RU2260047C2 - Recombinant plasmid dna providing synthesis of borrelia garinii immunodominant protein for lyme-borreliosis diagnosis - Google Patents
Recombinant plasmid dna providing synthesis of borrelia garinii immunodominant protein for lyme-borreliosis diagnosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2260047C2 RU2260047C2 RU2003131242/13A RU2003131242A RU2260047C2 RU 2260047 C2 RU2260047 C2 RU 2260047C2 RU 2003131242/13 A RU2003131242/13 A RU 2003131242/13A RU 2003131242 A RU2003131242 A RU 2003131242A RU 2260047 C2 RU2260047 C2 RU 2260047C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- fragment
- protein
- flab
- amino acid
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 title claims abstract description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 9
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 59
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 101150001984 flaB gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 101150055083 ospC gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108010092231 staphylococcal alpha-toxin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 claims description 8
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 claims description 8
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 6
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 abstract description 3
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 101100356028 Proteus mirabilis recA gene Proteins 0.000 abstract 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 abstract 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 108010003342 flaB flagellin Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 25
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 101710105711 Outer surface protein C Proteins 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 6
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 6
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 6
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000831940 Homo sapiens Stathmin Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100024237 Stathmin Human genes 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241001480847 Ixodes persulcatus Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 101000614399 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 2A regulatory subunit B'' subunit beta Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102100040471 Serine/threonine-protein phosphatase 2A regulatory subunit B'' subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001755 vocal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- WONRDHPFOHAWOG-UHFFFAOYSA-N 2-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C(Cl)C=CC2=C1 WONRDHPFOHAWOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 206010003399 Arthropod bite Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101900341261 Borrelia burgdorferi Outer surface protein C Proteins 0.000 description 1
- XHCUETHYSHFAKY-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCCN(C)CC([Na])=O Chemical compound CCCCCCCCCCCCN(C)CC([Na])=O XHCUETHYSHFAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 241000238889 Ixodidae Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000004374 Tick Bites Diseases 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000001449 borreliacidal effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 208000000292 ehrlichiosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- YYJNOYZRYGDPNH-MFKUBSTISA-N fenpyroximate Chemical compound C=1C=C(C(=O)OC(C)(C)C)C=CC=1CO/N=C/C=1C(C)=NN(C)C=1OC1=CC=CC=C1 YYJNOYZRYGDPNH-MFKUBSTISA-N 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000422 nocturnal effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, микробиологической промышленности, генно-инженерной биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантных полипептидов, несущих специфичные антигенные детерминанты белка OspC и фрагмента флагеллярного белка FlaB Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.).The invention relates to medicine, the microbiological industry, genetic engineering biotechnology and can be used to produce recombinant polypeptides that carry specific antigenic determinants of the OspC protein and the FlaB Borrelia burgdorferi sensu lato protein fragment (s.l.).
Лайм-боррелиоз (ЛБ), вызываемый спирохетами трех геновидов комплекса Borrelia burgdorferi s.l. (B.garinii, B.afzelii и В.burgdorferi sensu stricto - B.burgdorferi s.s.), является острым, с переходом в хроническую форму, природно-очаговым заболеванием, переносимым клещами группы Ixodes. ЛБ широко распространен в северном полушарии. На ранних стадиях болезнь довольно эффективно поддается лечению антибиотиками, в то время как при переходе в хроническую форму лечение весьма затруднено и требует значительно большего времени и более сложной схемы лечения. Постановка диагноза, особенно ранних стадий заболевания ЛБ, на основе одной лишь симптоматики очень затруднена ввиду огромного разнообразия клинических проявлений ЛБ, сходных с другими заболеваниями. На территории России распространены только два геновида возбудителей ЛБ - B.garinii и B.afzelii, хотя в недавних сообщениях приводятся данные об обнаружении в иксодовых клещах в Северо-западном регионе России и в Московской области боррелий геновида В.burgdorferi s.s. (Семенов А.В., Алексеев А.Н., Дубинина А.Н., Кауфманн У., Йенсен П.М. Исследование генетической гетерогенности популяции Ixodes persulcatus Schulze (Acari: Ixodidae) на северо-западе России и распространенность клещевых патогенов, возбудителей болезни Лайма и эрлихиоза, в клещах различных генотипов // Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 2001; (3): 11-15; Масузава Т, Наумов Р.Л., Кудекен M., Харитоненков И. Г. Обнаружение Borrelia burgdorferi sensu stricto в Московской области, Россия // Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 2001; (2):52.). Заболеваемость ЛБ составила в 1999 г. и в 2000 г. 8470 и 7533 человек соответственно. Однако эти цифры не отражают полной картины, т.к. в медицинской практике достоверно диагностируется лишь эритематозная форма ЛБ при наличии типичной мигрирующей эритемы в месте укуса клеща. Безэритематозные формы и хронические стадии клещевого боррелиоза практически не диагностируются в России из-за отсутствия отечественных наборов для серодиагностики ЛБ, импортные же наборы - очень дорогие. Если учесть тот факт, что на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока на долю возбудителя эритематозной формы ЛБ приходится всего 10-20% боррелий (геновид B.afzelii), а распространенность другого геновида (B.garinii) значительно доминирует, то становится очевидным, что клещевой боррелиоз у преобладающей части лиц, покусанных клещами, вообще пока не диагностируется. Таким образом, создание систем для диагностики клещевого боррелиоза, в особенности его ранних стадий, является актуальной задачей здравоохранения России.Lyme borreliosis (LB) caused by spirochetes of the three genovids of the Borrelia burgdorferi s.l. (B.garinii, B.afzelii and B.burgdorferi sensu stricto - B.burgdorferi s.s.), is an acute, with a transition to a chronic form, natural focal disease transmitted by ticks of the Ixodes group. LB is widespread in the northern hemisphere. In the early stages, the disease can be treated effectively with antibiotics, while the transition to the chronic form is very difficult and requires significantly more time and a more complex treatment regimen. Diagnosis, especially in the early stages of LB disease, on the basis of symptoms alone, is very difficult due to the huge variety of clinical manifestations of LB similar to other diseases. Only two genes of LB pathogens are widespread in Russia - B.garinii and B.afzelii, although recent reports cite the detection of Borrelia genus B.burgdorferi s.s. in ixodid ticks in the Northwestern region of Russia and the Moscow Region. (Semenov A.V., Alekseev A.N., Dubinina A.N., Kaufmann U., Jensen P.M. Study of the genetic heterogeneity of the population of Ixodes persulcatus Schulze (Acari: Ixodidae) in northwestern Russia and the prevalence of tick-borne pathogens, causative agents of Lyme disease and ehrlichiosis, in ticks of various genotypes // Medical parasitology and parasitic diseases, 2001; (3): 11-15; Masuzawa T, Naumov R.L., Kudeken M., Kharitonenkov I.G. Detection of Borrelia burgdorferi sensu stricto in the Moscow region, Russia // Medical parasitology and parasitic diseases, 2001; (2): 52.). The incidence of LB in 1999 and in 2000 was 8470 and 7533, respectively. However, these figures do not reflect the full picture, as in medical practice, only the erythematous form of LB is reliably diagnosed in the presence of a typical migratory erythema at the site of a tick bite. Non-erythematous forms and chronic stages of tick-borne borreliosis are practically not diagnosed in Russia due to the lack of domestic kits for serodiagnosis of LB, while imported kits are very expensive. Given the fact that in the Urals, Siberia and the Far East, the pathogen of the erythematous form of LB accounts for only 10-20% of borrelia (B.afzelii genotype), and the prevalence of another genotype (B.garinii) is significantly dominant, it becomes obvious. that tick-borne borreliosis in the predominant part of persons bitten by ticks is not yet diagnosed at all. Thus, the creation of systems for the diagnosis of tick-borne borreliosis, especially in its early stages, is an urgent task for the healthcare sector in Russia.
Поскольку культивирование боррелий является длительным и дорогостоящим процессом, перспективным подходом в создании тестов для серодиагностики ЛБ является выявление специфичных для возбудителя иммунодоминантных антигенов, получение рекомбинантных форм этих белков и конструирование на их основе иммуноферментных тест-систем.Since the cultivation of borrelia is a long and expensive process, a promising approach in creating tests for serodiagnostics of LB is the identification of pathogen-specific immunodominant antigens, the preparation of recombinant forms of these proteins, and the construction of enzyme-linked immunosorbent assays.
Одним из наиболее сильных антигенов В.burgdorferi s.l., индуцирующих гуморальный иммунный ответ на ранних стадиях инфекции, является флагеллярный белок FlaB, кодируемый геном flaB (Berland R., Fikrig E., Rahn D., Hardin J. and Flavell R. Molecular characterization of the humoral response to the 41 - kilodalton flagellar antigen of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent// Infection and Immunity. 1991, v.59, p.3531-35; Walich R.; Moter S. E., Simon M.M., Ebnet K., Heiberger A. and Kramer M.D. The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene// Infection and Immunity, 1990, v.58, p.1711-1719).One of the strongest B.burgdorferi sl antigens that induces a humoral immune response in the early stages of infection is the FlaB flagellar protein encoded by the flaB gene (Berland R., Fikrig E., Rahn D., Hardin J. and Flavell R. Molecular characterization of the humoral response to the 41 - kilodalton flagellar antigen of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent // Infection and Immunity. 1991, v. 59, p. 3531-35; Walich R .; Moter SE, Simon MM, Ebnet K., Heiberger A. and Kramer MD The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene // Infection and Immunity, 1990, v. 58, p.1711-1719).
Однако использование полноразмерного FlaB для диагностики затруднено ввиду его высокого антигенного перекреста с аналогичными белками других микроорганизмов, прежде всего возбудителя сифилиса (Luft В.J., Dunn J.J., Dattwyler R.J., Gorgone G., Goveric P.D. and Schubach W.H. Cross-reactive antigenic domains of the flagellin protein of Borrelia burgdorferi/ Res. Microbiology, 1993, v.144, p.251-257; Pavia C.S. Overview of the pathogenic spirochetes//Journal of Spirochetal and Tick-Born Diseases, 1. 1994, v.1; Subramanian G., Koonin E. and Aravind L. Comparative genome analysis of the pathogenic spirochetes Borrelia burgdorferi and Treponema pallidium //Infection and Immunity, 3.2000, v.68, p.1633-1648).However, the use of full-sized FlaB for diagnosis is difficult due to its high antigenic crossing with similar proteins of other microorganisms, especially the causative agent of syphilis (Luft B.J., Dunn JJ, Dattwyler RJ, Gorgone G., Goveric PD and Schubach WH Cross-reactive antigenic domains of the flagellin protein of Borrelia burgdorferi / Res. Microbiology, 1993, v.144, p. 251-257; Pavia CS Overview of the pathogenic spirochetes // Journal of Spirochetal and Tick-Born Diseases, 1. 1994, v.1; Subramanian G., Koonin E. and Aravind L. Comparative genome analysis of the pathogenic spirochetes Borrelia burgdorferi and Treponema pallidium // Infection and Immunity, 3.2000, v. 68, p. 1633-1648).
