RU2180352C2 - VIRAL GENOME FRAGMENT OF CHICKEN K STRAIN VARIOLA WHICH CONTAINS THYMIDINE KINASE GENE, pTK1FPV AND pTK2FPV RECOMBINANT PLASMID DNAs WHICH CONTAIN THIS SEQUENCE, AND pINTFPV1 RECOMBINANT PLASMID DNA WHICH IS ABLE TO INTEGRATE INTO VIRAL GENOME OF CHICKEN VARIOLA - Google Patents
VIRAL GENOME FRAGMENT OF CHICKEN K STRAIN VARIOLA WHICH CONTAINS THYMIDINE KINASE GENE, pTK1FPV AND pTK2FPV RECOMBINANT PLASMID DNAs WHICH CONTAIN THIS SEQUENCE, AND pINTFPV1 RECOMBINANT PLASMID DNA WHICH IS ABLE TO INTEGRATE INTO VIRAL GENOME OF CHICKEN VARIOLA Download PDFInfo
- Publication number
- RU2180352C2 RU2180352C2 RU99124650A RU99124650A RU2180352C2 RU 2180352 C2 RU2180352 C2 RU 2180352C2 RU 99124650 A RU99124650 A RU 99124650A RU 99124650 A RU99124650 A RU 99124650A RU 2180352 C2 RU2180352 C2 RU 2180352C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fragment
- chicken
- plasmid
- gene
- sali
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 22
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 title claims description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title abstract description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title abstract description 8
- 208000001203 Smallpox Diseases 0.000 title abstract 3
- 241000870995 Variola Species 0.000 title abstract 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 54
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 claims description 47
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 claims description 47
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 17
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 108010088237 ATCGAT-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 abstract description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 0 *=*NC1=*C1 Chemical compound *=*NC1=*C1 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000700667 Pigeonpox virus Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 101900209501 Vaccinia virus Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, ветеринарии и медицине, и представляет собой: последовательность ДНК, несущественную для репликации вируса и содержащую ген тимидинкиназы (ТК-ген), из генома вируса оспы кур штамма "К", и имеющую первичную нуклеотидную последовательность, приведенную ниже; рекомбинантные плазмидные ДНК pTKlFPV и pTK2FPV, содержащие полученную последовательность ДНК; рекомбинантный плазмидный вектор pINTFPVl, обладающий способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур. The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, veterinary medicine and medicine, and is: a DNA sequence that is not essential for virus replication and containing the thymidine kinase gene (TK gene) from the chickenpox virus genome of strain “K” and having a primary nucleotide the sequence below; recombinant plasmid DNA pTKlFPV and pTK2FPV containing the obtained DNA sequence; pINTFPVl recombinant plasmid vector with the ability to integrate into the chickenpox virus genome.
Вирус оспы кур является представителем рода Avipoxvirus семейства Poxviridae. Оспа кур, заболевание вызываемое вирусом оспы кур, является высококонтагиозным заболеванием кур. Распространена болезнь повсеместно. Экономический ущерб заключается в резком и продолжительном снижении яйценоскости, вынужденном убое больных и переболевших птиц. Для специфической профилактики оспы кур используют живые вакцины двух типов, приготовленные из аттенуированных иммунногенных и ареактогенных штаммов гетерологичного вируса оспы голубей или вируса оспы кур [1]. The chicken pox virus is a member of the Avipoxvirus genus of the Poxviridae family. Chicken pox, a disease caused by the chicken pox virus, is a highly contagious chicken disease. The disease is widespread everywhere. Economic damage consists in a sharp and prolonged decrease in egg production, forced slaughter of sick and ill birds. For specific prevention of chicken pox, two types of live vaccines are used, prepared from attenuated immunogenic and areactogenic strains of the heterologous pigeon pox virus or chicken pox virus [1].
Авипоксвирусы обладают многими свойствами, характерными для всех поксвирусов: геном состоит из линейной двухспиральной ДНК размером до 300 kb, репликация вируса происходит в цитоплазме инфицированных клеток, вирионы обладают неикосаэдрической морфологией [2]. В отличие от других поксвирусов авипоксвирусы обладают узким кругом хозяев: продуктивная инфекция происходит только в организме птиц или в культурах клеток, полученных из тканей птиц. Попытки получить продуктивную инфекцию авипоксвирусов в организме млекопитающих или в культурах клеток млекопитающих не увенчались успехом [3]. Из других свойств авипоксвирусов следует также отметить термоустойчивость и простоту наработки [1]. Avipoxviruses possess many properties characteristic of all poxviruses: the genome consists of linear double-stranded DNA up to 300 kb in size, virus replication occurs in the cytoplasm of infected cells, and virions have a non-icosahedral morphology [2]. Unlike other poxviruses, avipoxviruses have a narrow host range: productive infection occurs only in birds or in cell cultures derived from bird tissues. Attempts to obtain a productive infection of avipoxviruses in the mammalian organism or in mammalian cell cultures were unsuccessful [3]. Of the other properties of avipoxviruses, it should also be noted the thermal stability and ease of operation [1].
