RS64646B1 - Kombinacija faktora vii i bispecifičnog antitela protiv faktora ix i x - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na farmaceutske kompozicije korisne za lečenje poremećaja koagulacije, kao što je hemofilija A, posebno kod pacijenta koji ima hemofiliju tipa A sa razvojem antitela inhibitora faktora VIII.

Stanje tehnike

[0002] Koagulacija uključuje dva puta, jedan unutrašnji, drugi spoljašnji, koji dovode do krajnjeg zajedničkog puta. Kombinacija dvaju mehanizama osigurava obrazovanje čvrstog i fleksibilnog krvnog ugruška koji se opire krvnom pritisku. Pod dejstvom trombina, fibrinogen prolazi kroz hemijske modifikacije koje dovode do obrazovanja fibrina. Fibrin je neophodan za obrazovanje ugruška.

[0003] Unutrašnji put sadrži faktore koji su prisutni u cirkulaciji pa proces koagulacije počinje unutar samog krvnog suda. Što se tiče spoljašnjeg puta, on uključuje tkivne faktore koji normalno nisu prisutni u cirkulaciji i koji se oslobađaju prilikom vaskularne povrede.

[0004] Faktor VII je glikoprotein koji se javlja u spoljašnjem putu koagulacije krvi. Kako bi započeo kaskadu, FVII se mora aktivirati u FVlla. Nakon aktivacije, FVlla obrazuje kompleks sa tkivnim faktorom (TF), proteinom povezanim sa fosfolipidima, koji se oslobađa prilikom vaskularne povrede. Sam FVlla (van kompleksa sa tkivnim faktorom) ima slabu proteolitičku aktivnost. Zatim, kompleks FVlla-TF transformiše faktor X u faktor Xa u prisustvu jona kalcijuma. Taj kompleks deluje i na aktivaciju faktora FIX u FIXa, čime katalizuje unutrašnji put. Faktori IXa i Xa povratno aktiviraju aktivirani faktor VII.

[0005] Faktor IX i faktor X javljaju se u unutrašnjem putu koagulacije. Aktivirani faktor IX omogućava aktivaciju faktora X u faktor Xa.

[0006] Faktor Xa u kompleksu sa aktiviranim faktorom FV i sa protrombinazom transformiše protrombin u trombin. Trombin zatim deluje na fibrinogen kako bi ga transformisao u fibrin i takođe omogućava aktivaciju FVIII i FV u FVllla i FVa, tim redom. Kada je reč o trombinu, on omogućava aktivaciju faktora XIII u FXllla, koji je odgovaran za konsolidaciju fibrinskog ugruška, u prisustvu kalcijuma koji je prirodno prisutan u plazmi.

[0007] Međutim, ukoliko izostane jedan faktor koagulacije, kaskada koagulacije se prekida ili je manjkava i tada se govori o abnormalnoj koagulaciji.

[0008] Aktivirani faktor VII deluje lokalno u prisustvu tkivnog faktora oslobođenog nakon povrede tkiva koja izaziva krvarenja, čak i bez faktora VIII ili IX. Zato se faktor VII, poželjno u aktivnom obliku, koristi za lečenje određenih poremećaja koagulacije krvi koji se manifestuju krvarenjima.

[0009] Dakle, faktor VII se koristi u lečenju pacijenata obolelih od hemofilije, sa nedostatkom faktora VIII (hemofilija tipa A) ili faktora IX (hemofilija tipa B), kao i pacijenata koji imaju druge nedostatke faktora koagulacije, na primer nasledni nedostatak FVII. FVII se preporučuje i u lečenju moždanih udara.

[0010] Određeni pacijenti sa hemofilijom razvijaju antitela inhibitore spram Faktora VIII koji se daje kao terapija za hemofiliju, obično u koncentrovanom obliku. To trenutno predstavlja najčešću komplikaciju pri lečenju hemofilije.

[0011] Bispecifična antitela koja su usmerena na FIX ili FIXa i FX ili FXa, kao što je Emicizumab, koriste se za lečenje pacijenata obolelih od hemofilije A, sa inhibitorima faktora VIII. Ta antitela funkcionalno zamenjuju FVIII čime podstiču aktivaciju FX-a FIXa-om približavanjem tih dvaju molekula. Ta antitela imaju dugotrajno dejstvo.

[0012] Ispitana je (R. HARTMANN, et al. OR36 / Synergistic Effects of a Procoagulant Bispecific Antibody and FEIBA or Factor VIIA on Thrombin Generation (Haemophilia (2017), 23 (Suppl.2), 11-27)) kombinacija rekombinantnog FVlla iz uzgajanja ćelija (kao što je Novoseven<®>, proizveden u BHK ćelijama) sa Emicizumabom (kao što je ACE910 ili Hemlibra<®>). Ta je kombinacija pokazala isključivo aditivni efekat u lečenju poremećaja koagulacije.

[0013] Stoga postoji potreba za farmaceutskom kombinacijom koja omogućava pružanje bolje nege pacijentima sa hemofilijom A, a određenije pacijentima sa anti-faktorom VIII.

Kratak sadržaj pronalaska

[0014] Ovaj pronalazak predlaže kombinovanje transgenetskog faktora VII sa multispecifičnim antitelom usmerenim protiv faktora IX i X.

[0015] Prema ovom pronalasku, kombinacija ovog pronalaska faktora VII dobijenog transgenezom i antitela usmerenog protiv faktora IX i faktora X dovodi do sinergetskog efekta u lečenju poremećaja koagulacije, a naročito u lečenju pacijenata obolelih od hemofilije A sa inhibitorima FVIII i pacijenata sa nedostatkom FVII.

[0016] Dakle, jedan aspekt ovog pronalaska predstavlja farmaceutska kompozicija koja obuhvata:

a. transgenetski faktor VII i

b. multispecifično antitelo, poželjno bispecifično, usmereno protiv faktora IX i faktora X, kao što je na primer emicizumab.

[0017] Faktor VII je poželjno u obliku aktiviranog faktora VII (FVlla).

[0018] U jednom određenom načinu ostvarivanja, faktor IX je u obliku aktiviranog faktora IX (FIXa) i/ili je faktor X u obliku aktiviranog faktora X (FXa).

[0019] Pomenuti transgenetski faktor VII poželjno predstavlja humani faktor VII kog proizvode epitelne ćelije mlečnih žlezda transgenetskog nehumanog sisara, na primer kunića koji je transgenetski za humani faktor VII.

[0020] Ovaj pronalazak obezbeđuje i kombinovani proizvod koji obuhvata:

a. transgenetski faktor VII i

b. multispecifično antitelo usmereno protiv faktora IX i faktora X, za upotrebu u prevenciji ili lečenju poremećaja koagulacije, kao što je hemofilija A, određenije hemofilija A sa inhibitorima faktora VIII (FVIII).

[0021] Kombinovani proizvod poželjno je u obliku farmaceutske kompozicije koja istovremeno obuhvata transgenetski faktor VII i pomenuto antitelo.

[0022] Alternativno, transgenetski faktor VII i antitelo su u obliku odvojenih kompozicija izvedenih za istovremeno ili odvojeno (na primer uzastopno) davanje pacijentu.

[0023] Drugi predmet ovog pronalaska nadalje se odnosi na komplet koji obuhvata:

- Jedan kontejner koji sadrži transgenetski faktor FVII; i

- Drugi kontejner koji sadrži antitelo usmereno protiv faktora IX i faktora X.

Nacrt:

[0024]

Fig.1: Procena sinergetskog trombogenog efekta kombinacije Sevenfact<™>+ Hemlibra<®>na 1. šaržu plazme hemofilije A nakon indukovanja TF/PL-om. (A) Procena sinergetskog trombogenog efekta na ETP, (B) Procena sinergetskog trombogenog efekta na pik stvaranja trombina, (C) Procena sinergetskog trombogenog efekta na brzinu.

Fig.2: Procena sinergetskog trombogenog efekta kombinacije Sevenfact<™>+ Hemlibra<®>na 2. šaržu plazme hemofilije A nakon indukovanja TF/PL-om. (A) Procena sinergetskog trombogenog efekta na ETP, (B) Procena sinergetskog trombogenog efekta na pik stvaranja trombina, (C) Procena sinergetskog trombogenog efekta na brzinu.

Detaljan opis pronalaska

Opšte definicije

[0025] Fenomen koagulacije sadrži kaskadu enzimskih reakcija koje uključuju faktore koagulacije prisutne u obliku proenzima koji se, u prisustvu određenih kofaktora, pretvaraju proteolitičkim cepanjem u njihov „aktivniˮ oblik. Aktivni oblik svakog faktora prisutnog u obliku neaktivnog prekursora označen je slovom a. Dakle, FVlla nastaje, in vivo, cepanjem zimogena različitim proteazama (FIXa, FXa, FVlla) na dva lanca spojena disulfidnim mostom.

[0026] Pojam „lečenjeˮ ili „lečitiˮ uopšteno označava poboljšanje, profilaksu ili preokret bolesti ili poremećaja ili najmanje jednog simptoma, na primer usporavanje napredovanja bolesti ili stabilizaciju jednog simptoma. Podrazumeva se i odlaganje pojave bolesti ili poremećaja ili najmanje jednog simptoma.

