RS63135B1

RS63135B1 - Postupci upotrebe polinukleotida koji kodiraju ox40 ligand

Info

Publication number: RS63135B1
Application number: RS20220382A
Authority: RS
Inventors: Joshua Frederick; Ailin Bai
Original assignee: Modernatx Inc
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2022-05-31
Also published as: US20210318817A1; LT3394093T; US20200000935A1; US11003366B2; SI3394093T1; US11687256B2; CY1125192T1; HRP20220525T1; SMT202200310T1; ES2919552T3; US11403008B2; US20220378868A1; WO2017112943A1; PT3394093T; US20180318385A1; EP3394093B1; EP4039699A1; PL3394093T3; US10143723B2; DK3394093T3

Description

Opis

POZADINA

[0001] Kancer je bolest koju karakteriše nekontrolisana deoba i rast ćelija unutar tela. U Sjedinjenim Državama, otprilike trećina svih žena i polovina svih muškaraca imaće kancer tokom svog života. Polipeptidi su uključeni u svaki aspekt bolesti uključujući biologiju ćelije kancera (kancerogenezu, supresiju ćelijskog ciklusa, popravku DNK i angiogenezu), lečenje (imunoterapija, hormonska manipulacija, enzimska inhibicija), i/ili dijagnozu i određivanje tipa kancera (molekulski markeri za kancer dojke, prostate, debelog creva i grlića materice, na primer). Uz mnoštvo neželjenih posledica koje izazivaju standardna lečenja kao što su hemioterapija i radioterapija koji se danas upotrebljavaju, genetička terapija za manipulaciju peptidima povezanim sa bolestima i njihovim funkcijama obezbeđuje ciljaniji pristup dijagnozi, lečenju i upravljanju bolesti. Međutim, genska terapija predstavlja višestruke izazove uključujući neželjen imunski odgovor i zabrinutost za bezbednost usled inkorporacije gena na nasumične lokacije unutar genoma.

[0002] Različiti postupci lečenja kancera su u razvoju. Na primer, vakcine dendritskih ćelija (DC) proučavane su kao moguća terapija protiv kancera. Međutim, DC vakcine zahtevaju višestruke korake izolovanja DC iz subjekta, ex vivo manipulaciju DC kako bi se ćelije pripremile za prezentaciju tumorskog antigena, i naknadnu primenu manipulisanih DC nazad u subjekta. Dodatno, saopšteno je da ukupne stope kliničkog odgovora za DC vakcine ostaju niske i sposobnost DC vakcina da indukuju regresiju kancera ostaje niska. Videti, npr. Kalkinski et al., "Dendritic cell-based therapeutic cancer vaccines: what we have and what we need," Future Oncol.

5(3):379-390 (2009).

[0003] WO 2015/048744 A2 se odnosi na polinukleotide koji kodiraju imunomodulirajuće polipeptide. S. Andriani (Cancer Research; Vol. 64, No.9; 1. maj 2004) odnosi se na transfer gena OX40 liganda posredovan adenovirusnim vektorom u tumorske ćelije u domaćinima koji imaju tumor.

KRATAK SAŽETAK

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulaciju lipidnih nanočestica iRNK koja kodira OX40L polipeptid za upotrebu u postupku redukovanja ili smanjenja veličine tumora, inhibiranja rasta tumora, ili u postupku lečenja kancera, pri čemu iRNK sadrži jedno ili više mikroRNK (miRNA) vezujućih mesta u 3'UTR, pri čemu je mikroRNK vezujuće mesto miR-122 vezujuće mesto.

[0005] Takođe se objavljuju kompozicije i postupci za aktiviranje imunskog odgovora kod subjekta. Jedan aspekt objave opisuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U sledećem aspektu, aktivirane T ćelije redukuju ili smanjuju veličinu tumora ili inhibiraju rast tumora kod subjekta.

[0006] Sledeći aspekt objave opisuje postupak povećanja broja ćelija prirodnih ubica (NK) kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U sledećem aspektu, povećane NK ćelije redukuju ili smanjuju veličinu tumora ili inhibiraju rast tumora kod subjekta.

[0007] U nekim aspektima, objava opisuje postupak za aktiviranje T ćelija i povećanje broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.

[0008] U sledećem primeru izvođenja, primena subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid dodatno indukuje oslobađanje IL-2. U sledećem primeru izvođenja, primena subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid dodatno indukuje oslobađanje IL-4. U sledećem primeru izvođenja, primena subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid dodatno indukuje oslobađanje IL-21.

[0009] U nekim aspektima, primena subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid indukuje proliferaciju T ćelija. U drugim aspektima, primena subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid indukuje infiltraciju T ćelija u tumor ili povećava broj T ćelija koje infiltriraju tumor. U određenim aspektima, primena subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid indukuje odgovor memorijskih T ćelija. U nekim aspektima, aktivirane T ćelije sadrže CD4<+>T ćelije. U drugim aspektima, aktivirane T ćelije sadrže CD8<+>T ćelije. U drugim aspektima, aktivirane T ćelije sadrže CD8 T ćelije. U drugim aspektima, aktivirane T ćelije sadrže i CD4<+>ćelije i CD8 T ćelije. U nekim aspektima, broj NK ćelija je povećan najmanje oko dva puta, najmanje oko tri puta, najmanje oko četiri puta, najmanje oko pet puta, najmanje oko šest puta, najmanje oko sedam puta, najmanje oko osam puta, najmanje oko devet puta, ili najmanje oko deset puta.

[0010] U nekim primerima izvođenja objave, polinukleotid sadrži najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid kao što je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid sadrži dve ili više njihovih kombinacija. U sledećem aspektu, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid je odabran iz grupe koja se sastoji od pseudouridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ), 2-tiouridina (s2U), 4'-tiouridina, 5-metilcitozina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseuduridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseuduridina, 2-tiodihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-2-tio-pseudouridina, 4-metoksipseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoksiurdina, 2'-O-metil uridina, 1-metilpseudouridina (m1ψ), 5-metoksi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), α-tioguanozina, α-tio-adenozina, 5-cijano uridina, 4'-tio uridin 7-deaza-adenina, 1-metiladenozina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenozina (m6A), i 2,6-diaminopurina, (I), 1-metil-inozina (m1I), viozina (imG), metilviozina (mimG), 7-deazaguanozina, 7-cijano-7-deaza-guanozina (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanozina (preQ1), 7-metil-guanozina (m7G), 1-metil-guanozina (m1G), 8-okso-guanozina, 7-metil-8-okso-guanozina, i dve ili više njihovih kombinacija.

[0011] U sledećem aspektu objave, nukleozidi u iRNK su hemijski modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%. U sledećem aspektu, hemijski modifikovani nukleozidi u iRNK su odabrani iz grupe koja se sastoji od uridina, adenina, citozina, guanina, i bilo koje njihove kombinacije.

[0012] U jednom primeru izvođenja, uridin nukleozidi u iRNK su hemijski modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%. U sledećem aspektu, adenin nukleozidi u iRNK su hemijski modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%. U sledećem primeru izvođenja, citozin nukleozidi u iRNK su hemijski modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%. U sledećem aspektu, guanin nukleozidi u iRNK su hemijski modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%.

[0013] Predmetna objava dodatno opisuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno ili povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu je iRNK koja kodira OX40L polipeptid otvoreni okvir čitanja. U jednom aspektu, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da se vezuje za OX40 receptor.

[0014] Sledeći aspekt objave opisuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno ili povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu polinukleotid dodatno sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži miRNA vezujuće mesto. U jednom primeru izvođenja, miRNA vezujuće mesto se vezuje za miR-122. U posebnom primeru izvođenja, miRNA vezujuće mesto se vezuje za miR-122-3p ili miR-122-5p.

[0015] U jednom aspektu objave, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identična SEQ ID NO: 26, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122. U sledećem aspektu, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identična SEQ ID NO: 24, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122. U sledećem aspektu, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja se vezuje za SEQ ID NO: 22.

[0016] Sledeći aspekt objave opisuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno ili povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu polinukleotid dodatno sadrži 5' netranslatirani region (UTR). U nekim aspektima, 5' UTR sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u Tabeli 3.

[0017] U drugom aspektu, polinukleotid koji se upotrebljava u postupcima iz objave dodatno sadrži 3' UTR. U nekim aspektima, 3' UTR sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u Tabeli 4.

[0018] U sledećem aspektu objave, miRNA vezujuće mesto je insertovano unutar 3' UTR. U nekim aspektima, polinukleotid dodatno sadrži spejser sekvencu između otvorenog okvira čitanja i miRNA vezujućeg mesta. U jednom aspektu, spejser sekvenca sadrži najmanje oko 10 nukleotida, najmanje oko 20 nukleotida, najmanje oko 30 nukleotida, najmanje oko 40 nukleotida, najmanje oko 50 nukleotida, najmanje oko 60 nukleotida, najmanje oko 70 nukleotida, najmanje oko 80 nukleotida, najmanje oko 90 nukleotida, ili najmanje oko 100 nukleotida.

[0019] U nekim aspektima objave, polinukleotid dodatno sadrži 5ꞌ terminusnu kapu. U jednom primeru izvođenja, 5' terminusna kapa je Cap0, Cap1, ARCA, inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-aminoguanozin, LNA-guanozin, 2-azidoguanozin, Cap2, Cap4, 5' metilG kapa, ili njihov analog.

[0020] U sledećem aspektu, polinukleotid dodatno sadrži 3' poliadenilaciju (poliA rep).

[0021] U nekim primerima izvođenja pronalaska, polinukleotid sadrži najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, ili najmanje deset miRNA vezujućih mesta.

[0022] U sledećem aspektu, polinukleotid je kodon optimizovan. U jednom aspektu, polinukleotid je kodon optimizovan za ekspresiju kod sisara. U određenom aspektu, polinukleotid je kodon optimizovan za ekspresiju kod ljudi.

[0023] U nekim aspektima, polinukleotid je in vitro transkribovan (IVT). U drugim aspektima, polinukleotid je himeran. U drugim aspektima, polinukleotid je cirkularan.

[0024] Sledeći aspekt objave opisuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno ili povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu efikasne količine polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu je OX40L polipeptid fuzionisan za jedan ili više heterolognih polipeptida. U jednom aspektu, jedan ili više heterolognih polipeptida povećavaju farmakokinetičko svojstvo OX40L polipeptida.

[0025] U sledećem aspektu objave, polinukleotid dodatno sadrži drugi otvoreni okvir čitanja koji kodira drugi polipeptid.

[0026] U nekim aspektima predmetne objave, postupci dodatno sadrže primenu drugog polinukleotida. U jednom primeru izvođenja, drugi polinukleotid sadrži drugi otvoreni okvir čitanja koji kodira drugi polipeptid. U sledećem aspektu, drugi otvoreni okvir čitanja je druga iRNK. U nekim aspektima, druga iRNK sadrži najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid.

[0027] U drugom aspektu objave, polinukleotid se formuliše sa agensom za isporuku. U nekim aspektima, agens za isporuku sadrži lipidoid, lipozom, lipopleks, lipidnu nanočesticu, polimerno jedinjenje, peptid, protein, ćeliju, mimik nanočestice, nanotubu, ili konjugat. U jednom aspektu, agens za isporuku je lipidna nanočestica. U drugom aspektu, lipidna nanočestica sadrži lipid odabran iz grupe koja se sastoji od DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, PEGilovanih lipida, lipida amino alkohola, KL22, i njihovih kombinacija.

[0028] U nekim aspektima objave, polinukleotid se formuliše za in vivo isporuku. U jednom aspektu, polinukleotid se formuliše za subkutanu, intravensku, intraperitonealnu, intratumorsku, intramuskularnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intralezijsku, intrakranijalnu, intraventrikularnu, oralnu, inhalacionim sprejom, topikalnu, rektalnu, nazalnu, bukalnu, vaginalnu, intratumorsku, ili intramuskularnu sa implantiranim rezervoarom, subkutanu, intratumorsku, ili intradermalnu isporuku. U sledećem aspektu, polinukleotid se primenjuje subkutano, intravenski, intraperitonealno, intratumorski, intramuskularno, intraartikularno, intrasinovijalno, intrasternalno, intratekalno, intrahepatično, intralezijski, intrakranijalno, intraventrikularno, oralno, inhalacionim sprejom, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili putem implantiranog rezervoara.

[0029] U nekim aspektima, postupci iz predmetne objave leče kancer. U jednom aspektu, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera korteksa nadbubrežne žlezde, uznapredovalog kancera, analnog kancera, aplastične anemije, kancera žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, kancera kostiju, metastaze u kostima, tumora mozga, kancera mozga, kancera dojke, kancera u detinjstvu, kancera nepoznatog primarnog porekla, Kaslmanove (Castlemanꞌs) bolesti, kancera grlića materice, kancera debelog creva/rektuma, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, tumora iz Juing (Ewing) porodice, kancera oka, kancera žučne kese, gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, gastrointestinalnih stromalnih tumora, gestacijske trofoblastne bolesti, Hočkinove (Hodgkin) bolesti, Kapošijevog (Kaposi) sarkoma, karcinoma bubrežnih ćelija, kancera larinksa i hipofarinksa, akutne limfocitne leukemije, akutne mijeloidne leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, hronične mijelomonocitne leukemije, kancera jetre, hepatocelularnog karcinoma (HCC), nesitnoćelijskog kancera pluća, sitnoćelijskog kancera pluća, karcinoidnog tumora pluća, limfoma kože, malignog mezotelioma, multipla mijeloma, mijelodisplastičnog sindroma, kancera nosne šupljine i paranazalnog sinusa, kancera nazofarinksa, neuroblastoma, ne-Hočkinovog limfoma, kancera usne duplje i orofarinksa, osteosarkoma, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera penisa, tumora hipofize, kancera prostate, retinoblastoma, rabdomiosarkoma, kancera pljuvačne žlezde, sarkoma mekog tkiva odraslih, kancera bazalnih i pločastih ćelija kože, melanoma, kancera tankog creva, kancera želuca, kancera testisa, kancera grla, kancera timusa, kancera štitne žlezde, sarkoma materice, vaginalnog kancera, kancera vulve, Valdenstromove (Waldenstrom) makroglobulinemije, Vilmsovog (Wilms) tumora, sekundarnih kancera uzrokovanih lečenjem kancera, i bilo koje njihove kombinacije.

[0030] U nekim aspektima objave, polinukleotid se isporučuje pomoću uređaja koji sadrži pumpu, flaster, rezervoar za lek, uređaja sa kratkom iglom, uređaja sa jednom iglom, uređaja sa više igala, uređaja sa mikro iglama, uređaja za mlazno ubrizgavanje, uređaja za isporuku balističkog praha/čestica, katetera, lumena, krioprobe, kanile, mikrokanile, ili uređaja koji koriste toplotu, RF energiju, električnu struju, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0031] U jednom aspektu, polinukleotid se primenjuje subjektu intratumorski u jediničnoj dozi od najmanje oko 10 μg, najmanje oko 12,5 μg, ili najmanje oko 15 μg. U sledećem aspektu, efikasna količina je između oko 0,10 μg/kg i oko 1000 mg/kg.

[0032] U posebnom aspektu objave, broj NK ćelija je povećan najmanje pet puta na 24 sata posle primene.

[0033] U sledećem aspektu, rast tumora je inhibiran najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100% posle primene u poređenju sa kontrolnim polinukleotidom koji ne kodira OX40L polipeptid.

[0034] U jednom aspektu objave, postupci iz objave dodatno sadrže primenu PD-1 antagonista subjektu. U nekim aspektima, PD-1 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za PD-1. U posebnom aspektu, PD-1 antagonist je monoklonalno antitelo. U nekim aspektima, PD-1 antagonist je odabran iz grupe koja se sastoji od nivolumaba, pembrolizumaba, pidilizumaba, i bilo koje njihove kombinacije.

[0035] U sledećem aspektu, postupci iz objave dodatno sadrže primenu PD-L1 antagonista subjektu. U nekim aspektima, PD-L1 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za PD-L1. U posebnom aspektu, PD-L1 antagonist je monoklonalno antitelo. U nekim aspektima, PD-L1 antagonist je odabran iz grupe koja se sastoji od durvalumaba, avelumaba, MEDI473, BMS-936559, atezolizumaba, i bilo koje njihove kombinacije.

[0036] U sledećem aspektu, postupci iz objave dodatno sadrže primenu CTLA-4 antagonista subjektu. U nekim aspektima, CTLA-4 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za CTLA-4. U posebnom aspektu, CTLA-4 antagonist je monoklonalno antitelo. U nekim aspektima, CTLA-4 antagonist je odabran iz grupe koja se sastoji od ipilimumaba, tremelimumaba, i bilo koje njihove kombinacije.

KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA

[0037]

SL. 1 pokazuje primer polinukleotida (iRNK) koji kodira OX40L. iRNK može sadržati 5ꞌ kapu, 5ꞌ UTR, OFR (iRNK) koja kodira OX40L polipeptid, 3ꞌ UTR, miR122 vezujuće mesto, i poli-A rep.

SL. 2 pokazuje ekspresiju OX40L na površini B16F10 ćelija posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Levi pikovi predstavljaju kontrolu (bilo lažno tretiranu ili tretiranu sa iRNK negativnom kontrolom (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona)). Desna četiri pika predstavljaju ekspresiju OX40L od primene 6,3 ng, 12,5 ng, 25 ng, ili 50 ng OX40L iRNK.

SL. 3A pokazuje ekspresiju OX40L na površini HeLa ćelija posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid; tretman je bio u odsustvu mitomicina C. SL. 3B pokazuje ekspresiju OX40L na površini MC-38 ćelija posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid; tretman je bio u odsustvu mitomicina C. Pik 1 na SL. 3A i 3B pokazuje površinsku ekspresiju na lažno tretiranim ćelijama. Pikovi 2-6 pokazuju površinsku ekspresiju na dane 1, 2, 3, 5, i 7 (respektivno) posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 3C pokazuje ekspresiju OX40L na površini HeLa ćelija posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid; tretman je bio u prisustvu mitomicina C. SL. 3D pokazuje ekspresiju OX40L na površini MC-38 ćelija posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid; tretman je bio u prisustvu mitomicina C. Pik 1 na SL. 3C i 3D pokazuje površinsku ekspresiju na lažno tretiranim ćelijama. Pikovi 2-6 pokazuju površinsku ekspresiju na dane 1, 2, 3, 5, i 7 (respektivno) posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 3E pokazuje ekspresiju humanog OX40L na površini HeLa ćelija posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Pik 1 pokazuje površinsku ekspresiju na lažno tretiranim ćelijama. Pikovi 2-6 pokazuju površinsku ekspresiju na dan 1, 2, 3, 4, i 5 (respektivno) posle tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 3F pokazuje kvantifikaciju mišjeg OX40L proteina u ćelijskom lizatu i supernatantu ćelijske kulture posle tretmana HeLa ćelija sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 3G pokazuje kvantifikaciju humanog OX40L proteina u ćelijskom lizatu i supernatantu ćelijske kulture posle tretmana HeLa ćelija sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Y-osa na SL.3F i 3G pokazuje količinu proteina u nanogramima (ng) po bunariću.

SL. 4A pokazuje šematski crtež testa aktivacije T-ćelija. B16F10 ćelije ili HeLa ćelije koje eksprimiraju OX40L zajedno su kultivisane sa CD4<+>T-ćelijama i

1

antimišjim CD3 antitelom (B16F10 ćelije) ili anti-humanim CD3 antitelom i solubilnim anti-humanim CD28 (HeLa ćelije). Proizvodnja IL-2 je merena upotrebom ELISA kao korelacija aktivacije T-ćelija.

SL. 4B pokazuje rezultate testa aktivacije T-ćelija kao što je izmereno pomoću mišjeg IL-2. SL. 4C pokazuje rezultate testa aktivacije T-ćelija kao što je izmereno pomoću humanog IL-2. Y-osa pokazuje mIL2 ekspresiju u ng/ml.

SL. 4D pokazuje podatke sa SL. 4C sa šematskim dijagramom koji pokazuje test aktivacije naivnih T-ćelija dodavanjem ćelija koje eksprimiraju OX40L.

SL. 4E pokazuje test aktivacije T-ćelija upotrebom prethodno stimulisanih T-ćelija kultivisanih u prisustvu ili odsustvu HeLa ćelija koje eksprimiraju OX40L i u prisustvu ili odsustvu anti-humanog CD3 antitela.

SL. 5 pokazuje nivoe fluksa luciferaze u tumorskom tkivu u poređenju sa tkivom jetre kod životinja tretiranih sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira polipeptid luciferaze. Reprezentativni simboli su sledeći. Obrnuti trougao bez ispune, zvezda bez ispune, dijamant bez ispune, osenčeni dijamant, i krug bez ispune pokazuju fluks luciferaze u tumorskom tkivu posle primene 50 μg, 25 μg, 12,5 μg, 6,25 μg, i 3,125 μg mOX40L_miR122 iRNK (respektivno). Osenčeni obrnuti trougao, osenčena zvezda, kvadrat bez ispune, osenčeni kvadrat, i trougao bez ispune pokazuju fluks luciferaze u tkivu jetre posle primene 50 μg, 25 μg, 12,5 μg, 6,25 μg, i 3,125 μg mOX40L_miR122 iRNK (respektivno). Osenčeni krug i osenčeni trougao pokazuju fluks luciferaze u tumorskom tkivu (osenčeni krug) i tkivu jetre (osenčeni trougao) posle primene PBS kontrole. SL. 6 pokazuje količinu OX40L polipeptida koja je prisutna u tumorskom tkivu melanoma kod životinja tretiranih sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Levi panel pokazuje 8 sati posle tretmana, i desni panel pokazuje 24 sata posle tretmana.

SL. 7A pokazuje količinu OX40L polipeptida koja je prisutna u tumorskom tkivu adenokarcinoma debelog creva kod životinja tretiranih sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira NST-OX40L (netranslatabilna OX40L iRNK), ili koje nisu tretirane. Ekspresija OX40L je izmerena na 3 sata, 6 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, i 168 sati. SL. 7B pokazuje količinu OX40L polipeptida (gore) i iRNK (dole) koja je prisutna u tumorskom tkivu nakon primene rastućih doza polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 7C pokazuje količinu OX40L polipeptida (gore) i iRNK (dole) koja je prisutna u tkivu jetre nakon primene istog polinukleotida. SL. 7D pokazuje količinu OX40L polipeptida (gore) i iRNK (dole) koja je prisutna u tkivu slezine nakon primene istog polinukleotida.

SL. 8A-8C pokazuju in vivo efikasnost (izmerenu na dan 42) primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u modelu adenokarcinoma debelog creva. SL. 8A pokazuje rast tumora za životinje tretirane sa kontrolnom iRNK (NT OX40L_miR122 kontrola). SL. 8B pokazuje rast tumora za životinje tretirane sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (OX40L_miR122). SL. 8C pokazuje Kaplan-Majerovu (Kaplan-Meier) krivu preživljavanja za sve grupe tretmana (OX40L_miR122, NST_OX40L_miR122, i PBS).

SL. 9A-9C pokazuju ekspresiju OX40L u tumorima A20 B-ćelijskog limfoma kod životinja tretiranih sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 9A pokazuje ekspresiju OX40L kvantitativno izraženu u nanogramima po gramu tumorskog tkiva, kao što je izmereno pomoću ELISA.

SL. 9B pokazuje ekspresiju OX40L na ćelijskoj površini tumorskih ćelija, kao što je izmereno pomoću protočne citometrije. SL. 9C pokazuje ekspresiju OX40L na ćelijskoj površini tumorskih ćelija, kao što je izmereno pomoću protočne citometrije.

SL. 10A-10B pokazuju infiltraciju ćelija prirodnih ubica (NK) u mikrosredini tumora kod životinja tretiranih sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 10A pokazuje prosečan procenat živih NK ćelija koje su prisutne u mikrosredini tumora. Levi bar pokazuje povećanje procenta NK ćelija posle primene mOX40L_mRNA. Desni bar pokazuje povećanje procenta NK ćelija posle primene NST mOX40L_mRNA. SL. 10B pokazuje individualne podatke o životinjama iz iste studije.

SL. 11A-11D pokazuju in vivo efikasnost primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u tumorskom modelu B-ćelijskog limfoma.

SL. 11A pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa kontrolnom iRNK (NST-FIX kontrola). SL. 11B pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (OX40L_miR122). SL. 11C pokazuje prosečnu zapreminu tumora za svaku grupu, izmerenu na dan 35. SL. 11D pokazuje Kaplan-Majerove krive preživljavanja za svaku grupu tretmana. Kvadrati pokazuju zapreminu tumora posle primene OX40L_miR122. Trouglovi pokazuju zapreminu tumora posle primene NST-FIX (kontrola).

SL. 12A pokazuje in vivo imunski odgovor posle primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Miševi su inokulisani sa MC-38 ćelijama adenokarcinoma debelog creva. Kada su tumori dostigli palpabilnu veličinu, miševima je primenjen polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (OX40L_122; trougao), nonsens kontrolna iRNK (NST-OX40L_122; obrnuti trougao), ili PBS (kvadrat). Šezdeset dana nakon primene polipeptida, miševi su ponovo izazvani drugom inokulacijom tumorskim ćelijama MC-38. SL. 12A pokazuje tumor pojedinačne životinje tokom prvog perioda do dana 60. SL. 12B pokazuje broj životinja sa rastom tumora 23 dana posle ponovnog izazova.

SL. 13 pokazuje ekspresiju OX40L u A20 tumorima u različitim vremenskim tačkama posle prve i/ili druge doze polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Ekspresija je prikazana na 24 sata, 72 sata, 7 dana, i 14 dana posle primene prve doze polinukleotida i 24 sata, 72 sata, i 7 dana posle primene druge doze polinukleotida.

SL. 14A-14C pokazuju različite tipove ćelija koje su prisutne u mikrosredini tumora nakon primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 14A pokazuje procenat ćelija koje eksprimiraju OX40L u A20 tumorima koje su kancerske ćelije, imunske ćelije, ćelije koje nisu kancerske/nisu imunske, i ćelije mijeloidne loze. SL. 14B pokazuje procenat ćelija koje eksprimiraju OX40L u MC38 tumorima koje su tumorske ćelije, imunske ćelije, i ćelije mijeloidne loze. SL. 14C pokazuje procenat mijeloidnih ćelija u mikrosredini tumora koje su ćelije koje eksprimiraju OX40L nakon primene polinukleotida.

SL. 15A-15D pokazuju različite tipove imunskih ćelija koje infiltriraju mikrosredinu tumora u A20 tumorima nakon primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 15A pokazuje procenat NK ćelija u infiltratu tumora 24 sata posle tretmana, kao što je detektovano pomoću DX5 markera. SL. 15B pokazuje procenat CD4<+>T-ćelija u infiltratu tumora 14 dana posle tretmana, kao što je detektovano pomoću CD4 markera. SL. 15C pokazuje procenat CD8<+>T-ćelija u infiltratu tumora 14 dana posle tretmana, kao što je detektovano pomoću CD8 markera. SL. 15D pokazuje procenat CD8<+>T-

1

ćelija u infiltratu tumora MC38 tumora 24 i 72 sata posle prve i druge doze polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.

SL. 16A-16B pokazuju in vivo efikasnost primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u A20 tumorima. SL. 16A pokazuje zapreminu tumora (mereno u mm<3>) tokom vremena. Tretmani su pokazani na sledeći način: mOX40L_miR122 (ispunjeni krugovi); kontrolna iRNK (NST) (kvadrati bez ispune); PBS (trouglovi bez ispune); i netretirano (krugovi bez ispune). SL. 16B pokazuje Kaplan-Majerovu krivu preživljavanja za iste životinje.

SL. 17A-17B pokazuju ekspresiju OX40L proteina u primarnim humanim hepatocitima, ćelijama humanog kancera jetre (Hep3B), i ćelijama humanog karcinoma grlića materice (HeLa) na 6 sati, 24 sata, i 48 sati posle transfekcije.

SL. 17A pokazuje ekspresiju humanog OX40L polipeptida kao što je izmereno u nanogramima po bunariću. SL. 17B pokazuje ekspresiju mišjeg OX40L polipeptida kao što je izmereno u nanogramima po bunariću.

SL. 18A-18E pokazuju in vivo antitumorsku efikasnost mOX40L_miR122 isporučene intratumorski ili intravenski. SL. 18A pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih intratumorski sa kontrolnom iRNK ("NST-OX40L") (strelice označavaju dane injektiranja). SL. 18B pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih intratumorski sa mOX40L_miR122 iRNK ("OX40L-miR122") (strelice označavaju dane injektiranja). SL. 18C pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih intravenski sa kontrolnom iRNK ("NST-OX40L") (strelice označavaju dane injektiranja). SL. 18D pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih intravenski sa mOX40L_miR122 iRNK ("OX40L-miR122") (strelice označavaju dane injektiranja). SL. 18E pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih intravenski sa PBS (strelice označavaju dane injektiranja).

SL. 19 pokazuje krive preživljavanja za životinje tretirane intravenski sa PBS, negativnom kontrolom iRNK ("NST-OX40L") ili mOX40L-miR122 iRNK ("OX40L"). Dani doze su označeni strelicama.

SL. 20A - 20F pokazuju in vivo antitumorsku efikasnost kombinovane terapije koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i anti-PD-1 antitelo. SL. 20A pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim injekcijama kontrolne iRNK ("NST_mOX40L_122") i kontrolnim antitelom ("IgG2a pacova"). SL. 20B pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim injekcijama mOX40L_miR122 ("mOX40L_122") i kontrolnim antitelom ("IgG2a pacova"). SL. 20C pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim injekcijama kontrolne iRNK ("NST_mOX40L_122") i anti-PD-1 antitelom ("anti-PD-1"). SL. 20D pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim injekcijama mOX40L_miR122 ("mOX40L_122") i anti-PD-1 antitelom ("anti-PD-1"). SL. 20E pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim injekcijama anti-PD-1 antitela i PBS. SL. 20F pokazuje rast tumora kod životinja tretiranih sa PBS i kontrolnim antitelom ("IgG2a pacova"). CR = sa potpunim odgovorom (complete responder).

SL. 21 pokazuje krive preživljavanja za životinje tretirane intratumorski sa kombinovanom terapijom koja sadrži kontrolnu iRNK i kontrolno antitelo ("NST_mOX40L_122 IgG2a pacova"), mOX40L_miR122 i kontrolno antitelo ("mOX40L_122 IgG2a pacova"), kontrolnu iRNK i anti-PD-1 antitelo ("NST_mOX40L_122 anti-PD-1"), mOX40L_miR122 i anti-PD-1 antitelo ("mOX40L_122 anti-PD-1"), anti-PD-1 antitelo i PBS ("PBS anti-PD-1"), i PBS i kontrolno antitelo ("PBS IgG2a pacova").

SL. 22A - 22B pokazuju memorijski imunski odgovor kod životinja tretiranih sa kombinovanom terapijom koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i miR122 vezujuće mesto i anti-PD-1 antitelo. Životinje su inicijalno tretirane intratumorskim injekcijama mOX40L_miR122 i anti-PD-1 antitelom kao što je pokazano na SL. 20D. Četiri životinje identifikovane kao one sa potpunim odgovorom (CR) ponovo su izazvane sa MC38 tumorskim ćelijama. SL. 22A pokazuje individualni rast tumora kod naivnih životinja izazvanih MC38 tumorskim ćelijama. SL. 22B pokazuje individualni rast tumora kod četiri CR životinje ponovo izazvane sa MC38 tumorskim ćelijama.

DETALJAN OPIS

[0038] Predmetna objava je usmerena na postupke aktiviranja T ćelija ili povećanja broja ćelija prirodnih ubica (NK) kod subjekta upotrebom polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Ovde opisani polinukleotid može dodatno da redukuje ili smanji veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta kome je to

1

potrebno obezbeđivanjem polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.

I. Definicije

[0039] Kako bi se predmetna objava mogla lakše razumeti, prvo su definisani određeni termini. Kao što se upotrebljava u ovoj objavi, osim ukoliko je ovde izričito drugačije obezbeđeno, svaki od sledećih termina imaće značenje izneto u nastavku. Dodatne definicije su iznete u celoj objavi.

[0040] U ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine neodređenih i određenih članova uključuju reference množine osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Termini neodređenih članova, kao i termini "jedan ili više", i "najmanje jedan" mogu se ovde upotrebljavati naizmenično. U određenim aspektima, termin neodređenih članova znači "jedan". U drugim aspektima, termin neodređenih članova uključuje "dva ili više" ili "višestruko".

[0041] Štaviše, "i/ili" gde se ovde upotrebljava treba uzeti kao specifičnu objavu svake od dve specificirane odlike ili komponente sa ili bez druge. Stoga, termin "i/ili" kao što se upotrebljava u frazi kao što je "A i/ili B" ovde je namenjen da uključi "A i B", "A ili B", "A" (samo) i "B" (samo). Slično, termin "i/ili" kao što se upotrebljava u frazi kao što je "A, B, i/ili C" je namenjen da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B, i C; A, B, ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo).

[0042] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje koje obično razume onaj sa prosečnim iskustvom u struci na koju se ova objava odnosi. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; i Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, obezbeđuju one sa veštinom sa opštim rečnikom mnogih termina koji se upotrebljavaju u ovoj objavi.

[0043] Gde god su aspekti ovde opisani sa jezikom "koji sadrže", inače analogni aspekti opisani u terminima "sastoje se od" i/ili "sastoje se suštinski od" su takođe obezbeđeni.

1

[0044] Jedinice, prefiksi, i simboli su označeni u njihovom Sistème International de Unites (SI) prihvaćenom obliku. Numerički opsezi uključuju brojeve koji definišu opseg. Tamo gde je naveden opseg vrednosti, treba razumeti da se svaka celobrojna međuvrednost, i svaki njen deo, između navedene gornje i donje granice tog opsega, takođe posebno objavljuje, zajedno sa svakim podopsegom između takvih vrednosti. Gornja i donja granica bilo kog opsega mogu nezavisno da budu uključene ili isključene iz opsega, i svaki opseg gde su bilo koja, nijedna ili obe granice uključene takođe je obuhvaćen unutar objave. Tamo gde je vrednost eksplicitno navedena, treba razumeti da se vrednosti koje su oko iste količine ili iznosa kao i navedena vrednost takođe objavljuju. Tamo gde se kombinacija objavljuje, svaka podkombinacija elemenata te kombinacije se takođe specifično objavljuje. Suprotno tome, tamo gde se različiti elementi ili grupe elemenata pojedinačno objavljuju, njihove kombinacije se takođe objavljuju. Tamo gde se bilo koji element objave objavljuje kao da ima više alternativa, primeri te objave u kojima je svaka alternativa izuzeta pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji sa drugim alternativama se takođe ovim objavljuju; više od jednog elementa objave može imati takva izuzeća, i sve kombinacije elemenata koji imaju takva izuzeća se ovim objavljuju.

[0045] Nukleotidi se označavaju njihovim opšteprihvaćenim jednoslovnim kodovima. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, nukleinske kiseline se pišu sleva nadesno u orijentaciji od 5' do 3'. Nukleotidi se ovde označavaju njihovim opšte poznatim jednoslovnim simbolima koje preporučuje Komisija za biohemijsku nomenklaturu IUPAC-IUB. U skladu sa tim, A predstavlja adenin, C predstavlja citozin, G predstavlja guanin, T predstavlja timin, i U predstavlja uracil.

[0046] Amino-kiseline se ovde označavaju bilo njihovim uobičajeno poznatim troslovnim simbolima ili jednoslovnim simbolima koje preporučuje Komisija za biohemijsku nomenklaturu IUPAC-IUB. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, amino-kiselinske sekvence se pišu sleva nadesno u amino prema karboksi orijentaciji.

[0047] Oko: Termin "oko" kao što se upotrebljava u vezi sa numeričkom vrednošću u celoj specifikaciji i patentnim zahtevima označava interval tačnosti, poznat i prihvatljiv za osobu sa iskustvom u struci. Generalno, takav interval tačnosti je ± 10%.

[0048] Tamo gde su dati opsezi, uključene su i krajnje tačke. Štaviše, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili na drugi način očigledno iz konteksta i razumevanja onog sa prosečnim iskustvom u struci, vrednosti koje su izražene kao opsezi mogu da

1

poprime bilo koju specifičnu vrednost ili podopseg unutar navedenih opsega u različitim aspektima objave, do desetine jedinice donje granice opsega, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0049] Amino-kiselinska supstitucija: Termin "amino-kiselinska supstitucija" označava zamenu amino-kiselinskog ostatka koji je prisutan u roditeljskoj sekvenci (npr. konsenzus sekvenca) sa drugim amino-kiselinskim ostatkom. Amino-kiselina može biti supstituisana u roditeljskoj sekvenci, na primer, putem hemijske sinteze peptida ili rekombinantnih postupaka poznatih u struci. U skladu sa tim, pozivanje na "supstituciju na poziciji X" označava supstituciju amino-kiseline koja je prisutna na poziciji X sa alternativnim amino-kiselinskim ostatkom. U nekim aspektima, obrasci supstitucije mogu se opisati u skladu sa šemom AnY, gde je A jednoslovni kod koji odgovara amino-kiselini koja je prirodno prisutna na poziciji n, i Y je supstituišući amino-kiselinski ostatak. U drugim aspektima, obrasci supstitucije mogu se opisati u skladu sa šemom An(YZ), gde je A jednoslovni kod koji odgovara amino-kiselinskom ostatku koji supstituiše amino-kiselinu koja je prirodno prisutna na poziciji X, i Y i Z su alternativni supstituišući amino-kiselinski ostataci, tj. u kontekstu predmetne objave, supstitucije (čak i kada se označavaju amino-kiselinskom supstitucijom) sprovode se na nivou nukleinske kiseline, tj. supstituisanje amino-kiselinskog ostatka sa alternativnim amino-kiselinskim ostatkom sprovodi se supstituisanjem kodona koji kodira prvu amino-kiselinu sa kodonom koji kodira drugu amino-kiselinu.

[0050] Konzervativna amino-kiselinska supstitucija: "Konzervativna amino-kiselinska supstitucija" je ona u kojoj je amino-kiselinski ostatak zamenjen amino-kiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice amino-kiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, ili histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, ili cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, ili triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, ili histidin). Stoga, ukoliko je amino-kiselina u polipeptidu zamenjena sa drugom aminokiselinom iz iste porodice bočnih lanaca, smatra se da je amino-kiselinska supstitucija konzervativna. U sledećem aspektu, niz amino-kiselina može se konzervativno zameniti strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili kompoziciji članova porodice bočnih lanaca.

1

[0051] Nekonzervativne amino-kiselinske supstitucije uključuju one u kojima (i) je ostatak koji ima elektropozitivan bočni lanac (npr. Arg, His ili Lys) supstituisan za, ili pomoću, elektronegativnog ostatka (npr. Glu ili Asp), (ii) hidrofilni ostatak (npr. Ser ili Thr) je supstituisan za, ili pomoću, hidrofobnog ostatka (npr. Ala, Leu, Ile, Phe ili Val), (iii) cistein ili prolin je supstituisan za, ili pomoću, bilo kog drugog ostatka, ili (iv) ostatak koji ima glomazni hidrofobni ili aromatični bočni lanac (npr. Val, His, Ile ili Trp) je supstituisan za, ili pomoću, onog koji ima manji bočni lanac (npr. Ala ili Ser) ili nema bočni lanac (npr. Gly).

[0052] Druge amino-kiselinske supstitucije mogu lako biti identifikovane od strane radnika sa prosečnim iskustvom. Na primer, za amino-kiselinu alanin, supstitucija se može uzeti od bilo koje od D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteina i D-cisteina. Za lizin, zamena može biti bilo koja od D-lizina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina, ili D-ornitina. Generalno, supstitucije u funkcionalno važnim regionima za koje se može očekivati da indukuju promene u svojstvima izolovanih polipeptida su one u kojima je (i) polarni ostatak, npr. serin ili treonin, supstituisan za (ili pomoću) hidrofobnog ostatka, npr. leucin, izoleucin, fenilalanin, ili alanin; (ii) cisteinski ostatak je supstituisan za (ili pomoću) bilo kog drugog ostatka; (iii) ostatak koji ima elektropozitivan bočni lanac, npr. lizin, arginin ili histidin, je supstituisan za (ili pomoću) ostatka koji ima elektronegativni bočni lanac, npr. glutaminska kiselina ili asparaginska kiselina; ili (iv) ostatak koji ima glomazni bočni lanac, npr. fenilalanin, je supstituisan za (ili pomoću) onog koji nema takav bočni lanac, tj. glicin. Verovatnoća da jedna od prethodnih nekonzervativnih supstitucija može da promeni funkcionalna svojstva proteina takođe je u korelaciji sa pozicijom supstitucije u odnosu na funkcionalno važne regione proteina: neke nekonzervativne supstitucije u skladu sa tim mogu imati mali ili nikakav efekat na biološka svojstva.

[0053] Efikasna količina: Kao što se ovde upotrebljava, termin "efikasna količina" agensa je ona količina dovoljna da postigne korisne ili željene rezultate, na primer, kliničke rezultate, i, kao takva, "efikasna količina" zavisi od konteksta u kojem se primenjuje. Na primer, u kontekstu primene agensa koji leči tumor, efikasna količina agensa je, na primer, količina dovoljna da redukuje ili smanji veličinu tumora ili da inhibira rast tumora, u poređenju sa odgovorom dobijenim bez primene agensa. Termin "efikasna količina" može se upotrebljavati naizmenično sa "efikasnom dozom", "terapijski efikasnom količinom", ili "terapijski efikasnom dozom".

1

[0054] Ekspresija: Kao što se ovde upotrebljava, "ekspresija" sekvence nukleinske kiseline označava jedan ili više od sledećih događaja: (1) proizvodnja RNK templata od DNK sekvence (npr. transkripcijom); (2) obrada RNK transkripta (npr. splajsovanjem, editovanjem, formiranjem 5' kape, i/ili obradom 3' kraja); (3) translacija RNK u polipeptid ili protein; i (4) posttranslaciona modifikacija polipeptida ili proteina.

[0055] Homologija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "homologija" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula nukleinske kiseline (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između molekula polipeptida. U nekim aspektima, smatra se da su polimerni molekuli "homologni" jedan drugom ukoliko su njihove sekvence najmanje 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identične ili slične. Termin "homologan" se nužno odnosi na poređenje između najmanje dve sekvence (polinukleotidne ili polipeptidne sekvence). U skladu sa objavom, dve polinukleotidne sekvence smatra se da su homologne ukoliko su polipeptidi koje kodiraju najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili čak 99% za najmanje jedan niz od najmanje oko 20 amino-kiselina. U nekim aspektima, homologne polinukleotidne sekvence odlikuju se sposobnošću da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno specificiranih amino-kiselina. Za polinukleotidne sekvence dužine manje od 60 nukleotida, homologija se određuje sposobnošću da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno specificiranih amino-kiselina. U skladu sa objavom, dve proteinske sekvence smatra se da su homologne ukoliko su proteini najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% identični za najmanje jedan niz od najmanje oko 20 amino-kiselina.

[0056] Identičnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "identičnost" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između polinukleotidnih molekula (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između molekula polipeptida. Izračunavanje procenta identičnosti dve polinukleotidne sekvence, na primer, može se izvesti poravnanjem dve sekvence u svrhe optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu introdukovati u jednu ili obe od prve i druge sekvence nukleinske kiseline za optimalno poravnanje i neidentične sekvence se mogu zanemariti u svrhe poređenja). U određenim aspektima, dužina sekvence koja je poravnata u svrhe poređenja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% dužine referentne sekvence. Zatim se porede nukleotidi na odgovarajućim pozicijama nukleotida. Kada

2

poziciju u prvoj sekvenci zauzima isti nukleotid kao i odgovarajuću poziciju u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele, uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koju treba introdukovati za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići upotrebom matematičkog algoritma. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može se odrediti upotrebom postupaka kao što su oni opisani u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., i Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može se odrediti upotrebom algoritma Mejersa (Meyers) i Milera (Miller) (CABIOS, 1989, 4:11-17), koji je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0) upotrebom PAM120 tabele težine ostatka, penala za dužinu praznine od 12 i penala za prazninu od 4. Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može se, alternativno, odrediti upotrebom GAP programa u GCG softverskom paketu upotrebom NWSgapdna.CMP matrix. Postupci koji se uobičajeno upotrebljavaju za određivanje procenta identičnosti između sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na one objavljene u Carillo, H., i Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Tehnike za određivanje identičnosti kodifikovane su u javno dostupnim računarskim programima. Primeri računarskog softvera za određivanje homologije između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, and FASTA Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).

[0057] Imunski odgovor: Termin "imunski odgovor" označava delovanje, na primer, limfocita, antigen prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita, i solubilnih makromolekula koje proizvode prethodno navedene ćelije ili jetra (uključujući antitela, citokine, i komplement) koje rezultuje selektivnim oštećenjem, uništavanjem, ili eliminacijom iz ljudskog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, ćelija kancera, ili, u slučajevima autoimunosti ili patološke inflamacije, normalnih humanih ćelija ili tkiva.

[0058] Izolovan: Kao što se ovde upotrebljava, termin "izolovan" označava supstancu ili entitet koji je odvojen od najmanje nekih komponenti sa kojima je bio povezan (bilo u prirodi ili u eksperimentalnom okruženju). Izolovane supstance (npr. nukleotidna sekvenca ili proteinska sekvenca) mogu imati različite nivoe čistoće u odnosu na supstance sa kojima su bile povezane. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se odvojiti od najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, ili više drugih komponenti sa aspektima sa kojima su inicijalno bile povezane. U nekim aspektima, izolovani agensi su više od oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% čisti. Kao što se ovde upotrebljava, supstanca je "čista" ukoliko je suštinski bez drugih komponenti. Suštinski izolovan: Pod "suštinski izolovan" se podrazumeva da je jedinjenje suštinski odvojeno od sredine u kojoj je formirano ili detektovano. Delimično odvajanje može uključivati, na primer, kompoziciju obogaćenu jedinjenjem iz predmetne objave. Suštinsko odvajanje može uključivati kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% po težini jedinjenja iz predmetne objave, ili njegove soli.

[0059] Polinukleotid, vektor, polipeptid, ćelija, ili bilo koja kompozicija koja se ovde objavljuje koja je "izolovana" je polinukleotid, vektor, polipeptid, ćelija, ili kompozicija koja se nalazi u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polinukleotidi, vektori, polipeptidi, ili kompozicije uključuju one koji su prečišćeni do stepena da više nisu u obliku u kome se nalaze u prirodi. U nekim aspektima, polinukleotid, vektor, polipeptid, ili kompozicija koja je izolovana je suštinski čista.

[0060] Otvoreni okvir čitanja: Kao što se ovde upotrebljava, "otvoreni okvir čitanja" ili "ORF" označava sekvencu koja ne sadrži stop kodon u datom okviru čitanja.

[0061] Operativno povezan: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "operativno povezan" označava funkcionalnu vezu između dva ili više molekula, konstrukata, transkripata, entiteta, funkcionalnih grupa, ili slično.

[0062] Polinukleotid: Termin "polinukleotid" kao što se ovde upotrebljava označava polimere nukleotida bilo koje dužine, uključujući ribonukleotide, dezoksiribonukleotide, njihove analoge, ili njihove smeše. Ovaj termin označava primarnu strukturu molekula. Stoga, termin uključuje tro-, dvo- i jedno-lančanu dezoksiribonukleinsku kiselinu ("DNK"), kao i tro-, dvo- i jedno-lančanu ribonukleinsku kiselinu ("RNK"). Takođe uključuje modifikovane, na primer alkilacijom, i/ili dodavanjem kape, i nemodifikovane oblike polinukleotida. Konkretnije, termin "polinukleotid" uključuje polidezoksiribonukleotide (koji sadrže 2-dezoksi-D-ribozu), poliribonukleotide (koji sadrže D-ribozu), uključujući tRNK, rRNK, hRNA, siRNA i iRNK, bilo da su splajsovane ili nesplajsovane, bilo koji drugi tip polinukleotida koji je N- ili C-glikozid purinske ili pirimidinske baze, i druge polimere koji sadrže normukleotidne okosnice, na primer, poliamid (npr. peptidne nukleinske kiseline "PNA") i polimorfolino polimere, i druge sintetičke polimere nukleinske kiseline specifične za sekvencu pod uslovom da polimeri sadrže nukleobaze u konfiguraciji koja omogućava sparivanje baza i slaganje baza, kao što se pronalazi kod DNK i RNK. U posebnim aspektima, polinukleotid sadrži iRNK. U drugom aspektu, iRNK je sintetička iRNK. U nekim aspektima, sintetička iRNK sadrži najmanje jednu neprirodnu nukleobazu. U nekim aspektima, sve nukleobaze određene klase su zamenjene sa neprirodnim nukleobazama (npr. svi uridini u polinukleotidu koji se ovde objavljuje mogu biti zamenjeni neprirodnom nukleobazom, npr. 5-metoksiuridinom). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. sintetička RNK ili sintetička DNK) sadrži samo prirodne nukleobaze, tj. A, C, T i U u slučaju sintetičke DNK, ili A, C, T, i U u slučaju sintetičke RNK.

[0063] Stručnjak sa iskustvom će razumeti da su T baze u kodonskim mapama koje se ovde objavljuju prisutne u DNK, dok bi T baze bile zamenjene U bazama u odgovarajućim RNK. Na primer, kodon-nukleotidna sekvenca koja se ovde objavljuje u obliku DNK, npr. vektor ili templat za in vitro translaciju (IVT), imaće svoje T baze transkribovane kao U zasnovano na odgovarajućoj transkribovanoj iRNK. U tom pogledu, obe kodon-optimizovane DNK sekvence (koje sadrže T) i njihove odgovarajuće RNK sekvence (koje sadrže U) smatraju se kodon-optimizovanom nukleotidnom sekvencom iz predmetne objave. Stručnjak sa iskustvom bi takođe razumeo da se ekvivalentne kodonske mape mogu generisati zamenom jedne ili više baza neprirodnim bazama. Stoga bi, npr. TTC kodon (DNK mapa) odgovarao UUC kodonu (RNK mapa), koji bi zauzvrat odgovarao ΨΨC kodonu (RNK mapa u kojoj je U zamenjen sa pseudouridinom).

[0064] Standardni A-T i G-C bazni parovi formiraju se pod uslovima koji omogućavaju formiranje vodoničnih veza između N3-H i C4-oksi timidina i N1 i C6-

2

NH2, respektivno, adenozina i između C2-oksi, N3 i C4-NH2, citidina i C2-NH2, N'-H i C6-oksi, respektivno, guanozina. Stoga, na primer, guanozin (2-amino-6-oksi-9-β-D-ribofuranozil-purin) može biti modifikovan da formira izoguanozin (2-oksi-6-amino-9-β-D-ribofuranozil-purin). Takva modifikacija rezultuje nukleozidnom bazom koja više neće efikasno formirati standardni bazni par sa citozinom. Međutim, modifikacija citozina (1-β-D-ribofuranozil-2-oksi-4-amino-pirimidin) kako bi se formirao izocitozin (1-β-D-ribofuranozil-2-amino-4-oksi-pirimidin-) rezultuje modifikovanim nukleotidom koji se neće efikasno bazno sparivati sa guanozinom, ali će formirati bazni par sa izoguanozinom (S.A.D. pat. br. 5,681,702, Collins et al.). Izocitozin je dostupan od Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); izocitidin se može pripremiti postupkom koji su opisali Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 i tamo citirane reference; 2'-dezoksi-5-metil-izocitidin se može pripremiti postupkom koji su opisali Tor et al., 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 i tamo citirane reference; i izoguaninski nukleotidi se mogu pripremiti upotrebom postupka koju su opisali Switzer et al., 1993, supra, i Mantsch et al., 1993, Biochem. 14:5593-5601, ili postupkom opisanim u S.A.D. pat. br. 5,780,610, prema Collins et al. Drugi neprirodni bazni parovi mogu se sintetisati postupkom opisanim u Piccirilli et al., 1990, Nature 343:33-37, za sintezu 2,6-diaminopirimidina i njegovog komplementa (1-metilpirazolo-[4,3]pirimidin-5,7-(4H,6H)-diona. Poznate su i druge takve modifikovane nukleotidne jedinice koje formiraju jedinstvene bazne parove, kao što su one opisane u Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc.114:3675-3683 i Switzer et al., supra.

