RS64931B9 - Derivati benzizoxazol sulfonamida - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novi derivat benzizoksazol sulfonamida, koji deluje kao inhibitor lizin acetil transferaze (KAT) porodice MYST i koristan je u lečenju abnormalnog rasta ćelija, kao što je kancer, kod pacijenata. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje i na upotrebu jedinjenja i kompozicija u lečenju abnormalnog rasta ćelija kod pacijenata.

Osnova tehnike

[0002] MYST porodica je najveća porodica KAT i nazvana je po osnivačima kvasca i sisara: MOZ, Ibf2/Sas3, Sas2 i TIP60 (Dekker 2014). MYST proteini posreduju u mnogim biološkim funkcijama uključujući regulaciju gena, popravku DNK, regulaciju i razvoj ćelijskog ciklusa (Avvakumov 2007; Voss 2009). KAT proteini iz porodice MYST igraju ključnu ulogu u posttranslacionoj modifikaciji histona i stoga imaju dubok uticaj na strukturu hromatina u eukariotskom jezgru (Avvakumov 2007). Porodicu trenutno čini pet KAT sisara: TIP60 (KAT5; HTATIP; MIM 601409), MOZ (KAT6A; MIM 601408; MYST3), MORF (KAT6b; KKF; MYST4), HBO (KAT7; HBO1; MYSTK2); MYST1) (Voss 2009). Ovih pet članova porodice MYST prisutni su kod ljudi i poznato je da je poremećena funkcija MYST proteina povezana sa kancerom (Avvakumov 2007). Najčešće korišćena imena za članove porodice MYST su:

MYST funkcionalni domeni

[0003] MYST proteini funkcionišu u kompleksima proteina sa više podjedinica uključujući adaptere kao što su ING proteini koji posreduju u vezivanju DNK (Avvakumov 2007). Na primer, TIP60 je povezan sa NuA4 multiproteinskim kompleksom (koji obuhvata više od 16 članova) (Zhang 2017). Međutim, postojali su i neki izveštaji o motivu vezivanja DNK spirala-zavoj-spirala unutar strukture samog MOZ proteina (Holbert 2007), što ukazuje na sposobnost direktnog vezivanja za DNK.

[0004] Na aktivnost acetiltransferaze MYST proteina utiče MYST domen (katalitički domen). MYST domen sadrži motiv vezivanja acetil-koenzima A, koji je strukturno konzerviran sa drugim HAT, i neobičan C2HC-tip cink prst (Voss 2009). Smatra se da je visoko očuvan MYST domen, uključujući motiv vezivanja acetil-CoA i cink prst, definišuća karakteristika ove porodice enzima (Avvakumov 2007).

Uloga MYST proteina

[0005] Acetilacija histonskih ostataka je generalno povezana sa aktivacijom transkripcije. Međutim, u nekim slučajevima, transkripciona represija se takođe pripisuje MYST proteinima (Voss 2009). Poznato je da pojedinačni članovi porodice MYST učestvuju u širokom spektru važnih biohemijskih interakcija:

HBO1 pozitivno reguliše pokretanje replikacije DNK (Avvakumov 2007; Agarval 2004; Doyon 2006; Iizuka 2006) preko acetilacije histonskih supstrata, što verovatno dovodi do pristupačnije konformacije hromatina (Avvakumov 2007, Iizuka 2006). Takođe je poznato da HBO1 igra ulogu u patogenezi kancera dojke promovišući obogaćivanje ćelija sličnih matičnim ćelijama kancera (Duong 2013) i destabilizacijom receptora estrogena α (ERα) kroz ubikvinicijaciju, koja se odvija preko histonacetilujejuće aktivnosti HBO1 (Iizuka 2013). HBO1 je takođe uključen u akutnu mijeloidnu leukemiju (AML) (Shi 2015).

[0006] TIP60 (KAT5) je najviše proučavan član porodice MYST. TIP60 igra važnu ulogu ne samo u regulaciji transkripcije, već i u procesu popravljanja oštećenja DNK, posebno u dvolančanim prekidima DNK (DSB) (Gil 2017). TIP60 može da acetiluje p53, ATM i c-Mic. TIP60 i MOF posebno acetilujeju lizin 120 (K120) p53 nakon oštećenja DNK (Avvakumov 2007). TIP60 je takođe impliciran kao važan za regulatornu biologiju T-ćelija (Treg). FOXP3 je glavni regulator u razvoju i funkciji Tregs i pokazalo se da je acetilacija FOXP3 od strane TIP60 od suštinskog značaja za aktivnost FOXP3 (Li 2007, Xiao 2014). Ističući ovo, uslovno brisanje TIP60 kod miševa dovodi do fatalne autoimune bolesti nalik na skurf, oponašajući fenotip koji se vidi kod miševa koji nokautiraju FOXP3 (Xiao 2014). Kod kancera, Treg ćelije mogu olakšati napredovanje tumora potiskivanjem adaptivnog imuniteta protiv tumora.

[0007] MOF („mužjaci odsutni na prvom“) je prvobitno identifikovan kao jedna od komponenti kompenzacije doze kod Drosophile, i klasifikovan je kao član porodice MYST na osnovu funkcionalnih studija i analize sekvence. (Su 2016). Humani ortolog pokazuje značajnu sličnost sa drozofilom MOF; koji sadrži mesto vezivanja za acetil-CoA, hromodomen (koji vezuje histone) i C2HC-tip cink prst (Su 2016). MOF je ključni enzim za acetilaciju histona H4K16, a kompleksi koji sadrže MOF uključeni su u različite esencijalne ćelijske funkcije sa vezama sa kancerom (Su 2016). Pored globalnog smanjenja acetilacije histona, iscrpljivanje MOF u ćelijama sisara može dovesti do abnormalne transkripcije gena, posebno izazivajući abnormalnu ekspresiju određenih tumorskih supresorskih gena ili onkogena, što ukazuje na kritičnu ulogu MOF u tumorigenezi. (Su 2016). Na primer, pokazalo se da je KAT aktivnost MOF potrebna za održavanje MLL-AF9 leukemije i može biti važna za više podtipova AML-a (Valerio 2017).

[0008] KAT6B (Querkopf) je prvi put identifikovan u mutacionom skriningu za gene koji regulišu ravnotežu između proliferacije i diferencijacije tokom embrionalnog razvoja (Thomas 2000). Miševi homozigotni za mutantni alel KAT6B imaju ozbiljne defekte u razvoju moždane kore koji su rezultat ozbiljnog smanjenja i proliferacije i diferencijacije specifično kortikalne progenitorske populacije tokom embrionalnog razvoja. KAT6B je neophodan za održavanje populacije nervnih matičnih ćelija odraslih i deo je sistema koji reguliše diferencijaciju matičnih ćelija u neurone (Merson 2006). KAT6B je takođe mutiran u retkim oblicima leukemije (Vizmanos 2003).

[0009] MOZ lokus se rangira kao 12. najčešće amplifikovan region u svim tipovima kancera (Zack 2013). MOZ je unutar amplikona 8p11-p12, koji se vidi na frekvencijama oko 10-15% kod različitih karcinoma, posebno dojke i jajnika (Turner-Ivey 2014). MOZ je prvi put identifikovan kao fuzioni partner CREB-vezujućeg proteina (CBP) tokom ispitivanja specifične hromozomske translokacije kod akutne mijeloidne leukemije (AML) (Avvakumov 2007, Borrow 1996). Aktivnost MOZ KAT je neophodna za promovisanje ekspresije MEIS1 i HOXa9, proteina koji se obično primećuju kao prekomerno eksprimirani kod nekih limfoma i leukemija. Povećan opstanak MOZ<+/->heterozigotnih miševa u Eµ-Mic transgenom modelu limfoma B-ćelija, gde gubitak jednog MOZ alela dovodi do biološki relevantnog smanjenja nivoa Meis1 i Hoka9 u pre-B-ćelijama (Sheikh 2015).

[0010] Poznati su inhibitori nekih MYST. Na primer, prikazan je sledeći derivat anakardne kiseline (Ghizzoni 2012) kao inhibitor TIP60 (IC50= 74 µM) i MOF (IC50= 47µM):

Drugi poznati inhibitori uključuju (Zhang

SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK, SEQ ID NO:1

ARTKKTARXTGGKAPRKKL, SEQ ID NO:2

[0011] Stein et al "Discovery and structure-activity relationships of su lfonamide ETA-selective antagonists", J. Med Chem, 1995, vol 38(8), p1344-1354 otkriva odnose strukture aktivnosti sulfonamida ETAantagonisti receptora.

[0012] WO 2018/102419 (Epizyme Inc, objavljen 7. juna 2018) otkriva jedinjenja koja sadrže sulfonsku grupu kao KAT inhibitore.

[0013] WO 2019/243491 (CTXT PTY LIMITED, objavljen 26. Decembra 2019) otkriva jedinjenja koja deluju kao inhibitori lizin acetil transferaze (KAT) porodice MYST.

[0014] U svetlu utvrđene uloge KAT uopšte, a posebno MYST, u bolestima kao što je kancer, postoji potreba za novim inhibitorima ovih proteina.

Suština pronalaska

[0015] Svaka od realizacija u nastavku koja opisuje pronalazak predviđa u okviru svog obima farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja pronalaska. Shodno tome, fraza "ili njihova farmaceutski prihvatljiva so" je implicitna u opisu svih ovde opisanih jedinjenja.

[0016] Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje koje je

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0017] Jedinjenje pronalaska, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, takođe može biti obeleženo deuterijumom.

[0018] Ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0019] Ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, za lečenje kancera.

[0020] Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenata.

[0021] Ovaj pronalazak se odnosi na kombinaciju jedinjenja pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa antitumorskim agensom ili sa terapijom zračenjem, za lečenje kancera.

[0022] Ovaj pronalazak se odnosi na kombinaciju jedinjenja pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa antitumorskim agensom, za lečenje kancera.

[0023] U jednom aspektu ovog pronalaska, kancer je kancer dojke.

[0024] U jednom aspektu ovog pronalaska, kancer je kancer dojke, pri čemu je kancer dojke ER pozitivan kancer dojke.

Kratak opis crteža

[0025] SL. 1 prikazuje PXRD spektar 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida u vodi (Oblik 1).

Detaljan opis pronalaska

[0026] Ovaj pronalazak se može lakše razumeti pozivanjem na sledeći detaljan opis poželjnih realizacija pronalaska i primera uključenih ovde. Podrazumeva se da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja specifičnih izvođenja i nije namera da bude ograničavajuća. Dalje se podrazumeva da osim ako nije posebno definisano ovde, terminologiji korišćenoj ovde treba dati njeno tradicionalno značenje poznato u relevantnoj tehnici.

[0027] Pronalazak koji je ovde opisan može se na odgovarajući način primeniti u odsustvu bilo kog elementa (elemenata) koji ovde nije posebno otkriven. Tako, na primer, u svakoj instanci ovde bilo koji od izraza "sastoji", "koji se u suštini sastoji od" i "sastoji se od" može biti zamenjen sa bilo kojim od druga dva termina.

[0028] Radi praktičnosti, mnogi hemijski ostaci i jedinjenja su predstavljeni korišćenjem dobro poznatih skraćenica, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Ac (acetil), AcOH (sirćetna kiselina), AIBN (azobisizobutironitril), n-BuLi (n-butillitijum), CN (cijano), CPME (ciklopentil metil etar), DCM (dihlorometan ili metilen hlorid), aceton-d6(deuterisani aceton), CDCl3(deuterisani hloroform), DMSO-d6(deuterisani dimetilsulfoksid), metanol-d4(deuterisani metanol), D2O (deuterisana voda), DIAD (diizopropil azodikarboksilat), DMAP (N,N-dimetilpiridin-4-amin), DMF (N,N-dimetilformamid), DMSO (dimetilsulfoksid), dppf (1.1'-bis(difenilfosfino)ferocen), dppp (1,3-bis(difenilfosfino)propan), Et (etil), etil acetat (EtOAc), EtOH (etanol) , LDA (litijum diizopropil amid), Me (metil), MeOH (metanol), MeCN (acetonitril), MeOAc (metil acetat), Ms (metansulfonil), MsCl (metansulfonil hlorid), MTBE (metil terc-butil etar), NADPH (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat), N/D (nije određeno); NaOMe (natrijum metoksid), NaOtPn (natrijum terc-pentoksid), Pd(OAc)2(paladijum(II) acetat), PdCl2(dppf) ili Pd(dppf)Cl2(1.1'-bis(difenilfosfino)ferocen dihloropaladijum (II)), Pd(PPh3)4(tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(O)), Pet. Etar (petroleum etar), Ph (fenil), 2-PrOH (izopropanol, 2-propanil), t-Bu (terc-butil), TBAF (tetra-nbutilamonijumfluorid), TBS (terc-butildimetilsilil), TMG (tetrametilguanidin), TBSCI (tercbutildimetilsilil hlorid), TEA (trietilamin), TFA (trifluorosirćetna kiselina), THF (tetrahidrofuran), TMEDA (tetrametiletilendiamin) i X-Phos (2-dicikloheksilfosfino-2'.4',6'-triizopropilbifenil).

[0029] Pored toga, TLC se odnosi na tankoslojnu hromatografiju, HPLC se odnosi na tečnu hromatografiju visokih performansi, LCMS se odnosi na tečnu hromatografiju-masenu spektrometriju i SFC (superkritična tečna hromatografija).

[0030] Ostale skraćenice: rt ili Rt (vreme zadržavanja), min (minuta ili minuta), h (sati sati), RT (sobna temperatura), aq. (vodeni), zas. (zasićeni), ekv. ili ek. (ekvivalent(i)).

[0031] Termin "lečenje", kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, znači preokretanje, ublažavanje, inhibiranje napredovanja ili sprečavanje bolesti, poremećaja ili stanja na koje se taj termin odnosi, ili jednog ili više simptoma takve bolesti, poremećaja ili stanja . Izraz "lečenje", kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, odnosi se na čin lečenja kao što je "lečenje" definisano neposredno iznad.

[0032] Izraz "kombinacija", kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, označava kombinaciju fiksne doze ili kombinaciju agenasa koja se primenjuje povremeno, istovremeno ili uzastopno, prema istom ili drugačijem putu primene. Kako se ovde koristi, "efikasna" količina se odnosi na količinu supstance, agensa, jedinjenja ili kompozicije koja je dovoljna da rezultuje smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevenciju oštećenja ili invaliditeta usled bolesti -bilo kao pojedinačna doza ili prema režimu višestrukih doza, sam ili u kombinaciji sa drugim agensima ili supstancama. Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici mogao bi da odredi takve količine na osnovu faktora kao što su veličina pacijenta, ozbiljnost simptoma pacijenta, i određena kombinacija, kompozicija ili odabrani put primene. Pacijent ili subjekt može biti čovek ili ne-human sisar kome je potrebno lečenje. U jednom aspektu, pacijent je čovek.

[0033] Osim ako nije drugačije naznačeno, sve reference ovde na jedinjenja pronalaska uključuju reference na njihove soli, solvate, hidrate i komplekse, i na njihove solvate, hidrate i komplekse soli, uključujući polimorfe, stereoizomere i njihove izotopski obeležene verzije.

[0034] Primeri izvođenja koji su ovde otkriveni uključuju izotopski obeležena jedinjenja, koja su identična onima koja su navedena, osim što su jedan ili više atoma zamenjeni atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se obično nalazi u prirodi. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja iz primera izvođenja koji su ovde otkriveni uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, sumpora, fluora i hlora, kao što su, ali bez ograničenja,<2>H,<3>H,<13>C,<14>C,<15>N,<18>O,<17>O,<31>P,<32>P,<35>S,<18>F, i<36>Cl, respektivno. U jednom aspektu, izotop ugrađen u jedinjenja pronalaska je<2>H. Ovde opisana jedinjenja i farmaceutski prihvatljive soli navedenih jedinjenja koja sadrže gorepomenute izotope i/ili druge izotope drugih atoma su u okviru predmetnog primera izvođenja. Određena izotopski obeležena jedinjenja ovde otkrivenih primera izvođenja, na primer, ona u koja ona u koja su ugrađeni radioaktivni izotopi kao npr.

<3>H i<14>C, korisna su u testovima distribucije leka i/ili supstrata u tkivu. Tricijumovani, tj.<3>H i ugljenik-14, tj.<14>C, izotopi su posebno poželjni zbog njihove lakoće pripreme i detekcije. Dalje, zamena sa težim izotopima kao što je deuterijum, tj.<2>H, može dati određene terapeutske prednosti koje proizilaze iz veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećanog in vivo poluživota ili smanjena potrebne doze i, stoga, može biti poželjna u nekim okolnostima. Izotopski obeležena jedinjenja ovde otkrivenih primerra izvođenja mogu se generalno pripremiti izvođenjem postupaka otkrivenih na Šemama i/ili Primerima u nastavku, zamenom lako dostupnih izotopski obeleženih reagensa umesto reagensa koji nije izotopski obeležen. U jednom aspektu, jedinjenja su obeležena deuterijumom.

[0035] Neki primeri izvođenja se odnose na farmaceutski prihvatljive soli ovde opisanih jedinjenja. Ovde opisana jedinjenja koja su bazna po prirodi sposobna su da formiraju širok spektar soli sa različitim neorganskim i organskim kiselinama. Kiseline koje se mogu koristiti za pripremu farmaceutski prihvatljivih kiselih adicionih soli takvih baznih jedinjenja opisanih ovde su one koje formiraju netoksične kisele adicione soli, na primer, soli koje sadrže farmakološki prihvatljive anjone, kao što su hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, nitrat, sulfat , bisulfat, fosfat, kiseli fosfat, izonikotinat, acetat, laktat, salicilat, citrat, kiseli citrat, tartarat, pantotenat, bitartarat, askorbat, sukcinat, maleat, gentizinat, fumarat, glukonat, glukuronat, saharat, format, benzoat, glutamat, metansulfonat, etansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat i pamoat [tj., 1.1'-metilen-bis-(2-hidroksi-3-naftoat)] soli. Ovde opisana jedinjenja koja uključuju bazni deo, kao što je amino grupa, mogu da formiraju farmaceutski prihvatljive soli sa različitim amino kiselinama, pored prethodno pomenutih kiselina.

[0036] Takođe se mogu formirati hemisoli kiselina i baza, na primer, hemisulfatne i hemikalcijumove soli.

[0037] Za pregled odgovarajućih soli, videti Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use od Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002). Postupci za pravljenje farmaceutski prihvatljivih soli jedinjenja opisanih ovde su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

[0038] Termin "solvat" se ovde koristi da opiše molekularni kompleks koji sadrži jedinjenje opisano ovde i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih molekula rastvarača, na primer, etanol.

[0039] Ovde opisana jedinjenja mogu takođe postojati u nesolvatovanim i rastvorenim oblicima. Shodno tome, neke realizacije se odnose na hidrate i solvate ovde opisanih jedinjenja. Kada su rastvarač ili voda čvrsto vezani, kompleks će imati dobro definisanu stehiometriju nezavisno od vlažnosti. Međutim, kada su rastvarač ili voda slabo vezani, kao u kanalnim solvatima i higroskopnim jedinjenjima, sadržaj vode/rastvarača zavisiće od vlažnosti i uslova sušenja. U takvim slučajevima, nestehiometrija će biti norma. Termin 'solvat' se ovde koristi da opiše molekularni kompleks koji sadrži jedinjenje pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih molekula rastvarača, na primer, etanol. Termin 'hidrat' se koristi kada je rastvarač voda. Farmaceutski prihvatljivi solvati u skladu sa pronalaskom obuhvataju hidrate i solvate u kojima rastvarač kristalizacije može biti izotopski supstituisan, npr. D2O, d6-aceton, de-DMSO.

[0040] Takođe mogu postojati kompleksi kao što su klatrati, kompleksi inkluzije lek-domaćin u kojima su, za razliku od prethodno pomenutih solvata, lek i domaćin prisutni u stehiometrijskim ili nestehiometrijskim količinama. Takođe mogu postojati kompleksi leka koji sadrže dve ili više organskih i/ili neorganskih komponenti koje mogu biti u stehiometrijskim ili nestehiometrijskim količinama. Dobijeni kompleksi mogu biti jonizovani, delimično jonizovani ili nejonizovani. Za pregled takvih kompleksa, videti J Pharm Sci, 64 (8), 1269-1288 od Haleblian (avgust 1975.).

[0041] Otkriveni su prolekovi ovde datih jedinjenja. Prema tome, određeni derivati jedinjenja pronalaska koji sami po sebi mogu imati malu ili nikakvu farmakološku aktivnost mogu, kada se daju pacijentu, biti pretvoreni u jedinjenja pronalaska, na primer, hidrolitičkim cepanjem. Takvi derivati se nazivaju prolekovi. Dodatne informacije o upotrebi prolekova mogu se naći u "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14, ACS Symposium Series (T Higuchi and W Stella) i "Bioreversible Carriers in Drug Design", Pergamon Press, 1987 (ed. E B Roche, American Pharmaceutical Association).

[0042] Prolekovi se, na primer, mogu proizvesti zamenom odgovarajućih funkcionalnosti prisutnih u jedinjenjima prema pronalasku sa određenim delovima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti kao 'pro-ostatci' kao što je opisano, na primer, u "Drug design" od H Bundgaarda (Elsevier, 1985).

[0043] Neki neograničavajući primeri prolekova uključuju:

(i) kada jedinjenje sadrži funkcionalnu grupu karboksilne kiseline (-COOH), njegov estar, na

1

primer, zamena vodonika sa (C1-C8)alkil;

(ii) kada jedinjenje sadrži alkoholnu funkcionalnost (-OH), njegov etar, na primer, zamena vodonika sa (C1-C6)alkanoiloksimetilom, ili sa fosfatnom etar grupom; i

(iii) gde jedinjenje sadrži primarnu ili sekundarnu amino funkcionalnost (-NH2ili -NHR gde je R = H), njegov amid, na primer, zamena jednog ili oba vodonika sa prikladno metabolički labilnom grupom, kao što je amid, karbamat, urea, fosfonat, sulfonat, itd.

[0044] Dalji primeri zamenskih grupa u skladu sa prethodnim primerima i primeri drugih tipova prolekova mogu se naći u prethodno pomenutim referencama. Konačno, određena jedinjenja pronalaska mogu sama da deluju kao prolekovi drugih jedinjenja pronalaska.

[0045] Metaboliti jedinjenja pronalaska, tj. formirana jedinjenja in vivo nakon primene leka takođe mogu postojati.

[0046] Ovde opisana jedinjenja koja sadrže jedan ili više asimetričnih atoma ugljenika mogu postojati kao dva ili više stereoizomera. Kada ovde opisano jedinjenje sadrži alkenil ili alkenilen grupu, mogući su geometrijski cis/trans (ili Z/E) izomeri. Tamo gde su strukturni izomeri međusobno konvertibilni preko barijere niske energije, može se javiti tautomerna izomerija ('tautomerizam'). Ovo može imati oblik protonskog tautomerizma u jedinjenjima koja su ovde opisana koja sadrže, na primer, imino, keto ili oksim grupu, ili takozvani valentni tautomerizam u jedinjenjima koja sadrže aromatični deo. Jedno jedinjenje može pokazati više od jedne vrste izomerizma.

[0047] Ovde opisana jedinjenja obuhvataju sve stereoizomere (npr. cis i trans izomeri) i svi optički izomeri jedinjenja opisanih ovde (npr. R i S enantiomeri), kao i racemske, dijastereomerne i druge smeše takvih izomera. Dok su svi stereoizomeri obuhvaćeni obimom naših patentnih zahteva, stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da određeni stereoizomeri mogu biti poželjniji.

[0048] U nekim primerima izvođenja, ovde opisana jedinjenja mogu postojati u nekoliko tautomernih oblika, uključujući enol i imin oblik, i keto i enamin oblik i geometrijske izomere i njihove smeše. Svi takvi tautomerni oblici su uključeni u obim ovih izvođenja. Tautomeri postoje kao mešavine tautomernog seta u rastvoru. U čvrstom obliku, obično preovlađuje jedan tautomer. Iako se može opisati jedan tautomer, ova izvođenja obuhvataju sve tautomere ovih jedinjenja.

[0049] Predmetni primeri izvođenja takođe uključuju atropizomere ovde opisanih jedinjenja. Atropizomeri se odnose na jedinjenja koja se mogu razdvojiti u rotaciono ograničene izomere.

[0050] U okviru ovog izvođenja uključeni su svi stereoizomeri, geometrijski izomeri i tautomerni oblici ovde opisanih jedinjenja, uključujući jedinjenja koja pokazuju više od jedne vrste izomerizma, i mešavine jednog ili više njih.

[0051] Cis/trans izomeri se mogu razdvojiti konvencionalnim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima, na primer, hromatografijom i frakcionom kristalizacijom.

[0052] Konvencionalne tehnike za pripremu/izolaciju pojedinačnih enantiomera uključuju hiralnu sintezu iz odgovarajućeg optički čistog prekursora ili razdvajanje racemata (ili racemata soli ili derivata) korišćenjem, na primer, hiralne tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) ili SFC.

[0053] Alternativno, racemat (ili racemski prekursor) može da reaguje sa odgovarajućim optički aktivnim jedinjenjem, na primer, alkoholom, ili, u slučaju kada jedinjenje opisano ovde sadrži kiseli ili bazni deo, bazu ili kiselinu kao što je 1-feniletilamin ili vinska kiselina. Dobijena dijastereomerna smeša može da se razdvoji hromatografijom i/ili frakcionom kristalizacijom i jedan ili oba dijastereoizomera se konvertuju u odgovarajući čisti enantiomer(e) na način koji je stručnjaku dobro poznat.

[0054] "Abnormalni rast ćelija" ili "kancer" kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, odnosi se na rast ćelija koji je nezavisan od normalnih regulatornih mehanizama (npr. gubitak kontaktne inhibicije). Ovo uključuje abnormalni rast: (1) tumorskih ćelija (tumora) koje se razmnožavaju ekspresijom mutirane tirozin kinaze ili prekomernom ekspresijom receptorske tirozin kinaze; (2) benigne i maligne ćelije drugih proliferativnih bolesti kod kojih dolazi do aberantne aktivacije tirozin kinaze; (3) bilo koji tumor koji se razmnožava pomoću receptorskih tirozin kinaza; (4) bilo koji tumor koji proliferira aberantnom aktivacijom serin/treonin kinaze; (5) benigne i maligne ćelije drugih proliferativnih bolesti u kojima se javlja aberantna aktivacija serin/treonin kinaze; (6) bilo koji tumor koji se razmnožava aberantnim signalnim, metaboličkim, epigenetskim i transkripcionim mehanizmom; i (7) benigne i maligne ćelije drugih proliferativnih bolesti kod kojih aberantni signalni, metabolički, epigenetski i transkripcioni mehanizam.

[0055] Radi pogodnosti, ovde se mogu koristiti određene dobro poznate skraćenice, uključujući: pozitivan receptor estrogena (ER+), negativan receptor 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2-), ne-sitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) i kancer prostate otporan na kastraciju ( CRPC).