[0027] Pojam „prevencijaˮ ili „preveniratiˮ označava smanjenje rizika od razvoja ili sticanja bolesti ili naznačenog poremećaja.

[0028] U kontekstu ovog pronalaska, pod „pacijentomˮ ili „subjektomˮ podrazumeva se svaki sisar, a određenije ljudska bića, muškarci ili žene, svih uzrasta, uključujući i decu.

[0029] Pojam „farmaceutska kompozicijaˮ upućuje na preparate koji omogućavaju biološku aktivnost aktivnih supstanci i ne sadrže nikakvu dodatnu komponentu koja je toksična za subjekte kojima se ta kompozicija daje.

Transgenetski faktor VII

[0030] Pojam „Faktor VIIˮ ili „FVIIˮ uključuje polipeptide koji obuhvataju sekvencu 1-406 humanog faktora VII divljeg tipa (kao što je opisano u patentu U. S.4,784, 950) ili FVII koji potiče od druge vrste (na primer goveđi, svinjski, pseći, pacovski/mišji). Obuhvata i prirodne alelske varijacije faktora VII koje mogu postojati i sve oblike ili stepene glikozilacije ili druge posttranslacione modifikacije. Pojam „Faktor VIIˮ uključuje i varijante FVII koje imaju istu ili veću biološku aktivnost u odnosu na aktivnost divljeg oblika, pri čemu te varijante naročito uključuju polipeptide koji se od divljeg FVII razlikuju za umetanje, brisanje ili supstituciju jedne aminokiseline ili više njih.

[0031] U ovom opisu, pojam „Faktor VIIˮ bez razlike upućuje na nepocepani FVII (zimogen) ili na aktivirani Faktor VII (FVlla), osim ukoliko je drugačije navedeno.

[0032] Dakle, FVlla se sastoji od lakog lanca od 152 aminokiseline molekulske mase od približno 20 kDa i teškog lanca od 254 aminokiseline molekulske mase od približno 30 kDa međusobno povezanih jednim disulfidnim mostom (Cys135-Cys262).

[0033] Pod „rekombinantnim faktorom VIIˮ podrazumevaju se svi faktori VII koji su dobijeni genetičkim inženjeringom i nastaju ekspresijom odgovarajućeg gena u bilo kom mikroorganizmu, biljci ili transgenetskoj biljci. Pod mikroorganizmom podrazumeva se bilo koji bakterijski, gljivični, virusni ili ćelijski sistem. Rekombinantni faktor VII mogu proizvoditi i eukariotske ćelije u kulturi kao što su ćelije biljke ili sisara, na primer životinjske ili humane ćelije.

[0034] Pod „transgenetskim faktorom VIIˮ podrazumeva se bilo koji rekombinantni faktor VII dobijen iz životinje koja je transgenetska za faktor VII.

[0035] Pod „transgenetskom životinjomˮ podrazumeva se bilo koja nehumana životinja sa modifikacijom genoma radi omogućavanja ekspresije proteina od interesa (ovde faktora VII).

Modifikacija genoma može se dobiti promenom, modifikacijom ili umetanjem gena. Ta modifikacija može biti posledica dejstva klasičnih sredstava za promenu ili mutagenih sredstava ili se može izvesti mestospecifičnom mutagenezom. Modifikacija genoma može se dobiti i umetanjem jednog gena ili više njih ili zamenom jednog gena ili više njih u njegovom (njihovom) divljem ili mutiranom obliku. Transgenetska životinja može se izabrati, bez ograničavanja, iz grupe koju čine kunić, koza, krava, kamila, hrčak, miš, pacov, konj, prasica, jednogrba kamila, ovca, lama. U jednom određenom načinu ostvarivanja, može se izabrati životinja koja ne eksprimuje α1,3-galaktoziltransferazu.

[0036] Pod izrazom „biološka aktivnost faktora VIIaˮ podrazumeva se mogućnost FVlla da stvara trombin, na primer na površini aktivnih trombocita. Aktivnost faktora VII može se proceniti na različite načine. Biološka aktivnost FVlla može se na primer kvantifikovati merenjem mogućnosti kompozicije FVII da podstakne koagulaciju krvi uz upotrebu plazme sa nedostatkom FVII i tromboplastina, kao što je opisano na primer u patentu US br.5,997,864. U tom je ispitivanju biološka aktivnost procenjena u odnosu na kontrolni uzorak i pretvorena u „jedinice FVIIˮ poređenjem sa pulovanim standardnim humanim serumom koji sadrži 1 jedinicu/ml aktivnosti Faktora VII. Alternativno se biološka aktivnost faktora VII može kvantifikovati (i) merenjem mogućnosti Faktora Vlla da proizvede faktor Xa u sistemu koji obuhvata tkivni faktor (TF) uključen u lipidnu membranu i Faktor X (Persson et al. J. Biol. Chem.272: 19919- 19924, 1997); (ii) merenjem hidrolize faktora X u vodenom sistemu; (iii) merenjem fizičkog vezivanja FVlla za TF pomoću rezonancije površinskog plazmona (Persson , FEBS letts, 413 :359-363, 1997), (iv) merenjem hidrolize sintetičkog supstrata ili (v) merenjem stvaranja trombina u sistemu in vitro nezavisno od TF-a.

[0037] U poželjnom načinu ostvarivanja, ovde opisani FVII predstavlja polipeptid čija peptidna sekvenca može biti peptidna sekvenca prirodnog humanog FVII, to jest sekvenca prisutna kod ljudi koji nemaju poremećaje povezane sa FVII. Jedna takva sekvenca opisana je u dokumentu EP 0200421.

[0038] Sekvenca FVII korišćena u ovom pronalasku poželjno predstavlja sekvencu SEQ ID NO: 1.

[0039] Pod „sinergijomˮ ili „sinergetskim efektomˮ poželjno se podrazumeva efekat kombinacije dvaju proizvoda 2 puta veći od zbira efekata svakog od proizvoda uzetih zasebno. Prema ovom pronalasku, sinergetski efekat se dobija kada upotreba transgenetskog FVlla u kombinaciji sa multispecifičnim antitelom usmerenim protiv faktora IX i faktora X omogućava dobijanje 2 puta većeg efekta od zbira efekta dobijenog samo transgenetskim FVlla i efekta dobijenog samo multispecifičnim antitelom usmerenim protiv faktora IX i faktora X, na najmanje jedan parametar stvaranja trombina. Parametar stvaranja trombina bira se iz grupe koju čine visina pika, brzina ili potencijal endogenog trombina (ETP).

[0040] U jednom određenom načinu ostvarivanja, FVlla se daje u koncentraciji manjoj od ili jednakoj 105 nM, poželjno manjoj od 100 nM.

[0041] U jednom određenom načinu ostvarivanja, multispecifično antitelo usmereno protiv faktora IX i faktora X daje se u koncentraciji manjoj od 600 nM, poželjno manjoj od 550 nM, poželjno manjoj od 500 nM, poželjno manjoj od 450 nM, poželjno manjoj od 400 nM, poželjno manjoj od 350 nM, poželjno manjoj od 325nM.

[0042] U jednom određenom načinu ostvarivanja, faktor VII se dobija iz mleka transgenetske životinje.

[0043] Postupak za dobijanje rekombinantnog proteina u mleku transgenetske životinje može sadržati sledeće faze: u embrion nehumanog sisara ugrađuje se sintetički molekul DNK koji obuhvata gen koji kodira protein od interesa (ovde na primer humani FVII), pri čemu je taj gen pod kontrolom promotora proteina koji se prirodno luči u mleko. Zatim se embrion smešta u ženku sisara iste vrste. Kada se sisar iz tog embriona dovoljno razvije, izaziva se laktacija sisara pa se uzima mleko. Mleko tada sadrži FVII od interesa koji je izlučila transgenetska životinja.

[0044] Primer dobijanja proteina u mleku ženke sisara koji nije ljudsko biće dat je u patentnoj prijavi EP0527063, čiji se sadržaj može primeniti na proizvodnju faktora VII ovog pronalaska.

[0045] Lučenjem faktora VII mlečnim žlezdama, čime se omogućava njegovo lučenje u mleko transgenetskog sisara, podrazumeva se kontrola ekspresije faktora VII na tkivno zavisan način. Takvi su postupci za kontrolu dobro poznati stručnjaku iz ove oblasti. Kontrola ekspresije izvodi se preko sekvenci koje omogućavaju ekspresiju proteina ka određenom tkivu. Reč je naročito o promotorskim sekvencama WAP-a, beta-kazeina, beta-laktoglobulina i signalnim peptidnim sekvencama, pri čemu taj spisak nije ograničavajući.

[0046] U poželjnom načinu ostvarivanja, faktor VII prema ovom pronalasku dobija se u mleku transgenetskih ženki kunića.

