[go: up one dir, main page]

RS63809B1 - Selektivni degradatori estrogenskih receptora - Google Patents

Selektivni degradatori estrogenskih receptora

Info

Publication number
RS63809B1
RS63809B1 RS20221142A RSP20221142A RS63809B1 RS 63809 B1 RS63809 B1 RS 63809B1 RS 20221142 A RS20221142 A RS 20221142A RS P20221142 A RSP20221142 A RS P20221142A RS 63809 B1 RS63809 B1 RS 63809B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
cells
pharmaceutically acceptable
formula
cancer
Prior art date
Application number
RS20221142A
Other languages
English (en)
Inventor
Jolie Anne Bastian
Jeffrey Daniel Cohen
Almudena Rubio
Daniel Jon Sall
Jennifer Anne McMahon
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=67470734&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63809(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of RS63809B1 publication Critical patent/RS63809B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4741—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having oxygen as a ring hetero atom, e.g. tubocuraran derivatives, noscapine, bicuculline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Finger-Pressure Massage (AREA)
  • Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)

Description

Opis
Osnova
[0001] Selektivni degradatori estrogenskog receptora (SERDi) se vezuju za estrogenski receptor (ER) i snižavaju transkripcionu aktivnost u kojoj je posrednik ER. Ova degradacija i snižavanje izazvano sa SERDima mogu da budu korisni u tretmanu poremećaja proliferacije ćelija, kao što je kancer.
[0002] Neki primeri SERDa malih molekula su otkriveni u literaturi (videti, na primer, WO2005073204, WO2014205136 i WO2016097071). Međutim, poznati SERDi još uvek nisu toliko korisni koliko je potrebno za efikasno lečenje raka. Na primer, pronalazak SERDa sa boljim farmakokinetičkim (PK) i farmakodinamičkim (PD) karakteristikama, sa većom efikasnošću u lečenju i dobrom oralnom bioraspoloživošću bi bili od velike pomoći u lečenju kancera. Čist antagonist SERD sa potentnom inhibicijom ER-posredovane transkripcije bi bio od velike koristi u lečenju kancera. Postoji potreba za novim SERDima za lečenje kancera kao što su kancer dojke, kancer jajnika, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer materice, kancer želuca i kancer pluća kao i mutacije zbog pojave rezistencije. Preciznije, postoji potreba za novm SERDima za lečenje ER-pozitivnog kancera dojke, kancera želuca i/ili kancera pluća.
Kratak sadržaj
[0003] Ovde su obezbeđena jedinjenja formule:
i njihove farmaceutski prihvatljive soli i njihove farmaceutske kompozicije. U ovoj formuli, ili je R<1>ili R<2>nezavisno izabran od Cl, F, -CF3ili -CF3, a drugi je vodonik.
[0004] Dalje je obezbeđeno jedinjenje kako je ovde opisano i njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu u terapiji. Ovde opisana jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste u tretmanu kancera dojke, kancera jajnika, kancera endometrijuma, kancera prostate, kancera materice, kancera želuca ili kancera pluća.
Detaljan opis
[0005] Ovde su otkrivena nova tetraciklinska jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljive soli koji deluju kao SERDi. Novo otkriveni SERDi koji su ovde opisani obezbeđuju inhibiciju ER-posredovane transkripcije što će da bude korisno u lečenju kancera kao što su kancer dojke, kancer jajnika, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer materice, kancer želuca i kancer pluća kao i mutacija zbog pojave rezistencije. Ovi SERDi mogu da se koriste ili kao pojedinačna sredstva ili u kombinaciji sa drugim grupama lekova uključujući selektivne modulatore estrogen receptora (SERMi), inhibitore aromataze, CDK4 inhibitore, CDK6 inhibitore, PI3K inhibitore i mTOR inhibitore za lečenje hormon receptor- pozitivnih kancera kao što su kancer dojke, kancer želuca i/ili kancer pluća.
[0006] Nova jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljive soli, koja su ovde opisana su predstavljena Formulom I:
pri čemu je ili R<1>ili R<2>nezavisno izabran od Cl, F, -CF3, ili -CF3, a drugi je vodonik.
Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da jedinjenja, kako je opisano Formulom I ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, sadrže asimetrični centar čija je pozicija u formuli označena sa<*>. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će takođe da razume da će Cahn-Ingold-Prelog (R) ili (S) označavanja za asimetrične centre da variraju u zavisnosti od modela supstitucije oko asimetričnog centra. Asimetrični centar u jedinjenju Formule I obezbeđuje R-enantiomerni oblik pokazan Formulom II:
[0007] A S-enantiomerni oblik je pokazan Formulom III:
[0008] Svi pojedinačni stereoizomeri, enantiomeri i diastereomeri, kao i smeše enantiomera i diastereomera, jedinjenja u skladu sa Formulom I, Formulom II i Formulom III uključujući racemate, su obuhvaćeni okvirom jedinjenja koja su ovde opisana. Jedinjenja za farmaceutsku upotrebu koja sadrže asimetrične centre su često izolovana kao pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri a ovako izolovana jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III su uključena u okvir jedinjenja koja su ovde otkrivena. Strčnjak sa iskustvom u tehnici će takođe da razume da ovde opisana jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III i njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu da budu deuterisana (gde vodonik može da bude zamenjen sa deuterijumom) i smatra se da su takve molekule uključene u okvir ovde otkrivenih jedinjenja.
[0009] Ovde su pokazani specifični primeri jedinjenja Formule I (uključujući nazive po IUPAC nomenklaturi):
5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol;
5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]hinolin-2-ol;
8-hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]hinolin-2-ol;
7-hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]hinolin-2-ol;
7-fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]hinolin-2-ol;
7-fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]hinolin-2-ol;
5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-metil-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol; i
5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-metil-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]hinolin-2-ol.
[0010] Zbog prethodno označenog asimetričnog centra, svaki od ovih specifičnih primera jedinjenja Formule I prethodno prikazanih, ima R- i S-enantiomerne oblike (to jest, R-enantiomerna jedinjenja Formule II i S-enantiomerna jedinjenja Formule III) kako je pokazano u Tabeli 1.
