RS67058B1

RS67058B1 - Miševi koji imaju modifikovani lambda laki lanac imunoglobulina i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS67058B1
Application number: RS20250752A
Authority: RS
Inventors: Andrew J Murphy; Lynn Macdonald; Chunguang Guo; John Mcwhirter
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2025-08-29
Also published as: SMT202500277T1; KR20250022220A; PT3720279T; US12356967B2; FI4140297T3; SI4140297T1; HUE060608T2; EP4140297B1; WO2019113065A1; ES2928995T3; CA3084049A1; CN111432635B; US20190223418A1; IL274797B1; KR102760506B1; PL3720279T3; LT4140297T; US20210345591A1; CN116058333A; ES3035461T3

Description

Opis

UNAKRSNA REFERENCA SA SRODNIM PRIJAVAMA

[0001] Ova prijava zahteva prioritet privremene prijave Br.62/594,944 Sjedinjenih država, koja je podneta 5 decembra, 2017; privremene prijave Br. 62/594,946 Sjedinjenih država, koja je podneta 5 decembra, 2017; prioritet privremene prijave Br.62/609,241 Sjedinjenih država, koja je podneta 21 decembra, 2017; i privremene prijave Br.62/609,251 Sjedinjenih država, koja je podneta 21 decembra, 2017.

LISTA SEKVENCI

[0002] Predmetna prijava sadrži popis Liste sekvenci.

STANJE TEHNIKE

[0003] Humana antitela su klasa terapeutika sa najbržim razvojem. Od tehnologija koje su trenutno u upotrebi za njihovu proizvodnju, razvoj genetički modifikovanih životinja (npr., miševa) koje su modifikovane sa genetičkim materijalom koji kodira humana antitela, u celosti ili delom, revolucionizovao je oblast humanih terapeutskih monoklonskih antitela za lečenje različitih bolesti. Ipak, potreban je razvoj unapređenih in vivo sistema za generisanje humanih monoklonalnih antitela koja maksimizuju repertoare humanih antitela u domaćinu genetički modifikovanih životinja.

SUŠTINA PRONALASKA

[0004] Obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela u genetički modifikovanom mišu, postupak se sastoji iz koraka:

(a) imunizovanja genetički modifikovanog miša antigenom od interesa

pri čemu genetički modifikovani miš ima zametni (germinativni) genom koji sadrži:

prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(i) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(ii) jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata (ii) su operativno povezani sa jednim mišjim Cλ genom (iii);

pri čemu jedan mišji Cλ gen (iii) je umesto mišjeg Cκ gena na prvom modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina;

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata (ii) su umesto jednog ili više endogenih mišjih Vκ genskih segmenata i jednog ili više endogenih mišjih Jκ genskih segmenata;

gde genetički modifikovani miš nema mišji Cκ gen na prvom modifikovanom endogenom lokusu k lakog lanca imunoglobulina;

(b) održavanja genetički modifikovanog miša pod uslovima koji su dovoljni da genetički modifikovani miš proizvede imunski odgovor na antigen od interesa; i

(c) regenerisanje iz genetički modifikovanog miša:

(i) antitela koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži humani λ varijabilni domen i mišji λ konstantni domen,

(ii) nukleotida koji kodira varijabilni domen humanog lakog lanca ili varijabilni domen humanog teškog lanca, laki lanac, ili teški lanac antitela koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo koje se veže za antigen od interesa sadrži laki lanac koji se sastoji iz humanog λ varijabilnog domena i mišjeg λ konstantnog domena, ili

(iii) ćelije koja eksprimira antitelo koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji se sastoji iz humanog λ varijabilnog domena i mišjeg λ konstantnog domena.

[0005] U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen ima sekvencu koja je bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95%, bar 98%, ili bar 99% identična sa mišjim Cλ1, mišjim Cλ2 ili mišjim Cλ3 genom. U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen je ili uključuje mišji Cλ1 gen.

[0006] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata zamenjuju jedan ili više mišjih VK genskih segmenata, i jedan ili više mišjih Jκ genskih segmenata. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata zamenjuju sve funkcionalne mišje Vκ genske segmenata i/ili sve funkcionalne mišje Jκ genske segmente.

[0007] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata obuhvataju Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata obuhvataju Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata obuhvataju Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57,Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, i Vλ3-1.

[0008] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata obuhvataju Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ 7, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata obuhvataju Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, i Jλ7.

[0009] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata jednu ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata, gde jedna ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci u prirodi se nalazi u blizini sa humanim Vλ genskim segmentom u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca imunoglobulina. Na primer, pozivajući se na Sliku 20, prvi primer endogene humane Vλ nekodirajuće sekvence prirodno se nalazi u blizini sa (i 3’) u odnosu na Vλ3-12 genski segment u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca imunoglobulina. Modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina uključujući prvi primer endogene humane Vλ nekodirajuće sekvence mogao bi obuhvatiti da nekodirajuća sekvenca na položaju koji je u blizini (i poželjno 3’) sa Vλ3-12 genskim segmentom u mdifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina. Modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imuoglobulina uključujući prvi primer endogene humane Vλ nekodirajuće sekvence takođe bi mogao obuhvatiti nekodirajuću sekvencu na položaju koji je u blizini (i poželjno 5’) sa Vλ2-11 genskim segmentom u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim slučajevima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina uključujući prvi primer endogene humane Vλ nekodirajuće sekvence mogao bi takođe uključiti da nekodirajuća sekvenca na položaju koji je u blizini (i poželjno 3’) u odnosu na Vλ3-12 genski segment i u blizini (i poželjno 5’) u odnosu na Vλ2-11 genski segment u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaki od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci je ili uključuje intron.

[0010] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanih Jλ genskih segmenata, pri čemu jedna ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini sa humanim Jλ genskim segmentom u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci je ili uključuje intron. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata jednu ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednom od jednog ili više humanih Jλ genskog segmenta, pri čemu jedna ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini sa humanim Jκ genskim segmentom u endogenom lokusu humanog κ lakog lanca imunoglobulina. Na primer, pozivajući se na Sliku 21, prvi primer endogene humane Jκ nekodirajuće sekvence prirodno se pojavljuje u endogenom lokusu humanog κ lakog lanca imunoglobulina. Modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina uključujući prvi primer endogene humane Jκ nekodirajuće sekvnence mogla bi da bude nekodirajuća sekvenca u položaju koji je blizini sa Jλ genskim segmentom (npr., Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Jλ7) u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci je ili uključuje intron.

[0011] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jedan ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na Vλ4-69, Vλ8-61,Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ili Vλ3-1 u modifikovanom endogenom lokus κ lakog lanca imunoglobulina, i svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci se prirodno nalazi u blizini sa Vλ4-69, Vλ8-61,Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ili Vλ3-1 endogenog lokusa humanog λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci je u blizini sa Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Jλ7 u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci se prirodno nalazi u blizini odnosu na Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Vλ7 endogenog lokusa humanog λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili JX7 u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ili Jκ5 endogenog lokusa humanog κ lakog lanca imunoglobulina.

[0012] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži nekodirajuću sekvencu κ lakog lanca između jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genskih segmenata. U nekim izvođenjima, nekodirajuća sekvenca κ lakog lanca je nekodirajuća sekvenca humanog κ lakog lana. U nekim izvođenjima, nekodirajuća sekvenca humanog κ lakog lanca ima sekvencu koja se prirodno nalazi između humanog Vκ4-1 genskog segmenta i humanog Jκ1 genskog segmenta u endogenom lokusu humanog κ lakog lanca imunoglobulina.

[0013] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš je homozigotan za modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, ovde opisani miš je heterozigotan za modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, zametni (germinativni) genom miša uključuje drugi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(a) jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata, i

(b) jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata,

gde jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata su u operativnoj vezi sa Cκ genom.

[0014] U nekim izvođenjima, genom miša dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) u operativnoj vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom. U nekim izvođenjima, transkripcioni kontrolni element uključuje transkripcioni kontrolni element RAG1, transkripcioni kontrolni element RAG2, transkripcioni kontrolni element teškog lanca imunoglobulina, transkripcioni kontrolni element κ lakog lanca imunoglobulina, transkripcioni kontrolni element λ lakog lanca imunoglobulina, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira egzogenu TdT je locirana u lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, lokusu À lakog lanca imunoglobulina, lokusu teškog lanca imunoglobulina, lokusu RAG1, ili lokusu RAG2. U nekim izvođenjima, TdT je humana TdT. U nekim izvođenjima, TdT je kratak izooblik TdT (TdTS).

[0015] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genomu i ispoljava lake lance (npr., eksprimuje varijabilne domene lakog lanca uključujući) sa bar 1.2-puta, bar 1.5-puta, bar 1.75-puta, bar 2-puta, bar 3-puta, bar 4-puta, ili bar 5-puta povećanjem u spojnoj raznolikosti u odnosu na uporedivog miša (npr., iz legla) koji ne obuvata egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferzu (TdT) koja je u operativnoj vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genomu. U nekim izvođenjima, spojna raznolikost je izmerena brojem jedinstvenih CDR3/ 10,000 čitanja.

[0016] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom zametnom (germinativnom) genomu i bar 25%, bar 30%, bar 35%, bar 40%, bar 45%, bar 50%, bar 55%, bar 60%, bar 65% lakih lanaca (npr., lambda i/ili kapa laki lanci) koji su proizvedeni od strane miša ispoljavaju adicije koje nisu vezane za matricu.

[0017] U nekim izvođenjima, germinativni genom korišćenog miša dalje obuhvata:

modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina, koji obuhvata:

(a) jedan ili više humanih VHgenskih segmenata,

(b) jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i

(c) jedan ili više humanih JHgenskih segmenata,

gde jedan ili više humanih VHgenskih segmenata (a), jedan ili više humanih DHgenskih segmenata (b), i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata (c) su operativno povezani sa jednim ili više gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina u modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina.

[0018] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata su umesto jednog ili više mišjih VHgenskih segmenata, jednog ili više mišjih DHgenskih segmenata, jednog ili više mišjih JHgenskih segmenata, ili njihovih kombinacija. U nekom izvođenju, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata zamenjuju jedan ili više mišjih VHgenskih segmenata, jedan ili više mišjih DHgenskih segmenata, jedan ili više mišjih JHgenskih segmenata, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0019] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata uključuju VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata uključuju VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, i VH6-1.

[0020] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata uključuju DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata uključuju DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, i DH7-27.

[0021] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih JHgenskih segmenata uključuju JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih JHgenskih segmenata uključuju JHI, JH2, JH3, JH4, JH5, i JH6.

[0022] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više nekodirajućih sekvenci humanog VH, od kojih je svaka susedna sa bar jednim od jednog ili više genskih segmentata humanih VH, gde svaka od jedne ili više nekodirajućih sekvenci VHprirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani VHgenski segment u endogenom lokusu humanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više nekodirajućih sekvenci humanih VHje ili sadrži intron. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više nekodirajućih sekvenci humanih DH, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanih DHgenskih segmenata, pri čemu svaka od jednog ili više nekodirajućih sekvenci DHprirodno se pojavljuje u blizini u odnosu na genski segment humanog DHu endogenom humanom loksu teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više nekodirajućih sekvenci humanih DHje ili uključuje intron. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više nekodirajućih sekvenci humanih JH, od kojih je svaka susedna sa bar jednom od jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, gde svaka od jedne ili više nekodirajućih sekvenci JHnekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi susedno u odnosu na genski segment humanog JHgena u endogenom lokusu humanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više nekodirajućih sekvenci humanih JHje ili uključuje intron.

[0023] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš je homozigotan za modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina.

[0024] U nekim izvođenjima, konstantni region mišjeg teškog lanca imunoglobulina je mišji endogeni lokus konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina.

[0025] U nekim izvođenjima, endogeni Vλ genski segmenti, endogeni Jλ genski segmenti, i endogeni Cλ geni su uklonjeni u celini ili delom. U nekim izvođenjima, ovde opisani miš ne eksprimuje detektabilno endogene varijabilne domene λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, ovde opisani miš ne eksprimuje detektabilno endogene varijabilne domene κ lakog lanca imunoglobulina.

[0026] U nekim izvođenjima, modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina nedostaje funkcionalni endogeni mišji Adam6 gen. U nekim izvođenjima, germinativni genom miša sadrži jednu ili više sekvenci nukleotida koje kodiraju jedan ili više ADAM6 polipeptida miša, funktionalne ortologe, funkcionalne homologe, ili njihove funkcionalne fragmente. U nekim izvođenjima, jedan ili više mišjih polipeptida ADAM6, funkcionalni ortolozi, funkcionalni homolozi, ili njihovi funkcionalni fragmenti su eksprimovani (npr., u ćeliji muškog reproduktivnog sistema, npr., ćeliji testisa).

[0027] U nekim izvođenjima, jedna ili više sekvenci nukleotida koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata nalaze se na istom hromozomu kao modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više sekvenci nukleotida koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata se nalaze u modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalni ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata su između prvog humanog VHgenskog segmenta i drugog humanog VHgenskog segmenta. U nekim izvođenjima, prvi humani VHgenski segment je VH1-2 i drugi humani VHgenski segment je VH6-1. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovi funkcionalni fragmenti su umesto humanog Adam6 pseudogena. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata zamenjuju humani Adam6 pseudogen. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koja kodira jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata su između humanog VHgenskog segmenta i humanog DHgenskog segmenta.

[0028] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži populaciju B ćelija koja eksprimuje antitela, uključujući λ lake lance imunoglobulina pri čemu svaki sadrži varijabilni domen λ lakog lanca humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, varijabilni domen λ akog lanca humanog imunoglobulina je kodiran od strane preuređene sekvence varijabilnog regiona λ lakog lanca humanog imunoglobulina uključujući uključujući (i) jedan od jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata ili njegove somatski hipermutirane varijante, i (ii) jedan od jednog ili više humanih Jλ genskih segmenata ili njegove somatski hipermutirane varijante.

[0029] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži populaciju B ćelija koja eksprimuje antitela, uključujući teške lance imunoglobulina pri čemu svaka sadrži humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina je kodiran sa preuređenom sekvencom varijabilnog regiona humanog teškog lanca imunoglobulina uključujući (i) jedan od jednog ili više humanih VHgenskih segmenata ili njegovu somatski hipermutiranu varijantu, (ii) jedan od jednog ili više humanih DHgenskih segmenata ili njegovu somatsku hipermutiranu varijantu, i (ii) jedan od jednog ili više humanih JHgenskih segmenata ili njegovu somatski hipermutiranu varijantu.

[0030] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš proizvodi populaciju B ćelija u odgovoru na imunizaciju sa antigenom koji sadrži jedan ili više epitopa. U nekim izvođenjima, miš proizvodi populaciju B ćelija koja eksprimira antitela koja vežu (npr., specifično se vežu) za jedan ili više epitopa antigena od interesa. U nekim izvođenjima, antitela koja su eksprimirana od strane populacije B ćelija proizvedene u odgovoru na antigen sadrže težak lanac koji ima varijabilne domene humanog teškog lanca kodiranog od strane sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca i/ili lambda laki lanac koji ima varijabilni domen humanog lambda lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisana. U nekim izvođenjima, antitela koja su eksprimirana od strane populacije B ćelija proizvedenih u odgovoru na antigen sadrže težak lanac koji ima varijabilni domen humanog teškog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca i/ili kapa laki lanac koji ima varijabilni domen humanog kapa lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca kao što je ovde opisano.

[0031] U nekim izvođenjima, miš proizvodi populaciju B ćelija koje eksprimuju antitela koja se vežu za jedan ili više epitopa od antigena od interesa, pri čemu antitela eksprimirana od populacije B ćelija koja je proizvedena u odgovoru na antigen sadrže: (i) težak lanac koji ima humani varijabilni region teškog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca, (ii) lambda laki lanac koji ima varijabilni domen humanog lambda lakog lanca kodiranog od strane sekvence varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisano, (iii) kapa laki lanac koji ima varijabilni domen humanog kapa lakog lanca koji je kodiran sekvencom varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca kao što je ovde opisano, ili (iv) bilo koju njihovu kombinaciju.

[0032] U nekim izvođenjima, sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvenca varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca kao što je ovde opisano je somatski hipermutirana. U nekim izvođenjima, bar oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% B ćelija u populaciji B ćelija proizvedenih u odgovoru na antigen sadrže sekvencu varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvencu varijabilnnog regiona λ lakog lanca, i/ili sekvencu varijabilnog regiona κ lakog lanca koja je somatski hipermutirana.

[0033] U nekim izvođenjima, ovde su opisane ćelije /ili tkiva (npr., izolovane ćelije i/ili tkiva) iz miša. U nekim izvođenjima, ćelije i tkiva sadrže, na primer, limfoidno tkivo, splenocite, B ćelije, matične ćelije i/ili zametne germinativne ćelije. U nekim izvođenjima, ćelija je izolovana. U nekim izvođenjima, izolovana ćelija je ili sadrži pro B-ćeliju, pre-B ćeliju, nezrelu B ćeliju, zrelu naivnu B ćeliju, aktiviranu B ćeliju, memorijsku B ćeliju, lifocit B linije, i/ili plazma ćeliju. U nekim izvođenjima, izolovana ćelija sadrži matičnu ćeliju (npr., embrionalnu matičnu ćeliju) i/ili germinativnu ćeliju (npr., spermatozoid, oocit).

[0034] Takođe je prikazana izolovana ćelija glodara, čiji germinativni genom uključuje:

modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata:

(a) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(b) jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, i

(c) Cλ gen,

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata su u operativnoj vezi sa Cλ genom.

[0035] U nekim izvođenjima, izolovana ćelija miša koja je ovde opisana je mišja embrionalna matična (ES) ćelija.

[0036] U nekim izvođenjima, predmetni prikaz obuvata mišji embrion koji je generisan iz ovde opisane mišje ES ćelije.

[0037] U nekim izvođenjima, predmetni prikaz obuhvata imortalizovanu ćeliju koja je dobijena iz ovde opisane izolovane mišje ćelije.

[0038] Takođe je prikazan postupak za dobijanje miša čiji germinativni genom sadrži modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina, postupak obuhvata korake:

(a) uvođenje jednog ili više fragmenta DNK u germinativni genom mišje ES ćelije, pri čemu jedan ili više fragmenata DNK sadrže:

(i) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(ii) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, i jedan mišji Cλ gen su uvedeni u germinativni genom mišje ES ćelije u endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, i jedan mišji Cλ gen su operativno vezani; i

(b) dobijanje miša upotrebom mišje ES ćelije dobijene pod (a).

[0039] Takođe je prikazan postupak za dobijanje miša čiji germinativni genom sadrži modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina, sadrži korak uvođenja nekodirajuće sekvence κ lakog lanca u germinativni genom mišje ES ćelije tako da nekodirajuća sekvenca κ lakog lanca je između jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata u germinativnom genomu mišje ES ćelije.

[0040] Takođe je prikazan postupak za dobijanje miša čiji germinativni genom sadrži modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina, postupak obuhvata sledeće korake:

modifikovanje endogenog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina u germinativnom genomu da sadrži:

(a) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(b) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, i

(c) jedan mišji Cλ gen,

gde jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata su operativno povezani sa jednim mišjim Cλ genom, i

gde jedan mišji Cλ gen je insertovan umesto mišjeg Cκ gena na endogenom κ lokusu imunoglobulina.

[0041] U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen zamenjuje mišji Cκ gen na endogenom lokusu κ imunoglobulina.

[0042] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata sadrže Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata sadrže Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, and Vλ3-1. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata sadrže Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, and Vλ3-1.

[0043] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata sadrži Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata sadrži Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, i Jλ 7.

[0044] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata, gde jedna ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini sa humanim Vλ genskim segmentom u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci je ili sadrži intron. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanog Jλ genskog segmenta, gde jedna ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani Jλ genski segment u endogenom lokusu λ lakog lanca humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci je ili uključuje intron. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanog Jλ genskog segmenta, pri čemu jedna ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani Jκ genski segment u endogenom lokusu humanog κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci je ili sadrži intron.

[0045] U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen ima sekvencu koja je bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95%, bar 98%, ili bar 99% identična sa mišjim Cλ1, mišjim Cλ2 ili mišjim Cλ3 genom. U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen je ili sadrži mišji Cλ1 gen.

[0046] U nekim izvođenjima, jedan ili više fragmenata DNK sadrže bar jedan selekcioni marker. U nekim izvođenjima, jedan ili više fragmenata DNK sadrže bar jedno mesto rekombinacije koje je specifično mesto rekombinacije.

[0047] U nekim izvođenjima, germinativni genom miša sadrži:

modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina, uključujući:

(a) jedan ili više humanih VHgenskih segmenata,

(b) jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i

(c) jedan ili više humanih JHgenskih segmenata,

gde jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata su u operativnoj vezi sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina.

[0048] U nekim izvođenjima, korak modifikovanja endogenog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina u germinativnom genomu je izveden u mišjoj ES ćeliji čiji germinativni genom sadrži modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina uključujući jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata koji su operativno povezani sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina.

[0049] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih VHnekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, gde svaki od jedne ili više humanih VHnekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani VHgenski segment u endogenom lokusu humanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaki od jedne ili više humanih VHnekodirajućih sekvenci je ili uključuje intron. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih DHnekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanih DHgenskih segmenata, gde svaka od jedne ili više DHnekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani DHgenski segment u endogenom lokusu humanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više humanih DHnekodirajućih sekvenci je ili uključuje intron. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih JHnekodirajućih sekvenci, od kojih je svaka u blizini sa bar jednim od jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, gde svaka od jedne ili više JHnekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi susedno u odnosu na humani JHgenski segment u endogenom lokusu humanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, svaka od jedne ili više humanih JHnekodirajućih sekvenci je ili sadrži intron.

[0050] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela u mišu, postupak obuhvata korake:

(a) imunizovanje genetički modifikovanog miša sa antigenom od interesa,

pri čemu genetički modifikovani miš ima germinativni genom koji sadrži:

prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(i) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(ii) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

gde jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata pod (i) i jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata (ii) su u operativnoj vezi sa jednim mišjim Cλ genom pod (iii);

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata pod (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata pod (ii)

su umesto jednog ili više endogenih mišjih Vκ genskih segmenata i jednog ili više endogenih mišjih Jκ genskih segmenata;

gde genski modifikovanom mišu nedostaje mišji Cκ gen na prvom modifikovanom endogenom lokusu k lakog lanca imunoglobulina;

(b) održavanje genetički modifikovanog miša pod uslovima koji su dovoljni genetički modifikovanom mišu da proizvede imuni odgovor na antigen od interesa; i

(c) regenerisanje iz genetički modifikovanog miša:

(i) antitela koje veže antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji se sastoji iz humanog λ varijabilnog domena i mišjeg λ konstantnog domena,

(ii) nukleotida koji kodira varijabilni domen humanog lakog lanca ili varijabilni domen humanog teškog lanca, laki lanac, ili težak lanac antitela koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo koje se veže za antigen od interesa sadrži laki lanac koji se sastoji iz humanog λ varijabilnog domena i mišjeg λ konstantnog domena, ili

[0051] U nekim izvođenjima, u odgovoru na korak imunizacije, miš proizvodi B ćeliju koja eksprimuje antitelo koje veže antigen od interesa. U nekim izvođenjima, antitelo koje je eksprimirano od strane B ćelije sadrži težak lanac koji ima humani varijabilni domen teškog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca i/ili lambda lakog lanca koji ima humani varijabilni domen lambda lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, antitelo koje je eksprimirano od strane B ćelije sadrži (i) težak lanac koji ima varijabilni domen humanog teškog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca, (ii) lambda laki lanac koji ima varijabilni domen humanog lambda lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisana, (iii) kapa laki lanac koji ima varijabilni domen humanog kapa lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca kao što je ovde opisano, ili (iv) bilo koja njihova kombinacija.

[0052] U nekim izvođenjima, u odgovoru na korak imunizacije, miš proizvodi populaciju B ćelija koja eksprimuje antitela koja vežu antigen od interesa. U nekim izvođenjima, antitela koja su eksprimirana od strane populacije B ćelija koja je proizvedena u odgovoru na antigen sadrže težak lanac koji ima humani varijabilni domen teškog lanca koji je kodiran sekvencom humanog varijabilnog regiona teškog lanca i/ili lambda laki lanac koji ima humani varijabilni domen lambda lakog lanca koji je kodiran sekvencom humanog varijabilnog regiona lambda lakog lanca kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, antitela koja su eksprimirana od strane populacije B ćelija proizvedenih u odgovoru na antigen sadrže (i) težak lanac koji ima humani varijabilni domen teškog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona teškog lanca, (ii) lambda laki lanac koji ima humani varijabilni domen lambda lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona lambda lakog lanca kao što je ovde opisano, (iii) kapa laki lanac koji ima humani varijabilni domen kapa lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona kapa lakog lanca kao što je ovde opisano, ili (iv) bilo koja njihova kombinacija.

[0053] U nekim izvođenjima, u odgovoru na korak imunizacije, miš proizvodi populaciju B ćelija koja eksprimuje antitela koja se vežu za jedan ili više epitope antigena od interesa, gde su antitela eksprimovana od populacije B ćelija koje su proizvedene u odgovoru na antigen sadrže: (i) težak laanc koji ima varijabilni domen humanog teškog lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona humanog teškog lanca, (ii) lambda laki lanac koji ima varijabilni domen humanog lambda lakog lanca koji je kodiran sa sekvencom varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisano, (iii) kapa laki lanac koji ima varijabilni domen humanog kapa lakog lanca koji je kodiran sa sekvencom varijabilnog regiona huamnog kapa lakog lanca kao što je ovde opisano, ili (iv) bilo kojom njihovom kombinacijom.

[0054] U nekim izvođenjima, sekvenca variajbilnog regiona humanog teškog lanca, sekvenca varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca kao što je ovde opisano je somatski hipermutirana. U nekim izvođenjima, bar oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% B ćelija u populaciji B ćelija koje su proizvedene u odgovoru na antigen sadrže sekvencu varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvenca varijabilnog regiona λ lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona κ lakog lanca koja je somatski hipermutirana.

[0055] U nekim izvođenjima, antitelo koje veže antigen od interesa je izolovano iz, dobijeno iz, ili je identifikovano iz B ćelije miša. U nekim izvođenjima, antitelo je izolovano iz, dobijeno iz, ili je identifikovano iz hibridoma koji je napravljen sa mišjom B ćelijom.

[0056] U nekim izvođenjima, antigen sadrži jedan ili više epitopa i antitelo koje veže antigen od interesa veže se za epitop jednog ili više epitopa.

[0057] U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen ima sekvencu koja je bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95%, bar 98%, ili bar 99% identična sa mišjim Cλ1, mišjim Cλ2 ili mišjim Cλ3 genom. U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen je ili sadrži mišji Cλ1 gen.

[0058] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata sadrži Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata sadrži Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, i Vλ3-1. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata sadrži Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, i Vλ3-1.

[0059] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata sadrži Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata sadrži Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, i Jλ 7.

[0060] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci, pri čemu svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci je susedna u odnosu na Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ili Vλ3-1 u modifikovannom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde se svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci prirodno nalazi u blizini u odnosu na Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ili Vλ3-1 endogenog lokusa humanog λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Jλ7 u modifikovanom endogenomu lokus κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Jλ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Jλ7 endogenog lokusa humanog λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci je u blizini sa Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Vλ7 u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ili Jκ5 endogenog humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina.

[0061] U nekim izvođenjima, miš ima germinativni genom uključujući modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina uključujući:

(a) jedan ili više humanih VHgenskih segmenata,

(b) jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i

(c) jedan ili više humanih JHgenskih segmenata,

[0062] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata sadrži VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata sadrži VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, i VH6-1.

[0063] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata sadrži DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata sadrži DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, i DH7-27.

[0064] U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih JHgenskih segmenata sadrži JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, jedan ili više humanih JHgenskih segmenata sadrži JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, i JH6.

[0065] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih VHnekodirajućih sekvenci, gde jedna ili više humanih VHnekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 ili VH6-1 u modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih VHnekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 ili VH6-1 endogenog lokusa humanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih DHnekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih DHnekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 ili DH7-27 u modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulin, i gde svaka od jedne ili više humanih DHnekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 ili DH7-27 endogenog lokusa humanog teškog lanca. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži jednu ili više humanih JHnekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih JHnekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 ili JH6 u modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih JHnekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 ili JH6 endogenog lokusa humanog teškog lanca imunoglobulina.U nekim izvođenjima, ćelija miša koja je oporavljena je B ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija koja je izvedena iz ćelije miša je hibridom.

[0066] U nekim izvođenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu humanog varijabilnog regiona teškog lanca, sekvencu varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca, i/ili sekvencu varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca je dobijena iz B ćelija.

[0067] U nekim izvođenjima, modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina nedostaje funkcionalni endogeni mišji Adam6 gen. U nekim izvođenjima, germinativni genom miša sadrži jednu ili više sekvenci nukleotida koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata. U nekim izvođenjima, jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovi funkcionalni fragmenti su eksprimovani (npr., u ćeliji muškog reproduktivnog sistema, npr., ćelije testisa).

[0068] U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovi funkcionalni homolozi se nalaze na istom hromozomu kao modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovi funkcionalni fragmenti su uključeni u modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata su između prvog humanog VHgenskog segmenta i drugog humanog VHgenskog segmenta. U nekim izvođenjima, prvi humani VHgenski segment je VH1-2 i drugi humani VHgenski segment je VH6-1. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata su umesto humanog Adam6 pseudogena. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata zamenjuju humani Adam6 pseudogen. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više mišjih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovi funkcionalni fragmenti su između humanog VHgenskog segmenta i humanog DHgenskog segmenta.

[0069] U nekim izvođenjima, korišćeni miš je onaj čiji germinativni genom sadrži homozigotni modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina uključujući:

(i) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, gde jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata sadrži Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ili bilo koju njihovu kombinaciju,

(ii) jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, gde jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata sadrži Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7, ili bilo koju njihovu kombinaciju, i

(iii) mišji Cλ gen;

gde jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata, jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, i mišji Cλ gen su operativno povezani jedan sa drugim, gde mišji Cλ gen je umesto mišjeg Cκ gena endogenog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina, gde modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži:

(a) jednu ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ili Vλ3-1 u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ili Vλ3-1 endogenog lokusa humanog λ lakog lanca imunoglobulina, i

(b) jedna ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, ili Jλ7 u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci prirodno je u blizini u odnosu na Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ili Jκ5 endogenog humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina, i

gde lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži nekodirajuću sekvencu humanog κ lakog lanca između jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata koji imaju sekvencu koja se prirodno nalazi između humanog Vκ4-1 genskog segmenta i humanog Jκ1 genskog segmenta u endogenom humanom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina.

[0070] U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen je mišji Cλ1 gen.

[0071] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži pojačivače Eκi i Eκ3’ mišjeg κ lakog lanca imunoglobulina.

[0072] U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju jednog ili više mišjih Vκ genskih segmenata i/ili jedan ili više Jκ genskih segmenata. U nekim izvođenjima, modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju svih funkcionalnih mišjih VK i/ili Jκ genskih segmenata.

[0073] U nekim izvođenjima, korišćeni miš je onaj čiji germinativni genom sadrži:

(a) homozigotni endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina uključujući jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata operativno povezanih sa jednim ili više endogenim genom konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina tako da miš eksprimuje teške lance imunoglobulina gde svaki sadrži sekvencu humanog varijabilnog domena teškog lanca i sekvencu mišjeg konstantog domena teškog lanca,

(b) prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina uključujući jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više Jκ genskih segmenata oprativno povezanih sa endogenim mišjim Cκ regionom gena tako da miš eksprimuje lake lance imunoglobulina pri čemu svaki sadrži sekvencu humanog varijabilnog domena κ lakog lanca i sekvencu mišjeg konstantog domena κ lakog lanca, i (c) drugi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina uključujući:

(iii) mišji Cλ gen;

(a) jednu ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci, pri čemu svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ili Vλ3-1 u modifokovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Vλ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ319, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ili Vλ3-1 endogenog lokusa humanog λ lakog lanca imunoglobulina, i

(b) jedna ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci, gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci je u blizini u odnosu na Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Jλ7 u modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, i gde svaka od jedne ili više humanih Jκ nekodirajućih sekvenci prirodno se nalazi u blizini u odnosu na Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ili Jκ5 endogeni lokus humanog κ lakog lanca imunoglobulina, i

gde lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži nekodirajuću sekvencu humanog κ lakog lanca između jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genskih segmenata koji ima sekvencu koja se prirodno nalazi između humanog Vκ4-1 genskog segmenta i humanog Jκ1 genskog segmenta u endogenom humanom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina; tako da miš eksprimuje lake lance imunoglobulina pri čemu svaki sadrži sekvencu humanog varijabilnog domena λ lakog lanca i sekvencu mišjeg konstantnog domena λ lakog lanca.

[0074] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži inaktivisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, ovde opisani miš je heterozigotan za inaktivisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, ovde opisani miš je homozigotan za inaktivisani endogeni lokus λ lanca imunoglobulina.

[0075] U nekim izvođenjima, genom miša dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom. U nekim izvođenjima, transkripcioni kontrolni element sadrži transkripcioni kontrolni element RAG1, transkripcioni kontrolni element RAG2, transkripcioni kontrolni element teškog lanca imunoglobulina, transkripcioni kontrolni element κ lakog lanca imunoglobulina, transkripcioni kontrolni element λ lakog lanca imunoglobulina, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira za egzogenu TdT je locirana na lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, lokusu λ lakog lanca imunoglobulina, lokus teškog lanca imunoglobulina, lokusu RAG1, ili lokusu RAG2. U nekim izvođenjima, TdT je humani TdT. U nekim izvođenjima, TdT je kratak izooblik TdT (TdTS).

[0076] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genomu i ispoljava lake lance (npr., eksprimuje varijabilne domene lakog lanca uključujući) sa bar 1.2-puta, bar 1.5-puta, bar 1.75-puta, bar 2-puta, bar 3-puta, bar 4-puta, ili bar 5-puta povećanje u spojnoj raznolikosti u odnosu na uporevog miša (npr., jedinke iz legla) koji ne sadrži egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genu. U nekim izvođenjima, spojna raznolikost je merena brojem jedinstvenih CDR3/ 10,000 čitanja. U nekim izvođenjima, spojna raznolikost je merena brojem jedinstvenih CDR3/ 10,000 čitanja.

[0077] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je u operativnoj vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genomu i bar 25%, bar 30%, bar 35%, bar 40%, bar 45%, bar 50%, bar 55%, bar 60%, bar 65% lakih lanaca (npr., lambda i/ili kapa laki lanci) proizvedenih od miša koji ispoljava adicije koje ne pripadaju matrici.

[0078] Takođe je prikazano antitelo koje je dobijeno postupkom koji obuhvata korake:

(a) obezbeđivanje ovde opisanog miša;

(b) imunizovanje miša sa antigenom od interesa;

(c) održavanje miša pod uslovima koji su dovoljni da miš proizvede imunski odgovor na antigen od interesa; i

(d) oporavak antitela koje veže antigen od interesa iz miša, ili ćelije miša, ili ćelije koja je izvedena iz ćelije miša,

gde antitelo pod (d) sadrži humani varijabilni teškog lanca i humane varijabilne domene λ lakog lanca.

[0079] Takođe je prikazano antitelo koje je dobijeno postupkom koji obuhvata korake:

(a) imunizovanje ovde opisanog miša sa antigenom od interesa;

(b) održavanjem miša pod uslovima koji su dovoljni da miš proizvede imuni odgovor na antigen od interesa; i

(c) oporavak antitela koje veže antigen od interesa iz miša, ili ćelije miša, ili ćelije koja je izvedena iz ćelije miša,

gde antitelo pod (c) sadrži humani varijabilni težak lanac i humane varijabilne domene λ lakog lanca.

[0080] U nekim izvođenjima, miš ne eksprimuje detektabilno endogene varijabilne domene κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, miš ne eksprimuje detektabilno endogene varijabilne domene λ lakog lanca imunoglobulina.

[0081] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš proizvodi populaciju B ćelija u odgovoru na imunizaciju sa antigenom koji sadrži jedan ili više epitopa. U nekim izvođenjima, miš proizvodi populaciju B ćelija koja eksprimuje antitela koja vežu (npr., specifično se vežu) za jedan ili više epitopa antigena od interesa. U nekim izvođenjima, antitela koja su eksprimovana od strane populacije B ćelija koja je proizvedena u odgovoru na antigen sadrži težak lanac koji ima humani varijabilni domen teškog lanca koji je kodiran sa sekvencom humanog varijabilnog regiona teškog lanca i/ili lambda laki lanac koji ima humani varijabilni domen lambda lakog lanaca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona lambda lakog lanca kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, antitela koja su eksprimovana od strane populacije B ćelija proizvedene u odgovoru na antigen sadrže (i) težak lanac koji ima humani varijabilni domen teškog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona teškog lana, (ii) lambda laki lanac koji ima humani varijabilni domen lambda lakog lanca koji je kodiran sekvencom humanog varijabilnog regiona lambda lakog lanca kao što je ovde opisano, (iii) kapa laki lanac koji ima humani varijabilni domen kapa lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona kapa lakog lanca kao što je ovde opisano, ili (iv) bilo koja njihova kombinacija.

[0082] U nekim izvođenjima, miš proizvodi populaciju B ćelija koja eksprimuje antitela koja se vežu za jedan ili više epitopa antigena od interesa, gde antitela koja su eskprimovana od strane populacije B ćelija proizvedene u odgovoru na antigen sadrže: (i) težak lanac koji ima varijabilni domen humanog teškog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona teškog lanca, (ii) lambda laki lanac koji ima humanoi varijabilni domen lambda lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona lambda lakog lanca kao što je ovde opisano, i/ili (iii) kapa laki lanac koji ima humani varijabilni domen kapa lakog lanca koji je kodiran od strane sekvence humanog varijabilnog regiona kapa lakog lanca kao što je ovde opisano.

[0083] U nekim izvođenjima, sekvenca humanog varijabilnog regiona teškog lanca, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca, i/ili sekvenca humanog varijabilnog regiona κ lakog lanca kao što je ovde opisana je somatski hipermutirana. U nekim izvođenjima, bar oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% B ćelija u populaciji B ćelija proizvedenih u odgovoru na antigen sadrže sekvencu humanog varijabilnog regiona teškog lanca, sekvencu varijabilnog regiona λ lakog lanca, i/ili sekvencu varijabilnog regiona κ lakog lanca koja je somatski hipermutirana.

[0084] U nekim izvođenjima, postupak za dobijanje antitela, može biti onaj koji dalje obuhvata:

(i) eksprimovanje prve nukleotidne sekvence koja kodira težak lanac imunoglobulina u ćeliji domaćina, gde prva nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu humanog varijabilnog regiona teškog lanca;

(ii) eksprimovanje druge nukleotidne sekvence koja kodira λ laki lanac imunoglobulina u ćeliji domaćina, pri čemu druga nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca koja je identifikovana (npr., eksprimovana i/ili izolovana) iz miša čiji germinativni genom sadrži prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(i) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(ii) jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

gde jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata pod (ii) su u operativnoj vezi sa jednim mišjim Cλ genom pod (iii);

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata pod (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata pod (ii) su umesto jednog ili više endogenih mišjih Vκ genskih segmenata i jednog ili više endogenih mišjih Jκ genskih segmenata;

(iii) kultivisanje ćelije domaćina tako da laki lanci imunoglobulina i teški lanci imunoglobulina su eksprimovani i obrazuju antitelo; i

(iv) dobijanje antitela iz ćelije domaćina i/ili kulture ćelije domaćina.

[0085] U nekim izvođenjima, prva sekvenca nukleotida sadrži humani konstantni region teškog lanca. U nekim izvođenjima, antitelo je puno humano antitelo.

[0086] U nekim izvođenjima, drugi nukleotid sadrži sekvencu humanog konstantnog regiona λ lakog lanca.

[0087] U nekim izvođenjima, antitelo je reverzno himerno antitelo. U nekim izvođenjima, prva sekvenca nukleotida sadrži mišji konstantni region teškog lanca. U nekim izvođenjima, druga sekvenca nukleotida sadrži sekvencu mišjeg konstantnog regiona λ lakog lanca.

[0088] U nekim izvođenjima, korišćeni miš je onaj čiji germinativni genom sadrži:

(a) prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(i) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(ii) jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

gde jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata (ii) su u operativnoj vezi sa jednim mišjim Cλ genom pod (iii);

pri čemu genski modifikovanom mišu nedostaje mišji Cκ gen na prvom modifikovanom endogenom lokusu k lakog lanca imunoglobulina; i

(b) drugi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina dalje sadrži:

(i) jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata, i

(ii) jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata,

pri čemu jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata su operativno povezani sa Cκ genom.

[0089] U nekim izvođenjima, Cκ gen je endogeni mišji Cκ gen.

[0090] U nekim izvođenjima, genom miša dalje uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa elementom za kontrolu transkripcije. U nekim izvođenjima, kontrolni element za transkripciju uključuje RAG1 transkripcioni kontrolni element, RAG2 transkripcioni kontrolni element, kontrolni element transkripcije teškog lanca imunoglobulina, kontrolni element transkripcije imunoglobulina κ lakog lanca, kontrolni element transkripcije λ lakog lanca imunoglobulina, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira egzogeni TdT nalazi se na lokusu lakog lanca imunoglobulina κ, lokusu lakog lanca imunoglobulina λ, lokusu teškog lanca imunoglobulina, RAG1 lokusu ili RAG2 lokusu. U nekim izvođenjima, TdT je humani TdT. U nekim izvođenjima, TdT je kratak izooblik TdT (TdTS).

[0091] U nekim izvođenjima, genom miša dalje obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa elementom za kontrolu transkripcije. U nekim izvođenjima, kontrolni element za transkripciju uključuje RAG1 transkripcioni kontrolni element, RAG2 transkripcioni kontrolni element, kontrolni element transkripcije teškog lanca imunoglobulina, kontrolni element transkripcije imunoglobulina κ lakog lanca, kontrolni element transkripcije λ lakog lanca imunoglobulina, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira egzogeni TdT nalazi se na lokusu lakog lanca imunoglobulina κ, lokusu lakog lanca imunoglobulina λ, lokusu teškog lanca imunoglobulina, RAG1 lokusu ili RAG2 lokusu. U nekim izvođenjima, TdT je humani TdT. U nekim izvođenjima, TdT je kratak izooblik TdT (TdTS).

[0092] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genomu i ispoljava lake lance (npr., eksprimuje varijabilne domene lakog lanca uključujući) sa bar 1.2-puta, bar 1.5-puta, bar 1.75-puta, bar 2-puta, bar 3-puta, bar 4-puta, ili bar 5-puta povećanje u spojnoj raznolikosti u odnosu na uporedivog miša (npr., iz legla) koji ne sadrži egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genomu. U nekim izvođenjima, spojna raznolikost je izmerena brojem jedinstvenih CDR3/ 10,000 čitanja. U nekim izvođenjima, spojna raznolikost je izmerena brojem jedinstvenih CDR3/ 10,000 čitanja.

[0093] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je operativno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom u njegovom germinativnom genomu i bar 25%, bar 30%, bar 35%, bar 40%, bar 45%, bar 50%, bar 55%, bar 60%, bar 65% lakih lanaca (npr., lambda i/ili kapa laki lanci) koji su proizvedeni od strane miša koji ispoljava adicije koje nisu vezane za matricu.

[0094] U nekim izvođenjima, miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano obuhvata gensku pozadinu koja sadrži soj 129, soj BALB/c, soj C57BL/6, mešani soj 129xC57BL/6, ili njihovu kombinaciju.

KRATAK OPIS NACRTA

[0095] Nacrti koji su ovde uključeni, koji se sastoje iz sledećih Slika, dati su za svrhu ilustracije samo i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

Slike 1A i 1B prikazuju ilustracije primera izvođenja, ne u razmeri, strategije za konstruisanje vektora za ciljanje (opisanog u Primeru 1.1) koji se koristi za dobijanje izvođenja miša u skladu sa predmetnim prikazom.

Slika 2A prikazuje ilustraciju primera izvođenja, ne u razmeri, umetanja vektora za ciljanje (opisanog u Primeru 1.1) u projektovani lokus Igk lakog lanca klona mišje embrionalne matične ćelije (ES), koji je bio klon ES ćelije koji se koristi u dobijanju izvođenja prema predmetnom pronalasku.

Slika 2B prikazuje ilustraciju primera izvođenja, ne u razmeri, uklanjanja selekcionih kaseta(a) posredovanog rekombinazom u konstruisanom lokusu lakog lanca Igk koje je rezultat umetanja vektora za ciljanje (opisanog u Primeru 1.1) koji se koristi za dobijanje izvođenje miša prema predmetnom pronalasku.

Slika 3 prikazuje ilustraciju primera izvođenja, ne u razmeri, strategije za konstruisanje vektora ciljanja (opisanog u Primeru 1.2) koji se koristi za dobijanje izvođenja miša u skladu sa predmetnom pronalaskom.

Slika 4A prikazuje ilustraciju, ne u razmeri, umetanja vektora za ciljanje (opisanog u Primeru 1.2) u projektovani lokus Igk lakog lanca klona mišje embrionalne matične ćelije (ES), koji je ES ćelijski klon korišćen za dobijanje izvođenja miša prema predmetnom pronalasku.

Slika 4B prikazuje ilustraciju primera izvođenja, ne u razmeri, uklanjanja selekcionih kaseta(a) posredovanog rekombinazom u konstruisanom Igk lokusu lakog lanca koje je rezultat umetanja vektora za ciljanje (opisanog u Primeru 1.2) koji se koristi u dobijanju izvođenja miša prema predmetnom pronalasku.

Slika 5 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativnog izvođenja u skladu sa predmetnim prikazom, prikazujući splenocite sa jednim ćelijskim putem sakupljeni od divljeg tipa (WT) i 6558 HO (LiK, homozigotnih) miševa, gornji red koji ilustruje ekspresiju CD19 (y-osa ) i CD3 (x-osa), a donji red koji ilustruje splenocite sa ograničenjem na CD19<+>koji eksprimiraju imunoglobulin D (IgD, y-osa) i imunoglobulin M (IgM, k-osa).

Slika 6 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativnog izvođenja u skladu sa predmetnim prikazom, uključujući reprezentativnu koštanu srž zatvorenu od jedne ćelije sakupljene od divljeg tipa (WT) i 6558HO (LiK, homozigotnih) miševa, gornji red koji ilustruje ekspresiju CD19 (y-osa) i CD3 (x-osa), a donji red koji ilustruje ekspresiju imunoglobulina M (IgD, y-osa) i B220 (x-osa).

