RU100769U1

RU100769U1 - BIOREACTOR FOR INDUSTRIAL CULTIVATION OF PLANT CELLS IN DEPTH SUSPENSION

Info

Publication number: RU100769U1
Application number: RU2009138454/10U
Authority: RU
Inventors: Андрей Анатольевич Алимов; Сергей Викторович Воробьев; Наталья Викторовна Дудник; Галина Васильевна Зайцева; Екатерина Ивановна Лапшова; Андрей Германович Мошкин; Семен Ефимович Строгов; Владимир Васильевич Туркин
Original assignee: Закрытое Акционерное Общество "Биоген Технолоджиз"
Priority date: 2009-10-20
Filing date: 2009-10-20
Publication date: 2010-12-27

Abstract

1. Биореактор для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с пневматическим перемешиванием эрлифтного типа, содержащий цилиндрический корпус с установленным в нем вертикальным элементом высотой от 0,8 до 1,0 диаметра биореактора для создания внутреннего контура циркуляции культуральной суспензии с равной площадью зон входящего и нисходящего потоков. ! 2. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что вертикальный элемент представляет собой перегородку. ! 3. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что вертикальный элемент представляет собой коаксиально установленную трубу. 1. Bioreactor for industrial cultivation of plant cells in a deep suspension with pneumatic mixing of the airlift type, containing a cylindrical body with a vertical element installed in it with a height of 0.8 to 1.0 diameter of the bioreactor to create an internal circulation loop of the culture suspension with an equal area of the incoming and downstream flows. ! 2. The bioreactor according to claim 1, characterized in that the vertical element is a partition. ! 3. The bioreactor according to claim 1, characterized in that the vertical element is a coaxially mounted pipe.

Description

Настоящая полезная модель относится к биотехнологии, а точнее, к промышленной биотехнологии клеток высших растений, продуцирующих ценные вещества растительной природы, трудно получаемые из интактных растений, или не синтезируемые в них.This useful model relates to biotechnology, and more specifically, to industrial biotechnology of higher plant cells producing valuable plant substances that are difficult to obtain from intact plants or not synthesized in them.

Эта молодая отрасль биотехнологии открывает новые перспективы фармацевтической, парфюмерно-косметической и химической промышленности. Однако для коммерческого производства растительных клеточных продуктов необходимо успешное решение двух основных проблем: биологической - иметь высокопродуктивный штамм клеток и технологической - уметь масштабировать процесс. Клеточная культура, суперпродуктивная в лаборатории (шейкерные колбы), может не расти и/или не продуцировать целевой продукт в биореакторах большего масштаба.This young branch of biotechnology opens up new prospects for the pharmaceutical, perfumery, cosmetic and chemical industries. However, for the commercial production of plant cell products it is necessary to successfully solve two main problems: biological - to have a highly productive strain of cells and technological - to be able to scale the process. A super-productive cell culture in the laboratory (shaker flasks) may not grow and / or produce the target product in larger scale bioreactors.

Известны лишь отдельные примеры удачного промышленного масштабирования процесса культивирования клеток растений, приведенные в последних обзорах [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684; Kieran P.M. et al. // J. Biotech. - 1997. - V.59. - P.p.39-52; Collin H.A. // Plant Growth Regulation. - 2001. - V.34. - P.p.119-134; Bourgand F. et al. // Plant Science. - 2001. - V.161. - P.p.839-851].Only a few examples of successful industrial scaling of the process of cultivation of plant cells, known in recent reviews [Dornenburg N., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684; Kieran P.M. et al. // J. Biotech. - 1997 .-- V.59. - P.p. 39-52; Collin H.A. // Plant Growth Regulation. - 2001. - V.34. - P.p.119-134; Bourgand F. et al. // Plant Science. - 2001. - V.161. - P.p.839-851].

Из двух основных типов биореактров - культиваторов для клеток микроорганизмов (с механическим или пневматическим перемешиванием, соответственно), для крупномасштабного культивирования клеток растений чаще всего используют аппараты первого типа, обычно называемые баковыми реакторами с мешалкой и относимые к стандартным биореакторам.Of the two main types of bioreactors - cultivators for microorganism cells (with mechanical or pneumatic stirring, respectively), for large-scale cultivation of plant cells, the first type of apparatus is most often used, usually called agitated tank reactors and referred to as standard bioreactors.

