RS65665B1 - Selektivne kompozicije inhibitora il-6-trans-signalizacije - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

[0001] IL-6 je pleiotropni citokin koji proizvode hematopoetske i nehematopoetske ćelije, npr. kao odgovor na infekciju i oštećenje tkiva. IL-6 vrši svoje višestruke biološke aktivnosti kroz dva glavna puta signalizacije, takozvanog klasičnog puta ligand-receptora preko membranski vezanog IL-6R prisutnog uglavnom na hepatocitima i određenim leukocitima, i transsignalizacionog puta preko cirkulišućeg sIL-6R koji potiče od proteolitičkog cepanja membranski vezanog IL-6R ili iz alternativnog splajsovanja.

[0002] U klasičnom putu, IL-6 se direktno vezuje za membranski vezani IL-6R na površini ograničenog opsega tipova ćelija. Kompleks IL-6/IL-6R se povezuje sa unapred formiranim dimerom proteina receptora gp130 koji transdukuje signal, uzrokujući sterične promene u homodimeru gp130 i time inicirajući intracelularnu signalnu kaskadu. Klasična signalizacija je odgovorna za akutne inflamatorne odbrambene mehanizme i ključne fiziološke funkcije IL-6, kao što su signali rasta i regenerativni signali za crevne epitelne ćelije.

[0003] Ekstracelularni domeni IL-6R i gp130 mogu se generisati bez domena za ankerisanje membrane translacijom alternativno splajsovanih mRNK, što rezultira varijantama sIL-6R i sgp130. Pored toga, ekstracelularni domen IL-6R mogu izlučiti membranski vezane proteaze iz porodice A dezintegrina i metaloproteaze (ADAM) (kod ljudi, ADAM17) za generisanje sIL-6R. U procesu transsignalizacije, sIL-6R se vezuje za IL-6, formirajući agonistički kompleks koji se vezuje za trans-membranske gp130 dimere prisutne na mnoštvu tipova ćelija koji ne izražavaju IL-6R vezan za membranu; signalizacija IL-6 putem signalnih pretvarača i aktivatora transkripcije (STAT) se zatim indukuje u ćelijama koje normalno ne reaguju na IL-6. Aktivnost IL-6/sIL-6R kompleksa se normalno kontroliše visokim nivoima sgp130 prisutnim u cirkulaciji koji efikasno kompetituju sa gp130 vezanim za membranu. Transsignalizacija je uglavnom uključena u hroničnu upalu i pokazalo se da sprečava da populacije T-ćelija sluzokože koje promovišu bolesti pređu u apoptozu. EP1630232 opisuje transfekciju HEK293 ćelija gp130-Fc, inkubaciju transfektovanih ćelija tokom 24 sata, a zatim sakupljanje gp130-Fc iz kolekcije kultivisanih ćelija.

[0004] Bilo bi poželjno imati molekul koji oponaša prirodni inhibitor transsignalizacije sgp130, ali sa većim afinitetom vezivanja i, shodno tome, jačom inhibitornom aktivnošću. . Štaviše, bilo bi poželjno imati molekul koji se može primeniti kod ljudi sa minimalnom toksičnošću i imunogenim potencijalom.

SAŽETAK PRONALASKA

[0005] Sada je utvrđeno da se selektivni inhibitor II,-6-trans-signalizacije može primeniti kod ljudi bez ikakvih značajnih štetnih efekata u velikom opsegu doziranja. Ovaj inhibitor je u suštini bez obrazaca agregacije i glikozilacije koji su povezani sa imunogenim potencijalom. Pored toga, inhibitor obezbeđuje povoljno poluvreme eliminacije kod ljudi.

[0006] Pronalazak obezbeđuje polipeptidni dimer koji se sastoji od dva monomera SEQ ID NO: 1. Poželjno je da su monomeri povezani jednim ili više disulfidnih mostova. Poželjno, dimer je povezan disulfidnim mostovima na pozicijama Cys623i Cys626SEQ ID NO: 1. Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptidni dimer koji se sastoji od dva monomera SEQ ID NO: 2. Poželjno je da su monomeri povezani jednim ili više disulfidnih mostova. Poželjno, dimer je povezan disulfidnim mostovima na pozicijama Cys623i Cys626SEQ ID NO: 2.

[0007] Polipeptidni dimer ne sadrži više od 6% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze po mol polipeptidu. Poželjno, polipeptidni dimer uključuje najmanje 52% glikana koji imaju jedan ili više ostataka sijalinske kiseline.

[0008] pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja se sastoji od polipeptidnih dimera koji su ovde obelodanjeni. Poželjno, ne više od 5% polipeptidnog dimera u kompoziciji je prisutno kao oligomerni agregat i/ili kompozicija ne sadrži više od 10,0%, 8,0%, 6,0 ili 4,0% po težini polipeptida koji su skraćena varijacija polipeptida (npr. skraćena verzija SEQ ID NO: 1 u odnosu na polipeptide SEQ ID NO: 1 ili skraćena verzija SEQ ID NO: 2 u odnosu na polipeptide SEQ ID NO: 2). Štaviše, dimeri u takvim kompozicijama mogu uključivati karakteristike opisane u gornjem pasusu i detaljnije opisane u nastavku.

[0009] pronalazak dalje uključuje upotrebu polipeptidnih dimera i kompozicija opisanih u ovom dokumentu za proizvodnju leka za tretman stanja opisanog u ovom dokumentu.

[0010] Pored toga, pronalazak uključuje metode pripreme polipeptidnih dimera, koji obuhvataju povezane nukleotidne sekvence, vektore ekspresije, ćelije koje eksprimiraju polipeptid i pročišćavanje polipeptida. Konkretno, pronalazak uključuje nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptid SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2 ili polipeptid koji ima sekvencu aminokiselina najmanje 90% identičnu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2. Poželjno, nukleotidna sekvenca je najmanje 90% identična nukleotidnoj sekvenci sa sl. 3 ili sl.7 i poželjnije kodira polipeptid sa SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. Poželjno je da nukleotidna sekvenca bude nukleotidna sekvenca sa slike 7.

KRATAK OPIS SLIKA

[0011]

Sl. 1 prikazuje trans-signalni put IL-6. sIL-6R generisan iz alternativno spojene mRNK ili proteolitičkog cepanja je u stanju da se veže za IL-6 i formira IL-6/sIL-6 kompleks koji se vezuje za gp130 prisutan na velikoj većini tipova telesnih ćelija i indukuje intracelularnu signalnu kaskadu.

Sl. 2 prikazuje da polipeptidni dimer koji se sastoji od dva monomera SEQ ID NO: 1 ne ometa vezivanje IL-6 za membranski vezani IL-6R (klasična signalizacija), već se selektivno vezuje za kompleks IL-6/sIL-6R i sprečava trans-signalizaciju.

Sl. 3 prikazuje sekvencu nukleotida i aminokiselina pojedinačne gp130-Fc podjedinice.

Sl. 4 prikazuje mapu ekspresijskog vektora pANTVhG1. Prikazani su elementi za ekspresiju humanog IgG ili fuzionog proteina i za selekciju u eukariotskim ćelijama, kao i relevantna mesta varenja restrikcionih enzima (nisu u srazmeri). Elementi uključuju: CMV P, promoter ekspresije citomegalovirusa; humane IgG1 sekvence: VH, CH1, zglobnu regiju, CH2 i CH3; hIgGI poli A, sekvencu humane IgG poliadenilacije; pAT153; sekvencu vektora ekspresije izvedenu iz pBR322 koja sadrži poreklo replikacije i Amp gen za bakterijsku rezistenciju protiv ampicilina; SV40 sekvencu promotera; DHFR, sekvencu kodiranja dihidrofolat reduktaze; MluI, HindIII, EagI i SspI sekvence digestije restrikcionih enzima; i sekvencu signala mišjeg konsenzusa. Detalji elemenata za prokariotsku propagaciju i selekciju nisu prikazani.