Slika 7 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativnog izvođenja u skladu sa predmetnim prikazom, uključujući reprezentativne splenocite sa ograničenim delovanjem na CD19<+>sakupljene od divljeg tipa (WT) i 6558HO (LiK, homozigotnih) miševa koji ilustruju ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina koji sadrže mišji Igλ (y-osa) ili konstantne regije miša Igκ (x-osa).

Slika 8 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativne varijante u skladu sa ovim otkrićem, uključujući reprezentativne splenocite zatvorene od jedne ćelije sakupljene od različitih naznačenih humanizovanih miševa koji ilustruju ekspresiju CD19 (y-osa) i CD3 (x-osa). HOH/LiK/λ<-/->miševi - miševi homozigotni za teški lanac humanizovanog imunoglobulina (videti, na primer, patente SAD br.

8,642,835 i 8,697,940), homozigotni za LiK lokus i homozigotni za inaktivirani endogeni lanac lakog lanca λ HOH/KoK/LiK/λ<-/->miševi - miševi homozigotni za teški lanac humanizovanog imunoglobulina (videti, na primer, patente SAD br. 8,642,835 i 8,697,940), hemizigotni za jedan kapa lokus koji se sastoji od LiK kapa lokusa i od drugog kapa lokusa koji sadrži humanizovani lokus kapa lakog lanca imunoglobulina, i homozigotan za inaktivisani lokus endogenog λ lakog lanca imunoglobulina; HOH/KoK miševi – kontrolni miševi homozigotni za humanizovani imunoglobulinski težak lanac i homozigotni za kapa laki lanac humanizovanog imunoglobulina.

Slika 9 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativne varijante u skladu sa ovim otkrićem, uključujući reprezentativne splenocite sa ograničenim delovanjem na CD19<+>sakupljene od različitih naznačenih humanizovanih miševa koji ilustruju ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina koji sadrže mišji Igλ (y-osa) ili mišji Igκ (x-osa) konstantni regioni.

Slika 10 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativnog izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključujući reprezentativnu koštanu srž zatvorenu od jedne ćelije, sakupljene od različitih naznačenih humanizovanih miševa, ilustrujući ekspresiju imunoglobulina M (IgD, y-osa) i B220 (x-osa).

Slika 11 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativnog izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključujući reprezentativnu koštanu srž zatvorenu od jedne ćelije sakupljene od različitih naznačenih humanizovanih miševa koji ilustruju ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina koji sadrže mišji Igλ (y-osa) ili mišji Igκ (x-osa) konstantni regioni u nezrelim (gornji red) i zrelim (donji red) B ćelijama.

Slika 12 prikazuje šematsku ilustraciju primera izvođenja, u skladu sa ovim otkrićem, ne u razmeri, projektovanog lokusa lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano i preuređenje lokusa da bi se formirao molekul iRNK.

Slika 13 prikazuje rezultate izvedene iz reprezentativnog izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključujući reprezentativne proteinske imunoblotove (“Western” blotove) SDS-PAGE koristeći serum izolovan od divljeg tipa (WT) i 6558 homozigotnih (LiK HO) miševa kao što je opisano u Primeru 3.3

Slika 14 prikazuje rezultate testiranja izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, prikazujući reprezentativne splenocite sa jednim ćelijskim putem, sakupljene od humanizovanih miševa, ilustrujući ekspresiju CD19 (y-osa) i CD3 (x-osa). HOH/LiK/λ<-/->/TdT miševi - miševi homozigotni za teški lanac humanizovanog imunoglobulina (videti, na primer, patente SAD br. 8,642,835 i 8,697,940), homozigotni za LiK lokus i homozigotni za inaktivisani endogeni lokus λ lakog lanca immunoglobulina koji uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira za egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT); i HOH/KoK/LiK/λ<-/->/TdT miševi – miševi homozigotni za humanizovani težak lanac imunoglobulina (videti, npr., U.S. Patent Nos. 8,642,835 i 8,697,940), hemizigotni za jedan kapa lokus koji sadrži LiK lokus i drugi kapa lokus koji sadrži humanizovani lokus kappa lakog lanca imunoglobulina, i homozigotni za inaktivisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina koji uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT).

Slika 15 prikazuje rezultate testiranja izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, prikazujući reprezentativne splenocite sa ograničenim delovanjem na CD19<+>sakupljene od različitih naznačenih humanizovanih miševa koji ilustruju ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina koji sadrže mišji Igλ (y-osa) ili mišji konstantni regioni Igκ (x-osa).

Slika 16 prikazuje rezultate testiranja izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, prikazujući reprezentativnu koštanu srž zatvorenu od jedne ćelije sakupljene od različitih naznačenih humanizovanih miševa koji ilustruju ekspresiju imunoglobulina M (IgM, y-osa) i B220 (x-osa).

Slika 17 prikazuje rezultate testiranja izvođejnja u skladu sa predmetnim pronalaskom, prikazujući reprezentativnu koštanu srž zatvorenu od jedne ćelije sakupljene od različitih naznačenih humanizovanih miševa koji ilustruju ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina koji sadrže mišji Igλ (y-osa) ili mišji Igκ (x-osa) konstantni regioni u nezrelim (gornji red) i zrelim (donji red) B ćelijama.

Slika 18 prikazuje rezultate testiranja izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, prikazujući grafikon koji upoređuje imune odgovore kod sojeva LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT i VI-3/TdT miševa nakon imunizacije proteinskim imunogenom.

Slika 19 prikazuje rezultate testiranja izvođenja u skladu sa predmetnim pronalaskom, prikazujući grafik koji upoređuje imune odgovore na His tag kod LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT i VI-3/TdT sojeva miševa nakon imunizacije irelevantnim proteinskim antigenom fuzionisanim sa HIS tagom.

Slika 20 prikazuje ilustraciju, ne u razmeri, dela lokusa lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina λ. Slika 20 uključuje prvu strelicu koja pokazuje na prikaz prve egzemplarne nekodirajuće sekvence endogenog humanog Vλ u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina λ. Kao što je ilustrovano, prva primerna endogena humana Vλ nekodirajuća sekvenca (predstavljena linijom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina λ prirodno se pojavljuje pored segmenta ljudskog Vλ3-12 gena (predstavljenog tamno sivim kvadratom) i humanog segmenta gena Vλ2-11 (predstavljen tamno sivim kvadratom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina Igλ. Slika 20 takođe uključuje drugu strelicu koja pokazuje na prikaz druge egzemplarne nekodirajuće sekvence endogenog humanog Vλ u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina λ. Kao što je ilustrovano, druga primerna endogena humana Vλ nekodirajuća sekvenca (predstavljena linijom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina λ prirodno se pojavljuje pored segmenta humanog Vλ2-11 gena (predstavljenog tamno sivim kvadratom) i segment humanog Vλ3-10 gena (predstavljen tamno sivim kvadratom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina λ.

Slika 21 prikazuje ilustraciju, ne u razmeri, dela lokusa lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina κ. Slika 21 uključuje prvu strelicu koja pokazuje na prikaz prve egzemplarne endogene humane Jκ nekodirajuće sekvence u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina κ. Kao što je ilustrovano, prva primerna endogena ljudska Jκ nekodirajuća sekvenca (predstavljena linijom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina k prirodno se pojavljuje pored segmenta humanog Jκ1 gena (predstavljenog tamno sivim kvadratom) i humanog segmenta Jκ2 gena (predstavljen tamno sivim kvadratom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina κ. Slika 21 takođe uključuje drugu strelicu koja pokazuje na prikaz druge egzemplarne endogene humane Jκ nekodirajuće sekvence u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina κ. Kao što je ilustrovano, druga primerna endogena ljudska Jκ nekodirajuća sekvenca (predstavljena linijom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina κ prirodno se pojavljuje pored segmenta humanog Jκ2 gena (predstavljenog tamno sivim kvadratom) i humanog segmenta Jκ3 gena (predstavljen tamno sivim kvadratom) u lokusu lakog lanca endogenog humanog imunoglobulina κ.

KRATAK OPIS ODABRANIH SEKVENCI U POPISU SEKVENCI

[0096] Slede reprezentativne sekvence nukleinskih kiselina i aminokiselina različitih konstantnih regiona imunoglobulina mišjih, pacovskih ili humanih lambda gena. Sekvence nukleinskih kiselina i aminokiselina imunoglobulinskih gena i polipeptida dostupne su na internet stranici Međunarodnog imunogenetičkog informacionog sistema, www.imgt.org.

DNK Cλ1 miša (SEQ ID NO:1):

DNK Cλ3 miša (SEQ ID NO:5):

DNK Cλ3 pacova (SEQ ID NO:11):

Aminokiselina humanog Cλ1 (SEQ ID NO:16):

DNK humanog Cλ6 (SEQ ID NO:21):

DEFINICIJE

[0097] Obim predmetnog pronalaska je definisan ovde predstavljenim zahtevima i nije ograničen sa određenim ovde opisanim izvođenjima. Stručnjaci iz oblasti tehnike, čitajući predmetnu specifikaciju, biće svesni različitih modifikacija koje mogu biti ekvivalentne sa takvim opisanim izvođenjima, ili na drugi način obuhvaćeni obimom patentnih zahteva. Uopšteno, ovde korišćeni termini su u skladu sa njihovim značenjem u oblasti tehnike, osim ako nije jasno naznačeno drugačije. Eksplicitne definicije određenih termina su obezbeđene u tekstu ispod; značenja ovih i drugih termina u posebnim slučajevima kroz ovu specifikaciju u oblasti tehnike iz konteksta. Dodatne definicije koje slede i ostali termini su predstavljeni kroz specifikaciju. Reference su citirane za patentnu i nepatentnu literaturu u ovoj specifikaciji, ili njene relevantne delove.

[0098] Upotreba rednih termina kao što su „prvi“, „drugi“, „treći“ itd., u zahtevima za modifikovanje elementa zahteva samo po sebi ne predstavlja nikakav prioritet, prednost ili redosled jednog elementa zahteva u odnosu na drugi ili vremenski redosled u kome se radnje nekog postupka izvode, ali se koriste samo kao oznake za razlikovanje jednog elementa zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa koji ima isto ime (ali za upotrebu rednog termina) za razlikovanje elemenata zahteva.

[0099] Kako se koriste u ovoj prijavi, termini "oko" i "približno" se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji brojevi koji se koriste u ovoj prijavi sa ili bez oko ili približno su namenjeni da pokriju sve normalne fluktuacije koje proceni neko ko je uobičajeno verziran u relevantnu oblast tehnike.

[0100] Članove koji se odnose na jedninu u specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako nije jasno naznačeno suprotno, treba razumeti da sadrže pozivanje na množinu. Zahtevi ili opisi koji uključuju „ili“ između jednog ili više članova grupe smatraju se ispunjenim ukoliko je jedan, više od jednog ili svi članovi grupe prisutan u, upotrebljen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak, osim ako nije drugačije naznačeno ili na drugi način evidentno iz konteksta. Pronalazak takođe uključuje izvođenja u kojima je tačno jedan član grupe prisutan, upotrebljen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili proces. Pronalazak takođe uključuje izvođenja u kojima je više od jednog ili svako od članova grupe prisutan u, upotrebljen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Dalje, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd., iz jednog ili više navedenih zahteva, uvodi u drugi zahtev u zavisnosti od isti osnovni zahtev (ili, ako je relevantno, bilo koji drugi zahtev) osim ako nije drugačije naznačeno ili osim ako bi prosečnom stručnjaku iz oblasti tehnike bilo očigledno da će se pojaviti kontradikcija ili nedoslednost. Kada su elementi predstavljeni kao liste, (npr. u Markush-ovoj grupi ili sličnom formatu), treba razumeti da je svaka podgrupa elemenata takođe otkrivena, i da se bilo koji element(i) mogu ukloniti iz grupe. Trebalo bi razumeti da, generalno, kada se pronalazak ili aspekti pronalaska pominju kao da sadrže određene elemente, karakteristike itd., određena izvođenja pronalaska ili aspekti pronalaska se sastoje, ili se u suštini sastoje od takvih elemenata, karakteristika, itd. Radi jednostavnosti, ova izvođenja nisu u svakom slučaju ovde posebno izložena sa mnogo reči. Takođe, treba razumeti da se bilo koje izvođenje ili aspekt iz pronalaska može eksplicitno isključiti iz patentnih zahteva, bez obzira da li je specifično isključenje navedeno u specifikaciji.

[0101] Primena: kako se ovde koristi, uključuje davanje kompozicije subjektu ili sistemu (npr. ćeliji, organu, tkivu, organizmu ili relevantnoj komponenti ili skupu komponenti). Stručnjak iz oblasti tehnike će razumeti da način primene može da se razlikuje u zavisnosti, na primer, od subjekta ili sistema kome se kompozicija primenjuje, prirode kompozicije, svrhe primene, itd. Na primer, u određenim izvođenjima, primena životinjama (npr. čoveku ili mišu) može biti bronhijalna (uključujući bronhijalnu instilaciju), bukalna, enteralna, interdermalna, intraarterijska, intradermalna, intragastrična, intramedularna, intramuskularna, intranazalna, intraperitonealna, intratekalna, intravenozna, intraventrikularna, mukozna, nazalna, oralna, rektalna, subkutanozna, sublingvalna, lokalna, trahealna (uključujući intratrahealnu instilaciju), transdermalna, vaginalna i/ili vitrealna. U nekim izvođenjima, primena može uključivati povremeno doziranje. U nekim izvođenjima, primena može uključivati kontinuirano doziranje (npr. perfuziju) tokom najmanje odabranog vremenskog perioda.

[0102] Poboljšanje: kako se ovde koristi, uključuje prevenciju, smanjenje ili ublažavanje stanja, ili poboljšanje stanja subjekta. Poboljšanje uključuje, ali ne zahteva potpuni oporavak ili potpunu prevenciju bolesti, poremećaja ili stanja.

[0103] Približno: kao što je primenjeno na jednu ili više vrednosti od interesa, uključuje vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim izvođenjima, termin "približno" ili "oko" odnosi se na opseg vrednosti koje spadaju u okvir od ± 10% (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti osim ako nije drugačije navedeno ili na drugi način očigledno iz konteksta (osim kada bi takvav broj premašio 100% od moguće vrednosti).

[0104] Biološki aktivan: kako se ovde koristi, odnosi se na karakteristiku bilo kog agensa koji ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr., u organizmu). Na primer, agens koji, kada je prisutan u organizmu, ima biološki efekat u tom organizmu, smatra se biološki aktivnim. U određenim aspektima, gde je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli najmanje jednu biološku aktivnost proteina ili polipeptida se obično naziva "biološki aktivnim" delom.

[0105] Uporedivo: kako se ovde koristi, odnosi se na dva ili više agenasa, entiteta, situacija, postavke uslova, itd. koji možda nisu identični jedan sa drugim, ali koji su dovoljno slični da bi omogućili poređenje između tako da se mogu razumno izvući zaključci na osnovu uočenih razlika ili sličnosti. Osobe koje su uobičajeno verzirane iz oblasti tehnike će razumeti, u kontekstu, koji je stepen identiteta potreban u bilo kojoj datoj okolnosti da bi se dva ili više takvih agenasa, entiteta, situacija, postavke uslova, itd. smatrali uporedivim.

[0106] Konzervativno: kako se ovde koristi, odnosi se na slučajeve kada se opisuje konzervativna supstitucija aminokiseline, uključujući supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. šaržu ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće bitno promeniti funkcionalna svojstva proteina od interesa, na primer, sposobnost receptora da se veže za ligand. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju: alifatične bočne lance kao što su glicin (Gly, G), alanin (Ala, A), valin (Val, V), leucin (Leu, L) i izoleucin (Ile, I); alifatično-hidroksilni bočni lanci kao što su serin (Ser, S) i treonin (Thr, T); bočni lanci koji sadrže amid kao što su asparagin (Asn, N) i glutamin (Gln, K); aromatični bočni lanci kao što su fenilalanin (Phe, F), tirozin (Tyr, Y) i triptofan (Trp, W); bazni bočni lanci kao što su lizin (Lys, K), arginin (Arg, R) i histidin (His, H); kiseli bočni lanci kao što su asparaginska kiselina (Asp, D) i glutaminska kiselina (Glu, E); i bočni lanci koji sadrže sumpor, kao što su cistein (Cys, C) i metionin (Met, M). Konzervativne supstitucione grupe aminokiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin (Val/Leu/Ile, V/L/I), fenilalanin/tirozin (Phe/Tir, F/Y), lizin/arginin (Lys/Arg, K/R), alanin/valin (Ala/Val, A/V), glutamat/aspartat (Glu/Asp, E/D) i asparagin/glutamin (Asn/Gln, N/K). U nekim izvođenjima, konzervativna aminokiselinska supstitucija može biti supstitucija bilo kog prirodnog ostatka u proteinu sa alaninom, kao što se koristi u, na primer, sekniranju mutageneze alanina. U nekim izvođenjima, napravljena je konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u matrici logverovatnoće PAM250 prikazanoj u Gonnet, G.H. et al., 1992, Science 256:1443-1445. U nekim izvođenjima, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima nenegativnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250.

[0107] Kontrola: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na značenje pojma "kontrola" koje se u struci razume kao standard sa kojim se upoređuju rezultati. Tipično, kontrole se koriste za povećanje integriteta u eksperimentima izolovanjem varijabli kako bi se doneo zaključak o takvim varijablama. U nekim izvođenjima, kontrola je reakcija ili test koji se izvodi istovremeno sa test reakcijom ili testom da bi se obezbedio komparator. „Kontrola“ takođe uključuje „kontrolnu životinju“. "Kontrolna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija kao što je ovde opisano, ili biti bez modifikacije (tj. životinja je divljeg tipa). U jednom eksperimentu se primenjuje „test“ (tj. promenljiva koja se ispituje). U drugom eksperimentu, "kontrola", varijabla koja se ispituje nije primenjena. U nekim izvođenjima, kontrola je istorijska kontrola (tj. ispitivanja ili testa koji je prethodno obavljen, ili količina ili rezultat koji je prethodno već poznat). U nekim izvođenjima, kontrola je ili sadrži odštampan ili na drugi način sačuvan zapis. Kontrola može biti pozitivna ili negativna kontrola.

[0108] Poremećaj (oštećenje): kako se ovde koristi, odnosi se na rezultat događaja homologne rekombinacije sa molekulom DNK (npr. sa endogenom homolognom sekvencom kao što je gen ili genski lokus). U nekim izvođenjima, prekid može da postigne ili predstavlja umetanje (dodavanje), brisanje (deleciju), supstituciju, zamenu, mutaciju sa pogrešnim smislom (eng. “missens”) ili pomeranje okvira sekvence DNK ili bilo koje njihove kombinacije. Insercije mogu uključivati umetanje celih gena ili fragmenata gena, npr. egzona, koji mogu biti drugog porekla od endogene sekvence (npr. heterologne sekvence). U nekim izvođenjima, poremećaj može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr. polipeptida koji je kodiran genom). U nekim izvođenjima, oštećenje može smanjiti ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, poremećaj oštećenje može da promeni sekvencu gena ili kodiranog genskog proizvoda (npr. kodirani polipeptid). U nekim izvođenjima, poremećaj može da skrati ili razdvoji u fragmente gen ili kodirani genski proizvod (npr. kodirani polipeptid). U nekim izvođenjima, poremećaj može proširiti gen ili kodirani genski proizvod. U nekim takvim izvođenjima, prekidom se može postići sklapanje fuzionog polipeptida. U nekim izvođenjima, poremećaj može uticati na nivo, ali ne i na aktivnost, gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, poremećaj može uticati na aktivnost, ali ne i nivo, gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, poremećaj možda nema značajan uticaj na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, poremećaj možda nema značajan uticaj na aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, poremećaj ne može imati značajan uticaj na nivo ili aktivnost gena ili genskog proizvoda.

[0109] Utvrđivanje, merenje, procena, procena, ispitivanje i analiza: ovde se koriste naizmenično za upućivanje na bilo koji oblik merenja i uključuju određivanje da li je element prisutan ili nije prisutan. Ovi termini uključuju i kvantitativna i/ili kvalitativna određivanja. Ispitivanje može biti relativno ili apsolutno. „Ispitivanje prisustva“ može biti određivanje količine nečega prisutnog i/ili utvrđivanje da li je prisutno ili odsutno.

[0110] Endogeni promotor: kako se ovde koristi, odnosi se na promotor koji je prirodno povezan, na primer, u organizmu divljeg tipa, sa endogenim genom.

[0111] Konstruisano (modifikovano): kako se ovde koristi odnosi se, uopšteno, na aspekt manipulisanja od strane čoveka. Na primer, u nekim izvođenjima, polinukleotid se može smatrati „proizvedenim“ kada dve ili više sekvenci koje nisu povezane zajedno u tom redosledu u prirodi su manipulisane od strane humane ruke kako bi bile direktno povezane jedna sa drugom u modifikovanom polinukleotidu. U nekim izvođenjima, modifikovani polinukleotid može da sadrži regulatornu sekvencu koja se u prirodi nalazi operativno povezana sa prvom kodirajućom sekvencom, ali nije u operativnoj vezi sa drugom kodirajućom sekvencom, povezana je delovanjem humane ruke tako da je operativno povezana sa drugom kodirajućom sekvencom. Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline od kojih svaka kodira polipeptidne elemente ili domene koji u prirodi nisu međusobno povezani, mogu biti povezane jedna sa drugom u jednom modifikovanom polinukleotidu. Uporedivo, u nekim izvođenjima, ćelija ili organizam se može smatrati „proizvedenim“ ako je njome manipulisano tako da su njegove genetske informacije izmenjene (npr., uveden je novi genski materijal koji ranije nije bio prisutan ili je prethodno prisutan genski materijal izmenjen ili uklonjen). Kao što je uobičajena praksa i razumeju je stručnjaci u ovoj oblasti tehnike, potomstvo modifikovanog polinukleotida ili ćelije se tipično još uvek naziva "modifikovanim" iako je stvarna manipulacija izvršena na prethodnom entitetu. Osim toga, kao što će proceniti stručnjaci u ovoj oblasti tehnike, dostupne su različite metodologije pomoću kojih se može postići modifikovanje "inženjering" kako je ovde opisano. Na primer, u nekim izvođenjima, "modifikovanje" može uključivati selekciju ili dizajn (npr. sekvence nukleinskih kiselina, polipeptidnih sekvenci, ćelija, tkiva i/ili organizama) upotrebom računarskih sistema programiranih da izvrše analizu ili poređenje, ili na drugi način da analiziraju, preporuče i/ili odaberu sekvence, izmene itd.). Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, "modifikovanje" može uključivati upotrebu in vitro metodologija hemijske sinteze i/ili tehnologija rekombinantnih nukleinskih kiselina kao što je, na primer, amplifikacija nukleinske kiseline (npr. putem lančane reakcije polimeraze) hibridizacija, mutacija, transformacija, transfekcija, itd., i/ili bilo koja od različitih kontrolisanih metodologija uparivanja. Kao što će proceniti stručnjaci u ovoj oblasti, veliki broj uspostavljenih takvih tehnika (npr. za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija, itd.) je dobro poznat u oblasti tehnike i opisan je u raznim opštim i specifičnijim referencama koje se citiraju i/ili razmatraju u ovoj specifikaciji vidi npr. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 and Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. and S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994.

[0112] Funkcionalno: kako se ovde koristi, odnosi se na oblik ili fragment entiteta (npr. gen ili segment gena) koji pokazuje određeno svojstvo (npr. čini deo kodirajuće sekvence) i/ili aktivnost. Na primer, u kontekstu imunoglobulina, varijabilni regioni su kodirani jedinstvenim segmentima gena (tj. V, D i/ili J) koji se sklapaju (ili rekombinuju) da formiraju funkcionalne kodirajuće sekvence. Kada su prisutni u genomu, segmenti gena su organizovani u klastere, iako se pojavljuju varijacije. "Funkcionalni" genski segment je segment gena predstavljen u eksprimovanoj sekvenci (tj., varijabilnom regionu) za koji je izolovana odgovarajuća genomska DNK (tj. klonirana) i identifikovana u sekvenci. Neke sekvence segmenata imunoglobulinskog gena sadrže otvorene okvire čitanja i smatraju se funkcionalnim iako nisu zastupljene u izraženom repertoaru, dok druge sekvence segmenata imunoglobulinskog gena sadrže mutacije (npr. tačkaste mutacije, insercije, delecije, itd.) koje rezultiraju stop kodonom i/ili skraćenom sekvencom koja naknadno čini(e) takve sekvence genskog segmenta nesposobnim da izvode svojstvo/e i/ili aktivnost/e povezane sa nekom nemutiranom(im) sekvencom(ama). Takve sekvence nisu predstavljene u eksprimiranim sekvencama i stoga su kategorisane kao pseudogeni.

[0113] Gen: kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu DNK u hromozomu koja kodira proizvod (npr. RNK proizvod i/ili polipeptidni proizvod). U nekim izvođenjima, gen uključuje kodirajuću sekvencu (tj. sekvencu koja kodira određeni proizvod). U nekim izvođenjima, gen uključuje nekodirajuću sekvencu. U nekim posebnim izvođenjima, gen može uključivati i kodirajuću (npr. egzonsku) i nekodirajuću (npr. intronsku) sekvencu. U nekim izvođenjima, gen može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci (npr. promotore, pojačivače, itd.) i/ili intronske sekvence koje, na primer, mogu da kontrolišu ili utiču na jedan ili više aspekata ekspresije gena (npr. ćelijski tip). -specifična ekspresija, inducibilna ekspresija itd.). Radi jasnoće, primećujemo da, kako se koristi u ovom pronalasku, termin "gen" se generalno odnosi na deo nukleinske kiseline koji kodira polipeptid ili njegov fragment; termin može opciono da obuhvata regulatorne sekvence, kao što će biti jasno iz konteksta onima koji su obično verzirani u ovu oblast tehnike. Ova definicija nema za cilj da isključi primenu termina "gen" na ekspresione jedinice koje ne kodiraju proteine, već radije da pojasni da se, u većini slučajeva, termin kako se koristi u ovom dokumentu odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid.

[0114] Heterologni: kako se ovde koristi, odnosi se na agens ili entitet iz drugog izvora. Na primer, kada se koristi u vezi sa polipeptidom, genom ili genskim proizvodom prisutnim u određenoj ćeliji ili organizmu, termin pojašnjava da je relevantni polipeptid, gen ili genski proizvod: 1) napravljen od strane čoveka; 2) unesen je u ćeliju ili organizam (ili njegovog prekursora) rukom čoveka (npr. genskim inženjeringom); i/ili 3) nije prirodno proizveden ili nije prisutan u relevantnoj ćeliji ili organizmu (npr. relevantni tip ćelije ili tip organizma). „Heterologni“ takođe uključuje polipeptid, gen ili genski proizvod koji je normalno prisutan u određenoj nativnoj ćeliji ili organizmu, ali je izmenjen ili modifikovan, na primer, mutacijom ili stavljanjem pod kontrolu neprirodno povezanih i, u nekim izvođenjima, neendogenih regulatornih elemenata (npr. promotor).

[0115] Ćelija domaćin: kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju u koju je uvedena nukleinska kiselina ili protein. Stručnjaci će nakon čitanja ovog pronalaska razumeti da se takvi termini ne odnose samo na određenu ćeliju, već se takođe koriste za označavanje potomaka takve ćelije. Pošto se određene modifikacije mogu javiti u narednim generacijama zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo možda nije identično roditeljskoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u okvir fraze „ćelija domaćin“. U nekim izvođenjima, ćelija domaćin je ili sadrži prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. Uopšteno, ćelija domaćin je svaka ćelija koja je pogodna za primanje i/ili proizvodnju heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira na Carstvo životinja kojim je ćelija određena. Primeri ćelija uključuju ćelije prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), ćelije bakterija (npr. sojevi Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), ćelije mikobakterija, ćelije gljivica, ćelije kvasca (npr., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomices pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr., SF-9, SF-21, ćelije insekata zaražene bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), nehumane životinjske ćelije, humane ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim izvođenjima, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, majmuna, hrčka, pacova ili miša. U nekim izvođenjima, ćelija je eukariotska i izabrana je od sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), ćelija retine, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, VI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr. BHK21), Jurkat, Daudi1 (A43), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, ćelija tumora i ćelijska linija izvedena iz prethodnog ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćeliju retine koja eksprimira virusni gen (npr. PFR.C6® ćelija). U nekim izvođenjima, ćelija domaćin je ili sadrži izolovana ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija domaćin je deo tkiva. U nekim izvođenjima, ćelija domaćin je deo organizma.

[0116] Identitet: kako se ovde koristi u vezi sa poređenjem sekvenci, odnosi se na identitet koji je određen brojnim različitim algoritamima poznatim u tehnici koji se mogu koristiti za merenje identiteta nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence. U nekim izvođenjima, identiteti kao što su ovde opisani se određuju upotrebom ClustalV v. 1.83 (sporo) poravnanja upotrebom “open gap penalty” od 10.0, “open gap penalty” od 0.1 i upotrebom Gonetove matrice sličnosti (MACVECTORTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

[0117] Umesto: kako se ovde koristi, odnosi se na pozicionu supstituciju u kojoj se prva sekvenca nukleinske kiseline nalazi na poziciji druge sekvence nukleinske kiseline u hromozomu (npr. gde je druga sekvenca nukleinske kiseline prethodno bila (npr., prvobitno) smeštena u hromozomu, na primer, na endogenom lokusu druge sekvence nukleinske kiseline). Fraza "umesto" ne zahteva da se druga sekvenca nukleinske kiseline ukloni iz, npr., lokusa ili hromozoma. U nekim izvođenjima, druga sekvenca nukleinske kiseline i prva sekvenca nukleinske kiseline su uporedive jedna sa drugom u da su, na primer, prva i druga sekvenca homologne jedna drugoj, sadrže odgovarajuće elemente (npr. elemente koji kodiraju proteine, regulatorne elemente, itd.) i/ili imaju slične ili identične sekvence. U nekim izvođenjima, a prva i/ili druga sekvenca nukleinske kiseline obuhvata jedan ili više promotora, pojačivača, mesta donora za spajanje, akceptornog mesta spajanja, introna, egzona, netranslatiranog regiona (UTR); u nekim izvođenjima, prva i/ili druga sekvenca nukleinske kiseline uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. U nekim izvođenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline je homolog ili varijanta (npr., mutant) druge sekvence nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline sekvenca je ortolog ili homolog druge sekvence. U nekim izvođenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, uključujući gde je prva sekvenca nukleinske kiseline ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, druga sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži sekvencu glodara (npr. sekvencu miša ili pacova). U nekim izvođenjima, uključujući gde je prva sekvenca nukleinske kiseline ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, druga sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži humanu sekvencu. U nekim izvođenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline je varijanta ili mutant (tj. sekvenca koja sadrži jednu ili više razlika u sekvenci, npr. supstitucije, u poređenju sa drugom sekvencom) druge sekvence. Ovako postavljena sekvenca nukleinske kiseline može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne sekvence nukleinske kiseline koja se koristi za dobijanje tako postavljene sekvence (npr. promotori, pojačivači, 5'- ili 3'-netranslatirani regioni, itd.). Na primer, u različitim izvođenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline je supstitucija endogene sekvence sa heterolognom sekvencom koja rezultira proizvodnjom genskog proizvoda iz tako postavljene sekvence nukleinske kiseline (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne i ekspresiju endogena sekvenca; prva sekvenca nukleinske kiseline je endogena genomska sekvenca sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima sličnu funkciju kao polipeptid kodiran endogenom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira polipeptid varijabilnog regiona koji nije humani, u celini ili delimično, DNK fragment kodira jedan ili više polipeptida humanog varijabilnog regiona, u celini ili delimično). U različitim izvođenjima, segment gena za humani imunoglobulin ili njegov fragment je umesto endogenog nehumanog segmenta ili fragmenta gena imunoglobulina.

[0118] In vitro: kako se ovde koristi, odnosi se na događaje koji se dešavaju u veštačkoj sredini, na primer, u epruveti ili reakcionom sudu, u ćelijskoj kulturi, itd., pre nego u višećelijskom organizmu.

[0119] In vivo: kako se ovde koristi, odnosi se na događaje koji se dešavaju unutar višećelijskog organizma, kao što je čovek i/ili životinja koja nije čovek. U kontekstu sistema zasnovanih na ćelijama, termin se može koristiti za označavanje događaja koji se dešavaju unutar žive ćelije (za razliku od, na primer, in vitro sistema).

[0120] Izolovani: kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu i/ili entitet koji je (1) odvojen od najmanje nekih komponenti sa kojima je bio povezan kada je prvobitno proizveden (bilo u prirodi i/ili u eksperimentalnom okruženju), i/ili (2) dizajniran, proizveden, pripremljen i/ili proizveden ljudskom rukom. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se odvojiti od oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili više od oko 99% ostalih komponenti sa kojima su one prvobitno bile povezane. U nekim izvođenjima, izolovani agensi su razdvojeni od 10% do 100%, 15%-100%, 20%-100%, 25%-100%, 30%-100%, 35%-100%, 40%- 100%, 45%-100%, 50%-100%, 55%-100%, 60%-100%, 65%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100% , 85%-100%, 90%-100%, 95%-100%, 96%-100%, 97%-100%, 98%-100% ili 99%-100% od ostalih komponenti sa kojima su prvobitno bile povezane. U nekim izvođenjima, izolovani agensi su odvojeni od 10% do 100%, 10%-99%, 10%-98%, 10%-97%, 10%-96%, 10%-95%, 10%-90% , 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 10 %-45%, 10%-40%, 10%-35%, 10%-30%, 10%-25%, 10%-20% ili 10%-15% ostalih komponenti sa kojima u početku su bili povezani. U nekim izvođenjima, izolovani agensi su odvojeni od 11% do 99%, 12%-98%, 13%-97%, 14%-96%, 15%-95%, 20%-90%, 25%-85%, 30%-80%, 35%-75%, 40%-70%, 45%-65%, 50%-60% ili 55%-60% ostalih komponenti sa kojima su prvobitno bile povezane. U nekim izvođenjima, izolovani agensi su oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili više od oko 99% čistoće. U nekim izvođenjima, izolovani agensi su 80%-99%, 85%-99%, 90%-99%, 95%-99%, 96%-99%, 97%-99% ili 98%-99% čisti. U nekim izvođenjima, izolovani agensi su 80%-99%, 80%-98%, 80%-97%, 80%-96%, 80%-95%, 80%-90% ili 80%-85% čisti. U nekim izvođenjima, izolovani agensi su 85%-98%, 90%-97% ili 95%-96% čisti. U nekim izvođenjima, supstanca je "čista" ako je suštinski bez drugih komponenti. U nekim izvođenjima, kao što će razumeti stručnjaci u ovoj oblasti, supstanca se i dalje može smatrati "izolovanom" ili čak "čistom", nakon što je kombinovana sa određenim drugim komponentama kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenasa (npr. pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim izvođenjima, procenat izolacije ili čistoće supstance se izračunava bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenasa. Da damo samo jedan primer, u nekim izvođenjima, biološki polimer kao što je polipeptid ili polinukleotid koji se javlja u prirodi smatra se „izolovanim“ kada: a) na osnovu svog porekla ili izvora iz kog se dobija nije povezan sa nekim ili svim od komponenti koje ga prate u njegovom izvornom stanju u prirodi; b) da je suštinski bez drugih polipeptida ili nukleinskih kiselina iste vrste iz vrste koja ga proizvodi u prirodi; ili c) je izražen ili je na drugi način u vezi sa komponentama iz ćelije ili drugog ekspresionog sistema koji nije od vrste koja ga proizvodi u prirodi. Tako, na primer, u nekim izvođenjima, polipeptid koji je hemijski sintetisan, ili se sintetiše u ćelijskom sistemu različitom od onog koji ga proizvodi u prirodi, smatra se "izolovanim" polipeptidom. Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, polipeptid koji je podvrgnut jednoj ili više tehnika prečišćavanja može se smatrati "izolovanim" polipeptidom u meri u kojoj je odvojen od drugih komponenti: a) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojima je bio povezan kada je prvobitno proizveden.

[0121] Lokus ili lokusi: kao što se ovde koriste, odnosi se na poziciju(e) gena (ili značajne sekvence), sekvence DNK, sekvence koja kodira polipeptid, ili poziciju na hromozomu genoma organizma. Na primer, "imunoglobulinski lokus" može se odnositi na poziciju segmenta gena imunoglobulina (npr., V, D, J ili C), sekvencu DNK segmenta gena imunoglobulina, kodirajuću sekvencu segmenta gena imunoglobulina, ili poziciju segmenta gena imunoglobulina na hromozomu genoma organizma za koji je identifikovano gde se nalazi takva sekvenca. "imunoglobulinski lokus" može da sadrži regulatorni element segmenta gena imunoglobulina, uključujući, ali nije ograničeno na, pojačivač, promotor, 5’ i/ili 3’ regulatornu sekvencu ili region, ili njihova kombinacija. "imunoglobulinski lokus" može da sadrži intergensku DNK, npr., DNK koja se normalno nalazi ili se pojavljuje između segmenata gena u lokusu divljeg tipa. Osobe koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike će razumeti da hromozomi mogu, u nekim izvođenjima, sadržati stotine ili čak hiljade gena i pokazuju fizičku ko-lokalizaciju sličnih genetičkih lokusa kada se uporede između različitih vrsta. Takvi genetički lokusi se mogu opisati da imaju zajedničku sinteniju.

[0122] Pojavljuje se u prirodi: kako se ovde koristi u vezi sa biološkim elementom (npr. sekvenca nukleinske kiseline) znači da se biološki element može naći u određenom kontekstu i/ili lokaciji, bez modifikovanja (npr. genski inženjering), u ćeliji ili organizmu (npr. životinja). Drugim rečima, sekvenca koja se prirodno pojavljuje u određenom kontekstu i/ili lokaciji nije u navedenom kontekstu i/ili lokaciji kao rezultat modifikovanja (npr. genski inženjering). Na primer, sekvenca koja se prirodno pojavljuje pored segmenta humanog Jκ1 gena u endogenom lokusu lakog lanca humanog imunoglobulina kapa je sekvenca koja se može naći pored segmenta humanog Jκ1 gena u endogenom lokusu lakog lanca humanog imunoglobulina kapa, u odustvu genetskog inženjeringa, kod čoveka. U nekim izvođenjima, sekvenca se može dobiti, izvesti i/ili izolovati odakle se prirodno pojavljuje u ćeliji ili organizmu. U nekim izvođenjima, ćelija ili organizam nije direktan izvor sekvence koja se prirodno pojavljuje u ćeliji ili organizmu. Na primer, odgovarajuća sekvenca u ćeliji ili organizmu može biti identifikovana i zatim proizvedena ili replicirana mehanizmima poznatim u oblasti tehnike.

[0123] Životinja koja nije čovek: kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji organizam kičmenjaka koji nije čovek. U nekim slučajevima, životinja koja nije čovek je ciklostom, koštana riba, hrskavična riba (na primer, ajkula ili raža), vodozemac, gmizavac, sisar i ptica. U nekim izvođenjima, životinja koja nije čovek je sisar. U nekim slučajevima, sisar koji nije čovek je primat, koza, ovca, svinja, pas, krava ili miš. U nekim slučajevima, životinja koja nije čovek je miš. Životinja koja nije čovek koja je korišćena u postupku predmetnog pronalaska je miš.

[0124] Nukleinska kiselina: kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja je ili može biti ugrađena u oligonukleotidni lanac. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je jedinjenje i/ili supstanca koja je ili može biti inkorporirana u oligonukleotidni lanac preko fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" se odnosi na pojedinačne ostatke nukleinske kiseline (npr., nukleotide i/ili nukleozide); u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" se odnosi na oligonukleotidni lanac koji sadrži pojedinačne ostatke nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je ili sadrži RNK; u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je ili sadrži DNK. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili se sastoji od jednog ili više ostataka prirodnih nukleinskih kiselina. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je, sadrži ili se sastoji od jednog ili više analoga nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, analog nukleinske kiseline se razlikuje od "nukleinske kiseline" po tome što ne koristi fosfodiestarsku kičmu. Na primer, u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili se sastoji od jedne ili više "peptidnih nukleinskih kiselina", koje su poznate u tehnici i imaju peptidne veze umesto fosfodiestarskih veza u okosnici. Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" ima jednu ili više fosforotioatnih i/ili 5'-N-fosforamiditnih veza umesto fosfodiestarskih veza. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili se sastoji od jednog ili više prirodnih nukleozida (npr. adenozin, timidin, gvanozin, citidin, uridin, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksiguanozin i deoksicitidin). U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je, sadrži ili se sastoji od jednog ili više analoga nukleozida (npr., 2-aminoadenozin, 2-tiotimidin, inozin, pirolo-pirimidin, 3-metil adenozin, 5-metilcitidin, C-5 propinil-citidin, C-5 propiniluridin, 2-aminoadenozin, C5-bromuridin, C5-fluoruridin, C5-joduridin, C5-propiniluridin, C5-propinil-citidin, C5-metilcitidin, 2-aminoadenozin, 7-deazanozin , 7-deazagvanozin, 8-oksoadenozin, 8-oksogvanozin, O(6)-metilgvanin, 2-tiocitidin, metilovane baze, interkalirane baze i njihove kombinacije). U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" sadrži jedan ili više modifikovanih šećera (npr. 2'-fluororiboza, riboza, 2'-deoksiriboza, arabinoza i heksoza) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalni genski proizvod kao što je RNK ili polipeptid. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" uključuje jedan ili više introna. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" uključuje jedan ili više egzona. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" se priprema jednim ili više izolacija iz prirodnog izvora, enzimskom sintezom polimerizacijom zasnovanom na komplementarnoj matrici (in vivo ili in vitro), reprodukcijom u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu, i hemijska sinteza. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je najmanje, npr., ali nije ograničena na, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 20, 20, 52 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1.500, 2000. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je jednolančana; u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" je dvolančana. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jedan element koji kodira, ili je komplement sekvence koja kodira, polipeptid. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina" ima enzimsku aktivnost.

[0125] Operativno povezan: kako se ovde koristi, odnosi se na jukstapoziciju u kojoj su opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na njihov predviđeni način. Kontrolna sekvenca "operativno povezana" za kodirajuću sekvencu je vezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. "Operativno povezane" sekvence obuhvataju i sekvence kontrole ekspresije koje su u blizini gena od interesa i sekvence kontrole ekspresije koje deluju trans ili na daljinu da kontrolišu gen od interesa (ili sekvencu od interesa). Termin "sekvenca za kontrolu ekspresije" uključuje polinukleotidne sekvence, koje su neophodne da utiču na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. "Sekvence kontrole ekspresije" obuhvataju: odgovarajuće sekvence inicijacije, terminacije, promotora i pojačivača transkripcije; efikasne signale za obradu RNK kao što su signali spajanja i poliadenilacije; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku iRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost prevođenja (tj. Kozak-ova konsenzusna sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost polipeptida; i po potrebi, sekvence koje pojačavaju sekreciju polipeptida. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina. Na primer, kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno obuhvataju promotor, mesto za vezivanje ribozoma i sekvencu terminacije transkripcije, dok kod eukariota tipično takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za terminaciju transkripcije. Termin "kontrolne sekvence" treba da uključi komponente čije je prisustvo bitno za ekspresiju i obradu, a takođe može uključiti i dodatne komponente čije prisustvo ima prednost, na primer, sekvence vodiča i sekvence partnera fuzije.

[0126] Fiziološki uslovi: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na razumevanje iz oblasti tehnike, što znači referentne uslove pod kojima ćelije ili organizmi žive i/ili se reprodukuju. U nekim izvođenjima, termin uključuje uslove spoljašnjeg ili unutrašnjeg miljea koji se mogu javiti u prirodi za organizam ili ćelijski sistem. U nekim izvođenjima, fiziološka stanja su ona stanja prisutna u telu čoveka ili životinje koja nije humana, posebno ona stanja prisutna na i/ili unutar operativnog mesta. Fiziološki uslovi uobičajeno uključuju, na primer, temperaturni opseg od 20-40°C, atmosferski pritisak od 1, pH od 6-8, koncentraciju glukoze od 1-20 mM, koncentraciju kiseonika na atmosferskim nivoima i gravitaciju kakva se sreće na zemlji. U nekim izvođenjima, uslovima u laboratoriji se manipuliše i/ili održava u fiziološkim uslovima. U nekim izvođenjima, fiziološka stanja se susreću u organizmu.

[0127] Polipeptid: kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koji polimerni lanac aminokiselina. U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se javlja u prirodi. U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se ne javlja u prirodi. U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži delove koji se javljaju u prirodi odvojeno jedan od drugog (tj. od dva ili više različitih organizama, na primer, humanih i nehumanih delova). U nekim izvođenjima, polipeptid ima sekvencu aminokiselina koja je konstruisana tako da je dizajnirana i/ili proizvedena delovanjem ruke čoveka. U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom koja se ne javlja u prirodi (npr. sekvenca koja je modifikovana tako da je dizajnirana i/ili proizvedena delovanjem ruke čoveka da kodira pomenuti polipeptid).

[0128] Rekombinantni: kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji su dizajnirani, modifikovani, pripremljeni, eksprimirani, stvoreni ili izolovani rekombinantnim sredstvima, kao što su polipeptidi eksprimirani korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, polipeptide izolovane iz rekombinantnog, kombinatorna biblioteka humanih polipeptida (Hoog-enboom, H. R., 1997, TIB Tech.15:62-70; Azzazi, H. i V.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem.35:425-45; Gavilondo, J.V 20202R i J.V., BioTechniques 29:128-45; Hoogenboom H. i P. Chames, 2000, Immunol. Today 21:371-8), antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja su genski modifikovana da uključuju gene humanog imunoglobulina (videti npr., Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl. Acids Res.20:6287-95; Kellermann, S-A. i L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol.13:593-7; Little, M. et al., 2000, Immunol. Today 21:364-70; Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol.190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech.32 (4): 356-63; Macdo nald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Akad. Sci. U.S.A.111(14):5147-52; Murphy, A.J. et al., 2014, Proc. Natl. Akad. Sci. U.S.A.111(14):5153-8) ili polipeptida pripremljenih, eksprimiranih, kreiranih ili izolovanih na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje odabranih elemenata sekvence jedan sa drugim. U nekim izvođenjima, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence se nalazi u prirodi. U nekim izvođenjima, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence je dizajnirano in silico. U nekim izvođenjima, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence su rezultat mutageneze (npr. in vivo ili in vitro) poznatog elementa sekvence, npr. iz prirodnog ili sintetičkog (npr., veštačkog) izvora. Na primer, u nekim izvođenjima, rekombinantni polipeptid se sastoji od sekvenci pronađenih u genomu izvornog organizma od interesa (npr., čoveka, miša, itd.). U nekim izvođenjima, rekombinantni polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja je rezultat mutageneze (npr. in vitro ili in vivo, na primer, kod životinje koja nije čovek), tako da su aminokiselinske sekvence rekombinantnih polipeptida sekvence koje, iako potiču od polipeptidnih sekvenci ili su u vezi sa njima, možda ne postoje prirodno u genomu nehumane životinje in vivo.

[0129] Referenca: kako se ovde koristi, odnosi se na standardni ili kontrolni agens, životinju, kohortu, pojedinca, populaciju, uzorak, sekvencu ili vrednost u odnosu na koju se upoređuje agens, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa. U nekim izvođenjima, referentni agens, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost se testira i/ili određuje u suštini istovremeno sa testiranjem ili određivanjem agensa, životinje, kohorte, pojedinca, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa. U nekim izvođenjima, referentni agens, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost je istorijska referenca, opciono izvedena u opipljivom medijumu. U nekim izvođenjima, referenca se može odnositi na kontrolu. „Referenca“ takođe uključuje „referentnu životinju“. "Referentna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija kao što je ovde opisano ili bez modifikacije (tj. životinja divljeg tipa). Obično, kao što bi razumeli stručnjaci u ovoj oblasti, referentni agens, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost se određuje ili karakteriše pod uslovima koji su uporedivi sa onima koji se koriste za određivanje ili karakterizaciju agensa, životinje (npr. sisar), kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa.

[0130] Zamena: kako se ovde koristi, odnosi se na proces kroz koji se „zamenjena“ sekvenca nukleinske kiseline (npr. gen) pronađena u lokusu domaćina (npr. u genomu) uklanja sa tog lokusa, drugačija, na njenom mestu se nalazi „zamena” nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline i zamenjene sekvence nukleinske kiseline su uporedive jedna sa drugom po tome što su, na primer, homologne jedna drugoj, sadrže odgovarajuće elemente (npr. elemente koji kodiraju proteine, regulatorne elemente itd.), i/ili imaju slične ili identične sekvence. U nekim izvođenjima, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline uključuje jedan ili više promotora, pojačivača, mesta donora za spajanje, akceptorskog mesta spajanja, introna, egzona, netranslatiranog regiona (UTR); u nekim izvođenjima, zamena sekvence nukleinske kiseline uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. U nekim izvođenjima, zamena sekvence nukleinske kiseline je homolog ili varijanta (npr., mutant) sekvence zamenjene nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, zamena sekvence nukleinske kiseline je ortolog ili homolog zamenjene sekvence. U nekim izvođenjima, zamena sekvence nukleinske kiseline je ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, uključujući gde je zamena sekvenca nukleinske kiseline ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži sekvencu miša. U nekim izvođenjima, uključujući gde je zamena sekvence nukleinske kiseline ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži humanu sekvencu. U nekim izvođenjima, zamena sekvence nukleinske kiseline je varijanta ili mutant (tj., sekvenca koja sadrži jednu ili više razlika u sekvenci, npr. supstitucije, u poređenju sa zamenjenom sekvencom) zamenjene sekvence. Ovako postavljena sekvenca nukleinske kiseline može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne sekvence nukleinske kiseline koja se koristi za dobijanje tako postavljene sekvence (npr. promotori, pojačivači, 5'- ili 3'-netranslatirani regioni, itd.). Na primer, u različitim izvođenjima, zamena je supstitucija endogene sekvence sa heterolognom sekvencom koja rezultira proizvodnjom genskog proizvoda iz tako postavljene sekvence nukleinske kiseline (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne i ekspresiju endogene sekvence; zamena je endogene genomske sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima sličnu funkciju kao polipeptid kodiran endogenom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira polipeptid nehumanog varijabilnog regiona, u celini ili u deo, a DNK fragment kodira jedan ili više humanih polipeptida varijabilnog regiona, u celini ili delimično). U različitim izvođenjima, endogeni segment gena nehumanog imunoglobulina ili njegov fragment je zamenjen segmentom gena humanog imunoglobulina ili njegovim fragmentom.

[0131] U suštini: kako se ovde koristi, odnosi se na kvalitativni uslov ispoljavanja ukupnog ili skoro potpunog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Osoba koja je uobičajeno verzirana u biološku oblast tehnike razumeće da biološki i hemijski fenomeni retko, ako ikada, idu do kraja i/ili nastavljaju do potpunosti ili postižu ili izbegavaju apsolutni rezultat. Termin "suštinski" se stoga ovde koristi da obuhvati potencijalni nedostatak kompletnosti svojstven mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.

[0132] Suštinska sličnost: kako se ovde koristi, odnosi se na poređenje između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što će proceniti stručnjaci sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti tehike, dve sekvence se generalno smatraju "suštinski sličnim" ako sadrže slične ostatke (npr. aminokiseline ili nukleotide) na odgovarajućim pozicijama. Kao što se razume u tehnici, dok slični ostaci mogu biti identični ostaci (videti takođe Suštinski Identitet, dole), slični ostaci mogu takođe biti neidentični ostaci sa prikladno uporedivim strukturnim i/ili funkcionalnim karakteristikama. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima u ovoj oblasti, određene aminokiseline se tipično klasifikuju kao "hidrofobne" ili "hidrofilne" aminokiseline, i/ili kao da imaju "polarne" ili "nepolarne" bočne lance. Zamena (supstitucija) jedne aminokiseline drugom istog tipa se često može smatrati "konzervativnom" zamenom. Tipične kategorizacije aminokiselina su sažete u tabeli ispod.

Alanin Ala A Nepolarna Neutralna 1.8 Arginin Arg R Polarna Pozitivna -4.5 Asparagin Asn N Polarna Neutralna -3.5 Asparaginska Asp D Polarna Negativna -3.5 kiselina

Cistein Cys C Nepolarna Neutralna 2.5 Glutaminska Glu E Polarna Negativna -3.5 kiselina

Glutamin Gln Q Polarna Neutralna -3.5 Glicin Gly G Nepolarna Neutralna -0.4 Histidin His H Polarna Pozitivna -3.2 Izoleucin Ile I Nepolarna Neutralna 4.5 Leucin Leu L Nepolarna Neutralna 3.8 Lizin Lys K Polarna Pozitivna -3.9 Metionin Met M Nepolarna Neutralna 1.9 Fenilalanin Phe F Nepolarna Neutralna 2.8 Prolin Pro P Nepolarna Neutralna -1.6 Serin Ser S Polarna Neutralna -0.8 Treonin Thr T Polarna Neutralna -0.7 Triptofan Trp W Nepolarna Neutralna -0.9 Tirozin Tyr Y Polarna Neutralna -1.3 Valin Val V Nepolarna Neutralna 4.2

Dvoznačne aminokiseline 3-Slova 1-Slovo Asparagin ili aparaginska kiselina Asx B Glutamin ili glutaminska kiselina Glx Z Leucin ili Izoleucin Xle J Neodređena ili nepoznata Xaa X

aminokiselina

[0133] Kao što je dobro poznato u ovoj oblasti tehnike, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina mogu se uporediti korišćenjem bilo kog od niza algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, gappedBLAST i PSI-BLAST za sekvence aminokiselina. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Primeri takvih programa su opisani u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol.266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol.132, Humana Press, 1998. Pored identifikacije sličnih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju indikaciju stepena sličnosti. U nekim izvođenjima, smatra se da su dve sekvence suštinski slične ako su bar, npr., ali bez ograničenja na, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka su slični (npr. identični ili uključuju konzervativnu supstituciju) u relevantnom delu ostataka. U nekim izvođenjima, relevantni deo je kompletan niz (npr. sekvenca gena, segment gena, sekvenca koja kodira domen, polipeptid ili domen). U nekim izvođenjima, relevantni deo je najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili više ostataka. U nekim izvođenjima, relevantni deo je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka. U nekim izvođenjima, relevantni deo obuhvata neprekidne ostatke duž kompletne sekvence. U nekim izvođenjima, relevantni deo obuhvata diskontinualne ostatke duž kompletne sekvence, na primer, nekontinualne ostatke spojene savijenom konformacijom polipeptida ili njegovog dela.

[0134] Suštinski identitet: kako se ovde koristi, odnosi se na poređenje između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što će stručnjaci sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti razumeti, dve sekvence se generalno smatraju "u suštini identičnim" ako sadrže identične ostatke (npr. aminokiseline ili nukleotide) na odgovarajućim pozicijama. Kao što je dobro poznato u ovoj struci, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina mogu se uporediti korišćenjem bilo kog od niza algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa razmakom i PSI-BLAST za sekvence aminokiselina. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol.266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998. Pored identifikacije identičnih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju indikaciju stepena identiteta. U nekim izvođenjima, smatra se da su dve sekvence suštinski identične ako najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka je identično na relevantnom delu ostataka. U nekim izvođenjima, relevantni deo ostataka je potpuna sekvenca. U nekim izvođenjima, relevantan deo ostataka je, npr., ali nije ograničen na, najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.

[0135] Ciljni konstrukt ili vektor ciljanja: kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidni molekul koji sadrži ciljani region. Ciljni region obuhvata sekvencu koja je identična ili suštinski identična sekvenci u ciljnoj ćeliji, tkivu ili životinji i obezbeđuje integraciju ciljanog konstrukta u poziciju unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje putem homologne rekombinacije. Ciljni regioni koji ciljaju korišćenjem sajtova za prepoznavanje specifičnih mesta prepoznavanja rekombinaza (npr. loxP ili Frt mesta) su takođe uključeni i opisani ovde. U nekim izvođenjima, konstrukt za ciljanje kako je ovde opisan dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili gen od posebnog interesa, selektivni marker, kontrolne i/ili regulatorne sekvence i druge sekvence nukleinske kiseline koje omogućavaju rekombinaciju posredovanu egzogenim dodavanjem proteina koji pomažu u ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. U nekim izvođenjima, konstrukt za ciljanje kako je ovde opisan dalje sadrži gen od interesa u celini ili delimično, pri čemu je gen od interesa heterologni gen koji kodira polipeptid, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom. U nekim izvođenjima, konstrukt za ciljanje kako je ovde opisan dalje sadrži humanizovani gen od interesa, u celini ili delimično, pri čemu humanizovani gen od interesa kodira polipeptid, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao polipeptid kodiran endogena sekvenca. U nekim izvođenjima, konstrukt za ciljanje (ili vektor za ciljanje) može da sadrži sekvencu nukleinske kiseline kojom manipuliše čovek. Na primer, u nekim izvođenjima, konstrukt za ciljanje (ili vektor za ciljanje) može da se konstruiše tako da sadrži modifikovani ili rekombinantni polinukleotid koji sadrži dve ili više sekvenci koje nisu povezane zajedno u tom redosledu u prirodi, ali njima se manipuliše rukom čoveka da bi se direktno povezani jedan sa drugim u modifikovanom ili rekombinantnom polinukleotidu.

[0136] Transgen ili transgeni konstrukt: kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline (kodiraju, na primer, polipeptid od interesa, u celini ili delimično) koja je uvedena u ćeliju rukom čoveka, kao što su ovde opisani postupci. Transgen može biti delimično ili potpuno heterologan, tj. stran, genetički modifikovanoj životinji ili ćeliji u koju je uveden. Transgen može uključiti jednu ili više transkripcionih regulatornih sekvenci i bilo koju drugu nukleinsku kiselinu, kao što su introni ili promotori, koji mogu biti neophodni za ekspresiju odabrane sekvence nukleinske kiseline.

[0137] Genetički modifikovana nehumana životinja ili nehumana životinja modifikovana genetičkim inženjeringom: ovde se koriste naizmenično i odnose se na bilo koju neprirodnu životinju koja nije humana životinja u kojoj jedna ili više ćelija nehumane životinje sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i/ili gen koji kodira polipeptid od interesa, u celini ili delimično. Na primer, u nekim izvođenjima, "genetički modifikovana nehumana životinja" ili "genetički modifikovana nehumana životinja" odnosi se na nehumanu životinju koja sadrži transgen ili transgenski konstrukt kako je ovde opisano. U nekim izvođenjima, heterologna nukleinska kiselina i/ili gen se uvode u ćeliju, direktno ili indirektno uvođenjem u prekursorsku ćeliju, putem namerne genetske manipulacije, kao što je mikroinjekcijom ili infekcijom rekombinantnim virusom. Termin genetička manipulacija ne uključuje klasične tehnike uzgoja, već je usmeren na uvođenje rekombinantnog(ih) molekula(a) DNK. Ovaj molekul može biti integrisan unutar hromozoma, ili može biti ekstrahromozomska replicirajuća DNK. Izrazi „genetički modifikovana nehumana životinja“ ili „genetički modifikovana nehumana životinja“ odnose se na životinje koje su heterozigotne ili homozigotne za heterolognu nukleinsku kiselinu i/ili gen, i/ili životinje koje imaju jednu ili više kopija heterologna nukleinske kiseline i/ili gena. Genetički modifikovana nehumana životinja koja je korišćena u obezbeđenom postupku je miš.

[0138] Vektor: kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. U nekom aspektu, vektori su sposobni za ekstrahromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su vezani u ćeliji domaćinu kao što je eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori sposobni da usmeravaju ekspresiju operativno povezanih gena se ovde nazivaju "ekspresioni vektori".

[0139] Divlji tip: kako se ovde koristi, odnosi se na entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kakva se nalazi u prirodi u "normalnom" (u suprotnosti sa mutantnim, bolesnim, izmenjenim, itd.) stanju ili kontekstu.

Osobe koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike će razumeti da geni i polipeptidi divljeg tipa često postoje i nalaze se u više različitih oblika (npr. alelima).

DETALJAN OPIS

[0140] Postupak za proizvodnju antitela u genetički modifikovanom mišu je obezbeđen, postupak sadrži korake:

(a) imunizovanja genetički modifikovanog miša antigenom od interesa

pri čemu genetički modifikovani miš ima germinativni genom koji se sastoji od:

prvog modifikovanog endogenog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena,

(ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

pri čemu su jedan ili više segmenata humanog Vλ gena iz (i) i jedan ili više segmenata humanog Jλ gena iz (ii) operativno vezani za jedan mišji Cλ gen iz (iii);

pri čemu jedan mišji Cλ gen (iii) je umesto mišjeg Ck gena na prvom modifikovanom enogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina;

pri čemu jednan ili više humanih Vλ genskih segmenata pod (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata pod (ii) su umesto jednog ili više endogenih mišjih Vκ genskih segmenata i jednog ili više endogenih mišjih Jκ genskih segmenata;

pri čemu genetički modifikovanom mišu nedostaje mišji Cκ gen na prvom modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina.

(b) održavanja genetički modifikovanog miša pod uslovima dovoljnim da genetički modifikovani miš proizvede imunski odgovor na antigen od interesa; i

(c) regenerisanja iz generički modifikovanog miša:

(i) antitelo koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži humani λ varijabilni domen i mišji λ konstantni domen,

(ii) nukleotid koji kodira varijabilni domen humanog lakog lanca ili varijabilni domen humanog teškog lanca, laki lanac, ili težak lanac antitela koji se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo koje vezuje antigen od interesa sadrži laki lanac koji sadrži humani λ varijabilni domen i mišji λ konstantni domen, ili

(iii) ćelija koja eksprimuje antitelo koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži humani λ varijabilni domen i mišji λ konstantni domen.

Ovaj predmetni prikaz takođe opisuje, između ostalog, modifikovane miševe koji imaju heterologni genetički materijal koji kodira humane Vλ domene, koji heterologni genetički materijal sadrži sekvence humanih Vλ i Jλ gena (tj. segmente gena) i druge humane sekvence koje obezbeđuju pravilno preuređenje (npr. rekombinaciju). signalna sekvenca (RSS)) i ekspresija antitela koja imaju Igλ lake lance koji uključuju humani deo i deo koji nije humani, ili antitela koja imaju Igλ lake lance koji su u potpunosti humani. Na primer, u različitim izvođenjima, kada je segment humanog gena prisutan u genomu konstruisanog miša, odgovarajuća sekvenca(e) signala rekombinacije takođe može biti prisutna (npr. Vλ RSS sa Vλ segmentom gena, Jλ RSS sa Jλ genetičkim segmentom, Vκ RSS sa Vκ genetičkim segmentom, Jκ RSS sa Jκ genetičkim segmentom, itd.). Takođe su opisani modifikovani miševi koji sadrže heterologni genetički materijal koji je umetnut na takav način da se antitela koja sadrže lake lance koji imaju humani Vλ domen i mišji Cλ domen eksprimiraju u repertoaru antitela miša. Dalje, opisani su modifikovani miševi koji sadrže heterologni genetički materijal koji je umetnut na takav način da se antitela koja sadrže lake lance koji imaju humani Vλ domen i mišji Cλ domen ekspresuju iz modifikovanih Igk lokusa lakog lanca koji uključuju humane i nehumane sekvence Igl gena (npr. segmenti gena) i, u nekim slučajevima, sekvence lakog lanca Igκ, u genomu germinativne linije miša.

[0141] Bez želje da budemo vezani nekom posebnom teorijom, smatra se da miševi kako su ovde opisani obezbeđuju poboljšani in vivo sistem koji koristi ekspresiju antitela koja sadrže humane Vλ domene za proizvodnju terapeutskih antitela. Takođe se smatra da miševi kako je ovde opisano, u nekim izvođenjima, obezbeđuju alternativne konstruisane oblike lokusa lakog lanca (npr. Igκ lokusa lakog lanca) koji sadrže heterologni genetički materijal za razvoj terapeutika zasnovanih na humanim antitelima (npr., humana monoklonska antitela, multispecifični vezivni agensi, scFvs, fuzioni polipeptidi, itd.) na ciljeve bolesti koji su povezani sa predodređenim odgovorima antitela (npr. odgovori antitela koje karakteriše ogromni udeo ili κ ili λ lakih lanaca). Dakle, korišćeni miševi posebno su korisni za razvoj humanih antitela i molekula zasnovanih na humanim antitelima (npr. multispecifični vezivni agensi, scFvs, fuzioni polipeptidi, itd.) protiv ciljeva povezanih sa slabom imunogenošću (npr. virusi) zbog, u deo, na iskrivljene repertoare antitela i/ili odgovore.

[0142] Predmetni prikaz opisuje, između ostalog, lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji uključuje jedan ili više segmenata humanog Vλ gena, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i mišji Cλ gen. Takav lokus se naziva "lambda u kapa" lokus ili "LiK".

[0143] Posebno, predmetni prikaz opisuje proizvodnju miša koji ima germinativni (genom zametne linije) koji sadrži modifikovani lokus Igκ lakog lanca koji je, u nekim izvođenjima, karakterisan uvođenjem većeg broja segmenata humanog Vλ i Jλ gena i uvođenje mišjeg Cλ gena na mesto mišjeg Cκ gena, tako da je pomenuto mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena operativno povezano sa navedenim Cλ genom miša. Kao što je ovde opisano, proizvodnja tako modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ rezultira ekspresijom antitela koja sadrže lake lance koji uključuju humani Vλ domen i mišji Cλ domen iz pomenutog modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ u genomu zametne linije miša. Genom zametne linije korišćenih miševa obuhvata lokus lakog lanca Igκuključujući sekvence humanog Igλ lakog lanca. U nekim izvođenjima, genom zametne linije korišćenih miševa sadrži (i) lokus Igκ lakog lanca uključujući sekvence lakog lanca Igλ i (ii) (a) lokus Igκ lakog lanca uključujući sekvence lakog lanca Igκ ili (ii) (b) lokus Igκ lakog lanca uključujući sekvence humanog Igκ lakog lanca. Genom zametne linije korišćenih miševa, u nekim izvođenjima, sadrži lokus Igκ lakog lanca kao što je ovde opisano i dalje obuhvata (i) humanizovani IgH lokus ili (ii) humanizovani IgH lokus i funkcionalno utišano ili na drugi način pretvoreno u nefunkcionalno endogeni Igλ laki lanac lokusa. Korišćeni miševi, kao što je ovde opisano, eksprimiraju repertoare antitela koji sadrže Igλ lake lance koji uključuju humane Vλ domene.

[0144] Korišćeni miševi sadrže humane sekvence lakog lanca Igλ unutar lokusa Igκ lakog lanca. Miševi kako je ovde opisano sadrže sekvence Igλ lakog lanca čoveka i miša unutar lokusa lakog lanca Igκ. U nekim izvođenjima, nehumane životinje kao što su ovde opisane sadrže sekvence lakog lanca Igλ i humanog Igκ unutar lokusa Igκ lakog lanca.

[0145] U nekim izvođenjima, sekvence lakog lanca Igκ i/ili Igλ uključuju intergensku DNK koja je humanog i/ili mišjeg porekla. U nekim izvođenjima, sekvence lakog lanca Igκ i/ili Igλ uključuju intergensku DNK koja je modifikovana i zasnovana na izvornoj sekvenci koja je humanog ili mišjeg porekla. U nekim izvođenjima, pomenuta intergenska DNK je istog lokusa imunoglobulina u kome je intergenska DNK tako postavljena, umetnuta, pozicionirana ili modifikovana (npr., Igκ intergenska DNK u lokusu Igκ lakog lanca). U nekim izvođenjima, pomenuta intergenska DNK je različitog lokusa imunoglobulina u kome je intergenska DNK tako postavljena, umetnuta, pozicionirana ili modifikovana (npr. Igλ intergenska DNK u lokusu Igκ lakog lanca). U nekim određenim izvođenjima, miševi opisani ovde sadrže modifikovani lokus lakog lanca Igκ koji sadrži intergensku DNK koja uključuje sekvencu(e) lakog lanca Igκ, sekvencu(e) Igλ lakog lanca i/ili njihove kombinacije.

[0146] U različitim izvođenjima, lokus teškog lanca humanizovanog imunoglobulina sadrži najmanje jedan humani VH, najmanje jedan humani DHi najmanje jedan humani JHsegment gena koji je operativno vezan za konstantni region teškog lanca imunoglobulina (npr. endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina miša koji uključuje jedan ili više gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina kao što su, na primer, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA, itd.), npr., veći broj humanih segmenata gena VH, DHi JHkoji su operativno povezani sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina koji nije humani. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi imaju genom zametne linije koji uključuje jedan ili više lokusa imunoglobulina prikazanih na Nacrtima. Ovako modifikovani miševi obezbeđuju izvor humanih antitela i fragmenata humanih antitela, i obezbeđuju poboljšani in vivo sistem pogodan za iskorišćavanje humanih Vλ sekvenci za proizvodnju humanih terapeutskih antitela.

[0147] Kao što je opisano u odeljku Primeri ispod, korišćeni su miševi koji imaju genom koji sadrži najmanje jedan od svakog humanog teškog (tj. VH, DHi JH) i lakog lanca (npr. Vλ i Jλ na endogenom kapa lokusu) segmenti gena varijabilnog regiona, npr., mnoštvo segmenata gena varijabilnog regiona kod ljudi teškog (tj. VH, DHi JH) i lakog lanca (npr. Vλ i Jλ na endogenom kapa lokusu) varijabilnog regiona, na mestu gena za varijabilni region miša segmente na endogenim lokusima imunoglobulina, i uključuju humanu nekodirajuću intergensku DNK između segmenata gena humanog varijabilnog regiona. Takva intergenska DNK uključuje, na primer, promotere, vodiče sekvence i rekombinacione signalne sekvence koje omogućavaju pravilnu rekombinaciju i ekspresiju segmenata humanog gena u kontekstu varijabilnih domena antitela. Stručnjaci razumeju da mišji imunoglobulinski lokusi takođe sadrže takvu nekodirajuću intergensku DNK. Nakon čitanja ovog prikaza, osobe iz struke će razumeti da se druga humana ili nehumana intergenska DNK može koristiti u konstruisanju takvih lokusa što rezultira istom ekspresijom humanih varijabilnih domena u kontekstu antitela kod miša. Takvi slični lokusi treba da sadrže samo humane kodirajuće sekvence (tj. egzone) željenih segmenata humanog gena da bi se postigla ekspresija antitela koja sadrže humane varijabilne domene.

[0148] Različiti aspekti određenih izvođenja su detaljno opisani u sledećim odeljcima, od kojih se svaki može primeniti na bilo koji aspekt ili izvođenje kako je ovde opisano. Upotreba sekcija nije ograničena.

Repertoari antitela kod miševa

[0149] Imunoglobulini (takođe zvani antitela) su veliki (~150 kD), glikoproteini u obliku slova Y koje proizvode B ćelije imunog sistema domaćina da neutrališu patogene (npr. viruse, bakterije, itd.). Svaki imunoglobulin (Ig) se sastoji od dva identična teška lanca i dva identična laka lanca, od kojih svaki ima dve strukturne komponente: varijabilni domen i konstantni domen. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca razlikuju se po antitelima proizvedenim od strane različitih B ćelija, ali su isti za sva antitela proizvedena od jedne B ćelije ili klona B ćelija. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca svakog antitela zajedno obuhvataju region koji se vezuje za antigen (ili mesto za vezivanje antigena). Imunoglobulini mogu postojati u različitim varijantama koje se nazivaju izotipovima ili klasama na osnovu konstantnih regiona teškog lanca (ili domena) koje sadrže. Konstantni region teškog lanca je identičan u svim antitelima istog izotipa, ali se razlikuje u antitelima različitih izotipova. Tabela ispod daje prikaz devet izotipova antitela kod miša i ljudi.

[0150] Dodatni izotipovi su identifikovani kod drugih vrsta. Izotipovi daju specijalizovana biološka svojstva antitelu zbog različitih strukturnih karakteristika između različitih izotipova i nalaze se na različitim lokacijama (ćelije, tkiva, itd.) unutar životinjskog tela. U početku, B ćelije proizvode IgM i IgD sa identičnim regionima koji se vezuju za antigen. Nakon aktivacije, B ćelije prelaze na različite izotipove procesom koji se naziva zamena (prekopčavanje) klasa, koji uključuje promenu konstantnog regiona antitela koje proizvodi B ćelija, dok varijabilni regioni ostaju isti, čime se čuva antigenska specifičnost originalnog antitela. (B ćelija).

[0151] Dva odvojena lokusa (Igκ i Igλ) sadrže segmente gena koji, nakon preuređivanja, kodiraju lake lance antitela, i pokazuju i alelnu i isključivanje izotipa. Odnosi ekspresije k<+>do λ<+>B ćelija variraju među vrstama. Na primer, ljudi pokazuju odnos od oko 60:40 (κ:λ). Kod miševa i pacova primećen je odnos 95:5 (κ:λ). Zanimljivo je da je odnos κ:λ primećen kod mačaka (5:95) suprotan od miševa i pacova. Sprovedeno je nekoliko studija kako bi se razjasnili mogući razlozi iza ovih posmatranih odnosa, a kao obrazloženje su predloženi i složenost lokusa (tj. broj segmenata gena, posebno V genetičkih segmenata) i efikasnost preuređenja genetičkih segmenata. Humani Igλ lokus lakog lanca proteže se preko 1.000 kb i sadrži približno 70 Vλ genetičkih segmenata (29 do 33 funkcionalna) i sedam parova segmenata gena Jλ -Cλ (četiri do pet funkcionalnih) organizovanih u tri klastera (vidi, npr., sliku 1 od US patent br.9,006,511). Većina posmatranih Vλ regiona u ekspresiranom repertoaru antitela je kodirana segmentima gena koji se nalaze unutar najproksimalnijeg klastera (koji se naziva klaster A). Mišji Igλ lokus lakog lanca je upadljivo drugačiji od humanog lokusa i, u zavisnosti od soja, sadrži samo nekoliko Vλ i Jλ genetičkih segmenata organizovanih u dva različita klastera gena (videti, na primer, sliku 2 US patent br.9,006,511).

[0152] Razvoj terapeutskih antitela za lečenje različitih humanih bolesti u velikoj meri je bio usredsređen na stvaranje konstruisanih modifikovanih nehumanih životinjskih linija, posebno modifikovanih linija glodara, koje sadrže različite količine genetskog materijala u svojim genomima koji odgovaraju genima humanog imunoglobulina (pregledano u, npr., Bruggemann, M. et al., 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp.

63:101-8). Početni napori u stvaranju ovakvih genetički modifikovanih linija glodara bili su fokusirani na integraciju delova lokusa humanog imunoglobulina koji bi sami po sebi mogli da podrže rekombinaciju segmenata gena i proizvodnju teških i/ili lakih lanaca koji su u potpunosti bili humani, dok su endogeni imunoglobulinski lokusi inaktivirani. (videte npr., Bruggemann, M. et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.

86:67-09-13; Bruggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol.21:1323 -6; Tailor, L.D. et al., 1992, Nucl. Acids Res.20:6287-6295; Davies, N.P. et al., 1993, Biotechnol.11:911-4; Green, L.L. et al., 1994, Nat Genet.7:13-21; Lonberg, N. et al., 1994, Nature 368:856-9; Tailor, L.D. et al., 1994, Int. Immunol. 6:579-91; Vagner, S.D. et al., 1994, Eur J. Immunol. 24:2672-81; Fishvild, D.M. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51; Vagner, S.D. et al., 1996, Genomics 35:405 Mendez, MJ et al., 1997, Nat. Genet.15:146-56; Green, L.L. et al., 1998, J. Ekp. Med. 188:483-95; Xian, J. et al., 1998, Tr ansgenics 2:333-43; Little, M. et al., 2000, Immunol. Danas 21:364-70; Kellermann, S.A. i L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol. 13:593-7). Konkretno, neki napori su uključivali integraciju sekvenci lakog lanca Igλ (videti, na primer, Publikaciju patentne prijave SAD br.2002/0088016 A1, 2003/0217373 A1 i 2011/0236378 A1; U.S. patent br. I.C. et al., 1999, J. Immunol 163:6898-906; Popov, A.V et al., 1999, J. Ekp. Med.189(10):1611-19). Takvi napori su se fokusirali na slučajnu integraciju veštačkih hromozoma kvasca koji sadrže humane Vλ, Jλ i Cλ sekvence i na taj način stvaraju sojeve miša koji eksprimiraju u potpunosti humane Igλ lake lance (tj., humani Vλ i Cλ domeni). Noviji napori su koristili slične strategije koristeći konstrukte koji takođe sadrže humane Vλ, Jλ i Cλ sekvence (Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol.190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat Biotech., 32(4):356-63).

[0153] Ipak, drugi napori su uključivali specifično umetanje segmenata humanog Vλ, Jλ gena u endogene lokuse lakog lanca Ig glodara (κ i λ) tako da su pomenuti segmenti gena Vλ, Jλ operativno povezani sa genima konstantnog regiona endogenog Ig lakog lanca (videti, npr., US patenti br.9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 i 9,163,092). Kod takvih životinja, svi segmenti humanog Vλ gena iz klastera A i B i jedan ili četiri segmenta humanog Jλ gena su umetnuti u endogene lokuse Igκ i Igλ lakog lanca. Kao rezultat toga, nekoliko različitih segmenata humanog Vλ i Jλ gena pokazalo je pravilno preuređenje na oba konstruisana lokusa lakog lanca Ig glodara da bi se formirali funkcionalni laki lanci izraženi u repertoaru antitela glodara, koji laki lanci su uključivali humane Vλ domene u kontekstu bilo endogenog Cκ i Cλ regiona (videti, na primer, tabelu 7 i slike 11-13 US patenta br.9,006,511). Konkretno, miševi koji su imali modifikovane lokuse Igκ lakog lanca koji sadrže segmente humanog Vλ i Jλ gena pokazali su odnos humane lambda prema endogenom lambda (mereno odnosom IgCκ prema IgCλ) od oko 1:1 u odeljku slezine (vidi, npr., tabelu 4 US patenta br.9,006,511). Zaista, oba modifikovana soja miševa (tj. modifikovani Igκ ili modifikovani Igλ lokusi lakog lanca) pokazali su da se humani Vλ domeni mogu eksprimirati iz endogenih lokusa Ig lakog lanca kod glodara, koji obično pokazuju veliku predodređenost u ekspresiji lakog lanca (vidi gore). Ovo otkriće daje priznanje da se mogu proizvesti alternativno projektovane strukture lokusa Ig lakog lanca kako bi se maksimizirala upotreba segmenata humanog Vλ i Jλ gena u repertoarima antitela na terapeutske mete kod životinja koje nisu ljudi, posebno u poređenju sa životinjama koje nisu ljudi sadrže Igλ lokus lakog lanca kome nedostaje složenost i robustan kvalitet (npr.

miševi i pacovi) koji je normalno povezan sa lokusom lakog lanca Igλ (tj., takav lokus koji se pojavljuje u humanoj ćeliji). Takve alternativno projektovane strukture lokusa lakog lanca Ig obezbeđuju kapacitet za jedinstvene repertoare antitela koji su rezultat njihovog dizajna.

[0154] Predmetni prikaz predstavlja primer uspešne proizvodnje miša čiji genom zametne linije sadrži modifikovani endogeni Igκ lokus lakog lanca koji se sastoji od više segmenata humanog Vλ i Jλ gena u operativnoj vezi sa genom konstantnog regiona lakog lanca Igl miša, koji konstantna konstanta lakog lanca Igλ miša gen regiona je umetnut na mesto gena konstantnog regiona nehumanog Igk lakog lanca lokusa endogenog Igκ lakog lanca. Konkretno, ovo otkriće posebno pokazuje uspešnu proizvodnju (1) modifikovanog miša koji eksprimira antitela koja imaju humane varijabilne regione i mišje konstantne regione, koja antitela uključuju lake lance koji sadrže humani Vλ domen i mišji Cλ domen, i (2) modifikovani miš životinja koji eksprimira antitela koja imaju humane varijabilne regione i humane konstantne regione, koja antitela uključuju lake lance koji sadrže humane Vλ i Cλ domene. Kao što je ovde posebno objašnjeno, ekspresija takvih lakih lanaca se postiže umetanjem pomenutog množine segmenata humanog Vλ i Jλ gena u endogeni lokus lakog lanca Igκ (ili alel). U nekim izvođenjima, korišćeni su miševi modifikovani tako da je ekspresija endogenih varijabilnih regiona lakog lanca Igλ inaktivirana (npr. brisanjem gena).

[0155] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su modifikovani tako da je ekspresija endogenih varijabilnih regiona lakog lanca Igκ inaktivirana (npr. zamenom ili supstitucijom). U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su modifikovani tako da miševi eksprimiraju varijabilne regione humanog Igλ lakog lanca iz modifikovanog endogenog lokusa lakog lanca Igκ i varijabilnih regiona humanog Igκ lakog lanca iz modifikovanog endogenog lokusa lakog lanca Igκ. Dakle, predmetni prikaz, u najmanje nekim izvođenjima, obuhvata razvoj poboljšanog in vivo sistema za proizvodnju humanih antitela obezbeđivanjem modifikovanog miša koji sadrži alternativno modifikovani lokus Igk lakog lanca koji rezultira ekspresiranim repertoarom antitela koji sadrži humane Vλ domene i Cλ domene miša.

Konstrukti nukleinske kiseline

[0156] Uobičajeno, polinukleotidni molekul koji sadrži humane Igλ sekvence lakog lanca (npr., segmente humanog Vλ i Jλ gena) ili njihov deo(love) povezan(e) sa (npr., umetnute u) u vektor, poželjno DNK vektor, da bi se replicirao polinukleotid molekula u ćeliji domaćinu.

[0157] Sekvence lakog lanca humanog Igλ mogu se klonirati direktno iz poznatih sekvenci ili izvora (npr., biblioteke) ili sintetizovane iz sekvenci zametne linije dizajnirane in silico na osnovu objavljenih sekvenci dostupnih u GenBank-u ili drugim javno dostupnim bazama podataka (npr. IMGT). Alternativno, biblioteke bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) mogu obezbediti imunoglobulinske DNK sekvence od interesa (npr., humane Vλ i Jλ sekvence i njihove kombinacije). BAC biblioteke mogu sadržati veličinu umetanja od 100-150 kb i sposobne su da sadrže umetke do 300 kb (Shizuia, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Sviatek, et al.., 1993, Genes and Development 7:2071-2084; Kim, et al., 1996, Genomics 34 213-218). Na primer, opisana je humana BAC biblioteka koja sadrži prosečne veličine umetanja od 164-196 kb (Osoegava, K. et al., 2001, Genome Res.11(3):483-96; Osoegava, K. et al., 1998., Genomics 52:1-8, članak br. GE985423). Humane i mišje genomske BAC biblioteke su konstruisane i komercijalno dostupne (npr. ThermoFisher). Genomske BAC biblioteke takođe mogu poslužiti kao izvor sekvenci imunoglobulina DNK, kao i transkripcionih kontrolnih regiona.

[0158] Alternativno, sekvence DNK imunoglobulina mogu biti izolovane, klonirane i/ili prenete sa veštačkih hromozoma kvasca (YAC). Na primer, određena je nukleotidna sekvenca lokusa lakog lanca humanog Igλ (videti, npr., Dunham, I. et al., 1999, Nature 402:489-95). Dalje, IACs su ranije korišćeni za sastavljanje transgena lokusa humanog Igλ lakog lanca (videti, npr., Popov, A.V. et al., 1996, Gene 177:195-201; Popov, A.V. et al., 1999, J. Ekp. Med., 189(10):1611-19). Čitav lokus lakog lanca Igλ (humani ili mišji) može biti kloniran i sadržan u nekoliko YAC. Ako se koristi više YAC-ova i sadrže regione preklapajuće sličnosti, oni se mogu rekombinovati unutar sojeva domaćina kvasca da bi se proizveo jedan konstrukt koji predstavlja ceo lokus ili željene delove lokusa (npr. region na koji se usmerava ciljajući vektor). YAC krakovi se mogu dodatno modifikovati pomoću kaseta za selekciju sisara retrouklapanjem da bi se pomoglo u uvođenju konstrukta u embrionalne matične ćelije ili embrione upotrebom postupaka poznatih u tehnici i/ili ovde opisanim.

[0159] DNK i sekvence aminokiselina segmenata gena humanog Igλ lakog lanca za upotrebu u konstruisanju modifikovanog lokusa Igκ lakog lanca kao što je ovde opisano mogu se dobiti iz objavljenih baza podataka (npr. GenBank, IMGT, itd.) i/ili objavljenih sekvenci antitela. U nekim izvođenjima, konstrukti nukleinske kiseline koji sadrže segmente gena humanog Igλ lakog lanca sadrže J region (tj. genomsku sekvencu koja sadrži mnoštvo segmenata J gena lakog lanca), gde J region sadrži kodirajuće sekvence segmenata humanog Jλ gena sa njihovim odgovarajućim 12RSS, gde je 12RSS pozicioniran među nekodirajućom intergenskom DNK koja je obično povezana sa kodirajućim sekvencama segmenata humanog Jκ gena sa njihovim odgovarajućim 23RSS.

[0160] U nekim izvođenjima, takva sekvenca se može nazvati modifikovanim J regionom lakog lanca. U nekim određenim izvođenjima, konstrukti nukleinske kiseline koji sadrže segmente gena humanog Igλ lakog lanca sadrže humane Vλ i Jλ sekvence operativno povezane sa genom konstantnog regiona lakog lanca Igλ miša (Cλ). U nekim određenim izvođenjima, konstrukti nukleinske kiseline koji sadrže segmente gena humanog Igλ lakog lanca sadrže humane Vλ i Jλ sekvence koje su operativno povezane sa jednim ili više regiona pojačivača lakog lanca Igκ miša (ili sekvencama pojačivača). U nekim određenim izvođenjima, konstrukti nukleinske kiseline koji sadrže segmente gena humanog gλ lakog lanca sadrže humane Vλ i Jλ sekvence koje su operativno povezane sa genom Cλ regiona miša i regionima pojačivača lakog lanca Igκ miša (ili sekvencama pojačivača).

[0161] U nekim izvođenjima, konstrukti nukleinske kiseline koji sadrže humane Vλ i Jλ sekvence dalje sadrže intergensku DNK koja je humanog i/ili mišjeg porekla. U nekim izvođenjima, intergenska DNK je ili sadrži nekodirajuću sekvencu lakog lanca mišjeg Igκ, nekodirajuću sekvencu lakog lanca humanog Igκ, nekodirajuću sekvencu lakog lanca mišjeg Igλ, nekodirajuću sekvencu lakog lanca humanog Igλ ili njihove kombinacije.

[0162] Konstrukti nukleinske kiseline mogu biti pripremljeni upotrebom postupaka poznatih iz oblasti tehnike. Na primer, konstrukt nukleinske kiseline se može dobiti kao deo većeg plazmida. Ovakva priprema omogućava kloniranje i selekciju ispravnih konstrukcija na efikasan način kao što je poznato u oblasti tehnike. Konstrukti nukleinske kiseline koji sadrže sekvence lakog lanca humanog Igλ, u celini ili delom, kao što je ovde opisano, mogu biti locirani između mesta restrikcije na plazmidu tako da mogu biti izolovani iz preostalih sekvenci plazmida za ugradnju u željenu nehumanu životinju.

[0163] U oblasti tehnike su dobro poznati različiti postupci koji su korišćeni u dobijanju konstrukata nukleinskih kiselina (npr., plazmida) i transformaciji organizama domaćina Za druge pogodne ekspresione sisteme i za prokariotske i eukariotske ćelije, kao i opšte rekombinantne postupke, videti Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. and S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.

Ciljajući vektori

[0164] Vektori koji ciljaju mogu se koristiti za uvođenje konstrukta nukleinske kiseline u genomski ciljani lokus i obuhvataju konstrukt nukleinske kiseline i krakove homologije koji sa obe strane ograničavaju pomenuti konstrukt nukleinske kiseline; stručnjaci iz oblasti tehnike će biti svesni različitih opcija i karakteristika koje se generalno mogu primeniti na dizajn, strukturu, i/ili upotrebu vektora za ciljanje. Na primer, vektori za ciljanje mogu biti u linearnom obliku ili u cirkularnom obliku, i mogu biti jednolančani ili dvolančani. Vektori za ciljanje mogu biti deoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). Radi jasnije reference, krakovi homologije su ovde naznačeni sa 5’ i 3’ (tj., ushodno i nishodno) krakovi homologije. Ova terminologija se odnosi na relativnu poziciju krakova homologije u odnosu na konstrukt nukleinske kiseline unutar ciljajućih vektora.5’ i 3’ krakovi homologije odgovaraju regionima u ciljanom lokusu ili u regionu unutar drugog ciljajućeg vektora, koji su ovde naznačeni kao "5’ ciljna sekvenca" i "3’ ciljna sekvenca," redom. U nekim izvođenjima, krakovi homologije takođe mogu funkcionisati kao 5’ ili 3’ ciljne sekvence.

[0165] U nekim izvođenjima, ovde opisani postupci koriste dva, tri ili više vektora za ciljanje koji su spsobni da se rekombinuju jedan sa drugim. U različitim izvođenjima, vektori za ciljanje su veliki vektori za ciljanje (LTVEC) kao što je ovde na drugom mestu definisano. U takvim izvođenjima, prvi, drugi, i treći vektori za ciljanje svaki sadrže 5’ i 3’ homologi krak.3’ homologi krak prvog vektora za ciljanje sadrži sekvencu koja se preklapa sa 5’ homolognim krakom drugog vektora za ciljanje (tj., preklapajuće sekvence), koji omogućava za homolognu rekombinaciju između između prvog i drugog LTVECs.

[0166] U slučaju dvostrukih postupaka ciljanja, 5’ homologi krak prvog ciljajučeg vektora i 3’ homologi krak drugog ciljajućeg vektora može biti sličan sa odgovarajućim segmentima unutar ciljnog genomskog lokusa (tj., ciljna sekvenca), koja može promovisati homolognu rekombinaciju prvog i drugog vektora za ciljanje sa odgovarajućim genomskim segmentima i modifikuje ciljni genomski lokus.

[0167] U slučaju trostrukih postupaka ciljanja, 3’ homologi krak drugog ciljnog vektora mogu sadržati sekvencu koja se preklapa sa 5’ homologim krakom trećeg ciljajućeg vektora (tj., preklapajuće sekvence), koji mogu omogućiti homolognu rekombinaciju između drugog i trećeg LTVEC. 5’ homologi krak prvog ciljajućeg vektora i 3’ homologi krak trećeg ciljajućeg vektora su slični sa odgovarajućim segmentima unutar ciljnog genomskog lokusa (tj., ciljana sekvenca), koje mogu promovisati homolognu rekombinaciju prvog i trećeg ciljajućeg vektora sa odgovarajućim genomskim segementima i modifikuje ciljani genomski lokus.

[0168] Krak homologije i ciljna sekvenca ili dva kraka homologije "odgovaraju" ili su "odgovarajući" jedan sa drugom gde dva regiona dele dovoljni nivo identiteta sekvence jedna sa drugom da deluju kao supstrati za reakciju homologne rekombinacije. Identitet u sekvenci između date ciljne sekvence i odgovarajući krak homologije koji se može naći u ciljajućem vektoru (tj., preklapajuća sekvenca) ili između dva homologa kraka može biti bilo kog stepena identiteta u sekvenci koja omogućava da se dogodi homologna rekombinacija. Kao navođenje jednog primera, količina identiteta u sekvenci koju deli homologi krak ciljajućeg vektora (ili njegov fragment) i ciljna sekvenca drugog ciljnog vektora ili ciljna sekvenca ciljnog genomskog lokusa (ili njegovog fragmenta) može biti, npr., ali nisu ograničeni na, bar 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identitet u sekvenci, tako da sekvence prolaze kroz homolognu rekombinaciju.

[0169] Osim toga, odgovarajući region sličnosti (npr., identitet) između homologog kraka i odgovarajuće ciljne sekvence može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da se promoviše homologna rekombinacija u ciljnom genomskom lokusu. Na primer, dati homologi krak i/ili odgovarajuća ciljna sekvneca može sadržati odgovarajuće regione sličnosti koji su, npr., ali nisu ograničeni na, oko 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb, ili 200-300kb u dužini (kao što je ovde na drugom mestu opisano) tako da homologi krak ima dovoljnu sličnost da podlegne homolognoj rekombinaciji sa odgovarajućom ciljnom sekvencom(ama) u ciljnom genomskom lokusu ćelije ili unutar drugog ciljnog vektora. U nekim izvođenjima, dati homologi krak i/ili odgovarajuća ciljna sekvenca sadrži odgovarajuće regione sličnosti koji su, npr., ali nisu ograničeni na, oko 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb, ili 95-100kb u dužini (kao što je na drugom mestu opisanu) tako da homologi krak ima dovoljnu sličnost da podlegne homolognoj rekombinaciji sa odgovarajućom ciljnom sekvencom(ama) sa ciljnim genomskim lokusom ćelije ili unutar drugog ciljanog vektora.

[0170] Preklapajuće sekvence 3’ homolognog kraka prvog ciljajućeg vektora i 5’ homologog kraka drugog ciljajućeg vektora ili 3’ homologog kraka drugog ciljajućeg vektora i 5’ homologog kraka trećeg ciljajućeg vektora mogu biti bilo koje dužine koja je dovoljna da se promoviše homolgna rekombinacija između pomenutih ciljajućih vektora. Na primer, data preklapajuća sekvenca homologog kraka može sadržati odgovarajuće preklapajuće regione koji su oko 1-5kb, 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb, ili 200-300kb u dužini tako da preklapajuća sekvenca homologih krakova ima dovoljnu sličnost da podlegne homolognoj rekombinaciji sa odgovarajućim preklapajućim sekvencama unutar drugog ciljajućeg vektora. U nekim izvođenjima, data preklapajuća sekvenca homologog kraka sadrži preklapajući region koji je oko 1-100kb, 5-100kb, 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb, ili 95-100kb u dužini tako da preklapajuća sekvenca homolog kraka ima dovoljnu sličnost prolaze kroz homolognu rekombinaciju sa odgovarajućom preklapajućom sekvencom unutar drugog ciljajućeg vektora. U nekim izvođenjima, preklapajuća sekvenca je od 1-5kb, uključujući. U nekim izvođenjima, preklapajuća sekvenca je od oko 1kb do oko 70kb, uključujući. U nekim izvođenjima, preklapajuća sekvenca je od oko 10kb do oko 70kb, uključujući. U nekim izvođenjima, preklapajuća sekvenca je od oko 10kb do oko 50kb, uključujući. U nekim izvođenjima, preklapajuća sekvenca je bar 10kb. U nekim izvođenjima, preklapajuća sekvenca je bar 20kb. Na primer, preklapajuća sekvenca može biti od oko 1kb do oko 5kb, uključujući, od oko 5kb do oko 10kb, uključujući, od oko 10kb do oko 15kb, uključujući, od oko 15kb do oko 20kb, uključujući, od oko 20kb do oko 25kb, uključujući, od oko 25kb do oko 30 kb, uključujući, od oko 30kb do oko 35kb, uključujući, od oko 35kb do oko 40kb, uključujući, od oko 40kb do oko 45kb, uključujući, od oko 45kb do oko 50kb, uključujući, od oko 50kb do oko 60kb, uključujući, od oko 60kb do oko 70kb, uključujući, od oko 70kb do oko 80kb, uključujući, od oko 80kb do oko 90kb, uključujući, od oko 90kb do oko 100kb, uključujući, od oko 100kb do oko 120kb, uključujući, od oko 120kb do oko 140kb, uključujući, od oko 140kb do oko 160kb, uključujući, od oko 160kb do oko 180kb, uključujući, od oko 180kb do oko 200kb, uključujući, od oko 200kb do oko 220kb, uključujući, od oko 220kb do oko 240kb, uključujući, od oko 240kb do oko 260kb, uključujući, od oko 260kb do oko 280kb, uključujući, ili oko 280kb do oko 300 kb, uključujući. Da se navede bar jedan primer, preklapajuća sekvenca može biti od oko 20kb do oko 60kb, uključujući. Alternativno, preklapajuća sekvenca može biti bar 1kb, bar 5kb, bar 10kb, bar 15kb, bar 20kb, bar 25kb, bar 30kb, bar 35kb, bar 40kb, bar 45kb, bar 50kb, bar 60kb, bar 70kb, bar 80kb, bar 90kb, bar 100kb, bar 120kb, bar 140kb, bar 160kb, bar 180kb, bar 200kb, bar 220kb, bar 240kb, bar 260kb, bar 280kb, ili bar 300kb. U nekim izvođenjima, preklapajuća sekvenca može biti najviše 400kb, najviše 350kb, najviše 300kb, najviše 280kb, najviše 260kb, najviše 240kb, najviše 220kb, najviše 200kb, najviše 180kb, najviše 160kb, najviše 140kb, najviše 120kb, najviše 100kb, najviše 90kb, najviše 80 kb, najviše 70kb, najviše 60 kb ili najviše 50kb.

[0171] Homologi krakovi mogu, u nekim izvođenjima, odgovarati lokusu koji je nativan u odnosu na ćeliju (npr., ciljani lokus), ili alternativno oni mogu odgovarati regionu heterolognog ili egzogenog segmenta DNK koja je integrisana u genom ćelije, uključujući, na primer, transgene, ekspresione kasete, ili heterolognih ili egzogenih regiona DNK. U nekim izvođenjima, homologi krakovi mogu, u nekim izvođenjima, odgovarati regionu na ciljnom vektoru u ćeliji. U nekim izvođenjima, homologi krakovi ciljajućeg vektora mogu odgovarati regionu kvaščevog veštačkog hromozoma (YAC), bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), humanog veštačkog hromozoma, ili bilo kod drugog modifikovanog regiona koji se nalazi u odgovarajućoj ćeliji domaćina. Dalje, homologi krakovi ciljajućih vektora mogu odgovarati sa ili biti izvedeni iz regiona BAC biblioteke, biblioteke kozmida, ili biblioteke PI faga. U nekim određenim izvođenjima, homologi krakovi ciljajućeg vektora odgovaraju lokusu koji je nativan, heterologan, ili egzogeni prokariotu, ćeliji, ptici (npr., kokoš), nehumana životinja, miš, humano biće, pacov, miš, hrčak zec, svinja, govedo, jelen, ovca, koza, mačka, pas, tvor, primat (npr., marmozet, rezus majmun), domestifikovani sisar, poljoprivredni sisar, ili bilo koji drugi organizam od interesa. U nekim izvođenjima, homologi krakovi odgovaraju lokusu u ćeliji koji pokazuje ograničenu podložnost ciljanu upotrebom konvencionalnog postupka ili koji je pokazao relativno niske nivoe uspešne integracije na ciljanom mestu, i/ili značajne nivoe neciljane integracije, u odsustvu prekida ili dvolančanog prekida koji je indukovan nukleaznim agensom (npr., Cas proteinom). U nekim izvođenjima, homologi krakovi su dizajnirani sa sadrže modifikovanu DNK.

[0172] U nekim izvođenjima, 5’ i 3’ homologi krakovi ciljajućih vektor(a) odgovaraju ciljanom genomu. Alternativno, homologi krajevi odgovaraju srodnom genomu. Na primer, ciljni genom je genom miša prvog soja, i ciljni krakovi odgovaraju genomu miša drugog soja, pri čemu su prvi so ji drugi soj različiti. U određenim izvođenjima, homologi krakovi odgovaraju genomu iste životinje ili sui z genoma istog soja, npr., ciljni genom je mišji genom prvog soja, i ciljajući krakovi odgovaraju genomu miša iz istog miša ili iz istog soja.

[0173] Homologi krak ciljajućeg vektora može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše događaj homologne rekombinacije sa odgovarajućom ciljnom sekvencom, uključujući, na primer, 1-5kb, uključujući, 5-10kb, uključujući, 5-15kb, uključujući, 5-20kb, uključujući, 5-25kb, uključujući, 5-30kb, uključujući, 5-35kb, uključujući, 5-40kb, uključujući, 5-45kb, uključujući, 5-50kb, uključujući, 5-55kb, uključujući, 5-60kb, uključujući, 5-65kb, uključujući, 5-70kb, uključujući, 5-75kb, uključujući, 5-80kb, uključujući, 5-85kb, uključujući, 5-90kb, uključujući, 5-95kb, uključujući, 5-100kb, uključujući, 100-200kb, uključujući, ili 200-300kb, uključujući, u dužini. U nekim izvođenjima, homologi krak ciljajućeg vektora ima dužinu koja je dovoljna da promoviše događaj homologne rekombinacije sa odgovarajućom ciljnom sekvenom koja je 1-100kb, uključujući, 5-100kb, uključujući, 10-100kb, uključujući, 15-100kb, uključujući, 20-100kb, uključujući, 25-100kb, uključujući, 30-100kb, uključujući, 35-100kb, uključujući, 40-100kb, uključujući, 45-100kb, uključujući, 50-100kb, uključujući, 55-100kb, uključujući, 60-100kb, uključujući, 65100kb, uključujući, 70-100kb, uključujući, 75-100kb, uključujući, 80-100kb, uključujući, 85-100kb, uključujući, 90-100kb, uključujući, ili 95-100kb, uključujući, u dužini. Kao što je ovde opisano, veliki ciljajući vektori koristiti ciljajuće krakove veće dužine.

[0174] Nukleazna sredstva (npr., CRISPR/Cas sistemi) mogu se koristiti u kombinaciji sa ciljajućim vektorima da bi se olakšala modifikacija ciljnog lokusa (npr., modifikacija lokusa Igκlakog lanca, ili modifikacija prethodno modifikovanog ili modifikovanog lokusa Igκlakog lanca). Takva sredstva nukleaze može promovisati homolognu rekombinaciju između ciljajućeg vektora i ciljnog lokusa. Kada se upotrebe nukleazna sredstva u kombinaciji sa ciljajućim vektorom, ciljajući vektor može sadržati 5’ i 3’ homologne krakove koji odgovaraju 5’ i 3’ ciljne sekvence koje su locirane u dovoljnoj blizi sa nukleaznim mestom cepanja tako da se promoviše pojavljivanje događaja homologne rekombinacije između ciljnih sekvenci i homolognih krakova nakon prekisa ili prekida dvostrukog lanca na mestu cepanja nukleaze. Termin "mesto cepanja nukleaze" sadrži sekvencu DNK u kojoj prekid ili je prekid dvostukog lanca kreiran sa agensom nukleaze (npr., Cas9 mestom cepanja). Ciljne sekvence u ciljanom lokusu koji odgovaraju 5’ i 3’ homologih krajeva ciljajućeg vektora su "locirani u dovoljnoj blizini" u odnosu na mesto cepanja nukleazom ukoliko je distanca takva da promoviše pojavljivanje događaja homologne rekombinacije između 5’ i 3’ ciljnih sekvenci i homologih krakova nakon prekida ili prekidom dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja. Prema tome, u određenim izvođenjima, ciljne sekvence koje odgovaraju 5’ i/ili 3’ homologe krakove ciljajućeg vektora su bar jedan nukleotid dato mesta prepoznavanja ili su unutar bar 10 nukleotida do oko 14kb u datom mestu prepoznavanja. U nekim izvođenjima, mesto cepanja nukleaze je neposredno blizu bar jedne ili obe ciljne sekvence.

[0175] Prostorni odnos ciljnih sekvenci koje odgovaraju homologim krakovima ciljanih vektora i mesto cepanja nukleazom se može razlikovati. Na primer, ciljne sekvence mogu biti locirane 5’ u odnosu na mesto cepanja nukleazom, ciljne sekvence mogu biti locirane 3’ u odnosu na mesto prepoznavanja, ili ciljne sekvence mogu da okružuju mesto cepanja nukleazom.

[0176] Kombinovana upotreba ciljajućeg vektora (uključujući, na primer, veliki ciljajući vektor) sa nukleaznim sredstvom može rezultovati u povećanoj efikasnosti ciljanja u poređenju sa upotrebom samog ciljanog vektora. Na primer, kada je ciljajući vektor korišćen u kombinaciji sa agensom nukleaze, ciljajuća efikasnost ciljajućeg vektora može se povećati bar dva-puta, bar tri-puta, bar četiri-puta, bar pet-puta, bar šest-puta, bar sedam-puta, bar osam-puta, bar devet-puta, bar deset-puta ili u opsegu koji je obrazovan iz ovih celih brojeva, kao što je 2-10-puta kada je upoređen sa upotrebom samog ciljajućeg vektora.

[0177] Neki ciljani vektori su "veliki ciljajući vektori" ili "LTVECs," koji uključuju ciljajuće vektore koji sadrže homologne krakove koji odgovaraju i izvedeni su iz sekvenci nukleinskih kiselina koje su veće od onih koje se obično koriste drugim pristupcima koji su namenjeni za izvođenje homologne rekombinacije u ćelijama. LTVEC može biti, na primer, bar 10kb u dužini, ili zbir ukupnih 5’ kraka homologije i 3’ kraka homologije mogu biti, na primer, bar 10kb. LTVECs takođe uključuju ciljajuće vektore koji obuhvataju kontrukte nukleinske kiseline veće od onih koji se uobičajeno koriste drugim pristupima koji su namenjeni za sprovođenje homologne rekombinacije u ćelijama. Na primer, LTVECs omogućavaju mogifikaciju velikih lokusa koji se ne mogu prilagoditi tradicionalnim ciljajućim vektorima koji su zasnovani na plazmidu zbog njihovih ograničenja u veličini. Na primer, ciljani lokus može biti (tj., 5’ i 3’ kraci homologije mogu odgovarati) lokusu ćelije koji se ne može ciljati upotrebom koncencionalnog postupka ili koji se mogu ciljati samo pogrešno ili samo sa značajno niskom efikasnosti u odsutvu prekida ili prekida u dvosturukog lanca indukovana sa nukleaznim sredstvom (npr., Cas protein).

[0178] U nekim izvođenjima, ovde opisani postupci upotrebljavaju dva ili tri LTVECs koji su sposobni za rekombinovanje jedan sa drugim i sa ciljnim genomskim lokusom u trosmernom ili četvorosmernom događaju rekombinacije. Takvi postupci čine mogućim modifikaciju velikih lokusa koji se ne mogu postići upotrebom pojedinačnog LTVEC.

[0179] Primeri LTVECs obuhvataju vektore koji su izvedeni iz bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), humanog veštačkog hromozoma, ili veštačkog hromozoma kvasca (YAC). LTVECs mogu imati linearni oblik ili biti u cirkularnom obliku. Primeri LTVECs i postupci za njihovo dobijanje su opisano u, npr., U.S. Patent br. 6,586,251, 6,596,541 i No.7,105,348; i objava br. WO 2002/036789 međunarodne prijave patenta.

Miševi, ćelije i tkiva

[0180] Korišćeni su miševi koji eksprimuju (npr., čije B ćelije eksprimuju) antitela koja sadrže lake lance koja sadrže humani Vλ domen koji nastaje iz integracije genskog materijala koji odgovara bar delu lokusa humanog Igλ lakog lanca (tj., bar delu humanih Vλ i Jλ genetičkih segmenata), i koji kodira humani Vλ domen (tj., preuređenu humanu Vλ-Jλ sekvencu), umesto odgovarajućih sekvenci nehumanih varijabilnih regiona Igκlakog lanca u germinativnom genomu miša.

[0181] Predmetni prikaz koristi unapređene in vivo sisteme za identifikovanje i razvijanje novih antitela, komponenti antitela (npr., delove koji vežu antigen i/ili kompozicije ili formate koji ih sadrže), i/ili terapeutike koji su zasnovani na antitelu koji se mogu koristiti, na primer, u lečenju različitih bolesti koje pogađaju humana bića. Dalje, predmetni prikaz takođe obuhvata spoznavanje da miševi koji imaju modifikovane imunoglobulinske lokuse, kao što su modifikovani lokusi (Ig) kapa (κ) lakog lanca imunoglobulina i/ili koji na drugi način eksprimiraju, proizvode ili sadrže repertoire antitela koji se karakterišu lakim lancima koji imaju regione humanog V lambda (λ) su korisni. Na primer, u nekim izvođenjima, takvi miševi se mogu koristiti za iskorišćavanje diverziteta humanih Vλ sekvenci u identifikaciji i razvoju novih terapeutika koji su zasnovani na antitelu. U nekim izvođenjima, miševi koji su ovde opisani obezbeđuju unapređene in vivo sisteme za razvoj antitela i/ili terapeutike koji su zasnovani na antitelima za davanje humanim bićima. U nekim izvođenjima, ovde opisani miševi obezbeđuju unapređene in vivo sisteme za razvijanje antitela i/ili terapeutika koji su zasnovani na antitelu koji sadrže humane Vλ domene koji se karakterišu sa poboljšanjim performansama (npr., ekspresija i/ili predstavljanje u repertoaru antigen-specifičnog antitela) u poređenju sa antitelima i/ili terapeuticima koji su zasnovani na antitelu koji su dobijeni iz postojećih in vivo sistema koji sadrže sekvence humanog Vλ regiona.

[0182] Predmetni prikaz obezbeđuje, između ostalih stvari, miša koji ima lokus Igκlakog lanca koji sadrži modifikovani varijabilni region lakog lanca imunoglobulina i modifikovani gen konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina. Kao što je ovde opisano, korišćeni miševi, sadrže u njihovom germinativnom genomu lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži modifikovani varijabilni regiona κ lakog lanca imunoglobulina koji se karakteriše sa prisustvom jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata i jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata, pri čemu jedan ili više humanih Vλ i jedan ili više humanih Jλ genetičkih segmenata su u operativnoj vezi sa mišjim genom konstantnog regiona (Cλ) λ lakog lanca imunoglobulina, pri čemu mišji gen konstantnog regiona (Cλ) λ lakog lanca imunoglobulina je pozicioniran umesto nehumanog gena za konstantni region (Cκ) κ lakog lanca imunoglobulina u endogenom κ lokusu imunoglobulina miša. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže lokus Igκ lakog lanca koji sadrži intergensku DNK koji je λ laki lanac imunoglobulina i/ili κ lakog lanca imunoglobulina u poreklu, i njihove kombinacije.

[0183] U mnogim izvođenjima, modifikovani varijabilni region κ lakog lanca imunoglobulina dalje sadrži sekvencu κ lakog lanca imunoglobulina koji je pozicioniran ili insertovan između pomenutog jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata. U nekim izvođenjima, pomenuta sekvenca κ lakog lanca imunoglobulina koja je pozicionirana ili je insertovana između pomenutog jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata je ili sadrži mišju sekvencu. U nekim izvođenjima, pomenuta sekvenca κ lakog lanca imunoglobulina koji j je pozicioniran ili insertovan između pomenutog jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata je ili sadrži humanu sekvencu. Na primer, u nekim izvođenjima, humana sekvenca κ lakog lanca imunoglobulina je ili sadrži genomsku sekvencu koja se prirodno pojavljuje između humanog Vκ4-1 genskog segmenta i humanog Jκ1 genskog segmenta humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina.

[0184] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže bar 5, bar 6, bar 7, bar 8, bar 9, bar 10, bar 11, bar 12, bar 13, bar 14, bar 15, bar 16, bar 17, bar 18, bar 19, bar 20, bar 21, bar 22, bar 23, bar 24 ili bar 25 funkcionalnih humanih Vλ genetičkih segmenata. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže 5 do 25, 5 do 24, 5 do 23,5 do 22, 5 do 21, 5 do 20,5 do 19, 5 do 18, 5 do 17,5 do 16, 5 do 15, 5 do 14,5 do 13,5 do 12,5 do 11,5 do 10,5 do 9,5 do 8, 5 do 7, ili 5 do 6 funkcionalnih humanih Vλ genetičkih segmenata. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže 6 do 25, 7 do 25, 8 do 25, 9 do 25, 10 do 25, 11 do 25, 12 do 25, 13 do 25, 14 do 25, 15 do 25, 16 do 25, 17 do 25, 18 do 25, 19 do 25, 20 do 25, 21 do 25, 22 do 25, 23 do 25 ili 24 do 25 funkcionalnih humanih Vλ genetičkih segmenata. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže 6 do 24, 7 do 23, 8 do 22, 9 do 21, 10 do 20, 11 do 19, 12 do 18, 13 do 17, 14 do 16, ili 15 do 16 funkcionalne humane Vλ genske segmente. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže 6 do 24, 7 do 23, 8 do 22, 9 do 21, 10 do 20, 11 do 19, 12 do 18, 13 do 17, ili 14 do 16 funkcionalnih humanih Vλ genetičkih segmenata.

[0185] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže 10 do 70, 10 do 65, 10 do 60, 10 do 55, 10 do 50, 10 do 45, 10 do 40, 10 do 35, 10 do 30, 10 do 25, 10 do 20, ili 10 do 15 ukupno humanih Vλ genetičkih segmenata. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže 15 do 70, 20 do 70, 25 do 70, 30 do 70, 35 do 70, 40 do 70, 45 do 70, 50 do 70, 55 do 70, 60 do 70, ili 65 do 70 ukupno humanih Vλ genetičkih segmenata. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže 15 do 65, 20 do 60, 25 do 55, 20 do 50, 25 do 45, 30 do 40, 30 do 35, ili 35 do 40 ukupno humanih Vλ genetičkih segmenata.

[0186] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže humane Vλ i/ili Jλ genske segmente u prirodnoj ili germinativnog konfiguraciji (npr., sekvenca DNK koja sadrži mnoštvo kodirajućih sekvenci humanog Vλ i/ili Jλ segmenta gena koje su rasute između nekodirajuće humane sekvence λ lakog lanca sekvence lakog lanca imunoglobulina). U nekim izvođenjima, korišćeni miš sadrži humane Vλ i/ili Jλ segmente gena u konfiguraciji koja se odvaja ili odstupa od prirodne germinativne konfiguracije (npr., sekvenca DNK koja sadrži mnoštvo kodirajućih sekvenci humanih Vλ i/ili Jλ segmenata gena koje su rasute između nekodirajuće sekvence κ lakog lanca imunoglobulina (npr., čovek ili miš). U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže humane Vλ i/ili Jλ genske segmente u konfiguraciji koja se ne pojavljuje prirodno u lokusu humanog λ lakog lanca imunoglobulina germinativnog genoma humane ćelije.

[0187] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže sekvencu DNK u endogenom lokusu nehumanog Igκ lakog lanca koji sadrži mnoštvo humanih Vλ i Jλ kodirajućih sekvenci rasutih (ili postavljenih jedno uz drugo, povezanih, itd.) sa nekodirajućom humanom sekvencom lakog lanca imunoglobulina (npr., κ, λ i njihove kombinacije). U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže sekvencu DNK u endogenom lokusu nehumanog Igλ lakog lanca koji sadrži mnoštvo humanih Vλ i Jλ kodirajućih sekvenci rasutih sa nekodirajućom nehumanom (npr., mišjom) sekvencom λ lakog lanca imunoglobulina.

[0188] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi se karakterišu sa ekspresijom antitela iz endogenih lokusa κ lakog lanaca imunoglobulina u germinativnom genomu pomenutih miševa, pri čemu antitela sadrže (1) humane Vλ domene i (2) mišje Cλ domene. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi se karakterišu sa unapređenom upotrebom humanih Vλ regiona iz modifikovanih lokusa κ lakog lanca imunoglobulina (npr., ali nije ograničeni na, oko 2-puta) u poređenju sa jednim ili više referentnim modifikovanim miševima.

[0189] U nekim slučajevima, prikazan je miš, mišja ćelija mišje tkivo čiji germinativni genom sadrži u endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata: (a) jedan ili više humanih Vλ genetičkih segmenata, (b) jedan ili više humanih Jλ genetičkih segmenata, i (c) mišji Cλ gen, pri čemu (a) i (b) su operativno povezani sa (c), i gde mišu nedostaje mišji Cκ gen u endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina.

[0190] U nekim slučajevima, prikazan je miš, mišja ćelija ili mišje tkivo čiji germinativni genom sadrži endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži inserciju jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata, jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata i mišjeg Cλ gena, gde humani Vλ i Jλ genetički segmentu su u operativnoj vezi sa pomenutim mišjim Cλ genim, i gde mišji Cλ gen je insertovan umesto mišjeg Cκ gena u endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina. U mnogim izvođenjima miša, mišje ćelije ili mišjeg tkiva, mišji Cλ gen koji je insertovan umesto mišjeg Cκ gena u endogenom κ lakom lancu imunoglobulina.

[0191] mišUnekim izvođenjima, gen Cλ miša sadrži sekvencu koja je bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95%, ili bar 98% identična sa Cλ genom miša koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz mišjeg Cλ1, mišjeg Cλ2 i mišjeg Cλ3. U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen sadrži sekvencu koja je u suštini identična ili je identična sa mišjim Cλ genom koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz mišjeg Cλ1, mišjeg Cλ2 i mišjeg Cλ3. U nekim izvođenjima, mišji Cλ1 gen je ili sadrži SEQ ID NO:1. U nekim određenim izvođenjima, mišji Cλ2 gen je ili sadrži SEQ ID NO:3. U nekim određenim izvođenjima, mišji Cλ3 gen je ili sadrži SEQ ID NO:5. U nekim određenim izvođenjima, mišji Cλ gen sadrži sekvencu koja je identična sa mišjim Cλ1 genom.

[0192] U nekim izvođenjima, Cλ gen miša sadrži sekvencu koja je 80% do 100%, 85% do 100%, 90% do 100%, 95% do 100%, ili 98% do 100% identična sa mišjim Cλ genom koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz mišjeg Cλ1, mišjeg Cλ2 i mišjeg Cλ3. U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen sadrži sekvencu koja je 80% do 98%, 80% do 95%, 80% do 90%, ili 80% do 85% identična sa mišjim Cλ genom koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz mišjeg Cλ1, mišjeg Cλ2 i mišjeg Cλ3. U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen sadrži sekvencu koja je 85% do 98%, 90% do 95%, ili 88% do 93% identična sa mišjim Cλ genom odabranim iz grupe koja se sastoji iz mišjeg Cλ1, mišjeg Cλ2 i mišjeg Cλ3.

[0193] U nekim izvođenjima, Cλ gen glodara je ili sadrži Cλ gen pacova. U nekim izvođenjima, Cλ gen pacova sadrži sekvencu koja je bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95%, ili bar 98% identična sa Cλ genom pacova koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz gena Cλ1 pacova, Cλ2 pacova, Cλ3 pacova i Cλ4 pacova. U nekim izvođenjima, gen Cλ pacova sadrži sekvencu koja je u suštini identična ili je identična sa Cλ genom pacova koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz gena Cλ1 pacova, Cλ2 pacova, Cλ3 pacova i Cλ4 pacova. U nekim određenim izvođenjima, gen Cλ1 pacova je ili sadrži SEQ ID NO:7. U nekim određenim izvođenjima, gen Cλ2 pacova je ili sadrži SEQ ID NO:9. U nekim određenim izvođenjima, gen Cλ3 pacova je ili sadrži SEQ ID NO:11. U nekim određenim izvođenjima, gen Cλ4 pacova je ili sadrži SEQ ID NO:13.

[0194] U nekim izvođenjima, Cλ gen pacova sadrži sekvencu koja je 80% do 100%, 85% do 100%, 90% do 100%, 95% do 100%, ili 98% do 100% identična sa Cλ genom pacova koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz gena Cλ1 pacova, Cλ2 pacova, Cλ3 pacova i Cλ4 pacova. U nekim izvođenjima, gen Cλ pacova sadrži sekvencu koja je 80% do 98%, 80% do 95%, 80% do 90%, ili 80% do 85% identična sa Cλ genom pacova koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz gena Cλ1 pacova, Cλ2 pacova, Cλ3 pacova i Cλ4 pacova. U nekim izvođenjima, gen Cλ pacova sadrži sekvencu koja je 85% do 98%, 90% do 95%, ili 88% do 93%, identična sa Cλ genom pacova koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz gena Cλ1 pacova, Cλ2 pacova, Cλ3 pacova i Cλ4 pacova.

[0195] U nekim izvođenjima, humani Cλ gen sadrži sekvencu koja je bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95%, ili bar 98% identična sa humanim Cλ genom koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz humanog Cλ1, humanog Cλ2, humanog Cλ3, humanog Cλ6 i humanog Cλ7 gena. U nekim izvođenjima, humani Cλ gen sadrži sekvencu koja je u suštini identična ili je identična sa humanim Cλ genom koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz humanog Cλ, humanog Cλ2, humanog Cλ3, humanog Cλ6 i humanog Cλ7 gena. U nekim izvođenjima, humani Cλ gen sadrži sekvencu koja je identična sa humanim Cλ genom koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz humanog Cλ1, humanog Cλ2, humanog Cλ3, humanog Cλ6 i humanog Cλ7 gena. U nekim određenim izvođenjima, humani Cλ1 gen je ili sadrži SEQ ID NO:15. U nekim određenim izvođenjima, humani Cλ2 gen je ili sadrži SEQ ID NO: 17. U nekim određenim izvođenjima, humani Cλ3 gen je ili sadrži SEQ ID NO: 19. U nekim određenim izvođenjima, humani Cλ6 gen je ili sadrži SEQ ID NO:21. U nekim određenim izvođenjima, humani CX7 gen je ili sadrži SEQ ID NO:23. U nekim određenim izvođenjima, humani Cλ gen je ili sadrži humani Cλ2 gen.

[0196] U nekim izvođenjima, humani Cλ gen sadrži sekvencu koja je 80% do 100%, 85% do 100%, 90% do 100%, 95% do 100%, ili 98% do 100% identična sa humanim Cλ genom koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz humanog Cλ1, humanog Cλ2, humanog Cλ3, humanog Cλ6 i humanog Cλ7 gena. U nekim izvođenjima, humani Cλ gen sadrži sekvencu koja je 80% do 98%, 80% do 95%, 80% do 90%, ili 80% do 85% identičan sa humanim Cλ genom koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz humanog Cλ1, humanog Cλ2, humanog Cλ3, humanog Cλ6 i humanog Cλ7 gena. U nekim izvođenjima, humani Cλ gen sadrži sekvencu koja je 85% do 98%, 90% do 95%, ili 88% do 93%, identična sa humanim Cλ genom koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz humanog Cλ1, humanog Cλ2, humanog Cλ3, humanog Cλ6 i humanog Cλ7 gena.

[0197] U nekim izvođenjima korišćenog miša, mišja ćelija ili mišje tkivo, insercija jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata zamenjuju nehumane Vκ i Jκ genske segmente u endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, insercija sadrži humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno nalazi između humanih Vλ i Jλ genetičkih segmenata, i njihove kombinacije. U nekim izvođenjima korišćena životinja miš, mišja ćelija ili mišje tkivo, insercija jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata su umesto ili zamenjuju nehumane Vκ i Jκ genske segmenate u endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima miš, mišja ćelija ili mišje tkivo, korišćeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju bar 24, bar 34, bar 52, bar 61, ili bar 70 humanih Vλ genetičkih segmenata i bar 1, bar 2, bar 3, bar 4 ili bar 5 humanih Jλ genetičkih segmenata. U nekim određenim izvođenjima korišćenog miša, mišja ćelija ili mišje tkivo, lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju 39 humanih Vλ genetičkih segmenata i bar 5 humanih Jλ genetičkih segmenata. U nekim izvođenjima korišćenog miša, mišja ćelija ili mišje tkivo, lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju humanih Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, VÀ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ28, Vλ4-3, Vλ3-1 ili bilo koju njihovu kombinaciju, I humanih J Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, insercija sadrži humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno nalaze susedno u odnosu na humane Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, VÀ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, VÀ2-23, Vλ3-22, VÀ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, VÀ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, VÀ2-8, VÀ4-3, ili VÀ3-1 u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca, I humana nekodirajuća DNK (u celosti ili delom) koja se prirodno se nalazi susedno u odnosu na humani Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ili Jλ7 u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca. U nekim određenim izvođenjima, insercija sadrži humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno se nalazi susedno u odnosu na humane Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, VÀ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, VÀ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, VÀ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, VÀ4-3, ili VÀ3-1 U endogenom lokusu humanog λ lakog lanca, i humana nekodirajuća DNK koja se prirodno nalazi susedno u odnosu na humani Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ili Jκ5 u endogenom lokusu humanog κ lakog lanca. U nekim određenim izvođenjima, insercija humanih Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ili bilo koja njihova kombinacija sadrži humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno nalazi susedno u odnosu na humani Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, VÀ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ili Vλ3-1 u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca, i insercija humanog Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7, ili bilo koju njihovu kombinaciju koja sadrži humanu nekodirajuću DNK (u celosti ili delom) koji se prirodno se nalazi susedno u odnosu na humani Jλ1, Vλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca. U nekim određenim izvođenjima, insercija humanog Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ili bilo koju njihovu kombinaciju sadrži humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno se nalazi susedno u blizini odnosu na humani Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ili Vλ3-1 u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca, i insercija humanog Jλ1, Vλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7, ili bilo koja njihova kombinacija sadrži humanu nekodirajuću DNK (u celosti ili delom) koja se prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ili Jκ5 u endogenom lokusu humanog κ lakog lanca.

[0198] U nekim izvođenjima korišćenog miša, mišje ćelije ili mišjeg tkiva, lokus κ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano dalje sadrži sekvencu κ lakog lanca humanog imunoglobulina sequence između jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata, jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata, jednog ili više humanih Vλ genetičkih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genetičkih segmenata, i njihove kombinacije. U nekim izvođenjima, sekvenca κ lakog lanca humanog imunoglobulina kao što je ovde opisano je ili obuhvata genomsku sekvencu koja se prirodno pojavljuje između humanog Vκ4-1 genskog segmenta i humanog Jκ1 genskog segmenta lokusa κ lakog lanca humanog imunoglobulina.

[0199] U nekim izvođenjima korišćenog miša, mišje ćelije ili tkiva miša, germinativni genom pomenutog miša, mišja ćelija ili tkivo miša dalje sadrži endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenetičkih segmenata, jednog ili više humanih DHgenetičkih segmenata i jednog ili više humanih JHgenetičkih segmenata, pri čemu su humani VH, DHand JHgenetički segmenti u operativnoj vezi sa ne-humanim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina u endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina (videti, npr., U.S. Patent br-e.8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,323).

[0200] U nekim izvođenjima, insercija jednog ili više humanih VHgenetičkih segmenata, jednog ili više humanih DHgenetičkih segmenata i jednog ili više humanih JHgenetičkih segmenata su umesto ili zamenjuju, u celini ili delom, ne-humane VH, DHand JHgenske segmente (npr., poziciono zamenjuju ili supstituišu kodirajuće sekvence ne-humanih VH, DHi JHgenetičkih segmenata sa kodirajućim sekvencama humanih VH, DHi JHgenetičkih segmenata). U nekim određenim izvođenjima, insercija sadrži humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje između humanih VH, DHu JHgenetičkih segmenata, i njihovih kombinacija. U nekim izvođenjima, ne-humani konstanti region teškog lanca imunoglobulina je ili sadrži endogeni konstantni regiona ne-humanog teškog lanca imunoglobulina. U mnogim izvođenjima, konstantni region ne-humanog teškog lanca imunoglobulina (npr., endogenog) sadrži jedan ili više gena ili segmenata gena konstantnog regiona ne-humanog teškog lanca imunoglobulina (npr., IgM, IgD, IgG, IgE, IgA, etc.). U nekim određenim izvođenjima, lokus teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisan sadrži inserciju humanih VHgenetičkih segmenata VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ili bilo koju njihovu kombinaciju, humanih DHgenetičkih segmenata DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ili bilo koju njihovu kombinaciju, i humanih JHgenetičkih segmenata JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim određenim izvođenjima, insercija sadrži humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VHI-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, ili VH6-1 u endogenom lokusu teškog lanca humane ne-kodirajuće DNK koja se prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, ili DH7-27, i humana ne-kodirajuća DNK koja se prirodno se nalazi u blizini u odnosu na humani JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, ili JHu endogenom lokusu teškog lanca.

[0201] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži Adam6 gen u njegovom genomu (npr., njegovom germinativnom genomu), koji kodira ADAM6 polipeptid, funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog, ili njegov funkcionalni fragment (videti, npr., U.S. Patent Br-e.8,642,835 i 8,697,940). U nekim izvođenjima, ADAM6 polipeptid, funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog, ili njegov funkcionalni fragment je eksprimiran sa Adam6 gena. U nekim izvođenjima, Adam6 gen ne potiče od miša koji sadrži Adam6 gen (npr., miš koji sadrži Adam6 gen pacova ili Adam6 gen miša koji je dobijen iz drugog soja miša). U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži ektopični Adam6 gen. "Ektopični" Adam6 gen, kao što je ovde koriščeno, se odnosi na Adam6 gen koji je u različitom kontekstu u odnosu na Adam6 gen koji se pojavljuje u divljem tipu miša. Na primer, Adam6 gen može da se nalazi na različitom hromozomu, može da se nalazi u različitom lokusu, ili je pozicionirann pored različitih sekvenci. Primer ektopičnom Adam6 gena je mišji Adam6 gen koji se nalazinu sekvencama humanog imunoglobulina (npr., genetički segmenti humanog varijabilnog regiona teškog lanca). U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži insertovan ili integrisan Adam6 gen.

[0202] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži inserciju jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih Adam6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njihovih funkcionalnih fragmenata u njegovom genomu (npr., njegovom germinativnom genomu).

[0203] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži jednu ili više nukleotnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih ADAM6 polipeptida, funkcionalne ortologe, funkcionalne homologe, ili njihove funkcionalne homologe u njegovom genomu (npr., njegov germinativni genom). U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži mišji Adam6a gen i/ili mišji Adam6b gen u njegovom genomu (npr. njegov germinativni genom). U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži jednu ili više nukelotidnih sekvenci mišjeg ADAM6a, funkcionalnog ortologa, funkcionalnog homologa, ili njegovog funkcionalnog fragmenta, i/ili mišjeg ADAM6b, funkcionalnog ortologa, funkcionalnog homologa, ili njegovog funkcionalnog fragmenta.

[0204] U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su insertovani i/ili se nalaze na istom hromozomu kao endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više nehumanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su insertovani i/ili se nalaze u položaju tako da jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su u blizini sa segmentima gena varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su insertovani i/ili su locirani u položaju tako da jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su u blizini sa segmentima gena varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su insertovani i/ili su locirani u položaju tako da jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata se nalaze između segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više nehumanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su insertovane i/ili se nalaze između prvog i drugog humanog VHgenskog segmenta. U nekim izvođenjima, prvi humani VHgenetički segment je humani VH1-2 i drugi humani VHgenetički segment je humani VH6-1. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više nehumanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su insertovane i/ili su locirane umesto humanog Adam6 pseudogena. U nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više nehumanih ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa, ili njegovih funkcionalnih fragmenata su insertovane između humanog VHgenskog segmenta i humanog DHgenskog segmenta.

[0205] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži Adam6 gen koji obnavlja i pojačava aktivnost ADAM6. U nekim izvođenjima, Adam6 gen obnavlja aktivnost ADAM6 do nivoa uporedivnog miša koji sadrži funkcionalni, endogeni Adam6 gen. U nekim izvođenjima, Adam6 gen pojačava aktivnost ADAM6 do nivoa koji je bar 2 puta, bar 3 puta, bar 4 puta, bar 5 puta, bar 6 puta, bar 7 puta, bar 8 puta, bar 9 puta, ili bar 10 puta aktivnosti ADAM6 uporedivne nehumane životinje koja ne sadrži funkcionalni Adam6 gen.

[0206] U nekim izvođenjima, ovde opisani miš sadrži Adam6 gen koji obnavlja ili pojačava fertilitet kod mužjaka miševa. U nekim izvođenjima, Adam6 gen obnavlja fertilitet kod mužjaka miševa do nivoa uporedivog sa nehumanom životinjom koja sadrži funkcionalni, endogeni Adam6 gen. U nekim izvođenjima, Adam6 gen obnavlja fertilitet kod mužjaka miševa tako da je broj mladunaca koji su proizvedeni parenjem mužjaka miša bar 70%, bar 80%, bar 90%, bar 95% od broja mladunaca koji su proizvedeni od uporedivog parenja uporedivog, mužajaka miša koji ne sadrži funkcionalni Adam6 gen. U nekim izvođenjima, Adam6 gen pojačava fertilitet kod mužjaka nehumane životinje tako da broj mladunaca koji je proizveden parenjem mužjaka nehumane životinje obuhvata bar 2 puta, bar 3 puta, bar 4 puta, bar 5 puta, bar 6 puta, bar 7 puta, bar 8 puta, bar 9 puta, ili bar 10 puta broja mladunaca koji su dobijeni iz uporedivog parenja uporedive, mužjaka nehumane životinje koja ne sadrži funkcionalni Adam6 gen.

[0207] U nekim izvođenjima, lokus teškog lanca imunoglobulina miša kao što je ovde opisan ne sadrži bar jedan endogeni nehumani Adam6 gen. U nekim izvođenjima, nedostatak bar jednog endogenog mišjeg Adam6 gena smanjuje aktivnost ADAM6 i/ili fertilitet kod mužjaka miševa kome nedostaje endogeni Adam6 gen miša. U nekim izvođenjima, lokus teškog lanca nehumanog imunoglobulina kao što je ovde opisan sadrži prekid od bar jednog endogenog mišjeg Adam6 gena. U nekim izvođenjima, prekid od bar jednog endogenog mišjeg Adam6 gena smanjuje aktivnost ADAM6 i/ili fertilitet kod mužjaka miša kome nedostaje endogeni mišji Adam6 gen.

[0208] U nekim izvođenjima miša, mišja ćelija ili mišje tkivo, miš, mišja ćelija ili mišje tkivo je homozigotno ili heterozigotno za endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano.

[0209] U nekim izvođenjima miša, mišja ćelija ili mišje tkivo, miš, mišja ćelija ili mišje tkivo je homozigotno ili heterozigotno za endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano.

[0210] U nekim izvođenjima korišćenog miša, mišje ćelije ili mišjeg tkiva, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina je deletiran u celini ili delom. U nekim izvođenjima korišćenog miša, mišja ćelija ili mišje tkivo, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina je funkcionalno utišan ili na drugi način nefunkcionalan (npr., ciljanjem gena). U nekim određenim izvođenjima korišćeni miš, mišja ćelija ili mišje tkivo, miš, mišja ćelija ili mišje tkivo je homozigotno ili heterozigotno za funkcionalno utišani ili na drugi način nefunkcionalni endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano.

[0211] U nekim izvođenjima, miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano ne eksprimira detektabilno endogene λ lake lance imunoglobulina, endogene κ lake lance imunoglobulina, ili endogene k lake lance imunoglobulina i endogene κ lake lance imunoglobulina.

[0212] U nekim izvođenjima, životinja miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano ima genom koji dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) koja je u operativnoj vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom.

[0213] U nekim izvođenjima, transkripcioni kontrolni element sadrži RAG1 transkripcioni kontrolni element, RAG2 transkripcioni kontrolni element, transkripcioni kontrolni element teškog lanca imunoglobulina, transkripcioni kontrolni element κ lakog lanca imunoglobulina, transkripcioni kontrolni element λ lakog lanca imunoglobulina, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0214] U nekim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira egzogenu TdT je locirana na lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, lokusu λ lakog lanca imunoglobulina, lokusu teškog lanca imunoglobulina, RAG1 lokusu, ili RAG2 lokusu.

[0215] U nekim izvođenjima, TdT je humana TdT. U nekim izvođenjima, TdT je kratak izooblik TdT (TdTS).

[0216] Humana sekvenca lakog lanca Igλ, u nekim izvođenjima, sadrži genetički materijal iz (npr. izolovan ili dobijen iz) ili identičan lokusu lakog lanca Igλ humanog lanca, pri čemu sekvenca humanog Igλ lakog lanca kodira Ig laki lanac koji sadrži kodirani deo genetskog materijala iz lokusa lakog lanca humanog Igλ. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisana sadrži najmanje jedan segment humanog Vλ gena i najmanje jedan segment humanog Jλ gena, i jednu ili više sekvenci neophodnih za promovisanje preuređenja (npr. sekvence signala rekombinacije) pomenuti najmanje jedan segment humanog Vλ gena sa navedenim najmanje jednim humanim Jλ genetičkim segmentom da formira funkcionalno preuređenu humanu Vλ-Jλ sekvencu koja kodira humani Vλ domen. U mnogim izvođenjima, sekvenca lakog lanca humanog Igλ sadrži mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena i jednu ili više sekvenci neophodnih za promovisanje preuređivanja navedenih segmenata humanog Vλ gena sa pomenutim segmentima humanog Jλ gena. U mnogim izvođenjima, sekvenca lakog lanca humanog Igλ sadrži najmanje kodirajuće sekvence (npr. egzone) jednog ili više segmenata humanog Vλ gena i najmanje kodirajuće sekvence (npr. egzone) jednog ili više segmenata humanog Jλ gena. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisana je genomska sekvenca lokusa humanog Igλ lakog lanca (npr. izolovana i/ili klonirana iz bakterijskog veštačkog hromozoma) i sadrži više segmenata humanog Vλ gena u konfiguraciji zametne linije. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca obuhvata humane Vλ i Jλ sekvence (tj. segmente gena) u konfiguraciji zametne linije (tj., mnoštvo segmenata humanog Vλ gena razdvojenih intervenišućom DNK koja uključuje sekvence neophodne i koje promovišu rekombinaciju, i mnoštvo segmenata Jλ gena razdvojenih sa DNK koja se nalazi između koja uključuje sekvence neophodne za i koje promovišu rekombinaciju).

[0217] U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisana je modifikovana sekvenca i sadrži mnoštvo segmenata humanog Jλ gena u konfiguraciji koja je drugačija od one koja se pojavljuje u lokusu lakog lanca humanog Igλ u humanoj ćeliji. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca kako je ovde opisana je modifikovana sekvenca i sadrži mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλgena u konfiguraciji koja liči ili je slična onoj koja se pojavljuje u lokusu Igk lakog lanca divljeg-tipa mišje ili humane ćelije. U nekim izvođenjima, sekvenca lakog lanca Igλ čoveka obuhvata modifikovane humane Jλ sekvence (tj. kodirajuće sekvence segmenata humanog Jλ gena napravljene de novo sintezom DNK koja uključuje sekvence neophodne za i koje promovišu rekombinaciju sa jednim ili više segmenata humanog Vλ gena). U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca obuhvata Igk i Igλ sekvence koje se prirodno pojavljuju odvojeno u Igk i Igλ genomskim sekvencama, respektivno. U nekim određenim izvođenjima, sekvenca lakog lanca Igλ obuhvata Igk sekvencu(e), posebno Jk region (tj. sekvencu koja sadrži kodirajuće i nekodirajuće sekvence koje se pojavljuju u regionu koji sadrži više segmenata Jk gena), koji se prirodno pojavljuje u lokusu Igk lakog lanca osim što navedena Igk sekvenca sadrži kodirajuće sekvence Jλ genetičkih segmenata i Jλ 12RSS na mestu odgovarajućih kodirajućih sekvenci Jk genetičkih segmenata i Jk 23RSS, respektivno. U nekim određenim izvođenjima, sekvenca lakog lanca Igλ humanog lanca obuhvata više segmenata Jλ gena i Jλ 12RSS umesto segmenata Jk gena i Jk 23RSS sekvence Jk regiona. U različitim izvođenjima, intervenirajuća (ili intergenska) DNK koja uključuje sekvence neophodne za i koje promovišu rekombinaciju uključuje humani Igk i/ili humanu Igλ genomsku sekvencu(e).

Alternativno, u nekim izvođenjima, intervenirajuća (ili intergenska) DNK koja uključuje sekvence neophodne za i koje promovišu rekombinaciju uključuje mišju Igk i/ili mišju Igλ genomsku sekvencu(e).

[0218] U nekim određenim izvođenjima, sekvenca lakog lanca humanog Igλ je ili sadrži sekvencu koja se pojavljuje na Nacrtu. U nekim izvođenjima, sekvenca lakog lanca Igλ kodira, ili je sposobna da kodira (npr., nakon rearanžiranja segmenata humanog gena), polipeptid Vλ domena, koji se polipeptid Vλ domena pojavljuje u imunoglobulinu, posebno, imunoglobulin koji je eksprimovan humanom B ćelijom. Takođe su korišćeni miševi, embrioni, ćelije i ciljani konstrukti za dobijanje miševa, mišjih embriona i ćelija koje sadrže pomenutu sekvencu lakog lanca humanog Igλ umesto odgovarajuće sekvence lakog lanca Igk miša (npr. endogeni lokus lakog lanca miša Igk).

[0219] U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca je umetnuta na mesto odgovarajuće sekvence lakog lanca miša Igk unutar genoma zametne linije miša. U nekim izvođenjima, sekvenca lakog lanca humanog Igλ je umetnuta uzvodno od sekvence lakog lanca Igλ miša, koja sekvenca lakog lanca Igλ miša je pozicionirana na mestu sekvence lakog lanca Igk miša. U nekim izvođenjima, sekvenca lakog lanca humanog Igk je umetnuta u sredinu pomenute sekvence lakog lanca humanog Igλ (tj. između segmenata humanog Vλ i Jλ gena) tako da je navedena sekvenca lakog lanca humanog Igk suprotstavljena sekvencama humanog Igλ lakog lanca.

[0220] U nekim izvođenjima, ceo ili suštinski ceo varijabilni region lokusa lakog lanca Igκ miša je zamenjen ili supstituisan sa jednom ili više sekvenci lakog lanca humanog Igλ (kao što je ovde opisano), a pomenuti jedan ili više humanih Igλ lakih lanaca sekvence su operativno povezane sa genom konstantnog regiona lakog lanca miša. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona lakog lanca miša je obrisan ili zamenjen kod miša koji uključuje sekvencu humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano. U jednom neograničavajućem primeru, u slučaju umetanja sekvence humanog Igλ lakog lanca koja je umetnuta u lokus lakog lanca Igk miša, navedena insercija se vrši na način da se održi integritet regiona pojačivača lakog lanca miša Igκ (ili sekvence pojačivača) blizu tačke umetanja (npr., mišji Igk intronski pojačivač i/ili mišji Igκ 3' pojačivač). Dakle, takvi miševi imaju regione pojačivača Igκ lakog lanca divljeg tipa (ili sekvence pojačivača) koje su operativno povezane sa sekvencama lakog lanca Igλ (npr., segmenti humanog Vλ i Jλ gena i gen za Cλ region miša) ili operativno povezane sa humanim Igλ sekvencama lakog lanca (npr., segmenti humanog Vλ i Jλ gena, i gen humanog Cλ regiona). U nekim izvođenjima, lokus lakog lanca Igκ miša koji je izmenjen, izmešten, poremećen, izbrisan, zamenjen ili konstruisan sa jednom ili više sekvenci lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano, je mišji Igk lokus lakog lanca. U nekim izvođenjima, jedna ili više sekvenci humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano je umetnuto u jednu kopiju (tj., alel) mišjeg Igκ lokusa lakog lanca dve kopije pomenutog lokusa lakog lanca Igκ miša, što dovodi do miša koji je heterozigotan u odnosu na sekvencu lakog lanca humanog Igκ. U nekim izvođenjima miša koji je heterozigotan u odnosu na sekvencu lakog lanca Igκ humanog lanca, miš uključuje jednu ili više sekvenci lakog lanca humanog Igκ ubačenih u drugu kopiju (tj. alel) lokusa lakog lanca Igκ miša. U nekim izvođenjima, korišćen je miš koji je homozigot za lokus lakog lanca Igk koji uključuje jednu ili više sekvenci humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano.

[0221] U nekim izvođenjima, modifikovani mišji lokus lakog lanca Igk kao što je ovde opisano obuhvata segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca miša Igλ, pri čemu se navedeni gen konstantnog regiona lakog lanca miša Igλ nalazi na mestu gena konstantnog regiona lakog lanca Igκ miša koji se pojavljuje u lokusu Igκ lakog lanca divljeg tipa miša iste vrste.

[0222] U nekim izvođenjima, jedna ili više sekvenci endogenog mišjeg Igλ lakog lanca (ili njihovih delova) endogenog mišjeg lokusa lakog lanca Igλ nisu izbrisane. U nekim izvođenjima, jedna ili više sekvenci endogenog mišjeg Igλ lakog lanca (ili njihovih delova) lokusa lakog lanca endogenog mišjeg Igλ su izbrisane. U nekim izvođenjima, jedna ili više sekvenci endogenog mišjeg Igλ lakog lanca (npr. V, J i/ili C ili bilo koja njihova kombinacija) lokusa endogenog mišjeg Igλ lakog lanca je izmenjena, izmeštena, poremećena, izbrisana ili zamenjena tako da navedeni lokus lakog lanca Igλ miša je funkcionalno utišan. U nekim izvođenjima, jedna ili više sekvenci endogenog mišjeg Igλ lakog lanca (npr. V, J i/ili C ili bilo koja njihova kombinacija) lokusa endogenog mišjeg Igλ lakog lanca je izmenjena, izmeštena, poremećena, izbrisana ili zamenjena vektorom za ciljanje tako da je pomenuti lokus lakog lanca miša Igλ funkcionalno inaktiviran (tj. nije u stanju da proizvede funkcionalni laki lanac antitela koji se ekspresuje i/ili može detektovati u repertoaru antitela tog miša). Smernice za inaktivaciju endogenog mišjeg lokusa lakog lanca Igλ su date u, na primer, U.S. patentu br.9,006,511 (videti, npr., sl.2).

[0223] Takođe se pominje miš koji sadrži modifikovani lokus lakog lanca Igκ kao što je ovde opisano, koji je nasumično integrisan u njegov genom (npr., kao deo nasumično integrisane sekvence lakog lanca humanog Igλ). Prema tome, takvi miševi se mogu opisati kao oni koji imaju transgen humanog Igλ lakog lanca koji sadrži više segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca miša ili humanog Igκ i regionima pojačivača lakog lanca miša (ili sekvencama pojačivača) , tako da su navedeni segmenti humanog Vλ i Jλ gena sposobni da preurede i kodiraju Ig laki lanac antitela u ekspresiranom repertoaru životinje miša, koji Ig laki lanac uključuje humani Vλ domen i mišji Cλ domen ili koji Ig laki lanac uključuje humane Vλ i Cλ domene. Konstruisani lokus Igκ lakog lanca ili transgen kao što je ovde opisan može se detektovati korišćenjem različitih postupaka uključujući, na primer, PCR, “Western” blot, “Southern” blot, polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) ili test dobijanja ili gubitka alela. U nekim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je heterozigotan u odnosu na modifikovani lokus lakog lanca Igκ kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je hemizigot u odnosu na modifikovani lokus lakog lanca Igκ kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, miš kako je ovde opisano sadrži jednu ili više kopija projektovanog lokusa lakog lanca Igκ kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, ovde opisani miševi sadrže lokus lakog lanca Igκ kao što je prikazano na nacrtu.

[0224] Predmetni prikaz prepoznaje da će životinja miša kako je ovde opisana koristiti segmente gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca, λ lakog lanca i κ lakog lanca uključene u njen genom u svojim mehanizmima selekcije i generisanja antitela (npr. rekombinacija i somatska hipermutacija). Kao takvi, u različitim izvođenjima, varijabilni domeni humanog teškog lanca humanog imunoglobulina, λ lakog lanca i κ lakog lanca generisani od strane miševa koji su ovde opisani su kodirani segmentima gena varijabilnog regiona teškog, λ lakog lanca i κ lakog lanca koji su uključeni u njihove genoma ili njegove somatski hipermutirane varijante, respektivno.

[0225] U nekim izvođenjima, korišćen je miš čiji genom sadrži modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ, gde miš uključuje B ćeliju koja uključuje sekvencu humanog teškog varijabilnog regiona, sekvencu varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca koja je somatski hipermutirana. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog teškog varijabilnog regiona, humanog λ lakog lanca i/ili sekvence varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca prisutna u B ćeliji miša prema ovom pronalasku ima 1, 2, 3, 4, 5, ili više somatskih hipermutacija. Stručnjaci su upoznati sa postupcima za identifikaciju segmenata izvornog gena u sekvenci zrelog antitela. Na primer, dostupni su različiti alati za pomoć u ovoj analizi, kao što su, na primer, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA i At-porekla.

[0226] Predmetni prikaz uključuje, između ostalog, ćelije i tkiva miševa opisanih ovde. U nekim izvođenjima obezbeđeni su splenociti (i/ili drugo limfoidno tkivo) miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je B ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je pro-B ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je pre-B ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je nezrela B ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je zrela naivna B ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je aktivirana B ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je memorijska B ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazan je limfocit B loze od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je plazma ili plazma ćelija od miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazana je matična ćelija miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, matična ćelija je embrionalna matična ćelija. U nekim slučajevima, prikazana je zametna ćelija miša kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, zametna ćelija je oocit. U nekim slučajevima, zametna ćelija je ćelija sperme. U nekim slučajevima, ćelija sperme miša kao što je ovde opisano eksprimuje jedan ili više ADAM6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa ili njihovih funkcionalnih fragmenata. U nekim slučajevima, bilo koja ćelija ili tkivo miša kao što je ovde opisano može biti izolovano. U nekim slučajevima, prikazana je izolovana ćelija i/ili izolovano tkivo miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, prikazan je hibridom, pri čemu je hibridom napravljen sa B ćelijom miša kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, hibridom se pravi sa B ćelijom miša koji je imunizovan antigenom od interesa. U nekim slučajevima, hibridom se pravi sa B ćelijom miša koja eksprimuje antitelo koje se vezuje (npr., specifično se vezuje) za epitop na antigenu od interesa.

[0227] Bilo koji od miševa kako je ovde opisano može biti imunizovan sa jednim ili više antigena od interesa pod uslovima i tokom vremena dovoljnih da miš razvije imuni odgovor na pomenuti jedan ili više antigena od interesa. Stručnjaci su upoznati sa postupcima za imunizaciju miševa. Primer, neograničavajući postupak za imunizaciju miševa može se naći u US 2007/0280945A1.

[0228] Predmetni pronalazak obezbeđuje, između ostalog, imunizovane miševe kako je ovde opisano, i ćelije i tkiva izolovane iz istih. U nekim izvođenjima, miš opisan ovde proizvodi populaciju B ćelija kao odgovor na imunizaciju antigenom koji uključuje jedan ili više epitopa. U nekim izvođenjima, miš proizvodi populaciju B ćelija koje eksprimiraju antitela koja se vezuju (npr., specifično se vezuju) za jedan ili više epitopa antigena od interesa. U nekim izvođenjima, antitela eksprimirana populacijom B ćelija proizvedenih kao odgovor na antigen uključuju teški lanac koji ima varijabilni domen humanog teškog lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona teškog lanca čoveka i/ili lambda laki lanac koji ima humani lambda laki varijabilni domen lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, antitela eksprimirana populacijom B ćelija proizvedenih kao odgovor na antigen uključuju (i) teški lanac koji ima varijabilni domen teškog lanca čoveka kodiran sekvencom varijabilnog regiona teškog lanca čoveka, (ii) lambda laki lanac koji ima varijabilni domen humanog lambda lakog lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisano, (iii) kapa laki lanac koji ima varijabilni domen humanog kapa lakog lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca humanog lanca kao što je ovde opisano, ili (iv) bilo koja njihova kombinacija.

[0229] U nekim izvođenjima, miš proizvodi populaciju B ćelija koje eksprimuju antitela koja se vezuju za jedan ili više epitopa antigena od interesa, pri čemu antitela eksprimirana od strane populacije B ćelija proizvedenih kao odgovor na antigen uključuju: (i) teški lanac koji ima varijabilni domen humanog teškog lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona humanog teškog lanca, (ii) lambda laki lanac koji ima varijabilni domen humanog lambda lakog lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca kao što je ovde opisano, (iii ) kapa laki lanac koji ima varijabilni domen humanog kapa lakog lanca kodiran sekvencom varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca kao što je ovde opisano, ili (iv) bilo koja njihova kombinacija. U nekim izvođenjima, sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvenca varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca, kao što je ovde opisano, je somatski hipermutirana. U nekim izvođenjima, najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90% B ćelija u populaciji B ćelija proizvedenih kao odgovor na antigen uključuje sekvencu varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvencu varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca i/ili humanu k sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je somatski hipermutirana.

[0230] U nekim izvođenjima, miševi ovde korišćeni, u svom genomu zametne linije, (1) uključuju modifikovani endogeni imunoglobulin κ lokus lakog lanca koji sadrži (a) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena, (b) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i (c) mišji Cλ gen, gde su jedan ili više segmenata humanog Vλ gena i jedan ili više segmenata humanog Jλ gena operativno povezani sa mišjim Cλ genom, (2) nedostaje mišji Cκ gen na konstruisanom endogenom imunoglobulinu κ lokus, i (3) uključuju modifikovani endogeni imunoglobulin κ lokus lakog lanca koji sadrži (a) jedan ili više segmenata humanog VK gena, (b) jedan ili više segmenata humanog Jκ gena, i (c) Cκ gen, gde jedan ili više segmenata humanog Vκ gena i jedan ili više segmenata humanog Jκ gena su operativno povezani sa Cκ genom. U nekim izvođenjima, procenat lakih lanaca u splenocitima (npr. kako je otkriveno ili primećeno, npr. protočnom citometrijom (videti, npr., Primer 3)) takvih miševa koji su λ laki lanci je najmanje 35%, najmanje 40 %, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, ili najmanje 75%. U nekim izvođenjima, procenat lakih lanaca u splenocitima (npr. kako je otkriveno ili primećeno, npr. protočnom citometrijom (videti, na primer, Primer 3)) takvih miševa koji su λ laki lanci je između 35-80%, između 35 -75%, između 40-80%, između 40-75%, između 50-80%, između 50-75%, između 55-80%, između 55-75%, između 60-80%, ili između 60- 75%. U nekim izvođenjima, procenat lakih lanaca u splenocitima (npr. kako je otkriveno ili primećeno, npr. protočnom citometrijom (videti, npr., Primer 3)) takvih miševa koji su κ laki lanci je najviše 65%, na najviše 60%, najviše 55%, najviše 50%, najviše 45%, najviše 40%, ili najviše 35%. U nekim izvođenjima, procenat lakih lanaca u splenocitima (npr. kako je otkriveno ili primećeno, npr. protočnom citometrijom (videti, na primer, Primer 3)) takvih miševa koji su κ laki lanci je između 20-65%, između 25 -65%, između 20-60%, između 25-60%, između 20-55%, između 25-55%, između 20-50%, između 25-50%, između 20-45%, između 25-45 %, između 20-40% ili između 25-40%. U nekim izvođenjima, odnos κ: λ lakih lanaca u splenocitima (npr. kako je otkriveno ili primećeno, npr. protočnom citometrijom (videti, npr., Primer 3)) takvih miševa je između 0,5:1 i 3:1, 0,65 :1 i 3:1, između 0,8:1 i 3:1, između 1:1 i 3:1, između 1,2:1 i 3:1, između 1:1 i 2,3:1, između 1,1:1 i 1,8: 1, između 1,2:1 i 2,3:1, ili između 1,2:1 i 1,8:1.

Postupci pravljenja miševa

[0231] Kompozicije i postupci za pravljenje miševa čiji genom zametne linije obuhvata modifikovani lokus Igk lakog lanca koji uključuje segmente humanog Vλ i Vλ gena umesto sekvenci nehumanih Igκ lakog lanca, uključujući sekvence koje kodiraju humani Igλ laki lanac koje uključuju specifične polimorfne prikazani su oblici humanih Vλ i Vλ segmenata (npr. specifični V i/ili J aleli ili varijante), uključujući kompozicije i postupke za pravljenje miševa koji eksprimiraju antitela koja sadrže Igλ lake lance koji sadrže humane varijabilne regione i nehumane ili humane konstantne regione , sastavljene od lokusa Igκ lakog lanca koji sadrži segmente humanog Vλ i Vλ gena operativno povezane sa genom konstantnog regiona lakog lanca miša, koji mišji gen konstantnog regiona lakog lanca Igλ se nalazi na mestu gena konstantnog regiona lakog lanca miša Igκ koji se normalno pojavljuje u lokusu lakog lanca Igκ miša divljeg tipa. U nekim izvođenjima, takođe su prikazane kompozicije i postupci za pravljenje miševa koji eksprimiraju takva antitela pod kontrolom endogenog(ih) pojačivača(a) Igκ i/ili endogene regulatorne sekvence(e) Igκ. U nekim izvođenjima, takođe su prikazane kompozicije i postupci za pravljenje koje eksprimiraju takva antitela pod kontrolom heterolognog(ih) pojačivača(a) Igκ i/ili heterologne Igκ regulatorne sekvenca(e).

[0232] Ovde opisani postupci uključuju umetanje humanih Vλ i Jλ sekvenci koje kodiraju humane Vλ domene uzvodno od gena konstantnog regiona lakog lanca miša, čiji gen konstantnog regiona lakog lanca miša se nalazi na mestu gena konstantnog regiona lakog lanca miša Igκ koji normalno se pojavljuje u lokusu lakog lanca Igκ miša divljeg tipa, tako da se eksprimuje antitelo, koje antitelo karakteriše prisustvo lakog lanca koji sadrži humani Vλ domen i mišji Cλ domen ili prisustvo lakog lanca koji sadrži humani Vλ i jedan ili više mišjih Cλ domena, a eksprimiran je i na površini B ćelija i u krvnom serumu miša.

[0233] U nekim izvođenjima, postupci uključuju umetanje genetičkog materijala koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena u Igκ lokusu lakog lanca (npr. divlji tip, modifikovan ili konstruisan lokus Igκ lakog lanca). U nekim određenim izvođenjima, postupci uključuju umetanje genetičkog materijala koji sadrži segmente humanog Jλ gena u lokus lakog lanca Igκ modifikovanog ili projektovanog soja. U nekim izvođenjima, genetički materijal koji sadrži sekvence lakog lanca humanog Igλ može biti konstruisan ili genomski (npr., kloniran iz bakterijskog veštačkog hromozoma). U nekim izvođenjima, genetički materijal koji sadrži sekvence lakog lanca Igλ čoveka može biti dizajniran iz objavljenih izvora i/ili bakterijskih veštačkih hromozoma tako da pomenuti genetički materijal sadrži humane Vλ i Jλ segmente u orijentaciji koja je drugačija od one koja se pojavljuje u lokusu lakog lanca humanog Igλ ipak pomenuti genetički materijal još uvek sadrži sekvence koje podržavaju preuređenje pomenutih humanih Vλ i Jλ segmenata da bi se kodirao funkcionalni humani Vλ domen Ig lakog lanca. Da damo samo jedan primer, genetički materijal koji odgovara većem broju segmenata humanog Vλ i Jλ gena može biti dizajniran korišćenjem smernica koje su ovde date da se konstruiše sekvenca lakog lanca Igλ čoveka koja sadrži humane Vλ i Jλ segmente u redosledu i/ili rasporedu koji je drugačiji od onog koji se pojavljuje u lokusu lakog lanca Igλ u humanoj ćeliji (npr., raspored koji liči ili je sličan lokusu lakog lanca Igκ čoveka ili miša, kao što je serija V genetičkih segmenata, praćenih 3' intervenirajućom DNK, a zatim 3' nizom J genetičkih segmenata). U takvom primeru, genetički sadržaj segmenata humanog Vλ i Jλ gena bio bi ekvivalentan odgovarajućim segmentima u humanoj ćeliji, međutim, redosled i raspored bi bili drugačiji. Kada se konstruiše modifikovani lokus Igk lakog lanca za generisanje miša kao što je ovde opisano, potrebne sekvence signala rekombinacije mogu biti konfigurisane tako da segmenti humanog V i J gena mogu ispravno preurediti i formirati funkcionalni humani Vλ domen. Smernice za konfiguraciju zametne linije humanih Vλ i Jλ genetičkih segmenata i sekvenci neophodnih za pravilnu rekombinaciju mogu se naći u, na primer, Molecular Biology of B Cellls, London: Elsevier Academic Press, 2004, Ed. Honjo, T., Alt, F.V., Neuberger, M. Poglavlja 4 (str.37-59) i 5 (61-82).

[0234] U nekim izvođenjima, postupci uključuju višestruka umetanja u jedan klon ES ćelije. U nekim izvođenjima, postupci uključuju sekvencijalne insercije napravljene u uzastopnim klonovima ES ćelija. U nekim izvođenjima, postupci uključuju jedno umetanje napravljeno u modifikovanom klonu ES ćelije.

[0235] U nekim izvođenjima, postupci uključuju umetanje DNK uzvodno od mišjeg Cλ1 gena (ili humanog Cλ2 gena) tako da je pomenuta DNK insercija(e) operativno povezana sa navedenim mišjim Cλ1 genom (ili humanim Cλ2 genom), što Insercije DNK obuhvataju segmente humanog Vλ gena Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ili bilo koja njihova kombinacija, i segmenti humanog Jλ gena Jλ1, Jλ2 , Jλ3, Jλ6, Jλ7, ili bilo koja njihova kombinacija, i koji mišji Cλ1 gen (ili humani Cλ2 gen) se nalazi na mestu mišjeg Ck gena endogenog Igk lokusa lakog lanca.

[0236] U nekim izvođenjima, postupci uključuju umetanje DNK nizvodno od segmenta humanog Vλ3-1 gena i uzvodno od nehumanog regiona intronskog pojačivača (ili sekvence pojačivača) projektovanog lokusa Igκ lakog lanca, tako da je navedeno Insercije DNK su operativno povezane sa mišjim Cλ1 genom (ili humanim Cλ2 genom), čija DNK insercija(e) sadrži genomsku sekvencu humanog Igκ koja se prirodno pojavljuje između segmenta humanog Vκ 4-1 gena i segmenta humanog Jκ1 gena lokus humanog Igκ lakog lanca i jedan ili više segmenata humanog Jλ gena (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam), čiji se mišji Cλ1 gen (ili humani Cλ2 gen) nalazi na mestu mišjeg Cκ gena endogenog ne-humanog Igκ lokusa lakog lanca. U nekim određenim izvođenjima, postupci uključuju umetanje(e) DNK između humanog segmenta gena Vλ3-1 i introničnog pojačivača Igκ koji nije humani, čije umetanje(e) DNK uključuje humanu Vκ-Jκ sekvencu koja se prirodno pojavljuje između humanog Vκ4-1 i Segmenti gena Jκ1 lokusa lakog lanca humanog Igκ i pet segmenata humanog Jλ gena (npr. Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 i Jλ7). U različitim izvođenjima, DNK insercija(e) uključujući segmente humanog Jλ gena obuhvata humanu Jκ genomsku DNK sa kodirajućim sekvencama segmenata humanog Jλ gena i humanog Jλ 12RSS.

[0237] Umetanje dodatnih humanih Vλ i Jλ segmenata može se postići upotrebom postupaka opisanih ovde da bi se dodatno dopunio raznovrsnost projektovanog Igλ lokusa lakog lanca. Na primer, u nekim izvođenjima, postupci mogu uključiti umetanje oko 270 kb DNK uzvodno od mišjeg Cλ1 gena (ili humanog Cλ2 gena) projektovanog lokusa Igκ lakog lanca tako da je navedena DNK operativno povezana sa navedenim mišjim Cλ1 genom (ili humanim Cλ2 gen), čija DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 i Vλl4-69. U takvim izvođenjima, pomenuta DNK je umetnuta uzvodno od segmenta humanog Vλ5-52 gena koji je operativno vezan za mišji Cλ1 gen (ili human Cλ2 gen) projektovanog lokusa Igκ lakog lanca, koji DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ10-54 Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 i Vλ4-69. U nekim određenim izvođenjima, pomenuta DNK uključuje humani VpreB gen. Dodatni segmenti humanog Vλ gena opisani gore mogu biti klonirani direktno iz komercijalno dostupnih BAC klonova i raspoređeni u manji fragment DNK korišćenjem rekombinantnih tehnika koje su ovde opisane ili na drugi način poznate u tehnici. Alternativno, dodatni segmenti humanog Vλ gena opisani iznad mogu se sintetizovati kao modifikovani DNK fragment i dodati u modifikovani Igκ lokus lakog lanca kao što je gore opisano korišćenjem tehnika molekularne biologije poznatih u tehnici. Slično, dodatni segmenti humanog Jλ gena mogu se dobiti iz komercijalno dostupnih BAC klonova ili sintetizovani direktno iz objavljenih sekvenci. Primerna ilustracija koja prikazuje modifikovani lokus Igκ lakog lanca miševa kako je ovde opisano je dat na Slici 2B ili 4B.

[0238] Tamo gde je prikladno, sekvenca lakog lanca humanog Igλ (tj. sekvenca koja sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena) koja kodira humani Vλ domen može se posebno modifikovati da uključi kodone koji su optimizovani za ekspresiju kod miša (npr., videti U.S. patenti br. 5,670,356 i 5,874,304). Kodonom optimizovane sekvence su modifikovane sekvence, i poželjno je da kodiraju identičan polipeptid (ili biološki aktivan fragment polipeptida pune dužine koji ima suštinski istu aktivnost kao polipeptid pune dužine) kodiran roditeljskim polinukleotidom koji nije optimizovan za kodon. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog Igλ lakog lanca koja kodira humani Vλ domen može odvojeno da uključi izmenjenu sekvencu da bi se optimizovala upotreba kodona za određeni tip ćelije (npr., ćelija miša). Na primer, kodoni svake nukleotidne sekvence koji se ubacuju u genom miša mogu biti optimizovani za ekspresiju u ćeliji miša. Takva sekvenca se može opisati kao kodon-optimizovana sekvenca.

[0239] Ubacivanje nukleotidnih sekvenci koje kodiraju humane Vλ domene koristi minimalnu modifikaciju genoma zametne linije miša kao što je ovde opisano i rezultira ekspresijom antitela koja sadrže lake lance koji imaju humane Vλ domene, a koji su humani Vλ domeni eksprimirani iz endogenog modifikovanog lokusa Igκ lakih lanaca. Postupci za generisanje modifikovanih miševa, uključujući nokaute i sa ubačenim genom, su poznati u oblasti tehnike (videti, na primer, Gene Targeting: A Practical Approach, Joiner, ed., Okford Universiti Press, Inc., 2000). Na primer, generisanje genetički modifikovanih miševa može opciono uključivati poremećaj genetičkih lokusa jednog ili više endogenih mišjih gena (ili genetičkih segmenata) i uvođenje jednog ili više heterolognih gena (ili segmenata gena ili nukleotidnih sekvenci) u genom miša, u nekim izvođenjima, na istoj lokaciji kao endogeni mišji gen (ili segmenti gena). U nekim izvođenjima, nukleotidne sekvence koje kodiraju humane Vλ domene se uvode uzvodno od gena konstantnog regiona lakog lanca miša ili humanog Igλ nasumično ubačenog inženjeringa lakog lanca transgena u genom zametne linije miša. U nekim izvođenjima, nukleotidne sekvence koje kodiraju humane Vλ domene se uvode uzvodno od gena konstantnog regiona lakog lanca miša endogenog lokusa lakog lanca Igκ u genomu zametne linije miša; u nekim određenim izvođenjima, endogeni lokus lakog lanca Igκ je izmenjen, modifikovan ili projektovan tako da sadrži segmente humanog Igλ gena (npr., humani V i J) koji su operativno povezani sa mišjim Cλ1 genom ili operativno povezani sa humanim Cλ2 genom.

[0240] Šematske ilustracije (ne u razmeri) primera postupaka za konstruisanje modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ kao što je ovde opisano date su na slikama 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4A i 4B. Konkretno, slike 1A i 1B predstavljaju primer strategije za konstrukciju modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ koji se karakteriše umetanjem nukleotidnih sekvenci koje sadrže mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena. Kao što je ilustrovano na slikama 1A i 1B, fragment DNK koji sadrži humani Vκ -Jκ intergenski region (videti US patent br. 9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,035,128, 1, 1, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 7, 6, 6, 6, 6, 6, 5, 6, 6, 6, 6, 6, 126 (npr., humani Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 i Jλ7) je operativno povezan sa mišjim Igκ pojačivačem introna (ili sekvencom pojačivača) kroz niz koraka koristeći različite tehnike molekularne biologije opisane u Primeru 1. Ovaj modifikovani fragment je takođe projektovan da sadrži konstantni region lakog lanca miša Igl koji je operativno vezan za segmente humanog Jλ gena. Selekcione kasete (npr. Neomicin i Higromicin) su uključene u ciljani vektor da bi se omogućila selekcija pozitivnih klonova u bakterijama i ćelijama sisara (npr. embrionalne matične ćelije). Kao što je ilustrovano, gen otpornosti na neomicin je okružen rekombinacionim mestima specifičnim za lox2372 (lox) i pozicioniran između humanog Vκ-Jκ regiona i skupa segmenata humanog Jλ gena, dok je kaseta za selekciju higromicina okružena rekombinacionim mestima specifičnim za loxP mesto i pozicioniran 3' gena konstantnog regiona lakog lanca miša (mCl1). Fragment DNK se zatim kombinuje sa fragmentom DNK koji sadrži pojačivač lakog lanca Igκ miša 3’ da bi se stvorio konačni ciljani vektor (slika 1B). Dobijeni ciljani vektor (konstrukt G) je linearizovan i elektroporisan u ćelije embrionalnog matičnog (ES) miša da bi se stvorio miš čiji genom zametne linije sadrži modifikovani Igκ lokus lakog lanca. Kao što je opisano u odeljku sa primerima u nastavku, mišje ES ćelije korišćene u elektroporaciji ciljanog vektora sadržale su modifikovani lokus Igκ lakog lanca kao što je prethodno opisano u US patentima br. Homologna rekombinacija sa vektorom za ciljanje kao što je prikazano na Slici 3 rezultira konstruisanim lokusom lakog lanca Igκ koji karakteriše mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa mišjim Cλ1 genom, koji mišji Cλ1 gen se nalazi umesto mišjeg Cκ gena koji se prirodno pojavljuje u lokusu lakog lanca Igκ divljeg tipa. Humani segmenti Jλ gena su jedinstveno modifikovani u sekvenci koja se prirodno pojavljuje u genomskom humanom Jκ regionu, ali ipak ima humane Jλ kodirajuće sekvence i pridružene 12RSS umesto sekvenci kodiranja kod čoveka Jκ i pridruženog 23RSS. Pozitivni klonovi ES ćelija miša su potvrđeni korišćenjem postupka skrininga koji su ovde opisani i/ili poznati u oblasti tehnike. Bilo koja preostala selekciona kaseta se može izbrisati po želji putem delecije posredovane rekombinazom (videti Primer 2).

[0241] Takođe se pominje vektor za ciljanje gde se humani Cλ gen koristi u vektoru za ciljanje umesto mišjeg Cλ gena. Da damo samo jedan primer, slika 3 ilustruje ciljani vektor koji je konstruisan na sličan način kao što je gore opisano, osim što je sekvenca koja kodira humani Cλ2 gen modifikovana u vektor za ciljanje i u operativnoj vezi sa pet segmenata humanog Jλ gena. Korišćenje takvog pristupa pruža dodatnu korist u razvoju terapeutika humanih antitela jer se DNK koja kodira varijabilne i konstantne regione lakih lanaca može izolovati zajedno, čime se eliminiše svaki sledeći korak kloniranja koji se povezuje sa konstantnim regionom humanog lakog lanca za pripremu potpuno humanog antitela.

[0242] Ciljni vektori za konstruisanje modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ kao što je ovde opisano mogu biti inkorporirani u genom zametne linije ne-humane ćelije (npr., matična ćelija embriona miša). U nekim izvođenjima, ciljani vektori kao što su ovde opisani su ugrađeni u lokus Igκ lakog lanca divljeg tipa u genomu zametne linije nehumane ćelije koja dalje sadrži humanu VH, DHi JHgenomsku DNK (npr. koja sadrži veći broj humanih VH, DHi JHsegmenata gena) koji su operativno povezani sa jednim ili više gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina (npr., videti U.S. patent br. 8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,323). U nekim izvođenjima, ciljani vektori kao što su ovde opisani su ugrađeni u modifikovani ili konstruisani lokus lakog lanca imunoglobulina κ u genomu zametne linije nehumane ćelije koja dalje sadrži humanu VH, DHi JHgenomsku DNK (npr. koja sadrži veći broj humanih VH, DHi JHsegmenti gena) operativno povezani sa jednim ili više zenoglobulinskih konstantnih gena (npr. Vidi američke patentne br. 8,502,018, 8,642,835, 8,697.940, 8,791,323, 9,006,511, 9,012,735, 9,029,682, 9,035,128, 9,066,502, 9,029,662 i 9,163,092).

[0243] Vektor za ciljanje se uvodi u mišje (npr. mišje) embrionalne matične ćelije elektroporacijom tako da sekvenca sadržana u vektoru za ciljanje rezultira kapacitetom mišje ćelije ili miša koji eksprimira antitela koja imaju lake lance koji uključuju humane Vλ domene i mišje Cλ domene, i koji laki lanci su eksprimirani iz endogenog konstruisanog imunoglobulinskog κ lokusa lakog lanca. Kao što je ovde opisano, genetički modifikovan miš se generiše tamo gde je kreiran lokus lakog lanca imunoglobulina κ u genomu zametne linije miša (npr., endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji sadrži sekvencu lakog lanca Igλ humanog lanca (tj. mnoštvo). segmenata humanih Vλ i Jλ gena) operativno vezan za mišji Cλ gen umesto endogenog mišjeg Cκ gena). Antitela se eksprimiraju na površini mišjih B ćelija i u serumu pomenutog miša, čija antitela karakterišu laki lanci koji imaju humane Vλ domene i mišje Cλ domene. Kada lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina κ u genomu zametne linije miša nije ciljan vektorom za ciljanje, modifikovani transgen κ lakog lanca imunoglobulina se poželjno ubacuje na lokaciju koja nije na lokaciji endogenog mišjeg imunoglobulina κ lakog lanca (npr. nasumično ubačen transgen).

[0244] Kreiranje projektovanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina kod miša kao što je gore opisano obezbeđuje projektovani soj miša koji proizvodi antitela koja uključuju λ lake lance imunoglobulina eksprimirane iz tako projektovanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina koji ima humani Vλ domen i mišji Cλ domen. Uz pomoć prisustva projektovanog lokusa teškog lanca imunoglobulina koji uključuje mnoštvo segmenata humanog VH, DHi JHgena koji su operativno povezani sa genima konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, modifikovani soj miša koji proizvodi antitela i komponente antitela za razvoj terapeutika zasnovanih na humanim antitelima je dobijen. Tako je dobijen jedan modifikovani soj miša koji ima kapacitet da obezbedi alternativni in vivo sistem za iskorišćavanje humanih Vλ domena za razvoj novih lekova zasnovanih na antitelima za lečenje humanih bolesti.

[0245] U nekim slučajevima, prikazan je postupak dobijanja miša čiji genom zametne linije sadrži modifikovani lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina κ, pri čemu postupak obuhvata (a) uvođenje fragmenta DNK u matičnu ćeliju miša embriona, pomenuti fragment DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja uključuje (i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena, (ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i (iii) mišji Cλ gen, pri čemu su (i)-(iii) operativno povezani, i gde nukleotidna sekvenca dalje sadrži sekvencu lakog lanca imunoglobulina κ između (i) i (ii), (b) dobijanje embrionalne matične ćelije miša generisane u (a); i (c) stvaranje miša koristeći matičnu ćeliju miša iz (b).

[0246] U nekim slučajevima, prikazan je postupak dobijanja miša čiji genom zametne linije sadrži modifikovani lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina κ, pri čemu postupak obuhvata (a) uvođenje fragmenta DNK u neljudsku embrionalnu matičnu ćeliju, rekao je DNK fragment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja uključuje jedan ili više segmenata humanog Jλ gena, jedan ili više pojačivača lakog lanca imunoglobulina κ i Cλ gen miša, čiji su segmenti humanog Jλ gena operativno povezani sa navedenim jednim ili više mišjih imunoglobulina k pojačivače lakog lanca i pomenuti mišji Cλ gen, (b) dobijanje embrionalne matične ćelije miša generisane u (a); i (c) stvaranje miša koristeći matičnu ćeliju miša iz (b).

[0247] U nekim slučajevima, postupak pravljenja miša čiji genom zametne linije sadrži modifikovani lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina κ, koji je konstruisao lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina k obuhvata umetanje jednog ili više segmenata humanog Vλ gena, jednog ili više segmenata humanog Jλ gena i mišjeg Cλ gena, koji su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani sa navedenim Cλ genom miša, i gde je mišji Cλ gen umetnut na mesto mišjeg Cκ gena na lokusu endogenog imunoglobulina κ, je prikazan, postupak koji se sastoji od modifikacije genoma zametne linije miša tako da sadrži modifikovani endogeni κ lokus lakog lanca imunoglobulina koji uključuje umetanje jednog ili više segmenata humanog Vλ gena, jednog ili više segmenata humanog Jλ gena i mišjeg Cλ gena, koji su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani sa navedenim mišjim Cλ genom, i koji mišji Cλ gen je umetnut na mesto mišjeg Cκ gena na lokus endogenog imunoglobulina κ.

[0248] U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje najmanje 24, najmanje 34, najmanje 52, najmanje 61, ili najmanje 70 segmenata humanog Vλ gena. U nekim izvođenjima postupka pravljenja miša, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje 39 segmenata humanog Vλ gena. U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, jedan ili više segmenata humanog Vl gena uključuje humani Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ223, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ili bilo koji njihova kombinacija. U nekim određenim izvođenjima, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje pored relevantnih segmenata humanog Vλ gena u endogenom lokusu humanog λ lakog lanca.

[0249] U nekim slučajevima postupka dobijanja miša, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena uključuje najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4 ili najmanje 5 segmenata humanog Jλ gena. U nekim slučajevima postupka pravljenja miša, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena uključuje 5 segmenata humanog Jλ gena. U nekim slučajevima postupka pravljenja miša, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena obuhvata humani Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim određenim slučajevima, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena uključuje humanu nekodirajuću DNK, u celini ili delimično, koja se prirodno pojavljuje pored relevantnih segmenata humanog Jλ gena u endogenom lokusu λ lakog lanca čoveka. U nekim slučajevima, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje pored humanog Jκ1-Jκ5 u endogenom lokusu κ lakog lanca čoveka.

[0250] U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, fragment DNK uključuje intergensku DNK koja sadrži nekodirajuću imunoglobulinsku DNK (npr. DNK koja se prirodno pojavljuje između kodirajuće sekvence dva segmenta V gena, V i J segment gena ili između dva segmenta J gena). U mnogim slučajevima, navedena nekodirajuća DNK imunoglobulina je nekodirajuća DNK lakog lanca imunoglobulina (npr. humana ili mišja). U nekim slučajevima, nekodirajuća DNK lakog lanca imunoglobulina je DNK lakog lanca imunoglobulina κ, DNK lakog lanca imunoglobulina λ ili njihove kombinacije.

[0251] U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, fragment DNK dalje sadrži jedan ili više selekcionih markera. U nekim slučajevima postupka dobijanja miša, fragment DNK dalje sadrži jedno ili više mesta rekombinacije specifičnih za mesto. U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, fragment DNK dalje sadrži jedan ili više skupova rekombinacionih mesta specifičnih za mesto koje se rekombinuju sa istom rekombinazom. U nekim slučajevima postupaka dobijanja miša, fragment DNK dalje sadrži jedan ili više niza rekombinacionih mesta specifičnih za lokaciju koja se rekombinuju sa različitim rekombinazama.

[0252] U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, DNK fragment sadrži projektovanu sekvencu koja uključuje sekvencu κ lakog lanca imunoglobulina i sekvencu λ lakog lanca imunoglobulina zajedno u kontinuiranoj sekvenci. U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, fragment DNK sadrži projektovanu sekvencu koja uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina κ i sekvencu lakog lanca imunoglobulina zajedno u jednoj sekvenci, ali je prekinuta sekvencom koja nije imunoglobulina (npr. signal rekombinacije). sekvenca, gen rezistencije i njihove kombinacije). U nekim određenim slučajevima postupka za dobijanje miša, modifikovana sekvenca uključuje delove Jκ regiona i delove Jλ regiona. U nekim slučajevima, modifikovana sekvenca uključuje delove humanog Jκ regiona i delove humanog Jλ regiona. U nekim određenim izvođenjima, delovi humanog Jk regiona uključuju nekodirajuće sekvence humanog Jκ regiona koje se prirodno pojavljuju u lokusu lakog lanca humanog imunoglobulina κ humane ćelije. U nekim određenim izvođenjima, delovi humanog Jλ regiona uključuju kodirajuće sekvence i rekombinacione signalne sekvence (RSS) jednog ili više segmenata humanog Jλ gena. U nekim određenim izvođenjima postupka dobijanja miša, fragment DNK sadrži modifikovanu sekvencu koja se u nekim izvođenjima karakteriše prisustvom kodirajućih sekvenci i rekombinacionih signalnih sekvenci (RSS) jednog ili više segmenata humanog Jλ gena koji poziciono zamenjuju ili supstutuišu (tj. pozicionirane umesto) odgovarajućih kodirajućih sekvenci i rekombinacionih signalnih sekvenci (RSS) segmenata humanog Jκ gena tako da navedene kodirajuće sekvence i rekombinacione signalne sekvence (RSS) pomenutog jednog ili više segmenata humanog Jλ gena budu unutar, u susedstvu, u blizini ili pored navedenih nekodirajućih sekvenci pomenutog jednog ili više segmenata humanog Jk gena.

[0253] U nekim slučajevima postupak dobijanja miša, fragment DNK se uvodi u nehumanu embrionalnu matičnu ćeliju čiji genom zametne linije sadrži jedan ili više modifikovanih imunoglobulinskih lokusa (npr., teški lanac imunoglobulina, laki lanac imunoglobulina κ, imunoglobulin λ laki lanac i njihove kombinacije). U nekim određenim slučajevima, modifikovani lokusi imunoglobulina su endogeni konstruisani imunoglobulinski lokusi.

[0254] U nekim slučajevima postupka dobijanja miša, fragment DNK se uvodi u embrionalnu matičnu ćeliju miša čiji genom zametne linije obuhvata endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina koji uključuje umetanje jednog ili više segmenata humanog VHgena, jednog ili više humanih Segmenti DHgena i jedan ili više segmenata humanog JHgena, koji su segmenti humanog VH, DHi JHgena operativno povezani sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina koji nije humani.

[0255] U nekim slučajevima postupka dobijanja miša, fragment DNK se uvodi u embrionalnu matičnu ćeliju miša čiji genom zametne linije obuhvata endogeni imunoglobulinski k lokus lakog lanca koji obuhvata umetanje jednog ili više humanih Vλ i jednog ili više humanih Jλ segmenti gena, čiji su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca miša imunoglobulina κ. U nekim određenim slučajevima postupka dobijanja miša, fragment DNK se uvodi u embrionalnu matičnu ćeliju miša čiji genom zametne linije obuhvata endogeni imunoglobulinski k lokus lakog lanca koji uključuje umetanje jednog ili više humanih Vλ i jednog ili više humanih Jλ genskih segmenata i sekvenca lakog lanca humanog imunoglobulina pozicionirana, postavljena ili locirana između pomenutog jednog ili više segmenata humanog Vλ gena i pomenutog jednog ili više segmenata humanog Jλ gena, pri čemu su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani sa genom konstantnog regiona mišjeg κ lakog lanca imunoglobulina.

[0256] U nekim slučajevima postupka dobijanja miša, modifikovanje genoma zametne linije miša tako da sadrži modifikovani imunoglobulinski κ lokus lakog lanca se izvodi u embrionalnoj matičnoj ćeliji miša čiji genom zametne linije sadrži endogeni imunoglobulinski teški lanac lokus koji sadrži umetanje jednog ili više segmenata humanog VHgena, jednog ili više segmenata humanog DHgena i jednog ili više segmenata humanog JHgena, pri čemu su segmenti humanog VH, DHi JHgena operativno povezani sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina koji nije humani.

[0257] U nekim slučajevima postupka dobijanja miša, modifikacija genoma zametne linije miša tako da sadrži modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ se izvodi u matičnoj ćeliji embriona miša čiji genom zametne linije sadrži endogeni svetlosni imunoglobulin k lokus lanca koji obuhvata umetanje jednog ili više humanih Vλ i jednog ili više segmenata humanog Jλ gena, pri čemu su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša. U nekim izvođenjima postupka za dobijanje miša, modifikacija zametnog genoma miša tako da sadrži modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ se izvodi u embrionalnoj matičnoj ćeliji miša čiji zametni genom sadrži endogeni imunoglobulinski lokus κ lakog lanca koji sadrži jednog ili više humanih Vλ i jednog ili više segmenata humanog J gena, i sekvence lakog lanca imunoglobulina κ pozicionirane, postavljene ili locirane između pomenutog jednog ili više segmenata humanog Vλ gena i pomenutog jednog ili više segmenata humanog Jλ gena, gde su humani Vλ i segmenti gena Jλ su operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca miša imunoglobulina κ.

[0258] U nekim slučajevima postupka za dobijanje miša, umetanje jednog ili više segmenata humanog VHgena, jednog ili više segmenata humanog DHgena i jednog ili više segmenata humanog JHgena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje pored segmenata humanog VHgena, humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje pored segmenata humanog DHgena i humanu nekodirajuća DNK koja se prirodno pojavljuje pored segmenata humanog JHgena u endogenom lokusu humanog imunoglobulina.

[0259] Takođe je obezbeđen je miš napravljen, generisan, proizveden, dobijen ili koji se može dobiti postupkom kako je ovde opisano.

[0260] U nekim izvođenjima, genom miša kako je ovde opisan dalje sadrži jedan ili više varijabilnih regiona teškog humanog imunoglobulina kao što je opisano u US patentima br.8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,32. Alternativno, konstruisani lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano može da se modifikuje u embrionalnu matičnu ćeliju drugačijeg modifikovanog soja kao što je, na primer, VELOCIMMUNE® soj (videti, npr., U.S. patent br.8,502,083,6). Homozigotnost modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ, kao što je ovde opisano, može se naknadno postići uzgojem. Alternativno, u slučaju nasumično ubačenog konstruisanog transgena lakog lanca imunoglobulina κ (opisano gore), sojevi miša se mogu odabrati na osnovu, između ostalog, ekspresije humanih Vλ domena iz transgena. U nekim izvođenjima, VELOCIMMUNE® miš može biti VELOCIMMUNE® 1 (VI-1) miš, koji uključuje osamnaest segmenata humanog VHgena, sve segmente humanog DHgena i sve segmente gena JH. VI-1 miš takođe može uključiti šesnaest segmenata humanog Vκ gena i sve segmente humanog Jk gena. U nekim izvođenjima, VELOCIMMUNE® miš može biti VELOCIMMUNE® 2 (VI-2) miš, koji uključuje trideset devet segmenata humanog VHgena, sve segmente humanog DHgena i sve segmente gena JH. VI-2 miš takođe može uključiti trideset humanih Vκ segmenata gena i sve segmente humanog Jκ gena. U nekim izvođenjima, VELOCIMMUNE® miš može biti VELOCIMMUNE® 3 (VI-3) miš, koji uključuje osamdeset segmenata humanog VHgena, sve segmente humanog DHgena i sve segmente gena JH. VI-3 miš takođe može uključiti četrdeset humanih Vκ segmenata gena i sve segmente humanog Jκ gena.

[0261] Alternativno, i/ili dodatno, u nekim izvođenjima, zametni genom miša kako je ovde opisan dalje sadrži uklonjeni, inaktiviran, funkcionalno utišan ili na drugi način nefunkcionalan endogeni l λ lokus lakog lanca imunoglobulina. Genetičke modifikacije za brisanje ili nefunkcionalnost gena ili genetskog lokusa mogu se postići korišćenjem ovde opisanih postupaka i/ili postupaka poznatih u oblasti tehnike.

[0262] Genetički modifikovani miš osnivač se može identifikovati na osnovu prisustva modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ u njegovom zametnom genomu i/ili ekspresije antitela koja imaju humani Vλ domen i mišji Cλ domen u tkivima ili ćelijama miša. Genetički modifikovani miš osnivač se zatim može koristiti za uzgoj dodatnih miševa koji nose konstruisani lokus lakog lanca imunoglobulina κ čime se stvara kohorta miševa od kojih svaki nosi jednu ili više kopija modifikovanog lokusa lakog lanca imunoglobulina κ. Štaviše, genetički modifikovani miševi koji nose lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano mogu dalje da se uzgajaju sa drugim genetički modifikovanim miševima koji nose druge transgene (npr. gene humanog imunoglobulina) ili projektovane lokuse imunoglobulina po želji.

[0263] Genetički modifikovani miševi se takođe mogu proizvesti da sadrže odabrane sisteme koji omogućavaju regulisanu, usmerenu, inducibilnu i/ili specifičnu ekspresiju za ćelijski tip transgena ili integrisane sekvence(e). Na primer, miševi kao što je ovde opisano mogu biti modifikovani da sadrže jednu ili više sekvenci koje kodiraju humani Vλ domen antitela koje je/su uslovno eksprimirani (npr., pregledano u Rajevski, K. et al., 1996, J. Clin. Invest 98(3):600-3). Primeri sistema uključuju Cre/loxP rekombinazni sistem bakteriofaga PI (videti, npr. Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:6232-6) i FLP/Frt rekombinazni sistem od S. cerevisiae (O'Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-5). Takve životinje se mogu obezbediti konstruisanjem „dvostrukih“ genski modifikovanih životinja, na primer, parenjem dve genetički modifikovane životinje, od kojih jedna sadrži transgen koji sadrži odabranu modifikaciju (npr., modifikovani lokus Igκ lakog lanca kao što je ovde opisano), a druga sadrži transgen koji kodira rekombinazu (npr. Cre rekombinazu).

[0264] Miševi kao što je ovde opisano mogu biti pripremljeni kao što je gore opisano, ili upotrebom postupaka poznatih u oblasti tehnike, da sadrže dodatne humane, humanizovane ili drugačije modifikovane gene, često u zavisnosti od nameravane upotrebe miša. Genetički materijal takvih humanih, humanizovanih ili na drugi način modifikovanih gena može se uvesti kroz dalju izmenu genoma ćelija (npr. embrionalne matične ćelije) koje imaju genetske modifikacije ili promene kao što je gore opisano ili kroz tehnike oplemenjivanja poznatih u struci sa drugim genetičkim modifikovani ili konstruisani sojevi po želji. U nekim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano su pripremljeni da dalje sadrže humane IgH i/ili Igκ gene lakog lanca ili genske segmente (videti npr. Murphy, A.J. et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

111(14):5153-5158; U.S. Patent Nos. 8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 and 8,791,323; U.S. Patent No: 8,791,323; i U.S. objava patenta br.2013/0096287 A1.

[0265] U nekim izvođenjima, miševi kako je ovde opisano mogu biti pripremljeni uvođenjem ciljanog vektora opisanog ovde u ćeliju iz modifikovanog ili projektovanog soja. Na primer, vektor za ciljanje kao što je ovde opisan može se uvesti u VELOCIMMUNE® miša. VELOCIMMUNE® miševi eksprimiraju antitela koja imaju potpuno humane varijabilne regione i mišje konstantne regione. U drugom primeru, vektor ciljanja kao što je ovde opisan može se uvesti u projektovanog miša kao što je opisano u bilo kom od US patenta br. U nekim izvođenjima, miševi opisani ovde su pripremljeni da dalje sadrže gene humanog imunoglobulina (geni varijabilnog i/ili konstantnog regiona). U nekim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano sadrže modifikovani lokus Igκ lakog lanca kao što je ovde opisan i genetički materijal od heterologne vrste (npr. ljudi), pri čemu genetički materijal kodira, u celini ili delimično, jednog ili više humanih teških i/ ili varijabilne regione lakog lanca Igk.

[0266] Na primer, kao što je ovde opisano, miševi koji sadrže modifikovani lokus Igκ lakog lanca kao što je ovde opisano mogu dalje da sadrže (npr. ukrštanjem ili višestrukim strategijama ciljanja gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u Murphi, A.J. et al., (2014) Proc. Natl. Akad. Sci. U.S.A.111(14):5153-8; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Akad. Sci. U.S.A.111(14):5147-52; Patenti SAD br.8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,323. U nekim izvođenjima, miš koji sadrži modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina, kao što je ovde opisano, ukrštava se sa mišem koji sadrži lokus varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog imunoglobulina i/ili imunoglobulina κ lakog lanca (videti, npr., U.S. patent br.8, 8, 58, 8, 8,697,940 i/ili 8,791,323). U nekim izvođenjima, miš koji sadrži modifkovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina, kao što je ovde opisano, ukrštava se sa mišem koji sadrži lokus varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog imunoglobulina (videti, npr., US patente br. 8,791,323) i inaktivirani lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina λ (videti, npr., U.S. patent br. 9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 61, 60, 60, 61, 609, 639, 628, 61, 639, 639, 628, 61, 609, 609, 609, 609, 609, 609, 609, 609, 609, 609, 511, 323).

[0267] Drugi postupci za dobijanje miša koje sadrže genetičku modifikaciju uključuju, na primer, modifikaciju genoma ne-ES ćelije (npr. fibroblasta ili indukovane pluripotentne ćelije) i korišćenje nuklearnog transfera somatskih ćelija (SCNT) za prenos genetički modifikovanog genoma na odgovarajuću ćeliju, na primer, enukleisanu oocitu, i gestaciju modifikovane ćelije (npr. modifikovane oocite) kod miša pod pogodnim uslovima da bi se formirao embrion.

[0268] Postupci za modifikaciju zametnog genoma miša uključuju, na primer, korišćenje nukleaze cinkanih prstiju (ZFN), efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) ili Cas proteina (tj. CRISPR/Cas sistem) za uključuju modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano. Smernice za postupke za modifikaciju zametnog genoma miša mogu se naći u, na primer, patentnim prijavama US br. 14/747,461 (podneta 23. juna 2015), 14/948,221 (podneta 20. novembra 2015.) i 1644, 2015. 18. decembra 2015. godine).

[0269] Korišćena životinja koja nije čovek je miš.

[0270] U nekim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je miš koji je miš soja C57BL izabran između C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLvN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL /6BiJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U nekim određenim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je soj 129 izabran iz grupe koja se sastoji od soja 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr. 129S1/SV, 129S1/SvIm2S), 129P2, 129P3, 129X1, 129S1. 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti, npr., Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). U nekim određenim izvođenjima, genetički modifikovani miš kako je ovde opisan je mešavina prethodno pomenutog soja 129 i prethodno pomenutog soja C57BL/6. U nekim određenim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je mešavina prethodno pomenutih 129 sojeva, ili mešavina prethodno navedenih BL/6 sojeva. U nekim određenim izvođenjima, 129 soj mešavine kako je ovde opisan je soj 129S6 (129/SvEvTac). U nekim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je BALB soj, npr. BALB/c soj. U nekim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je mešavina soja BALB i drugog prethodno pomenutog soja.

Specifični primeri izvođenja - lokusi teškog lanca imunoglobulina

[0271] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano i dalje obuhvataju modifikovane IgH lokuse (ili alele) koje karakteriše prisustvo većeg broja segmenata humanog VH, DHi JHgena raspoređenih u konfiguraciju zametne linije i operativno povezan sa genima konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša, pojačivačima i regulatornim regionima. U nekim izvođenjima, modifikovani imunoglobulin teški lokus lanca (ili alel) kako je ovde opisano obuhvata jedan ili više segmenata humanog VHgena, jedan ili više segmenata humanog DHgena i jedan ili više segmenata humanog JHgena koji su operativno povezani sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina miša. U nekim određenim izvođenjima, modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina (ili alel) obuhvata najmanje segmente humanog VH gena VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3- 33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, Vh3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim određenim izvođenjima, modifikovani IgH lokus (ili alel) obuhvata najmanje segmente humanog DHgena DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2- 8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim određenim izvođenjima, modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina (ili alel) obuhvata najmanje segmente humanog JHgena JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0272] Predmetni prikaz prepoznaje da će miš, kako je ovde opisan, koristiti segmente gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka sadržane u njegovom genomu u svojim mehanizmima selekcije i generisanja antitela (npr. rekombinacija i somatska hipermutacija). Kao takvi, u različitim izvođenjima, varijabilni domeni teškog lanca humanog imunoglobulina generisani od miševa koji su ovde opisani su kodirani segmentima gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka koji su uključeni u njihov genom ili njihove somatski hipermutirane varijante.

[0273] U nekim izvođenjima, korišćen je miš čiji genom sadrži modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina, gde miš uključuje B ćeliju koja uključuje sekvencu humanog teškog varijabilnog regiona, sekvencu varijabilnog regiona λ lakog lanca čoveka, i/ili sekvencu varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca koja je somatski hipermutirana. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog teškog varijabilnog regiona, sekvenca varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog k lakog lanca prisutna u B ćeliji miša prema ovom pronalasku ima 1, 2, 3, 4, 5 ili više somatskih hipermutacija. Stručnjaci su upoznati sa postupcima za identifikaciju segmenata izvornog gena u sekvenci zrelog antitela. Na primer, dostupni su različiti alati za pomoć u ovoj analizi, kao što su, na primer, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA i Ab-porekla.

[0274] U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca imunoglobulina miša uključuje jedan ili više gena konstantnog regiona teškog lanca mišjeg imunoglobulina kao što su, na primer, imunoglobulin M (IgM), imunoglobulin D (IgD), imunoglobulin G (IgG), imunoglobulin E (IgE) i imunoglobulin A (IgA). U nekim određenim izvođenjima, konstantni region teškog lanca imunoglobulina miša uključuje mišji IgM, mišji IgD, mišji IgG3, mišji IgG1, mišji IgG2b, mišji IgG2a, mišji IgE i mišji IgA konstantni region. U nekim izvođenjima, pomenuti segmenti humanog VH, DHi JHgena su operativno povezani sa jednim ili više pojačivača teškog lanca imunoglobulina miša (tj. sekvence pojačivača ili regioni pojačivača). U nekim izvođenjima, pomenuti segmenti humanog VH, DHi JHgena su operativno povezani sa jednim ili više regulatornih regiona teškog lanca mišjeg imunoglobulina (ili regulatornih sekvenci). U nekim izvođenjima, pomenuti segmenti humanog VH, DHi JHgena su operativno povezani sa jednim ili više pojačivača teškog lanca imunoglobulina miša (ili sekvencom pojačivača) i jednim ili više regulatornih regiona teškog lanca imunoglobulina miša (ili regulatorne sekvence).

[0275] U nekim izvođenjima, modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina kako je ovde opisan ne sadrži endogeni gen Adam6. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina kako je ovde opisan ne sadrži endogeni gen Adam6 (ili sekvencu koja kodira Adam6) u istoj zametnoj genomskoj poziciji kao što je pronađeno u genomu zametne linije divljeg tipa miša iste vrste. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina kako je ovde opisan ne sadrži humani Adam6 pseudogen. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano obuhvata umetanje najmanje jedne nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više nehumanih (npr. mišjih) Adam6 polipeptida, funkcionalnih ortologa, funkcionalnih homologa ili njihovih funkcionalnih fragmenata. U nekim izvođenjima, pomenuta insercija može biti izvan modifikovanog lokusa teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano (npr., ali bez ograničenja na, uzvodno od 5' većine VHsegmenta gena), unutar modifikovanog lokusa teškog lanca imunoglobulina ili negde drugde u genom zametne linije miša (npr., ali ne ograničavajući se na, nasumično uvedenu nehumanu sekvencu koja kodira Adam6), ćelije ili tkiva.

[0276] U različitim izvođenjima, korišćen miš, mišja ćelija ili mišje tkivo, kao što je ovde opisano, ne eksprimiraju detektabilno, u celini ili delimično, endogeni mišji VHregion u molekulu antitela. U različitim izvođenjima, korišćen miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano ne sadrži (ili nedostaje, ili sadrži deleciju) jednu ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, u celini ili delimično, endogeni mišji VHregion (npr. VH, DHi/ili JH) u molekulu antitela. U različitim izvođenjima, korišćen miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano ima genom zametne linije koji uključuje deleciju endogenih segmenata VH, DHi JHgena miša, u celini ili delimično. U različitim izvođenjima, korišćen miš je fertilan.

[0277] Smernice za kreiranje ciljanih vektora, nehumanih ćelija i životinja koje nose takve modifikovane lokuse teškog lanca imunoglobulina (ili alele) mogu se naći u US patentima br. 8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,323 Stručnjaci su upoznati sa različitim tehnologijama, poznatim u struci, za postizanje takvog genetskog inženjeringa i/ili manipulacije genoma nehumanih (npr. sisara) ili za drugačije pripremanje, obezbeđivanje ili proizvodnju takvih sekvenci za uvođenje u genom zametne linije miševa.

Specifični primeri izvođenja - lokusi lakog lanca imunoglobulina κ

[0278] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ karakterisan prisustvom većeg broja segmenata humanog Vλ i Jλ gena raspoređenih u konfiguraciji zametne linije (tj. nisu preuređeni i povezani sa rekombinacionim signalnim sekvencama) i umetnutim uzvodno od mišjeg Cλ gena, i operativno vezan za njega, pri čemu mišji Cλ gen je umetnut na mesto mišjeg Cκ gena. Kao što je ovde opisano, takav modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ dalje uključuje regione pojačivača imunoglobulina κ lakog lanca miša (ili sekvence pojačivača). U nekim izvođenjima, modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ obuhvata jedan ili više segmenata humanog Vλ gena i jedan ili više segmenata humanog Jλ gena koji su operativno povezani sa mišjim Cλ genom. U nekim određenim izvođenjima, modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ (ili alel) obuhvata segmente humanog Vλ gena koji se pojavljuju u najmanje klasteru A lokusa λ lakog lanca humanog imunoglobulina; u nekim izvođenjima, klaster A i klaster B lokusa lakog lanca humanog imunoglobulina λ u nekim određenim izvođenjima, klaster A, klaster B i klaster C lokusa lakog lanca humanog imunoglobulina λ. U nekim određenim izvođenjima, modifikovani lokus (ili alel) lakog lanca imunoglobulina k obuhvata najmanje segmente humanog Vλ gena Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51 , Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2 -23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim određenim izvođenjima, modifikovani lokus lakog lanca Igκ (ili alel) obuhvata najmanje segmente humanog Jλ gena Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 Jλ7, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0279] Ovo otkriće prepoznaje da će miš, kako je ovde opisan, koristiti segmente gena varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca uključene u njegov genom u svojim mehanizmima selekcije i generisanja antitela (npr. rekombinacija i somatska hipermutacija). Kao takvi, u različitim izvođenjima, varijabilni domeni λ lakog lanca humanog imunoglobulina generisani od strane miševa koji su ovde opisani su kodirani segmentima gena varijabilnog regiona humanog λ lakog lanca koji su uključeni u njihov genom ili njihove somatski hipermutirane varijante.

[0280] U nekim izvođenjima, korišćen je miš čiji genom sadrži modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina, gde miš uključuje B ćeliju koja uključuje sekvencu humanog teškog varijabilnog regiona, sekvencu varijabilnog regiona λ lakog lanca čoveka, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca koja je somatski hipermutirana. U nekim izvođenjima, sekvenca humanog teškog varijabilnog regiona, sekvenca varijabilnog regiona humanog l lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog κ lakog lanca prisutna u B ćeliji miša prema ovom pronalasku ima 1, 2, 3, 4, 5 ili više somatskih hipermutacija. Stručnjaci su upoznati sa postupcima za identifikaciju segmenata izvornog gena u sekvenci zrelog antitela. Na primer, dostupni su različiti alati za pomoć u ovoj analizi, kao što su, na primer, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA i Ab-origin.

[0281] U mnogim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina (ili alel) sadrži iste regione pojačivača lakog lanca imunoglobulina k (ili sekvence pojačivača) koji se pojavljuju u lokusu (ili alelu) κ lakog lanca imunoglobulina divljeg tipa. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus (ili alel) κ lakog lanca imunoglobulina sadrži regione pojačivača lakog lanca imunoglobulina κ (ili sekvence pojačivača) koji se pojavljuju u lokusu (ili alelu) lakog lanca imunoglobulina k divljeg tipa. različite vrste (npr. različite vrste miša).

[0282] U nekim izvođenjima, pomenuti segmenti humanog Vλ i Jλ gena su operativno povezani sa jednim ili više pojačivača lakog lanca imunoglobulina κ (tj. sekvence pojačivača ili regiona pojačivača). U nekim određenim izvođenjima, pomenuti segmenti humanog Vλ i Jλ gena su operativno vezani za intronski pojačivač lakog lanca imunoglobulina miša (Igk Ei ili Eik). U nekim određenim izvođenjima, pomenuti segmenti humanog Vλ i Jλ gena su operativno povezani sa regionom pojačivača k lakog lanca miša imunoglobulina 3’ (Igκ 3’E ili 3’Ek). U nekim određenim izvođenjima, pomenuti humani segmenti Vλ i Jλ gena su operativno povezani sa mišjim Eiκ i operativno povezani sa mišjim 3’Ek.

[0283] U nekim izvođenjima, modifikovani lokus (ili alel) lakog lanca imunoglobulina κ, kako je ovde opisan, ne sadrži (tj. nedostaje) humani VpreB gen (ili sekvencu koja kodira humani VpreB gen).

[0284] U nekim određenim izvođenjima, mišji Cλ gen iz modifikovanog lokusa lakog lanca Igκ (ili alela) je ili sadrži mišji Cλ gen iz genetske pozadine koja uključuje soj 129, soj BALB/c, C57BL/6 soj, mešani soj 129kC57BL/6 ili njihove kombinacije.

[0285] U nekim izvođenjima, Cλ gen miša modifikovanog lokusa Igκ lakog lanca (ili alela) kako je ovde opisano sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična SEQ ID NO: 1 (mišji Cλ1), SEQ ID NO:3 (mišji λ2) ili SEQ ID NO:5 (mišji Cλ3). U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen modifikovanog lokusa Igκ lakog lanca (ili alela) kako je ovde opisano sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična SEQ ID NO: 1 (mišji Cλ1), SEQ ID NO:3 (mišji Cλ2) ili SEQ ID NO:5 (mišji Cλ3). U nekim izvođenjima, Cλ gen miša modifikovanog lokusa lakog lanca Igk (ili alela) kako je ovde opisano je ili sadrži sekvencu mišjeg Cλ1 gena.

[0286] U nekim izvođenjima, Cλ domen miša kodiran sekvencom pozicioniranom na modifikovanom lokusu lakog lanca Igκ (ili alelu) kako je ovde opisano sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan SEQ ID NO:2 (miš Cλ1), SEQ ID NO:4 (miš Cλ2) ili SEQ ID NO:6 (mišji Cλ3). U nekim izvođenjima, Cλ domen miša kodiran sekvencom pozicioniranom na modifikovanom lokusu lakog lanca Igκ (ili alela) kako je ovde opisano sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična SEQ ID NO:2 (mišji Cλ1), SEQ ID NO: 4 (mišji Cλ2) ili SEQ ID NO:6 (mišji Cλ3). U nekim izvođenjima, mišji Cλ gen kodiran sekvencom pozicioniranom na modifikovanom lokusu lakog lanca Igκ (ili alelu) kako je ovde opisano je ili sadrži polipeptid mišjeg Cλ1 domena.

[0287] Između ostalog, ovo otkriće pokazuje da prisustvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena na Igκ lokusima lakog lanca (ili alelima) povećava raznolikost repertoara lakog lanca korišćenog miša u poređenju sa raznovrsnošću lakih lanaca u eksprimiranom repertoaru antitela miša koji ne sadrži takve modifikovane Igκ lokuse lakog lanca.

Specifični primeri izvođenja - lokusi lakog lanca imunoglobulina λ

[0288] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano i dalje obuhvataju lokuse (ili alele) λ lakog lanca divljeg tipa ili inaktivirani imunoglobulin.

[0289] U nekim izvođenjima, korišeni miševi, mišje ćelije i/ili tkiva miša, kao što je ovde opisano, sadrže deleciju, u celini ili delimično, lokusa λ lakog lanca endogenog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi, mišje ćelije i/ili tkiva miša, kao što je ovde opisano, sadrže inserciju unutar lokusa λ lakog lanca endogenog imunoglobulina, pri čemu pomenuta insercija čini da lokus lakog lanca λ endogenog imunoglobulina nije funkcionalan. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi, mišje ćelije i/mišja tkiva kao što je ovde opisano sadrže deleciju jednog ili više segmenata gena lokusa λ lakog lanca endogenog imunoglobulina tako da lokus lakog lanca λ endogenog imunoglobulina nije u stanju da se rekombinuje i/ili eksprimuje u funkcionalni laki lanac antitela.

[0290] U nekim izvođenjima, korišćen miš, mišja ćelija ili mišje tkivo, kao što je ovde opisano, ne eksprimiraju detektabilno, u celini ili delimično, endogeni nehumani Vλ region u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, korišćen miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kako je ovde opisano ne sadrži (ili nema ili sadrži deleciju) jednu ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, u celini ili delimično, endogeni nehumani Vλ region u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, korišćen miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano ima genom zametne linije koji uključuje deleciju endogenih segmenata Vλ i Jλ gena miša, u celini ili delimično. U nekim izvođenjima, korišćen miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano kao genom zametne linije koji uključuje deleciju endogenih segmenata Vλ, Jλ i Cλ gena miša, u celini ili delimično.

[0291] Smernice za stvaranje ciljanih vektora, nehumanih ćelija i životinja koje sadrže inaktivirane Igλ lokuse lakog lanca (ili alele) mogu se naći u, na primer, u US patentima br. 9,163,092. Stručnjaci su upoznati sa različitim tehnologijama, poznatim u struci, za postizanje genetske inaktivacije specifičnih lokusa i/ili manipulacije nehumanim (npr. inaktivacija (npr. brisanje gena) za uvođenje u genom zametne linije miševa

Specifični primeri izvođenja - kombinacije lokusa imunoglobulina

[0292] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano i dalje obuhvataju jedan ili više dodatnih humanih ili humanizovanih gena (npr. putem ukrštanja ili višestrukih strategija ciljanja gena). Takvi miševi se mogu pripremiti kao što je gore opisano, ili korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, da bi se postigao željeni modifikovani genotip u zavisnosti od nameravane upotrebe miša. Genetički materijal takvih dodatnih humanih ili humanizovanih gena može se uvesti kroz dalju promenu genoma ćelija (npr. embrionalne matične ćelije) koje imaju genetske modifikacije kao što je gore opisano ili kroz tehnike oplemenjivanja poznatih u tehnici sa drugim genetički modifikovanim sojevima po želji.

[0293] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su pripremljeni da dalje sadrže lokus teškog lanca humanog ili humanizovanog imunoglobulina (npr., uključujući, ali ne ograničavajući se na, veći broj segmenata humanog VH, DHi JHgena koji su operativno povezani sa jednim ili više mišjih imunoglobulina geni konstantnog regiona teškog lanca na lokusu teškog lanca endogenog imunoglobulina). U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su heterozigotni za modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano i heterozigotni za lokus teškog lanca humanog ili humanizovanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su homozigotni za modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano i homozigotni za humani ili humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina.

[0294] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su pripremljeni da dalje sadrže lokus teškog lanca humanog ili humanizovanog imunoglobulina (npr., uključujući, ali ne ograničavajući se na, veći broj segmenata humanog VH, DHi JHgena koji su operativno povezani sa jednim ili više mišjih imunoglobulina geni konstantnog regiona teškog lanca na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina) i lokus lakog lanca humanizovanog imunoglobulina κ (npr. uključujući, ali ne ograničavajući se na, mnoštvo segmenata humanog Vκ i Jκ gena koji su operativno povezani sa konstantnim regionom lakog lanca imunoglobulina κ miša gen na endogenom imunoglobulinskom κ lokusu lakog lanca. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su heterozigotni za lokus teškog lanca humanog ili humanizovanog imunoglobulina i dalje obuhvataju jedan endogeni imunoglobulin κ lokus lakog lanca koji sadrži mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa gen konstantnog regiona lakog lanca miša imunoglobulina (tj., modifikovani lokus Igκ lakog lanca kao što je ovde opisano), i drugi endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji ima više segmenata humanog Vκ i Jκ gena koji su operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi su homozigotni za lokus teškog lanca humanog ili humanizovanog imunoglobulina i dalje sadrže endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji sadrži mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa konstantom lakog lanca imunoglobulina l miša gen regiona (tj., modifikovani lokus lakog lanca Igκ kao što je ovde opisan), i drugi lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina k koji ima više segmenata humanog Vκ i Jκ gena koji su operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina κ miša.

[0295] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi imaju genom koji sadrži (a) homozigotni ili heterozigotni lokus teškog lanca humanog ili humanizovanog imunoglobulina koji sadrži segmente humanog VH, DHi JHgena koji su operativno povezani sa jednom ili više endogenih konstantnih regiona teškog lanca nehumanog imunoglobulina takvih da miš eksprimira teški lanac imunoglobulina koji sadrži sekvencu humanog VHdomena fuzionisanu sa sekvencom nehumanog CHdomena; (b) prvi lokus lakog lanca imunoglobulina k koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa Cλ genom miša-imunoglobulina tako da miš eksprimira laki lanac imunoglobulina koji sadrži sekvencu humanog Vλ domena fuzionisanu sa sekvencom mišjeg Cλ domena; i (c) drugi lokus k lakog lanca imunoglobulina koji sadrži segmente humanog Vκ i Jκ gena koji su operativno povezani sa endogenim mišjim Cκ genom tako da miš eksprimira laki lanac imunoglobulina koji sadrži sekvencu humanog Vκ domena fuzionisanu sa sekvencom Cκ domena miša.

[0296] U nekim izvođenjima, korišćeni miševi imaju genom koji sadrži (a) homozigotni ili heterozigotni lokus teškog lanca humanog ili humanizovanog imunoglobulina koji sadrži segmente humanog VH, DHi JHgena koji su operativno povezani sa jednim ili više konstantnih regiona teškog lanca endogenog imunoglobulina miša, kao što je da miš eksprimira teški lanac imunoglobulina koji sadrži sekvencu humanog VHdomena fuzionisanu sa sekvencom mišjeg CHdomena; (b) prvi lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa Cλ genom mišjeg imunoglobulina tako da miš eksprimira laki lanac imunoglobulina koji sadrži sekvencu humanog Vλ domena fuzionisanu sa sekvencom Cλ domena miša; (c) drugi lokus k lakog lanca imunoglobulina koji sadrži segmente humanog Vκ i Jκ gena koji su operativno povezani sa endogenim mišjim Cκ genom tako da miš eksprimira laki lanac imunoglobulina koji sadrži sekvencu humanog Vκ domena fuzionisanu sa sekvencom Cκ domena miša; i (d) homozigotnog ili heterozigotnog funkcionalno inaktiviranog ili deletiranog, u celini ili delimično, endogenog lokusa lakog lanca imunoglobulina λ.

[0297] Na primer, kao što je ovde opisano, miševi koji sadrže modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina k kao što je ovde opisano mogu dalje da sadrže (npr., putem ukrštanja ili višestrukih strategija ciljanja gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u patentima US br. 8,642,835, 8,697,940, 9,006,511, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 i 9,163,092. U nekim izvođenjima, korišćeni miševi dodatno sadrže humanizovani imunoglobulinski lokus teškog lanca, (npr., lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži humane VH, DHi JHsegmente gena operativnog povezane sa jednim ili više nehumanih gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina.) U nekim izvođenjima, korišćeni miševi dalje sadrže humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina i nefunkcionalni lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina λ (npr. izbrisan u celini ili delimično, ili na drugi način učinjen nefunkcionalnim). U nekim izvođenjima, korišćeni miševi sadrže lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji ima segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa humanim ili mišjim Cλ genom pozicioniranim na mestu mišjeg Cκ gena i drugi lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži humani Vκ i segmente Jκ gena operativno povezane sa endogenim Cκ genom miša. U takvim izvođenjima, korišćeni miševi nazivaju se hemizigotima za modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ. U nekom aspektu, pomenuti hemizigotni miševi koji su ovde korišćeni dodatno sadrže lokus teškog lanca humanizovanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, pomenuti hemizigotni miševi koji su ovde korišćeni dalje obuhvataju lokus teškog lanca humanizovanog imunoglobulina i nefunkcionalni lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina λ.

Postupci za upotrebu opisanih miševa, ćelija ili tkiva

[0298] Miševi kako je ovde opisano mogu se koristiti kao platforma za razvoj antitela. Posebno, miševi koji su ovde opisani predstavljaju posebno povoljnu platformu za stvaranje i identifikaciju varijabilnih domena humanog lambda lakog lanca i antitela koja uključuju takve varijabilne domene humanog lambda lakog lanca. Posebno, postupak za proizvodnju antitela u genetički modifikvanom mišu je obezbeđen, postupak se sastoji iz koraka:

(a) imunizovanja genetički modifikovanog miša antigenom od interesa, pri čemu genetički modifikovani miš ima zametni genom koji sadrži:

prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(i) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata,

(ii) jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata pod (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata

pod (ii) su operativno povezani sa jednim mišjim Cλ genom pod (iii);

pri čemu jedan mišji Cλ gen pod (iii) je umesto mišjeg Cκ gena na prvom modifikovanom endogenom lokusu κ lakog lanca imunoglobulina;

pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata pod (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata pod (ii) su umesto jednog ili više endogenih mišjih Vκ genskih segmenata i jedan ili više endogenih mišjih Jκ genskih segmenata;

pri čemu genetički modifikovanom mišu nedostaje mišji Cκ gen na prvom modifikovanom endogenom lokusu k lakog lanca imunoglobulina;

(b) održavanje genetički modifikovanog miša pod uslovima dovoljnim da genetički modifikovani miš proizvede imunski odgovor na antigen od interesa; i

(c) regenerisanje iz genetički modifikovanog miša:

(i) antitela koje vezuje antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži humani λ varijabilni domen i mišji λ konstantni domen,

(ii) nukleotida koji kodira varijabilni domen humanog lakog lanca ili varijabilni domen humanog teškog lanca, laki lanac, ili težak lanac antitela koje vezuje antigen od interesa, pri čemu antitelo koje vezuje antigen od interesa sadrži laki lanac koji sadrži humani λ varijabilni domen i mišji λ konstantni domen, ili

(iii) ćelije koja eksprimuje antitelo koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži humani λ variabijabilni domen i mišji λ konstantni domen.

[0299] Shodno tome, ovo otkriće obezbeđuje da se miševi opisani ovde mogu koristiti u postupcima pravljenja antitela. Antitela napravljena u skladu sa ovim otkrićem mogu da obuhvataju, na primer, humana antitela, himerna antitela, reverzna himerna antitela, fragmente bilo kog od ovih antitela, ili njihove kombinacije.

[0300] U nekim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano mogu da se koriste za pravljenje humanog antitela (npr., potpuno humanog antitela), koje ljudsko antitelo sadrži varijabilne regione izvedene iz sekvenci nukleinskih kiselina kodiranih genetičkim materijalom ćelije miša kao opisano ovde. U nekim izvođenjima, miš kako je ovde opisan je imunizovan antigenom od interesa pod uslovima i tokom vremena dovoljnih da miš razvije imuni odgovor na pomenuti antigen od interesa. Antitela i/ili sekvence antitela (tj. sekvence koje kodiraju deo antitela, npr. sekvencu varijabilnog regiona) su izolovane i/ili identifikovane od miša (ili jedne ili više ćelija, na primer, jedne ili više B ćelija) tako imunizovan i okarakterisan korišćenjem različitih testova koji mere, na primer, afinitet, specifičnost, mapiranje epitopa, sposobnost blokiranja interakcije ligand-receptor, inhibicionu aktivaciju receptora, itd. U različitim izvođenjima, antitela proizvedena od miševa kako je ovde opisano sadrže jednu ili više humanih varijabilnih regiona koji su izvedeni iz jedne ili više nukleotidnih sekvenci humanog varijabilnog regiona izolovanih od miša. U nekim izvođenjima, antitela protiv leka (npr., anti-idiotipska antitela) mogu biti podignuta kod miševa kao što je ovde opisano. U različitim izvođenjima, antitela proizvedena od miševa kao što je ovde opisano su reverzna himerna antitela koja uključuju varijabilni domen humanog lakog lanca i konstantni domen lakog lanca miša i/ili varijabilni domen humanog teškog lanca i konstantni domen mišjeg teškog lanca.

[0301] U različitim izvođenjima, antitela proizvedena od miševa uključuju teške i lake lance koji imaju humani varijabilni domen i mišji konstantni domen. U nekim izvođenjima, antitela proizvedena od miševa kao što je ovde opisano su reverzna himerna antitela koja uključuju varijabilni domen humanog lakog lanca i konstantni domen lakog lanca miša. U nekim izvođenjima, antitela proizvedena od miševa kao što je ovde opisano su reverzna himerna antitela koja uključuju varijabilni domen teškog lanca čoveka i konstantni domen teškog lanca miša.

[0302] U nekim izvođenjima, obezbeđeni postupci uključuju imunizaciju miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa. U nekim izvođenjima, obezbeđeni postupci uključuju identifikaciju limfocita (npr., klonski odabranog limfocita) od navedenog miša, gde limfocit eksprimira antitelo koje vezuje (npr. specifično vezuje) antigen od interesa. U nekim izvođenjima, limfocit je B ćelija. U nekim izvođenjima, sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvenca varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca i/ili sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca humanog kapa dobijena je iz limfocita (npr. B ćelija) i/ili identifikovana (npr. genotipizirani, npr. sekvencirani). U nekim izvođenjima, aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca čoveka, varijabilnog domena humanog lambda lakog lanca i/ili varijabilnog domena humanog kapa lakog lanca dobija se iz limfocita (npr. B ćelije) i/ili identifikuje (npr. sekvenciranjem). U nekim izvođenjima, sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvenca varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca, i/ili sekvenca varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca iz B ćelije miša je eksprimirana u ćeliji domaćinu. U nekim izvođenjima, varijanta sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca, sekvence varijabilnog regiona humanog lambda lakog lanca, i/ili sekvence varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca iz B ćelije miša je eksprimirana u ćeliji domaćinu. U nekim izvođenjima, varijanta uključuje jednu ili više mutacija. U nekim izvođenjima, jedna ili više mutacija mogu poboljšati farmakokinetičko i/ili farmakodinamičko svojstvo antitela uključujući varijantu. U nekim izvođenjima, jedna ili više mutacija mogu poboljšati specifičnost, afinitet i/ili imunogenost antitela uključujući varijantu.

[0303] U nekim izvođenjima, postupci pravljenja humanog antitela uključuju identifikaciju nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni domen teškog lanca humanog imunoglobulina i/ili varijabilni domen lakog lanca humanog imunoglobulina od miša koji je ovde opisan; i (i) spajanje ili vezivanje nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni domen teškog lanca humanog imunoglobulina sa nukleotidnom sekvencom koja kodira konstantni domen teškog lanca humanog imunoglobulina, čime se formira sekvenca teškog lanca humanog imunoglobulina koja kodira potpuno težak lanac humanog imunoglobulina, (ii) spajanje ili vezivanje nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni domen λ lakog lanca humanog imunoglobulina sa nukleotidnom sekvencom koja kodira konstantni domen lakog lanca humanog imunoglobulina, čime se formira sekvenca lakog lanca humanog imunoglobulina λ koja kodira potpuno humani λ laki lanac imunoglobulina, i /ili (iii) spajanje ili vezivanje nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni domen κ lakog lanca humanog imunoglobulina sa nukleotidnom sekvencom koja kodira konstantni domen κ lakog lanca humanog imunoglobulina, čime se formira sekvenca humanog imunoglobulina κ lakog lanca koja kodira potpuno humani κ lakog lanca imunoglobulina lanac. U određenim izvođenjima, sekvenca teškog lanca humanog imunoglobulina i (i) sekvenca lakog lanca humanog imunoglobulina λ, ili (ii) sekvenca lakog lanca humanog imunoglobulina k se eksprimiraju u ćeliji (npr. ćelija domaćina, ćelija sisara) tako da se teški lanci potpuno humanog imunoglobulina i (i) laki lanci potpuno humanog imunoglobulina λ ili (ii) laki lanci potpuno humanog imunoglobulina κ eksprimiraju i formiraju humana antitela. U nekim izvođenjima, humana antitela su izolovana iz ćelije ili medijuma kulture uključujući ćeliju.

[0304] Miševi kao što je ovde opisano mogu da se koriste za identifikaciju sekvence nukleotida ili nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen generisan od miša koji je ovde opisan, npr., kao deo antitela protiv epitopa ili antigena.

[0305] Miševi kako je ovde opisano mogu da se koriste za identifikaciju aminokiselinske sekvence humanog varijabilnog domena koju generiše miš koji je ovde opisan, npr., kao deo antitela protiv epitopa ili antigena.

[0306] Miševi kako je ovde opisano obezbeđuju poboljšani in vivo sistem i izvor bioloških materijala (npr. ćelije, nukleotidi, polipeptidi, proteinski kompleksi) za proizvodnju humanih antitela koja su korisna za različite testove. U različitim izvođenjima, miševi kako je ovde opisano se koriste za razvoj terapeutika koji ciljaju polipeptid od interesa (npr., transmembranski ili sekretovani polipeptid) i/ili moduliraju jednu ili više aktivnosti povezanih sa navedenim polipeptidom od interesa i/ili moduliraju interakcije navedenog polipeptida od interesa sa drugim partnerima za vezivanje (npr., ligandom ili polipeptidom receptora). Na primer, u različitim izvođenjima, miševi kako je ovde opisano se koriste za razvoj terapeutika koji ciljaju na jedan ili više receptorskih polipeptida, moduliraju aktivnost polipeptida receptora i/ili moduliraju interakcije polipeptida receptora sa drugim partnerima za vezivanje. U različitim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano se koriste za identifikaciju, skrining i/ili razvoj kandidata za terapiju (npr., antitela, siRNK, itd.) koji vezuju jedan ili više polipeptida od interesa. U različitim izvođenjima, miševi kako je ovde opisano se koriste za skrining i razvoj kandidata za terapiju (npr., antitela, male interferirajuće RNK (siRNK), itd.) koji blokiraju aktivnost jednog ili više polipeptida od interesa ili koji blokiraju aktivnost jednog ili više receptorskih polipeptida od interesa. U različitim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano se koriste za određivanje profila vezivanja antagonista i/ili agonista jednog ili više polipeptida od interesa. U nekim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano se koriste za određivanje epitopa ili epitopa jednog ili više kandidatskih terapijskih antitela koja vezuju jedan ili više polipeptida od interesa.

[0307] U različitim izvođenjima, miševi kako je ovde opisano se koriste za određivanje farmakokinetičkih profila jednog ili više kandidata za humana antitela. U različitim izvođenjima, jedan ili više miševa kako je ovde opisano i jedan ili više kontrolnih ili referentnih miševa su svaki izloženi jednom ili više kandidata za humana antitela u različitim dozama (npr.0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg ili 50 mg/kg ili više). Terapijska antitela kandidata mogu se dozirati bilo kojim željenim putem davanja uključujući parenteralne i neparenteralne puteve primene. Parenteralni putevi uključuju, npr., intravenski, intraarterijski, intraportalni, intramuskularni, subkutani, intraperitonealni, intraspinalni, intratekalni, intracerebroventrikularni, intrakranijalni, intrapleuralni ili drugi putevi injekcije. Neparenteralni putevi uključuju, npr., oralni, nazalni, transdermalni, plućni, rektalni, bukalni, vaginalni, okularni. Primena takođe može biti kontinuiranom infuzijom, lokalnom primenom, produženim oslobađanjem od implantata (gelovi, membrane ili slično) i/ili intravenskom injekcijom. Krv je izolovana od miševa (humanizovanih i kontrolnih) u različitim vremenskim tačkama (npr.0 sati, 6 sati, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana ili do 30 ili više dana). Mogu se izvršiti različiti testovi da bi se odredili farmakokinetički profili primenjenih kandidatskih terapeutskih antitela korišćenjem uzoraka dobijenih od miševa kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ukupni IgG, antiterapijski odgovor antitela, aglutinaciju, itd.

[0308] U različitim izvođenjima, miševi kako je ovde opisano se koriste za merenje terapeutskog efekta blokiranja ili modulacije aktivnosti polipeptida od interesa i efekta na ekspresiju gena kao rezultat ćelijskih promena ili, u kontekstu polipeptida receptora, gustine polipeptida receptora na površini ćelija kod miševa. U različitim izvođenjima, životinja koja nije humana kao što je ovde opisana ili ćelije izolovane iz njih su izložene terapeutskom kandidatu koji vezuje polipeptid od interesa i, nakon narednog vremenskog perioda, analizira se na efekte na specifične ćelijske procese koji su povezani sa navedenim polipeptidom. od interesa, na primer, interakcije ligand-receptor ili transdukcija signala.

[0309] Miševi kako je ovde opisano eksprimiraju varijabilne regione humanog antitela, tako da se ćelije, ćelijske linije i ćelijske kulture mogu generisati da služe kao izvor varijabilnih regiona humanog antitela za upotrebu u vezivnim i funkcionalnim testovima, npr. za ispitivanje vezivanja ili funkciju antagonista ili agonista, posebno kada je antagonist ili agonist specifičan za humani antigen od interesa ili specifičan za epitop koji funkcioniše u interakciji ligand-receptor (vezivanje). U različitim izvođenjima, epitopi vezani kandidatima za terapeutska antitela ili siRNA mogu se odrediti korišćenjem ćelija izolovanih od miševa kako je ovde opisano.

[0310] Ćelije dobijenih miševa mogu se izolovati i koristiti na ad hoc osnovi, ili se mogu održavati u kulturi tokom mnogih generacija. U različitim izvođenjima, ćelije dobijenog miša su imortalizovane (npr. korišćenjem virusa) i održavane u kulturi neograničeno (npr., u serijskim kulturama).

[0311] U nekim izvođenjima, mišja ćelija je mišji limfocit. U nekim izvođenjima, mišja ćelija je izabrana između B ćelije, dendritične ćelije, makrofaga, monocita i T ćelije. U nekim izvođenjima, mišja ćelija je nezrela B ćelija, zrela naivna B ćelija, aktivirana B ćelija, memorijska B ćelija i/ili plazma ćelija.

[0312] U nekim izvođenjima, ćelija miša je ćelija nehumanog embrionalnog matičnog (ES). U nekim izvođenjima, mišja ES ćelija je mišja ES ćelija. U nekim određenim izvođenjima, mišja ES ćelija je iz soja 129, soja C57BL, BALB/c ili njihove mešavine. U nekim određenim izvođenjima, embrionalna matična ćelija miša je mešavina sojeva 129 i C57BL. U nekim određenim izvođenjima, a mišja embrionalna matična ćelija je mešavina sojeva 129, C57BL i BALB/c.

[0313] U nekim izvođenjima, obezbeđena je upotreba mišje ES ćelije kao što je ovde opisano za pravljenje miša. U nekim određenim izvođenjima, mišja ES ćelija se koristi za pravljenje miša koji sadrži modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina k kao što je ovde opisano.

[0314] U nekim izvođenjima, mišje tkivo se bira između masnog tkiva, bešike, mozga, dojke, koštane srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, želudca, timusa, testisa, jajne ćelije i njihove kombinacije.

[0315] U nekim izvođenjima, opisana je besmrtna ćelija napravljena, generisana, proizvedena ili dobijena iz izolovane ćelije ili tkiva miša kao što je ovde opisano.

[0316] U nekim izvođenjima, opisan je mišji embrion napravljen, generisan, proizveden ili dobijen iz mišje ES ćelije kao što je ovde opisano.

[0317] Miševi kako je ovde opisano obezbeđuju in vivo sistem za generisanje varijanti varijabilnih regiona humanog antitela koji vezuju polipeptid od interesa (npr., varijante humanog Vλ domena). Takve varijante uključuju varijabilne regione humanog antitela koji imaju željenu funkcionalnost, specifičnost, nisku unakrsnu reaktivnost na zajednički epitop koji dele dve ili više varijanti polipeptida od interesa. U nekim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano se koriste za generisanje panela varijabilnih regiona humanog antitela koji sadrže niz varijantnih varijabilnih regiona koji se testiraju na željenu ili poboljšanu funkcionalnost.

[0318] Miševi kako je ovde opisano obezbeđuju in vivo sistem za generisanje biblioteka varijabilnih regiona humanih antitela (npr., biblioteka humanog Vλ domena). Takve biblioteke obezbeđuju izvor za sekvence varijabilnog regiona teškog i/ili lakog lanca koje mogu biti kalemljene na različite Fc regione na osnovu željene efektorske funkcije, koje se koriste kao izvor za sazrevanje afiniteta sekvence varijabilnog regiona korišćenjem tehnika poznatih u tehnici (npr. , mutageneza usmerena na mesto, PCR sklon greškama, itd.) i/ili se koristi kao izvor komponenti antitela za generisanje terapeutskih molekula zasnovanih na antitelima kao što su, na primer, himerni antigen receptori (tj. molekul projektovan korišćenjem antitela komponente, npr., scFv), multi-specifična vezujuća sredstva (npr. bi-specifična vezujuća sredstva) i fuzioni proteini (npr. jednodomenska antitela, scFvs, itd.).

[0319] U nekim izvođenjima, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela kod miša, pri čemu postupak obuhvata korake (a) imunizacije miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa; (b) održavanje miša u uslovima dovoljnim da miš proizvede imuni odgovor na antigen od interesa; i (c) dobijanje antitela od miša, ili mišje ćelije, koje vezuje antigen od interesa.

[0320] U nekim izvođenjima postupka za proizvodnju antitela kod miša, mišja ćelija je B ćelija. U nekim izvođenjima postupka za proizvodnju antitela kod miša, mišja ćelija je hibridom.

[0321] U nekim izvođenjima, korišćen je miš čiji genom zametne linije sadrži homozigotni endogeni k lokus lakog lanca imunoglobulina koji sadrži (i) humani Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ili bilo koju njihovu kombinacija, (ii) humani J Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ili bilo koju njihovu kombinacija, i (iii) mišji Cλ gen, pri čemu su (i)-(iii) operativno povezani jedan sa drugim, mišji Cλ gen se ubacuje na mesto mišjeg Ck gena endogenog imunoglobulinskog k lokusa lakog lanca, segment(i) humanog Vλ gena obuhvataju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje pored odgovarajućih segmenata humanog Vλ gena u endogenom humanom λ lokusu lakog lanca, a segment(i) humanog Jλ gena obuhvataju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje pored odgovarajućih humanih segmenata Vλ gena u endogenom humanom lokusu lakog lanca. U nekim određenim izvođenjima korišćenog miša, mišji Cλ gen je ili sadrži mišji Cλ1 gen. U nekim određenim izvođenjima korišćenog miša, humani Cλ gen je ili sadrži humani Cλ2 gen. U nekim određenim izvođenjima korišćenog miša, lokus lakog lanca k endogenog imunoglobulina dalje sadrži pojačivače lakog lanca imunoglobulina κ Eκi i 3’ Eκ. U nekim određenim izvođenjima korišćenog miša, lokus lakog lanca κ endogenog imunoglobulina uključuje brisanje segmenata VK i Jκ gena miša.

[0322] Takođe je prikazano antitelo pripremljeno postupkom, postupkom koji obuhvata korake: (a) obezbeđivanje miša kao što je ovde opisano; (b) imunizacija miša antigenom od interesa; (c) održavanje miša u uslovima dovoljnim da miš proizvede imuni odgovor na antigen od interesa; i (d) dobijanje antitela od miša, ili mišje ćelije, koje vezuje antigen od interesa, pri čemu antitelo iz (d) uključuje humane VHi Vλ domene.

[0323] U nekim slučajevima antitela dobijenog postupkom, humani VHdomen kodiran preuređenim varijabilnim regionom teškog lanca čoveka koji sadrži humani VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4- 39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, Vh3-21, VH3-20, VH1-18, Vh3-15, Vh3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 VH6-1 ili njihova somatski hipermutirana varijanta.

[0324] U nekim slučajevima antitela dobijenog postupkom, humani Vλ domen kodiran promenljivim regionom humanog λ lakog lanca koji sadrži humani Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3 -27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 Vλ3-1, ili njegova somatski hipermutirana varijanta.

[0325] Takođe je prikazan miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr., antitela ili njegovog fragmenta) za terapiju ili dijagnozu.

[0326] Takođe je prikazan miš, mišja ćelija ili mišje tkivo kao što je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje, prevenciju ili poboljšanje bolesti, poremećaja ili stanja.

[0327] Takođe je prikazana upotreba miša, mišje ćelije ili tkiva miša kao što je ovde opisano u proizvodnji i/ili razvoju leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba kao lek.

[0328] Takođe je prikazana upotreba miša ili ćelije kako je ovde opisano u proizvodnji i/ili razvoju antitela ili njegovog fragmenta.

[0329] Miševi kako su ovde opisani obezbeđuju in vivo sistem za analizu i ispitivanje leka ili vakcine. U različitim izvođenjima, kandidatski lek ili vakcina mogu biti isporučeni jednom ili više miševa kao što je ovde opisano, praćeno praćenjem miševa da bi se odredio jedan ili više imunoloških odgovora na lek ili vakcinu, bezbednosni profil leka ili vakcine, ili efekat na bolest ili stanje i/ili jedan ili više simptoma bolesti ili stanja. Primeri postupaka koji se koriste za određivanje bezbednosnog profila uključuju merenja toksičnosti, optimalne koncentracije doze, odgovora antitela (tj. anti-leka), efikasnosti leka ili vakcine i mogućih faktora rizika. Takvi lekovi ili vakcine se mogu poboljšati i/ili razviti kod takvih miševa.

[0330] Efikasnost vakcine se može odrediti na više načina. Ukratko, miševi kako je ovde opisano se vakcinišu korišćenjem postupaka poznatih u oblasti tehnike, a zatim se izazivaju vakcinom ili se vakcina daje već inficiranim miševima. Odgovor miša ili miševa na vakcinu može se meriti praćenjem i/ili izvođenjem jednog ili više testova na miševima (ili ćelijama izolovanim od njih) da bi se odredila efikasnost vakcine. Odgovor miša ili miševa na vakcinu se zatim upoređuje sa kontrolnim životinjama, koristeći jednu ili više mera poznatih u oblasti tehnike i/ili ovde opisanih.

[0331] Efikasnost vakcine se dalje može odrediti testovima neutralizacije virusa. Ukratko, miševi kako je ovde opisano su imunizovani i serum je sakupljen u različitim danima nakon imunizacije. Serijska razblaženja seruma su prethodno inkubirana sa virusom tokom kojeg će se za njega vezati antitela u serumu koja su specifična za virus. Mešavina virusa/seruma se zatim dodaje u permisivne ćelije da bi se odredila infektivnost testom plaka ili testom mikroneutralizacije. Ako antitela u serumu neutrališu virus, ima manje plakova ili nižih relativnih jedinica luciferaze u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0332] Miševi kako je ovde opisano proizvode varijabilne regione humanog antitela i, prema tome, obezbeđuju in vivo sistem za proizvodnju humanih antitela za upotrebu u dijagnostičkim primenama (npr. imunologija, serologija, mikrobiologija, ćelijska patologija, itd.). U različitim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano mogu da se koriste za proizvodnju varijabilnih regiona humanog antitela koji vezuju relevantna antigena mesta za identifikaciju ćelijskih promena kao što je, na primer, ekspresija specifičnih površinskih markera ćelije koji ukazuju na patološke promene. Takva antitela mogu da se konjuguju sa različitim hemijskim entitetima (npr. radioaktivni tragač) i da se koriste u različitim in vivo i/ili in vitro testovima po želji.

[0333] Miševi kako su ovde opisani obezbeđuju poboljšani in vivo sistem za razvoj i selekciju humanih antitela za upotrebu u onkologiji i/ili infektivnim bolestima. U različitim izvođenjima, miševi kao što je ovde opisano i kontrolni miševi (npr., koji imaju genetsku modifikaciju koja je drugačija od one koja je ovde opisana ili nemaju genetsku modifikaciju, tj. divlji tip) mogu biti implantirani tumorom (ili tumorskim ćelijama) ili inficirani virusom (npr. gripa, HIV, HCV, HPV, itd.). Nakon implantacije infekcije, miševima se može dati kandidat za terapiju. Tumoru ili virusu može biti dozvoljeno dovoljno vremena da se uspostavi na jednoj ili više lokacija unutar miševa pre primene kandidata za terapiju. Alternativno, i/ili dodatno, imuni odgovor se može pratiti kod takvih miševa kako bi se okarakterisala i odabrala potencijalna humana antitela koja se mogu razviti kao terapeutski lek.

Farmaceutske kompozicije

[0334] Antitelo, nukleinska kiselina ili njihov terapeutski relevantan deo proizveden od miša koji je ovde prikazan ili izveden iz antitela, nukleinske kiseline ili njihovog terapeutski relevantnog dela proizvedenog od miša koji je ovde otkriven, mogu da se daju subjektu (npr. čovek). Farmaceutska kompozicija može uključiti antitelo proizvedeno od miša koji je ovde otkriven. Farmaceutska kompozicija može uključivati pufer, razblaživač, ekscipijens ili bilo koju njihovu kombinaciju. Kompozicija, po želji, takođe može da sadrži jednu ili više dodatnih terapeutski aktivnih supstanci.

[0335] Iako su opisi farmaceutskih kompozicija dati ovde u principu usmereni na farmaceutske kompozicije koje su pogodne za etičku primenu na ljudima, kvalifikovani stručnjak će razumeti da su takve kompozicije generalno pogodne za primenu životinjama svih vrsta. Modifikacija farmaceutskih kompozicija pogodnih za davanje ljudima da bi se kompozicije učinile pogodnim za davanje različitim životinjama je dobro shvaćeno, a obično kvalifikovani veterinarski farmakolog može da modifikuje i/ili izvrši takvu modifikaciju sa običnim, ako ih ima, eksperimentisanjem.

[0336] Na primer, ovde opisani farmaceutski sastav može biti u sterilnom obliku za injekcije (npr. oblik koji je pogodan za subkutanoznu injekciju ili intravensku infuziju). Na primer, farmaceutska kompozicija može biti u tečnom doznom obliku koji je pogodan za injekcije. U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija je obezbeđena kao prah (npr., liofilizovan i/ili sterilizovan), opciono pod vakuumom, koji se može rekonstituisati sa vodenim razblaživačem (npr., vodom, puferom, rastvorom soli, itd.) pre injekcije. U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije se razblažuju i/ili rekonstituišu u vodi, rastvoru natrijum hlorida, rastvoru natrijum acetata, rastvoru benzil alkohola, fiziološkom rastvoru puferovanog fosfatom, itd., nije protresen).

[0337] Formulacije farmaceutskih kompozicija opisanih ovde mogu biti pripremljene bilo kojim postupkom poznatim ili razvijenim u farmakologiji. Generalno, takvi pripremni postupci uključuju korak dovođenja aktivnog sastojka u vezu sa razblaživačem ili drugim ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka, a zatim, ako je potrebno i/ili poželjno, oblikovanje i/ili pakovanje proizvoda u željenu jedinicu sa jednom ili više doza.

[0338] U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija koja uključuje antitelo proizvedeno od životinje koja nije humana, koja je ovde otkrivena, može biti uključena u kontejner za skladištenje ili davanje, na primer, bočicu, špric (npr. špric za intravensku terapiju) ili vrećicu (npr. vrećicu za IV). Farmaceutska kompozicija u skladu sa ovim otkrićem može biti pripremljena, upakovana i/ili prodata u rasutom obliku kao pojedinačna jedinična doza, i/ili kao više pojedinačnih doza. Kako se ovde koristi, "jedinična doza" je diskretna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka je generalno jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi se dala subjektu i/ili pogodnom delu takve doze kao što je, na primer, polovina ili jedna trećina takve doze.

[0339] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa i/ili bilo kojih dodatnih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa otkrićem će varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine i/ili stanja subjekta koji se leči i dalje u zavisnosti od puta kojim se kompozicija primenjuje. Na primer, kompozicija može da sadrži između 0,1% i 100% (mas/mas) aktivnog sastojka.

[0340] Farmaceutska kompozicija može dodatno da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kako se ovde koristi, uključuje bilo koji ili sve rastvarače, disperzione medije, razblaživače ili druge tečne vehikule, disperzione ili suspenzijske pomoćne supstance, površinski aktivne agense, izotonične agense, zgušnjivače ili agensi za emulgovanje, konzervansi, čvrsta veziva, lubrikanti i slično, kako odgovaraju određenom željenom obliku doze. Remington's The Science and Practice of Pharmaci, 21. izdanje, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) otkriva različite ekscipijense koji se koriste u formulisanju farmaceutskih kompozicija i poznate postupke za njihovu pripremu. Osim ako je bilo koji uobičajeni ekscipijensni medijum nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, kao što je stvaranje bilo kakvog neželjenog biološkog efekta ili druga štetna interakcija sa bilo kojom drugom komponentom(ama) farmaceutske kompozicije, može se koristiti.

[0341] U nekim slučajevima, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% čist. U nekim slučajevima, ekscipijens je odobren za upotrebu kod ljudi i za veterinarsku upotrebu. U nekim slučajevima, pomoćna supstanca je odobrena od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država. U nekim slučajevima, pomoćna supstanca je farmaceutskog kvaliteta. U nekim slučajevima, ekscipijent ispunjava standarde Farmakopeje Sjedinjenih Država (USP), Evropske farmakopeje (EP), Britanske farmakopeje i/ili Međunarodne farmakopeje.

[0342] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se koriste u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, sredstva za dispergovanje i/ili granulaciju, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, sredstva za dezintegraciju, vezivna sredstva, konzervanse, pufere agensi, sredstva za podmazivanje i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu po potrebi biti uključeni u farmaceutske formulacije. Ekscipijenti kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije, sredstva za bojenje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, arome i/ili mirisi mogu biti prisutni u kompoziciji, prema proceni formulatora.

[0343] U nekim slučajevima, opisana farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa (npr. konzervans, inertni razblaživač, disperzioni agens, površinski aktivni agens i/ili emulgator, puferski agens, itd.). U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više konzervansa. U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije ne sadrže konzervans.

[0344] U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija je u obliku koji se može ohladiti i/ili zamrznuti. U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija je u obliku koji se ne može hladiti i/ili zamrzavati. U nekim slučajevima, rekonstituisani rastvori i/ili tečni oblici doze mogu se čuvati određeni vremenski period nakon rekonstitucije (npr.2 sata, 12 sati, 24 sata, 2 dana, 5 dana, 7 dana, 10 dana, 2 nedelje, mesec, dva meseca ili duže). U nekim slučajevima, skladištenje kompozicija antitela duže od navedenog vremena dovodi do razgradnje antitela.

[0345] Tečni dozni oblici i/ili rekonstituisani rastvori mogu sadržati čestice i/ili promenu boje pre primene. U nekim slučajevima, rastvor ne treba koristiti ako je promenio boju ili zamućen i/ili ako su čestice ostale nakon ceđenja.

[0346] Opšta razmatranja u vezi sa formulacijom i/ili proizvodnjom farmaceutskih agenasa mogu se naći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Kitovi

[0347] Takođe je opisano pakovanje ili kit koji sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih sa najmanje jednim mišem, mišijom ćelijom, fragmentom DNK, vektorom za ciljanje ili bilo kojom njihovom kombinacijom, kao što je ovde opisano. Kompleti se mogu koristiti u bilo kom primenljivom postupku (npr. postupak istraživanja). Opciono povezano sa takvim kontejnerom(ima) može biti obaveštenje u obliku koji je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koje obaveštenje odražava (a) odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za primenu na humanim bićima, (b) uputstva za upotrebu i/ili (c) ugovor koji reguliše transfer materijala i/ili bioloških proizvoda (npr. miša ili mišje ćelije kako je ovde opisano) između dva ili više entiteta i njihovih kombinacija.

[0348] U nekim slučajevima, obezbeđen je kit koji sadrži miša, mišju ćeliju, mišje tkivo, besmrtnu ćeliju, mišju ES ćeliju ili mišji embrion kao što je opisano. Takođe je prikazan kit koji sadrži aminokiselinu (npr., antitelo ili njegov fragment) iz miša, mišje ćelije, mišjeg tkiva, besmrtne ćelije, mišje ES ćelije, mišjeg embriona kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, kit koji sadrži nukleinsku kiselinu (npr., nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov fragment) iz miša, mišje ćelije, mišjeg tkiva, ovekovečene ćelije, mišje ES ćelije ili mišjeg embriona kao što je ovde opisano Takođe je otkriven kit koji sadrži sekvencu (sekvencu aminokiselina i/ili nukleinske kiseline) identifikovana iz miša, mišje ćelije, mišjeg tkiva, besmrtne ćelije, mišje ES ćelije ili mišjeg embriona kao što je ovde opisano.

[0349] Takođe je otkriven komplet kao što je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr., antitela ili njegovog fragmenta) za terapiju ili dijagnozu.

[0350] Takođe je prikazan kit kako je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr., antitela ili njegovog fragmenta) za lečenje, prevenciju ili poboljšanje bolesti, poremećaja ili stanja.

[0351] Ostale karakteristike određenih izvođenja će postati očigledne u toku sledećih opisa primera izvođenja, koji su dati za ilustraciju i nisu namenjeni da ih ograničavaju.

PRIMERI

[0352] Sledeći primeri su dati tako da stručnjaku iz oblasti tehnike opišu kako da napravi i koristi postupke i kompozicije koje su ovde opisane, i nemaju za cilj da ograniče obim onoga što pronalazači ovog predmetnog prikaza otkrića smatraju svojim pronalaskom. Osim ako nije drugačije naznačeno, temperatura je naznačena celzijusima, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1. Konstrukcija ciljanih vektora za generisanje miša koji eksprimira najmanje jedan lambda laki lanac iz lokusa kapa lakog lanca

Primer 1.1. Modifikovanje vektora ciljanja koji sadrži lambda konstantni region miša

[0353] Ovaj primer ilustruje primere postupaka za konstruisanje ciljanog vektora za umetanje u genom miša. Štaviše, ovaj primer pokazuje proizvodnju miša čiji genom zametne linije sadrži modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ. Konkretno, ovaj primer pokazuje konstrukciju vektora ciljanja za modifikovanje lokusa endogenog κ lakog lanca imunoglobulina kod miša tako da miš eksprimira i/ili proizvodi antitela koja uključuju λ lake lance imunoglobulina koji imaju humane varijabilne regione i mišji konstantne regione λ imunoglobulina (Cλ) iz navedenog lokusa lakog lanca imunoglobulina κ u zametnom genomu miša. Kao što je dole opisano u Primeru 2, fragmenti DNK koji sadrže višestruke humane Jλ (npr.

Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 i Jλ7) kodirajućih sekvenci i mišju Cλ (npr., mišji Cλ1) kodirajuću sekvencu se ubacuju u endogeni mišji imunoglobulinski κ lokus lakog lanca. U posebnim primerima izvođenja, mišji Cλ1 gen je umetnut na mesto mišjeg Cκ gena i u operativnoj vezi sa mišjim Igκ pojačivačima (npr. Eκ i i 3’Eκ). Primer strategije za kreiranje vektora ciljanja za generisanje projektovanog lokusa k lakog lanca imunoglobulina kod miša koji karakteriše prisustvo većeg broja segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa Cλ genom miša i operativno povezani sa endogenim pojačivačima Igκ su prikazani na Slici 1 (Slika 1A: početni koraci izgradnje vektora za ciljanje; Slika 1B: dodatni sledeći koraci konstrukcije vektora za ciljanje; sekvenca lakog lanca humanog imunoglobulina κ između segmenata humanog Vλ i Jλ gena je označena otvorenom trakom podneseno sa širokim dijagonalnim linijama nadole (npr. videti patente US br. 9,006,511, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 i 9,163,092), lox: lox2372; pod kontrolom gena lox2372, NEO: gen za rezistenciju na neomicin (neo<R>) pod transkripcionom kontrolom promotora ubikvitina, HYG: gen za otpornost na higromicin (hyg<R>) pod transkripcionom kontrolom promotora ubikvitina, Spec: gen za otpornost na Spectinomicin (Spec<R>), R6K: R6K početak replikacije).

[0354] Ciljni vektor koji sadrži humane Jλ i Cλ sekvence za umetanje u lokus lakog lanca imunoglobulina miša kreiran je korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., Patent SAD br.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003). Nature Biotech.21(6):652-9) i tehnike molekularne biologije poznate u tehnici. Oni sa uobičajenim veštinama, čitajući ovaj primer, će ceniti da se opisane tehnologije i pristup mogu koristiti za korišćenje bilo koje humane Jλ i bilo koje Cλ kodirajuće sekvence, ili kombinacije kodirajućih sekvenci (ili fragmenata sekvence) po želji.

[0355] Ukratko, fragment DNK od 2,7 kb koji sadrži segmente humanog Jλ gena Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 i Jλ7 i jedinstvene 5' i 3' regione koji se preklapaju koji odgovaraju humanoj Vk-Jk genomskoj (nekodirajućoj) sekvenci i genomskoj sekvenca 5' mišjeg Ck gena, respektivno, napravljena je de novo sintezom DNK (pA; Slika 1A, gore levo, Blue Heron Biotech, Bothell, VA). Različita mesta za prepoznavanje restrikcijskih enzima su uključena u DNK fragment da bi se olakšalo naknadno kloniranje selekcionih markera i drugih DNK fragmenata (opisanih u nastavku). Fragment DNK je jedinstveno dizajniran da sadrži nekodirajuće humane Jκ sekvence poredane sa humanim Jλ kodirajućim sekvencama i humanim Jλ rekombinacionim signalnim sekvencama (RSS). Kao što je poznato u tehnici, RSS se sastoji od konzerviranog bloka od sedam nukleotida (heptamera) nakon čega sledi razmak dužine 12 ili 23 para baza i nakon čega sledi drugi konzervirani blok od devet nukleotida (nonamer). Dakle, RSS ima konfiguraciju 7-12-9 (12RSS) ili 7-23-9 (23RSS) u zavisnosti od pridruženog genskog segmenta (vidi, npr., sliku 5.4 u see, e.g., Figure 5.4 in Murphy, Kenneth, et al. "Chapter 5." Janeway’s Immunobiology, 8th ed., Garland Science/Taylor & Francis Group, LLC, 2012). Posebno, segmenti humanog Jλ gena (tj. humane Jλ kodirajuće sekvence) i njima povezani 12RSS su zamenjeni umesto segmenata humanog Jk gena (tj. humanih Jκ kodirajućih sekvenci) i njima povezanih 23RSS. Dakle, ovaj fragment je sadržao humane Jλ i Jκ DNK sekvence. Uključivanje takvih sekvenci u ciljane vektore opisane ovde može obezbediti (ili promovisati) efikasno spajanje segmenata humanog Vλ i Jλ gena unutar projektovanog mišjeg Igκ lokusa lakog lanca.

[0356] Plazmid A (pA) je digestiran sa Agelom i EcoRI i vezan na kasetu za selekciju Neomicina (tj., Neo<R>gen pod kontrolom ubikvitinskog promotora okruženog lox2372 mestima) koji sadrži kompatibilne krajeve da bi se stvorio plazmid B (pB) (Slika 1A). Odvojeno, jedinstveni fragmenti DNK koji sadrže mišji Igκ intronski pojačivač (Ei), mišji Cλ1 gen (iz BAC klona RP23-60e14), fragment DNK koji sadrži 316bp sekvence odmah nizvodno od sekvence kodiranja Cκ miša i 80bp sekvence koja se preklapa da bi se olakšalo izotermni sklop i mesta za prepoznavanje restrikcionih enzima (NotI, Mlul) da bi se olakšali naredni koraci kloniranja, R6K-Spec (gen Spectinomicin Adenilitransferaze i R6K početak replikacije) su pojačani lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i kombinovani zajedno izotermnim sklapanjem (videti, npr., Gibson, D.G. et.al., 2009, Nat. Meth. 6(5):343-5; Gibson, D.G. et al., 2010, Nat. Meth. 7:901-903) za stvaranje plazmida C (pC), koji je zatim digestiran sa NotI i Mlul i vezan za kasetu za selekciju higromicina (tj., gen Hig<R>pod kontrolom ubikvitinskog promotora okruženog loxP mestima) koji sadrži kompatibilne krajeve da bi se stvorio plazmid D (pD; Slika 1A, gore i srednje desno). Ovaj dobijeni plazmid (pD; Slika 1A, sredina) je zatim digestiran sa PI-Scel i AscI i povezan sa plazmidom B (pB) koji sadrži kompatibilne krajeve (Slika 1A, dole) da bi se dobio plazmid E (pE).

[0357] U sledećem koraku, ciljani vektor koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa mišjim Ck genom i sekvencom lakog lanca humanog imunoglobulina k pozicionirani između segmenata humanog Vλ i Jλ gena (videti, npr., U.S. Patent br.9,006,511) je odvojeno digestiran sa NotI i ponovo spojeni da bi se uklonio humani Vλ region uključujući κ sekvencu humanog imunoglobulina (Slika 1B, vrh), što je rezultiralo brisanjem od ~137 kb. Dobijeni konstrukt (konstrukt F) je kombinovan sa plazmidom E (pE) korišćenjem CRISPR/Cas9 postupka izotermnog sklapanja (videti, npr., Patent SAD br.

9,738,897 i publikaciju SAD br.2016/0145646) tako da je humani Jκ region humana Jλ-12RSS kodirajuća sekvenca (CDS) bila je operativno povezana sa humanim Vκ-Jκ intergenskim (nekodirajućim) regionom (videti, npr., U.S. patent br.9,006,511) i mišjim Igκ 3' pojačivačem (Slika 1B). Pozitivni bakterijski klonovi su odabrani na medijumima koji sadrže Kanamicin, Higromicin i Spektinomicin. Rezultujući vektor za ciljanje (konstrukcija G) je sadržao, od 5' do 3', mesto za prepoznavanje loxP, NotI mesto, humanu Vκ-Jκ intergensku sekvencu (videti, npr., US Patent br.9,006,511), selekcionu kasetu neomicina sa strane prema lox2372 mestima za prepoznavanje, humani Jκ region sa pet humanih Jλ genetičkih segmenata i njihovim odgovarajućim 12RSS, intronički pojačivač mišjeg imunoglobulina κ (Eiκ), mišji Cλ1 gen, higromicin selekciona kaseta okružena loxP aglobulinskim lox3 imunoglobulinskim mestima, ' pojačivač (3' Eκ) i kaseta za selekciju Spectinomicinom (Slika 1B).

Primer 1.2. Modifikovanje vektora ciljanja koji sadrži humani lambda konstantni region

[0358] Ovaj primer ilustruje primere postupaka za dobijanje ciljanog vektora za umetanje u genom miša. Štaviše, ovaj primer pokazuje proizvodnju miša čiji genom zametne linije sadrži modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ. Konkretno, ovaj primer pokazuje konstrukciju vektora za ciljanje za projektovanje lokusa endogenog imunoglobulina κ lakog lanca kod miša tako da miš eksprimira i/ili proizvodi antitela koja uključuju λ lake lance imunoglobulina koji imaju humane varijabilne regione i λ konstantu humanog imunoglobulina (Cλ) regioni iz navedenog lokusa lakog lanca imunoglobulina κ u zametnom genomu miša. Kao što je dole opisano u Primeru 2, fragmenti DNK koji sadrže višestruke humane Jλ (npr. Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 i Jλ7) kodirajućih sekvenci i humanu Cλ (npr. humanu Cλ2) kodirajuću sekvencu se ubacuju u endogeni mišji imunoglobulin κ lokus lakog lanca. Konkretno, humani Cλ2 gen je umetnut na mesto mišjeg Cκ gena i u operativnoj vezi sa pojačivačima mišjeg imunoglobulina κ (npr. Eiκ i 3’Eκ). Primer strategije za kreiranje vektora ciljanja je prikazan na slici 3.

[0359] Ciljni vektor koji sadrži humane Jλ i humane Cλ kodirajuće sekvence za umetanje u lokus lakog lanca Igκ miša kreiran je korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., Patent US br. 6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9) i tehnike molekularne biologije poznate u oblasti tehnike. Oni sa uobičajenim veštinama, čitajući ovaj primer, će ceniti da se opisani pristup i tehnologije mogu koristiti za korišćenje bilo koje humane Jλ i Cλ kodirajuće sekvence, ili kombinacije kodirajućih sekvenci (ili fragmenata sekvence) po želji.

[0360] Ukratko, fragment DNK od 871 bp koji sadrži humanu Cλ kodirajuću sekvencu i jedinstvene 5' i 3' regione preklapanja koji odgovaraju genomskim sekvencama 5' i 3' mišjeg Cκ gena, respektivno, napravljen je de novo sintezom DNK (pH; Slika 3, gore levo, Blue Heron Biotech, Bothell, VA). Različita mesta za prepoznavanje restrikcijskih enzima su uključena u DNK fragment da bi se omogućilo naknadno kloniranje selekcionih markera i drugih DNK fragmenata (opisanih u nastavku). Plazmid H (pH) je digestiran sa Agelom i Xholom i vezan za kasetu za selekciju higromicina (tj. Hig<R>gen pod kontrolom ubikvitinskog promotora okruženog loxP mestima) koji sadrži kompatibilne krajeve da bi se stvorio plazmid J (pJ; Slika 3). Intermedijarni konstrukt (konstrukt K, generisan od konstrukta F i plazmida B korišćenjem Cas9 i izotermnog sklopa) koji sadrži modifikovani humani Jk region sa humanim Jλ kodirajućim sekvencama (opisanim gore) koji su operativno povezani sa mišjim Ck genom i pojačivačima mišjeg Igk kombinovan je sa plazmidom J upotrebom CRISPR/Cas9 postupka izotermnog sklapanja (videti, npr., Patent SAD br.

9,738,897 i publikaciju SAD br. 2016/0145646) tako da je humani Jκ region sa humanim Jλ-12RSS sekvencom kodiranja operativno povezan sa sekvencom kodiranja (CDS) humana Cλ2 kodirajuća sekvenca plazmida J (slika 3). Pozitivni bakterijski klonovi su odabrani na medijumima koji sadrže Kanamicin, Higromicin i Spektinomicin. Rezultujući vektor za ciljanje (konstrukcija L) je sadržao, od 5' do 3', mesto za prepoznavanje loxP, NotI mesto, humanu Vκ-Jκ intergensku sekvencu (videti, npr., US Patent br.

9,006,511), selekcionu kasetu Neomicina sa strane prema lox2372 lokacijama za prepoznavanje, humani Jκ region sa pet humanih Jλ genetičkih segmenata i njihovim odgovarajućim 12RSS, mišji Igκ intronski pojačivač (Eik), humani Cλ2 gen, higromicin selekcionu kasetu okružena loxP lokacijama za prepoznavanje, imunoglobulin 3 miša' pojačivač (3' Eκ) i kasetu za selekciju Spectinomicinom (Slika 3).

Primer 2. Dobijanje miševa koji imaju modifikovani lokus lakog lanca

[0361] Ovaj primer pokazuje proizvodnju miševa čiji zametni genim obuhvata endogeni imunoglobulinski κ lokus lakog lanca koji se sastoji od umetanja većeg broja segmenata humanogλ i Jλ gena i mišjeg Cλ gena, čiji su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani na pomenuti Cλ gen miša, i gde mišji Cλ gen je umetnut na mesto mišjeg Cκ gena endogenog imunoglobulinskog κ lokusa lakog lanca. Takve miševe karakteriše, u nekim izvođenjima, ekspresija λ lakih lanaca imunoglobulina (varijabilni i konstantni domeni) iz endogenog lokusa lakog lanca imunoglobulina κ.

[0362] Ciljano umetanje ciljanih vektora opisanih u Primerima 1.1 i 1.2 je potvrđeno lančanom reakcijom polimeraze. Ciljana BAC DNK, potvrđena lančanom reakcijom polimeraze, uvedena je u F1 hibridne (C57BL6NTac/129S6SvEvTac) ćelije embrionalnog matičnog (ES) miša putem elektroporacije nakon čega je usledilo kultivisanje u medijumu za selekciju.

[0363] ES ćelije korišćene za elektroporaciju konstrukta G (miš Cλ 1) imale su zametni genom koji je uključivao heterozigotni lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji sadrži više segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa konstantnim regionom gena lakog lanca imunoglobulina κ uključujući pojačivače lakog lanca imunoglobulina κ miša, i sekvencu lakog lanca k humanog imunoglobulina pozicioniranu između segmenata humanog Vλ i Jλ gena i jednog lokusa lakog lanca imunoglobulina κ miša divljeg tipa. ES ćelije pre i posle elektroporacije su prikazane na slici 2A (1741HET: mišji klon ES ćelije sa heterozigotnim genomom za modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa konstantnim regionom κ gena lakog lanca miša uključujući pojačivače lakog lanca imunoglobulina κ miša, i sekvencu lakog lanca imunoglobulina κ pozicioniranu između segmenata humanog Vλ i Jλ gena označenih otvorenom trakom sa širokim dijagonalnim linijama nadole, i lokusima teškog i λ lakog lanca imunoglobulina divljeg tipa, npr., videti patente US br. 9,006,511, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 i 9,163,092; 6557HET: mišji ES ćelijski klon nakon umetanja konstrukta lakog lanca G, koji dovodi do lanca lakog imunoglobulina, koji pojačava imuni lanac lakog imunog lanca κ modifikovani imunoglobulinski κ lokus lakog lanca karakteriše prisustvo većeg broja humanih segmenata Vλ i Jλ gena, koji su segmenti humanog Jλ gena sadržani u sekvenci humanog Jκ regiona sa sekvencama koje kodiraju segment humanog Jλ gena i humanim Jλ 12RSS umesto odgovarajućih sekvenci koje kodiraju segment humanog Jκ gena i humanim Jκ 23RSS, i pri čemu su humani Vλ i Jλ genski segmenti su operativno vezani za gen konstantnog regiona lakog lanca mišjeg imunoglobulina λ (npr., mCλ1); lox: lox2372; NEO: Gen otpornosti na neomicin (neo<R>) pod transkripcionom kontrolom promotora ubikvitina; HIG: Gen otpornosti na higromicin (hyg<R>) pod kontrolom transkripcije promotora ubikvitina; lokacije odabranih setova prajmera/sonde za skrining klonova ES ćelija su naznačene u blizini lokacija regiona unutar projektovanog lokusa Igκ lakog lanca otkrivenog u testu opisanom u nastavku).

[0364] ES ćelije korišćene za elektroporaciju konstrukta L (humani Cλ 2) imale su zametni genom koji je uključivao heterozigotni lokus lakog lanca imunoglobulina k koji sadrži više segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa konstantom lakog lanca imunoglobulina k miša gen regiona uključujući pojačivače lakog lanca imunoglobulina κ miša i sekvencu lakog lanca humanog imunoglobulina κ pozicioniranu između segmenata humanog Vλ i Jλ gena i jednog Igk lokusa divljeg tipa miša. ES ćelije pre i posle elektroporacije su prikazane na slici 4A (1741HET: supra; 20029HET: klon mišje ES ćelije nakon umetanja ciljanog vektora koji ima genom heterozigot za modifikovani Igκ lokus lakog lanca uključujući mišji imunoglobulin κ pojačivače lakog lanca Igk lokus lakog lanca karakteriše prisustvo većeg broja segmenata humanog Vλ i Jλ gena, čiji se segmenti humanog Vλ gena nalaze u sekvenci humanog Jκ regiona sa sekvencama koje kodiraju segment humanog Jλ gena i humanim Jλ 12RSS umesto odgovarajućeg humanog sekvence koje kodiraju segment gena Jκ i humani Jκ 23RSS, i koji su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca humanog Igλ (npr. hCλ2) lox: lox2372; NEO: gen otpornosti na neomicin (neo<R>) pod transkripcijom kontrola promotora ubikvitina; HIG: gen otpornosti na higromicin (hig<R>) pod transkripcionom kontrolom promotora ubikvitina; lokacije odabranih setova prajmera/sonde za skrining ES ćelija klonovi su naznačeni u blizini lokacija regiona unutar modifikovanog lokusa Igκ lakog lanca otkrivenog u testu opisanom u nastavku).

[0365] Kolonije otporne na lekove su sakupljene 10 dana nakon elektroporacije i pregledane pomoću TAKMANTM i kariotipizacije radi ispravnog ciljanja kao što je prethodno opisano (Valenzuela et al., supra; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol.476:295-307;). Tabela 1 daje primere skupova prajmera/sonda koji se koriste za skrining pozitivnih ES ćelijskih klonova (F: napred; R: obrnuto; P: sonda; GOA: dobitak alela; LOA: gubitak alela; WT: divlji tip).

[0366] VELOCIMOUSE® postupak (DeChiara, T.M. et al., 2010, Methods Enzymol.476:285-294; DeChiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol.530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol.25:91-99;), u kojem su ciljane ES ćelije ubrizgane u nekompaktne 8-ćelijske stadijume švajcarskih Vebster embriona, korišćen je za proizvodnju zdravih, potpuno ES ćelija izvedenih F0 generacije miševa heterozigotnih za modifikovani Igκ lokus lakog lanca (Slike 2A i 4A). Heterozigotni miševi F0 generacije su ukršteni sa C57Bl6/NTac miševima da bi se dobili F1 heterozigoti koji su ukršteni da bi se dobile homozigotne životinje generacije F2 za fenotipske analize.

[0367] Alternativno, mišje ES ćelije koje nose modifikovani imunoglobulin κ lokus kao što je gore opisano mogu se modifikovati da se uklone jedna ili više selekcionih kaseta uvedenih sa vektorom za ciljanje po želji (Slika 2B: 6557HET: supra; 6558HET: klon mišje ES ćelije posle ekscizija posredovane rekombinazom selekcionih kaseta neomicina i higromicina umetnute nakon homologne rekombinacije sa vektorom za ciljanje; Slika 4B: 20029HET: supra; 20030HET: klon mišje ES ćelije nakon ekscizije posredovane rekombinazom neomicina i rekombinaze umetnutog rekombinatnog selekcionog kaseta nakon homologne rekombinacije sa vektorom ciljanja Cre: Cre rekombinaza). Na primer, kaseta za neomicin i higromicin uvedena ciljanim vektorima može se ukloniti u konstruisanim ES ćelijama (ili embrionima) prolaznom ekspresijom rekombinaze ili razmnožavanjem do genski modifikovanog soja koji eksprimuje rekombinazu (videti npr. Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6; Orban, P.C. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:6861-5; Gu, H. et al., 1993, Cell 73(6):1155-64; Araki, K. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:160-4; Dymecki, S.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.93(12):6191-6).

[0368] Uzeto zajedno, ovaj primer ilustruje generisanje miša) čiji zametni genom obuhvata modifikovani lokus Igκ lakog lanca koji se karakteriše prisustvom većeg broja segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa mišjim Cλ genom, gde se mišji Cλ gen se ubacuje na mesto mišjeg Cκ gena endogenog Igκ lokusa lakog lanca. Modifikovani lokus lakog lanca Igk kao što je opisano uključuje mnoštvo segmenata humanog Vλ i Jλ gena u neendogenom rasporedu. Ovde opisana strategija za umetanje segmenata humanog Vλ i Jλ gena i mišjeg Cλ gena na mesto mišjeg Cκ gena omogućava konstrukciju miša koji eksprimira antitela koja isključivo sadrže humane Vλ domene. Bilo je nejasno da li bi tako modifikovani lokus Igk lakog lanca koji uključuje isključivo segmente λ gena (izvan endogenog λ lokusa, u neendogenoj orijentaciji) mogao da proizvede funkcionalne lake lance. Kao što je ovde opisano, takvi humani Vλ domeni su eksprimirani iz endogenih lokusa lakog lanca Igk u genomu zametne linije obezbeđenih miševa.

Tabela 1. Reprezentativni primer/setova sondi za skrining pozitivnih ES ćelijskih klonova Naziv Sekvenca (5’-3’) Test

F GTGGAAGATTGATGGCAGTGAAC (SEQ ID NO:25)

mIgKC-1 R GTGCTGCTCATGCTGTAGGT (SEQ ID NO:26) LOA

P AAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGA (SEQ ID NO:27)

F CCATCCAGTGAGCAGTTAACATC (SEQ ID NO:28)

mIgKC-2 R TGTCGTTCACTGCCATCAATC (SEQ ID NO:29) LOA

P AGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTC (SEQ ID NO:30)

F GGAGCCCTTCCTTGTTACTTCA (SEQ ID NO:31)

mIgKLC1-1 R AGGTGGAAACAGGGTGACTGATG (SEQ ID NO:32) GOA-6557

P TCCTCTGTGCTTCCTTCCTCAGGC (SEQ ID NO:33)

F TCCTTGTTACTTCATACCATCCTCT (SEQ ID NO:34)

mIgKLC1-2 R AGGGTGACTGATGGCGAAGACT (SEQ ID NO:35) GOA-6557

P TTCCTTCCTCAGGCCAGCCC (SEQ ID NO:36)

F GAGGCTTGCTGAGCTTTCAG (SEQ ID NO:37)

hIgKLJ-1 R AGGACGGTCAGCTTGGTC (SEQ ID NO:38) GOA P TATGAGCCTGTGTCACAGTGTTGGG (SEQ ID NO:39)

(nastavak)

Naziv Sekvenca (5’-3’) Test F GCTGACCCAGGACTCTGTTC (SEQ ID NO:40)

hIgKLJ-2 R TCCCAGTTCCGAAGACATAACAC (SEQ ID NO:41) GOA

P CCCTTTGGTGAGAAGGGTTTTGGTC (SEQ ID NO:42)

F TACGCGGCCAGCAGCTAT (SEQ ID NO:43)

hIgLC2-1 R TGGCAGCTGTAGCTTCTGT (SEQ ID NO:44) GOA-20029

P CTGAGCCTGACGCCTGAGCAG (SEQ ID NO:45)

F TCAACCTTTCCCAGCCTGTCT (SEQ ID NO:46)

1561hJl R CCCCAGAGAGAGAAAACAGATTTT (SEQ ID NO:47) LOA P ACCCTCTGCTGTCCCT (SEQ ID NO:49)

F GGTGGAGAGGCTATTCGGC (SEQ ID NO:50)

Neo R GAACACGGCGGCATCAG (SEQ ID NO:51) GOA P TGGGCACAACAGACAATCGGCTG (SEQ ID NO:52)

F TGCGGCCGATCTTAGCC (SEQ ID NO:53)

Hyg R TTGACCGATTCCTTGCGG (SEQ ID NO:54) GOA P ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC (SEQ ID NO:55)

F GGGCTACTTGAGGACCTTGCT (SEQ ID NO:56)

1468h2 R GACAGCCCTTACAGAGTTTGGAA (SEQ ID NO:57) Parentalni P CAGGGCCTCCATCCCAGGCA (SEQ ID NO:58)

F ATCTCCCTACTTCCTGGCTAATG (SEQ ID NO:59)

1525hk-VJ1 R GCTTGGAACCTGATTGGTTGTC (SEQ ID NO:60) Parentalni

P AGCCTTGATCCTTGGGAATCCAGGACA (SEQ ID NO:61)

F GCAAACAAAAACCACTGGCC (SEQ ID NO:62)

mIgKd2 R GGCCACATTCCATGGGTTC (SEQ ID NO:63) WT

P CTGTTCCTCTAAAACTGGACTCCACAGTAAATGGAAA (SEQ ID NO:64)

Primer 3. Karakterizacija miševa koji imaju modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina

Primer 3.1. Fenotipska procena imunskih ćelija kod miševa koji imaju modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina

[0369] Ovaj primer pokazuje karakterizaciju različitih populacija imunih ćelija kod miševa (npr. miševa) modifikovanih da sadrže više segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa mišjim Cλ genom, i pojačivač lakog lanca imunoglobulina k miša i regulatorni regioni, unutar lokusa lakog lanca endogenog imunoglobulina k. Konkretno, ovaj primer posebno pokazuje da miševi koji imaju ovde opisane konstruisane lokuse lakog lanca imunoglobulina k pokazuju jedinstveni profil ekspresije lakog lanca u poređenju sa miševima divljeg tipa. Ovaj primer takođe pokazuje da pod uslovom da miševi izražavaju širok repertoar humanih Vλ regiona iz projektovanog lokusa lakog lanca imunoglobulina k.

[0370] Ukratko, slezine i butne kosti su sakupljene iz divljeg tipa (WT, 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac) i 6558HO (homozigotni LiK, 75% C57BL/6NTac 25% Tac)SvEv. Koštana srž je sakupljena iz femura ispiranjem sa 1 X fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS, Gibco) sa 2,5% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Crvena krvna zrnca iz preparata slezine i koštane srži su lizirana sa ACK puferom za lizu (Gibco) nakon čega je usledilo ispiranje sa 1XPBS sa 2,5% FBS.

[0371] Izolovane ćelije (1X10<6>) su inkubirane sa odabranim koktelima antitela 30 minuta na 4°C: antimIgk-FITC (187.1, BD Biosciences), anti-mIgλ-PE (RML-42, BioLegend; 1060-09 , Southern Biotech), antimIgλ -FITC (106002, Bio-Rad; ABIN303989, Antibodies-online), anti-mišji IgM-PeCi7 (11/41, eBioscience), anti-miši IgD-PerCP/Ci5.5 (11-26c.2a, BioLegend), anti-mišji CD3-Pacific Blue (17A2, BioLegend), anti-mišji B220-APC (RA3-6B2, eBio-science), anti-mišji CD19-APC-H7 (ID3, BD Biosciences). Nakon bojenja, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehiu. Prikupljanje podataka je obavljeno na protočnom citometru BD LSRFORTESSATM i analizirano pomoću softvera FLOVJOTM. Reprezentativni rezultati su prikazani na slikama 5-7.

[0372] Kao što je prikazano na slikama 5 i 6, LiK miševi pokazuju slične raspodele CD19<+>i nezrelih/zrelih B ćelija u poređenju sa miševima divljeg tipa u odeljcima slezine i koštane srži, respektivno. Međutim, LiK miševi pokazuju jedinstvenu ekspresiju lakog lanca u poređenju sa miševima divljeg tipa u tome što je samo ekspresija Igλ<+>primećena kod ovih miševa (Slika 7). Konkretno, >90% CD19<+>B ćelija kod LiK miševa eksprimira λ laki lanac imunoglobulina čime se potvrđuje pravilna rekombinacija i ekspresija na konstruisanom imunoglobulinskom κ lokusu. Kao što se i očekivalo, s obzirom da ovi miševi nemaju mišji Cκ gen, LiK miševi ne pokazuju ekspresiju imunoglobulina κ koja se može detektovati protočnom citometrijom (tj., anti-mIgκ antitelo detektuje konstantni region). Slični nivoi ekspresije lakog lanca imunoglobulina λ primećeni su kod dodatnih LiK miševa iz legla (podaci nisu prikazani). Ekspresija humanih Vλ regiona u kontekstu mišjeg Cλ regiona sa LiK lokusa je potvrđena, između ostalog, analizom repertoara imunoglobulina korišćenjem tehnika sekvenciranja sledeće generacije (opisanih u Primeru 3.2 ispod).

Primer 3.2. Repertoar imunoglobulina kod miševa koji imaju modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina

[0373] Upotreba gena humanih antitela (tj. VDJ genetičkih segmenata) u projektovanom soju miša opisanom iznad je određena analizom repertoara antitela sledeće generacije. Konkretno, RT-PCR sekvenciranje je sprovedeno na RNK izolovanoj iz splenocita miševa homozigotnih za LiK lokus (6558 HO) da bi se potvrdila tačna transkripcija i rekombinacija LiK lokusa. Reprezentativna ilustracija preuređenog LiK lokusa je prikazana na Slici 12 (LiK lokus: modifikovani imunoglobulin k lokus lakog lanca kao što je ovde opisano; preuređeni LiK lokus: reprezentativno preuređenje konstruisanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina (ovde se pominje kao „LiK lokus") što rezultira humanom Vλ-Jλ rekombinacijom; preuređena LiK iRNK: reprezentativna transkripcija i obrada iRNK preuređenog LiK lokusa).