[0065] Sekvenca nukleinske kiseline: Termini "sekvenca nukleinske kiseline", "nukleotidna sekvenca", ili "polinukleotid" upotrebljavaju se naizmenično i označavaju neprekidnu sekvencu nukleinske kiseline. Sekvenca može biti bilo jednolančana ili dvolančana DNK ili RNK, npr. iRNK.

[0066] Fraza "nukleotidna sekvenca koja kodira" i njene varijante označavaju kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline (npr. iRNK ili DNK molekul) koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid ili njegov funkcionalni fragment kao što je ovde izneto. Kodirajuća sekvenca može dodatno da uključuje signale inicijacije i terminacije koji su operativno povezani sa regulatornim elementima, uključujući promotor i signal poliadenilacije koji su sposobni da usmere ekspresiju u ćelijama pojedinca ili sisara kojima se nukleinska kiselina primenjuje. Kodirajuća sekvenca može dodatno da uključuje sekvence koje kodiraju signalne peptide.

[0067] Polipeptid: Termini "polipeptid", "peptid", i "protein" se ovde upotrebljavaju naizmenično da označe polimere amino-kiselina bilo koje dužine. Polimer može sadržati modifikovane amino-kiseline. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiselina koji je modifikovan prirodno ili pomoću intervencije; na primer, formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidacija, acetilacija, fosforilacija, ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. U definiciju su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga amino-kiseline (uključujući, na primer, neprirodne amino-kiseline kao što su homocistein, ornitin, p-acetilfenilalanin, D-amino-kiseline, i kreatin), kao i druge modifikacije poznate u struci.

[0068] Termin, kao što se ovde upotrebljava, označava proteine, polipeptide, i peptide bilo koje veličine, strukture, ili funkcije. Polipeptidi uključiju genske proizvode, polipeptide koji se javljaju u prirodi, sintetičke polipeptide, homologe, ortologe, paraloge, fragmente i druge ekvivalente, varijante, i analoge prethodno navedenog. Polipeptid može biti jedan OX40L polipeptid ili može biti multi-molekulski kompleks kao što je dimer, trimer ili tetramer. Oni takođe mogu da sadrže jedan lanac ili višelančane polipeptide. Najčešće se disulfidne veze nalaze u višelančanim polipeptidima. Termin polipeptid se takođe može primeniti na polimere amino-kiselina u kojima su jedan ili više amino-kiselinskih ostataka veštački hemijski analog odgovarajuće amino-kiseline koje se javljaju u prirodi.

[0069] Profilaksa: Kao što se ovde upotrebljava, "profilaksa" označava meru preduzetu za održavanje zdravlja i preveniranje širenja bolesti. "Imunska profilaksa" označava meru za stvaranje aktivnog ili pasivnog imuniteta kako bi se preveniralo širenje bolesti.

[0070] Pseudouridin: Kao što se ovde upotrebljava, pseudouridin označava C-glikozidni izomer nukleozida uridina. "Analog pseudouridina" je bilo koja modifikacija, varijanta, izoforma ili derivat pseudouridina. Na primer, analozi pseudouridina uključuju, ali nisu ograničeni na 1-karboksimetil-pseudouridin, 1-propinilpseudouridin, 1-taurinometil-pseudouridin, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridin, 1-metilpseudouridin (m<1>ψ), 1-metil-4-tio-pseudouridin (m<1>s<4>ψ), 4-tio-1-metilpseuduridin, 3-metil-pseudouridin (m<3>ψ), 2-tio-1-metil-pseudouridin, 1-metil-1-deazapseuduridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidropseuduridin, 2-tiodihidropseuduridin, 2-metoksiuridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseuduridin, 4-

2

metoksi-2-tio-pseuduridin, N1-metil-pseudouridin, 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp<3>ψ), i 2'-O-metil-pseudouridin (ψm).

[0071] Put transdukcije signala: "Put transdukcije signala" označava biohemijski odnos između različitih molekula za transdukciju signala koji igraju ulogu u prenosu signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Kao što se ovde upotrebljava, fraza "receptor ćelijske površine" uključuje, na primer, molekule i komplekse molekula koji su sposobni da prime signal i prenesu takav signal preko ćelijske membrane. Primer "receptora ćelijske površine" iz predmetne objave je OX40 receptor.

[0072] Sličnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "sličnost" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između polinukleotidnih molekula (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između molekula polipeptida. Izračunavanje međusobnog procenta sličnosti polimernih molekula može se izvesti na isti način kao i izračunavanje procenta identičnosti, osim što izračunavanje procenta sličnosti uzima u obzir konzervativne supstitucije kao što se razume u struci.

[0073] Subjekt: Pod "subjekt" ili "pojedinac" ili "životinja" ili "pacijent" ili "sisar" podrazumeva se bilo koji subjekt, posebno subjekt sisar, za koga se želi dijagnoza, prognoza, ili terapija. Subjekti sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude, domaće životinje, životinje na farmi, životinje u zoološkim vrtovima, životinje za sport, kućne ljubimce kao što su psi, mačke, zamorci, zečevi, pacovi, miševi, konji, goveda, krave; primati kao što su čovekoliki majmuni, majmuni, orangutani, i šimpanze; kanide kao što su psi i vukovi; felide kao što su mačke, lavovi, i tigrovi; ekvide kao što su konji, magarci, i zebre; medvedi, životinje za hranu kao što su krave, svinje, i ovce; ungulate kao što su jeleni i žirafe; glodari kao što su miševi, pacovi, hrčci, i zamorci; i tako dalje. U određenim aspektima, sisar je čovek. U drugim aspektima, subjekt je humani pacijent. U posebnom aspektu, subjekt je humani pacijent kome je potrebno lečenje kancera.

[0074] Suštinski: Kao što se ovde upotrebljava, termin "suštinski" označava kvalitativno stanje ispoljavanja ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Neko sa uobičajenim iskustvom u biološkim strukama razumeće da biološki i hemijski fenomeni retko, ukoliko ikada, idu do završetka i/ili se odvijaju do ispunjenja ili postižu ili izbegavaju apsolutni rezultat. Termin "suštinski" se prema tome ovde upotrebljava tako da obuhvati potencijalni nedostatak kompletnosti svojstven mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.

2

[0075] Lečiti, lečenje, terapija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "lečiti" ili "lečenje" ili "terapija" označava delimično ili potpuno ublažavanje, olakšavanje, poboljšanje, olakšanje, odlaganje početka, inhibiranje progresije, redukovanje ozbiljnosti, i/ili redukovanje incidence jednog ili više simptoma ili odlika hiperproliferativne bolesti, npr. kancera. Na primer, "lečiti" kancer može označavati inhibiranje preživljavanja, rasta, i/ili širenja tumora. Lečenje se može primeniti subjektu koji ne pokazuje znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja i/ili subjektu koji pokazuje samo rane znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja u svrhu smanjenja rizika od razvoja patologije asocirane sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.

[0076] Nemodifikovan: Kao što se ovde upotrebljava, "nemodifikovan" označava bilo koju supstancu, jedinjenje ili molekul pre nego što je promenjeno na bilo koji način. Nemodifikovan može, ali ne uvek, označavati divlji tip ili nativni oblik biomolekula. Molekuli mogu biti podvrgnuti nizu modifikacija pri čemu svaki modifikovani molekul može poslužiti kao "nemodifikovani" početni molekul za naknadnu modifikaciju.

II. Postupci upotrebe

[0077] Postupci iz predmetne objave opisuju upotrebu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.

[0078] Humani OX40L je prvi put identifikovan na površini humanih limfocita inficiranih humanim T-limfotropnim virusom tip-I (HTLV-I) od strane Tanaka et al. (Tanaka et al., International Journal of Cancer (1985), 36(5):549-55). Humani OX40L je glikozilovani transmembranski protein tipa II od 34 kDa koji postoji na površini ćelija kao trimer. OX40L sadrži citoplazmatski domen (amino-kiseline 1-23), transmembranski domen (amino-kiseline 24-50) i vanćelijski domen (amino-kiseline 51-183). OX40L se takođe označava kao član 4 superfamilije faktora nekroze tumora (ligand) (TNFSF4), CD252, CD134L, tax-transkripciono aktivirani glikoprotein 1 (TXGP1), glikoprotein 34 (GP34), i ACT-4-L.

[0079] Stoga, predmetna objava opisuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U jednom aspektu, aktivacija T ćelija kod subjekta usmerena je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U drugom aspektu, aktivirane T ćelije kod subjekta redukuju ili smanjuju veličinu tumora ili inhibiraju rast tumora kod subjekta. Aktivacija T ćelija može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci

2

kao što je merenje proliferacije T ćelija; merenje proizvodnje citokina sa enzimskim imunosorbentnim testovima (ELISA) ili enzimskim imunospot testovima (ELISPOT); ili detekcijom markera na ćelijskoj površini asociranih sa aktivacijom T ćelija (npr. CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154, i CD134) tehnikama kao što je protočna citometrija.

[0080] U nekim aspektima, predmetna objava opisuje postupak indukovanja proliferacije T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U jednom aspektu, proliferacija T ćelija kod subjekta usmerena je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U drugom aspektu, proliferacija T ćelija kod subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Proliferacija T ćelija može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što su brojanje ćelija, vijabilno bojenje, testovi optičke gustine, ili detekcija markera na ćelijskoj površini asociranih sa aktivacijom T ćelija (npr. CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154, i CD134) tehnikama kao što je protočna citometrija.

[0081] U drugim aspektima, predmetna objava opisuje postupak indukovanja infiltracije T ćelija u tumor subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U jednom aspektu, infiltracija T ćelija u tumor subjekta usmerena je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U drugom aspektu, infiltracija T ćelija u tumor subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Infiltracija T ćelija u tumor može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što su pravljenje preseka tkiva i bojenje za ćelijske markere, merenje lokalne proizvodnje citokina na mestu tumora, ili detekcija površinskih markera T ćelija tehnikama kao što je protočna citometrija.

[0082] U drugim aspektima, predmetna objava opisuje postupak indukovanja odgovora memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U jednom aspektu, odgovor memorijskih T ćelija kod subjekta usmeren je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U drugom aspektu, odgovor memorijskih T ćelija kod subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Odgovor memorijskih T ćelija može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što je merenje markera T ćelija asociranih sa memorijskim T ćelijama, merenje lokalne proizvodnje citokina povezane sa memorijskim imunskim odgovorom, ili detektovanje površinskih markera memorijskih T ćelija tehnikama kao što je protočna citometrija.

2

[0083] U određenim aspektima, aktivirane T ćelije pomoću predmetnih postupaka su CD4 ćelije, CD8<+>ćelije, CD62<+>(L-selektin<+>) ćelije, CD69<+>ćelije, CD40L<+>ćelije, CD137<+>ćelije, CD25<+>ćelije, CD71<+>ćelije, CD26<+>ćelije, CD27<+>ćelije, CD28<+>ćelije, CD30<+>ćelije, CD45<+>ćelije, CD45RA<+>ćelije, CD45RO<+>ćelije, CD11b<+>ćelije, CD154<+>ćelije, CD134<+>ćelije, CXCR3<+>ćelije, CCR4<+>ćelije, CCR6<+>ćelije, CCR7<+>ćelije, CXCR5<+>ćelije, Crth2<+>ćelije, gama delta T ćelije, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, aktivirane T ćelije pomoću predmetnih postupaka su Th1 ćelije. U drugim aspektima, T ćelije aktivirane pomoću predmetnih postupaka su Th2 ćelije. U drugim aspektima, T ćelije aktivirane pomoću predmetne objave su citotoksične T ćelije.

[0084] U nekim aspektima, infiltrirajuće T ćelije pomoću predmetnih postupaka su CD4<+>ćelije, CD8<+>ćelije, CD62<+>(L-selektin<+>) ćelije, CD69<+>ćelije, CD40L<+>ćelije, CD137<+>ćelije, CD25<+>ćelije, CD71<+>ćelije, CD26<+>ćelije, CD27<+>ćelije, CD28<+>ćelije, CD30<+>ćelije, CD45<+>ćelije, CD45RA<+>ćelije, CD45RO<+>ćelije, CD11b<+>ćelije, CD154<+>ćelije, CD134<+>ćelije, CXCR3<+>ćelije, CCR4<+>ćelije, CCR6<+>ćelije, CCR7<+>ćelije, CXCR5<+>ćelije, Crth2<+>ćelije, gama delta T ćelije, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, infiltrirajuće T ćelije pomoću predmetnih postupaka su Th1 ćelije. U drugim aspektima, infiltrirajuće T ćelije pomoću predmetnih postupaka su Th2 ćelije. U drugim aspektima, infiltrirajuće T ćelije pomoću predmetne objave su citotoksične T ćelije.

[0085] U nekim aspektima, memorijskih T ćelija indukovane pomoću predmetnih postupaka su CD4<+>ćelije, CD8<+>ćelije, CD62<+>(L-selektin<+>) ćelije, CD69<+>ćelije, CD40L<+>ćelije, CD137<+>ćelije, CD25<+>ćelije, CD71<+>ćelije, CD26<+>ćelije, CD27<+>ćelije, CD28<+>ćelije, CD30<+>ćelije, CD45<+>ćelije, CD45RA<+>ćelije, CD45RO<+>ćelije, CD11b<+>ćelije, CD154<+>ćelije, CD134<+>ćelije, CXCR3<+>ćelije, CCR4<+>ćelije, CCR6<+>ćelije, CCR7<+>ćelije, CXCR5<+>ćelije, Crth2<+>ćelije, gama delta T ćelije, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, memorijskih T ćelija pomoću predmetnih postupaka su Th1 ćelije. U drugim aspektima, memorijskih T ćelija pomoću predmetnih postupaka su Th2 ćelije. U drugim aspektima, memorijskih T ćelija pomoću predmetne objave su citotoksične T ćelije.

[0086] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja broja ćelija prirodnih ubica (NK) kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U jednom aspektu, povećanje broja NK ćelija kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U

2

drugom aspektu, povećanje broja NK ćelija kod subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Povećanje broja NK ćelija kod subjekta može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što je detekcija površinskih markera NK ćelija (npr. CD335/NKp46; CD336/NKp44; CD337/NPp30) ili unutarćelijskih markera NK ćelija (npr. perforin; granzimi; granulizin).

[0087] U određenim aspektima, primena iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava ukupan broj NK ćelija kod subjekta u poređenju sa brojem NK ćelija kod subjekta kome nije primenjena iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U drugim aspektima, primena iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava ukupan broj NK ćelija kod subjekta u poređenju sa subjektom kome se primenjuje dendritska ćelija transdukovana sa iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U drugim aspektima, primena iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava broj NK ćelija kod subjekta unutar mikrosredine tumora u poređenju sa onim kod subjekta kome nije primenjena iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U drugim aspektima, primena iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava broj NK ćelija kod subjekta unutar mikrosredine tumora u poređenju sa onim kod subjekta kome se primenjuje dendritska ćelija transdukovana sa iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U drugim aspektima, koncentracija NK ćelija unutar mikrosredine tumora je povećana dok ukupan broj NK ćelija kod subjekta ostaje isti.

[0088] U određenim aspektima objave, broj NK ćelija je povećan najmanje oko dva puta, najmanje oko tri puta, najmanje oko četiri puta, najmanje oko pet puta, najmanje oko šest puta, najmanje oko sedam puta, najmanje oko osam puta, najmanje oko devet puta, ili najmanje oko deset puta u poređenju sa kontrolom (npr. fiziološki rastvor ili iRNK bez ekspresije OX40L). U posebnom primeru izvođenju, broj NK ćelija je povećan pomoću iRNK koja kodira OX40L polipeptid najmanje oko dva puta u poređenju sa kontrolom (npr. fiziološki rastvor ili iRNK bez ekspresije OX40L).

[0089] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-2 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kako bi se povećao IL-2 kod subjekta kome je to potrebno. U jednom aspektu, povećanje IL-2 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U jednom aspektu, povećanje ekspresije IL-2 pomoću polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid je najmanje oko dva puta, najmanje oko tri puta, najmanje oko četiri puta, najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šest puta veće od kontrole (npr. tretirane sa PBS). Ekspresija IL-2 može se izmeriti upotrebom bilo koje dostupne tehnike, kao što su ELISA ili ELISPOT testovi.

[0090] U drugim aspektima, predmetna objava opisuje postupak povećanja IL-4 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kako bi se povećao IL-4 kod subjekta kome je to potrebno. U jednom aspektu, povećanje IL-4 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U jednom primeru izvođenja, povećanje ekspresije IL-4 pomoću polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid je najmanje oko dva puta, najmanje oko tri puta, najmanje oko četiri puta, najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šest puta veće od kontrole (npr. tretirane sa PBS). Ekspresija IL-4 može se izmeriti upotrebom bilo koje dostupne tehnike, kao što su ELISA ili ELISPOT testovi.

[0091] U drugim aspektima, predmetna objava opisuje postupak povećanja IL-21 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kako bi se povećao IL-21 kod subjekta kome je to potrebno. U jednom aspektu, povećanje IL-21 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U jednom aspektu, povećanje ekspresije IL-21 pomoću polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid je najmanje oko dva puta, najmanje oko tri puta, najmanje oko četiri puta, najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šest puta veće od kontrole (npr. tretirane sa PBS). Ekspresija IL-21 može se izmeriti upotrebom bilo koje dostupne tehnike, kao što su ELISA ili ELISPOT testovi.

[0092] Polinukleotid (npr. iRNK) iz predmetne objave može se primeniti bilo kojim putem koji je dostupan, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intratumorsku, enteralnu, gastroenteralnu, epiduralnu, oralnu, transdermalnu, epiduralnu (periduralnu), intracerebralnu (u cerebrum), intracerebroventrikularnu (u moždane komore), epikutanu (nanošenje na kožu), intradermalnu (u samu kožu), subkutanu (ispod kože), nazalnu primenu (kroz nos), intravensku (u venu), intraperitonealnu (u peritoneum), intraarterijsku (u arteriju), intramuskularnu (u mišić), intrakardijalnu (u srce), intraosalnu infuziju (u kostnu srž), intratekalnu (u kičmeni kanal), intraperitonealnu (infuzija ili injekcija u peritoneum), intravezikalnu infuziju, intravitrealnu (kroz oko), intrakavernoznu injekciju (u bazu penisa), intravaginalnu primenu, intrauterinu, ekstra-amnionsku primenu, transdermalnu (difuzija kroz intaktnu kožu za sistemsku distribuciju), transmukoznu (difuzija kroz mukoznu

1

membranu), insuflaciju (ušmrkavanje), sublingvalnu, sublabijalnu, klistir, kapi za oči (na konjuktivu), ili kapi za uho. U drugim aspektima, iRNK iz predmetne objave primenjuje se parenteralno (npr. uključuje subkutanu, intravensku, intraperitonealnu, intratumorsku, intramuskularnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intralezionalnu ili intrakranijalnu injekciju ili infuzionu tehniku), intraventrikularno, oralno, inhalacionim sprejom, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili putem implantiranog rezervoara.

[0093] Predmetna objava takođe uključuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim primerima izvođenja, intratumorska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. aktivacija T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0094] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja proliferacije T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim primerima izvođenja, intratumorska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. proliferacija T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0095] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja infiltracije T ćelija u tumor kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim primerima izvođenja, intratumorska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. infiltracija T ćelija u tumor) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0096] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja odgovora memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim primerima izvođenja, intratumorska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. odgovor memorijskih T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0097] Predmetna objava takođe uključuje postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim primerima izvođenja, intratumorska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. povećanje NK ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene. iRNK iz

2

predmetne objave može biti formulisana specifično za intratumorsku isporuku kao što je pokazano ovde na drugom mestu.

[0098] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-2 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-2 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0099] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-4 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-4 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0100] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-21 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-21 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0101] Predmetna objava takođe uključuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intraperitonealna primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. aktivacija T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0102] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja proliferacije T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intraperitonealna primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. proliferaciju T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0103] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja infiltracije T ćelija u tumor kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intraperitonealna primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. infiltracija T ćelija u tumor) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0104] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja odgovora memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intraperitonealna primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. odgovor memorijskih T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0105] Predmetna objava takođe uključuje postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intraperitonealna primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. povećanje NK ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene. iRNK iz predmetne objave može biti formulisana specifično za intraperitonealnu isporuku kao što je pokazano ovde na drugom mestu.

[0106] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-2 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-2 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0107] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-4 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-4 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0108] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-21 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intraperitonealnu primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-21 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0109] Predmetna objava takođe uključuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intravenska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. aktivacija T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0110] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja proliferacije T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intravenska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. proliferacija T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0111] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja infiltracije T ćelija u tumor kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim

4

aspektima, intravenska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. infiltracija T ćelija u tumor) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0112] Predmetna objava takođe uključuje postupak indukovanja odgovora memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intravenska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. odgovor memorijskih T ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene.

[0113] Predmetna objava takođe uključuje postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U određenim aspektima, intravenska primena predmetne iRNK može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. povećanje NK ćelija) u poređenju sa drugim putevima primene. iRNK iz predmetne objave može biti formulisana specifično za intravensku isporuku kao što je pokazano ovde na drugom mestu.

[0114] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-2 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-2 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0115] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-4 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-4 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0116] Predmetna objava dodatno opisuje postupak povećanja IL-21 kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži intravensku primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu. U jednom aspektu, povećanje IL-21 kod subjekta usmereno je na antitumorski imunski odgovor kod subjekta.

[0117] Predmetna objava dodatno uključuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kao monoterapiju, tj. bez bilo kakvog drugog antikancerskog agensa u kombinaciji. Predmetna objava takođe opisuje postupak povećanja broja ćelija prirodnih ubica (NK) kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kao monoterapiju. Neki aspekti objave takođe uključuju postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kao monoterapiju.

[0118] U određenim aspektima, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa jednim ili više antikancerskih agenasa subjektu. U drugim aspektima, objava uključuje postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa jednim ili više antikancerskih agenasa subjektu. Drugi aspekti objave takođe opisuju postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sa jednim ili više antikancerskih agenasa subjektu. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više antikancerskih agenasa su iRNK. U određenim primerima izvođenja, jedan ili više antikancerskih agenasa su iRNK koja kodira tumorski antigen. U drugim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa nisu tumorski antigen ili iRNK koja kodira tumorski antigen.

[0119] U nekim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa su odobreni agensi od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država. U drugim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa su agensi prethodno odobreni od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država.

[0120] U nekim aspektima, subjekt za predmetne postupke je lečen sa jednom ili više standardnih terapija nege. U drugim aspektima, subjekt za predmetne postupke nije reagovao na jednu ili više standardnih terapija nege ili antikancerskih terapija. U jednom aspektu, subjekt je prethodno bio lečen sa PD-1 antagonistom pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa monoklonalnim antitelom koje se vezuje za PD-1 pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa terapijom anti-PD-1 monoklonalnim antitelom pre polinukleotida iz predmetnih postupaka. U drugim aspektima, terapija anti-PD-1 monoklonalnim antitelom sadrži nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa monoklonalnim antitelom koje se vezuje za PD-L1 pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa terapijom anti-PD-L1 monoklonalnim antitelom pre polinukleotida iz predmetnih postupaka. U drugim aspektima, terapija anti-PD-L1 monoklonalnim antitelom sadrži durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, atezolizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0121] U nekim aspektima, subjekt je lečen sa CTLA-4 antagonistom pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je prethodno lečen sa monoklonalnim antitelom koje se vezuje za CTLA-4 pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa anti-CTLA-4 monoklonalnim antitelom pre polinukleotida iz predmetne objave. U drugim aspektima, terapija anti-CTLA-4 antitelom sadrži ipilimumab ili tremelimumab.

[0122] U nekim aspektima, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa PD-1 antagonistom. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-1 monoklonalnim antitelom.

[0123] U jednom primeru izvođenja, anti-PD-1 antitelo (ili njegov antigen-vezujući deo) korisno za objavu je pembrolizumab. Pembrolizumab (takođe poznat kao "KEYTRUDA<®>", lambrolizumab, i MK-3475) je humanizovano monoklonalno IgG4 antitelo usmereno prema humanom receptoru ćelijske površine PD-1 (programirana smrt-1 ili programirana ćelijska smrt-1). Pembrolizumab je opisan, na primer, u S.A.D. pat. br. 8,900,587; videti takođe http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789 (poslednji put pristupljeno: 14. decembra 2014). Pembrolizumab je odobrila FDA za lečenje relapsnog ili refraktornog melanoma i uznapredovalog NSCLC.

[0124] U sledećem primeru izvođenja, anti-PD-1 antitelo korisno za objavu je nivolumab. Nivolumab (takođe poznat kao "OPDIVO<®>"; ranije označen kao 5C4, BMS-936558, MDX-1106, ili ONO-4538) je potpuno humano IgG4 (S228P) PD-1 antitelo inhibitor imunske kontrolne tačke koje selektivno sprečava interakciju sa PD-1 ligandima (PD-L1 i PD-L2), čime se blokira smanjenje antitumorskih funkcija T-ćelija (S.A.D. pat. br. 8,008,449; Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56). Nivolumab je pokazao aktivnost u različitim uznapredovalim čvrstim tumorima uključujući karcinom bubrežnih ćelija (adenokarcinom bubrega, ili hipernefrom), melanom, i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) (Topalian et al., 2012a; Topalian et al., 2014; Drake et al., 2013; WO 2013/173223.

[0125] U drugim aspektima, anti-PD-1 antitelo je MEDI0680 (ranije AMP-514), koje je monoklonalno antitelo prema PD-1 receptoru. MEDI0680 je opisano, na primer, u S.A.D. pat. br. 8,609,089B2 ili na http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047 (poslednji put pristupljeno 14. decembra 2014).

[0126] U određenim aspektima, anti-PD-1 antitelo je BGB-A317, koje je humanizovano monoklonalno antitelo. BGB-A317 je opisano u S.A.D. publ. br.

2015/0079109.

[0127] U određenim aspektima, PD-1 antagonist je AMP-224, koji je B7-DC Fc fuzioni protein. AMP-224 je razmatran u S.A.D. publ. br. 2013/0017199 ili na http://www. cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug? cdrid=700595 (poslednji put pristupljeno 8. jula 2015).

[0128] U drugim aspektima, objava uključuje postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa PD-1 antagonistom. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-1 monoklonalnim antitelom. U drugim aspektima, anti-PD-1 monoklonalno antitelo sadrži nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0129] U drugim aspektima, objava uključuje postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa PD-1 antagonistom. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigenvezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-1 monoklonalnim antitelom. U drugim aspektima, anti-PD-1 monoklonalno antitelo sadrži nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0130] U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-L1. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-L1 monoklonalnim antitelom. U drugim aspektima, anti-PD-L1 monoklonalno antitelo sadrži durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, atezolizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0131] U određenim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitelo korisno za objavu je MSB0010718C (takođe nazvano avelumab; videti US 2014/0341917) ili BMS-936559 (ranije 12A4 ili MDX-1105) (videti, npr. S.A.D. pat. br.7,943,743; WO 2013/173223). U drugim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736 (takođe nazvano durvalumab; Khleif (2013) U: Proceedings from the European Cancer Congress 2013; 27. septembar-1. oktobar 2013; Amsterdam, Holandija).

[0132] U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-L1. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-L1 monoklonalnim antitelom. U drugim aspektima, anti-PD-L1 monoklonalno antitelo sadrži durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, atezolizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0133] U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-L1. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-L1 monoklonalnim antitelom. U drugim aspektima, anti-PD-L1 monoklonalno antitelo sadrži durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, atezolizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0134] U nekim aspektima, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa CTLA-4 antagonistom. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za CTLA-4. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-CTLA-4 monoklonalnim antitelom. U drugim aspektima, anti-CTLA-4 monoklonalno antitelo sadrži ipilimumab ili tremelimumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, objava je usmerena na postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu

4

subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa CTLA-4 antagonistom. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za CTLA-4. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja broja NK ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-CTLA-4 monoklonalnim antitelom. U drugim aspektima, anti-CTLA-4 monoklonalno antitelo sadrži ipilimumab ili tremelimumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0135] U nekim aspektima, objava je usmerena na postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa CTLA-4 antagonistom. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigenvezujućim delom koji se specifično vezuje za CTLA-4. U sledećem aspektu, objava je usmerena na postupak povećanja IL-2, IL-4, IL-21, ili bilo koje njihove kombinacije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-CTLA-4 monoklonalnim antitelom.

[0136] Primer kliničkog anti-CTLA-4 antitela je humano mAb 10D1 (sada poznato kao ipilimumab i na tržištu kao YERVOY<®>) kao što je objavljeno u S.A.D. pat. br.

6,984,720. Sledeće anti-CTLA-4 antitelo korisno za predmetne postupke je tremelimumab (takođe poznato kao CP-675,206). Tremelimumab je humano IgG2 monoklonalno anti-CTLA-4 antitelo. Tremelimumab je opisan u WO/2012/122444, S.A.D. publ. br.2012/263677, ili WO publ. br.2007/113648 A2.

[0137] Stoga, primena iRNK kao što je označeno u predmetnoj objavi nije u obliku dendritske ćelije koja sadrži iRNK koja kodira OX40L protein. Umesto toga, primena u predmetnom pronalasku je direktna primena iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu (npr. u tumor kod subjekta).

Bolesti, poremećaji i/ili stanja

[0138] U nekim primerima izvođenja, polinukleotidi (npr. iRNK) koji kodiraju OX40L polipeptid iz predmetne objave mogu se upotrebljavati za redukovanje ili smanjenje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno.

[0139] U nekim aspektima, tumor je asociran sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem. U posebnom primeru izvođenja, bolest, poremećaj, i/ili stanje je kancer. Stoga, u jednom aspektu, primena polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid leči kancer.

[0140] "Kancer" označava široku grupu različitih bolesti koje karakteriše nekontrolisani rast abnormalnih ćelija u telu. Neregulisana deoba i rast ćelija rezultuje formiranjem malignih tumora koji vrše invaziju na susedna tkiva i takođe mogu metastazirati u udaljene delove tela kroz limfni sistem ili krvotok. "Kancer" ili "kancersko tkivo" može uključivati tumor u različitim stadijumima. U određenim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma 0, tako da je, npr. kancer ili tumor u veoma ranom razvoju i nije metastazirao. U nekim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma I, tako da je, npr. kancer ili tumor relativno male veličine, nije se proširio u obližnje tkivo, i nije metastazirao. U drugim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma II ili stadijuma III, tako da je, npr. kancer ili tumor veći nego u stadijumu 0 ili stadijumu I, i urastao je u susedna tkiva ali nije metastazirao, osim potencijalno u limfne čvorove. U drugim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma IV, tako da je, npr. kancer ili tumor metastazirao. Stadijum IV se takođe može označiti kao uznapredovali ili metastatski kancer.

[0141] U nekim aspektima, kancer može uključivati, ali nije ograničen na, kancer kore nadbubrežne žlezde, uznapredovali kancer, analni kancer, aplastičnu anemiju, kancer žučnih kanala, kancer mokraćne bešike, kancer kostiju, metastaze u kostima, tumore na mozgu, kancer mozga, kancer dojke, kancer u detinjstvu, kancer nepoznatog primarnog porekla, Kaslmanovu bolest, kancer grlića materice, kancer debelog creva/rektuma, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, Juing porodicu tumora, kancer oka, kancer žučne kese, gastrointestinalne karcinoidne tumore, gastrointestinalne stromalne tumore, gestacijsku trofoblastnu bolest, Hočkinovu bolest, Kapošijev sarkom, karcinom bubrežnih ćelija, kancer larinksa i hipofarinksa, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijelomonocitnu leukemiju, kancer jetre, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, karcinoidni tumor pluća, limfom kože, maligni mezoteliom, multipla mijelom, mijelodisplastični sindrom, kancer nosne šupljine i paranazalnih sinusa, kancer nazofarinksa, neuroblastom, ne-Hočkinov limfom, kancer usne duplje i kancer orofarinksa, osteosarkom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer penisa, tumore hipofize, kancer prostate, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer pljuvačne žlezde, sarkom mekog tkiva odraslih, kancer bazalnih i pločastih ćelija kože, melanom, kancer tankog creva, kancer želuca, kancer testisa, kancer grla, kancer timusa, kancer štitne žlezde, sarkom materice, vaginalni kancer, kancer vulve, Valdenstromovu makroglobulinemiju, Vilmsov tumor i sekundarne kancere uzrokovane lečenjem kancera.

[0142] U nekim aspektima, tumor je čvrst tumor. "Čvrst tumor" uključuje, ali nije ograničen na, sarkom, melanom, karcinom, ili drugi kancer čvrstog tumora. "Sarkom" označava tumor koji je sačinjen od supstance kao što je embrionalno vezivno tkivo i generalno se sastoji od blisko zbijenih ćelija uklopljenih u fibrilarnu ili homogenu supstancu. Sarkomi uključuju, ali nisu ograničeni na, hondrosarkom, fibrosarkom, limfosarkom, melanosarkom, miksosarkom, osteosarkom, Abametijev (Abamethy's) sarkom, adipozni sarkom, liposarkom, alveolarni sarkom mekog dela, ameloblastni sarkom, botrioidni sarkom, hloroma sarkom, horio karcinom, embrionalni sarkom, sarkom Vilmsovog tumora, sarkom endometrijuma, stromalni sarkom, Juingov sarkom, fascijalni sarkom, fibroblastni sarkom, sarkom gigantske ćelije, granulocitni sarkom, Hočkinov sarkom, idiopatski multipli pigmentisani hemoragični sarkom, imunoblastni sarkom B ćelija, limfom, imunoblastni sarkom T-ćelija, Jensenov sarkom, Kapošijev sarkom, sarkom Kupferovih (Kupffer) ćelija, angiosarkom, leukosarkom, maligni mezenhimalni sarkom, parostealni sarkom, retikulocitni sarkom, Rausov sarkom, serocistični sarkom, sinovijalni sarkom, ili teleangiektatični sarkom.

[0143] Termin "melanom" označava tumor koji nastaje iz melanocitnog sistema kože i drugih organa. Melanomi uključuju, na primer, akra-lentiginozni melanom, amelanotični melanom, benigni juvenilni melanom, Klaudmanov (Cloudmanꞌs) melanom, S91 melanom, Harding-Pasej (Harding-Passey) melanom, juvenilni

4

melanom, lentigo maligni melanom, maligni melanom, metastatski melanom, nodularni melanom, subungalni melanom, ili melanom koji se širi po površini.

[0144] Termin "karcinom" označava maligni novi rast koji je sačinjen od epitelskih ćelija koje imaju tendenciju da se infiltriraju u okolna tkiva i dovedu do metastaza. Primeri karcinoma uključuju, npr. acinusni karcinom, acinous carcinoma, adenocistični karcinom, adenoidni cistični karcinom, karcinom adenomatozum, karcinom kore nadbubrežne žlezde, alveolarni karcinom, karcinom alveolarnih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, carcinoma basocellulare, bazaloidni karcinom, karcinom bazalnih pločastih ćelija, bronhioalveolarni karcinom, bronhiolarni karcinom, bronhogeni karcinom, cerebriformni karcinom, holangioćelijski karcinom, horionski karcinom, koloidni karcinom, comedo karcinom, corpus karcinom, kribriformni karcinom, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutaneum, cilindrični karcinom, karcinom cilindričnih ćelija, karcinom kanala, carcinoma durum, embrionalni karcinom, encefaloidni karcinom, epiermoidni karcinom, carcinoma epitheliale adenoides, egzofitni karcinom, carcinoma ex ulcere, fibrozni karcinom, želatinoformni karcinom, želatinozni karcinom, karcinom gigantskih ćelija, carcinoma gigantocellulare, karcinom žlezda, karcinom granuloza ćelija, karcinom matriksa dlake, hematoidni karcinom, hepatoćelijski karcinom, karcinom Hurtle (Hurthle) ćelija, hijalinski karcinom, hipernefroidni karcinom, infantilni embrionalni karcinom, karcinom in situ, intraepidermski karcinom, intraepitelski karcinom, Krompeherov (Krompecherꞌs) karcinom, karcinom Kulčicki (Kulchitzky) ćelija, karcinom velikih ćelija, lentikularni karcinom, carcinoma lenticulare, lipomatozni karcinom, limfoepitelski karcinom, carcinoma medullare, medularni karcinom, melanotoični karcinom, karcinom mole, mucinozni karcinom, karcinom muciparum, mukoćelijski karcinom, mukoepidermoidni karcinom, karcinom mucosum, mukusni karcinom, karcinom mikomatodes, karcinom nazofarinksa, sitnoćelijski karcinom, carcinoma ossificans, osteoidni karcinom, papilarni karcinom, periportalni karcinom, preinvazivni karcinom, karcinom spinoznih ćelija, pultaceozni karcinom, karcinom renalnih ćelija bubrega, karcinom rezervnih ćelija, carcinoma sarcomatodes, šnajderov karcinom, scirozni karcinom, karcinom skroti, karcinom ćelija prstena pečatnjaka, karcinom simpleks, karcinom malih ćelija, solanoidni karcinom, karcinom sferoidnih ćelija, karcinom vretenastih ćelija, karcinom spongiosum, pločasti karcinom, karcinom pločastih ćelija, string karcinom, carcinoma telangiectaticum, carcinoma telangiectodes, karcinom prelaznih ćelija, carcinoma tuberosum, tuberozni karcinom, verukozni karcinom, ili karcinom viflosum.

[0145] Dodatni kanceri koji se mogu lečiti uključuju, npr. leukemiju, Hočkinovu bolest, ne-Hočkinov limfom, multipli mijelom, neuroblastom, kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća, rabdomiosarkom, primarnu trombocitozu, primarnu makroglobulinemiju, sitnoćelijske tumore pluća, primarne tumore mozga, kancer želuca, kancer debelog creva, maligni insulanom pankreasa, maligni karcinoid, kancer mokraćne bešike, premaligne lezije kože, kancer testisa, limfome, kancer štitne žlezde, papilarni kancer štitne žlezde, neuroblastom, neuroendokrini kancer, kancer jednjaka, kancer genitourinarnog trakta, malignu hiperkalcemiju, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer korteksa nadbubrežne žlezde, kancer prostate, Milerijan (Müllerian) kancer, kancer jajnika, kancer peritoneuma, kancer falopijeve tube, ili papilarni serozni karcinom materice.

III. Kompozicije

Polinukleotidi

[0146] Polinukleotid iz predmetne objave sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. OX40L je ligand za OX40 (CD134). OX40L je takođe označen kao CD252 (klaster diferencijacije 252), član 4 superfamilije faktora nekroze tumora (ligand), taxtranskripciono aktivirani glikoprotein 1, TXGP1, ili gp34.

[0147] Humani OX40L je dužine od 183 amino-kiseline i sadrži tri domena: citoplazmatski domen amino-kiselina 1-23; transmembranski domen amino-kiselina 24-50, i vanćelijski domen amino-kiselina 51-183.

[0148] U nekim aspektima, polinukleotid sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sisara. U nekim aspektima, OX40L polipeptid sisara je mišji OX40L polipeptid. U nekim aspektima, OX40L polipeptid sisara je humani OX40L polipeptid. U nekim primerima izvođenja, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 1. U sledećem primeru izvođenja, OX40L polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 2.

[0149] U nekim primerima izvođenja, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identičnu amino-

4

kiselinskoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1 (npr. odabrana od SEQ ID NO: 1-3) ili amino-kiselinskoj sekvenci kodiranoj pomoću nukleotidne sekvence koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna za vezivanje za OX40 receptor.

[0150] U drugim aspektima, OX40L polipeptid koristan za objavu sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u Tabeli 1 sa jednom ili više konzervativnih supstitucija, pri čemu konzervativne supstitucije ne utiču na vezivanje OX40L polipeptida za OX40 receptor, tj. amino-kiselinska sekvenca se vezuje za OX40 receptor posle supstitucija.

[0151] U određenim primerima izvođenja, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identičnu SEQ ID NO: 2), pri čemu se OX40L polipeptid vezuje za OX40 receptor.

[0152] U drugim primerima izvođenja, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira OX40L polipeptid sadrži sekvencu najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identičnu sekvenci nukleinske kiseline koja je navedena u Tabeli 1 (npr. odabrana od SEQ ID NO: 4-21).

4

Tabela 1. OX40L polipeptidne i polinukleotidne sekvence

4

1

2

4

[0153] U nekim aspektima, iRNK korisna za postupke sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L. U drugim aspektima, iRNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira citoplazmatski domen OX40L. U nekim aspektima, iRNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira transmembranski domen OX40L. U određenim aspektima, iRNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L i transmembranski OX40L. U drugim aspektima, iRNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L i citoplazmatski domen OX40L. U još drugim aspektima, iRNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L, transmembranski OX40L, i citoplazmatski domen OX40L.

[0154] U nekim aspektima, iRNK sadrži kodon optimizovanu sekvencu koja kodira OX40L polipeptid, npr. kodon optimizovanu sekvencu iz Tabele 1 (npr. odabranu od SEQ ID NO: 7-21).

[0155] U nekim aspektima, polinukleotidi sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji je pune dužine. U nekim aspektima, polinukleotidi sadrže iRNK koja kodira humani OX40L polipeptid koji ima dužinu od 183 amino-kiseline. U određenim aspektima, OX40L polipeptidu može nedostajati najmanje jedna, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje 10, najmanje 14, ili najmanje 15 amino-kiselina na N-terminusu ili C-terminusu OX40L polipeptida.

[0156] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. iRNK) iz predmetne objave je strukturno modifikovan ili hemijski modifikovan. Kao što se ovde upotrebljava, "strukturna" modifikacija je ona u kojoj se dva ili više povezanih nukleozida insertuju, deletiraju, dupliciraju, invertuju ili randomizuju u polinukleotidu bez značajne hemijske modifikacije same iRNK. Pošto će hemijske veze nužno biti prekinute i ponovo formirane kako bi se izvršila strukturna modifikacija, strukturne modifikacije su hemijske prirode i dakle su hemijske modifikacije. Međutim, strukturne modifikacije će rezultovati drugačijom sekvencom nukleotida. Na primer, iRNK "AUCG" može biti hemijski modifikovana u "AU-5meC-G". Ista iRNK može biti strukturno modifikovana iz "AUCG" u "AUCCCG". Ovde, dinukleotid "CC" je insertovan, što rezultuje strukturnom modifikacijom polinukleotida.

[0157] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. iRNK) iz predmetne objave, može imati uniformnu hemijsku modifikaciju svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ili, u drugim aspektima, populaciju modifikacija proizvedenih pukom titracijom naniže iste početne modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida, ili izmereni procenat hemijske modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida, ali sa nasumičnom inkorporacijom, kao što je slučaj kada su svi uridini zamenjeni analogom uridina, npr. pseudouridinom ili 5- metoksiuridinom. U sledećem primeru izvođenja, polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid može imati uniformnu hemijsku modifikaciju dva, tri, ili četiri nukleozida istog tipa duž celog polinukleotida (npr. iRNK) (kao što su svi uridini i svi citozini, itd. modifikovani na isti način).

[0158] Kada je polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave hemijski i/ili strukturno modifikovan, iRNK se može označiti kao "modifikovana iRNK". Neograničavajući primeri hemijskih modifikacija su opisani ovde na drugom mestu.

mikroRNK vezujuća mesta

[0159] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid može dodatno sadržati jedno ili više mikroRNK vezujućih mesta. mikroRNK (ili miRNA) su nekodirajuće RNK dužine 19-25 nukleotida koje se vezuju za 3'UTR molekula nukleinske kiseline i smanjuju ekspresiju gena bilo redukovanjem stabilnosti molekula nukleinske kiseline ili inhibiranjem translacije.

[0160] Projektovanjem mikroRNK ciljnih sekvenci u polinukleotide (npr. u 3'UTR sličan region ili drugi region) iz objave, može se ciljati molekul za degradaciju ili redukovanu translaciju, pod uslovom da je mikroRNK o kojoj je reč dostupna. U jednom aspektu, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) vezuje se za odgovarajuću zrelu miRNA koja je deo aktivnog RNK-indukovanog kompleksa za utišavanje (RISC) koji sadrži Dicer. U sledećem aspektu, vezivanje miRNA vezujućeg mesta za odgovarajuću miRNA u RISC vrši degradaciju iRNK koja sadrži miRNA vezujuće mesto ili sprečava da iRNK bude translatirana.

[0161] Kao što se ovde upotrebljava, termin "mikroRNK vezujuće mesto" označava mikroRNK ciljno mesto ili mesto koje prepoznaje mikroRNK, ili bilo koju nukleotidnu sekvencu za koju se mikroRNK vezuje ili asocira. Trebalo bi razumeti da "vezivanje" može da prati tradicionalna pravila Votson-Krik (Watson-Crick) hibridizacije ili može da odražava bilo koju stabilnu asocijaciju mikroRNK sa ciljnom sekvencom na mestu mikroRNK mesta ili pored njega.

[0162] Neke mikroRNK, npr. miR-122, veoma su zastupljene u normalnom tkivu, ali su prisutne u mnogo nižim nivoima u tkivu kancera ili tumora. Stoga, projektovanje mikroRNK ciljnih sekvenci (tj. mikroRNA vezujućih mesta) u polinukleotide koji kodiraju OX40L polipeptid (npr. u 3'UTR sličan region ili drugi region) može efikasno ciljati molekul za degradaciju ili redukovanu translaciju u normalnom tkivu (gde je mikroRNK veoma zastupljena) dok obezbeđuje visoke nivoe translacije u tkivu kancera ili tumora (gde je mikroRNK prisutna u mnogo nižim nivoima). Ovo obezbeđuje pristup ciljanja tumora za postupke i kompozicije iz objave.

[0163] U nekim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je u potpunosti komplementarno sa miRNA (npr. miR-122), čime se vrši degradacija iRNK fuzionisane sa miRNA vezujućim mestom. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto nije u potpunosti komplementarno sa odgovarajućom miRNA. U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je iste dužine kao i odgovarajuća miRNA (npr. miR-122). U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je jedan nukleotid kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122, koja ima 22 nt) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili oba. U još nekim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je dva nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili oba. U još drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je tri nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili oba. U nekim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je četiri nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili oba. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je pet nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili oba. U nekim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je šest nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili oba. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je sedam nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je osam nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je devet nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je deset nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je jedanaest nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je dvanaest nukleotida kraće od odgovarajuće mikroRNK (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. miRNA vezujuća mesta koja su kraća od odgovarajućih miRNA su i dalje sposobna da vrše degradaciju iRNK u koju je inkorporisano jedno ili više miRNA vezujućih mesta ili spreče translaciju iRNK.

[0164] U nekim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima dovoljnu komplementarnost sa miRNA (npr. miR-122) tako da RISC kompleks koji sadrži miRNA (npr. miR-122) iseca polinukleotid koji sadrži mikroRNK vezujuće mesto. U drugim aspektima, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima nesavršenu komplementarnost, tako da RISC kompleks koji sadrži miRNA (npr. miR-122) indukuje nestabilnost u polinukleotidu koji sadrži mikroRNK vezujuće mesto. U sledećem aspektu, mikroRNK vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima nesavršenu komplementarnost, tako da RISC kompleks koji sadrži miRNA (npr. miR-122) suzbija transkripciju polinukleotida koji sadrži mikroRNK vezujuće mesto. U jednom aspektu, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima jednu nepodudarnost sa odgovarajućom miRNA (npr. miR-122). U sledećem aspektu, miRNA vezujuće mesto ima dve nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima tri nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima četiri nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima pet nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima šest nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima sedam nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima osam nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima devet nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima deset nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima jedanaest nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima dvanaest nepodudarnosti sa odgovarajućom miRNA.

[0165] U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima najmanje oko deset neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko deset neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA (npr. miR-122), najmanje oko jedanaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko jedanaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko dvanaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko dvanaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko trinaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko trinaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, ili najmanje oko četrnaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko četrnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA. U nekim aspektima, miRNA vezujuća mesta imaju najmanje oko petnaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko petnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko šesnaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko šesnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko sedamnaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko sedamnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko osamnaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko osamnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko devetnaest neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko devetnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko dvadeset neprekidnih nukleotida komplementarnih sa najmanje oko dvadeset neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, ili najmanje oko dvadeset jedan neprekidni nukleotid komplementaran sa najmanje oko dvadeset jednim neprekidnim nukleotidom odgovarajuće miRNA.

[0166] U nekim primerima izvođenja, polinukleotidi sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid i najmanje jedno miR122 vezujuće mesto, najmanje dva miR122 vezujuća mesta, najmanje tri miR122 vezujuća mesta, najmanje četiri miR122 vezujuća mesta, ili najmanje pet miR122 vezujućih mesta. U jednom aspektu, miRNA vezujuće mesto vezuje miR-122 ili je komplementarno sa miR-122. U sledećem aspektu, miRNA vezujuće mesto vezuje se za miR-122-3p ili miR-122-5p. U posebnom aspektu, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identičnu SEQ ID NO: 24, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122. U sledećem posebnom aspektu, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identičnu SEQ ID NO: 26, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122. Ove sekvence su prikazane u nastavku u Tabeli 2.

Tabela 2. miR-122 i miR-122 vezujuća mesta

[0167] U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je insertovano u polinukleotid iz objave na bilo kojoj poziciji polinukleotida (npr.3' UTR); mesto insercije u polinukleotidu može biti bilo gde u polinukleotidu sve dok insercija miRNA vezujućeg mesta u polinukleotidu ne ometa translaciju funkcionalnog OX40L polipeptida u odsustvu odgovarajuće miRNA (npr. miR122); a u prisustvu miRNA (npr. miR122), insercija miRNA vezujućeg mesta u polinukleotid i vezivanje miRNA vezujućeg mesta za odgovarajuću miRNA sposobne su da vrše degradaciju polinukleotida ili sprečavaju translaciju polinukleotida. U jednom primeru izvođenja, miRNA vezujuće mesto je insertovano u 3'UTR polinukleotida.

1

[0168] U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto je insertovano u najmanje oko 30 nukleotida nizvodno od stop kodona iRNK koja kodira OX40L. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto je insertovano u najmanje oko 10 nukleotida, najmanje oko 15 nukleotida, najmanje oko 20 nukleotida, najmanje oko 25 nukleotida, najmanje oko 30 nukleotida, najmanje oko 35 nukleotida, najmanje oko 40 nukleotida, najmanje oko 45 nukleotida, najmanje oko 50 nukleotida, najmanje oko 55 nukleotida, najmanje oko 60 nukleotida, najmanje oko 65 nukleotida, najmanje oko 70 nukleotida, najmanje oko 75 nukleotida, najmanje oko 80 nukleotida, najmanje oko 85 nukleotida, najmanje oko 90 nukleotida, najmanje oko 95 nukleotida, ili najmanje oko 100 nukleotida nizvodno od stop kodona polinukleotida, npr. iRNK koja kodira OX40L. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto je insertovano u oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida, oko 20 nukleotida do oko 90 nukleotida, oko 30 nukleotida do oko 80 nukleotida, oko 40 nukleotida do oko 70 nukleotida, oko 50 nukleotida do oko 60 nukleotida, oko 45 nukleotida do oko 65 nukleotida nizvodno od stop kodona polinukleotida, npr. iRNK koja kodira OX40L.

Arhitektura IVT polinukleotida

[0169] U nekim aspektima, polinukleotid iz predmetne objave koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid je IVT polinukleotid. Tradicionalno, osnovne komponente iRNK molekula uključuju najmanje kodirajući region, 5'UTR, 3'UTR, 5' kapu i poli-A rep. IVT polinukleotidi iz predmetne objave mogu da funkcionišu kao iRNK, ali se razlikuju od iRNK divljeg tipa po svojim funkcionalnim i/ili strukturnim svojstvima dizajna koji služe, npr. za prevazilaženje postojećih problema efikasne proizvodnje polipeptida upotrebom terapeutika zasnovanih na nukleinskim kiselinama.