[0047] Ekspresija u mlečnim žlezdama ženke kunića posebno se poželjno izvodi pod kontrolom promotora beta-kazeina koji je dobro poznat stručnjaku iz ove oblasti. Određenije, plazmid koji sadrži promotor beta-kazeina proizvodi se uvođenjem sekvence koja sadrži promotor gena beta-kazeina, pri čemu se taj plazmid izvodi tako da može da primi strani gen koji je pod kontrolom tog promotora.

Ugrađuje se gen koji kodira humani FVII i koji je pod kontrolom promotora beta-kazeina. Plazmid koji sadrži promotor i sekvencu koja kodira protein od interesa digestuju restrikcioni enzimi kako bi oslobodili fragment DNK koji sadrži promotor beta-kazeina i sekvencu humanog FVII. Nakon prečišćavanja, fragmenti se uvode, mikroinjektiranjem u muški pronukleus embriona ženki kunića divljeg tipa. Embrioni se potom uzgajaju pre prebacivanja u jajovod hormonski pripremljenih ženki divljeg tipa. Na porođaju tih ženki, PCR-om se procenjuje potomstvo kako bi se odredile transgenetske životinje. Broj kopija transgena i njegov integritet otkriva se Saudern tehnikom na osnovu DNK ekstrahovane iz dobijene transgenetske mladunčadi kunića. Imunoenzimskim testovima procenjuje se koncentracija humanog FVII koji se eksprimuje u mleku transgenetskih ženskih potomaka.

[0048] U jednom određenom načinu ostvarivanja, faktor VII koji je koristan u ovom pronalasku dobija se postupkom koji obuhvata sledeće faze:

(a) umetanje DNK sekvence koja obuhvata gen koji kodira faktor VII u embrion nehumanog sisara, pri čemu je pomenuti gen pod transkripcionom kontrolom promotora beta-kazeina, (b) prebacivanja embriona dobijenog u fazi a) u jajovod ženki nehumanog sisara kako bi se razvio u odraslog nehumanog sisara,

(c) izazivanje laktacije kod odraslog nehumanog sisara ženskog roda dobijenog u fazi b) ili kod ženskog potomka tog nehumanog sisara u čijem su genomu prisutni gen i promotor,

(d) uzimanje mleka pomenutog nehumanog sisara i

(e) prečišćavanje FVII prisutnog u uzetom mleku.

[0049] Ovde koristan transgenetski FVII ima suštinski homogenu izoelektričnu tačku.

[0050] Pod „izoelektričnom tačkomˮ ili „pl-omˮ podrazumeva se pH za koji je neto elementarno naelektrisanje molekula faktora VII ili faktora Vlla jednako nuli, to jest pH na kom je molekul elektroneutralan (cviterjonski oblik). Izoelektrična tačka faktora VII prema ovom pronalasku može se izmeriti izvođenjem tehnike koja je dobro poznata stručnjaku iz ove oblasti kao što je izoelektrično fokusiranje ili „iso-electric focusingˮ („IEFˮ). Ta elektroforetska tehnika omogućava razdvajanje proteina na osnovu njihove izoelektrične tačke. Ona se sastoji od migracije proteina, izazvane uniformnom električnom strujom, u pH gradijent sve dok oni ne dostignu pH koji je jednak njihovoj specifičnoj izoelektričnoj tački, kada prestaju da migriraju budući da je njihovo neto naelektrisanje jednako nuli. Za određivanje izoelektrične tačke datog proteina koriste se IEF gelovi.

[0051] Pod „suštinski homogenimˮ podrazumeva se da najmanje 90%, poželjno najmanje 95% molekula faktora VII kompozicije ima izoelektričnu tačku u opsegu odstupanja pH jedinice manjem od ili jednakom 1,2. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska najmanje 50%, poželjno najmanje 55%, poželjno 60% molekula transgenetskog faktora VII kompozicije ima izoelektričnu tačku u opsegu odstupanja pH jedinice manjem od 1, poželjno manjem od 0,5. U drugom poželjnom načinu ostvarivanja, najmanje 50%, poželjno najmanje 55%, poželjno 60% molekula faktora VII kompozicije ima izoelektričnu tačku u opsegu odstupanja pH jedinice od 0,4.

[0052] Pod „N-glikanskim oblicimaˮ podrazumeva se skup N-glikanskih oblika prisutnih na dvama mestima N-glikozilacije faktora VII ovog pronalaska. N-glikanski oblici su jednostruko naelektrisani ako je njihovo ukupno naelektrisanje jednako 1. U kontekstu ovog pronalaska, pod „naelektrisanjemˮ se podrazumeva fosfatna grupa, sulfatna grupa ili molekul sijalinske kiseline. Tako su N-glikanski oblici jednostruko naelektrisani ako sadrže isključivo jednu fosfatnu grupu ili jednu sulfatnu grupu ili jedan molekul sijalinske kiseline. Za razliku od pojma „jednostruko naelektrisanˮ, pojam „dvostruko naelektrisanˮ označava da je ukupno naelektrisanje koje nose N-glikanski oblici jednako 2, to jest da oni imaju dva naelektrisanja izabrana od fosfatne grupe, sulfatne grupe i/ili molekula sijalinske kiseline. Drugačije rečeno, dvostruko naelektrisani N-glikanski oblici poseduju jedan molekul sijalinske kiseline i jednu fosfatnu grupu ili jedan molekul sijalinske kiseline i jednu sulfatnu grupu ili dva molekula sijalinskih kiselina ili dve fosfatne grupe ili dve sulfatne grupe ili jednu fosfatnu grupu i jednu sulfatnu grupu. Pojam „trostruko naelektrisanˮ označava da je ukupno naelektrisanje koje nose N-glikanski oblici jednako 3, to jest da oni imaju tri naelektrisanja izabrana od fosfatne grupe, sulfatne grupe i/ili molekula sijalinske kiseline. Drugačije rečeno, trostruko naelektrisani N-glikanski oblici poseduju jedan molekul sijalinske kiseline i jednu fosfatnu grupu i jednu sulfatnu grupu ili dva molekula sijalinske kiseline i jednu fosfatnu grupu ili dva molekula sijalinske kiseline i jednu sulfatnu grupu ili jednu grupu sijalinske kiseline i dve fosfatne grupe ili jednu grupu sijalinske kiseline i dve sulfatne grupe ili jednu fosfatnu grupu i dve sulfatne grupe ili jednu sulfatnu grupu i dve fosfatne grupe ili tri molekula sijalinske kiseline ili tri fosfatne grupe ili tri sulfatne grupe. Što se tiče pojma „neutralanˮ, on označava da N-glikanski oblici ne sadrže nikakvo naelektrisanje.

[0053] Naelektrisanje N-glikanskih oblika faktora VII prema ovom pronalasku može se izmeriti izvođenjem tehnike koja je dobro poznata stručnjaku iz ove oblasti, naročito tečnom hromatografijom ultra visokih performansi sa smolom za izmenu anjona uparenom sa fluorescentnom detekcijom (AEX-UPLC/FD). Ta metoda omogućava razdvajanje različitih N-glikanski oblika u zavisnosti od njihovog prividnog naelektrisanja (vidi naročito, Hermentin et al, Glycobiology, vol.6, no.2, 1996). U kontekstu hromatografije za anjonsku izmenu, kao stacionarna faza koristi se pozitivno naelektrisana smola. Te se pozitivno naelektrisane smole uglavnom sastoje od umreženog polimera ili gela na koji se kaleme pozitivno naelektrisane grupe. U poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, koristi se slaba kolona za izmenu anjona aminopropilnog tipa.

[0054] U slučaju kompozicije faktora VII prema ovom pronalasku, čini se da je među svim N-glikanskim oblicima faktora VII kompozicije, najmanje 50% N-glikanskih oblika, najmanje 60% N-glikanskih oblika, poželjno najmanje 65%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjno najmanje 95% jednostrano naelektrisano. U poželjnom načinu ostvarivanja, molekuli faktora VII koji imaju jednostrano naelektrisane N-glikanske oblike čine između 50% i 95% molekula faktora VII kompozicije, poželjno između 50% i 90% molekula faktora VII kompozicije, poželjno između 50% i 80% molekula faktora VII kompozicije, poželjno između 50% i 75% molekula faktora VII kompozicije, poželjno između 50% i 70% molekula faktora VII kompozicije, poželjno između 50 i 65% molekula faktora VII kompozicije, poželjno između 50% i 60% molekula faktora VII kompozicije.

[0055] Suštinski homogena izoelektrična tačka kompozicije faktora VII kombinacije prema ovom pronalasku proizilazi iz kombinacije karakteristika glikozilacije i γ-karboksilacije molekula FVII koji je čine.

[0056] Ovde korisni transgenetski faktor VII ima karakteristike posttranslacionih modifikacija. Naročito je reč o modifikacijama glikozilacije, kao što su dva mesta N-glikozilacije sa nultim ili veoma niskim procentom Galα1,3Gal u kompoziciji FVII ili sasvim niskim kako ne bi bila imunogena. Nasuprot tome, ovde opisani FVII nije plazmatični FVII, to jest ne predstavlja proizvod prečišćen iz humane ili životinjske plazme. Određenije, ovde korisni transgenetski FVII ima posttranslacione modifikacije, kao što su dva mesta O-glikozilacije sa definisanim glikanskim obrascima, jedna γ-karboksilacija i specifični disulfidni mostovi.

