RU2110575C1 - Recombinant plasmid dna pro pf5 determining synthesis of capsule antigen fi of plague pathogen and protective antigen of anthrax pathogen and a method of construction of recombinant plasmid dna pro pf5 - Google Patents
Recombinant plasmid dna pro pf5 determining synthesis of capsule antigen fi of plague pathogen and protective antigen of anthrax pathogen and a method of construction of recombinant plasmid dna pro pf5 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2110575C1 RU2110575C1 RU95112629A RU95112629A RU2110575C1 RU 2110575 C1 RU2110575 C1 RU 2110575C1 RU 95112629 A RU95112629 A RU 95112629A RU 95112629 A RU95112629 A RU 95112629A RU 2110575 C1 RU2110575 C1 RU 2110575C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmid dna
- antigen
- pro
- pathogen
- plague
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 title claims abstract description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims abstract 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 17
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 8
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 claims description 3
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010093184 Pesticin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 4
- 102000001324 CD59 Antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108010055167 CD59 Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710132699 Lysozyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 1
- 102100026848 Lysozyme-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- -1 pH 8.0 - 25 mm Chemical compound 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, в частности генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез капсульного антигена (F1-антигена) чумного микроба и протективного антигена (PA) сибиреязвенного микроба (Bacillus anthracis). The invention relates to the field of molecular biology, biotechnology, in particular genetic engineering, and is a recombinant plasmid DNA that determines the synthesis of capsular antigen (F1 antigen) of the plague microbe and protective antigen (PA) of the anthrax microbe (Bacillus anthracis).
Капсульный антиген - основной иммуноген чумного микроба. Известны рекомбинантные ДНК, определяющие синтез FI-антигена. EcoRI фрагмент плазмиды pFra, содержащий fra-оперон, клонирован в составе космиды pHC79 [1]. Capsular antigen is the main immunogen of the plague microbe. Recombinant DNAs are known that determine the synthesis of a FI antigen. An EcoRI fragment of plasmid pFra containing a fra operon was cloned into the cosmid pHC79 [1].
Протективный антиген является основным иммуногеном сибиреязвенного микроба. Ген, кодирующий синтез PA, также клонирован в E.coli в составе вектора pBR322 [2]. Protective antigen is the main immunogen of the anthrax microbe. The gene encoding PA synthesis is also cloned into E. coli as part of the pBR322 vector [2].
Однако в литературе не описано случаев, когда оба этих антигена клонированы в составе одной плазмиды. However, the literature does not describe cases where both of these antigens are cloned into a single plasmid.
Задачей изобретения является получение новой плазмиды, содержащей гены fra-оперона чумного микроба и PA сибиреязвенного микроба. The objective of the invention is to obtain a new plasmid containing genes fra-operon of the plague microbe and PA anthrax microbe.
Задача решается тем, что сконструирована новая рекомбинантная плазмида proPF5, содержащая указанные гены. The problem is solved in that a new recombinant plasmid proPF5 containing the indicated genes was constructed.
Полученная рекомбинантная ДНК при введении ее в аттенуированные штаммы сальмонелл может создать возможность получения бивалентной живой пероральной вакцины против особо опасных инфекций - чумы и сибирской язвы. The resulting recombinant DNA, when introduced into attenuated Salmonella strains, can create the possibility of obtaining a bivalent live oral vaccine against especially dangerous infections - plague and anthrax.
Рекомбинантная плазмида proPF5, размером 20 тпо, кодирующая синтез FI-антигена чумного микроба и PA сибиреязвенного микроба, является неконъюгативной и состоит из ClaI-PstI фрагмента малой плазмиды pPstI чумного микроба размером 3,8 тпо, содержащего ген иммунности к пестицину и область начала репликации, PstI-ClaI фрагмента плазмиды pBR325, размером 2,2 тпо, содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу, Bam HI фрагмента плазмиды pro+, содержащего ген, кодирующий протективный антиген сибиреязвенного микроба размером 6 тпо и EcoRI фрагмента плазмиды pKM1, размером 8 тпо, содержащего fra-оперон чумного микроба. The recombinant proPF5 plasmid, 20 TPO, encoding the synthesis of the plague microbe FI antigen and the anthrax PA, is non-conjugative and consists of the ClaI-PstI fragment of the small plague plasmid pPstI plasmid 3.8 TPO containing the gene for the onset of replicin and pesticin immunity PstI-ClaI fragment of plasmid pBR325, 2.2 TPO, containing the chloramphenicol resistance gene, Bam HI fragment of pro + plasmid, containing the gene encoding the protective antigen of the anthrax microbe of 6 TPO and EcoRI fragment of the plasmid pKM1, 8 TPO, containing the fra operon of the plague microbe.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5. Construction of recombinant plasmid DNA proPF5.
