RU2029565C1

RU2029565C1 - Adsorbents for extracting atherogenic lipoproteins from biological liquids

Info

Publication number: RU2029565C1
Application number: RU92014773A
Authority: RU
Inventors: Ариф Исмаилович Гамзазаде; Сулейман Мадат оглы Насибов
Original assignee: Ариф Исмаилович Гамзазаде; Сулейман Мадат оглы Насибов
Priority date: 1992-12-25
Filing date: 1992-12-25
Publication date: 1995-02-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: these sorbents are solid, granulated and porous carriers such as silochrome, macroporous glass and silica gel, which are modified by interpolymer complex including chitosan and sodium dextrane sulfate, and have optimum pore diameter between 130 and 250 nm. EFFECT: disclosed sorbents allow carrying out sorption from whole flowing blood (plasma and lymph), are characterized by relatively high capacity and selectivity relative to lipoproteins having low and extremely low density, excellent hemocompatibility and low cost. 2 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к средствам экстракорпорального связывания атерогенных липопротеинов. The invention relates to medicine, namely to means of extracorporeal binding of atherogenic lipoproteins.

Известно, что развитие атеросклероза тесно связано с процессами транспорта холестерина в артериальную стенку атерогенными липопротеинами (липопротеинами низкой и очень низкой плотности - ЛНП и ЛОНП) [1]. It is known that the development of atherosclerosis is closely related to the processes of cholesterol transport to the arterial wall by atherogenic lipoproteins (low and very low density lipoproteins - LDL and VLDL) [1].

В норме действует рецепторный механизм, благодаря которому накопления холестерина и атерогенных липопротеинов в клетке не происходит. При холестеринемии любой природы этот механизм нарушается, и возникает необходимость избирательного удаления атерогенных липопротеинов из организма. Normally, the receptor mechanism works, due to which the accumulation of cholesterol and atherogenic lipoproteins in the cell does not occur. With cholesterolemia of any nature, this mechanism is violated, and the need arises for the selective removal of atherogenic lipoproteins from the body.

Известны сорбенты для связывания атерогенных липопротеинов из плазмы крови, представляющие собой гелевые матрицы, модифицированные сульфополи- сахаридами, обеспечивающими специфичность этих сорбентов по отношению к атерогенным липопротеинам - это сефароза, модифицированная гепарином [2], и поливиниловый спирт, модифицированный декстрансульфатом [3]. Главным недостатком этих сорбентов является невозможность работы с цельной протекающей кровью из-за плохих гидродинамических свойств гелей и их высокой стоимости. Sorbents for binding atherogenic lipoproteins from blood plasma are known, which are gel matrices modified with sulfopolysaccharides that ensure the specificity of these sorbents with respect to atherogenic lipoproteins — hepharin modified sepharose [2] and polyvinyl alcohol modified with dextransulfate [3]. The main disadvantage of these sorbents is the inability to work with whole flowing blood due to the poor hydrodynamic properties of the gels and their high cost.

Известен гемосорбент для извлечения атерогенных липопротеинов, полученный иммобилизацией гепарина на поверхности силохрома (СХ) с диаметром пор 100-300 онм [4]. Жесткая матрица - силохром обладает прочностью и устойчивостью в физиологических условиях и большой однородностью пор, что позволяет осуществлять сорбцию непосредственно из крови, а наличие специфического лиганда к ЛНП - гепарина обеспечивает емкость по общему холестерину, равную 8,7 мг/г. Однако указанный сорбент не обладает высокой емкостью по отношению к атерогенным липопротеинам (7,0 мг/г). Known hemosorbent for the extraction of atherogenic lipoproteins obtained by immobilization of heparin on the surface of silochrome (CX) with a pore diameter of 100-300 onm [4]. A rigid matrix - silochrome possesses strength and stability under physiological conditions and a great uniformity of pores, which allows sorption directly from the blood, and the presence of a specific ligand for LDL - heparin provides a total cholesterol capacity of 8.7 mg / g. However, this sorbent does not have a high capacity with respect to atherogenic lipoproteins (7.0 mg / g).