Tabela 1: Enantiomerni oblici jedinjenja Formule I
(nastavlja se)
[0011] Ovde su takođe opisane farmaceutske komozicije koje uključuju jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivom podlogom, nosačem ili razblaživačem. Ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu da se izrade upotrebom farmaceutski prihvatljivih aditiva. Naziv "farmaceutski prihvatljiv aditiv(i)" kako se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više nosača, razblaživaživača i podloga koje su kompatibilne sa drugim aditivima kompozicija ili formulacija i ne deluju štetno na pacijente. Ovde opisana jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III ili njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se formulišu kao farmaceutske kompozicije za primenu različitim načinima, kao što su oralno ili IV.
Bioraspoloživost je često faktor u tretmanu kancera a sposobnost izbora načina primene i farmaceutskih kompozicija za kontrolu ili optimizaciju bioraspoloživosti aktivnog sastojka je korisna. Na primer, oralna bioraspoloživost SERD kompozicije bi bila posebno korisna.
Veruje se da jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, kako je ovde opisano, imaju oralnu bioraspoloživost. Primeri farmaceutskih kompozicija i procesi za njihovu izradu mogu da se nađu u "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", L. V. Allen Jr, Editor, 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012. Neograničavajući primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i podloga uključuju sledeće: fiziološki rastvor, vodu, skrob, šećere, manitol i derivate silicijuma; sredstva za vezivanje kao što su karboksimetil celuloza i drugi derivati celuloze, alginati, želatin i polivinilpirolidon; kaolin i bentonit; i polietil glikole.
[0012] Ovde su takođe opisana jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u terapiji. Ovde su takođe obezbeđena jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u tretmanu kancera dojke, kancera jajnika, kancera endometrijuma, kancera prostate, kancera materice, kancera želuca ili kancera pluća. Posebno, kancer dojke može da bude ER-pozitivni kancer dojke, ER-pozitivni kancer želuca ili ER-pozitivni kancer pluća. Na primer, jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, mogu da se primene oralno.
[0013] Jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da budu od kliničke koristi kao pojedinačno sredstvo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava (na primer, anti-kancerogena sredstva), za tretman kancera kao što su kancer dojke, kancer jajnika, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer materice, kancer želuca ili kancer pluća. Kada se koriste u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima (kao što su anti-kancerogena sredstva), jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu da se koriste istovremeno, po redu ili odvojeno od drugih terapeutskih sredstava.
Primeri grupa lekova sa kojima jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu da se kombinuju, uključuju SERMi, inhibitore aromataze, CDK4 inhibitore, CDK6 inhibitore, PI3K inhibitore i mTOR inhibitore za lečenje hormon receptor-pozitivnog kancera dojke. Mnogo precizniji primeri lekova sa kojima jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu da se kombinuju uključuju abemaciklib (CDK4/6 inhibitor), everolimus (mTOR inhibitor), Alpelisib (PIK3CA inhibitor) i 8-[5-(1-hidroksi-1-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoksipropil]-3-metil-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (PI3K/mTOR inhibitor).
[0014] Kako se ovde koristi, naziv "efektivna količina" se odnosi na količinu ili dozu jedinjenja Formule I, Formule II i Formuli III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, koja nakon pojedinačne ili višestruke primene doze na pacijentu obezbeđuje traženi efekat kod pacijenta pod dijagnozom ili tretmanom. Preferirano, traženi efekat je inhibicija proliferacije ćelija tumora, smrt ćelije tumora ili oba. Jedinjenja Formule I, Formule II i Formuli III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli su generalno efikasna u velikom opsegu doze. Na primer, dnevno doziranje je obično u opsegu od približno100 mg do približno 2000 mg.
[0015] Kako se ovde koristi, "lečenje", "tretiranje" ili "tretman" se odnosi na obuzdavanje, usporavanje, zaustavljanje, ili preobražaj progresije ili težine postojećih simptoma ili poremećaja.
[0016] Kako se ovde koristi, naziv "pacijent" se odnosi na ljude kod kojih postoji određena bolest, poremećaj ili stanje.
[0017] Jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se izrade različitim procedurama poznatim u tehnici od kojih su neke ilustrovane u niže datim Izradama i Primerima. Specifične faze sinteze za svaki od opisanih načina mogu da se kombinuju na različite načine ili u konjukciji sa fazama iz različitih procedura za izradu jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Produkti mogu da se povrate uobičajenim postupcima dobro poznatim u tehnici, uključujući ekstrakciju, evaporaciju, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. Reagensi i sirovine su lako raspoloživi za stručnjaka sa uobičajenim iskustvom u tehnici.
[0018] Međuproizvodi i procesi korisni za sintezu jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III, kako je ovde opisano, treba da budu uključeni u ovaj opis. Pored toga, neki ovde opisani međuproizvodi mogu da sadrže jednu ili više zaštitnih grupa. Različite zaštitne grupe mogu da budu iste ili različite u svakoj pojavi u zavisnosti od određenih uslova reakcije i određenih transformacija koje se izvode. Uslovi zaštite i deprotekcije su dobro poznati stručnjaku u praksi i opisani su u literaturi (videti na primer "Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc.2007).
[0019] Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u praksi može da razdvoji ili izdvoji pojedinačne izomere, enantiomere i diastereomere u bilo kojoj pogodnoj tački u procesu sinteze jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, postopcima kao što su tehnike selektivne kristalizacije ili asimetrična hromatografija (videti na primer J. Jacques i saradnici, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Eliel
1
and S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Mada pojedinačni izomeri, enantiomeri i diastereomeri mogu da se izdvoje ili razdvoje kako je ovde navedeno, njihove Cahn-Ingold-Prelog (R) ili (S) oznake za asimetrične centre možda još nisu utvrđene. Kako Cahn-Ingold-Prelog (R) ili (S) oznake nisu raspoložive, identifikatori "izomer 1" i "izomer 2" se koriste u kombinaciji sa IUPAC nazivom bez Cahn-Ingold-Prelog stereohemijske oznake. Jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III koja su ovde identifikovana kao "izomer 1" ili "izomer 2" su izdvojena kako je definisano u niže datim specifičnim eksperimentalnim opisima. Da li je izomer "1" ili "2", zavisi od redosleda u kome se jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III eluiraju iz kolone za asimetričnu hromatografiju pod navedenim uslovima, tj. "izomer 1" je prvi koji eluira iz kolone pod navedenim uslovima. Ukoliko je asimetirična hromatografija započeta ranije u procesu sinteze, ista oznaka se primenjuje na naredne međuproizvode i jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III.