Плазмидную ДНК pro+ гидролизуют рестриктазой BamHI и лигируют с плазмидной ДНК pUC19, также гидролизованной BamHI, затем полученной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM83, подращивают их 1 ч в бульоне LB и высевают на плотную среду МакКонки, содержащую 50 мкг/мл ампициллина. Рекомбинантные клоны, имеющие светлую окраску, анализируют на продукцию протективного антигена в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле с гипериммунной моновалентной сывороткой против РА. Из клонов, продуцирующих РА, щелочным методом выделяют плазмидную ДНК, обозначенную pro19. Затем выделенную плазмидную ДНК pro19 гидролизуют рестриктазой BamHI и лигируют с плазмидной ДНК pP5, гидролизованной рестриктазой BglII. При этом сайты BamHI/BglII ликвидируются. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM83, подращивают 1 ч в бульоне LB и высевают на чашки с L-агаром, содержащим 20 мкг/мл хлорамфеникола. Клоны, резистентные к хлорамфениколу, анализируют на продукцию РА в РДП в геле с гипериммунной сывороткой против РА. Из клонов, продуцирующих РА, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную proP5, и гидролизуют ее рестриктазой PvuII, дающей тупые концы. Plasmid pro + DNA is hydrolyzed with BamHI restriction enzyme and ligated with plasmid DNA pUC19, also hydrolyzed with BamHI, then the competent cells of E. coli strain JM83 are transformed with the resulting mixture, grow them for 1 h in LB broth and plated on dense MacConkey medium containing 50 µg / ml. Recombinant clones with a light color, analyzed for the production of protective antigen in the reaction of diffusion precipitation (RDP) in a gel with hyperimmune monovalent serum against RA. From clones producing RA, plasmid DNA designated pro19 is isolated by the alkaline method. The isolated pro19 plasmid DNA is then hydrolyzed with BamHI restriction enzyme and ligated with pP5 plasmid DNA hydrolyzed with BglII restriction enzyme. At the same time, BamHI / BglII sites are liquidated. The resulting mixture was transformed into competent cells of the E. coli strain JM83, cultivated for 1 h in LB broth and plated on L-agar plates containing 20 μg / ml chloramphenicol. Clones resistant to chloramphenicol are analyzed for RA production in an RPD gel with anti-RA hyperimmune serum. Plasmid DNA designated proP5 is isolated from the clones producing RA and hydrolyzed with restriction enzyme PvuII giving blunt ends.
На следующем этапе плазмидную ДНК pKM1, содержащую fra-оперон, гидролизуют рестриктазой EcoRI, затем, добавив смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, достраивают липкие концы с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Данную инкубационную смесь соединяют с ранее полученным рестриктом proP5/PvuII и лигируют с помощью ДНК-лигазы фага T4. Полученным лигатом трансформируют компетентные клетки штамма E. coli JM83, подращивают 1 ч в бульоне LB и высевают на чашки с L-агаром, содержащим 20 мкг/мл хлорамфеникола. Выросшие клоны, устойчивые к хлорамфениколу, анализируют на продукцию капсульного антигена (F1) чумного микроба в реакции пассивной гемагглютинации с коммерческим эритроцитарным чумным иммуноглобулиновым диагностикумом. Из клонов, продуцирующих FI и РА, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную proPF5. In the next step, plasmid DNA pKM1 containing fra operon is hydrolyzed with restriction enzyme EcoRI, then, adding a mixture of deoxynucleotide triphosphates, the sticky ends are expanded using a maple fragment of DNA polymerase I. This incubation mixture is combined with the previously obtained proP5 / PvuII restriction and ligated with ligases of phage T4. The competent ligand of E. coli strain JM83 is transformed with the obtained ligate, grown for 1 h in LB broth and plated on L-agar plates containing 20 μg / ml chloramphenicol. The grown clones resistant to chloramphenicol are analyzed for the production of the capsule antigen (F1) of the plague microbe in the reaction of passive hemagglutination with a commercial erythrocyte plague immunoglobulin diagnosticum. Plasmid DNA designated proPF5 is isolated from clones producing FI and PA.