[0374] Ukratko, B ćelije slezine su pozitivno obogaćene iz ukupnih splenocita pomoću magnetnog sortiranja ćelija korišćenjem mišjih anti-CD19 magnetnih perli i MACS® kolona (Miltenii Biotech). Ukupna RNK je izolovana iz prečišćenih B ćelija slezine korišćenjem kompleta za izolaciju RNeasi Plus RNK (Kiagen) prema specifikacijama proizvođača. Reverzna transkripcija je izvedena da bi se generisala cDNK koja sadrži sekvencu gena konstantnog regiona imunoglobulina λ, korišćenjem kompleta za amplifikaciju cDNK SMARTerTM RACE (Clontech) i specifičnih prajmera za imunoglobulin λ (vidi dole). Tokom ovog procesa, sekvenca DNK, obrnuti kompliment sa 3' prajmera za prebacivanje šablona (TS), je pričvršćena na 3' kraj novosintetizovane cDNK. Prečišćene Igλ-specifične cDNK su zatim amplifikovane 1. rundom PCR reakcije korišćenjem TS specifičnog prajmera i reverznih prajmera specifičnih za sekvence Cλ1 miša. PCR proizvodi u rasponu od ~450-700bp su izolovani korišćenjem Pippin Prep-a (SAGE Science), a zatim su ovi fragmenti dalje amplifikovani 2. rundom PCR reakcije. Tabela 2 prikazuje sekvence odabranih prajmera koji se koriste za izgradnju biblioteke repertoara (za: unapred prajmer; rev: reverzni prajmer). PCR proizvodi u rasponu od ~400bp-700bp su izolovani, prečišćeni i kvantifikovani pomoću kPCR-a korišćenjem KAPA Library kompleta za kvantifikaciju (KAPA Biosistems) pre učitavanja u Miseq sekvencer (Illumina) za sekvenciranje korišćenjem Miseq kompleta reagensa v3 (2x300 ciklusa).

[0375] Za bioinformatičku analizu, Raw Illumina sekvence su de-mulpleksirane i filtrirane na osnovu kvaliteta, dužine i podudaranja sa odgovarajućim prajmerom gena konstantnog regiona. Preklapajuća čitanja uparenih krajeva su spojena i analizirana korišćenjem prilagođenog unutrašnjeg cevovoda. Cevovod je koristio lokalnu instalaciju IgBLAST-a (NCBI, v2.2.25+) za usklađivanje preuređenih sekvenci lakog lanca sa bazom segmenata gena Vλ i Jλ humane zametne linije, i označavao je produktivne i neproduktivne spojeve zajedno sa prisustvom stop kodona. CDR3 sekvence i očekivani nukleotidi koji nisu šabloni su ekstrahovani korišćenjem granica kako je definisano u Međunarodnom imunogenetičkom informacionom sistemu (IMGT).

Tabela 2. Reprezentativni prajmeri za konstrukciju repertoara bibilioteke

Naziv Sekvenca 3’)

prajmera

TS CACCATCGAT GTCGACACGC CTAGGG (SEQ ID NO:65)

prajmer

IgλC CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC (SEQ ID NO:66)

(RT

prajmer)

IgλC

(1st

PCR)

TS

specifični

(1st

PCR)

[0376] Većina funkcionalnih segmenata humanog Vλ Jλ gena uključenih u LiK lokus kod modifikovanih miševa koji su ovde prikazani kao primeri bili su predstavljeni u eksprimiranom repertoaru antitela LiK miševa koji se sastoji od više segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa mišjim Cλ genom na endogenom kapa lokusu (podaci nisu prikazani). Sve u svemu, pronalazači su primetili da B ćelije LiK miševa eksprimiraju antitela koja imaju lake lance eksprimirane iz LiK lokusa kako se očekivalo. U analiziranim transkriptima nisu primećeni izmenjeni proizvodi spajanja, insercije, delecije ili na drugi način neočekivane mutacije. Ovi rezultati potvrđuju da rekombinacija na LiK lokusu generiše funkcionalne lake lance kao deo repertoara antitela ovih miševa. Slična analiza je obavljena kod miševa koji su sadržali više segmenata humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa humanim Cλ genom na endogenom kapa lokusu, gde je otkrivena ekspresija većeg broja segmenata humanog Vλ i Jλ gena (podaci nisu prikazani).

Primer 3.3. Ekspresija antitela kod miševa koji imaju modifikovani lokus lakog lanca

[0377] Ovaj primer pokazuje ekspresiju antitela (npr., IgG) od miševa, koja antitela sadrže lake lance okarakterisane prisustvom humanih Vλ regiona i Cλ regiona miša, i koji laki lanci su eksprimirani iz konstruisanog endogenog mišjeg imunoglobulina κ lakog lanca lokusa. Između ostalog, ovaj primer posebno pokazuje ekspresiju IgG antitela (u dimernim i monomernim oblicima) u serumu miševa čiji zametni genom obuhvata endogeni imunoglobulinski κ lokus lakog lanca koji uključuje umetanje jednog ili više segmenata humanog Vλ gena, jednog ili više humanih segmenata gena Jλ i Cλ miša, pri čemu su su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno povezani sa navedenim Cλ genom miša, i koji mišji Cλ gen je umetnut na mesto mišjeg Ck gena endogenog mišjeg lokusa lakog lanca Igk.

[0378] Krv je uzeta iz divljeg tipa (WT, 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac) i 6558 homozigotnih ("LiK", 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac) miševa. Serum je odvojen od krvi korišćenjem Ependorfovih epruveta centrifugiranih na 9000 o/min pet minuta na 4°C. Sakupljeni serum je korišćen za imunoblotovanje da bi se identifikovala ekspresija IgG antitela.

[0379] Mišji serumi su razblaženi 1:100 ili 1:500 u PBS (bez Ca2<+>i Mg2<+>) i stavljeni na 4-20% Novek Tris-Glicine gelove u redukcionim i neredukcionim uslovima. Gelovi su prebačeni na membrane od poliviniliden difluorida (PVDF) prema specifikacijama proizvođača. Mrlje su blokirane preko noći sa 5% nemasnog mleka u tris-puferisanom fiziološkom rastvoru sa 0,05% Tveen-20 (TBST, Sigma). PVDF membrane su bile izložene primarnom antitelu (kozji anti-mlgGl konjugovan sa HRP, Southern Biotech) razblaženom 1:1000 u 0,1% nemasnom mleku u TBST tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Mrlje su oprane četiri puta po deset minuta po pranju i razvijene pet minuta sa Amersham ECL Vestern Blotting reagensom za detekciju (GE Healthcare Life Sciences) u skladu sa specifikacijama proizvođača. Mrlje su zatim snimljene korišćenjem GE Healthcare ImageKuant LAS-4000 Cooled CCD Camera Gel Documentation System. Slike su snimane u intervalima od 15 sekundi sve dok nije snimljeno 20 slika ili dok slike nisu bile potpuno eksponirane, šta god je bilo prvo. Reprezentativni rezultati su prikazani na slici 13 (brojevi traka su naznačeni na vrhu svake slike gela i dodela traka je ista za obe slike; gore levo: smanjeni uzorci; dole levo: neredukovani uzorci; LiK HO: 6558 homozigot; WT: divlji tip; molekulske težine su naznačene na levoj strani svake slike gela).

[0380] Kao što je prikazano na slici 13, veličina IgG antitela izraženih kod LiK miševa je slična veličini primećenoj za IgG antitela izražena kod miševa divljeg tipa, što pokazuje da LiK miševi proizvode funkcionalna antitela koja vezuju antigen i mogu se koristiti kao in vivo sistem za proizvodnju humanih antitela i komponenti humanih antitela za upotrebu u lečenju humanih bolesti.

Primer 4. Generisanje i karakterizacija miševa koji sadrže nekoliko konstruisanih imunoglobulinskih lokusa

[0381] LiK miševi, kao što je ovde opisano, odvojeno su uzgajani sa više konstruisanih sojeva miševa tokom višestrukog razmnožavanja korišćenjem tehnika poznatih u tehnici da se utvrde sojevi miševa koji sadrže sledeće konstruisane lokuse imunoglobulina: (1) soj miša homozigot za humanizovani teški lanac imunoglobulina (videti, npr., patente SAD br. 8,642,835 i 8,697,940 za laki lanac imunoglobulina), lokus koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa Cλ genom kako je ovde opisan i homozigot za inaktivirani lokus lakog lanca endogenog imunoglobulina λ (videti, npr., US Patent br.

9,006,511), u nekim izvođenjima koji se ovde pominju kao HoH /λ<-/->miševi, (2) soj miša homozigot za humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina (supra), homozigot za inaktivirani endogeni λ lokus lakog lanca imunoglobulina (supra) i hemizigot za lokus lakog lanca imunoglobulina k ima prvi lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa Cλ genom kao što je ovde opisano i drugi lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji sadrži humane Vκ i Jκ segmente gena koji su operativno povezani sa endogenim mišjim Cκ genom (videti, npr., US patent br. 8,642,835 i 8,697,940), u nekim izvođenjima koji se ovde pominju kao HoH/KoK/LiK/λ<-/->miševi. Alternativno, takvi miševi se mogu generisati uvođenjem ciljanih vektora koji sadrže projektovane lokuse u ES ćelije koje već sadrže nekoliko konstruisanih imunoglobulinskih lokusa. U nekim izvođenjima, lokus teškog lanca imunoglobulina kod navedenih miševa sadrži funkcionalan i eksprimiran mišji Adam6 gen.

[0382] Konkretno, LiK miševi su uzgajani sa više konstruisanih sojeva miševa u višestrukim uzgojima da bi se ustanovili HoH/LiK/λ<-/->i HoH/KoK/LiK/λ<-/->miševi.

[0383] Jednom ustanovljene, različite populacije imunih ćelija su okarakterisane kod ovih humanizovanih miševa pomoću protočne citometrije. Ukratko, slezine i butne kosti su sakupljene iz HoH/LiK/λ<-/->(n=3), HoH/KoK/LiK/λ<-/->(n=4) i VELOCIM-MUNE® („HoH/KoK“; n =3; videti US patente br.8,642,835 i 8,697,940) miševa i pripremljeni za analizu protočnom citometrijom kao što je gore opisano. Reprezentativni rezultati su prikazani na slikama 8-11. Prosečna ekspresija lakog lanca (k: λ) primećena u splenocitima testiranih konstruisanih sojeva miševa bila je približno sledeća: HoH/LiK/λ<-/->: 0:100, HoH/KoK/LiK/λ<-/->: 40:60, HoH/KoK: 85:15.

Primer 5. Proizvodnja antitela kod modifikovanih miševa

[0384] Ovaj primer pokazuje proizvodnju antitela kod miša koji sadrži modifikovani endogeni imunoglobulinski κ lokus lakog lanca kao što je gore opisano korišćenjem antigena od interesa (npr., jednoprolazni ili višeprolazni membranski protein, itd.). Postupci koji su opisani u ovom primeru, ili postupci imunizacije dobro poznati u tehnici, mogu se koristiti za imunizaciju miševa koji sadrže modifikovani endogeni κ lokus lakog lanca imunoglobulina kao što je opisano sa različitim antigenima (npr., polipeptidima, itd.). Bilo koji genetički modifikovani miševi koji su ovde gore opisani, npr., LiK miševi - miševi koji sadrže lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji sadrži segmente humanog Vλ i Jλ gena koji su operativno povezani sa Cλ genom (kao što su miševi homozigotni za LiK lokus); HoH/LiK/λ<-/>-miševi - miševi koji sadrže LiK lokus (kao što su miševi homozigoti za LiK lokus) i koji takođe sadrže lokus teškog lanca humanizovanog imunoglobulina (videti, npr., patente SAD br.8,642,835 i 8,642,835 i 8,640, inaktivirani endogeni) lokus lakog lanca imunoglobulina λ (videti, npr., U.S. patent br.9,006,511); i HoH/KoK/LiK/λ<-/->miševi - miševi hemizigotni za lokus lakog lanca imunoglobulina κ koji imaju prvi lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži LiK i drugi lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži segmente humanog Vκ i Jκ gena koji su operativno povezani sa endogeni mišji Cκ gen (videti, npr., US patent br.8,642,835 i 8,697,940), a takođe sadrži lokus teškog lanca humanizovanog imunoglobulina (videti, npr., US patent br.

9,006,511), može se koristiti za proizvodnju antitela nakon imunizacije antigenom od interesa. Takvi miševi su pogodni za imunizaciju i proizvodnju humanih antitela i/ili fragmenata humanih antitela.

[0385] LiK miševi koji dalje uključuju projektovane imunoglobulinske lokuse opisane gore su izazvani antigenom od interesa korišćenjem postupka imunizacije poznatih u tehnici. Imuni odgovor antitela se prati ELISA imunoesejem (tj. titar seruma). Kada se postigne željeni imuni odgovor, splenociti (i/ili drugo limfno tkivo) se sakupljaju i spajaju sa ćelijama mijeloma miša da bi se sačuvala njihova održivost i formirale besmrtne ćelijske linije hibridoma. Generisane ćelijske linije hibridoma se pregledaju (npr. ELISA testom) i biraju da identifikuju ćelijske linije hibridoma koje proizvode antigen-specifična antitela. Hibridomi se mogu dalje okarakterisati za relativni afinitet vezivanja i izotip po želji. Koristeći ovu tehniku, i imunogen opisan gore, dobija se nekoliko antigen-specifičnih himernih antitela (tj. antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene).

[0386] DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakih lanaca može biti izolovana ili pripremljena na drugi način, i može biti povezana sa humanim teškim lancem i konstantnim regionima lakog lanca (npr. željenog izotipa) za pripremu potpuno humanih antitela. Takva potpuno humana antitela (i/ili njihovi teški ili laki lanci) mogu se proizvesti u ćeliji, tipično u ćeliji sisara kao što je CHO ćelija. Potpuno humana antitela se zatim mogu okarakterisati za relativni afinitet vezivanja i/ili neutralizujuću aktivnost antigena od interesa.

[0387] DNK koja kodira antigen-specifična himerna antitela proizvedena od B ćelija modifikovanih miševa opisanih i/ili prikazanih ovde i/ili njihovih varijabilnih domena lakih i/ili teških lanaca, mogu se izolovati direktno iz limfocita specifičnih za antigen. Na primer, himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region mogu se izolovati i okarakterisati tako da se definišu određena antitela (i/ili B ćelije koje ih proizvode) od interesa. Da damo samo nekoliko primera, procenjene karakteristike takvih antitela, i/ili varijabilni i/ili njihovi konstantni regioni, mogu biti ili uključivati jedan ili više od afiniteta, selektivnosti, identiteta epitopa, itd.

[0388] Konstantni regioni miša su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisala potpuno humana antitela. Dok odabrani konstantni region može da varira u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena visokog afiniteta i specifičnosti cilja nalaze se u varijabilnom regionu. Alternativno, kada se koriste LiK miševi koji sadrže humani Cλ2 gen umesto mišjeg Cκ gena kao što je ovde opisano, korak zamene konstantnog regiona miša u antitelu izolovanom od imunizovanog miša je izostavljen. Antigen-specifična antitela se takođe izoluju direktno iz antigen pozitivnih B ćelija (od imunizovanih miševa) bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u, npr., U.S. patentu br.

7,582,298. Upotrebom ovog postupka, napravljeno je nekoliko potpuno humanih antigen-specifičnih antitela (tj. antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene).

Primer 6. Generisanje miševa sa modifikovanim lokusom lakog lanca i ekspresijom gena humane terminalne deoksinukleotidil transferaze (TdT)

Primer 6.1. Dobijanje miševa koji imaju modifikovani lokus lakog lanca i eksprimiraju humanu TDT

[0389] Ovaj primer ilustruje generisanje miševa čiji zametni genom sadrži modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina κ kako je ovde opisano i dalje ekspresuje humani TdT. Miševi koji eksprimiraju humani TdT su napravljeni kao što je opisano u Primeru 1.1. iz VO 2017/210586,. Miševi koji imaju genom koji sadrži i lokus lakog lanca imunoglobulina κ kao što je ovde opisano i dalje eksprimirajući humanu TdT, generisani su višestrukim uzgojem da bi se uspostavile kohorte mišjih sojeva koji sadrže obe modifikacije.

Primer 6.2. Fenotipska procena miševa koji imaju modifikovani Kapa lokus i izražavaju humanu TDT

[0390] Jednom ustanovljene, populacije imunih ćelija su okarakterisane kod ovih humanizovanih miševa pomoću protočne citometrije. Ukratko, slezine i femuri su sakupljeni od HoH/LiK/λ<-/-/>TdT (n=4) i HoH/KoK/LiK/λ<-/->/TdT (n=6) miševa i pripremljeni za analizu protočne citometrije kako je opisano gore (vidi Primer 3 iznad). Reprezentativni rezultati su prikazani na slikama 14-17. Prosečna ekspresija lakog lanca (k: λ) primećena u splenocitima modifikovanih sojeva miševa je bila sledeća: HoH/LiK/ λ<-/->/TdT: 0:100, HoH/KoK/LiK/ λ<-/->/TdT: 45 :55.

Primer 6. 3. Spojni diverzitet humanog imunoglobulina kapa i nezametni kod LiK miševa koji sadrže humanu TdTS

[0391] Kao što je pokazano u VO 2017/210586, miševi koji sadrže egzogeno uvedenu TdT su pokazali povećanje i u spojnoj raznolikosti i u dodacima nukleotida koji nisu zametne linije (takođe "dodaci nukleotida bez matrice" kako se ovde koriste) u svojim lakim lancima. Miševi koji sadrže HoH/LiK/ λ<-/-/>TdT i HoH/KoK/LiK/ λ<-/->/TdT su procenjeni da bi se utvrdila raznolikost sekvenci repertoara imunoglobulina i prisustvo dodataka nukleotida koji nisu matrice u njihovom CDR3 korišćenjem tehnologije sekvenciranja sledeće generacije.

[0392] Ukratko, splenociti su sakupljeni od miševa i B ćelije su pozitivno obogaćene iz ukupnih splenocita anti-mišjim CD19 magnetnim perlama i MACS kolonama (Miltenii Biotech). Ukupna RNK je izolovana iz B ćelija slezine korišćenjem kompleta RNeasi Plus (Kiagen).

[0393] Reverzna transkripcija sa oligo-dT prajmerom praćena genetičkim specifičnim PCR je izvedena da bi se generisala cDNK koja sadrži Cλ1 sekvencu miša, korišćenjem SMARTer<TM>RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). Tokom reverzne transkripcije, specifična DNK sekvenca (PIIA: 5’-CCCATGTACT CTGCGTTGAT ACCACTGCTT-3’, SEQ ID NO:71) je pričvršćena za 3’ kraj novosintetisane cDNK. cDNK su prečišćene pomoću NucleoSpin Gela i PCR Clean-Up Kit-a (Clontech), a zatim dalje amplifikovane korišćenjem reverznog komplimenta prajmera za PIIA (5'-AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AG- TACAT- 3', SEK ID NO:72) uparen sa mišjim Cλ1 specifičnim prajmerom (5'-CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC-3', SEK ID NO:73).

[0394] Prečišćeni amplikoni su zatim amplifikovani pomoću PCR-a korišćenjem PIIA specifičnog prajmera (5'-GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATTCTAAGCAG TGGTATCAAC GCAGAGT-3', SEQ ID NO:74 ubačenog mišjeg Cλ-1 specifičnog prajmera (GTGACTGGAG TTCAGACGTGTGTCTAAGCTTCGTCGGCGGCGCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC GCGCGCGCGC ACTGATG-3', SEQ ID NO: 75. PCR proizvodi između 450-690 bp su izolovani i sakupljeni od strane Pippin Prep (SAGE Science). Ovi fragmenti su dalje amplifikovani PCR-om korišćenjem sledećih prajmera: 5'-AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACX XXXXXACACT CTTTC-CCTTC ACGACGCTCT TCCGATC-3', SEQ ID NO:76 i 5'-CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATXXXXXX GT-GACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCT-3', SEQ ID NO:77 („XXXXXX“ predstavlja sekvencu višestrukog indeksiranja sekvence od 6bp). PCR proizvodi između 490bp-710bp su izolovani i sakupljeni pomoću Pippin Prep-a, zatim kvantifikovani pomoću kPCR-a koristeći KAPA Library kvantifikacioni komplet (KAPA Biosistems) pre učitavanja na Miseq sekvencer (Illumina) za sekvenciranje (v3, 600 ciklusa).

[0395] Za bioinformatičku analizu, rezultujuće Illumina sekvence su de-multipleksirane i isečene radi kvaliteta. Čitanja uparenih krajeva koja se preklapaju su zatim sastavljena i označena korišćenjem lokalne instalacije igblasta (NCBI, v2.2.25+). Čitanja su usklađena sa bazom podataka Vλ i Jλ segmenata humane zametne linije i sortirana za najbolji pogodak. Sekvenca je označena kao dvosmislena i uklonjena iz analize kada je otkriveno više najboljih pogodaka sa identičnim rezultatom. Razvijen je set internih perl skripti za analizu rezultata.

[0396] Lambda laki lanci B ćelija slezine HoH/LiK/λ<-/->/TdT miševa, i lambda i kapa laki lanci B ćelija slezine HoH/KoK/LiK/λ<-/->/TdT miševa, ispitivani su na povećanje dodavanja bez matrica i diverziteta spojeva na lambda i/ili kapa lokusima. Laki lanci HoH/LiK/λ<-/->/TdT i HoH/KoK/LiK/λ<-/->/TdT miševa pokazali su najmanje 2 puta povećanje različitosti spojeva mereno brojem jedinstvenih CDR3/ 10.000 čitanja (podaci nisu pokazano). Pored toga, oko 50% lakih lanaca (lambda i/ili kapa) iz HoH/LiK/λ<-/->/TdT i HoH/KoK/LiK/λ<-/->/TdT miševa je pokazalo dodatke koji nisu matrice u poređenju sa lakim lancima iz kontrolnih miševa bez TdT, koji su pokazali samo oko 10% dodataka bez matrica (podaci nisu prikazani).

Primer 7. Imunizacija modifikovanih miševa i analiza imunog odgovora na imunogene

[0397] Ovaj primer ilustruje imunizaciju LiK/Vλ-3 i LiK/Vλ-3/TdT miševa i analizu odgovora serumskih antitela na imunogene. Ukratko, (1) Vλ-3/TdT (npr. pozitivna kontrola za humani kapa laki lanac, koji takođe ima endogene mišje lokuse lambda lakog lanca) i Vλ-3 miševi sa humanim lambda lakim lancima, (2) LiK/Vλ- 3 i (3) LiK/Vλ-3/TdT, respektivno, imunizovani su proteinskim imunogenima korišćenjem standardnih protokola i adjuvansa. Miševima je puštena krv pre početka imunizacije i periodično im je krvarena nakon pojačavanja imunogena. Titri antiseruma su analizirani na odgovarajućim antigenima.

[0398] Titri antitela u serumu protiv imunogena su određeni korišćenjem ELISA. Devedeset mikrotitarskih ploča sa šest bunarića (Pierce) je obloženo antigenima u količini od 2 µg/ml u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS, Irvine Scientific) preko noći na 4°C. Ploče su isprane sa PBS koji sadrži 0,05% Tveen-20 (PBS-T, Sigma-Aldrich) i blokirane sa 250 µl 0,5% albumina goveđeg seruma (BSA, Sigma-Aldrich) u PBS tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS-T. Preimunskii i imunskii anti-serumi su serijski razblaženi tri puta u 1% BSA-PBS i dodavani na ploče 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i dodata su konjugovana sekundarna antitela kozjeg antimišjeg IgG-Fc-peroksidaze peroksidaze rena (HRP) (Jackson Immunoresearch), kozja antimišja Kappa-HRP (SouthernBiotech) ili kozja antimišja Lambda-HRP (SouthernBiotech). u razblaženju 1:5000 na ploče i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i razvijene korišćenjem TMB/H2O2kao supstrata inkubacijom od 15-20 minuta. Reakcija je zaustavljena kiselinom i ploče su očitane na spektrofotometru (Victor, Perkin Elmer) na 450 nm. Titri antitela su izračunati korišćenjem softvera Graphpad PRISM. Titar je definisan kao interpolirani faktor razblaženja seruma čiji je signal vezivanja 2 puta veći u odnosu na pozadinu.

[0399] Humoralni imuni odgovori kod LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT i VI-3/TdT miševa su ispitivani nakon imunizacije proteinskim imunogenom. Antiserumi miševa imunizovanih proteinom pokazuju visoke titre antigena u sojevima LiK/VI-3 i LiK/VI-3/TdT uporedivim sa VI-3/TdT sojem (Slika 18). Visoki lambda titri su izazvani i kod LiK/VI-3 i LiK/VI-3/TdT miševa. Kod miševa VI-3/TdT soja, lambda titri nisu primećeni kod tri miša, dok su niski titri primećeni kod dva miša, što odgovara maloj upotrebi mišjih lambda varijabli u ovom soju. Kao što se očekivalo, kod LiK/VI-3 i LiK/VI-3/TdT miševa nije došlo do kapa titara jer im nedostaje kapa laki lanac, dok je VI-3/TdT pokazao visoke kapa titre. Slika 19 pokazuje početni titri (najniže razblaženje seruma) primećeni na irelevantnom proteinskom antigenu za His tag kod sva tri soja miševa sa anti-Fc i anti-kapa detekcijom, dok su veoma niski titri primećeni sa anti-lambda detekcijom u LiK/VI-3 i LiK/VI-3/TdT miševima.

Software Name: WIPO Sequence

Software Version: 2.1.0

Production Date: 2022-08-02

General Information:

Current application / IP Office: EP

Current application / Applicant file reference: N419123EP-A

Earliest priority application / IP Office: US

Earliest priority application / Application number: 62/594,944

Earliest priority application / Filing date: 2017-12-05

Applicant name: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

Applicant name / Language: en

Invention title: NON-HUMAN ANIMALS HAVING AN ENGINEERED IMMUNOGLOBULIN LAMBDA LIGHT CHAIN AND USES THEREOF ( en )

Sequence Total Quantity: 77

Sequences:

Sequence Number (ID): 1

Length: 317

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..317

> mol_type, genomic DNA

> organism, Mus sp.

Residues:

gccagcccaa gtcttcgcca tcagtcaccc tgtttccacc ttcctctgaa gagctcgaga 60

ctaacaaggc cacactggtg tgtacgatca ctgatttcta cccaggtgtg gtgacagtgg 120

actggaaggt agatggtacc cctgtcactc agggtatgga gacaacccag ccttccaaac 180

agagcaacaa caagtacatg gctagcagct acctgaccct gacagcaaga gcatgggaaa 240

ggcatagcag ttacagctgc caggtcactc atgaaggtca cactgtggag aagagtttgt 300

cccgtgctga ctgttcc 317

Sequence Number (ID): 2

Length: 106

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..106

> mol_type, protein

> organism, Mus sp.

Residues:

GQPKSSPSVT LFPPSSEELE TNKATLVCTI TDFYPGVVTV DWKVDGTPVT QGMETTQPSK 60 QSNNKYMASS YLTLTARAWE RHSSYSCQVT HEGHTVEKSL SRADCS 106

Sequence Number (ID): 3

Length: 314

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..314

> mol_type, genomic DNA

> organism, Mus sp.

Residues:

gtcagcccaa gtccactccc actctcaccg tgtttccacc ttcctctgag gagctcaagg 60

aaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ccaacttttc cccg 1a0g7tggt gtgacagtgg 120

cctggaaggc aaatggtaca cctatcaccc agggtgtgga cacttcaaat cccaccaaag 180

Sequence Number (ID): 4

Length: 105

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Mus sp.

Residues:

GQPKSTPTLT VFPPSSEELK ENKATLVCLI SNFSPSGVTV AWKANGTPIT QGVDTSNPTK 60 EGNKFMASSF LHLTSDQWRS HNSFTCQVTH EGDTVEKSLS PAECL 105

Sequence Number (ID): 5

Length: 314

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..314

> mol_type, genomic DNA

> organism, Mus sp.

Residues:

gtcagcccaa gtccactccc acactcacca tgtttccacc ttcccctgag gagctccagg 60

aaaacaaagc cacactcgtg tgtctgattt ccaatttttc cccaagtggt gtgacagtgg 120

cctggaaggc aaatggtaca cctatcaccc agggtgtgga cacttcaaat cccaccaaag 180

aggacaacaa gtacatggcc agcagcttct tacatttgac atcggaccag tggagatctc 240

acaacagttt tacctgccaa gttacacatg aaggggacac tgtggagaag agtctgtctc 300

ctgcagaatg tctc 314

Sequence Number (ID): 6

Length: 105

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Mus sp.

Residues:

GQPKSTPTLT MFPPSPEELQ ENKATLVCLI SNFSPSGVTV AWKANGTPIT QGVDTSNPTK 60 EDNKYMASSF LHLTSDQWRS HNSFTCQVTH EGDTVEKSLS PAECL 105

Sequence Number (ID): 7

Length: 314

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..314

> mol_type, genomic DNA

> organism, Rattus sp.

Residues:

gtcagcccaa gtccactccc acactcacag tatttccacc ttcaactgag gagctccagg 60

gaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ctgatttcta cccgagtgat gtggaagtgg 120

cctggaaggc aaatggtgca cctatctccc agggtgtgga cactgcaaat cccaccaaac 180

agggcaacaa atacatcgcc agcagcttct tacgtttgac agcagaacag tggagatctc 240

gcaacagttt tacctgccaa gttacacatg aagggaacac tgt 1g08gagaag agtctgtctc 300

ctgcagaatg tgtc 314

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Rattus sp.

Residues:

GQPKSTPTLT VFPPSTEELQ GNKATLVCLI SDFYPSDVEV AWKANGAPIS QGVDTANPTK 60 QGNKYIASSF LRLTAEQWRS RNSFTCQVTH EGNTVEKSLS PAECV 105

Sequence Number (ID): 9

Length: 314

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..314

> mol_type, genomic DNA

> organism, Rattus sp.

Residues:

accaacccaa ggctacgccc tcagtcaccc tgttcccacc ttcctctgaa gagctcaaga 60

ctgacaaggc tacactggtg tgtatggtga cagatttcta ccctggtgtt atgacagtgg 120

tctggaaggc agatggtacc cctatcactc agggtgtgga gactacccag cctttcaaac 180

agaacaacaa gtacatggct accagctacc tgcttttgac agcaaaagca tgggagactc 240

atagcaatta cagctgccag gtcactcacg aagagaacac tgtggagaag agtttgtccc 300

gtgctgagtg ttcc 314

Sequence Number (ID): 10

Length: 105

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Rattus sp.

Residues:

DQPKATPSVT LFPPSSEELK TDKATLVCMV TDFYPGVMTV VWKADGTPIT QGVETTQPFK 60 QNNKYMATSY LLLTAKAWET HSNYSCQVTH EENTVEKSLS RAECS 105

Sequence Number (ID): 11

Length: 314

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..314

> mol_type, genomic DNA

> organism, Rattus sp.

Residues:

gtcagcccaa gtccactccc acactcacag tatttccacc ttcaactgag gagctccagg 60

gaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ctgatttcta cccgagtgat gtggaagtgg 120

cctggaaggc aaatggtgca cctatctccc agggtgtgga cactgcaaat cccaccaaac 180

agggcaacaa atacatcgcc agcagcttct tacgtttgac agcagaacag tggagatctc 240

gcaacagttt tacctgccaa gttacacatg aagggaacac tgtggaaaag agtctgtctc 300

ctgcagagtg tgtc 314

Sequence Number (ID): 12 109

Length: 105

- , ..

> mol_type, protein

> organism, Rattus sp.

Residues:

Sequence Number (ID): 13

Length: 314

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..314

> mol_type, genomic DNA

> organism, Rattus sp.

Residues:

accaacccaa ggctacgccc tcagtcaccc tgttcccacc ttcctctgaa gagctcaaga 60

ctgacaaggc tacactggtg tgtatggtga cagatttcta ccctggtgtt atgacagtgg 120

tctggaaggc agatggtacc cctatcactc agggtgtgga gactacccag cctttcaaac 180

agaacaacaa gtacatggct accagctacc tgcttttgac agcaaaagca tgggagactc 240

atagcaatta cagctgccag gtcactcacg aagagaacac tgtggagaag agtttgtccc 300

gtgctgagtg ttcc 314

Sequence Number (ID): 14

Length: 105

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Rattus sp.

Residues:

Sequence Number (ID): 15

Length: 315

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..315

> mol_type, genomic DNA

> organism, Homo sapiens

Residues:

cccaaggcca accccacggt cactctgttc ccgccctcct ctgaggagct ccaagccaac 60

aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac ttctacccgg gagctgtgac agtggcttgg 120

aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga gtggagacga ccaaaccctc caaacagagc 180

aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac 240

agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agtggcccct 300

acagaatgtt catag 315

Sequence Number (ID): 16

Length: 104

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers: 110

- source, 1..104

PKANPTVTLF PPSSEELQAN KATLVCLISD FYPGAVTVAW KADGSPVKAG VETTKPSKQS 60 NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS 104

Sequence Number (ID): 17

Length: 317

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..317

> mol_type, genomic DNA

> organism, Homo sapiens

Residues:

gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60

ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120

cttggaaagc agatagcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac 180

aaagcaacaa caagtacgcg gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt 240

cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300

cccctacaga atgttca 317

Sequence Number (ID): 18

Length: 105

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Homo sapiens

Residues:

QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTTPSKQ 60 SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HRSYSCQVTH EGSTVEKTVA PTECS 105

Sequence Number (ID): 19

Length: 315

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..315

> mol_type, genomic DNA

> organism, Homo sapiens

Residues:

cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac 60

aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac ttctacccgg gagccgtgac agttgcctgg 120

aaggcagata gcagccccgt caaggcgggg gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc 180

aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac 240

aaaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agttgcccct 300

acggaatgtt catag 315

Sequence Number (ID): 20

Length: 104

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..104

> mol_type, protein

> organism, Homo sapiens 111

Residues:

Sequence Number (ID): 21

Length: 321

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..321

> mol_type, genomic DNA

> organism, Homo sapiens

Residues:

ggtcagccca aggctgcccc atcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgcctgatc agtgacttct acccgggagc tgtgaaagtg 120

gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaac acgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180

cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctgcag aatgttcata g 321

Sequence Number (ID): 22

Length: 105

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Homo sapiens

Residues:

QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVKVA WKADGSPVNT GVETTTPSKQ 60 SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HRSYSCQVTH EGSTVEKTVA PAECS 105

Sequence Number (ID): 23

Length: 317

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..317

> mol_type, genomic DNA

> organism, Homo sapiens

Residues:

gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag 60

ccaacaaggc cacactggtg tgtctcgtaa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120

cctggaaggc agatggcagc cccgtcaagg tgggagtgga gaccaccaaa ccctccaaac 180

aaagcaacaa caagtatgcg gccagcagct acctgagcct gacgcccgag cagtggaagt 240

cccacagaag ctacagctgc cgggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300

cccctgcaga atgctct 317

Sequence Number (ID): 24

Length: 105

Molecule Type: AA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..105

> mol_type, protein

> organism, Homo sapiens

Residues:

QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLVS DFYPGAVTVA WKADGSPVKV GVETTKPSKQ 60 SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HRSYSCRVTH E 1G12STVEKTVA PAECS 105 Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..23

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..23

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gtggaagatt gatggcagtg aac 23

Sequence Number (ID): 26

Length: 20

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..20

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gtgctgctca tgctgtaggt 20

Sequence Number (ID): 27

Length: 27

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..27

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..27

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

aaatggcgtc ctgaacagtt ggactga 27

Sequence Number (ID): 28

Length: 23

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..23

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..23

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ccatccagtg agcagttaac atc 23

Sequence Number (ID): 29

Length: 21

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..21

> note, Chemically synthesized nucleotide 113

- source, 1..21

tgtcgttcac tgccatcaat c 21

Sequence Number (ID): 30

Length: 22

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..22

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..22

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

aggtgcctca gtcgtgtgct tc 22

Sequence Number (ID): 31

Length: 22

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..22

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..22

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ggagcccttc cttgttactt ca 22

Sequence Number (ID): 32

Length: 23

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..23

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..23

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

aggtggaaac agggtgactg atg 23

Sequence Number (ID): 33

Length: 24

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..24

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..24

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tcctctgtgc ttccttcctc aggc 24

Sequence Number (ID): 34 114

Length: 25

- _ , ..

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tccttgttac ttcataccat cctct 25

Sequence Number (ID): 35

Length: 22

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..22

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..22

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

agggtgactg atggcgaaga ct 22

Sequence Number (ID): 36

Length: 20

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..20

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ttccttcctc aggccagccc 20

Sequence Number (ID): 37

Length: 20

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..20

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gaggcttgct gagctttcag 20

Sequence Number (ID): 38

Length: 18

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..18

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..18

> mol_type, other DNA 115

> organism, synthetic construct

Sequence Number (ID): 39

Length: 25

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..25

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tatgagcctg tgtcacagtg ttggg 25

Sequence Number (ID): 40

Length: 20

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..20

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gctgacccag gactctgttc 20

Sequence Number (ID): 41

Length: 23

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..23

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..23

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tcccagttcc gaagacataa cac 23

Sequence Number (ID): 42

Length: 25

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..25

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ccctttggtg agaagggttt tggtc 25

Sequence Number (ID): 43

Length: 18

Molecule Type: DNA 116

Features Location/Qualifiers:

- , ..

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tacgcggcca gcagctat 18

Sequence Number (ID): 44

Length: 19

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..19

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..19

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tggcagctgt agcttctgt 19

Sequence Number (ID): 45

Length: 21

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..21

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ctgagcctga cgcctgagca g 21

Sequence Number (ID): 46

Length: 21

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..21

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tcaacctttc ccagcctgtc t 21

Sequence Number (ID): 47

Length: 24

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..24

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..24

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues: 117

ccccagagag agaaaacaga tttt 24 Sequence Number (ID): 49

Length: 16

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..16

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..16

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

accctctgct gtccct 16

Sequence Number (ID): 50

Length: 19

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..19

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..19

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ggtggagagg ctattcggc 19

Sequence Number (ID): 51

Length: 17

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..17

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..17

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gaacacggcg gcatcag 17

Sequence Number (ID): 52

Length: 23

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..23

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..23

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tgggcacaac agacaatcgg ctg 23

118

Sequence Number (ID): 53

- misc_feature, 1..17

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..17

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tgcggccgat cttagcc 17

Sequence Number (ID): 54

Length: 18

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..18

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..18

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ttgaccgatt ccttgcgg 18

Sequence Number (ID): 55

Length: 21

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..21

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

acgagcgggt tcggcccatt c 21

Sequence Number (ID): 56

Length: 21

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..21

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gggctacttg aggaccttgc t 21

Sequence Number (ID): 57

Length: 23

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..23

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..23 119

> mol_type, other DNA

Sequence Number (ID): 58

Length: 20

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..20

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

cagggcctcc atcccaggca 20

Sequence Number (ID): 59

Length: 23

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..23

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..23

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

atctccctac ttcctggcta atg 23

Sequence Number (ID): 60

Length: 22

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..22

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..22

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gcttggaacc tgattggttg tc 22

Sequence Number (ID): 61

Length: 27

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..27

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..27

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

agccttgatc cttgggaatc caggaca 27

Sequence Number (ID): 62

Length: 20 120

Molecule Type: DNA

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gcaaacaaaa accactggcc 20

Sequence Number (ID): 63

Length: 19

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..19

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..19

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ggccacattc catgggttc 19

Sequence Number (ID): 64

Length: 37

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..37

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..37

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

ctgttcctct aaaactggac tccacagtaa atggaaa 37

Sequence Number (ID): 65

Length: 26

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..26

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..26

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

caccatcgat gtcgacacgc ctaggg 26

Sequence Number (ID): 66

Length: 24

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..24

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..24

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct 121

Residues:

Length: 55

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..55

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..55

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagggtg actgatggcg aagac 55

Sequence Number (ID): 68

Length: 57

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..57

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..57

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaccat cgatgtcgac acgccta 57

Sequence Number (ID): 69

Length: 68

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..68

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..68

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

- misc_difference, 30..35

> note, n is a, c, g, t, unknown or other

Residues:

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60 tccgatct 68

Sequence Number (ID): 70

Length: 64

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..64

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..64

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

- misc_difference, 25..30

> note, n is a, c, g, t, unknown or other

Residues:

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag 12 tt2cagacgtg tgctcttccg 60 atct 64

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..30

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..30

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

cccatgtact ctgcgttgat accactgctt 30

Sequence Number (ID): 72

Length: 27

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..27

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..27

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

aagcagtggt atcaacgcag agtacat 27

Sequence Number (ID): 73

Length: 24

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..24

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..24

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

caccagtgtg gccttgttag tctc 24

Sequence Number (ID): 74

Length: 57

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..57

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..57

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcag tggtatcaac gcagagt 57

Sequence Number (ID): 75

Length: 57

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..57 123

> note, Chemically synthesized nucleotide

Residues:

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaggtgg aaacagggtg actgatg 57

Sequence Number (ID): 76

Length: 67

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..67

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..67

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

- misc_difference, 30..35

> note, n is a, c, g, t, unknown or other

Residues:

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60 tccgatc 67

Sequence Number (ID): 77

Length: 64

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- misc_feature, 1..64

> note, Chemically synthesized nucleotide

- source, 1..64

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

- misc_difference, 25..30

> note, n is a, c, g, t, unknown or other

Residues:

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atct 64

END

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju antitela u genetički modifikovanom mišu, postupak se sastoji iz koraka:

(a) imunizovanja genetički modifikovanog miša antigenom od interesa,

pri čemu genetički modifikovan miš ima zametni genom koji sadrži:

prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži:

(i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena,

(ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena, i

(iii) jedan mišji Cλ gen,

pri čemu jedan ili više segmenata humanog Vλ gena (i) i jedan ili više segmenata humanog Jλ gena (ii) su operativno povezani sa jednim mišjim Cλ genom (iii);

pri čemu jedan ili više segmenata humanog Vλ gena (i) i jedan ili više segmenata humanog Jλ gena (ii) su umesto jednog ili više endogenih segmenata mišjeg Vκ gena i jedan ili više endogenih segmenata mišjeg Jκ gena;

(c) regenerisanje iz genetički modifikovanog miša:

(i) antitela koje se veže za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji se sastoji iz humanog λ varijabilnog domena i mišjeg λ konstantnog domena,

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je genetički modifikovani miš homozigotan za prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je genetički modifikovani miš heterozigotan za prvi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, pri čemu zametni genom genetički modifikovanog miša sadrži drugi modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji se sastoji iz:

(a) jednog ili više segmenata humanog Vκ gena, i

(b) jednog ili više segmenata humanog Jκ gena,

pri čemu jedan ili više segmenata humanog Vκ gena i jedan ili više segmenata humanog Jκ gena su operativno povezani sa Cκ genom.

5. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu zametni genom miša dalje sadrži:

modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži:

(a) јеdan ili više segmenata humanog VHgena,

(b) јеdan ili više segmenata humanog DHgena, i

(c) јеdan ili više segmenata humanog JHgena,

pri čemu јеdan ili više segmenata humanog VHgena (a), јеdan ili više segmenata humanog DHgena (b), i јеdan ili više segmenata humanog JHgena (c) su operativno povezani sa jednim ili više gena konstantnog regiona teškog lanca mišjeg imunoglobulina u modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, pri čemu јеdan ili više segmenata humanog VHgena (a), pri čemu јеdan ili više segmenata humanog DHgena (b), i pri čemu јеdan ili više segmenata humanog JHgena (c) su umesto jednog ili više segmenata VHgena miša, jednog ili više segmenata DHgena miša, jednog ili više segmenata JHgena miša, ili njihova kombinacija.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 5 ili 6, pri čemu modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina dalje sadrži:

(i) jednu ili više ne-kodirajućih humanih VHsekvenci, od kojih je svaka susedna sa najmanje jednim od jednog ili više segmenata humanih VHgena, pri čemu svaka od jedne ili više VHne-kodirajućih sekvenci prirodno se nalazi susedno u odnosu na segment humanog VHgena u endogenom lokusu teškog lanca humanog imunoglobulina;

(ii) jednu ili više ne-kodirajućih humanih DHsekvenci, od kojih je svaka susedna sa najmanje jednim od jednog ili više segmenata humanih DHgena, pri čemu svaka od jedne ili više DHne-kodirajućih sekvenci prirodno se nalazi susedno u odnosu na segment humanog DHgena u endogenom lokusu teškog lanca humanog imunoglobulina;

(iii) jednu ili više ne-kodirajućih humanih JHsekvenci, od kojih je svaka susedna sa najmanje jednim od jednog ili više segmenata humanih JHgena, pri čemu svaka od jedne ili više JHne-kodirajućih sekvenci prirodno se nalazi susedno u odnosu na segment humanog JHgena u endogenom lokusu teškog lanca humanog imunoglobulina; ili

(iv) bilo koja njihova kombinacija.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7, pri čemu jedan ili više gena konstantnog regiona teškog lanca mišjeg imunoglobulina su jedan ili više gena konstantnog regiona teškog lanca endogenog mišjeg imunoglobulina.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 8, pri čemu:

(i) jedan ili više humanih VHgenskih segmenata sadrži VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66,

VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39,

VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15,

VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ili njihovu kombinaciju, (ii) jedan ili više humanih DHgenskih segmenata sadrži DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7,

DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22,

DH6-25, DH1-26, DH7-27, ili njihovu kombinaciju, i

(iii) jedan ili više humanih JHgenskih segmenata sadrži JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, ili njihova kombinacija.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 9, pri čemu je genetički modifikovani miš homozigotan za modifikovani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina.

11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata (i) i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata (ii) zamenjuju jedan ili više mišjih Vκ genskih segmenata, jedan ili više mišjih Jκ genskih segmenata, ili njihovu kombinaciju.

12. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu prvi modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina dalje sadrži ne-kodirajuću sekvencu κ lakog lanca između jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jλ genskih segmenata.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 12, pri čemu ne-kodirajuća sekvenca κ lakog lanca ima sekvencu koja se prirodno pojavljuje između humanog Vκ4-1 genskog segmenta i humanog Jκ1 genskog segmenta u endogenom lokusu κ lakog lanca humanog imunoglobulina.

14. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu endogeni Vλ genski segmenti, endogeni Jλ genski segmenti, i endogeni Cλ geni su obrisani u celini ili delom.

15. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je svaki varijabilni domen humanog lakog lanca kodiran sa preuređenom sekvencom varijabilnog regiona λ lakog lanca humanog imunoglobulina koja sadrži jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata pod (i) ili njegova somatski hipermutirana varijanta, i jedan od jednog ili više humanih Jλ genskih segmenata pod (ii) ili njegova somatski hipermutirana varijanta.

16. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu zametni genom dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT) operativno vezanu za transkripcioni kontrolni element.