Claims (28)
1. Способ определения способности соединения или средства снижать активность простагландин-синтазы, выбранной из группы, состоящей из микросомальной простагландин-Е-синтазы (mPGES) и гематопоэтической простагландин-D-синтазы (hPGDS), в реакции с субстратом с образованием конечного простагландина, включающий следующие стадии:1. A method for determining the ability of a compound or agent to reduce the activity of prostaglandin synthase selected from the group consisting of microsomal prostaglandin E synthase (mPGES) and hematopoietic prostaglandin D synthase (hPGDS), in reaction with a substrate to form the final prostaglandin, including following stages:
(a) перемешивание простагландин-синтазы с субстратом, кофактором и соединением или средством;(a) mixing prostaglandin synthase with a substrate, cofactor and compound or agent;
(б) инкубирование смеси, полученной на стадии (a), с останавливающим раствором, который содержит средство, препятствующее спонтанному превращению субстрата в конечный простагландин;(b) incubating the mixture obtained in stage (a) with a stopping solution that contains an agent that prevents the spontaneous conversion of the substrate to the final prostaglandin;
(в) инкубирование смеси, полученной на стадии (б), с детектирующим реагентом, содержащим конечный простагландин, помеченный флуоресцентной меткой, и антитело, для которого конечный простагландин является иммуногеном;(c) incubating the mixture obtained in step (b) with a detection reagent containing the final prostaglandin labeled with a fluorescent label and an antibody for which the final prostaglandin is an immunogen;
(г) облучение смеси, полученной на стадии (в), и контрольной смеси плоскополяризованным светом с длиной волны возбуждения флуоресцентной метки и измерение поляризации флуоресценции в смеси, полученной на стадии (в) и в контрольной смеси; и(d) irradiating the mixture obtained in stage (c) and the control mixture with plane-polarized light with a wavelength of excitation of the fluorescent label and measuring the polarization of fluorescence in the mixture obtained in stage (c) and in the control mixture; and
(e) сравнение результатов измерений, выполненных на стадии (г),(e) a comparison of the measurements made in step (d),
причем если величина поляризации флуоресценции смеси, полученной на стадии (в), превышает значение поляризации флуоресценции контрольной смеси, это является показателем того, что соединение или средство снижает активность простагландин-синтазы.moreover, if the fluorescence polarization value of the mixture obtained in stage (c) exceeds the fluorescence polarization value of the control mixture, this is an indication that the compound or agent reduces the activity of prostaglandin synthase.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что простагландин-синтаза представляет собой микросомальную простагландин-Е-синтазу (mPGES), субстратом является простагландин H2 (PGH2), кофактором - глютатион (GSH), а конечным простагландином - простагландин Е2 (PGE2).2. The method according to claim 1, characterized in that prostaglandin synthase is a microsomal prostaglandin E synthase (mPGES), the substrate is prostaglandin H 2 (PGH 2 ), the cofactor is glutathione (GSH), and the final prostaglandin is prostaglandin E 2 (PGE 2 ).
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что микросомальная простагландин-Е-синтаза представляет собой человеческую mPGES, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.3. The method according to claim 2, characterized in that the microsomal prostaglandin E synthase is a human mPGES containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что простагландин-синтаза представляет собой гематопоэтическую простагландин-D-синтазу (hPGDS), субстратом является PGH2, кофактором - глютатион (GSH), а конечным простагландином - простагландин D2 (PGD2).4. The method according to claim 1, characterized in that prostaglandin synthase is a hematopoietic prostaglandin D synthase (hPGDS), the substrate is PGH 2 , the cofactor is glutathione (GSH), and the final prostaglandin is prostaglandin D 2 (PGD 2 ) .
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что гематопоэтическая простагландин-D-синтаза представляет собой человеческую гематопоэтическую простагландин-D-синтазу и включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.5. The method according to claim 4, characterized in that the hematopoietic prostaglandin-D synthase is a human hematopoietic prostaglandin-D synthase and includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что средством останавливающего раствора является FeCl2.6. The method according to claim 1, characterized in that the means of the stopping solution is FeCl 2 .