[0056] Dalji primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju abnormalnog rasta ćelija kod pacijenta. Dodatni primeri izvođenja se odnose na tretman abnormalnog rasta ćelija kod pacijenta koji se sastoji od davanja pacijentu količine ovde opisanog jedinjenja koje je efikasno u lečenju abnormalnog rasta ćelija.

[0057] U drugim primerima izvođenja, abnormalni rast ćelija je kancer.

[0058] U nekim primerima izvođenja, kancer je izabran iz grupe koju čine kancer pluća, mezoteliom, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, karcinom jetre, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hočkin-ova bolest, kancer jednjaka, karcinom tankog creva, karcinom endokrinog sistema, karcinom štitaste žlezde, karcinom paratiroidne žlezde, karcinom nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, hematološki malignitet, hronična ili akutna leukemija, limfocitni limfomi, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), primarni CNS limfom, tumori kičmene moždine, glioblastom, gliom moždanog stabla, adenom hipofize ili kombinacija dva ili više navedenih kancera.

[0059] Dodatni primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju solidnih tumora kod pacijenata. Neki primeri izvođenja se odnose na lečenje solidnih tumora kod pacijenta koje se sastoji od davanja pacijentu količine ovde opisanog jedinjenja koje je efikasno u lečenju solidnog tumora.

[0060] U jednom primeru izvođenja, solidni tumor je dojke, pluća, debelog creva, mozga, prostate, želuca, pankreasa, jajnika, melanoma, endokrini, materice, testisa ili bešike.

[0061] U jednom primeru izvođenja, solidni tumor je dojke, pluća, prostate, pankreasa ili jajnika.

[0062] U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer dojke.

[0063] U jednom primeru izvođenja, kancer dojke je ER+ kancer dojke.

[0064] U jednom primeru izvođenja, kancer dojke je ER+ HER2- kancer dojke.

[0065] U jednom primeru izvođenja, kancer dojke je lokalno uznapredovali ili metastazirani ER+ HER2-karcinom dojke.

[0066] U jednom primeru izvođenja, kancer pluća je ne-sitnoćelijski kancer pluća.

[0067] U jednom primeru izvođenja, kancer pluća je lokalno uznapredovali ili metastazirani ne-sitnoćelijski kancer pluća.

[0068] U jednom primeru izvođenja, kancer prostate je kancer otporan na kastraciju.

[0069] U jednom primeru izvođenja, kancer prostate je lokalno uznapredovali ili metastazirani kancer prostate otporan na kastraciju.

1

[0070] Dodatni primerima izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju hematoloških tumora kod pacijenata. Neke realizacije se odnose na lečenje hematoloških tumora kod pacijenta koje se sastoji od davanja pacijentu količine ovde opisanog jedinjenja koje je efikasno u lečenju hematološkog tumora.

[0071] U jednom primeru izvođenja, hematološki tumor je leukemija, limfom ili multipli mijelom.

[0072] U jednom primeru izvođenja, hematološki tumor je leukemija ili limfom.

[0073] Dodatni primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta koje se sastoji od davanja pacijentu količine jedinjenja opisanog ovde koje je efikasno u lečenju kancera.

[0074] U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer dojke, pluća, debelog creva, mozga, prostate, želuca, pankreasa, jajnika, melanoma, endokrini, materice, testisa, bešike ili hematološki.

[0075] U jednom primeru izvođenja, kancer je dojke, pluća, prostate, pankreasa, jajnika ili hematološki.

[0076] U jednom primeru izvođenja, kancer je dojke, pluća, prostate, pankreasa ili jajnika.

[0077] U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer dojke.

[0078] U jednom primeru izvođenja, kancer dojke je ER+ kancer dojke.

[0079] U jednom primeru izvođenja, kancer dojke je ER+ HER2- kancer dojke.

[0080] U jednom primeru izvođenja, kancer dojke je lokalno uznapredovali ili metastazirani ER+ HER2-karcinom dojke.

[0081] U jednom primeru izvođenja, kancer pluća je ne-sitnoćelijski kancer pluća.

[0082] U jednom primeru izvođenja, kancer pluća je lokalno uznapredovali ili metastazirani ne-sitnoćelijski kancer pluća.

[0083] U jednom primeru izvođenja, kancer prostate je kancer prostate otporan na kastraciju.

[0084] U jednom primeru izvođenja, kancer prostate je lokalno uznapredovao ili metastazirani kancer prostate otporan na kastraciju.

[0085] U jednom primeru izvođenja, kancer je hematološki.

[0086] U jednom primeru izvođenja, hematološki tumor je leukemija ili limfom.

[0087] Dalji primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta koje obuhvata davanje pacijentu količine ovde opisanog jedinjenja koje je efikasno u lečenju kombinacije kancera sa antitumorskim agensom izabranim iz grupe koju čine mitotički inhibitori, alkilujući agensi, antimetaboliti, interkalirajući antibiotici, inhibitori faktora rasta, zračenje, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, antitela, citotoksici, antihormoni i anti-androgeni.

[0088] Više primera izvođenja se odnosi na farmaceutske kompozicije za lečenje kancera kod pacijenata koje sadrže količinu ovde opisanog jedinjenja koje je efikasno u lečenju kancera i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0089] Dodatni primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta, a posebno čoveka, koje obuhvata davanje pacijentu količine jedinjenja opisanog ovde, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili hidrata, koja je efikasna u lečenju kancera. U jednom aspektu, kancer obuhvata, ali nije ograničen na, kancer pluća, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkin-ova bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer štitne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, hronična ili akutna leukemija, limfocitni limfomi, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), primarni CNS limfom, tumori kičmene moždine, gliom moždanog stabla, gliom hipofize ili kombinacija jednog ili više navedenih karcinoma. Jedan primer izvođenja obuhvata davanje pacijentu količine ovde opisanog jedinjenja koje je efikasno u lečenju navedenog solidnog tumora. U jednom poželjnom primeru izvođenja solidni tumor je kancer dojke, pluća, debelog creva, mozga, prostate, želuca, pankreasa, jajnika, kože (melanom), endokrinog, materice, testisa i bešike.

[0090] U drugom primeru izvođenja, pomenuti kancer je benigna proliferativna bolest, uključujući, ali bez ograničenja, psorijazu, benignu hipertrofiju prostate ili restenozu.

[0091] Neki primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta koje obuhvata davanje navedenom pacijentu količine jedinjenja opisanog ovde, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili hidrata, koji je efikasan u lečenju kombinacije kancera sa anti-tumorskim agensom izabranim iz grupe koju čine mitotički inhibitori, alkilujući agensi, antimetaboliti, interkalacioni antibiotici, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, antitela, citotoksični lekovi, antihormoni i anti-androgeni.

[0092] Dodatna ostvarenja se odnose na farmaceutsku kompoziciju za lečenje kancera kod pacijenta, a posebno čoveka, koja sadrži količinu jedinjenja opisanog ovde, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili hidrata, koji je efikasan u lečenju kancera, i

1

farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom aspektu pomenute kompozicije, kancer obuhvata, ali nije ograničen na, kancer pluća, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hočkin-ova bolest, kancer jednjaka, karcinom tankog creva, karcinom endokrinog sistema, karcinom štitne žlezde, karcinom paratiroidne žlezde, karcinom nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, karcinom uretre, karcinom penisa, karcinom prostate, hronična ili akutna leukemija, limfocitni limfomi, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), primarni CNS limfom, tumori kičmene moždine, gliom moždanog stabla, adenom hipofize ili kombinacija jednog ili više navedenih karcinoma. U drugom primeru izvođenja pomenute farmaceutske kompozicije, navedeni abnormalni rast ćelija je benigna proliferativna bolest, uključujući, ali bez ograničenja, psorijazu, benignu hipertrofiju prostate ili restinozu.

[0093] Dalji primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta koje se sastoji od davanja navedenom pacijentu količine jedinjenja opisanog ovde, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili hidrata, koji je efikasan u lečenju kombinacije kancera sa drugim odabranim anti-tumorskim agensom iz grupe koju čine mitotički inhibitori, alkilujući agensi, antimetaboliti, interkalacioni antibiotici, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, antitela, citotoksični agensi, antihormoni i antiandrogeni. Neke realizacije razmatraju farmaceutsku kompoziciju za lečenje abnormalnog rasta ćelija pri čemu kompozicija uključuje jedinjenje opisano ovde, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili hidrat, koji je efikasan u lečenju abnormalnog rasta ćelija, i drugi antitumorski agens odabran iz grupa koju čine mitotički inhibitori, alkilujući agensi, anti-metaboliti, interkalacioni antibiotici, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, antitela, citotoksični, antihormoni i anti-androgeni.

[0094] Još više primera izvođenja se odnosi na jedinjenje za upotrebu u lečenju poremećaja povezanog sa angiogenezom kod pacijenta, uključujući čoveka, koji obuhvata davanje navedenom pacijentu količine jedinjenja opisanog ovde, kao što je definisano gore, ili farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili hidrata od toga, koji je efikasan u lečenju pomenutog poremećaja u kombinaciji sa jednim ili više antitumorskih agenasa navedenih

1

prethodno. Takvi poremećaji uključuju kancerozne tumore kao što je melanom; poremećaji oka kao što su degeneracija makule povezane sa uzrastom, pretpostavljeni sindrom očne histoplazmoze i neovaskularizacija retine zbog proliferativne dijabetičke retinopatije; reumatoidni artritis; poremećaji gubitka koštane mase kao što su osteoporoza, Paget-ova bolest, humoralna hiperkalcemija maligniteta, hiperkalcemija od metastaziranih tumora u kosti, i osteoporoza izazvana tretmanom glukokortikoidima; koronarna restenoza; i određene mikrobne infekcije uključujući one povezane sa mikrobnim patogenima odabranim od adenovirusa, hantavirusa, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp., Bordetella pertussis i Streptococcus grupe A.

[0095] Neki primeri izvođenja se odnose na jedinjenje za upotrebu u (i na farmaceutsku kompoziciju za) lečenje kancera kod pacijenata koje sadrži količinu jedinjenja opisanog ovde, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili hidrata, u kombinaciji sa količinom od jednog ili više supstanci odabrane od agenasa protiv angiogeneze, inhibitora transdukcije signala (npr. inhibiranje načina na koji regulatorni molekuli koji upravljaju osnovnim procesima rasta, diferencijacije i preživljavanja ćelije komuniciraju unutar ćelije) i antiproliferativnih agenasa, čije količine su zajedno efikasne u tretiranje navedenog abnormalnog rasta ćelija.

[0096] Sredstva protiv angiogeneze, kao što su inhibitori MMP-2 (matriks-metaloprotienaze 2), inhibitori MMP-9 (matriks-metaloprotienaze 9) i inhibitori COX-II (ciklooksigenaze II), mogu se koristiti zajedno sa jedinjenjem opisanim ovde u postupcima i farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde.

[0097] Inhibitori tirozin kinaze se takođe mogu kombinovati sa ovde opisanim jedinjenjem.

[0098] VEGF inhibitori, na primer, sutent i aksitinib, takođe se mogu kombinovati sa ovde opisanim jedinjenjem.

[0099] Inhibitori ErbB2 receptora se mogu davati u kombinaciji sa ovde opisanim jedinjenjem. Takođe se pokazalo da različita druga jedinjenja, kao što su derivati stirena, poseduju inhibitorna svojstva tirozin kinaze, a neki od inhibitora tirozin kinaze su identifikovani kao inhibitori erbB2 receptora.

[0100] Inhibitori receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) mogu se davati u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0101] PI3K inhibitori, kao što su PI3K alfa ili PI3K beta inhibitori, mogu se davati u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0102] Ciljni inhibitori rapamicina (mTOR) kod sisara mogu se davati u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

1

[0103] c-Met inhibitori se mogu primeniti u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0104] CDK inhibitori se mogu davati u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0105] MEK inhibitori se mogu davati u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0106] PARP inhibitori se mogu davati u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0107] JAK inhibitori se mogu davati u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0108] Antagonist proteina programirane smrti 1 (PD-1) se može primeniti u kombinaciji sa jedinjenjem iz ovog pronalaska.

[0109] Antagonist programiranog liganda smrti 1 (PD-L1) se može primeniti u kombinaciji sa jedinjenjem ovog pronalaska.

[0110] Druga antiproliferativna sredstva koja se mogu koristiti sa jedinjenjima koja su ovde opisana uključuju inhibitore enzima farnezil protein transferaze i inhibitore receptorske tirozin kinaze PDGFr.

[0111] Ovde opisano jedinjenje se takođe može koristiti sa drugim agensima korisnim u lečenju abnormalnog rasta ćelija ili kancera, uključujući, ali ne ograničavajući se na, agense sposobne da pojačaju antitumorski imuni odgovor, kao što su CTLA4 (citotoksični limfocitni antigen 4) antitela, i druga sredstva koja mogu blokirati CTLA4; i antiproliferativna sredstva kao što su drugi inhibitori farnezil protein transferaze, na primer farnezil protein transferaza.

[0112] Ovde opisano jedinjenje može se primeniti kao jedina terapija ili može uključivati jednu ili više drugih antitumorskih supstanci, na primer one odabrane između, na primer, mitotičkih inhibitora, agenasa za alkilovanje, antimetabolita, inhibitora faktora rasta, inhibitora ćelijskog ciklusa, interkalirajućih antibiotika, enzima i anti-hormona.

[0113] Ovde opisana jedinjenja mogu da se koriste sama ili u kombinaciji sa jednim ili više različitih agenasa protiv kancera ili sredstava za podršku. Na primer, ovde opisana jedinjenja mogu se koristiti sa citotoksičnim agensima. Neki primeri izvođenja takođe razmatraju upotrebu ovde opisanih jedinjenja zajedno sa hormonskom terapijom. Dalje, neke realizacije obezbeđuju jedinjenje koje je ovde opisano samo ili u kombinaciji sa jednim ili više proizvoda za podršku, na primer, proizvod izabran iz grupe koju čine Filgrastim (Neupogen), ondansetron (Zofran), Fragmin, Procrit, Aloki, Emend ili njihove kombinacije. Takav zajednički tretman se može postići simultanim, uzastopnim ili odvojenim doziranjem pojedinačnih komponenti tretmana.

[0114] Ovde opisana jedinjenja mogu da se koriste sa antitumorskim agensima, agensima za alkilaciju, antimetabolitima, antibioticima, antitumornim agensima biljnog porekla, derivatima kamptotecina, inhibitorima tirozin kinaze, antitelima, interferonima i/ili modifikatorima biološkog odgovora. S tim u vezi, sledeća je neograničavajuća lista primera

1

sekundarnih agenasa koji se mogu koristiti sa jedinjenjima koja su ovde opisana.

[0115] Neki primeri izvođenja se takođe odnose na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, kao što je ovde ranije definisano u vezi sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, razblaživačem ili nosačem.

[0116] Dalji primeri izvođenja se odnose na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži mešanje jedinjenja pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata, kao što je ranije definisano sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, razblaživačem ili nosačem.

[0117] Za prethodno pomenute terapeutske upotrebe primenjena doza će, naravno, varirati u zavisnosti od upotrebljenog jedinjenja, načina primene, željenog tretmana i indikovanog poremećaja. Dnevna doza jedinjenja pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, može biti u opsegu od 1 mg do 1 grama; od 1 mg do 250 mg; od 1 mg do 100 mg; od 1 mg do 50 mg; od 1 mg do 25 mg; i od 1 mg do 10 mg.

[0118] Ovi primeri izvođenja takođe obuhvataju kompozicije sa produženim oslobađanjem.

[0119] Na primenu ovde opisanih jedinjenja (u ovom tekstu posle "aktivnog (aktivnih) jedinjenja") može uticati bilo koji postupak koji omogućava isporuku jedinjenja do mesta delovanja. Ovi postupci uključuju oralne puteve, intraduodenalne puteve, parenteralnu injekciju (uključujući intravensku, subkutanu, intramuskularnu, intravaskularnu ili infuziju), topikalnu i rektalnu primenu.

[0120] Aktivno jedinjenje se može primeniti kao jedina terapija ili može uključivati jednu ili više drugih antitumorskih supstanci, na primer onih odabranih između, na primer, mitotičkih inhibitora, na primer vinblastina; alkilujućih agenasa, na primer cis-platin, karboplatin i ciklofosfamid; antimetabolitae, na primer 5-fluorouracil, citozin arabinozid i hidroksiurea, ili, na primer, jedan od poželjnih anti-metabolita otkrivenih u European Patent Application No.

239362 kao takav N-(5-[N-(3.4-dihidro-2-metil-4-oksohinazolin-6-ilmetil)-N-metilamino]-2-tenoil)-L-glutaminska kiselina; inhibitori faktora rasta; inhibitori ćelijskog ciklusa; interkalacioni antibiotici, na primer adriamicin i bleomicin; enzimi, na primer interferon; i anti-hormoni, na primer anti-estrogeni kao što je Nolvadex<®>(tamoksifen) ili, na primer, antiandrogeni kao što je Casodex<®>(4'-cijano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidroksi-2-metil-3'-(trifluorometil)propionanilid). Takav zajednički tretman se može postići simultanim, uzastopnim ili odvojenim doziranjem pojedinačnih komponenti tretmana.

[0121] Farmaceutska kompozicija može, na primer, biti u obliku pogodnom za oralnu primenu kao tableta, kapsula, pilula, praška, formulacije sa produženim oslobađanjem, rastvora, suspenzije, za parenteralnu injekciju kao sterilni rastvor, suspenzija ili emulzija, za lokalnu primenu kao mast ili krema ili za rektalnu primenu kao supozitorije. Farmaceutska

1

kompozicija može biti u jediničnim doznim oblicima pogodnim za jednokratnu primenu preciznih doza. Farmaceutska kompozicija će uključivati konvencionalni farmaceutski nosač ili ekscipijent i jedinjenje koje je ovde opisano kao aktivni sastojak. Pored toga, može uključivati i druge medicinske ili farmaceutske agense, nosače, adjuvanse, itd.

[0122] Primeri oblika parenteralne primene obuhvataju rastvore ili suspenzije aktivnih jedinjenja u sterilnim vodenim rastvorima, na primer, vodene rastvore propilen glikola ili dekstroze. Takvi dozni oblici mogu biti na odgovarajući način puferovani, ako se želi.

[0123] Pogodni farmaceutski nosači uključuju inertne razblaživače ili punila, vodu i različite organske rastvarače. Farmaceutske kompozicije mogu, po želji, da sadrže dodatne sastojke kao što su arome, veziva, ekscipijenti i slično. Tako za oralnu primenu, tablete koje sadrže različite ekscipijente, kao što je limunska kiselina, mogu se koristiti zajedno sa raznim dezintegrantima kao što su skrob, alginska kiselina i određeni kompleksni silikati i sa vezivnim agensima kao što su saharoza, želatin i akacija. Pored toga, sredstva za podmazivanje kao što su magnezijum stearat, natrijum lauril sulfat i talk su često korisni za tabletiranje. Čvrste kompozicije sličnog tipa se takođe mogu koristiti u mekim i tvrdim punjenim želatinskim kapsulama. Poželjni materijali, stoga, uključuju laktozu ili mlečni šećer i polietilen glikole visoke molekularne težine. Kada su vodene suspenzije ili eliksiri poželjni za oralnu primenu, aktivno jedinjenje u njima se može kombinovati sa različitim zaslađivačima ili aromama, sredstvima za bojenje ili bojama i, ako je poželjno, emulgatorima ili suspendujućim agensima, zajedno sa razblaživačima kao što su voda, etanol, propilen glikol, glicerin, ili njihove kombinacije.

[0124] Primeri i preparati dati u nastavku dalje ilustruju i daju primere jedinjenja koja su ovde opisana i postupke za dobijanje takvih jedinjenja. Obim ovde opisanih primera izvođenja nije ni na koji način ograničen sledećim primerima i pripremama. U sledećim primerima, molekuli sa jednim hiralnim centrom, osim ako nije drugačije naznačeno, postoje kao racemska smeša. Oni molekuli sa dva ili više hiralnih centara, osim ako nije drugačije naznačeno, postoje kao racemska smeša dijastereomera. Pojedinačni enantiomeri/dijastereomeri se mogu dobiti postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.

[0125] U prikazanim primerima, oblici soli su povremeno izolovani kao posledica aditiva mobilne faze tokom HPLC hromatografskog prečišćavanja. U ovim slučajevima, soli kao što su format, trifluoroacetat i acetat su izolovane i testirane bez dalje obrade. Smatra se da će stručnjak u ovoj oblasti moći da realizuje oblik slobodne baze standardnom metodologijom (kao što je korišćenje jonoizmenjivačkih kolona, ili izvođenje jednostavnih osnovnih ekstrakcija korišćenjem blage vodene baze).

2

[0126] Uopšteno, jedinjenja koja su ovde opisana mogu biti pripremljena postupcima poznatim u hemijskoj struci, posebno u svetlu ovde sadržanog opisa. Određeni procesi za proizvodnju jedinjenja opisanih ovde su dati kao dalje karakteristike primera izvođenja i ilustrovani su reakcionim šemama datim u nastavku i u eksperimentalnom delu.

PRIMERI

[0127] Sledeći primeri i referentni primeri ilustruju ovaj pronalazak.

Opšti eksperimentalni detalji

[0128] Osim ako nije drugačije navedeno, važe sledeće generalizacije.<1>H NMR spektri su snimljeni na Bruker Ultrashield Plus (400 MHz) ili Bruker AVANCE III (400 MHz). Multiplicitet signala je označena sledećim skraćenicama: s, singlet; d, dublet; t, triplet; k, kvartet; p, pentet; sept, septet; dd, dublet dubleta; dt, dublet tripleta; tt, triplet tripleta; br, širok; m, multiplet. Sve uočene konstante kuplovanja, J, prikazane su u hercima (Hz). Protoni koji se mogu zameniti se ne primećuju uvek. LCMS podaci su generisani koristeći ili Agilent 6100 Series Single Quad, Agilent 1260 Infinity Series UPLC/MS, Agilent 1200 (LCMS-A), Waters 2695 Alliance, Agilent 6120 Single Quad ili maseno usmereni HPLC-MS. Izotopi hlora su prijavljeni kao<35>Cl, izotopi broma su prijavljeni kao bilo koji<79>Br ili<81>Br ili oba<79>Br/<81>Br.

Reprezentativna LCMS metodologija je data u nastavku:

[0129]

Instrument: Agilent serija 6100 Single Quad LC/MS, Agilent serija 1200 HPLC, Pumpa: Kvaternarna pumpa serije 1200 G1311A, Autosampler: Termostatski autosampler serije 1200 G1329A, Detektor: 1200 Series G1314B Variable Wavelength Detector

LC uslovi: HPLC analiza reverzne faze, Kolona: Luna C8 (2) 5 µm 50 × 4.6 mm 100 A, Temperatura kolone: 30 °C, Zapremina ubrizgavanja: 5 µL, Rastvarač A: Voda 0.1 % Mravlja kiselina, Rastvarač B: MeCN 0.1 % mravlja kiselina, gradijent: 5-100 % rastvarač B tokom 10 min, detekcija: 254 nm ili 214 nm

Uslovi MS: Izvor jona: Quadrupole, Jonski režim: Multimode-ES, Temperatura gasa za sušenje: 300 °C, Temperatura isparivača: 200 °C, Napon kapilare (V): 2000 (pozitivan), Kapilarski napon (V): 4000 (negativan ), Opseg skeniranja: 100-1000, Veličina koraka: 0.1 sek, Vreme preuzimanja: 10 min

LCMS metoda A (LCMS-A): LC model: Agilent 1200, Tip pumpe: Binarna pumpa, Tip detektora: DAD, MS model: Agilent G6110A Quadrupole, LC uslovi: Kolona: Xbridge-C18, 2.5 µm, 2.1×30 mm, Temperatura kolone: 30 °C, Akvizicija talasne dužine: 214 nm, 254 nm, Mobilna faza: A: 0.07% HCOOH vodeni rastvor, B: MeOH; MS uslovi: MS: Izvor jona: ES+ (ili ES-) MS opseg: 50 - 900 m/z, Fragmentor: 60, Protok gasa za sušenje: 10 L/min, Pritisak nebulizatora: 35 psi Temperatura gasa za sušenje: 350 °C, Vcap: 3.5 kV

Tabela gradijenta:

Priprema uzorka:

[0130] Uzorak je rastvoren u metanolu, koncentracija oko 0.11 - 1 mg/mL, zatim filtriran kroz špric filter sa 0.22 µm. (Zapremina injekcije: 1 - 10µL)

Opšti postupci:

[0131] Osim ako nije drugačije navedeno, promenljive na Šemama I-VI imaju ista značenja koja su ovde definisana.

[0132] Kao što je prikazano na Šemi I, jedinjenje tipa I može se tretirati jedinjenjem tipa II u prisustvu efikasne baze (kao što je Cs2CO3) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je MeCN) da bi se dobilo jedinjenje tipa III. Jedinjenje tipa III može se pretvoriti u jedinjenje tipa IV tretmanom sa N-hidroksiacetamidom u prisustvu efikasne baze (kao što je K2CO3ili 1,1,3,3-tetrametilguanidin) u odgovarajućoj smeši rastvarača (kao što je DMF/H2O). Jedinjenje tipa IV može se tretirati jedinjenjem tipa V u prisustvu efikasne baze (kao što je piridin, NaH ili NaOtPn), čiste ili u odgovarajućem rastvaraču (kao što je THF ili DMF) da bi se dobilo jedinjenje Formule (A). U nekim slučajevima, jedinjenja tipa II, III, i IV, ili Formule (A) može sadržati zaštitne grupe, koje se mogu dodati ili ukloniti dodatnim koracima u sintetičkoj sekvenci koristeći uslove poznate u struci (Protective Groups in Organic Synthesis, A. Wiley-Interscience Publication, 1981 or Protecting Groups, 10 Georg Thieme Verlag, 1994). Jedinjenja u svakom koraku mogu biti prečišćena standardnim tehnikama, kao što su hromatografija na koloni, kristalizacija ili SFC ili HPLC reverzne faze. Promenljive R<2a>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<7>, i R<8>su kao što su ovde definisane u primerima izvođenja, šemama, primerima i patentnim zahtevima.

2

[0133] Kao što je prikazano na Šemi II, jedinjenje tipa VI može biti deuterisan tretmanom sa efikasnom bazom (kao što je Cs2CO3) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je CDsOD) da bi se dobilo jedinjenje tipa VII. Jedinjenje tipa VII može se pretvoriti u jedinjenje tipa VIII tretmanom sa N-hidroksiacetamidom u prisustvu efikasne baze (kao što je 1,1,3,3-tetrametilguanidin) u odgovarajućoj smeši rastvarača (kao što je MeCN/D2O). Jedinjenje tipa VIII može se tretirati jedinjenjem tipa V u prisustvu efikasne baze (kao što je piridin), čist, da bi se dobilo jedinjenje Formule (B). Jedinjenja u svakom koraku mogu biti prečišćena standardnim tehnikama, kao što su hromatografija na koloni, kristalizacija ili SFC ili HPLC reverzne faze. Promenljive R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, i R<7>su kao što su ovde definisane u primerima izvođenja, šemama, primerima i patentnim zahtevima.