Эту проблему можно обойти, используя для диагностики лишь фрагмент FlaB, обладающий, по данным ряда исследователей, высокой антигенной специфичностью для возбудителей ЛБ (Ge Y., Li С., Corum L., Slaughter С. and Charon N.W. Structure and expression of the FlaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi //Journal of Bacteriology, 5. 1998, v.180, p.2418-2425; Robinson J.M., Pilot-Matias T.J., Pratt S.D., Patel С.В., Bevirt T.S. and Hunt J.S. Analysis of the humoral response to the flagellin protein of Borrelia burgdorferi: cloning of regions capable of differentiating Lyme disease from syphilis// Journal of Clinical Microbiology, 3. 1993, v.31, p.629-635).This problem can be circumvented by using only the FlaB fragment for diagnosis, which, according to some researchers, has high antigenic specificity for LB pathogens (Ge Y., Li C., Corum L., Slaughter C. and Charon NW Structure and expression of the FlaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi // Journal of Bacteriology, 5. 1998, v.180, p.2418-2425; Robinson JM, Pilot-Matias TJ, Pratt SD, Patel C.V., Bevirt TS and Hunt JS Analysis of the humoral response to the flagellin protein of Borrelia burgdorferi: cloning of regions capable of differentiating Lyme disease from syphilis // Journal of Clinical Microbiology, 3. 1993, v.31, p.629-635).
Известен патент США №5618533 «Flagellin-based polypeptides for the diagnosis of lyme disease» на флагеллярные полипептиды. Работа выполнена на микроорганизмах геновида В.burgdorferi s.s., не имеющего сколько-нибудь существенного распространения на территории России, в частности отсутствующего на большей части Европейской территории России и совершенно отсутствующего в Азиатской ее части. Использованы следующие полипептиды аминокислотной последовательности белка FlaB В.burgdorferi s.s str. B31: 165-273, 197-273, 197-241.Known US patent No. 5618533 "Flagellin-based polypeptides for the diagnosis of lyme disease" on flagellar polypeptides. The work was carried out on microorganisms of the genus B.burgdorferi s.s., which does not have any significant distribution on the territory of Russia, in particular, which is absent in most of the European territory of Russia and completely absent in its Asian part. The following polypeptides of the amino acid sequence of B. Burgdorferi s.s str. B31: 165-273, 197-273, 197-241.
В данной работе в качестве примера вектора для экспрессии указан GEX-2T с промотором PtaqI. Использование этого вектора не позволяет получать полипептидные продукты в чистом виде, их можно получить только в виде слитого белка с глютатион-S-трансферазой, что вызывает некоторые проблемы при их получении и использовании, а именно:In this work, GEX-2T with the PtaqI promoter is indicated as an example of an expression vector. The use of this vector does not allow to obtain polypeptide products in pure form, they can be obtained only in the form of a fused protein with glutathione S-transferase, which causes some problems in their preparation and use, namely:
- может в некоторых случаях приводить к искажениям результатов при диагностике ЛБ из-за собственной иммунной реактивности глютатион-S-трансферазы,- may in some cases lead to distortions in the diagnosis of LB due to the intrinsic immune reactivity of glutathione-S-transferase,
- требует более дорогих материалов для очистки рекомбинантных протеинов,- requires more expensive materials for the purification of recombinant proteins,
- позволяет проводить их очистку только в нативных условиях,- allows you to clean them only in native conditions,
- ввиду того, что внутри клетки синтезируется не только целевой продукт, но и дополнительная протяженная аминокислотная последовательность, количество нарабатываемого целевого продукта уменьшается,- due to the fact that inside the cell not only the target product is synthesized, but also an additional extended amino acid sequence, the amount of the target product produced is reduced,
- использованная в плазмидном векторе регуляторная область недостаточно жестко контролирует активность промотора Ptaql, что приводит к существенной экспрессии гена в отсутствие индуктора и, как следствие этого, уменьшению стабильности рекомбинантной плазмиды.- the regulatory region used in the plasmid vector does not tightly control the activity of the Ptaql promoter, which leads to significant gene expression in the absence of an inducer and, as a result, a decrease in the stability of the recombinant plasmid.
Известны патенты США №5643733 «Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof» и №5965702 «Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof». Данные работы выполнены также на не имеющем распространения в России геновиде В.burgdorferi s.s. Использованы следующие полипептиды аминокислотной последовательности белка FlaB В.burgdorferi s.s: 137-262, 64-311. В патентах использованы плазмиды рВ410, рВТ1042, рВТ445 и рВТ259. Использованные в данных патентах векторные системы позволяют получить флагеллярные полипептиды в виде слитого белка с фрагментом β-галактозидазы, что также создает дополнительные трудности при их получении и использовании, а именно:Known US patents No. 5643733 "Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof" and No. 5965702 "Borrelia burgdorferi antigens and uses this". These works were also performed on the B.burgdorferi s.s. The following polypeptides of the amino acid sequence of B.burgdorferi s.s. FlaB protein were used: 137-262, 64-311. In the patents, plasmids pB410, pBT1042, pBT445 and pBT259 were used. The vector systems used in these patents make it possible to obtain flagellar polypeptides in the form of a fusion protein with a β-galactosidase fragment, which also creates additional difficulties in their preparation and use, namely:
- фрагмент β-галактозидазы может давать артефактные результаты при проведении ИФА анализа (ложноположительные результаты диагностики),- a fragment of β-galactosidase can give artifact results during ELISA analysis (false positive diagnostic results),
- данная система не позволяет проводить быструю и качественную очистку с использованием аффинной хроматографии (белок получается в результате многостадийного центрифугирования и недостаточно чист),- this system does not allow for fast and high-quality purification using affinity chromatography (protein is obtained as a result of multi-stage centrifugation and is not clean enough),
- нерастворимость или слабая растворимость слитого белка в водных растворах усложняет изготовление тест-систем и их использование,- insolubility or poor solubility of the fused protein in aqueous solutions complicates the manufacture of test systems and their use,
- кроме того, использование данной системы экспрессии накладывает существенные ограничения на выбор штамма-хозяина и состав питательной среды для получения целевого продукта,- in addition, the use of this expression system imposes significant restrictions on the choice of the host strain and the composition of the nutrient medium to obtain the target product,
- ввиду того, что внутри клетки синтезируется не только целевой продукт, но и дополнительная протяженная аминокислотная последовательность, количество нарабатываемого целевого продукта уменьшается.- due to the fact that inside the cell not only the target product is synthesized, but also an additional extended amino acid sequence, the amount of the target product produced is reduced.
В литературе не описаны генно-инженерные конструкции, позволяющие получать флагеллярныи белок FlaB и его фрагменты, свойственные В.garinii и, в частности, свойственные западно-сибирским изолятам B.garinii.Genetic engineering constructs are not described in the literature that make it possible to obtain the FlaB flagellar protein and its fragments characteristic of B. garinii and, in particular, characteristic of the West Siberian B.garinii isolates.
Другим сильным антигеном B.hurgdorferi s.l., индуцирующим гуморальный иммунный ответ на ранних стадиях инфекции, является кодируемый геном ospC белок OspC, относящийся к семейству поверхностных липопротеинов боррелий (Wilske В., Preas-Mursic V., Jarius S., Hofmann A., Pradel I., Soutschek E., Schwab E., Will G. and Wanner G. Immunological and molecular polymorphism of OspC, an immunodominant major outer surface protein of Borrelia burgdorferi //Infection and Immunity, 5. 1993, v.61, p.2182-2191).Another strong antigen of B.hurgdorferi sl, inducing a humoral immune response in the early stages of infection, is the OspC protein encoded by the ospC gene, belonging to the family of Borrelia surface lipoproteins (Wilske B., Preas-Mursic V., Jarius S., Hofmann A., Pradel I., Soutschek E., Schwab E., Will G. and Wanner G. Immunological and molecular polymorphism of OspC, an immunodominant major outer surface protein of Borrelia burgdorferi // Infection and Immunity, 5. 1993, v. 61, p. 2182-2191).
OspC и FlaB являются первыми антигенами, вызывающими иммунный ответ у больных Лайм-боррелиозом. Иммуноглобулины М против этих белков присутствуют в крови в высоком титре уже через одну - две недели после заражения (Rauer S., Spohn N., Rasiah., Neubert U. and Vogt A. Enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant OspC and internal 14-kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease// Journal of Clinical Microbiology, 4. 1998, v.36, p.857-861).OspC and FlaB are the first antigens to elicit an immune response in patients with Lyme borreliosis. Immunoglobulins M against these proteins are present in the blood in high titer one to two weeks after infection (Rauer S., Spohn N., Rasiah., Neubert U. and Vogt A. Enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant OspC and internal 14- kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease // Journal of Clinical Microbiology, 4. 1998, v. 36, p. 857-861).