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что флуоресцентная метка содержит флуоресцеин, фикоэритрин (ФЭ), техасский красный (ТК), родамин, свободные соли лантаноидов, хелатные соли лантаноидов, BODIPY, ALEXA или CyDye.7. The method according to claim 1, characterized in that the fluorescent label contains fluorescein, phycoerythrin (FE), Texas Red (TC), rhodamine, free lanthanide salts, chelate salts of lanthanides, BODIPY, ALEXA or CyDye.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентной метки выступает техасский красный (ТК).8. The method according to claim 7, characterized in that the texas red (TK) acts as a fluorescent label.
9. Способ по п.2, отличающийся тем, что средством останавливающего раствора является FeCl2.9. The method according to claim 2, characterized in that the means of the stopping solution is FeCl 2 .
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что стадия инкубирования (б) имеет продолжительность, по крайней мере 30 секунд, а стадия инкубирования (в) продолжается по крайней мере 3 минуты.10. The method according to claim 9, characterized in that the incubation step (b) has a duration of at least 30 seconds, and the incubation step (c) lasts at least 3 minutes.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что флуоресцентная метка содержит флуоресцеин, фикоэритрин (ФЭ), техасский красный (ТК), родамин, свободные соли лантаноидов, хелатные соли лантаноидов, BODIPY, ALEXA или CyDye.11. The method according to claim 10, characterized in that the fluorescent label contains fluorescein, phycoerythrin (FE), Texas Red (TC), rhodamine, free lanthanide salts, chelating salts of lanthanides, BODIPY, ALEXA or CyDye.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что флуоресцентной меткой является техасский красный (ТК), а длина волны плоскополяризованного возбуждающего света составляет 580±20 нм.12. The method according to claim 11, characterized in that the fluorescent label is Texas Red (TC), and the wavelength of plane-polarized exciting light is 580 ± 20 nm.
13. Способ по п.4, отличающийся тем, что средством останавливающего раствора является FeCl2.13. The method according to claim 4, characterized in that the means of the stopping solution is FeCl 2 .
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что флуоресцентная метка содержит флуоресцеин, фикоэритрин (ФЭ), техасский красный (ТК), родамин, свободные соли лантаноидов, хелатные соли лантаноидов, BODIPY, ALEXA или CyDye.14. The method according to item 13, wherein the fluorescent label contains fluorescein, phycoerythrin (FE), Texas red (TC), rhodamine, free lanthanide salts, chelate salts of lanthanides, BODIPY, ALEXA or CyDye.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что флуоресцентной меткой является техасский красный (ТК), а длина волны плоскополяризованного возбуждающего света составляет 580±20 нм.15. The method according to 14, characterized in that the fluorescent label is Texas Red (TC), and the wavelength of plane-polarized exciting light is 580 ± 20 nm.
16. Способ определения способности соединения или средства снижать активность простагландин-синтазы, выбранной из группы, состоящей из гематопоэтической простагландин-D-синтазы (hPGDS) и микросомальной простагландин-Е-синтазы (mPGES), в реакции с субстратом с образованием конечного простагландина, включающий следующие стадии:16. A method for determining the ability of a compound or agent to reduce the activity of prostaglandin synthase selected from the group consisting of hematopoietic prostaglandin D synthase (hPGDS) and microsomal prostaglandin E synthase (mPGES), in reaction with a substrate to form the final prostaglandin, including following stages:
(a) перемешивание простагландин-синтазы с субстратом, кофактором и соединением или средством;(a) mixing prostaglandin synthase with a substrate, cofactor and compound or agent;
(б) инкубирование смеси, полученной на стадии (a), с останавливающим раствором, который содержит средство, препятствующее спонтанному превращению непрореагировавшего субстрата в конечный простагландин;(b) incubating the mixture obtained in stage (a) with a stopping solution that contains an agent that prevents the spontaneous conversion of the unreacted substrate to the final prostaglandin;
(в) инкубирование смеси, полученной на стадии (б), с детектирующим реагентом, содержащим конечный простагландин, помеченный техасским красным, и антитело, для которого конечный простагландин является иммуногеном;(c) incubating the mixture obtained in stage (b) with a detection reagent containing the final prostaglandin labeled with Texas red and an antibody for which the final prostaglandin is an immunogen;
(г) облучение смеси, полученной на этапе (в), и контрольной смеси плоскополяризованным светом с длиной волны 580±20 нм и измерение поляризации флуоресценции для смеси, полученной на стадии (в), и контрольной смеси при 620±20 нм; и(d) irradiating the mixture obtained in stage (c) and the control mixture with plane-polarized light with a wavelength of 580 ± 20 nm and measuring the fluorescence polarization for the mixture obtained in stage (c) and the control mixture at 620 ± 20 nm; and