[0057] Ovde korisni FVlla može sadržati više posttranslacionih modifikacija: devet ili deset prvih N-terminalnih glutaminskih kiselina su γ-karboksilovane, Asp63je delimično hidroksilovan, Ser52i Ser60su O-glikozilovani i redom imaju obrasce Glukoze(Ksiloze)0-2i Fukoze, Asn145i Asn322su N-glikozilovani uglavnom monosijalo biantenarnim složenim strukturama.

[0058] Ovde korisni molekuli transgenetskog faktora VII poželjno imaju, najmanje 80% njih, γkarboksilaciju na devet ostataka glutaminske kiseline. U drugom načinu ostvarivanja, najmanje 85% pomenutih molekula imaju γ-karboksilaciju na devet ostataka glutaminske kiseline. U drugom načinu ostvarivanja, između 85% i 100%, poželjno između 90% i 100%, poželjno između 95% i 100% pomenutih molekula imaju γ-karboksilaciju na devet ostataka glutaminske kiseline. Procenat γ-karboksilacije na ostatku glutaminske kiseline 35 (Glu 35) molekula faktora VII kompozicije poželjno je manji od 20%. U drugom načinu ostvarivanja, procenat γ-karboksilacije ostatka Glu35 je manji od 15%, poželjno manji od 10%, poželjno manji od 5%.

[0059] Obrazac Gala1,3Gal predstavlja složenu strukturu dveju galaktoza povezanih na α1,3. Smešten je na kraju oligosaharidnih antena N-povezanih struktura. Taj je obrazac poznat po svojoj imunogenosti. Zato se prednost daje proizvodnji FVII ili FVlla čiji je procenat strukture Galα1,3Gal nulti ili toliko slab da se ne može razlučiti od pozadinskog šuma dobijenog merenjima izvedenim trenutno dostupnim uređajima za analizu. Ta ekspresija podjednako označava sve transgenetske FVII čiji je procenat Galα1,3Gal približan procentu plazmatičnog FVII. Procenat Galα1,3Gal kompozicije ovde opisanog FVII poželjno nije imunogen za čoveka. Uz to, ovde korisni FVII poželjno sadrži, kao humani FVII, dva mesta N-glikozilacije, na položaju 145 i 322, i 2 mesta O-glikozilacije, na položaju 52 i 60. U jednom mestu N-glikozilacije, oligosaharidni lanci su povezani sa asparaginom (N-povezani). U jednom mestu O-glikozilacije, oligosaharidni lanci su povezani sa serinom. Obrasci povezani na te aminokiseline biće različiti za svaki protein kompozicije. Međutim, moguće je kvantifikovati procenat svakog glikanskog obrasca ili svakog šećera za celu kompoziciju.

[0060] Dati procenti različitih glikana u ovoj prijavi ne uzimaju u obzir O-glikozilaciju.

[0061] Kompoziciju FVII poželjno odlikuje to što je, od svih glikanskih obrazaca FVII kompozicije, najmanje 40% u monosijalo biantenarnim glikanskim oblicima. U drugom načinu ostvarivanja, monosijalo biantenarni oblici prisutni su u najmanje 50%. U drugom načinu ostvarivanja, monosijalo biantenarni oblici prisutni su u najmanje 60%, poželjno najmanje 65%, poželjno najmanje 70%.

[0062] Monosijalo biantenarni glikanski oblici FVII su poželjno u većini. Kompoziciju FVII odlikuje to što najmanje neke od sijalinskih kiselina faktora VII uključuju α2-6 veze.

[0063] Najmanje 65% sijalinskih kiselina FVII poželjno uključuje α2,6 veze. Najmanje 70%, čak 80% a, naročito, najmanje 90% sijalinskih kiselina FVII veoma poželjno uključuje α2,6 veze.

[0064] Sve sijalinske kiseline naročito poželjno uključuju α2,6 veze, to jest sve sijalinske kiseline su povezane sa galaktozom pomoću α2,6 veze. Ovde opisana kompozicija FVII može nadalje obuhvatati sijalinske kiseline α2-3 veza.

[0065] Prema načinima ostvarivanja ovog pronalaska, od 65% do 100% sijalinskih kiselina FVII uključuje α2,6 veze. Od 70% ili 80% do 100% sijalinskih kiselina FVII poželjnije uključuje α2,6 veze.

[0066] Među monosijalo biantenarnim glikanskim oblicima FVII, većina glikanskih oblika poželjno nije fukozilovana.

[0067] Ti su nefukozilovani monosijalo biantenarni glikanski oblici poželjno prisutni u FVII kompozicije u procentu većem od 20%. Taj je procenat poželjno veći od 25% ili veći od 40%. Procenat fukozilacije kompozicije FVII naročito je poželjno u opsegu između 20% i 50%. U jednom načinu ostvarivanja, taj procenat može biti manji od 20%.

[0068] U jednom određenom načinu ostvarivanja, najmanje 10%, poželjno najmanje 15%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 25% N-glikanskih oblika faktora VII kompozicije su visokomanozni/hibridni.

[0069] Ovde opisani profil glikozilacije poželjno daje FVII-u poboljšanu biološku aktivnost i stabilnost. Kompozicije faktora VII sa suštinski homogenom izoelektričnom tačkom olakšavaju fazu formulisanja na optimalnoj pH, poželjno na optimalnoj pH od 6,0 ± 0,2, pri čemu farmaceutske kompozicije izbegavaju taloženje FVII. Naime, poznato je da će one, na izoelektričnoj tački molekula, imati težnju da se sakupljaju i talože. Molekuli faktora VII koji se koriste u kompoziciji ovog pronalaska imaju izoelektričnu tačku u opsegu između 6,6 i 7,0. Time se postiže bolja stabilnost kompozicije faktora VII, naročito kada se ona formuliše na pH nižem od izoelektrične tačke, a određenije na pH 6,0. Poboljšavanje stabilnosti kompozicije faktora VII omogućava izbegavanje elektrostatičkih interakcija koje su odgovorne za fenomene taloženja i sakupljanja rastvorljivog i nerastvorljivog tipa, kao i izbegavanje gubitka sirovina pa tako i smanjenja prinosa koje dovodi do gubitka količine aktivne supstance i samim tim potencijalno do gubitka aktivnosti.

[0070] U poželjnom načinu ostvarivanja, transgenetski FVII proizvodi ženka kunića u svom mleku čime se omogućava dobijanje kompozicije u kojoj svaki molekul faktora VII kompozicije ima dva mesta N-glikozilacije. Svi molekuli FVII kompozicije poželjno imaju procenat glikanskih obrazaca Galα1,3Gal manji od 4%, čak nulti. Tako transgenetski FVII koji proizvodi ženka kunića poželjno ne poseduje glikanski obrazac Galα1,3Gal.

[0071] FVII se može prečistiti iz mleka pomoću tehnika poznatih stručnjaku iz ove oblasti. Na primer, postupak za prečišćavanje proteina od interesa iz mleka, kao što je opisan u patentu US 6,268,487, može obuhvatati sledeće faze koje se sastoje od: a) podvrgavanja mleka tangencijalnoj filtraciji na membrani čija je poroznost dovoljna za obrazovanje retentata i permeata, pri čemu permeat sadrži egzogeni protein, b) podvrgavanja permeata uređaju za hromatografsko hvatanje kako bi se pomerio egzogeni protein i dobio efluent, c) spajanja efluenta i retentata, d) ponavljanja faza a) do c) sve dok se FVII ne odvoji od lipida, kazeinskih micela i dok se ne izdvoji FVII.

[0072] FVII ovog pronalaska poželjno je u aktivnom obliku. U jednom načinu ostvarivanja, FVII se može aktivirati in vitro faktorima Xa, Vlla, Ila, IXa ili Xlla. FVII se obično može aktivirati i tokom postupka za njegovo prečišćavanje, određenije prolaskom kroz pozitivno naelektrisane hromatografske kolone.

Multispecifično antitelo

[0073] Pod „multispecifičnim antitelomˮ podrazumeva se svako antitelo koje poseduje najmanje dva mesta specifičnog vezivanja za najmanje dva različita antigena ili različita epitopa istog antigena. Pojam „specifičnoˮ označava da antitelo može da prepozna i veže jedan antigen, suštinski bez unakrsne reakcije sa drugim antigenom. Antitelo poželjno ispoljava konstantu afiniteta Kd od najmanje 10<-6>M, poželjno najmanje 10<-7>M, još poželjnije najmanje 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M prema svakom antigenu.

[0074] Dakle, antitela korisna u ovom pronalasku mogu istovremeno da se vezuju specifično za faktor koagulacije IX i za faktor koagulacije X u aktivnom ili neaktivnom obliku. Antitelo korišćeno u ovom pronalasku, koje istovremeno može da se veže specifično za faktor koagulacije IX i za faktor koagulacije X poželjno može da deluje kao zamena faktora VIII (FVIII), što znači da antitelo daje prednost aktivaciji FX-a FIXa-om.

