RU2016152429A - Меченый антиген е гепаднавируса и его применение в скрининге противовирусных веществ - Google Patents

Claims (41)

1. Способ оценки способности молекулы-кандидата ингибировать ковалентно замкнутую кольцевую (кзк) ДНК гепаднавируса, включающий стадии:

(а) приведения в контакт клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый антиген Е гепаднавируса, с указанной молекулой-кандидатом, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую один или несколько тагов, где последовательность встроена в эпсилон-структуру, кодируемую геномом гепаднавируса,

где указанная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую один или несколько тагов, встроена между нуклеотидами, соответствующими позиции С1902 и позиции А1903 генома HBV,

где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит в направлении 5' от последовательности, кодирующей один или несколько тагов, последовательность, способную образовывать пары с основаниями нижнего стебля эпсилон-структуры, кодируемой геномом гепаднавируса, и где последовательность, способная образовывать пары с основаниями указанного нижнего стебля эпсилон-структуры, кодируемой геномом гепаднавируса, способна образовывать пары с нуклеотидами, соответствующими позициям от Т1849 до А1854 генома HBV;

(б) оценки уровня меченого антигена Е гепаднавируса и

(в) отбора молекулы-кандидата, если уровень меченого антигена Е гепаднавируса снижается по сравнению с контролем.

2. Способ по п. 1, где указанный гепаднавирус представляет собой вирус гепатита В (HBV) и указанный антиген Е гепаднавируса представляет собой антиген Е вируса гепатита В (HBeAg).

3. Способ по п. 1, где указанный меченый антиген Е гепаднавируса содержит только один таг или где указанный меченый антиген Е гепаднавируса содержит два или более тагов.

4. Способ по п. 3, где указанный таг выбран из группы, состоящей из гемагглютининового (НА) тага, His-тага, Flag-тага (такого как 1×Flag-таг или 3×Flag-таг), с-myc-тага, V5-тага и/или С9-тага.

5. Способ по п. 4,

где нуклеотидная последовательность, кодирующая НА таг, приведена в SEQ ID NO: 1; где нуклеотидная последовательность, кодирующая His-таг, приведена в SEQ ID NO: 2;

где нуклеотидная последовательность, кодирующая 1×Flag-таг, приведена в SEQ ID NO: 3; где нуклеотидная последовательность, кодирующая 3×Flag-таг, приведена в SEQ ID NO: 7; где нуклеотидная последовательность, кодирующая c-myc-таг, приведена в SEQ ID NO: 4; где нуклеотидная последовательность, кодирующая V5-таг, приведена в SEQ ID NO: 5; и/или где нуклеотидная последовательность, кодирующая С9-таг, приведена в SEQ ID NO: 6;

или

где аминокислотная последовательность НА тага приведена в SEQ ID NO: 8; где аминокислотная последовательность His-тага приведена в SEQ ID NO: 9; где аминокислотная последовательность 1×Flag-тага приведена в SEQ ID NO: 10; где аминокислотная последовательность 3×Flag-тага приведена в SEQ ID NO: 14; где аминокислотная последовательность c-myc-тага приведена в SEQ ID NO: 11; где аминокислотная последовательность V5-тага приведена в SEQ ID NO: 12; и/или где аминокислотная последовательность С9-тага приведена в SEQ ID NO: 13.

6. Способ по п. 1, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую прекоровый белок гепаднавируса.

7. Способ по п. 6, где нуклеотидная последовательность, кодирующая прекоровый белок гепаднавируса, представляет собой нуклеотидную последовательность прекорового белка вируса гепатита В, приведенную в SEQ ID NO: 15; или

где аминокислотная последовательность прекорового белка гепаднавируса представляет собой аминокислотную последовательность прекорового белка вируса гепатита В, приведенную в SEQ ID NO: 17.

8. Способ по п. 6 или 7, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая один или несколько тагов, находится в направлении 3' по ходу транскрипции относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей 29 N-концевых аминокислот прекорового белка вируса гепатита В.