[0020] Ukoliko nije posebno navedeno, ovde korišćene skraćenice su definisane u skladu sa Aldrichimica Acta, Vol.17, No. 1, 1984. Ostale skraćenice su definisane na sledeći način: "ACN" se odnosi na acetonitril; "BSA" se odnosi na albumin seruma govečeta; "cataCXium® A Pd G3" se odnosi na [(di(1-adamantil)-butilfosfin)-2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat; "DCM" se odnosi na dihlormetan ili metilen hlorid; "DMA" se odnosi na dimetilacetamid; "DMEA" se odnosi na dimetiletilamin; "DMEM" se odnosi na Dulbekov modifikovani Eagle-ov medijum; "DMF" se odnosi na N,N-dimetilformamid; "DMSO" se odnosi na dimetil sulfoksid; "DNK" se odnosi na deoksiribonukleinsku kiselinu; "cDNK" se odnosi na komplementarnu DNK; "DNase" se odnosi na deoksiribonukleazu; "DTT" se odnosi na ditiotreitol; "EC50" se odnosi na koncentraciju sredstva koja produkuje 50% odgovora ciljane aktivnosti u poređenju sa predefinisanim jedinjenjem pozitivne kontrole (apsolutne EC50); "EDTA" se odnosi na etilendiamintetrasirćetnu kiselinu; "ee" se odnosi na enantiomerni višak; "ERα" se odnosi na alfa estrogenski receptor; "ERβ" se odnosi na beta estrogenski receptor; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "EtOH" se odnosi na etanol ili etil alkohol; "FBS" se odnosi na serum fetusa govečeta; "HBSS" se odnosi na Hank-ov uravnoteženi rastvor soli; "HEC" se odnosi na hidroksi etil celulozu; "HEPES" se odnosi na 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonsku kiselinu; "HPLC" se odnosi na visoko efikasnu tečnu hromatografiju; " IC50" se odnosi na koncentraciju sredstva koja produkuje 50% maksimalnog inhibitornog odgovora mogućeg za to sredstvo (relativna IC50), ili na koncentraciju sredstva koja produkuje 50% inhibicije aktivnosti ciljanog enzima u poređenju sa placebo kontrolom (apsolutna IC50); "IPA" se odnosi na izopropilamin; "iPrOH" se odnosi na izopropanol ili izopropil alkohol; "IV" se odnosi na intravensku primenu; "Ki" se odnosi na konstantu inhibicije; "MEK" se odnosi na metil etil keton; "MeOH" se odnosi na metil alkohol ili metanol; "MTBE" se odnosi na metil t-butil etar; "PBS" se odnosi na puferovane fosfatne soli; "PO" se odnosi na oralnu primenu; "PRα" se odnosi na alfa receptor progesterona; "QD" se odnosi na doziranje jedanput dnevno; "RNK" se odnosi na ribonukleinsku kiselinu; "RNase" se odnosi na ribonukleazu; "RT-PCR" se odnosi na lančanu reakciju reverzne transkripcije polimeraze; "RT-qPCR" se odnosi na lančanu reakciju reverzne kvantitativne transkripcije polimeraze; "SFC" se odnosi na superkritičnu tečnu hromatografiju; "TED50" se odnosi na efektivnu dozu da se dostigne 50% ciljane inhibicije u tumorima; "THF" se odnosi na tetrahidrofuran; "t(R)" se odnosi na vreme zadržavanja;
"XantPhos Pd G2" se odnosi na hlor[(4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksanten)-2- amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II); i "XPhos Pd G2" se odnosi na hlor(2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil)[2- amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II).
[0021] Naredne izrade i primeri dalje ilustruju pronalazak.
Izrade i Primeri
[0022]
Šema 1
[0023] Šema 1 opisuje sinteze jedinjenja Formule I.
[0024] U Fazi A je izvedena Grignardova reakcija. Grignardova reakcija je dobro poznata u tehnici kao reakcija za formiranje ugljenik-ugljenik veza. Reakcija uključuje organometalnu reakciju u kojoj se aril magnezijum halid, Grignardov reagens, vezuje za karbonil grupu kao što je kiseli hlorid jedinjenja 2, da se dobije jedinjenje iz Faze A. Na primer, 4-hlorsupstituisani hinolon, jedinjenje 1, se tretira sa Grignardovim reagensom, kao što je izopropilmagnezijum hlorid, da se formira Grignard međuproizvod a nakon toga se dodaje kiseli hlorid, 4-fluorobenzoil hlorid, jedinjenje 2, u rastvaraču kao što je THF. Po završetku, reakcija može da se neutrališe sa vodom da se dobije jedinjenje 3.
[0025] U Fazi B, aril metil etar jedinjenja 3 može da se demetiluje pod različitim uslovima poznatim stručnjaku sa iskustvom kao što je tretman sa bortribromidom. Na primer, jedinjenje
1
3 se polako tretira sa bortribromidom na temperaturi od približno 0 °C u rastvaraču kao što je DCM. Smeša se meša na sobnoj temperaturi i neutrališe sa dibaznim kalijum fosfatom da se dobije jedinjenje 4.
[0026] U Fazi C, azetidin etar 6 može da se formira tretmanom odgovarajućeg p-fluorofenil ketona 4 i soli azetidin alkohola 5, ili odgovarajuće slobodne baze sa pogodnom bazom, na primer natrijum hidridom, natrijum t-butoksidom ili kalijum t-butoksidom, u odgovarajućem aprotičnom polarnom rastvaraču kao što su DMF ili THF, da se dobije etar jedinjenje 6.