[0170] Primarni konstrukt IVT polinukleotida sadrži prvi region povezanih nukleotida koji je omeđen prvim bočnim regionom i drugim bočnim regionom. Ovaj prvi region može uključivati, ali nije ograničen na, kodirani OX40L polipeptid. Prvi bočni region može uključivati sekvencu povezanih nukleozida koji funkcionišu kao 5' netranslatirani region (UTR) kao što je 5' UTR bilo koje od nukleinskih kiselina koje kodiraju nativni 5' UTR polipeptida ili ne-nativni 5' UTR kao što je, ali ne ograničavajući se na, heterologni 5' UTR ili sintetički 5' UTR. IVT koji kodira OX40L polipeptid može sadržati na svom 5' terminusu region signalne sekvence koji kodira jednu ili više signalnih sekvenci. Bočni region može sadržati region povezanih

2

nukleotida koji sadrži jednu ili više kompletnih ili nekompletnih 5' UTR sekvenci. Bočni region takođe može sadržati 5' terminusnu kapu. Drugi bočni region može sadržati region povezanih nukleotida koji sadrži jedan ili više kompletnih ili nekompletnih 3' UTR koji mogu da kodiraju nativni 3' UTR OX40L ili ne-nativni 3' UTR kao što je, ali ne ograničavajući se na, heterologni 3' UTR ili sintetički 3' UTR. Bočni region takođe može sadržati 3' sekvencu repa. 3' sekvenca repa može biti, ali nije ograničena na, poliA rep, poliA-G kvartet i/ili sekvencu ukusnice.

[0171] Prvi operativni region premošćuje 5' terminus prvog regiona i prvi bočni region. Tradicionalno, ovaj operativni region sadrži Start kodon. Operativni region može alternativno sadržati bilo koju sekvencu inicijacije translacije ili signal uključujući Start kodon.

[0172] Drugi operativni region premošćuje 3' terminus prvog regiona i drugi bočni region. Tradicionalno ovaj operativni region sadrži Stop kodon. Operativni region može alternativno sadržati bilo koju sekvencu inicijacije translacije ili signal uključujući Stop kodon. Višestruki serijski stop kodoni se takođe mogu upotrebljavati u IVT polinukleotidu. U nekim aspektima, operativni region iz predmetne objave može sadržati dva stop kodona. Prvi stop kodon može biti "TGA" ili "UGA" i drugi stop kodon može biti odabran iz grupe koja se sastoji od "TAA", "TGA", "TAG", "UAA", "UGA" ili "UAG".

[0173] Primarni konstrukt IVT polinukleotida sadrži prvi region povezanih nukleotida koji je omeđen prvim bočnim regionom i drugim bočnim regionom. Kao što se ovde upotrebljava, "prvi region" se može označiti kao "kodirajući region" ili "region koji kodira" ili jednostavno "prvi region". Ovaj prvi region može uključivati, ali nije ograničen na, kodirani polipeptid od interesa. U jednom aspektu, prvi region može uključivati, ali nije ograničen na, otvoreni okvir čitanja koji kodira najmanje jedan polipeptid od interesa. Otvoreni okvir čitanja može biti kodon optimizovan u celini ili delimično. Bočni region može sadržati region povezanih nukleotida koji sadrži jednu ili više kompletnih ili nekompletnih 5' UTR sekvenci koje mogu biti u potpunosti kodon optimizovane ili delimično kodon optimizovane. Bočni region može uključivati najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline uključujući, ali ne ograničavajući se na, miR sekvence, TERZAK™ sekvence i sekvence kontrole translacije. Bočni region takođe može sadržati 5' terminusnu kapu 138. 5' terminusni region kape može uključivati kapu koja se javlja u prirodi, sintetičku kapu ili optimizovanu kapu. Drugi bočni region može sadržati region povezanih nukleotida koji sadrži jedan ili više kompletnih ili nekompletnih 3' UTR. Drugi bočni region može biti u potpunosti kodon optimizovan ili delimično kodon optimizovan. Bočni region može uključivati najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline uključujući, ali ne ograničavajući se na, miR sekvence i sekvence kontrole translacije. Posle drugog bočnog regiona, primarni konstrukt polinukleotida može sadržati 3' sekvencu repa. 3' sekvenca repa može uključivati sintetički region repa i/ili nukleozid koji završava lanac. Neograničavajući primeri sintetičkog regiona repa uključuju poliA sekvencu, poliC sekvencu, ili poliA-G kvartet. Neograničavajući primeri nukleozida koji završavaju lanac uključuju 2'-O metil, F i zaključane nukleinske kiseline (LNA).

[0174] Prvi operativni region premošćuje 5' terminus prvog regiona i prvi bočni region. Tradicionalno ovaj operativni region sadrži Start kodon. Operativni region može alternativno sadržati bilo koju sekvencu inicijacije translacije ili signal uključujući Start kodon.

[0175] Drugi operativni region premošćuje 3' terminus prvog regiona i drugi bočni region. Tradicionalno ovaj operativni region sadrži Stop kodon. Operativni region može alternativno sadržati bilo koju sekvencu inicijacije translacije ili signal uključujući Stop kodon. U skladu sa predmetnom objavom, višestruki serijski stop kodoni se takođe mogu upotrebljavati.

[0176] U nekim aspektima, prvi i drugi bočni region IVT polinukleotida mogu biti u opsegu nezavisno od 15-1.000 nukleotida dužine (npr. više od 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500 nukleotida ili najmanje 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500 nukleotida).

[0177] U nekim aspektima, sekvenca repa IVT polinukleotida može biti u opsegu od toga da je odsutna do 500 nukleotida dužine (npr. najmanje 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ili 500 nukleotida). Tamo gde je region repa poliA rep, dužina se može odrediti u jedinicama ili kao funkcija vezivanja poliA vezujućeg proteina. U ovom aspektu, poliA rep je dovoljno dugačak da vezuje najmanje 4 monomera poliA vezujućeg proteina. Monomeri poliA vezujućeg proteina vezuju se za nizove od približno 38 nukleotida. Kao takvi, uočeno je da su poliA repovi od oko 80 nukleotida i 160 nukleotida funkcionalni.

4

[0178] U nekim aspektima, region kape IVT polinukleotida može sadržati jednu kapu ili seriju nukleotida koji formiraju kapu. U ovom aspektu region kape može biti od 1 do 10, npr. 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, ili najmanje 2, ili 10 ili manje nukleotida dužine. U nekim aspektima, kapa je odsutna.

[0179] U nekim aspektima, prvi i drugi operativni region IVT polinukleotida mogu biti u opsegu od 3 do 40, npr. 5-30, 10-20, 15, ili najmanje 4, ili 30 ili manje nukleotida dužine i mogu sadržati, pored Start i/ili Stop kodona, jednu ili više signalnih i/ili restrikcionih sekvenci.

[0180] U nekim aspektima, IVT polinukleotidi mogu biti strukturno modifikovani ili hemijski modifikovani. Kada su IVT polinukleotidi hemijski i/ili strukturno modifikovani, polinukleotidi se mogu označiti kao "modifikovani IVT polinukleotidi".

[0181] U nekim aspektima, ukoliko su IVT polinukleotidi hemijski modifikovani, oni mogu imati uniformnu hemijsku modifikaciju svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ili populaciju modifikacija proizvedenih pukom titracijom naniže iste početne modifikacije u svim ili bilo kom istom tipu nukleozida, ili izmereni procenat hemijske modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida, ali sa nasumičnom inkorporacijom, kao što je gde su svi uridini zamenjeni analogom uridina, npr. pseudouridinom ili 5-metoksiuridinom. U sledećem aspektu, IVT polinukleotidi mogu imati uniformnu hemijsku modifikaciju od dva, tri, ili četiri nukleozida istog tipa duž celog polinukleotida (kao što su svi uridini i svi citozini, itd. modifikovani na isti način).

[0182] U nekim aspektima, IVT polinukleotidi mogu uključivati sekvencu koja kodira samoisecajući peptid, koji je ovde opisan, kao što je, ali nije ograničen na 2A peptid. Polinukleotidna sekvenca 2A peptida u IVT polinukleotidu može biti modifikovana ili kodon optimizovana pomoću postupaka koji su ovde opisani i/ili su poznati u struci. U nekim aspektima, ova sekvenca se može upotrebljavati za odvajanje kodirajućeg regiona dva ili više polipeptida od interesa u IVT polinukleotidu.

Arhitektura himernog polinukleotida

[0183] U nekim aspektima, polinukleotid iz predmetne objave je himerni polinukleotid. Himerni polinukleotidi ili RNK konstrukti koji se ovde objavljuju održavaju modularnu organizaciju sličnu IVT polinukleotidima, ali himerni polinukleotidi sadrže jednu ili više strukturnih i/ili hemijskih modifikacija ili izmena koje daju korisna svojstva polinukleotidu. Kao takvi, himerni polinukleotidi koji su modifikovani iRNK molekuli iz predmetne objave nazivaju se "himerno modifikovana iRNK" ili "himerna iRNK".

[0184] Himerni polinukleotidi imaju delove ili regione koji se razlikuju po veličini i/ili obrascu hemijske modifikacije, poziciji hemijske modifikacije, procentu hemijske modifikacije ili populaciji hemijske modifikacije i kombinacijama prethodno navedenog.

[0185] Primeri delova ili regiona, gde himerni polinukleotid funkcioniše kao iRNK i kodira OX40L, ali nije ograničen na, netranslatirane regione (UTR, kao što su 5' UTR ili 3' UTR), kodirajuće regione, regione kape, regione poliA repa, start regione, stop regione, regione signalne sekvence, i njihove kombinacije. Regioni ili delovi koji spajaju ili leže između drugih regiona takođe mogu biti dizajnirani da imaju podregione.

[0186] U nekim aspektima, himerni polinukleotidi iz objave imaju strukturu koja sadrži Formulu I.

5' [An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L33' Formula I

pri čemu:

svaki od A i B nezavisno sadrži region povezanih nukleozida;

bilo A ili B ili i A i B kodiraju OX40L polipeptid koji je opisan ovde na drugom mestu;

C je opcioni region povezanih nukleozida;

najmanje jedan od regiona A, B, ili C je poziciono modifikovan, pri čemu navedeni poziciono modifikovni region sadrži najmanje dva hemijski modifikovana nukleozida jednog ili više nukleozida istog tipa adenozina, timidina, guanozina, citidina, ili uridina, i pri čemu su najmanje dve hemijske modifikacije nukleozida istog tipa različite hemijske modifikacije;

n, o i p su nezavisno ceo broj između 15-1000;

x i y su nezavisno 1-20;

z je 0-5;

L1 i L2 su nezavisno opcione linker funkcionalne grupe, pri čemu su navedene linker funkcionalne grupe bilo zasnovane na nukleinskoj kiselini ili nisu zasnovane na nukleinskoj kiselini; i

L3 je opcioni konjugat ili opciona linker funkcionalna grupa, pri čemu je navedena linker funkcionalna grupa bilo zasnovana na nukleinskoj kiselini ili nije zasnovana na nukleinskoj kiselini.

[0187] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida A sadrži sekvencu povezanih nukleozida koja može da funkcioniše kao 5' netranslatirani region (UTR). Sekvenca povezanih nukleozida može biti prirodni ili sintetički 5' UTR. Kao neograničavajući primer, himerni polinukleotid može da kodira OX40L polipeptid i sekvenca povezanih nukleozida A može da kodira nativni 5' UTR OX40L polipeptida ili neheterologni 5' UTR kao što je, ali nije ograničeno na sintetički UTR.

[0188] U sledećem aspektu, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida A je region kape. Region kape može biti lociran 5' do regiona povezanih nukleozida A koji funkcioniše kao 5' UTR. Region kape može sadržati najmanje jednu kapu kao što je, ali ne ograničavajući se na, CapO, Cap1, ARCA, inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoroguanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2 -amino-guanozin, LNA-guanozin, 2-azido-guanozin, Cap2 i Cap4.

[0189] U nekim aspektima, polinukleotid iz objave sadrži Cap1 5'UTR. U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži 5' UTR sekvencu, npr. Cap1, za kodiranje OX40L polipeptida koji se ovde objavljuje, povećava ekspresiju OX40L u poređenju sa polinukleotidima koji kodiraju OX40L koji sadrži različit 5' UTR (npr. CapO, ARCA, inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, 2-azido-guanozin, Cap2 ili Cap4). U nekim aspektima, polinukleotid sadrži Cap1 5'UTR, pri čemu polinukleotid kodira OX40L polipeptid. U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži Cap1 5'UTR, povećava ekspresiju OX40L.

[0190] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida B sadrži najmanje jedan otvoreni okvir čitanja sekvence nukleinske kiseline koja kodira OX40L polipeptid. Sekvenca nukleinske kiseline može biti kodon optimizovana i/ili sadržati najmanje jednu modifikaciju.

[0191] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida C sadrži sekvencu povezanih nukleozida koja može da funkcioniše kao 3' UTR. Sekvenca povezanih nukleozida može biti prirodni ili sintetički 3' UTR. Kao neograničavajući primer, himerni polinukleotid može da kodira OX40L polipeptid i sekvenca povezanih nukleozida C može da kodira nativni 3' UTR OX40L polipeptida ili neheterologni 3' UTR kao što je, ali nije ograničeno na sintetički UTR.

[0192] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida A sadrži sekvencu povezanih nukleozida koja funkcioniše kao 5' UTR i najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida C sadrži sekvencu povezanih nukleozida koja funkcioniše kao 3' UTR. U nekim aspektima, 5' UTR i 3' UTR mogu biti iz iste ili različite vrste. U sledećem aspektu, 5' UTR i 3' UTR mogu kodirati nativne netranslatirane regione iz različitih proteina iz iste ili različitih vrsta.

[0193] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave mogu se klasifikovati kao hemimeri (hemimers), gapmeri (gapmers), vingmeri (wingmers), ili blokmeri (blockmers).

[0194] Kao što se ovde upotrebljava, "hemimer" je himerni polinukleotid koji sadrži region ili deo koji sadrži polovinu jednog obrasca, procenta, pozicije ili populacije hemijske(ih) modifikacije(a) i polovinu drugog obrasca, procenta, pozicije ili populacije hemijske(ih) modifikacije(a). Himerni polinukleotidi iz predmetne objave takođe mogu sadržati hemimerne podregione. U nekim aspektima, deo ili region je 50% jednog i 50% drugog.

[0195] U nekim aspektima, ceo himerni polinukleotid je 50% jednog i 50% drugog. Bilo koji region ili deo bilo kog himernog polinukleotida iz objave može biti hemimer. Tipovi hemimera uključuju hemimere obrasca, hemimere populacije ili hemimere pozicije. Po definiciji, hemimeri su 50:50 procenata hemimeri.

[0196] Kao što se ovde upotrebljava, "gapmer" je himerni polinukleotid koji ima najmanje tri dela ili regiona sa prazninom između delova ili regiona. "Praznina (gap)" može sadržati region povezanih nukleozida ili jedan nukleozid koji se razlikuje od himerne prirode dva dela ili regiona koji ga omeđavaju. Dva dela ili regiona gapmera mogu biti međusobno isti ili različiti.

[0197] Kao što se ovde upotrebljava, "vingmer" je himerni polinukleotid koji ima najmanje tri dela ili regiona sa prazninom između delova ili regiona. Za razliku od gapmera, dva bočna dela ili regiona koji okružuju prazninu u vingmeru su ista po stepenu ili vrsti. Takva sličnost može biti u dužini broja jedinica različitih modifikacija ili u broju modifikacija. Krila (wings) vingmera mogu biti duža ili kraća od praznine. Delovi ili regioni krila mogu biti 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 95% duži ili kraći od regiona koji sadrži prazninu.

[0198] Kao što se ovde upotrebljava, "blokmer" je polinukleotid sa obrascem gde su delovi ili regioni ekvivalentne veličine ili broja i tipa modifikacija. Regioni ili podregioni u blokmeru mogu biti 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 ili 500 nukleozida dugački.

[0199] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave koji imaju obrazac hemijske modifikacije označavaju se kao "himere obrasca". Himere obrasca se takođe mogu označiti kao blokmeri. Himere obrasca su oni polinukleotidi koji imaju obrazac modifikacija unutar, duž ili među regionima ili delovima.

[0200] Obrasci modifikacija unutar dela ili regiona su oni koji počinju i završavaju se unutar definisanog regiona. Obrasci modifikacija duž dela ili regiona su oni obrasci koji počinju u jednom delu ili regionu i završavaju se u drugom susednom delu ili regionu. Obrasci modifikacija među delovima ili regionima su oni koji počinju i završavaju se u jednom delu ili regionu i ponavljaju se u drugom delu ili regionu, koji nije nužno u blizini prvog regiona ili dela.

[0201] Regioni ili podregioni himera ili blokmera obrasca mogu imati jednostavne alternirajuće obrasce kao što je ABAB[AB]n gde svako "A" i svako "B" predstavljaju različite hemijske modifikacije (najmanje jedna baza, šećer ili linker okosnice), različite vrste hemijskih modifikacija (npr. koje se javljaju u prirodi i koje se ne javljaju u prirodi), različite procente modifikacija ili različite populacije modifikacija. Obrazac se može ponoviti n broj puta gde je n=3-300. Dodatno, svaki A ili B može predstavljati od 1-2500 jedinica (npr. nukleozida) u obrascu. Obrasci takođe mogu biti alternirajući višestruci kao što su AABBAABB[AABB]n (alternirajući dvostruki višestruki) ili AAABBBAAABBB[AAABBB]n (alternirajući trostruki višestruki) obrazac. Obrazac se može ponoviti n broj puta gde je n=3-300.

[0202] Različiti obrasci se takođe mogu mešati zajedno kako bi se formirao obrazac drugog reda. Na primer, jedan alternirajući obrazac može se kombinovati sa trostrukim alternirajućim obrascem kako bi se formirao alternirajući obrazac drugog reda A'B'. Jedan primer bi bio [ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAAB BB], gde je [ABABAB] A', i [AAABBBAAABBB] je B'. Na sličan način, ovi obrasci se mogu ponoviti n broj puta, gde je n=3-300.

[0203] Obrasci mogu uključivati tri ili više različitih modifikacija kako bi se formirao obrazac ABCABC[ABC]n. Ovi trikomponentni obrasci takođe mogu biti višestruci, kao što je AABBCCAABBCC[AABBCC]n i mogu biti dizajnirani kao kombinacije sa drugim obrascima kao što je ABCABCAABBCCABCABCAABBCC, i mogu biti i obrasci višeg reda.

[0204] Regioni ili podregioni modifikacija pozicije, procenta, i populacije ne moraju da odražavaju jednak doprinos svakog tipa modifikacije. Oni mogu formirati serije kao što su "1-2-3-4", "1-2-4-8", gde svaki ceo broj predstavlja broj jedinica određenog tipa modifikacije. Alternativno, oni mogu biti samo neparni, kao što je "1-3-3-1-3-1-5" ili čak samo "2-4-2-4-6-4-8" ili mešavina i neparnih i parnih brojeva jedinica kao što je "1-3-4-2-5-7-3-3-4".

[0205] Himere obrasca mogu varirati u svojoj hemijskoj modifikaciji po stepenu (kao što su one prethodno opisane) ili po vrsti (npr. različite modifikacije).

[0206] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetnog pronalaska koji imaju najmanje jedan region sa dve ili više različitih hemijskih modifikacija dva ili više nukleozidnih članova istog tipa nukleozida (A, C, G, T, ili U) označavaju se kao "poziciono modifikovane" himere. Poziciono modifikovane himere se ovde takođe označavaju kao himere "selektivnog postavljanja" ili "polinukleotidi selektivnog postavljanja". Kao što naziv implicira, selektivno postavljanje označava dizajn polinukleotida koji, za razliku od polinukleotida u struci gde je modifikacija bilo kog A, C, G, T ili U ista na osnovu postupka sinteze, može imati različite modifikacije za pojedine A, C, G, T ili U u polinukleotidu ili njegovom regionu. Na primer, u poziciono modifikovanom himernom polinukleotidu, mogu postojati dve ili više različitih hemijskih modifikacija bilo kog tipa nukleozida A, C, G, T, ili U. Takođe mogu postojati kombinacije dva ili više sa bilo koja dva ili više nukleozida istog tipa. Na primer, poziciono modifikovan ili selektivno postavljen himerni polinukleotid može sadržati 3 različite modifikacije populacije adenina u molekulu i takođe imati 3 različite modifikacije populacije citozina u konstruktu - od kojih sve mogu imati jedinstveno, nenasumično, postavljanje.

[0207] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave koji imaju procenat hemijske modifikacije označavaju se kao "himere procenta". Himere procenta mogu imati regione ili delove koji sadrže najmanje 1%, najmanje 2%, najmanje 5%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% modifikacija pozicije, obrasca ili populacije. Alternativno, himera procenta može biti potpuno modifikovana u pogledu modifikacije pozicije, obrasca, ili populacije. Procenat modifikacije himere procenta može se podeliti između modifikacija koje se javljaju u prirodi i koje se ne javljaju u prirodi.

[0208] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave koji imaju populaciju hemijske modifikacije označavaju se kao "himere populacije". Himera populacije može sadržati region ili deo gde nukleozidi (njihova baza, šećer ili veza okosnice, ili njihova kombinacija) imaju odabranu populaciju modifikacija. Takve modifikacije mogu se odabrati od funkcionalnih populacija kao što su modifikacije koje indukuju, menjaju ili moduliraju fenotipski ishod. Na primer, funkcionalna populacija može biti populacija ili selekcija hemijskih modifikacija koje povećavaju nivo citokina. Druge funkcionalne populacije mogu pojedinačno ili zajedno da funkcionišu da smanje nivo jednog ili više citokina. Upotreba selekcije ovih modifikacija sličnih funkcionalnim u himernom polinukleotidu bi stoga činila "funkcionalnu himeru populacije". Kao što se ovde upotrebljava, "funkcionalna himera populacije" može biti ona čije je jedinstveno funkcionalno svojstvo definisano populacijom modifikacija kao što je prethodno opisano ili se termin može primeniti na celokupnu funkciju samog himernog polinukleotida. Na primer, kao celina himerni polinukleotid može da funkcioniše na drugačiji ili superiorniji način u poređenju sa nemodifikovanim ili nehimernim polinukleotidom.

1

[0209] Treba napomenuti da se polinukleotidi koji imaju uniformnu hemijsku modifikaciju svih nukleozida bilo kog istog tipa ili populaciju modifikacija proizvedenih pukom titracijom naniže iste početne modifikacije u svim nukleozidima bilo kog istog tipa, ili izmereni procenat hemijske modifikacije svih nukleozida bilo kog istog tipa ali sa nasumičnom inkorporacijom, kao što je slučaj kada su svi uridini zamenjeni analogom uridina, npr. pseudouridinom ili 5-metoksiuridinom, ne smatraju himernim polinukleotidima. Slično, polinukleotidi koji imaju uniformnu hemijsku modifikaciju od dva, tri, ili četiri nukleozida istog tipa duž celog polinukleotida (kao što su svi uridini i svi citozini, itd. modifikovani na isti način) ne smatraju se himernim polinukleotidima. Jedan primer polinukleotida koji nije himeran je kanonski pseudouridin/5-metil citozin modifikovani polinukleotid. Ovi uniformni polinukleotidi su u potpunosti došli putem in vitro transkripcije (IVT) enzimske sinteze; i usled ograničenja enzima koji sintetišu, oni sadrže samo jednu vrstu modifikacije pri pojavi svakog istog tipa nukleozida, odn. adenozina (A), timidina (T), guanozina (G), citidina (C) ili uridina (U), koji se nalaze u polinukleotidu. Takvi polinukleotidi se mogu okarakterisati kao IVT polinukleotidi.

[0210] Himerni polinukleotidi iz predmetne objave mogu biti strukturno modifikovani ili hemijski modifikovani. Kada su himerni polinukleotidi iz predmetne objave hemijski i/ili strukturno modifikovani, polinukleotidi se mogu označiti kao "modifikovani himerni polinukleotidi".

[0211] Regioni ili delovi himernih polinukleotida mogu biti odvojeni linker ili spejser funcionalnom grupom. Takvi linkeri ili spejseri mogu biti zasnovani na nukleinskoj kiselini ili nenukleozidni.

[0212] U nekim aspektima, himerni polinukleotidi mogu uključivati sekvencu koja kodira samoisecajući peptid koji je ovde opisan, kao što je, ali ne ograničavajući se na 2A peptid. Polinukleotidna sekvenca 2A peptida u himernom polinukleotidu može biti modifikovana ili kodon optimizovana pomoću postupaka koji su ovde opisani i/ili su poznati u struci.

[0213] Bez obzira na prethodno navedeno, himerni polinukleotidi iz predmetne objave mogu sadržati region ili deo koji nije poziciono modifikovan ili nije himeran kao što je ovde definisano. Na primer, region ili deo himernog polinukleotida može biti uniformno modifikovan na jednom ili više A, T, C, G, ili U, ali polinukleotidi neće biti uniformno modifikovani duž celog regiona ili dela.

2

[0214] Himerni polinukleotidi iz predmetne objave mogu biti potpuno poziciono modifikovani ili delimično poziciono modifikovani. Takođe mogu imati podregione koji mogu biti bilo kog obrasca ili dizajna.

[0215] U nekim aspektima, regioni ili podregioni polinukleotida mogu biti u opsegu od toga da su odsutni do 500 nukleotida dužine (npr. najmanje 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ili 500 nukleotida). Tamo gde je region poliA rep, dužina se može odrediti u jedinicama ili kao funkcija vezivanja poliA vezujućeg proteina. U ovom aspektu, poliA rep je dovoljno dugačak da vezuje najmanje 4 monomera poliA vezujućeg proteina. Monomeri poliA vezujućeg proteina vezuju se za nizove od približno 38 nukleotida. Kao takvi, uočeno je da su poliA repovi od oko 80 nukleotida do oko 160 nukleotida funkcionalni. Himerni polinukleotidi iz predmetne objave koji funkcionišu kao iRNK ne moraju da sadrže poliA rep.

[0216] U skladu sa predmetnom objavom, himerni polinukleotidi koji funkcionišu kao iRNK mogu imati region kape. Region kape može sadržati jednu kapu ili seriju nukleotida koji formiraju kapu. U ovom aspektu region kape može biti od 1 do 10, npr.

2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, ili najmanje 2, ili 10 ili manje nukleotida dužine. U nekim aspektima, kapa je odsutna.

[0217] Predmetna objava razmatra himerne polinukleotide koji su cirkularni ili ciklični. Kao što naziv implicira, cirkularni polinukleotidi su cirkularne prirode što znači da su terminusi spojeni na neki način, bilo ligacijom, kovalentnom vezom, zajedničkom asocijacijom sa istim proteinom ili drugim molekulom ili kompleksom ili hibridizacijom.

[0218] Himerni polinukleotidi, formulacije i kompozicije koje sadrže himerne polinukleotide, i postupci pravljenja, upotrebe i primene himernih polinukleotida takođe su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/53907.

[0219] U nekim aspektima, himerni polinukleotid kodira OX40L polipeptid. U nekim aspektima, himerni polinukleotidi iz objave sadrže bilo koju od sekvenci OX40L nukleinske kiseline koje su navedene u Tabeli 1. U nekim aspektima himerni polinukleotid iz objave kodira bilo koji od OX40L polipeptida koji su navedeni u Tabeli 1.

Cirkularni polinukleotid

[0220] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid može biti cirkularan ili cikličan. Kao što se ovde upotrebljava, "cirkularni polinukleotidi" ili "circP" znači jednolančani cirkularni polinukleotid koji deluje suštinski kao, i ima svojstva, RNK. Termin "cirkularni" takođe je namenjen da obuhvati bilo koju sekundarnu ili tercijarnu konfiguraciju circP. Cirkularni polinukleotidi su cirkularne prirode što znači da su terminusi spojeni na neki način, bilo ligacijom, kovalentnom vezom, zajedničkom asocijacijom sa istim proteinom ili drugim molekulom ili kompleksom ili hibridizacijom.

[0221] Cirkularni polinukleotidi, formulacije i kompozicije koje sadrže cirkularne polinukleotide, i postupci pravljenja, upotrebe i primene cirkularnih polinukleotida takođe su objavljeni u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/53904.

[0222] U nekim aspektima, cirkularni polinukleotid kodira OX40L polipeptid. U nekim aspektima, cirkularni polinukleotidi iz objave sadrže bilo koju od sekvenci OX40L nukleinske kiseline koja je navedena navedena u Tabeli 1. U nekim aspektima, cirkularni polinukleotidi iz objave kodiraju bilo koji od OX40L polipeptida koji su navedeni u Tabeli 1. U nekim aspektima, cirkularni polinukleotid povećava ekspresiju OX40L.

Multimeri polinukleotida

[0223] U nekim aspektima, više različitih himernih polinukleotida i/ili IVT polinukleotida mogu biti povezani zajedno preko 3'-kraja upotrebom nukleotida koji su modifikovani na 3'-terminusu. Hemijska konjugacija se može upotrebljavati za kontrolu stehiometrije isporuke u ćelije. Ovo se može kontrolisati hemijskim povezivanjem himernih polinukleotida i/ili IVT polinukleotida upotrebom 3'-azido terminiranog nukleotida na jednoj vrsti polinukleotida i nukleotida koji sadrži C5-etinil ili alkinil na suprotnoj vrsti polinukleotida. Modifikovani nukleotid se dodaje posttranskripciono upotrebom terminalne transferaze (New England Biolabs, Ipswich, MA) u skladu sa protokolom proizvođača. Posle dodavanja 3'-modifikovanog nukleotida, dve vrste polinukleotida mogu se kombinovati u vodenom rastvoru, u prisustvu ili odsustvu bakra, kako bi se formirala nova kovalentna veza putem mehanizma klik hemije kao što je opisano u literaturi.

[0224] U sledećem primeru, više od dva himerna polinukleotida i/ili IVT polinukleotida mogu biti povezani zajedno upotrebom funkcionalizovanog linker molekula. Na primer, funkcionalizovani molekul saharida može biti hemijski modifikovan tako da

4

sadrži više hemijskih reaktivnih grupa (SH-, NH2-, N3, itd.) da reaguje sa srodnom funkcionalnom grupom na 3'-funkcionalizovanom iRNK molekulu (tj. 3'-maleimid estar, 3'-NHS-estar, alkinil). Broj reaktivnih grupa na modifikovanom saharidu može se kontrolisati na stehiometrijski način kako bi se direktno kontrolisao stehiometrijski odnos konjugovanih himernih polinukleotida i/ili IVT polinukleotida.

[0225] U nekim aspektima, himerni polinukleotidi i/ili IVT polinukleotidi mogu biti povezani zajedno u obrascu. Obrazac može biti jednostavan alternirajući obrazac kao što je CD[CD]x gde svaki "C" i svaki "D" predstavljaju himerni polinukleotid, IVT polinukleotid, različite himerne polinukleotide ili različite IVT polinukleotide. Obrazac se može ponoviti x broj puta, gde je x= 1-300. Obrasci takođe mogu biti alternirajući višestruci kao što je CCDD[CCDD] x (alternirajući dvostruki višestruki) ili CCCDDD[CCCDDD] x (alternirajući trostruki višestruki) obrazac. Alternirajući dvostruki višestruki ili alternirajući trostruki višestruki mogu se ponoviti x broj puta, gde je x= 1-300.

Konjugati i kombinacije polinukleotida

[0226] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid može biti dizajniran tako da bude konjugovan sa drugim polinukleotidima, bojama, interkalacionim agensima (npr. akridini), umreživačima (npr. psoralen, mitomicin C), porfirinima (TPPC4, teksafirin, sapfirin), policikličnim aromatičnim ugljovodonicima (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačkim endonukleazama (npr. EDTA), agensima za alkilovanje, fosfatom, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkilom, supstituisanim alkilom, radioaktivno obeleženim markerima, enzimima, haptenima (npr. biotin), olakšivačima transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičkim ribonukleazama, proteinima, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand, ili antitela, npr. antitelo, koje se vezuje za specificirani tip ćelije kao što je ćelija kancera, endotelska ćelija, ili ćelija kosti, hormonima i hormonskim receptorima, nepeptidnim vrstama, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, ili lek.

[0227] Konjugacija može rezultovati povećanom stabilnošću i/ili poluživotom i može biti posebno korisna u usmeravanju polinukleotida na specifična mesta u ćeliji, tkivu ili organizmu.

Polinukleotidi koji imaju netranslatirane regione (UTR)

[0228] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid iz objave može dodatno sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više heterolognih polipeptida. U jednom aspektu, jedan ili više heterolognih polipeptida poboljšavaju farmakokinetička svojstva ili farmakodinamička svojstva OX40L polipeptida ili polinukleotida koji kodira polipeptid. U sledećem aspektu, jedan ili više heterolognih polipeptida sadrže polipeptid koji može produžiti poluživot OX40L polipeptida.

[0229] U jednom aspektu, iRNK kodira vanćelijski deo OX40L polipeptida i jedan ili više heterolognih polipeptida.

[0230] U sledećem aspektu, iRNK kodira vanćelijski region OX40L polipeptida i heterologni polipeptid. U sledećem aspektu, iRNK kodira fuzioni protein koji sadrži vanćelijski region OX40L polipeptida i polipeptid koji može produžiti poluživot OX40L polipeptida.

[0231] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid može dodatno sadržati jedan ili više regiona ili delova koji deluju ili funkcionišu kao netranslatirani region. Po definiciji, netranslatirani regioni (UTR) divljeg tipa nekog gena se transkribuju, ali ne translatiraju. U iRNK, 5'UTR počinje na mestu početka transkripcije i nastavlja se do start kodona, ali ne uključuje start kodon; dok 3'UTR počinje odmah nakon stop kodona i nastavlja se do signala za završetak transkripcije. Sve je više dokaza o regulatornim ulogama koje imaju UTR u smislu stabilnosti molekula nukleinske kiseline i translacije. Regulatorna svojstva UTR mogu biti inkorporisana u polinukleotide iz predmetne objave kako bi se, između ostalog, poboljšala stabilnost molekula. Specifična svojstva se takođe mogu inkorporisati kako bi se osigurala kontrolisana smanjena ekspresija transkripta u slučaju da su pogrešno usmereni na neželjena mesta organa. Tabele 3 i 4 obezbeđuju listu primera UTR koji se mogu koristiti u polinukleotidima iz predmetne objave.

5' UTR i inicijacija translacije

[0232] U određenim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid dodatno sadrži 5' UTR i/ili sekvencu inicijacije translacije. Prirodni 5'UTR imaju svojstva koja imaju uloge u inicijaciji translacije. Imaju potpise kao što su Kozak sekvence za koje je opšte poznato da su uključene u proces kojim ribozom inicira translaciju mnogih gena. Takođe je poznato da 5'UTR formira sekundarne strukture koje su uključene u vezivanje faktora elongacije.

[0233] Projektovanjem svojstava koja se tipično nalaze u obilno eksprimiranim genima specifičnih ciljnih organa, može se poboljšati stabilnost i proizvodnja proteina polinukleotida iz objave. Na primer, introdukcija 5' UTR iRNK za koje se zna da su povećano eksprimirane kod kancera, kao što je c-myc, može se upotrebljavati za poboljšanje ekspresije molekula nukleinske kiseline, kao što su polinukleotidi, u ćelijama kancera. Netranslatirani regioni korisni u dizajnu i proizvodnji polinukleotida uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su objavljeni u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2014/164253 A2.

[0234] U Tabeli 3 pokazan je listing 5'-netranslatiranih regiona iz objave. Varijante 5' UTR mogu se koristiti pri čemu se jedan ili više nukleotida dodaje ili uklanja sa terminusa, uključujući A, U, C ili G.

Tabela 3. 5'-Netranslatirani regioni

[0235] Druge ne-UTR sekvence takođe se mogu upotrebljavati kao regioni ili podregioni unutar polinukleotida. Na primer, introni ili delovi sekvenci introna mogu biti inkorporisani u regione polinukleotida. Inkorporisanje intronskih sekvenci može povećati proizvodnju proteina kao i nivoe polinukleotida.

[0236] Kombinacije svojstava mogu biti uključene u bočne regione i mogu biti sadržane unutar drugih svojstava. Na primer, ORF može biti omeđen sa 5' UTR koji može sadržati jak signal inicijacije translacije Kozak i/ili 3' UTR koji može uključivati oligo(dT) sekvencu za dodavanje poli-A repa po templatu. 5'UTR može sadržati prvi fragment polinukleotida i drugi fragment polinukleotida iz istog i/ili različitih gena kao što su 5'UTR opisani u S.A.D publikaciji patentne prijave br.20100293625.

[0237] Ovi UTR ili njihovi delovi mogu biti postavljeni u istoj orijentaciji kao u transkriptu iz kog su odabrani ili im se može izmeniti orijentacija ili lokacija. Dakle 5' ili 3' UTR može biti invertovan, skraćen, produžen, napravljen sa jednim ili više drugih 5' UTR ili 3' UTR.

[0238] U nekim aspektima, UTR sekvence se mogu promeniti na neki način u odnosu na referentnu sekvencu. Na primer, 3' ili 5' UTR se može izmeniti u odnosu na UTR divljeg tipa ili nativni UTR promenom orijentacije ili lokacije kao što je prethodno navedeno ili se može izmeniti inkluzijom dodatnih nukleotida, delecijom nukleotida, zamenom ili transpozicijom nukleotida. Bilo koja od ovih promena koje proizvode "izmenjeni" UTR (bilo da je 3' ili 5') sadrži varijantni UTR.

[0239] U nekim aspektima, može se upotrebljavati dvostruki, trostruki ili četvorostruki UTR, kao što je 5' ili 3' UTR. Kao što se ovde upotrebljava, "dvostruki" UTR je onaj u kome su dve kopije istog UTR kodirane bilo u seriji ili suštinski u seriji. Na primer, dvostruki beta-globin 3' UTR može se upotrebljavati kao što je opisano u S.A.D. patentnoj publikaciji 20100129877.

[0240] U nekim aspektima, bočni regioni mogu biti heterologni. U nekim aspektima, 5' netranslatirani region može biti poreklom iz različite vrste od 3' netranslatiranog regiona. Netranslatirani region takođe može uključivati elemente za poboljšanje translacije (TEE). Kao neograničavajući primer, TEE može uključivati one opisane u S.A.D. prijavi br.20090226470.

3' UTR i elementi bogati sa AU

[0241] U određenim primerima izvođenja, iRNK koja kodira OX40L polipeptid dodatno sadrži 3' UTR. 3'-UTR je deo iRNK koji neposredno prati kodon terminacije translacije i često sadrži regulatorne regione koji posttranskripciono utiču na ekspresiju gena. Regulatorni regioni unutar 3'-UTR mogu uticati na poliadenilaciju, efikasnost translacije, lokalizaciju, i stabilnost iRNK. U jednom primeru izvođenja, 3'-UTR koristan za objavu sadrži vezujuće mesto za mikroRNK. U nekim aspektima, 3'-UTR ima region prigušivača, koji se vezuje za proteine represore i inhibira ekspresiju iRNK. U drugim aspektima, 3'-UTR sadrži element bogat sa AU. Proteini vezuju ARE da bi uticali na stabilnost ili stopu raspada transkripata na lokalizovan način ili uticali na inicijaciju translacije. U drugim aspektima, 3'-UTR sadrži sekvencu AAUAAA koja usmerava dodavanje nekoliko stotina ostataka adenina zvanih poli(A) rep na kraj iRNK transkripta.

[0242] Tabela 4 pokazuje listing 3'-netranslatiranih regiona korisnih za iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Varijante 3' UTR mogu se koristiti pri čemu se jedan ili više nukleotida dodaje ili uklanja sa terminusa, uključujući A, U, C ili G.

Tabela 4A. Primeri 3'- netranslatiranih regiona

1

2

4

[0243] U određenim aspektima, 3' UTR sekvenca korisna za objavu sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% identičnu sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 45-62 i bilo koje njihove kombinacije. U posebnom primeru izvođenja, 3' UTR sekvenca dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto, npr. miR122 vezujuće mesto. U drugim aspektima, 3'UTR sekvenca korisna za objavu sadrži 3' UTR-018 (SEQ ID NO: 62).

[0244] U određenim primerima izvođenja, 3' UTR sekvenca sadrži jedno ili više miRNA vezujućih mesta, npr. miR-122 vezujuća mesta, ili bilo koje druge heterologne nukleotidne sekvence u njoj, bez narušavanja funkcije 3' UTR. Neki primeri 3' UTR sekvenci koje sadrže miRNA vezujuće mesto navedeni su u Tabeli 4B.

Tabela 4B. Primer 3' UTR sa miRNA vezujućim mestima

[0245] U određenim aspektima, 3' UTR sekvenca korisna za objavu sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% identičnu sekvenci iznetoj kao SEQ ID NO: 63 ili 64.

Regioni koji imaju 5' kapu

[0246] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid može dodatno sadržati 5' kapu.5' kapa korisna za iRNK koja kodira OX40L može da vezuje vezujući protein kape (CBP) iRNK, čime se povećava stabilnost iRNK. Kapa može dodatno pomoći u uklanjanju 5' proksimalnih introna tokom splajsovanja iRNK.

[0247] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave sadrži nehidrolizabilnu strukturu kape koja sprečava uklanjanje kape i stoga povećava poluživot iRNK. Pošto hidroliza strukture kape zahteva isecanje 5'-ppp-5' fosforodiestarskih veza, modifikovani nukleotidi se mogu upotrebljavati tokom reakcije dodavanja kape. Na primer, enzim za dodavanje kape virusa vakcinije iz New England Biolabs (Ipswich, MA) može se upotrebljavati sa αtio-guanozin nukleotidima u skladu sa uputstvima proizvođača kako bi se kreirala fosforotioatna veza u 5'-ppp-5' kapi. Mogu se upotrebljavati dodatni modifikovani guanozin nukleotidi kao što su α-metilfosfonat i seleno-fosfatni nukleotidi.

[0248] U određenim aspektima, 5' kapa sadrži 2'-O-metilaciju šećera riboze 5'-terminusnih i/ili 5'-anteterminusnih nukleotida na 2'-hidroksilnoj grupi u šećernom prstenu. U drugim aspektima, kape za OX40L kodirajuću iRNK uključuju analoge kape, koji se ovde takođe označavaju kao sintetički analozi kape, hemijske kape, hemijski analozi kape, ili strukturni ili funkcionalni analozi kape, koji se razlikuju od prirodnih (tj. endogenih, divljeg tipa ili fizioloških) 5'-kapa u svojoj hemijskoj strukturi, zadržavajući funkciju kape. Analozi kape mogu biti hemijski (tj. neenzimski) ili enzimski sintetisani i/ili povezani sa polinukleotidima iz objave.

[0249] Na primer, anti-reverzni analog kape (ARCA) kapa sadrži dva guanina povezana 5'-5'-trifosfatnom grupom, pri čemu jedan guanin sadrži N7 metil grupu kao i 3'-O-metil grupu (tj. N7,3'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin (m<7>G-3'mppp-G; koji se ekvivalentno može označiti 3' O-Mem7G(5')ppp(5')G). 3'-O atom drugog, nemodifikovanog, guanina postaje vezan za 5'-terminusni nukleotid polinukleotida sa kapom. N7- i 3'-O-metilisani guanin obezbeđuje terminusnu funkcionalnu grupu polinukleotida sa kapom.

[0250] Sledeći primer kape je mCAP, koji je sličan ARCA, ali ima 2'-O-metil grupu na guanozinu (tj. N7,2'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin, m<7>Gm-ppp-G).

[0251] U nekim aspektima, kapa je analog dinukleotidne kape. Kao neograničavajući primer, analog dinukleotidne kape može biti modifikovan na različitim fosfatnim pozicijama sa boranofosfatnom grupom ili foforoselenoatnom grupom kao što su analozi dinukleotidne kape opisani u S.A.D. patentu br. US 8,519,110.

[0252] U sledećem aspektu, kapa je analog kape je N7-(4-hlorofenoksietil) supstituisani dinukleotidni oblik analoga kape poznat u struci i/ili ovde opisan. Neograničavajući primeri N7-(4-hlorofenoksietil) supstituisanog dinukleotidnog oblika analoga kape uključuju N7-(4-hlorofenoksietil)-G(5')ppp(5')G i N7-(4-hlorofenoksietil)-m<3>'-<O>G(5')ppp(5')G analog kape (videti, npr. različite analoge kape i postupke sinteze analoga kape koji su opisani u Kore et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574). U sledećem aspektu, analog kape iz predmetne objave je 4-hloro/bromofenoksietil analog.

[0253] Dok analozi kape dozvoljavaju istovremeno dodavanje kape na polinukleotid ili njegov region, u in vitro reakciji transkripcije, do 20% transkripata može ostati bez dodate kape. Ovo, kao i strukturne razlike analoga kape u odnosu na endogene 5'kapa strukture nukleinskih kiselina koje proizvodi endogena, ćelijska transkripciona mašinerija, može dovesti do redukovane translacione kompetencije i redukovane ćelijske stabilnosti.

[0254] OX40L kodirajućoj iRNK iz objave takođe može biti dodata kapa nakon proizvodnje (bilo IVT ili hemijska sinteza), upotrebom enzima, kako bi se generisale autentičnije 5'-kapa strukture. Kao što se ovde upotrebljava, fraza "autentičniji" označava svojstvo koje blisko odražava ili oponaša, bilo strukturno ili funkcionalno, svojstvo endogenog ili divljeg tipa. To jest, "autentičnije" svojstvo je reprezentativnije za endogenu, divljeg tipa, prirodnu ili fiziološku ćelijsku funkciju i/ili strukturu u poređenju sa sintetičkim svojstvima ili analozima, itd. iz stanja tehnike, ili koja nadmašuje odgovarajuće endogeno, divljeg tipa, prirodno ili fiziološko svojstvo u jednom ili više pogleda. Neograničavajući primeri autentičnijih 5' kapa struktura iz predmetne objave su oni koji, između ostalog, imaju poboljšano vezivanje kapa vezujućih proteina, produženi poluživot, redukovanu podložnost na 5' endonukleaze i/ili redukovano uklanjanje 5' kape, u poređenju sa sintetičkim 5' kapa strukturama poznatim u struci (ili sa divljim tipom, prirodnom ili fiziološkom 5' kapa strukturom). Na primer, rekombinantni enzim za dodavanje kape virusa vakcinije i rekombinantni enzim 2'-O-metiltransferaza mogu da kreiraju kanonsku 5'-5'-trifosfatnu vezu između 5'-terminusnog nukleotida polinukleotida i nukleotida guanina kape pri čemu guanin kape sadrži N7 metilaciju i 5'-terminusni nukleotid iRNK sadrži 2'-O-metil. Takva struktura se naziva Cap1 (kapa1) struktura. Ova kapa rezultuje višom translacionom kompetentnošću i ćelijskom stabilnošću i redukovanom aktivacijom ćelijskih proinflamatornih citokina, u poređenju, npr. sa drugim 5’ kapa analognim strukturama poznatim u struci. Strukture kape uključuju, ali nisu ograničene na, 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (kapa 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (kapa 1), i 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (kapa 2).

[0255] U skladu sa predmetnom objavom, 5' terminusne kape mogu uključivati endogene kape ili analoge kape. U skladu sa predmetnom objavom, 5' terminusna kapa može sadržati analog guanina. Korisni analozi guanina uključuju, ali nisu ograničeni na, inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, i 2- azido-guanozin.

Poli-A repovi

[0256] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid dodatno sadrži poli A rep. U dodatnim aspektima, terminusne grupe na poli-A repu mogu biti inkorporisane za stabilizaciju. U drugim aspektima, poli-A rep sadrži des-3' hidroksilne repove. Korisni poli-A repovi mogu takođe uključivati strukturne funkcionalne grupe ili 2'-Ometil modifikacije kao što podučava Junjie Li, et al. (Current Biology, Vol. 15, 1501-1507, 23. avgust 2005).

[0257] U jednom aspektu, dužina poli-A repa, kada je prisutan, veća je od 30 nukleotida. U sledećem aspektu, poli-A rep je duži od 35 nukleotida (npr. najmanje ili više od oko 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, i 3.000 nukleotida). U nekim aspektima, polinukleotid ili njegov region uključuje od oko 30 do oko 3.000 nukleotida (npr. od 30 do 50, od 30 do 100, od 30 do 250, od 30 do 500, od 30 do 750, od 30 do 1.000, od 30 do 1.500, od 30 do 2.000, od 30 do 2.500, od 50 do 100, od 50 do 250, od 50 do 500, od 50 do 750, od 50 do 1.000, od 50 do 1.500, od 50 do 2.000, od 50 do 2.500, od 50 do 3.000, od 100 do 500, od 100 do 750, od 100 do 1.000, od 100 do 1.500, od 100 do 2.000, od 100 do 2.500, od 100 do 3.000, od 500 do 750, od 500 do 1.000, od 500 do 1.500, od 500 do 2.000, od 500 do 2.500, od 500 do 3.000, od 1.000 do 1.500, od 1.000 do 2.000, od 1.000 do 2.500, od 1.000 do 3.000, od 1.500 do 2.000, od 1.500 do 2.500, od 1.500 do 3.000, od 2.000 do 3.000, od 2.000 do 2.500, i od 2.500 do 3.000).

[0258] U nekim aspektima, poli-A rep je dizajniran u odnosu na dužinu ukupnog polinukleotida ili dužinu određenog regiona polinukleotida. Ovaj dizajn se može zasnivati na dužini kodirajućeg regiona, dužini određenog svojstva ili regiona ili zasnivati na dužini krajnjeg proizvoda koji se eksprimira iz polinukleotida.

[0259] U ovom kontekstu, poli-A rep može biti 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% duži od polinukleotida ili njegovog svojstva. Poli-A rep takođe može biti dizajniran kao frakcija polinukleotida kojima pripada. U ovom kontekstu, poli-A rep može biti 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ili 90% ili više od ukupne dužine konstrukta, regiona konstrukta ili ukupne dužine konstrukta minus poli-A rep. Dodatno, projektovana vezujuća mesta i konjugacija polinukleotida za poli-A vezujući protein mogu poboljšati ekspresiju.

[0260] Pored toga, više različitih polinukleotida može biti povezano zajedno putem PABP (Poli-A vezujući protein) preko 3'-kraja upotrebom modifikovanih nukleotida na 3'-terminusu poli-A repa. Eksperimenti transfekcije mogu se sprovesti u relevantnim ćelijskim linijama i proizvodnja proteina može se testirati pomoću ELISA na 12 h, 24 h, 48 h, 72 h i dan 7 nakon transfekcije.

[0261] U nekim aspektima, polinukleotidi iz predmetne objave dizajnirani su da uključuju region poliA-G kvarteta. G-kvartet je ciklični vodonično vezani niz od četiri nukleotida guanina koji se mogu formirati od strane sekvenci bogatih sa G i u DNK i u RNK. U ovom aspektu, G-kvartet je inkorporisan na kraju poli-A repa. Rezultujući polinukleotid testira se na stabilnost, proizvodnju proteina i druge parametre uključujući poluživot u različitim vremenskim tačkama. Otkriveno je da poliA-G kvartet rezultuje proizvodnjom proteina iz iRNK ekvivalentnom najmanje 75% one koja je uočena upotrebom samo poli-A repa od 120 nukleotida.

Region start kodona

[0262] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave dodatno sadrži regione koji su analogni ili funkcionišu kao region start kodona.

[0263] U nekim aspektima, translacija polinukleotida se inicira na kodonu koji nije start kodon AUG. Translacija polinukleotida može se inicirati na alternativnom start kodonu kao što je, ali ne ograničavajući se na, ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG (videti Touriol et al. Biology of the Cell 95 (2003) 169-178 i Matsuda i Mauro PLoS ONE, 20105:11). Kao neograničavajući primer, translacija polinukleotida počinje na alternativnom start kodonu ACG. Kao sledeći neograničavajući primer, translacija polinukleotida počinje na alternativnom start kodonu CTG ili CUG. Kao još jedan neograničavajući primer, translacija polinukleotida počinje na alternativnom start kodonu GTG ili GUG.