В патенте [5] описаны сорбенты для извлечения атерогенных липопротеинов из биологических жидкостей, полученные путем модификации органических (целлофан, биогель) и неорганических (макропористое стекло) матриц различными сульфополисахаридами, такими как гепарин, декстрансульфат натрия (ДС) и хондроитинсульфат и т.д. При этом наибольшей емкостью к атерогенным липопротеинам обладает сорбент на основе макропористого стекла (МПС), содержащий иммобилизованный ДС (65% извлечения). Однако этот показатель зависит от оптимального сочетания ряда факторов: диаметра пор, размера гранул молекулярной массы (характеристическая вязкость) ДС, от содержания в нем серы. Так, наибольшей процент извлечения (65%) отмечен при следующих характеристиках сорбента: размер гранул 0,08-0,12 мм, мол. мас ДС 7,0 кД (или характеристическая вязкость [η] = 0,027 дл/г), содержание серы 17,7 мас.%. При этом увеличение молекулярной массы с 7,0 до 500 кД ([η] = 0,2 дл/г) при прочих равных условиях снижает степень извлечения до 18%. К такому же результату приводит использование ДС с низким (5,7%) содержанием серы. The patent [5] describes sorbents for the extraction of atherogenic lipoproteins from biological fluids obtained by modifying organic (cellophane, biogel) and inorganic (macroporous glass) matrices with various sulfopolysaccharides, such as heparin, sodium dextransulfate (DS) and chondroitin sulfate, etc. At the same time, the sorbent based on macroporous glass (MPS) containing immobilized DS (65% recovery) has the highest capacity for atherogenic lipoproteins. However, this indicator depends on the optimal combination of a number of factors: pore diameter, granule size of the molecular weight (intrinsic viscosity) of the DS, and its sulfur content. So, the highest percent recovery (65%) was noted with the following characteristics of the sorbent: granule size 0.08-0.12 mm, mol. wt DS 7.0 kD (or intrinsic viscosity [η] = 0.027 dl / g), sulfur content 17.7 wt.%. The increase in molecular weight from 7.0 to 500 kDa ([η] = 0.2 dl / g), all other things being equal, reduces the degree of extraction to 18%. The use of DS with a low (5.7%) sulfur content leads to the same result.

Недостатками прототипа являются:
1. Использование гранул размером 0,08-0,12 мм, что непригодно для перфузии цельной крови, вследствие травматизации форменных элементов. Все используемые в практике гемосорбенты имеют гранулы диаметром более 0,2 мм.The disadvantages of the prototype are:
1. The use of granules with a size of 0.08-0.12 mm, which is unsuitable for perfusion of whole blood, due to trauma to the uniform elements. All hemosorbents used in practice have granules with a diameter of more than 0.2 mm.

2. Заведомо низкая скорость перфузии (0,3 мл/мин), в то время как в практической гемосорбции скорость перфузии составляет от 40 до 100 мл/мин. 2. Obviously low perfusion rate (0.3 ml / min), while in practical hemosorption, the perfusion rate is from 40 to 100 ml / min.

3. Использование низкомолекулярного (7,0 кД) и высокозамещенного ДС, получение которого связано с трудностями и использование которого ведет к значительному расходу при иммобилизации его на носителе. 3. The use of low molecular weight (7.0 kDa) and highly substituted DS, the receipt of which is associated with difficulties and the use of which leads to significant consumption when immobilizing it on a carrier.

Все это препятствует использованию данных сорбентов в практической гемосорбции. All this prevents the use of these sorbents in practical hemosorption.

Целью изобретения является создание специфического сорбента, позволяющего осуществлять эффективную сорбцию атерогенных липопротеинов из любых биологических жидкостей, обладающего высокой избирательностью к атерогенным липопротеинам и пригодного к использованию в условиях практической гемосорбции. The aim of the invention is the creation of a specific sorbent that allows for effective sorption of atherogenic lipoproteins from any biological fluids, which is highly selective for atherogenic lipoproteins and suitable for use in practical hemosorption.

Указанная цель достигается тем,что адсорбент содержит в качестве лиганда интерполимерный комплекс хитозана (ХТ) с декстрансульфатом натрия в мольном соотношении компонентов 1: 2-1:12 и весовом соотношении матрица:лиганд 1: 0,003-1:0,020 (г:г). Указанный интерполимерный комплекс хитозана с декстрансульфатом натрия ранее в литературе на описан. This goal is achieved by the fact that the adsorbent contains as a ligand an interpolymer complex of chitosan (CT) with sodium dextransulfate in a molar ratio of components of 1: 2-1: 12 and a weight ratio of matrix: ligand 1: 0.003-1: 0.020 (g: g). The indicated interpolymer complex of chitosan with sodium dextran sulfate was previously described in the literature.