Sl. 5 prikazuje mapu ekspresijskog vektora pFER02. Prikazani su elementi za ekspresiju peptida 1 i za selekciju u eukariotskim ćelijama, kao i relevantna mesta varenja restrikcionih enzima (nisu u srazmeri). Elementi uključuju: CMV P, promoter ekspresije citomegalovirusa; SEQ ID NO: 2, sekvencu kodiranja; hIgG1 poli A, sekvencu humane IgG poliadenilacije; pAT153; sekvencu vektora ekspresije izvedenu iz pBR322 koja sadrži poreklo replikacije i Amp gen za bakterijsku rezistenciju protiv ampicilina; sekvencu promotera SV40; sekvencu kodiranja DHFR, dihidrofolat reduktaze; sekvencu digestije MluI, EagI i SspI restriktivnog enzima; i sekvencu signala mišjeg konsenzusa.

Sl. 6 prikazuje elemente nukleotidne sekvence ekspresije plazmida pFER02.

Sl. 7 prikazuje sekvencu aminokiselina pojedinačne gp130-Fc podjedinice i sekvencu nukleotida optimizovanu za optimalnu upotrebu kodona u CHO ćelijama.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0012] Jedno otelotvorenje pronalaska obezbeđuje dimer od dva gp130-Fc fuziona monomera (npr. dva monomera SEQ ID NO: 1). U svom aktivnom obliku, polipeptid SEQ ID NO: 1 postoji kao dimer povezan sa dve disulfidne veze na Cys623i Cys626(sl. 2). SEQ ID NO: 2 odgovara aminokiselinskoj sekvenci gp130-Fc fuzionog monomera koji ima endogeni signalni peptid. Signalni peptid se uklanja tokom sinteze proteina, što rezultira proizvodnjom polipeptida SEQ ID NO: 1.

[0013] Ovde opisani polipeptidni dimeri selektivno inhibiraju prekomernu trans-signalizaciju (sl. 1) i indukuju apoptozu štetnih T-ćelija uključenih u višestruke inflamatorne bolesti. Polipeptidni dimer cilja i neutrališe komplekse IL-6/sIL-6R i stoga se očekuje da inhibira samo IL-6 trans-signalizaciju u željenim terapijskim koncentracijama, ostavljajući klasičnu signalizaciju i njene mnoge fiziološke funkcije, kao i njene akutne inflamatorne odbrambene mehanizme, netaknutim (sl. 2). Veruje se da polipeptidni dimer ne može da ometa klasičnu signalizaciju IL-6 zbog sterične prepreke; Fc deo ne može da se ubaci u ćelijsku membranu, čineći deo gp130 nedostupnim za vezivanje za kompleks IL-6/sIL-6R vezan za membranu. Stoga se očekuje da će polipeptid imati efikasnost sličnu globalnoj blokadi IL-6 (npr. tocilizumab, sirukumab), ali sa manje neželjenih efekata.

[0014] Ovde opisani polipeptidni dimeri poželjno sadrže gp130-Fc monomere koji imaju sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:1. U određenim otelotvorenjima, monomeri imaju sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:2. Ovde opisani polipeptidni dimeri obuhvataju polipeptide koji imaju najmanje 90% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2. Polipeptid se sastoji od gp130 D6 domena (posebno aminokiseline TFTTPKFAQGE: pozicije aminokiselina 585-595 SEQ ID NO: 1), AEGA u zglobnoj regiji Fc domena (pozicije aminokiselina 609-612 SEQ ID NO:1) i ne obuhvata linker između gp130 dela i Fc domena. Obelodanjivanje obezbeđuje polipeptidni dimer koji se sastoji od dva monomera koji imaju sekvencu aminokiselina od najmanje 90% sekvence identifikovane sa SEQ ID NO: 1, pri čemu sekvenca aminokiselina obuhvata gp130 D6 domen, AEGA u zglobnoj regiji Fc domena, i ne postoji linker između gp130 dela i Fc domena. U poželjnom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje polipeptidni dimer koji se sastoji od dva monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu od najmanje 90% sekvence identifikovane sa SEQ ID NO: 2, pri čemu aminokiselinska sekvenca obuhvata gp130 D6 domen, AEGA u zglobnoj regiji Fc domena, i ne postoji linker između gp130 dela i Fc domena, poželjno pri čemu su monomeri povezani sa jednim ili više disulfidnih mostova, pri čemu polipeptidni dimer ne sadrži više od 6% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze po mol polipeptidu, po željno ne više od 3 mol%, poželjnije ne više od 1 mol%, još poželjnije ne više od 0,5 mol% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze.

[0015] Poželjno je da polipeptidi budu suštinski slobodni od delova galaktoze-alfa-1,3-galaktoze, jer su oni povezani sa imunogenim odgovorom. Iznenađujuće je utvrđeno da dimeri pronalaska imaju nizak nivo takvih delova. Polipeptid (npr. polipeptidni monomer i/ili dimer opisan ovde) ne sadrži više od 6% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze po mol polipeptidu. Poželjno, polipeptid ne sadrži više od 4 mol %, 3 mol %, 2 mol %, 1 mol %, 0,5 mol %, 0,2 mol %, 0,1 mol % ili čak nemerljiv nivo galaktoze-alfa-1,3-galaktoze (npr. izmereno pomoću WAX-HPLC, NP-HPLC ili VOSKA, poželjno kako je određeno pomoću WAX-HPLC). U drugim otelotvorenjima, polipeptidi sadrže manje od 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, ili čak 0,1% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze, u odnosu na ukupnu količinu glikana, bilo po masi ili na molarnoj osnovi.

[0016] U nekim otelotvorenjima, takođe je poželjno da polipeptid ipronalaska bude sijalizovan, npr. da bi se povećalo poluvreme eliminacije polipeptida pronalaska. Svaki lanac polipeptida sadrži 10 pretpostavljenih mesta N-glikozilacije; devet mesta N-glikozilacije nalazi se u delu gp130, a jedno mesto N-glikozilacije nalazi se u delu Fc. Polipeptid stoga sadrži ukupno 20 mesta glikozilacije. U određenim otelotvorenjima, srednja vrednost od najmanje 52% ili najmanje 54% glikana na polipeptidu uključuje ostatak sijalinske kiseline, kao što je srednja vrednost od 52-65% (npr. izmerena pomoću WAX-HPLC, NP-HPLC ili VOSKA, poželjno kako je određeno pomoću WAX-HPLC). Poželjno, polipeptid pronalaska ima približnu molekulsku težinu od 220 kDa; svaka 93 kDA ima dodatnu molekulsku težinu od ~20 kDa izvedenu iz 10 N-glikozilacionih lanaca.

[0017] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje pruža kompozicije koji se sastoje od mnoštva polipeptida opisanih u ovom dokumentu (npr. mnoštvo polipeptidnih monomera i/ili polipeptidnih dimera opisanih u ovom dokumentu). U nekim otelotvorenjima, kompozicija obuhvata srednju vrednost od najmanje 25% (npr. najmanje 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, ili 40%) mono-sijalizovanih polipeptida; srednju vrednost od najmanje 10% (npr. najmanje 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ili 25%) di-sijalizovanih polipeptida; srednju vrednost od najmanje 1% (npr. najmanje 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, or 6%) trisijalizovanih polipeptida; i/ili srednju vrednost od najmanje 0,1% (npr. najmanje 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, ili 1%) tetra-sijalizovanih glikana; u odnosu na glikanske grupe u kompoziciji.

[0018] Dalje je poželjno minimizirati stepen agregacije polipeptida, koji se ovde naziva oligomerizacija koja rezultira oligomernim agregatima. „Oligomerni agregati“ kako se ovde koriste, ne odnose se na aktivni dimerizovani peptid. Umesto toga, termin se odnosi na agregat od najmanje tri monomera (npr. SEQ ID NO: 1) ili, tipičnije, najmanje dimer aktivnih dimera. Iznenađujuće je utvrđeno da peptidni dimeri pronalaska pokazuju nizak nivo agregacije. U određenim otelotvorenjima, manje od 5%, manje od 4%, manje od 3%, manje od 2%, manje od 1,5%, ili čak manje od 1,0% polipeptida je prisutno kao oligomer. Sadržaj oligomera se može meriti, na primer, hromatografijom isključivanja veličine - rasipanjem svetlosti sa više uglova (SEC-MALS) ili SEC-UV.