Плазмида proPF5 стабильно наследуется в E.coli JM83. После 80 генераций в L-бульоне без селективного давления стабильность была 100%. Plasmid proPF5 is stably inherited in E. coli JM83. After 80 generations in L-broth without selective pressure, the stability was 100%.
На фиг. 1 показана схема конструирования плазмиды proPF5, расположение генов и ее рестрикционная карта для основных рестриктаз; на фиг. 2 показано происхождение фрагментов плазмидной ДНК proPF5. In FIG. 1 shows a design scheme for the proPF5 plasmid, the location of genes and its restriction map for major restriction enzymes; in FIG. 2 shows the origin of proPF5 plasmid DNA fragments.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Способ выделения плазмидной ДНК из бактерий E.coli JM83. Example 1. The method of isolation of plasmid DNA from bacteria E. coli JM83.
Клетки бактерий E.coli JM83, содержащие плазмиду pUC19 (аналогично выделяются все остальные плазмиды, указанные в настоящем изобретении), выращивают в 10 мл L-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, при 30oC до титра 1•109. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4oC), ресуспендируют в 0,5 мл раствора (лизоцим 2 мг/мл, трис-HCl, pH 8,0 - 25 мМ, ЭДТА 10 мМ, глюкоза 50 мМ), выдерживают 5 мин при 0oC. Далее прибавляют 1 мл раствора, содержащего 0,2 н NaOH и 1% додецилсульфата натрия, смесь перемешивают, выдерживают 3 мин во льду и добавляют 0,8 мл раствора ЗМ ацетата калия (pH 4,8), осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости раствора и оставляют на 30 мин во льду. Образовавшийся осадок удаляют из смеси центрифугированием (15000 g, 5 мин, 4oC) и к полученному супернатанту добавляют 1 мл изопропанола, выдерживают 15 мин при комнатной температуре и центрифугируют. Осадок растворяют в 1 мл деионизованной H2O, добавляют 20 мкл 5M NaCl и 2,5 объема этилового спирта, выдерживают 2 ч при 20oC, осадок плазмидной ДНК собирают центрифугированием, промывают его 70%-ным этиловым спиртом и суспендируют в 0,3 мл ТЕ-буфера (трис-HCl 10 мМ, pH 8,0, ЭДТА 1 мМ). Полученные препараты плазмидной ДНК прогревают 5 мин при 68oC и используют для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5.Bacterial cells of E. coli JM83 containing plasmid pUC19 (all other plasmids specified in the present invention are similarly isolated) are grown in 10 ml of L-broth containing 50 μg / ml ampicillin at a temperature of 30 ° C to a titer of 1 · 10 9 . Cells are precipitated by centrifugation (5000 g, 5 min, 4 o C), resuspended in 0.5 ml of solution (lysozyme 2 mg / ml, Tris-HCl, pH 8.0 - 25 mm, EDTA 10 mm, glucose 50 mm) incubated for 5 min at 0 o C. Then add 1 ml of a solution containing 0.2 n NaOH and 1% sodium dodecyl sulfate, the mixture is stirred, incubated for 3 min in ice and add 0.8 ml of a solution of 3M potassium acetate (pH 4.8) , carefully mix until a noticeable decrease in the viscosity of the solution and leave for 30 minutes in ice. The precipitate formed is removed from the mixture by centrifugation (15000 g, 5 min, 4 ° C) and 1 ml of isopropanol is added to the obtained supernatant, incubated for 15 minutes at room temperature and centrifuged. The precipitate was dissolved in 1 ml of deionized H 2 O, add 20 μl of 5M NaCl and 2.5 volumes of ethyl alcohol, incubated for 2 hours at 20 o C, the plasmid DNA precipitate was collected by centrifugation, washed with 70% ethyl alcohol and suspended in 0. 3 ml TE buffer (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM). The resulting plasmid DNA preparations were heated for 5 minutes at 68 ° C and used to construct recombinant plasmid DNA proPF5.