[0027] Jedinjenje 6 se nakon toga u Suzuki reakciji unakrsnog udvajanja alkiluje sa odgovarajuće supstituisanom aril bornom kiselinom, jedinjenje 7, da se dobije jedinjenje 8 u Fazi D. Stručnjak sa iskustvom će znati da postoje različiti uslovi koji mogu da budu korisni za postizanje ovakvih reakcija unakrsnog udvajanja. Pogodni paladijum reagensi mogu da uključe XantPhos Pd G2, cataCXium® A Pd G3, bis(trifenilfosfin)paladijum(II) hlorid, tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum (0) sa tricikloheksilfosfinom, (1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen)paladijum(II) hlorid, paladijum tetrakistrifenilfosfin, ili paladijum(II) acetat. U pogodne baze spadaju kalijum fluorid, cezijum karbonat, natrijum karbonat, kalijum karbonat, litijum t-butoksid, ili tribazni kalijum fosfat monohidrat.
Jedinjenje 6, na primer, može da reaguje sa odgovaajućom bornom kiselinom, jedinjenje 7, kao što je 2-fluoro-4-(trifluorometil)fenilborna kiselina u rastvaraču kao što je 2-metil-2-butanol sa bazom kao što je kalijum karbonat i katalizatorom XPhos Pd G2 i zagreva se na približno 80 °C pod mikrotalasima da se dobije jedinjenje 8.
[0028] Stručnjak sa iskustvom u praksi će znati da Faza D, Suzuki reakcija unakrsnog udvajanja, može da bude završena pre formiranja azetidin etra u Fazi C.
[0029] U Fazi E, stručnjak sa iskustvom u praksi će prepoznati da jedinjenje 8 može da se ciklizuje inicijalnom redukcijom ketona. Ovo može da se izvrši pomoću redukcionog sredstva, kao što je litijum trietil borhidrid u rastvaračima kao što su 1,4- dioksan i THF, na temperaturi od približno 0 °C do sobne temperature, da se dobije odgovarajući sekundarni alkohol. Alkohol kao međuproizvod može da se ostavi kao sirov i može da se deprotonuje sa pogodnom bazom kao što su cezijum karbonat, natrijum hidrid, natrijum t-butoksid ili kalijum t-butoksid u rastvaraču kao što su THF, DMSO ili DMF. Nastali alkoksid može da se ciklizuje u aril fluorid na sobnoj temperaturi, uz zagrevanje do refluksa, ili na temperaturi od približno 60 °C. Nakon toga može da se dobije supstituisani ciklični etar formiran pri pomeranju fluorida da se dobiju jedinjenja Formule I.
[0030] Alternativno, keton 8, može da se redukuje u alkohol i asimetrično prečisti u Fazi F da se dobije asimetrični alkohol 9, a nakon toga ciklizuje u Fazi G kako je prethodno opisano za Fazu E, da se dobiju jedinjenja Formule I.
[0031] U drugoj alternativnoj reakciji, keton može da se redukuje upotrebom asimetričnog reagensa kao što je (R)-(+)-α.α-difenil-2-pirolidinmetanol zajedno sa trimetil boratom i bordimetilsulfidom da se direktno dobije željeni asimetrični alkohol, jedinjenje 9, koji nakon toga može da se ciklizuje u Fazi G, kako je prethodno opisano za Fazu E. da se dobiju jedinjenja Formule I.
[0032] U opcionoj fazi, farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano, može da se formira reakcijom odgovarajuće slobodne baze jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano sa odgovarajućom farmaceutski prihvatljivom kiselinom u pogodnom rastvaraču, pod standardnim uslovima. Pored toga, formiranje ovakvih soli može da se izvrši istovremeno nakon deprotekcije azotzaštitne grupe. Mogućnost formiranja farmaceutski prihvatljivih soli je dobro poznata. Videti, na primer, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J. i saradnici "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); i Berge, S.M. i saradnici, "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u praksi će razumeti da jedinjenje Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano može lako da se konvertuje i može da se izoluje kao farmaceutski prihvatljiva so. Primeri korisnih soli uključuju, ali bez ograničenja na, soli benzensulfonske kiseline i soli 4-metibenzensulfonske kiseline. Soli 4-metilbenzensulfonske kiseline su takođe poznate kao tosilatne soli.
Izrada 1
2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol
[0033]
1
[0034] Natrijum triacetoksiborhidrid (405 g, 1.91 mol) se u porcijama u periodu od 15 minuta na 0 °C dodaje u izmešani rastvor 3-(fluorometil)azetidin hidrohlorida (160 g, 1.28 mol) u DCM (2.4 L) u atmosferi N2i meša 10 minuta na 0 °C. Doda se 1,4-dioksan-2,5-diol (99 g, 0.83 mol) na 0 °C u 6 porcija u periodu od 1 sat a nakon toga meša 15 minuta na 0-5 °C. Reakcija se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša 2 sata u atmosferi N2. Reakcija se ohladi na 10-15 °C u periodu od 20 minuta, nakon toga zagreje na 25-30 °C i održava na toj temperaturi 2 sata. U periodu od 25-30 minuta na temperaturi od 10-15 °C se dodaje voda (800 mL), ostavi 5-10 minuta da se zagreje na sobnu temperaturu i nakon toga se slojevi razdvoje. Vodeni sloj se ispere sa DCM (800 mL), slojevi razdvoje a nakon toga se kombinovani vodeni slojevi ohlade na 10-15 °C i pH podesi na 13-14 koristeći 50% rastvor natrijum hidroksida (~540 mL). Vodeni sloj se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu, ekstrahuje sa DCM (4 X 800 mL), suši sa natrijum sulfatom (80 g), filtrira i koncentruje do sušenja da se dobije naslovljeno jedinjenje (139 g, 82%) kao gusto žuto ulje. ES/MS (m/z): 134.1(M+H).
Izrada 2
2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-dihidrohlorid
[0035]
[0036] 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol (529 g, 4 mol) se rastvori u MTBE (2.6 L) i ohladi na 0 °C. Dodaje se HCl/EtOH rastvor (492 mL, 30 mt %) u kapima u toku 30 minuta a nakon toga meša 30 minuta na 0 °C. Filtrirnjem se izdvoje čvrste supstance i filter pogača ispere sa MTBE (2 X 200 mL). Suši se 8 sati u atmosferi N2da se dobije naslovljeno jedinjenje (580 g, 86%) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 134.0 (M+H).