[0075] Takva multispecifična antitela, poželjno bispecifična, mogu se dobijati pomoću raznih postupaka koji su poznati stručnjaku iz ove oblasti, na primer hemijskom konjugacijom ili upotrebom kvadroma, koji nastaju fuzijom dvaju hibridoma čime se dobijaju dva različita monoklonska antitela; ili genetskom rekombinacijom.

[0076] Dakle, polinukleotidi koji kodiraju takva antitela mogu se umetnuti u ekspresione vektore i eksprimovati u ćelijama ili organizmima domaćinima izvedenim pomoću tehnika koje su dobro poznate stručnjaku iz ove oblasti.

[0077] Ovde korisna antitela mogu biti veoma jednostavnog formata, izrađena od fragmenata Fv u jednostavan lanac (scFv) dvaju ili više antitela, povezanih prilagođenim peptidnim linkerom. Pod „Fv-omˮ se podrazumeva najmanji fragment antitela koji zadržava karakteristike prepoznavanja antigena i vezivanja za njega. Fragment „Fvˮ je dimer (dimer VH+ VL) koji se sastoji od varijabilnog regiona (VH) kog nosi teški lanac (H) i susednog varijabilnog regiona (VL) kog nosi laki lanac (L).

[0078] Alternativno, može biti reč o antitelima pune dužine, koja poželjno sadrže Fc region. Moguće je nekoliko formata. Na primer, u prvom formatu su scFv fragmenti antitela A spojeni na krajevima teških lanaca antitela B (uglavnom N-terminalnim). Dobijeno antitelo ima jednu vrstu teškog lanca koja sadrži domene VH, CH1, CH2 i CH3 antitela B i domene VH i VL antitela A i jednu vrstu lakog lanca koja sadrži domene VL i CL antitela B (Qu et al. Blood, 111, 2211-2219, 2008). U drugom formatu, teški lanac i laki lanac antitela A povezani su sa teškim lancem i lakim lancem antitela B. Po potrebi se mogu uvesti mutacije, na primer tipa „ispupčenja u udubljenjaˮ (Ridgway et al, Protein Eng, 9, 617-21, 1996; patent US 7,695,936) kako bi se izbegle neusklađenosti.

[0079] U ovom opisu, pojam „Faktor IXˮ bez razlike upućuje na neaktivirani Faktor IX ili na aktivirani Faktor IX (FIXa), osim ukoliko je drugačije navedeno.

[0080] U ovom opisu, pojam „Faktor Xˮ bez razlike upućuje na neaktivirani Faktor X ili aktivirani Faktor X (FXa), osim ako je drugačije navedeno.

[0081] Antitelo koje prepoznaje (i) FIX i/ili FIXa i (ii) FX i/ili FXa može se dobiti naročito prema postupcima opisanim u patentnim prijavama WO2005/035756, WO2006/109592 ili WO2012/067176.

[0082] U poželjnom načinu ostvarivanja, pomenuto antitelo je emicizumab. Proizvodnja tog antitela opisana je na primer u patentnoj prijavi WO2018047813 ili patentnoj prijavi EP1688488.

Farmaceutske kompozicije i doziranja

[0083] Faktor VII i antitelo mogu se formulisati u obliku farmaceutskih kompozicija koje su odvojene ili spojene u istoj farmaceutskoj kompoziciji. U slučaju odvojenog davanja, FVII i antitelo mogu se formulisati tako da se prilagode različitim ili istovetnim načinima davanja.

[0084] Tako se FVII može davati na primer intravenski, potkožno ili intramuskularno.

[0085] Antitelo se takođe može davati na primer intravenski, potkožno ili intramuskularno.

[0086] Kompozicija Faktora VII može na primer biti ista kao kompozicija opisana u patentnoj prijavi WO2010/149907.

[0087] Tako kompozicija, u primernom načinu ostvarivanja, obuhvata:

- faktor VII, poželjno u obliku faktora Vlla;

- arginin, eventualno u obliku hidrohlorida;

- izoleucin;

- lizin;

- glicin;

- trinatrijumcitrat ili kalcijumhlorid;

- i, po potrebi, polisorbat 80 ili polisorbat 20.

[0088] Određenije, kompozicija može obuhvatati:

- faktor VII, poželjno u obliku faktora Vlla;

- od 10 do 40 g/l arginina, eventualno u obliku hidrohlorida;

- od 4,2 do 6,6 g/l izoleucina;

- od 0,6 do 1,8 g/l lizina;

- od 0,6 do 1,8 g/l glicina;

- od 0 do 0,2 g/l trinatrijumcitrata ili od 1 do 2 g/L kalcijumhlorida;

- i, po potrebi, od 0 do 0,5 g/l polisorbata 80.

[0089] Kompozicija FVII, koja eventualno obuhvata i najmanje jedno multispecifično antitelo kao što je ovde opisano, može se skladištiti u tečnom obliku ili u čvrstom obliku, koji se obično dobijaju sušenjem. Goreotkrivene koncentracije utvrđene su spram kompozicija u tečnom obliku, pre sušenja ili nakon rekonstitucije u obliku preparata za ubrizgavanje.

[0090] Sušenje je postupak za eliminisanje vode do krajnjih granica. Reč je o dehidrataciji čiji je cilj da eliminiše što više vode. Taj fenomen može biti prirodan ili prisilan. Ovo se sušenje može izvoditi pomoću tehnika liofilizacije, atomizacije i krioatomizacije.

[0091] Liofilizacija predstavlja ovde opisani poželjni način dobijanja čvrstog oblika kompozicije za farmaceutsku upotrebu.

[0092] Postupci za liofilizaciju su dobro poznati stručnjaku iz ove oblasti, vidi na primer [Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000].

[0093] Mogu se zamisliti i drugi postupci prikladni za smanjivanje stepena vlažnosti ili sadržaja vode kompozicije. Stepen vlažnosti je poželjno manji od ili jednak 3mas.%, poželjno manji od ili jednak 2,5%, poželjno manji od ili jednak 2%, poželjno manji od ili jednak 1,5%.

[0094] Čvrsta kompozicija, poželjno u liofilizovanom obliku, može se rastvarati u vodi za preparate za ubrizgavanje (ili „vodi za injekcije ili WFIˮ) kako bi se dobila formulacija za terapijsku primenu.

[0095] Formulacija za ubrizgavanje može se davati parenteralno (intravenski, potkožno, intramuskularno) u količini koju prepiše lekar. Nije isključeno davanje tečnog oblika (pre sušenja) ili čvrstog oblika na bilo koji način i bilo kojim prikladnim sredstvom.

[0096] Doziranje FVII koje je korisno u ovom pronalasku, može se prikladno odrediti u skladu sa vrstom formulacije, načinom davanja, uzrastom i masom pacijenta, simptomima pacijenta, težinom bolesti, itd.

[0097] Doza FVII koju treba dati prema ovom pronalasku može se poželjno odabrati između 270 µg/kg i 2,70 µg/kg. Doza FVII koju treba dati poželjno je manja od 270 µg/kg telesne mase, poželjno je manja od 225 µg/kg telesne mase, poželjno je manja od 180 µg/kg telesne mase, poželjno je manja od 135 µg/kg telesne mase, poželjno je manja od 90 µg/kg telesne mase, poželjno je manja od 45 µg/kg telesne mase, poželjno je manja od 9 µg/kg, poželjno je manja od 5,4 µg/kg, poželjno je manja od 2,7µg/kg.

[0098] Kompozicija multispecifičnog antitela, kao što je antitelo emicizumab, ista je kao na primer kompozicije opisane u patentnim prijavama WO2017/188356 i WO2018/047813.

[0099] Tako, u primernom načinu ostvarivanja, kompozicija predstavlja tečnu kompoziciju.

[0100] U primernom načinu ostvarivanja, kompozicija obuhvata:

- bispecifično antitelo faktora IX i faktora X,

- surfaktant kao što je poloksamer 188 ili polisorbat 20

- pufer histidina-asparaginske kiseline

- arginin.

[0101] Određenije, kompozicija može obuhvatati:

- od 20 mg/mL do 180 mg/mL bispecifičnog antitela faktora IX i faktora X,

- od 0,2 mg/mL do 1 mg/mL poloksamera 188,

- od 10 mM do 40 mM pufera histidina-asparaginske kiseline

- od 100 mM do 300 mM arginina,

na pH u rasponu između 4,5 i 6,5.

[0102] Doziranje kompozicije multispecifičnog antitela, kao što je antitelo emicizumab, koje je korisno u ovom pronalasku, može se prikladno odrediti u skladu sa vrstom formulacije, načinom davanja, uzrastom i masom pacijenta, simptomima pacijenta, težinom bolesti, itd. Doza antitela može na primer iznositi od 0,3 do 5 mg/kg, poželjno najviše 3 mg/kg jednom sedmično tokom perioda uvođenja, koji može trajati na primer 4 sedmice, nakon čega sledi doza održavanja, koja je poželjno snižena, na primer od 1,5 mg/kg jednom sedmično. Doza antitela koja se daje poželjno je manja od 5 mg/kg telesne mase, poželjno je manja od 3 mg/kg telesne mase, poželjno je manja od 1,5 mg/kg telesne mase, poželjno je manja od 1 mg/kg telesne mase, poželjno je manja od 0,5 mg/kg telesne mase, poželjno je manja od 0,1 mg/kg telesne mase, poželjno je manja od 0,05 mg/kg telesne mase.