Стратегия получения рекомбинантных авипоксвирусов основана на подходе, хорошо зарекомендовавшего себя при получении рекомбинантных вирусов осповакцины. Суть данного подхода заключается в том, что на первом этапе конструируют гибридную плазмиду, содержащую гетерологичный ген, фланкированный последовательностями ДНК вируса осповакцины из несущественной области вирусного генома. Полученную плазмиду используют для введения в клетки, инфицированные вирусом осповакцины. За счет рекомбинации по областям гомологии происходит встройка чужеродной последовательности в геном вируса. Затем определенным образом в популяции вирусного потомства можно выявить гибридные вирусы [4]. The strategy for producing recombinant avipoxviruses is based on an approach that has proven itself in the production of recombinant vaccinia viruses. The essence of this approach is that at the first stage, a hybrid plasmid is constructed containing a heterologous gene flanked by the vaccinia virus DNA sequences from an inessential region of the viral genome. The resulting plasmid is used to introduce vaccinia virus-infected cells. Due to recombination in homology regions, the insertion of a foreign sequence into the virus genome takes place. Then, in a certain way, hybrid viruses can be detected in the population of viral offspring [4].
Известно несколько районов в составе генома авипоксвирусов, пригодных для интеграции чужеродных генов: ген тимидинкиназы [5], район терминальных инвертированных повторов [6], район, гомологичный гену тимидинкиназы вируса осповакцины [7]. Самым распространенным способом отбора рекомбинантных авипоксвирусов является использование гена β-галактозидазы E.coli, что позволяет быстро идентифицировать рекомбинанты, используя хромогенный субстрат. Одной из наиболее распространенных конструкций для плазмиды интеграции является конструкция, предложенная в работе [7]. Особенностью этой конструкции является наличие двух противоположно направленных промоторных элементов внутри фланкирующих последовательностей. Причем под контролем одного из промоторов находится ген β-галактозидазы, что позволяет легко и быстро идентифицировать полученные вирусные рекомбинанты, а под контролем второго промотора находится исследуемый чужеродный ген. Several regions are known in the avipoxvirus genome suitable for integration of foreign genes: the thymidine kinase gene [5], the region of terminal inverted repeats [6], and the region homologous to the vaccinia virus thymidine kinase gene [7]. The most common method for selecting recombinant avipoxviruses is the use of the E. coli β-galactosidase gene, which makes it possible to quickly identify recombinants using a chromogenic substrate. One of the most common constructs for plasmid integration is the design proposed in [7]. A feature of this design is the presence of two oppositely directed promoter elements within the flanking sequences. Moreover, the β-galactosidase gene is under the control of one of the promoters, which makes it possible to quickly and easily identify the resulting viral recombinants, and the foreign gene under study is controlled by the second promoter.
В конце 80-х годов начались работы по получению рекомбинантных авипоксвирусов. В первую очередь были получены рекомбинантные вирусы оспы кур, содержащие гены вирусов, представляющих интерес для птицеводства: вируса болезни Марека [8, 9], вируса болезни Ньюкастла [6], вируса болезни Гамборо [10] и др. В опытах на птицах полученные рекомбинанты показали хорошие иммуннопротективные свойства, сравнимые с действием имеющихся коммерческих вакцин. В работе [3] было проведено сравнение использования рекомбинантных и имеющихся коммерческих вакцин и сделан вывод, что наилучший эффект дает комбинированное использование обоих типов вакцин. В этой работе также сделан вывод о необходимости получения рекомбинантных вирусов оспы кур, содержащих в своем геноме гены двух и более вирусов, то есть прототипов поливалентных вакцин. In the late 80s, work began on the production of recombinant avipoxviruses. First of all, recombinant chicken pox viruses were obtained containing the genes of viruses of interest to poultry: Marek's disease virus [8, 9], Newcastle disease virus [6], Gumboro disease virus [10] and others. Recombinants obtained in experiments on birds showed good immunoprotective properties comparable to the effects of existing commercial vaccines. In [3], the use of recombinant and available commercial vaccines was compared and it was concluded that the combined effect of both types of vaccines gives the best effect. This work also concluded that it is necessary to obtain recombinant chicken pox viruses that contain genes of two or more viruses, that is, prototypes of polyvalent vaccines.
Практически одновременно были начаты работы по получению рекомбинантных авипоксвирусов, содержащих в своем геноме гены вирусов, вызывающих заболевания у млекопитающих и человека. Были получены рекомбинантные вирусы оспы кур, содержащие в своем геноме гены вирусов бешенства и кори, показавшие хорошие протективные свойства в опытах на мышах и крысах [11 - 13]. В работе [14] было показано, что рекомбинанты, полученные на основе вируса оспы канареек, более эффективны в опытах на животных, чем аналогичные рекомбинанты, полученные на основе вируса оспы кур. Впоследствии все исследования по получению и изучению свойств рекомбинантных авипоксвирусов в экспериментах на млекопитающих проводятся с использованием вируса оспы канареек в качестве вирусного вектора. Из последних работ можно отметить работу, в которой показано успешное применение рекомбинантных авипоксвирусов при вакцинации против чумы плотоядных в опытах на собаках [15]. Представляют интерес работы, в которых сообщается об использовании рекомбинантных авипоксвирусов в иммуннотерапии бешенства [16], рака [17], СПИДа [18], а также в качестве продуцентов интерлейкина, интерферона, фактора некроза опухолей [19]. Этот краткий литературный обзор позволяет сделать вывод, что использование рекомбинантных авипоксвирусов может найти применение в птицеводстве, ветеринарии и медицине. Almost simultaneously, work was begun on the production of recombinant avipoxviruses containing the genes of viruses causing diseases in mammals and humans in their genome. Recombinant chicken pox viruses were obtained, containing genes for rabies and measles viruses in their genome, which showed good protective properties in experiments on mice and rats [11–13]. It was shown in [14] that recombinants obtained on the basis of canary pox virus are more effective in animal experiments than similar recombinants obtained on the basis of chicken pox virus. Subsequently, all studies on the preparation and study of the properties of recombinant avipoxviruses in mammalian experiments are carried out using the canary pox virus as a viral vector. Of recent works, one can note the work in which the successful use of recombinant avipoxviruses in vaccination against carnivore plague in experiments on dogs has been shown [15]. Of interest are studies that report the use of recombinant avipoxviruses in the immunotherapy of rabies [16], cancer [17], AIDS [18], as well as producers of interleukin, interferon, and tumor necrosis factor [19]. This brief literature review allows us to conclude that the use of recombinant avipoxviruses may find application in poultry, veterinary medicine and medicine.