[0134] Kao što je prikazano na Šemi III, jedinjenje tipa IX može se pretvoriti u jedinjenje tipa X tretmanom sa 1-(metansulfonil)-1H-pirazooml u prisustvu efikasne baze (kao što je Cs2CO3) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je MeCN). Jedinjenje tipa X može se tretirati jedinjenjem tipa V u prisustvu efikasne baze (kao što je piridin), čist, da bi se dobilo jedinjenje Formule (C). Jedinjenja u svakom koraku mogu biti prečišćena standardnim tehnikama, kao što su hromatografija na koloni, kristalizacija ili SFC ili HPLC reverzne faze. Promenljive R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, i R<7>su kao što su ovde definisane u primerima izvođenja, šemama, primerima i patentnim zahtevima.

2

[0135] Kao što je prikazano na Šemi IV, jedinjenje tipa XI, sa odgovarajućom odlazećom grupom (kao što je -Br ili -SO2CH3) može se pretvoriti u jedinjenje tipa VI tretmanom sa 1H-pirazolom u prisustvu efikasne baze (kao što je Cs2CO3) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je MeCN). Jedinjenje tipa VI može se pretvoriti u jedinjenje tipa X tretmanom sa N-hidroksiacetamidom u prisustvu efikasne baze (kao što je 1,1,3,3-tetrametilguanidin) u odgovarajućoj smeši rastvarača (kao što je DMF/H2O). Jedinjenje tipa X može se tretirati jedinjenjem tipa V u prisustvu odgovarajuće baze (kao što je piridin), čist, da bi se dobilo jedinjenje Formule (C). Jedinjenja u svakom koraku mogu biti prečišćena standardnim tehnikama, kao što su hromatografija na koloni, kristalizacija ili SFC ili HPLC reverzne faze. Promenljive R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, i R<7>su kao što su ovde definisane u primerima izvođenja, šemama, primerima i patentnim zahtevima.

2

[0136] Kao što je prikazano na Šemi V, jedinjenje tipa XII može se pretvoriti u jedinjenje tipa XIII tretmanom sa odgovarajuće opciono zamenjenim 1H-pirazolom u prisustvu efikasne baze (kao što je Cs2CO3) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je MeCN). Jedinjenje tipa XIII može se pretvoriti u jedinjenje tipa XIV pod Suzuki uslovima unakrsnog kuplovanja u prisustvu efikasnog katalizatora (kao što je metansulfonato(tri-tbutilfosfino)(2"amino-1,1-bifenil-2-il)paladijum(II)) u odgovarajućoj smeši rastvarača ( kao što je PhMe/H2O). Jedinjenje tipa XIV može se pretvoriti u jedinjenje tipa XV tretmanom sa N-hidroksiacetamidom u prisustvu efikasne baze (kao što je 1,1,3,3-tetrametilguanidin) u odgovarajućoj smeši rastvarača (kao što je DMF/H2O). Jedinjenje tipa XV može se tretirati jedinjenjem tipa V u prisustvu odgovarajuće baze (kao što je piridin), čist, da bi se dobilo jedinjenje Formule (D). Jedinjenja u svakom koraku mogu biti prečišćena standardnim tehnikama, kao što su hromatografija na koloni, kristalizacija ili SFC ili HPLC reverzne faze.

2

Promenljive R<2a>, R<4>, R<5>, R<6>, i R<7>su kao što su ovde definisane u primerima izvođenja, šemama, primerima i patentnim zahtevima.

[0137] Kao što je prikazano na Šemi VI, jedinjenje tipa XVI može se pretvoriti u jedinjenje tipa XVII tretmanom sa (3,5-dimetoksifenil)metanolom pod Mitsunobu uslovima (PPhs, DIAD) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je 2-Me-THF). Jedinjenje tipa XVII može se pretvoriti u jedinjenje tipa XVIII pod Suzuki uslovima unakrsnog kuplovanja u prisustvu efektivne kombinacije katalizatora/liganda (kao što je Pd(OAc)2/X-Phos) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je CPME/H2O). Jedinjenje tipa XVII može se pretvoriti u jedinjenje Formule (C) tretmanom sa efikasnom kiselinom (kao što je TFA) u odgovarajućem rastvaraču (kao što je DCM). Jedinjenja u svakom koraku mogu biti prečišćena standardnim tehnikama, kao što su hromatografija na koloni, kristalizacija ili SFC ili HPLC reverzne faze. Promenljive R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, i R<7>su kao što su ovde definisane u primerima izvođenja, šemama, primerima i patentnim zahtevima.

Sinteza intermedijara:

Priprema 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01) prema Šemi 1.

2

Korak 1: Sinteza 4-bromo-2-fluoro-6-metoksibenzonitrila (1b).

[0139] U rastvor 4-bromo-2,6-difluorobenzonitrila (1a) (40.0 g, 183.5 mmol) u THF (210.0 mL) i MeOH (30.0 mL) je dodat NaOMe (11.9 g, 220 mmol) u porcijama na 0 °C. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. TLC analiza (1:4 EtOAc/petroleum etar) pokazala je potrošnju polaznog materijala. Smeša je prebačena u levak za odvajanje i isprana sa H2O (150 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (300 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom (330 g SiO2, 10% EtOAc/petroleum etar) da bi se dobio 4-bromo-2-fluoro-6-metoksibenzonitril (1b) (15.7 g, 52% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.49 (dd, J=1.5, 8.8 Hz, IH), 7.41 (s, IH), 3.98 (s, 3H).

Korak 2: Sinteza metil 4-cijano-3-fluoro-5-metoksibenzoata (1c).

[0140] Rastvor 4-bromo-2-fluoro-6-metoksibenzonitrila (1b) (15.7 g, 68.2 mmol), TEA (20.7 g, 205 mmol), dppp (2.8 g, 6.8 mmol) i Pd(OAc)2(766 mg, 3.4 mmol) u MeOH (150 mL) je mešan na 80 °C u atmosferi CO tokom 16 h. TLC analiza (1:4 EtOAc/petroleum etar) pokazala je potrošnju polaznog materijala. Reakcija je koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (120 g SiO2, 1:4 EtOAc/petrol etar) da bi se dobio metil 4-cijano-3-fluoro-5-metoksibenzoat (1c) (10.0 g, 70% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 57.53 - 7.47 (m, 2H), 4.03 (s, 3H), 3.91 (s, 3H).

Korak 3: Sinteza 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01).

2

[0141] U rastvor metil 4-cijano-3-fluoro-5-metoksibenzoata (1c) (9.5 g, 45.4 mmol) u THF (50 mL) je dodat LiBH4(2.0 g, 90.8 mmol) u porcijama na 0 °C. Smeša je mešana na 70 °C tokom 2 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala sa formiranjem željene mase proizvoda. Reakcija je ugašena sporim dodavanjem H2O (100 mL). Smeša je prebačena u levak za odvajanje i ekstrahovana sa EtOAc (2x150 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom i zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, osušeni preko Na2SO4, filtrirai i koncentrovani da bi se dobio 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitril (Int-01) (7.9 g, 96% prinos) kao smeđe ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 57.05 (s, IH), 6.98 (d, J=10.0 Hz, 1H), 4.58 (d, J=5.7 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H).

[0142] Intermedijari u tabeli ispod su pripremljeni prema postupcima koji se koriste za sintezu 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01). Sledeći intermedijeri su sintetizovani sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 1:

Alternativno pripremanje 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01) prema Šemi 2.

[0143]

Korak 1: Sinteza 2,6-difluoro-4-(hidroksimetil)benzonitrila (2b).

[0144] Rastvor 2,6-difluoro-4-formilbenzonitrila (2a) (21.5 g, 129 mmol) u apsolutnom EtOH (400 mL) je ohlađen u kupatilu sa ledom i vodom do ~3 °C (unutrašnje). Dodat je čvrsti NaBH4(5×1 g peleta, 5.0 g, 130 mmol), uzrokujući blago razvijanje gasa. Smeša je mešana uz hlađenje u kupatilu led-voda tokom 2 h, a zatim ugašena na istoj temperaturi dodavanjem u kapima dejonizovane H2O (100 mL tokom 5 min). Polako je dodavan vodeni rastvor HCl (2.0 N, 50 mL tokom 30 min), održavajući temperaturu <10 °C (unutrašnja). Rastvor je koncentrovan pod vakuumom da bi se uklonio EtOH. Vodeni ostatak je prebačen u levak za odvajanje, ostavljajući za sobom gumenu belu čvrstu supstancu. Vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc (2x). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (2x), osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani. Sirovi materijal je trituriran sa heptanom, filtriran i osušen pod vakuumom da bi se dobio 2,6-difluoro-4-(hidroksimetil)benzonitril (2b) (21.3 g, 98%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz,

1

DMSO-d6) δ 7.34 (d, J=9.3 Hz, 2H), 5.69 (br. s, IH), 4.60 (br. s, 2H).

Korak 2: Sinteza 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01).

[0145] Rastvor 2,6-difluoro-4-(hidroksimetil)benzonitrila (2b) (21.3 g, 126 mmol) u anhidrovanom MeOH (400 mL) je ohlađen na -40 °C (unutrašnji) sa suvim ledom/acetonitril kupatilom. Rastvor NaOMe (5.0 M u MeOH, 100 mL, 500 mmol) je dodat tokom perioda od 10 min dodavanjem kapajućeg levka. Nakon što je dodavanje završeno, kupatilo za hlađenje je uklonjeno. Smeša je ostavljena da se prirodno zagreje do sobne temperature i mešana je još 8 h. Reakciona smeša je ohlađena na 0 °C (unutrašnje) i HCl (2.0 N, 200 mL) je dodata u kapima da bi se dobio rastvor sa pH ~5-6. Smeša je koncentrovana pod vakuumom da bi se uklonio MeOH. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc (3k). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (2k), osušeni preko MgSO4, i filtriran. Smeša je koncentrovana do ~150 mL na rotacionom isparivaču (temperatura kupatila ~35 °C) i dobijena suspenzija je ostavljena da se ohladi do sobne temperature. Čvrste materije su sakupljene filtracijom. Filter kolač je ispran heptanom (2k). Filtrat i ispiranje heptana su dalje koncentrovani da bi se dobio drugi usev čvrstih supstanci, koje su sakupljene filtracijom. Kombinovane čvrste supstance su osušene pod vakuumom da bi se dobio 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitril (Int-01) (18.6 g, 82%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.82 (s, IH), 6.79 (d, J=9.2 Hz, IH), 4.76 (s, 2H), 3.97 (s, 3H).

[0146] Intermedijer u tabeli ispod je pripremljen prema metodama koje se koriste za sintezu 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01). Sledeći intermedijer je sintetizovan sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 2:

2

Priprema 2-fluoro-4-(hidroksimetil)benzonitrila (Int-06) prema Šemi 3.

[0147]

[0148] Rastvor (5.0 g, 33.5 mmol) 2-fluoro-4-formilbenzonitrila (3a) u EtOH (100 mL) je ohlađen na 0°C. NaBH4(1.3 g, 33 mmol) je dodat i reakcija je mešana na 0°C tokom 2 h. Smeša je ugašena dodavanjem H2O (25 mL tokom 5 min). Dodata je razblažena HCl (2 N, 13 mL), održavajući unutrašnju temperaturu <10 °C. Rastvor je koncentrovan pod vakuumom da bi se uklonio EtOH. Vodena smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2x). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je trituriran sa heptanom i osušen da bi se dobio 2-fluoro-4-(hidroksimetil)benzonitril (Int-06) (4.2 g, 82% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.87 (dd, J=7.9, 6.8 Hz, 1H), 7.42 (dd, J=10.6, 1.3 Hz, 1H), 7.35 (dd, J=8.0, 1.3 Hz, 1H), 5.55 (t, J=5.7 Hz, 1H), 4.60 (d, J=5.7 Hz, 2H).

Priprema 5-bromo-4-(bromometil)-2-fluorobenzonitrila (Int-07) prema Šemi 4.

[0149]

[0150] U rastvor 5-bromo-2-fluoro-4-metilbenzonitrila (4a) (1.01 g, 4.72 mmol) u MeCN (10.0 mL) dodat je 1,3-dibromo-5,5-dimetilimidazolidin-2,4-dion (701 mg, 2.45 mmol) i AIBN (101 mg, 0.613 mmol). Smeša je mešana na 80 °C preko noći i zatim koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (80 g SiO2, 0-30% EtOAc/heptan) da se obezbedi (Int-07) (847 mg, 84% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84 (d, J=6.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J=8.9 Hz, IH), 4.54 (s, 2H).

[0151] Intermedijer u tabeli ispod je pripremljen prema postupcima koji se koriste za sintezu 5-bromo-4-(bromometil)-2-fluorobenzonitrila (Int-07). Sledeći intermedijer je sintetizovan sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 3:

Priprema (4-cijano-2,5-difluorofenil)metil metansulfonata (Int-09) prema Šemi 5.

[0152]

4

Korak 1: Sinteza 2,5-difluoro-4-(hidroksimetil)benzonitrila (5b)

[0153] Rastvor 2,5-difluoro-4-formilbenzonitrila (5a) (250 mg, 1.5 mmol) u EtOH (5.0 mL) je ohlađen na 0°C u ledenom kupatilu, a zatim je dodat NaBH4(60 mg, 1.6 mmol). Smeša je mešana 30 min na 0°C. Reakcija je ugašena na istoj temperaturi dodavanjem H2O (0.5 mL) i HCl (6.0 N, 0.32 mL). Smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 i slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan da bi se dobio 2,5-difluoro-4-(hidroksimetil)benzonitril (5b) (202 mg, 80% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.44 (dd, J=5.62, 8.80 Hz, 1H), 7.30 (dd, J=4.89, 8.56 Hz, IH), 4.85 (s, 2H).

Korak 2: Sinteza (4-cijano-2,5-difluorofenil)metil metansulfonata (Int-09)

[0154] Rastvor 2,5-difluoro-4-(hidroksimetil)benzonitrila (5b) (915 mg, 5.41 mmol) u DCM (25.0 mL) je ohlađen na 0 °C i zatim su dodati TEA (871 mg, 5.84 mmol) i MsCI (649 g, 5.66 mmol). Posle 2 h, reakcija je stavljena direktno na SiO2i prečišćena fleš hromatografijom (40 g SiO2, 0-75% EtOAc/heptan) da bi se obezbedio (4-cijano-2,5-difluorofenil)metil metansulfonat (Int-09) (1.15 g, 86% prinos) kao bistro ulje, koje je očvrslo stajanjem.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) 57.44 - 7.39 (m, 2H), 5.34 - 5.32 (m, 2H), 3.14 (s, 3H).

[0155] Intermedijer u tabeli ispod je pripremljen prema postupcima koji se koriste za sintezu (4-cijano-2,5-difluorofenil)metil metansulfonata (Int-09). Sledeći međuproizvod je sintetizovan sa nekritičnim izmenama ili zamenama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 4:

Priprema 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-5-metilbenzonitrila (Int-11) prema Šemi 6.

[0156]

Korak 1: Sinteza metil 4-cijano-5-fluoro-2-metilbenzoata (6b)

[0157] U rastvor 4-bromo-2-fluoro-5-metilbenzonitrila (6a) (1.0 g, 4.67 mmol) i TEA (1.7 g, 17 mmol) u MeOH (30.0 mL) u posudi od 100 mL od nerđajućeg čelika dodat je PdCl2(dppf) (247 mg, 0.327 mmol). Posuda je pod pritiskom sa CO do 4 bara i mešana na 55 °C tokom 20 h. Reakcija je filtrirana i koncentrovana. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 0-55% EtOAc/heptan) da bi se dobio metil 4-cijano-5-fluoro-2-metilbenzoat (6b) (716 mg, 79% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.74 (d, J=9.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J=6.1 Hz, IH), 3.95 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).

Korak 2: Sinteza 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-5-metilbenzonitrila (Int-11)

[0158] U rastvor metil 4-cijano-5-fluoro-2-metilbenzoata (6b) (710 mg, 3.68 mmol) u THF (18.4 mL) je dodat LiBH4(120 mg, 5.51 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je ugašena sa H2O (3 mL). Smeša je mešana 30 min, a zatim ohlađena u ledenom kupatilu. Smeša je pažljivo ugašena sa HCl (6.0 N, 0.60 mL). THF je uklonjen pod vakuumom, a ostatak je podeljen između EtOAc i 1:1 H2O/zasićeni vodeni NaHCO3. Organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (24 g SiO2, 0-80% EtOAc/heptan) da bi se dobio 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-5-metilbenzonitril (Int-11) (495 mg, 82% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.44 - 7.35 (m, 2H), 4.74 (d, J=5.5 Hz, 2H), 2.26 (s, 3H), 1.84 (t, J=5.5 Hz, 1H);<19>F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -110.29 (dd, J=5.7, 10.3 Hz).

Priprema (3-amino-5-fluoro-4-metoksi-1,2-benzoksazol-6-il)metanola (Int-12) prema Šemi 7.

[0159]

Korak 1: Sinteza (2.3,5-trifluorofenil)metanola (7b)

[0160] U rastvor 2.3,5-trifluorobenzaldehida (7a) (1.8 g, 11 mmol) u THF (30 mL) je dodat NaBH4 (468 mg, 12.4 mmol) u porcijama na 0 °C. Smeša je mešana na 0 °C tokom 2 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala. Reakcija je ugašena sporim dodavanjem H2O (10 mL) i koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 0-50% EtOAc/heptan) da bi se obezbedio (2.3,5-trifluorofenil)metanol (7b) (740 mg, 41% prinos) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.10 - 6.96 (m, 1H), 6.94 - 6.78 (m, 1H), 4.81 (d, J=5.9 Hz, 2H), 1.91 (t, J=6.1 Hz, IH).

Korak 2: Sinteza terc-butil(dimetil)[(2.3,5-trifluorofenil)metoksi]silana (7c)

[0161] U rastvor (2.3,5-trifluorofenil)metanola (7b) (740 mg, 4.56 mmol) u DCM (20 mL) dodat je DMAP (27.9 mg, 0.228 mmol), TEA (639 mg, 6.85 mmol) i rastvor TBSCI (894 mg, 5.93 mmol) u DCM (5 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. LCMS je pokazao potrošnju polaznog materijala. Smeša je koncentrovana do sušenja, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 0-10% EtOAc/petroleum etra) da obezbedi tercbutil(dimetil)[(2.3,5-trifluorofenil)metoksi]silan (7c) (1.1 g, prinos 87%) kao bezbojno ulje.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) 57.06 - 6.95 (m, IH), 6.87 - 6.70 (m, 1H), 4.79 (s, 2H), 0.95 (s, 9H), 0.13 (s, 6H).

Korak 3: Sinteza 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-2.3,6-trifluorobenzonitrila (7d)

[0162] Rastvor LDA (0.07 M u THF, 20.0 mL, 1.41 mmol) u THF (20 mL) je ohlađen na -70 °C i zatim tretiran u kapima sa rastvorom terc-butil(dimetil)[(2.3,5-trifluorofenil)metoksi]silanom (7c) (300 mg, 1.09) u THF (5 mL) tokom 5 min. Smeša je mešana 2 h na -70 °C i zatim tretirana u kapima sa rastvorom p-tolilsulfonil cijanida (216 mg, 1.19 mmol) u THF (5 mL) tokom 10 min. Smeša je mešana na -70 °C 1 h. Smeša je ugašena dodavanjem zasićenog vodenog rastvora NH4Cl i podeljena između EtOAc (60 mL) i H2O (60 mL). Organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (SiO2, 3:1 - 10:1 EtOAc/petroleum etar). Kombinovane frakcije koje sadrže proizvod su ponovo prečišćene preparativnom HPLC sa Agela DuraShell C18 kolonom (150k25 mm, veličina čestica 5 µm), koja je eluirana sa 70-100% MeCN/H2O (+0.04% NH4OH, 10 mM NH4HCO3) sa brzinom protoka od 25 mL/min da bi se obezbedio 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-2.3,6-trifluorobenzonitril (7d) (150 mg, 46% prinos) kao žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) 5 7.10 - 7.02 (m, 1H), 4.69 (s, 2H), 0.81 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).

Korak 4: Sinteza 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-3,6-difluoro-2-metoksibenzonitrila (7e)

[0163] Rastvoru 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-2.3,6-trifluorobenzonitril (7d) (150 mg, 0.498 mmol) u THF (20 mL) je dodat NaOMe (71.7 mg, 0.398 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na 0 °C tokom 1 h. Smeša je ugašena sa H2O i podeljena između EtOAc i H2O. Organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan da bi se dobio sirovi 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-3,6-difluoro-2-metoksibenzonitril (7e) (150 mg, 96% prinos) kao žuto ulje, koje je uzeto bez daljeg prečišćavanja.

Korak 5: Sinteza (3-amino-5-fluoro-4-metoksi-1,2-benzoksazol-6-il)metanola (Int-12)

[0164] Rastvoru sirovog 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-3,6-difluoro-2-metoksibenzonitrila (7e) (150 mg, 0.479 mmol) i N-hidroksiacetamida (108 mg, 1.33 mmol) u DMF (10 mL) i H2O (2 mL) je dodat K2CO3(397 mg, 2.87 mmol). Smeša je mešana na 60 °C tokom 16 h. Smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan do sušenja. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC sa Agela DuraShell C18 kolonom (150x25 mm, veličina čestica 5 µm), koja je eluirana sa 5-35% MeCN/H2O H2O (+0.04% NH4OH, 10 mM NH4HCO3) sa brzinom protoka od 25 mL/min da bi se obezbedio (3-amino-5-fluoro-4-metoksi-1,2-benzoksazol-6-il)metanol (Int-12) (25 mg, 24% prinos u dva koraka) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.12 (d, J=4.3 Hz, 1H), 6.03 (s, 2H), 5.47 (t, J=5.8 Hz, 1H), 4.62 (d, J=5.6 Hz, 2H), 4.05 (s, 3H); m/z (ESI+) 213.1 (M+H)<+>.

Priprema 1-(metansulfonil)-1H-pirazol (Int-13) prema Šemi 8.

[0165]

[0166] Rastvoru 1H-pirazola (8a) (33.0 g, 485 mmol) i TEA (73.6 mg, 727 mmol) u DCM je polako dodat MsCI (73.9 g, 645 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na 0 °C 10 min, a zatim na sobnoj temperaturi 1 h. TLC analiza (1:1 EtOAc/petroleum etar) pokazala je potrošnju polaznog materijala. Reakcija je razblažena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (200 mL) i smeša je razdvojena. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (200 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (300 mL) i zasićenim vodenim rastvorom Na2CO3(300 mL), osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani da bi se dobio 1-(metansulfonil)-1H-pirazol (Int-13) (64 g, 90% prinos) kao bledožuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.04 (d, J=2.6 Hz, 1H), 7.86 - 7.79 (m, IH), 6.46 (dd, J=1.6, 2.7 Hz, IH), 3.33 (s, 3H).

[0167] Intermedijari u tabeli ispod su pripremljeni prema postupcima koji se koriste za sintezu 1-(metansulfonil)-1H-pirazoala (Int-13). Sledeći intermedijeri su sintetizovani sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje. Ako je naznačeno, regioizomerne smeše su izolovane bez daljeg odvajanja.

Tabela 5:

4

Priprema 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1-(metansulfonil)-1H-pirazola (Int-17) prema Šemi 9.

[0168]

Korak 1: Sinteza 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazola (9b).

[0169] Rastvoru (1H-pirazol-4-il)metanola (9a) (500 mg, 5.1 mmol) u DCM (10.0 mL) je dodat TBSCI (845 mg, 5.6 mmol), TEA (774 mg, 7.7 mmol) i DMAP (31.1 mg, 0.26 mmol). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 16 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala sa formiranjem željene mase proizvoda. Smeša je razblažena sa DCM (20 mL) i isprana uzastopno sa H2O (20 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(20 mL) i slanim rastvorom (20 mL). Organska faza je osušena preko Na2SO4, filtrirana i koncentrovana da bi se dobio 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol (9b) (1.0 g, 92% prinos), koji je uzet bez daljeg prečišćavanja. m/z (ESI+) 212.8 (M+H)<+>.

Korak 2: Sinteza 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1-(metansulfonil)-1H-pirazola (Int-17).

[0170] Rastvoru 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazola (9b) (1.0 g, 4.7 mmol) u DCM (15.0 mL) je dodat TEA (619 mg, 6.1 mmol). Smeša je ohlađena na 0 °C u kupatilu sa ledom i vodom. MsCI (3.8 g, 33.0 mmol) je dodat u kapima. Smeša je mešana 2 h na 0 °C i sobnoj temperaturi 16 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala sa formiranjem željene mase proizvoda. Smeša je razblažena sa DCM (100 mL) i isprana uzastopno sa H2O (50 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(50 mL) i slanim rastvorom (50 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan da bi se dobio 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1-(metansulfonil)-1H-pirazol (Int-17) (1.1 g, 80% prinos), koji je uzet bez daljeg prečišćavanja. m/z (ESI+) 291.1 (M+H)<+>.

[0171] Intermedijer u tabeli ispod je pripremljen prema postupcima korišćenim za sintezu 4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1-(metansulfonil)-1H-pirazola (Int-17). Sledeći intermedijer je sintetizovan sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje. Ako je naznačeno, regioizomerne smeše su izolovane bez daljeg odvajanja.

Tabela 6:

Priprema 2.4,6-trimetoksibenzen-1-sulfonil hlorida (Int-19) prema Šemi 10.

[0172]

[0173] Hlorosumporna kiselina (15.0 mL) je ohlađena na -10 °C i dodat je 1,3,5-trimetoksibenzen (10a) (1.4 g, 8.4 mmol) u jednoj porciji. Smeša je mešana na -10 °C 15 min. TLC analiza (1:1 EtOAc/petroleum etar) pokazala je potrošnju polaznog materijala. Reakcija je ugašena pažljivim prelivanjem preko ledene vode. Smeša je ekstrahovana sa DCM (3x100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(50 mL), osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (20 g SiO2, 0-50% EtOAc/petrol etar) da bi se dobio 2,4,6-trimetoksibenzen-1-sulfonil hlorid (Int-19) (1.8 g, 60% prinos) kao čvrsta supstanca, koja je uzeta bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) 86.12 (s, 2H), 3.96 (s, 6H), 3.89 (s, 3H).

[0174] Intermedijer u tabeli ispod je pripremljen prema postupcima koji se koriste za sintezu 2,4,6-trimetoksibenzen-1-sulfonil hlorida (Int-19). Sledeći intermedijer je sintetizovan sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 7:

4

Priprema 2-metoksi-5-(trifluorometoksi)benzen-1-sulfonil hlorida (Int-21) prema Šemi 11.

[0175]

[0176] Hlorsulfurna kiselina (26.0 mL) je ohlađena na 0 °C i 1-metoksi-4-(trifluorometoksi)benzen (11a) (2.0 g, 10.4 mmol) je dodat u jednoj porciji. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Reakcija je ugašena pažljivim prelivanjem preko ledene vode. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2k60 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani zasićenim vodenim rastvorom Na2CO3(50 mL), osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani da bi se dobio 2-metoksi-5-(trifluorometoksi)benzen-1-sulfonil hlorid (Int-21) (2.6 g, 86% prinos) kao žuto ulje, koje je uzeto bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 (d, J=2.8 Hz, 1H), 7.56 (dd, J=2.4, 9.1 Hz, 1H), 7.16 (d, J=9.2 Hz, IH), 4.08 (s, 3H).