[0019] Poželjno je da je polipeptid prisutan u svom obliku pune dužine (npr. uključuje dva monomera pune dužine, npr. SEQ ID NO: 1). Međutim, ćelijska kultura može proizvesti skraćenu varijantu koja se ovde naziva pojedinačni gp130 oblik (SGF). SGF je kovalentno vezani molekul sa dva lanca, jedan lanac koji se sastoji od monomera gp130-Fc pune dužine (npr. SEQ ID NO:1) i drugog lanca koji se sastoji od skraćenog monomera gp130-Fc (npr.

skraćivanje SEQ ID NO: 1), koji drugi lanac uključuje Fc domen i nedostaje mu većina ili ceo gp130 domen (npr. prekinut je pre sekvence linkera na Fc regiju). Dosadašnje studije pokazuju da SGF nema heterogeni amino-terminus. SGF se može formirati na konzistentnim nivoima u bioreaktoru, a kada se formira, nivoi SGF se ne menjaju lako tokom purifikacije, prerade ili ubrzanih uslova skladištenja. SGF nivoi se teško uklanjaju tokom purifikacije zbog sličnih fizičko-hemijskih svojstava polipeptidnom dimeru pune dužine; stoga napori za uklanjanje SGF mogu rezultirati značajnim smanjenjem prinosa. Iznenađujuće je utvrđeno da su dimeri pronalaska skoro uvek pune dužine. U određenim otelotvorenjima, kompozicija pronalaska ne sadrži više od 4,0% po težini, 3,0% po težini, 2,0% po težini ili čak 1,5% po težini polipeptida koji su skraćena varijacija polipeptida SEQ ID NO: 1 u odnosu na polipeptide SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, kompozicija pronalaska ne sadrži više od 4,0% po težini, 3,0% po težini, 2,0% po težini ili čak 1,5% po težini polipeptida koji su skraćena varijacija polipeptida SEQ ID NO: 2 u odnosu na polipeptide SEQ ID NO: 2.

[0020] Polipeptid pronalaska se obično primenjuje parenteralno, kao što je intravenski ili subkutano.

[0021] Pogodne formulacije uključuju one koje sadrže surfaktant, posebno neionski surfaktant kao što je polisorbatni surfaktant (npr. polisorbat 20). Formulacije takođe mogu uključivati puferske agense i šećere. Primer puferskog agensa je histidin. Primer šećera je saharoza. Dakle, odgovarajuća formulacija može uključivati polisorbat 20 (npr.0,01-1 mg/ml, 0,02-0,5 mg/ml, 0,05-0,2 mg/ml), histidin (npr.0,5 mM-250 mM, 1-100 mM, 5-50 mM, 10-20 mM) i saharozu (npr.10-1000 mM, 20-500 mM, 100-300 mM, 150-250 mM).

Indikacije

[0022] Kod akutne upale, pokazalo se da IL-6 indukuje odgovor akutne faze u jetri, što dovodi do oslobađanja kaskade proteina akutne faze, posebno CRP. Formiranjem kompleksa sa sIL-6R izlučenim apoptotičkim neutrofilima na mestu upale i vezivanjem rezultujućeg IL-6/sIL-6R trans-signalnog kompleksa za signalni pretvarač gp130 na endotelnim ćelijama, IL-6 indukuje ekspresiju hemokina kao što je monocitni hemotaktički protein (MCP)-1 i privlači mononuklearne ćelije. To dovodi do rešavanja akutne upale i pokretanja adaptivnog imunog odgovora. Dakle, kod akutne upale, IL-6 sa sIL-6R kompleksom podržava tranziciju između rane pretežno neutrofilne faze upale i održivijeg priliva mononuklearnih ćelija koji na kraju takođe dovodi do rešavanja upale.

[0023] Hronična upala, kao kod Kronove bolesti (CD), ulceroznog kolitisa (UC), reumatoidnog artritisa (RA) ili psorijaze, histološki je povezana sa prisustvom mononuklearnih ćelija, kao što su makrofagi i limfociti, koje perzistiraju u tkivu nakon što su stečene za rešavanje akutne inflamatorne faze. U modelima hroničnih inflamatornih bolesti, čini se da IL-6 ima štetnu ulogu u favorizovanju akumulacije mononuklearnih ćelija na mestu povrede, putem indukcije kontinuirane sekrecije MCP-1, angio-proliferacije i antiapoptotičkih funkcija na T-ćelijama.

[0024] Inflamatorna bolest creva (IBD), odnosno CD ili UC, je hronična upala koja se javlja u crevima osetljivih pojedinaca za koju se veruje da je nezavisna od specifičnog patogena. Promene u barijeri sluzokože epitela sa povećanom permeabilnošću creva dovode do pojačane izloženosti imunog sistema sluzokože luminalnim antigenima, što uzrokuje neodgovarajuću aktivaciju imunog sistema creva kod pacijenata. Nekontrolisana aktivacija mukoznih CD4+ T-limfocita uz uzastopno prekomerno oslobađanje proinflamatornih citokina izaziva patogeno gastrointestinalno zapaljenje i oštećenje tkiva. Postoji konsenzus da su glavne aktivirane imunološke ćelije uključene u patogenezu IBD crevne T-ćelije i makrofagi.

[0025] Pokazalo se da je IL-6 centralni citokin kod IBD kod ljudi. Utvrđeno je da pacijenti sa CD i UC proizvode povećane nivoe IL-6 u poređenju sa kontrolanim grupama, pri čemu su nivoi IL-6 u korelaciji sa kliničkom aktivnošću. Takođe je utvrđeno da pacijenti sa CD imaju povećane nivoe sIL-6R i, shodno tome, IL-6/sIL-6R kompleksa u serumu. Lamina propria mononuklearne ćelije dobijene iz hirurških uzoraka debelog creva od pacijenata sa CD i UC pokazale su da i CD4+ T-ćelije i makrofagi proizvode povećane količine IL-6 u poređenju sa kontrolnim grupama. Utvrđeno je da se sIL-6R oslobađa otpuštanjem sa površine makrofaga i mononuklearnih ćelija sa povećanom proizvodnjom povezanom sa povišenim nivoima IL-6. Kod pacijenata sa CD, T-ćelije sluzokože pokazale su jake dokaze za IL-6 trans-signalizaciju sa aktivacijom STAT3, bcl-2 i bcl-xl. Blokada IL-6 trans-signalizacije izazvala je apoptozu T-ćelija, što ukazuje na to da sistem IL-6/sIL-6R posreduje u rezistenciji T-ćelija na apoptozu u CD.

[0026] Stoga, kod pacijenata sa IBD, stečena akumulacija CD4+ T-ćelija koje promovišu bolest u lamina propriji koja dovodi do produžavanja upale kritično zavisi od trans-signallizacije antiapoptotičkog IL-6/sIL-6R. Smatra se da je delovanjem na IL-6/sIL-6R kompleks, polipeptid koji je ovde obelodanjen koristan u tretmanu CD i drugih inflamatornih bolesti.

[0027] Dakle, polipeptid pronalaska može tretirati stanja posredovana IL-6. Stanja posredovana IL-6 uključuju inflamatornu bolest ili rak. S tim u vezi, ovde opisani polipeptidi i kompozicije mogu se primeniti kod subjekta koji ima inflamatornu bolest, kao što je juvenilni idiopatski artritis, Kronova bolest, kolitis (npr. kolitis koji nije povezan sa IBD, uključujući radijacioni kolitis, divertikularni kolitis, ishemijski kolitis, zarazni kolitis, celijakiju, autoimuni kolitis ili kolitis koji je rezultat alergija koje utiču na debelo crevo), dermatitis, psorijaza, uveitis, divertikulitis, hepatitis, sindrom iritabilnog creva (IBS), eritematozni lupus, nefritis, Parkinsonova bolest, ulcerozni kolitis, multipla skleroza (MS), Alchajmerova bolest, artritis, reumatoidni artritis, astma i razne kardiovaskularne bolesti kao što su ateroskleroza i vaskulitis. U određenim otelotvorenjima, inflamatorna bolest se bira iz grupe koja se sastoji od dijabetesa, gihta, periodičnog sindroma povezanog sa kriopirinom i hroničnog opstruktivnog plućnog poremećaja.