Аппараты с пневматическим перемешиванием в зависимости от способа ввода газа в полость аппарата делятся на два подтипа: барботажные и эрлифтные. Последние имеют внутренний или внешний контур циркуляции культуральной суспензии под действием подаваемого газа. По форме пневматически перемешиваемые аппараты обычно выполняются в виде колонн с большим отношением их высоты к диаметру (до 2-3).Devices with pneumatic stirring, depending on the method of introducing gas into the cavity of the apparatus, are divided into two subtypes: bubble and airlift. The latter have an internal or external circulation circuit of the culture suspension under the action of the feed gas. In shape, pneumatically-mixed devices are usually made in the form of columns with a large ratio of their height to diameter (up to 2-3).

Механически перемешиваемые биореакторы по сравнению с пневматически перемешиваемыми, как отмечено [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684], обеспечивают лучшее перемешивание культуры и массопередачу кислорода. Освоенные в серийном производстве, они доступнее и дешевле [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - P.p.2307-2310].Mechanically agitated bioreactors compared with pneumatically agitated, as noted [Dornenburg N., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684], provide better mixing of the culture and mass transfer of oxygen. Developed in mass production, they are more affordable and cheaper [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - P.p.2307-2310].

Однако при этом они более энергоемки [ShugelK. // Bioreactor Design, Operation and Control. P.p.99-118]. Из-за наличия движущихся частей в аппарате высок риск контаминации и, главное, гибели клеток от сдвигового стресса [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684]. Поэтому механически перемешиваемые реакторы трудно масштабируются. В обзорах [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - P.p.2307-2310; Kieran P.M. et al. // J. Biotech. - 1997. - V.59. - P.p.39-52] отмечается, что в большинстве случаев масштабирование сопровождается снижением продуктивности, что связано с проблемами перемешивания и массопередачи. В частности, отмечено [Vogelman H. // 6-th Int. Ferment Symp. - London. - 1980. - P.p.839-851], что из-за больших напряжений сдвига, которые достигают 7000 дин·см², в аппарате вместимостью 20 м³ биомасса клеток табака, считающихся достаточно толерантными к сдвиговому стрессу, в 2-3 раза ниже, чем во встряхиваемых колбах.However, they are more energy intensive [ShugelK. // Bioreactor Design, Operation and Control. Pp99-118]. Due to the presence of moving parts in the apparatus, the risk of contamination and, most importantly, cell death from shear stress is high [Dornenburg N., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - Pp674-684]. Therefore, mechanically stirred reactors are difficult to scale. In reviews [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - Pp2307-2310; Kieran PM et al. // J. Biotech. - 1997 .-- V.59. - Pp39-52] it is noted that in most cases scaling is accompanied by a decrease in productivity, which is associated with problems of mixing and mass transfer. In particular, noted [Vogelman H. // 6th Int. Ferment Symp. - London. - 1980. - Pp839-851], that because of the large shear stresses that reach 7000 dynes · cm ² , in the apparatus with a capacity of 20 m ^{3 the} biomass of tobacco cells, which are considered quite tolerant to shear stress, is 2-3 times lower than in shaken flasks.

Клетки растений весьма чувствительны к воздействию механических сил (удары лопастями мешалок, об стенки аппаратов) и срезывающих усилий, или напряжений турбулентных потоков слоев жидкостей. Эта чувствительность связана с большими размерами растительных клеток, относительной хрупкостью их целлюлозно-пектиновых оболочек, а также вакуолизацией [Липский А.Х. и др. // Культура клеток растений. «Наука», М., 1981. - С.51-68; Hooker B.S. et al. // Biotech. Bioeng. - 1990. - V.35. - P.p.296-304]. Подвергаясь воздействию определенного уровня стресса, клетки могут разрушаться или деформироваться, что вызывает их гибель или, по меньшей, но нежелательной мере, нарушение биосинтеза целевых продуктов. Исследователи пришли к заключению, что для успешного культивирования клеток растений в биореакторе необходимо иметь определенный компромисс таких эффектов, как перемешивание, массопередача кислорода, напряжение или скорость сдвига [Moo-Yong М., Chisti Y. // 8-th Int. Biotechn. Symp. - Paris. - V.1. - P.p.454-466].Plant cells are very sensitive to the effects of mechanical forces (blows by the blades of the stirrers, against the walls of the apparatus) and shear forces, or stresses of turbulent flows of the layers of liquids. This sensitivity is associated with the large size of plant cells, the relative fragility of their cellulose-pectin shells, and vacuolization [Lipsky A.Kh. et al. // Culture of plant cells. "Science", M., 1981. - S. 51-68; Hooker B.S. et al. // Biotech. Bioeng. - 1990. - V.35. - P.p.296-304]. Being exposed to a certain level of stress, the cells can be destroyed or deformed, which causes their death or, at least, but undesirable measure, disruption of the biosynthesis of the target products. The researchers concluded that for successful cultivation of plant cells in a bioreactor, a certain compromise of effects such as mixing, oxygen mass transfer, stress, or shear rate is necessary [Moo-Yong M., Chisti Y. // 8-th Int. Biotechn. Symp - Paris. - V.1. - P.p. 454-466].

Пневматически перемешиваемые биореакторы, особенно эрлифты, характеризуются более низким сдвигом по сравнению с механически перемешиваемыми и легко масштабируются, но хуже перемешиваются (особенно барботажные), из-за чего имеются мертвые зоны, происходит оседание клеток и более низка интенсивность массопередачи кислорода (особенно в эрлифте) [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684].Pneumatically mixed bioreactors, especially airlifts, are characterized by a lower shift compared to mechanically mixed and easily scaled, but worse mix (especially bubble ones), because of which there are dead zones, cell sedimentation and lower oxygen mass transfer rate (especially in airlift) [Dornenburg N., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684].

Из проанализированного материала следует, что по большинству показателей (особенно по такому важному, как сдвиговый стресс) эрлифт предпочтительнее как механически перемешиваемых, так и барботажных биореакторов. Но в эрлифте менее интенсивна массопередача кислорода, что может не соответствовать потребностям культур с высокой дыхательной активностью при максимизации выхода биомассы и целевых продуктов.From the analyzed material it follows that for most indicators (especially for such an important one as shear stress), airlift is preferable to both mechanically mixed and bubbling bioreactors. But in the airlift, the mass transfer of oxygen is less intense, which may not correspond to the needs of crops with high respiratory activity while maximizing the yield of biomass and target products.

Поэтому технической задачей настоящей полезной модели является создание конструкции эрлифта для промышленного культивирования клеток растений с условиями перемешивания, обеспечивающими необходимую интенсивность процесса массопередачи кислорода, отсутствие застойных зон и травмирования клеток.Therefore, the technical task of this utility model is to create an airlift design for industrial cultivation of plant cells with mixing conditions that provide the necessary intensity of oxygen mass transfer, the absence of stagnant zones and cell injury.

Простейшей конструкцией эрлифта с внутренним контуром циркуляции может служить вертикальная цилиндрическая металлическая емкость с крышкой. Внутри емкость разделяется на две зоны примерно одинаковой площади с помощью трубы или вертикальной перегородки, расположенных обычно по центру емкости на некотором расстоянии от дна и крышки аппарата. Под одну из зон подают воздух (или, если необходимо, смесь газов), и в этой зоне газожидкостная смесь с биомассой поднимается вверх, а по другой зоне она, содержащая меньше газа, опускается вниз. Так происходит перемешивание культуральной суспензии, которое характеризуется параметром - временем полного перемешивания.The simplest airlift design with an internal circulation circuit can be a vertical cylindrical metal container with a lid. Inside, the container is divided into two zones of approximately the same area using a pipe or a vertical partition, usually located in the center of the container at a certain distance from the bottom and the lid of the device. Under one of the zones air is supplied (or, if necessary, a mixture of gases), and in this zone, the gas-liquid mixture with biomass rises, and in the other zone it contains less gas and goes down. This is the mixing of the culture suspension, which is characterized by a parameter - the time of complete mixing.

По существующим рекомендациям устройства эрлифтов, которые обычно представляют собой колонные аппараты с большим отношением высоты к диаметру, трубы (перегородки) также имеют большую высоту, равную по величине примерно двум - трем диаметрам аппарата [Moo-Yong М., Chisti J. // 8-th Int. Biotechn. Symp.- Paris. - V.1. - P.p.454-466]. Однако, как показали многочисленные исследования авторов для адекватного перемешивания в биореакторах для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии достаточно иметь высоту зон циркуляции в эрлифте примерно равной диаметру биореактора. Для этого в биореакторе для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с пневматическим перемешиванием эрлифтного типа, внутри которого установлен вертикальный элемент, обеспечивающий создание внутреннего контура циркуляции культуральной суспензии с равной площадью зон входящего и нисходящего потоков, высота вертикального элемента составляет от 0,8 до 1,2 диаметра биореактора. При этом вертикальный элемент представляет собой сплошную перегородку по центру аппарата или коаксиально установленную трубу.According to existing recommendations, airlift devices, which are usually column devices with a large height to diameter ratio, pipes (partitions) also have a large height equal in size to about two to three device diameters [Moo-Yong M., Chisti J. // 8 -th Int. Biotechn. Symp.- Paris. - V.1. - P.p. 454-466]. However, as shown by numerous studies of the authors for adequate mixing in bioreactors for industrial cultivation of plant cells in a deep suspension, it is sufficient to have the height of the circulation zones in the airlift approximately equal to the diameter of the bioreactor. To do this, in a bioreactor for industrial cultivation of plant cells in a deep suspension with pneumatic mixing of the airlift type, inside which a vertical element is installed, which creates an internal circulation loop of the culture suspension with an equal area of the zones of incoming and outgoing flows, the height of the vertical element is from 0.8 to 1 , 2 diameters of bioreactor. In this case, the vertical element is a continuous partition in the center of the apparatus or a coaxially mounted pipe.

На представленных чертежах на фиг.1 показан биореактор для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с внутренним вертикальным элементом в виде перегородки, а на фиг.2 - в виде коаксиально установленной трубы.In the drawings, FIG. 1 shows a bioreactor for industrial cultivation of plant cells in a deep suspension with an internal vertical element in the form of a partition, and in FIG. 2 - in the form of a coaxially mounted pipe.

Биореактор на фиг.1 содержит обечайку 1 с отношением высоты к диаметру биореактора Н≈2D, внутреннюю перегородку 2 с отношением высоты к высоте биореактора h≈0,5 H и воздушный барботер 3 с диаметром ^⌀<D/2. Биореактор заполнен культуральной суспензией 4.The bioreactor in figure 1 contains a shell 1 with a ratio of height to diameter of the bioreactor H≈2D, an internal partition 2 with a ratio of height to height of the bioreactor h≈0.5 H and an air bubbler 3 with a diameter of ^⌀ <D / 2. The bioreactor is filled with culture suspension 4.

Биореактор на фиг.2 содержит обечайку 1 с отношением высоты к диаметру биореактора Н≈2D, коаксиально установленную трубу 2 с отношением высоты к высоте биореактора h≈0,5 Н и отношением диаметра к диаметру биореактора и воздушный барботер 3 с диаметром ^⌀<D/2. Биореактор заполнен культуральной суспензией 4.The bioreactor in figure 2 contains a shell 1 with a ratio of height to diameter of the bioreactor H≈2D, a coaxially installed tube 2 with a ratio of height to height of the bioreactor h≈0.5 N and a ratio of diameter to diameter of the bioreactor and air bubbler 3 with a diameter of ^⌀ <D / 2. The bioreactor is filled with culture suspension 4.

Биореактор работает следующим образом. В подготовленный биореактор загружают питательную среду, стерилизуют ее водяным паром требуемого давления в течение необходимого времени, после охлаждения среды до температуры культивирования вводят в нее клеточный инокулят, устанавливают постоянный температурный режим культивирования путем подачи в теплообменное устройство биореактор термостатируемой воды, (на чертеже не показано) Для перемешивания питательной среды с клетками, а также для подачи в нее кислорода и отвода других газов через барботер 3 подают стерильный воздух с постоянным увеличением его расхода по установленному графику по мере роста биомассы клеток, сопровождаемого повышением концентрации клеток и потребности их в кислороде (на общую массу). Насыщенная воздухом из барботера 3 культуральная суспензия поднимается в восходящей зоне (образуемой перегородкой 2) вверх, откуда, освобождаясь от воздуха, по нисходящей зоне опускается в низ биореактра. Таким образом происходит вертикальная циркуляция культуральной суспензии в биореакторе, ее перемешивание и массообмен с воздухом, кислородом и другими газами.The bioreactor operates as follows. The nutrient medium is loaded into the prepared bioreactor, sterilized with steam of the required pressure for the required time, after cooling the medium to the cultivation temperature, the cell inoculum is introduced into it, the cultivation temperature is set to constant by supplying thermostatic water to the bioreactor, (not shown in the drawing) For mixing the nutrient medium with the cells, as well as for supplying oxygen to it and removing other gases through a bubbler 3, sterile air is supplied from the post a steady increase in its consumption according to the established schedule as the biomass of cells increases, accompanied by an increase in the concentration of cells and their oxygen demand (by total weight). The culture suspension saturated with air from the bubbler 3 rises in the ascending zone (formed by the partition 2), from where, being freed from the air, it descends to the bottom of the bioreactor in the descending zone. Thus, the vertical circulation of the culture suspension in the bioreactor occurs, its mixing and mass transfer with air, oxygen and other gases.

Кроме обеспечения требуемого перемешивания и массопередачи кислорода при высоте разделительных перегородок 2 указанного размера представляется возможным использовать в качестве конструктивной основы эрлифта с внутренним контуром циркуляции стандартные биореакторы бакового типа в их оснащении, у которых отношение общей высоты к диаметру составляет около 1,5-2. В этом случае вместо мешалки внутри биореактора размещается труба 2 с высотой, не превышающей его диаметр, (оптимально, как показано на фиг.2). Внизу одной из зон, образованных трубой 2, должен быть расположен воздушный барботер 3, устроенный согласно любой из приемлемых конструкций. Над верхним краем трубы 2 в ходе культивирования должен поддерживаться минимальный уровень жидкости, обеспечивающий перелив из восходящей в нисходящую зоны.In addition to providing the required mixing and mass transfer of oxygen at the height of the separation walls 2 of the indicated size, it seems possible to use standard tank-type bioreactors in their equipment, in which the ratio of the total height to diameter is about 1.5-2, as the structural basis of the airlift with the internal circulation circuit. In this case, instead of an agitator, a pipe 2 is placed inside the bioreactor with a height not exceeding its diameter (optimally, as shown in FIG. 2). At the bottom of one of the zones formed by the pipe 2, there should be an air bubbler 3 arranged according to any of the acceptable designs. During the cultivation, a minimum level of liquid must be maintained above the upper edge of the pipe 2, ensuring overflow from the ascending to descending zones.

Авторы проводили опыты по культивирования клеток растений в биореакторах различных конструкций. В них культивировали, в частности, клетки стефании гладкой Stephania glabra (Roxb) Miers, представляющие коммерческий интерес в связи с возможным использованием их вторичнонго метаболита - алкалоида стефарина для производства медицинского препарата антихолинэстеразного действия - стефаглабрина сульфата.The authors conducted experiments on the cultivation of plant cells in bioreactors of various designs. They cultivated, in particular, smooth Stephania stephania glabra (Roxb) Miers cells, which are of commercial interest in connection with the possible use of their secondary metabolite, stefarin alkaloid, for the production of the anticholinesterase drug, stefaglabrin sulfate.

Клетки довольно успешно культивировали ранее в лабораторных биореакторах с перемешиванием механическим [Савина Т.А. и др. // II Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» - Алматы. - 1993. - С.193] и барботажным [Решетняк О.В. и др. // IX Междунар. конф. «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». - Звенигород. - 2008. - С.322]. Емкость аппаратов - 14 и 20 л, соответственно. При этом было установлено, что для получения высоких выходов стефарина, как в шейкерных колбах, необходимо производить культивирование при довольно высоком значении коэффициента массопередачи кислорода, равном 17 ч^-1 и создаваемом в биореакторе с механическим перемешиванием. В барботажном биореакторе клетки в большей массе оседали у дна биореактора, что, возможно, разрушало их структуру и ухудшало массопередачу кислорода и питательных веществ между клетками и культуральной жидкостью. Удельный объемный выход биомассы был в 1,3 раза ниже, а содержание в ней стефарина в 1,6 раза меньше, чем в шейкерных колбах.The cells were rather successfully cultivated earlier in laboratory bioreactors with mechanical stirring [Savina T.A. and others // II Intern. conf. “Biology of cultivated plant cells and biotechnology” - Almaty. - 1993. - P.193] and bubbling [Reshetnyak O.V. and others // IX Intern. conf. "Biology of plant cells in vitro and biotechnology." - Zvenigorod. - 2008. - P.322]. The capacity of the devices is 14 and 20 liters, respectively. It was found that in order to obtain high yields of stefarin, as in shaker flasks, it is necessary to cultivate at a rather high oxygen mass transfer coefficient of 17 h ^-1 and created in a bioreactor with mechanical stirring. In the bubbling bioreactor, the cells were deposited at the bottom of the bioreactor, which possibly destroyed their structure and impaired mass transfer of oxygen and nutrients between the cells and the culture fluid. The specific volumetric yield of biomass was 1.3 times lower, and the content of stefarin in it was 1.6 times lower than in shaker flasks.

В связи с вышеизложенным исследовали культивирование клеток стефании гладкой в опытных биореакторах емкостью 100-250 л с перемешиванием механической мешалкой и пневматическим способом, как предлагается в настоящей полезной модели.In connection with the foregoing, we studied the cultivation of smooth Stefania cells in experimental bioreactors with a capacity of 100-250 l with stirring with a mechanical stirrer and pneumatic method, as proposed in this utility model.

Результаты этих опытов изложены ниже.The results of these experiments are described below.

Пример 1Example 1

Проводили культивирование в биореакторе БИОР-0,1 бакового типа емкостью 100 л отечественного производства (изготовитель - ОКБ ТБМ, г.Кириши, Ленинградская область) с механической мешалкой. Аппарат представляет собой вертикальную цилиндрическую емкость с внутренним диаметром 0,4 м, высотой - 0,81 м, снабженную теплообменной рубашкой, турбинной мешалкой с магнитной муфтой с регулируемым числом оборотов, штуцерами для ввода и вывода материальных потоков и установки КИП и А. Ранее такой аппарат был успешно использован для культивирования в заводских условиях (НПО «Восток», Кировская область) клеток женьшеня Panax ginseng С.А.Меу [Шамков Н.В. и др. // Биотехнология. - 1991. - №1. - С.32-34].Cultivation was carried out in a bioreactor BIOR-0.1 of a tank type with a capacity of 100 l of domestic production (manufacturer - OKB TBM, Kirishi, Leningrad Region) with a mechanical stirrer. The apparatus is a vertical cylindrical container with an inner diameter of 0.4 m, a height of 0.81 m, equipped with a heat-exchange jacket, a turbine stirrer with a magnetic coupling with an adjustable speed, fittings for input and output of material flows and installation of instrumentation and A. Previously, the apparatus was successfully used for cultivation in the factory (NPO "Vostok", Kirov region) Panax ginseng cells S.A. Meu [Shamkov N.V. et al. // Biotechnology. - 1991. - No. 1. - S. 32-34].

В стерильный аппарат БИОР-0,1 заливали 55 л питательной среды рекомендуемого состава [Савина Т.А. и др. // II Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» - Алматы. - 1993. - С.193], стерилизовали ее паром, устанавливали температуру (26±1)°С, засевали клеточной культурой, выращенной в шейкерных колбах, из расчета 30 г сырой биомассы на 1 л свежей питательной среды в аппарате. Включали минимальное перемешивание (150 об/мин) и подачу стерильного воздуха от 60 л/ч и, возможно, выше при наличии роста клеток (требуемое максимальное значение коэффициента массопередачи кислорода 17 ч^-1 достигается в данном аппарате при подаче воздуха 2 м³/ч). Культивирование проводили с периодическим отбором проб на анализ концентрации клеток, их жизнеспособности и содержания стефарина.55 l of the nutrient medium of the recommended composition was poured into the sterile apparatus BIOR-0.1 [Savina T.A. and others // II Intern. conf. “Biology of cultivated plant cells and biotechnology” - Almaty. - 1993. - P.193], sterilized with steam, set the temperature (26 ± 1) ° C, inoculated with a cell culture grown in shaker flasks, based on 30 g of raw biomass per 1 liter of fresh nutrient medium in the apparatus. Minimum mixing (150 rpm) and a supply of sterile air from 60 l / h and possibly higher in the presence of cell growth were included (the required maximum oxygen mass transfer coefficient of 17 h ^- 1 is achieved in this apparatus with an air supply of 2 m ³ / h ) Cultivation was carried out with periodic sampling to analyze the concentration of cells, their viability and the content of stefarin.

За время культивирования в аппарате не обнаружено роста клеток, а доля жизнеспособных снизилась с 85% до 30%.During the cultivation, no cell growth was detected in the apparatus, and the proportion of viable decreased from 85% to 30%.

Аналогичным образом проводили культивирование клеток стефании гладкой в биореакторе БИОР-0,25 бакового типа (высота 1 м, диметр 0,6 м) емкостью 250 л с мешалкой при минимальной скорости 100 об/мин. В аппарат загружено 150 л свежей питательной среды и в общем подготовка культивирования проведена, как описано выше. Получены по существу аналогичные результаты. Сырая биомасса - 18 г/л (засеяно 30 г/л), сухая - 2 г/л, содержание стефарина - 0,14% по сухой биомассе, доля жизнеспособных клеток - 54%.Similarly, cultivation of stefania cells smooth in the bioreactor BIOR-0.25 tank type (height 1 m, diameter 0.6 m) with a capacity of 250 l with a stirrer at a minimum speed of 100 rpm was carried out. 150 l of fresh nutrient medium was loaded into the apparatus and, in general, preparation of cultivation was carried out as described above. Essentially similar results were obtained. Raw biomass - 18 g / l (seeded 30 g / l), dry - 2 g / l, stefarin content - 0.14% by dry biomass, the proportion of viable cells - 54%.

Таким образом, условия культивирования в испытанных стандартных биореакторах бакового типа при скорости вращения мешалки в диапазоне 100-150 об/мин оказались неприемлемыми для выращивания клеток стефании гладкой.Thus, the cultivation conditions in the tested standard tank-type bioreactors at an agitator rotation speed in the range of 100-150 rpm turned out to be unacceptable for growing smooth stefanie cells.

Пример 2Example 2

На базе стандартного биореактора БИОР-0,1 бакового типа вместимостью 100 л сконструирован эрлифтный аппарат с внутренним циркуляционным контуром. Для этого в полости аппарата вместо мешалки коаксиально смонтировали металлическую трубу внутреннего диаметра 0,25 м на высоте 0,31 ми на расстоянии 0,09 м от днища аппарата. Под трубой горизонтально расположили кольцевой воздушный барботер диаметром 0,15 м, имеющий вверху отверстия для выхода воздуха диаметром по 1,5 мм на расстоянии 20 мм друг от друга. В этом модернизированном аппарате максимально требуемое значение коэффициента массопередачи кислорода для культивирования клеток стефании гладкой достигается при подаче воздуха до 4 м³/ч.On the basis of the standard bioreactor BIOR-0.1 of tank type with a capacity of 100 l, an air-lift apparatus with an internal circulation circuit is designed. For this, instead of a mixer, a metal pipe of an inner diameter of 0.25 m at a height of 0.31 mi at a distance of 0.09 m from the bottom of the apparatus was coaxially mounted in the cavity of the apparatus. An annular air bubbler with a diameter of 0.15 m was horizontally placed under the pipe, having at the top openings for air outlet with a diameter of 1.5 mm at a distance of 20 mm from each other. In this modernized apparatus, the maximum required value of the mass transfer coefficient of oxygen for cultivating smooth stefanie cells is achieved with air supply up to 4 m ³ / h.

В созданном эрлифтном аппарате, подготовленном технологически и засеянном исходной культурой из шейкерных колб аналогично изложенному выше (пример 1), провели культивирование клеток стефании гладкой вышеописанным способом, но с перемешиванием только сжатым воздухом (без мешалки), подаваемым через кольцевой барботер в коаксиальную трубу. Подача воздуха на аэрацию составляла от 0,06 м³/ч и выше в зависимости от текущей концентрации биомассы. Культивирование осуществляли периодическим способом циклами до 2-х недель каждый до достижения максимальной концентрации клеток.In the created airlift apparatus, prepared technologically and seeded with the initial culture from shaker flasks as described above (Example 1), stephanie cells were cultured using the smooth method described above, but with stirring only with compressed air (without a mixer) supplied through an annular bubbler into a coaxial tube. The air supply for aeration ranged from 0.06 m ³ / h and above, depending on the current concentration of biomass. Cultivation was carried out in a batch manner in cycles of up to 2 weeks each until the maximum cell concentration was reached.

Таким образом, проведено более 10 циклов культивирования с получением концентрации клеток по сырой биомассе от 200 до 300 г/л, по сухой - от 13 до 18 г/л при доле жизнеспособных клеток 80-90%. Содержание стефарина в сухой биомассе, определенное экстракционно фотоколориметрическим методом [Бидниченко Ю.И. // Дис. канд. фарм. наук. - Львов. - 1990], составляло в среднем 0,2%. Эти показатели статистически не отличаются от тех, которые наблюдались в параллельных опытах культивирования клеток в шейкерных колбах: сырая биомассы - 200-400 г/л, сухая биомасса - 15-21 г/л, жизнеспособность клеток 80-90%, содержание стефарина в среднем 0,2%.Thus, more than 10 cultivation cycles have been carried out to obtain a cell concentration from 200 to 300 g / l of raw biomass and 13 to 18 g / l of dry biomass with a viable cell fraction of 80-90%. The content of stefarin in dry biomass determined by extraction photocolorimetric method [Bidnichenko Yu.I. // Dis. Cand. farm. sciences. - Lviv. - 1990], averaged 0.2%. These indicators are not statistically different from those observed in parallel experiments on culturing cells in shaker flasks: crude biomass - 200-400 g / l, dry biomass - 15-21 g / l, cell viability of 80-90%, average stefarin content 0.2%.

Пример 3Example 3

Аналогично вышеописанному провели культивирование клеток стефании гладкой в эрлифтном аппарате вместимостью 250 л, созданном на базе стандартного биореактора бакового типа с мешалкой БИОР-0,25. На месте мешалки установили коаксиальную трубу диаметром 0,4 м высотой 0,5 м от днища аппарата. Под ней разместили воздушный барботер диаметром 0,24 м с отверстиями диаметром 1,5 мм на расстоянии по 20 мм.Similarly to the above, cultivation of smooth Stefania cells was carried out in an airlift apparatus with a capacity of 250 l, created on the basis of a standard tank-type bioreactor with a BIOR-0.25 mixer. A coaxial pipe with a diameter of 0.4 m and a height of 0.5 m from the bottom of the apparatus was installed in place of the mixer. An air bubbler with a diameter of 0.24 m with holes with a diameter of 1.5 mm at a distance of 20 mm was placed under it.

В эрлифтном биореакторе на базе БИОР-0,25, содержащем 150 л культуральной суспензии, проведено культивирование клеток стефании гладкой со следующим результатом: сырая биомасса - 200 г/л, сухая биомасса - 13 г/л, доля живых клеток - 80%, содержание стефарина в сухой биомассе - 0,2%. Эти показатели практически не отличаются от полученных в эрлифте емкостью 100 л, а также в шейкерных колбах.In airlift bioreactor based on BIOR-0.25, containing 150 l of culture suspension, smooth stephanie cells were cultured with the following result: crude biomass - 200 g / l, dry biomass - 13 g / l, percentage of living cells - 80%, content stefarin in dry biomass - 0.2%. These indicators practically do not differ from those obtained in an airlift with a capacity of 100 l, as well as in shaker flasks.

Таким образом, в аппаратах емкостью 100 и 250 л, обустроенных согласно настоящему предложению, практически проведено масштабирование процесса культивирования клеток растений от лабораторного уровня (шейкерные колбы).Thus, in apparatuses with a capacity of 100 and 250 l, equipped in accordance with this proposal, the process of cultivating plant cells from the laboratory level (shaker flasks) was practically scaled.

Таким образом, авторами создана конструкции эрлифтного биореактора для промышленного культивирования клеток растений с условиями перемешивания, обеспечивающими необходимую интенсивность процесса массопередачи кислорода, отсутствием застойных зон и травмированием клеток.Thus, the authors created airlift bioreactor designs for industrial cultivation of plant cells with mixing conditions that provide the necessary intensity of the oxygen mass transfer process, the absence of stagnant zones and cell injury.

Claims

1. Bioreactor for industrial cultivation of plant cells in a deep suspension with pneumatic mixing of the airlift type, containing a cylindrical body with a vertical element installed in it with a height of 0.8 to 1.0 diameter of the bioreactor to create an internal circulation loop of the culture suspension with an equal area of the incoming and downstream flows.

2. The bioreactor according to claim 1, characterized in that the vertical element is a partition.

3. The bioreactor according to claim 1, characterized in that the vertical element is a coaxially mounted pipe.