Izrada 3
1
(3-Hlor-7-metoksihinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanon
[0037]
[0038] Hlađenjem 4-bromo-3-hlor-7-metoksihinolina (70 g, 254 mmol) i THF (1 L) na 40 °C u atmosferi N2dolazi do precipitacije materijala. Dodaje se izopropilmagnezijum hlorid (2 M rastvor u THF, 254 mL, 509 mmol) u toku 20 minuta i smeša meša 1 sat. U kapima se dodaje rastvor 4-fluorobenzoil hlorida (66 mL, 559 mmol) u THF (140 mL) i nakon toga ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu. Reakcija se neutrališe sa zasićenim rastvorom NH4Cl (300 mL) i vodom (200 mL) i slojevi se razdvoje. Organski sloj se ispere sa zasićenim rastvorom NH4Cl (300 mL), suši preko MgSO4, filtrira i koncentruje da se dobije uljani ostatak. Sirovo braon ulje se filtrira kroz silika gel uz eluiranje sa smešom MTBE/heksani (1:1) da se dobije sirovi produkt kao žuta čvrsta supstanca (84 g). Čvrsta supstanca se tretira sa smešom 10%metilacetat/heptan (800 mL) i meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Filtrira se da se sakupe čvrste supstance i ostavi. Filtrat se koncentruje i prečisti na silika gelu uz eluiranje sa 10-40% EtOAc/heksani a nakon toga se produkt tretira sa smešom 10% metilacetat/heptan (200 mL) i meša 3 sata na sobnoj temperaturi. Filtriranjem se dobijaju čvrste supstance, kombinuju sa čvrstim supstancama iz prethodnog filtriranja i suše pod vakuumom u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (31 g, 38%) kao žuta čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 316.0 (M+H).
Izrada 4
(3-Hlor-7-hidroksihinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanon
[0039]
1
[0040] Bor tribromid (1 M rastvor u DCM, 295 mL, 295 mmol) se doda u smešu (3-hlor-7-metoksihinolin-4-il)-(4- fluorofenil)metanona (31 g, 98 mmol) u DCM (217 ml) i smeša meša 3 dana na sobnoj temperaturi. Smeša se na 0 °C polako sipa u rastvor dibaznog kalijum fosfata (2 M u vodi, 700 mL) i vode (200 mL). Smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša 1 sat. Rastvor se koncentruje pod vakuumom da se uklone organski rastvarači, filtrira, filtrat sakupi i suši pod vakuumom na 45 °C u toku noći. Čvrste supstance se tretiraju sa smešom DCM/heptan (1:1, 450 mL) i mešaju u toku noći. Čvrste supstance se sakupe i suše pod vakuumom u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (32 g, kvantitativni prinos) kao svetlo braon čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 302.0 (M+H).
Izrada 5
(3-Hlor-7-hidroksihinolin-4-il)-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)metanon
[0041]
[0042] 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol hidrohlorid (3.90 g, 23.0 mmol) se doda u izmešani rastvor (3-hlor-7-hidroksihinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona (5.00 g, 15.3 mmol) u DMF (75 ml) a nakon toga se doda natrijum hidrid (60% u mineralnom ulju, 3.02 g, 76.8 mmol). Meša se u atmosferi N2i zagreva 45 minuta na 40 °C. Rastvor se neutrališe sa vodom i koncentruje. Ostatak se podeli između 20% iPrOH/CHCl3i zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata i razdvoji, vodeni sloj se ekstrahuje sa 2 x 20% iPrOH/CHCl3, organski ekstrakti se kombinuju, kombinovani organski slojevi se suše preko magnezijum sulfata,
1
filtriraju i filtrat koncentruje da se dobije sirovi produkt kao tamno crveno ulje. Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 5-10% 7 N rastvor NH3u smeši MeOH/DCM da se dobije naslovljeno jedinjenje (5.31 g, 84%) kao žuta čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 415.0 (M+H).
Izrada 6
(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil){3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroksihinolin-4-il}metanon
[0043]
[0044] Smeša (3-hlor-7-hidroksihinolin-4-il)-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)metanona (200 mg, 0.48 mmol), 2-fluoro-4-(trifluorometil)fenilborne kiseline (158 mg, 0.72 mmol), kalijum karbonata (202 mg, 1.45 mmol), 2-metil-2-butanola (3 ml) i vode (1 ml) se u mikrotalasnoj bočici degasira sa N2(5x). Doda se XPhos Pd G2 (12 mg, 0.015 mmol), zatvori i 2 sata zagreva mikrotalasima na 80 °C. Ostatak se podeli između MTBE i zasićenog rastvora NH4Cl. Slojevi se razdvoje i vodeni sloj ekstrahuje sa MTBE. Organski ekstrakti se kombinuju, suše preko magnezijum sulfata, filtriraju i filtrat koncentruje da se dobije narandžasti ostatak. Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa smešom 5% MeOH/DCM da se dobije naslovljeno jedinjenje (205 mg, 78%) kao žuta čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 543.2 (M+H).
[0045] Naredna jedinjenja se izrađuju na način u osnovi analogan sa postupkom za Izradu 6, uz sledeće varijacije u proceduri, vreme zagrevanja između 1-2 sata, esktrakcija sa MTBE ili EtOAc i sušenje organskih slojeva preko magnezijum sulfata ili natrijum sulfata.
Prečiščavanje hromatografijom na koloni silika gela uz korišćenje do 10% (MeOH ili 7 M amonijačnom MeOH) u DCM (Izrada 10: gradijent 3-8% 7 M amonijačni MeOH u DCM;
1
Izrade 9 i 11: gradijent 4 do 10% 7 M amonijačni MeOH u DCM) i/ili reverzno faznom hromatografijom pod visokim pH kao što je navedeno.