[0264] Poznato je da nukleotidi koji omeđavaju kodon koji inicira translaciju, kao što je, ali ne ograničavajući se na, start kodon ili alternativni start kodon, utiču na efikasnost translacije, dužinu i/ili strukturu polinukleotida. (Videti, npr. Matsuda i Mauro PLoS ONE, 2010 5:11). Maskiranje bilo kog od nukleotida koji omeđavaju kodon koji inicira translaciju može se upotrebljavati za promenu pozicije inicijacije translacije, efikasnosti translacije, dužine i/ili strukture polinukleotida.

[0265] U nekim aspektima, agens za maskiranje upotrebljava se u blizini start kodona ili alternativnog start kodona kako bi se maskirao ili sakrio kodon da bi se

1

redukovala verovatnoća inicijacije translacije na maskiranom start kodonu ili alternativnom start kodonu. Neograničavajući primeri agenasa za maskiranje uključuju polinukleotide antisens zaključane nukleinske kiseline (LNA) i egzon-spojne komplekse (EJC) (videti, npr. Matsuda i Mauro koji opisuju agense za maskiranje LNA polinukleotide i EJC (PLoS ONE, 20105:11)).

[0266] U sledećem aspektu, agens za maskiranje upotrebljava se za maskiranje start kodona polinukleotida kako bi se povećala verovatnoća da će se translacija inicirati na alternativnom start kodonu. U nekim aspektima, agens za maskiranje upotrebljava se za maskiranje prvog start kodona ili alternativnog start kodona kako bi se povećala šansa da će se translacija inicirati na start kodonu ili alternativnom start kodonu nizvodno do maskiranog start kodona ili alternativnog start kodona.

[0267] U nekim aspektima, start kodon ili alternativni start kodon lociran je unutar savršenog komplementa za miR vezujuće mesto. Savršeni komplement miR vezujućeg mesta može pomoći u kontroli translacije, dužini i/ili strukturi polinukleotida slično agensu za maskiranje. Kao neograničavajući primer, start kodon ili alternativni start kodon lociran je u sredini savršenog komplementa za miR-122 vezujuće mesto. Start kodon ili alternativni start kodon može biti lociran posle prvog nukleotida, drugog nukleotida, trećeg nukleotida, četvrtog nukleotida, petog nukleotida, šestog nukleotida, sedmog nukleotida, osmog nukleotida, devetog nukleotida, desetog nukleotida, jedanaestog nukleotida, dvanaestog nukleotida, trinaestog nukleotida, četrnaestog nukleotida, petnaestog nukleotida, šesnaestog nukleotida, sedamnaestog nukleotida, osamnaestog nukleotida, devetnaestog nukleotida, dvadesetog nukleotida ili dvadeset prvog nukleotida.

[0268] U sledećim aspektima, start kodon polinukleotida uklanja se iz polinukleotidne sekvence kako bi translacija polinukleotida počela na kodonu koji nije start kodon. Translacija polinukleotida može da počne na kodonu koji sledi posle uklonjenog start kodona ili na nizvodnom start kodonu ili alternativnom start kodonu. U neograničavajućem primeru, start kodon ATG ili AUG uklanja se kao prva 3 nukleotida polinukleotidne sekvence kako bi se translacija inicirala na nizvodnom start kodonu ili alternativnom start kodonu. Polinukleotidna sekvenca gde je uklonjen start kodon može dodatno sadržati najmanje jedan agens za maskiranje za nizvodni start kodon i/ili alternativne start kodone kako bi se kontrolisala ili kako bi se pokušalo da se kontroliše inicijacija translacije, dužina polinukleotida i/ili struktura polinukleotida.

2

Region stop kodona

[0269] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave može dodatno sadržati najmanje jedan stop kodon ili najmanje dva stop kodona pre 3' netranslatiranog regiona (UTR). Stop kodon se može odabrati od UGA, UAA, i UAG. U nekim aspektima, polinukleotidi iz predmetne objave uključuju stop kodon UGA i jedan dopunski stop kodon. U dodatnom aspektu, dopunski stop kodon može biti UAA. U sledećem aspektu, polinukleotidi iz predmetne objave uključuju tri stop kodona, četiri stop kodona, ili više.

Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid

[0270] U određenim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave sadrži (i) iRNK koja kodira OX40L polipeptid, kao što su sekvence obezbeđene u prethodnoj Tabeli 1, (ii) miR-122 vezujuće mesto, kao što su sekvence obezbeđene u prethodnoj Tabeli 2, (iii) 5' UTR, kao što su sekvence obezbeđene u prethodnoj Tabeli 3, i (iv) 3' UTR, kao što su sekvence obezbeđene u prethodnim Tabelama 4A ili 4B. U posebnom primeru izvođenja, polinukleotid iz predmetne objave sadrži sekvencu iznetu u Tabeli 5A u nastavku (SEQ ID NO: 65).

Tabela 5A. Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid i miR-122 vezujuće mesto

[0271] Dopunski polinukleotidi koji sadrže iRNK, miR-122 vezujuće mesto, 5' UTR, i 3' UTR pokazani su u nastavku u Tabeli 5B.

Tabela 5B. Dopunski polinukleotidi koji sadrže iRNK i miR-122 vezujuće mesto

4

[0272] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid iz objave sadrži najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% sekvence koja je identična polinukleotidnoj sekvenci koja je izneta kao SEQ ID NO: 65 u Tabeli 5A, pri čemu je protein kodiran polinukleotidom sposoban da se vezuje za OX40 receptor divljeg tipa.

[0273] U određenim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave sadrži (i) 5' kapu koja je prethodno obezbeđena, (ii) 5' UTR, kao što su sekvence koje su obezbeđene u prethodnoj Tabeli 3, (iii) otvoreni okvir čitanja koji kodira OX40L polipeptid, kao što su sekvence koje su obezbeđene u prethodnoj Tabeli 1, (iv) stop kodon, (v) 3' UTR, kao što su sekvence koje su obezbeđene u prethodnim Tabelama 4A ili 4B, i (vi) poli-A rep koji je prethodno obezbeđen.

IV. Postupci pravljenja polinukleotida

[0274] Predmetna objava takođe razmatra postupke za pravljenje polinukleotida koji se ovde objavljuje ili njegovog komplementa. U nekim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji se ovde objavljuje, i koji kodira OX40L polipeptid, može se konstruisati upotrebom in vitro transkripcije. U drugim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji se ovde objavljuje, i koji kodira OX40L polipeptid, može se konstruisati hemijskom sintezom upotrebom sintesajzera oligonukleotida. U drugim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji se ovde objavljuje, i koji kodira OX40L polipeptid pravi se upotrebom ćelije domaćina. U određenim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji se ovde objavljuje, i koji kodira OX40L polipeptid pravi se pomoću jedne ili više kombinacija IVT, hemijske sinteze, ekspresije ćelije domaćina, ili bilo kojih drugih postupaka poznatih u struci.

[0275] Nukleozidi koji se javljaju u prirodi, nukleozidi koji se ne javljaju u prirodi, ili njihove kombinacije, mogu potpuno ili delimično prirodno zameniti prisutne nukleozide koji se javljaju u kandidat nukleotidnoj sekvenci i mogu biti inkorporisani u za sekvencu optimizovanu nukleotidnu sekvencu (npr. iRNK) koja kodira OX40L polipeptid. Rezultujuće iRNK se zatim mogu ispitati na njihovu sposobnost da proizvode protein i/ili proizvode terapijski ishod.

In vitro transkripcija-enzimska sinteza

[0276] Polinukleotid koji se ovde objavljuje može se transkribovati upotrebom in vitro transkripcionog (IVT) sistema. Sistem tipično sadrži transkripcioni pufer, nukleotid trifosfate (NTP), inhibitor RNaze i polimerazu. NTP se mogu odabrati od, ali nisu ograničeni na, one koji su ovde opisani, uključujući prirodne i neprirodne (modifikovane) NTP. Polimeraza se može odabrati od, ali nije ograničena na, T7 RNK polimerazu, T3 RNK polimerazu i mutantne polimeraze kao što su, ali nisu ograničene na, polimeraze koje su sposobne da inkorporišu modifikovane nukleinske kiseline. Videti S.A.D. publ. br. US20130259923.

[0277] IVT sistem tipično sadrži transkripcioni pufer, nukleotid trifosfate (NTP), inhibitor RNaze i polimerazu. NTP se mogu odabrati od, ali nisu ograničeni na, one koji su ovde opisani, uključujući prirodne i neprirodne (modifikovane) NTP. Polimeraza se može odabrati od, ali nije ograničena na, T7 RNK polimerazu, T3 RNK polimerazu i mutantne polimeraze kao što su, ali nisu ograničene na, polimeraze koje su sposobne da inkorporišu polinukleotide koji se ovde objavljuju.

[0278] Bilo koji broj RNK polimeraza ili varijanti može se upotrebljavati u sintezi polinukleotida iz predmetne objave.

[0279] RNK polimeraze se mogu modifikovati insertovanjem ili delecijom aminokiselina sekvence RNK polimeraze. Kao neograničavajući primer, RNK polimeraza je modifikovana da pokaže povećanu sposobnost inkorporacije 2'-modifikovanog nukleotid trifosfata u poređenju sa nemodifikovanom RNK polimerazom (videti Međunarodnu publikaciju WO2008078180 i S.A.D. patent 8,101,385).

[0280] Varijante se mogu dobiti evoluiranjem RNK polimeraze, optimizacijom aminokiselinske sekvence RNK polimeraze i/ili sekvence nukleinske kiseline i/ili upotrebom drugih postupaka poznatih u struci. Kao neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze evoluirane su upotrebom sistema kontinuirane usmerene evolucije koji su postavili Esvelt et al. (Nature (2011) 472(7344):499-503) gde klonovi T7 RNK polimeraze mogu da kodiraju najmanje jednu mutaciju kao što je, ali ne ograničavajući se na, lizin na poziciji 93 supstituisan treoninom (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N ili L864F. Kao sledeći neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze mogu kodirati najmanje mutaciju kao što je opisano u S.A.D. publikacijama br. 20100120024 i 20070117112. Varijante RNK polimeraze takođe mogu uključivati, ali nisu ograničene na, supstitucione varijante, konzervativnu amino-kiselinsku supstituciju, insercione varijante, delecione varijante i/ili kovalentne derivate.

[0281] U jednom aspektu, polinukleotid može biti dizajniran tako da ga prepoznaju RNK polimeraze divljeg tipa ili varijantne RNK polimeraze. Pri tome, polinukleotid se može modifikovati tako da sadrži mesta ili regione promena sekvence u odnosu na polinukleotid divljeg tipa ili roditeljski himerni polinukleotid.

[0282] Reakcije sinteze polinukleotida ili nukleinske kiseline mogu se izvesti enzimskim postupcima korišćenja polimeraza. Polimeraze katalizuju kreiranje fosfodiestarskih veza između nukleotida u polinukleotidu ili lancu nukleinske kiseline. Trenutno poznate DNK polimeraze mogu se podeliti u različite porodice na osnovu poređenja amino-kiselinskih sekvenci i analize kristalne strukture. Porodica DNK polimeraza I (pol I) ili A polimeraza, uključujući Klenov (Klenow) fragmente E. coli, Bacillus DNK polimerazu I, Thermus aquaticus (Taq) DNK polimeraze, i T7 RNK i DNK polimeraze, je među najbolje proučenim od ovih porodica. Sledeća velika porodica je porodica DNK polimeraza α (pol α) ili B polimeraza, uključujući sve eukariotske replicirajuće DNK polimeraze i polimeraze iz faga T4 i RB69. Iako koriste sličan katalitički mehanizam, ove porodice polimeraza razlikuju se po specifičnosti supstrata, efikasnosti inkorporisanja analoga supstrata, stepenu i stopi ekstenzije prajmera, načinu DNK sinteze, aktivnosti egzonukleaze, i osetljivosti prema inhibitorima.

[0283] DNK polimeraze se takođe biraju na osnovu optimalnih uslova reakcije koje zahtevaju, kao što su reakciona temperatura, pH, i koncentracije templata i prajmera. Ponekad se koristi kombinacija više od jedne DNK polimeraze kako bi se postigla željena veličina DNK fragmenta i efikasnost sinteze. Na primer, Cheng et al. povećavaju pH, dodaju glicerol i dimetil sulfoksid, smanjuju vremena denaturacije, povećavaju ekstenziona vremena, i koriste sekundarnu termostabilnu DNK polimerazu koja poseduje aktivnost egzonukleaze od 3' do 5' da efikasno amplifikuju dugačke ciljeve iz kloniranih inserata i humane genomske DNK (Cheng et al., PNAS, Vol. 91, 5695-5699 (1994)). RNK polimeraze iz bakteriofaga T3, T7, i SP6 široko se upotrebljavaju za pripremu RNK za biohemijske i biofizičke studije. RNK polimeraze, enzimi za dodavanje kape, i poli-A polimeraze objavljene su u Međunarodnoj publikaciji br. WO2014028429 koja je na čekanju.

[0284] U jednom aspektu, RNK polimeraza koja se može upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji se ovde opisuju je Syn5 RNK polimeraza (videti Zhu et al. Nucleic

1

Acids Research 2013). Syn5 RNK polimeraza je nedavno okarakterisana iz morskih cijanofaga Syn5 od strane Zhu et al. gde su takođe identifikovali promotor sekvencu (videti Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013). Zhu et al. su pronašli da Syn5 RNK polimeraza katalizuje sintezu RNK u širem opsegu temperatura i saliniteta u poređenju sa T7 RNK polimerazom. Pored toga, pronađeno je da je zahtev za inicijacijskim nukleotidom na promotoru manje strog za Syn5 RNK polimerazu u poređenju sa T7 RNK polimerazom, što čini Syn5 RNK polimerazu obećavajućom za sintezu RNK.

[0285] U jednom aspektu, Syn5 RNK polimeraza može se upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji se ovde opisuju. Kao neograničavajući primer, Syn5 RNK polimeraza može se upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji zahteva precizne 3'-terminuse.

[0286] U jednom aspektu, Syn5 promotor može se upotrebljavati u sintezi polinukleotida. Kao neograničavajući primer, Syn5 promotor može biti 5'-ATTGGGCACCCGTAAGGG-3' kao što su opisali Zhu et al. (Nucleic Acids Research 2013).

[0287] U jednom aspektu, Syn5 RNK polimeraza može se upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji sadrže najmanje jednu hemijsku modifikaciju koja je ovde opisana i/ili je poznata u struci (videti, npr. inkorporaciju pseudo-UTP i 5Me-CTP opisanu u Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013).

[0288] U jednom aspektu, polinukleotidi koji se ovde opisuju mogu da se sintetišu upotrebom Syn5 RNK polimeraze koja je prečišćena upotrebom modifikovane i poboljšane procedure prečišćavanja koju su opisali Zhu et al. (Nucleic Acids Research 2013).

[0289] Različiti alati u genetičkom projektovanju zasnovani su na enzimskoj amplifikaciji ciljnog gena koji deluje kao templat. Za proučavanje sekvenci pojedinačnih gena ili specifičnih regiona od interesa i druge potrebe istraživanja, neophodno je generisati više kopija ciljnog gena iz malog uzorka polinukleotida ili nukleinskih kiselina. Takvi postupci se mogu primeniti u proizvodnji polinukleotida iz objave.

[0290] Lančana reakcija polimeraze (PCR) ima široke primene u brzoj amplifikaciji ciljnog gena, kao i mapiranju i sekvenciranju genoma. Ključne komponente za sintezu DNK sadrže ciljne molekule DNK kao templat, prajmere komplementarne sa krajevima ciljnih DNK lanaca, dezoksinukleozid trifosfate (dNTP) kao gradivne

1 1

blokove, i DNK polimerazu. Kako PCR napreduje kroz korake denaturacije, vezivanja i ekstenzije, novoproizvedeni molekuli DNK mogu delovati kao templat za sledeći ciklus replikacije, postižući eksponencijalno amplifikaciju ciljne DNK. PCR zahteva ciklus zagrevanja i hlađenja za denaturaciju i vezivanje. Varijacije osnovne PCR uključuju asimetričnu PCR [Innis et al., PNAS, vol. 85, 9436-9440 (1988)], inverznu PCR [Ochman et al., Genetics, vol. 120(3), 621-623, (1988)], PCR nakon reverzne transkripcije (RT-PCR) (Freeman et al., BioTechniques, vol. 26(1), 112-22, 124-5 (1999)). U RT-PCR, jednolančana RNK je željeni cilj i prvo se konvertuje u dvolančanu DNK pomoću reverzne transkriptaze.

[0291] Razvijene su različite izotermne in vitro tehnike amplifikacije nukleinske kiseline kao alternative ili komplementi PCR. Na primer, amplifikacija pomerenih lanaca (SDA) zasniva se na sposobnosti restrikcionog enzima da formira prekid (Walker et al., PNAS, vol. 89, 392-396 (1992)). Sekvenca koju prepoznaje restrikcioni enzim insertovana je u vezanu sekvencu prajmera. Prajmeri su produženi pomoću DNK polimeraze i dNTP kako bi se formirao dupleks. Samo jedan lanac dupleksa se iseca restrikcionim enzimom. Svaki pojedinačni lanac je tada dostupan kao templat za naknadnu sintezu. SDA ne zahteva komplikovan ciklus kontrole temperature PCR.

[0292] Amplifikacija zasnovana na sekvenci nukleinske kiseline (NASBA), takođe nazvana amplifikacija posredovana transkripcijom (TMA), takođe je postupak izotermne amplifikacije koji koristi kombinaciju DNK polimeraze, reverzne transkriptaze, RNAze H, i T7 RNK polimeraze [Compton, Nature, vol. 350, 91-92 (1991)]. Ciljna RNK se upotrebljava kao templat i reverzna transkriptaza sintetiše svoj komplementarni lanac DNK. RNAza H hidrolizuje RNK templat, praveći prostor za DNK polimerazu da sintetiše lanac DNK komplementaran prvom lancu DNK koji je komplementaran RNK cilju, formirajući DNK dupleks. T7 RNK polimeraza kontinuirano generiše komplementarne RNK lance ovog DNK dupleksa. Ovi RNK lanci deluju kao templati za nove cikluse sinteze DNK, rezultujući amplifikacijom ciljnog gena.

[0293] Roling-srkl (Rolling-circle) amplifikacija (RCA) amplifikuje jednolančani cirkularni polinukleotid i uključuje brojne runde izotermne enzimske sinteze gde Φ29 DNK polimeraza produžava prajmer kontinuirano napredujući oko polinukleotidnog kruga da bi replicirala njegovu sekvencu iznova i iznova. Prema tome, postiže se linearna kopija cirkularnog templata. Prajmer se zatim može vezati za ovu linearnu kopiju i može se sintetisati njegov komplementarni lanac [videti Lizardi et al., Nature

1 2

Genetics, vol. 19, 225-232 (1998)]. Jednolančana cirkularna DNK takođe može poslužiti kao templat za sintezu RNK u prisustvu RNK polimeraze (Daubendiek et al., JACS, vol. 117, 7818-7819 (1995)). Inverzna brza amplifikacija krajeva cDNA (RACE) RCA opisana je od strane Polidoros et al. Informaciona RNK (iRNK) se reverzno transkribuje u cDNA, nakon čega sledi tretman RNAzom H kako bi se odvojila cDNA. cDNA se zatim cirkularizuje pomoću CircLigase u cirkularnu DNK. Amplifikacija rezultujuće cirkularne DNK postiže se sa RCA (Polidoros et al., BioTechniques, vol. 41, 35-42 (2006)).

[0294] Bilo koji od prethodno navedenih postupaka može se koristiti u proizvodnji jednog ili više regiona polinukleotida iz predmetnog pronalaska.

[0295] Asembliranje polinukleotida ili nukleinskih kiselina pomoću ligaze takođe se široko upotrebljava. DNK ili RNK ligaze promovišu intermolekulsku ligaciju 5' i 3' krajeva polinukleotidnih lanaca preko formiranja fosfodiestarske veze. Lančana reakcija ligaze (LCR) je obećavajuća dijagnostička tehnika zasnovana na principu da se dve susedne polinukleotidne probe hibridizuju sa jednim lancem ciljnog gena i kupluju jedna sa drugom pomoću ligaze. Ukoliko ciljni gen nije prisutan, ili ukoliko postoji nepodudarnost na ciljnom genu, kao što je polimorfizam jednog nukleotida (SNP), probe ne mogu da ligiraju (Wiedmann et al., PCR Methods and Application, vol.3 (4), s51-s64 (1994)). LCR se može kombinovati sa različitim tehnikama amplifikacije kako bi se povećala osetljivost detekcije ili povećala količina proizvoda ukoliko se upotrebljava u sintezi polinukleotida i nukleinskih kiselina.

[0296] Nekoliko kompleta za pripremu biblioteke za nukleinske kiseline sada je komercijalno dostupno. Oni uključuju enzime i pufere za konvertovanje male količine uzoraka nukleinske kiseline u indeksiranu biblioteku za nizvodne aplikacije. Na primer, DNK fragmenti se mogu staviti u NEBNEXT<®>ULTRATM DNA Library Prep Kit od strane NEWENGLAND BIOLABS<®>za krajnju pripremu, ligaciju, odabir po veličini, čišćenje, PCR amplifikaciju i finalno čišćenje.

[0297] Kontinuirani razvoj se nastavlja za poboljšanje tehnika amplifikacije. Na primer, S.A.D. pat. 8,367,328 od Asada et al., podučava o korišćenju pojačivača reakcije za povećanje efikasnosti reakcija sinteze DNK pomoću DNK polimeraza. Pojačivač reakcije sadrži kiselu supstancu ili katjonske komplekse kisele supstance. S.A.D. pat. 7,384,739 od Kitabayashi et al., podučava o supstanci koja snabdeva karboksilatnim jonima koja promoviše enzimsku sintezu DNK, pri čemu je supstanca koja snabdeva karboksilatnim jonima odabrana od oksalne kiseline, malonske

1

kiseline, estara oksalne kiseline, estara malonske kiseline, soli malonske kiseline, i estara maleinske kiseline. S.A.D. pat. 7,378,262 od Sobek et al., objavljuje kompoziciju enzima za povećanje vernosti DNK amplifikacija. Kompozicija sadrži jedan enzim sa aktivnošću 3' egzonukleaze, ali bez aktivnosti polimeraze i drugi enzim koji je polimeraza. Oba enzima su termostabilna i reverzibilno su modifikovana tako da budu neaktivni na nižim temperaturama.

[0298] S.A.D. pat. br. 7,550,264 od Getts et al. podučava da se višestruke runde sinteze molekula sens RNK izvode prikačinjanjem repova oligodezoksinukleotida na 3' kraj cDNA molekula i inicijacijom RNK transkripcije upotrebom RNK polimeraze. S.A.D. pat. publikacija br. 2013/0183718 od Rohayem podučava o sintezi RNK pomoću RNK-zavisnih RNK polimeraza (RdRp) pokazujući aktivnost RNK polimeraze na jednolančanim DNK templatima. Oligonukleotidi sa nestandardnim nukleotidima mogu se sintetisati enzimskom polimerizacijom dovođenjem u kontakt templata koji sadrži nestandardne nukleotide sa mešavinom nukleotida koji su komplementarni nukleotidima templata kao što je objavljeno u S.A.D. pat. br.6,617,106 od Benner.

Hemijska sinteza

[0299] Standardni postupci mogu se primeniti da se sintetiše izolovana polinukleotidna sekvenca koja kodira OX40L polipeptid. Na primer, može se sintetisati pojedinačni DNK ili RNK oligomer koji sadrži kodon-optimizovanu nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni izolovani polipeptid. U drugim aspektima, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu se sintetisati i zatim ligirati. U nekim aspektima, pojedinačni oligonukleotidi tipično sadrže 5' ili 3' viseće krajeve za komplementarno asembliranje.

[0300] Polinukleotid koji se ovde objavljuje (npr. iRNK) može biti hemijski sintetisan upotrebom postupaka hemijske sinteze i potencijalnih supstitucija nukleobaza poznatih u struci. Videti, na primer, Međunarodne publikacije br. WO2014093924, WO2013052523; WO2013039857, WO2012135805, WO2013151671; S.A.D. publ. br. US20130115272; ili S.A.D. patente br. US8999380, US8710200.

1 4

Prečišćavanje

[0301] Prečišćavanje polinukleotida (npr. iRNK) koji kodiraju OX40L polipeptid koji se ovde opisuju može uključivati, ali nije ograničeno na, čišćenje polinukleotida, osiguranje kvaliteta i kontrolu kvaliteta. Čišćenje se može izvesti postupcima poznatim u struci kao što su, ali ne ograničavajući se na, AGENCOURT<®>perle (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), poli-T perle, LNA™ oligo-T probe za hvatanje (EXIQON<®>Inc, Vedbaek, Danska) ili postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC kao što su, ali ne ograničavajući se na, jaku anjonskoizmenjivačku HPLC, slabu anjonskoizmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC). Termin "prečišćen" kada se upotrebljava u odnosu na polinukleotid kao što je "prečišćeni polinukleotid" označava onaj koji je odvojen od najmanje jednog kontaminanta. Kao što se ovde upotrebljava, "kontaminant" je bilo koja supstanca koja drugu čini neprikladnom, nečistom ili inferiornom. Stoga, prečišćeni polinukleotid (npr. DNK i RNK) prisutan je u obliku ili postavci različitoj od one u kojoj se nalazi u prirodi, ili u obliku ili postavci različitoj od one koja je postojala pre podvrgavanja postupku tretmana ili prečišćavanja.

[0302] U nekim aspektima, prečišćavanje polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid iz objave uklanja nečistoće koje mogu da redukuju ili uklone neželjeni imunski odgovor, npr. redukovanje aktivnosti citokina.

[0303] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid iz objave prečišćava se pre primene upotrebom hromatografije na koloni (npr. jaka anjonskoizmenjivačka HPLC, slaba anjonskoizmenjivačka HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), ili (LCMS)). U nekim aspektima, polinukleotid, koji kodira OX40L polipeptid koji se ovde objavljuje prečišćen hromatografijom na koloni (npr. jaka anjonskoizmenjivačka HPLC, slaba anjonskoizmenjivačka HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), ili (LCMS)) povećava ekspresiju OX40L u poređenju sa polinukleotidima koji kodiraju OX40L polipeptid prečišćen drugačijim postupkom prečišćavanja. U nekim aspektima, polinukleotid prečišćen hromatografijom na koloni (npr. jaka anjonskoizmenjivačka HPLC, slaba anjonskoizmenjivačka HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), ili (LCMS)) kodira sisarski OX40L polipeptid. U nekim aspektima, prečišćeni polinukleotid kodira mišji OX40L polipeptid. U nekim aspektima, prečišćeni polinukleotid kodira humani OX40L polipeptid. U nekim primerima izvođenja, prečišćeni polinukleotid kodira polipeptid koji sadrži amino-

1

kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, prečišćeni polinukleotid kodira polipeptid koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 2.

[0304] U nekim aspektima, prečišćeni polinukleotid je najmanje oko 80% čist, najmanje oko 85% čist, najmanje oko 90% čist, najmanje oko 95% čist, najmanje oko 96% čist, najmanje oko 97% čist, najmanje oko 98% čist, najmanje oko 99% čist, ili oko 100% čist.

[0305] Osiguranje kvaliteta i/ili kontrola kvaliteta može se sprovesti upotrebom postupaka kao što su, ali ne ograničavajući se na, gel elektroforezu, UV apsorbancu, ili analitičku HPLC.

[0306] U sledećem aspektu, polinukleotidi se mogu sekvencirati postupcima koji uključuju, ali nisu ograničeni na PCR nakon reverzne transkriptaze.

V. Modifikacije

[0307] Kao što se ovde upotrebljava u polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, termini "hemijska modifikacija" ili, prema potrebi, "hemijski modifikovan" označavaju modifikaciju u odnosu na adenozin (A), guanozin (G), uridin (U), timidin (T) ili citidin (C) ribo- ili dezoksiribonukleozide u jednom ili više od njihove pozicije, obrasca, procenta ili populacije. Generalno, ovde, ovi termini nisu namenjeni da označavaju modifikacije ribonukleotida u 5'-terminusnim funkcionalnim gupama kape iRNK koje se javljaju u prirodi.

[0308] U polipeptidu, termin "modifikacija" označava modifikaciju u poređenju sa kanonskim skupom od 20 amino-kiselina.

[0309] Modifikacije mogu biti različite posebne modifikacije. U nekim aspektima, regioni mogu da sadrže jednu, dve, ili više (opciono različitih) modifikacija nukleozida ili nukleotida (nukleobaza). U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, introdukovan u ćeliju, može pokazati redukovanu degradaciju u ćeliji, u poređenju sa nemodifikovanim polinukleotidom. U drugim aspektima, modifikacija je u nukleobazi i/ili strukturi šećera. U još drugim aspektima, modifikacija je u strukturi okosnice.

1

Hemijske modifikacije:

[0310] Neki primeri izvođenja predmetne objave obezbeđuju polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu iRNK uključuje najmanje jednu hemijsku modifikaciju. U nekim aspektima, hemijska modifikacija je odabrana od pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitozina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiodihidropseuduridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-2-tiopseudouridina, 4-metoksi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tiopseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina,), 5-metoksiuridina, i 2'-O-metil uridina.

[0311] "Nukleozid" kao što se ovde upotrebljava označava jedinjenje koje sadrži molekul šećera (npr. pentozu ili ribozu) ili njegov derivat u kombinaciji sa organskom bazom (npr. purinom ili pirimidinom) ili njenim derivatom (takođe se ovde označava kao "nukleobaza"). "Nukleotid" kao što se ovde upotrebljava označava nukleozid, uključujući fosfatnu grupu. Modifikovani nukleotidi mogu da se sintetišu bilo kojim korisnim postupkom, kao što je, na primer, hemijski, enzimski, ili rekombinantno, kako bi se uključio jedan ili više modifikovanih ili neprirodnih nukleozida. Polinukleotidi mogu sadržati region ili regione povezanih nukleozida. Takvi regioni mogu imati promenljive veze okosnice. Veze mogu biti standardne fosfodioestarske veze, u kom slučaju bi polinukleotidi sadržali regione nukleotida.

[0312] Modifikovano sparivanje baza nukleotida obuhvata ne samo standardne adenozin-timin, adenozin-uracil, ili guanozin-citozin bazne parove, već i bazne parove formirane između nukleotida i/ili modifikovanih nukleotida koji sadrže nestandardne ili modifikovane baze, pri čemu aranžman donora vodonične veze i akceptora vodonične veze omogućava vodoničnu vezu između nestandardne baze i standardne baze ili između dve komplementarne nestandardne bazne strukture. Jedan primer takvog nestandardnog sparivanja baza je sparivanje baza između modifikovanog nukleotida inozina i adenina, citozina ili uracila. Bilo koja kombinacija baze/šećera ili linkera može biti inkorporisana u polinukleotide iz predmetne objave.

[0313] Stručnjak sa iskustvom razumeće da će, osim tamo gde je drugačije naznačeno, polinukleotidne sekvence navedene u ovoj objavi navoditi "T" u reprezentativnoj DNK sekvenci, ali tamo gde sekvenca predstavlja RNK, "T" će biti zamenjeni sa "U".

[0314] Modifikacije polinukleotida (npr. RNK polinukleotida, kao što su iRNK polinukleotidi) koje su korisne u polinukleotidima iz predmetne objave uključuju, ali

1

nisu ograničeni na sledeće: 2-metiltio-N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin; 2-metiltio-N6-metiladenozin; 2-metiltio-N6-treonil karbamoiladenozin; N6-glicinilkarbamoiladenozin; N6-izopenteniladenozin; N6-metiladenozin; N6-treonilkarbamoiladenozin; 1,2'-O-dimetiladenozin; 1-metiladenozin; 2'-O-metiladenozin; 2'-O-riboziladenozin (fosfat); 2-metiladenozin; 2-metiltio-N6 izopenteniladenozin; 2-metiltio-N6-hidroksinorvalil karbamoiladenozin; 2'-O-metiladenozin; 2'-O-riboziladenozin (fosfat); izopenteniladenozin; N6-(cishidroksiizopentenil)adenozin; N6,2'-O-dimetiladenozin; N6,2'-O-dimetiladenozin; N6,N6,2'-O-trimetiladenozin; N6,N6-dimetiladenozin; N6-acetiladenozin; N6-hidroksinorvalilkarbamoiladenozin; N6-metil-N6-treonilkarbamoiladenozin; 2-metiladenozin; 2-metiltio-N6-izopenteniladenozin; 7-deaza-adenozin; N1-metiladenozin; N6, N6 (dimetil)adenin; N6-cis-hidroksi-izopentenil-adenozin; α-tioadenozin; 2 (amino)adenin; 2 (aminopropil)adenin; 2 (metiltio) N6 (izopentenil)adenin; 2-(alkil)adenin; 2-(aminoalkil)adenin; 2-(aminopropil)adenin; 2-(halo)adenin; 2-(halo)adenin; 2-(propil)adenin; 2'-amino-2'-dezoksi-ATP; 2'-azido-2'-dezoksi-ATP; 2'-dezoksi-2'-a-aminoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidoadenozin TP; 6 (alkil)adenin; 6 (metil)adenin; 6-(alkil)adenin; 6-(metil)adenin; 7 (deaza)adenin; 8 (alkenil)adenin; 8 (alkinil)adenin; 8 (amino)adenin; 8 (tioalkil)adenin; 8-(alkenil)adenin; 8-(alkil)adenin; 8-(alkinil)adenin; 8-(amino)adenin; 8-(halo)adenin; 8-(hidroksil)adenin; 8-(tioalkil)adenin; 8-(tiol)adenin; 8-azido-adenozin; aza adenin; deaza adenin; N6 (metil)adenin; N6-(izopentil)adenin; 7-deaza-8-aza-adenozin; 7-metiladenin; 1-deazaadenozin TP; 2'fluoro-N6-Bz-dezoksiadenozin TP; 2'-OMe-2-amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-dezoksiadenozin TP; 2'-a-etiniladenozin TP; 2-aminoadenin; 2-aminoadenozin TP; 2-amino-ATP; 2'-a-trifluorometiladenozin TP; 2-azidoadenozin TP; 2'-b-etiniladenozin TP; 2-bromoadenozin TP; 2'-btrifluorometiladenozin TP; 2-hloroadenozin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluoroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksiadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-bbromoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hloroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluoroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiadenozin TP; 2-fluoroadenozin TP; 2-jodoadenozin TP; 2-merkaptoadenozin TP; 2-metoksi-adenin; 2-metiltio-adenin; 2-trifluorometiladenozin TP; 3-deaza-3-bromoadenozin TP; 3-deaza-3-hloroadenozin TP; 3-deaza-3-fluoroadenozin TP; 3-deaza-3-jodoadenozin TP; 3-deazaadenozin TP; 4'-

1

azidoadenozin TP; 4'-karbociklični adenozin TP; 4'-etiniladenozin TP; 5'-homoadenozin TP; 8-aza-ATP; 8-bromo-adenozin TP; 8-trifluorometiladenozin TP; 9-deazaadenozin TP; 2-aminopurin; 7-deaza-2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-2-aminopurin; 2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-adenin, 7-deaza-2-aminopurin; 2-tiocitidin; 3-metilcitidin; 5-formilcitidin; 5-hidroksimetilcitidin; 5-metilcitidin; N4-acetilcitidin; 2'-O-metilcitidin; 2'-O-metilcitidin; 5,2'-O-dimetilcitidin; 5-formil-2'-O-metilcitidin; lizidin; N4,2'-O-dimetilcitidin; N4-acetil-2'-O-metilcitidin; N4-metilcitidin; N4,N4-dimetil-2'-OMe-citidin TP; 4-metilcitidin; 5-aza-citidin; pseudo-izocitidin; pirolo-citidin; α-tio-citidin; 2-(tio)citozin; 2'-amino-2'-dezoksi-CTP; 2'-azido-2'-dezoksi-CTP; 2'-dezoksi-2'-a-aminocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidocitidin TP; 3 (deaza) 5 (aza)citozin; 3 (metil)citozin; 3-(alkil)citozin; 3-(deaza) 5 (aza)citozin; 3-(metil)citidin; 4,2'-O-dimetilcitidin; 5 (halo)citozin; 5 (metil)citozin; 5 (propinil)citozin; 5 (trifluorometil)citozin; 5-(alkil)citozin; 5-(alkinil)citozin; 5-(halo)citozin; 5-(propinil)citozin; 5-(trifluorometil)citozin; 5-bromo-citidin; 5-jodo-citidin; 5-propinil citozin; 6-(azo)citozin; 6-aza-citidin; aza citozin; deaza citozin; N4 (acetil)citozin; 1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin; 1-metil-pseudoizocitidin; 2-metoksi-5-metil-citidin; 2-metoksi-citidin; 2-tio-5-metil-citidin; 4-metoksi-1-metil-pseudoizocitidin; 4-metoksipseudoizocitidin; 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin; 4-tio-1-metilpseudoizocitidin; 4-tio-pseudoizocitidin; 5-aza-zebularin; 5-metil-zebularin; pirolopseudoizocitidin; zebularin; (E)-5-(2-bromo-vinil)citidin TP; 2,2'-anhidro-citidin TP hidrohlorid; 2'fluor-N4-Bz-citidin TP; 2'fluoro-N4-acetil-citidin TP; 2'-O-metil-N4-acetilcitidin TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidin TP; 2'-a-etinilcitidin TP; 2'-a-trifluorometilcitidin TP; 2'-b-etinilcitidin TP; 2'-b-trifluorometilcitidin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksicitidin TP; 2'-dezoksi-2'-baminocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hlorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksicitidin TP; 2'-O-metil-5-(1-propinil)citidin TP; 3'-etinilcitidin TP; 4'-azidocitidin TP; 4'-karbociklični citidin TP; 4'-etinilcitidin TP; 5-(1-propinil)ara-citidin TP; 5-(2-hloro-fenil)-2-tiocitidin TP; 5-(4-amino-fenil)-2-tiocitidin TP; 5aminoalil-CTP; 5-cijanocitidin TP; 5-etinilaracitidin TP; 5-etinilcitidin TP; 5'-homo-citidin TP; 5-metoksicitidin TP; 5-trifluorometilcitidin TP; N4-amino-citidin TP; N4-benzoil-citidin TP; pseudoizocitidin; 7-metilguanozin; N2,2'-O-dimetilguanozin; N2-metilguanozin; viozin; 1,2'-O-dimetilguanozin; 1-metilguanozin; 2'-O-metilguanozin; 2'-O-ribozilguanozin (fosfat);

1

2'-O-metilguanozin; 2'-O-ribozilguanozin (fosfat); 7-aminometil-7-deazaguanozin; 7-cijano-7-deazaguanozin; arhaeozin; metilviozin; N2,7-dimetilguanozin; N2,N2,2'-O-trimetilguanozin; N2,N2,7-trimetilguanozin; N2,N2-dimetilguanozin; N2,7,2'-O-trimetilguanozin; 6-tio-guanozin; 7-deaza-guanozin; 8-okso-guanozin; N1-metilguanozin; α-tio-guanozin; 2 (propil)guanin; 2-(alkil)guanin; 2'-amino-2'-dezoksi-GTP; 2'-azido-2'-dezoksi-GTP; 2'-dezoksi-2'-a-aminoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-aazidoguanozin TP; 6 (metil)guanin; 6-(alkil)guanin; 6-(metil)guanin; 6-metil-guanozin; 7 (alkil)guanin; 7 (deaza)guanin; 7 (metil)guanin; 7-(alkil)guanin; 7-(deaza)guanin; 7-(metil)guanin; 8 (alkil)guanin; 8 (alkinil)guanin; 8 (halo)guanin; 8 (tioalkil)guanin; 8-(alkenil)guanin; 8-(alkil)guanin; 8-(alkinil)guanin; 8-(amino)guanin; 8-(halo)guanin; 8-(hidroksil)guanin; 8-(tioalkil)guanin; 8-(tiol)guanin; aza guanin; deaza guanin; N (metil)guanin; N-(metil)guanin; 1-metil-6-tio-guanozin; 6-metoksi-guanozin; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanozin; 6-tio-7-deaza-guanozin; 6-tio-7-metil-guanozin; 7-deaza-8-aza-guanozin; 7-metil-8-okso-guanozin; N2,N2-dimetil-6-tio-guanozin; N2-metil-6-tioguanozin; 1-Me-GTP; 2'fluoro-N2-izobutil-guanozin TP; 2'O-metil-N2-izobutilguanozin TP; 2'-a-etinilguanozin TP; 2'-a-trifluorometilguanozin TP; 2'-betinilguanozin TP; 2'-b-trifluorometilguanozin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluoroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksiguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-bbromoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hloroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluoroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiguanozin TP; 4'-azidoguanozin TP; 4'-karbociklični guanozin TP; 4'-etinilguanozin TP; 5'-homo-guanozin TP; 8-bromo-guanozin TP; 9-deazaguanozin TP; N2-izobutil-guanozin TP; 1-metilinozin; inozin; 1,2'-O-dimetilinozin; 2'-O-metilinozin; 7-metilinozin; 2'-O-metilinozin; epoksikueuozin; galaktozil-kueuozin; manozilkueuozin; kueuozin; aliamino-timidin; aza timidin; deaza timidin; dezoksi-timidin; 2'-O-metiluridin; 2-tiouridin; 3-metiluridin; 5-karboksimetiluridin; 5-hidroksiuridin; 5-metiluridin; 5-taurinometil-2-tiouridin; 5-taurinometiluridin; dihidrouridin; pseudouridin; (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin; 1-metil-3-(3-amino-5-karboksipropil)pseudouridin; 1-metilpseduouridin; 1-metilpseudouridin; 2'-O-metiluridin; 2'-O-metilpseudouridin; 2'-O-metiluridin; 2-tio-2'-O-metiluridin; 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin; 3,2'-O-dimetiluridin; 3-metil-pseudouridin TP; 4-tiouridin; 5-(karboksihidroksimetil)uridin; 5-(karboksihidroksimetil)uridin metil estar; 5,2'-O-dimetiluridin; 5,6-dihidro-uridin; 5-aminometil-2-tiouridin; 5-

11

karbamoilmetil-2'-O-metiluridin; 5-karbamoilmetiluridin; 5-karboksihidroksimetiluridin; 5-karboksihidroksimetiluridin metil estar; 5-karboksimetilaminometil-2'-O-metiluridin; 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin; 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin; 5-karboksimetilaminometiluridin; 5-karboksimetilaminometiluridin; 5-karbamoilmetiluridin TP; 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metiluridin; 5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin; 5-metoksikarbonilmetiluridin; 5-metiluridin,), 5-metoksiuridin; 5-metil-2-tiouridin; 5-metilaminometil-2-selenouridin; 5-metilaminometil-2-tiouridin; 5-metilaminometiluridin; 5-metildihidrouridin; 5-oksisirćetna kiselina-uridin TP; 5-oksisirćetna kiselina-metil estar-uridin TP; N1-metilpseudo-uridin; uridin 5-oksisirćetna kiselina; uridin 5-oksisirćetna kiselina metil estar; 3-(3-amino-3-karboksipropil)-uridin TP; 5-(izo-pentenilaminometil)- 2-tiouridin TP; 5-(izo-pentenilaminometil)-2'-O-metiluridin TP; 5-(izo-pentenilaminometil)uridin TP; 5-propinil uracil; α-tio-uridin; 1 (aminoalkilamino-karboniletilenil)-2(tio)-pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-pseudouracil; 1 supstituisani 2(tio)-pseudouracil; 1 supstituisani 2,4-(ditio)pseudouracil; 1 supstituisani 4 (tio)pseudouracil; 1 supstituisani pseudouracil; 1-(aminoalkilaminokarboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracil; 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil) pseudouridin TP; 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudo-UTP; 1-metil-pseudo-UTP; 2 (tio)pseudouracil; 2' dezoksi uridin; 2' fluorouridin; 2-(tio)uracil; 2,4-(ditio)psuedouracil; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-guanozin; 2'-amino-2'-dezoksi-UTP; 2'-azido-2'-dezoksi-UTP; 2'-azido-dezoksiuridin TP; 2'-O-metilpseudouridin; 2' dezoksi uridin; 2' fluorouridin; 2'-dezoksi-2'-a-aminouridin TP; 2'-dezoksi-2'-aazidouridin TP; 2-metilpseudouridin; 3 (3 amino-3 karboksipropil)uracil; 4 (tio)pseudouracil; 4-(tio)pseudouracil; 4-(tio)uracil; 4-tiouracil; 5 (1,3-diazol-1-alkil)uracil; 5 (2-aminopropil)uracil; 5 (aminoalkil)uracil; 5 (dimetilaminoalkil)uracil; 5 (guanidinijumalkil)uracil; 5 (metoksikarbonilmetil)-2-(tio)uracil; 5 (metoksikarbonilmetil)uracil; 5 (metil) 2 (tio)uracil; 5 (metil) 2,4 (ditio)uracil; 5 (metil) 4 (tio)uracil; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracil; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio)uracil; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracil; 5 (propinil)uracil; 5 (trifluorometil)uracil; 5-(2-aminopropil)uracil; 5-(alkil)-2-(tio)pseudouracil; 5-(alkil)-2,4 (ditio)pseudouracil; 5(alkil)-4 (tio)pseudouracil; 5-(alkil)pseudouracil; 5-(alkil)uracil; 5-(alkinil)uracil; 5-(alilamino)uracil; 5-(cijanoalkil)uracil; 5-(dialkilaminoalkil)uracil; 5-(dimetilaminoalkil)uracil; 5-(guanidinijumalkil)uracil; 5-(halo)uracil; 5-(1,3-diazol-1-alkil)uracil; 5-(metoksi)uracil; 5-(metoksikarbonilmetil)-2-(tio)uracil; 5-(metoksikarbonil-metil)uracil; 5-(metil) 2(tio)uracil; 5-(metil) 2,4 (ditio)uracil; 5-(metil) 4 (tio)uracil; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracil; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracil; 5-(metil)-4 (tio)pseudouracil; 5-(metil)pseudouracil; 5-(metilaminometil)-2 (tio)uracil; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracil; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracil; 5-(propinil)uracil; 5-(trifluorometil)uracil; 5-aminoalil-uridin; 5-bromo-uridin; 5-jodo-uridin; 5-uracil; 6 (azo)uracil; 6-(azo)uracil; 6-aza-uridin; aliamino-uracil; aza uracil; deaza uracil; N3 (metil)uracil; P seudo-UTP-1-2-etanska kiselina; pseudouracil; 4-tio-pseudo-UTP; 1-karboksimetil-pseudouridin; 1-metil-1-deaza-pseudouridin; 1-propinil-uridin; 1-taurinometil-1-metil-uridin; 1-taurinometil-4-tio-uridin; 1-taurinometil-pseudouridin; 2-metoksi-4-tio-pseudouridin; 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin; 2-tio-1-metilpseudouridin; 2-tio-5-aza-uridin; 2-tio-dihidropseudouridin; 2-tio-dihidrouridin; 2-tiopseudouridin; 4-metoksi-2-tio-pseudouridin; 4-metoksi-pseudouridin; 4-tio-1-metilpseudouridin; 4-tio-pseudouridin; 5-aza-uridin; dihidropseudouridin; (±)1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (2R)-1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (2S)-1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (E)-5-(2-bromo-vinil)ara-uridin TP; (E)-5-(2-bromovinil)uridin TP; (Z)-5-(2-bromo-vinil)ara-uridin TP; (Z)-5-(2-bromo-vinil)uridin TP; 1-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)pseudouridin TP; 1-(2,2-dietoksietil)pseudouridin TP; 1-(2,4,6-trimetilbenzil)pseudouridin TP; 1-(2,4,6-trimetil-benzil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-trimetil-fenil)pseudo-UTP; 1-(2-amino-2-karboksietil)pseudo-UTP; 1-(2-amino-etil)pseudo-UTP; 1-(2-hidroksietil)pseudouridin TP; 1-(2-metoksietil)pseudouridin TP; 1-(3,4-bis-trifluorometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(3,4-dimetoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(3-amino-3-karboksipropil)pseudo-UTP; 1-(3-amino-propil)pseudo-UTP; 1-(3-ciklopropil-prop-2-inil)pseudouridin TP; 1-(4-amino-4-karboksibutil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-benzil)pseudo-UTP; 1-(4-aminobutil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-azidobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-bromobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-hlorobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-fluorobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-jodobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metansulfonilbenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metoksi-benzil)pseudo-UTP; 1-(4-metoksi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-metilbenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metil-benzil)pseudo-UTP; 1-(4nitrobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-nitro-benzil)pseudo-UTP; 1(4-nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-tiometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-trifluorometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-trifluorometilbenzil)pseudouridin TP; 1-(5-amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-amino-heksil)pseudo-UTP; 1,6-dimetil-pseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]-etoksi}-etoksi)-propionil]pseudouridin TP; 1-{3-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]-propionil}pseudouridin TP; 1-acetilpseudouridin TP; 1-alkil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-alkil-6-(2-propinil)-pseudo-UTP; 1-alkil-6-alil-pseudo-UTP; 1-alkil-6-etinilpseudo-UTP; 1-alkil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1-alkil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-alilpseudouridin TP; 1-aminometil-pseudo-UTP; 1-benzoilpseudouridin TP; 1-benziloksimetilpseudouridin TP; 1-benzil-pseudo-UTP; 1-biotinil-PEG2-pseudouridin TP; 1-biotinilpseudouridin TP; 1-butil-pseudo-UTP; 1-cijanometilpseudouridin TP; 1-ciklobutilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklobutil-pseudo-UTP; 1-cikloheptilmetil-pseudo-UTP; 1-cikloheptil-pseudo-UTP; 1-cikloheksilmetil-pseudo-UTP; 1-cikloheksil-pseudo-UTP; 1-ciklooktilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklooktil-pseudo-UTP; 1-ciklopentilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklopentil-pseudo-UTP; 1-ciklopropilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklopropil-pseudo-UTP; 1-etil-pseudo-UTP; 1-heksil-pseudo-UTP; 1-homoalilpseudouridin TP; 1-hidroksimetilpseudouridin TP; 1-izo-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tio-pseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-metansulfonilmetilpseudouridin TP; 1-metoksimetilpseudouridin TP; 1-metil-6-(2,2,2-trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(supstituisani fenil)pseudo-UTP; 1-metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-metil-6-azidopseudo-UTP; 1-metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hloro-pseudo-UTP; 1-metil-6-cijano-pseudo-UTP; 1-metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-etoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-etil-karboksilat-pseudo-UTP; 1-metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1-metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroksiamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-jodo-pseudo-UTP; 1-metil-6-izo-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-metoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1-metil-6-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-terc-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-trifluorometoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-morfolinometilpseudouridin TP; 1-pentil-pseudo-UTP; 1-fenil-pseudo-UTP; 1-pivaloilpseudouridin TP; 1-propargilpseudouridin TP; 1-propilpseudo-UTP; 1-propinil-pseudouridin; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-terc-butil-pseudo-UTP; 1-tiometoksimetilpseudouridin TP; 1-tiomorfolinometilpseudouridin TP; 1-trifluoroacetilpseudouridin TP; 1-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-vinilpseudouridin TP;

11

2,2'-anhidro-uridin TP; 2'-bromo-dezoksiuridin TP; 2'-F-5-metil-2'-dezoksi-UTP; 2'-OMe-5-Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-etiniluridin TP; 2'-a-trifluorometiluridin TP; 2'-b-etiniluridin TP; 2'-b-trifluorometiluridin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksiuridin TP; 2'-dezoksi-2'-baminouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hlorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiuridin TP; 2-metoksi-4-tio-uridin; 2-metoksiuridin; 2'-O-metil-5-(1-propinil)uridin TP; 3-alkil-pseudo-UTP; 4'-azidouridin TP; 4'-karbociklični uridin TP; 4'-etiniluridin TP; 5-(1-propinil)ara-uridin TP; 5-(2-furanil)uridin TP; 5-cijanouridin TP; 5-dimetilaminouridin TP; 5'-homo-uridin TP; 5-jodo-2'-fluoro-dezoksiuridin TP; 5-feniletiniluridin TP; 5-trideuterometil-6-deuterouridin TP; 5-trifluorometiluridin TP; 5-vinilarauridin TP; 6-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(supstituisani-fenil)-pseudo-UTP; 6-amino-pseudo-UTP; 6-azido-pseudo-UTP; 6-bromo-pseudo-UTP; 6-butil-pseudo-UTP; 6-hloro-pseudo-UTP; 6-cijano-pseudo-UTP; 6-dimetilamino-pseudo-UTP; 6-etoksi-pseudo-UTP; 6-etilkarboksilat-pseudo-UTP; 6-etil-pseudo-UTP; 6-fluoro-pseudo-UTP; 6-formil-pseudo-UTP; 6-hidroksiamino-pseudo-UTP; 6-hidroksi-pseudo-UTP; 6-jodo-pseudo-UTP; 6-izopropil-pseudo-UTP; 6-metoksi-pseudo-UTP; 6-metilamino-pseudo-UTP; 6-metilpseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-propil-pseudo-UTP; 6-tercbutil-pseudo-UTP; 6-trifluorometoksi-pseudo-UTP; 6-trifluorometil-pseudo-UTP; alfatio-pseudo-UTP; pseudouridin 1-(4-metilbenzensulfonska kiselina) TP; pseudouridin 1-(4-metilbenzoeva kiselina) TP; pseudouridin TP 1-[3-(2-etoksi)]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoksi)-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-etoksi)-etoksil-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-etoksi)-etoksi}] propanska kiselina; pseudouridin TP 1-metilfosfonska kiselina; pseudouridin TP 1-metilfosfonska kiselina dietil estar; pseudo-UTP-N1-3-propanska kiselina; pseudo-UTP-N1-4-butanska kiselina; pseudo-UTP-N1-5-pentanska kiselina; pseudo-UTP-N1-6-heksanska kiselina; pseudo-UTP-N1-7-heptanska kiselina; pseudo-UTP-N1-metil-p-benzoeva kiselina; pseudo-UTP-N1-p-benzoeva kiselina; vibutozin; hidroksivibutozin; izoviozin; peroksivibutozin; nemodifikovani hidroksivibutozin; 4-demetilviozin; 2,6-(diamino)purin;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il: 1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il;1,3-(diaza)-2-(okso)fenoksazin-1-il;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioksa)-naftalen;2 (amino)purin;2,4,5-(trimetil)fenil;2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-citidin;2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluroadenin; 2'metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-uridin; 2'-amino-2'-dezoksiriboza; 2-amino-6-hloro-purin; 2-aza-inozinil; 2'-azido-2'-dezoksiriboza; 2'fluoro-2'-dezoksiriboza; 2'-fluoro-modifikovane baze; 2'-O-metil-riboza; 2-okso-7-aminopiridopirimidin-3-il; 2-okso-piridopirimidin-3-il; 2-piridinon; 3 nitropirol; 3-(metil)-7-(propinil)izokarbostirilil; 3-(metil)izokarbostirilil; 4-(fluoro)-6-(metil)benzimidazol; 4-(metil)benzimidazol; 4-(metil)indolil; 4,6-(dimetil)indolil; 5 nitroindol; 5 supstituisani pirimidini; 5-(metil)izokarbostirilil; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidin; 6-(azo)timin; 6-(metil)-7-(aza)indolil; 6-hloro-purin; 6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(aza)indolil; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin--il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(propinil)izokarbostirilil; 7-(propinil)izokarbostirilil, propinil-7-(aza)indolil; 7-deaza-inozinil; 7-supstituisani 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-supstituisani 1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 9-(metil)-imidizopiridinil; aminoindolil; antracenil; bis-orto-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; bis-orto-supstituisani-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; difluorotolil; hipoksantin; imidizopiridinil; inozinil; izokarbostirilil; izoguanizin; N2-supstituisani purini; N6-metil-2-aminopurin; N6-supstituisani purini; N-alkilovani derivat; naptalenil; nitrobenzimidazolil; nitroimidazolil; nitroindazolil; nitropirazolil; nubularin; 06-supstituisani purini; O-alkilovani derivat; orto-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolopirimidin-2-on-3-il; orto-supstituisani-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; oksoformicin TP; para-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; para-supstituisani-6-fenilpirolo-pirimidin-2-on-3-il; pentacenil; fenantracenil; fenil; propinil-7-(aza)indolil; pirenil; piridopirimidin-3-il; piridopirimidin-3-il, 2-okso-7-amino-piridopirimidin-3-il; pirolopirimidin-2-on-3-il; pirolopirimidinil; pirolopirizinil; stilbenzil; supstituisani 1,2,4-triazoli; tetracenil; tubercidin; ksantin; ksantozin-5'-TP; 2-tio-zebularin; 5-aza-2-tio-zebularin; 7-deaza-2-amino-purin; piridin-4-on ribonukleozid; 2-amino-ribozid-TP; formicin A TP;

11

formicin B TP; pirolozin TP; 2'-OH-ara-adenozin TP; 2'-OH-ara-citidin TP; 2'-OH-arauridin TP; 2'-OH-ara-guanozin TP; 5-(2-karbometoksivinil)uridin TP; i N6-(19-aminopentaoksanonadecil)adenozin TP.