В России до настоящего времени не проводились какие-либо исследования, связанные с получением и изучением рекомбинантных авипоксвирусов отечественных штаммов. So far, no studies have been conducted in Russia related to the production and study of recombinant avipoxviruses of domestic strains.
Технической задачей изобретения является конструирование вирусного вектора интеграции на основе вируса оспы кур штамма "К", используемого в России для специфической профилактики оспы кур, с целью создания поливалентных вакцин для птицеводства, а также в ветеринарии и медицине в качестве эффективного эукариотеческого вектора. An object of the invention is the construction of a viral integration vector based on the chicken pox virus strain K, used in Russia for the specific prevention of chicken pox, in order to create polyvalent vaccines for poultry farming, as well as in veterinary medicine and medicine as an effective eukaryotic vector.
Поставленная задача решается путем амплифицирования и клонирования фрагмента генома вируса оспы кур штамма "К", несущественного для репликации вируса и содержащего ТК-ген, и конструирования на его основе плазмидного вектора, обладающего способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур. The problem is solved by amplifying and cloning a fragment of the genome of chicken pox virus strain K, which is not essential for virus replication and containing the TK gene, and constructing a plasmid vector based on it that is able to integrate into the chickenpox virus genome.
Для этого: 1. Выделяют геномную ДНК из вируса оспы кур штамма "К". 2. Методом ПЦР получают последовательность ДНК, содержащую ТК-ген и несущественную для репликации вируса, используя специфические праймеры. 3. Используя полученную последовательность ДНК, с помощью генно-инженерных манипуляций получают рекомбинантные плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV, содержащие полученную последовательность ДНК в виде двух примерно одинакового размера фрагментов, содержащих 5'- и 3'-концевые части ТК-гена с прилегающими участками генома вируса оспы кур. 4. Определяют первичную нуклеотидную последовательность полученной последовательности ДНК, используя плазмидные ДНК pTKlFPV и pTK2FPV. 5. Получают плазмидный вектор pINTFPVl при помощи генно-инженерных манипуляций, используя плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV и другие вспомогательные плазмиды. 6. Проводят трансфекцию плазмидным вектором pINTFPVl культуры клеток фибробластов эмбрионов кур, зараженных вирусом оспы кур штамма "К". Используя хромогенный субстрат X-gal, из вирусной популяции выделяют рекомбинантные вирусы. To do this: 1. Genomic DNA is isolated from the chicken pox virus of strain "K". 2. Using the PCR method, a DNA sequence is obtained that contains the TK gene and is not essential for virus replication using specific primers. 3. Using the obtained DNA sequence, using genetic engineering manipulations, recombinant plasmids pTKlFPV and pTK2FPV are obtained containing the obtained DNA sequence in the form of two approximately equal sized fragments containing the 5'- and 3'-terminal parts of the TK gene with adjacent parts of the virus genome smallpox chickens. 4. The primary nucleotide sequence of the obtained DNA sequence is determined using the plasmid DNA pTKlFPV and pTK2FPV. 5. Get the plasmid vector pINTFPVl using genetic engineering manipulations using plasmids pTKlFPV and pTK2FPV and other auxiliary plasmids. 6. Transfection with the plasmid vector pINTFPVl of the fibroblast cell culture of chicken embryos infected with chicken pox virus strain K is carried out. Using the X-gal chromogenic substrate, recombinant viruses are isolated from the viral population.