Tabela 2: Jedinjenja izrađena u skladu sa Izradom 6
2
(nastavlja se)
Izrada 14
Racematni 4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)(hidroksi)metil]-3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]hinolin-7-ol
[0046]
[0047] U atmosferi N2se (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil){3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroksihinolin-4-il}metanon (305 g, 562.2 mmol) doda u THF (1.5 L) i rastvor ohladi na 0-5 °C. U kapima se doda litijum trietilborhidrid (1 M u THF, 1.5 L, 1.5 mol). Smeša se meša 1 sat na 0-5 °C. U kapima se dodaju voda (300 mL) i zasićeni NH4Cl (1 L). Smeša se zagreje na sobnu temperaturu. Doda se EtOAc (2 L) i organski sloj se sakupi. Organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (500 mL), suši preko MgSO4, filtrira i koncentruje do sušenja. Ostatak se rastvori u 95:5 smeši acetona i 2 M rastvora amonijaka u MeOH i filtrira preko silika gela da se dobije naslovljeno jedinjenje (264 g, 86.2%) kao narandžasta čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 545.2 (M+H).
Izrada 15
4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)(hidroksi)metil]-3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]hinolin-7-ol
Izomer 1
[0048]
[0049] Racematni 4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksilfenil)(hidroksi)metil]-3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]hinolin-7-ol (354 g, 0.62 mol) se prečisti koristeći asimetričnu hromatografiju pod sledećim uslovima: kolona Chiralpak AD-H, 150 x 50 mm, brzina protoka 300 g/minut, UV 350 nm, mobilna faza 35% iPrOH sa 0.5% DMEA/CO2, temperatura kolone 40 °C, da se dobije naslovljeno jedinjenje (171.4 g, 48%) prvog eluiranog izomera.
Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetričnim analitičkim SFC, >98% ee, t(R) =0.79 minuta, kolona: 4.6 x 150 mm Chiralpak AD-H, uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% iPrOH sa 0.5% DMEA u CO2, brzina protoka 0.6 mL/minut, UV detekcija 350 nm.
Alternativna Izrada 15
[0050] Trimetil borat (65 mg, 0.62 mmol) se doda u rastvor (R)-(+)-α.α-difenil-2-pirolidinmetanola (132 mg, 0.52 mmol) u THF (20 mL). Smeša se meša 1 sat u atmosferi N2na sobnoj temperaturi. Doda se bor-dimetilsulfid (2.0 M u THF, 2.6 mL, 5.2 mmol) a nakon toga (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil){3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroksihinolin-4-il}metanon (1.0 g, 1.73 mmol). Reakcija se zagreje u toku noći na 45 °C. Doda se nova količina bor-dimetilsulfida (2.0 M u THF, 2.6 mL, 5.2 mmol) i meša 5 sati na 45 °C. Polako se dodaje zasićeni rastvor NH4Cl (25 mL) i organska faza se izdvoji. Vodeni ekstrakti se ponovo ekstrahuju sa smešom 20% iPrOH/CHCl3. Organski ekstrakti se kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i upare da se dobije međuproizvod kompleksa bora (1.2 g). Rastvori se jedna trećina međuproizvoda kompleksa bora (0.4 g, 0.6 mmol) u 1,4-dioksanu (4 mL) i etanolaminu (0.3 mL, 5 mmol) i reakcija zagreva 3 sata na 70 °C. Reakcija se neutrališe sa zasićenim rastvorom NH4Cl (25 mL) i organska faza se izdvoji. Vodeni ekstrakti se ponovo ekstrahuju sa smešom 20% iPrOH/CHCl3(4 x 25 mL). Organski ekstrakti se kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju do sušenja da se dobije naslovljeno jedinjenje kao narandžasta čvrsta supstanca (0.33 g, 0.57 mmol, 100% prinos). LC/MS (m/z):
[M+H]<+>545. Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetričnim analitičkim SFC, 96% ee, t(R) =0.79 minuta, kolona: 4.6 x 150 mm Chiralpak AD-H, uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% iPrOH sa 0.5% DMEA u CO2, brzina protoka 0.6 mL/minut, UV detekcija 350 nm.
PRIMER 1
Racematni 5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]hinolin-2-ol
[0051]
[0052] Rastvor (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil){3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroksihinolin-4-il}metanona (5.27 g, 9.71 mmol) u 1,4-dioksanu (100 mL) se ohladi na 5 °C. Doda se litijum trietilborhidrid (1 M u THF, 30.0 mL, 30.0 mmol). Kupatilo za hlađenje se ukloni i rastvor meša 1.5 sat na sobnoj temperaturi. Smeša se
2
neutrališe sa vodom. Dodaju se zasićeni rastvor NH4Cl i EtOAc. Slojevi se razdvoje i vodeni sloj ekstrahuje sa EtOAc. Organski ekstrakti se kombinuju, suše preko anhidrovanog MgSO4, filtriraju i filtrat koncentruje. Sirovi ostatak se rastvori u THF (100 mL). Doda se natrijum hidrid (60% u mineralnom ulju, 1.94 g, 48.5 mmol). Rastvor se refluksuje u toku 1.5 sat. Doda se nova količina natrijum hidrida (60% u mineralnom ulju, 1.94 g, 48.5 mmol), a nakon toga refluksuje još 30 minuta. Rastvor se ohladi na sobnu temperaturu i neutrališe sa vodom. Dodaju se EtOAc i zasićeni rastvor NH4Cl. Slojevi se razdvoje i vodeni sloj ekstrahuje sa EtOAc. Organski ekstrakt se kombinuje, suši preko anhidrovanog MgSO4, filtrira i filtrat koncentruje. Ostatak se prečisti hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 5-7% MeOH u DCM da se dobije naslovljeno jedinjenje (3.70 g, 72%) kao svetlo žuta pena. ES/MS (m/z): 525.2 (M+H).