Известен патент US6464985 «Compositions arid methods using the borreliacidal epitope(s) of Borrelia burgdorferi outer surface protein С (OspC) for the diagnosis and prevention of Lyme disease». Эта работа выполнена также на геновиде Borrelia burgdorferi s.s. Использован фрагмент DraI-SmaI гена ospC Borrelia burgdorfen s.s., кодирующий фрагмент белка OspC с 145 по 194 аминокислотный остаток (а.о.). Однако белок OspC характеризуется высокой гетерогенностью среди различных геновидов, достигающей 40% аминокислотного состава. С аминокислотной вариабельностью коррелирует и антигенная изменчивость. Сыворотки лиц, инфицированных каким-либо геновидом Borrelia burgdorferi s.l., как правило, плохо связываются с антигеном OspC других геновидов (Bunkis J., Olsen В., Westman G. and Bergstrum S. Variable serum immunoglobulin responses against different Borrelia burgdorferi sensu lato species in population at risk for patients with Lyme disease // Journal of Clinical Microbiology, 6. 1995, v.33, p.1473-1478). Внутри геновидов, а тем более групп штаммов, вариабельность значительно меньше и обычно не превосходит нескольких процентов (Wang I.-N., Dykhuezen D.Е., Qiu W., Dunn J.J., Bosler E.M. and Luft B.J. Genetic diversity of ospC in local population of Borrelia burgdorferi sensu stricto // Genetics, 1.1999, v.151, p.15-30). Использованная в этой работе плазмида предназначена для клонирования генов, состыкованных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей олигопептид, способный биотинилироваться in vivo. При экспрессии клонируемых генов синтезируются химерные белки, содержащие биотинилированный полипептид, который обеспечивает аффинную очистку целевых химерных белков на колонках с авидином или стрептавидином. Но такой способ очистки является сравнительно дорогим и пригоден для очистки белков только в нативных условиях. Кроме того, полученные очищенные антигены нельзя использовать в тест-системах с применением биотинилированных антител.The patent US6464985 "Compositions arid methods using the borreliacidal epitope (s) of Borrelia burgdorferi outer surface protein C (OspC) for the diagnosis and prevention of Lyme disease" is known. This work was also performed on the genre of Borrelia burgdorferi s.s. The DraI-SmaI fragment of the ospC gene of Borrelia burgdorfen s.s., encoding the OspC protein fragment from 145 to 194 amino acid residues (aa), was used. However, the OspC protein is characterized by high heterogeneity among various genovids, reaching 40% of the amino acid composition. Antigenic variability also correlates with amino acid variability. The sera of individuals infected with any genus Borrelia burgdorferi sl are generally poorly bound to the OspC antigen of other genotypes (Bunkis J., Olsen B., Westman G. and Bergstrum S. Variable serum immunoglobulin responses against different Borrelia burgdorferi sensu lato species in population at risk for patients with Lyme disease // Journal of Clinical Microbiology, 6. 1995, v. 33, p. 1473-1478). Within genotypes, and especially strain groups, the variability is much less and usually does not exceed several percent (Wang I.-N., Dykhuezen D.E., Qiu W., Dunn JJ, Bosler EM and Luft BJ Genetic diversity of ospC in local population of Borrelia burgdorferi sensu stricto // Genetics, 1.1999, v. 151, p. 15-30). The plasmid used in this work is intended for cloning genes docked with a nucleotide sequence encoding an oligopeptide capable of biotinylation in vivo. When expressing cloned genes, chimeric proteins are synthesized containing a biotinylated polypeptide that provides affinity purification of the target chimeric proteins on avidin or streptavidin columns. But this method of purification is relatively expensive and is suitable for protein purification only in native conditions. In addition, the obtained purified antigens cannot be used in test systems using biotinylated antibodies.
Известен патент WO 0216422 «Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi». Работа выполнена на Borrelia burgdorferi s.s. В клетках E.coli были экспрессированы как полный белок OspC, так и его фрагменты, содержащие аминокислотные остатки с 19 по 204, с 19 по 211, с 19 по 213. Получен гибридный белок, состоящий из аминокислотной последовательности зрелого OspC, слитой с аминокислотной последовательностью зрелого OspA, вследствие чего обе последовательности находятся в неацилированной форме и таким образом теряют соответствующие антигенные детерминанты нативных белков.Known patent WO 0216422 "Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi". The work was done at Borrelia burgdorferi s.s. In E. coli cells, both the complete OspC protein and its fragments containing amino acid residues from 19 to 204, from 19 to 211, from 19 to 213 were expressed. A hybrid protein was obtained consisting of the amino acid sequence of mature OspC fused to the amino acid sequence mature OspA, as a result of which both sequences are in unacylated form and thus lose the corresponding antigenic determinants of native proteins.
Известен патент US 5620862 «Methods for diagnosing early Lyme disease».Known patent US 5620862 "Methods for diagnosing early Lyme disease".
Работа выполнена на Borrelia burgdorferi s.s. В данной работе в качестве примера вектора для экспрессии указан GEX-2T с промотором PtaqI. Использование этого вектора позволяет получать полипептидные продукты в виде слитого белка с глютатион-S-трансферазой. Выше (US 5618533) уже были указаны проблемы, возникающие при их получении и использовании.The work was done at Borrelia burgdorferi s.s. In this work, GEX-2T with the PtaqI promoter is indicated as an example of an expression vector. Using this vector allows to obtain polypeptide products in the form of a fused protein with glutathione-S-transferase. Above (US 5618533) problems have already been indicated that arise when they are received and used.
В литературе не описаны генно-инженерные конструкции, позволяющие получать OspC или его фрагменты, свойственные B.garinii, в частности свойственные западно-сибирским изолятам B.garinii.No genetic engineering constructs have been described in the literature that make it possible to obtain OspC or its fragments characteristic of B.garinii, in particular, characteristic of the West Siberian B.garinii isolates.
Задачей изобретения является создание рекомбинантных полипептидов, несущих специфичные антигенные детерминанты белка OspC и фрагмента флагеллярного белка FlaB, свойственные изолятам Borrelia garinii, распространенным в России, в частности в западной Сибири.The objective of the invention is the creation of recombinant polypeptides that carry specific antigenic determinants of the OspC protein and the FlaB flagellar protein fragment, characteristic of Borrelia garinii isolates, common in Russia, in particular in Western Siberia.
Другой задачей изобретения является создание таких рекомбинантных плазмидных конструкций, которые бы обеспечивали:Another objective of the invention is the creation of such recombinant plasmid constructs that would provide:
а) эффективную строго контролируемую индуцируемую экспрессию встраиваемых структурных областей генов иммунодоминантных белков В. garinii (OspC и FlaB) в клетках E.coli,a) effective strictly controlled inducible expression of the inserted structural regions of genes of immunodominant proteins of B. garinii (OspC and FlaB) in E. coli cells,
б) последующую быструю и эффективную аффинную очистку рекомбинантных белков в широком диапазоне условий (денатурирующих и нативных) без использования дорогих реагентов,b) the subsequent fast and effective affinity purification of recombinant proteins in a wide range of conditions (denaturing and native) without the use of expensive reagents,
с) отсутствие каких-либо ограничений на модификации антител при конструировании тест-системы.c) the absence of any restrictions on antibody modifications in the design of the test system.
Целевые белки, получаемые с помощью заявляемых плазмидных ДНК pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25, не содержат протяженных чужеродных аминокислотных последовательностей, вследствие чего не дают неспецифических сигналов в иммуноферментных анализах. Это, в свою очередь, обеспечивает повышение специфичности диагностики. Целевой белок, получаемый с помощью заявляемой плазмидной ДНК pREB9-H6-C25 экспрессируется целиком и содержит все антигенные детерминанты нативного белка.Target proteins obtained using the claimed plasmid DNA pREB9-H6-F7 and pREB9-H6-C25 do not contain extended foreign amino acid sequences, as a result of which they do not give non-specific signals in enzyme immunoassays. This, in turn, provides increased diagnostic specificity. The target protein obtained using the claimed plasmid DNA pREB9-H6-C25 is expressed in its entirety and contains all antigenic determinants of the native protein.
В сконструированных плазмидах экспрессия клонированных генов находится под строгим контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis, благодаря чему практически исключается неиндуцируемая экспрессия клонированных генов, продукты которых могут быть токсичными для клетки хозяина. Это обеспечивает более высокую стабильность рекомбинантных плазмид и продуктивность рекомбинантных штаммов.In the constructed plasmids, the expression of the cloned genes is strictly controlled by the regulatory region of the recA Proteus mirabilis gene, which virtually eliminates the non-induced expression of the cloned genes, the products of which may be toxic to the host cell. This provides higher stability of recombinant plasmids and the productivity of recombinant strains.
Для решения указанных задач были сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25.To solve these problems, recombinant plasmid DNAs pREB9-H6-F7 and pREB9-H6-C25 were constructed.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-F7 обеспечивает синтез специфичного для Borrelia garinii фрагмента белка FlaB в Rec+ штаммах Е.coli под воздействием индукторов, активирующих систему SOS-репарации. Она содержит:Recombinant plasmid DNA pREB9-H6-F7 provides the synthesis of Borrelia garinii-specific FlaB protein fragment in Rec + strains of E. coli under the influence of inducers that activate the SOS repair system. It contains:
• фрагмент размером 0,10 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий сигнальную аминокислотную последовательность α-токсина Staphylococcus aureus (CAT) и восемь N-концевых аминокислотных остатков зрелого CAT;• a fragment of 0.10 thousand base pairs (kbp) encoding the signal amino acid sequence of Staphylococcus aureus α-toxin (CAT) and eight N-terminal amino acid residues of mature CAT;
• специфичный для Borrelia garinii фрагмент гена flaB размером 0,50 т.п.о.;• a 0.50 kb specific flaB gene fragment specific for Borrelia garinii;
• нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена flaB, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6-ти гистидинов;• the nucleotide sequence in the reading frame of the flaB gene encoding the amino acid residues of glycine and 6 histidines;
• BamHI - EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 (SU1761805 A1) с внутренним уникальным сайтом рестрикции XmaI, содержащий ген bla β-лактамазы в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток E.coli к ампициллину, и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis;• BamHI - EcoRI DNA fragment of plasmid pIL-2/21 (SU1761805 A1) with an internal unique XmaI restriction site containing the bla β-lactamase gene as a genetic marker that determines the resistance of ampicillin to plasmid transformed E. coli cells and the regulatory region of the recA gene Proteus mirabilis;
• уникальные сайты рестрикции: XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI.• Unique restriction sites: XmaI, EcoRI, BstEII and BamHI.