[0315] U nekim primerima izvođenja, iRNK koja kodira OX40L polipeptid uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza.

[0316] U nekim aspektima, modifikovane nukleobaze u polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid odabrane su iz grupe koja se sastoji od pseudouridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ), 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitozina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseuduridina, 2-tio-1-metil-pseuduridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseuduridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseuduridina, 4-metoksi-2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseuduridina, 5-metiluridina,), 5-metoksiuridina i 2'-O-metil uridina. U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza.

[0317] U nekim aspektima, modifikovane nukleobaze u polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid odabrane su iz grupe koja se sastoji od 1-metilpseudouridina (m1ψ), 5-metoksi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (ψ), α-tio-guanozina i α-tio-adenozina. U nekim aspektima, polinukleotid uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr.2, 3, 4 ili više) od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza.

[0318] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži pseudouridin (ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim primerima izvođenja, iRNK sadrži 1-metil-pseudouridin (m1ψ). U nekim primerima izvođenja, iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži 1-metil-pseudouridin (m1ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži 2-tiouridin (s2U). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži 2-tiouridin i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži metoksi-uridin (mo5U). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži 5-metoksi-uridin (mo5U) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2'-O-metil uridin. U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira

11

OX40L polipeptid sadrži 2'-O-metil uridin i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži N6-metil-adenozin (m6A). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrži N6-metil-adenozin (m6A) i 5-metil-citidin (m5C).

[0319] U nekim primerima izvođenja, iRNK koja kodira OX40L polipeptid je uniformno modifikovana (npr. potpuno modifikovana, modifikovana duž cele sekvence) sa određenom modifikacijom. Na primer, polinukleotid može biti uniformno modifikovan sa 5-metil-citidinom (m5C), što znači da su svi ostaci citozina u iRNK sekvenci zamenjeni sa 5-metil-citidinom (m5C). Slično, polinukleotid može biti uniformno modifikovan za bilo koji tip nukleozidnog ostatka koji je prisutan u sekvenci zamenom sa modifikovanim ostatkom kao što je bilo koji od onih koji su prethodno izneti.

[0320] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani citozin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani citozin uključuju N4-acetil-citidin (ac4C), 5-metil-citidin (m5C), 5-halo-citidin (npr. 5-jodo-citidin), 5-hidroksimetil-citidin (hm5C), 1-metil-pseudoizocitidin, 2-tio-citidin (s2C), 2-tio-5-metilcitidin.

[0321] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani uridin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani uridin uključuju 5-cijano uridin ili 4'-tio uridin.

[0322] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani adenin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani adenin uključuju 7-deaza-adenin, 1-metil-adenozin (m1A), 2-metil-adenin (m2A), N6-metil-adenozin (m6A), i 2,6-diaminopurin.

[0323] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani guanin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani guanin uključuju inozin (I), 1-metilinozin (m1I), viozin (imG), metilviozin (mimG), 7-deaza-guanozin, 7-cijano-7-deaza-guanozin (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanozin (preQ1), 7-metilguanozin (m7G), 1-metil-guanozin (m1G), 8-okso-guanozin, ili 7-metil-8-oksoguanozin.

[0324] Druge modifikacije koje mogu biti korisne u polinukleotidima koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave navedene su u Tabeli 6.

11

Tabela 6. Dopunski tipovi modifikacija

11

12

[0325] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave mogu uključivati bilo koji korisni linker između nukleozida. Takvi linkeri, uključujući modifikacije okosnice, dati su u Tabeli 7.

Tabela 7. Modifikacije linkera

[0326] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave može uključivati bilo koju korisnu modifikaciju, kao što je šećer, nukleobaza, ili internukleozidna veza (npr. na vezujućem fosfatu/na fosfodiestarskoj vezi/na fosfodiestru okosnice). Jedan ili više atoma pirimidinske nukleobaze mogu biti zamenjeni ili supstituisani sa opciono supstituisanim amino, opciono supstituisanim tiolom, opciono supstituisanim alkilom (npr. metil ili etil), ili halo (npr. hloro ili fluoro). U određenim aspektima, modifikacije (npr. jedna ili više modifikacija) prisutne su u svakom od šećera i internukleozidnoj vezi. Modifikacije u skladu sa predmetnom objavom mogu biti modifikacije ribonukleinskih kiselina (RNK) u dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), treozo nukleinske kiseline (TNA), glikol nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA), zaključane nukleinske kiseline (LNA), heksitol nukleinske kiseline (HNA), ili njihove hibride. Dopunske modifikacije su ovde opisane. Modifikovane nukleinske kiseline i njihova sinteza objavljene su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052523 koja je na čekanju.

[0327] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave suštinski ne indukuje urođeni imunski odgovor ćelije u koju se iRNK introdukuje. Svojstva indukovanog urođenog imunskog odgovora uključuju 1) povećanu ekspresiju proinflamatornih citokina, 2) aktivaciju unutarćelijskih PRR (RIG-I, MDA5, itd. i/ili 3) zaustavljanje ili redukovanje translacije proteina.

[0328] Bilo koji od regiona polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave može biti hemijski modifikovan kao što se ovde podučava ili kao što se podučava u Međunarodnoj prijavnoj publikaciji broj WO2013/052523 A1.

[0329] U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira OX40L polipeptid. U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira humani OX40L polipeptid. U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira polipeptid koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave sadrži sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 65.

[0330] U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira najmanje jedan OX40L mutant, fragment, ili njegovu varijantu, npr. OX40L funkcionalni fragment koji sadrži vanćelijski domen OX40L ili fragment vanćelijskog domena OX40L, citoplazmatski domen OX40L ili fragment citoplazmatskog domena OX40L, i/ili transmembranski domen OX40L ili fragment transmembranskog domena OX40L.

12

[0331] U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave odabrana je od sekvenci nukleinske kiseline OX40L koje su navedene u Tabeli 1 (npr. odabrana od SEQ ID NO: 4-21).

[0332] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave takođe može uključivati gradivne blokove, npr. modifikovane ribonukleozide, i modifikovane ribonukleotide, polinukleotidnih molekula. Na primer, ovi gradivni blokovi mogu biti korisni za pripremanje polinukleotida iz objave. O takvim gradivnim blokovima podučava se u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052523 i Međunarodnoj prijavnoj publikaciji br. WO 2014/093924 A1.

Modifikacije na šećeru

[0333] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi (npr. molekuli gradivni blokovi), koji se mogu inkorporisati u polinukleotid (npr. RNK ili iRNK, kao što je ovde opisano) koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave, mogu se modifikovati na šećeru ribonukleinske kiseline. Na primer, 2' hidroksilna grupa (OH) može se modifikovati ili zameniti većim brojem različitih supstituenata. Primeri supstitucija na 2'-poziciji uključuju, ali nisu ograničeni na, H, halo, opciono supstituisani C1-6 alkil; opciono supstituisani C1-6 alkoksi; opciono supstituisani C6-10 ariloksi; opciono supstituisani C3-8 cikloalkil; opciono supstituisani C3-8 cikloalkoksi; opciono supstituisani C6-10 ariloksi; opciono supstituisani C6-10 aril-C1-6 alkoksi, opciono supstituisani C1-12 (heterociklil)oksi; šećer (npr. riboza, pentoza, ili bilo koji koji je ovde opisan); polietilenglikol (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, gde je R H ili opciono supstituisani alkil, i n je ceo broj od 0 do 20 (npr. od 0 do 4, od 0 do 8, od 0 do 10, od 0 do 16, od 1 do 4, od 1 do 8, od 1 do 10, od 1 do 16, od 1 do 20, od 2 do 4, od 2 do 8, od 2 do 10, od 2 do 16, od 2 do 20, od 4 do 8, od 4 do 10, od 4 do 16, i od 4 do 20); "zaključane" nukleinske kiseline (LNA) u kojima je 2'-hidroksil privezan pomoću C1-6 alkilenskog ili C1-6 heteroalkilenskog mosta za 4'-ugljenik istog šećera riboze, gde su primeri mostova uključivali metilen, propilen, etar, ili amino mostove; aminoalkil, kao što je ovde definisano; aminoalkoksi, kao što je ovde definisano; amino kao što je ovde definisano; i amino-kiselinu, kao što je ovde definisano.

[0334] Generalno, RNK uključuje šećernu grupu riboze, koja je 5-člani prsten koji ima kiseonik. Kao primer, neograničavajući modifikovani nukleotidi uključuju zamenu kiseonika u ribozi (npr. sa S, Se, ili alkilenom, kao što je metilen ili etilen); dodavanje dvostruke veze (npr. kako bi se riboza zamenila ciklopentenilom ili cikloheksenilom); kontrakciju prstena riboze (npr. kako bi se formirao 4-člani prsten od ciklobutana ili oksetana); proširenje prstena riboze (npr. kako bi se formirao 6- ili 7-člani prsten koji ima dodatni ugljenik ili heteroatom, kao što je za anhidroheksitol, altritol, manitol, cikloheksanil, cikloheksenil, i morfolino koji takođe ima fosforamidatnu okosnicu); multiciklične oblike (npr. triciklo; i "otključane" oblike, kao što je glikol nukleinska kiselina (GNA) (npr. R-GNA ili S-GNA, gde je riboza zamenjena jedinicama glikola prikačenim za fosfodiestarske veze), treozo nukleinska kiselina (TNA, gde je riboza zamenjena sa α-L-treofuranozil-(3'-→2')), i peptidna nukleinska kiselina (PNA, gde 2-amino-etil-glicin veze zamenjuju ribozu i fosfodiestarsku okosnicu). Grupa šećera može takođe sadržati jedan ili više ugljenika koji imaju suprotnu stereohemijsku konfiguraciju od one odgovarajućeg ugljenika u ribozi. Stoga, polinukleotidni molekul može uključivati nukleotide koji sadrže, npr. arabinozu, kao šećer. O takvim modifikacijama šećera podučava se u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052523 i Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/75177.

Kombinacije modifikovanih šećera, nukleobaza, i internukleozidnih veza

[0335] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz objave mogu uključivati kombinaciju modifikacija šećera, nukleobaze, i/ili internukleozidne veze. Ove kombinacije mogu uključivati bilo koju jednu ili više modifikacija koje su ovde opisane.

[0336] Primeri modifikovanih nukleotida i kombinacija modifikovanih nukleotida obezbeđeni su u nastavku u Tabeli 8. Ove kombinacije modifikovanih nukleotida mogu se upotrebljavati za formiranje polinukleotida iz objave. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, modifikovani nukleotidi mogu biti kompletno supstituisani za prirodne nukleotide polinukleotida iz objave. Kao neograničavajući primer, prirodni nukleotid uridin može biti supstituisan sa modifikovanim nukleozidom koji je ovde opisan. U sledećem neograničavajućem primeru, prirodni nukleotid uridin može biti delimično supstituisan (npr. oko 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99,9%) sa najmanje jednim od modifikovanih nukleozida koji se ovde objavljuju. Bilo koja kombinacija baze/šećera ili linkera može biti inkorporisana u polinukleotide iz objave i

12

o takvim modifikacijama podučava se u Međunarodnim patentnim publikacijama br. WO 2013/052523 i WO 2014/093924 A1.

Tabela 8. Kombinacije

12

[0337] Dopunski primeri modifikovanih nukleotida i kombinacija modifikovanih nukleotida obezbeđeni su u nastavku u Tabeli 9.

Tabela 9. Dopunske kombinacije

12

1

11

12

1

14

1

14 VI. Farmaceutske kompozicije

Formulacija, primena, isporuka i doziranje

[0338] Predmetna objava opisuje upotrebu farmaceutske kompozicije koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kako bi se aktivirale T ćelije kod subjekta kome je to potrebno. Predmetna objava dodatno opisuje upotrebu farmaceutske kompozicije koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid kako bi se povećao broj ćelija prirodnih ubica (NK) kod subjekta kome je to potrebno. U nekim aspektima objave, polinukleotid se formuliše u kompozicijama i kompleksima u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Farmaceutske kompozicije mogu opciono sadržati jednu ili više dopunskih aktivnih supstanci, npr. terapijski i/ili profilaktički aktivnih supstanci. Farmaceutske kompozicije iz predmetne objave mogu biti sterilne i/ili bez pirogena. Opšta razmatranja u vezi sa formulacijom i/ili proizvodnjom farmaceutskih agenasa mogu se pronaći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

[0339] U nekim aspektima, kompozicije se primenjuju ljudima, humanim pacijentima ili subjektima. U svrhe predmetne objave, fraza "aktivni sastojak" generalno označava polinukleotide koji se isporučuju kao što je ovde opisano.

[0340] Iako su opisi farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane uglavnom usmereni na farmaceutske kompozicije koje su pogodne za primenu ljudima, stručnjak sa iskustvom će razumeti da su takve kompozicije generalno pogodne za primenu bilo kojoj drugoj životinji, npr. ne-humanim životinjama, npr. ne-humanim sisarima. Modifikacija farmaceutskih kompozicija koje su pogodne za primenu ljudima kako bi se kompozicije učinile pogodnim za primenu različitim životinjama je dobro shvaćena, i veterinarski farmakolog sa prosečnim iskustvom može da dizajnira i/ili izvrši takvu modifikaciju sa uobičajenim, ako ga uopšte ima, eksperimentisanjem. Subjekti kojima se razmatra primena farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude i/ili druge primate; sisare.

[0341] U nekim aspektima, polinukleotid iz predmetne objave formuliše se za subkutanu, intravensku, intraperitonealnu, intratumorsku, intramuskularnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intralezijsku, intrakranijalnu, intraventrikularnu, oralnu, inhalacionionim sprejom, topikalnu, rektalnu, nazalnu, bukalnu, vaginalnu, intratumorsku, ili intramuskularnu sa implantiranim rezervoarom, subkutanu, intratumorsku, ili intradermalnu isporuku. U drugim aspektima, polinukleotid se formuliše za intratumorsku, intraperitonealnu, ili intravensku isporuku. U posebnom primeru izvođenja, polinukleotid iz predmetne objave se formuliše za intratumorsku isporuku.

[0342] Formulacije farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane mogu se pripremiti bilo kojim postupkom koji je poznat ili nakon ovoga razvijen u struci farmakologije. Generalno, takvi pripremni postupci uključuju korak dovođenja aktivnog sastojka u asocijaciju sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka, i zatim, ukoliko je potrebno i/ili poželjno, deljenje, oblikovanje i/ili pakovanje proizvoda u željenu jedinicu sa jednom ili više doza.

[0343] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, i/ili bilo kojih dopunskih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa objavom će varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine, i/ili stanja subjekta koji se leči i dodatno u zavisnosti od puta kojim se kompozicija primenjuje. Putem primera, kompozicija može sadržati između 0,1% i 100%, npr. između ,5 i 50%, između 1-30%, između 5-80%, najmanje 80% (tež./tež.) aktivnog sastojka.

Formulacije

[0344] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz objave mogu se formulisati upotrebom jednog ili više ekscipijenasa za: (1) povećanu stabilnost; (2) povećanu transfekciju ćelija; (3) dozvoljavanje produženog ili odloženog oslobađanja (npr. iz depo formulacije polinukleotida); (4) promenu biodistribucije (npr. ciljaju polinukleotid na specifična tkiva ili tipove ćelija); (5) povećanu translaciju kodiranog proteina in vivo; i/ili (6) promenu profila oslobađanja kodiranog proteina in vivo. Pored tradicionalnih ekscipijenasa kao što su bilo koji i svi rastvarači, disperzioni medijumi, razblaživači, ili drugi tečni vehikulumi, pomoćna sredstva za disperziju ili suspenziju, površinski aktivni agensi, izotonični agensi, agensi za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervansi, ekscipijensi iz predmetne objave mogu uključivati, bez ograničavanja, lipidoide, lipozome, lipidne nanočestice, polimere, lipoplekse, nanočestice jezgroomotač, peptide, proteine, ćelije transfektovane polinukleotidima (npr. za transplantaciju u subjekta), hijaluronidazu, mimike nanočestica i njihove kombinacije. U skladu sa tim, formulacije iz objave mogu uključivati jedan ili više ekscipijenasa, svaki u količini koja zajedno povećava stabilnost polinukleotida, povećava transfekciju ćelije od strane polinukleotida, povećava ekspresiju proteina kodiranog polinukleotidima, i/ili menja profil oslobađanja proteina kodiranih polinukleotidom. Dodatno, polinukleotidi iz predmetne objave mogu se formulisati upotrebom nanočestica nukleinske kiseline koje se samoasembliraju.

[0345] Formulacije farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane mogu biti pripremljene bilo kojim postupkom koji je poznat ili nakon ovoga razvijen u struci farmakologije. Generalno, takvi pripremni postupci uključuju korak asociranja aktivnog sastojka sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka.

[0346] Farmaceutska kompozicija u skladu sa predmetnom objavom može biti pripremljena, upakovana, i/ili prodata na veliko, kao pojedinačna jedinična doza, i/ili kao mnoštvo pojedinačnih jediničnih doza. Kao što se ovde upotrebljava, "jedinična doza" označava diskretnu količinu farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka je generalno jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi bila primenjena subjektu i/ili pogodnom delu takve doze kao što je, na primer, jedna polovina ili jedna trećina takve doze.

[0347] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, i/ili bilo kojih dopunskih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa predmetnom objavom mogu varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine, i/ili stanja subjekta koji se leči i dodatno u zavisnosti od puta kojim se kompozicija primenjuje. Na primer, kompozicija može sadržati između 0,1% i 99% (tež./tež.) aktivnog sastojka. Kao primer, kompozicija može sadržati između 0,1% i 100%, npr. između,5 i 50%, između 1-30%, između 5-80%, najmanje 80% (tež./tež.) aktivnog sastojka.

[0348] U nekim primerima izvođenja, formulacije koje su ovde opisane sadrže najmanje jedan polinukleotid. Kao neograničavajući primer, formulacije sadrže 1, 2, 3, 4 ili 5 polinukleotida. U drugim primerima izvođenja, iRNK iz objave formuliše se za intratumorsku isporuku u tumor pacijenta kome je to potrebno.

[0349] Farmaceutske formulacije mogu dopunski sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kao što se ovde upotrebljava, uključuje, ali nije ograničen na, bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, pomoćna sredstva za disperziju ili suspenziju, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervanse, i slično, kako pogoduje određenom željenom doznom obliku. Različiti ekscipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija i tehnike za pripremanje kompozicije poznati su u struci

14

(videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Može se razmatrati upotreba konvencionalnog ekscipijensnog medijuma osim u onoj meri u kojoj bilo koji konvencionalni ekscipijensni medijum može biti nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, kao što je stvaranje bilo kakvog neželjenog biološkog efekta ili drugačija interakcija na štetan način sa bilo kojom drugom komponentom(ama) iz farmaceutske kompozicije.

[0350] U nekim aspektima, veličina čestica lipidnih nanočestica se povećava i/ili smanjuje. Promena veličine čestica može pomoći u suzbijanju bioloških reakcija kao što je, ali ne ograničavajući se na, inflamaciju ili može povećati biološki efekat modifikovane iRNK isporučene sisarima.

[0351] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se upotrebljavaju u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, konzervanse, agense za puferisanje, agense za lubrikovanje, i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono biti uključeni u farmaceutske formulacije iz objave.

[0352] U nekim aspektima, polinukleotidi se primenjuju u ili sa, formulišu se ili isporučuju sa nanostrukturama koje mogu da sekvestriraju molekule kao što je holesterol. Neograničavajući primeri ovih nanostruktura i postupci pravljenja ovih nanostruktura opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130195759. Primeri struktura ovih nanostruktura pokazani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130195759, i mogu uključivati jezgro i omotač koji okružuje jezgro.

Lipidoidi

[0353] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid može se formulisati sa lipidoidima. Sinteza lipidoida je opširno opisana i formulacije koje sadrže ova jedinjenja su posebno pogodne za isporuku polinukleotida (videti Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001).

[0354] Dok su ovi lipidoidi upotrebljavani za efikasnu isporuku dvolančanih malih interferirajućih RNK molekula kod glodara i ne-humanih primata (videti Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105:11915-11920; Akinc et al., Mol Ther.2009 17:872-879; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010), predmetna objava opisuje njihovu formulaciju i upotrebu u isporučivanju polinukleotida.

[0355] Kompleksi, micele, lipozomi ili čestice mogu se pripremiti da sadrže ove lipidoide i prema tome mogu rezultovati efikasnom isporukom polinukleotida, kako se sudi po proizvodnji kodiranog proteina, nakon injektiranja lipidoidne formulacije putem lokalizovanih i/ili sistemskih puteva primene. Lipidoidni kompleksi polinukleotida mogu se primenjivati na različite načine uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravenske, intraperitonealne, intratumorske, intramuskularne, ili subkutane puteve.

[0356] Na in vivo isporuku nukleinskih kiselina mogu uticati mnogi parametri, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kompoziciju formulacije, prirodu PEGilacije čestica, stepen punjenja, odnos polinukleotida prema lipidu, i biofizičke parametre kao što su, ali ne ograničavajući se na, veličinu čestica (Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879). Na primer, male promene u dužini ukotvljujućeg lanca poli(etilen glikol) (PEG) lipida mogu rezultovati značajnim efektima na in vivo efikasnost. Formulacije sa različitim lipidoidima, uključujući, ali ne ograničavajući se na penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilentetramin hidrohlorid (TETA-5LAP; takođe poznat kao 98N12-5, videti Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (uključujući derivate i varijante), i MD1, mogu se testirati za in vivo aktivnost.

[0357] Lipidoid koji se ovde označava kao "98N12-5" objavili su Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879.

[0358] Lipidoid koji se ovde označava kao "C12-200" objavili su Love et al., Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864-1869 i Liu i Huang, Molecular Therapy. 2010 669-670. Lipidoidne formulacije mogu uključivati čestice koje sadrže bilo 3 ili 4 ili više komponenti pored polinukleotida.

[0359] Lipidoidi i formulacije polinukleotida koje sadrže lipidoide koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/097077.

Lipozomi, lipopleksi, i lipidne nanočestice

14

[0360] Polinukleotidi iz objave mogu biti formulisani upotrebom jednog ili više lipozoma, lipopleksa, ili lipidnih nanočestica. U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid uključuju lipozome. Lipozomi su veštački pripremljene vezikule koje se prvenstveno mogu sastojati od lipidnog dvosloja i mogu se upotrebljavati kao vehikulum za isporuku za primenu farmaceutskih formulacija. Lipozomi mogu biti različitih veličina kao što su, ali ne ograničavajući se na, multilamelarne vezikule (MLV) koje mogu biti velike stotine nanometara u prečniku i mogu sadržati niz koncentričnih dvoslojeva razdvojenih uskim vodenim kompartmentima, male unilamelarne vezikule (SUV) koje mogu biti manje od 50 nm u prečniku, i velike unilamelarne vezikule (LUV) koje mogu biti između 50 i 500 nm u prečniku. Dizajn lipozoma može uključivati, ali nije ograničen na, opsonine ili ligande kako bi se poboljšalo prikačinjanje lipozoma za nezdravo tkivo ili kako bi se aktivirali događaji kao što je, ali ne ograničavajući se na, endocitozu. Lipozomi mogu da sadrže nizak ili visok pH kako bi se poboljšala isporuka farmaceutskih formulacija.

[0361] Formiranje lipozoma može zavisiti od fizičko-hemijskih karakteristika kao što su, ali ne ograničavajući se na, zarobljenu farmaceutsku formulaciju i sastojke lipozoma, prirodu medijuma u kome su lipidne vezikule dispergovane, efektivnu koncentraciju zarobljene supstance i njenu potencijalnu toksičnost, bilo koje dopunske procese uključene tokom primene i/ili isporuke vezikula, optimizaciju veličine, polidisperznost i vek trajanja vezikula za predviđenu primenu, kao i reproducibilnost od serije do serije i mogućnost proizvodnje u velikim razmerama bezbednih i efikasnih lipozomskih proizvoda.

[0362] Kao neograničavajući primer, lipozomi kao što su vezikule sa sintetičkim membranama pripremaju se pomoću postupaka, aparatura i uređaja koji su opisani u S.A.D. patentnim publikacijama br, US20130177638, US20130177637, US20130177636, US20130177635, US20130177634, US20130177633, US20130183375, US20130183373 i US20130183372.

[0363] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane uključuju, bez ograničenja, lipozome kao što su oni formirani od 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DODMA) lipozoma, DiLa2 lipozome iz Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2- dilinoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioksolan (DLin-KC2-DMA), i MC3 (kao što je opisano u

14

US20100324120) i lipozome koji mogu da isporuče lekove malog molekula kao što je, ali ne ograničavajući se na, DOXIL<®>iz Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).

[0364] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu uključivati, bez ograničenja, lipozome kao što su oni formirani sintezom stabilizovanih plazmid-lipid čestica (SPLP) ili stabilizovanih nukleinska kiselina lipid čestica (SNALP) koji su prethodno opisani i pokazano je da su pogodni za isporuku oligonukleotida in vitro i in vivo (videti Wheeler et al. Gene Therapy.1999 6:271-281; Zhang et al. Gene Therapy.1999 6:1438-1447; Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372; Morrissey et al., Nat Biotechnol.2005 2:1002-1007; Zimmermann et al., Nature.

2006 441:111-114; Heyes et al. J Contr Rel.2005 107:276-287; Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176; Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; S.A.D. patentna publikacija br. US20130122104). Originalni proizvodni postupak od strane Wheeler et al. bio je postupak dijalize deterdžentom, koji su kasnije poboljšali Jeffs et al. i označava se kao postupak spontanog formiranja vezikula. Formulacije lipozoma se sastoje od 3 do 4 lipidne komponente pored polinukleotida. Kao primer lipozom može sadržati, ali nije ograničen na, 55% holesterola, 20% disteroilfosfatidil holina (DSPC), 10% PEG-S-DSG, i 15% 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA), kao što su opisali Jeffs et al. Kao drugi primer, određene formulacije lipozoma sadrže, ali nisu ograničene na, 48% holesterola, 20% DSPC, 2% PEG-c-DMA, i 30% katjonskog lipida, pri čemu katjonski lipid može biti 1,2-distearloksi-N,N-dimetilaminopropan (DSDMA), DODMA, DLin-DMA, ili 1,2-dilinoleniloksi-3-dimetilaminopropan (DLenDMA), kao što su opisali Heyes et al.

[0365] U nekim aspektima, formulacije lipozoma sadrže od oko 25,0% holesterola do oko 40,0% holesterola, od oko 30,0% holesterola do oko 45,0% holesterola, od oko 35,0% holesterola do oko 50,0% holesterola i/ili od oko 48,5% holesterola do 60,0% holesterola. U drugim aspektima, formulacije sadrže procenat holesterola odabran iz grupe koja se sastoji od 28,5%, 31,5%, 33,5%, 36,5%, 37,0%, 38,5%, 39,0% i 43,5%. U nekim aspektima, formulacije sadrže od oko 5,0% do oko 10,0% DSPC i/ili od oko 7,0% do oko 15,0% DSPC.

[0366] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije uključuju lipozome koji su formirani da isporuče polinukleotide koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Polinukleotidi mogu biti inkapsulirani u lipozomu i/ili mogu biti sadržani u vodenom jezgru koje se zatim može inkapsulirati u lipozom (videti Međunarodne publikacije br.

14

WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901 i WO2012006378 i S.A.D. patentne publikacije br. US20130189351, US20130195969 i US20130202684).

[0367] U sledećem aspektu, lipozomi se formulišu za ciljanu isporuku. Kao neograničavajući primer, lipozom se formuliše za ciljanu isporuku u jetru. Lipozom koji se upotrebljava za ciljanu isporuku može uključivati, ali nije ograničen na, lipozome koji su opisani u i postupke pravljenja lipozoma koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130195967.

[0368] U sledećem aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u katjonskoj ulje-u-vodi emulziji gde čestica emulzije sadrži jezgro ulja i katjonski lipid koji može da interaguje sa polinukleotidom koji ukotvljuje molekul za česticu emulzije (videti Međunarodnu publ. br. WO2012006380).

[0369] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u voda-u-ulju emulziji koja sadrži kontinuiranu hidrofobnu fazu u kojoj je hidrofilna faza dispergovana. Kao neograničavajući primer, emulzija se može napraviti postupcima koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO201087791.

[0370] U sledećem aspektu, lipidna formulacija uključuje najmanje katjonski lipid, lipid koji može da pojača transfekciju i najmanje jedan lipid koji sadrži hidrofilnu glavenu grupu povezanu sa lipidnom funkcionalnom grupom (Međunarodna publ. br. WO2011076807 i S.A.D. publ. br.20110200582). U sledećem aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipidnoj vezikuli koja može imati unakrsne veze između funkcionalizovanih lipidnih dvoslojeva (videti S.A.D. publ. br.20120177724).

[0371] U jednom aspektu, polinukleotidi se formulišu u lipozomu kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013086526. Polinukleotidi mogu biti inkapsulirani u lipozomu upotrebom reverznih pH gradijenata i/ili optimizovanih internih puferskih kompozicija kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013086526.

[0372] U jednom aspektu, polinukleotidne farmaceutske kompozicije formulišu se u lipozomima kao što su, ali ne ograničavajući se na, DiLa2 lipozome (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES<®>(Marina Biotech, Bothell, WA), lipozome zasnovane na neutralnom DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin) (npr. isporuka siRNA za kancer jajnika (Landen et al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713)) i lipozome obložene hijaluronanom (Quiet Therapeutics, Izrael).

14

[0373] U jednom aspektu, katjonski lipid je katjonski lipid male molekulske težine, kao što su oni opisani u S.A.D. patentnoj prijavi br. 20130090372. U sledećem aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipidnoj vezikuli koja može imati unakrsne veze između funkcionalizovanih lipidnih dvoslojeva.

[0374] U drugim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipozomu koji sadrži katjonski lipid. Lipozom može imati molski odnos atoma azota u katjonskom lipidu prema fosfatima u polinukleotidu (N:P odnos) od između 1:1 i 20:1 kao što je opisano u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013006825. U sledećem aspektu, lipozom može imati N:P odnos veći od 20:1 ili manji od 1:1.

[0375] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipid-polikatjon kompleksu. Formiranje lipid-polikatjon kompleksa može se postići postupcima koji su poznati u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. publ. br. 20120178702. Kao neograničavajući primer, polikatjon uključuje katjonski peptid ili polipeptid kao što su, ali ne ograničavajući se na, polilizin, poliornitin i/ili poliarginin i katjonske peptide koji su opisani u Međunarodnoj publ. br. WO2012013326 ili S.A.D. patentnoj publ. br. US20130142818. U sledećem aspektu, polinukleotidi se formulišu u lipid-polikatjon kompleksu koji može dodatno da uključuje nekatjonski lipid kao što su, ali ne ograničavajući se na, holesterol ili dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE).

[0376] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u aminoalkoholnom lipidoidu. Aminoalkoholni lipidoidi koji se mogu upotrebljavati u predmetnoj objavi mogu se pripremiti postupcima koji su opisani u S.A.D. patentu br.8,450,298.

[0377] Na formulaciju lipozoma može uticati, ali nije ograničeno na, odabir katjonske lipidne komponente, stepen zasićenosti katjonskih lipida, priroda PEGilacije, odnos svih komponenti i biofizički parametri kao što je veličina. U jednom primeru od strane Semple et al. (Semple et al. Nature Biotech.2010 28:172-176), formulacija lipozoma bila je sastavljena od 57,1% katjonskog lipida, 7,1% dipalmitoilfosfatidilholina, 34,3% holesterola, i 1,4% PEG-c-DMA. Kao sledeći primer, promena kompozicije katjonskog lipida mogla bi efikasnije da isporuči siRNA u različite antigen prezentujuće ćelije (Basha et al. Mol Ther.2011 19:2186-2200). U nekim aspektima, formulacije lipozoma sadrže od oko 35 do oko 45% katjonskog lipida, od oko 40% do

14

oko 50% katjonskog lipida, od oko 50% do oko 60% katjonskog lipida i/ili od oko 55% do oko 65% katjonskog lipida. U nekim aspektima, odnos lipida prema iRNK u lipozomima je od oko 5:1 do oko 20:1, od oko 10:1 do oko 25:1, od oko 15:1 do oko 30:1 i/ili najmanje 30:1.

[0378] U nekim aspektima, odnos PEG u formulacijama lipidnih nanočestica (LNP) povećava se ili smanjuje i/ili dužina ugljeničnog lanca PEG lipida modifikuje se sa C14 na C18 kako bi se promenila farmakokinetika i/ili biodistribucija LNP formulacija. Kao neograničavajući primer, LNP formulacije sadrže od oko 0,5% do oko 3,0%, od oko 1,0% do oko 3,5%, od oko 1,5% do oko 4,0%, od oko 2,0% do oko 4,5%, od oko 2,5% do oko 5,0% i/ili od oko 3,0% do oko 6,0% lipidnog molskog odnosa PEG-c-DOMG (R-3-[(ω-metoksi-poli(etilenglikol)2000)karbamoil)]-1,2-dimiristiloksipropil-3-amin) (koji se ovde takođe označava kao PEG-DOMG) u poređenju sa katjonskim lipidom, DSPC i holesterolom. U sledećem aspektu, PEG-c-DOMG može biti zamenjen sa PEG lipidom kao što je, ali nije ograničeno na, PEG-DSG (1,2-distearoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol), PEG-DMG (1,2-dimiristoil-sn-glicerol) i/ili PEG-DPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol). Katjonski lipid može biti odabran od bilo kog lipida poznatog u struci, kao što su, ali ne ograničavajući se na, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C 12-200 i DLin-KC2-DMA.

[0379] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipidnoj nanočestici kao što su one koje su opisane u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012170930.

[0380] U sledećem aspektu, formulacija koja sadrži polinukleotid je nanočestica koja može sadržati najmanje jedan lipid. Lipid može biti odabran od, ali nije ograničen na, DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, PEGilovane lipide i lipide amino alkohola. U sledećem aspektu, lipid je katjonski lipid kao što su, ali ne ograničavajući se na, DLinDMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA i lipidi amino alkohola. Katjonski lipidi amino alkohola mogu biti lipidi koji je opisani u i/ili napravljeni postupcima koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130150625. Kao neograničavajući primer, katjonski lipid može biti 2-amino-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-{[(9Z,2Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 1 u US20130150625); 2-amino-3-[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]-2-{[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 2 u US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-

1

[(oktiloksi)metil]propan-1-ol (Jedinjenje 3 u US20130150625); i 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-{[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 4 u US20130150625); ili bilo koja njegova farmaceutski prihvatljiva so ili stereoizomer.

[0381] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid iz objave formuliše se u lipidnoj nanočestici, pri čemu polinukleotid sadrži iRNK koja kodira polipeptid koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid iz objave formuliše se u lipidnoj nanočestici, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 65.

[0382] Formulacije lipidnih nanočestica tipično sadrže lipid, posebno jonizujući katjonski lipid, na primer, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirat (DLin-MC3-DMA), ili di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioat (L319), i dodatno sadrže neutralni lipid, sterol i molekul koji je sposoban da redukuje agregaciju čestica, na primer PEG ili PEG-modifikovani lipid.

[0383] U jednom aspektu, formulacija lipidnih nanočestica se suštinski sastoji od (i) najmanje jednog lipida odabranog iz grupe koja se sastoji od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319); (ii) neutralnog lipida odabranog od DSPC, DPPC, POPC, DOPE i SM; (iii) sterola, npr. holesterola; i (iv) PEG-lipid, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA, u molskom odnosu od oko 20-60% katjonskog lipida: 5-25% neutralnog lipida: 25-55% sterola; 0,5-15% PEG-lipida.

[0384] U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 25% do oko 75% na molskoj osnovi katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), npr. od oko 35 do oko 65%, od oko 45 do oko 65%, oko 60%, oko 57,5%, oko 50% ili oko 40% na molskoj osnovi.

[0385] U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 0,5% do oko 15% na molskoj osnovi neutralnog lipida, npr. od oko 3 do oko 12%, od oko 5 do oko 10% ili oko 15%, oko 10%, ili oko 7,5% na molskoj osnovi. Primeri neutralnih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, DSPC, POPC, DPPC, DOPE i SM. U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 5% do oko 50% na molskoj osnovi sterola (npr. oko 15 do oko 45%,

1 1

oko 20 do oko 40%, oko 40%, oko 38,5%, oko 35%, ili oko 31% na molskoj osnovi). Primer sterola je holesterol. U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 0,5% do oko 20% na molskoj osnovi PEG ili PEG-modifikovanog lipida (npr. oko 0,5 do oko 10%, oko 0,5 do oko 5%, oko 1,5%, oko 0,5%, oko 1,5%, oko 3,5%, ili oko 5% na molskoj osnovi). U jednom aspektu, PEG ili PEG modifikovani lipid sadrži PEG molekul prosečne molekulske težine od 2.000 Da. U drugim aspektima, PEG ili PEG modifikovani lipid sadrži PEG molekul prosečne molekulske težine manje od 2.000, na primer oko 1.500 Da, oko 1.000 Da, ili oko 500 Da. Primeri PEG-modifikovanih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, PEG-distearoil glicerol (PEG-DMG) (koji se ovde takođe označava kao PEG-C14 ili C14-PEG), PEG-cDMA (koji se dodatno razmatra u Reyes et al. J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)).

[0386] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju 25-75% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), 0,5-15% neutralnog lipida, 5-50% sterola, i 0,5-20% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0387] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju 35-65% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), 3-12% neutralnog lipida, 15-45% sterola, i 0,5-10% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0388] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju 45-65% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), 5-10% neutralnog lipida, 25-40% sterola, i 0,5-10% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0389] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 60% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 7,5% neutralnog lipida, oko 31% sterola, i oko 1,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0390] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 50% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-

1 2

(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 10% neutralnog lipida, oko 38,5% sterola, i oko 1,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0391] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 50% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 10% neutralnog lipida, oko 35% sterola, oko 4,5% ili oko 5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida, i oko 0,5% lipida koji ciljno deluje na molskoj osnovi.

[0392] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 40% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 15% neutralnog lipida, oko 40% sterola, i oko 5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0393] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 57,2% katjonskog lipida odabranog od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 7,1% neutralnog lipida, oko 34,3% sterola, i oko 1,4% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0394] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 57,5% katjonskog lipida odabranog od PEG lipida je PEG-cDMA (PEG-cDMA se dodatno razmatra u Reyes et al. (J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)), oko 7,5% neutralnog lipida, oko 31,5% sterola, i oko 3,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.

[0395] U nekim aspektima, formulacija lipidnih nanočestica se suštinski sastoji od mešavine lipida u molskim odnosima od oko 20-70% katjonskog lipida: 5-45% neutralnog lipida: 20-55% holesterola: 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida; npr. u molskom odnosu od oko 20-60% katjonskog lipida: 5-25% neutralnog lipida: 25-55% holesterola: 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida.

[0396] U posebnim aspektima, molski odnos lipida je približno 50/10/38,5/1,5 (mol% katjonski lipid/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG, PEG-DSG ili PEG-DPG), 57,2/7,134,3/1,4 (mol% katjonski lipid/neutralni lipid, npr. DPPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-cDMA), 40/15/40/5 (mol% katjonski lipid/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG), 50/10/35/4,5/0,5 (mol% katjonski lipid/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DSG), 50/10/35/5 (katjonski lipid/neutralni lipid, npr.

1

DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG), 40/10/40/10 (mol% katjonski lipid/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA), 35/15/40/10 (mol% katjonski lipid/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA) ili 52/13/30/5 (mol% katjonski lipid/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA).

[0397] Primeri kompozicija lipidnih nanočestica i postupci pravljenja istih opisani su, na primer, u Semple et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176; Jayarama et al. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51: 8529-8533; i Maier et al. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578.

[0398] U jednom aspektu, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane sadrže katjonski lipid, PEG lipid i strukturni lipid i opciono sadrže nekatjonski lipid. Kao neograničavajući primer, lipidne nanočestice sadrže oko 40-60% katjonskog lipida, oko 5-15% nekatjonskog lipida, oko 1-2% PEG lipida i oko 30-50% strukturnog lipida. Kao sledeći neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 50% katjonskog lipida, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 1,5% PEG lipida i oko 38,5% strukturnog lipida. Kao još jedan neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 55% katjonskog lipida, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 2,5% PEG lipida i oko 32,5% strukturnog lipida. U jednom aspektu, katjonski lipid je bilo koji katjonski lipid koji je ovde opisan kao što su, ali ne ograničavajući se na, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA i L319.

[0399] U jednom aspektu, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane su 4-komponentne lipidne nanočestice. Lipidna nanočestica može sadržati katjonski lipid, nekatjonski lipid, PEG lipid i strukturni lipid. Kao neograničavajući primer, lipidna nanočestica može sadržati oko 40-60% katjonskog lipida, oko 5-15% nekatjonskog lipida, oko 1-2% PEG lipida i oko 30-50% strukturnog lipida. Kao sledeći neograničavajući primer, lipidna nanočestica može sadržati oko 50% katjonskog lipida, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 1,5% PEG lipida i oko 38,5% strukturnog lipida. Kao još jedan neograničavajući primer, lipidna nanočestica može sadržati oko 55% katjonskog lipida, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 2,5% PEG lipida i oko 32,5% strukturnog lipida. U jednom aspektu, katjonski lipid može biti bilo koji katjonski lipid koji je ovde opisan, kao što su, ali ne ograničavajući se na, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA i L319.

1 4

[0400] U jednom aspektu, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane sadrže katjonski lipid, nekatjonski lipid, PEG lipid i strukturni lipid. Kao neograničavajući primer, lipidne nanočestice sadrže oko 50% katjonskog lipida DLin-KC2-DMA, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 1,5% PEG lipida PEG-DOMG i oko 38,5% strukturnog lipida holesterola. Kao neograničavajući primer, lipidne nanočestice sadrže oko 50% katjonskog lipida DLin-MC3-DMA, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 1,5% PEG lipida PEG-DOMG i oko 38,5% strukturnog lipida holesterola. Kao neograničavajući primer, lipidne nanočestice sadrže oko 50% katjonskog lipida DLin-MC3-DMA, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 1,5% PEG lipida PEG-DMG i oko 38,5% strukturnog lipida holesterola. Kao još jedan neograničavajući primer, lipidne nanočestice sadrže oko 55% katjonskog lipida L319, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 2,5% PEG lipida PEG-DMG i oko 32,5% strukturnog lipida holesterola.

[0401] U jednom aspektu, katjonski lipid je odabran od, ali nije ograničen na, katjonski lipid koji je opisan u Međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2008103276, WO2013086373 i WO2013086354, S.A.D. patentima br.7,893,302, 7,404,969, 8,283,333, i 8,466,122 i S.A.D. patentnim publikacijama br. US20100036115, US20120202871, US20130064894, US20130129785, US20130150625, US20130178541 i US20130225836. U sledećem aspektu, katjonski lipid može biti odabran od, ali nije ograničen na, formulu A koja je opisana u Međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638 i WO2013116126 ili S.A.D. patentnim publikacijama br. US20130178541 i US20130225836. U još jednom aspektu, katjonski lipid može biti odabran od, ali nije ograničen na, formulu CLI-CLXXIX iz Međunarodne publikacije br. WO2008103276, formulu CLI-CLXXIX iz S.A.D. patenta br. 7,893,302, formulu CLI-CLXXXXII iz S.A.D. patenta br. 7,404,969 i formule I-VI iz S.A.D. patentne publikacije br. US20100036115, formulu I iz S.A.D. patentne publikacije br. US20130123338. Kao neograničavajući primer, katjonski lipid može biti odabran od (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonakoza-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilheksakoza-17,20-dien-9-amina, (1Z,19Z)-N5N-dimetilpentakoza-16,19-dien-

1

8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildokoza-13,16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetilhenikoza-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltrikoza-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltrikoza-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloktakoza-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilheksakoza-17,20-dien-7-amina, (16Z,19Z)-N,N-dimetilpentakoza-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriakonta-22,25-dien-10-amina, (21Z,24Z)-N,N-dimetiltriakonta-21,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptakos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilheksakos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloktakoza-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptakozan-10-amina, (20Z,23Z)-N-ethil-N-metilnonakoza-20,23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-1-nonilikoza-11,14-dien-1-il] pirolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptakos-20-en-10-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptakos-15-en-10-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonakos-14-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonakos-17-en-10-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriakont-24-en-10-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonakos-20-en-10-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriakont-22-en-10-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentakos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenikoza-12,15-dien-1-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildokoza-13,16-dien-1-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil] eptadekan-8-amina, 1-[(1S,2R)-2-heksilciklopropil]-N,N-dimetilnonadekan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]nonadekan-10-amina, N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]henikozan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciklopropil]metil}ciklopropil]nonadekan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]heksadekan-8-amina, N,N-dimetil-[(1R,2S)-2-undecilciklopropil]tetradekan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]heptil}dodekan-1-amina, 1-[(1R,2S)-2-heptilciklopropil]-N,N-dimetiloktadekan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciklopropil]-N,N-dimetilpentadekan-6-amina, N,N-dimetil-l-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]pentadekan-8-amina, R-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-1-[(oktiloksi)metil]etil}pirolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-[(5Z)-okt-5-en-1-iloksi]propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-1-[(oktiloksi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(heksiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina,

1

(2S)-1-(heptiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloksi)-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-oktadeka-6,9,12-trien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(pentiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-(heksiloksi)-3-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-dokoza-13,16-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-dokoza-13,16-dien-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-dokos-13-en-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-dokos-13-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-heksadek-9-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloktil)oksi]-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloktil)oksi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(oktiloksi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciklopropil]metil}ciklopropil]oktil}oksi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oclilciklopropil)oktil]oksi}-3-(oktiloksi)propan-2-amina i (1IE,20Z,23Z)-N,N-dimetilnonakoza-I1,20,2-trien-10-amina ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomere.

[0402] U jednom aspektu, lipid je lipid koji se može isecati kao što su oni koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012170889. U sledećem aspektu, lipid je katjonski lipid kao što je, ali nije ograničen na, Formulu (I) iz S.A.D. patentne prijave br. US20130064894.

[0403] U jednom aspektu, katjonski lipid je sintetisan postupcima poznatim u struci i/ili kao što je opisano u Međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2013086373 i WO2013086354.

[0404] U sledećem aspektu, katjonski lipid je trialkil katjonski lipid. Neograničavajući primeri trialkil katjonskih lipida i postupci pravljenja i upotrebe trialkil katjonskih lipida opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013126803.

1

[0405] U jednom primeru izvođenja, LNP formulacije polinukleotida sadrže PEG-c-DOMG u lipidnom molskom odnosu od 3%. U sledećem aspektu, LNP formulacije polinukleotida sadrže PEG-c-DOMG u lipidnom molskom odnosu od 1,5%.