[0053] Naredna jedinjenja se izrađuju na način u osnovi analogan sa postupkom iz Primera 1, uz sledeće varijacije u proceduri. Za redukciju, koristi se 3 do 5 ekvivalenata litijum trietilborhidrida sa vremenom reakcije od 30 minuta do jedan sat i uz sušenje organskih slojeva preko magnezijum sulfata ili natrijum sulfata. Sirovi ostatak se koristi direktno ili prečisti hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 0-5-7.5-10% MeOH u DCM pre ciklizacije. Ciklizacija se obavlja refluksovanjem u THF za do 16 sati, ili u DMF, od 2 sata na sobnoj temperaturi za Pr.2, do 2 sata na 85 °C za Pr.8. Ekstrahuje se sa DCM ili EtOAc i organski slojevi suše preko magnezijum sulfata ili natrijum sulfata. Prečisti se hromatografijom na koloni silika gela koristeći do 10% (MeOH ili 7 M amonijačni MeOH) u DCM (Pr.2: gradijent 0-10% MeOH u DCM; Pr.5: gradijent 4-10% 7 M amonijačni MeOH u DCM; Pr.8: gradijent 5-7.5% 7 M amonijačni MeOH u DCM) ili reverzno faznom HPLC pod visokim pH kako je navedeno.
Tabela 3: Primeri jedinjenja izrađeni kao u Primeru 1
(nastavlja se)
2 (nastavlja se)
PRIMER 1A
5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 1 i
PRIMER 1B
5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0054]
2
[0055] Dva enantiomera 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ola se razdvoje asimetričnom SFC po sledećim uslovima: kolona: LUX® celuloza-1, 5 x 25 cm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% iPrOH (sa 0.5% DMEA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 300 g/minut; talasna dužina UV detekcije: 270 nm da se dobije Primer 1A kao prvi eluirani enantiomer (Izomer 1). ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.30 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm. Naslovljeno jedinjenje Primera 1B se izdvoji da se dobije drugi eluirani enantiomer (Izomer 2). ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 2 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, 98% ee, t(R): 2.03 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
Alternativna izrada PRIMERA 1B
Kristalni 5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0056] 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, 4-metilbenzensulfonska kiselina, Izomer 2 (23.8 g, 0.034 mol) u vodi (250 mL) se meša pri 1000 opm. Doda se NaOH (76 µL) i rastvor meša 2 sata. Doda se DCM (600 mL). Smeša se izdvoji, DCM ekstrakti suše sa magnezijum sulfatom, materijal filtrira kroz filter špric (0.45 µm) i koncentruje do sušenja. Materijal se ostavi da stoji u struji N2preko vikenda. Doda se smeša 1:1 EtOH/voda (80 mL) i smeša meša uz sonikaciju. Žuto-mrka čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem preko membrane od najlona da se dobije naslovljeno jedinjenje (10.47 g, 0.02 mol, 59%).
2
Difrakcija X-zraka praška (XRD)
[0057] XRPD modeli kristalinih čvrstih supstanci su dobijeni na Bruker D4 Endeavor difraktometru X-zraka praška, opremljenom sa CuKα izvorom i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorci se skeniraju između 4 i 402θ°, sa veličinom faze od 0.0082θ° i brzinom skeniranja od 0.5 sekundi/faza, koristeći divergenciju od 1.0 mm, fiksirani anti-sketer od 6.6 mm i detektor proreza od 11.3 mm. Suvi prašak se spakuje na kvarcni držač uzorka a glatka površina se dobija pomoću staklene ljuspice. Modeli difrakcije kristalnog oblika se sakupe na sobnoj temperaturi i pri relativnoj vlažnosti. Pozicije pikova kristala se određuju u MDI-Jade nakon pomeranja celog modela na osnovu internog NIST 675 standarda sa pikovima na 8.853 i 26.7742θ°. U kristalografskoj tehnici je dobro poznato da, za bilo koji dati kristalni oblik, relativni intenziteti pikova difrakcije mogu da variraju zbog preferirane orijentacije koja je rezultat faktora kao što su morfologija kristala i karakteristike. Kada su prisutni efekti preferirane orijentacije, intenziteti pikova su promenjeni, ali su karakteristične pozicije pika polimorfa nepromenjene. Videti, na primer, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, strane 1843-1844, 1995. Osim toga, u kristalografskoj tehnici je takođe dobro poznato da za bilo koji dati kristalni oblik ugaone pozicije pika mogu neznatno da variraju. Na primer, pozicije pika mogu da se menjaju zbog promena u temperaturi na kojoj se uzorak analizira, zbog pomeranja uzorka, ili prisustva ili odsustva unutrašnjeg standarda. U ovom slučaju, pretpostavlja se da promena pozicije pika od ± 0.22θ° uzima u obzir ove potencijalne varijacije bez ometanja nedvosmislene identifikacije naznačenog kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može da se izvrši na bazi bilo koje jedinstvene kombinacije različitih pikova.
[0058] Karakteristike izrađenog uzorka kristalnog 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksilfenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ola, Izomer 2 pomoću XRD modela koristeći CuKα zračenje koji ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj Tabeli 3 i koji posebno imaju pikove za 19.8 u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 6.8, 16.0 i 22.1; uz toleranciju za uglove difrakcije od 0.2 stepena.