Ниже приведено словесное описание плазмиды pREB9-H6-F7, которая представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 1. Указанная плазмида имеет размер 4061 п.о., молекулярную массу - 2,8 мегадальтон и состоит из следующих элементов (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pREB9-H6-F7):Below is a verbal description of the plasmid pREB9-H6-F7, which is presented in the sequence listing SEQ ID NO 1. This plasmid has a size of 4061 bp, a molecular weight of 2.8 megadaltons and consists of the following elements (all positions of nucleotide residues are relative to plasmids pREB9-H6-F7):
I. фрагмента, кодирующего сигнальную последовательность α-токсина Staphylococcus aureus и восемь первых N-концевых аминокислотных остатков зрелого CAT (позиции 195-296 п.о.) и содержащего кодон инициации трансляции (позиции нуклеотидов 195-197);I. a fragment encoding the signal sequence of the α-toxin of Staphylococcus aureus and the first eight N-terminal amino acid residues of mature CAT (positions 195-296 bp) and containing the translation initiation codon (positions of nucleotides 195-197);
II. фрагмента гена flaB В.garinii (позиции 297-800 п.о.), который кодирует аминокислотную последовательность фрагмента белка FlaB В.garinii (100-267 аминокислотные остатки (а.о.) оригинальной последовательности). Нуклеотидная последовательность фрагмента гена flaB Borrelia garinii и кодируемая им аминокислотная последовательность фрагмента белка FlaB представлены в перечне последовательностей: SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3;II. a fragment of the B. garinii flaB gene (positions 297-800 bp), which encodes the amino acid sequence of the B. garinii FlaB protein fragment (100-267 amino acid residues (a.o.) of the original sequence). The nucleotide sequence of the Borrelia garinii flaB gene fragment and the amino acid sequence of the FlaB protein fragment encoded by it are presented in the sequence listing:
III. нуклеотидной последовательности в рамке считывания гена flaB, кодирующей аминокислотный остаток глицина (позиции 801-803) и полигистидиновый тракт (позиции 804-821 п.о.) - 6-гистидиновую последовательность для последующей очистки рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на Ni2+-хелатном сорбенте (Ni2+-NTA-sepharose-Cl 6B). Глицин необходим, чтобы придать подвижность 6-гистидиновой последовательности;III. the nucleotide sequence in the reading frame of the flaB gene encoding the glycine amino acid residue (positions 801-803) and the polyhistidine tract (positions 804-821 bp) - a 6-histidine sequence for subsequent purification of the recombinant protein using affinity chromatography on Ni 2+ - chelated sorbent (Ni 2+ -NTA-sepharose-Cl 6B). Glycine is needed to mobilize the 6-histidine sequence;
IY. кодона терминации трансляции (позиции 822-824 п.о.);IY. translation termination codon (positions 822-824 bp);
Y. BamHI - EcoRI фрагмента ДНК плазмиды pIL-2/21 (825-194 п.о.), который содержит:Y. BamHI - EcoRI plasmid DNA fragment pIL-2/21 (825-194 bp), which contains:
• фрагмент генома бактериофага лямбда (позиции 1662-1756 п.о.), который содержит Т0-терминатор транскрипции (позиции 1719-1745);• a fragment of the genome of the bacteriophage lambda (positions 1662-1756 bp), which contains the T0 transcription terminator (positions 1719-1745);
• фрагмент ДНК плазмиды pBR322 (позиции 1763-4059 п.о.) длиной 2297 п.о., соответствующий фрагменту (позиции 2065-4361 п.о.) оригинальной последовательности pBR322, который содержит:• a DNA fragment of plasmid pBR322 (position 1763-4059 bp) with a length of 2297 bp corresponding to a fragment (position 2065-4361 bp) of the original pBR322 sequence, which contains:
а. участок начала репликации (позиция 2233 п.о.),a. replication start site (position 2233 bp),
b. ген bla, кодирующий β-лактамазу, в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток E.coli к ампициллину;b. the bla gene encoding β-lactamase as a genetic marker that determines the resistance of ampicillin to E. coli transformed by plasmid;
с. регуляторную область гена recA Proteus mirabilis, обеспечивающую под воздействием индукторов (налидиксовая кислота, митомицин С, УФ-воздействие, радиоизлучение) инициацию транскрипции матричной РНК, кодирующей целевой продукт (позиции 44-194 п.о.).from. the regulatory region of the recA Proteus mirabilis gene, which, under the influence of inducers (nalidixic acid, mitomycin C, UV exposure, radio emission), initiates the transcription of messenger RNA encoding the target product (positions 44-194 bp).
Уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции имеют следующие координаты:The unique recognition sites for restriction endonucleases have the following coordinates:
XmaI - (CCCGGG) 5-10, EcoRI (GAATTC) - 189-194; BstEII (GGTCACC) - 801-807, BamHI (GGATCC) - 825-830.XmaI - (CCCGGG) 5-10, EcoRI (GAATTC) - 189-194; BstEII (GGTCACC) - 801-807, BamHI (GGATCC) - 825-830.
Фрагменты III, IV и V составляют вектор pREB9-H6.Fragments III, IV and V comprise the vector pREB9-H6.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pREB9-H6-C25 обеспечивает синтез белка OspC В.garinii в RecA+ штаммах Е.coli под воздействием индукторов, активирующих систему SOS-репарации. Она содержит:Recombinant plasmid DNA pREB9-H6-C25 provides the synthesis of OspC protein of B. garinii in RecA + E. coli strains under the influence of inducers that activate the SOS repair system. It contains:
• фрагмент размером 0,66 тысяч пар оснований (т.п.о.), кодирующий белок OspC В.garinii и нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена ospC, кодирующую аминокислотные остатки глицина и 6-ти гистидинов;• a fragment of 0.66 thousand base pairs (kbp) encoding the B. garinii OspC protein and the nucleotide sequence in the reading frame of the ospC gene, encoding the amino acid residues of glycine and 6 histidines;
• BamHI - EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pIL-2/21 (SU1761805 А1) с внутренним уникальным сайтом рестрикции XmaI, содержащий ген bla β-лактамазы в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток E.coli к ампициллину, и регуляторную область гена recA Proteus mirabilis,• BamHI - EcoRI DNA fragment of the plasmid pIL-2/21 (SU1761805 A1) with an internal unique XmaI restriction site containing the bla β-lactamase gene as a genetic marker that determines the resistance of ampicillin to plasmid transformed E. coli cells and the regulatory region of the recA gene Proteus mirabilis,
• уникальные сайты рестрикции: XmaI, EcoRI, BstEII и BamHI.• Unique restriction sites: XmaI, EcoRI, BstEII and BamHI.
Ниже приведено словесное описание плазмиды pREB9-H6-C25, которая представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 4. Указанная плазмида имеет размер 4097 п.о., молекулярную массу -2,8 мегадальтон и состоит из следующих элементов (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pREB9-H6-C25):The following is a verbal description of the plasmid pREB9-H6-C25, which is presented in the sequence listing SEQ ID NO 4. The plasmid is 4097 bp in size, has a molecular weight of -2.8 megadaltons and consists of the following elements (all positions of nucleotide residues are relative to plasmids pREB9-H6-C25):
I. структурной части гена ospC В.garinii (позиции 195-836 п.о.), который кодирует аминокислотную последовательность белка OspC В.garinii. Нуклеотидная последовательность гена ospC Borrelia garinii и кодируемая им аминокислотная последовательность белка OspC представлены в перечне последовательностей: SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6;I. the structural part of the B. garinii ospC gene (positions 195-836 bp), which encodes the amino acid sequence of the B. garinii OspC protein. The nucleotide sequence of the ospC gene of Borrelia garinii and the amino acid sequence of the OspC protein encoded by it are presented in the sequence listing: SEQ ID NO 5,
II. нуклеотидной последовательности в рамке считывания гена ospC, кодирующей аминокислотный остаток глицина (позиции 837-839) и 6-гистидиновую последовательность (позиции 840-857 п.о.) - для последующей очистки рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на Ni2+-хелатном сорбенте. Глицин необходим, чтобы придать подвижность 6-гистидиновой последовательности:II. the nucleotide sequence in the reading frame of the ospC gene encoding the amino acid residue of glycine (positions 837-839) and the 6-histidine sequence (positions 840-857 bp) - for subsequent purification of the recombinant protein using affinity chromatography on a Ni 2+ chelate sorbent . Glycine is needed to mobilize the 6-histidine sequence:
III. кодона терминации трансляции (позиции 858-860);III. translation termination codon (positions 858-860);
IV. BamHI - EcoRI фрагмента ДНК плазмиды pIL-2/21 (861-194), который содержит:IV. BamHI - EcoRI of the DNA fragment of plasmid pIL-2/21 (861-194), which contains:
• фрагмент генома фага лямбда (позиции 1698-1792), который содержит Т0-терминатор транскрипции (позиции 1755-1781);• a fragment of the lambda phage genome (positions 1698-1792) that contains the T0 transcription terminator (positions 1755-1781);
• фрагмент ДНК плазмиды pBR322 1799-4095 п.о. (2297 п.о.), соответствующий 2065-4361-фрагменту оригинальной последовательности pBR322, который содержит:• DNA fragment of plasmid pBR322 1799-4095 bp (2297 bp) corresponding to the 2065-4361 fragment of the original pBR322 sequence, which contains:
а. участок начала репликации (позиция 2269 п.о.),a. replication start site (position 2269 bp),
Ь. ген bla β-лактамазы, в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость трансформированных плазмидой клеток Е.coli к ампициллину;B. bla β-lactamase gene, as a genetic marker that determines the resistance of ampicillin to E. coli transformed by plasmid;
с. регуляторную область гена recA Proteus mirabilis, обеспечивающую под воздействием индукторов (налидиксовая кислота, митомицин С, УФ-воздействие, радиоизлучение) инициацию транскрипции матричной РНК, кодирующей целевой продукт (позиции 44-194 п.о.).from. the regulatory region of the recA Proteus mirabilis gene, which, under the influence of inducers (nalidixic acid, mitomycin C, UV exposure, radio emission), initiates the transcription of messenger RNA encoding the target product (positions 44-194 bp).
Уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами имеют следующие координаты:Unique recognition sites by restriction endonucleases have the following coordinates:
XmaI - (CCCGGG) 5-10, EcoRI (GAATTC) - 189-194; BstEII (GGTCACC) - 837-843, BamHI - (GGATCC) 861-866.XmaI - (CCCGGG) 5-10, EcoRI (GAATTC) - 189-194; BstEII (GGTCACC) - 837-843, BamHI - (GGATCC) 861-866.
Фрагменты II, III и IV составляют вектор pREB9-H6.Fragments II, III, and IV comprise the vector pREB9-H6.
Перечень фигур иллюстративного материала:The list of figures illustrative material:
Фиг.1. Физико-генетическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pREB9-H6-F7.Figure 1. Physico-genetic map of recombinant plasmid DNA pREB9-H6-F7.
Фиг.2. Физико-генетическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pREB9-H6-C25.Figure 2. Physico-genetic map of recombinant plasmid DNA pREB9-H6-C25.
Примеры конструирования плазмид.Examples of the construction of plasmids.
Пример 1.Example 1
Получение вектора pREB9-H6 было осуществлено в два шага.The preparation of the vector pREB9-H6 was carried out in two steps.
А) Плазмидную ДНК pIL-2/21 (SU 1761805 А1) гидролизовали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем отжигали и лигировали с олигонуклеотидами AATTCCGGCCGGGTCACCG и GATCCGGTGACCCGGCCGG. При этом происходила вырезка гена интерлейкина и его замена на линкерную последовательность, содержащую сайты узнавания рестриктазами Есо52I и BstEII.A) Plasmid DNA pIL-2/21 (SU 1761805 A1) was hydrolyzed with restriction enzymes EcoRI and BamHI, then annealed and ligated with AATTC CGGCCG GGTCACC G and GATCC GGTGACC CGGCCG G oligonucleotides . In this case, its gene was cut off and the interleukin gene was cut and the gene for interleukin was cut recognition sites of restriction enzymes Eco52I and BstEII.