Пример 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5. Example 2. A method of constructing recombinant plasmid DNA proPF5.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5 проводят следующим образом; 0,5 мкг ДНК плазмиды pUC19 и 1,0 мкг ДНК плазмиды pro+ инкубируют с рестриктазой BamHI (5 ед.) в буфере (10 мМ трис-HCl, pH 7,6, 100 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол). После инкубации смесь прогревают при 68oC 10 мин. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле.The construction of recombinant plasmid DNA proPF5 is as follows; 0.5 μg of plasmid pUC19 DNA and 1.0 μg of pro + plasmid DNA were incubated with BamHI restriction enzyme (5 units) in buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 100 mM MgCl 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol). After incubation, the mixture is heated at 68 ° C. for 10 minutes. Analysis of the completeness of hydrolysis is carried out using electrophoresis in a 0.7% agarose gel.
Соединение фрагментов ДНК проводят в том же буфере с добавлением АТФ и дитиотреитола до конечной концентрации 0,5 мМ и 5 мМ соответственно и 0,2 ед. ДНК-лигазы фага T4. Лигирование проводят в течение 12 ч при 6oC. Полученную после лигирования смесь используют для трансформации клеток E. coli JM83.The combination of DNA fragments is carried out in the same buffer with the addition of ATP and dithiothreitol to a final concentration of 0.5 mm and 5 mm, respectively, and 0.2 units Phage T4 DNA ligases. Ligation is carried out for 12 hours at 6 ° C. The mixture obtained after ligation is used to transform E. coli JM83 cells.
Трансформацию проводят следующим образом: 1 мл ночной культуры E.coli JM83 вносят в 100 мл L-бульона, подращивают на качалке в течение 40 мин при 37oC. Клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, 0oC), промывают равным объемом стерильного физраствора (0oC), суспендируют в 50 мл 0,1 М раствора CaCl2 (0oC) и выдерживают во льду 1 ч. Клетки повторно центрифугируют (5000 g, 10 мин, 0oC), затем ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl2 (0oC), выдерживают ночь во льду, добавляют равный объем 20%-ного стерильного глицерина (0oC), разливают по 200 мкл в промороженные эппендорфы, помещают их на -70oC и эти аликвоты компетентных клеток используют для трансформации. В 200 мкл размороженных компетентных клеток добавляют ДНК и выдерживают 30 мин при 0oC, затем 2 мин при 42oC, добавляют 0,8 мл L-бульона, подращивают 1 ч при 37oC и высевают на плотную среду МакКонки, содержащую 50 мкг/мл ампициллина. Трансформанты выращивают при 37oC в течение 18 ч, отбирают светлые колонии и анализируют их на продукцию PA в РДП в геле (0,15 М NaCl, 10 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 8,3, 1% агар Дифко), которую проводят следующим образом: в геле делают три лунки, расположенные на равном расстоянии друг от друга (0,5 см), в одну из них вносят раствор РА (40 мкг), в другую - коммерческую моновалентную сыворотку против протективного антигена, в третью - лизированные клетки исследуемых клонов E. coli JM83. Лизирующая смесь имеет следующий состав: 1% тритон X-100, 20 мМ ЭДТА, 0,5 мг/мл лизоцим. После лизина клеток вносим 3 мкл ДНКазы (5 мг/мл), содержащей 60 мМ MgCl2.The transformation is carried out as follows: 1 ml of an overnight culture of E. coli JM83 is added to 100 ml of L-broth, grown on a rocking chair for 40 min at 37 o C. Cells are harvested by centrifugation (5000 g, 10 min, 0 o C), washed with volume of sterile saline solution (0 o C), suspended in 50 ml of 0.1 M CaCl 2 solution (0 o C) and kept in ice for 1 h. Cells are re-centrifuged (5000 g, 10 min, 0 o C), then resuspended in 3 ml of 0.1 M CaCl 2 (0 o C), incubated overnight in ice, add an equal volume of 20% sterile glycerol (0 o C), pour 200 μl into frozen eppendorfs, place them on a -70 o C and these aliquots of competent cells are used for transformation. DNA was added to 200 μl of thawed competent cells for 30 min at 0 ° C, then 2 min at 42 ° C, 0.8 ml of L-broth was added, grown for 1 h at 37 ° C and plated on a dense MacConkey medium containing 50 μg / ml ampicillin. Transformants were grown at 37 o C for 18 h, light colonies were selected and analyzed for PA production in RDP in gel (0.15 M NaCl, 10 mm sodium phosphate buffer, pH 8.3, 1% Difco agar), which carried out as follows: in the gel make three wells located at an equal distance from each other (0.5 cm), in one of them make a solution of RA (40 μg), in the other - commercial monovalent serum against a protective antigen, in the third - lysed cells of the studied E. coli JM83 clones. The lysing mixture has the following composition: 1% Triton X-100, 20 mM EDTA, 0.5 mg / ml lysozyme. After the lysine of the cells, we add 3 μl of DNase (5 mg / ml) containing 60 mM MgCl 2 .