[0103] Kompozicija antitela koja je korisna u ovom pronalasku može se davati pacijentu na bilo koji prikladan način, na primer, intravenski, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, transdermalno, potkožno, intraartikularno, sublingvalno, intrasinovijalno, oralno ili inhalacijom. Prednost se poželjno daje intravenskom ili potkožnom načinu davanja.

[0104] Prema jednom određenom načinu ostvarivanja, faktor VII i antitelo se istovremeno daju pacijentu.

[0105] Prema drugom određenom načinu ostvarivanja, faktor VII i antitelo se odvojeno daju pacijentu, poželjno uzastopno.

Terapijske indikacije

[0106] Ovdeopisana kombinacija omogućava prevenciju ili lečenje poremećaja koagulacije, naročito hemofilije sa nedostatkom faktora VIII (hemofilije tipa A, poželjno stečene hemofilije A).

[0107] Pacijenti poželjno predstavljaju pacijente koji imaju hemofiliju tipa A, sa anti-Faktorom VIII.

[0108] Ovdeopisana kombinacija omogućava prevenciju ili lečenje poremećaja koagulacije, naročito nedostataka faktora VII.

[0109] Ovde opisana kombinacija omogućava udruživanje brzog efekta FVII koji aktivira spoljašnji put kaskade koagulacije i produženog efekta ovde opisanih multispecifičnih antitela koja aktiviraju unutrašnji put kaskade koagulacije. Kombinacija omogućava pružanje bolje nege pacijentima.

Primeri:

Primer 1: Prečišćavanje i ekstrahovanje transgenetskog FVII

[0110] Postupak za prečišćavanje i ekstrahovanje faktora VII koji se izvodi u ovom primeru predstavlja postupak opisan u prijavi EP12305882. Faze tog postupka opisane su u nastavku. Mleko transgenetskih ženki kunića dobijeno je od potomstva transgenetskih ženki kunića. Zamrznuto mleko transgenetskih ženki kunića odmrznuto je i koncentrovano u obliku pulovanog mleka transgenetskih ženki kunića.

[0111] Zatim je tako dobijeno pulovano mleko transgenetskih ženki kunića podvrgnuto fazi bistrenja pomoću dubinskog filtera sa poroznošću od 0,2 µm kako bi se eliminisali lipidi i nerastvorljiva jedinjenja. Potom je tako izbistreno mleko podvrgnuto fazi virusne inaktivacije obradom pomoću rastvarača tipa deterdženta, na primer Polisorbata 80 ili Tri-n-Butil Fosfata na 25°C ± 2°C tokom najmanje dva sata. Takva obrada omogućava naročito efikasnu inaktivaciju virusa, a određenije, virusa tipa virusa bez omotača. Zatim je izbistreno i virusno neaktivno mleko podvrgnuto fazi afinitetne hromatografije koja koristi ligand sa specifičnim afinitetom za faktor VII/faktor Vlla. Potom je eluat faktora VII koji je dobijen nakon te faze hromatografije podvrgnut fazi ultrafiltracije i formulacije, čime se omogućava dobijanje koncentrata intermedijarnog faktora VII sa čistoćom od 95%.

[0112] Zatim je koncentrat intermedijarnog faktora VII podvrgnut fazi filtracije pomoću filtera sa poroznošću od 0,1 µm do 0,2 µm nakon koje je sledila faza nanofiltracije na filterima sa poroznošću od 20 nm pa 15 nm. Potom je tako dobijeni proizvod koji sadrži faktor VII podvrgnut fazi hromatografije tipa gel Q Sepharose XL pa fazi hromatografije tipa CHT-I nakon koje je sledila hromatografija tipa SEC Superdex 200. Zatim je tako dobijeni koncentrat faktora VII podvrgnut fazi stabilizacije pa filtracije na filteru sa poroznošću od 0,2 µm.

[0113] Tako opisani postupak omogućava dobijanje koncentrata faktora VII sa čistoćom od približno 99,9995%.

Primer 2: Poređenje trombogenog potencijala Novoseven<®>-a, Sevenfact<®>-a i Hemlibra<®>-e

[0114] Stručnjak iz ove oblasti može izmeriti trombogeni potencijal Novoseven<®>-a, Sevenfact<®>-a i Hemlibra<®>-e (koja se naziva i Emicizumabom) izvođenjem protokola u nastavku.

Reagensi:

[0115]

▪ kalibrator trombina (Stago)

▪ PPP reagens 5 pM (Stago)

▪ PPP slabi reagens (Stago)

▪ CK-Prest (Stago)

▪ Fluo-pufer (Stago)

▪ Fluo-supstrat (Stago)

▪ Plazma sa nedostatkom FVIII (Siemens)

▪ Sevenfact<®>/Transgenetski faktor VII kog proizvodi kunić 1 mg/ml (LFB)

▪ PNP (Cryopep)

▪ Novoseven<®>(NovoNordisk)

▪ Hemlibra<®>/Emicizumab (Roche / Genentech / Chugaï)

Postupak:

[0116] Test stvaranja trombina sastojao se od aktiviranja koagulacije ex vivo bilo mešavinom tkivnog faktora i fosfolipida (TF / PL) ili primenom cefalina pa merenja koncentracije trombina stvorenog tokom vremena.

• Merenje trombogenog potencijala Novoseven<®>-a nakon pokretanja koagulacije TF / PL-om:

[0117] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL PPP reagensa (Stago) koji sadrži 0,5 pM tkivnog faktora (TF) i 4 µM fosfolipida (PL). Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0118] Terapijska doza FVlla iznosi 270 µgkg, što odgovara 6 µg/mL FVlla u plazmi, ako se uzme u obzir rekuperacija od 100%. Test stvaranja trombina izvođen je na dozama Novoseven<®>-a od 0 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, 4 µg/mL, 5 µg/mL i 6 µg/mL, u prisustvu 0,5 pM TF-a / 2 µM PL-a (pokretača koagulacije).

• Merenje trombogenog potencijala Novoseven<®>-a nakon pokretanja koagulacije cefalinom:

[0119] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL cefalina (CK-Prest rekonstituisan sa 5 mL destilovane H20).

[0120] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0121] Test stvaranja trombina izvođen je na dozama Novoseven<®>-a od 0 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, 4 µg/mL, 5 µg/mL i 6 µg/mL, u prisustvu 20 µL cefalina (pokretača koagulacije).

• Merenje trombogenog potencijala Sevenfact<®>-a nakon pokretanja koagulacije TF / PL-om:

[0122] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL PPP reagensa (Stago) koji sadrži 0,5 pM tkivnog faktora (TF) i 4 µM fosfolipida (PL).

[0123] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0124] Test stvaranja trombina izvođen je na dozama Sevenfact<®>-a od 0 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, 4 µg/mL, 5 µg/mL i 6 µg/mL, u prisustvu 0,5 pM TF-a / 2 µM PL-a (pokretača koagulacije).

• Merenje trombogenog potencijala Sevenfact<®>-a nakon pokretanja koagulacije cefalinom:

[0125] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL cefalina (CK-Prest rekonstituisan sa 5 mL destilovane H20).

[0126] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0127] Test stvaranja trombina izvođen je na dozama Sevenfact<®>-a od 0 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, 4 µg/mL, 5 µg/mL i 6 µg/mL, u prisustvu 20 µL cefalina.

• Merenje trombogenog potencijala Hemlibra<®>-e nakon pokretanja koagulacije TF / PL-om:

[0128] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL PPP reagensa (Stago) koji sadrži 0,5 pM tkivnog faktora (TF) i 4 µM fosfolipida (PL).

[0129] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0130] Hemlibra<®>(Roche / Genentech / Chugaï, SAD), bispecifično antitelo koje podražava funkciju FVIII, koristila se na maksimalnoj koncentraciji od 50 µg/mL što predstavlja koncentraciju detektovanu kod pacijenta u lečenju (Oldenburg et al. NEJM, 2017). Test stvaranja trombina izvođen je na dozama Hemlibra<®>-e od 0 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL i 50 µg/mL, u prisustvu 0,5 pM TF-a / 4 µM PL-a (pokretača koagulacije).

• Merenje trombogenog potencijala Hemlibra<®>-e nakon pokretanja koagulacije cefalinom

[0131] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL cefalina (CK-Prest rekonstituisan sa 5 mL destilovane H20).

[0132] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0133] Test stvaranja trombina izvođen je na dozama Hemlibra<®>-a od 0 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL i 50 µg/mL, u prisustvu 20 µL cefalina.