9. Способ по п. 1, где молекула нуклеиновой кислоты содержит геном гепаднавируса, такой как геном вируса гепатита В (HBV), приведенный в любой из SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34.

10. Способ по п. 9, где указанный геном HBV представляет собой геном HBV подтипа ayw.

11. Способ по п. 1, где эпсилон-структура, кодируемая геномом гепаднавируса, представляет собой эпсилон-структуру, кодируемую геномом HBV, приведенную в SEQ ID NO: 25.

12. Способ по п. 1, где последовательность, способная образовывать пары с основаниями нижнего стебля эпсилон-структуры, кодируемой геномом гепаднавируса, состоит из последовательности, приведенной в SEQ ID No. 26; или где последовательность, способная образовывать пары с основаниями нижнего стебля эпсилон-структуры, кодируемой геномом гепаднавируса, кодирует полипептид, приведенный в SEQ ID NO. 40.

13. Способ по п. 1, где молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый антиген Е гепаднавируса, содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 41; или

где молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый антиген Е гепаднавируса, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 42.

14. Способ по п. 2,

где нуклеотидная последовательность, кодирующая меченый HBeAg, приведена в SEQ ID NO: 20; или где аминокислотная последовательность меченого HBeAg приведена в SEQ ID NO: 22.

15. Способ по п. 6, где нуклеотидная последовательность, кодирующая меченый прекоровый белок HBV, приведена в SEQ ID NO: 19; или где аминокислотная последовательность меченого прекорового белка HBV приведена в SEQ ID NO: 21.

16. Способ по п. 1, в котором указанная стадия (а) дополнительно включает стадию (аа), которая включает культивирование клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый антиген Е гепаднавируса, в условиях, обеспечивающих

(i) синтез прегеномной (пг) РНК гепаднавируса;

(ii) обратную транскрипцию указанной синтезированной пгРНК в минус-цепь ДНК;

(iii) синтез второй плюс-цепи ДНК, чтобы указанная минус-цепь ДНК и указанная плюс-цепь ДНК образовывали двуцепочечную релаксированную кольцевую ДНК;

(iv) образование кзкДНК из указанной релаксированной кольцевой двуцепочечной ДНК;

(v) возможно, восстановление условий, обеспечивающих трансляцию меченого антигена Е гепаднавируса;

(vi) транскрипцию мРНК, кодирующей меченый антиген Е гепаднавируса;

(vii) трансляцию меченого антигена Е гепаднавируса,

где восстановление условий, обеспечивающих трансляцию меченого антигена Е гепаднавируса, представляет собой восстановление стартового кодона.

17. Способ по п. 1, в котором оценку уровня меченого антигена Е гепаднавируса согласно стадии (б) осуществляют с помощью ELISA, CLIA или AlphaLISA.

18. Способ по п. 1, в котором оценка уровня меченого антигена Е гепаднавируса согласно стадии (б) включает применение антитела, специфически распознающего указанный антиген Е гепаднавируса, и одного или нескольких антител, специфически распознающих один или несколько тагов.

19. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую меченый антиген Е гепаднавируса, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую один или несколько тагов, где последовательность встроена в эпсилон-структуру, кодируемую геномом гепаднавируса,

где указанная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую один или несколько тагов, встроена между нуклеотидами, соответствующими позиции С1902 и позиции А1903 генома HBV,

где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит в направлении 5' от последовательности, кодирующей один или несколько тагов, последовательность, способную образовывать пары с основаниями нижнего стебля эпсилон-структуры, кодируемой геномом гепаднавируса, и где последовательность, способная образовывать пары с основаниями указанного нижнего стебля эпсилон-структуры, кодируемой геномом гепаднавируса, способна образовывать пары с нуклеотидами, соответствующими позициям от Т1849 до А1854 генома HBV.