Priprema 2-metoksi-5.6,7.8-tetrahidronaftalen-1-sulfonil hlorida i 3-metoksi-5.6,7.8-tetrahidronaftalen-2-sulfonil hlorida (Int-22) prema Šemi 12.

[0177]

[0178] Smeša CHCl3(10.0 mL) i hlorosumporne kiseline (1.0 mL) je ohlađena na -10 °C i dodat je 6-metoksi-1,2,3,4-tetrahidronaftalen (12a) (1.0 g, 6.1 mmol). Smeša je mešana na -10 °C 15 min. TLC analiza (1:1 EtOAc/petroleum etar) pokazala je potrošnju polaznog materijala. Reakcija je ugašena pažljivim prelivanjem preko ledene vode. Smeša je ekstrahovana sa DCM (3x50 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani zasićenim vodenim NaHCO3(50 mL), osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 0-50% EtOAc/petroleter) da bi se obezbedili 2-metoksi-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-sulfonil hlorid i 3-metoksi-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-sulfonil hlorid (Int-22) (-1:1 smeša, 600 mg, 37% prinos) kao bledo žuta guma.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.65 (s, IH), 7.35 (d, J=8.5 Hz, 1H), 6.92 (d, J=8.5 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.01 (s, 6H), 3.23 (t, J=6.0 Hz, 2H), 2.91-2.63 (m, 6H), 1.88-1.69 (m, 8H).

[0179] Intermedijer u tabeli ispod je pripremljen prema postupcima koji se koriste za sintezu 2-metoksi-5.6,7.8-tetrahidronaftalen-1-sulfonil hlorida i 3-metoksi-5.6,7.8-tetrahidronaftalen-2-sulfonil hlorida (Int-22). Sledeći intermedijeri su sintetizovani sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 8:

Priprema 4-ciklopropil-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorida (Int-24) prema Šemi 13.

4

[0181] Rastvor (13a) (1.0 g, 5.61 mmol) (J. Org. Chem. 2008, 7481-7485) i TMEDA (717 mg, 6.17 mmol) u petrol etru (15.0 mL) je ohlađen u kupatilu sa ledom i vodom i zatim tretiran kap po kap sa n-BuLi (2.5 M u heksanu, 2.5 mL, 6.17 mmol) preko levka za dodavanje, održavajući temperatura <5 °C (unutrašnja). Smeša je mešana na 0 °C tokom 20 min, a zatim ohlađena na -70 °C u kupatilu sa suvim ledom/acetonom. Prethodno ohlađeni rastvor (-65 °C) SO2(5.4 g, 84.2 mmol) u Et2O (100 mL) je dodavan polako, održavajući temperaturu < -60 °C (unutrašnje). Bledo-žuta reakciona smeša je polako zagrejana do 10 °C. Dobijene čvrste materije su sakupljene filtracijom i isprane suvim Et2O. Filter kolač je suspendovan u heksanu (30 mL) i smeša je ohlađena na 0 °C. U hladnu suspenziju je dodat rastvor SOCl2(757 mg, 5.61 mmol) u heksanu (20 mL) polako, održavajući temperaturu <3 °C (unutrašnja). Dobijena smeša je mešana na 0 °C tokom 18 h. Rastvor je filtriran i filter kolač je ispran hladnim heksanom (20 mL). Čvrste materije su prenete u EtOAc (50 mL) i isprane sa H2O (50 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan da bi se dobio 4-ciklopropil-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorid (Int-24) (856 mg, 55% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.32 (s, 2H), 3.97 (s, 6H), 1.93 (tt, J=5.0, 8.3 Hz, IH), 1.18-1.11 (m, 2H), 0.86-0.80 (m, 2H).

Priprema 4-metoksi-6-((4-metil-1).H-pirazol-1-il)metil)benzo[d]izoksazol-3-amina (Int-25) prema Šemi 14.

[0182]

4

Korak 1: Sinteza 4-(bromometil)-2-fluoro-6-metoksibenzonitrila (14b).

[0183] U rastvor 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01) (8.0 g, 44.2 mmol) i PPhs (18.7 g, 71.2 mmol) u acetonitrilu (400 mL) je dodat Br2(11.8 g, 73.8 mmol) i smeša je zagrevana na 55 °C tokom 2 h. Dodati su voda i višak Na2SO3i smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Pet. Etar/EtOAc = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (9.7 g, 91%) u vidu bele čvrste supstance, koja je direktno korišćena u sledećem koraku.

Korak 2: Sinteza 2-fluoro-6-metoksi-4-((4-metil-1)H-pirazol-1-il)metil)benzonitrila (14c).

[0184] Smeša 4-(bromometil)-2-fluoro-6-metoksibenzonitrila (14b) (100 mg, 0.41 mmol), 4-metil-1H-pirazola (40 mg, 0.49 mmol) i K2CO3(113 mg, 0.82 mmol) u DMF (5 mL) je zagrevana na 60 °C preko noći. Smeša je razblažena vodom, ekstrahovana sa EtOAc i organski ekstrakt je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Reakcija je shodno tome povećana korišćenjem 4-(bromometil)-2-

4

fluoro-6-metoksibenzonitrila (14b) (500 mg, 2.05 mmol) i dve serije su kombinovane i prečišćene hromatografijom na koloni (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (380 mg, 63%) u vidu žute čvrste supstance. m/z 246.0 [M+H]<+>.

Korak 3: Sinteza 4-metoksi-6-((4-metil-1).H-pirazol-1-il)metil)benzo[d]izoksazol-3-amina (Int-25)

[0185] Rastvoru N-hidroksiacetamida (238 mg, 3.18 mmol) u anhidrovanom DMF (13 mL) na 0 °C dodat je t-BuOK (357 mg, 3.18 mmol) i smeša je mešana 30 min. 2-fluoro-6-metoksi-4-((4-metil-1H-pirazol-1-il)metil)benzonitril (14c) (260 mg, 1.06 mmol) je zatim dodat i smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu i mešana preko noći. Dodata je voda i smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su sušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (DCM/MeOH = 50/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (150 mg, 55%) kao žuta čvrsta supstanca. m/z 259.1 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.76 (s, 1H), 6.43 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.07 (s, 3H).

Priprema 2,6-dimetoksibenzensulfonil hlorida (Int-26) prema Šemi 15.

[0186]

[0187] U rastvor 1,3-dimetoksibenzena (5.0 g, 36 mmol) i TMEDA (4.6 g, 39.8 mmol) u nheksanu (100 mL) na 0 °C pod N2je dodat n-BuLi (2.5 M rastvor u heksanu, 16.0 mL, 39.8 mmol) kap po kap uz održavanje unutrašnje temperature reakcije ispod 5 °C. Smeša je mešana na 0 °C tokom 20 minuta, a zatim ohlađena na -78 °C i barbotirana sa SO2gasom 20

4

min. Smeša je zatim ostavljena da se polako zagreje do 10 °C i dobijeni talog je sakupljen filtracijom i ispran suvim dietil etrom. Čvrsta supstanca je suspendovana u n-heksanu (100 mL), ohlađena na 0 °C i dodat je rastvor SO2Cl2(4.9 g, 36 mmol) u n-heksanu (20 mL) u kapima uz održavanje unutrašnje temperature ispod 3 °C. Smeša je zatim mešana na 0 °C tokom 1 h i čvrste supstance su sakupljene filtracijom i isprane hladnim n-heksanom. Čvrste materije su zatim podeljene između dietil etra i vode, slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je dalje ekstrahovan dietil etrom. Kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4.0 g, 47%) u vidu bele čvrste supstance.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 (t, J=8.4 Hz, 1H), 6.66 (d, J=8.4 Hz, 2H), 3.97 (s, 6H).

Priprema N-(6-bromo-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Int-27) prema Postupku AA.

[0188]

Postupak AA:

[0189]

[0190] U rastvor amina (0.5 mmol, 1.0 ekv.) u anhidrovanom THF (10 mL) na -78 °C pod N2je dodat LiHMDS (1 M rastvor u THF, 3 ekv.) u kapima i smeša je mešana na -78 °C tokom 30 min. Zatim je u kapima dodat rastvor sulfonil hlorida (1.5 ekv.) u anhidrovanom THF (2.0 mL) i smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana preko noći. Dodata je voda i smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni ili prep. TLC da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. Varijacije gore navedenih uslova su zabeležene u tabeli ispod.

4

Tabela 9:

Priprema 7-bromo-5-metilbenzo[d]izoksazol-3-amina (Int-28) prema Šemi 16.

[0191]

Korak 1: Sinteza 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzojeve kiseline (16a)

[0192] U rastvor 2-bromo-1-fluoro-4-metilbenzena (10.0 g, 53 mmol) i diizopropilamina (5.9 g, 58 mmol) u anhidrovanom THF (200 mL) na -78 °C pod N2je dodat n-BuLi (2.5 M rastvor u heksanu, 25.6 mL, 64.0 mmol) kap po kap i smeša je mešana na -78 °C 1 h. Višak čvrstog CO2(suvi led) je dodat i mešanje je nastavljeno na -78 °C tokom 3 h. Smeša je razblažena vodom (500 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (500 mL). Organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (12.3 g, 100%) kao braon čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. m/z 232.8 [M+H]<+>.

Korak 2: Sinteza 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzoil hlorida (16b)

[0193] U rastvor 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzojeve kiseline (16a) (12.3 g, 53 mmol) i DMF (4 kapi) u DCM (100 mL) na sobnoj temperaturi pod N2je dodat oksalil hlorid (13.0 g, 106 mmol) u kapima i smeša je mešana 2 h. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (14.0 g, 100%) kao braon čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 3: Sinteza 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzamida (16c)

[0194] Rastvor 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzoil hlorida (16b) (14.0 g, 53 mmol) u DCM (100 mL) je dodat kap po kap u 30% vodeni rastvor amonijum hidroksida (100 mL) i smeša je mešana 2 h. Smeša je razblažena sa EtOAc (200 mL), isprana vodom (200 mL × 3), slanim rastvorom i organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (12.0 g, 97%) kao braon čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. m/z 231.9 [M+H]<+>.

Korak 4: Sinteza 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzonitrila (16d)

[0195] Rastvor 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzamida (16c) (10.0 g, 43.0 mmol) i tionil hlorid (15.4 g, 129 mmol) u DMF (100 mL) je zagrevan na 100 °C tokom 3 h. Smeša je razblažena sa EtOAc (200 mL) i isprana vodom (400 mL × 5), slanim rastvorom i organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (5.0 g, 54%) u vidu braon čvrste supstance, koje je korišćeno u sledećem koraku bez

1

daljeg prečišćavanja. m/z 213.9 [M+H]<+>.

Korak 5: Sinteza 7-bromo-5-metilbenzo[d]izoksazol-3-amina (Int-28)

[0196] Suspenzija N-hidroksiacetamida (5.27 g, 70.2 mmol) i t-BuOK (7.88 g, 70.2 mmol) u anhidrovanom DMF (200 mL) je mešana na 0 °C tokom 1 h. 3-bromo-2-fluoro-5-metilbenzonitril (16d) (5.0 g, 23.4 mmol) je zatim dodat i smeša je ostavljena da se zagreje do RT i mešana preko noći. Smeša je razblažena sa EtOAc (300 mL), isprana vodom (600 mL × 4), slanim rastvorom i organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Pet. etar/EtOAc = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2.8 g, 52%) kao žuta čvrsta supstanca. m/z 226.9 [M+H]<+>.

Priprema N-(7-bromo-5-metilbenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Int-29) prema Postupku AB.

[0197]

Postupku AB:

[0198]

[0199] U rastvor amina (0.2 mmol, 1.0 ekv.) u piridinu (2 mL) dodat je sulfonil hlorid (1.5 ekv.) i smeša je zagrevana na 120 °C pod mikrotalasnim zračenjem tokom 2 h. Smeša je podeljena između vode i EtOAc, slojevi su razdvojeni i organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen prep. TLC da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. Varijacije gore navedenih uslova su zabeležene u tabeli ispod.

2

Tabela 10:

Postupci formiranja sulfonamida:

[0200]

Postupak A:

[0201] Urastvor jedinjenja tipa IV (1.0 ekv.) u piridinu (c = 0.1 M) je dodato jedinjenje tipa V (1.2 ekv.) . Smeša je mešana uz zagrevanje na temperaturi između 80 i 120 °C tokom ~3-16 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, koncentrovana do sušenja i prečišćena standardnim postupcima poznatim stručnjacima da bi se dobilo jedinjenje Formule (A).

Postupak B:

[0202] U suspenziju NaH (60% disperzije u mineralnom ulju, 3.0 ekv.) u THF (c= 0.15 M) na 0 °C dodat je rastvor jedinjenja tipa IV (1.0 ekv.) u 1:1 THF/DMF (c = 0.15 M) ili THF (c = 0.15 M) kap po kap. Rastvor jedinjenja tipa V (1.3 ekv.) u 2:1 THF/DMF (c = 0.15 M) ili THF (c= 0.15 M) je dodato na istoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na 60 °C tokom 16 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, koncentrovana do sušenja i prečišćena standardnim postupcima poznatim stručnjacima da bi se dobilo jedinjenje Formule (A).

Postupak C:

[0203] Rastvoru jedinjenja tipa IV (1.0 ekv.) u THF (c = 0.3 M) je dodat NaOtPn (40% u PhMe, 1.0 ekv.) i rastvor jedinjenja tipa V (1.0 ekv.) u THF (c = 0.3 M). Smeša je mešana na 60 °C tokom 16 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, koncentrovana do sušenja i prečišćena standardnim postupcima poznatim stručnjacima da bi se dobilo jedinjenje Formule (A).

Postupak D:

[0204] U rastvor jedinjenja tipa IV (1.0 ekv.) i jedinjenja tipa V (1.2 ekv.) u ACN (c = 0.2 M) je dodat 0.05 M rastvor DMSO u ACN (1.0 mL/mmol jedinjenja tipa IV, 0.05 ekv. DMSO), zatim 3.5-lutidin (3.0 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 sati, koncentrovana do sušenja i prečišćena standardnim postupcima poznatim stručnjacima da bi se dobilo jedinjenje Formule (A).

Priprema primera i referentnih primera

Referentni primer 01: Priprema 5-etil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida prema Šemi A.

[0205]

4

Korak 1: Sinteza 2-fluoro-6-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (A-1).

[0206] U rastvor 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitrila (Int-01) (7.0 g, 38.6 mmol) i 1-(metansulfonil)-1H-pirazola (Int-13) (6.2 g, 42.5 mmol) u MeCN (150 mL) je dodat Cs2CO3(18.9 g, 58 mmol). Smeša je mešana na 70 °C tokom 2 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala. Reakcija je filtrirana i filtrat je koncentrovan do sušenja. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 1:1 EtOAc/petrol etar) da bi se dobio 2-fluoro-6-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitril (A-1) (7.0 g, prinos 78%) kao žuta čvrsta supstanca. m/z (ESI+) 231.8 (M+H)<+>.

Korak 2: Sinteza 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (A-2).

[0207] U rastvor 2-fluoro-6-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (A-1) (7.0 g, 30.3 mmol) i N-hidroksiacetamida (6.8 g, 90.8 mmol) u DMF (200 mL) i H2O (30 mL) je dodat K2CO3(25.1 g, 182 mmol). Smeša je mešana na 60 °C tokom 16 h. TLC analiza (EtOAc) pokazala je potrošnju polaznog materijala. Reakciona smeša je koncentrovana da bi se uklonila većina DMF i zatim razblažena sa H2O (100 mL). Dobijeni precipitat je sakupljen filtracijom. Filter kolač je ispran sa H2O (3k20 mL) i osušen u vakuumu da bi se dobio 4metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (A-2) (6.0 g). Prethodni filtrat je ekstrahovan sa EtOAc (2k30 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (SiO2, EtOAc) da bi se obezbedila dodatna serija 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (A-2) (0.5 g). Dve serije proizvoda su kombinovane i sušene pod vakuumom da bi se dobio 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (A-2) (6.5 g, prinos 88%) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.51 (d, J=1.3 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.31 (t, J=2.0 Hz, 1H), 6.08-5.78 (m, 2H), 5.52-5.31 (m, 2H), 3.93-3.73 (m, 3H). m/z (ESI+) 244.8 (M+H)<+>.

Korak 3: Sinteza 5-etil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Primer 01) prema Postupku formiranja sulfonamida A.

[0208] U rastvor 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (A-2) (1.23 g, 5.032 mmol) u piridinu (2.5 mL) je dodat 5-etil-2-metoksibenzen-1-sulfonil hlorid (1.54 g, 6.54 mmol). Reakcija je mešana na 80 °C tokom 3.5 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala sa formiranjem željene mase proizvoda. Reakcija je očvrsnula nakon hlađenja. Čvrsta supstanca je rastvorena u DCM i AcOH (1.4 mL) sa minimalnom količinom MeOH. Smeša je prečišćena fleš hromatografijom (40 g SiO210-70% MeOAc/heptan). Sakupljene su čiste frakcije koje sadrže jedinjenje iz naslova. Nečiste frakcije su ponovo prečišćene fleš hromatografijom (40 g SiO210-70% MeOAc/heptan). Čiste frakcije su kombinovane sa prethodno izolovanim čistim frakcijama i koncentrovane da bi se dobila bela čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je suspendovana u MeOAc, refluksovana 1 h i ostavljena da se ohladi do sobne temperature. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio 5-etil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 01) (1.4 g, 63% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.98 (s, IH), 7.87 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.62 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.49 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.46 (dd, J=2.0, 8.5 Hz, 1H), 7.10 (d, J=8.5 Hz, 1H), 6.83 (s, IH), 6.74 (s, 1H), 6.30 (t, J=2.0 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 2.59 (k, J=7.5 Hz, 2H), 1.13 (t, J=7.5 Hz, 3H); m/z (ESI+) 443.1 (M+H)<+>.

Referentni primer 02: Priprema 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(3-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida prema Šemi B.

Referentni primer 03: Priprema 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida prema Šemi B.

[0210]

Korak 1: Sinteza 2-fluoro-6-metoksi-4-[(3-metil-1)H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (B-1) i 2-fluoro-6-metoksi-4-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (B-2).

[0211] U smešu (~1:1) 1-(metansulfonil)-3-metil-1H-pirazola i 1-(metansulfonil)-5-metil-1H-pirazola (Int-15) u MeCN (25 mL) je dodat 2-fluoro-4-(hidroksimetil)-6-metoksibenzonitril (Int-01) (1.0 g, 5.5 mmol) i Cs2CO3(2.3 g, 7.2 mmol). Smeša je mešana na 70 °C tokom 1 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala sa formiranjem željene mase proizvoda. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (20 g SiO2, 100% EtOAc) da bi se dobila smeša (~1:1) 2-fluoro-6-metoksi-4-[(3-metil-1)H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (B-1) i 2-fluoro-6-metoksi-4-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (B-2) (1.13 g, prinos 84%) kao žuta guma. m/z (ESI+) 245.8 (M+H)<+>.

Korak 2: Sinteza 4-metoksi-6-[(3-metil-1).H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (B-3) i 4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (B-4).

[0212] U smešu (~1:1) 2-fluoro-6-metoksi-4-[(3-metil-1)H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (B-1) i 2-fluoro-6-metoksi-4-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (B-2) (1.13 g, 4.73 mmol) u DMF (20 mL) i H2O (3 mL) dodat je N-hidroksiacetamid (1.07 g, 14.2 mmol) i K2CO3(3.9 g, 28.4 mmol). Smeša je mešana na 60 °C tokom 16 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala sa formiranjem željene mase proizvoda. Smeša je koncentrovana do sušenja. Ostatak je stavljen u EtOAc (30 mL) i isprana sa H2O (30 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (20 g SiO2, 100% EtOAc) da bi se dobila smeša (~1:1) 4-metoksi-6-[(3-metil-1)H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (B-3) i 4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (B-4) (916 mg, 75% prinos) kao čvrsta supstanca. m/z (ESI+) 258.8 (M+H)<+>.

Korak 3: Sinteza 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(3-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Primer 02) i 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 03) prema Postupku formiranja sulfonamida A.

[0213] U smešu (~1:1) 4-metoksi-6-[(3-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3amina (B-3) i 4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (B-4) (800 mg, 3.1 mmol) u piridinu (10.0 mL) je dodat 2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorid (Int-26) (1.1 g, 4.65 mmol). Smeša je mešana na 120 °C tokom 2 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (20 g SiO2, 1:4 MeOH/EtOAc). Materijal je ponovo prečišćen preparativnom HPLC sa IMC Triart kolonom (20k150 mm, veličina čestica 7 µm), koja je eluirana sa 23-63% MeCN/H2O (+0.225% mravlje kiseline) sa brzinom protoka od 25 mL/min. Materijal je ponovo prečišćen preparativnom SFC sa Diacel CHIRALCEL OD-H kolonom (30x250 mm, veličina čestica 5 µm), koja je eluirana sa 45% EtOH/CO2(+0.1% NH4OH) sa brzinom protoka od 60 mL/min da bi se dobio 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(3-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 02) (63 mg, 4% prinos) kao prvi eluirani pik kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.62 (br. s, 1H), 7.74 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.49 (t, J=8.4 Hz, IH), 6.81 (s, IH), 6.77 (d, J=8.3 Hz, 3H), 6.07 (d, J=2.1 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 3.93-3.84 (m, 3H), 3.77 (s, 6H), 2.15 (s, 3H); m/z (ESI+) 458.8 (M+H)<+>. 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 03) (33 mg, 2% prinos) je dobijen kao drugi eluirani pik kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (br. s, 1H), 7.49 (t, J=8.6 Hz, 1H), 7.40 (d, J=1.7 Hz, 1H), 6.78 (s, IH), 6.76 (s, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.11 (dd, J=1.8, 0.9 Hz, IH), 5.41 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.76 (s, 6H), 2.21 (s, 3H); m/z (ESI+) 458.8 (M+H)<+>.

[0214] Primeri i referentni primeri u tabeli ispod su sintetizovani prema postupcima koji se koriste za sintezu 5-etil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 01), 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(3-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 02), i 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 03) i opštog postupka formiranja sulfonamida A-D. Sledeći primeri su sintetizovani sa nekritičnim izmenama ili zamenama opisanih procedura koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje. Ako je potrebno, odvajanje regioizomernih smeša je sprovedeno prema poznatim postupcima u struci, kao što su SFC ili HPLC, i sprovedeno je u bilo kom pogodnom koraku u sintetičkoj sekvenci.

Tabela 11:

1

2

4

1

2

4

Primer 45: Priprema 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida prema Šemi C (put A).

[0215]

[0216] U suspenziju 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (A-2) (2.5 g, 10 mmol) u piridinu (8.0 mL) je dodat 2-metoksibenzen-1-sulfonil hlorid (3.17 g, 15.4 mmol). Reakcija je mešana na 120 °C tokom 1.5 h. Smeša je ohlađena do sobne temperature i razblažena sa MeOH. Dobijena suspenzija je filtrirana, a filter kolač je ispran sa MeOH (30 mL). Čvrste materije su rastvorene u DCM (50 mL) i dodat je MeOH (30 mL). DCM je uklonjen pod vakuumom i talog je sakupljen filtracijom. Filter kolač je osušen liofilizacijom da bi se dobio 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Primer 45) (2.5 g, prinos 59%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18 (s, IH), 7.87 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.80 (dd, J=1.6, 7.9 Hz, 1H), 7.66-7.59 (m, 1H), 7.49 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.19 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.09 (t, J=7.7 Hz, IH), 6.83 (s, IH), 6.74 (s, 1H), 6.30 (t, J=2.0 Hz, IH), 5.44 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.78 (s, 3H); m/z (ESI+) 415.0 (M+H)<+>.

Primer 45: Alternativno pripremanje 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida prema Šemi D.

[0217]

[0218] Reaktor od 100 mL opremljen gornjom mešalicom je napunjen sa 4-metoksi-6-(1H-pirazol-1-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-aminom (A-2) (10.00 g, 40.94 mmol), 2-metoksibenzensulfonil hloridom (10.15 g, 49.13 mmol) i acetonitrilom (100 mL). Dobijena suspenzija je mešana na 25 °C tokom 55 minuta. Preko pipete, u jednoj porciji je dodat dimetilsulfoksid (0.36 mL, 4.09 mmol). Preko šprica, 3.5-lutidin (14.8 mL, 122.82 mmol) je dodat u kapima tokom 15 minuta. Dobijena svetložuta suspenzija je mešana na 25 °C tokom 18 sati da bi se postigla konverzija >98% prema proceni LCMS. Reakciona smeša je zakiseljena sa 1 M aq. HCl (100 mL), zatim koncentrovana do ~80 mL (rotacioni isparivač, 40 °C, 85 mbar). Suspenzija je tretirana sa dodatnim 1 M aq. HCl (40 mL) da se isperu zidovi posude, zatim mešana na 20 °C tokom 2.5 sata. Dobijeni talog je sakupljen usisnom filtracijom. Kolač na filteru je ispran vodom (2 × 50 mL), zatim sušen pod vakuumom na 35 °C tokom 48 sati, dajući sirovi 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Primer 45) (15.2 g, 90% prinos, 98% čistoća prema LCMS) kao čvrstu supstancu. m/z 415.1 (M+H)<+>.

[0219] Za prečišćavanje sirovog proizvoda, suspenzija sirovog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Primer 45) (14.00 g, 33.78 mmol) u dihlorometanu (210 mL) je zagrevana u kupatilu na 40 °C dok se ne dobije bistar rastvor (10 minuta). Smeša je filtrirana, a filtrat vraćen u čist reakcioni sud, korišćenjem dodatnog dihlorometana (70 mL) da se kvantifikuje transfer. Etil acetat (140 mL) je dodat u rastvor tokom 2 minuta, a zatim je smeša mešana 2.5 sata. Nije primećena kristalizacija, pa je rastvor koncentrovan pod sniženim pritiskom (200 mbar) da bi se uklonio dihlorometan (zapremina je smanjena za oko 70 mL). Ostatku je dodato još etil acetata (140 mL) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 21 sat. Dobijena suspenzija je koncentrovana pod sniženim pritiskom (40 °C, 200 mbar) do oko 280 mL, a zatim mešana na sobnoj temperaturi 3 sata. Čvrste materije su sakupljene filtracijom, sa dodatnim etil acetatom (70 mL) korišćenim za ispiranje reakcionog suda i filter kolača. Filter kolač je sušen u vakuumskoj peći na 35 °C tokom 23 sata, dajući 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Primer 45) (12.0 g, 85% prinos, 97.9% čistoće prema UPLC-u, nijedna nečistoća nije veća od 0.5%) kao čvrsta supstanca. m/z 415.1 (M+H)<+>.