Полученной плазмидой трансформировали (метод трансформации описан ниже) клетки Е.coli штамм DH5α (ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ ККМ) затем нарабатывали необходимое количество плазмидной ДНК для второго этапа (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, стр.98-106).The obtained plasmid was transformed (the transformation method is described below) E. coli strain DH5α cells (SSC VB “Vector” Research Institute of KKM) then the required amount of plasmid DNA was generated for the second stage (Maniatis T. et al. Molecular Cloning. M .: Mir, 1984, pg. 98-106).
Б) На втором этапе плазмидную ДНК из А) гидролизовали рестриктазами BsfEII и BamHI, затем отжигали с олигонуклетидами 5'-GTCACCAT-CACCATCACCATTAAG и GATCCTTAATGGTGATGGTGATG. На этом этапе происходила встройка в плазмидную молекулу нуклеотидной последовательности, кодирующей а.о. глицина и 6-ти гистидинов (шестигистидиновый тракт). Полученным плазмидным вектором трансформировали клетки Е.coli штамм DH5α и после его наработки использовали для дальнейшего получения рекомбинантных плазмид pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25.B) In the second stage, the plasmid DNA from A) was hydrolyzed with restriction enzymes BsfEII and BamHI, then annealed with 5'- GTCACC AT-CACCATCACCATTAAG and GATCC TTAATGGTGATGGTGATG oligonucleotides. At this stage, the nucleotide sequence encoding a.o. was inserted into the plasmid molecule. glycine and 6 histidines (six-histidine tract). The obtained plasmid vector transformed E. coli strain DH5α cells and, after its production, was used to further obtain recombinant plasmids pREB9-H6-F7 and pREB9-H6-C25.
Гидролиз ДНК рестриктазами и сшивку фрагментов ДНК при помощи ДНК-лигазы фага Т4 проводили согласно прилагаемым к препаратам ферментов инструкциям фирм-производителей.Hydrolysis of DNA with restrictase enzymes and cross-linking of DNA fragments using T4 phage DNA ligase was carried out according to the instructions of the manufacturers attached to the enzyme preparations.
Пример 2.Example 2
Получение плазмид pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25.Obtaining plasmids pREB9-H6-F7 and pREB9-H6-C25.
а) Введение фрагмента гена flaB и лидерной последовательности стафилококкового альфа-токсина в вектор pREB9-H6 и получение рекомбинантной плазмиды pREB9-H6-F7.a) Introduction of the flaB gene fragment and the staphylococcal alpha-toxin leader sequence into the pREB9-H6 vector and the preparation of the recombinant plasmid pREB9-H6-F7.
В качестве источника ДНК боррелий служили иксодовые клещи вида Ixodes persulcatus, инфицированные B.garinii NT29 и собранные в лесопарковой зоне ННЦ. Для амплификации структурных областей генов, кодирующих CAT S.aureus штамм Wood 46 (НИИ им. Н.Ф.Гамалеи) и белок FlaB B.garinii NT29 использовали две пары праймеров PR22+PR31 и PR87+PR88 соответственно. Нуклеотидные последовательности праймеров:Ixodes ticks of the species Ixodes persulcatus infected with B.garinii NT29 and collected in the forest park zone of the NSC served as a source of Borrelia DNA. To amplify the structural regions of genes encoding CAT S.aureus strain Wood 46 (Research Institute named after N.F. Gamalei) and protein FlaB B.garinii NT29, two pairs of primers PR22 + PR31 and PR87 + PR88 were used, respectively. The nucleotide sequences of the primers:
PR22 - 5'-GGAATTCATGAAAACACGTATAGTC-3'PR22 - 5'-G GAATTC ATGAAAACACGTATAGTC-3 '
PR31 - 5'-AGGTCACCATTTGTCATTTCTTCTTTTTC 3'PR31 - 5'-A GGTCACC ATTTGTCATTTCTTCTTTTTC 3 '
PR87 - 5'-GTTAACGGCACATATTCAGATGC-3'PR87 - 5'-GTTAACGGCACATATTCAGATGC-3 '
PR88 - 5'-GAGGTGACCTAAATTTGCCCTTTGATC-3'PR88 - 5'-GAGGTGACCTAAATTTGCCCTTTGATC-3 '
Для клонирования и экспрессии фрагмента гена flaB использовали бактериальный штамм E.coli C600 (ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ ККМ) и плазмидный вектор pREB9-H6, в котором экспрессия клонируемых генов осуществляется под контролем регуляторной области гена recA P.mirabilis.For cloning and expression of the flaB gene fragment, the bacterial strain E. coli C600 (SSC VB Vektor Research Institute of KKM) and plasmid vector pREB9-H6, in which the expression of the cloned genes is controlled by the regulatory region of the recA gene of P. mirabilis, were used.
Выделение ДНК из клещей. В качестве сорбента при выделении ДНК применяли коммерческий препарат диоксида кремния фирмы "Sigma" (USA)-товарное название "Силика".Isolation of DNA from ticks. As a sorbent for DNA isolation, a commercial preparation of silicon dioxide by Sigma (USA) was used, the product name is Silica.
Живого клеща помещали на 2 мин в раствор 70% этанола и подсушивали промоканием на фильтровальной бумаге. Край брюшка клеща отрезали лезвием бритвы на предметном стекле, после чего содержимое брюшной полости выдавливали в 50 мкл буфера №1 следующего состава: 4М гуанидин-изотиоцианат, 1% лаурил-саркозил натрия, 10 мМ ЭДТА, 0,01% 2-меркаптоэтанол. Смесь переносили в пробирку типа Еппендорф, выдерживали при 65°С 1 час и удаляли белки экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1). В водную фазу, содержащую ДНК, вносили 5 мкл суспензии силики (3 мг/мл) с сорбционной емкостью в отношении ДНК 2.5 мг/мл и инкубировали при комнатной температуре на шейкере в течение 30 мин. Диоксид кремния с сорбированой на нем ДНК осаждали центрифугированием при 2000×g 5 мин. Осадок дважды промывали буфером №1, дважды 70% этанолом и 96% этанолом и подсушивали. ДНК элюировали с сорбента с помощью инкубации в буфере ТЕ 8-10 мин при 50°С.A live tick was placed for 2 min in a solution of 70% ethanol and dried by blotting on filter paper. The edge of the tick’s abdomen was cut off with a razor blade on a glass slide, after which the contents of the abdominal cavity were squeezed into 50 μl of buffer No. 1 of the following composition: 4M guanidine-isothiocyanate, 1% lauryl-sarcosyl sodium, 10 mM EDTA, 0.01% 2-mercaptoethanol. The mixture was transferred to an Eppendorf type tube, kept at 65 ° C for 1 hour, and the proteins were removed by extraction with a phenol-chloroform mixture (1: 1). 5 μl of a suspension of silica (3 mg / ml) with a sorption capacity for DNA of 2.5 mg / ml was added to the aqueous phase containing DNA and incubated at room temperature on a shaker for 30 min. Silicon dioxide with DNA adsorbed on it was precipitated by centrifugation at 2000 × g for 5 min. The precipitate was washed twice with buffer No. 1, twice with 70% ethanol and 96% ethanol and dried. DNA was eluted from the sorbent by incubation in TE buffer for 8-10 min at 50 ° C.
Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ Трис-Cl рН 8.3, 16.6 мМ (NH4)2SO4, 1.5 мМ MgCl2, 0.03%(об/об) Твин 20, 10% (об/об) глицерин, по 10 pmol каждого праймера, по 0.05 мМ каждого их 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, 4 мкл раствора ДНК (10% всей ДНК, выделенной из клеща), 1.5 ед Taq-полимеразы фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск). Амплификацию фрагмента структурной области гена flab проводили под минеральным маслом в пробирках объемом 0,5 мл ('QSP", USA) на многоканальном термоциклере МС2 ("ДНК-технология", Москва) в режиме активного регулирования температуры реакционной смеси в следующих температурно-временных условиях каждого цикла: денатурация ДНК при 94°С 0,4 мин; отжиг праймеров с ДНК при 60°C 0,6 мин; полимеризация цепи ДНК при 72°С 0,6 мин; количество циклов - 30. На 31-ом цикле время отжига и полимеризации составляло 5 мин и 9 мин соответственно.Polymerase chain reaction. PCR was performed in 50 μl of the reaction mixture of the following composition: 67 mM Tris-Cl pH 8.3, 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.5 mM MgCl 2 , 0.03% (v / v) Tween 20, 10% (v / v) glycerol, 10 pmol of each primer, 0.05 mM of each of their 4 deoxynucleoside triphosphates, 4 μl of DNA solution (10% of all DNA extracted from the tick), 1.5 units of Taib polymerase from Sibenzyme (Novosibirsk). A fragment of the structural region of the flab gene was amplified under mineral oil in 0.5 ml tubes ('QSP ", USA) on a MC2 multichannel thermal cycler (DNA technology, Moscow) under active temperature control of the reaction mixture under the following temperature-time conditions each cycle: denaturation of DNA at 94 ° C for 0.4 min; annealing of primers with DNA at 60 ° C for 0.6 min; polymerization of the DNA chain at 72 ° C for 0.6 min; number of cycles - 30. At the 31st cycle, the time annealing and polymerization were 5 min and 9 min, respectively.