[0134] U svim tim testovima, pojava fluorescencije je merena na fluorimetru Fluoroskan Ascent (ThermoLabsystems) sa talasnom dužinom pobuđivanja od 390 nm i dužinom emisije od 460 nm. Zatim su analizirani trombinogrami (krive koje predstavljaju intenzitet fluorescencije tokom vremena) pomoću softvera Thrombinoscope<™>, koji pretvara vrednost fluorescencije u nM trombina uporednim

proračunom.

[0135] Stvaranje trombina je završeno a ključne promenljive za procenu snage različitih medikamenata su zabeležene i upoređene: potencijal endogenog trombina (ETP), visina pika, kašnjenje i brzina.

Primer 3: Procena sinergetskih trombogenih potencijala Novoseven<®>-a i Hemlibra<®>-e ili SevenFact<®>-a i Hemlibra<®>-e

[0136] Stručnjak iz ove oblasti može izmeriti trombogeni potencijal kombinacija Novoseven<®>/Hemlibra<®>i Sevenfact<®>/Hemlibra<®>izvođenjem protokola u nastavku.

Reagensi:

[0137] Reagensi, uređaji i eksperimentalni protokol za plazmu sa nedostatkom FVIII istovetni su onima opisanim u primeru 2.

Postupak:

• Merenje trombogenog potencijala kombinacije Novoseven<®>+ Hemlibra<®>nakon pokretanja koagulacije TF / PL-om:

[0138] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL PPP reagensa (Stago) koji sadrži 0,5 pM tkivnog faktora (TF) i 4 µM fosfolipida (PL).

[0139] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0140] Test stvaranja trombina izvođen je u prisustvu 0,5 pM TF-a / 4 µM PL-a (pokretača koagulacije) na nekoliko kombinacija Novoseven<®>/Hemlibra<®>. Kompozicija koja sadrži najveću količinu proizvoda sastojala se od 6 µg/mL Novoseven<®>-a i 50 µg/mL Hemlibra<®>-e, na njihovom maksimumu.

[0141] Trombogeni potencijal dobijen u prisustvu kombinacije proizvoda upoređen je sa potencijalom pojedinačnih proizvoda. Da bi se razmotrio sinergetski efekat kombinacije proizvoda, procenjene su slabije doze kako bi se osiguralo da ne zasićuju detekciju trombina.

[0142] Ispitivane kompozicije su sadržale:

• Merenje trombogenog potencijala kombinacije Novoseven<®>+ Hemlibra<®>nakon pokretanja koagulacije cefalinom

[0143] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL cefalina (CK-Prest rekonstituisan sa 5 mL destilovane H20).

[0144] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0145] Test stvaranja trombina izvođen je u prisustvu 20 µL cefalina na nekoliko kombinacija Novoseven<®>/Hemlibra<®>. Kompozicija koja sadrži najveću količinu proizvoda sastojala se od 6 µg/mL Novoseven<®>-a i 50 µg/mL Hemlibra<®>-e, na njihovom maksimumu.

[0146] Trombogeni potencijal dobijen u prisustvu kombinacije proizvoda upoređen je sa potencijalom pojedinačnih proizvoda. Da bi se razmotrio sinergetski efekat kombinacije proizvoda, procenjene su slabije doze kako bi se osiguralo da ne zasićuju detekciju trombina.

[0147] Ispitivane kompozicije su sadržale:

• Merenje trombogenog potencijala kombinacije Sevenfact<®>+ Hemlibra<®>nakon pokretanja koagulacije TF / PL-om

[0148] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL PPP reagensa (Stago) koji sadrži 0,5 pM tkivnog faktora (TF) i 4 µM fosfolipida (PL).

[0149] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0150] Test stvaranja trombina izvođen je u prisustvu 0,5 pM TF-a / 4 µM PL-a (pokretača koagulacije) na nekoliko kombinacija Sevenfact<®>/Hemlibra<®>. Kompozicija koja sadrži najveću količinu proizvoda sastojala se od 6 µg/mL Sevenfact<®>-a i 50 µg/mL Hemlibra<®>-e, na njihovom maksimumu.

[0151] Trombogeni potencijal dobijen u prisustvu kombinacije proizvoda upoređen je sa potencijalom pojedinačnih proizvoda. Da bi se razmotrio sinergetski efekat kombinacije proizvoda, procenjene su slabije doze kako bi se osiguralo da ne zasićuju detekciju trombina.

[0152] Ispitivane kompozicije su sadržale:

• Merenje trombogenog potencijala kombinacije Sevenfact<®>+ Hemlibra<®>nakon pokretanja koagulacije cefalinom

[0153] Test stvaranja trombina izvođen je na 80 µL pulovane plazme sa nedostatkom FVIII koja podražava plazmu hemofilije A u prisustvu 20 µL cefalina (CK-Prest rekonstituisan sa 5 mL destilovane H20).

[0154] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (supstrat CaCl2) što predstavlja početak merenja stvaranja trombina.

[0155] Test stvaranja trombina izvođen je u prisustvu 20 µL cefalina na nekoliko kombinacija Sevenfact<®>/Hemlibra<®>. Kompozicija koja sadrži najveću količinu proizvoda sastojala se od 6 µg/mL Sevenfact<®>-a i 50 µg/mL Hemlibra<®>-e na njihovom maksimumu.

[0156] Trombogeni potencijal dobijen u prisustvu kombinacije proizvoda upoređen je sa potencijalom pojedinačnih proizvoda. Da bi se razmotrio sinergetski efekat kombinacije proizvoda, procenjene su slabije doze kako bi se osiguralo da ne zasićuju detekciju trombina.

[0157] Ispitivane kompozicije su sadržale:

[0158] U svim tim testovima, pojava fluorescencija je merena na fluorimetru Fluoroskan Ascent (ThermoLabsystems) sa talasnom dužinom pobuđivanja od 390 nm i dužinom emisije od 460 nm. Zatim su analizirani trombinogrami (krive koje predstavljaju intenzitet fluorescencije tokom vremena) pomoću softvera Thrombinoscope<™>, koji pretvara vrednost fluorescencije u nM trombina uporednim proračunom.

[0159] Sinergetski efekat se na primer uzimao u obzir kada je najmanje jedan od parametara izračunatih na osnovu testa stvaranja trombina za datu kombinaciju bio veći od zbira svakog od tih parametara koji su dobijeni sa pojedinačnim komponentama, odvojenih od pozadinskog šuma eksperimenta.

Primer 4: Poređenje potencijala Sevenfact<™>-a, Hemlibra<®>-e i kombinacije dvaju u plazmi hemofilije A:

Reagensi:

[0160]

▪ kalibrator trombina (Stago)

▪ reagens PRP reagens 1pM TF (Stago)

▪ MP reagens 4µM PL (Stago)

▪ Fluo-pufer (Stago)

▪ Fluo-supstrat (Stago)

▪ Sevenfact<™>: Transgenetski faktor VII kog proizvodi kunić 1 mg/mL (LFB)

▪ Hemlibra<®>: Emicizumab (Roche / Genentech / Chugaï)

▪ Plazma hemofilije A (Cryopep)

▪ Owren Koller (Stago)

Postupak:

[0161] Test stvaranja trombina sastojao se od aktiviranja koagulacije ex vivo, na primer mešavinom tkivnog faktora i fosfolipida (TF / PL) pa merenja koncentracije trombina stvorenog tokom vremena. Testovi stvaranja trombina izvođeni su sa 80µL plazme hemofilije A (Cryopep), u prisustvu 20 µL mešavine PRP i MP reagensa (Stago) koji sadrži 0,5 pM tkivnog faktora i 4 µM fosfolipida.

[0162] Reakcija je započeta dodavanjem 20 µL Fluca-kompleta (Fluo supstrat CaCl2), što odgovara početnoj tački merenja stvaranja trombina (TG).

[0163] Fluorescencija je merena fluorimetrom pomoću uređaja Fluoroskan Ascent (ThermoLabsystems) sa talasnom dužinom pobuđivanja od 390 nm i talasnom dužinom emisije od 460 nm. Trombinogrami su analizirani pomoću softvera Thrombinoscope<™>koji uporednim računom pretvara intenzitet fluorescencije u molarnu koncentraciju trombina (nM).

[0164] Kako bi se izmerio trombogeni potencijal dvaju molekula, ispitivano je više plazmi hemofilije A. Najviša terapijska doza FVlla iznosila je 270 µg/kg, što odgovara 6 µg/mL FVlla (ili 120 nM) u plazmi. Primena te doze može se smatrati kao maksimalni potencijal stvaranja trombina. Na osnovu koncentracija proizvoda u cirkulaciji dobijenih kod pacijenata, ispitivane su i koncentracije Sevenfact<™>-a u opsegu između 20 i 100 nM. Hemlibra<®>(Roche / Genentech / Chugaï, SAD), bispecifično antitelo koje podražava funkciju FVIII, korišćeno je na maksimalnoj koncentraciji od 120 µg/mL. Koncentracija koja se trenutno otkriva kod pacijenata koji se leče iznosi 50 µg/mL (ili 300 nM) (Oldenburg et al. NEJM, 2017). Stoga je Hemlibra<®>ovde korišćena na približno 300 nM (50 µg/mL). Promenljive koje su ispitivane kako bi se izmerio trombogeni potencijal Hemlibra<®>-e, Sevenfact<™>-a su:

- potencijal endogenog trombina (ETP): oblast ispod krive koja predstavlja ukupnu količinu stvorenog trombina,

- visina pika: maksimalna izmerena koncentracija trombina i

- brzina stvaranja trombina: brzina obrazovanja trombina.