[0220] Za dalje prečišćavanje, suspenzija 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Primer 45) (2.0 g, 4.73 mmol) u acetonu (80 mL) je zagrevana do refluksa (temperatura kupatila 55 °C) uz mešanje tokom 2 sata. Dok je smeša još uvek zagrevana, polako je dodavan etil acetat (30 mL), tako da je unutrašnja temperatura ostala iznad 45 °C. Dobijena suspenzija je koncentrovana do oko 30 mL pod blagim vakuumom (temperatura kupatila 65 °C), zatim ohlađena polako brzinom od 1 °C/min do 20 °C (~31 minut). Dobijeni precipitat je sakupljen usisnom filtracijom. Filter kolač je sušen pod vakuumom na 50 °C tokom 22 sata, dajući 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Primer 45) (1.825 g, 93% prinos, 99.5% čistoće prema UPLC) kao kristalna čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) 5 8<.>14 (dd, J=1.7, 7.8 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.59 - 7.51 (m, 2H), 7.44 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.14 - 7.06 (m, 1H), 6.95 (d, J=8.3 Hz, 1H), 6.78 (d, J=0.6 Hz, IH), 6.45 (s, IH), 6.32 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.38 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.91 (s, 3H).

Primer 45b: Priprema anhidrovanog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Oblik 1) prema Šemi C-1 (Put B).

[0221]

[0222] 2-metoksibenzen-1-sulfonil hlorid (7.6 g, 37 mmol) je stavljen u balon sa okruglim dnom sa 2 grla i opremljen unutrašnjim termometrom. 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (A-2) (8.18 g, 33.5 mmol) je dodat i sadržaj rastvoren u piridinu (55 mL, 0.6 M) uz lagano zagrevanje. Zagrevanje je započeto sa temperaturom u uljanom kupatilu od 110°C i unutrašnjom temperaturom od 101°C. Posle 5 h zagrevanja, reakcija je završena kao što je utvrđeno LCMS analizom. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i podeljena između DCM (200 mL), 6 N HCl (100 mL) i ledene vode (100 mL). Proizvod je ekstrahovan u DCM (x3) i kombinovani DCM ekstrakt je ispran sa 1 N HCl (x3) da bi se uklonili tragovi piridina. DCM ekstrakt je osušen preko MgSO4i koncentrovan do tamnog ulja. Ulje je prečišćeno fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 40 - 100% EtOAc u heptanu da bi se dobilo 4.6 g proizvoda, što je potvrđeno NMR. 4.6 g proizvoda je rekristalisano prvo rastvaranjem u CH3CN (60 mL) na refluksu dok se većina čvrstih supstanci nije rastvorila. Ovaj vreli rastvor je filtriran korišćenjem prethodno zagrejanog/vrućeg staklenog levka opremljenog nazubljenim filter papirom. Ovaj korak uklanja sve neorganske ili silika gel nečistoće. Filter papir je ispran malim porcijama CH3CN dodavanjem do ukupne zapremine pranja od 10 mL. Filtrat je sakupljen u čašu od 250 mL opremljenu šipkom za mešanje. U vreli filtrat je dodat MTBE (45 mL) i započeto je mešanje. Posle 30 sekundi mešanja, počeo je da se formira beli talog. Mešanje je nastavljeno na 400 obrtaja u minuti dok je lagana struja N2gasa je forsirana preko vrha rastvora da bi se ubrzao proces isparavanja. Forsirano N2uparavanje je nastavljeno 3 h dok ukupna zapremina nije bila 50 mL. Bela čvrsta supstanca je filtrirana uz ispiranje sa MTBE (x2) i heptanom (x2). Beli prah je stavljen u posudu za kristalizaciju prečnika 3 inča, prekriven komadom filter papira i zagrevan u vakuumskoj peći na 70°C tokom 48 sati koristeći spori protok N2u i iz pećnice za sušenje kako bi se olakšao proces sušenja. Posle sušenja dobijeno je 3.9 g kristalnog proizvoda, što je potvrđeno NMR. Tačka topljenja = 203-204°C. Anal. izračunati za C19H18N4O5S: C, 55.06; H, 4.38; N, 13.52. Nađeno: C, 55.09; H, 4.41; N, 13.57.

[0223] Kristalna čvrsta supstanca pripremljena prethodno kao anhidrovana (Oblik 1) je dalje okarakterisana difrakcijom rendgenskih zraka na prahu (XSRD). Analiza difrakcije rendgenskih zraka u prahu je sprovedena na Bruker A25 D8 Advance Powder X-Ray difraktometru opremljenom, teta-2teta goniometrom i Lynxeye detektorom sa veličinom PSD prozora od 3.3°, primarnim soller prorezom postavljenim na 2.5° i prorezi za divergenciju su postavljeni na konstantno osvetljenje od 0.6 mm. Napon i amperaža rendgenske cevi su podešeni na 40 kV i 40 mA respektivno. Podaci su prikupljeni na talasnoj dužini bakra koristeći veličinu koraka od 0.02 stepena, vreme koraka od 0.3 s od 3.0 do 40.0° 2-teta. Uzorak je pripremljen stavljanjem praha u Si-nisko pozadinski držač šupljine. Prašak uzorka

1

je pritisnut lopaticom da bi se osigurala odgovarajuća visina uzorka. Podaci su prikupljeni korišćenjem Bruker DIFFRAC softvera, a analiza je izvršena pomoću DIFFRAC EVA softvera. Prikupljeni XSRD obrasci su uvezeni u Bruker DIFFRAC EVA softver. Odabir pikova je obavljen korišćenjem softverske „funkcije traženja pikova“, a zatim je pažljivo proveren i ispravljen kako bi se osiguralo da su sve pozicije pikova tačno dodeljene. Odabrani su pikovi sa relativnim intenzitetom ≥ 4.0%. Tipična greška od ± 0.2° 2-teta u pozicijama pikova se primenjuje na ove podatke. Manja greška povezana sa ovim merenjem može nastati zbog niza faktora uključujući: (a) pripremu uzorka (npr. visina uzorka), (b) instrument, (c) kalibraciju, (d) operater (uključujući one greške prisutne prilikom određivanja lokacije pikova) i (e) priroda materijala (npr. preferirana orijentacija i greške u transparentnosti). Stoga se smatra da pikovi imaju tipičnu pridruženu grešku od ± 0.2° 2-teta. Kada se smatra da se dva pika na listi preklapaju, manje intenzivan pik je uklonjen sa liste. Pikovi koji postoje kao ramena, na susednom piku većeg intenziteta, takođe su uklonjeni sa liste pikova. Iako ramena mogu biti > 0.2° 2-teta od položaja susednog pika, ne smatraju se vidljivima sa susednog pika.

[0224] Da bi se dobile apsolutne pozicije pikova, uzorak praha treba da bude poravnat sa referencom. Ovo može biti ili simulirani uzorak praha iz kristalne strukture istog oblika rastvoren na sobnoj temperaturi, ili interni standard, npr. silicijum ili korund. Simulirani prah anhidrovanog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Oblik 1) je dobijen iz monokristalne strukture. Da bi se dobio monokristal, 200 mg materijala iz Primera 45b je rastvoreno u CH3CN (3 mL) uz zagrevanje do refluksa. Dodat je MTBE (2 mL) i smeša je ostavljena da stoji u epruveti otvorenoj na vazduhu 48 h, što je rezultovalo sporim isparavanjem rastvarača. Formirani su veliki kristali, koji su filtrirani i isprani MTBE (x2) i heptanom (x2) i osušeni pod vakuumom. Dobijeno je 116 mg (58% obnavljanja) materijala iz Primera 45b kao kristalna, bela čvrsta supstanca kao što je potvrđeno<1>H NMR. Kristali, vizuelizovani mikroskopijom polarizovane svetlosti, pokazali su veliku veličinu čestica i bili su triklinskog oblika. Simulirani uzorak praha iz monokristalne strukture dobijen je proračunom koristeći Mercury 4.1.0 koji je deo CCDC softverskog paketa.

[0225] XSRD obrazac anhidrovanog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida oblik 1 (Primer 45a), prikazan je na Sl. 1. XSRD lista pikova i podaci o relativnom intenzitetu za anhidrovani 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid oblik 1 (Primer 45a) (2-Teta°) je dat u Tabeli 12 ispod. Karakteristične pozicije XSRD vrhova su označene zvezdicom.

2

Tabela 12: Lista pikova XSRD za Primer 45 Oblik 1 Anhidrovani.

[0226] Jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska se odnosi na kristalni oblik anhidrovanog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il} benzen-1-sulfonamida, koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka u prahu koji sadrži pikove na 2θ vrednostima: 13.4 i 18.1 °2Θ ± 0.2 ° 2Θ.

[0227] Jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska se odnosi na kristalni oblik anhidrovanog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il} benzen-1-sulfonamida, sa obrascem difrakcije rendgenskih zraka praha koji sadrži pikove na 2θ vrednosti od: 13.4 i 18.1 °2Θ ± 0.2 °2Θ i dalje sadrži najmanje jedan pik izabran od 2θ vrednosti od: 11.4, 14.1 i 17.5 °2Θ ± 0.2 °2Θ.

[0228] Jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska se odnosi na kristalni oblik anhidrovanog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il} benzen-1-sulfonamida, sa obrascem difrakcije rendgenskih zraka praha koji sadrži pikove na 2θ vrednosti od: 13.4 i 18.1 °2Θ ± 0.2 °2Θ , i dalje sadrži pikove na 2θ vrednosti: 11.4, 14.1 i 17.5 °2Θ ± 0.2 °2Θ.

[0229] Jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska se odnosi na kristalni oblik anhidrovanog 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida, koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka praha koji sadrži pikove na 2θ vrednostima: 11.4, 13.4, 14.1, 17.5 i 18.1 °2Θ ± 0.2 °2θ.

[0230] Primeri i referentni primeri u tabeli ispod su sintetizovani prema postupcima koji se koriste za sintezu 5-etil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 01), 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(3-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 02), i 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 03) i opšti postupak formiranja sulfonamida C u formatu biblioteke visoke propusnosti. Sledeći primeri su sintetizovani sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 13:

4

1

2

4

Referentni primer 87: Pripremanje N-(6-{[4-(hidroksimetil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida prema Šemi E.

[0231]

Korak 1: Sinteza 6-{[4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-amina (E-2).

[0232] Rastvoru 4-{[4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil}-2-fluoro-6-metoksibenzonitrila (E-1) (Pripremljen kao u Referentnom primeru 01, 500 mg, 1.33 mmol) i N-hidroksiacetamida (300 mg, 3.99 mmol) u DMF (10.0 mL) i H2O (2.0 mL) je dodat K2CO3(1.1 g, 7.99 mmol). Smeša je mešana na 60 °C tokom 16 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala. Reakciona smeša je koncentrovana da bi se uklonio DMF i razblažena sa H2O. Dobijeni talog je sakupljen filtracijom. Filter kolač je osušen pod vakuumom. LCMS analiza je pokazala mešavinu željenog proizvoda i des-TBS nusproizvoda. Sirova čvrsta supstanca je kombinovana uz paralelnu reakciju sa 200 mg 4-{[4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil}-2-fluoro-6-metoksibenzonitrilom. Kombinovane čvrste supstance su prenete u DCM (10.0 mL). Dodati su TBSCI (178 mg, 1.18 mmol), TEA (149 mg, 1.48 mmol) i DMAP (6.0 mg, 0.49 mol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Smeša je razblažena sa DCM (100 mL) i isprana uzastopno sa H2O (50 mL), zasićenim NaHCO3(50 mL) i slanim rastvorom (50 mL). Organska faza je osušena preko Na2SO4, filtrirana i koncentrovana. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (20 g SiO2, 60-70% EtOAc/petroletar) da bi se obezbedio 6-{[4-({[tercbutil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-amin (E-2) (280 mg, 34% prinos u 2 koraka) kao bela čvrsta supstanca. m/z (ESI+) 388.9 (M+H)<+>.

Korak 2: Sinteza N-(6-{[4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil)-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzen-1--sulfonamida (E-3) prema formiranju sulfonamida Postupak B.

[0233] U suspenziju NaH (60% disperzije u mineralnom ulju, 40.1 mg, 1.00 mmol) u THF (2.0 mL) dodat je rastvor 6-{[4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-amina (E-2) (130 mg, 0.335 mmol) u THF (2.0 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 15 min, a zatim je dodat rastvor 2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorida (Int-26) (95.0 mg, 0.402 mmol) u THF (2.0 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 17 h. Suspenzija je filtrirana i koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (12 g SiOz, 1:1 EtOAc/petrol etar) da bi se dobilo N-(6-{[4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (E3) (80 mg, 41% prinos) kao bledožuta guma. m/z (ESI+) 589.1 (M+H)<+>

Korak 3: Sinteza N-(6-{[4-(hidroksimetil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 87).

[0234] Rastvoru N-(6-{[4-({[terc-butil(dimetil)silil]oksi}metil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (E-3) (80.0 mg, 0.16 mmol) u THF (2.0 mL) je dodat TBAF (76.3 mg, 0.32 mmol). Reakcioni rastvor je mešan 1 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala sa formiranjem željene mase proizvoda. Reakcija je koncentrovana do sušenja. Ostatak je stavljen u EtOAc (15 mL) i ispran sa H2O (10 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan do sušenja. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC sa IMC-Actus Triart C-18 kolonom (30x150 mm, veličina čestica 5 µm), koja je eluirana sa 5-25% MeCN/H2O (0.05% NH4OH) sa brzinom protoka od 35 mL/min N-(6-{[4-(hidroksimetil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 87) (4.5 mg, 6% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.73 (br. s, 1H), 7.40 (br. s, 2H), 6.74 (br. s, 4H), 5.35 (br. s, 2H), 4.81 (t, J=5.4 Hz, 1H), 4.34 (d, J=5.4 Hz, 2H), 3.97-3.59 (m, 9H); m/z (ESI+) 475.0 (M+H)<+>.

[0235] Primeri u tabeli ispod su sintetizovani prema postupcima korišćenim za sintezu N-(6-{[4-(hidroksimetil)-1H-pirazol-1-il]metil}-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-2,6dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 87). Sledeći primeri su sintetizovani sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje. Ako je potrebno, odvajanje regioizomernih smeša je sprovedeno prema standardnim postupcima poznatim u tehnici, kao što su SFC ili HPLC, i sprovedeno je u bilo kom pogodnom koraku u sintetičkoj sekvenci.

Tabela 14:

Referentni primer 90: Priprema 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid prema Šemi F.

[0236]

Korak 1: Sinteza 2-fluoro-6-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]benzonitrila (F-1).

[0237] U rastvor 2-fluoro-6-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (164 mg, 0.703

1

mmol) (A-1) u CDaOD (4.0 mL) je dodat Cs2CO3(229 mg, 0.703 mmol). Smeša je mešana na 40 °C tokom 2 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (24 g SiO2, 0-40% EtOAc/DCM) da bi se dobio 2-fluoro-6-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]benzonitril (F-1) (81.0 mg, 49% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.61 (d, J=1.71 Hz, IH), 7.47 (d, J=2.32 Hz, 1H), 6.52-6.57 (m, 2H), 6.37 (t, J=2.08 Hz, IH), 3.88-3.91 (m, 3H); m/z (ESI+) 234.2 (M+H)<+>.

Korak 2: Sinteza 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (F-2).

[0238] U suspenziju 2-fluoro-6-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]benzonitrila (F-1) (81.0 mg, 0.35 mmol) i N-hidroksiacetamida (78.2 mg, 1.04 mmol) u MeCN (2.7 mL) i D2O (0.3 mL) je dodat 1,1,3,3-tetrametilguanidin (240 mg, 2.08 mmol). Smeša je mešana na 60 °C tokom 7 h i 65 °C tokom dodatna 2 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (24 g SiO2, 60-100% EtOAc/DCM) da obezbedi 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (F-2) (32 mg, 37% prinos) kao belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85 - 7.89 (m, IH), 7.49 (d, J=1.83 Hz, 1H), 6.70 (d, J=0.86 Hz, 1H), 6.63 (d, J=0.73 Hz, 1H), 6.30 (t, J=2.08 Hz, 1H), 5.93 (s, 2H), 3.83-3.87 (m, 3H); m/z (ESI+) 247.2 (M+H)<+>.

Korak 3: Sinteza 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 90) prema Postupku formiranja sulfonamida A.

[0239] Smeša 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (F-2) (25.0 mg, 0.10 mmol) i 2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorida (Int-26) (36.0 mg, 0.152 mmol) u piridinu je mešana na 95 °C tokom 2 h. Dobijena guma je razblažena sa DCM i tretirana sa AcOH (46 uL, 0.812 mmol). Smeša je prečišćena direktno fleš hromatografijom (24 g SiO2, 70-100% EtOAc/heptan) da obezbedi 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 90) (37.0 mg, 82% prinos) kao belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.60 (s, IH), 7.88 (d, J=2.08 Hz, 1H), 7.43-7.54 (m, 2H), 6.84 (s, 1H), 6.73-6.80 (m, 3H), 6.30 (t, J=2.08 Hz, IH), 3.87 (s, 3H), 3.76 (s, 6H); m/z (ESI+) 448.1 (M+H)<+>.

1 1

[0240] Primer u tabeli ispod je sintetizovan prema postupcima kojiu se koriste za sintezu 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)(<2>H2)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 90). Sledeći primeri su sintetizovani sa nekritičnim izmenama ili zamenama opisanih procedura koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 15:

Referentni primer 92: Priprema N-{5-bromo-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida prema Šemi G.

[0241]

1 2

Korak 1: Sinteza 5-bromo-2-fluoro-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (G-1)

[0242] U rastvor 5-bromo-4-(bromometil)-2-fluorobenzonitrila (Int-07) (280 mg, 0.956 mmoL) u MeCN (6.4 mL) je dodat 1H-pirazol (71.6 mg, 1.05 mmol) i Cs2CO3(0.374 mg, 1.15 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 6 h. Smeša je razblažena sa EtOAc i filtrirana. Filtrat je koncentrovan do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 10-100% EtOAc/heptan) da bi se dobio 5-bromo-2-fluoro-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitril (G-1) (188 mg, 70% prinos) kao bistro ulje, koje je stajanjem očvrslo u bledožutu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (d, J=5.7 Hz, 1H), 7.65 (d, J=1.7 Hz, 1H), 7.53 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.52 (d, J=9.3 Hz, 1H), 6.40 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.43 (s, 2H); m/z (ESI+) 280.0, 282.0 (M+H)<+>.

Korak 2: Sinteza 5-bromo-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (G-2)

[0243] U rastvor 5-bromo-2-fluoro-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (G-1) (185 mg, 0.66 mmol) i N-hidroksiacetamida (149 mg, 1.98 mmol) u MeCN (3.5 mL) i H2O (0.35 mL) je dodat 1,1,3,3-tetrametilguanidin (45.9 mg, 0.399 mmol). Smeša je mešana na 75 °C tokom 4 h. Reakcija je koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 30-90% EtOAc/heptan) da bi se dobio 5-bromo-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-

1

benzoksazol-3-amin (G-2) (157 mg, 81% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.18 (s, IH), 7.87 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.55 (d, J=1.3 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.50 (s, 2H), 6.34 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.51 (s, 2H); m/z (ESI+) 293.0, 295.0 (M+H)<+>.

Korak 3: Sinteza N-{5-bromo-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Referentni primer 92)

[0244] Rastvor 5-bromo-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (G-2) (155 mg, 0.529 mmol) i 2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorid (Int-26) (188 mg, 0.793 mmol) -u piridinu (0.31 mL) je zagrejan do 95 °C, pri čemu je reakcija postala homogena. Reakcija je mešana na 95 °C tokom 2 h i zatim koncentrovana do sušenja. Ostatak je stavljen u minimalnu količinu DCM i tretiran sa AcOH (0.10 mL, 1.75 mmol). Smeša je napunjena direktno na SiO2i prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 35-100% MeOAc/heptan) da obezbedi N-{5-bromo-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Referentni primer 92) (221 mg, 84% prinos) kao belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.55 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 7.87 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.54 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.47 (t, J=8.4 Hz, IH), 6.88 (s, IH), 6.74 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.34 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.52 (s, 2H), 3.75 (s, 6H); m/z (ESI+) 493.0, 495.0 (M+H)<+>.

[0245] Primeri u tabeli ispod su sintetizovani prema postupcima korišćenim za sintezu N-{5-bromo-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Referentni primer 92). Sledeći primeri su sintetizovani sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje. Ako je potrebno, odvajanje regioizomernih smeša je sprovedeno prema standardnim metodama poznatim u tehnici, kao što su SFC ili HPLC, i sprovedeno je u bilo kom pogodnom koraku u sintetičkoj sekvenci.

Tabela 16:

1 4

Referentni primer 95: Pripremanje N-{4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid prema Šemi H.

[0246]

1

Korak 1: Sinteza 2-bromo-6-fluoro-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (H-1)

[0247] Suspenzija 2-bromo-4-(bromometil)-6-fluorobenzonitrila (Int-08) (459 mg, 1.57 mmol), 1H-pirazola (159 mg, 2.34 mmol) i Cs2CO3(767 mg) u 2-Me-THF (3.1 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 5.5 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala. Smeša je podeljena između H2O (5 mL) i EtOAc (20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (5 mL), osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 0-100% EtOAc/heptan) da bi se dobio 2-bromo-6-fluoro-4-[(1H pirazol-1-il)metil]benzonitril (H-1) (295 mg, 66% prinos) kao žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.62 (d, J=1.7 Hz, 1H), 7.47 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.92 (d, J=8.9 Hz, 1H), 6.38 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.36 (s, 2H); m/z (ESI+) 280.0, 282.0 (M+H)<+>.

1

Korak 2: Sinteza 2-etil-6-fluoro-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (H-2)

[0248] Mikrotalasna bočica napunjena sa 2-bromo-6-fluoro-4-[(1H pirazol-1-il)metil]benzonitrilom (H-1) (79.3 mg, 0.283 mmol), kalijum etiltrifluoroboratom (60.0 mg, 0.441 mmol), K2CO3(108 mg, 0.778 mmol) i metansulfonato(tri-t-butilfosfino)(2"amino-1.1-bifenil-2-il)paladijum(ll) (P(t-Bu)3Pd (7.9 mg, 0.014 mmol) je zapečaćen, evakuisan i napunjen sa N2. Dodati su PhMe (0.60 mL) i dejonizovana H2O (0.30 mL) i smeša je mešana na 100 °C tokom 5 h. LCMS analiza je pokazala formiranje željene mase proizvoda. Smeša je podeljena između zasićenog vodenog rastvora NH4Cl (10 mL) i EtOAc (15 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (15 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (12 g SiO2, 0-100% EtOAc/heptan) da bi se dobio 2-etil-6-fluoro-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitril (H-2) (43.1 mg, 66% prinos) kao sivobela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.60 (d, J=1.6 Hz, 1H), 7.46 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.76 (d, J=9.2 Hz, 1H), 6.36 (t, J=2.1 Hz, 1H), 5.36 (s, 2H), 2.85 (k, J=7.6 Hz, 2H), 1.28 (t, J=7.6 Hz, 3H); m/z (APCI+) 230.1 (M+H)<+>.

Korak 3: Sinteza 4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (H-3)

[0249] U rastvor 2-etil-6-fluoro-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (H-2) (40.6 mg, 0.177 mmol) i N-hidroksiacetamida (43.9 mg, 0.585 mg) u MeCN (1.0 mL) i H2O (0.1 mL) je dodat 1,1,3,3-tetrametilguanidin (120 mg, 1.0 mmol). Smeša je mešana na 75 °C tokom 24 h. Smeša je koncentrovana do sušenja i prečišćena fleš hromatografijom (12 g SiO2, 0-100% EtOAc/heptan) da bi se dobio 4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (H-3) (13.2 mg, 31% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.60 (d, J=1.6 Hz, 1H), 7.45 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.04 (s, IH), 6.87 (s, 1H), 6.34 (t, J=2.0 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 4.35 (br. s, 2H), 2.93 (k, J=7.6 Hz, 2H), 1.34 (t, J=7.6 Hz, 3H); m/z (APCI+) 243.1 (M+H)<+>.

Korak 4: Sinteza N-{4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 95)

[0250] Suspenzija 4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (H-3) (13.2 mg, 0.055 mmol) i 2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorida (Int-26) (21.3 mg, 0.090 mmol) u

1

piridinu (0.15 mL) je mešano na 95 °C tokom 3 h. LCMS analiza je pokazala potrošnju polaznog materijala. Reakcija je koncentrovana do sušenja i prečišćena fleš hromatografijom (4 g SiO2, 0-100% EtOAc/heptan) da bi se obezbedio N-{4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Referentni primer 95) (12.0 mg, 50% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.14 (s, 1H), 7.87 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.57-7.50 (m, 1H), 7.49 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.20 (br. s, 1H), 7.06 (br. s, 1H), 6.79 (br. d, J=7.8 Hz, 2H), 6.29 (t, J=2.1 Hz, 1H), 5.46 (s, 2H), 3.77 (br. s, 6H), 3.07 (k, J=7.5 Hz, 2H), 1.21 (t, J=7.5 Hz, 3H); m/z (APCI+) 443.1 (M+H)<+>.

[0251] Primer u tabeli ispod je sintetizovan prema postupcima koji su korišćeni za sintezu N-{4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 95). Sledeći primer je sintetizovan sa nekritičnim promenama ili zamenama opisanih procedura koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 17:

1

Referentni primer 97: Priprema 5-ciklopropil-2-metoksi-N-{6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid prema Šemi J.

[0252]

Korak 1: Sinteza 5-bromo-N-[(3.5-dimetoksifenil)metil]-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (J-2)

[0253] U rastvor 5-bromo-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (J-1) (Pripremljeno kao u Referentnom primeru 01, 700 mg, 1.42 mmol), PPh3(930 mg, 3.55 mmol) i (3.5-dimetoksifenil)metanol (358 mg, 2.13 mmol) u 2-Me-THF (30 mL) na 0 °C je u kapima dodat DIAD (574 mg, 2.84 mmol). Rastvor je mešan 16 h da bi se dobila bledožuta suspenzija. Suspenzija je filtrirana, a filtrat je koncentrovan do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (40 g SiO2, 1:2 petroleum etar/EtOAc) da obezbedi 5-bromo-N-[(3.5-dimetoksifenil)metil]-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (J-2) (200 mg,

1

22% prinos) kao belu čvrstu supstancu.

Korak 2: Sinteza 5-ciklopropil-N-[(3.5-dimetoksifenil)metil]-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (J-3)

[0254] Rastvoru 5-bromo-N-[(3.5-dimetoksifenil)metil]-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (J-2) (200 mg, 0.311 mmol) u CPME (10.0 mL) i H2O (1.0 mL) je dodat kalijum ciklopropiltrifluoroborat (138 mg, 0.932 mmol), Pd(OAc)2(14.0 mg, 0.062 mmol), K2CO3(172 mg, 1.24 mmol) i X-Phos (44.4 mg, 0.093 mmol). Smeša je evakuisana i ponovo napunjena N2(3x) i zatim mešano na 100 °C u atmosferi N2za 16 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, razblažena sa EtOAc (20 mL) i filtrirana. Filtrat je koncentrovan do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (20 g SiO2, EtOAc) da obezbedi 5-ciklopropil-N-[(3.5-dimetoksifenil)metil]-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (J 3) (100 mg, 53% prinos) kao bela čvrsta supstanca. m/z (ESI+) 605.3 (M+H)<+>.