Для амплификации полноразмерной структурной области гена CAT использовали ДНК S.aureus шт. Wood 46, выделенную по следующей схеме. Клетки золотистого стафилококка S.aureus выращивают в 1 л культуры (в 4 пробирки, содержащие по 5 мл мясопептонного бульона, засевают клетки S.aureus и инкубируют в условиях аэрации 18 час при 37°С. 20 мл полученной культуры инокулируют в 1 л мясопептонного бульона и инкубируют в условиях аэрации еще 18 час при 37°С). Клетки золотистого стафилококка из 1 л культуры осаждают центрифугированием при 5000 g, 20 мин при 0-4°С и дважды промывают буфером А, содержащим 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 145 мМ NaCl, с помощью центрифугирования клеточной суспензии при 5000g, 15 мин при 0-4°C. Осадок клеток после последней промывки суспендируют в 12,5 мл буфера А и добавляют 1-1,5 мл раствора лизостафина (100 мкг/мл). Суспензию инкубируют 1 час при 37°С. В суспензию вносят ДСН (додецил-сульфат натрия) до конечной концентрации 1% и прогревают 5 мин при 60°С. ДНК депротеинизируют, экстрагируя равным объемом фенола, насыщенного 100 мМ Трис-HCl, рН 8,5, затем дважды экстрагируя смесью фенол-хлороформ (1:1) и дважды хлороформом. ДНК из водной фазы осаждают двумя объемами этанола в присутствии 0,2 М натрия ацетата. Осадок ДНК промывают 70%-м этанолом, подсушивают в вакуумном термостате при 20°С, растворяют в 10 мл ТЕ-буфера (10 мМ Трис - Cl рН 8.0, 1 мМ ЭДТА). К раствору добавляют рибонуклеазу А до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 1 час при 37°С. В инкубационную смесь вносят протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 3 часа при 37°С. ДНК очищают от белка, как описано выше. Заключительную водную фазу, содержащую ДНК, диализуют против 3-х смен ТЕ-буфера (по 300 объемов каждая).For amplification of the full-sized structural region of the CAT gene, S.aureus pc. DNA was used. Wood 46, allocated as follows. Staphylococcus aureus S.aureus cells are grown in 1 L of culture (in 4 tubes containing 5 ml of meat-peptone broth, S.aureus cells are seeded and incubated for 18 hours at 37 ° C. 20 ml of the resulting culture are inoculated in 1 L of meat-peptone broth and incubated under aeration for another 18 hours at 37 ° C). Staphylococcus aureus cells from 1 L of culture are pelleted by centrifugation at 5000 g, 20 min at 0-4 ° C and washed twice with buffer A containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 145 mM NaCl, by centrifuging the cell suspension at 5000 g , 15 min at 0-4 ° C. The cell pellet after the last wash is suspended in 12.5 ml of buffer A and 1-1.5 ml of lysostaphin solution (100 μg / ml) is added. The suspension is incubated for 1 hour at 37 ° C. SDS (sodium dodecyl sulfate) is added to the suspension to a final concentration of 1% and heated for 5 minutes at 60 ° C. DNA is deproteinized by extraction with an equal volume of phenol saturated with 100 mM Tris-HCl, pH 8.5, then extracted twice with phenol-chloroform (1: 1) and twice with chloroform. DNA from the aqueous phase is precipitated with two volumes of ethanol in the presence of 0.2 M sodium acetate. The DNA precipitate is washed with 70% ethanol, dried in a vacuum oven at 20 ° C, dissolved in 10 ml of TE buffer (10 mM Tris - Cl pH 8.0, 1 mM EDTA). Ribonuclease A was added to the solution to a final concentration of 100 μg / ml and incubated for 1 hour at 37 ° C. Proteinase K is added to the incubation mixture to a final concentration of 100 μg / ml and incubated for 3 hours at 37 ° C. DNA is purified from the protein as described above. The final aqueous phase containing DNA is dialyzed against 3 shifts of TE buffer (300 volumes each).
Для ПЦР полноразмерной структурной области гена CAT использовали праймеры PR22 и PR31. Условия проведения амплификации были аналогичны выше описанным для гена flaB, но отжиг праймеров с ДНК проводили при 58°С, а время полимеризации цепи на каждом цикле составляло 1.5 мин.Primers PR22 and PR31 were used for PCR of the full-sized structural region of the CAT gene. The amplification conditions were similar to those described above for the flaB gene, but DNA primers were annealed at 58 ° С, and the chain polymerization time for each cycle was 1.5 min.
Электрофорез ДНК проводили в 5% полиакриламидном или 0.8% агарозном гелях.DNA electrophoresis was performed on 5% polyacrylamide or 0.8% agarose gels.
Выделение фрагментов ДНК из гелей. Фрагменты ДНК размером менее 700 п.о. экстрагировали из вырезанного участка пластины 5% ПААГ при помощи пассивной элюции в 5-10-кратный объем буфера №2 (2 мМ ЕДТА, 10 мМ Трис-Cl рН 8.0, 100 мМ NaCl) в течение 4-6 часов при 65°С с последующей депротеинизацией элюата фенолом и хлороформом. ДНК из водной фазы осаждали 2-мя объемами этанола в присутствии 20 мкг/мл гликогена. В случае разделения фрагментов ДНК в агарозном геле нужный фрагмент ДНК извлекали путем растворения соответствующего участка геля в равном объеме 8М NaClO4. Полученный раствор инкубировали с суспензией силики в течение 30-40 мин на шейкере, после чего силику с сорбированной ДНК осаждали центрифугированием при 2000×g, 1 мин. Осадок силики ресуспендировали в 200 мкл 4М NaClO4, вновь осаждали центрифугированием и повторяли промывку 4М NaClO4 еще раз. Для того чтобы освободиться от NaClO4, осадок «силики» дважды промывали 70% этанолом, затем обезвоживали 96% этанолом и высушивали. Сорбированную на «силике» ДНК элюировали с помощью инкубации на шейкере в 10-50 мкл буфера ТЕ (1 мМ ЕДТА, 10 мМ Трис-Cl рН 8.0) в течение 8-10 мин при 50°С. После удаления силики центрифугированием при 10000g 5 мин в растворе оказывалось около 70% исходной ДНК, не содержащей примесей в виде моно- или олигонуклеотидов.Isolation of DNA fragments from gels. DNA fragments less than 700 bp in size extracted from the cut out portion of the plate with 5% PAG using passive elution into a 5-10-fold volume of buffer No. 2 (2 mm EDTA, 10 mm Tris-Cl pH 8.0, 100 mm NaCl) for 4-6 hours at 65 ° C subsequent deproteinization of the eluate with phenol and chloroform. DNA from the aqueous phase was precipitated with 2 volumes of ethanol in the presence of 20 μg / ml glycogen. In the case of separation of DNA fragments in an agarose gel, the desired DNA fragment was extracted by dissolving the corresponding portion of the gel in an equal volume of 8 M NaClO 4 . The resulting solution was incubated with a suspension of silica for 30-40 min on a shaker, after which silica with sorbed DNA was precipitated by centrifugation at 2000 × g, 1 min. The silica precipitate was resuspended in 200 μl 4M NaClO 4 , again precipitated by centrifugation and washing with 4M NaClO 4 was repeated again. In order to free itself from NaClO 4 , the silica precipitate was washed twice with 70% ethanol, then it was dehydrated with 96% ethanol and dried. Sorbed on "silica" DNA was eluted by incubation on a shaker in 10-50 μl of TE buffer (1 mm EDTA, 10 mm Tris-Cl pH 8.0) for 8-10 min at 50 ° C. After removing the silica by centrifugation at 10,000 g for 5 min, about 70% of the original DNA, containing no impurities in the form of mono- or oligonucleotides, appeared in solution.
Очищенный ампликон фрагмента гена flaB западно-сибирского изолята B.garinii NT29 лигировали с гидролизованной рестриктазой SspI последовательностью полноразмерной структурной области гена CAT. На продуктах лигирования проводили дополнительную ПЦР с использованием праймеров PR22 и PR88, при режиме: денатурация ДНК при 94°С 0,4 мин; отжиг праймеров с ДНК при 58°С 0,6 мин; полимеризация цепи ДНК при 72°С 0,6 мин; количество циклов - 12. Продукт амплификации гидролизовали рестриктазами EcoRI и Есо065I (изошизомер BstEII), очищали с помощью «силики», лигировали с вектором pREB9-6H, предварительно гидролизованным теми же рестриктазами, и получали целевую плазмиду pREB9-H6-F7. Рекомбинантной плазмидой pREB9-H6-F7 трансформируют клетки грамотрицательных бактерий с генотипом RecA+, чувствительных к налидиксовой кислоте (или другому веществу, используемому в качестве индуктора), например штаммы E.coli BL21 или С600, в которых проводят экспрессию рекомбинантного антигена. Синтез целевого белка в клетках определяют методом электрофореза в ПААГ, а его идентификацию проводят с помощью иммуноферментного анализа.The purified amplicon of the flaB gene fragment of the West Siberian isolate B.garinii NT29 was ligated with the hydrolyzed restriction enzyme SspI sequence of the full-length structural region of the CAT gene. On ligation products, additional PCR was performed using primers PR22 and PR88, under the following conditions: DNA denaturation at 94 ° C for 0.4 min; annealing of primers with DNA at 58 ° C for 0.6 min; DNA chain polymerization at 72 ° C for 0.6 min; the number of cycles is 12. The amplification product was hydrolyzed with restriction enzymes EcoRI and Eco065I (BstEII isoschisomer), purified by silica, ligated with pREB9-6H vector previously hydrolyzed with the same restriction enzymes, and the target plasmid pREB9-H6-F7 was obtained. Recombinant plasmid pREB9-H6-F7 transforms gram-negative bacteria cells with the RecA + genotype sensitive to nalidixic acid (or another substance used as an inducer), for example, E. coli BL21 or C600 strains in which recombinant antigen is expressed. The synthesis of the target protein in cells is determined by electrophoresis in SDS page, and its identification is carried out using enzyme immunoassay.
б) Получение плазмиды pREB9-H6-C25b) Obtaining plasmids pREB9-H6-C25
В качестве источника ДНК боррелий служили те же иксодовые клещи вида Ixodes persulcatus, инфицированные B.garinii NT29 и собранные в лесопарковой зоне ННЦ. При клонировании гена ospC использовали те же методики, что и для гена flaB.The same ixodid ticks of the species Ixodes persulcatus infected with B. garinii NT29 and collected in the forest park zone of the NSC served as a source of Borrelia DNA. The ospC gene was cloned using the same techniques as for the flaB gene.
Для амплификации структурной области гена ospC использовали ДНК, выделенную из клещей, инфицированных B.garinii NT29. ПЦР проводили в два раунда. В первом раунде, проведенном с праймерами PR56 и PR57For amplification of the structural region of the ospC gene, DNA isolated from ticks infected with B.garinii NT29 was used. PCR was performed in two rounds. In the first round, held with primers PR56 and PR57
(PR56: 5' ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATATT 3'(PR56: 5 'ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATATT 3'
и PR57 5' TTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC 3') при следующем температурном режиме:and PR57 5 'TTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC 3') under the following temperature conditions:
1) денатурация - 94°С - 0,4 мин; отжиг - 58° - 0,6 мин; полимеризация 72°С - 0,8 мин; - 30 циклов;1) denaturation - 94 ° C - 0.4 min; annealing - 58 ° - 0.6 min; polymerization 72 ° C - 0.8 min; - 30 cycles;
2) денатурация - 94°С - 0,4 мин; отжиг - 58°C - 6 мин; полимеризация 72°С - 8 мин; - 30 циклов; - 31-ый цикл2) denaturation - 94 ° C - 0.4 min; annealing - 58 ° C - 6 min; polymerization 72 ° C - 8 min; - 30 cycles; - 31st cycle
Во втором раунде, состоящем из 8 циклов, в нуклеотидную последовательность ампликона вводили сайты узнавания для рестриктаз EcoRI и Есо065I, проводя ПЦР в присутствии праймеров PR47 и PR48, структура которых приведена ниже:In the second round, consisting of 8 cycles, recognition sites for restriction enzymes EcoRI and Eco065I were introduced into the nucleotide sequence of the amplicon by PCR in the presence of primers PR47 and PR48, the structure of which is shown below:
PR47: (5'-CGGAATTCATGAAAAAGAATACATTAAGTGC-3')PR47: (5'-CG GAATTC ATGAAAAAGAATACATTAAGTGC-3 ')
PR48:(5'-TTGGTGACCAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3').PR48: (5'-TT GGTGACC AGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3 ').