Интерполимерный комплекс хитозана с ДС получают смешиванием водного или водно-мочевинного раствора хлоргидрата хитозана с рН 5,5 - 7,5 с водным раствором ДС с мол.мас. 500 кД, что соответствует молекулярной массе коммерческого ДС, при мольном соотношении 1:2-1:12 и последующим высушиванием продукта лиофильно. Получение и свойства адсорбентов иллюстрируют следующие примеры. The interpolymer complex of chitosan with DS is obtained by mixing an aqueous or aqueous urea solution of chitosan hydrochloride with a pH of 5.5-7.5 with an aqueous solution of DS with molar mass. 500 kD, which corresponds to the molecular weight of the commercial DS, with a molar ratio of 1: 2-1: 12 and subsequent drying of the product by freeze drying. The preparation and properties of adsorbents are illustrated by the following examples.

П р и м е р 1. Подготовка и активация носителя. PRI me R 1. Preparation and activation of media.

Образцы гранулированных частиц носителя СХ, МПС, силикагель (СГ) со средним размером 0,4 - 0,8 мм обрабатывают 0,2 М водным раствором азотной кислоты в соотношении 1:20 при 70-80^oC в течение 3 ч, затем промывают водой до нейтрального значения рН промывных вод и сушат при 500-600^oC в течение 3 ч.Samples of granular particles of a CX, MPS carrier, silica gel (SG) with an average size of 0.4 - 0.8 mm are treated with a 0.2 M aqueous solution of nitric acid in a ratio of 1:20 at 70-80 ^o C for 3 hours, then washed water to a neutral pH of the wash water and dried at 500-600 ^o C for 3 hours

П р и м е р 2. 10 г МПС со средним диаметром пор 200 нм, обрабатывают 60 мл 3%-ного раствора γ-аминопропилтриэтоксисилана при 95-100^oC в течение 6 ч, затем суспензию промывают водой до нейтрального значения рН промывных вод и сушат в вакууме при 60^oC.PRI me R 2. 10 g of MPS with an average pore diameter of 200 nm, treated with 60 ml of a 3% solution of γ-aminopropyltriethoxysilane at 95-100 ^o C for 6 h, then the suspension is washed with water to a neutral pH of the wash water and dried in vacuum at 60 ^o C.

Количество введенных аминогрупп 0,3 ммоль/г. The number of introduced amino groups of 0.3 mmol / g

П р и м е р 3. Пример осуществляют аналогично примеру 2, но в качестве носителя используют СХ со средним диаметром пор 180 нм. Количество аминных групп на матрице составляет 0,24 ммоль/г. PRI me R 3. The example is carried out analogously to example 2, but as the carrier use CX with an average pore diameter of 180 nm. The amount of amine groups on the matrix is 0.24 mmol / g.

П р и м е р 4. Пример осуществляют аналогично примеру 2, но в качестве носителя используют СГ со средним диаметром пор 200 нм. Количество аминных групп на матрице составляет 0,16 ммоль/г. PRI me R 4. The example is carried out analogously to example 2, but as the carrier use SG with an average pore diameter of 200 nm. The amount of amine groups on the matrix is 0.16 mmol / g.

П р и м е р 5. К 10 г МПС с диаметром пор 200 нм добавляют 150 мл толуола и 6 мл γ-глицидоксипропилтриэтоксисилана, кипятят в течение 8 ч, затем суспензию промывают толуолом, ацетоном, водой и сушат в вакууме при 60^oC. Количество введенных эпоксигрупп 0,13 ммоль/г.PRI me R 5. To 10 g of MPS with a pore diameter of 200 nm add 150 ml of toluene and 6 ml of γ-glycidoxypropyltriethoxysilane, boil for 8 hours, then the suspension is washed with toluene, acetone, water and dried in vacuum at 60 ^o C The amount of epoxy groups introduced is 0.13 mmol / g.