[0028] Poželjno je da je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 inflamatorna bolest creva, poželjno pri čemu tretman indukuje remisiju inflamatorne bolesti creva. Poželjno je da je inflamatorna bolest creva Kronova bolest ili ulcerozni kolitis, poželjno pri čemu tretman održava remisiju inflamatorne bolesti creva. Poželjno je da je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 reumatoidni artritis, psorijaza, uveitis ili ateroskleroza. Poželjno je da je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 kolitis koji nije povezan sa inflamatornom bolešću creva, poželjno je da je kolitis radijacioni kolitis, divertikularni kolitis, ishemijski kolitis, infektivni kolitis, celijakija, autoimuni kolitis ili kolitis koji je rezultat alergija koje utiču na debelo crevo. Poželjno je da se inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 bira između Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, reumatoidnog artritisa i psorijaze, poželjnije između Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa.

[0029] Za inflamatorne bolesti kao što je inflamatorna bolest creva, tretman može uključivati remisiju stanja, održavanje remisije stanja ili oboje.

[0030] Druga otelotvorenja pružaju metod tretmana, smanjenja težine ili sprečavanja karcinoma, uključujući, ali ne ograničavajući se na multipli mijelom, leukemiju plazma ćelija, karcinom bubrežnih ćelija, Kaposijev sarkom, kolorektalni karcinom, karcinom želuca, melanom, leukemiju, limfom, gliom, multiformni glioblastom, karcinom pluća (uključujući, ali ne ograničavajući se na karcinom pluća nemalih ćelija (NSCLC; i adenokarcinom i karcinom skvamoznih ćelija)), ne-Hodgkinov limfom, Hodgkinovu bolest, plazmocitom, sarkom, timom, karcinom prostate, hepatocelularni karcinom, karcinom mokraćne bešike, karcinom materice, karcinom pankreasa, karcinom jednjaka, karcinom mozga, karcinom glave i vrata, karcinom jajnika, karcinom grlića materice, karcinom testisa, karcinom želuca, karcinom jednjaka, hepatom, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), T-ALL, akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML) i hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), karcinome pljuvačke ili druge karcinome.

[0031] Dalja otelotvorenja ovog obelodanjivanja pružaju metod tretmana, smanjenja težine ili sprečavanja bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od sepse, resorpcije kostiju (osteoporoze), kaheksije, umora povezanog sa karcinomom, psorijaze, sistemskog nastanka juvenilnog idiopatskog artritisa, sistemskog eritematoznog lupusa (SLE), mezangijalnog proliferativnog glomerulonefritisa, hiperglobulinemije, Castlemanove bolesti, IgM gamopatije, srčanog miksoma i autoimunog dijabetesa zavisnog od insulina.

[0032] Kao što se ovde koristi, termini „tretman“, „tretirati“ i „tretiranje“ odnose se na reverziju, ublažavanje, odlaganje početka ili inhibiranje napretka bolesti ili poremećaja, ili jednog ili više njihovih simptoma, kao što je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, tretman se može primeniti nakon što se razvije jedan ili više simptoma. U drugim otelotvorenjima, tretman se može primeniti u odsustvu simptoma. Na primer, tretman se može primeniti kod osetljive osobe pre pojave simptoma (npr. u svetlu istorije simptoma i/ili u svetlu genetskih ili drugih faktora osetljivosti). Tretman se takođe može nastaviti nakon što se simptomi povuku, na primer kako bi se sprečilo ili odložilo njihovo ponavljanje.

[0033] Polipeptid pronalaska se može primeniti zajedno sa drugim aktivnim agensom. Drugi aktivni agens može biti jedna ili više 5-aminosalicilna kiselina, azatioprin, 5-merkaptopurin i kortikosteroid. Režimi doziranja za primenu 5-aminosalicilne kiseline, azatioprina, 5-merkaptopurina i kortikosteroida su dobro poznati stručnjaku.

Metode proizvodnje

[0034] Dalje otelotvorenje obelodanjivanja obezbeđuje vektor, koji se sastoji od molekula nukleinske kiseline koji kodira SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2, kao i ćelije koje se sastoje od navedenog vektora. DNK koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 može biti klonirana u vektor tako da je signalni peptid povezan u okviru sa amino terminusom aminokiselinske sekvence lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina).

[0035] Dizajn vektora ekspresije, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koju treba transformisati, nivo ekspresije željenog proteina i tako dalje. Regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina kod sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visok nivo ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači izvedeni iz retrovirusnih LTR, citomegalovirus (CMV) (kao što je CMV promoter/pojačivač), Simian virus 40 (SV40) (kao što je SV40 promoter/pojačivač), adenovirus (npr. adenovirusni glavni kasni promoter (AdMLP)), poliom i jaki promoteri sisara kao što su nativni imunoglobulin i promoteri aktina. Ćelija domaćina može biti ćelija sisara, insekta, biljke, bakterije ili kvasca, poželjno ćelija sisara kao što je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). Primerne CHO ćelije su (Cho)/dhfr- ćelije dobijene iz Evropske kolekcije ćelijskih kultura (ECACC, br.9406067).

[0036] Poželjno, ćelija domaćin je CHO ćelija, a nukleinska kiselina koja kodira polipeptid je kodon optimizovan za upotrebu u CHO ćelijama. Poželjno, nukleinska kiselina koja kodira polipeptid je sekvenca prikazana na sl.3 ili sl.7.

[0037] Obelodanjivanje dalje pruža metode za proizvodnju polipeptida pronalaska. U jednom otelotvorenju, predviđena je metoda za proizvodnju dimera koji se sastoji od dva monomera SEQ ID NO: 1 povezana disulfidnim mostom, navedena metoda se sastoji od izražavanja SEQ ID NO: 1 u ćelijama i purifikacije navedenog polipeptida. Poželjno je da se obezbede metode za proizvodnju dimera koji se sastoji od dva monomera SEQ ID NO: 2 povezana disulfidnim mostom, navedena metoda se sastoji od izražavanja SEQ ID NO: 2 u ćelijama i purifikacije navedenog polipeptida. Metode za uvođenje vektora nukleinske kiseline su poznate stručnjaku i uključuju npr. elektroporaciju, transfekciju i slično. Transfektovane ćelije se uzgajaju kako bi se ćelijama omogućilo da izraze željeni protein. Ćelije i medijumi kulture se zatim prikupljaju i polipeptidni dimeri se purifikuju, npr. koracima hromatografske kolone (npr. MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q). Dimer se takođe može koncentrisati i/ili tretirati koracima redukcije/ inaktivacije virusa.

[0038] Dalje otelotvorenje pronalaska obuhvata polipeptidne dimere proizvedene metodama koje su ovde obelodanjene. Poželjno, dimeri imaju karakteristike opisane u ovom dokumentu (npr. % galaktoze-alfa-1,3-galaktoze po mol polipeptidu, sijalilacija). Dimeri proizvedeni metodama mogu se koristiti za pripremu odgovarajućih kompozicija. Navedene kompozicije pželjno imaju karakteristike opisane u ovom dokumentu (npr. niska agregacija, skraćenja).

EGZEMPLIFIKACIJA

Primer 1

Priprema i karakterizacija peptida 1 (polipeptid SEQ ID NO: 1 u svom aktivnom dimerizovanom obliku)

Kloniranje i ekspresija peptida 1 u CHO / dhfr - ćelije

[0039] CHO /dhfr<->ćelije su dobijene iz Evropske kolekcije ćelijskih kultura (ECACC, br.

