RU2013153505A

RU2013153505A - Способы, системы и композиции для детекции микробной днк при помощи пцр

Info

Publication number: RU2013153505A
Application number: RU2013153505/10A
Authority: RU
Inventors: Чин-Пин ЦЕН; Шай-Шинь ЧАН
Original assignee: ДАЙНОКЬЮБ ИНВЕСТМЕНТС,ЭлЭлСи; ЦЕН,Чин-Пин
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2015-06-27
Also published as: US9388458B2; TWI465572B; AU2012255042A1; EP2710155A4; JP6112623B2; EP2710155A2; US20120295806A1; CA2842659A1; KR20140071968A; RU2620953C2; AU2012255042B2; WO2012159060A3; BR112013029601A2; CN103917660B; TW201247878A; CN103917660A; JP2014516529A; WO2012159060A2

Abstract

1. Способ селективной амплификации одной или нескольких целевых бактериальных ДНК в образце, включающий:гибридизацию множества гибридизационных зондов с указанной целевой микробной ДНК, где каждый из указанных гибридизационных зондов содержит 5′-концевой участок, имеющий последовательность небактериальной ДНК, выбранную из вирусной последовательности или искусственно сконструированной последовательности, и 3′-концевой участок, имеющий последовательность, комплементарную участку последовательности гена бактериальной 16S rRNA;удаление негибридизированных гибридизационных зондов и любого несвязанного 3′-концевого участка целевой бактериальной ДНК;удлинение 3′-концов гибридизационных зондов и целевой бактериальной ДНК с образованием двухцепочечных, удлиненных с помощью праймера матриц ипроведение способа ПЦР для селективного амплифицирования удлиненных с помощью праймера матриц при помощи набора праймеров, который включает по меньшей мере один праймер, имеющий небактериальную последовательность, комплементарную небактериальной последовательности гибридизационных зондов.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап удаления и этап удлинения включают добавление смеси экзонуклеазы I и ДНК-полимеразы Кленова.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что последовательность указанного 3′-концевого участка гибридизационных зондов комплементарна консервативному участку последовательности гена 16S рРНК.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ ПЦР выбирают из стандартной ПЦР или ПЦР в режиме реального времени.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный образец не обрабатывают от контаминиров�

Claims

1. Способ селективной амплификации одной или нескольких целевых бактериальных ДНК в образце, включающий:

гибридизацию множества гибридизационных зондов с указанной целевой микробной ДНК, где каждый из указанных гибридизационных зондов содержит 5′-концевой участок, имеющий последовательность небактериальной ДНК, выбранную из вирусной последовательности или искусственно сконструированной последовательности, и 3′-концевой участок, имеющий последовательность, комплементарную участку последовательности гена бактериальной 16S rRNA;

удаление негибридизированных гибридизационных зондов и любого несвязанного 3′-концевого участка целевой бактериальной ДНК;

удлинение 3′-концов гибридизационных зондов и целевой бактериальной ДНК с образованием двухцепочечных, удлиненных с помощью праймера матриц и

проведение способа ПЦР для селективного амплифицирования удлиненных с помощью праймера матриц при помощи набора праймеров, который включает по меньшей мере один праймер, имеющий небактериальную последовательность, комплементарную небактериальной последовательности гибридизационных зондов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап удаления и этап удлинения включают добавление смеси экзонуклеазы I и ДНК-полимеразы Кленова.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что последовательность указанного 3′-концевого участка гибридизационных зондов комплементарна консервативному участку последовательности гена 16S рРНК.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ ПЦР выбирают из стандартной ПЦР или ПЦР в режиме реального времени.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный образец не обрабатывают от контаминирования бактериальной ДНК.

6. Способ детекции бактериальной инфекции у субъекта, включающий:добавление множества гибридизационных зондов в образец субъекта, где каждый из указанных гибридизационных зондов содержит 5′-концевой участок, имеющий последовательность небактериальной ДНК, выбранную из вирусной последовательности или искусственно сконструированной последовательности, 3′-концевой участок, имеющий последовательность, комплементарную участку целевой бактериальной ДНК;

гибридизацию гибридизационных зондов с бактериальной ДНК в образце;

удаление негибридизированных гибридизационных зондов и любого несвязанного 3′-концевого участка бактериальной ДНК;

удлинение 3′-концов гибридизационных зондов и бактериальной ДНК с образованием двухцепочечных, удлиненных с помощью праймера матриц;

амплифицирование удлиненных с помощью праймера матриц путем проведения способа ПЦР при помощи набора праймеров, который включает по меньшей мере один прямой праймер, имеющий небактериальную последовательность, комплементарную небактериальной последовательности гибридизационного зонда; и

анализирование амплифицированных ПЦР-продуктов для определения присутствия или отсутствия бактерии.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный образец не обрабатывают от контаминации бактериальной ДНК.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что последовательность указанного 3′-концевого участка гибридизационных зондов комплементарна консервативному участку последовательности гена 16S рРНК.

9. Гибридизационный зонд для создания удлиненной с помощью праймера ДНК-матрицы из целевой бактериальной ДНК в образце для селективной амплификации с помощью способа ПЦР, при этом указанный гибридизационный зонд содержит:

5′-концевой участок, имеющий небактериальную последовательность, выбранную из вирусной последовательности и искусственно сконструированной последовательности; и

3′-концевой участок, имеющий последовательность, комплементарную участку последовательности гена бактериальной 16S rRNA.

10. Гибридизационный зонд по п.9, отличающийся тем, что указанная небактериальная последовательность представляет собой последовательность прямого праймера M13.

11. Гибридизационный зонд по п.9, отличающийся тем, что последовательность указанного 3′-концевого участка гибридизационного зонда комплементарна консервативной последовательности гена 16S рРНК.

12. Набор для создания удлиненной с помощью праймера ДНК-матрицы из целевой микробной ДНК для селективной ПЦР-амплификации и детекции, включающий:

множество гибридизационных зондов по п.9.

13. Набор по п.12, дополнительно включающий смесь 3′-5′-экзонуклеазы и ДНК-полимеразы Кленова.

14. Система для детекции целевой бактерии в образце, которая содержит:

блок приема образца для приема образца;

блок обработки образца и

блок анализа образца для анализа образца,

где указанный блок обработки образца представляет собой управляемый компьютером блок, выполненный с возможностью осуществления этапов:

добавления множества гибридизационных зондов по п.9 в образец и поддерживания условия реакции с тем, чтобы позволить гибридизационным зондам гибридизироваться с бактериальной ДНК в образце;

добавления реактива для разрушения/удлинения для:

удаления негибридизированных гибридизационных зондов и несвязанного 3′-концевого участка гибридизированной целевой бактериальной ДНК, и

удлинения 3′-концов гибридизированных гибридизационных зондов и целевой микробной ДНК в направлении от 3′ к 5′для создания двухцепочечных, удлиненных с помощью праймера матриц;

добавления реактивов для ПЦР и поддерживание условий реакции для осуществления ПЦР-амплификации удлиненных с помощью праймера матриц, где указанные реактивы для ПЦР включают по меньшей мере один праймер, имеющий последовательность, комплементарную небактериальной последовательности гибридизационных зондов; и

перемещения обработанного образца в блок анализа для анализа.

15. Система по п.14, отличающаяся тем, что указанный блок анализа представляет собой блок анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью.