RU2057542C1 - Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота - Google Patents
Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2057542C1 RU2057542C1 RU94004516A RU94004516A RU2057542C1 RU 2057542 C1 RU2057542 C1 RU 2057542C1 RU 94004516 A RU94004516 A RU 94004516A RU 94004516 A RU94004516 A RU 94004516A RU 2057542 C1 RU2057542 C1 RU 2057542C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- aqueous solution
- isopropanol
- ion exchanger
- purification
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 113
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 82
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 30
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-1,1,1-trifluorobutane Chemical compound FC(F)(F)CCCBr DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Substances CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000039 preparative column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M methacrylate group Chemical group C(C(=C)C)(=O)[O-] CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229940119528 pork insulin Drugs 0.000 claims 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 claims 1
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 abstract description 6
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001253 acrylic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 1.0 N Substances 0.000 description 1
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 description 1
- 206010012655 Diabetic complications Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010049287 Lipodystrophy acquired Diseases 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006132 lipodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к технологии очистки полипептидов. Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота путем колоночной препаративной хроматографии низкого давления включает пропускание водного раствора инсулина - сырца рН 3,0 - 3,5 через ионит - продукт сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, имеющий степень набухания Kн а б = 4,5 - 4,8 и полную обменную емкость 9,2 - 9,8 мг • экв / г, и процесс осуществляют путем пропускания водного раствора инсулина - сырца с рН 3,0 - 3,5 через указанный ионит, предварительно уравновешенный 10 - 16 %-ным водным раствором изопропанола рН 3,0 - 3,5, затем ионит промывают 10 - 16 %-ным водным раствором изопропанола ( рН 3,0 - 3,5 ) и проводят элюцию инсулина 20 - 25 %-ным водным раствором изопропанола рН 3,4 - 3,9, содержащим 0,05 - 0,15 М ацетата аммония, из полученного алюата целевой продукт выделяют осаждением. Заявляемый способ позволяет повысить степень очистки инсулина до 98,7 %.
Description
Изобретение относится к технологии очистки полипептидов, а точнее к способу очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота, широко используемого в медицинской практике для лечения сахарного диабета.
Применение в медицинской практике инсулинов низкой степени очистки приводит к ряду осложнений, таких как инсулинорезистентность и синдром хронической передозировки инсулина, развитие диабетических осложнений: ретинопатии, нефропатии и других, различного рода аллергий к инсулину, липодистрофии, и в конечном итоге, к высокой смертности больных диабетом.
Согласно ВФС 42-2150-92 и международным фармакопейным требованиям препарат инсулина должен содержать не менее 97% целевого вещества при содержании проинсулина не более 10 п.п.м. [нг/мг] Этим показателям соответствуют инсулины, получаемые с помощью хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) в лабораторных условиях. До сих пор однако не разработана технология препаративного выделения высокоочищенного инсулина, которая могла бы быть широко использована на предприятиях фармацевтической промышленности. Наиболее доступной для промышленного освоения с точки зрения аппаратурного оформления и количественных выходов высокоочищенного инсулина является технология, основанная на препаративной колоночной хроматографии низкого давления.
Известен способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота при помощи колоночной хроматографии низкого давления. Указанный способ включает пропускание через колонку Wofatit 5%-ного раствора инсулина в 1 н. СН3СООН при соотношении раствора и смолы 5:1 (рН 4,5). Адсорбированный продукт элюируют смесью вода: ацетон (6:4 по объему) при соотношении элюента и смолы 25:1. Затем элюат упаривают в вакууме до концентрации 2-3 г/л, добавляют 20%-ный водный раствор этанола (1:6 по объему), гомогенизируют и выдерживают в течение 24 ч при t 0-5оС. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают. Выход из 100 г инсулина-сырца 67 г инсулина со степенью чистоты 94% Указанный способ очистки инсулина с помощью колоночной хроматографии низкого давления характеризуется низким выходом целевого продукта и низкой степенью очистки, не превышающей 94% и несмотря на некоторые технологические преимущества (традиционное аппаратурное оформление, дешевизна процесса) по сравнению, например, с методом хроматографии высокого давления, не может быть использован для получения препаратов инсулина, удовлетворяющих современным фармакопейным требованиям.
В основу изобретения положена задача разработки путем изменения технологических операций способа очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота, позволяющего повысить степень очистки инсулина до степени очистки, соответствующей фармакопейным требованиям, и увеличить его выход.
Задача решена тем, что в заявленном способе очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота путем колоночной препаративной хроматографии низкого давления, включающей пропускание водного раствора инсулина-сырца через ионит с последующей элюцией инсулина и осаждения его из элюата, согласно изобретению, в качестве ионита используют продукт сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, имеющий степень набухания Кнаб. 4,5-4,8, полную обменную емкость 9,2-9,8 мг·экв/г, и процесс осуществляют путем пропускания водного раствора инсулина-сырца рН 3,0-3,5 через указанный ионит, предварительно уравновешенный 10-16%-ным водным раствором изопропанола рН 3,0-3,5, затем ионит промывают 10-16%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,0-3,5) и проводят элюцию инсулина 20-25% -ным водным раствором изопропилового спирта рН 3,4-3,9, содержащим 0,05-0,15 М ацетата аммония, из полученного элюата целевой продукт выделяют осаждением.
Заявленный способ позволяет повысить степень очистки инсулина до 98,7% с содержанием проинсулина 0,5-4,1 п. п.м. в сравнении с известным способом, который обеспечивает степень очистки до 94% Кроме того, заявляемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта до 86,1 мас. (выход целевого продукта по известному способу 67 мас.).
Существенным дополнительным преимуществом заявляемого способа по сравнению с известным является значительное уменьшение количества требуемого биосорбента. Для получения 1 кг свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота необходимо использовать 2,2 кг ионита в заявляемом способе и 10-11,5 кг ионита Wofatit в известном способе. При этом сорбент в заявляемом способе выдерживает сотни циклов регенерации и актов сорбции-десорбции, сохраняя без изменения емкость сорбции и ее 100% обратимость.
Способ осуществляют следующим образом. Водный раствор исходного инсулина-сырца, подкисленный 0,1 н. НСl рН 3,0-3,5, пропускают через ионит-продукт радикальной сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, уравновешенный 10-16%-ным водным раствором изопропилового спирта рН 3,0-3,5 при соотношении раствора и смолы 1:1. Ионит промывают 10-16%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,0-3,5), в количестве 2-3 объемов сорбционной колонки и элюируют инсулин 20-25%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,4-3,9), содержащим 0,05-0,15 М ацетата аммония. К элюату добавляют абсолютный этиловый спирт и выкристаллизовывают целевой продукт. Анализ заявляемых условий проведения процесса очистки инсулина показал следующее:
снижение рН раствора инсулина перед сорбцией до 2,0-2,8 приводит к уменьшению равновесной емкости сорбции. Повышение рН до 4,0-4,5 приводит к необратимой сорбции инсулина, а при рН > 4,7 происходит агрегация и выпадение в осадок инсулина;
увеличение концентрации водного раствора изопропилового спирта (> 16%) приводит к снижению чистоты целевого продукта. Уменьшение концентрации (<10% ) водного раствора изопропилового спирта также приводит к снижению чистоты целевого продукта и ухудшению его выхода;
Уменьшение концентрации изопропилового спирта на стадии элюции (<20%) приводит к увеличению объема элюата, что затрудняет проведение кристаллизации. Увеличение данной концентрации (>25%) приводит к снижению чистоты целевого продукта;
уменьшение или увеличение концентрации ацетата аммония на стадии элюции приводит к ассоциатообразованию и необратимости сорбции;
уменьшение или увеличение рН при элюции приводит к снижению чистоты целевого продукта.
снижение рН раствора инсулина перед сорбцией до 2,0-2,8 приводит к уменьшению равновесной емкости сорбции. Повышение рН до 4,0-4,5 приводит к необратимой сорбции инсулина, а при рН > 4,7 происходит агрегация и выпадение в осадок инсулина;
увеличение концентрации водного раствора изопропилового спирта (> 16%) приводит к снижению чистоты целевого продукта. Уменьшение концентрации (<10% ) водного раствора изопропилового спирта также приводит к снижению чистоты целевого продукта и ухудшению его выхода;
Уменьшение концентрации изопропилового спирта на стадии элюции (<20%) приводит к увеличению объема элюата, что затрудняет проведение кристаллизации. Увеличение данной концентрации (>25%) приводит к снижению чистоты целевого продукта;
уменьшение или увеличение концентрации ацетата аммония на стадии элюции приводит к ассоциатообразованию и необратимости сорбции;
уменьшение или увеличение рН при элюции приводит к снижению чистоты целевого продукта.
Чистоту выделенного свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), содержание проинсулина в препаратах инсулина методом радиоммунологического анализа (РИА).
Выход целевого продукта составляет 80,0-86,1 мас. при степени чистоты 98,0-98,7% с содержанием проинсулина 0,5-4,1 п.п.м.
П р и м е р 1. 150 мг свиного инсулина (88,4% по данным ВЭЖХ, содержание проинсулина 25400 п.п.м. по данным радиоиммунологического анализа) растворяют в 10 мл воды, подкисленной 0,1 н.НСl до рН 3,1. Полученный раствор пропускают через колонку с ионитом, представляющим собой продукт радикальной сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля (степень набухания Кнаб. 4,5; полная обменная емкость 9,6 мг·экв/г). Предварительно ионит измельчают на гранулы 100-150 мкм, промывают водой, этанолом, водой, 0,5 н. раствором NaOH, водой, 1,0 н, раствором HCl, водой. После сушки до постоянной массы ионит уравновешивают 15%-ным водным раствором изопропанола, подкисленным 0,1 н. НСl до рН 3,1 и помещают в колонку размером d 1,5 см, Н 4,5 см, V 10 мл.
Сорбцию инсулина ведут со скоростью 5 мл/см2 ·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 20 мл 15%-ного водного раствора изопропанола (рН 3,1) и десорбируют инсулин 20%-ным водным раствором изопропанола (рН 3,5), содержащим 0,1 М ацетата аммония. К элюату (4,5 мл) добавляют 26 мл абсолютного этилового спирта. Выпавший продукт отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат при 35оС.
Получают 121,5 мг инсулина (выход 86,7 мас.) со степенью чистоты 98,4% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 4,1 п.п.м. (по данным РИА).
П р и м е р 2. 740 мг инсулина крупного рогатого скота с 81,2% чистоты (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 43200 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 32 мл воды, подкисленной 0,1 н.НСl до рН 3,5. Полученный раствор пропускают через колонку (D 2,5 см, Н 10 см, V 35 мм) с ионитом аналогичным примеру 1, уравновешенным 18%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,5). Сорбцию ведут при скорости пропускания 10 мл/см2 ·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 70 мл 16% -ного водного изопропилового спирта, и десорбируют инсулин 22%-ным водным изопропанолом (рН3,7), содержащим 0,15 М ацетата аммония. К элюату (V 22 мл) добавляют 110 мл абсолютного этилового спирта и получают 629,1 мг инсулина крупного рогатого скота (выход 85,1 мас.) со степенью чистоты 98,1% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 2,8 п.п.м. (по данным РИА).
П р и м е р 3. 2,1 г свиного инсулина с 81,8% чистоты (по данным ВЭЖХ) и содержанием проинсулина 32400 п. п.м. (по данным РИА) растворяют в 130 мл воды, подкисленной до рН 3,3. Полученный раствор пропускают через колонку (D 28 см, Н 12 см, V 140 мм), с ионитом-продуктом радикальной сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля (степень набухания Кнаб. 4,8; полная обменная емкость 9,8 мг·экв/г), уравновешенную 16% -ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,3). Сорбцию ведут при скорости 12 мл/см2·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 280 мл 16%-ным раствором изопропанола и десорбируют инсулин 23%-ным водным изопропанолом (рН 3,8), содержащим 0,1 М ацетата аммония.
К элюату (115 мл) добавляют 512 мл абсолютного этилового спирта. Получают 1,72 г свиного инсулина (выход 82 мас.) со степенью чистоты 98,6% (по данным ВЭЖХ) и содержанием проинсулина 0,5 п.п.м. (по данным РИА).
П р и м е р 4. 2,2 г инсулина крупного рогатого скота со степенью чистоты 79,8% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 238 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 142 мл воды, подкисленной до рН 3,1. Полученный раствор пропускают через колонку (D 3,0 см, Н 12 см, V 160 мл) с ионитом продуктом сополимеризации метакриловой, акриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля (степень набухания Кнаб. 4,5; полная обменная емкость 9,2 мг·экв/г), уравновешенную 10%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,1). Сорбцию ведут при скорости 15 мл/см2·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент промывают 320 мл 10%-ного водного раствора изопропанола и десорбируют инсулин 22%-ным водным изопропанолом (рН 3,4), содержащим 0,12 М ацетата аммония. К элюату (130 мл) добавляют 585 мл абсолютного этанола. Получают 1,76 г инсулина крупного рогатого скота (выход 80 мас.) со степенью чистоты 98,7% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 0,9 п.п.м. (по данным РИА).
П р и м е р 5. 5,7 г свиного инсулина с 79,6% чистоты (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 19800 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 340 мл воды, подкисленной 0,1 н.НСl до рН 3,4. Полученный раствор пропускают через колонку (D4 см, Р 12 см, V 380 мл) с ионитом, аналогичным примеру 1, уравновешенным 12% -ным раствором изопропилового спирта (рН 3,4). Сорбцию ведут при скорости пропускания 15 мл/см2·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 700 мл 12%-ного раствора изопропанола (рН 3,4) и десорбируют инсулин 21%-ным водным изопропанолом (рН 3,9), содержащим 0,15 М ацетата аммония.
К элюату (279 мл) добавляют 820 мл абсолютного этилового спирта. Получают 4,84 г свиного инсулина (выход 85,1 мас.) со степенью чистоты 98,3% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 1,2 п.п.м. (по данным РИА).
П р и м е р 6. 5,2 г инсулина крупного рогатого скота (степень чистоты 84,2% по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 23200 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 320 мл воды, подкисленной 0,1 н. НСl до рН 3,2.
Полученный раствор пропускают через колонку (D 4 см, Н 14 см, V 390 мл) с ионитом, аналогичным примеру 1, уравновешенным 14%-ным раствором изопропилового спирта (рН 3,2). Сорбцию ведут при скорости пропускания через колонку 15 мл/см2·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 720 мл 14%-ного водного раствора изопропанола (рН 3,2) и десорбируют инсулин 22%-ным водным раствором изопропанола (рН 3,5), содержащим 0,12 М ацетата аммония.
К элюату (242 мл) добавляют 844 мл абсолютного этилового спирта. После высушивания получают 4,48 г инсулина крупного рогатого скота (выход 85,2 мас.) со степенью чистоты 98,0 (по данным РИА).
Claims (1)
- СПОСОБ ОЧИСТКИ СВИНОГО ИНСУЛИНА И ИНСУЛИНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА путем колоночной препаративной хроматографии низкого давления, включающий пропускание водного раствора инсулина-сырца через ионит с последующей элюцией инсулина и осаждением его из элюата, отличающийся тем, что в качестве ионита используют продукт сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, имеющий степень набухания Kн а б4,5 4,8 и полную обменную емкость 9,2 9,8 мг • экв/г, процесс осуществляют путем пропускания водного раствора инсулина-сырца с pH 3,0 3,5 через укаанный ионит, предварительно уравновешенный 10 16%-ным водным раствором изопропанола с pH 3,0 3,5, затем ионит промывают 10 16%-ным водным раствором изопропилового спирта с pH 3,0 3,5 и проводят элюцию инсулина 20 25%-ным водным раствором изопропилового спирта с pH 3,4 3,9, содержащим 0,05 0,15 М ацетата аммония, из полученного элюата целевой продукт выделяют осаждением.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94004516A RU2057542C1 (ru) | 1994-02-17 | 1994-02-17 | Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94004516A RU2057542C1 (ru) | 1994-02-17 | 1994-02-17 | Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2057542C1 true RU2057542C1 (ru) | 1996-04-10 |
| RU94004516A RU94004516A (ru) | 1996-07-10 |
Family
ID=20152286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94004516A RU2057542C1 (ru) | 1994-02-17 | 1994-02-17 | Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2057542C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BG65045B1 (bg) * | 2001-12-03 | 2007-01-31 | "Софарма" Ад | Метод за получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин |
| RU2453331C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Завод Медсинтез" | Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения |
-
1994
- 1994-02-17 RU RU94004516A patent/RU2057542C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Патент Франции N 2581647, кл. C 07K 7/40, 1985. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BG65045B1 (bg) * | 2001-12-03 | 2007-01-31 | "Софарма" Ад | Метод за получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин |
| RU2453331C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Завод Медсинтез" | Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94004516A (ru) | 1996-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3262128B2 (ja) | 蛋白質の精製方法 | |
| NO304190B1 (no) | Rent parathyroid hormon, fremgangsmÕte for dets fremstilling samt farmasoytisk sammensetning inneholdende det | |
| EP0933083A1 (en) | Process for the purification of serum albumin | |
| NL8501105A (nl) | Werkwijze voor de zuivering van insuline. | |
| RU2057542C1 (ru) | Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота | |
| Green | [73] Purification of avidin | |
| Robinson et al. | Pilot scale affinity chromatography: Purification of β‐galactosidase | |
| Wachtel et al. | Chromatography as a Means of Separating Amino Acids1 | |
| CN110862427B (zh) | 一种庆大霉素C1a的纯化方法 | |
| CN117756863A (zh) | 一种新橙皮苷二氢查尔酮-丙烯醛加合物的制备方法 | |
| Atassi et al. | Neuraminic acid and its relation to chronic bronchitis III. Carbohydrate constituents of sputum | |
| RU2120299C1 (ru) | Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина | |
| CN1245406C (zh) | 从河豚鱼肝脏提取河豚毒素的方法 | |
| CN108570079A (zh) | 一种弱酸性阳离子树脂漏吸提纯阿米卡星的方法 | |
| US20030109688A1 (en) | Acarbose purification process | |
| CN1325511C (zh) | 谷胱甘肽纯化分离方法 | |
| RU2026303C1 (ru) | Способ очистки водного раствора сырого доксорубицина | |
| WO1999007720A2 (en) | Process for the purification of acarbose, pharmaceutical composition containing same and its use for the treatment of diabetes | |
| CN112409426A (zh) | 一种硫酸西索米星的制备方法 | |
| RU2186581C2 (ru) | Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина | |
| JPH06245786A (ja) | コロミン酸の精製方法 | |
| CN118812695B (zh) | 一种利司那肽的纯化方法 | |
| RU2094077C1 (ru) | Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина | |
| Allen et al. | [28] Vitamin B12 | |
| CN115260294B (zh) | 一种替考拉宁的分离纯化方法 |