Korak 3: Sinteza 5-ciklopropil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 97)

[0255] U rastvor 5-ciklopropil-N-[(3.5-dimetoksifenil)metil]-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (J 3) (100 mg, 0.165 mmol) u DCM (2.0 mL) je dodat TFA (2.0 mL). Smeša je mešana 1 h i zatim koncentrovana do sušenja. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (12 g SiO2, 1:10 MeOH/EtOAc). Materijal je ponovo prečišćen preparativnom HPLC sa Phenomenek Gemini-NX kolonom (150x30 mm, veličina čestica 5 µm), koja je eluirana sa 2-42% MeCN/H2O (+0.05% NH4OH) sa brzinom protoka od 30 mL/min da bi se dobio 5-ciklopropil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 97) (50 mg, 67% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (br s, IH), 7.88 (d, J=1.9 Hz, 1H), 7.51 (dd, J=1.6, 11.0 Hz, 2H), 7.27 (br. d, J=6.8 Hz, 1H), 7.05 (br. d, J=8.9 Hz, 1H), 6.82 (br. s, 1H), 6.72 (br. s, 1H), 6.30 (t, J=1.9 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 3.83 (s, 2H), 3.90 (br. d, J=8.3 Hz, 1H), 3.73 (s, 2H), 3.76-3.67 (m, 1H), 2.01-1.89 (m, 1H), 1.04-0.78 (m, 2H), 0.70-0.42 (m, 2H). m/z (ESI+) 454.8 (M+H)<+>.

Referentni primer 98: Priprema N-(6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-

11

metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamid [ili 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida] prema Šemi K.

[0256]

Korak 1: Alternativna sinteza 4-((1H-pirazol-1-il)metil)-2-fluoro-6-metoksibenzonitrila (A-1) iz 14b

[0257] Rastvor 1H-pirazola (2.0 g, 29.6 mmol) i NaH (60% zapr/zapr disperzija u mineralnom ulju, 1.5 g, 37.1 mmol) u DMF (520 mL) je mešan na 0 °C tokom 1 h. Rastvor 4-(bromometil)-2-fluoro-6-metoksibenzonitrila (14bZatim je dodat (6.0 g, 24.7 mmol) u DMF (80 mL) i smeša je mešana na RT preko noći. Reakcija je ugašena vodom i smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Pet. etar/EtOAc = 6/1) da bi se dobilo 4-((1H-pirazol-1-il)metil)-2-fluoro-6-metoksibenzonitril (A-1) (2.4 g, 42%) kao žuta čvrsta supstanca. m/z 232.0 [M+H]<+>.

Korak 2: Alternativna sinteza 6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-amin (A-2) korišćenjem kalijum terc-butoksida

[0258] U rastvor acetohidroksamne kiseline (3.7 g, 49.5 mmol) u anhidrovanom DMF (150 mL) na RT dodat je kalijum terc-butoksid (5.6 g, 49.5 mmol) i smeša je mešana na RT tokom 1 h. Zatim je dodat 4-((1H-pirazol-1-il)metil)-2-fluoro-6-metoksibenzonitril (A-1) (3.8 g, 16.5 mmol) i mešanje je nastavljeno na 60 °C tokom 4 h. Dodata je voda i smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Pet. Etar/EtOAc = 5/1) da bi se dobilo 6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-amin (A-2) (2.1 g, 53%) kao žuta čvrsta supstanca. m/z 245.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.87 (dd, J=1.6, 0.4 Hz, 1H), 7.50 (dd, J=1.6, 0.4 Hz, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.30 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.93 (s, 2H), 5.41 (s, 2H), 3.86 (s, 3H).

Korak 3: Sinteza N-(6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Referentni primer 98)

[0259] Smeša 6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-amina (A-2) (50 mg, 0.205 mmol) i 2,6-dimetoksibenzensulfonil hlorida (Int-26) (73 mg, 0.308 mmol) u piridinu (1 mL) je zagrevana na 120 °C tokom 2 h pod mikrotalasnim zračenjem (Serija 1).

[0260] Smeša 6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-amina (A-2)(500 mg, 2.1 mmol) i 2,6-dimetoksibenzensulfonil hlorida (Int-26) (746 mg, 3.2 mmol) u piridinu (5 mL) je zagrevana na 120 °C tokom 2 h pod mikrotalasnim zračenjem (Serija 2). Ova reakcija je ponovljena još jednom na potpuno istoj skali (serija 3).

[0261] Smeša 6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-amina (A-2)(350 mg, 1.4 mmol) i 2,6-dimetoksibenzensulfonil hlorida (Int-26) (509 mg, 2.2 mmol) u piridinu (4 mL) je zagrevana na 120 °C tokom 2 h pod mikrotalasnim zračenjem (Serija 4). Četiri reakcione smeše su kombinovane, razblažene vodom, podešena na pH 5-6 sa 2 M vodenim rastvorom HCl i ekstrahovana sa EtOAc (300 mL × 3). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Pet. etar/EtOAc = 2/1) da bi se dobio N-(6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamid (Referentni Primer 98) (1.07 g, 43%) kao bela čvrsta supstanca. m/z 445.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (s, IH), 7.87 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.50 - 7.46 (m, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.76 (m, 3H), 6.30 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 3.87 (s, 3H) , 3.76 (s, 6H).

Referentni primer 98: Alternativno pripremanje 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida prema Šemi L.

[0262]

Korak 1: Alternativna sinteza 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (A-2) korišćenjem 1,1,3,3-tetrametilguanidina.

[0263] Suspenzija 2-fluoro-6-metoksi-4-(1H-pirazol-1-ilmetil)benzonitrila (A-1) (15.43 g, 66.7 mmol), N-hidroksiacetamida (15.0 g, 200 mmol) i 1,1,3,3-TMG (46.1 g, 400 mmol) u acetonitrilu (270 mL) i dejonizovanoj vodi (30 mL) su zagrevani na 60 °C tokom 7 sati. Acetonitril je uklonjen pod vakuumom, a zaostalo gusto ulje je podeljeno između etil acetata (300 mL) i dejonizovane vode (250 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom (2 × 150 mL). Svi organski slojevi su kombinovani i isprani sa zas. aq. NaCl. Neke čvrste materije su počele da se formiraju u organskom sloju, pa je dodat metanol (~10 mL) i suspenzija je zagrevana do homogenosti. Posle hlađenja do sobne temperature, organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan. Dobijena bledo žuta čvrsta supstanca je

11

suspendovana u etil acetatu (125 mL) i kratko zagrevana do refluksa. Suspenzija je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, rezultujuća čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, a filter kolač je ispran heptanom. Filtrat i ispiranje heptana su koncentrovani do sušenja, zaostala čvrsta supstanca suspendovana u etil acetatu (15 mL), suspenzija je kratko zagrejana do refluksa, a drugi deo taloga je sakupljen kao ranije. Kombinovani delovi taloga su sušeni pod vakuumom da bi se dobio 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (A-2) (11.86 g, 48.6 mmol) kao bledožuti prah.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7<.>87 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.49 (d, J=1.2 Hz, 1H), 6.69 (s, IH), 6.62 (s, 1H), 6.30 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.93 (s, 2H), 5.41 (s, 2H), 3.86 (s, 3H). LCMS: [M+H]<+>245.

Korak 2: Sinteza 22,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 98)

[0264] Smeša 4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (A-2) (9.5 g, 39 mmol) i 2,6-dimetoksibenzensulfonil hlorida (Int-26) (12.1 g, 51.1 mmol) u piridinu (20 mL) je zagrevana na 97 °C interno 1 sat. Posle hlađenja na 50 °C, rastvor je sipan u balon koji je sadržao usitnjeni led (200 g) i 6N HCl (100 mL). Reakcioni balon je ispran dihlorometanom da se kvantifikuje transfer. Dobijena vodena smeša je ekstrahovana dihlorometanom (4 k 100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani dejonizovanom vodom i zas. aq. NaCl, osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do žute pene. Metil acetat (50 mL) je dodat u penu i suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Čvrste materije su sakupljene usisnom filtracijom i isprane heptanom. Nakon sušenja pod vakuumom, sirovi 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(1H-pirazol-1-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamid (Referentni primer 98)(16.1 g, 95%) je dobijen kao narandžasto-smeđa čvrsta supstanca. Trituracija sirove čvrste supstance sa metil acetatom još dva puta nije uklonila narandžastu boju, pa je sirovi proizvod triturisan u toplom dihlorometanu, ostavljen da se ohladi na sobnu temperaturu i filtriran da bi se dobila kremasta bela čvrsta supstanca. Matična tečnost dihlormetana je dalje prečišćena hromatografijom (330 g kolona silicijum dioksida, eluiranjem sa 60-100% etil acetata u heptanu) da bi se dobila bela čvrsta supstanca. Čvrste materije i DCM trituracije i hromatografije DCM filtrata su kombinovane, mešane u metil acetatu uz refluksovanje i ohlađene do sobne temperature tokom 2 sata. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena usisnom filtracijom i osušena u vakuumskoj peći na 100 °C preko noći, dajući prečišćeni 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(1H-pirazol-1-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamid (Referentni primer 98) (15.3 g, 89%) kao prljavo beli prah.

[0265] Tri serije Referentnog primera 98 (ukupno 54.3 g), pripremljeni kao što je gore opisano, su kombinovani, suspendovani u metil acetatu (250 mL) i zagrevani do refluksa 1 sat. Nakon uklanjanja iz kupatila za grejanje, mešanje je nastavljeno tokom 4 sata dok se smeša hladila do sobne temperature. Dobijeni precipitat je sakupljen filtracijom i ispran heptanom. Čvrsta supstanca je sušena pod vakuumom na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, a zatim dalje sušena u peći u vakuumu na 130 °C tokom 16 sati, dajući 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(1H-pirazol-1-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamid (Referentni primer 98) (53.55 g, 99%) kao prljavo belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.60 (s, IH), 7.88 (d, J=1.7 Hz, 1H), 7.45-7.52 (m, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.77 (d, J=8.4 Hz, 3H), 6.30 (t, J=2.1 Hz, IH), 5.44 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.76 (s, 6H). LCMS: [M+H]<+>445. Anal. Izračunati za C20H20N4O6S: C, 54.05; H, 4.54; N, 12.61; S, 7.21. Nađeno: C, 53.91; H, 4.58; N, 12.51; S, 7.09.

Referentni primer 99: Pripremanje N-(6-((1H-pirazol-1-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-3-metilhinolin-8-sulfonamida prema Postupku AC.

[0266]

Referentni primer 100: Priprema 2,6-dimetoksi-N-(4-metoksi-6-((4-metil-1H-pirazol-1-il)metil)benzo[d]izoksazol-3-il)benzensulfonamida prema Postupku AC.

[0267]

[0268] Rastvoru amina (0.2 mmol, 1.0 ekv.) u piridinu (2 mL) dodat je sulfonil hlorid (1.5 ekv.) i smeša je zagrevana na 120 °C pod mikrotalasnim zračenjem tokom 2 h. Smeša je

11

podeljena između vode i EtOAc, slojevi su razdvojeni, a organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen prep. TLC da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. Varijacije gore navedenih uslova su zabeležene u tabeli 18.

Tabela 18

11

Referentni primer 101: Priprema 2,6-dimetoksi-N-(4-metoksi-6-(1-metil-1H-pirazol-4-il)benzo[d]izoksazol-3-il)benzensulfonamida prema Šemi M.

[0269]

[0270] Rastvoru N-(6-bromo-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Int-27) (40 mg, 0.09 mmol) u 1.4-dioksanu (8 mL) i vodi (2 mL) dodati su (1-metil-1H-pirazol-4-il)borna kiselina (80 mg, 0.631 mmol), Na2CO3(100 mg, 0.948 mmol) i Pd(PPh3)4(37 mg, 0.032 mmol) i smeša je zagrevana na refluksu pod N2atmosferom preko noći. Smeša je podešena na pH 4-5 sa 1 M vodenim rastvorom HCl, razblažena sa EtOAc i isprana vodom, slanim rastvorom, osušena preko Na2SO4, filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen prep. TLC (DCM/MeOH = 50/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (22 mg, 55%) kao bela čvrsta supstanca. m/z 445.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.52 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.50 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.38 (s, IH), 7.05 (s, 1H), 6.78 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.78 (s, 6H).

11

Referentni primer 102: Priprema 2,6-dimetoksi-N-(5-metil-7-(1-metil-1H-pirazol-4-il)benzo[d]izoksazol-3-il)benzensulfonamida prema Šemi N.

[0271]

[0272] Rastvoru N-(7-bromo-5-metilbenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Int-29)(50 mg, 0.117 mmol) u 1.4-dioksanu (8 mL) i vodi dodati su (2 mL) (1-metil-1H-pirazol-4-il)borna kiselina (22 mg, 0.176 mmol), Na2CO3(50 mg, 0.468 mmol) i Pd(dppf)Cl2(9 mg, 0.012 mmol) i smeša je zagrevana na refluksu pod N2atmosferom preko noći. Smeša je podešena na pH 5 sa 1 M vodenim rastvorom HCl, razblažena vodom i ekstrahovana sa EtOAc (30 mL × 3). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen prep. TLC (Pet. Etar/EtOAc = 3/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (24 mg, 48%) u obliku bele čvrste supstance. m/z 429.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.24 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.49 - 7.22 (m, 2H), 6.67 (d, J=8.6 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.69 (s, 6H), 2.39 (s, 3H).38 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.78 (d, J=8.5 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.78 (s, 6H).

Referentni primer 103: Priprema 3-hidroksi-2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida prema Šemi O.

[0273]

11

Referentni primer 104: Priprema 2-hidroksi-6-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il)benzen-1-sulfonamida prema Šemi O.

[0274]

Referentni primer 105: Priprema N-{6-[(4-hidroksi-1H-pirazol-1-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1 -sulfonamida prema Šemi O.

[0275]

11

[0276] U Erlenmajer balon od 500 mL je dodata H2O (27.2 mL) HPLC gradusa, vodeni kalijum fosfatni pufer (1.0 M, 4.0 mL, pH 7.5), vodeni rastvor MgCl2(165 mM, 0.8 mL), mikrozomi jetre muških pacova izazvanih deksametazonom (4.0 mL, 20 mg/mL, Xenotech) i rastvor 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (pripremljen kao u Referentnom primeru 98, 5 mM u MeCN, 0.20 mL, 1.0 µmol). Inkubacija je započeta dodavanjem sveže pripremljenog vodenog rastvora NADPH (4.0 mL, 13 mM). Nezatvorena Erlenmajerova boca je mućkana u vodenom kupatilu održavanom na 37 °C tokom 1.5 h. Inkubaciona smeša je ugašena dodavanjem MeCN (40 mL) nakon čega je usledilo centrifugiranje na ~1700 g tokom 5 min. Supernatant je delimično uparen u vakuum centrifugi. Preostali rastvor je tretiran sa MeCN (0.5 mL), čistom mravljom kiselinom (0.5 mL) i dejonizovanom H2O da obezbedi konačnu zapreminu od ~50 mL. Rastvor je podvrgnut centrifugiranju na -40.000 g tokom 30 min. Supernatant je adsorbovan na Zorbax Polaris C18-A HPLC kolonu (250k4.6 mm, veličina čestica 5 µm) korišćenjem JASCO PU-1580 HPLC pumpe pri brzini protoka od 0.8 mL/min tokom ~60 min. HPLC kolona je prebačena u Thermo LTK Velos maseni spektrometar povezan sa Waters Acquity UHPLC instrumentom koji se sastoji od kvaternarne pumpe, autosamplera i UV/vis detektora sa fotodiodnim nizom. Gradijent MeCN/H2O (+0.1% mravlje kiseline) je primenjen na odvojene proizvode od interesa. Nakon prolaska kroz PDA detektor, eluent je

12

podeljen u odnosu od približno 15:1, pri čemu je veći deo otišao u kolektor frakcija, a manji deo u maseni spektrometar. Frakcije su sakupljane svakih 20 s, a one koje sadrže pikove od interesa su analizirane pomoću UHPLC-UV-HRMS koristeći Thermo Orbitrap Elite maseni spektrometar visoke rezolucije za hvatanje jona povezan sa Thermo Accela UHPLC i UV/vis detektorom sa diodnim nizom sa CTC Analytics Leap autoinjector (Thermo-Fisher). Uzorci su ubrizgani (10 µL) u Phenomenex KinetexC18 UHPLC kolonu (50x2.1 mm, veličina čestica 1.7 µm) održavanu na 45 °C, koja je eluirana sa MeCN/H2O (+0.1% mravlje kiseline) gradijent sa brzinom protoka od 0.4 mL/min. Posle UHPLC-UV-HRMS analize, frakcije su sakupljene, a rastvarač je uklonjen vakuum centrifugiranjem. Osušeni uzorci su analizirani NMR spektroskopijom i kvantifikovani eksternom kalibracijom prema<1>H NMR spektar standardnog rastvora 5<.>0 mM benzojeve kiseline u DMSO-d6koristeći funkciju ERETIC2 u okviru Topspin V3.2. N-{6-[(4-hidroksi-1H-pirazol-1-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Referentni primer 105) (0.028 umol, 3% prinos) je dobijen kao prvi eluirani pik.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.45 (s, 1H), 7.38 (m, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.70 (m, 3H), 6.63 (s, 1H), 5.22 (s, 2H) , 3.86 (s, 3H), 3.69 (s, 6H). HRMS (ESI-TOF) izračunat za (C20H21N4O7S)[M+H]<+>m/z = 461.1125, nađeno 461.1121 (-0.45 ppm). 3-hidroksi-2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 103) (0.072 umol, 7% prinos) je dobijen kao drugi eluirani pik.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.33 (s, IH), 7.88 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.01 (d, J=9.0 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.76 - 6.68 (m, 2H), 6.31 (t, J=2.3 Hz, IH), 5.44 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.65 (s, 3H). HRMS (ESI-TOF) izračunat za (C20H21N4O7S)[M+H]<+>m/z = 461.1125, nađeno 461.1123 (-0.25 ppm).2-hidroksi-6-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Referentni primer 104) (0.19 µmol, 19% prinos) je dobijen kao treći eluirani pik.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.86 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.13 (m, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.53 (m, 2H), 6.40 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.30 (s, 1H), 5.41 (s, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.72 (s, 3H). HRMS (ESI-TOF) izračunat za (C19H19N4O6S) [M+H]<+>431.1020, pronađeno 431.1017 (-0.28 ppm).

Referentni primer 106: Priprema N-{6-[hidroksi(piridin-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzensulfonamida prema Šemi P.

[0277]

Referentni primer 107: Priprema 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(piridin-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamida prema Šemi P.

[0278]

Korak 1: Sinteza N-(6-[hidroksi(piridin-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Referentni primer 106):

[0279] Rastvor N-(6-bromo-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Int-27) (628 mg, 1.42 mmol) u anhidrovanom THF (20 mL) je ohlađen na -78 °C. n-BuLi (1.20 mL 2.5 u heksanu, 3.00 mmol) je dodat u kapima. Dobijena suspenzija je mešana na -78 °C tokom 1 h. Zatim je u kapima dodat rastvor piridin-2-aldehida (187 mg, 1.75 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL). Dobijena reakciona smeša je mešana na -78 °C tokom 1 h.

[0280] Dodato je još piridin-2-aldehida (75 mg, 0.71 mmol) u 1 mL anhidrovanog THF. Dobijena reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Reakcija je ugašena sa HOAc (0.5 mL). Ugašena reakciona smeša je podeljena između EtOAc (50 mL) i vode (50 mL). Organska faza je odvojena, isprana slanim rastvorom, osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i prečišćena fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 0-100% EtOAc u heptanu, zatim 0-20% 2-PrOH u EtOAc da bi se dobio N-{6-[hidroksi(piridin-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzensulfonamid (Referentni primer 106) kao čvrsta supstanca (247 mg, 37%).

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (d, J=4.9 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.82 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.42-7.33 (m, 3H), 7.10 (s, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.58 (d, J=8.4 Hz, 2H), 5.99 (s, IH), 4.01 (s, 3H), 3.88 (s, 6H). m/z 472.2 [M+H].

Korak 2: Sinteza N-(6-(hloro(piridin-2-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (P-1):

[0281] Rastvoru N-{6-[hidroksi(piridin-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Referentni primer 106) (113 mg, 0.240 mmol) u anhidrovanom DCM (5 mL) je dodat SOCl2(0.20 mL, 2.7 mmol). Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 h. Rastvarač je uklonjen, a rezultujući ostatak je podeljen između EtOAc (50 mL) i zas. vodenog rastvora NaHCO3(50 mL).

[0282] Organska faza je odvojena, osušena preko natrijum sulfata i koncentrovana da bi se dobilo N-(6-(hloro(piridin-2-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamid (P-1) (78 mg, 66% prinos) koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.57 (br. d, J=4.2 Hz, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.75 (dt, J=1.7, 7.8 Hz, 1H), 7.57 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.37 (t, J=8.5 Hz, 1H), 7.27-7.22 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.57 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.17 (s, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.87 (s, 6H), nedostaje sulfonamid NH; m/z 490.1 [M+H]<+>.

Korak 3: Sinteza 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(piridin-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamida (Referentni primer 107):

[0283] Rastvoru N-(6-(hloro(piridin-2-il)metil)-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (P-1) (75 mg, 0.153 mmol) u HOAc (5 mL) je dodat prah cinka (69 mg, 1.1 mmol) i rastvor je zagrejan do 60 °C. Posle 3 h na 60 °C, reakcija je završena. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i pažljivo neutralizovana zasićenim NaHCO3. Organski slojevi su ekstrahovani sa EtOAc (2 × 50 mL) i kombinovani organski ekstrakt je osušen preko natrijum sulfata, koncentrovan do sušenja i prečišćen fleš hromatografijom

12

eluiranjem sa gradijentom od 0 - 100% EtOAc u heptanu, a zatim sa 0 - 20% 2-POH u EtOAc. Koncentracija čistih frakcija je dala 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(piridin-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamid (Referentni primer 107) (38 mg, 55% u dva koraka) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.57 (br. s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.65 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.37 (t, J=8.5 Hz, 1H), 7.19 (br. d, J=6.6 Hz, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.64-6.53 (m, 3H), 4.23 (s, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.87 (s, 6H). m/z 456.3 [M+H].

Referentni primer 108: Priprema N-{6-[(S*)-hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2.6 -dimetoksibenzensulfonamida prema Šemi K.

[0284]

Referentni primer 109: Pripremanje N-(6-[(R*)-hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzensulfonamida prema Šemi K.

[0285]

Referentni primer 110: Priprema 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(1,3-oksazol-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamida prema Šemi K.

[0286]

Korak 1: Sinteza N-(6-bromo-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Q-1)

[0287] Rastvoru N-(6-bromo-4-metoksibenzo[d]izoksazol-3-il)-2,6-dimetoksibenzensulfonamida (Int-27) (15 g, 34 mmol) u THF (300 mL) i 2,4-dimetoksibenzil alkohola (8.54 g, 50.8 mmol), PPh3(22.2 g, 84.6 mmol) je dodat DIAD (13.7 g, 67.7 mmol) kap po kap na 0 °C. Reakcioni rastvor je zagrejan do sobne temperature i ostavljen da se meša 16 h. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc (300 mL), isprana vodom (150 mL), slanim rastvorom, zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i ponovo slanim rastvorom. Organska faza je osušena preko natrijum sulfata i filtrirana. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobila smeša koja je prečišćena fleš hromatografijom eluiranjem sa 60%-70% EtOAc u petroleum etru da bi se dobio sirovi proizvod sa malo preostalog trifenilfosfin oksida. Sirova čvrsta supstanca je ponovo kristalizovana iz MeOH da bi se dobio N-(6-bromo-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Q-1) (8.0 g, 40% prinos) kao bela

12

čvrsta supstanca.

Korak 2: Sinteza rac-N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-N-(6-[hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Q-2)

[0288] Rastvoru N-(6-bromo-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il)-N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Q-1) (500 mg 0.843 mmol) u THF (9.5 mL) je dodat n-BuLi (0.506 mL 2.5 M rastvora u heksanu, 1.26 mmol) kap po kap na -78 °C u atmosferi argona. Posle 30 minuta na -78 °C, dodat je oksazol-2-karbaldehid (123 mg 1.26 mmol) kao rastvor u THF (0.5 mL). Reakcija je polako ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana 16 h. Reakciona smeša je sipana u zasićeni vodeni rastvor NH4Cl (20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa dva dela EtOAc (2 × 20 mL). Kombinovani ekstrakt je ispran slanim rastvorom (20 mL), osušen preko MgSO4i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa 100% EtOAc da bi se dobio rac-N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-N-{6-[hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Q-2) (150 mg, 29% prinos) kao žuta guma.

Korak 3: Sinteza N-{6-[(S*)-hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6- dimetoksibenzensulfonamid (Primer 108) i N-{6-[(R*)-hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-ii)-2.6 -dimetoksibenzensulfonamida (Referentni primer 109)

[0289] Rastvoru rac-N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-N-{6-[hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2, 6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Q-2) (150 mg 0.245 mmol) u TFA (5 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 2 h. Uočen je ružičasti rastvor i reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu. Ostatak je prethodno prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa EtOAc/MeOH 10:1 da bi se dobila racemska smeša Primera 108 i 109 koja je podvrgnuta hiralnom SFC prečišćavanju. Jedinjenja su odvojena jedno od drugog korišćenjem ChiralpakAS-3 100x4.6mm I.D., 3um kolone sa mobilnom fazom koja se sastoji od CO2(A) i etanola sa 0.05% DEA (B). Gradijentno eluiranje od 5% do 40% B za 4 min i držanje 40% B tokom 2.5 min, zatim 5% B tokom 1.5 min. Posle hiralnog odvajanja SFC dobijeno je 20 mg svakog proizvoda. Pik 1 = Referentni primer 108<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.06 (d, J=0.6 Hz, 1H), 7.45 (br. t, J=8.4 Hz, 1H), 7.18 (d, J=0.6 Hz, 1H), 7.15 (s, IH), 6.86 (s, 1H), 6.74 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.67 (d, J=5.1 Hz, 1H), 5.93 (d, J=5.3

12

Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.74 (s, 6H), nedostaje sulfonamid NH pik; m/z 462.0 (M+H)<+>. Pik 2 = Referentni primer 109<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.06 (d, J=0.6 Hz, 1H), 7.50 (t, J=8.5 Hz, 1H), 7.13-7.26 (m, 2H), 6.90 (s, 1H), 6.78 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.70 (d, J=5.4 Hz, 1H), 5.95 (d, J=5.3 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.78 (s, 6H), nedostaje sulfonamid NH pik; m/z 462.0 (M+H)<+>.