9406067). Adherentne CHO /dhfr<->ćelije imaju nedostatak dihidrofolat reduktaze (DHFR), enzima koji katalizuje redukciju folata u dihidrofolat, a zatim u tetrahidrofolat. CHO / dhfr-ćelije stoga pokazuju osetljivost na antifolatni lek, metotreksat (MTX).

[0040] Ćelijska linija CHO/dhfr<->je dobro okarakterisana i testirana. Bezbednost CHO /dhfr-roditeljske ćelijske linije kao ćelijskog supstrata za proizvodnju biofarmaceutika za ljudsku upotrebu potvrdila je ECACC (Porton Down, UK) za mikrobnu sterilnost, mikoplazmu i slučajne viruse prema 21 CFR.

Izbor i konstrukcija cDNA sekvence

[0041] cDNK sekvencu peptida 1 (polipeptidna sekvenca SEQ ID NO: 1) je sintetizovao GeneArt AG (Regensburg, Nemačka) kao jedan DNK fragment koristeći sekvencu za ekstracelularni domen gp130 (IL6ST, NCBI Gene ID 3572, transkriptna varijanta 1 (NP_002175), aminokiseline 23-617) i Fc domen humanog IgG1 (IGHG1, NCBI Gene ID 3500, aminokiseline 221-447 prema Kabat EU numeraciji). Sekvenca je optimizovana za optimalnu upotrebu kodona u CHO ćelijama. Tri dobro okarakterisane tačkaste mutacije uvedene su u regiju donjeg zgloba Fc dela.

[0042] Sekvenca cDNK je dalje modifikovana zamenom originalnog signalnog peptida gp130 sa signalnim peptidom IgG teškog lanca miša poznate efikasnosti u sistemima ekspresije CHO ćelija. Signalni peptid se odvaja tokom sinteze proteina. Prisustvo sekvence IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys u Fc regiji rezultira dimerizacijom dve identične gp130-Fc podjedinice preko sulfhidrilnih ostataka na Fc regiji, koji zajedno formiraju peptid 1.

[0043] Sl.3 predstavlja nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu gp130-Fc podjedinice koja se koristi za formiranje peptida 1.

Konstrukcija ekspresijskog plazmida za izbor master banke ćelija (MCB)

[0044] Peptid 1 cDNK je kloniran u pANTVhG1 ekspresijski vektor (antitop) koji sadrži dhfr gen za selekciju transfektanta sa MTX (sl. 4) na sledeći način: Prvo, ekspresijski vektor je digestiran sa MluI i EagI restrikcionim enzimima kako bi se omogućilo umetanje peptida 1 cDNK. Drugo, regija kodiranja peptida 1 je PCR pojačan pomoću OL1425 i OL1426 prajmera (tabela 1) i digestiran sa MluI i EagI restrikcionim enzimima. Treće, digestirani fragmenti su purifikovani gelom i ligirani zajedno da bi se generisao vektor ekspresije pFER02 (sl.5). Peptid 1 cDNK je ubačen pod kontrolu promotera citomegalovirusa (CMV).

[0045] U tabeli 2 prikazana je funkcija ekspresijskih elemenata pFER02. Sl. 6 prikazuje nukleotidne sekvence ekspresijskih elemenata pFER02.

Tabela 1 Oligonukleotidne sekvence koje se koriste za pojačavanje regije kodiranja peptida 1 za kloniranje u pANTVhG1

Proces odabira ćelijske linije koji vodi do finalnog klona koji proizvodi peptid 1

[0046] Vektor pFER02 je linearizovan tupim restrikcionim enzimom SspI, koji ima jedno mesto prepoznavanja koje se nalazi u genu beta-laktamaze. Linearizovani plazmid je transfektovan 5 × 10<6>CHO/dhfr<->ćelija pomoću transfekcije posredovane lipidima. Dvadeset četiri sata nakon transfekcije, transficirane ćelije su izabrane u medijumu sa dodatkom 5% dijalizovanog fetalnog telećeg seruma (FCS) i 100 nM metotreksata (MTX). Transfektovane ćelije su razređene u ovom medijumu na različitim gustinama i raspoređene u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčića, sa ravnim dnom. Ćelije su zatim inkubirane u vlažnoj atmosferi na 5% CO2i 37°C. Svež medijum za selekciju MTX dodavan je u redovnim intervalima tokom vremena inkubacije kako bi se osiguralo da nivoi MTX i hranljivih materija ostanu konstantni.

Inicijalni izbor ćelijske linije sa izborom MTX

[0047] Nekoliko nedelja nakon transfekcije, ploče kulture tkiva su pregledane pomoću Genetix CloneSelect<®>Imager, i primećeno je da >2,000 bunarčića ima aktivno rastuće kolonije. Supernatanti iz ovih bušnarčića su uzorkovani i testirani na titar peptida 1 ELISA testom. Na osnovu rezultata ovog testa, ukupno 105 bunarčića sa najboljom ekspresijom ekspanzirano je u ploče sa 48 bunarčića. Ukupno 83 ćelijske linije su izabrane za ekspanziju u ploče sa 6 bunarčića ili tikvice T-25; supernatant iz svake od ćelijskih linija je uzorkovan i testiran na titar peptida 1 (ELISA). Na osnovu ovih rezultata, 54 ćelijske linije sa najboljom ekspresijom sa optimalnim karakteristikama rasta izabrane su za ekspanziju u tikvice T-75 ili T-175; uzorkovani su supernatanti iz konfluentnih tikvica i kvantifikovani titri peptida 1 (ELISA). Poređenje nivoa ekspresije između ćelijskih linija omogućilo je identifikaciju 38 najboljih ćelijskih linija koje su izabrane za analizu produktivnosti. Produktivnost je ocenjena na sledeći način:

Produktivnost (pg/ćeliji/danu= ((Th – Ti)/((Vh Vi)/2))/vreme

Gde je:

Th je titar prikupljanja [µg/mL]

Ti je inicijalni titar [µg/mL]

Vh je broj održivih ćelija pri prikupljanju [× 10<6>ćelija/mL]

Vi je inicijalni broj održivih ćelija [× 10<6>ćelija/mL]

Vreme je proteklo vreme (dani) između Ti i Th

[0048] Na osnovu rezultata produktivnosti (pg/ćelija/dan), 13 ćelijskih linija je izabrano za amplifikaciju gena. Amplifikacija gena vođena sa MTX za izbor ćelijske linije peptida 1

[0049] 13 izabranih ćelijskih linija izabrano je za prvi krug amplifikacije gena selektivnim pritiskom pod povećanim koncentracijama MTX (0,1-50 M). Nakon 7-10 dana, supernatant iz svakog bunarčića iz svake od 13 ćelijskih linija je uzorkovan i testiran na titar peptida 1 (ELISA). Bunarčići iz svake ćelijske linije sa visokim nivoom ekspresije peptida 1 procenjeni su za produktivnost (pg/ćelija/dan). Pokrenut je drugi krug amplifikacije gena sa ukupno 16 bunarčića iz ćelijskih linija koji su pokazali značajno povećanje produktivnosti.

Produktivnost (pg/ćelija/dan)=((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/vreme tvu povećanih koncentracija MTX; supernatanti iz svake kulture su testirani na titar peptida 1 (ELISA). Izabrani bunarčići iz svake ćelijske linije su ekspanzirani i procenjena je produktivnost (pg/ćelija/dan); identifikovano je pet ćelijskih linija sa povećanom produktivnošću kao odgovor na povećani pritisak selekcije MTX. Ovih pet ćelijskih linija je napredovalo do trećeg kruga amplifikacije gena koristeći selekcioni pritisak pod povećanom koncentracijom MTX; supernatanti iz svakog bunarčića su testirani na titar peptida 1 (ELISA). Izabrani bunarčići za svaku ćelijsku liniju su ekspanzirani i procenjena je produktivnost (pg/ćelija/dan); izabrano je pet ćelijskih linija koje pokazuju visoku ekspresiju peptida 1.