Сущность предлагаемых объектов изобретения состоит в следующем:
1. Последовательность ДНК, несущественная для репликации вируса и содержащая ТК-ген, из генома вируса оспы кур штамма "К" имеет первичную нуклеотидную структуру, приведенную на фиг.3. Она получена из генома вируса оспы кур штамма "К" посредством генной амплификации с помощью полимеразной цепной реакции, в которой использовались 4 синтетических одигонуклеотида, обозначенные как ТК11, ТК12, ТК21, ТК22 и имеющие следующие последовательности:
ТК11 - 5 AAGCTTCGCCACGTTATTCGAA - 3;
ТК12 - 5 GCGTGAAATGCTATGTCGACG - 3;
ТК21 - 5 ACTCGTTTAGAAATCGATGCGTC - 3;
ТК22 - 5 GCCAAGTACGCGCGATAAAG - 3.The essence of the proposed objects of the invention is as follows:
1. The DNA sequence, which is not essential for the replication of the virus and contains the TK gene, from the genome of the chicken pox virus strain K has the primary nucleotide structure shown in Fig.3. It was obtained from the chickenpox virus genome of strain K through gene amplification using a polymerase chain reaction, in which 4 synthetic odigonucleotides were used, designated as TK11, TK12, TK21, TK22 and having the following sequences:
TK11 - 5 AAGCTTCGCCACGTTATTCGAA - 3;
TK12 - 5 GCGTGAAATGCTATGTCGACG - 3;
TK21 - 5 ACTCGTTTAGAAATCGATGCGTC - 3;
TK22 - 5 GCCAAGTACGCGCGATAAAG - 3.
Они представляют собой элемент новизны. Олигонуклеотиды ТК11, ТК12, ТК21 имеют в своем составе сайты рестрикции: HindIII, SalI, ClaI, которых нет в полученных фрагментах. Полученная последовательность ДНК для удобства получена в виде двух фрагментов, которые в дальнейшем будут использованы как фланкирующие последовательности при сборке плазмиды интеграции. They are an element of novelty. The oligonucleotides TK11, TK12, TK21 incorporate restriction sites: HindIII, SalI, ClaI, which are not in the obtained fragments. For convenience, the obtained DNA sequence was obtained in the form of two fragments, which will be further used as flanking sequences during the assembly of the integration plasmid.
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTKlFPV, содержащая 3'-конец ТК-гена вируса оспы кур и характеризующаяся следующими признаками:
имеет молекулярную массу 2,16 мегадальтон размером 3272 п.о.;
содержит амплифицированный фрагмент размером 604 п.о., обработанный эндонуклеазами рестрикции HindIII и SaiI, и кодирующий N-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур;
содержит HindIII-SalI - фрагмент плазмидного вектора pUC-18, имеющего размер 2668 п.о.;
содержит участок начала репликации;
содержит ген устойчивости к ампициллину;
содержит уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты: HindIII-400, SalI-1004, BamHI-1016, SmaI-1023, KpnI-1029, SacI-1037, EcoRI-1037.2. Recombinant plasmid DNA pTKlFPV containing the 3'-end of the TK gene of chicken pox virus and characterized by the following features:
has a molecular weight of 2.16 megadaltons in
contains an amplified 604 bp fragment treated with restriction endonucleases HindIII and SaiI, and encoding the N-terminal portion of chicken pox virus thymidine kinase;
contains HindIII-SalI - a fragment of plasmid vector pUC-18 having a size of 2668 bp .;
Contains a replication start site
contains ampicillin resistance gene;
contains unique sites for restriction endonucleases having the following coordinates: HindIII-400, SalI-1004, BamHI-1016, SmaI-1023, KpnI-1029, SacI-1037, EcoRI-1037.
3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTK2FPV, содержащая 5'-конец ТК-гена вируса оспы кур и характеризующаяся следующими признаками:
имеет молекулярную массу 2,16 мегадальтон размером 3269 п.о.;
содержит амплифицированный фрагмент размером 780 п.о., обработанный эндонуклеазой рестрикции ClaI и кодирующий C-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур;
содержит ClaI-SmaI фрагмент плазмиды pMTL-22 размером 2497 п.о.;
содержит участок начала репликации;
содержит ген устойчивости к ампициллину;
содержит уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты: XhoI-177, Bg1II-181, ClaI-188, EcoRI-981, HindIII-990, PstI-1000, SalI-1006, BamHI-1019.3. Recombinant plasmid DNA pTK2FPV containing the 5'-end of the TK gene of chicken pox virus and characterized by the following features:
has a molecular weight of 2.16 megadaltons in
contains an amplified fragment of 780 bp, treated with ClaI restriction endonuclease and encoding the C-terminal portion of chicken pox virus thymidine kinase;
contains a ClaI-SmaI fragment of plasmid pMTL-22 with a size of 2497 bp .;
Contains a replication start site
contains ampicillin resistance gene;
contains unique sites for restriction endonucleases having the following coordinates: XhoI-177, Bg1II-181, ClaI-188, EcoRI-981, HindIII-990, PstI-1000, SalI-1006, BamHI-1019.