Koraci 4 i 5: Sinteza N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1,3-oksazol-2-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Q-3)

[0290] Rastvoru rac-N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-N-{6-[hidroksi(1,3-oksazol-2-il)metil]-4-metoksi-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Q-2) (150 mg 0.245 mmol) u DCM (5 mL) je dodat tionil hlorid (290 mg 2.44 mmol) na sobnoj temperaturi. Rastvor je mešan 1 h dok se formirao bledožuti rastvor. Reakcija je završena pomoću TLC i smeša je ugašena vodom (20 mL) i ekstrahovana sa DCM (20 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan da bi se dobio sekundarni hlorid (150 mg, žuto ulje) koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. U rastvor sekundarnog hlorida (150 mg, 0.238 mmol) u HOAc (5 mL) dodat je cink prah (467 mg, 7.14 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakcija je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi 1 h. Reakcija je završena pomoću TLC i smeša je razblažena sa EtOAc (50 mL) i filtrirana. Filtrat je podešen na pH 7-8 korišćenjem zas. aq. Na2CO3. Organski sloj je osušen preko Na2SO4i koncentrovan da bi se dobio ostatak koji je prečišćen fleš hromatografijom da bi se dobio N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1,3-oksazol-2-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid (Q-3) (80 mg) kao žuto ulje.

Korak 6: Sinteza 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(1,3-oksazol-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamida (Referentni primer 110)

[0291] Rastvor N-[(2,4-dimetoksifenil)metil]-2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(1,3-oksazol-2-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Q-3) (80 mg 0.13 mmol) u TFA (5 mL) je mešan 1 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je koncentrovana i prethodno prečišćena fleš hromatografijom eluiranjem sa EtOAc/MeOH 10:1. Dobijeni sirovi proizvod je dalje prečišćen prep. HPLC i čiste frakcije su zamrznute i liofilizovane da bi se dobilo 10 mg proizvoda koji je još uvek kontaminiran nečistoćom kako je utvrđeno pomoću<1>H NMR. Ovaj uzorak je dalje prečišćen prep. TLC da bi se dobio 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(1,3-

12

oksazol-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamid (Referentni primer 110) (5 mg, 8.4% prinos) kao bela čvrsta supstanca. m/z 446.0 (M+H)<+>;<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ 7.87 (s, IH), 7.43 (t, J=8.5 Hz, 1H), 7.14 (s, IH), 6.92 (s, 1H), 6.72 (d, J=8.5 Hz, 3H), 4.34-4.11 (m, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.81 (s, 7H).

Referentni primer 111: Priprema 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(pirazin-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamida prema Šemi R.

[0292]

Korak 1: Sinteza 2-fluoro-4-[hidroksi(pirazin-2-il)metil]-6-metoksibenzonitrila (R-2).

[0293] Balon sa okruglim dnom od 250 mL sa tri grla je opremljen termometrom, šipkom za mešanje i ulazom za azot. Boca je napunjena 4-bromo-2-fluoro-6-metoksibenzonitrilom (1b) (4.00 g, 17.4 mmol) i 100 mL anhidrovanog THF. Balon je zatvoren čepom na septumu, ispran atmosferom azota i ohlađen na -20 °C (led/MeOH kupatilo). iPrMgCl-LiCl (17.5 mL 1.3 M, 22.8 mmol) je dodat u kapima, uz održavanje temperature ispod -15 °C. Dobijena smeša je mešana na -20 °C 1 h. Zatim je dodat pirazin-2-karboksaldehid (2.95 g, 1.57 mmol) kao rastvor u 20 mL anhidrovanog THF uz održavanje temperature ispod -10 °C. Dobijena reakcija je mešana na -10 °C tokom 1 h i zatim ugašena sa 4 N HCl (10 mL). Ugašena reakciona smeša je podeljena između EtOAc (200 mL) i vode (200 mL). Organska faza je odvojena, a vodena faza je ponovo ekstrahovana sa EtOAc (1 × 100 mL). Kombinovane organske faze su osušene preko Na2SO4, koncentrovane do sušenja i prečišćene fleš hromatografijom koristeći gradijent od 20 - 100% EtOAc u heptanu da bi se dobio 2-fluoro-

12

4-[hidroksi(pirazin-2-il)metil]-6-metoksibenzonitril (R-2) (2.6 g, prinos 58%) kao guma. m/z 260.0 (M+H)<+>;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.67 (d, J=0.7 Hz, 1H), 8.56-8.50 (m, 2H), 6.93 (s, 1H), 6.87 (d, J=9.2 Hz, IH), 5.88 (s, IH), 4.57 (br. s, IH), 3.94 (s, 3H).

Koraci 2-4: Sinteza 2-fluoro-6-metoksi-4-[(pirazin-2-il)metil]benzonitrila (R-3).

[0294] U rastvor 2-fluoro-4-[hidroksi(pirazin-2-il)metil]-6-metoksibenzonitrila (R-2) (145 mg, 0.559 mmol) i Et3N (0.120 mL, 0.861 mmol) u anhidrovanom THF (10 mL) na 0 °C je dodat metansulfonil hlorid (0.050 mL, 0.64 mmol). Dobijena smeša je zagrejana do sobne temperature i mešana 30 min. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (30 mL), isprana vodom (1 × 30 mL) i zas. aq. NaHCO3(1 × 30 mL). Ekstrakt je osušen preko Na2SO4i koncentrovan do sušenja. Materijal je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. Smeša sirovog mezilata (173 mg, 0.513 mmol) i LiBr (137 mg, 1.58 mmol) u anhidrovanom DMF (4 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Reakciona smeša je podeljena između EtOAc (50 mL) i vode (50 mL). Organska faza je odvojena, isprana vodom (1 × 50 mL) i slanim rastvorom (1 × 50 mL), osušena preko Na2SO4, i koncentrovana. Prečišćavanje fleš hromatografijom je obavljeno korišćenjem gradijenta od 0 - 100% EtOAc u heptanu da bi se dobilo 72 mg (44%) sekundarnog bromida. Sekundarni bromid (43 mg, 0.13 mmol) i prah cinka (90 mg, 1.4 mmol) su mešani na 80 °C u HOAc (2 mL) tokom 8 h. Posle hlađenja do sobne temperature, reakcija je razblažena sa EtOAc (50 mL) i pažljivo isprana sa zasićenim zas. aq. NaHCO3(50 mL). Organski sloj je zatim ispran slanim rastvorom (1 × 50 mL) i osušen preko Na2SO4. Nakon koncentrovanja do sušenja, sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom 0-100% EtOAc u heptanu da bi se dobilo 10 mg (31%) 2-fluoro-6-metoksi-4-[(pirazin-2-il). )metil]benzonitril (R-3) (10 mg, 31% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) 88.56 (br. s, 3H), 6.74 - 6.69 (m, 2H), 4.18 (s, 2H), 3.94 (s, 3H); m/z 244.0 (M+H)<+>.

Koraci 5-6: Sinteza 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(pirazin-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamida (Referentni primer 111).

[0295] U smešu 2-fluoro-6-metoksi-4-[(pirazin-2-il)metil]benzonitrila (R-3) (178 mg, 0.732 mmol) i N-hidroksiacetamida (165 mg, 2.20 mmol) u CH3CN (5 mL) i vode (0.5 mL) je dodat 1,1,3,3-tetrametilguanidin (0.55 mL, 4.4 mmol). Dobijena reakciona smeša je mešana na 60 °C tokom 16 h i zatim ohlađena do sobne temperature. Rastvarač je uklonjen, a

12

rezultujući ostatak je podeljen između EtOAc i vode. Organska faza je odvojena, a vodena faza je ekstrahovana drugi put sa EtOAc (50 mL). Kombinovani organski ekstrakt je osušen preko Na2SO4, koncentrovan do sušenja i prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 40-100% EtOAc u heptanu. Ovo je dalo 82 mg (44%) aminskog intermedijera kao ulja.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.68 (d, J=1.1 Hz, 1H), 8.60 - 8.55 (m, 1H), 8.51 (d, J=2.6 Hz, 1H), 6.91 (s, IH), 6.69 (s, 1H), 5.87 (br. s, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.88 (s, 3H); m/z 257.1 (M+H)<+>. Amin (73 mg, 0.28 mmol) iz gornje reakcije je tretiran sa 2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hloridom (Int-26) (100 mg, 0.43 mmol) i piridinom (2 mL). Reakciona smeša je mešana na 110 °C tokom 3 h. Zatim, dodatni 2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonil hlorid (Int-26) (50 mg, 0.21 mmol) je dodat i zagrevanje na 110 °C je nastavljeno još 1 h. Posle hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je podeljena između etil acetata (20 mL) i 2N HCl (20 mL). Organska faza je odvojena, osušena preko Na2SO4i prečišćena fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 20 - 100% EtOAc u heptanu nakon čega sledi drugi gradijent od 0 - 20% 2-PrOH u EtOAc da bi se dobio 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(pirazin-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamid (Referentni primer 111) (44 mg, 34% prinos) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.50 (s, IH), 8.68 (d, J=1.0 Hz, 1H), 8.58 - 8.53 (m, 1H), 8.50 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.49 (t, J=8.5 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.77 (d, J=8.6 Hz, 2H), 4.25 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.77 (s, 6H); m/z 456.8 (M+H)<+>.

[0296] Primeri i referentni primeri u tabeli u nastavku su sintetizovani prema postupcima korišćenim za sintezu 2,6-dimetoksi-N-[4-metoksi-6-(pirazin-2-ilmetil)-1,2-benzoksazol-3-il]benzensulfonamida (Referentni primer 111). Sledeći primeri su sintetizovani sa nekritičnim promenama ili supstitucijama opisanih postupaka koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje. Ako je potrebno, odvajanje regioizomernih smeša je sprovedeno prema standardnim postupcima poznatim u tehnici, kao što su SFC ili HPLC, i sprovedeno je u bilo kom pogodnom koraku u sintetičkoj sekvenci.

1

Tabela 19

11

12

1

Referentni primer 128: Priprema N-{5-fluoro-4-metoksi-6-[(lH-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1 -sulfonamida prema Šemi S.

[0297]

1 4

Korak 1: Sinteza metil 4-(benzilamino)-2,5-difluoro-3-metoksibenzoata (S-1).

[0298] Rastvor benzilamina (38.0 mL, 347 mmol), metil 2.4,5-trifluoro-3-metoksibenzoata (51.0 g, 232 mmol) i trietilamina (161 mL, 1160 mmol) u DMSO (500 mL) je zagrejan na 100 °C tokom 18 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, smeša je sipana u vodu i ekstrahovana etil acetatom. Organska faza je isprana sa zas. aq. NaCl, osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (eluiranje sa 5/1 pet. etar/etil acetat) da bi se dobio metil 4-(benzilamino)-2,5-difluoro-3-metoksibenzoat (S-1) (41 g, 57% prinos) kao svetlo žuto ulje. LCMS m/z 308.1 [M+H]<+>;<1>H NMR (400MHz, HLOROFORM-d) 57.43 - 7.20 (m, 6H), 4.74 (br s, 1H), 4.63 (br s, 2H), 3.97 - 3.80 (m, 6H).

Korak 2: Sinteza metil 4-amino-2,5-difluoro-3-metoksibenzoata (S-2).

[0299] Rastvor metil 4-(benzilamino)-2,5-difluoro-3-metoksibenzoata (S-1) (41 g, 133 mmol) u metanolu (500 mL) je tretirano sa Pd/C (7.0 g) i mešano na 50 °C pod vodonikom (45 psi) tokom 48 sati. Suspenzija je filtrirana kroz jastučić od celita<®>i filtrat je koncentrovan da bi se dobio metil 4-amino-2,5-difluoro-3-metoksibenzoat (S-2) (28.0 g, 96% prinos) kao sivobela čvrsta supstanca. LCMS m/z 217.9 [M+H]<+>;<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.27 (dd,

1

J=6.3, 11.6 Hz, 1H), 6.21 (s, 2H), 3.77 (d, J= 1.1 Hz, 6H).

Korak 3: Sinteza metil 4-cijano-2,5-difluoro-3-metoksibenzoata (S-3)

[0300] Suspenzija metil 4-amino-2,5-difluoro-3-metoksibenzoata (S-2) (28.0 g, 129 mmol) i bakar(I) cijanid (34.6 g, 387 mmol) u CH3CN (1 L) je zagrejan na 65 °C. Izoamil nitrit (22.7 g 193 mmol) je dodat u kapima i reakcija je mešana na 65 °C tokom 1 h. Analiza pomoću LCMS pokazala je da je ostalo nešto početnog materijala i dodato je još izoamil nitrita (15.1 g 129 mmol). Reakcija je zagrevana na 65 °C tokom 18 h. Posle hlađenja do sobne temperature, reakcija je razblažena sa EtOAc (200 mL) i filtrirana. Filtrat je koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 0-50% EtOAc u heptanu da bi se dobio metil 4-cijano-2,5-difluoro-3-metoksibenzoat (S-3) (14.0 g, 47% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>1H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ 7.36 (dd, J=4.8, 8.4 Hz, 1H), 4.21 (d, J=3.1 Hz, 3H), 3.97 (s, 3H).

Korak 4: Sinteza 3,6-difluoro-4-(hidroksimetil)-2-metoksibenzonitrila (S-4)

[0301] U rastvor metil 4-cijano-2,5-difluoro-3-metoksibenzoata (S-3) (14 g 62 mmol) u THF (400 mL) je dodat LiBH4(20 g, 92 mmol) polako na 0 °C. Nakon što je dodavanje završeno, reakcija je zagrejana do sobne temperature, a zatim zagrevana na 50 °C tokom 2 h. Posle hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je ugašena sporim dodavanjem H2O (100 mL) i organski delovi su ekstrahovani sa EtOAc (2 × 300 mL). Kombinovani organski ekstrakt je ispran slanim rastvorom i zas. NaHCO3, osušen preko Na2SO4i filtriran. Nakon uklanjanja rastvarača, 3,6-difluoro-4-(hidroksimetil)-2-metoksibenzonitril (S-4) (10 g, 81%) je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca. Ovaj materijal je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400MHz, HLOROFORM-d) δ 7.06 (dd, J=4.8, 8.8 Hz, 1H), 4.81 (s, 2H), 4.17 (d, J=3.3 Hz, 3H), 2.48 (br s, 1H).

Korak 5: Sinteza 3,6-difluoro-2-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (S-5)

[0302] U rastvor 3,6-difluoro-4-(hidroksimetil)-2-metoksibenzonitrila (S-4) (10 g, 50 mmol) i 1-(metansulfonil)-1H-pirazola (Int-13) (8.8 g, 60 mmol) u CH3CN (500 mL) je dodat Cs2CO3(24.5 g, 75.3 mmol) i je mešano na 70 °C tokom 2 h. Analiza pomoću LCMS pokazala je da je početni materijal utrošen. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i filtrirana. Nakon što

1

je filtrat koncentrovan, ostatak je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 20-50% EtOAc u petrolej etru da bi se dobio 3,6-difluoro-2-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)metil] benzonitril (S-5) (8.4 g, 67% prinos) kao žuta guma. LCMS m/z 250.0 [M+H]<+>;<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.62-7.40 (m, 1H), 6.76 (dd, J=5.0, 9.1 Hz, 1H), 6.33 (t, J=2.1 Hz, 1H), 5.49 (d, J=1.1 Hz, 2H), 4.13 (d, J=3.2 Hz, 3H).

Korak 6: Sinteza 5-fluoro-4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (S-6)

[0303] U rastvor 3,6-difluoro-2-metoksi-4-[(1H-pirazol-1-il)metil]benzonitrila (S-5) (8.4 g, 34 mmol) i N-hidroksiacetamida (7.6 g, 100 mmol) u CH3CN (400 mL) i vode (80 mL) je polako dodavan 1,1,3,3-tetrametilguanidin (23 g, 200 mmol). Smeša je zagrevana na 60 °C tokom 16 h. Smeša je ohlađena i koncentrovana da bi se uklonio CH3CN. Žuta čvrsta supstanca je istaložena iz rastvora koji je ispran vodom, a zatim smešom 10% EtOAc u petrol etru. Dobijena bledo žuta čvrsta supstanca je filtrirana da bi se dobio 5-fluoro-4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amin (S-6) (6.1 g, 69% prinos) kao bledo žuta čvrsta supstanca. LCMS m/z 262.9 [M+H]<+>;<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ 7.59 (d, J=1.7 Hz, 1H), 7.43 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.70 (d, J=9.2 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.35 (t, J=2.1 Hz, 1H), 5.31 (s, 2H), 2.23 (tt, J=5.1, 8.4 Hz, 1H), 1.20-1.14 (m, 2H), 0.81-0.73 (m, 2H).

Korak 7: Sinteza N-{5-fluoro-4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 128)

[0304] U rastvor 5-fluoro-4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-amina (S-6) (6.1 g, 23 mmol) u piridinu (100 mL) je dodat 2,6-dimetoksibenzensulfonil hlorid (Int-26) (6.1 g, 26 mmol) i dobijena smeša je mešana na 70 °C tokom 18 h. Smeša je koncentrovana i prečišćena fleš hromatografijom eluiranjem sa 10% MeOH u DCM da bi se dobio sirovi Referentni primer 128 (8 g) kao žuta čvrsta supstanca. Suspenzija žute čvrste supstance u CH3CN (100 mL) je refluksovana 10 min. Većina čvrstih supstanci je ostala.

[0305] Dakle, dodatni CH3CN (500 mL) je dodavan u koracima od 100 mL dok se čvrsta supstanca potpuno ne rastvori. Rastvor je ostavljen da se ohladi do 5 min i MTBE (400 mL) je dodat uz snažno mešanje. Počele su da se formiraju bele čvrste supstance i smeša je koncentrovana do 1/3 zapremine i rastvor je snažno mešan na 20 °C tokom 18 h. Talog je sakupljen filtracijom, ispran heptanom i osušen pod vakuumom da bi se dobilo 3.2 g (30%)

1

Referentni primer 128 kao bela čvrsta supstanca. Filtrat je koncentrovan da bi se dobilo 4.7 g sirovog Referentnog primera 128 kao žuta čvrsta supstanca koja je dalje prečišćena kao što je opisano u nastavku. 4.7 g je ponovo prečišćeno fleš hromatografijom eluiranjem sa gradijentom od 0 - 20% EtOAc u DCM da bi se dobilo 3 grama bele čvrste supstance koja je rastvorena u CH3CN (10 mL) i MTBE (25 mL). Bezbojni rastvor je mešan dok se ne zamuti i dok se ne istaloži bela čvrsta supstanca. Bela čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana sa MTBE (3 × 5 mL). Ova serija bele čvrste supstance je kombinovana sa šaržom od 3.2 g i kombinovana čvrsta supstanca je suspendovana u CH3CN (30 mL) i zatim zagrejana da se rastvori. MTBE (60 mL) je dodat postepeno i bela čvrsta supstanca je istaložena iz rastvora. Smeša je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana do ukupne zapremine od 30 mL. Dobijena bela čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana sa MTBE (3 × 10 mL), osušena u vakuum pećnici na 60 °C tokom 6 h da bi se dobilo N-{5-fluoro-4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamid (Referentni primer 128) (5.3 g, 49% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 5 10.13 (br. s, 1H), 7.86 (br. s, 1H), 7.59 - 7.43 (m, 2H), 6.90 (br. s, 1H), 7.59 -7.43 (m, 2H), J=3.3 Hz, 1H), 6.78 (br. d, J=8.5 Hz, 2H), 6.31 (br. s, 1H), 5.50 (br. s, 2H), 4.04 (br. s, 3H), 3.76 (s, 6H); m/z 463.0 [M+H]<+>.

[0306] Primeri u tabeli u nastavku su sintetizovani prema postupcima korišćenim za sintezu N-{5-fluoro-4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 128), N-{4-etil-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}-2,6-dimetoksibenzen-1-sulfonamida (Referentni primer 95), 5-etil-2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 01), 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(3-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 02), i 2,6-dimetoksi-N-{4-metoksi-6-[(5-metil-1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamida (Referentni primer 03), i opšteg postupaka formiranja sulfonamida A-D. Sledeći primeri su sintetizovani sa nekritičnim izmenama ili zamenama opisanih procedura koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da realizuje.

Tabela 20:

1

1

14

Biološka analiza, Deo 1

Protokol KAT testa:

[0307]

A. Priprema jedinjenja

1. Pripremiti 10 mM matične rastvore u 100% DMSO od čvrstog materijala

2. Serijski razblažiti 10 mM, 1 mM ili 0.1 mM stok jedinjenja 3 puta u 100% DMSO za odgovor na dozu od 11 tačaka

B. Priprema reagensa

1. Pripremiti 1x pufer za ispitivanje koji sadrži 10 mM Tris HCL pH 8.0, 2.5 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.005% BSG i 0.02% Tween-20

2. Razblažiti histonski peptid (CPC Scientific) i AcCoA (Sigma) zajedno u puferu za ispitivanje do 2x.

3. Razblažiti KAT enzim u puferu za analizu do 2x.

C. Enzimska reakcija

1. Konačni uslovi reakcije za svaki KAT test u zapremini reakcije od 20 ul:

i. KAT525 nM, 1 uM AcCoA, 2 uM H41-21 peptid, 30-minutna reakcija

ii. KAT6A 15 nM, 1 uM AcCoA, 2 uM H31-21 peptid, 45-minutna reakcija

iii. KAT6B 25 nM, 1 uM AcCoA, 2 uM H31-21 peptid, 60-minutna reakcija

iv. KAT712.5 nM, 1 uM AcCoA, 2 uM H31-21 peptid, 45-minutna reakcija

v. KAT815 nM, 1 uM AcCoA, 2 uM H31-21 peptida, 45-minutna reakcija

2. Dodati 0.5 ul razblaženog jedinjenja na ploču za ispitivanje (polipropilenske ploče sa V-dnom sa 384 bunarčića) ili 0.5 ul DMSO za kontrolne bunarčiće.

3. Dodati 10 ul smeše 2x Histon peptida/2x AcCoA na ploču za analizu.

4. Dodati 10 ul 2x enzima na ploču za analizu.

5. Zaustaviti reakciju posle naznačenog vremena dodavanjem 2 ul 5% mravlje kiseline 6. Svaka reakcija je analizirana korišćenjem self-assembled monolayer desorption/ionization time-of-flight masene spektrometrije (Mrksich, Milan (2008) Mass Spectrometry of SelfAssembled Monolayers: A New Tool for Molecular Surface Science ACS Nano 2008 2 (1), 7-18; SAMDI Tech, Inc. (Chicago, IL)).

7. Površina ispod krive (AUC) za pikove supstrata i proizvoda određena je za KAT5 na MV 2561 [Substrat H]<+>i 2603 [Proizvod H]<+>sa tolerancijom /- 1 Da, respektivno

8. Površina ispod krive (AUC) za pikove supstrata i proizvoda određena je za KAT6A, KAT6B, KAT7 i KAT8 na MV 2723 [Substrat H]<+>i 2765 [Proizvod H]<+>sa tolerancijom /- 1 Da, respektivno.

9. Procenat konverzije u proizvod je izračunat prema: AUCProizvod/(AUCSupstrat+ AUCProizvod).

D. Analiza podataka

1. IC50vrednosti su određene fitovanjem % konverzije za svaku koncentraciju inhibitora na IC50jednačinu sa 4 parametra koristeći sopstveni Pfizer softver za podešavanje krive.

2. Kivrednosti su određene fitovanjem % konverzije za svaku koncentraciji inhibitora Morisonovoj jednačini za kompetitivne inhibitore sa čvrstim vezivanjem korišćenjem sopstvenog softvera kompanije Pfizer za podešavanje krive.

Materijali

[0308] KAT enzimi su eksprimirani korišćenjem sistema ekspresije bakulovirusa i prečišćeni u Pfizeru, La Jolla. Peptid histona H3 (1-21) (ARTKKTARXTGGKAPRKKLA, SEQ ID NO:3) i histon H4 (1-21) peptid (SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV, SEQ ID NO:4) kupljeni su od CPC Scientific (Sunnyvale, CA). Acetil koenzim A je nabavljen od Sigma-Aldrich (Sent Luis, MO). Svi ostali biohemijski reagensi su kupljeni od Sigma-Aldrich ili ThermoFisher Scientific (Valtham, MA).

KAT reakcije

[0309] KAT analize su izvedene na sobnoj temperaturi u puferu za ispitivanje koji sadrži 1 µM AcCoA, 2 µM histonski peptid, 10 mM Tris HCL pH 8.0, 2.5 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.005% BSG i 0.02% Tween. 10 ul 2x Histon peptid/AcCoA smeše je dodato u polipropilensku ploču za ispitivanje sa V-dnom sa 384 bunarčića koja sadrži 0.5 ul serijski razblaženog test jedinjenja u 100% dimetil sulfoksidu (DMSO). Za početak reakcije, 10 ul 2x rastvora enzima je dodato na ploču za ispitivanje. KAT analize su prekinute nakon 30-60

14

minuta dodatkom 2 ul 5% mravlje kiseline. Svi testovi su koristili histon H3 (1-21) peptid osim KAT5 testa koji je koristio histon H4 (1-21) peptid. Konačna koncentracija enzima za svaki KAT bila je sledeća: KAT5, 25 nM; KAT6A, 15 nM; KAT6B, 25 nM; KAT7, 12.5 nM; KAT8 15 nM. Svaka reakcija je analizirana korišćenjem self-assembled monolayer desorption/ionization time-of-flight masene spektrometrije (Mrksich, Milan (2008) Mass Spectrometry of Self-Assembled Monolayers: A New Tool for Molecular Surface Science ACS Nano 20082 (1), 7-18; SAMDI Tech, Inc. (Chicago, IL)).

Obrada i analiza podataka

[0310] Površina ispod krive (AUC) za pikove supstrata i proizvoda određena je za KAT5 na MV 2561 [Substrat H]<+>i 2603 [Proizvod H]<+>sa tolerancijom /- 1 Da, respektivno. Površina ispod krive (AUC) za pikove supstrata i proizvoda određena je za KAT6A, KAT6B, KAT7 i KAT8 na MV 2723 [Substrat H]<+>i 2765 [Proizvod H]<+>sa tolerancijom /- 1 Da, respektivno. Procenat konverzije u proizvod je izračunat prema: AUCProizvod/(AUCSupstrat+AUCProizvod). Vrednosti IC50 su određene fitovanjem % konverzije za svaku koncentraciju inhibitora na IC50 jednačinu sa 4 parametra korišćenjem sopstvenog Pfizer softvera za podešavanje krive. Vrednosti Ki su određene prilagođavanjem % konverzije za svaku koncentraciju inhibitora Morisonovoj jednačini za kompetitivno čvrsto vezivanje inhibitora korišćenjem softvera za podešavanje krive kompanije Pfizer.

[0311] KAT6a i KAT6b Ki su dati u tabeli 21, a KAT5, KAT7 i KAT8 Ki su dati u tabeli 22 ispod.

Tabela 21:

14

14

14

Tabela 22:

14

14

1

11

12

Biološka analiza, Deo 2

Priprema proteina

KAT5

[0312] Molekularna biologija: DNK sekvenca sa optimizovanim kodonom (za ekspresiju u Escherichia coli) koja kodira aminokiselinske ostatke 2 do 461 (Uniprot K92993-2) humane KAT5 izoforme sintetizovao je GenScript USA Inc (Piscataway, New Jersey, SAD). Ovo je vezano u modifikovani pET43a E. coli ekspresioni vektor dizajniran da kodira N-terminalni heksahistidinski tag praćen mestom cepanja proteaze mozaičnog virusa duvana (TEV) i KAT5 sekvencom. Dobijena proteinska sekvenca je navedena ispod (SEQ ID NO:5).