Kloniranje limitiranom dilucijom

[0051] Kloniranje limitiranom dilucijom izvršeno je na pet ćelijskih linija koje pokazuju ekspresiju peptida 1. Nakon nedelju dana inkubacije, ploče su pregledane pomoću Genetix CloneSelect<®>Imager i identifikovane su pojedinačne kolonije. Brzine rasta dve ćelijske linije tokom kloniranja dilucijom primećene su kao posebno spore i stoga su ove ćelijske linije prekinute. Ukupno, od tri preostale ćelijske linije, izabrano je 58 klonskih kolonija za ekspanziju, prvo u ploče sa 48 bunarčića, a zatim sukcesivno ekspanzirane kroz ploče sa 12 bunarčića, tikvice T-25 i tikvice T-75 u odsustvu MTX. Potom je procenjena produktivnost svakog od 58 izabranih klonova (pg/ćelija/dan); izabrano je 16 klonova za adaptaciju suspenzije i adaptaciju na rast u hemijski definisanom medijumu.

Prilagođavanje ćelijskih linija kulturi suspenzije u hemijski definisanom medijumu [0052] 16 ćelijskih linija je prilagođeno kulturi suspenzije u hemijski definisanom medijumu na sledeći način: izabrane ćelijske linije u adherentnoj kulturi su prvo prilagođene suspenziji i u CHO medijumu za rast suspenzije (DMEM visoka glukoza, uključujući L-glutamin i natrijum piruvat, 5% dijalizirani FCS, 20 mg/L-prolin, 1 × penicilin/streptomicin, 1% pluronski F68), a zatim u hemijski definisanom medijumu za rast suspenzije (CD Opti-CHO<®>iz Life Technologies Ltd. (Paisley, UK), 2.5% 2,5% dijalizovan FCS, 0,1 × penicilin/streptomicin, 8 mM Glutamax<®>).

[0053] Kada su prilagođene kulturi suspenzije, ćelijske linije su odbijene, u fazama, u hemijski definisani medijum za rast suspenzije bez seruma (CD Opti-CHO<®>, 0,1 × penicillin/streptomicin, 8 mM Glutamax<®>). MTX je izostavljen iz svih kultura suspenzije. Prilagođene linije su ekspanzirane i pripremljene su banke ćelijskih linija. Ukratko, ćelije su ekspanzirane na ukupnu zapreminu od 300 ml i sakupljene kada je gustina ćelija premašila 0,85 × 10<6>ćelija/mL i vijabilnost je bila >90%. Dalje 3 × 10<7>ćelija je zasejano u svežu tikvicu koja sadrži medijum za rast suspenzije od 70 ml za analizu rasta i produktivnosti. Preostale ćelije su prikupljene centrifugiranjem i resuspendovane u odgovarajućoj zapremini medijuma za zamrzavanje da bi se dobila ćelijska suspenzija od 1 × 10<7>ćelija/mL. Bočice su zamrznute do -80°C. Banka ćelija je zatim prebačena u tečni azot za dugoročno skladištenje.

[0054] 16 ćelijskih linija je dalje rafinisano do 5 klonova nakon adaptacije bez seruma. 5 klonova je procenjeno za rast (gustina ćelija i vreme udvostručenja ćelija) i produktivnost (pg/ćelija/dan), nakon čega su izabrana 3 klona. Jedan klon je izabran da napravi master banku ćelija.

[0055] Izvršena je priprema master banke ćelija (MCB) i radne banke ćelija (WCB). Jedna bočica iz zalihe predkulture ćelija korišćena je za pripremu MCB od 200 bočica, a jedna bočica MCB korišćena je za pripremu WCB od 200 bočica. U svakom slučaju, bočica je odmrznuta, a medijum za krioprezervaciju uklonjen centrifugiranjem. Ćelije su resuspendovane i razmnožene u zapremini u medijumu za rast (CD OptiCHO<®>/ 4 mM L-glutamin). Tokom izrade MCB izvršena su četiri pasaža, a tokom izrade WCB izvršeno je šest pasaža.

[0056] Kada je dobijeno dovoljno ćelija, ćelije su alikvotovane u medijumu za krioprezervaciju (92,5% CD OptiCHO<®>/ 7,5% DMSO) u polipropilenske bočice (od kojih svaka sadrži približno 1,5 × 10<7>vijabilnih ćelija) i krioprezervirane smanjenjem temperature na -100°C tokom perioda od najmanje 60 minuta u procesu postepenog zamrzavanja. Bočice se čuvaju u kontejneru za automatsko punjenje tečnog azota u parnoj fazi u GMP kontrolisanom području.

Opis procesa proizvodnje supstance leka (DS)

[0057] Kratak opis procesa proizvodnje peptida 1 DS je sledeći. Ćelije iz bočice WCB se oživljavaju i progresivno ekspanziraju koristeći medijum bez proteina pre inokulacije u proizvodni bioreaktor. Po završetku ćelijske kulture, ćelije i ćelijski ostaci se uklanjaju filtracijom kulture.

[0058] Purifikacija se sastoji od tri koraka hromatografske kolone (MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q), koraka koncentracije i dijafiltracije i uključuje dva specifična koraka redukcije/ inaktivacije virusa; tretman Triton X-100 (inaktivacija virusa sa omotačem) i korak nanofiltracije (uklanjanje virusa sa omotačem i virusa bez omotača).

[0059] Nakon koncentracije i dijafiltracije, dodaju se pomoćne supstance za formulaciju DS. Formulacija peptida 1 je 0,22 µm filtrirana u posude.

[0060] Kolona sartobind fenil, koja se koristi u seriji od 10.000 l umesto Capto Q kolone, efikasna je u smanjenju prisustva oligomera. Ova kolona je uspela da smanji nivo oligomernih oblika sa prosečno 2,7% na 1%.

Analitičke metode

[0061] Analiza strukture glikana sprovedena je u Procognia Limited (Ashdod, Israel). N-glikani su oslobođeni iz uzorka koristeći PNGazu F, a zatim označeni 2-aminobenzamidom. Oslobođeni glikani su tretirani sa ili bez serije egzoglikozidaza kako bi se generisali različiti oblici glikana. Glikani su razdvojeni dvodimenzionalnom HPLC analizom (NP-HPLC i WAX) i identifikovani poređenjem sa bazom podataka o vremenu zadržavanja koja je izgrađena korišćenjem interno pripremljenih standarda razdvojenih i analiziranih istom dvodimenzionalnom HPLC analizom.

Sadržaj sijalinske kiseline

[0062] Tečna hromatografija ultravisokog pritiska (UPLC) je korišćena za određivanje sadržaja sijalinske kiseline i potvrđivanje identiteta peptida. Metoda je sprovedena pomoću Acquity UPLC BEH C181,7 µm 2,1x50 kolone i sledeće mobilne faze: 9:7:84/ acetonitril: metanol: voda, sa protokom 0,3 ml/min. Sijalinske kiseline su oslobođene iz ispitnog uzorka enzimskim cepanjem sa sijalidazom i nakon toga su derivatizovane fluorescentnom oznakom (1,2 diamino 4,5 metilendioksibenzen dihidrohlorid (DMB)). Označeni test uzorak je razdvojen sa UPLC sa izokratskom elucijom i fluorescentnom detekcijom sa talasnom dužinom ekscitacije od 373 nm i talasnom dužinom emisije od 448 nm. Sadržaj sijalinske kiseline u test uzorcima je kvantifikovan u odnosu na standarde N-glikolneuraminske kiseline (NGNA) i N-acetlineuraminske kiseline (NANA), izvedene kao standardna kriva. Sadržaj NGNA i NANA sijalinske kiseline je prijavljen kao pmol sijalinska kiselina / pmol protein.