4. Рекомбинантая плазмидная ДНК pINTFPVl, обладающая способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур и характеризующаяся следующими признаками:
имеет молекулярную массу 4,87 мегадальтон размером 7388 п.о.;
содержит HindIII-EcoRI фрагмент плазмиды pUC-18 размером 2635 п.о.;
содержит участок начала репликации;
содержит ген устойчивости к ампициллину;
содержит амплифицированный фрагмент размером 604 п.о., обработанный эндонуклеазами рестрикции HindIII и SalI и кодирующий N-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур;
содержит амплифицированный фрагмент размером 780 п.о., обработанный эндонуклеазами рестрикции ClaI и кодирующий C-концевую часть тимидинкиназы вируса оспы кур;
содержит два SalI-BamHI фрагмента плазмиды pBRPZ размером 110 п.о., содержащих промотор 11К вируса осповакцины;
содержит BamHI-KpnI фрагмент плазмиды pUC-128 размером 66 п.о., включающий уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, BamHI, SmaI, PstI, EcorI, HindIII, SalI, XhoI, ApaI, KpnI;
содержит BamHI-SalI фрагмент плазмиды pBRPZ размером 3000 п.о., включающий ген β-галактозидазы E.coli, обладающий способностью экспрессировать β-галактозидазу в составе генома вируса оспы кур;
содержит уникальные сайты для эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты: BamHI-1113, SmaI-1121, Pst-1129, EcoRI-1131, HindIII-1143, SalI-1158, XhoI-1164, ApaI-1177, KpnI-2183.4. Recombinant plasmid DNA pINTFPVl, which has the ability to integrate into the chickenpox virus genome and is characterized by the following features:
has a molecular weight of 4.87 megadaltons with a size of 7388 bp .;
contains HindIII-EcoRI fragment of plasmid pUC-18 with a size of 2635 bp .;
Contains a replication start site
contains ampicillin resistance gene;
contains an amplified 604 bp fragment treated with restriction endonucleases HindIII and SalI and encoding the N-terminal portion of chicken pox virus thymidine kinase;
contains an amplified fragment of 780 bp, treated with ClaI restriction endonucleases and encoding the C-terminal portion of chicken pox virus thymidine kinase;
contains two SalI-BamHI fragments of the plasmid pBRPZ with a size of 110 bp containing the 11K promoter of the vaccinia virus;
contains a 66 bp BamHI-KpnI fragment of plasmid pUC-128, including unique sites for restriction endonucleases, BamHI, SmaI, PstI, EcorI, HindIII, SalI, XhoI, ApaI, KpnI;
contains a BamHI-SalI fragment of the plasmid pBRPZ with a size of 3000 bp, including the E. coli β-galactosidase gene, which has the ability to express β-galactosidase in the chickenpox virus genome;
contains unique sites for restriction endonucleases having the following coordinates: BamHI-1113, SmaI-1121, Pst-1129, EcoRI-1131, HindIII-1143, SalI-1158, XhoI-1164, ApaI-1177, KpnI-2183.
Таким образом, при помощи генно-инженерных манипуляций из генома вируса оспы кур штамма "К" получена последовательность ДНК, несущественная для репликации вируса и содержащая ТК-ген; определена первичная нуклеотидная структура полученной последовательности ДНК; получены рекомбинантные плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV, содержащие полученную последовательность ДНК; сконструирован плазмидный вектор pTNTFPVl, обладающий способностью интегрироваться в геном вируса оспы кур. Полученное техническое решение может найти применение при получении генно-инженерных вакцин на основе вируса оспы кур, которые могут найти применение в ветеринарии и медицине. Thus, using genetic engineering manipulations from the genome of the chicken pox virus of strain K, a DNA sequence was obtained that is not essential for virus replication and contains the TK gene; determined the primary nucleotide structure of the obtained DNA sequence; recombinant plasmids pTKlFPV and pTK2FPV containing the obtained DNA sequence were obtained; The plasmid vector pTNTFPVl, which has the ability to integrate into the chickenpox virus genome, was constructed. The resulting technical solution can find application in the production of genetically engineered vaccines based on the chicken pox virus, which can be used in veterinary medicine.
Фиг.1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pTKlFPV. Figure 1. Physical map of the recombinant plasmid pTKlFPV.
Фиг.2. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pTK2FPV. Figure 2. Physical map of the recombinant plasmid pTK2FPV.
Фиг. 3. Первичная нуклеотидная структура полученной последовательности ДНК, содержащей ТК-ген и несущественной для репликации вируса, из генома вируса оспы кур штамма "К". Цветом выделен ТК-ген. FIG. 3. The primary nucleotide structure of the obtained DNA sequence containing the TK gene and not essential for virus replication from the chicken pox virus genome of strain "K". The TK gene is highlighted in color.
Фиг.4. Схема сборки плазмидного вектора pINTFPVI. Figure 4. Scheme of assembly of the plasmid vector pINTFPVI.
Фиг.5. Физическая карта рекомбинантного вектора pINTFPVI. Figure 5. Physical map of the recombinant vector pINTFPVI.
Пример 1. Получение последовательности ДНК, несущественной для репликации вируса и содержащей ТК-ген, из вируса оспы кур штамма "К". Example 1. Obtaining a DNA sequence that is not essential for virus replication and containing the TK gene from chicken pox virus strain "K".
В качестве вирусного вектора был выбран вирус оспы кур штамма "К", используемый в России для специфической вакцинации против вируса оспы кур. Штамм был получен из ВГНКИ Ветпрепаратов. Вирус нарабатывают, очищают по методике, описанной ранее в работе [21]. Вирусную ДНК выделяют по методике, описанной в работе [22]. Праймеры для проведения ПЦР рассчитывают по программе OLIGO [23] с учетом ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей генов тимидинкиназы авипоксвирусов [2, 20]. Структуры праймеров приведены ниже:
ТК11 - 5 AAGCTTCGCCACGTTATTCGAA - 3;
TK12 - 5 GCGTGAAATGCTATGTCGACG - 3;
ТК21 - 5 ACTCGTTTAGAAATCGATGCGTC - 3;
ТК22 - 5 GCCAAGTACGCGCGATAAAG - 3.Chicken pox virus strain K was used as the viral vector, used in Russia for specific vaccination against chicken pox virus. The strain was obtained from VGNKI Veterinary. The virus is produced, cleaned according to the method described previously in [21]. Viral DNA is isolated according to the procedure described in [22]. PCR primers are calculated using the OLIGO program [23] taking into account previously published nucleotide sequences of avipoxvirus thymidine kinase genes [2, 20]. Primer structures are shown below:
TK11 - 5 AAGCTTCGCCACGTTATTCGAA - 3;
TK12 - 5 GCGTGAAATGCTATGTCGACG - 3;
TK21 - 5 ACTCGTTTAGAAATCGATGCGTC - 3;
TK22 - 5 GCCAAGTACGCGCGATAAAG - 3.