[0406] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid uključuju najmanje jedan od PEGilovanih lipida koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012099755.

[0407] U jednom aspektu, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-snglicero-3-fofoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000). U jednom aspektu, LNP formulacija može sadržati PEG-DMG 2000, katjonski lipid koji je poznat u struci i najmanje jednu drugu komponentu. U sledećem aspektu, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000, katjonski lipid koji je poznat u struci, DSPC i holesterol. Kao neograničavajući primer, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol. Kao sledeći neograničavajući primer, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol u molskom odnosu 2:40:10:48 (videti npr. Geall et al., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294).

[0408] U jednom aspektu, LNP formulacija formuliše se pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji su ovde opisani inkapsulirani su u LNP formulacije kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276.

[0409] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji su ovde opisani formulišu se u nanočestici koja se isporučuje parenteralnim putem kao što je opisano u S.A.D. publ. br. US20120207845.

[0410] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipidnoj nanočestici napravljenoj pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130156845 ili Međunarodnoj publikaciji br. WO2013093648 ili WO2012024526.

[0411] Lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu se napraviti u sterilnom okruženju pomoću sistema i/ili postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130164400.

[0412] U jednom aspektu, LNP formulacija formuliše se u nanočestici kao što je nukleinska kiselina-lipidna čestica koja je opisana u S.A.D. patentu br. 8,492,359. Kao neograničavajući primer, lipidna čestica sadrži jedan ili više aktivnih agenasa ili

1

terapijskih agenasa; jedan ili više katjonskih lipida koji sadrže od oko 50 mol% do oko 85 mol% ukupnog lipida koji je prisutan u čestici; jedan ili više nekatjonskih lipida koji sadrže od oko 13 mol% do oko 49,5 mol% ukupnog lipida koji je prisutan u čestici; i jedan ili više konjugovanih lipida koji inhibiraju agregaciju čestica koji sadrže od oko 0,5 mol% do oko 2 mol% ukupnog lipida koji je prisutan u čestici. Nukleinska kiselina u nanočestici mogu biti polinukleotidi koji su ovde opisani i/ili su poznati u struci.

[0413] U jednom aspektu, LNP formulacija formuliše se pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, modifikovana RNK koja je ovde opisana inkapsulirana je u LNP formulacijama kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276.

[0414] U jednom aspektu, LNP formulacije koje su ovde opisane sadrže polikatjonsku kompoziciju. Kao neograničavajući primer, polikatjonska kompozicija je odabrana od formule 1-60 iz S.A.D. patentne publikacije br. US20050222064. U sledećem aspektu, LNP formulacije koje sadrže polikatjonsku kompoziciju upotrebljavaju se za isporuku modifikovane RNK koja je ovde opisana in vivo i/ili in vitro.

[0415] U jednom aspektu, LNP formulacije koje su ovde opisane dodatno sadrže molekul koji poboljšava permeabilnost. Neograničavajući molekuli koji poboljšavaju permeabilnost opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20050222064.

[0416] U jednom aspektu, polinukleotidne farmaceutske kompozicije formulisane su u lipozomima kao što su, ali ne ograničavajući se na, DiLa2 lipozome (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES<®>(Marina Biotech, Bothell, WA), lipozome zasnovane na neutralnom DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin) (npr. isporuka siRNA za kancer jajnika (Landen et al. Cancer Biology & Therapy 20065(12)1708-1713)) i lipozome obložene hijaluronanom (Quiet Therapeutics, Izrael).

[0417] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipozomskoj kompoziciji u liofilizovanoj gel-fazi kao što je opisano u S.A.D. publikaciji br. US2012060293.

[0418] Formulacije nanočestica mogu sadržati konjugat fosfata. Konjugat fosfata može povećati in vivo vremena cirkulacije i/ili povećati ciljanu isporuku nanočestice. Konjugati fosfata za upotrebu sa predmetnom objavom mogu se napraviti pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnoj prijavi br. WO2013033438 ili S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130196948. Kao neograničavajući primer, konjugati

1

fosfata mogu uključivati jedinjenje bilo koje od formula koje su opisane u Međunarodnoj prijavi br. WO2013033438.

[0419] Formulacija nanočestica može sadržati konjugat polimera. Konjugat polimera može biti konjugat koji je solubilan u vodi. Konjugat polimera može imati strukturu kao što je opisano u S.A.D. patentnoj prijavi br. 20130059360. U jednom aspektu, konjugati polimera sa polinukleotidima koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave mogu se napraviti upotrebom postupaka i/ili segmentisanih polimernih reagensa koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavi br. 20130072709. U sledećem aspektu, konjugat polimera može imati viseće bočne grupe koje sadrže prstenaste funkcionalne grupe kao što su, ali ne ograničavajući se na, konjugate polimera koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130196948.

[0420] Formulacije nanočestica mogu sadržati konjugat za poboljšanje isporuke nanočestica iz predmetne objave kod subjekta. Dodatno, konjugat može inhibirati fagocitni klirens nanočestica kod subjekta. U jednom aspektu, konjugat je "samo" peptid dizajniran od proteina humane membrane CD47 (npr. "samo" čestice koje su opisali Rodriguez et al (Science 2013339, 971-975)). Kao što su pokazali Rodriguez et al. samo peptidi su odložili klirens nanočestica posredovan makrofagom, što je poboljšalo isporuku nanočestica. U sledećem aspektu, konjugat je membranski protein CD47 (npr. videti Rodriguez et al. Science 2013339, 971-975). Rodriguez et al. su pokazali da, slično kao "samo" peptidi, CD47 može povećati odnos cirkulišućih čestica kod subjekta u poređenju sa skremblovanim peptidima i PEG obloženim nanočesticama.

[0421] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave formulišu se u nanočesticama koje sadrže konjugat za poboljšanje isporuke nanočestica iz predmetne objave kod subjekta. Konjugat može biti CD47 membrane ili konjugat može biti poreklom od CD47 membranskog proteina, kao što je "samo" peptid koji je prethodno opisan. U sledećem aspektu, nanočestica može sadržati PEG i konjugat CD47 ili njegov derivat. U još jednom aspektu, nanočestica sadrži i "samo" peptid koji je prethodno opisan i membranski protein CD47.

[0422] U sledećem aspektu, "samo" peptid i/ili CD47 protein je konjugovan za česticu sličnu virusu ili pseudovirion, kao što je ovde opisano za isporuku polinukleotida iz predmetne objave.

1

[0423] U sledećem aspektu, farmaceutske kompozicije sadrže polinukleotide koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave i konjugat koji može imati degadabilnu vezu. Neograničavajući primeri konjugata uključuju aromatičnu funkcionalnu grupu koja sadrži atom vodonika koji se može jonizovati, spejser funkcionalnu grupu, i polimer koji je solubilan u vodi. Kao neograničavajući primer, farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat sa degradabilnom vezom i postupci za isporuku takvih farmaceutskih kompozicija opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130184443.

[0424] Formulacije nanočestica mogu biti nanočestice ugljenih hidrata koje sadrže ugljenohidratni nosač i polinukleotid. Kao neograničavajući primer, ugljenohidratni nosač uključuje, ali nije ograničen na, anhidridom modifikovani fitoglikogen ili materijal tipa glikogena, fitoglikogen oktenil sukcinat, fitoglikogen beta-dekstrin, anhidridom modifikovan fitoglikogen beta-dekstrin (videti npr. Međunarodnu publikaciju br. WO2012109121).

[0425] Formulacije nanočestica iz predmetne objave mogu biti obložene surfaktantom ili polimerom kako bi se poboljšala isporuka čestice. U jednom aspektu, nanočestica je obložena hidrofilnom oblogom kao što su, ali nisu ograničene na, PEG obloge i/ili obloge koje imaju neutralno površinsko naelektrisanje. Hidrofilne obloge mogu pomoći da se isporuče nanočestice sa većim korisnim tovarom, kao što su, ali nisu ograničene na, polinukleotide unutar centralnog nervnog sistema. Kao neograničavajući primer, nanočestice koje sadrže hidrofilnu oblogu i postupci pravljenja takvih nanočestica opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130183244.

[0426] U jednom aspektu, lipidne nanočestice iz predmetne objave su hidrofilne polimerne čestice. Neograničavajući primeri hidrofilnih polimernih čestica i postupci pravljenja hidrofilnih polimernih čestica opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130210991.

[0427] U sledećem aspektu, lipidne nanočestice iz predmetne objave su hidrofobne polimerne čestice. Formulacije lipidnih nanočestica mogu se poboljšati zamenom katjonskog lipida sa biodegradabilnim katjonskim lipidom koji je poznat kao lipidna nanočestica koja se brzo eliminiše (reLNP). Pokazano je da se jonizujući katjonski lipidi, kao što su, ali ne ograničavajući se na, DLinDMA, DLin-KC2-DMA, i DLin-MC3-DMA, akumuliraju u plazmi i tkivima tokom vremena i mogu biti potencijalni izvor toksičnosti. Brzi metabolizam lipida koji se brzo eliminišu može poboljšati tolerantnost

1 1

i terapijski indeks lipidnih nanočestica za red veličine od 1 mg/kg doze do 10 mg/kg doze kod pacova. Uključivanje enzimski degradirane estarske veze može poboljšati profil degradacije i metabolizma katjonske komponente, dok se i dalje održava aktivnost reLNP formulacije. Estarska veza može biti interno locirana unutar lipidnog lanca ili može biti terminalno locirana na terminusnom kraju lipidnog lanca. Interna estarska veza može da zameni bilo koji ugljenik u lancu lipida.

[0428] U jednom aspektu, interna estarska veza je locirana na bilo kojoj strani zasićenog ugljenika.

[0429] U jednom aspektu, imunski odgovor se izaziva isporukom lipidnih nanočestica koje mogu uključivati nanovrstu, polimer i imunogen (S.A.D. publikacija br.

20120189700 i Međunarodna publikacija br. WO2012099805). Polimer može inkapsulirati nanovrste ili delimično inkapsulirati nanovrste. Imunogen može biti rekombinantni protein, modifikovana RNK i/ili OX40L polinukleotid koji je ovde opisan.

[0430] Lipidne nanočestice se mogu projektovati tako da menjaju površinska svojstva čestica tako da lipidne nanočestice mogu da penetriraju kroz mukoznu barijeru. Mukus je lociran na mukoznom tkivu kao što je, ali nije ograničeno na, oralno (npr. bukalne i ezofagusne membrane i tkivo krajnika), oftalmološko, gastrointestinalno (npr. želudac, tanko crevo, debelo crevo, kolon, rektum), nazalno, respiratorno (npr. nazalne, faringealne, trahealne i bronhijalne membrane), genitalno (npr. vaginalne, cervikalne i uretralne membrane). Smatra se da su nanočestice veće od 10-200 nm koje su poželjne zbog veće efikasnosti inkapsulacije leka i sposobnosti da obezbede kontinuiranu isporuku širokog spektra lekova prevelike kako bi brzo difundovale kroz mukozne barijere. Mukus se kontinuirano sekretuje, odljubljuje, odbacuje ili vari i reciklira, tako da se većina zarobljenih čestica može ukloniti iz mukoznog tkiva u roku od nekoliko sekundi ili u roku od nekoliko sati. Velike polimerne nanočestice (200 nm-500 nm u prečniku) koje su gusto obložene polietilen glikolom (PEG) male molekulske težine difunduju kroz mukus samo 4 do 6 puta sporije od istih čestica koje difunduju u vodi (Lai et al. PNAS 2007104 (5): 1482-487; Lai et al. Adv Drug Deliv Rev. 200961(2): 158-171). Transport nanočestica se može odrediti upotrebom stopa permeacije i/ili tehnika fluorescentne mikroskopije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oporavak fluorescencije nakon fotobeljenja (FRAP) i praćenje više čestica visokom rezolucijom (MPT). Kao neograničavajući primer, kompozicije

1 2

koje mogu da penetriraju kroz mukoznu barijeru mogu se napraviti kao što je opisano u S.A.D pat. br.8,241,670 ili Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013110028.

[0431] Lipidna nanočestica koja je projektovana da penetrira kroz mukus može sadržati polimerni materijal (tj. polimerno jezgro) i/ili polimer-vitamin konjugat i/ili triblok kopolimer. Polimerni materijal može uključivati, ali nije ograničen na, poliamine, polietre, poliamide, poliestere, polikarbamate, poliuree, polikarbonate, poli(stirene), poliimide, polisulfone, poliuretane, poliacetilene, polietilene, polietilenimine, poliizocijanate, poliakrilate, polimetakrilate, poliakrilonitrile, i poliarilate. Polimerni materijal može biti biodegradabilan i/ili biokompatibilan. Neograničavajući primeri biokompatibilnih polimera opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013116804. Polimerni materijal se može dodatno ozračiti. Kao neograničavajući primer, polimerni materijal može biti gama ozračen (videti npr. Međunarodnu prij. br. WO201282165). Neograničavajući primeri specifičnih polimera uključuju poli(kaprolakton) (PCL), etilen vinil acetat polimer (EVA), poli(mlečnu kiselinu) (PLA), poli(L-mlečnu kiselinu) (PLLA), poli(glikolnu kiselinu) (PGA), poli(mlečnu kiselinu-koglikolnu kiselinu) (PLGA), poli(L-mlečnu kiselinu-ko-glikolnu kiselinu) (PLLGA), poli(D,L-laktid) (PDLA), poli(L-laktid) (PLLA), poli(D,L-laktid-ko-kaprolakton), poli(D,L-laktideko-kaprolakton-ko-glikolid), poli(D,L-laktid-ko-PEO-ko-D,L-laktid), poli(D,L-laktid-ko-PPO-ko-D,L-laktid), polialkil cijanoakralat, poliuretan, poli-L-lizin (PLL), hidroksipropil metakrilat (HPMA), polietilenglikol, poli-L-glutaminsku kiselinu, poli(hidroksi kiseline), polianhidride, poliortoestre, poli(estarske amide), poliamide, poli(estarske etre), polikarbonate, polialkilene kao što su polietilen i polipropilen, polialkilen glikole kao što je poli(etilen glikol) (PEG), polialkilen okside (PEO), polialkilen tereftalate kao što su poli(etilen tereftalat), polivinil alkohole (PVA), polivinil etre, polivinil estre kao što je poli(vinil acetat), polivinil halide kao što je poli(vinil hlorid) (PVC), polivinilpirolidon, polisiloksane, polistiren (PS), poliuretane, derivatizovane celuloze kao što su alkil celuloze, hidroksialkil celuloze, etri celuloze, estri celuloze, nitro celuloze, hidroksipropilceluloze, karboksimetilceluloze, polimere akrilnih kiselina, kao što su poli(metil(met)akrilat) (PMMA), poli(etil(met)akrilat), poli(butil(met)akrilat), poli(izobutil(met)akrilat), poli(heksil(met)akrilat), poli(izodecil(met)akrilat), poli(lauril(met)akrilat), poli(fenil(met)akrilat), poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), poli(izobutil akrilat), poli(oktadecil akrilat) i njihove kopolimere i smeše, polidioksanon i njegove kopolimere, polihidroksialkanoate, polipropilen fumarat, polioksimetilen, poloksamere, poli(orto)estre, poli(buternu

1

kiselinu), poli(valerinsku kiselinu), poli(laktid-ko-kaprolakton), PEG-PLGA-PEG i trimetilen karbonat, polivinilpirolidon. Lipidna nanočestica može biti obložena ili asocirana sa kopolimerom kao što je, ali ne ograničavajući se na, blok kopolimer (kao što je razgranati polietar-poliamid blok kopolimer koji je opisan u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013012476), i (poli(etilen glikol))-(poli(propilen oksid))-(poli(etilen glikol)) triblok kopolimer (videti npr. S.A.D. publikaciju 20120121718 i S.A.D. publikaciju 20100003337 i S.A.D. patent br. br. 8,263,665). Kopolimer može biti polimer koji se generalno smatra bezbednim (GRAS) i formiranje lipidnih nanočestica može biti na takav način da se ne stvaraju novi hemijski entiteti. Na primer, lipidne nanočestice mogu sadržati poloksamere koji oblažu PLGA nanočestice bez formiranja novih hemijskih entiteta koje i dalje mogu da brzo penetriraju kroz humani mukus (Yang et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011 50:2597-2600). Neograničavajući skalabilni postupak proizvodnje nanočestica koje mogu penetrirati kroz humani mukus opisali su Xu et al (videti npr. J Control Release 2013, 170(2):279-86).

[0432] Vitamin polimer-vitamin konjugata može biti vitamin E. Vitaminski deo konjugata može biti supstituisan sa drugim pogodnim komponentama kao što su, ali ne ograničavajući se na, vitamin A, vitamin E, druge vitamine, holesterol, hidrofobnu funkcionalnu grupu, ili hidrofobnu komponentu drugih surfaktanata (npr. lanci sterola, masne kiseline, lanci ugljovodonika i lanci alkilen oksida).

[0433] Lipidna nanočestica koja je projektovana da penetrira kroz mukus može uključivati agense za promenu površine kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide, anjonske proteine (npr. goveđi albumin seruma), surfaktante (npr. katjonski surfaktanti kao što je na primer dimetildioktadecilamonijum bromid), šećere ili derivate šećera (npr. ciklodekstrin), nukleinske kiseline, polimere (npr. heparin, polietilen glikol i poloksamer), mukolitičke agense (N-acetilcistein, pelin, bromelain, papain, klerodendrum, acetilcistein, bromheksin, karbocistein, eprazinon, mesna, ambroksol, sobrerol, domiodol, letostein, stepronin, tiopronin, gelsolin, timozin β4 dornaza alfa, nelteneksin, erdostein) i razne DNaze uključujući rhDNazu. Agens za promenu površine može biti uklopljen ili upleten u površinu čestice ili raspoređen (npr. oblaganjem, adsorpcijom, kovalentnim povezivanjem, ili drugim procesom) na površini lipidne nanočestice (videti npr. S.A.D. publikaciju 20100215580 i S.A.D. publikacije 20080166414 i US20130164343).

[0434] U jednom aspektu, lipidne nanočestice koje penetriraju kroz mukus sadrže najmanje jedan polinukleotid koji je ovde opisan. Polinukleotid može biti inkapsuliran

1 4

u lipidnoj nanočestici i/ili raspoređen na površini čestice. Polinukleotid se može kovalentno kuplovati za lipidnu nanočesticu. Formulacije lipidnih nanočestica koje penetriraju kroz mukus mogu sadržati veći broj nanočestica. Dodatno, formulacije mogu sadržati čestice koje mogu da interaguju sa mukusom i izmene strukturna i/ili adhezivna svojstva okolnog mukusa kako bi se smanjila mukoadhezija što može povećati isporuku lipidnih nanočestica koje penetriraju kroz mukus do mukoznog tkiva.

[0435] U sledećem aspektu, lipidne nanočestice koje penetriraju kroz mukus su hipotonična formulacija koja sadrži oblogu koja poboljšava penetraciju kroz mukus. Formulacija može biti hipotonična za epitel u koji se isporučuje. Neograničavajući primeri hipotoničnih formulacija mogu se pronaći u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013110028.

[0436] U jednom aspektu, u cilju poboljšanja isporuke kroz mukoznu barijeru, polinukleotidna formulacija sadrži ili je hipotonični rastvor. Pronađeno je da hipotonični rastvori povećavaju stopu kojom su mukoinertne čestice, kao što su, ali ne ograničavajući se na, čestice koje penetriraju kroz mukus, uspele da stignu do površine vaginalnog epitela (videti npr. Ensign et al. Biomaterials 201334(28):6922-9).

[0437] U jednom aspektu, polinukleotid se formuliše kao lipopleks, kao što su, bez ograničenja, ATUPLEXTM sistem, DACC sistem, DBTC sistem i druga siRNA-lipopleks tehnologija iz Silence Therapeutics (London, Ujedinjeno Kraljevstvo), STEMFECTTM iz STEMGENT<®>(Cambridge, MA), i polietilenimin (PEI) ili ciljana i neciljana isporuka nukleinskih kiselina na bazi protamina (Aleku et al. Cancer Res.

2008 68:9788-9798; Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Santel et al., Gene Ther 200613:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 200613:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293; Weide et al. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide et al. J Immunother. 2008 31:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther.

4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 6; 104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132).

[0438] U jednom aspektu takve formulacije se takođe konstruišu ili kompozicije menjaju tako da se pasivno ili aktivno usmeravaju na različite tipove ćelija in vivo, uključujući, ali ne ograničavajući se na hepatocite, imunske ćelije, tumorske ćelije,

1

endotelske ćelije, antigen prezentujuće ćelije i leukocite (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Judge et al., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann et al., Microvasc Res 201080:286-293; Santel et al., Gene Ther 200613:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 200613:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Basha et al., Mol. Ther.2011 19:2186-2200; Fenske i Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:25-44; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer i Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133). Jedan primer pasivnog ciljnog delovanja formulacija na ćelije jetre uključuje formulacije lipidnih nanočestica na bazi DLin-DMA, DLin-KC2-DMA i DLin-MC3-DMA za koje je pokazano da se vezuju za apolipoprotein E i promovišu vezivanje i unos ovih formulacija u hepatocite in vivo (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364). Formulacije se takođe mogu selektivno ciljati kroz ekspresiju različitih liganada na njihovoj površini, kao što je prikazano putem primera, ali nije ograničeno na, folat, transferin, N-acetilgalaktozamin (GalNAc), i pristupima ciljanjem antitelima (Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol. 20118:197-206; Musacchio i Torchilin, Front Biosci.

2011 16:1388-1412; Yu et al., Mol Membr Biol.2010 27:286-298; Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309-319; Akinc et al., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan et al., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012757:497-507; Peer 2010 J Control Release.

20:63-68; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:4095-4100; Kim et al., Methods Mol Biol. 2011721:339-353; Subramanya et al., Mol Ther. 201018:2028-2037; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer i Lieberman, Gene Ther.2011 18:1127-1133).

[0439] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz objave formulišu se kao čvrsta lipidna nanočestica. Čvrsta lipidna nanočestica (SLN) može biti sferična sa prosečnim prečnikom između 10 i 1000 nm. SLN poseduje čvrsti matriks lipidnog jezgra koji može da solubilizuje lipofilne molekule i može se stabilizovati sa surfaktantima i/ili emulgatorima. U dodatnom aspektu, lipidna nanočestica može biti samoasemblirajuća lipid-polimer nanočestica (videti Zhang et al., ACS Nano, 2008, 2 (8), pp. 1696-1702). Kao neograničavajući primer, SLN može biti SLN koja je opisana u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013105101. Kao sledeći neograničavajući primer, SLN se može napraviti

1

postupcima ili procesima koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013105101.

[0440] Lipozomi, lipopleksi, ili lipidne nanočestice mogu se upotrebljavati za poboljšanje efikasnosti polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pošto ove formulacije mogu da povećaju ćelijsku transfekciju polinukleotidima; i/ili povećaju translaciju kodiranog OX40L. Jedan takav primer uključuje upotrebu lipidne inkapsulacije kako bi se omogućila efikasna sistemska isporuka polipleks plazmidne DNK (Heyes et al., Mol Ther. 2007 15:713-720). Lipozomi, lipopleksi, ili lipidne nanočestice takođe se mogu upotrebljavati za povećanje stabilnosti polinukleotida.

[0441] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave formulišu se za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku. Kao što se ovde upotrebljava, "kontrolisano oslobađanje" označava profil oslobađanja farmaceutske kompozicije ili jedinjenja koji je u skladu sa određenim obrascem oslobađanja kako bi se postigao terapijski ishod. U jednom aspektu, polinukleotidi su inkapsulirani u agens za isporuku koji je ovde opisan i/ili poznat u struci za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku. Kao što se ovde upotrebljava, termin "inkapsulirati" znači zatvoriti, okružiti ili obložiti. Kako se odnosi na formulaciju jedinjenja iz objave, inkapsulacija može biti suštinska, kompletna ili delimična. Termin "suštinski inkapsuliran" znači da najmanje više od 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 ili više od 99,999% farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave može biti zatvoreno, okruženo ili obloženo unutar agensa za isporuku. "Delimična inkapsulacija" znači da manje od 10, 10, 20, 30, 40 50 ili manje farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave može biti zatvoreno, okruženo ili obloženo unutar agensa za isporuku. Povoljno, inkapsulacija se može odrediti merenjem evakuacije ili aktivnosti farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave upotrebom fluorescentne i/ili elektronske mikrografije. Na primer, najmanje 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ili više od 99,99% farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave inkapsulirano je u agensu za isporuku.

[0442] U jednom aspektu, formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem uključuje, ali nije ograničena na, tri-blok kopolimere. Kao neograničavajući primer, formulacija uključuje dva različita tipa tri-blok kopolimera (Međunarodna publ. br. WO2012131104 i WO2012131106).

1

[0443] U sledećem aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid inkapsulirani su u lipidnu nanočesticu ili lipidnu nanočesticu koja se brzo eliminiše, i lipidne nanočestice ili lipidne nanočestice koje se brzo eliminišu mogu se zatim inkapsulirati u polimer, hidrogel i/ili hirurški zaptivač koji je ovde opisan i/ili poznat u struci. Kao neograničavajući primer, polimer, hidrogel ili hirurški zaptivač je PLGA, etilen vinil acetat (EVAc), poloksamer, GELSITE<®>(Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX<®>(Halozyme Therapeutics, San Diego, CA), hirurški zaptivači kao što su fibrinogen polimeri (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL), zaptivači na bazi PEG, ili COSEAL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL).

[0444] U sledećem aspektu, lipidna nanočestica je inkapsulirana u bilo koji polimer koji je poznat u struci koji može da formira gel kada se injektira u subjekta. Kao sledeći neograničavajući primer, lipidna nanočestica je inkapsulirana u polimerni matriks koji može biti biodegradabilan.

[0445] U jednom aspektu, formulacija polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptida za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku takođe uključuje najmanje jednu oblogu za kontrolisano oslobađanje. Obloge za kontrolisano oslobađanje uključuju, ali nisu ograničene na, OPADRY<®>, polivinilpirolidon/vinil acetat kopolimer, polivinilpirolidon, hidroksipropil metilcelulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksietil celulozu, EUDRAGIT RL<®>, EUDRAGIT RS<®>i derivate celuloze kao što su vodene disperzije etilceluloze (AQUACOAT<®>i SURELEASE<®>).

[0446] U jednom aspektu, formulacija polinukleotida sa kontrolisanim oslobađanjem i/ili ciljanom isporukom sadrži najmanje jedan degradabilni poliestar koji može sadržati polikatjonske bočne lance. Degradabilni poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove kombinacije. U sledećem aspektu, degradabilni poliestri mogu uključivati PEG konjugaciju kako bi se formirao PEGilovan polimer.

[0447] U jednom aspektu, formulacija polinukleotida sa kontrolisanim oslobađanjem i/ili ciljanom isporukom koja sadrži najmanje jedan polinukleotid sadrži najmanje jedan derivat PEG i/ili PEG srodan polimer kao što je opisano u S.A.D. patentu br.

8,404,222.

[0448] U sledećem aspektu, formulacija polinukleotida sa kontrolisanim oslobađanjem koja sadrži najmanje jedan polinukleotid je sistem polimera sa kontrolisanim oslobađanjem koji je opisan u US20130130348.

1

[0449] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave inkapsuliran je u terapijskoj nanočestici. Terapijske nanočestice mogu biti formulisane postupcima koji su ovde opisani i poznati u struci, kao što su, ali ne ograničavajući se na, Međunarodne publikacije br. WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, S.A.D. publikacije br. US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20130123351 i US20130230567 i S.A.D. patente br. 8,206,747, 8,293,276, 8,318,208 i 8,318,211. U sledećem aspektu, terapijske polimerne nanočestice se mogu identifikovati postupcima koji su opisani u S.A.D. publ. br. US20120140790.

[0450] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se za produženo oslobađanje. Kao što se ovde upotrebljava, "produženo oslobađanje" označava farmaceutsku kompoziciju ili jedinjenje koje je u skladu sa stopom oslobađanja tokom specifičnog vremenskog perioda. Vremenski period može uključivati, ali nije ograničen na, sate, dane, nedelje, mesece i godine. Kao neograničavajući primer, nanočestica sa produženim oslobađanjem sadrži polimer i terapijski agens kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave (videti Međunarodnu publ. br. 2010075072 i S.A.D. publikacije br. US20100216804, US20110217377 i US20120201859). U sledećem neograničavajućem primeru, formulacija sa produženim oslobađanjem sadrži agense koji dozvoljavaju perzistentnu bioraspoloživost, kao što su, ali ne ograničavajući se na, kristale, makromolekulske gelove i/ili suspenzije čestica (videti S.A.D. patentnu publikaciju br. US20130150295).

[0451] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati tako da budu specifični za cilj. Kao neograničavajući primeri, terapijske nanočestice uključuju kortikosteroid (videti Međunarodnu publ. br. WO2011084518). Kao neograničavajući primer, terapijske nanočestice formulišu se u nanočesticama koje su opisane u Međunarodnim publikacijama br. WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 i S.A.D. publikacijama br. US20100069426, US20120004293 i US20100104655.

[0452] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave sadrže polimerni matriks. Kao neograničavajući primer, nanočestica sadrži dva ili više polimera kao što su, ali ne ograničavajući se na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksi kiseline,

1

polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, polilizine, poli(etilen imine), poli(serin estre), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije.

[0453] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži diblok kopolimer. U jednom aspektu, diblok kopolimer uključuje PEG u kombinaciji sa polimerom kao što su, ali ne ograničavajući se na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksi kiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, polilizin, poli(etilen imin), poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije. U još jednom aspektu, diblok kopolimer je visoki-X diblok kopolimer, kao što su oni koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013120052.

[0454] Kao neograničavajući primer terapijska nanočestica sadrži PLGA-PEG blok kopolimer (videti S.A.D. publ. br. US20120004293 i S.A.D. pat. br. 8,236,330). U sledećem neograničavajućem primeru, terapijska nanočestica je stelt nanočestica koja sadrži diblok kopolimer PEG i PLA ili PEG i PLGA (videti S.A.D. pat. br.

8,246,968 i Međunarodnu publikaciju br. WO2012166923). U još jednom neograničavajućem primeru, terapijska nanočestica je stelt nanočestica ili stelt nanočestica specifična za cilj kao što je opisano u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130172406.

[0455] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži multiblok kopolimer (videti, npr. S.A.D. patente br. 8,263,665 i 8,287,910 i S.A.D. patentnu publ. br. US20130195987).

[0456] U još jednom neograničavajućem primeru, lipidna nanočestica sadrži blok kopolimer PEG-PLGA-PEG (videti npr. termosenzitivni hidrogel (PEG-PLGA-PEG) je upotrebljen kao vehikulum za isporuku TGF-beta1 gena u Lee et al. Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-β1 Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing. Pharmaceutical Research, 2003 20(12): 1995-2000; kao kontrolisani sistem za isporuku gena u Li et al., Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel. Pharmaceutical Research 200320(6):884-888; i Chang et al., Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer

1

enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle. J Controlled Release. 2007 118:245-253). Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave mogu se formulisati u lipidnim nanočesticama koje sadrže PEG-PLGA-PEG blok kopolimer.

[0457] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži multiblok kopolimer (videti, npr. S.A.D. patente br. 8,263,665 i 8,287,910 i S.A.D. patentnu publ. br. US20130195987).

[0458] U jednom aspektu, blok kopolimeri koji su ovde opisani uključeni su u polijonski kompleks koji sadrži nepolimernu micelu i blok kopolimer (videti npr. S.A.D. publ. br.20120076836).

[0459] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži najmanje jedan akrilni polimer. Akrilni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na, akrilnu kiselinu, metakrilnu kiselinu, kopolimere akrilne kiseline i metakrilne kiseline, kopolimere metil metakrilata, etoksietil metakrilate, cijanoetil metakrilat, amino alkil metakrilat kopolimer, poli(akrilnu kiselinu), poli(metakrilnu kiselinu), policijanoakrilate i njihove kombinacije.

[0460] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan poli(vinil estar) polimer. Poli(vinil estar) polimer može biti kopolimer kao što je nasumični kopolimer. Kao neograničavajući primer, nasumični kopolimer ima strukturu kao što je ona koja je opisana u Međunarodnoj prijavi br. WO2013032829 ili S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130121954. U jednom aspektu, poli(vinil estar) polimeri mogu biti konjugovani za polinukleotide koji su ovde opisani.

[0461] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži najmanje jedan diblok kopolimer. Diblok kopolimer može biti, ali nije ograničen na, poli(mlečna) kiselina poli(etilen)glikol kopolimer (videti npr. Međunarodnu patentnu publikaciju br. WO2013044219). Kao neograničavajući primer, terapijske nanočestice se upotrebljavaju za lečenje kancera (videti Međunarodnu publikaciju br. WO2013044219).

[0462] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan katjonski polimer koji je ovde opisan i/ili je poznat u struci.

[0463] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan polimer koji sadrži amin kao što su, ali nisu ograničeni na polilizin, polietilen imin, poli(amidoamin) dendrimere, poli(beta-amino estre) (videti npr. S.A.D. pat. br. 8,287,849) i njihove kombinacije.

1 1

[0464] U sledećem aspektu, nanočestice koje su ovde opisane sadrže amin katjonski lipid kao što su oni koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO2013059496. U jednom aspektu katjonski lipidi imaju amino-aminsku ili aminoamidnu funkcionalnu grupu.

[0465] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan degradabilni poliestar koji može sadržati polikatjonske bočne lance. Degradabilni poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove kombinacije. U sledećem aspektu, degradabilni poliesteri mogu uključivati PEG konjugaciju kako bi se formirao PEGilovan polimer.

[0466] U sledećem aspektu, terapijska nanočestica uključuje konjugaciju najmanje jednog liganda koji ciljano deluje. Ligand koji ciljno deluje može biti bilo koji ligand poznat u struci, kao što je, ali nije ograničeno na, monoklonalno antitelo (Kirpotin et al, Cancer Res.2006 66:6732-6740).

[0467] U jednom aspektu, terapijska nanočestica se formuliše u vodenom rastvoru koji se može upotrebljavati za ciljanje kancera (videti Međunarodnu publ. br. WO2011084513 i S.A.D. publ. br. US20110294717).

[0468] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se upotrebom postupaka koje su opisali Podobinski et al u S.A.D. patentu br.8,404,799.

[0469] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid su inkapsulirani, povezani sa i/ili asocirani sa sintetičkim nanonosačima. Sintetički nanonosači uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2010005740, WO2010030763, WO201213501, WO2012149252, WO2012149255, WO2012149259, WO2012149265, WO2012149268, WO2012149282, WO2012149301, WO2012149393, WO2012149405, WO2012149411, WO2012149454 i WO2013019669, u S.A.D. publikacijama br. US20110262491, US20100104645, US20100087337 i US20120244222. Sintetički nanonosači mogu se formulisati upotrebom postupaka koji su poznati u struci i/ili koji su ovde opisani. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači mogu se formulisati postupcima koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2010005740, WO2010030763 i WO201213501 i S.A.D. publikacijama br. US20110262491, US20100104645, US20100087337 i US2012024422. U sledećem aspektu, formulacije sintetičkih nanonosača mogu se liofilizovati postupcima koji su opisani u Međunarodnoj publ. br. WO2011072218 i

1 2

S.A.D. pat. br. 8,211,473. U još jednom aspektu, formulacije iz predmetne objave, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sintetičke nanonosače, mogu se liofilizovati ili rekonstituisati postupcima koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130230568.

[0470] U jednom aspektu, sintetički nanonosači sadrže reaktivne grupe za oslobađanje polinukleotida koji su ovde opisani (videti Međunarodnu publ. br. WO20120952552 i S.A.D. publ. br. US20120171229).

[0471] U jednom aspektu, sintetički nanonosači sadrže imunostimulatorni agens za poboljšanje imunskog odgovora od isporuke sintetičkog nanonosača. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosač može sadržati Th1 imunostimulatorni agens koji može poboljšati odgovor imunskog sistema zasnovan na Th1 (videti Međunarodnu publ. br. WO2010123569 i S.A.D. publ. br. US20110223201).

[0472] U jednom aspektu, sintetički nanonosači formulišu se za ciljano oslobađanje. U jednom aspektu, sintetički nanonosač formuliše se da oslobađa polinukleotide pri specifičnom pH i/ili posle željenog vremenskog intervala. Kao neograničavajući primer, sintetička nanočestica se formuliše tako da oslobađa polinukleotide posle 24 sata i/ili pri pH od 4,5 (videti Međunarodne publikacije br. WO2010138193 i WO2010138194 i S.A.D. publikacije br. US20110020388 i US20110027217).

[0473] U jednom aspektu, sintetički nanonosači formulišu se za kontrolisano i/ili produženo oslobađanje polinukleotida koji su ovde opisani. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači za produženo oslobađanje formulišu se postupcima koji su poznati u struci, koji su ovde opisani i/ili kao što je opisano u Međunarodnoj publ. br. WO2010138192 i S.A.D. publ. br.20100303850.

[0474] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se za kontrolisano i/ili produženo oslobađanje pri čemu formulacija sadrži najmanje jedan polimer koji je polimer kristalnog bočnog lanca (CYSC). CYSC polimeri su opisani u S.A.D. patentu br.8,399,007.

[0475] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid su inkapsulirani u, povezani za i/ili asocirani sa cviterjonskim lipidima. Neograničavajući primeri cviterjonskih lipida i postupci upotrebe cviterjonskih lipida opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130216607. U jednom aspektu, cviterjonski lipidi se mogu upotrebljavati u lipozomima i lipidnim nanočesticama koje su ovde opisane.

1

[0476] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u koloidnim nanonosačima kao što je opisano u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130197100.

[0477] U jednom aspektu, nanočestica je optimizovana za oralnu primenu. Nanočestica može sadržati najmanje jedan katjonski biopolimer kao što je, ali ne ograničavajući se na, hitozan ili njegov derivat. Kao neograničavajući primer, nanočestica se može formulisati postupcima koji su opisani u S.A.D. publ. br.

20120282343.

[0478] U nekim aspektima, LNP sadrže lipid KL52 (amino-lipid koji je objavljen u S.A.D. prijavnoj publikaciji br. 2012/0295832). Aktivnost i/ili bezbednost (izmerena ispitivanjem jednog ili više od ALT/AST, broja belih krvnih zrnaca i indukcije citokina) primene LNP mogu se poboljšati inkorporacijom takvih lipida. LNP koje sadrže KL52 mogu se primenjivati intravenski i/ili u jednoj ili više doza. U nekim aspektima, primena LNP koje sadrže KL52 rezultuje jednakom ili poboljšanom ekspresijom iRNK i/ili proteina u poređenju sa LNP koje sadrže MC3.

[0479] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid isporučuju se upotrebom manjih LNP. Takve čestice mogu sadržati prečnik od ispod 0,1 um sve do 100 nm kao što je, ali nije ograničeno na, manji od 0,1 um, manji od 1,0 um, manji od 5 um, manji od 10 um, manji od 15 um, manji od 20 um, manji od 25 um, manji od 30 um, manji od 35 um, manji od 40 um, manji od 50 um, manji od 55 um, manji od 60 um, manji od 65 um, manji od 70 um, manji od 75 um, manji od 80 um, manji od 85 um, manji od 90 um, manji od 95 um, manji od 100 um, manji od 125 um, manji od 150 um, manji od 175 um, manji od 200 um, manji od 225 um, manji od 250 um, manji od 275 um, manji od 300 um, manji od 325 um, manji od 350 um, manji od 375 um, manji od 400 um, manji od 425 um, manji od 450 um, manji od 475 um, manji od 500 um, manji od 525 um, manji od 550 um, manji od 575 um, manji od 600 um, manji od 625 um, manji od 650 um, manji od 675 um, manji od 700 um, manji od 725 um, manji od 750 um, manji od 775 um, manji od 800 um, manji od 825 um, manji od 850 um, manji od 875 um, manji od 900 um, manji od 925 um, manji od 950 um, ili manji od 975 um.

[0480] U sledećem aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid isporučuju se upotrebom manjih LNP koje mogu sadržati prečnik od oko 1 nm do oko 100 nm, od oko 1 nm do oko 10 nm, oko 1 nm do oko 20 nm, od oko 1 nm do oko 30 nm, od oko 1 nm do oko 40 nm, od oko 1 nm do oko 50 nm, od oko 1 nm

1 4

do oko 60 nm, od oko 1 nm do oko 70 nm, od oko 1 nm do oko 80 nm, od oko 1 nm do oko 90 nm, od oko 5 nm do oko 100 nm, od oko 5 nm do oko 10 nm, oko 5 nm do oko 20 nm, od oko 5 nm do oko 30 nm, od oko 5 nm do oko 40 nm, od oko 5 nm do oko 50 nm, od oko 5 nm do oko 60 nm, od oko 5 nm do oko 70 nm, od oko 5 nm do oko 80 nm, od oko 5 nm do oko 90 nm, oko 10 do oko 50 nM, od oko 20 do oko 50 nm, od oko 30 do oko 50 nm, od oko 40 do oko 50 nm, od oko 20 do oko 60 nm, od oko 30 do oko 60 nm, od oko 40 do oko 60 nm, od oko 20 do oko 70 nm, od oko 30 do oko 70 nm, od oko 40 do oko 70 nm, od oko 50 do oko 70 nm, od oko 60 do oko 70 nm, od oko 20 do oko 80 nm, od oko 30 do oko 80 nm, od oko 40 do oko 80 nm, od oko 50 do oko 80 nm, od oko 60 do oko 80 nm, od oko 20 do oko 90 nm, od oko 30 do oko 90 nm, od oko 40 do oko 90 nm, od oko 50 do oko 90 nm, od oko 60 do oko 90 nm i/ili od oko 70 do oko 90 nm.

[0481] U nekim aspektima, takve LNP se sintetišu upotrebom postupaka koji sadrže mikrofluidne miksere. Primeri mikrofluidnih miksera mogu uključivati, ali nisu ograničeni na interdigitalni mikromikser sa prorezom, uključujući, ali ne ograničavajući se na one koje proizvodi Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austrija) i/ili mikromikser sa raspoređivanjem u obliku riblje kosti (SHM) (Zhigaltsev, I.V. et al., Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing publikovano je u Langmuir. 2012. 28:3633-40; Belliveau, N.M. et al., Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2012. 1:e37; Chen, D. et al., Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. J Am Chem Soc. 2012. 134(16):6948-51). U nekim aspektima, postupci generisanja LNP koji sadrže SHM, dodatno sadrže mešanje najmanje dva ulazna toka pri čemu se mešanje događa haotičnom advekcijom izazvanom mikrostrukturom (MICA). U skladu sa ovim postupkom, tokovi tečnosti teku kroz kanale prisutne u obliku riblje kosti izazivajući rotacioni tok i savijanje fluida jednog oko drugog. Ovaj postupak takođe može sadržati površinu za mešanje tečnosti pri čemu površina menja orijentaciju tokom kruženja tečnosti. Postupci generisanja LNP upotrebom SHM uključuju one koji su objavljeni u S.A.D. prijavnim publikacijama br. 2004/0262223 i 2012/0276209.

[0482] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave formulišu se u lipidnim nanočesticama kreiranim

1

upotrebom mikromiksera kao što je, ali ne ograničavajući se na, interdigitalni mikrostrukturirani mikser sa prorezom (SIMM-V2) ili standardni interdigitalni mikro mikser sa prorezom (SSIMM) ili Caterpillar (CPMM) ili Impinging-jet (IJMM) od Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Majnz, Nemačka).

[0483] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave formulišu se u lipidnim nanočesticama koje su kreirane upotrebom mikrofluidne tehnologije (videti Whitesides, George M. The Origins and the Future of Microfluidics. Nature, 2006442: 368-373; i Abraham et al. Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002295: 647-651). Kao neograničavajući primer, kontrolisana mikrofluidna formulacija uključuje pasivni postupak za mešanje tokova vođenih stabilnim pritiskom u mikro kanalima na niskom Rejnoldsovom broju (videti npr. Abraham et al. Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002295: 647-651).

[0484] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u lipidnim nanočesticama kreiranim upotrebom mikromikser čipa kao što su, ali ne ograničavajući se na, one iz Harvard Apparatus (Holliston, MA) ili Dolomite Microfluidics (Royston, UK). Mikromikser čip se može upotrebljavati za brzo mešanje dva ili više tokova fluida sa podeli i rekombinuj mehanizmom.

[0485] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se za isporuku upotrebom mikrosfera koje inkapsuliraju lek koje su opisane u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013063468 ili S.A.D. patentu br. 8,440,614. Mikrosfere mogu sadržati jedinjenje formule (I), (II), (III), (IV), (V) ili (VI) kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013063468. U sledećem aspektu, amino-kiselina, peptid, polipeptid, lipidi (APPL) su korisni za isporuku polinukleotida iz objave u ćelije (videti Međunarodnu patentnu publikaciju br. WO2013063468).

[0486] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipidnim nanočesticama koje imaju prečnik od oko 10 od oko 100 nm kao što je, ali nije ograničen na, oko 10 od oko 20 nm, oko 10 od oko 30 nm, oko 10 od oko 40 nm, oko 10 od oko 50 nm, oko 10 od oko 60 nm, oko 10 od oko 70 nm, oko 10 od oko 80 nm, oko 10 od oko 90 nm, oko 20 od oko 30 nm, oko 20 od oko 40 nm, oko 20 od oko 50 nm, oko 20 od oko 60 nm, oko 20 od oko 70 nm, oko 20 od oko 80 nm, oko 20 od oko 90 nm, oko 20 od oko 100 nm, oko 30 od oko 40

1

nm, oko 30 od oko 50 nm, oko 30 od oko 60 nm, oko 30 od oko 70 nm, oko 30 od oko 80 nm, oko 30 od oko 90 nm, oko 30 od oko 100 nm, oko 40 od oko 50 nm, oko 40 od oko 60 nm, oko 40 od oko 70 nm, oko 40 od oko 80 nm, oko 40 od oko 90 nm, oko 40 od oko 100 nm, oko 50 od oko 60 nm, oko 50 od oko 70 nm, oko 50 od oko 80 nm, oko 50 od oko 90 nm, oko 50 od oko 100 nm, oko 60 od oko 70 nm, oko 60 od oko 80 nm, oko 60 od oko 90 nm, oko 60 od oko 100 nm, oko 70 od oko 80 nm, oko 70 od oko 90 nm, oko 70 od oko 100 nm, oko 80 od oko 90 nm, oko 80 od oko 100 nm i/ili oko 90 od oko 100 nm.

[0487] U jednom aspektu, lipidne nanočestice imaju prečnik od oko 10 do 500 nm. U jednom aspektu, lipidne nanočestice imaju prečnik veći od 100 nm, veći od 150 nm, veći od 200 nm, veći od 250 nm, veći od 300 nm, veći od 350 nm, veći od 400 nm, veći od 450 nm, veći od 500 nm, veći od 550 nm, veći od 600 nm, veći od 650 nm, veći od 700 nm, veći od 750 nm, veći od 800 nm, veći od 850 nm, veći od 900 nm, veći od 950 nm ili veći od 1000 nm.

[0488] U jednom aspektu, lipidna nanočestica je lipidna nanočestica granične veličine koja je opisana u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013059922. Lipidna nanočestica granične veličine može sadržati lipidni dvosloj koji okružuje vodeno jezgro ili hidrofobno jezgro; pri čemu lipidni dvosloj može sadržati fosfolipid kao što je, ali ne ograničavajući se na, diacilfosfatidilholin, diacilfosfatidiletanolamin, ceramid, sfingomijelin, dihidrosfingomijelin, cefalin, cerebrozid, diacilfofatidilholin C8-C20 masne kiseline, i 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilholin (POPC). U sledećem aspektu, lipidna nanočestica granične veličine može sadržati polietilen glikol-lipid kao što je, ali nije ograničen na, DLPE-PEG, DMPE-PEG, DPPC-PEG i DSPE-PEG.

[0489] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid se isporučuju, lokalizuju i/ili koncentrišu na specifičnoj lokaciji upotrebom postupaka isporuke koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013063530. Kao neograničavajući primer, subjektu se može primeniti prazna polimerna čestica pre, istovremeno sa ili posle primene polinukleotida subjektu. Prazna polimerna čestica podleže promeni zapremine kada je u kontaktu sa subjektom i postaje smeštena, uklopljena, imobilizovana ili zarobljena na specifičnoj lokaciji u subjektu.

[0490] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u sistemu za oslobađanje aktivne supstance (videti npr. S.A.D. patentnu publikaciju br. US20130102545). Sistem za oslobađanje aktivne

1

supstance može sadržati 1) najmanje jednu nanočesticu vezanu za lanac inhibitora oligonukleotida koji je hibridizovan sa katalitički aktivnom nukleinskom kiselinom i 2) jedinjenje vezano za najmanje jedan molekul supstrata koji je vezan za terapijski aktivnu supstancu (npr. polinukleotide koji su ovde opisani), gde se terapijski aktivna supstanca oslobađa isecanjem molekula supstrata katalitički aktivnom nukleinskom kiselinom.

[0491] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u nanočestici koja sadrži unutrašnje jezgro koje sadrži nećelijski materijal i spoljašnju površinu koja sadrži ćelijsku membranu. Ćelijska membrana može biti poreklom od ćelije ili membrana poreklom od virusa. Kao neograničavajući primer, nanočestica je napravljena postupcima koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052167. Kao sledeći neograničavajući primer, nanočestica koja je opisana u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052167 upotrebljava se za isporuku polinukleotida koji su ovde opisani.

[0492] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipidnim dvoslojevima podržanim poroznim nanočesticama (protoćelijama). Protoćelije su opisane u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013056132.

[0493] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji je ovde opisan formulišu se u polimernim nanočesticama kao što su one opisane u ili napravljene postupcima koji su opisani u S.A.D. patentima br.

8,420,123 i 8,518,963 i Evropskom patentu br. EP2073848B1. Kao neograničavajući primer, polimerna nanočestica ima visoku temperaturu staklastog prelaza kao što su nanočestice koje su opisane u ili nanočestice koje su napravljene postupcima koji su opisani u S.A.D. patentu br. 8,518,963. Kao sledeći neograničavajući primer, polimerna nanočestica za oralne i parenteralne formulacije napravljena je postupcima koji su opisani u Evropskom patentu br. EP2073848B1.

[0494] U sledećem aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji su ovde opisani formulišu se u nanočesticama koje se upotrebljavaju u snimanju. Nanočestice mogu biti nanočestice lipozoma kao što su one koje su opisane u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130129636. Kao neograničavajući primer, lipozom može sadržati gadolinijum(III)2-{4,7-bis-karboksimetil-10-[(N,N-distearilamidometil-N'-amido-metil]-1,4,7,10-tetra-azaciklododek-1-il}-sirćetnu kiselinu

1

i neutralnu, potpuno zasićenu fosfolipidnu komponentu (videti npr. S.A.D. patentnu publikaciju br. US20130129636).

[0495] U jednom aspektu, nanočestice koje se mogu upotrebljavati u predmetnoj objavi formiraju se postupcima koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavi br. US20130130348.

[0496] Nanočestice iz predmetne objave mogu dodatno da uključuju hranljive materije kao što su, ali ne ograničavajući se na, one čiji nedostaci mogu dovesti do opasnosti po zdravlje od anemije do defekata nervne cevi (videti npr. nanočestice koje su opisane u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013072929). Kao neograničavajući primer, hranljiva materija je gvožđe u obliku fero, feri soli ili elementarnog gvožđa, jod, folna kiselina, vitamin ili mikronutrijenati.

[0497] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u nanočestici koja može da bubri. Nanočestice koje mogu da bubre mogu biti, ali nisu ograničene na, one koje su opisane u S.A.D. patentu br.

8,440,231. Kao primer, nanočestica koja može da bubri upotrebljava se za isporuku polinukleotida iz predmetne objave u pulmonarni sistem (videti, npr. S.A.D. patent br.

8,440,231).

[0498] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u nanočesticama polianhidrida kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koji su opisani u S.A.D. patentu br.8,449,916.