Obrazac sijalilacije

[0063] Slaba anjonska razmena (VOSAK) - HPLC je korišćena za određivanje % neutralnih, mono-, di-, tri- i tetrasializovanih glikana. Metoda podrazumeva enzimsko oslobađanje N-glikana iz supstance leka sa PNGazom, fluorescentno obeležavanje 2-aminobenzamidom (2-AB), desalinizaciju pomoću Ludger D1 kertridža. Separacija sijalizovanih glikana sprovedeno je pomoću WAX-HPLC, koristeći kolonu Glyco Sep C sa gradijentom acetonitrila od 20%/0,5M amonijumskog formata na 40°C. Detekcija fluorescencije je podešena na 330 nm ekscitacije i 420 nm emisije. Paralelno je sprovedeno testiranje referentnog standarda. % neutralnih, mono-, di-, tri- i tetrasiliranih glikana određen je iz WAX-HPLC hromatograma i prijavljen.

Čistoća, SEC

[0064] % HPLC (SEC) sa isključivanjem veličine korišćen je za određivanje čistoće supstance leka odvajanjem intaktnih aktivnih dimera od SGF i oligomernih oblika (koji se prvenstveno sastoje od dimera aktivnih dimera). Netaknuti aktivni molekul dimera sastoji se od dve identične podjedinice glikoziliranog proteina (gp130 ekstracelularni domen spojen sa Fc delom teškog lanca humanog IgG1). Uzorci su razdvojeni na osnovu molekulske mase pomoću kolone za permeaciju gela (TSK G3000SWXL) sa brzinom protoka od 1 ml/min i mobilnom fazom od 0,2 M natrijum fosfata pH 7,0. Eluat kolone je praćen na 280 nm. Netaknuta vrsta se identifikuje po svom karakterističnom vremenu retencije; % čistoće aktivnog dimera izražava se kao procenat ukupne integrisane površine pika.

Oligomerni oblici

[0065] Procenat oligomernih oblika se određuje korišćenjem gorenavedene SEC metode. Procenat oligomernih oblika izražava se kao procenat ukupne integrisane površine pika.

Jednostruki obrazac gp130 (SGF)

[0066] Procenat SGF je određen gorenavedenom SEC metodom. Procenat SGF je izražen kao procenat ukupne integrisane površine pika.

[0067] Rezultati analiza dati su u tabeli 3.

Tabela 3 Rezultati testa karakterizacije

Analiza Teorijska Serija 1 Serija 2 Serija 3 Serija 4 Serija 5 Serija 6 vrednost (400 l) (800 l) (800 l) (800 l) (800 l) (10.000

Analiza Teorijska Serija 1 Serija 2 Serija 3 Serija 4 Serija 5 Serija 6 vrednost (400 l) (800 l) (800 l) (800 l) (800 l) (10.000

Opis i kompozicija proizvoda leka (DP)

[0068] DP je sterilni rastvor koji se primenjuje intravenskom infuzijom. DP se sastoji od peptida 1 u koncentraciji od 15 mg/ml u izotoničnom rastvoru koji sadrži 25 mM L-histidina, 200 mM saharoze i 0,1 mg polisorbata 20/ml pri pH 7,6. Bočice su obložene azotom radi zaštite od oksidacije. Proizvod je namenjen za jednokratnu upotrebu i skladištenje na -20°C do odmrzavanja za kliničku primenu.

Kompozicija i formula serije

[0069] Formula serije za proizvod leka je prikazana u tabeli 4.

Tabela 4

Primer 2

Kliničko ispitivanje 000067 (pojedinačna doza)

Dizajn

[0070] Ovo je bilo ispitivanje sa pojedinačnom dozom, kontrolisano placebom, jednostruko slepo, randomizovano u okviru doze, sa povećanjem doze u paralelnim grupama. Ispitivanje je sprovedeno u dva dela, gde je prvi deo obuhvatio zdrave ispitanike, a drugi deo pacijente sa CD u kliničkoj remisiji. Cilj je bio da se ispita bezbednost i podnošljivost, i ako je moguće, da se dobiju znaci farmakoloških efekata, nakon pojedinačnih doza peptida 1.

[0071] In U delu 1 uključena su 64 ispitanika, od kojih je 48 (44 muškarca, 4 žene) dobilo aktivni tretman, a 16 (svi muškarci) je dobilo placebo. Sedam doza je istraženo i primenjeno kao intravenska infuzija tokom 30 minuta (0,75 mg, 7,5 mg, 75 mg) ili 1 sata (150 mg, 300 mg, 600 mg i 750 mg). Pored toga, 6 ispitanika je primilo s.c. dozu od 60 mg peptida 1, a 2 ispitanika su primila s.c. dozu placeba. Peptid 1 je primenjen u dozi od 15 mg/ml u 25 mM histidina, 200 mM saharoze i 0,1 mg/ml polisorbata 20.

[0072] U delu 2 uključena su 24 pacijenta, od kojih je 18 (11 muškaraca, 7 žena) dobilo aktivni tretman (75 mg, 300 mg i 750 mg), a 6 (4 muškarca, 2 žene) je dobilo placebo, a svi su primenjeni intravenskim putem.

Rezultati

[0073] Farmakokinetička procena nakon i.v. primene peptida 1 pokazala je proporcionalnost doze i za AUC i za Cmax u opsegu od 0,75 mg do 750 mg, pri čemu su koncentracije Cmax u plazmi u rasponu od 0,2 do 170 µg/ml (sl.3). Klirens je bio oko 0,13 l/h, srednje terminalno poluvreme eliminacije oko 4,5 dana, a zapremina distribucije oko 20 l, što ukazuje na ekstravaskularnu distribuciju. S.c. primena 60 mg peptida 1 pokazala je Cmax od 1,1 µg/ml nakon 2,3 dana i poluvreme eliminacije od 5,0 dana. Bioraspoloživost nakon s.c. primene peptida 1 izračunata je na približno 50%.

[0074] Intravenska primena 75, 300 i 750 mg kod pacijenata sa CD u remisiji pokazala je veoma slične rezultate kao i kod zdravih ispitanika (sl.4). AUC i Cmax su bili proporcionalni dozi sa koncentracijama Cmax od 16, 76 i 186 µg/ml (16, 77 i 161 µg/ml za zdrave ispitanike).

Klirens je bio oko 0,13 l/h, srednje terminalno poluvreme eliminacije oko 4,6 dana, a zapremina distribucije oko 22 l.

[0075] Bezbednosni profil peptida 1 bio je povoljan sa nekoliko neželjenih događaja koji su se pojavili u svim terapijskim grupama, uključujući placebo grupu, a svi su bili blagi ili umereni. Nisu primećeni očigledni trendovi u vezi sa dozom u incidenciji ili učestalosti neželjenih događaja. Infuzije su prekinute kod dva ispitanika, kod jednog zbog blagih (1. deo, grupa od 300 mg) a kod drugog zbog umerenih (2. deo, grupa od 75 mg) reakcija na infuziju.

[0076] Nije bilo očiglednih trendova vezanih za dozu ili promena vezanih za tretman u vitalnim znacima, EKG ili parametrima kliničke hemije.

[0077] Jedan zdravi ispitanik u grupi od 300 mg pokazao je antitela protiv peptida 1 koja nisu izazvala neutralizaciju tokom kontrolne posete 5-6 nedelja nakon primene.

[0078] Sve u svemu, peptid je bio bezbedan i dobro se podnosio kada se primenjivao intravenski do 750 mg kao pojedinačna i.v. doza, a pri 60 mg kao pojedinačna s.c. doza

Primer 3

Kliničko ispitivanje 000115 (višestruko rastuća doza)

Dizajn

[0079] Ovo je bilo placebo kontrolisano, dvostruko slepo, u okviru randomizovane grupe doza, paralelno grupno ispitivanje sa ciljem da se ispita bezbednost, podnošljivost i farmakokinetika višestrukih rastućih doza peptida 1. Ispitivane doze su bile 75, 300 i 600 mg peptida 1 primenjenog jednom nedeljno, tokom 4 nedelje, i.v. infuzijom u trajanju od 30 minuta (75 mg) ili 1 sata (300 mg i 600 mg).

[0080] Uključena su dvadeset četiri (24) zdrava ispitanika, od kojih je 18 (11 muškaraca i 7 žena) dobilo aktivni tretman, a 6 (2 muškarca i 4 žene) placebo.