ПЦР проводят по стандартной методике [24]. Амплифицированный фрагмент, полученный при проведении ПЦР с праймерами ТК11 и ТК12, обрабатывают рестриктазами HindIII и SalI. Из полученного гидролизата выделяют в 4% полиакриламидном геле фрагмент длиной примерно 600 п.о., что совпадает с рассчитанной длиной амплифицированного фрагмента 604 п.о. Амплифицированный фрагмент, полученный при проведении ПЦР с праймерами ТК11 и ТК12, обрабатывают рестриктазой ClaI. Из полученного гидролиза выделяют в 4% полиакриламидном геле фрагмент длиной примерно 780 п.о., что совпадает с рассчитанной длиной 780 п. о. Полученные таким образом амплифицированные фрагменты далее были использованы для получения рекомбинантных плазмидных ДНК pTK1FPV и pTK2FPV. PCR is carried out according to standard methods [24]. The amplified fragment obtained by PCR with primers TK11 and TK12 is treated with restriction enzymes HindIII and SalI. A fragment of about 600 bp in length is isolated from the hydrolyzate obtained in a 4% polyacrylamide gel, which coincides with the calculated length of the amplified fragment of 604 bp. The amplified fragment obtained by PCR with primers TK11 and TK12 is treated with restriction enzyme ClaI. A fragment of about 780 bp in length is isolated from the hydrolysis obtained in a 4% polyacrylamide gel, which coincides with the calculated length of 780 bp. The amplified fragments thus obtained were further used to prepare recombinant plasmid DNAs pTK1FPV and pTK2FPV.
Пример 2. Получение рекомбинантных плазмидных ДНК pTKlFPV и pTK2FPV, содержащих полученную последовательность ДНК. Example 2. Obtaining recombinant plasmid DNA pTKlFPV and pTK2FPV containing the obtained DNA sequence.
1. 10 мкг плазмидной ДНК pUC-18 обрабатывают рестриктазами HindIII и SalI по общепринятой методике [25]. Из полученного гидролизата выделяют векторный фрагмент размером 2680 п.о. в 4% полиакриламидном геле праймеров. Амплифицированный фрагмент длиной 604 п.о. и векторную часть плазмиды pUC-18 сшивают при помощи лигазной реакции в 20 мкл буфера для лигирования [25]. 10 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM-109 [25]. Трансформанты высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 5 мкг/мл Х-gal, 5 мкг/мл IPTG. Из белых клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом [25]. Рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая фрагмент нужной длины, будет обозначена как pTK1FPV и в дальнейшем будет использована для определения нуклеотидной последовательности полученного амплифицированного фрагмента и для сборки плазмиды интеграции. Физическая карта плазмиды pTKlFPV приведена на фиг.1. 1. 10 μg of plasmid DNA pUC-18 is treated with restriction enzymes HindIII and SalI according to the standard procedure [25]. A 2680 bp vector fragment is isolated from the obtained hydrolyzate. in 4% polyacrylamide gel primers. The amplified fragment of 604 bp in length and the vector portion of plasmid pUC-18 is crosslinked by ligase reaction in 20 μl of ligation buffer [25]. 10 μl of the ligase mixture is used to transform competent E. coli JM-109 cells [25]. Transformants are plated on LV agar containing 100 μg / ml ampicillin, 5 μg / ml X-gal, 5 μg / ml IPTG. Plasmid DNA was isolated from white clones and analyzed by restriction analysis [25]. Recombinant plasmid DNA containing a fragment of the desired length will be designated as pTK1FPV and will be further used to determine the nucleotide sequence of the obtained amplified fragment and to assemble the integration plasmid. Physical map of plasmid pTKlFPV is shown in Fig.1.