(д) сравнение результатов измерений, выполненных на стадии (г),(e) a comparison of the measurement results performed in stage (d),
причем если величина поляризации флуоресценции смеси, полученной на стадии (в), превышает значение поляризации флуоресценции контрольной смеси, то соединение или средство снижает активность простагландин-синтазы.moreover, if the polarization fluorescence polarization of the mixture obtained in stage (c) exceeds the polarization fluorescence polarization of the control mixture, then the compound or agent reduces the activity of prostaglandin synthase.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что простагландин-синтаза представляет собой человеческую микросомальную простагландин-Е-синтазу (mPGES), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, субстратом является простагландин H2 (PGH2), кофактором - глютатион, а конечным простагландином - простагландин Е2 (PGE2).17. The method according to clause 16, wherein the prostaglandin synthase is a human microsomal prostaglandin E synthase (mPGES) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the substrate is prostaglandin H 2 (PGH 2 ), the cofactor is glutathione and the final prostaglandin is prostaglandin E 2 (PGE 2 ).
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что средством останавливающего раствора является FeCl2.18. The method according to 17, characterized in that the means of the stopping solution is FeCl 2 .
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что конечный простагландин, помеченный техасским красным, содержит молекулу линкера, с которой связываются конечный простагландин и техасский красный.19. The method according to p. 18, characterized in that the final prostaglandin labeled with Texas red contains a linker molecule, which binds the final prostaglandin and Texas red.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что молекула линкера выбирается из группы, включающей аминомасляную кислоту, аминокапроновую кислоту, 7-аминогептановую кислоту, 8-аминокаприловую кислоту, Fmoc-аминокапроновую кислоту, один или несколько -аланинов, изотиоцианатную группу, сукцинимидиловый эфир, галоидное производное сульфонала и карбодиимид.20. The method according to claim 19, characterized in that the linker molecule is selected from the group consisting of aminobutyric acid, aminocaproic acid, 7-aminoheptanoic acid, 8-aminocaprylic acid, Fmoc-aminocaproic acid, one or more α-alanines, an isothiocyanate group, and succinimididyl ether, a halide derivative of sulfonal and carbodiimide.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что молекулой линкером является карбодиимид.21. The method according to claim 20, characterized in that the linker molecule is carbodiimide.
22. Способ по п.16, отличающийся тем, что простагландин-синтаза представляет собой человеческую гематопоэтическую простагландин-D-синтазу (hPGDS), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, субстратом является PGH2, кофактором - глютатион, а конечным простагландином - простагландин D2 (PGD2).22. The method according to clause 16, wherein the prostaglandin synthase is a human hematopoietic prostaglandin D synthase (hPGDS) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the substrate is PGH 2 , the cofactor is glutathione, and the final prostaglandin is prostaglandin D 2 (PGD 2 ).
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что средством останавливающего раствора является FeCl2.23. The method according to item 22, wherein the means of the stopping solution is FeCl 2 .
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что конечный простагландин, помеченный техасским красным, содержит молекулу линкера, с которой связываются конечный простагландин и техасский красный.24. The method according to item 23, wherein the final prostaglandin labeled with texas red contains a linker molecule with which the final prostaglandin and texas red bind.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что молекула линкера выбирается из группы, включающей аминомасляную кислоту, аминокапроновую кислоту, 7-аминогептановую кислоту, 8-аминокаприловую кислоту, Fmoc-аминокапроновую кислоту, один или несколько -аланинов, изотиоцианатную группу, сукцинимидиловый эфир, галоидное производное сульфонала и карбодиимид.25. The method according to p. 24, characterized in that the linker molecule is selected from the group consisting of aminobutyric acid, aminocaproic acid, 7-aminoheptanoic acid, 8-aminocaprylic acid, Fmoc-aminocaproic acid, one or more α-alanines, an isothiocyanate group, and succinimidyl ether, a halide derivative of sulfonal and carbodiimide.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что в качестве молекулы линкера используется карбодиимид.26. The method according A.25, characterized in that the carbodiimide is used as the linker molecule.