Гель с образцами оставляют при комнатной температуре во влажной камере на ночь. Клоны, продуцирующие РА, образуют полосу преципитации, сливающуюся с контрольной. The gel with the samples is left at room temperature in a humid chamber overnight. Clones producing RA form a precipitation band that merges with the control.
Из отобранных клонов, продуцирующих РА, выделяют плазмидную ДНК pro19, проводят гидролиз 1 мкг этой плазмидной ДНК рестриктазой BamHI (5 ед.) в условиях, описанных выше, и лигируют с 0,5 мкг векторной плазмидной ДНК pP5, гидролизованной рестриктазой BglII (5 ед.) в буфере (10 мМ трис-HCl, pH 7,6, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол), предварительно прогрев реакционные смеси 10 мин при 68oC. Лигирование проводят, как описано выше. Полученную лигирующую смесь используют для трансформации компетентных клеток E. coli JM83. Трансформацию проводят, как описано выше, только после подращивания клетки высевают на чашки с L-агаром, содержащим 20 мкг/мл хлорамфиникола и выращивают 18 ч при 37oC. Выросшие клоны анализируют на продукцию РА в РДП, как описано выше. Из клонов, продуцирующих РА, выделяют плазмидную ДНК pro5 описанным выше способом, и используют ее в качестве вектора, предварительно гидролизовав 0,5 мкг плазмидной ДНК proP5 5 ед. рестриктазы PvuII в буфере (10 мМ трис-HCl, pH 7,6, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол) в течение 1 ч при 37oC и прогреве 10 мин при 68oC. 1 мкг Плазмидной ДНК pKM1 гидролизуют 5 ед. рестриктазы EcoRI в буфере (50 мМ трис-HCl, pH 7,6, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол) 1 ч при 37oC, после этого в инкубационную смесь вносят по 1 мкл 2 мМ раствора всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli и инкубируют смесь 10 мин при комнатной температуре, затем ее прогревают 10 мин при 68oC. После прогрева инкубационную смесь соединяют с плазмидной ДНК proP5, гидролизованной рестриктазой PvuII, добавляют дитиотрейтол до конечной концентрации 5 мМ, 1 мМ АТФ, 1 ед. ДНК - лигазы фага T4 и инкубируют 12 ч при 6oC. Полученным лигатом трансформируют компетентные клетки E. coli JM83 описанным выше способом, высевая клетки на чашки с L-агаром, содержащим 200 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивают 18 ч при температуре 37oC. Выросшие клоны анализируют на продукцию FI-антигена чумного микроба в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с коммерческим эритроцитарным иммуноглобулиновым диагностикумом. РПГА проводят следующим образом: в 8 лунок микротитровальной пластинки вносят по 50 мкл раствора твина 80 1 : 50 тыс. Затем в первую луночку вливают 50 мкл суспензии клеток исследуемого клона, выращенного при 37oC, и титруют по 50 мкл. Таким образом получают ряд двукратных последовательных разведений. Затем во все луночки добавляют по 25 мкг диагностикума чумного эритроцитарного иммуноглобулинового 0,6% концентрации и пластинки ставят в термостат на 37oC. Через 30 мин учитывают результат. Его считают положительным при равномерном выпадении эритроцитов на дно лунок. Клоны, продуцирующие капсульный антиген, тестируют повторно на продукцию РА, как описано выше.Plasmid pro19 DNA was isolated from the selected RA producing clones, 1 μg of this plasmid DNA was digested with BamHI restriction enzyme (5 units) under the conditions described above, and ligated with 0.5 μg of