[0313] Ekspresija proteina: Da bi se proizveo rekombinantni KAT5 protein, ekspresioni plazmid je transformisan u E. coli BL21 DE3 soj i uzgajan uz mućkanje na 37°C u zapremini od 1 L Terrific bujona (TB) sa dodatkom 100 µg/mL ampicilina i 50 µM cinka dok se ne postigne OD600 od 0.8. Kulture su prenete na 18°C i ekspresija proteina je izazvana dodatkom izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida do konačne koncentracije od 0.5 mM i kulture su mućkane preko noći tokom dodatnih 16 sati. Nakon ekspresije, ćelijske kulture su

1

centrifugirane na 5000 x g tokom 20 minuta i ćelijski peleti su čuvani zamrznuti na -20°C.

[0314] Prečišćavanje proteina: Prečišćavanje proteina je započeto odmrzavanjem ćelijskih peleta (25 g vlažne težine) u puferu za lizu (50 mM Hepes pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazola, 5% [zapr/zapr] glicerola, 0.1% [zapr/zapr] CHAPS , 2 mM 2-merkaptoetanol, 3 mM MgCl2, 0.5 mg/mL lizozima, benzonaza endonukleaza [EMD Millipore], 1 mM PMSF, kompletne tablete inhibitora proteaze bez EDTA [Roche]) koristeći odnos od 6 mL pufera na 1 g ćelija. Ćelije su dalje lizirane sonikacijom korišćenjem Misonix tečnog procesora (6 × 30 sekundi impulsa, amplituda 60 [70 vati]), a zatim centrifugirane na 48.000 x g na 4°C. Supernatant (ćelijski lizat) je pomešan sa 20 mL Q-Sepharose FF smole (GE Healthcare) prethodno ekvilibrisane sa Q puferom (20 mM Hepes pH 7.4, 1 M NaCl). Nevezana frakcija iz Q-Sepharose FF je zatim inkubirana sa 5 mL kompletne His-Tag Purification Resin (Roche), prethodno ekvilibrisane sa IMAC puferom za pranje (20 mM hepes pH 7.4, 500 mM NaCl, 35 mM imidazola). Smola je isprana IMAC puferom za ispiranje, a vezani KAT5 eluiran sa IMAC puferom za eluiranje (20 mM hepes pH 7.4, 500 mM NaCl, 300 mM imidazola). Protein eluiran sa IMAC je odmah odsoljen u pufer za skladištenje (50 mM Na citrat pH 6.5, 500 mM NaCl, 5% [zapr/zapr] glicerol) korišćenjem 2 x HiPrep 26/10 kolone za odsoljavanje (GE Healthcare) u seriji. Odsoljeni protein je dalje prečišćen prolazom kroz HiLoad 26/60 Superdex 75 kolonu prethodno ekvilibrisanu u puferu za skladištenje. Konačno, KAT5 protein je koncentrovan na 1.5 mg/mL korišćenjem Amicon Ultra centrifugalne filterske jedinice (Utra-15 MVCO 10 kDa), brzo zamrznut u tečnom azotu i čuvan u zamrzivaču na -70°C.

KAT6A

[0315] Molekularna biologija: DNK sekvenca koja kodira aminokiselinske ostatke 507 do 778 (Uniprot 092794-1) humanog KAT6A je amplifikovana sa PCR i vezana u modifikovani pET E. coli ekspresioni vektor dizajniran da kodira NusA tag za rastvorljivost praćen heksahistidinskim tagom i mestom cepanja proteaze mozaičnog virusa duvana (TEV) i KAT6A sekvencom. Dobijena proteinska sekvenca je navedena ispod (SEQ ID NO:6).

1 4

[0316] Ekspresija proteina: Da bi se proizveo rekombinantni KAT6A protein, ekspresioni plazmid je transformisan u E. coli BL21 DE3 soj i uzgajan uz mućkanje na 37°C u zapremini od 1 L Terrific bujona (TB) sa dodatkom 100 µg/mL ampicilina dok se ne postigne OD600 od 0.8. Kulture su prenete na 18°C i ekspresija proteina je izazvana dodatkom izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida do konačne koncentracije od 0.5 mM i kulture su mućkane preko noći tokom dodatnih 16 sati. Nakon ekspresije, ćelijske kulture su centrifugirane na 5000 x g tokom 20 minuta i ćelijski peleti su čuvani zamrznute na -20°C.

[0317] Prečišćavanje proteina: Prečišćavanje proteina je započeto odmrzavanjem ćelijskih peleta (40 g vlažne težine) u puferu za lizu (25 mM Tris-HCl pH 7.8, 500 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.01% [zapr/zapr] Triton-X 100, 5% [zapr/zapr] glicerol, 2 mM MgCl2, 10 mM imidazol, 0.5 mg/mL lizozima, benzonaza endonukleaza [EMD Millipore], 1 mM PMSF, kompletne tablete inhibitora proteaze bez EDTA [Roche]) koristeći odnos od 5 mL pufera na 1 g ćelija. Ćelije su dalje lizirane sa 3 prolaza (na 15000 psi) kroz ledom hlađenu Avestin C5 ćelijsku drobilicu i zatim centrifugirane na 48.000 x g na 4°C. Supernatant (ćelijski lizat) je filtriran kroz filter od 5 µm i primenjen na 5 mL HiTrap IMAC Sepharose FF kolonu (GE Healthcare) prethodno ekvilibrisanu sa IMAC puferom za ispiranje (25 mM Tris-HCl pH 7.8, 500 mM NaCl, 5 mM DTT 0.01% [zapr/zapr] Triton-X 100, 5% [zapr/zapr] glicerol, 20 mM imidazol) korišćenjem sistema za prečišćavanje Profinia Affinity hromatografije (Bio-Rad). IMAC kolona je zatim isprana IMAC Wash puferom i vezani KAT6A protein je eluiran sa IMAC puferom za eluiranje (25 mM Tris-HCl pH 7.8, 500 mM NaCl, 5% [zapr/zapr] glicerol, 5 mM DTT, 250 mM Imidazol). IMAC-eluirani protein je dalje prečišćen propuštanjem kroz HiLoad 26/60 Superdex 200 kolonu prethodno ekvilibrisanu u puferu za

1

skladištenje (25 mM Tris-HCl pH 7.8, 500 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% [zapr/zapr] glicerol) . Konačno, protein KAT6A je koncentrovan na ≤ 1 mg/mL korišćenjem Amicon Ultra centrifugalne filterske jedinice (Utra-15 MVCO 10 kDa), brzo zamrznut u tečnom azotu i čuvan u zamrzivaču na -70°C.

KAT7

[0318] Molekularna biologija: DNK sekvencu sa optimizovanim kodonom koja kodira aminokiselinske ostatke 325 do 611 (Uniprot O95251-1) humanog KAT7 sintetizovao je GenScript USA Inc (Piscataway, New Jersey, SAD). Ovo je vezano u modifikovani pET43a E. coli ekspresioni vektor dizajniran da kodira N-terminalni heksahistidinski tag praćen mestom cepanja proteaze mozaičnog virusa duvana (TEV) i KAT7 sekvencom. Dobijena proteinska sekvenca je navedena ispod (SEQ ID NO:7).

[0319] Ekspresija proteina: Da bi se proizveo rekombinantni KAT7 protein, ekspresioni plazmid je transformisan u E. coli BL21 DE3 RIL soj i uzgajan uz mućkanje na 37°C u zapremini od 1 L Terrific bujona (TB) sa dodatkom 100 µg/mL ampicilina i 50 µM cinka dok se ne postigne OD600 od 0.8. Kulture su prenete na 18°C i ekspresija proteina je izazvana dodatkom izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida do konačne koncentracije od 0.5 mM i kulture su mućkane preko noći tokom dodatnih 16 sati. Nakon ekspresije, ćelijske kulture su centrifugirane na 5000 x g tokom 20 minuta i ćelijski peleti su čuvani zamrznuti na -20°C.

[0320] Prečišćavanje proteina: Prečišćavanje proteina je započeto otapanjem ćelijskih peleta (10 g vlažne težine) u puferu za lizu (50 mM Hepes pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 5 mM imidazola, 0.05% [zapr/zapr] Brij 35, 10% zapr/zapr] glicerol, 3 mM MgCl2, 0.5 mg/mL lizozima, benzonaza endonukleaza [EMD Millipore], 1 mM PMSF, kompletne tablete inhibitora proteaze bez EDTA [Roche]) koristeći odnos od 10 mL pufera na 1 g ćelija. Ćelije su dalje lizirane sonikacijom korišćenjem Misonix tečnog procesora (6 × 30 sekundi impulsa, amplituda 60 [70 vati]), a zatim centrifugirane na 48.000 x g na 4°C. Supernatant (ćelijski lizat) je inkubiran sa 1 mL kompletne His-Tag smole za prečišćavanje (Roche), pre-

1

ekvilibrisane sa IMAC puferom za pranje 1 (25 mM Hepes pH 7.5, 800 mM NaCl, 5 mM imidazola, 10% [zapr/zapr ] glicerol, 5 mM DTT, 0.01% [zapr/zapr] Brij 35, 50 mM arginin, 50 mM glutaminska kiselina). Smola je uzastopno isprana sa IMAC Wash puferom 1 i IMAC Wash puferom 2 (25 mM hepes pH 7.5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazola, 10% [zapr/zapr] glicerola, 5 mM DTT [0.01] Brij 35, 50 mM arginin, 50 mM glutaminska kiselina). Vezani KAT7 protein je eluiran sa IMAC elucionim puferom (25 mM hepes pH 7.5, 200 mM NaCl, 500 mM imidazola, 10% [zapr/zapr] glicerola, 5 mM DTT 0.01% [zapr/zapr] Brij 35, 50 mM arginina, 50 mM glutaminske kiseline). Eluirani protein je sakupljen direktno u 4 zapremine desaltnog pufera (50 mM Na citrat pH 6.5, 200 mM NaCl, 0.01% [zapr/zapr] Brij 35, 10% [zapr/zapr] glicerol, 5 mM DTT) da bi se dobila konačna koncentracija imidazola do 100 mM. Protein eluiran sa IMAC je odmah odsoljen u Desalt puferu korišćenjem 2 x HiPrep 26/10 kolone za odsoljavanje (GE Healthcare) u seriji. Odsoljeni protein je dalje prečišćen propuštanjem kroz HiLoad 26/60 Superdex 75 kolonu prethodno ekvilibrisanu u puferu za skladištenje (50 mM Na citrat pH 6.5, 200 mM NaCl, 10% [zapr/zapr] glicerol, 5 mM DTT). Konačno, KAT7 protein je koncentrovan na 3.5 mg/mL korišćenjem Amicon Ultra centrifugalne filterske jedinice (Utra-15 MVCO 10 kDa), brzo zamrznut u tečnom azotu i čuvan u zamrzivaču na -70°C.

Biohemijski test acetiltransferaze

[0321] Da bi se odredila inhibicija KAT enzimske aktivnosti test jedinjenjima, reakcije analize su sprovedene u zapremini od 8 uL u pločama za analizu male zapremine sa 384 bunarčića. Reakcije su izvedene u puferu za ispitivanje (100 mM Tris-HCl, pH 7.8, 15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.01% Tween-20, 1 mM ditiotreitola i 0.01% m/zapr albumina od belanaca kokošijeg jajeta).

[0322] Reakcije su postavljene sa 1 µM acetil koenzima A, 100 nM rekombinantnog histona pune dužine obeleženog ograničenom biotinilacijom (KAT6A, KAT7: H3.1, KAT5), 10/5/8/40/20 nM KATK5/KAT7A/KAT6A enzim, odnosno antitelo specifično za acetil-lizin (H3.1: Tehnologija ćelijske signalizacije, H4: Abeam). Serija razblaženja u 11 tačaka test jedinjenja je pripremljena u DMSO; zapremina od 100 nL je prebačena pomoću alata sa iglama u test ploče koje sadrže supstrate, pre dodavanja enzima za početak reakcije. Pozitivne (bez jedinjenja, samo DMSO) i negativne (AcCoA izostavljene) kontrolne reakcije su uključene na istim pločama i primljene su iste količine DMSO kao i bunarčići tretirani jedinjenjem. Nakon dodavanja svih reagenasa, ploče su zapečaćene lepkom i inkubirane 90

1

minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato dodatnih 4 µL test pufera koji sadrži AlphaScreen<®>Protein A akceptorske perlice i Streptavidina donorske perlice (PerkinElmer, Waltham, MA) do konačne koncentracije od 8 µg/mL. Nakon inkubacije od 2 sata, ploče su očitane korišćenjem EnVision 2103 čitača ploča sa više obeleživača (PerkinElmer) u HTS AlphaScreen<®>režimu. IC50 vrednosti su dobijene iz neobrađenih očitavanja izračunavanjem procenta inhibicije (%I) za svaku reakciju u odnosu na kontrole na istoj ploči (%I=(I-CN)/(CP-CN) gde su CN/CP proseci negativne/pozitivne reakcije, respektivno), zatim fitovanjem %I podataka u odnosu na koncentraciju jedinjenja [I] na %I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D)))) gde A je donja asimptota, B je gornja asimptota, C je IC50 vrednost, a D je nagib.

[0323] Rezultati su prikazani u tabeli 23 ispod:

Tabela 23:

Histon H3 Lizin 23 Biomarkerski test acetilacije

[0324] Jedinjenja su testirana u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju acetilaciju histonskog H3K23 markera u sledećem testu:

Ćelijska linija U2OS je zasejana pri gustini od 9.000 ćelija po bunarčiću na pločama za kulturu tkiva optičkog kvaliteta sa 96 bunarčića u medijumu RPMI i 10% fetalnog goveđeg seruma i ostavljena da se pričvrsti 24 sata pod standardnim uslovima kulture (37 stepeni Celzijusa, 5% CO2). Na kraju ovog perioda medijum je aspiriran. Razblaženja jedinjenja pripremljena u DMSO su dodata u medijum, sa negativnim kontrolnim bunarčićima rezervisanim samo za tretman sa DMSO i pozitivnim kontrolama sa 100% inhibicijom koje su primale snažno inhibitorno jedinjenje (npr. cas 2055397-28-7, benzojeva kiselina, 3-fluoro-5-( 2-piridinil)-, 2-[(2-fluorofenil)sulfonil]hidrazid) (Baell, J., Nguyen, H.N., Leaver,

1

D.J., Cleary, B.L., Lagiakos, H.R., Sheikh, B.N., Thomas. T.J., Aryl sulfonohydrazides, WO2016198507A1, 2016) pri koncentraciji od 10 µM i 200 µL je preneto u ćelije. Posle inkubacije tokom 24 sata, ćelije su fiksirane sa 3.7% formaldehida u PBS tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, isprane (5 × 5 minuta) fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera koji sadrži 0.1% Tween 20 i blokirane puferom za blokiranje Odissey (LI-COR, Lincoln, NE) koji sadrži 0.1% TritonX100. Anti-H3K23ac specifično antitelo (Abcam ab177275) u Odissey puferu za blokiranje koji sadrži 0.1% Tween 20 je dodato i inkubirano 16 sati na 4 stepena Celzijusa. Posle ispiranja (kao prethodno), dodato je sekundarno antitelo obeleženo bojom Alexa647 (LifeTechnologies) i Hoechst 33342 (1 µg/mL, SigmaAldrich) tokom 1 sata inkubacije. Ploče su oprane kao i ranije i očitane na PerkinElmer Phenix platformi za snimanje visokog sadržaja. Koristeći Columbus pipeline za analizu slike, pojedinačna jezgra su locirana pomoću Hoechst 33342 boje, a nivo acetilacije je izračunat iz intenziteta vezanog za Alexa647 u istoj oblasti. Dobijeni srednji intenzitet po ćeliji je direktno konvertovan u procenat inhibicije u odnosu na kontrole na istoj ploči i podaci su usklađeni sa logističkim modelom sa četiri parametra da bi se odredila koncentracija inhibitora od 50% (IC50).

[0325] Rezultati su prikazani u tabeli 24 ispod:

Tabela 24:

Histon H3 Lizin 14 Biomarkerski test acetilacije

[0326] Jedinjenja su testirana u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju acetilaciju markera histona H3 lizina 14 u sledećem testu:

Ćelijska linija U2OS je zasejana pri gustini od 3.000 ćelija po bunarčiću u pločama za kulturu tkiva optičkog kvaliteta sa 384 bunarčića u medijumu RPMI sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i 10 mM Hepesa. Ćelije su ostavljene da prianjaju 24 sata pod standardnim uslovima kulture (37 stepeni Celzijusa, 5% CO2). Na kraju ovog perioda ćelije su isprane

1

medijumom bez seruma. Razblaženja jedinjenja pripremljena u DMSO dodata su u medijum bez seruma, sa negativnim kontrolnim bunarčićima rezervisanim samo za tretman sa DMSO i pozitivnim kontrolama sa 100% inhibicijom koje su primale snažno inhibitorno jedinjenje (npr.Z)-4-fluoro-N-((3-hidroksifenil)sulfonil)-5-metil-[1.1'-bifenil]-3-karbohidrazonska kiselina) u koncentraciji od 10 uM. Posle inkubacije od 24 sata, ćelije su fiksirane sa 4% formaldehida u PBS tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, isprane fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera i blokirane puferom za blokiranje koji sadrži 0.2% TritonX100 i 2% BSA. Anti-H3K14ac specifično antitelo (Cell Signaling Technologies) u puferu za blokiranje je dodato i inkubirano preko noći na 4 stepena Celzijusa. Posle ispiranja, dodato je sekundarno antitelo obeleženo AlexaFluor 488 bojom (ThermoFisher) i Hoechst 33342 (1 µg/mL, Life Technologies) tokom 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi. Ploče su oprane i očitane na PerkinElmer Opera HCS platformi za snimanje visokog sadržaja. Koristeći Columbus pipeline za analizu slike, pojedinačna jezgra su locirana pomoću Hoechst 33342 boje, a nivo acetilacije je izračunat iz intenziteta vezanog za AlexaFluor488 u istoj oblasti. Dobijeni srednji intenzitet po ćeliji je konvertovan u procenat inhibicije u odnosu na kontrole na istoj ploči i podaci su usklađeni sa četvoroparametarskim logističkim modelom da bi se odredila 50% inhibitorna koncentracija (IC50).

[0327] Rezultati su prikazani u tabeli 25 ispod:

Tabela 25:

H2A.Z Lizin 7 Biomarkerski test acetilacije

[0328] Jedinjenja su testirana na njihovu sposobnost da inhibiraju marker acetilacije histona H2A.Z lizin 7 u sledećem testu:

Ćelijska linija U2OS je zasejana pri gustini od 3.000 ćelija po bunarčiću u pločama za kulturu tkiva optičkog kvaliteta sa 384 bunarčića u medijumu RPMI sa dodatkom 10% fetalnog

1

goveđeg seruma i 10 mM Hepesa. Ćelije su ostavljene da prianjaju 24 sata pod standardnim uslovima kulture (37 stepeni Celzijusa, 5% CO2). Na kraju ovog perioda ćelije su isprane medijumom bez seruma. Razblaženja jedinjenja pripremljena u DMSO dodata su u medijum bez seruma, sa negativnim kontrolnim jamicama rezervisanim samo za tretman sa DMSO i pozitivnim kontrolama sa 100% inhibicijom koje su primale snažno inhibitorno jedinjenje enantiomer 1 7-jodo-N-(2-(oksazol-2-il)-2-feniletil)-2H-benzo[e][1.2,4]tiadiazin-3-karboksamid 1,1-dioksid, koji je jedinjenje 146 za vreme primene GB1713962.7, podneto 31. avgusta 2018, pri koncentraciji od 30 µM. Posle inkubacije od 24 sata, ćelije su fiksirane sa 4% formaldehida u PBS tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, isprane fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera i blokirane puferom za blokiranje koji sadrži 0.2% TritonX100 i 2% BSA. Anti-H2A.ZK7ac specifično antitelo (Abeam) u puferu za blokiranje dodato je i inkubirano preko noći na 4 stepena Celzijusa. Posle ispiranja, dodato je sekundarno antitelo obeleženo AlexaFluor488 bojom (ThermoFisher) i Hoechst 33342 (1 µg/mL, Life Technologies) tokom 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi. Ploče su oprane i očitane na Perkin Elmer Opera HCS platformi za snimanje visokog sadržaja. Koristeći Columbus pipeline za analizu slike, pojedinačna jezgra su locirana pomoću Hoechst 33342 boje, a nivo acetilacije je izračunat iz intenziteta vezanog za AlexaFluor488 u istoj oblasti. Dobijeni srednji intenzitet po ćeliji je konvertovan u procenat inhibicije u odnosu na kontrole na istoj ploči i podaci su usklađeni sa četvoroparametarskim logističkim modelom da bi se odredila 50% inhibitorna koncentracija (IC50).

[0329] Rezultati su prikazani u tabeli 26 ispod:

Tabela 26:

Reference

[0330]

1 1

Aggarwal and Calvi, Nature, 2004, 430, 372-376 doi:10.1038/nature02694

Avvaku mov et al., Oncogene, 2007, 26, 5395-5407 doi:10.1038/sj.onc.1210608

Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19 doi:10.1002/jps.2600660104

Borrow et al., Nat. Genet, 1996, 14, 33-41 doi:10.1038/ng0996-33

Dekker et al., Drug, Discov. Today, 2014, 19, 654-660 doi:10.1016/j.drudis.2013.11.012 Doyon et al., Mol. Cell., 2006, 21, 51-64 doi :10.1016/j.molcel.2005.12.007

Dhuban etal., Sci. Immunol., 2017, 2, 9297 doi:10.1126/sciimmunol.aai9297

Duong etal., CancerRes., 2013, 73, 5556-5568 doi:10.1158/0008-5472.CAN-13-0013 Ghizzoni et al., Eur. J. Med. Chem., 2012, 47, 337-344 doi:10.1016/j.ejmech.2011.11.001 Gil et al., J. Proteomics, 2017, 150, 297-309 doi :10.1016/j.jprot.2016.10.003

Gobert, M. et al., Cancer Research, 2009, 69, 2000-2009 doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-2360

Holbert et al., J. Biol. Chem., 2007, 282, 36603-36613 doi:10.1074/jbc.M705812200 Iizuka et al., Mol. Cell. Biol., 2006, 26, 1098-1108 doi :10.1128/MCB.26.3.1098-1108.2006 Iizuka et al., Cancer Sci., 2013, 104, 1647-1655 doi:10.1111/cas.12303

Jeong, et al., Blood Res 201651(3), 152-154 doi:10.5045/br.2016.51.3.152

Joshi, et al., Immunity 2015, 43, 579-590 doi:10.1016/j.immuni.2015.08.006

Li, B. et al., PNAS, 2007, 104, 4571-4576 doi:10.1073/pnas.0700298104

Melero, et al. Nature Reviews Cancer, 2015, 15, 457-472 doi:10.1038/nrc3973

Merson et al., J. Neurosci., 2006, 26, 11359-11370 doi :10.1523/JNEUROSCI.2247-06.2006 Miller, A.M. et al. J. Immunol., 2006, 177, 7398-7405 doi:10.4049/jimmunol.177.10.7398 Persa, E. et al. Cancer Letters, 2015368(2), 252-261 doi:10.1016/j.canlet.2015.03.003 Sheikh et al., Blood, 2015, 125(12), 1910-21 doi:10.1182/blood-2014-08-594655

Shi et al, Nature Biotech, 2015, 33, 661-667 doi:10.1038/nbt.3235

Su et al., Int. J. Mol. Sci., 2016, 17, 1-18 doi:10.3390/ijms17101594

Stern et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2005, 54, 11-29 doi:10.1016/j.critrevonc.2004.10.011 Thomas et al., Development, 2000, 127, 2537-2548 PMID:10821753

Tao, H. et al., Lung Cancer, 2012, 75, 95-101 doi:10.1016/j.lungcan.2011.06.002 Turner-Ivey et al., Neoplasia, 2014, 16(8): 644-655 doi:10.1016/j.neo.2014.07.007 Valerio et al., Cancer Research, 2017, 77(7), 1753-62 doi:10.1158/0008-5472.CAN-16-2374 Vizmanos et al., Genes Chromosomes Cancer, 2003, 36(4), 402-405 doi:10.1002/gcc.10174 Voss et al., BioEssays, 2009, 31(10), 1050-1061 doi:10.1002/bies.200900051

Wang, L., et al. EBioMedicine, 2016, 13, 99-112 doi:10.1016/j.ebiom.2016.10.018 Wang, X. et al., Oncogene, 2017, 36, 3048-3058 doi:10.1038/onc.2016.458

1 2

Xiao, Y. et al., Cell reports, 2014, 7, 1471-1480 doi :10.1016/j.celrep.2014.04.021

Yan, M. et al., Breast Cancer Research, 2011, 13, R47 doi:10.1186/bcr2869

Zack et al., Nature Genetics 201345, 1134-1140 doi:10.1038/ng.2760

Zhang et al., Mini. Rev. Med. Chem., 2017, 17, 1-8 doi: 10.2174/ 1389557516666160923125031

1

Claims (20)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje koje je

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje je 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid.
3. 3. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenata.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je kancer izabran od kancera dojke, pluća, prostate, pankreasa ili jajnika.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što kancer je kancer dojke.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što kancer je ER pozitivan kancer dojke.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što kancer je ER+ HER2-kancer dojke.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu patentnom 4, naznačeno time što je kancer lokalno uznapredovali ili metastazirani ER+ HER2-kancer dojke.
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što kancer je nesitnoćelijski kancer pluća.
11. 11. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je kancer lokalno uznapredovali ili metastazirani nesitnoćelijski kancer pluća.
12. 12. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što kancer je kancer prostate otporan na kastraciju.
13. 13. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je kancer lokalno uznapredovali ili metastazirani kancer prostate otporan na kastraciju.
14. 14. Kombinacija jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa sredstvom protiv tumora ili sa terapijom zračenjem, za upotrebu u lečenju kancera.
15. 15. Kombinacija jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa sredstvom protiv tumora, za upotrebu u lečenju kancera.
16. 16. Kombinacija za upotrebu prema patentnim zahtevima 14 ili 15, naznačeno time što kancer je kancer dojke.
17. 17. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, naznačeno time što kancer dojke je ER pozitivan kancer dojke.
18. 18. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 koje je kristalni oblik 2-metoksi-N-{4-metoksi-6-[(1H-pirazol-1-il)metil]-1,2-benzoksazol-3-il}benzen-1-sulfonamid anhidrid (Oblik 1), koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka praha koji sadrži pikove na 2θ vrednostima: 13.4 i 18.1 ° 2θ ± 0.2 °2θ.
19. 19. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 18, koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka praha koja dalje sadrži najmanje jedan pik izabran od 2θ vrednosti od: 11.4, 14.1 i 17.5 °2θ ± 0.2 °2θ. 1
20. 20. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 18, koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka praha koja dalje sadrži pikove na 2θ vrednosti od: 11.4, 14.1 i 17.5 °2θ ± 0.2 °2θ. 1