2. 10 мкг плазмидной ДНК pMTL-22 [26] обрабатывают рестриктазами ClaI и SmaI. Из полученного гидролизата выделяют в 4% полиакриламидном геле векторный фрагмент размером 2497 п.о. 780 п.о. Амплифицированный фрагмент длиной 780 п.о. и векторную часть плазмиды pMTL-22 сшивают при помощи лигазной реакции в 20 мкл буфера для лигирования. 10 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM-109. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 5 мкг/мл X-gal, 5 мкг/мл IPTG. Из белых колоний выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом. Рекомбинантные клоны, содержащие фрагмент нужной длины, будут обозначены как pTK2FPV и в дальнейшем будут использованы для определения первичной структуры полученного амплифицированного фрагмента и для сборки плазмиды интеграции. Физическая карта плазмиды pTK2FPV приведена на фиг.2. 2. 10 μg of plasmid DNA pMTL-22 [26] is treated with restriction enzymes ClaI and SmaI. A 2497 bp vector fragment is isolated from the obtained hydrolyzate in a 4% polyacrylamide gel. 780 bp Amplified fragment length of 780 bp and the vector portion of the plasmid pMTL-22 is crosslinked by ligase reaction in 20 μl of ligation buffer. 10 μl of ligase mixture is used to transform competent E. coli JM-109 cells. Transformants are plated on LB agar containing 100 μg / ml ampicillin, 5 μg / ml X-gal, 5 μg / ml IPTG. Plasmid DNA was isolated from the white colonies and analyzed by restriction analysis. Recombinant clones containing a fragment of the desired length will be designated as pTK2FPV and will subsequently be used to determine the primary structure of the resulting amplified fragment and to assemble the integration plasmid. Physical map of plasmid pTK2FPV is shown in Fig.2.
Пример 3. Определение первичной нуклеотидной структуры полученной последовательности ДНК. Example 3. Determination of the primary nucleotide structure of the obtained DNA sequence.
Первичную нуклеотидную структуру полученной последовательности ДНК определяют по методу Максама-Гилберта [25]. Для секвенирования используют по 3 независимых клона. Полученная последовательность приведена на фиг.3. Сравнение полученной первичной структуры с опубликованными ранее показало, что полученная последовательность ДНК содержит ген тимидинкиназы вируса оспы кур, причем 5'-конец гена тимидинкиназы расположен в амплифицированноv фрагменте длиной 780 п.о., а 3'-конец гена - в амплифицированном фрагменте длиной 604 п.о. The primary nucleotide structure of the obtained DNA sequence is determined by the Maxam-Gilbert method [25]. For sequencing, 3 independent clones are used. The resulting sequence is shown in figure 3. Comparison of the obtained primary structure with previously published ones showed that the obtained DNA sequence contains the chicken pox virus thymidine kinase gene, with the 5'-end of the thymidine kinase gene in the amplified fragment of 780 bp and the 3'-end of the gene in the amplified fragment of 604 by.
Пример 4. Получение плазмидного вектора интеграции pINTFPVl. Example 4. Obtaining plasmid integration vector pINTFPVl.
Для получения плазмидного вектора pINTFPVI используют плазмиды pTKlFPV и pTK2FPV, а также вспомогательные плазмиды pBRPZ [27] и pUC-128. Все генно-инженерные манипуляции проводят аналогично, как описано в примере 2, и согласно общепринятым методикам [25]. Схема сборки плазмиды pINTFPVI приведена на фиг.4. Физическая карта плазмиды pINTFPVI - на фиг.5. To obtain plasmid vector pINTFPVI, plasmids pTKlFPV and pTK2FPV, as well as auxiliary plasmids pBRPZ [27] and pUC-128, are used. All genetic engineering manipulations are carried out similarly as described in example 2, and according to generally accepted methods [25]. The assembly scheme of the plasmid pINTFPVI is shown in figure 4. Physical map of the plasmid pINTFPVI - figure 5.
Пример 5. Получение рекомбинантного вируса оспы кур, содержащего ген β-галактозидазы E.coli. Example 5. Obtaining recombinant chicken pox virus containing the gene of β-galactosidase E. coli.
Плазмидной ДНК pINTFPVI трансфецируют культуру клеток фибробластов эмбрионов кур, зараженную вирусом оспы кур штамма "К". Трансфекцию и отбор клонов проводят по методике, описанной ранее [11]. Полученные рекомбинантные вирусные клоны обладают способностью окрашивать культуральную среду при добавлении хромогенных субстратов: X-gal, Y-gal и др. Наличие рекомбинантных клонов доказывает правильность сборки плазмиды интеграции, а также возможность использовать полученную плазмиду для конструирования рекомбинантов, содержащих целевые чужеродные гены. PINTFPVI plasmid DNA transfected a chicken embryo fibroblast cell culture infected with chicken pox virus strain K. Transfection and selection of clones is carried out according to the method described previously [11]. The resulting recombinant viral clones have the ability to stain the culture medium with the addition of chromogenic substrates: X-gal, Y-gal, etc. The presence of recombinant clones proves the correct assembly of the integration plasmid, as well as the ability to use the obtained plasmid to construct recombinants containing target foreign genes.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99124650A RU2180352C2 (en) | 1999-11-24 | 1999-11-24 | VIRAL GENOME FRAGMENT OF CHICKEN K STRAIN VARIOLA WHICH CONTAINS THYMIDINE KINASE GENE, pTK1FPV AND pTK2FPV RECOMBINANT PLASMID DNAs WHICH CONTAIN THIS SEQUENCE, AND pINTFPV1 RECOMBINANT PLASMID DNA WHICH IS ABLE TO INTEGRATE INTO VIRAL GENOME OF CHICKEN VARIOLA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99124650A RU2180352C2 (en) | 1999-11-24 | 1999-11-24 | VIRAL GENOME FRAGMENT OF CHICKEN K STRAIN VARIOLA WHICH CONTAINS THYMIDINE KINASE GENE, pTK1FPV AND pTK2FPV RECOMBINANT PLASMID DNAs WHICH CONTAIN THIS SEQUENCE, AND pINTFPV1 RECOMBINANT PLASMID DNA WHICH IS ABLE TO INTEGRATE INTO VIRAL GENOME OF CHICKEN VARIOLA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU99124650A RU99124650A (en) | 2001-09-20 |