27. Способ определения способности соединения или средства снижать активность человеческой микросомальной простагландин-Е-синтазы (mPGES), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в реакции с субстратом простагландином Н2 (PGH2) с образованием простагландина E2 (PGE2), включающий следующие стадии:27. A method for determining the ability of a compound or agent to reduce the activity of human microsomal prostaglandin E synthase (mPGES) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in reaction with a prostaglandin H 2 substrate (PGH 2 ) to form prostaglandin E 2 (PGE 2 ) comprising the following steps:
(a) перемешивание mPGES с PGH2, глютатионом и соединением или средством;(a) mixing mPGES with PGH 2 , glutathione and a compound or agent;
(б) инкубирование смеси, полученной на стадии (а) с останавливающим раствором, который содержит FeCl2;(b) incubating the mixture obtained in stage (a) with a stopping solution that contains FeCl 2 ;
(в) инкубирование смеси, полученной на стадии (б) с детектирующим реагентом, содержащим PGE2, помеченный техасским красным, и антителом, для которого PGE2 является иммуногеном;(c) incubating the mixture obtained in step (b) with a detection reagent containing PGE 2 marked with Texas red and an antibody for which PGE 2 is an immunogen;
(г) облучение смеси, полученной на этапе (в), и контрольной смеси плоскополяризованным светом с длиной волны 580±20 нм и измерение поляризации флуоресценции для смеси, полученной на стадии (в), и контрольной смеси; и(d) irradiating the mixture obtained in stage (c) and the control mixture with plane-polarized light with a wavelength of 580 ± 20 nm and measuring the fluorescence polarization for the mixture obtained in stage (c) and the control mixture; and
(д) сравнение результатов измерений, выполненных на стадии (г), причем если величина поляризации флуоресценции смеси, полученной на стадии (в), превышает значение поляризации флуоресценции контрольной смеси, то соединение или средство снижает активность mPGES.(e) comparing the results of the measurements performed in step (d), wherein if the fluorescence polarization of the mixture obtained in step (c) exceeds the fluorescence polarization of the control mixture, then the compound or agent reduces the activity of mPGES.
28. Способ определения способности соединения или средства снижать активность человеческой гематопоэтической простагландин-D-синтазы (hPGDS), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, в реакции с субстратом простагландином Н2 (PGH2) с образованием простагландина D2 (PGG2), включающий следующие стадии:28. A method for determining the ability of a compound or agent to reduce the activity of human hematopoietic prostaglandin D synthase (hPGDS) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in reaction with a prostaglandin H 2 substrate (PGH 2 ) to form prostaglandin D 2 (PGG 2 ) comprising the following steps:
(a) перемешивание hPGDS с PGH2, глютатионом и соединением или средством;(a) mixing hPGDS with PGH 2 , glutathione and a compound or agent;
(б) инкубирование смеси, полученной на стадии (а) с останавливающим раствором, который содержит FeCl2;(b) incubating the mixture obtained in stage (a) with a stopping solution that contains FeCl 2 ;
(в) инкубирование смеси, полученной на этапе б) с детектирующим реагентом, содержащим PGD2, помеченный техасским красным, и антителом, для которого PGD2 является иммуногеном;(c) incubating the mixture obtained in step b) with a detection reagent containing PGD 2 labeled with Texas Red and an antibody for which PGD 2 is an immunogen;
(г) облучение смеси, полученной на этапе (в), и контрольной смеси плоскополяризованным светом с длиной волны 580±20 нм и измерение поляризации флуоресценции для смеси, полученной на стадии (в), и контрольной смеси; а также(d) irradiating the mixture obtained in stage (c) and the control mixture with plane-polarized light with a wavelength of 580 ± 20 nm and measuring the fluorescence polarization for the mixture obtained in stage (c) and the control mixture; and
(д) сравнение результатов измерений, выполненных на стадии (г),(e) a comparison of the measurement results performed in stage (d),
причем если величина поляризации флуоресценции смеси, полученной на стадии (в), превышает значение поляризации флуоресценции контрольной смеси, то соединение или средство снижает активность hPGDS.moreover, if the polarization fluorescence polarization of the mixture obtained in stage (c) exceeds the polarization fluorescence polarization of the control mixture, the compound or agent reduces the activity of hPGDS.