Rezultati

[0081] Procena farmakokinetike pokazala je veoma bliske karakteristike prvog i poslednjeg dana ltretmana i slične rezultate u studiji sa jednom dozom. AUC i Cmax su bili proporcionalni dozi nakon prvog i četvrtog doziranja sa koncentracijama Cmax od 19, 78 i 148 µg/ml nakon prve doze i 19, 79 i 142 µg/ml nakon četvrte doze (16, 77 i 161 µg/ml za jednu dozu kod zdravih ispitanika; sl. 5). Odgovarajuće najniže vrednosti bile su 0,66; 2,68; 4,56 µg/ml i 0,98; 3,95 i 7,67 µg/ml za tri nivoa doze. Srednje terminalno poluvreme eliminacije izračunato nakon poslednje doze bilo je oko 5,5 dana.

[0082] Bezbednosni profil peptida 1 bio je povoljan sa nekoliko neželjenih događaja koji su se pojavili u svim terapijskim grupama, uključujući placebo grupu, a svi su bili blagi ili umereni. Nisu primećeni očigledni trendovi u vezi sa dozom u incidenciji ili učestalosti neželjenih događaja. Jedan ispitanik (grupa od 600 mg) je povučen iz ispitivanja zbog blagih reakcija na infuziju.

[0083] Nije bilo očiglednih trendova vezanih za dozu ili promena vezanih za tretman u vitalnim znacima, EKG ili parametrima kliničke hemije.

[0084] Ni kod jednog od ispitanika nisu otkrivena antitela na peptid 1.

[0085] Sveukupno, peptid 1 je bio bezbedan i dobro se podnosio kada se davao intravenski do 600 mg jednom nedeljno tokom 4 nedelje.

LISTA SEKVENCI [0086]

SEQ ID NO: 1

Ċ

SEQ ID NO: 2

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Polipeptidni dimer koji se sastoji od dva gpl30-Fc monomera koji imaju najmanje 90% identiteta sekvence prema SEQ ID NO: 1, pri čemu monomeri obuhvataju aminokiseline na pozicijama 585-595 SEQ ID NO:1, zglobna regija Fc domena obuhvata aminokiseline na pozicijama 609-612 SEQ ID NO:1, a monomeri ne sadrže linker između dela gp130 i Fc domena, poželjno pri čemu su monomeri povezani jednim ili više disulfidnih mostova, pri čemu polipeptidni dimer ne obuhvata više od 6% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze po mol polipeptidu, poželjno ne više od 3 mol%, poželjnije ne više od 1 mol%, još poželjnije ne više od 0,5 mol% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze,

pri čemu se polipeptidni dimer može dobiti izražavanjem polipeptida koji ima najmanje 90% identiteta sekvence SEQ ID NO: 1 u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), odabirom ćelijske linije koja proizvodi navedeni polipeptidni dimer, kultivacijom ćelijske linije u medijumu za kulturu i sakupljanjem navedenih polipeptidnih dimera iz navedenih ćelija i/ili medija za kulturu ćelija, poželjno pri čemu su navedeni dimeri purifikovani i/ili koncentrisani.

2. Polipeptidni dimer iz patentnog zahteva 1, pri čemu polipeptidni dimer obuhvata glikane, pri čemu srednja vrednost od najmanje 52%, poželjno najmanje 54% glikana uključuje jedan ili više ostataka sijalinske kiseline, poželjnije 52-65%.

3. Polipeptidni dimer iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu monomeri imaju SEQ ID NO:

1 ili SEQ ID NO: 2.

4. Kompozicija koja se sastoji od polipeptidnog dimera iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:

a. ne više od 5% polipeptidnog dimera je prisutno kao oligomerni agregat,

b. kompozicija ne sadrži više od 4,0% po masi polipeptida koji su skraćena varijacija polipeptida SEQ ID NO: 1 u odnosu na polipeptide SEQ ID NO: 1, poželjno pri čemu ne više od 3%, poželjnije pri čemu ne više od 1,5%, najpoželjnije pri čemu ne više od 1,0% polipeptida je prisutno kao oligomer ili

c. i jedno i drugo.

5. Kompozicija koja se sastoji od polipeptidnog dimera iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3 ili kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4, pri čemu kompozicija dalje sadrži surfaktant.

6. Kompozicija prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je surfaktant nejonski surfaktant, poželjno pri čemu je surfaktant polisorbatni surfaktant, poželjnije pri čemu je surfaktant polisorbat 20.

7. Kompozicija koja se sastoji od polipeptidnog dimera iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 4-6, pri čemu kompozicija dalje sadrži pufersko sredstvo i šećer, poželjno pri čemu je pufersko sredstvo histidin, poželjno pri čemu je šećer saharoza.

8. Polipeptidni dimer iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 4-7 za upotrebu u tretmanu inflamatorne bolesti ili stanja posredovanog IL-6 kod čoveka.

9. Polipeptidni dimer ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 inflamatorna bolest creva, poželjno pri čemu tretman indukuje remisiju inflamatorne bolesti creva.

10. Polipeptidni dimer ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je inflamatorna bolest creva Kronova bolest ili ulcerozni kolitis, poželjno pri čemu tretman održava remisiju inflamatorne bolesti creva.

11. Polipeptidni dimer ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 reumatoidni artritis, psorijaza, uveitis ili ateroskleroza; ili pri čemu je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 kolitis koji nije povezan sa inflamatornom bolešću creva, poželjno pri čemu je kolitis radijacioni kolitis, divertikularni kolitis, ishemijski kolitis, infektivni kolitis, celijakija, autoimuni kolitis ili kolitis koji je rezultat alergija koje utiču na debelo crevo.

12. Polipeptidni dimer ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8-11, pri čemu se polipeptidni dimer ili kompozicija primenjuje parenteralno, poželjno intravenski ili subkutano.

13. Metoda za proizvodnju polipeptidnog dimera koji se sastoji od dva gp130-Fc monomera koji imaju najmanje 90% identiteta sekvence prema SEQ ID NO: 1, pri čemu monomeri sadrže aminokiseline na pozicijama 585-595 SEQ ID NO:1, regija zgloba Fc domena koja se sastoji od aminokiselina na pozicijama 609-612 SEQ ID NO:1, a monomeri ne sadrže linker između gp130 dela i Fc domena, poželjno pri čemu su monomeri povezani jednim ili više disulfidnih mostova, navedena metoda se sastoji od: - ekspresije aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sekvence prema SEQ ID NO: 1 u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO),

- izbora za ćelijsku liniju koja proizvodi navedeni polipeptidni dimer, pri čemu polipeptidni dimer ne sadrži više od 6% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze po mol polipeptidu, poželjno ne više od 3 mol%, poželjnije ne više od 1 mol%, još poželjnije ne više od 0,5 mol% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze,

- kultivacije ćelija iz ćelijske linije u medijumu za kulturu, i

- prikupljanja navedenih polipeptidnih dimera iz navedenih ćelija i/ili medija ćelijske kulture, poželjno pri čemu su navedeni dimeri prečišćeni i/ili koncentrovani.

14. Metoda iz patentnog zahteva 13, pri čemu polipeptidni dimer obuhvata glikane, pri čemu srednja vrednost od najmanje 52%, poželjno najmanje 54% glikana uključuje jedan ili više ostataka sijalinske kiseline, poželjnije 52-65%.

15. Metoda iz patentnog zahteva 13 ili 14, pri čemu monomeri imaju SEQ ID NO: 1.

16. Metoda bilo kog od patentnih zahteva 13-15, pri čemu:

a. ne više od 5% polipeptidnog dimera je prisutno kao oligomerni agregat,

b. nema više od 4,0% po masi polipeptida koji su skraćena varijacija polipeptida SEQ ID NO: 1 u odnosu na polipeptide SEQ ID NO: 1, poželjno pri čemu ne više od 3%, poželjnije pri čemu ne više od 1,5%, najpoželjnije pri čemu ne više od 1,0% polipeptida je prisutno kao oligomer ili

c. i jedno i drugo.