pP5 vector plasmid DNA hydrolyzed with BglII restriction enzyme (5 units) .) in buffer (10 mm Tris-HCl, pH 7.6, 100 mm NaCl, 10 mm MgCl 2 , 1 mm 2-mercaptoethanol), pre-heating the reaction mixture for 10 minutes at 68 o C. Ligation is carried out as described above. The resulting ligation mixture was used to transform competent E. coli JM83 cells. The transformation is carried out as described above, only after growing, the cells are seeded on plates with L-agar containing 20 μg / ml chloramphenicol and grown for 18 hours at 37 o C. The grown clones are analyzed for RA production in RDP, as described above. From the clones producing RA, the pro5 plasmid DNA was isolated as described above, and it was used as a vector after preliminary hydrolysis of 0.5 μg of the plasmid proP5 DNA 5 units. PvuII restriction enzymes in buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol) for 1 h at 37 ° C and heating for 10 minutes at 68 ° C. 1 μg Plasmid DNA pKM1 hydrolyzed 5 units EcoRI restriction enzymes in buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol) 1 h at 37 ° C, after which 1 μl of a 2 mM solution are added to the incubation mixture all four deoxynucleotide triphosphates, 1 unit of the Klenov fragment of E. coli DNA polymerase I and the mixture is incubated for 10 min at room temperature, then it is heated for 10 min at 68 ° C. After heating, the incubation mixture is combined with the plasmid proP5 hydrolyzed by PvuII restriction enzyme, dithiothreitol is added to a final concentration of 5 mM, 1 mm ATP, 1 unit Phage T4 DNA ligases were incubated for 12 h at 6 ° C. The competent ligates of E. coli JM83 were transformed using the ligate as described above, plating cells on L-agar plates containing 200 μg / ml chloramphenicol and growing for 18 h at 37 o C. The grown clones are analyzed for the production of the plague microbe FI antigen in a passive hemagglutination reaction (RPHA) with a commercial red blood cell immunoglobulin diagnosticum. RPGA is carried out as follows: 50 μl of a solution of tween 80 1: 50 thousand are added to 8 wells of a microtiter plate. Then, 50 μl of a suspension of cells of the test clone grown at 37 ° C are poured into the first well and titrated with 50 μl. Thus, a series of double serial dilutions are obtained. Then, 25 μg of the plague erythrocyte immunoglobulin diagnosticum of 0.6% concentration is added to all the wells and the plates are placed in a thermostat at 37 ° C. After 30 minutes, the result is taken into account. It is considered positive with a uniform loss of red blood cells to the bottom of the holes. Clones producing the capsular antigen are retested for RA production as described above.
Источники информации. Sources of information.
1. Galyov E.E., Smirnov O.Ju., Karlishev A.V., Volkovoy K.J., Denesyuk A.J., Nazimov J.V., Rubtsov K.S., Abramov V.M., Dalvadyanz S.M., Zavyalov V. P. Nucleotide sequence of the Jersinia pestis gene encoding FI antigen and the primary structure of the protein. FEBS Lett., 1990, v. 277, N 1,2, p. 230 - 232. 1. Galyov EE, Smirnov O.Ju., Karlishev AV, Volkovoy KJ, Denesyuk AJ, Nazimov JV, Rubtsov KS, Abramov VM, Dalvadyanz SM, Zavyalov VP Nucleotide sequence of the Jersinia pestis gene encoding FI antigen and the primary structure of the protein. FEBS Lett., 1990, v. 277, N 1,2, p. 230 - 232.