П р и м е р 6. Пример осуществляют аналогично примеру 5, но в качестве носителя используют СХ со средним диаметром пор 70 нм. Количество эпоксигрупп на матрице составляет 0,21 ммоль/г. PRI me R 6. The example is carried out analogously to example 5, but as the carrier use CX with an average pore diameter of 70 nm. The number of epoxy groups on the matrix is 0.21 mmol / g.

П р и м е р 7. Пример осуществляют, аналогично примеру 5, но в качестве носителя используют СГ со средним диаметром пор 70 нм. Количество эпоксигрупп на матрице составляет 0,17 ммоль/г. PRI me R 7. The example is carried out analogously to example 5, but as the carrier use SG with an average pore diameter of 70 nm. The amount of epoxy groups on the matrix is 0.17 mmol / g.

Приготовление адсорбентов. Preparation of adsorbents.

П р и м е р 8. К 1 г активированного по примеру 2 носителя добавляют 5 мл 1%-ного раствора поликомплекса при соотношении хлоргидрат хитозана:декстрансульфат натрия (ХГХ:ДС), равном 1:6 в 4 М водном растворе мочевины с рН 7,6, перемешивают встряхиванием в течение 5 ч при комнатной температуре, суспензию фильтруют, промывают 1 М раствором хлористого натрия, водой и сушат. Весовое соотношение матрица:лиганд составляет 1:0,0124 (г/г). PRI me R 8. To 1 g of the activated according to example 2 media add 5 ml of a 1% solution of the polycomplex with a ratio of chitosan hydrochloride: sodium dextran sulfate (CGC: DS) equal to 1: 6 in a 4 M aqueous solution of urea with pH 7.6, stirred by shaking for 5 hours at room temperature, the suspension is filtered, washed with 1 M sodium chloride solution, water and dried. The weight ratio of matrix: ligand is 1: 0.0124 (g / g).

П р и м е р 9. 1 г активированного по примеру 3 носителя обрабатывают аналогично примеру 8, но при соотношении ХГХ:ДС, равном 1:3. Весовое соотношение матрица:лиганд 1:0,0107 (г/г). PRI me R 9. 1 g activated in accordance with example 3 of the carrier is treated analogously to example 8, but with a ratio of HCG: DS equal to 1: 3. Weight ratio matrix: ligand 1: 0.0107 (g / g).

П р и м е р 10. 1 г активированного по примеру 4 носителя обрабатывают аналогично примеру 8, но при соотношении ХГХ:ДС, равном 1:9. Весовое соотношение матрица:лиганд 1:0,0112 (г/г). PRI me R 10. 1 g of the activated according to example 4 media is processed analogously to example 8, but with a ratio of HCG: DS equal to 1: 9. Weight ratio matrix: ligand 1: 0.0112 (g / g).

П р и м е р 11. 1 г активированного по примеру 5 носителя обрабатывают аналогично примеру 8. Весовое соотношение матрица:лиганд 1:0,0145 (г/г). PRI me R 11. 1 g of the activated according to example 5 media is treated analogously to example 8. The weight ratio of matrix: ligand 1: 0.0145 (g / g).

П р и м е р 12. 1 г активированного по примеру 7 носителя обрабатывают аналогично примеру 8, но при соотношении ХГХ:ДС, равном 1:9. Весовое соотношение матрица:лиганд 1:0,017 (г/г). PRI me R 12. 1 g of the activated according to example 7 media is treated analogously to example 8, but with a ratio of HHC: DS equal to 1: 9. Weight ratio matrix: ligand 1: 0.017 (g / g).

Определение емкости адсорбентов. Determination of the capacity of adsorbents.

П р и м е р 13. Кровь перфузируют через колонку объемом 1 см³ с адсорбентом, приготовленным согласно одного из примеров 8-12, по замкнутому контуру со скоростью 1 мл/мин в течение 45 мин при соотношении адсорбент : кровь 1: 6 по объему. В плазме крови, содержащей 300 мг/дл общего холестерина, после сорбции определяют концентрацию холестерина, а также содержание ЛНП методом ракетного иммуноэлектрофореза.PRI me R 13. Blood is perfused through a column with a volume of 1 cm ³ with an adsorbent prepared according to one of examples 8-12, in a closed loop at a speed of 1 ml / min for 45 minutes at a ratio of adsorbent: blood 1: 6 by volume. In a blood plasma containing 300 mg / dl of total cholesterol, after sorption, the concentration of cholesterol and the LDL content are determined by the method of missile immunoelectrophoresis.