ПЦР проводили при следующем температурном режиме: денатурация - 94°С - 0,4 мин; отжиг - 58°С - 0,6 мин; полимеризация 72°С - 0,8 мин; - 8 циклов.PCR was performed at the following temperature conditions: denaturation - 94 ° C - 0.4 min; annealing - 58 ° C - 0.6 min; polymerization 72 ° C - 0.8 min; - 8 cycles.
Концентрация целевого ампликона после второго раунда составляла около 15 мкг/мл. После второго раунда ПЦР продукт амплификации гидролизовали рестриктазами EcoRI и Есо065I, очищали с помощью «силики» и лигировали с вектором pREB9-6H, предварительно гидролизованным теми же рестриктазами, в результате чего получали целевую плазмиду pREB9-Н6-С25.The concentration of the target amplicon after the second round was about 15 μg / ml. After the second round of PCR, the amplification product was hydrolyzed with restriction enzymes EcoRI and Eco065I, purified using silica and ligated with the vector pREB9-6H previously hydrolyzed with the same restriction enzymes, whereby the target plasmid pREB9-H6-C25 was obtained.
Пример 3. Трансформация клеток Е.coli рекомбинантными плазмидными ДНК.Example 3. Transformation of E. coli cells with recombinant plasmid DNA.
Ночную культуру клеток E.coli шт. С-600 пересаживали в 5 мл среды ЛБ (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, стр.390) и доращивали до оптической плотности (OD595) 0.5-0.8 о.е. Полученную прекультуру пересаживали в 60 мл ЛБ и растили до плотности 0.5-0.6 о.е. Последующие этапы проводили при 4°С. Клетки собирали центрифугированием при 3000×g, 10 мин два раза промывали деионизованной водой, суспендировали в 100 мкл деионизованной воды. В суспензию клеток вносили лигазные смеси, содержащие плазмиды, из примеров 2 (а) и (б) и после пятиминутной инкубации подвергали электропорации. После электропорации трансформированные клетки сразу же переносили в 1.5 мл среды ЛБ, инкубировали 1 час при 37°С и затем концентрировали центрифугированием при 3000×g и высаживали на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей ампициллин в концентрации 150 мкг/мл.Nocturnal cell culture E.coli pcs. S-600 was transplanted into 5 ml of LB medium (Maniatis T. et al. Molecular cloning. M: Mir, 1984, p. 390) and grown to an optical density (OD 595 ) of 0.5-0.8 p.u. The resulting preculture was transplanted into 60 ml of LB and grown to a density of 0.5-0.6 p.u. The subsequent steps were carried out at 4 ° C. Cells were harvested by centrifugation at 3000 × g, washed for 10 minutes with deionized water two times, suspended in 100 μl of deionized water. Ligase mixtures containing plasmids were introduced into the cell suspension from Examples 2 (a) and (b) and, after a five-minute incubation, were subjected to electroporation. After electroporation, transformed cells were immediately transferred to 1.5 ml of LB medium, incubated for 1 hour at 37 ° С and then concentrated by centrifugation at 3000 × g and plated on a Petri dish with agarized LB medium containing 150 μg / ml ampicillin.
Из выросших клонов выделяют плазмидные ДНК pREB9-H6-F7 и pREB9-H6-C25 и подтверждают окончательную структуру путем секвенирования.PREB9-H6-F7 and pREB9-H6-C25 plasmid DNAs were isolated from the grown clones and the final structure was confirmed by sequencing.
Пример 4. Экспрессия рекомбинантного фрагмента флагеллярного белка FlaB и рекомбинантного белка OspC Borrelia garinii в клетках E.coli BL21.Example 4. Expression of a recombinant fragment of the flagellar protein FlaB and recombinant protein OspC Borrelia garinii in E. coli BL21 cells.
Рекомбинантную плазмиду трансформируют в клетки E.coli BL21 (ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ ККМ). Бактериальные клетки культивируют в 5 мл LB-среды, содержащей ампициллин с начальной концентрацией 100 мкг/мл, до плотности 1.5-2.0 оптических единиц при длине волны 600 нм, затем добавляют налидиксовую кислоту до концентрации 50 мкг/мл и продолжают культивирование при интенсивной аэрации в течение 3-4 часов (налидиксовую кислоту можно заменить другим веществом, активирующим SOS-репарацию, например митомицином С). 1 мл клеточной суспензии центрифугируют и клетки ресуспендируют в 200 мкл лизирующего буфера (0.15 М Трис-HCl, рН 6.8, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2% ДСН, 5% глицерин, 0.1% бромфеноловый синий). 10 мкл полученного лизата наносят на 12% ПААГ (полиакриламидный гель) с 0.1% ДСН и проводят электрофорез. Пластину геля обрабатывают в течение 20 минут 10% ТХУ (трихлоруксусная кислота) и помещают на 30 минут в 0.25% раствор Кумасси R-250 в 20% этаноле. Затем выдерживают 1 час в 15% уксусной кислоте. Рекомбинантный белок наблюдается в виде четко выраженной окрашенной полосы размером около 20 кДа для FlaB и около 24 кДа для OspC. Уровень синтеза фрагмента флагеллярного белка В.garinii FlaB в сконструированном штамме Е.coli составляет при плотности культуры 109 клеток/мл около 10 мг/л или 10-15% от общего количества клеточного белка, для OspC соответствующие показатели - 6 мг/л и 8-12%.The recombinant plasmid is transformed into E. coli BL21 cells (SRC WB “Vector” Research Institute of CMC). Bacterial cells are cultured in 5 ml of LB medium containing ampicillin with an initial concentration of 100 μg / ml to a density of 1.5-2.0 optical units at a wavelength of 600 nm, then nalidixic acid is added to a concentration of 50 μg / ml and cultivation is continued under intensive aeration in within 3-4 hours (nalidixic acid can be replaced by another substance that activates SOS repair, for example, mitomycin C). 1 ml of the cell suspension is centrifuged and the cells are resuspended in 200 μl of lysis buffer (0.15 M Tris-HCl, pH 6.8, 10 mM 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 5% glycerol, 0.1% bromphenol blue). 10 μl of the obtained lysate is applied to 12% PAG (polyacrylamide gel) with 0.1% SDS and electrophoresis is carried out. The gel plate is treated for 20 minutes with 10% TCA (trichloroacetic acid) and placed for 30 minutes in a 0.25% solution of Coomassie R-250 in 20% ethanol. Then stand 1 hour in 15% acetic acid. Recombinant protein is observed as a distinct stained band of about 20 kDa for FlaB and about 24 kDa for OspC. The level of synthesis of the B. garinii FlaB flagellar protein fragment in the constructed E. coli strain is about 10 mg / L or 10-15% of the total amount of cell protein at a culture density of 10 9 cells / ml, corresponding values are 6 mg / L for OspC and 8-12%.
Пример 5. Очистка и иммуноферментный анализ очищенных рекомбинантных белков В.garinnii: фрагмента флагеллярного белка FlaB и белка OspC.Example 5. Purification and enzyme immunoassay of purified recombinant B. garinnii proteins: FlaB flagellar protein fragment and OspC protein.
Клетки E.coli шт. BL21, содержащие плазмиду pREB9-H6-F7 или плазмиду pREB9-H6-C25, выращивают в 100 мл LB-среды и индуцируют налидиксовой кислотой, как описано в предыдущем примере. После окончания индукции бактериальные клетки собирают центрифугированием и лизируют в 5 мл 6 М гуанидингидрохлорида. Лизат центрифугируют при 40000×g 30 мин и надосадочную жидкость пропускают через хроматографическую колонку, содержащую аффинный сорбент - Ni2+-NTA-сефарозу 6В. Рекомбинантный белок (FlaB или OspC), содержащий С-концевой 6-ти гистидиновый тракт, остается связанным с сорбентом, в то время как бактериальные белки свободно проходят через колонку. Смыв рекомбинантных белков В.garinii FlaB или OspC осуществляют 0.5 М имидазолом рН 6,8. Выход рекомбинантного белка составляет в среднем 10 мг с одного литра индуцированной культуры клеток E.coli, степень чистоты более 95%.E.coli cells BL21 containing the plasmid pREB9-H6-F7 or the plasmid pREB9-H6-C25 was grown in 100 ml of LB medium and induced with nalidixic acid as described in the previous example. After induction, the bacterial cells are harvested by centrifugation and lysed in 5 ml of 6 M guanidine hydrochloride. The lysate is centrifuged at 40,000 × g for 30 minutes and the supernatant is passed through a chromatographic column containing an affinity sorbent — Ni 2+ -NTA-Sepharose 6B. A recombinant protein (FlaB or OspC) containing a C-
Очищенные антигены наносят на нитроцеллюлозную мембрану и облучают в течение 2-3 минут ультрафиолетом с длиной волны λmax 302 nm. Нитроцеллюлозу с пришитым фрагментом флагеллярного белка В. garinii FlaB или белком OspC помещают на 1 час в физраствор, содержащий 0.2% сухое обезжиренное молоко, затем в физраствор, содержащий 0.1% твин-20 и сыворотку больного Лайм-боррелиозом в разведении от 1:50 до 1:200 и инкубируют 1 час при легком покачивании. Затем промывают физраствором и вносят на один час в физраствор, содержащий конъюгат анитело-пероксидаза хрена против человеческих иммуноглобулинов М. Нитроцеллюлозную полоску промывают водой и помещают в раствор, содержащий 10% этанола, 0.1% Tris-HCl, pH 10.0, 0.05% перекиси водорода и 0.05% 2-хлорнафтола. Рекомбинантный антиген проявляется в виде хорошо окрашенных темных, почти черных пятен.The purified antigens are applied to the nitrocellulose membrane and irradiated for 2-3 minutes with ultraviolet light with a wavelength of λ max 302 nm. Nitrocellulose with an attached fragment of B. garinii FlaB flagellar protein or OspC protein is placed for 1 hour in saline containing 0.2% skimmed milk powder, then in saline containing 0.1% tween-20 and Lyme borreliosis patient serum diluted from 1:50 to 1: 200 and incubated for 1 hour with gentle swaying. It is then washed with saline and added for one hour to saline containing horseradish antibody peroxidase conjugate against human immunoglobulins M. The nitrocellulose strip is washed with water and placed in a solution containing 10% ethanol, 0.1% Tris-HCl, pH 10.0, 0.05% hydrogen peroxide and 0.05% 2-chloronaphthol. Recombinant antigen appears as well-stained dark, almost black spots.