2. Vodkin M.H., Leppla S.H., Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis. Cell, 1983, v. 34, p. 693 - 697. 2. Vodkin M.H., Leppla S.H., Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis. Cell, 1983, v. 34, p. 693 - 697.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95112629A RU2110575C1 (en) | 1995-07-19 | 1995-07-19 | Recombinant plasmid dna pro pf5 determining synthesis of capsule antigen fi of plague pathogen and protective antigen of anthrax pathogen and a method of construction of recombinant plasmid dna pro pf5 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95112629A RU2110575C1 (en) | 1995-07-19 | 1995-07-19 | Recombinant plasmid dna pro pf5 determining synthesis of capsule antigen fi of plague pathogen and protective antigen of anthrax pathogen and a method of construction of recombinant plasmid dna pro pf5 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU95112629A RU95112629A (en) | 1998-02-27 |
| RU2110575C1 true RU2110575C1 (en) | 1998-05-10 |
Family
ID=20170356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95112629A RU2110575C1 (en) | 1995-07-19 | 1995-07-19 | Recombinant plasmid dna pro pf5 determining synthesis of capsule antigen fi of plague pathogen and protective antigen of anthrax pathogen and a method of construction of recombinant plasmid dna pro pf5 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2110575C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2385348C2 (en) * | 2000-07-08 | 2010-03-27 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс Дстл | Expressing system |
-
1995
- 1995-07-19 RU RU95112629A patent/RU2110575C1/en active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2385348C2 (en) * | 2000-07-08 | 2010-03-27 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс Дстл | Expressing system |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Berger et al. | Cloning of the chromosomal determinants encoding hemolysin production and mannose-resistant hemagglutination in Escherichia coli | |
| Holt et al. | Streptococcus mutans genes that code for extracellular proteins in Escherichia coli K-12 | |
| US4617266A (en) | Production of Protein A | |
| Anderson et al. | Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding the structural subunit of Bacteroides nodosus fimbriae | |
| JPH10304876A (en) | Improved recombinant dna molecule | |
| JPH0759192B2 (en) | A method for stabilizing unstablely inherited plasmids. | |
| CN106190938A (en) | The recombination bacillus coli of a kind of structure and the method for biosynthesis 3 ' saliva lactose | |
| CN104212830B (en) | A kind of bacillus subtilis Self-controlled expression system and construction method thereof and application | |
| Rhen et al. | Transcriptional regulation of Salmonella enterica virulence plasmid genes in cultured macrophages | |
| CN104498418B (en) | A kind of gene regulation delay attenuation and the construction method for improving expression exogenous antigen Salmonella choleraesuls carrier | |
| CN112592881A (en) | Engineering bacillus subtilis for high-efficiency exogenous protein expression and high-density culture | |
| CN109022476A (en) | A kind of bacillus licheniformis CRISPR-Cas9 gene editing system and its application | |
| Oropeza et al. | Negative and positive regulation of the non‐osmoregulated ompS1 porin gene in Salmonella typhi: a novel regulatory mechanism that involves OmpR | |
| Johnson et al. | Characterization of Pseudomonas aeruginosa mutants with altered piliation | |
| KR910001807B1 (en) | Recombinant dna and coliform bacillus having genetic material for the production of staphylokinase and the production of staphylokinase | |
| RU2110575C1 (en) | Recombinant plasmid dna pro pf5 determining synthesis of capsule antigen fi of plague pathogen and protective antigen of anthrax pathogen and a method of construction of recombinant plasmid dna pro pf5 | |
| CN104894045B (en) | A kind of recombinant Lactobacillus and its preparation method and application of coexpression VP 1 Gene of Foot-and-Mouth Disease virus and immunologic adjuvant ox IL-6 genes | |
| US4595660A (en) | Molecular cloning with bifunctional plasmid vectors in Bacillus subtilis, mutants and substantially stably transformed mutants of Bacillus subtilis, and methods for utilizing the transformed mutants | |
| TWI221854B (en) | Lac shuttle vectors, kit for expression of a heterologous gene and DNA vaccine carrier containing the same | |
| CN113881619B (en) | Recombinant escherichia coli capable of synthesizing pertussis oligosaccharide antigen | |
| CN118530963A (en) | A method for efficiently synthesizing β-nicotinamide riboside in vitro and its application | |
| CN103740632B (en) | One strain recombination bacillus coli and the application in the N-glucoprotein vaccine of the anti-O157:H7 of preparation thereof | |
| Li et al. | VirB11, a traffic ATPase, mediated flagella assembly and type IV pilus morphogenesis to control the motility and virulence of Xanthomonas albilineans | |
| CN114591995A (en) | Recombinant bovine ephemeral fever virus glycoprotein lactococcus lactis vector and construction method and application thereof | |
| EP0565548B1 (en) | Two-phase system for the production and presentation of foreign antigens in hybrid live vaccines |