| RU2180352C2 true RU2180352C2 (en) | 2002-03-10 |
Family
ID=20227287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99124650A RU2180352C2 (en) | 1999-11-24 | 1999-11-24 | VIRAL GENOME FRAGMENT OF CHICKEN K STRAIN VARIOLA WHICH CONTAINS THYMIDINE KINASE GENE, pTK1FPV AND pTK2FPV RECOMBINANT PLASMID DNAs WHICH CONTAIN THIS SEQUENCE, AND pINTFPV1 RECOMBINANT PLASMID DNA WHICH IS ABLE TO INTEGRATE INTO VIRAL GENOME OF CHICKEN VARIOLA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2180352C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017021776A1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Bavarian Nordic A/S | Promoters for enhancing expression in poxviruses |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0443335A1 (en) * | 1990-01-29 | 1991-08-28 | IMMUNO Aktiengesellschaft | Recombinant pox virus plasmid containing a multi-functional DNA cassette |
| EP0652287A2 (en) * | 1993-09-22 | 1995-05-10 | American Home Products Corporation | Poxviral vectors and their use as a vaccine against feline infectious peritonitis virus disease |
-
1999
- 1999-11-24 RU RU99124650A patent/RU2180352C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0443335A1 (en) * | 1990-01-29 | 1991-08-28 | IMMUNO Aktiengesellschaft | Recombinant pox virus plasmid containing a multi-functional DNA cassette |
| EP0652287A2 (en) * | 1993-09-22 | 1995-05-10 | American Home Products Corporation | Poxviral vectors and their use as a vaccine against feline infectious peritonitis virus disease |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017021776A1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Bavarian Nordic A/S | Promoters for enhancing expression in poxviruses |
| CN107922981A (en) * | 2015-07-31 | 2018-04-17 | 巴法里安诺迪克有限公司 | For strengthening the promoter of the expression in poxvirus |
| RU2753884C2 (en) * | 2015-07-31 | 2021-08-24 | Бавариан Нордик А/С | Promoters for enhancing expression in poxviruses |
| CN107922981B (en) * | 2015-07-31 | 2022-02-25 | 巴法里安诺迪克有限公司 | Promoters for enhanced expression in poxviruses |
| US11753652B2 (en) | 2015-07-31 | 2023-09-12 | Bavarian Nordic A/S | Cassette encoding a FPV/brachyury fusion protein |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6291467B2 (en) | Promoter for recombinant virus expression | |
| EP0538496B1 (en) | Recombinant fowlpox virus with intact FPV-tk-gene | |
| US12365879B2 (en) | Synthetic chimeric poxviruses | |
| US20220204992A1 (en) | Recombinant orf virus vector | |
| JP6316227B2 (en) | Vector containing multiple homologous nucleotide sequences | |
| KR20050083839A (en) | Recombinant poxvirus comprising at least two cowpox ati promoters | |
| US7150874B2 (en) | Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes | |
| Scheiflinger et al. | Evaluation of the thymidine kinase (tk) locus as an insertion site in the highly attenuated vaccinia MVA strain | |
| JP2005525119A (en) | Recombinant fowlpox virus | |
| CN101142319B (en) | Vaccines based on the use of modified Ankara vaccinia virus | |
| RU2180352C2 (en) | VIRAL GENOME FRAGMENT OF CHICKEN K STRAIN VARIOLA WHICH CONTAINS THYMIDINE KINASE GENE, pTK1FPV AND pTK2FPV RECOMBINANT PLASMID DNAs WHICH CONTAIN THIS SEQUENCE, AND pINTFPV1 RECOMBINANT PLASMID DNA WHICH IS ABLE TO INTEGRATE INTO VIRAL GENOME OF CHICKEN VARIOLA | |
| WO2016195332A1 (en) | Poxvirus-derived promoter, and vector comprising same | |
| WO2005093070A1 (en) | Recombinant herpesvirus and utilization of the same | |
| US6106825A (en) | Entomopoxvirus-vertebrate gene delivery vector and method | |
| Moss | Vaccinia and other poxvirus expression vectors | |
| CA2033957A1 (en) | Vertebrate poxvirus expression vector under the control of entomopoxvirus spheroidin gene promoter | |
| JP3458880B2 (en) | Recombinant, polyvalent recombinant, and method for producing the same | |
| CN100393872C (en) | Replication-defective Tiantan vaccinia virus | |
| CA3192853A1 (en) | Mutant orf viruses and uses thereof | |
| Spencer | Matthew G. Cottingham, Rikke F. Andersen, Alexandra J. Spencer, Saroj Saurya, Julie Furze, Adrian VS Hill and Sarah C. Gilbert | |
| Cottingham et al. | Recombination-Mediated Genetic Engineering of a Bacterial Artificial | |
| EA041611B1 (en) | RECOMBINANT ORF VIRAL VECTOR | |
| HK1076835B (en) | Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ati promoter | |
| HK1076835A1 (en) | Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ati promoter |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20091125 |