[0499] Nanočestice i mikročestice iz predmetne objave mogu biti geometrijski projektovane da modulišu makrofage i/ili imunski odgovor. U jednom aspektu, geometrijski projektovane čestice mogu imati različite oblike, veličine i/ili površinska naelektrisanja kako bi se inkorporisali polinukleotidi iz predmetne objave za ciljanu isporuku kao što je, ali ne ograničavajući se na, pulmonarnu isporuku (videti npr. Međunarodnu publikaciju br. WO2013082111). Druga fizička svojstva koje geometrijski projektovane čestice mogu uključivati, ali nisu ograničene na, fenestracije, krake pod uglom, asimetriju i hrapavost površine, naelektrisanje koje može da promeni interakcije sa ćelijama i tkivima. Kao neograničavajući primer, nanočestice iz predmetne objave napravljene su postupcima koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013082111.

[0500] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave su nanočestice koje su solubilne u vodi, kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koje su opisane u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013090601. Nanočestice mogu biti neorganske

1

nanočestice koje imaju kompaktan i cviterjonski ligand kako bi pokazale dobru solubilnost u vodi. Nanočestice takođe mogu imati male hidrodinamičke prečnike (HD), stabilnost u odnosu na vreme, pH, i salinitet i nizak nivo vezivanja za nespecifične proteine.

[0501] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave razvijene su postupcima koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130172406.

[0502] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave su stelt nanočestice ili stelt nanočestice specifične za cilj, kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koje su opisane u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130172406. Nanočestice iz predmetne objave mogu biti napravljene postupcima koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130172406.

[0503] U sledećem aspektu, stelt ili stelt nanočestice specifične za cilj sadrže polimerni matriks. Polimerni matriks može sadržati dva ili više polimera kao što su, ali ne ograničavajući se na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksikiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, poliestre, polianhidride, polietre, poliuretane, polimetakrilate, poliakrilate, policijanoakrilate ili njihove kombinacije.

[0504] U jednom aspektu, nanočestica je hibridna struktura nanočestica-nukleinska kiselina koja ima sloj nukleinske kiseline visoke gustine. Kao neograničavajući primer, hibridna struktura nanočestica-nukleinska kiselina napravljena je postupcima koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130171646. Nanočestica može sadržati nukleinsku kiselinu kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide koji su ovde opisani i/ili koji su poznati u struci.

[0505] Najmanje jedna od nanočestica iz predmetne objave može biti uklopljena u jezgro nanostrukture ili obložena poroznom 3-D strukturom male gustine ili oblogom koja je sposobna da nosi ili se asocira sa najmanje jednim korisnim tovarom unutar ili na površini nanostrukture. Neograničavajući primeri nanostruktura koje sadrže najmanje jednu nanočesticu opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013123523.

Hijaluronidaza

1

[0506] Intramuskularna, intratumorska, ili subkutana lokalizovana injekcija polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid može uključivati hijaluronidazu, koja katalizuje hidrolizu hijaluronana. Katalizujući hidrolizu hijaluronana, sastojka intersticijumske barijere, hijaluronidaza snižava viskoznost hijaluronana, čime se povećava permeabilnost tkiva (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Korisno je ubrzati disperziju i sistemsku distribuciju kodiranih proteina koje proizvode transfektovane ćelije. Alternativno, hijaluronidaza se može upotrebljavati za povećanje broja ćelija koje su izložene polinukleotidu iz objave koji se primenjuje intramuskularno, intratumorski, ili subkutano.

Mimici nanočestica

[0507] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu biti inkapsulirani unutar i/ili apsorbovani u mimik nanočestica. Mimik nanočestica može da oponaša funkciju isporuke organizama ili čestica kao što su, ali ne ograničavajući se na, patogene, viruse, bakterije, gljivice, parazite, prione i ćelije. Kao neograničavajući primer, polinukleotidi iz objave mogu biti inkapsulirani u česticu bez viriona koja može da oponaša funkciju isporuke virusa (videti Međunarodnu publ. br. WO2012006376 i S.A.D. patentne publikacije br. US20130171241 i US20130195968).

Nanotube

[0508] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu biti prikačeni ili na drugi način vezani za najmanje jednu nanotubu kao što su, ali ne ograničavajući se na, rozeta nanotube, rozeta nanotube koje imaju dvostruke baze sa linkerom, ugljenične nanotube i/ili ugljenične nanotube sa jednim zidom. Polinukleotidi mogu biti vezani za nanotube preko sila kao što su, ali ne ograničavajući se na, sterične, jonske, kovalentne i/ili druge sile. Nanotube i formulacije nanotuba koje sadrže polinukleotide opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077.

Samoasemblirajuće nanočestice

1 1

[0509] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u samoasemblerajućim nanočesticama. Samoasemblirajuće nanočestice nukleinske kiseline opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077, kao što je u paragrafima [000740] - [000743]. Samoasemblerajuće nanočestice na bazi polimera opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077.

Samoasemblirajući makromolekuli

[0510] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u amfifilnim makromolekulima (AM) za isporuku. AM sadrže biokompatibilne amfifilne polimere koji imaju alkilovanu šećernu okosnicu kovalentno povezanu sa poli(etilen glikolom). U vodenom rastvoru, AM se samoasembliraju kako bi formirali micele. Neograničavajući primeri postupaka formiranja AM i AM opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130217753.

Neorganske nanočestice

[0511] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u neorganskim nanočesticama (S.A.D. pat. br. 8,257,745). Neorganske nanočestice mogu uključivati, ali nisu ograničene na, glinene supstance koje mogu da bubre u vodi. Kao neograničavajući primer, neorganske nanočestice uključuju sintetičke smektitne gline koje su napravljene od jednostavnih silikata (videti, npr. S.A.D. patente br.5,585,108 i 8,257,745).

[0512] U nekim aspektima, neorganske nanočestice sadrže jezgro polinukleotida koji se ovde objavljuju i polimerni omotač. Polimerni omotač može biti bilo koji od polimera koji su ovde opisani i koji su poznati u struci. U dopunskom aspektu, polimerni omotač se može upotrebljavati za zaštitu polinukleotida u jezgru.

Poluprovodne i metalne nanočestice

[0513] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u nanočestici koja se disperguje u vodi koja sadrži poluprovodni ili metalni materijal (S.A.D. publ. br. 20120228565) ili formirati u magnetnoj nanočestici (S.A.D.

1 2

publikacije br. 20120265001 i 20120283503). Nanočestice koje se disperguju u vodi mogu biti hidrofobne nanočestice ili hidrofilne nanočestice.

[0514] U nekim aspektima, poluprovodne i/ili metalne nanočestice mogu sadržati jezgro polinukleotida koji se ovde objavljuju i polimerni omotač. Polimerni omotač može biti bilo koji od polimera koji su ovde opisani i koji su poznati su u struci. U dopunskom aspektu, polimerni omotač se može upotrebljavati za zaštitu polinukleotida u jezgru.

Hirurški zaptivači: gelovi i hidrogelovi

[0515] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid inkapsulirani su u bilo koji hidrogel koji je poznat u struci koji formira gel kada se injektira u subjekta. Hirurški zaptivači kao što su gelovi i hidrogelovi opisani su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077.

Formulacije suspenzija

[0516] U nekim aspektima, opisane su formulacije suspenzija koje sadrže polinukleotide, depoe ulja koja se ne mešaju sa vodom, surfaktante i/ili kosurfaktante i/ili korastvarače. Kombinacije ulja i surfaktanata mogu omogućiti formulaciju suspenzije sa polinukleotidima. Isporuka polinukleotida u depou koji se ne meša sa vodom može se upotrebljavati za poboljšanje bioraspoloživosti kroz produženo oslobađanje iRNK iz depoa u okolnu fiziološku sredinu i sprečavanje degradacije polinukleotida nukleazama.

[0517] U nekim aspektima, formulacije suspenzija iRNK pripremaju se upotrebom kombinacija polinukleotida, rastvora na bazi ulja i surfaktanata. Takve formulacije mogu se pripremiti kao dvodelni sistem koji sadrži vodenu fazu koja sadrži polinukleotide i fazu na bazi ulja koja sadrži ulje i surfaktante. Primeri ulja za formulacije suspenzija mogu uključivati, ali nisu ograničeni na susamovo ulje i migliol (koji sadrže estre zasićenih kaprilne i kaprinske masne kiseline dobijenih iz kokosovih i palminih ulja i glicerina ili propilen glikola), kukuruzno ulje, sojino ulje, ulje kikirikija, pčelinji vosak i/ili ulje semena palme. Primeri surfaktanata mogu uključivati, ali nisu ograničeni na kremofor, polisorbat 20, polisorbat 80, polietilen glikol, transkutol, CAPMUL<®>, labrazol, izopropil miristat, i/ili span 80. U nekim aspektima, suspenzije

1

mogu sadržati korastvarače uključujući, ali ne ograničavajući se na etanol, glicerol i/ili propilen glikol.

[0518] Suspenzije se mogu formirati tako što se prvo priprema formulacija polinukleotida koja sadrži vodeni rastvor polinukleotida i fazu na bazi ulja koja sadrži jedan ili više surfaktanata. Formiranje suspenzije se događa kao rezultat mešanja dve faze (vodene i na bazi ulja). U nekim aspektima, takva suspenzija se može isporučiti u vodenu fazu kako bi se formirala emulzija ulje-u-vodi. U nekim aspektima, isporuka suspenzije u vodenu fazu rezultuje formiranjem emulzije ulje-u-vodi u kojoj faza na bazi ulja koja sadrži polinukleotide formira kapljice koje mogu biti u opsegu veličine od kapljica nanometarske veličine do kapljica mikrometarske veličine. U nekim aspektima, specifične kombinacije ulja, surfaktanata, kosurfaktanata i/ili korastvarača mogu da se koriste za suspendovanje polinukleotida u uljnoj fazi i/ili da se formiraju emulzije ulje-u-vodi nakon isporuke u vodenu sredinu.

[0519] U nekim aspektima, suspenzije obezbeđuju modulaciju oslobađanja polinukleotida u okolnu sredinu. U takvim aspektima, oslobađanje polinukleotida može biti modulisano difuzijom iz depoa koji se ne meša sa vodom, nakon čega sledi resolubilizacija u okolnu sredinu (npr. vodenu sredinu).

[0520] U nekim aspektima, polinukleotidi unutar depoa koji se ne meša sa vodom (npr. suspendovani unutar uljne faze) rezultuju izmenjenom stabilnošću polinukleotida (npr. izmenjena degradacija nukleazama).

[0521] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se tako da se nakon injektiranja spontano formira emulzija (npr. kada se isporuče u vodenu fazu). Takvo formiranje čestica može da obezbedi visok odnos površine prema zapremini za oslobađanje polinukleotida iz uljne faze u vodenu fazu.

[0522] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u nanoemulziji kao što su, ali ne ograničavajući se na, nanoemulzije koje su opisane u S.A.D. patentu br. 8,496,945. Nanoemulzije mogu sadržati nanočestice koje su ovde opisane. Kao neograničavajući primer, nanočestice mogu sadržati tečno hidrofobno jezgro koje može biti okruženo ili obloženo slojem lipida ili surfaktanta. Sloj lipida ili surfaktanta može sadržati najmanje jedan integralni peptid membrane i takođe može sadržati ciljno delujući ligand (videti npr. S.A.D. patent br.8,496,945).

1 4

Katjoni i anjoni

[0523] Formulacije polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu uključivati katjone ili anjone. U nekim aspektima, formulacije uključuju katjone metala kao što su, ali ne ograničavajući se na, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ i njihove kombinacije. Kao neograničavajući primer, formulacije uključuju polimere i polinukleotide u kompleksu sa metalnim katjonom (videti, npr. S.A.D. patente br.

6,265,389 i 6,555,525).

[0524] U nekim aspektima, katjonske nanočestice koje sadrže kombinacije dvovalentnih i monovalentnih katjona formulišu se sa polinukleotidima. Takve nanočestice mogu se spontano formirati u rastvoru tokom datog perioda (npr. sati, dana, itd.). Takve nanočestice se ne formiraju u prisustvu samo dvovalentnih katjona ili u prisustvu samo monovalentnih katjona. Isporuka polinukleotida u katjonskim nanočesticama ili u jednom ili više depoa koji sadrže katjonske nanočestice može poboljšati bioraspoloživost polinukleotida delujući kao dugodelujući depo i/ili smanjujući stopu degradacije nukleazama.

Oblikovane nanočestice i mikročestice

[0525] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u nanočesticama i/ili mikročesticama. Kao primer, nanočestice i/ili mikročestice mogu se napraviti upotrebom PRINT<®>tehnologije od LIQUIDA TECHNOLOGIES<®>(Morrisville, NC) (videti, npr. Međunarodnu publ. br. WO2007024323).

[0526] U nekim aspektima, nanočestice sadrže jezgro polinukleotida koji se ovde objavljuju i polimerni omotač. Polimerni omotač može biti bilo koji od polimera koji su ovde opisani i koji su poznati u struci. U dopunskom aspektu, polimerni omotač se može upotrebljavati za zaštitu polinukleotida u jezgru.

[0527] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u mikročesticama. Mikročestice mogu sadržati jezgro polinukleotida i korteks biokompatibilnog i/ili biodegradabilnog polimera. Kao neograničavajući primer, mikročestice koje se mogu upotrebljavati sa predmetnom objavom mogu biti one koje su opisane u S.A.D. patentu br. 8,460,709, S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130129830 i Međunarodnoj patentnoj publikaciji br.

1

WO2013075068. Kao sledeći neograničavajući primer, mikročestice se mogu dizajnirati da produže oslobađanje polinukleotida iz predmetne objave tokom željenog vremenskog perioda (videti npr. produženo oslobađanje terapijskog proteina u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130129830).

Nanojakne i nanolipozomi

[0528] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u nano jaknama (NanoJackets) i nanolipozomima od Keystone Nano (State College, PA). Nanojakne su napravljene od jedinjenja koja se prirodno nalaze u telu uključujući kalcijum, fosfat i takođe mogu uključivati malu količinu silikata. Nanojakne mogu biti veličine u opsegu od 5 do 50 nm i mogu se upotrebljavati za isporuku hidrofilnih i hidrofobnih jedinjenja kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide.

[0529] Nanolipozomi su napravljeni od lipida kao što su, ali ne ograničavajući se na, lipide koji se prirodno javljaju u telu. Nanolipozomi mogu biti veličine u opsegu od 60-80 nm i mogu se upotrebljavati za isporuku hidrofilnih i hidrofobnih jedinjenja kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide. U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u nanolipozomu kao što su, ali ne ograničavajući se na, ceramidne nanolipozome.

Minićelije

[0530] U jednom aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se formulisati u bakterijskim minićelijama. Kao neograničavajući primer, bakterijske minićelije su one koje su opisane u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013088250 ili S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130177499. Bakterijske minićelije koje sadrže terapijske agense kao što su polinukleotidi koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati za isporuku terapijskih agenasa do tumora mozga.

Polučvrste kompozicije

[0531] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se sa hidrofobnim matriksom tako da formiraju polučvrstu

1

kompoziciju. Kao neograničavajući primer, polučvrsta kompozicija ili kompozicija nalik pasti napravljena je postupcima koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO201307604. Polučvrsta kompozicija može biti formulacija sa produženim oslobađanjem kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO201307604.

[0532] U sledećem aspektu, polučvrsta kompozicija dodatno ima mikro-poroznu membranu ili biodegradabilni polimer formiran oko kompozicije (videti npr. Međunarodnu patentnu publikaciju br. WO201307604).

[0533] Polučvrsta kompozicija koja upotrebljava polinukleotide koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid može imati karakteristike polučvrste smeše kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO201307604 (npr. modul elastičnosti od najmanje 10<-4>N·mm<-2>, i/ili viskoznost od najmanje 100 mPa·s).

Egzozomi

[0534] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u egzozomima. Egzozomi mogu biti napunjeni sa najmanje jednim polinukleotidom i isporučeni u ćelije, tkiva i/ili organizme. Kao neograničavajući primer, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu biti napunjeni u egzozome koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013084000.

Isporuka na bazi svile

[0535] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u sistemu za isporuku na bazi svile sa produženim oslobađanjem. Sistem za isporuku na bazi svile može se formirati dovođenjem u kontakt rastvora fibroina svile sa terapijskim agensom kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Kao neograničavajući primer, sistem za isporuku na bazi svile sa produženim oslobađanjem koji se može upotrebljavati u predmetnoj objavi i postupci pravljenja takvog sistema opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130177611.

Mikročestice

1

[0536] U nekim aspektima, formulacije koje sadrže polinukleotide koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid sadrže mikročestice. Mikročestice mogu sadržati polimer koji je ovde opisan i/ili koji je poznat u struci, kao što su, ali ne ograničavajući se na, poli(α -hidroksi kiselinu), polihidroksi buternu kiselinu, polikaprolakton, poliortoestar i polianhidrid. Mikročestica može imati adsorbujuće površine za adsorbovanje biološki aktivnih molekula kao što su polinukleotidi. Kao neograničavajući primer mikročestice za upotrebu sa predmetnom objavom i postupci pravljenja mikročestica opisani su u S.A.D. patentnim publikacijama br. US2013195923 i US20130195898 i S.A.D. patentima br.8,309,139 i 8,206,749.

[0537] U sledećem aspektu, formulacija je mikroemulzija koja sadrži mikročestice i polinukleotide. Kao neograničavajući primer, mikroemulzije koje sadrže mikročestice opisane su u S.A.D. patentnim publikacijama br. US2013195923 i US20130195898 i S.A.D. patentima br.8,309,139 i 8,206,749.

Lipidi amino-kiseline

[0538] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u lipidima amino-kiseline. Lipidi amino-kiseline su lipofilna jedinjenja koja sadrže amino-kiselinski ostatak i jedan ili više lipofilnih repova. Neograničavajući primeri lipida amino-kiseline i postupci pravljenja lipida aminokiseline opisani su u S.A.D. patentu br.8,501,824.

[0539] U nekim aspektima, lipidi amino-kiseline imaju hidrofilni deo i lipofilni deo. Hidrofilni deo može biti amino-kiselinski ostatak i lipofilni deo može sadržati najmanje jedan lipofilni rep.

[0540] U nekim aspektima, formulacije lipida amino-kiseline upotrebljavaju se za isporuku polinukleotida subjektu.

[0541] U sledećem aspektu, formulacije lipida amino-kiseline isporučuju polinukleotid u obliku koji se može osloboditi i koji sadrži lipid amino-kiseline koji vezuje i oslobađa polinukleotide. Kao neograničavajući primer, oslobađanje polinukleotida može biti obezbeđeno linkerom koji je labilan na kiselinu kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koji su opisani u S.A.D. patentima br. 7,098,032, 6,897,196, 6,426,086, 7,138,382, 5,563,250, i 5,505,931.

1

Mikrovezikule

[0542] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u mikrovezikulama. Neograničavajući primeri mikrovezikula uključuju one koje su opisane u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130209544.

[0543] U nekim aspektima, mikrovezikula je mikrovezikula posredovana ARRDC1 (ARMM). Neograničavajući primeri ARMM i postupci pravljenja ARMM opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013119602.

Kompleksi interpolielektrolita

[0544] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u kompleksu interpolielektrolita. Kompleksi interpolielektrolita formiraju se kada se polimeri sa dinamičkim naelektrisanjem kompleksuju sa jednim ili više anjonskih molekula. Neograničavajući primeri polimera sa dinamičkim naelektrisanjem i kompleksa interpolielektrolita i postupci pravljenja kompleksa interpolielektrolita opisani su u S.A.D. patentu br.8,524,368.

Kristalni polimerni sistemi

[0545] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulišu se u kristalnim polimernim sistemima. Kristalni polimerni sistemi su polimeri sa kristalnim funkcionalnim grupama i/ili terminusnim jedinicama koje sadrže kristalne funkcionalne grupe. Neograničavajući primeri polimera sa kristalnim funkcionalnim grupama i/ili terminusnim jedinicama koje sadrže kristalne funkcionalne grupe označeni "CYC polimeri", kristalni polimerni sistemi i postupci pravljenja takvih polimera i sistema opisani su u S.A.D. patentu br. US 8,524,259.

Ekscipijensi

[0546] Farmaceutske formulacije mogu dopunski sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kao što se ovde upotrebljava, uključuje, ali nije ograničen na, bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, pomoćne supstance za disperziju ili suspenziju, površinski aktivne agense, izotonične

1

agense, agense za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervanse, čvrsta veziva, lubrikante, agense za ukus, stabilizatore, antioksidanse, agense za podešavanje osmolalnosti, agense za podešavanje pH i slično, kako pogoduje određenom željenom doznom obliku. Različiti ekscipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija i tehnike za pripremanje kompozicije poznati su u struci (videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Može se razmatrati upotreba konvencionalnog ekscipijensnog medijuma osim u onoj meri u kojoj bilo koji konvencionalni ekscipijensni medijum može biti nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, kao što je stvaranje bilo kakvog neželjenog biološkog efekta ili drugačija interakcija na štetan način sa bilo kojom drugom komponentom(ama) iz farmaceutske kompozicije.

[0547] U nekim aspektima, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% čist. U nekim aspektima, ekscipijens je odobren za upotrebu kod ljudi i za veterinarsku upotrebu. U nekim aspektima, ekscipijens može biti odobren od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država. U nekim aspektima, ekscipijens može biti farmaceutskog kvaliteta. U nekim aspektima, ekscipijens može da zadovolji standarde farmakopeje Sjedinjenih Država (USP), Evropske farmakopeje (EP), Britanske farmakopeje, i/ili Međunarodne farmakopeje.

[0548] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se upotrebljavaju u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, agense za dispergovanje i/ili granulisanje, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, agense za dezintegraciju, agense za vezivanje, konzervanse, agense za puferisanje, agense za lubrikovanje, i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono biti uključeni u farmaceutske kompozicije. Kompozicija takođe može uključivati ekscipijense kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije, agensi za bojenje, agensi za oblaganje, zaslađivači, arome, i/ili agensi za miris.

[0549] Primeri razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, kalcijum karbonat, natrijum karbonat, kalcijum fosfat, dikalcijum fosfat, kalcijum sulfat, kalcijum hidrogen fosfat, natrijum fosfat, laktozu, saharozu, celulozu, mikrokristalnu celulozu, kaolin, manitol, sorbitol, inozitol, natrijum hlorid, suvi skrob, kukuruzni skrob, šećer u prahu, itd. i/ili njihove kombinacije.

1

[0550] Primeri agenasa za granulisanje i/ili dispergovanje uključuju, ali nisu ograničeni na, krompirov skrob, kukuruzni skrob, skrob tapioke, natrijum skrob glikolat, gline, alginsku kiselinu, guar gumu, pulpu citrusa, agar, bentonit, celulozu i proizvode od drveta, prirodni sunđer, katjonske izmenjivačke smole, kalcijum karbonat, silikate, natrijum karbonat, umreženi poli(vinilpirolidon) (krospovidon), natrijum karboksimetil skrob (natrijum skrob glikolat), karboksimetil celulozu, umreženu natrijum karboksimetil celulozu (kroskarmeloza), metilcelulozu, preželatinizirani skrob (skrob 1500), mikrokristalni skrob, skrob koji nije solubilan u vodi, kalcijum karboksimetil celulozu, magnezijum aluminijum silikat (VEEGUM<®>), natrijum lauril sulfat, kvaternarna jedinjenja amonijaka, itd. i/ili njihove kombinacije.

[0551] Primeri površinski aktivnih agenasa i/ili emulgatora uključuju, ali nisu ograničeni na, prirodne emulgatore (npr. akacija, agar, alginska kiselina, natrijum alginat, tragakant, hondruks, holesterol, ksantan, pektin, želatin, žumance jajeta, kazein, vunena mast, holesterol, vosak, i lecitin), koloidne gline (npr. bentonit [aluminijum silikat] i VEEGUM<®>[magnezijum aluminijum silikat]), dugolančane derivate amino-kiselina, alkohole velike molekulske težine (npr. stearil alkohol, cetil alkohol, oleil alkohol, triacetin monostearat, etilen glikol distearat, gliceril monostearat, i propilen glikol monostearat, polivinil alkohol), karbomere (npr. karboksi polimetilen, poliakrilna kiselina, polimer akrilne kiseline, i karboksivinil polimer), karagenan, celulozne derivate (npr. natrijum karboksimetilceluloza, celuloza u prahu, hidroksimetil celuloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, metilceluloza), estre masnih kiselina sorbitana (npr. polioksietilen sorbitan monolaurat [TWEEN<®>20], polioksietilen sorbitan [TWEEN<®>60], polioksietilen sorbitan monooleat [TWEEN<®>80], sorbitan monopalmitat [SPAN<®>40], sorbitan monostearat [SPAN<®>60], sorbitan tristearat [SPAN<®>65], gliceril monooleat, sorbitan monooleat [SPAN<®>80]), polioksietilen estre (npr. polioksietilen monostearat [MYRJ<®>45], polioksietilen hidrogenizovano ricinusovo ulje, polietoksilovano ricinusovo ulje, polioksimetilen stearat, i SOLUTOL<®>), estre saharoze masnih kiselina, estre polietilen glikola masnih kiselina (npr. CREMOPHOR<®>), polioksietilen etre (npr. polioksietilen lauril etar [BRIJ<®>30]), poli(vinilpirolidon), dietilen glikol monolaurat, trietanolamin oleat, natrijum oleat, kalijum oleat, etil oleat, oleinsku kiselinu, etil laurat, natrijum lauril sulfat, PLUORINC<®>F 68, POLOXAMER<®>188, cetrimonijum bromid, cetilpiridinijum hlorid, benzalkonijum hlorid, dokusat natrijum, itd. i/ili njihove kombinacije.

1 1

[0552] Primeri agenasa za vezivanje uključuju, ali nisu ograničeni na, skrob (npr. kukuruzni skrob i skrobnu pastu); želatin; šećere (npr. saharoza, glukoza, dekstroza, dekstrin, melasa, laktoza, laktitol, manitol); amino-kiseline (npr. glicin); prirodne i sintetičke gume (npr. akacija, natrijum alginat, ekstrakt irske mahovine, panvar guma, gati guma, sluz izapol ljuski, karboksimetilceluloza, metilceluloza, etilceluloza, hidroksietilceluloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, mikrokristalna celuloza, celuloza acetat, poli(vinil-pirolidon), magnezijum aluminijum silikat (VEEGUM<®>), i arabinogalaktan ariša); alginate; polietilen oksid; polietilen glikol; neorganske soli kalcijuma; silicijumsku kiselinu; polimetakrilate; voskove; vodu; alkohol; itd. i njihove kombinacije.

[0553] Primeri konzervanasa mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, antioksidanse, helatne agense, antimikrobne konzervanse, antifungalne konzervanse, alkoholne konzervanse, kisele konzervanse, i/ili druge konzervanse. Oksidacija je potencijalni put degradacije za iRNK, naročito za tečne formulacije iRNK. Kako bi se sprečila oksidacija, u formulaciju se mogu dodati antioksidansi. Primeri antioksidanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, alfa tokoferol, askorbinsku kiselinu, askorbil palmitat, benzil alkohol, butilisani hidroksianizol, EDTA, m-krezol, metionin, butilisani hidroksitoluen, monotioglicerol, kalijum metabisulfit, propansku kiselinu, propil galat, natrijum askorbat, natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, tioglicerol, i/ili natrijum sulfit. Primeri helatnih agenasa uključuju etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA), limunsku kiselinu monohidrat, dinatrijum edetat, dikalijum edetat, edetinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, jabučnu kiselinu, fosfornu kiselinu, natrijum edetat, vinsku kiselinu, i/ili trinatrijum edetat. Primeri antimikrobnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, bronopol, cetrimid, cetilpiridinijum hlorid, hlorheksidin, hlorobutanol, hlorokrezol, hloroksilenol, krezol, etil alkohol, glicerin, heksetidin, imidureu, fenol, fenoksietanol, feniletil alkohol, fenilživa nitrat, propilen glikol, i/ili timerosal. Primeri antifungalnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, benzoevu kiselinu, hidroksibenzoevu kiselinu, kalijum benzoat, kalijum sorbat, natrijum benzoat, natrijum propionat, i/ili sorbinsku kiselinu. Primeri alkoholnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, etanol, polietilen glikol, fenol, fenolna jedinjenja, bisfenol, hlorobutanol, hidroksibenzoat, i/ili feniletil alkohol. Primeri kiselih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, vitamin A, vitamin C, vitamin E, betakaroten, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, askorbinsku

1 2

kiselinu, sorbinsku kiselinu, i/ili fitinsku kiselinu. Drugi konzervansi uključuju, ali nisu ograničeni na, tokoferol, tokoferol acetat, deteroksim mezilat, cetrimid, butilisani hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), etilendiamin, natrijum lauril sulfat (SLS), natrijum lauril etar sulfat (SLES), natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, kalijum sulfit, kalijum metabisulfit, GLYDANT PLUS<®>, PHENONIP<®>, metilparaben, GERMALL<®>115, GERMABEN<®>II, NEOLONE™, KATHON™, i/ili EUXYL<®>.

[0554] U nekim aspektima, pH rastvora polinukleotida održava se između pH 5 i pH 8 kako bi se poboljšala stabilnost. Primeri pufera za kontrolu pH mogu uključivati, ali nisu ograničeni na natrijum fosfat, natrijum citrat, natrijum sukcinat, histidin (ili histidin HCl), natrijum karbonat, i/ili natrijum malat. U sledećem aspektu, primeri pufera prethodno nabrojani mogu se upotrebljavati sa dopunskim jednovalentnim kontrajonima (uključujući, ali ne ograničavajući se na kalijum). Dvovalentni katjoni se takođe mogu upotrebljavati kao puferski kontrajoni; međutim, oni nisu poželjni zbog formiranja kompleksa i/ili degradacije iRNK.

[0555] Primeri agenasa za puferisanje takođe mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, rastvore citratnog pufera, rastvore acetatnog pufera, rastvore fosfatnog pufera, amonijum hlorid, kalcijum karbonat, kalcijum hlorid, kalcijum citrat, kalcijum glubionat, kalcijum gluceptat, kalcijum glukonat, D-glukonsku kiselinu, kalcijum glicerofosfat, kalcijum laktat, propansku kiselina, kalcijum levulinat, pentansku kiselinu, dvobazni kalcijum fosfat, fosfornu kiselinu, trobazni kalcijum fosfat, kalcijum hidroksid fosfat, kalijum acetat, kalijum hlorid, kalijum glukonat, smeše kalijuma, dvobazni kalijum fosfat, jednobazni kalijum fosfat, smeše kalijum fosfata, natrijum acetat, natrijum bikarbonat, natrijum hlorid, natrijum citrat, natrijum laktat, dvobazni natrijum fosfat, monobazni natrijum fosfat, smeše natrijum fosfata, trometamin, magnezijum hidroksid, aluminijum hidroksid, alginsku kiselinu, vodu bez pirogena, izotonični fiziološki rastvor, Ringerov (Ringer's) rastvor, etil alkohol, itd. i/ili njihove kombinacije.

[0556] Primeri agensa za lubrikovanje uključuju, ali nisu ograničeni na, magnezijum stearat, kalcijum stearat, stearinsku kiselinu, silicijum dioksid, talk, slad, gliceril behanat, hidrogenizovana biljna ulja, polietilen glikol, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid, leucin, magnezijum lauril sulfat, natrijum lauril sulfat, itd. i njihove kombinacije.

[0557] Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na, ulje badema, semena kajsije, avokada, babase, bergamota, semena crne ribizle, boražine, kade, kamilice, repice, kima, karnaube, ricinusa, cimeta, kakao puter, kokosa, jetre bakalara, kafe, kukuruza,

1

semena pamuka, emua, eukaliptusa, noćurka, ribe, lanenog semena, geraniola, tikve, semena grožđa, lešnika, izopa, izopropil miristat, jojobe, kukui oraha, lavandina, lavande, limuna, litsea cubeba, makadamija oraha, sleza, semena manga, semena livadske pene, minka, muškatnog oraščića, masline, pomorandže, atlantske sluzoglavke, palme, palminog semena, semena breskve, kikirikija, maka, semena bundeve, semena repice, pirinčane mekinje, ruzmarina, šafranike, sandalovine, saskvane, čubara, morske pasjakovine, susama, ši puter, silikonsko, soje, suncokreta, čajevca, čička, cubake, vetivera, oraha, i ulje pšenične klice. Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na, butil stearat, kaprilni triglicerid, kaprični triglicerid, ciklometikon, dietil sebakat, dimetikon 360, izopropil miristat, mineralno ulje, oktildodekanol, oleil alkohol, silikonsko ulje, i/ili njihove kombinacije.

[0558] Ekscipijensi kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije, agensi za bojenje, agensi za oblaganje, zaslađivanje, ukus, i/ili miris mogu biti prisutni u kompoziciji, u skladu sa procenom formulatora.

[0559] Primeri aditiva uključuju fiziološki biokompatibilne pufere (npr. trimetilamin hidrohlorid), dodavanje helanata (kao što su, na primer, DTPA ili DTPA-bisamid) ili kalcijum helat kompleksa (kao na primer kalcijum DTPA, CaNaDTPA-bisamid), ili, opciono, dodavanje kalcijumovih ili natrijumovih soli (na primer, kalcijum hlorid, kalcijum askorbat, kalcijum glukonat ili kalcijum laktat). Pored toga, mogu se upotrebljavati antioksidansi i agensi za suspendovanje.

Krioprotektanti za iRNK

[0560] U nekim aspektima, formulacije polinukleotida sadrže krioprotektante. Kao što se ovde upotrebljava, termin "krioprotektant" označava jedan ili više agenasa koji kada se kombinuju sa datom supstancom, pomažu da se redukuje ili eliminiše oštećenje te supstance koje se javlja pri zamrzavanju. U nekim aspektima, krioprotektanti se kombinuju sa polinukleotidima kako bi ih stabilizovali tokom zamrzavanja. Skladištenje u zamrznutom stanju iRNK između -20 °C i -80 °C može biti korisno za dugotrajnu (npr. 36 meseci) stabilnost polinukleotida. U nekim aspektima, krioprotektanti su uključeni u formulacije polinukleotida za stabilizaciju polinukleotida kroz cikluse zamrzavanja/odmrzavanja i pod uslovima skladištenja u zamrznutom stanju. Krioprotektanti iz predmetne objave mogu uključivati, ali nisu ograničeni na saharozu, trehalozu, laktozu, glicerol, dekstrozu, rafinozu i/ili manitol.

1 4

Trehaloza je navedena od strane Uprave za hranu i lekove kao generalno bezbedna (GRAS) i uobičajeno se upotrebljava u komercijalnim farmaceutskim formulacijama.

Agensi za povećanje zapremine

[0561] U nekim aspektima, formulacije polinukleotida sadrže agense za povećanje zapremine. Kao što se ovde upotrebljava, termin "agens za povećanje zapremine" označava jedan ili više agenasa koji su uključeni u formulacije da daju željenu konzistenciju formulaciji i/ili stabilizuju komponente formulacije. U nekim aspektima, agensi za povećanje zapremine su uključeni u liofilizovane polinukleotidne formulacije kako bi se dobio "farmaceutski elegantan" kolač, stabilizujući liofilizovane polinukleotide tokom dugotrajnog (npr.36 meseci) skladištenja. Agensi za povećanje zapremine iz predmetne objave mogu uključivati, ali nisu ograničeni na saharozu, trehalozu, manitol, glicin, laktozu i/ili rafinozu. U nekim aspektima, kombinacije krioprotektanata i agenasa za povećanje zapremine (na primer, saharoza/glicin ili trehaloza/manitol) mogu biti uključene kako bi se stabilizovali polinukleotidi tokom zamrzavanja i obezbedio agens za povećanje zapremine za liofilizaciju.

[0562] Neograničavajući primeri formulacija i postupaka za formulisanje polinukleotida iz predmetne objave takođe su obezbeđeni u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013090648, koja je podneta 14. decembra 2012. godine.

Gola isporuka

[0563] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu biti isporučeni u ćeliju (npr. u tumorsku ćeliju) goli. Kao što se ovde upotrebljava, "goli" označava isporuku polinukleotida bez agenasa koji promovišu transfekciju. Na primer, polinukleotidi koji se isporučuju u ćeliju, npr. tumorsku ćeliju, mogu biti bez modifikacija. Goli polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu se isporučiti u tumorsku ćeliju upotrebom puteva primene koji su poznati u struci, npr. intratumorska primena, i onih koji su ovde opisani.

Parenteralna i injektabilna primena

1

[0564] Tečni dozni oblici za parenteralnu primenu, npr. intratumorsku, uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu sadržati inertne razblaživače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci, kao što su, na primer, voda ili drugi rastvarači, agensi za solubilizovanje i emulgatori kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslina, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. Pored inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu uključivati adjuvanse kao što su agensi za vlaženje, agensi za aspekte emulgovanja i suspendovanja, agensi za zaslađivanje, ukus, i/ili miris. U određenim aspektima, za parenteralnu primenu, kompozicije se mešaju sa agensima za solubilizovanje kao što su CREMOPHOR<®>, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.

[0565] Farmaceutska kompozicija za parenteralnu primenu, npr. intratumorsku primenu, može sadržati najmanje jedan neaktivan sastojak. Bilo koji ili nijedan od upotrebljenih neaktivnih sastojaka može biti odobren od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA). Neiscrpna lista neaktivnih sastojaka za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama za parenteralnu primenu uključuje hlorovodoničnu kiselinu, manitol, azot, natrijum acetat, natrijum hlorid i natrijum hidroksid.

[0566] Injektabilni preparati, na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu se formulisati u skladu sa poznatim stanjem tehnike upotrebom pogodnih agenasa za dispergovanje, agenasa za vlaženje, i/ili agenasa za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu biti sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor, U.S.P., i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline kao što je oleinska kiselina mogu se upotrebljavati u pripremi injektabila. Sterilna formulacija takođe može sadržati adjuvanse kao što su lokalni anestetici, konzervansi i agensi za puferisanje.

1

[0567] Injektabilne formulacije, npr. intratumorske, mogu se sterilisati, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijum pre upotrebe.

[0568] Injektabilne formulacije, npr. intratumorske, mogu biti za direktnu injekciju u region tkiva, organa i/ili subjekta, npr. tumor.

[0569] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, često je poželjno da se uspori apsorpcija aktivnog sastojka iz intratumorske injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije leka tada zavisi od njegove stope rastvaranja koja, zauzvrat, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog oblika leka postiže se rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljnom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave formiranjem mikroinkapsuliranih matriksa leka u biodegradabilnim polimerima kao što je polilaktidpoliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, stopa oslobađanja leka se može kontrolisati. Primeri drugih biodegradabilnih polimera uključuju poli(ortoestre) i poli(anhidride). Depo injektabilne formulacije pripremaju se zarobljavanjem leka u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.

Dozni oblici

[0570] Farmaceutska kompozicija koja je ovde opisana može se formulisati u dozni oblik koji je ovde opisan, kao što je topikalni, intranazalni, intratrahealni, ili injektabilni ( npr. intravenski, intratumorski, intraokularni, intravitrealni, intramuskularni, intrakardijalni, intraperitonealni, ili subkutani).

Tečni dozni oblici

[0571] Tečni dozni oblici za parenteralnu primenu (npr. intratumorsku) uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu sadržati inertne razblaživače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci uključujući, ali ne ograničavajući se na, vodu ili druge rastvarače, agense za solubilizovanje i

1

emulgatore kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslina, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. U određenim aspektima, za parenteralnu primenu, kompozicije se mogu mešati sa agensima za solubizovanje kao što su CREMOPHOR<®>, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.

Injektabili

[0572] Injektabilni preparati (npr. intratumorski), na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu se formulisati u skladu sa poznatim stanjem tehnike i mogu uključivati pogodne agense za dispergovanje, agense za vlaženje, i/ili agense za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu biti sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, rastvor u 1,3-butandiolu. Prihvatljivi vehikulumi i rastvarači koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, Ringerov rastvor, U.S.P., i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline kao što je oleinska kiselina mogu se upotrebljavati u pripremi injektabila.

[0573] Injektabilne formulacije mogu se sterilisati, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijum pre upotrebe.

[0574] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, može biti poželjno da se uspori apsorpcija aktivnog sastojka iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije polinukleotida tada zavisi od njegove stope rastvaranja koja, zauzvrat, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog polinukleotida može se postići rastvaranjem ili suspendovanjem polinukleotida u uljnom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave formiranjem mikroinkapsuliranih matriksa

1

polinukleotida u biodegradabilnim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa polinukleotida prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, stopa oslobađanja polinukleotida se može kontrolisati. Primeri drugih biodegradabilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(ortoestre) i poli(anhidride). Depo injektabilne formulacije pripremaju se zarobljavanjem polinukleotida u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.

VII. Kompleti i uređaji

Kompleti

[0575] Objava opisuje različite komplete za pogodno i/ili efikasno sprovođenje postupaka iz predmetne objave. Tipično kompleti će sadržati dovoljne količine i/ili broj komponenti kako bi se omogućilo korisniku da izvede više tretmana subjekta(ata) i/ili da izvede više eksperimenata.

[0576] U jednom aspektu, predmetna objava opisuje komplete koji sadrže polinukleotide iz objave. U nekim aspektima, komplet sadrži jedan ili više polinukleotida.

[0577] Kompleti mogu biti za proizvodnju proteina, koji sadrže polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Komplet može dodatno sadržati pakovanje i uputstva i/ili agens za isporuku za formiranje kompozicije formulacije. Agens za isporuku može sadržati fiziološki rastvor, puferisani rastvor, lipidoid ili bilo koji agens za isporuku koji se ovde objavljuje.

[0578] U nekim aspektima, rastvor za puferisanje uključuje natrijum hlorid, kalcijum hlorid, fosfat i/ili EDTA. U sledećem aspektu, rastvor za puferisanje uključuje, ali nije ograničen na, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor sa 2 mM kalcijuma, 5% saharozu, 5% saharozu sa 2 mM kalcijuma, 5% manitol, 5% manitol sa 2 mM kalcijuma, Ringerov laktat, natrijum hlorid, natrijum hlorid sa 2 mM kalcijuma i manozu (videti npr. S.A.D. publ. br. 20120258046). U dodatnom aspektu, rastvor za puferisanje se istaloži ili se liofilizuje. Količina svake komponente može da varira kako bi se omogućila konzistentna, reproducibilna veća koncentracija fiziološkog rastvora ili jednostavne formulacije pufera. Komponente se takođe mogu menjati kako bi se povećala stabilnost modifikovane RNK u rastvoru za puferisanje tokom određenog vremenskog perioda i/ili pod različitim uslovima. U jednom aspektu, predmetna

1

objava opisuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže: polinukleotid koji sadrži translatabilni region, obezbeđen u količini efikasnoj da proizvede željenu količinu proteina kodiranog translatabilnim regionom kada se introdukuje u ciljnu ćeliju; drugi polinukleotid koji sadrži inhibitornu nukleinsku kiselinu, obezbeđenu u količini efikasnoj da suštinski inhibira urođeni imunski odgovor ćelije; i pakovanje i uputstva.

[0579] U jednom aspektu, predmetna objava opisuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu polinukleotid pokazuje redukovanu degradaciju ćelijskom nukleazom, i pakovanje i uputstva.

Uređaji

[0580] Predmetna objava opisuje uređaje koji mogu da inkorporiraju polinukleotide koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Ovi uređaji sadrže u stabilnoj formulaciji reagense za sintetezu polinukleotida u formulaciji koja je dostupna da bude odmah isporučena subjektu kome je to potrebno, kao što je humani pacijent.

[0581] Uređaji za primenu mogu da se koriste za isporuku polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid u skladu sa režimima pojedinačnog, višestrukog ili podeljenog doziranja o kojima se ovde podučava. O takvim uređajima podučava se u, na primer, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013151666 A2.

[0582] Postupci i uređaji koji su poznati u struci za višestruku primenu ćelijama, organima i tkivima predviđeni su za upotrebu u vezi sa postupcima i kompozicijama koje se ovde objavljuju kao aspekti predmetne objave. Ovo uključuje, na primer, one postupke i uređaje koji imaju više igala, hibridne uređaje koji koriste, na primer, lumene ili katetere, kao i uređaje koji koriste mehanizme pokretane toplotom, električnom strujom ili zračenjem.

[0583] U skladu sa predmetnom objavom, ovi uređaji za višestruku primenu mogu se koristiti za isporuku pojedinačnih, višestrukih ili podeljenih doza koje su ovde razmatrane. O takvim uređajima podučava se na primer u Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013151666 A2.

PRIMERI

Primer 1. In vitro ekspresija OX40L polipeptida na površini ćelije

2

[0584] Ekspresija OX40L polipeptida je izmerena na površini ćelija kancera nakon tretmana sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.

A. Formulacija mOX40L miR122

[0585] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) upotrebljen je u ovom primeru (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). OX40L modifikovana iRNK formulisana je u lipidnim nanočesticama (LNP) kao što je ovde opisano (Moderna Therapeutics, Cambridge, MA).

B. Analiza ekspresije OX40L na površini ćelija

[0586] Mišje ćelije melanoma (B16F10, ATCC br. CRL-6475; ATCC, Manassas, VA) zasejane su u ploče sa 12 bunarića pri gustini od 140.000 ćelija po bunariću. Rastuće doze mOX40L_miR122 (SEQ ID NO: 66) formulisane u LNP dodate su u svaki bunarić direktno posle zasejavanja ćelija. Doze mOX40L_miR122 uključivale su 6,3 ng, 12,5 ng, 25 ng, ili 50 ng iRNK po bunariću. Kontrolne ćelije su ili lažno tretirane ili tretirane sa negativnom kontrolom iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona).

[0587] Nakon tretmana, ekspresija OX40L na površini ćelije detektovana je upotrebom protočne citometrije. Ćelije su sakupljene prenošenjem supernatanata u Pro-Bind ploču sa 96 bunarića sa U-dnom (Beckton Dickinson GmbH, Haidelberg, Nemačka). Ćelije iz svakog bunarića su zatim podignute helatnim rastvorom bez tripsina, i obojene sa PE-konjugovanim anti-mišjim OX40L antitelom (R&D Systems, Minneapolis, MN) i vizualizovane pomoću protočne citometrije. Rezultati su pokazani na SL.2.

C. Rezultati

[0588] SL. 2 pokazuje dozno zavisnu ekspresiju OX40L na površini B16F10 ćelija kancera posle tretmana sa OX40L modifikovanom iRNK. Sve četiri doze

2 1

mOX40L_miR122 generisale su značajnu ekspresiju OX40L na površini ćelije u poređenju sa kontrolnim uzorcima.

[0589] Ovi rezultati pokazuju da primena OX40L modifikovane iRNK rezultuje ekspresijom OX40L polipeptida na površini ciljnih ćelija.

Primer 2: In vitro kinetika ekspresije OX40L na površini ćelija

[0590] U ovom primeru, nivoi ekspresije OX40L polipeptida na površini ćelija kancera izmereni su tokom vremena. Takođe je izmerena kvantifikacija ekspresije OX40L proteina.

A. Formulacija mOX40L miR122

[0591] U ovom primeru je upotrebljen polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L ili humani OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) (mOX40L_miR122, SEQ ID NO: 66; hOX40L_miR122, SEQ ID NO: 65). OX40L modifikovana iRNK formulisana je ili u lipidnim nanočesticama (LNP) kao što je prethodno opisano u Primeru 1 ili je formulisana u LIPOFECTAMINE 2000 (L2K) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) u skladu sa uputstvima proizvođača.

B. Ćelijske linije

[0592] Humane ćelije karcinoma grlića materice (HeLa, ATCC br. CCL-2; ATCC, Manassas, VA) zasejane su pri gustini od 250.000 ćelija po bunariću u ploče sa 6 bunarića. 24 sata nakon zasejavanja, L2K formulisan mOX40L_miR122 ili hOX40L_miR122 koji sadrži 3 µg iRNK dodat je u svaki bunarić. Ćelije su tretirane sa mOX40L_miR122 ili hOX40L_miR122 u prisustvu ili odsustvu 50 µg/ml mitomicina C 24 sata nakon transfekcije.

[0593] Mišje ćelije adenokarcinoma kolona (MC-38; Rosenberg et al., Science 233(4770):1318-21 (1986)) zasejane su pri gustini od 300.000 ćelija po bunariću u ploče sa 6 bunarića. LNP-formulisan mOX40L_miR122 koji sadrži 3 µg iRNK dodat je u svaki bunarić 24 sata posle zasejavanja ćelija. MC-38 ćelije su tretirane sa mOX40L_miR122 u prisustvu ili odsustvu 25 µg/ml mitomicina C.

2 2

[0594] Kontrolne ćelije su lažno tretirane. Ekspresija OX40L na površini ćelije izmerena je na dane 1, 2, 3, 5, i 7 nakon tretmana sa mOX40L_miR122 i dane 1, 2, 3, 4, i 5 nakon tretmana sa hOX40L_miR122. Ćelije su sakupljene i analizirane pomoću protočne citometrije kao što je prethodno opisano u Primeru 1. Rezultati za ćelije tretirane sa mOX40L_miR122 pokazani su na SL. 3A-3D; rezultati za ćelije tretirane sa hOX40L_miR122 pokazani su na SL. 3E. Ćelijski lizati i supernatanti ćelijske kulture su takođe sakupljeni i analizirani na ekspresiju OX40L proteina (kvantifikovano u nanogramima po bunariću). Rezultati za kvantifikaciju mišjeg i humanog OX40L proteina nakon tretmana pokazani su na SL.3F i 3G, respektivno.

C. Rezultati

[0595] SL. 3A-3D pokazuje da je OX40L detektovan na površini HeLa ćelija do najmanje dana 7 posle tretmana sa mOX40L_miR122. SL. 3A-3D takođe pokazuje da se ekspresija OX40L na površini ćelije na MC-38 ćelijama tretiranim sa mOX40L_miR122 vratila na početnu vrednost do dana 5 posle tretmana. U obe ćelijske linije, postepena redukcija nivoa ekspresije OX40L na površini ćelije tokom vremena blokirana je prisustvom mitomicina C. SL. 3E pokazuje da je ekspresija humanog OX40L detektovana na površini HeLa ćelija do najmanje dana 5 posle tretmana sa hOX40L_miR122.

[0596] Nije detektovano značajno odljubljivanje OX40L polipeptida u supernatantima kulture. Ovo sugeriše da se OX40L koji je eksprimiran iz iRNK nije aktivno odljubljivao sa površine ćelije, što je potvrđeno na SL. 3F i 3G. Dvadeset četiri sata posle tretmana sa mOX40L_miR122, hOX40L_miR122, ili lažnim tretmanom, ćelijski lizati su pripremljeni upotrebom standardnih pufera za lizu ćelija i postupaka za analizu proteina. SL. 3F i SL. 3G pokazuju da i mOX40L_miR122 (SL. 3F) i hOX40L_miR122 (SL. 3G) proizvode proteine koji su prepoznati komercijalno dostupnim ELISA testovima. Većina eksprimiranog proteina bila je povezana sa ćelijskim lizatom, sa samo približno 0,1% proizvedenog proteina koji je detektovan u supernatantu transfektovanih ćelija.

[0597] Ovi rezultati pokazuju da tretman ćelija sa OX40L modifikovanom iRNK rezultuje ekspresijom OX40L polipeptida na površini ciljnih ćelija. Ovi rezultati takođe pokazuju da se samo male količine proteina odljubljuju sa transfektovanih ćelija.

2

Primer 3. In vitro biološka aktivnost OX40L

[0598] Aktivacija T-ćelija uključuje dva istovremena događaja ćelijske signalizacije: primarni signal iz kompleksa receptora T-ćelija (npr. CD3 stimulacija) i drugi signal iz kostimulatorne ligand-receptor interakcije (npr. interakcija OX40L/OX40R). Kober et al., European Journal of Immunology 38:2678-2688 (2008). U ovom primeru procenjena je kostimulatorna biološka aktivnost OX40L eksprimiranog na površini ćelija tretiranih sa mOX40L_miR122 ili hOX40L_miR122.

