RU2015150098A

RU2015150098A - Способ амплификации днк на основе внедрения в цепь

Info

Publication number: RU2015150098A
Application number: RU2015150098A
Authority: RU
Inventors: Санна ФИЛЕН
Original assignee: Орион Диагностика Ой
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2014-04-23
Publication date: 2017-05-29
Also published as: US10227660B2; EP2989212B1; RU2673733C2; AU2014257553A1; KR20160036528A; JP2016518130A; US20160102343A1; EP2989212A1; CA2908877A1; WO2014173963A1; CN105358711A; ES2687468T3

Claims

1. Способ обнаружения целевой нуклеотидной последовательности токсикогенной C. difficile в образце, причем указанный способ включает приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним прямым праймером, по меньшей мере одним обратным праймером и по меньшей мере одним внедряющимся в цепь олигонуклеотидом в условиях, способствующих амплификации указанной целевой нуклеотидной последовательности,

где каждый указанный праймер и указанный внедряющийся в цепь олигонуклеотид содержит участок, комплементарный указанной целевой нуклеотидной последовательности, и

где указанный внедряющийся в цепь олигонуклеотид переводит по меньшей мере часть целевой нуклеотидной последовательности в одноцепочечное состояние, что позволяет связаться указанным прямому праймеру и обратному праймеру.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевая нуклеотидная последовательность присутствует в гене, локализованном в патогенном локусе (PaLoc) C. difficile, при этом, необязательно, указанный ген C. difficile является геном tcdB или tcdA.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что содержание GC-nap в целевой нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 30%.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный ген C. difficile является геном tcdB, и указанная целевая нуклеотидная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант указанной последовательности.

5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный ген C. difficile является геном tcdA, и указанная целевая нуклеотидная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO: 6 или вариант указанной последовательности.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный прямой праймер является олигонуклеотидом длиною менее 30 нуклеотидов, содержащим последовательность SEQ ID NO: 2 или вариант указанной последовательности, и/или отличающийся тем, что указанный обратный праймер является олигонуклеотидом длиною менее 30 нуклеотидов, содержащим последовательность SEQ ID NO: 3 или вариант указанной последовательности, и/или отличающийся тем, что указанный внедряющийся в цепь олигонуклеотид является олигонуклеотидом длиною более 30 нуклеотидов, содержащим последовательность SEQ ID NO: 4 или вариант указанной последовательности и дополнительно содержащим один или более модифицированных нуклеотидов в своей 3'-области.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный прямой праймер является олигонуклеотидом длиною менее 30 нуклеотидов, содержащим последовательность SEQ ID NO: 7 или вариант указанной последовательности, и/или отличающийся тем, что указанный обратный праймер является олигонуклеотидом длиною менее 30 нуклеотидов, содержащим последовательность SEQ ID NO: 8 или вариант указанной последовательности, и/или отличающийся тем, что указанный внедряющийся в цепь олигонуклеотид является олигонуклеотидом длиною более 30 нуклеотидов, содержащим последовательность SEQ ID NO: 9 или вариант указанной последовательности и дополнительно содержащим один или более модифицированных нуклеотидов в своей 3'-области.

8. Способ по любому из пп. 1-2 и 4-7, отличающийся тем, что дополнительно включает приведение указанного образца в контакт с рекомбиназой.

9. Способ по любому из пп. 1-2 и 4-7, отличающийся тем, что указанный способ осуществляется при изотермических условиях, способствующих амплификации указанной целевой нуклеотидной последовательности.

10. Композиция, содержащая по меньшей мере два олигонуклеотида, выбранные из (a) прямого праймера, (b) обратного праймера и (c) внедряющегося в цепь олигонуклеотида,

где каждый указанный олигонуклеотид определен по п. 6, или где каждый указанный олигонуклеотид определен по п. 7.

11. Набор, содержащий по меньшей мере два олигонуклеотида, выбранные из (a) прямого праймера, (b) обратного праймера и (c) внедряющегося в цепь олигонуклеотида,

12. Композиция по п. 10 или набор по п. 11, содержащая по меньшей мере один олигонуклеотид из пункта (a), по меньшей мере один олигонуклеотид из пункта (b), и по меньшей мере один олигонуклеотид из пункта (c).

13. Композиция или набор по п. 12, дополнительно содержащая ДНК-полимеразу и/или рекомбиназу.

14. Применение прямого праймера, обратного праймера и, необязательно, внедряющегося в цепь олигонуклеотида, каждый из которых определен по п. 6 или каждый из которых определен по п.7, в способе обнаружения токсикогенной C. difficile.

15. Способ диагностики инфекции, вызванной C. difficile, у пациента, включающий осуществление способа, который определен по любому из пп. 1-9, в образце от указанного пациента.