В табл. 1 приведены сорбционные характеристики адсорбентов, приготовленных согласно вышеприведенным примерам. In the table. 1 shows the sorption characteristics of the adsorbents prepared according to the above examples.

При мольном соотношении хитозан : ДС менее 1:2 образуется водорастворимый поликомплекс, что не позволяет иммобилизовать его на поверхность носителя, а при соотношении компонентов больше 1:12 в системе помимо поликомплекса существует свободный ДС. With a molar ratio of chitosan: DS less than 1: 2, a water-soluble polycomplex is formed, which does not allow it to be immobilized on the surface of the carrier, and with a ratio of components greater than 1:12, in addition to the polycomplex, there is a free DS.

Емкость сорбентов резко снижается при количестве иммобилизованного лиганда меньше 3 мг на 1 г сорбента, а при количестве лиганда на матрице больше 20 мг емкость сорбентов по извлекаемому компоненту практически не меняется. The sorbent capacity sharply decreases when the amount of immobilized ligand is less than 3 mg per 1 g of sorbent, and when the amount of ligand on the matrix is more than 20 mg, the capacity of the sorbents for the extracted component remains almost unchanged.

П р и м е р 14. Регенерация адсорбентов. PRI me R 14. The regeneration of adsorbents.

Адсорбент на основе макропористого стекла или силихрома и силикагеля после контакта с кровью промывают 2-3 раза физиологическим раствором, затем обрабатывают в течение 10 мин 1 М раствором хлористого натрия при соотношении адсорбент: элюент-1: 20 по весу, промывают физиологическим раствором и повторно определяют емкость сорбента на новой порции крови. Емкость сорбента по отношению к ЛНП сохраняется после 3 циклов сорбции-десорбции. The adsorbent based on macroporous glass or silichrome and silica gel after contact with blood is washed 2-3 times with physiological saline, then treated for 10 minutes with a 1 M sodium chloride solution at a ratio of adsorbent: eluent-1: 20 by weight, washed with saline and re-determined sorbent capacity on a new portion of blood. The capacity of the sorbent with respect to LDL is maintained after 3 cycles of sorption-desorption.

П р и м е р 15. Определение гемосовместимости. PRI me R 15. Determination of hemocompatibility.

Донорскую кровь (10 мл) пропускают через колонку, содержащую 1 см³ адсорбента, со скоростью 5 мл/мин в течение 20 мин. До и после сорбции определяют количество тромбоцитов и концентрацию свободного гемоглобина в плазме.Donor blood (10 ml) is passed through a column containing 1 cm ^{3 of} adsorbent at a rate of 5 ml / min for 20 minutes. Before and after sorption, the platelet count and plasma concentration of free hemoglobin are determined.

Полученные данные приведены в табл.2. The data obtained are given in table.2.

Как видно из табл.2, при перфузии крови через колонку с сорбентом, содержащим интерполимерный комплекс, адгезия тромбоцитов на их поверхности значительно ниже показателей, характерных для активированных углей (более 40%), широко применяющихся в гемосорбции. As can be seen from Table 2, when blood is perfused through a column with a sorbent containing an interpolymer complex, the platelet adhesion on their surface is much lower than the values characteristic of activated carbons (more than 40%), which are widely used in hemosorption.

Таким образом, предлагаемые адсорбенты обладают повышенной селективной емкостью по отношению к ЛНП и ЛОНП и хорошей гемосовместимостью при сорбции из протекающей крови. Thus, the proposed adsorbents have an increased selective capacity with respect to LDL and VLDL and good hemocompatibility during sorption from leaking blood.

Claims

ADSORBENT FOR THE REMOVAL OF ATHEROGENIC LIPOPROTEINS FROM BIOLOGICAL LIQUIDS, including a ligand-modified silica matrix, characterized in that it contains a chitosan interpolymer complex with sodium dextransulfate as a ligand with a molar ratio of 1: 2 to 1: 1 to 1: 1 matrix and 1: 1 to 1 0.03 - 1: 0.020 g / g.