Рекомбинантный фрагмент FlaB специфически связывается с антителами сывороток всех больных Лайм-боррелиозом (были исследованы образцы сывороток от 38 больных Лайм-боррелиозом), но не реагируют с антителами сывороток здоровых лиц (было обследовано 10 человек). Из 8-ми исследованных сывороток больных сифилисом слабый положительный сигнал был получен только с антителами одной сыворотки. На исследованной ограниченной выборке сывороток чувствительность выявления антител к рекомбинантному FlaB составила 100%, специфичность - 97%.The recombinant FlaB fragment specifically binds to the antibodies of the sera of all Lyme borreliosis patients (serum samples from 38 Lyme borreliosis patients were studied), but do not react with the antibodies of the sera of healthy individuals (10 people were examined). Of the 8 studied sera of patients with syphilis, a weak positive signal was obtained only with antibodies of one serum. In the studied limited sample of sera, the sensitivity of detection of antibodies to recombinant FlaB was 100%, specificity was 97%.
Рекомбинантный OspC специфически связывается с антителами сывороток большей части 79% (11 из 14) больных Лайм-боррелиозом, но не реагирует с антителами сывороток здоровых лиц (было обследовано 10 человек) и сыворотками больных сифилисом (было исследовано 8). Чувствительность определения - 79%, специфичность определения - 100%.Recombinant OspC specifically binds to serum antibodies in most of the 79% (11 of 14) patients with Lyme borreliosis, but does not react with antibodies from healthy individuals (10 people were examined) and sera from syphilis patients (8 were studied). The sensitivity of the determination is 79%, the specificity of the determination is 100%.
Перечень нуклеотидных и аминокислотных последовательностей приведен в конце описания.A list of nucleotide and amino acid sequences is given at the end of the description.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003131242/13A RU2260047C2 (en) | 2003-10-23 | 2003-10-23 | Recombinant plasmid dna providing synthesis of borrelia garinii immunodominant protein for lyme-borreliosis diagnosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003131242/13A RU2260047C2 (en) | 2003-10-23 | 2003-10-23 | Recombinant plasmid dna providing synthesis of borrelia garinii immunodominant protein for lyme-borreliosis diagnosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003131242A RU2003131242A (en) | 2005-04-10 |
| RU2260047C2 true RU2260047C2 (en) | 2005-09-10 |
Family
ID=35611526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003131242/13A RU2260047C2 (en) | 2003-10-23 | 2003-10-23 | Recombinant plasmid dna providing synthesis of borrelia garinii immunodominant protein for lyme-borreliosis diagnosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2260047C2 (en) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2395814C1 (en) * | 2009-03-24 | 2010-07-27 | Елена Николаевна Кологривова | Diagnostic technique for tick-borne borreliosis |
| RU2407787C1 (en) * | 2009-08-13 | 2010-12-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Borrelia garinii nt 29 genotype borrelia strain used for borrelia identification and diagnostic product preparation |
| US8268964B2 (en) | 2007-03-26 | 2012-09-18 | Dako Denmark A/S | MHC peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| RU2514230C1 (en) * | 2012-12-14 | 2014-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт биохимии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ биохимии" СО РАМН) | Recombinant chimeric polypeptides, carrying epitopes of various immunodominant proteins of spirochaeta of borrelia burgdorferi sensu lato complex, and serum diagnostic technique for ixodic tick-borne borreliosis |
| RU2549698C2 (en) * | 2009-08-28 | 2015-04-27 | Биомерье | Borrelia hybrid protein, nucleic acid coding this protein, expressing cartridge, vector, method and kit for diagnosing lyme borreliosis, vaccine for borreliosis prevention |
| US9404916B2 (en) | 2008-09-20 | 2016-08-02 | University College Cardiff Consultants Limited | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US10030065B2 (en) | 2007-07-03 | 2018-07-24 | Dako Denmark A/S | MHC multimers, methods for their generation, labeling and use |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10722562B2 (en) | 2008-07-23 | 2020-07-28 | Immudex Aps | Combinatorial analysis and repair |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| US12258373B2 (en) | 2018-12-17 | 2025-03-25 | Immudex Aps | Panel comprising Borrelia MHC multimers |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5618533A (en) * | 1992-02-11 | 1997-04-08 | Yale University | Flagellin-based polypeptides for the diagnosis of lyme disease |
| US5965702A (en) * | 1991-10-21 | 1999-10-12 | Abbott Laboratories | Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof |
| US6464985B1 (en) * | 1998-07-31 | 2002-10-15 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. | Compositions and methods using the borreliacidal epitope(s) of Borrelia burgdorferi outer surface protein C (OspC) for the diagnosis and prevention of lyme disease |
-
2003
- 2003-10-23 RU RU2003131242/13A patent/RU2260047C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965702A (en) * | 1991-10-21 | 1999-10-12 | Abbott Laboratories | Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof |
| US5618533A (en) * | 1992-02-11 | 1997-04-08 | Yale University | Flagellin-based polypeptides for the diagnosis of lyme disease |
| US6464985B1 (en) * | 1998-07-31 | 2002-10-15 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. | Compositions and methods using the borreliacidal epitope(s) of Borrelia burgdorferi outer surface protein C (OspC) for the diagnosis and prevention of lyme disease |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10336808B2 (en) | 2007-03-26 | 2019-07-02 | Dako Denmark A/S | MHC peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| US8268964B2 (en) | 2007-03-26 | 2012-09-18 | Dako Denmark A/S | MHC peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| US10030065B2 (en) | 2007-07-03 | 2018-07-24 | Dako Denmark A/S | MHC multimers, methods for their generation, labeling and use |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| US10722562B2 (en) | 2008-07-23 | 2020-07-28 | Immudex Aps | Combinatorial analysis and repair |
| US9404916B2 (en) | 2008-09-20 | 2016-08-02 | University College Cardiff Consultants Limited | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| RU2395814C1 (en) * | 2009-03-24 | 2010-07-27 | Елена Николаевна Кологривова | Diagnostic technique for tick-borne borreliosis |
| RU2407787C1 (en) * | 2009-08-13 | 2010-12-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Borrelia garinii nt 29 genotype borrelia strain used for borrelia identification and diagnostic product preparation |
| RU2549698C2 (en) * | 2009-08-28 | 2015-04-27 | Биомерье | Borrelia hybrid protein, nucleic acid coding this protein, expressing cartridge, vector, method and kit for diagnosing lyme borreliosis, vaccine for borreliosis prevention |
| RU2514230C1 (en) * | 2012-12-14 | 2014-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт биохимии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ биохимии" СО РАМН) | Recombinant chimeric polypeptides, carrying epitopes of various immunodominant proteins of spirochaeta of borrelia burgdorferi sensu lato complex, and serum diagnostic technique for ixodic tick-borne borreliosis |
| US12258373B2 (en) | 2018-12-17 | 2025-03-25 | Immudex Aps | Panel comprising Borrelia MHC multimers |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003131242A (en) | 2005-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2260047C2 (en) | Recombinant plasmid dna providing synthesis of borrelia garinii immunodominant protein for lyme-borreliosis diagnosis | |
| JPH09224680A (en) | Streptococcus pneumoniae protein structural gene | |
| CN108586618A (en) | A kind of preparation and application of pig epidemic diarrhea subunit vaccine | |
| CN108314710B (en) | Mycoplasma pneumoniae recombinant antigen and application thereof | |
| US6610301B1 (en) | Immunologically active proteins from Borrelia burgdorferi, nucleic acids which encode them, and their use in test kits and as vaccines | |
| CN103819557A (en) | Enterobacter sakazakii OmpA polyclonal antibody and preparation method and application thereof | |
| CN111621506B (en) | Mycoplasma bovis secreted protein MbovP0145 and its application | |
| CN113637056A (en) | A kind of test kit for identifying Brucella bovis and other species of Brucella | |
| CN112538119A (en) | Canine phagocytophilic cell anaplasma P44 recombinant protein and preparation method and application thereof | |
| CN101294154B (en) | Method for producing fasciola gigantica cathepsin L1 | |
| CN111018998B (en) | Lyme recombinant fusion protein OspC-VlsE and application thereof | |
| CN114249819B (en) | Feline panleukopenia virus antibody, kit containing same and application | |
| CN110257405B (en) | Mycoplasma bovis alcohol dehydrogenase gene and encoding protein and application thereof | |
| CN111978410A (en) | Fusion protein of brucella outer membrane protein OMP25 and periplasmic protein BP26 as well as expression and application thereof | |
| CN116462743B (en) | Acinetobacter baumannii translation elongation factor recombinant protein, preparation method and application | |
| RU2514230C1 (en) | Recombinant chimeric polypeptides, carrying epitopes of various immunodominant proteins of spirochaeta of borrelia burgdorferi sensu lato complex, and serum diagnostic technique for ixodic tick-borne borreliosis | |
| CN112521462A (en) | Equine infectious anemia virus p26-gp90 recombinant protein, and preparation method and application thereof | |
| CN116445448B (en) | Acinetobacter baumannii PLPFP recombinant protein, preparation method and application | |
| CN112062858A (en) | Tandem protein for diagnosing alveolar echinococcosis and cloning expression method thereof | |
| CN108624602B (en) | A monoclonal antibody against Nipah virus G protein with blocking activity and its application | |
| CN117659153A (en) | Application of Duncan bar Bei Sichong in serological detection of antigens ExoAg-1200 and ExoAg-2451 | |
| CN102643336A (en) | Avian chlamydophila psittaci outer membrane protein N-PmpD, preparation method and application | |
| CN102887949B (en) | Recombinant human prion protein (hPrP), and preparation method and application thereof | |
| CN112301041A (en) | Mycoplasma bovis P21 protein and application thereof | |
| CN111876438A (en) | Salmonella typhi recombinant fusion protein HlyE-CdtB, coding gene thereof, expression and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20061024 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20070927 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111024 |