2 - Rezultati

2.1 - Efekat Sevenfact<™>-a ili Hemlibra<®>-e na plazme hemofilije A

2.1.1 - Procena u 1. šarži plazme hemofilije A

[0165] U tom medijumu dobijeni su veoma slabi signali stvaranja trombina iz dvaju jedinjenja, bez obzira na korišćene koncentracije. Naime, uočeno stvaranje trombina je skoro nulto za Hemlibra<®>-u i Sevenfact<™>na koncentracijama od 20 i 40 nM. Sa 100 nM Sevenfact<™>-a, uočen je veoma slab pik stvaranja trombina (Tabela 1).

Tabela 1: Parametri stvaranja trombina iz 1. šarže plazme hemofilije A tretirane Sevenfact<™>-om ili Hemlibra<®>-om

[0166] Dakle, svaki pojedinačno korišćeni molekul dovodio je samo do veoma slabog stvaranja trombina.

2.1.2 - Procena u 2. šarži plazme hemofilije A

[0167] Ispitivana je druga šarža plazme hemofilije A. Ovde je takođe uočeno veoma slabo stvaranje trombina uz korišćenje Hemlibra<®>-e i Sevenfact<™>-a, sa maksimalnim pikom stvaranja trombina na koncentraciji od 100 nM Sevenfact<™>-a (Tabela 2).

Tabela 2: Parametri stvaranja trombina iz 2. šarže plazme hemofilije A tretirane Sevenfact<™>-om ili Hemlibra<®>-om

bra<®>300 nM

[0168] Odvojeno korišćeni Sevenfact<™>i Hemlibra<®>imaju slab trombogeni potencijal u tom medijumu.

Primer 5: Procena sinergetskog trombogenog potencijala kombinacije Sevenfact<™>+ Hemlibra<®>1 - Protokol

[0169] Reagensi, uređaji i eksperimentalni protokol za plazmu hemofilije A istovetni su onima opisanim u primeru 2.

2 - Rezultati

[0170] Kao što se vidi u primeru 2, pojedinačno korišćeni Sevenfact<™>i Hemlibra<®>dovodili su do slabog stvaranja trombina u plazmama hemofilije A. Ovde se ispitivao sinergetski efekat kombinacije Sevenfact<™>-a i Hemlibra<®>-e . Ispitivane su tri koncentracije Sevenfact<™>-a (20 nM, 40 nM i 100 nM) u prisustvu koncentracije Hemlibra<®>-e od 300 nM. Sinergetski efekat se uzimao u obzir ukoliko je efekat kombinacije Sevenfact<™>+ Hemlibra<®>bio najmanje 2 puta veći od zbira efekata Sevenfact<™>-a i Hemlibra<®>-e uzetih odvojeno za najmanje jedan od parametara testa stvaranja trombina (ETP, pik stvaranja trombina i brzina).

2.1 - Efekat Sevenfact<™>-a i Hemlibra<®>-e na plazme hemofilije A nakon pokretanja koagulacije TF / PL-om

2.1.1 - Procena u 1. šarži plazme hemofilije A

[0171] Rezultati su prikazani u tabeli 3 i na Fig.1. Na veoma slaboj koncentraciji Sevenfact<™>-a od 20 nM, razmere za ETP (Fig.1A), za pik trombina (Fig.1B) i za brzinu (Fig.1C) kombinacije Sevenfact<™>+ Hemlibra<®>redom su iznosile 2,14, 2,95 i 4,19. Dakle, uočen je sinergetski trombogeni efekat čak i na najslabijoj ispitivanoj koncentraciji.

[0172] Na koncentraciji od 40 nM, razmera je bila veća od 2 za sve ispitivane parametre. Dobijena razmera za ETP iznosila je 2,75 (Fig.1A), dobijena razmera za pik trombina iznosila je 3,96 (Fig.1B) a dobijena razmera za brzinu dostizala je vrednost od 6,21 (Fig.1C). Drugačije rečeno, brzina obrazovanja trombina uvećana je za 6 puta kada su Sevenfact<™>i Hemlibra<®>korišćeni u kombinaciji.

[0173] Sinergetski efekat je najveći na koncentraciji od 100 nM Sevenfact<™>-a. Na koncentraciji od 100 nM, razmera je bila veća od 2 za sve ispitivane parametre. Dobijena razmera za ETP iznosila je 4,00 (Fig. 1A) a razmera za pik trombina iznosila je 4,81 (Fig.1B), što znači da je maksimalna koncentracija stvorenog trombina bila približno 5 puta veća kada su Hemlibra<®>i Sevenfact<™>korišćeni u kombinaciji. Razmera koja odgovara brzini iznosila je 9,58 (Fig.1C), što znači da je trombin stvaran približno 10 puta brže kada su Sevenfact<™>i Hemlibra<®>korišćeni u kombinaciji.

[0174] Dolazi se do zaključka da su, za sve ispitivane koncentracije Sevenfact<™>-a, Sevenfact<™>i Hemlibra<®>korišćeni u kombinaciji imali sinergetski efekat na stvaranje trombina.

2.1.2 - Procena u 2. šarži plazme hemofilije A

[0175] Rezultati su prikazani u tabeli 4 i na Fig.2. Na veoma slaboj koncentraciji Sevenfact<™>-a od 20 nM, dobijena je razmera od 2,21 za parametar ETP-a (Fig.2A), dobijena je razmera od 2,34 za pik trombina (Fig.2B) i dobijena je razmera od 2,9 za parametar brzine (Fig.2C) kombinacije Sevenfact<™>+ Hemlibra<®>. Dakle, uočen je sinergetski trombogeni efekat čak i na najslabijoj ispitivanoj koncentraciji Sevenfact<™>-a.

[0176] Na koncentraciji od 40 nM, razmera koja odgovara ETP-u iznosila je 2,29 (Fig.2A), razmera koja odgovara piku trombina iznosila je 2,79 (Fig.2B) a razmera koja odgovara brzini iznosila je 3,68 (Fig.2C), što znači da je primena Sevenfact<™>-a u kombinaciji sa Hemlibra<®>-om omogućavala približno 4 puta brže obrazovanje trombina.

[0177] Sinergetski efekat je najveći na koncentraciji od 100 nM Sevenfact<™>-a. Na koncentraciji od 100 nM, razmera koja odgovara piku stvaranja trombina iznosila je 3,41 (Fig.2B) a razmera koja odgovara brzini iznosila je 5,63 (Fig.2C), što znači da je trombin stvaran približno 6 puta brže i da je dostignuta koncentracija trombina uvećana za približno 4 puta kada je Sevenfact<™>korišćen u kombinaciji sa Hemlibra<®>-om.

Claims (11)

[0178] Dolazi se do zaključka da su, za sve ispitivane koncentracije Sevenfact<™>-a, Sevenfact<™>i Hemlibra<®>korišćeni u kombinaciji imali sinergetski efekat na stvaranje trombina. Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata:

a. transgenetski Faktor VII i

b. multispecifično antitelo usmereno protiv faktora IX i faktora X.

2. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1, u kojoj pomenuti transgenetski faktor VII predstavlja humani faktor VII kog proizvode epitelne ćelije mlečnih žlezda transgenetskog nehumanog sisara.

3. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 2, pri čemu pomenuti transgenetski sisar predstavlja kunića.

4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kojoj antitelo predstavlja emicizumab.

5. Kombinovani proizvod koji obuhvata:

a. transgenetski Faktor VII i

b. multispecifično antitelo usmereno protiv faktora IX i faktora X, za upotrebu u prevenciji ili lečenju poremećaja koagulacije kod pacijenta.

6. Kombinovani proizvod za upotrebu prema zahtevu 5, u lečenju hemofilije A.

7. Kombinovani proizvod za upotrebu prema jednom od zahteva 5 ili 6, u lečenju hemofilije A sa inhibitorima faktora VIII.

8. Kombinovani proizvod za upotrebu prema zahtevima 5 do 7, pri čemu je pomenuti kombinovani proizvod u obliku farmaceutske kompozicije kao što je definisana u bilo kom od zahteva 1 do 4.

9. Kombinovani proizvod za upotrebu prema zahtevima 5 do 8, pri čemu su pomenuti faktor VIIa i pomenuto antitelo u obliku izvedenom za istovremeno davanje pacijentu.

10. Kombinovani proizvod za upotrebu prema zahtevima 5 do 8, pri čemu su pomenuti faktor VIIa i pomenuto antitelo u oblicima izvedenim za odvojeno davanje pomenutom pacijentu.

11. Komplet koji obuhvata

- Jedan kontejner koji sadrži transgenetski faktor FVII; i

- Drugi kontejner koji sadrži antitelo usmereno protiv faktora IX i faktora X.