A. Priprema ćelija koje eksprimiraju OX40L

[0599] Mišje ćelije melanoma (B16F10, ATCC br. CRL-6475; ATCC, Manassas, VA) zasejane su u ploče sa 6 bunarića pri gustini od 300.000 ćelija po bunariću. Humane ćelije karcinoma grlića materice (HeLa) zasejane su u ploče sa 6 bunarića kao što je prethodno opisano. Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i koji dodano sadrži miR-122 vezujuće mesto (mišji OX40L, mOX40L_miR122, SEQ ID NO: 66; humani OX40L, hOX40L_miR122, SEQ ID NO: 65) formulisan je u L2K kao što je prethodno opisano u primeru 2. 24 sata posle zasejavanja ćelija, formulacije koje sadrže 3 µg mOX40L_miR122 ili hOX40L_miR122 iRNK dodate su u svaki bunarić. Kontrolne ćelije su ili lažno tretirane ili tretirane sa negativnom kontrolom iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK osim što je bez inicirajućih kodona). Ćelije su inkubirane tokom 24 sata na 37 °C.

B. Priprema naivnih CD4+ T-ćelija

[0600] Slezine C57BL/6 miševa su uklonjene i obrađene upotrebom standardnih tehnika u struci kako bi se generisale suspenzije pojedinačnih splenocita. Ukupne CD4<+>T-ćelije su izolovane iz suspenzija splenocita upotrebom kompleta za izolaciju CD4 T ćelija miša (Miltenyi, San Diego, CA). Naivne humane CD4<+>T-ćelije su izolovane iz mononukleusnih ćelija humane periferne krvi (PBMC) uklanjanjem ne-CD4 ćelija upotrebom komercijalno dostupnog kompleta za izolaciju T ćelija sa magnetnim kuglicama.

C. Test aktivacije T-ćelija

2 4

[0601] U svaki bunarić transfektovanih B16F10 ćelija ili HeLa ćelija dodato je 200.000 T-ćelija u prisustvu agonističkog anti-mišjeg CD3 antitela (R&D Systems, Minneapolis, MN) ili agonističkog anti-humanog CD3 antitela i solubilnog antihumanog CD28; i ćelije su kokultivisane tokom 72 sata (mišje) ili 120 sati (humane). Šema testova je pokazana na SL.4A.

[0602] Posle kokulture sa T-ćelijama, proizvodnja mišjeg IL-2 je izmerena upotrebom mišjeg IL-2 ELISA testa (mišji IL-2 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN). Količina IL-2 koju proizvode CD4<+>T-ćelije služi kao indikator aktivacije T-ćelija. Rezultati su pokazani na SL. 4B. Proizvodnja humanog IL-2 je izmerena upotrebom humanog IL-2 ELISA testa (humani IL-2 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN). Rezultati su pokazani na SL.4C, 4D, i 4E.

D. Rezultati

[0603] SL. 4B pokazuje da ekspresija OX40L na površini B16F10 ćelija tretiranih sa mOX40L_miR122 izaziva IL-2 odgovor T-ćelija in vitro. mOX40L_miR122 iRNK indukovala je oko 12 ng/ml IL2. B16F10 ćelije tretirane sa netranslatiranom negativnom kontrolom iRNK pokazale su osnovne nivoe aktivacije T-ćelija uporedive sa lažno tretiranim ćelijama (tj.oko 6 ng/ml IL2). Prema tome, mOX40L_miR122 iRNK indukovala je oko dva puta veću ekspresiju IL2 u poređenju sa kontrolom (lažno tretirana ili netranslatirana iRNK).

[0604] SL. 4C i 4D pokazuju da, u prisustvu anti-humanog CD3 antitela kojim su ploče obložene i solubilnog anti-humanog CD28 kao primarnih aktivatora T-ćelija, kokultura sa OX40L iRNK transfektovanim HeLa ćelijama u velikoj meri povećava proizvodnju IL-2. Bez ekspresije OX40L, detektovana je mala ili nikakva proizvodnja IL-2. SL. 4E pokazuje sličan nivo povećane proizvodnje humanog IL-2 kada je isti eksperiment izveden sa prethodno stimulisanim (tj. nenaivnim) CD4<+>T-ćelijama.

[0605] Ovi rezultati pokazuju da je OX40L polipeptid biološki aktivan kao kostimulatorni molekul.

Primer 4. In vivo nivoi ekspresije modifikovane iRNK

2

[0606] Kako bi se istražili in vivo nivoi ekspresije polinukleotida koji sadrži modifikovanu iRNK, pripremljen je polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira luciferazu i koji dodatno sadrži miR-122 vezujuće mesto (SEQ ID NO: 69). Luciferazom modifikovana iRNK formulisana je u MC3 LNP (S.A.D. publikacija br. US20100324120).

A. Mišji model adenokarcinoma kolona MC-38

[0607] Tumori adenokarcinoma kolona MC-38 uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa (Rosenberg et al., Science 233(4770): 1318-21 (1986)).

B. Tretman sa luciferazom modifikovanom iRNK

[0608] Kada su MC-38 tumori dostigli približno 200 mm<3>, miševi su tretirani sa jednom intratumorskom dozom od 3,125 µg, 6,25 µg, 12,5 µg, 25 µg, ili 50 µg luciferazom modifikovane iRNK (SEQ ID NO: 69; Cap1, G5 RP iRNK u 1,5% DMG MC3 LNP). Kontrolne životinje su tretirane sa intratumorskom dozom PBS. 24 sata nakon tretmana, životinje su anestezirane, injektovane sa supstratom luciferaze D-luciferinom i bioluminescentno snimanje (BLI) živih životinja procenjeno je u IVIS snimaču 15 minuta kasnije. Dobijeni su signali iz tumorskog tkiva i upoređeni sa signalima iz tkiva jetre kod iste životinje. Rezultati su pokazani na SL.5.

C. Rezultati

[0609] SL. 5 pokazuje da je signal luciferaze u tumorskom tkivu detektovan do 48 sati nakon doziranja. SL. 5 takođe pokazuje da su tri najveće doze modifikovane iRNK (50 µg, 25 µg, i 12,5 µg) dale uporedive signale luciferaze u tumorskom tkivu. Doza od 12,5 µg modifikovane iRNK dala je visok signal tumora sa nižim signalom jetre (normalno tkivo) u mišjem modelu karcinoma kolona MC-38.

[0610] Ovi rezultati pokazuju da primena polinukleotida koji sadrži modifikovanu iRNK i miRNA vezujuće mesto prvenstveno cilja tumorska tkiva u odnosu na normalna tkiva.

Primer 5. In vivo dozno zavisna ekspresija OX40L u B16F10 tumorima

2

[0611] In vivo ekspresija OX40L je procenjena na modelu tumora B16F10.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0612] Pripremljen je polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). OX40L modifikovana iRNK je formulisana u MC3 LNP kao što je opisano u US20100324120. Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (OX40L NST, SEQ ID NO: 68; netranslatabilna verzija iste iRNK osim što je bez inicirajućih kodona).

B. Mišji tumorski model melanoma B16F10

[0613] Subkutani B16F10 tumori uspostavljeni su kod C57BL/6 miševa (Overwijk et al. Current Protocols in Immunology Ch.20, Unit 20.1 (2001)).

[0614] Kada je veličina tumora dostigla približno 200 mm<3>, životinje su tretirane sa jednom intratumorskom dozom mOX40L_miR122 (Cap1, G5 RP iRNK u 0,5 mol% DMG MC3 LNP) pri dozi od 5 µg iRNK (približno 0,25 mg/kg) ili 15 µg iRNK (približno 0,75 mg/kg). Kontrolne životinje su tretirane sa ekvivalentnim dozama negativne kontrole iRNK, OX40L _NST. Dodatne kontrolne životinje su tretirane sa PBS.

C. Merenje OX40L u tumorskom tkivu

[0615] Životinje su žrtvovane 8 sati i 24 sata posle doziranja. Tumorsko tkivo je sakupljeno i analizirano na ekspresiju OX40L upotrebom mišjeg OX40L ELISA testa (R&D Systems, Minneapolis, MN). Rezultati su pokazani na SL. 6 kao količina prisutnog OX40L po gramu tumorskog tkiva.

D. Rezultati

[0616] SL. 6 pokazuje da je pojedinačna intratumorska doza od 5 µg mOX40L_miR122 rezultovala sa preko 200 ng OX40L/g tumorskog tkiva i 8 sati i 24 sata nakon doziranja. SL. 6 takođe pokazuje da je pojedinačna intratumorska doza

2

od 15 µg mOX40L_miR122 rezultovala sa preko 500 ng OX40L/g tumorskog tkiva i 8 sati i 24 sata nakon doziranja.

[0617] Nasuprot tome, manje od 100 ng OX40L je bilo detektabilno u jetri životinja koje su tretirane sa višom 15 µg dozom mOX40L_miR122.

[0618] Ovi podaci pokazuju da primena mOX40L_miR122 rezultuje značajnim nivoima ekspresije OX40L polipeptida u tumorskom tkivu.

Primer 6. In vivo ekspresija OX40L u MC-38 tumorima

[0619] In vivo ekspresija OX40L procenjena je na modelu tumora MC-38.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0620] Pripremljen je polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). OX40L modifikovana iRNK je formulisana u MC3 LNP kao što je prethodno opisano. Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona; OX40L NST; SEQ ID NO: 68).

B. Mišji model adenokarcinoma kolona MC-38

[0621] Tumori adenokarcinoma kolona MC-38 uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa (Rosenberg et al., Science 233(4770): 1318-21 (1986)).

[0622] Kada su tumori dostigli srednju vrednost veličine od približno 100 mm<3>, životinje su tretirane sa jednom intratumorskom dozom mOX40L_miR122 (Cap1, G5 RP iRNK u 1,5 mol% DMG MC3 LNP) pri dozi od 12,5 µg iRNK. Kontrolne životinje su tretirane sa ekvivalentnom dozom negativne kontrole iRNK, OX40L_NST. Dodatne kontrolne životinje su ostavljene netretirane ("NT"). Za eksperimente sa doznim odgovorom, životinjama je primenjena intratumorska injekcija od 3,125, 6,25, ili 12,5 µg mOX40L_miR122; kontrolne životinje su ostavljene netretirane ili su tretirane sa 12,5 µg negativne kontrole iRNK.

C. Merenje OX40L u tumorskom tkivu

2

[0623] Kako bi se izmerila ekspresija OX40L tokom vremena, životinje su žrtvovane 3, 6, 24, 48, 72, i 168 sati posle doziranja. Tumorsko tkivo je sakupljeno i analizirano na ekspresiju OX40L upotrebom ELISA testa (R&D Systems, Minneapolis, MN), kao što je prethodno opisano u Primeru 5. Rezultati su pokazani na SL. 7A kao količina OX40L koja je prisutna po gramu tumorskog tkiva.

[0624] Kako bi se izmerila ekspresija OX40L kao funkcija doznog odgovora, životinje su žrtvovane 24 sata posle doziranja i tumorsko tkivo je sakupljeno za analizu kao što je prethodno opisano. Tumorsko tkivo, tkivo jetre, i tkivo slezine analizirano je na količinu OX40L proteina (SL. 7B-7D, gore) i iRNK (SL.7B-7D, dole).

[0625] Tumorske ćelije su takođe analizirane na ekspresiju OX40L na površini ćelije upotrebom protočne citometrije (podaci nisu pokazani). Tumorsko tkivo je usitnjeno i procesuirano kroz ćelijske cediljke kako bi se pripremile suspenzije pojedinačnih ćelija. Suspenzije ćelija su obojene PE-konjugovanim anti-mišjim OX40L antitelom (R&D Systems, Minneapolis, MN), i vizualizovane pomoću protočne citometrije.

D. Rezultati

[0626] SL. 7A pokazuje da je pojedinačna intratumorska doza od 12,5 µg mOX40L_miR122 rezultovala sa do 1200 ng OX40L/g tumorskog tkiva 24 sata nakon doziranja. Optičke gustine za dva 24-časovna OX40L-tretirana uzorka bile su iznad standardnog opsega, što je rezultovalo potcenjenim vrednostima pokazanim na SL.

7A. SL. 7A takođe pokazuje da je ekspresija OX40L bila detektabilna u tumorskom tkivu do 168 sati (7 dana) nakon doziranja. Nasuprot tome, kontrolno tretirane životinje nisu pokazale nikakav detektabilan OX40L u tumorskom tkivu u bilo kom trenutku. SL. 7B pokazuje dozno zavisno povećanje OX40L proteina (gore) i iRNK (dole) u tumorskom tkivu. SL. 7C i 7D pokazuju da je prisustvo OX40L proteina i iRNK u jetri i slezini (respektivno) niže od količina prisutnih u tumorskom tkivu.

[0627] Rezultati protočne citometrije su pokazali da je približno 6,5% svih živih ćelija povezanih sa tumorom pozitivno na ekspresiju OX40L (podaci nisu pokazani).

[0628] Ovi podaci pokazuju da primena mOX40L_miR122 rezultuje značajnim nivoima ekspresije OX40L polipeptida u tumorskom tkivu.

2

Primer 7. In vivo efikasnost OX40L modifikovane iRNK u modelu adenokarcinoma kolona

[0629] Procenjena je in vivo efikasnost polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0630] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona; NT OX40L_miR122; SEQ ID NO: 68). Obe modifikovane iRNK formulisane su u MC3 LNP kao što je prethodno opisano.

B. Mišji model adenokarcinoma kolona MC-38

[0631] Tumori MC-38 adenokarcinoma kolona uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa kao što je prethodno opisano.

[0632] Četrnaest dana posle inokulacije tumorskih ćelija, životinje su tretirane dva puta nedeljno tokom tri nedelje sa intratumorskom dozom MC3 LNP-formulisane modifikovane iRNK (15 µg iRNK po dozi). Kontrolne životinje su tretirane sa ekvivalentnom dozom i režimom negativne kontrole iRNK, NT OX40L_miR122 (SEQ ID NO: 68).

[0633] Zapremina tumora je izmerena u naznačenim vremenskim tačkama upotrebom ručnih kalipera. Zapremina tumora je zabeležena u kubnim milimetrima.

[0634] Studija in vivo efikasnosti sprovedena je do dana 42 nakon doziranja. Po završetku studije, kompletni skupovi podataka su analizirani i predstavljeni na SL. 8A i 8B. Krajnje Kaplan-Majerove krive preživljavanja su pripremljene i pokazane su na SL. 8C. Krajnje tačke u studiji bile su bilo smrt životinje ili zapremina tumora koja je dostigla 1500 mm<3>.

C. Rezultati

21

[0635] SL. 8A pokazuje da je primena kontrolne modifikovane iRNK imala mali efekat na zapreminu tumora, kao što je procenjeno po završetku studije (dan 42 posle prve doze). SL. 8B pokazuje da je primena mOX40L_miR122 miševima inhibirala ili usporila rast tumora kod nekih životinja i redukovala ili smanjila veličinu tumora kod nekih životinja, kao što je procenjeno po završetku studije (dan 42).

[0636] SL. 8C pokazuje da su životinje koje su primale mOX40L_miR122 imale duža vremena preživljavanja kao što je izmereno dana 42 u poređenju sa kontrolnim životinjama.

[0637] Ovi podaci pokazuju da polinukleotidi mOX40L_miR122 imaju antitumorsku efikasnost kada se primenjuju in vivo.

Primer 8. In vivo ekspresija OX40L u A20 tumorima

[0638] Mišji modeli B-ćelijskog limfoma koji upotrebljavaju A20 ćelijsku liniju korisni su za analizu mikrosredine tumora (Kim et al., Journal of Immunology 122(2):549-554 (1979); Donnou et al., Advances in Hematology 2012:701704 (2012)). Prema tome, in vivo ekspresija OX40L i mikrosredina tumora procenjeni su u tumorskom modelu A20 B-ćelijskog limfoma.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0639] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). OX40L modifikovana iRNK formulisana je u MC3 LNP kao što je prethodno opisano. Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona; NT OX40L; SEQ ID NO: 68).

B. Tumorski model A20 B-ćelijskog limfoma

[0640] Tumori B-ćelijskog limfoma uspostavljeni su subkutano kod BALB/c miševa. Ćelije B-ćelijskog limfoma miša (A20, ATCC br. TIB-208; ATCC, Manassas, VA) kultivisane su u skladu sa uputstvima prodavca. Ćelije su inokulisane subkutano kod BALB/c miševa kako bi se generisali subkutani tumori. Tumor je praćen u pogledu veličine i palpabilnosti.

[0641] Kada su tumori dostigli srednju vrednost veličine od približno 1300 mm<3>, životinje su podeljene u dve grupe. Grupa I je tretirana sa jednom intratumorskom dozom mOX40L_miR122 (Cap1, G5 RP iRNK u 0,5 mol% DMG MC3 LNP) pri dozi od 15 µg iRNK. Grupa II (kontrole) je tretirana sa ekvivalentnom dozom negativne kontrole iRNK, NT OX40L.

C. Merenje OX40L u tumorskom tkivu

[0642] Tumorsko tkivo je sakupljeno 24 sata posle doziranja i analizirano na ekspresiju OX40L upotrebom ELISA testa (R&D Systems, Minneapolis, MN), kao što je prethodno opisano u Primeru 5. Rezultati su pokazani na SL. 9A kao količina prisutnog OX40L po gramu tumorskog tkiva.

[0643] A20 tumorske ćelije su takođe analizirane na ekspresiju OX40L na površini ćelije. Tumorsko tkivo je usitnjeno i procesuirano kroz ćelijske cediljke kako bi se pripremile suspenzije pojedinačnih ćelija. Ćelije su obojene anti-mišjim OX40L antitelom (kozje poliklonalno IgG, PE konjugovano; R&D Systems, Minneapolis, MN) i anti-mišjim CD45 antitelom (klon 30-F11, PE-Cy5 konjugovano; eBioscience, San Diego, CA) za identifikaciju leukocita (tj. A20 ćelija kancera i infiltrirajućih imunskih ćelija). Ćelije su zatim analizirane pomoću protočne citometrije. Rezultati su pokazani na SL.9B i 9C.

D. Rezultati

[0644] SL. 9A pokazuje da je jedna intratumorska doza od 15 µg mOX40L_miR122 rezultovala u do 250 ng OX40L/g tumorskog tkiva 24 sata posle doziranja. Nasuprot tome, kontrolno tretirane životinje pokazale su manje od 100 ng OX40L u tumorskom tkivu 24 sata posle doziranja.

[0645] SL. 9B pokazuje da je približno 3% svih živih CD45<+>ćelija (tj. tumorskih ćelija) eksprimiralo OX40L na površini ćelije. U sličnom eksperimentu, pronađeno je da približno 15,8% ukupnih živih ćelija iz tumora eksprimira introdukovani OX40L, u poređenju sa manje od 0,5% OX40L-pozitivnih živih ćelija u tumorima tretiranim sa negativnom kontrolom iRNK (SL.9C).

[0646] Ovi podaci pokazuju da primena mOX40L_miR122 rezultuje značajnim nivoima ekspresije OX40L polipeptida u tumorskom tkivu.

Primer 9. In vivo farmakodinamički efekti OX40L

[0647] Procenjena je sposobnost ekspresije OX40L posredovane mOX40L_miR122 da regrutuje ćelije prirodne ubice (NK) na mesto tumora.

A. Tumorski model A20 B-ćelijskog limfoma

[0648] Tumori B-ćelijskog limfoma koji su prethodno opisani u Primeru 8 takođe su procenjeni na infiltraciju NK ćelija nakon tretmana. Kao što je prethodno opisano, miševi su tretirani sa jednom intratumorskom dozom bilo mOX40L_miR122 ili kontrolne NT OX40L iRNK (doza od 15 µg; Cap1, G5 RP iRNK u 0,5 mol% DMG MC3 LNP). 24 sata posle doziranja, tumori su sakupljeni kao što je prethodno opisano i procesuirani kroz ćelijske cediljke kako bi se pripremile suspenzije pojedinačnih ćelija.

B. Infiltracija ćelija prirodnih ubica

[0649] Suspenzije pojedinačnih ćelija su inkubirane sa anti-mišjim NKp46 antitelom (klon 29A1.4, konjugovano sa PerCP-eFluor® 710; eBioscience, San Diego, CA), koje je specifično za marker p46 NK ćelija (CD335), i anti-mišjim CD3 antitelom (klon 145-2C11, FITC konjugovano; BioLegend, San Diego, Kalifornija), koje je specifično za T-ćelije. Ćelije su analizirane na osnovu ekspresije CD45<+>za leukocite, kao i ekspresije NKp46 i CD3ε upotrebom protočne citometrije. NK ćelije su p46<+>i CD3-. Rezultati su pokazani na SL.10A i 10B.

C. Rezultati

[0650] SL. 10A pokazuje da su životinje tretirane sa mOX40L_miR122 pokazale približno 5 puta povećanje relativnog broja NK ćelija unutar A20 tumora 24 sata posle doziranja. SL. 10B pokazuje podatke o pojedinačnim životinjama iz iste studije.

21

[0651] Ovi rezultati pokazuju da tretman sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava broj NK ćelija unutar mikrosredine tumora.

Primer 10. In vivo efikasnost OX40L modifikovane iRNK u modelu B-ćelijskog limfoma

[0652] In vivo efikasnost mOX40L_miR122 procenjena je na modelu B-ćelijskog limfoma.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0653] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (netraslatabilna verzija faktora IX iRNK koja sadrži više stop kodona; NST-FIX, SEQ ID NO: 67). Obe modifikovane iRNK formulisane su na isti način (Cap1, G5 RP iRNK u 1,5 mol% DMG MC3 LNP).

B. Tumorski model A20 B-ćelijskog limfoma

[0654] Tumori B-ćelijskog limfoma uspostavljeni su subkutano kod BALB/c miševa. Ćelije B-ćelijskog limfoma miša (A20, ATCC br. TIB-208; ATCC, Manassas, VA) kultivisane su u skladu sa uputstvima prodavca. Ćelije su inokulisane subkutano kod BALB/c miševa kako bi se generisali subkutani tumori. Tumor je praćen u pogledu veličine i palpabilnosti.

[0655] Kada su tumori dostigli srednju vrednost veličine od približno 100 mm<3>, životinje su podeljene u dve grupe. Grupa I je tretirana sa ponovljenim intratumorskim dozama mOX40L_miR122 (Cap1, G5 RP iRNK u 1,5 mol% DMG MC3 LNP) pri dozi od 12,5 µg iRNK. Grupa II (kontrola) je tretirana sa ekvivalentnom dozom negativne kontrole iRNK, NST-FIX. Životinje su dozirane na dane 20, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 44, 48, i 51. Rezultati su pokazani na SL.11A, 11B, 11C, i 11D.

[0656] Studija je sprovedena do dana 57. Krajnje Kaplan-Majerove krive preživljavanja su pripremljene i pokazane na SL. 11D. Krajnje tačke u studiji bile su bilo smrt životinje ili zapremina tumora koja je dostigla 2000 mm<3>.

C. Rezultati

[0657] SL. 11A pokazuje individualni rast tumora kod životinja koje su tretirane sa kontrolnom NST-FIX iRNK. SL. 11B pokazuje individualni rast tumora kod životinja koje su tretirane sa mOX40L_miR122. Strelice predstavljaju dane doziranja. Više doza kontrolne modifikovane iRNK imale su mali efekat na zapreminu tumora. Nasuprot tome, više doza mOX40L_miR122 redukovalo je ili smanjilo veličinu tumora kod nekih životinja ili inhibiralo rast tumora kod nekih životinja.

[0658] SL. 11C pokazuje prosečnu veličinu tumora za svaku grupu procenjenu na dan 35 studije. Ovi podaci pokazuju da primena mOX40L_miR122 redukuje ili inhibira rast tumora u poređenju sa tretmanom sa kontrolnom iRNK. Sledeća formula je upotrebljena za izračunavanje procenta inhibicije rasta tumora (TGI) dana 34 u poređenju sa danom 19:

[0659] Upotrebom prethodne formule i podataka koji su pokazani na SL. 11C, TGI % za mOX40L_miR122 je bio 57%. Drugim rečima, životinje koje su tretirane sa mOX40L_miR122 pokazale su 57% inhibicije rasta tumora između dana 19 i 34 u poređenju sa životinjama koje su tretirane kontrolom.

[0660] SL. 11D pokazuje da su životinje koje su primale mOX40L_miR122 imale duže vreme preživljavanja kao što je izmereno dana 42 u poređenju sa kontrolnim životinjama.

[0661] Ovi podaci pokazuju da mOX40L_miR122 polinukleotidi imaju antitumorsku efikasnost kada se primenjuju in vivo.

Primer 11. In vivo memorijski imunski odgovor

[0662] mOX40L_miR122 je procenjen na svoju sposobnost da indukuje adaptivni (memorijski) imunski odgovor u modelu adenokarcinoma MC-38.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

21

[0663] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (netranslatabilna verzija OX40L iRNK koja sadrži više stop kodona; NST-OX40L, SEQ ID NO: 68). Obe modifikovane iRNK formulisane su na isti način (Cap1, G5 RP iRNK u 1,5 mol% DMG MC3 LNP).

B. Model MC-38 adenokarcinoma kolona

[0664] Tumori MC-38 adenokarcinoma kolona uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa kao što je prethodno opisano.

[0665] Sedam dana posle inokulacije tumorskih ćelija, životinje su tretirane svaka tri dana (Q3D) za maksimalno 10 intratumorskih doza MC3 LNP-formulisane modifikovane iRNK (12,5 µg iRNK po dozi). Kontrolne životinje su tretirane sa ekvivalentnom dozom i režimom negativne kontrole iRNK, NT OX40L_miR122.

[0666] Zapremina tumora je izmerena u naznačenim vremenskim tačkama upotrebom ručnih kalipera. Zapremina tumora je zabeležena u kubnim milimetrima. Dana 60 nakon inokulacije tumora, šest životinja sa naizgled potpunim odgovorom (CR) iz grupe mOX40L_miR122 ponovo je izazvano sa 5 × 10<5>MC-38 tumorskih ćelija; kao kontrola, šest naivnih životinja je takođe inokulisano sa 5 × 10<5>MC-38 ćelija. Rezultati analize su pokazani na SL. 12A i 13B.

C. Rezultati

[0667] SL. 12A pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa kontrolnom NST-OX40L iRNK, mOX40L_miR122, ili PBS. SL. 12A pokazuje da je 6 od 15 životinja kojima je primenjen mOX40L_miR122 (40%) pokazalo potpuni odgovor bez značajnog rasta tumora kao što je izmereno na dan 60. Za poređenje, životinje kojima je primenjen iRNK konstrukt negativne kontrole ili PBS pokazale su značajan rast tumora do dana 60 (SL. 12A). Ovi rezultati pokazuju da primena iRNK koja kodira OX40L polipeptid redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora.

[0668] Dana 60, šest životinja sa potpunim odgovorom ("CR") iz grupe mOX40L_miR122 i šest naivnih kontrolnih životinja ponovo su izazvane sa MC-38

21

ćelijama. SL. 12B pokazuje individualni rast tumora kod životinja koje su ponovo izazvane sa MC-38 ćelijama. Životinje kojima je prethodno primenjen mOX40L_miR122 nisu pokazale rast tumora (0/6 životinja) tokom 23 dana posle ponovnog izazivanja sa tumorskim ćelijama. Za poređenje, 67% (6/9 životinja) životinja u naivnoj kontrolnoj grupi pokazalo je rast tumora na dan 23. Ovi rezultati pokazuju da primena iRNK koja kodira OX40L polipeptid indukuje memorijski imunski odgovor sa antitumorskim efektima.

Primer 12. Produžena in vivo ekspresija OX40L u A20 tumorima

[0669] In vivo ekspresija OX40L u mikrosredini tumora procenjena je na modelu tumora A20 B-ćelijskog limfoma u različitim vremenskim tačkama posle jedne i/ili dve doze polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0670] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). OX40L modifikovana iRNK formulisana je u MC3 LNP kao što je prethodno opisano. Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona; NST-OX40L; SEQ ID NO: 68).

B. Tumorski model A20 B-ćelijskog limfoma

[0671] Tumori B-ćelijskog limfoma uspostavljeni su kao što je prethodno opisano. Kada su tumori dostigli srednju vrednost veličine od približno 1300 mm<3>, životinje su podeljene u tri grupe. Grupa I je tretirana sa jednom intratumorskom dozom mOX40L_miR122 (Cap1, G5 RP iRNK u 0,5 mol% DMG MC3 LNP) pri dozi od 15 µg iRNK. Grupa II (kontrola) je tretirana sa ekvivalentnom dozom negativne kontrole iRNK, NT OX40L. Grupa III je tretirana sa intratumorskom injekcijom PBS. Svaka grupa je takođe sadržala podgrupu životinja koje su primile drugu dozu iRNK ili PBS 7 dana posle prve doze.

21

C. Merenje ekspresije OX40L

[0672] Žive ćelije od A20 tumorskih ćelija analizirane su na ekspresiju OX40L na površini ćelije. Tumorsko tkivo je usitnjeno i procesuirano kroz ćelijske cediljke kako bi se pripremile suspenzije pojedinačnih ćelija. Žive ćelije su obojene anti-mišjim OX40L antitelom (kozje poliklonalno IgG, PE konjugovano; R&D Systems, Minneapolis, MN). Ćelije su zatim analizirane pomoću protočne citometrije. Rezultati su pokazani na SL.13.

D. Rezultati

[0673] SL. 13 pokazuje statistički značajnu ekspresiju OX40L na 24 sata, 72 sata, i 7 dana posle jedne doze mOX40L_miR122. Posebno, SL. 13 pokazuje da se ekspresija OX40L u A20 tumorima održava 72 sata i 7 dana posle jedne doze mOX40L_miR22. Kod životinja koje su primile drugu dozu, statistički značajna ekspresija OX40L detektovana je 24 sata posle druge doze mOX40L_miR122.

[0674] Ovi podaci pokazuju da primena mOX40L_miR122 rezultuje značajnim, produženim nivoima ekspresije OX40L polipeptida u tumorskom tkivu.

Primer 13. Identičnost tipova ćelija koje eksprimiraju OX40L posle iRNK tretmana

[0675] Procenjena je identičnost tipova ćelija koje eksprimiraju OX40L nakon iRNK tretmana unutar A20 i MC38 tumora. Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano. Mišji modeli A20 tumora i MC38 tumora uspostavljeni su kao što je prethodno opisano.

A. Diferencijacija ćelija pomoću protočne citometrije

[0676] Ćelije unutar A20 tumora diferencirane su pomoću CD19 i CD45 antitela, koja identifikuju B-limfom A20 ćelija kancera koje eksprimiraju CD19 (CD19<+>, CD45<+>) od imunskih infiltrata bez kancera (CD19-, CD45<+>) i ćelija bez kancera/neimunskih ćelija (CD19-, CD45-), respektivno. Rezultati su pokazani na SL. 14A. Ćelije unutar MC38

21

tumora diferencirane su pomoću CD45 markera kako bi se diferencirale infiltrirajuće imunske ćelije domaćina (CD45<+>) od ćelija kancera i neimunskih ćelija domaćina (CD45-). Rezultati su pokazani na SL. 14B. Imunske ćelije infiltrata diferencirane su sa CD11b antitelom. CD11b<+>imunske ćelije infiltrata su odvojeno analizirane na OX40L ekspresiju. Rezultati su pokazani na SL.14C.

B. Rezultati

[0677] SL. 14A pokazuje da kod A20 tumora tretiranih sa mOX40L_miR122, 76% ćelijske populacije koja eksprimira OX40L bile su same A20 tumorske ćelije, dok približno 19% OX40L pozitivne ćelijske populacije bile su ćelije imunskog sistema infiltracije unutar A20 tumora. Pokazano je da populacija imunskih ćelija domaćina koje eksprimiraju OX40L pretežno su ćelije mijeloidne loze, što je određeno pozitivnim bojenjem za CD11b. Od CD11b<+>ćelija mijeloidne loze u A20 tumorima, u proseku 25,4% je bilo pozitivno na ekspresiju OX40L (SL.14C).

[0678] SL. 14B pokazuje da kod MC38 tumora, većina OX40L pozitivnih ćelija bile su ćelije kancera (u proseku 57,3%), dok 35,6% pozitivnih ćelija bili su imunski infiltrati, opet primarno poreklom iz mijeloidne loze (CD45<+>, CD11b<+>).

[0679] Ovi podaci pokazuju da primena mOX40L_miR122 rezultuje ekspresijom OX40L u značajnom procentu u sredini tumora nakon intratumorske primene iRNK, i da većina ćelija koje eksprimiraju OX40L bile su ćelije kancera praćeno infiltratima mijeloidnih imunskih ćelija.

Primer 14. Modulacija populacija imunskih ćelija unutar tumora tretiranih sa OX40L iRNK

[0680] S obzirom na demonstriranu aktivnost OX40L na urođenim imunskim ćelijama prirodnim ubicama (NK) i adaptivnim CD4<+>/CD8<+>T ćelijama, cilj sledećih studija bio je da se procene farmakodinamički efekti intratumorskog tretmana sa OX40L na populacije imunskih ćelija povezanih sa tumorom. Mišji tumorski modeli A20 i MC38 uspostavljeni su kao što je prethodno opisano.

A. Diferencijacija ćelija pomoću protočne citometrije

21

[0681] A20 tumori su tretirani sa jednom dozom od 12,5 µg mOX40L_miR122 ili kontrolne iRNK (RNK/LNP) koja je formulisana u lipidnim nanočesticama. Uzorci tumora su prvobitno analizirani 24 sata nakon tretmana. NK ćelije su diferencirane upotrebom antitela prema markeru ćelijske površine zrelih NK ćelija, DX5. Rezultati su pokazani na SL. 15A. Drugi uzorci tumora su analizirani 14 dana posle tretmana sa mOX40L_miR122. CD4+ i CD8<+>T-ćelije su identifikovane upotrebom anti-mišjih CD4 i anti-mišjih CD8 antitela, respektivno. Rezultati su pokazani na SL. 15B-15C.

[0682] Sličan eksperiment je izveden u tumorskom modelu MC38. Miševima sa MC38 tumorima primenjena je jedna intratumorska injekcija mOX40L_miR122 ili NST-OX40L. Kod nekih životinja druga doza iRNK je primenjena 6 dana posle prve doze. Infiltrat imunskih ćelija je procenjen na CD8<+>ćelije 24 sata i 72 sata posle svake doze iRNK. Rezultati su pokazani na SL. 15D.

B. Rezultati

[0683] SL. 15A pokazuje da se 24 sata posle primene mOX40L_miR122 na A20 tumore, NK ćelijska infiltracija značajno povećala kod životinja koje su dozirane sa OX40L u poređenju sa kontrolama. SL. 15B-15C pokazuju da je 14 dana posle primene mOX40L_miR122 na A20 tumore, i CD4<+>(SL. 15B) i CD8<+>(SL. 15C) T-ćelijska infiltracija u mikrosredinu tumora značajno povećana u poređenju sa kontrolnim uzorcima tumora.

[0684] SL. 15D pokazuje značajno povećanje infiltriranih CD8<+>T-ćelija 72 sata posle druge doze mOX40L_miR122 u MC38 tumorima u poređenju sa tumorima koji su tretirani kontrolom.

[0685] Ovi podaci iz dva tumorska modela demonstriraju da primena polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid promoviše povećan broj i urođenih i adaptivnih imunskih ćelija unutar mikrosredine tumora.

Primer 15. In vivo efikasnost kod A20 tumora

[0686] In vivo efikasnost je procenjena na modelu A20 tumora. A20 tumori su uspostavljeni kao što je prethodno opisano.

22

A. Tretman tumora

[0687] Miševi su tretirani bilo sa 12,5 µg po dozi mOX40L_miR122 u LNP, 12,5 µg po dozi negativne kontrole iRNK dizajnirane da se ne translatira u protein u LNP (NST-OX40L), PBS negativnom kontrolom, ili su ostavljeni netretirani. iRNK/LNP i negativne kontrole su dozirane u zapremini od 25 µl direktno u A20 tumorske lezije pri učestalosti od jednom svakih 7 dana za do 6 doza maksimum. Zapremine tumora pojedinačnih životinja pokazane su na SL. 16A (izmereno kao mm<3>). Kaplan-Majerova kriva preživljavanja istih životinja pokazana je na SL. 16B. X-ose na oba grafikona su dani nakon indukcije bolesti, tj. subkutane implantacije ćelija kancera.

B. Rezultati

[0688] SL. 16A pokazuje da je povećan broj životinja tretiranih sa mOX40L_miR122 pokazao inhibiciju rasta tumora u poređenju sa kontrolnim životinjama. Sve kontrolne životinje (30/30) žrtvovane su do dana 60 nakon indukcije bolesti (prvenstveno zbog dostizanja unapred određene krajnje tačke opterećenja tumorom ≥ 2000 mm3). Nasuprot tome, 4/9 životinja ili 44% miševa tretiranih sa mOX40L_miR122 još nije dostiglo krajnju tačku opterećenja tumorom do dana 98.

[0689] SL. 16B pokazuje korist mOX40L_miR122 tretmana za preživljavanje, u kom su 2 miša u mOX40L_miR122 grupi (kako je označeno zvezdicom∗ na SL.16A) i 1 iz PBS grupe uklonjeni iz studije zbog ulceracije tumora i nisu uključeni u procenu preživljavanja. Prema ovim kriterijumima, 2/8 ili 25% životinja tretiranih sa OX40L iRNK naizgled je bilo sa potpunim odgovorom do dana 98 nakon implantacije u poređenju sa 0/29 kontrolnih životinja.

[0690] Ovi podaci pokazuju in vivo efikasnost primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (mOX40L_miR122) u modelu A20 tumora.

Primer 16. miR-122 modulira ekspresiju OX40L

[0691] Procenjeni su efekti inkorporisanja miR-122 vezujućeg mesta u polinukleotid.

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0692] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mišji OX40L, mOX40L_miR122, SEQ ID NO: 66; humani OX40L, hOX40L_miR122, SEQ ID NO: 65). Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira mišji OX40L polipeptid ili humani OX40L polipeptid, svaki bez miR-122 vezujućeg mesta, takođe su pripremljeni kako bi se uporedili efekti prisustva miR-122 vezujućeg mesta.

B. Transfekcije ćelija

[0693] Primarni humani hepatociti, ćelije humanog kancera jetre (Hep3B), i ćelije humanog karcinoma grlića materice (HeLa) transfektovane su polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira humani OX40L polipeptid (hOX40L) ili polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira humani OX40L polipeptid i dodatno sadrži miR-122 vezujuće mesto (hOX40L_miR122). Ćelije su analizirane na ekspresiju OX40L 6 sati, 24 sata, i 48 sati posle transfekcije. Rezultati su pokazani na SL. 17A. Isti eksperiment je takođe izveden sa mišjim OX40L, kao što je pokazano na SL.17B.

C. Rezultati

[0694] SL. 17A pokazuje da je inkorporisanje miR-122 vezujućeg mesta u polinukleotid značajno redukovalo ekspresiju humanog OX40L u primarnim hepatocitima u kasnijim vremenskim tačkama. Specifično, 24 sata nakon transfekcije, ekspresija OX40L bila je redukovana za 88% sa 6.706 ng/bunariću u ćelijama tretiranim sa hOX40L (bez miR-122 vezujućeg mesta) na 814 ng/bunariću u ćelijama tretiranim sa hOX40L_miR122 (koji sadrži miR-122 vezujuće mesto). Na 48 sati nakon transfekcije, ekspresija OX40L bila je redukovana za 94% sa 11.115 ng/bunariću na 698 ng/bunariću u ćelijama tretiranim sa polinukleotidom koji sadrži miR-122 vezujuće mesto.

[0695] SL. 17B pokazuje slične rezultate za mišji OX40L. Inkorporisanje miR-122 vezujućeg mesta u polinukleotid redukovalo je ekspresiju mišjeg OX40L u primarnim hepatocitima za 85% za 24 sata (sa 1.237 ng/bunariću na 182 ng/bunariću) i za 91% za 48 sati (sa 1.704 ng/bunariću na 161 ng/bunariću).

[0696] Ovi podaci pokazuju da inkorporisanje mikroRNK vezujućeg mesta (miR-122) u polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid redukuje ekspresiju OX40L polipeptida u primarnim hepatocitima u poređenju sa polinukleotidom kome nedostaje miR-122 vezujuće mesto.

Primer 17. In vivo aktivnost OX40L-kodirajućeg polinukleotida nakon intravenske primene

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK

[0697] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona: NST_OX40L_122).

B. Tumorski model akutne mijeloidne leukemije (AML)

[0698] Tumori akutne mijeloidne leukemije (AML) uspostavljeni su subkutano kod miševa. Mišje AML ćelije (P388D1 ćelije, ATCC br. CCL-46, ATCC, Manassas, VA) kultivisane su u skladu sa uputstvima prodavca. Ćelije su inokulisane subkutano u DBA/2 miševe kako bi se generisali subkutani tumori. Tumori su praćeni u pogledu veličine i palpabilnosti.

[0699] Kada su tumori uspostavljeni, životinje su podeljene u pet grupa. Doziranje za grupe sa intratumorskim doziranjem je bilo na svakih 7 dana (Q7D), počevši 7 dana posle implantacije tumora. Grupa I je tretirana sa intratumorskim dozama mOX40L_miR122 pri dozi od 12,5 µg iRNK (fiksna doza). Grupa II je tretirana sa intratumorskim dozama kontrolne NST_OX40L_122 iRNK po istom režimu doziranja. Doziranje za grupe sa intravenskim doziranjem je bilo na svakih 7 dana, počevši 4 dana posle implantacije tumora. Grupa III je tretirana sa intravenskim dozama mOX40L_miR122 pri dozi od 0,5 mg iRNK po kg telesne težine. Grupa IV je tretirana sa intravenskim dozama kontrolne iRNK po istom režimu doziranja. Grupa V je tretirana sa intravenskim dozama PBS.

22

C. Rezultati

[0700] Rezultati su pokazani na SL. 18A-18E i SL. 19. SL. 18A pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama kontrolne NST_OX40L_122 iRNK. SL. 18B pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama mOX40L_miR122 iRNK. SL. 18C pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intravenskom kontrolnom iRNK. SL.

18D pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intravenskim dozama mOX40L_miR122 iRNK. SL. 18E pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intravenskim dozama PBS (negativna kontrola).

[0701] Ovi rezultati pokazuju da i intratumorska i intravenska primena polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid koji sadrži miRNA vezujuće mesto redukuje ili inhibira rast tumora u poređenju sa kontrolnom iRNK ili PBS tretmanom.

[0702] SL. 19 pokazuje krive preživljavanja za životinje tretirane sa intravenskim dozama mOX40L_miR122 u poređenju sa životinjama tretiranim intravenski sa kontrolnom iRNK ili PBS. Ovi rezultati pokazuju da intravensko doziranje mOX40L_miR122 povećava preživljavanje u mišjem modelu tumora u poređenju sa preživljavanjem miševa tretiranih sa kontrolnom iRNK.

Primer 18. In vivo efikasnost kombinacije iRNK koja kodira OX40L polipeptid, i anti-PD-1 antitela

A. Priprema OX40L modifikovane iRNK i anti-PD-1 antitela

[0703] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). Takođe je pripremljena negativna kontrola iRNK (NST_OX40L_122).

[0704] Rastvori za doziranje anti-PD-1 monoklonalnih antitela (BioXcell BE0146, antimPD-1, klon RMP1-14, partija br. 5792-599016J1) pripremljeni su razblaživanjem alikvota štoka (6,37 mg/ml) do 0,5 mg/ml u sterilnom PBS. Rastvor za doziranje od 0,5 mg/ml obezbedio je dozu od 5 mg/kg u doznoj zapremini od 10 ml/kg. Rastvor za doziranje anti-PD-1 pripreman je svakodnevno svež i skladišten je zaštićen od svetlosti na 4 °C.

[0705] Rastvori za doziranje pacovskog IgG2a (BioXcell BE0089, pacovski IgG2a, klon 2A3, partija br. 601416M1) pripremljeni su razblaživanjem alikvota štoka (7,38 mg/ml) do 0,5 mg/ml u sterilnom PBS. Rastvor za doziranje od 0,5 mg/ml obezbedio je dozu od 5 mg/kg u doznoj zapremini od 10 ml/kg. Rastvor za doziranje anti-PD-1 pripreman je svakodnevno svež i skladišten je zaštićen od svetlosti na 4 °C.

B. Model MC38 adenokarcinoma kolona

[0706] Tumori MC-38 adenokarcinoma kolona uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa kao što je prethodno opisano.

[0707] Kada su tumori uspostavljeni, životinje su podeljene u grupe i primale sa intratumorske doze jedne od sledećih kombinovanih terapija pokazanih u tabeli u nastavku:

Tabela 10: Kombinovano doziranje i interval

[0708] Miševi su primali intratumorske doze iRNK na svakih 7 dana (Q7D). Miševi su primali intratumorske doze antitela na svake dve nedelje (BIWx2).

C. Rezultati

22

[0709] Rezultati su pokazani na SL. 20A-20E i SL. 21. SL. 20A pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama kontrolne NST_OX40L_122 iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama kontrolnog antitela. U kontrolnoj grupi bilo je 0/15 životinja sa potpunim odgovorom (CR). SL. 20B pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama mOX40L_miR122 iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama kontrolnog antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 0/15 za ovu grupu. SL. 20C pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskom kontrolnom iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama anti-PD-1 antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 2/15 za ovu grupu. SL. 20D pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama mOX40L_miR122 iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama anti-PD-1 antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 6/15 za grupu sa dvostrukom kombinacijom. SL. 20E pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama PBS u kombinaciji sa intratumorskim dozama anti-PD-1 antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 0/15 za ovu grupu. SL. 20F pokazuje individualni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama PBS u kombinaciji sa intratumorskim dozama kontrolnog antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR za ovu grupu tretmana bio je 0/14.

[0710] Ovi rezultati pokazuju da je kombinovana terapija koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i inhibitor imunske kontrolne tačke, kao što je anti-PD-1 antitelo, efikasna in vivo za inhibiranje ili redukovanje rasta tumora u MC38 mišjem tumorskom modelu. Kombinacija mOX40L_miR122 sa anti-PD-1 antitelom pokazala je sinergističku in vivo anti-tumorsku efikasnost. Ovi rezultati takođe pokazuju da se niže doze iRNK mogu upotrebljavati u kombinovanoj terapiji.

[0711] SL. 21 pokazuje krive preživljavanja za životinje u istim grupama tretmana. Ovi rezultati pokazuju da kombinovanje intratumorskog doziranja modifikovane OX40L iRNK sa intratumorskim doziranjem anti-PD-1 antitela efikasno povećava preživljavanje u mišjem tumorskom modelu u poređenju sa kontrolnim grupama tretmana.

Primer 19. In vivo memorijski imunski odgovor nakon tretmana sa kombinovanom terapijom

22

[0712] Miševi su tretirani sa mOX40L_miR122 u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom kao što je prethodno opisano u Primeru 18. Na dan 90 nakon inokulacije tumora, četiri životinje sa potpunim odgovorom (CR) iz grupe kombinovane terapije mOX40L_miR122 anti-PD-1 ponovo su izazvane sa 5 × 10<5>MC38 tumorskih ćelija. Kao kontrola, 10 naivnih životinja je takođe inokulisano sa 5 × 10<5>MC38 ćelija. Rezultati analize su pokazani na SL.22A i 22B.

[0713] SL. 22A pokazuje individualni rast tumora kod naivnih životinja izazvanih sa MC38 ćelijama. Naivni miševi su počeli da razvijaju detektabilne tumore približno 5 dana posle implantacije, i tumori su nastavili da rastu tokom studije. SL. 22B pokazuje individualni rast tumora kod životinja sa potpunim odgovorom kojima su prethodno date intratumorske doze kombinovane terapije mOX40L_miR122 i anti-PD-1 antitela. Životinje sa potpunim odgovorom nisu pokazale rast tumora (0/4 životinje) tokom 23 dana posle ponovnog izazivanja sa tumorskim ćelijama. Nasuprot tome, naivne životinje su pokazale visok procenat rasta tumora. Ovi rezultati pokazuju da intratumorsko doziranje iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom indukuje memorijski imunski odgovor sa antitumorskim efektima.

22

2

21

22

�

24

2

24

2

21

22

2

��

2

21

22

2

24

Claims

Patentni zahtevi

1. Formulacija lipidne nanočestice iRNK koja kodira OX40L polipeptid za upotrebu u postupku redukovanja ili smanjenja veličine tumora, inhibiranju rasta tumora, ili u postupku lečenja kancera,

naznačena time što iRNK sadrži jedno ili više mikroRNK (miRNA) vezujućih mesta u 3' UTR, pri čemu je mikroRNK vezujuće mesto miR-122 vezujuće mesto.

2. Formulacija iRNK za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122-3p ili miR-122-5p.

3. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačena time što miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identičnu SEQ ID NO: 24 i miRNA vezujuće mesto se vezuje za miR-122.

4. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identičnu SEQ ID NO: 26 i miRNA vezujuće mesto se vezuje za miR-122.

5. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što insercija miRNA vezujućeg mesta u iRNK ne ometa translaciju funkcionalnog OX40L polipeptida u odsustvu odgovarajuće miRNA (npr. miR122); a u prisustvu miRNA (npr. miR122), insercija miRNA vezujućeg mesta u iRNK i vezivanje miRNA vezujućeg mesta za odgovarajuću miRNA sposobne su da vrše degradaciju polinukleotida ili sprečavaju translaciju iRNK.

6. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što je 3' UTR sintetički 3' UTR ili prirodni 3' UTR.

7. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu

2

najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj od SEQ ID NO: 1-3, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da se vezuje za OX40 receptor,

opciono pri čemu amino-kiselinska sekvenca ima jednu ili više konzervativnih supstitucija, pri čemu konzervativne supstitucije ne utiču na vezivanje OX40L polipeptida za OX40 receptor.

8. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time što iRNK sadrži sekvencu najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identičnu sekvenci nukleinske kiseline odabranoj od SEQ ID NO: 4-21.

9. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time što iRNK sadrži sekvencu najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnu sekvenci koja je izneta kao SEQ ID NO: 65, pri čemu je protein kodiran od strane iRNK sposoban da se vezuje za OX40 receptor divljeg tipa.

10. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačena time što je iRNK hemijski modifikovana.

11. Formulacija iRNK za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što modifikovana iRNK ima uniformnu hemijsku modifikaciju svih ili bilo kog istog tipa nukleozida, opciono pri čemu je iRNK potpuno modifikovana za određenu modifikaciju, opciono pri čemu su svi uridini zamenjeni analogom uridina, opciono pri čemu je modifikovana iRNK potpuno modifikovana sa N1-metilpseudouridinom (m1ψ) i/ili 5-metilcitozinom.

12. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačena time što je iRNK formulisana za intratumorsku isporuku i opciono se primenjuje intratumorski.

13. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, naznačeno time što postupak dodatno sadrži primenu PD-1 antagonista, PD-L1 antagonista, i/ili CTLA-4 antagonista, opciono pri čemu

I) PD-1 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za PD-1, opciono PD-1 antagonist je monoklonalno antitelo, opciono PD-1 antagonist je odabran iz grupe koja se sastoji od nivolumaba, pembrolizumaba, pidilizumaba, i bilo koje njihove kombinacije,

II) PD-L1 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za PD-L1, opciono je monoklonalno antitelo, opciono PD-L1 antagonist je odabran iz grupe koja se sastoji od durvalumaba, avelumaba, MEDI473, BMS-936559, atezolizumaba, i bilo koje njihove kombinacije, i/ili

III) CTLA-4 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za CTLA-4, opciono CTLA-4 antagonist je monoklonalno antitelo, opciono CTLA-4 antagonist je odabran iz grupe koja se sastoji od ipilimumaba, tremelimumaba, i bilo koje njihove kombinacije.

14. Formulacija iRNK za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, naznačeno time što se u postupku aktiviraju T ćelije, opciono pri čemu aktivirane T ćelije redukuju ili smanjuju veličinu tumora ili inhibiraju rast tumora.

2