2
Tabela 4: pikovi difrakcije X-zraka praška kristalnog Primera 1B
Alternativna izrada PRIMERA 1B
[0059] 4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)(hidroksi)metil]-3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]hinolin-7-ol, Izomer 1 (63.05 g, 104.7 mmol) se na sobnoj temperaturi rastvori u DMSO (1.3 L) u atmosferi N2. U porcijama se u toku 5 minuta dodaje cezijum karbonat (108 g, 331 mmol). Smeša se zagreva 15 sati na 60 °C. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu i razblaži sa vodom (2.1 L) i EtOAc (1.3 L). Smeša se meša 5 minuta i razdvoji. Vodeni materijal se ponovo ekstrahuje sa EtOAc (1.3 L) i meša 5 minuta. Organski ekstrakti se odvoje i kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, vodom i EtOAc. Organski ekstrakti se suše preko MgSO4, koncentruju i suše pod visokim vakuumom u toku noći na sobnoj temperaturi da se dobije naslovljeno jedinjenje kao braon čvrsta supstanca (52.69 g, 95.9%). Enantiomerno obogaćen Primer 1B se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, 98.1% ee, t(R): 2.03 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
PRIMER 2A 5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 1 i
2
PRIMER 2B
5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0060]
[0061] Dva enantiomera 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ola se razdvoje asimetričnom SFC pod sledećim uslovima: kolona: CHIRALPAK® IC, 21 x 250 cm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% iPrOH (sa 0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 70 g/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm da se dobije Primer 2A kao prvi eluirani enantiomer (Izomer 1). ES/MS (m/z): 525.1 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.56 minuta; kolona: CHIRALPAK® IC, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% iPrOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm. Naslovljeno jedinjenje Primera 2B se izdvoji da se dobije drugi eluirani enantiomer (Izomer 2). ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 2 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, 98% ee, t(R): 2.33 minuta; kolona: CHIRALPAK® IC, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% iPrOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
PRIMER 3A
8-Hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 1 i
PRIMER 3B
8-Hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0063] Dva enantiomera 8-hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-l-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzo-pirano[4,3-c]hinolin-2-ola se razdvoje asimetričnom SFC pod sledećim uslovima: kolona: CHIRALCEL® OD-H, 21 x 250 cm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (sa 0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 80 g/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm da se dobije Primer 3A kao prvi eluirani enantiomer (Izomer 1). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.55 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm. Naslovljeno jedinjenje Primera 3B se izdvoji da se dobije drugi eluirani enantiomer (Izomer 2). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 2 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 2.26 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
PRIMER 4A
7-Hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 1 i
PRIMER 4B
7-Hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0064]
1
[0065] Dva enantiomera 7-hlor-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzo-pirano[4,3-c]hinolin-2-ola se razdvoje asimetričnom SFC pod sledećim uslovima: kolona: CHIRALCEL® OD-H, 21 x 250 cm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (sa 0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 80 g/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm da se dobije Primer 4A kao prvi eluirani enantiomer (Izomer 1). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.71 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm. Naslovljeno jedinjenje Primera 4B se izdvoji da se dobije drugi eluirani enantiomer (Izomer 2). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 2 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 2.38 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
PRIMER 5A
7-Fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 1 i
PRIMER 5B
8-Fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0066]
2
[0067] Dva enantiomera 8-fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzo-pirano[4,3-c]hinolin-2-ola se razdvoje asimetričnom SFC pod sledećim uslovima: kolona: CHIRALCEL® OD-H, 21 x 250 cm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% MeOH (sa 0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 80 g/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm da se dobije Primer 5A kao prvi eluirani enantiomer (Izomer 1). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.56 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm. Naslovljeno jedinjenje Primera 5B se izdvoji da se dobije drugi eluirani enantiomer (Izomer 2). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 2 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 2.29 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
PRIMER 6A
7-Fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 1 i
PRIMER 6B
7-Fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0068]
[0069] Dva enantiomera 7-fluoro-5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-5H-[1]benzo-pirano[4,3-c]hinolin-2-ola se razdvoje asimetričnom SFC pod sledećim uslovima: kolona: CHIRALCEL® OD-H, 21 x 250 cm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (sa 0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 80 g/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm da se dobije Primer 6A kao prvi eluirani enantiomer (Izomer 1). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.32 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm. Naslovljeno jedinjenje Primera 6B se izdvoji da se dobije drugi eluirani enantiomer (Izomer 2). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 2 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.95 minuta; kolona: CHIRALCEL® D-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 35% MeOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
PRIMER 8A
5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-metil-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 1 i
PRIMER 8B
5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-metil-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2
[0070]
4
[0071] Dva enantiomera 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-7-metil-5H-[1]benzo-pirano[4,3-c]hinolin-2-ola se razdvoje asimetričnom SFC pod sledećim uslovima: kolona: CHIRALCEL® OD-H, 21 x 250 cm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% iPrOH (sa 0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 80 g/minut; talasna dužina UV detekcije: 265 nm da se dobije Primer 8A kao prvi eluirani enantiomer (Izomer 1). ES/MS (m/z): 471.2 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 1 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 1.47 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% iPrOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm. Naslovljeno jedinjenje Primera 8B se izdvoji da se dobije drugi eluirani enantiomer (Izomer 2). ES/MS (m/z): 471.2 (M+H). Enantiomerno obogaćen Izomer 2 se potvrdi asimetičnom analitičkom SFC, >99% ee, t(R): 2.05 minuta; kolona: CHIRALCEL® OD-H, 4.6 x 150 mm; uz eluiranje sa mobilnom fazom 30% iPrOH (0.2% IPA) u CO2; temperatura kolone: 40 °C; brzina protoka: 5 mL/minut; talasna dužina UV detekcije: 225 nm.
PRIMER 9
5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, Izomer 2, benzensulfonska kiselina
[0072]
[0073] Suspenzija 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzo- pirano[4,3-c]hinolin-2-ola, Izomer 2 (Primer 1B) (100 mg, 0.19 mmol) u ACN (3 mL) se zagreje na 50 °C. Doda se rastvor monohidratne benzensulfonske kiseline (40 mg, 0.23 mmol) u ACN (1 mL). Bistar žuti rastvor se zagreva 10 minuta na 50 °C. Zagrevanje se prekine, reaktivna smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu i smeša meša u toku noći. Doda se toluen (2 mL) i reaktivna smeša meša 2 sata. Rastvor se filtrira, dobijena čvrsta supstanca se sakupi i ispere sa ACN (1 mL). Čvrsta supstanca se suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (74 mg, 55%).
Alternativna izrada PRIMER 9
[0074] Suspenzija 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzo- pirano[4,3-c]hinolin-2-ola, Izomer 2 (Primer 1B) (124.1 mg, 0.24 mmol) u MEK (4 mL) se zagreje na 50 °C. Doda se rastvor monohidratne benzensulfonske kiseline (50 mg, 0.28 mmol) rastvorene u MEK (1 mL). Zagrevanje se prekine, reaktivna smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu i smeša meša u toku vkenda. Koncentruje se u struji N2. Doda se MEK (1 mL) i suspenduje da se dobije žuta kristalna čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se sakupi, ispere sa MEK i suši pod vakuumom na sobnoj temperaturi da se dobije naslovljeno jedinjenje (78.8 mg, 48%).
XRD, Primer 9
[0075] XRD se izvrši kako je opisano za Primer 1B. Karakteristike izrađenog uzorka 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ola, Izomer 2, benzensulfonske kiseline sa modelom XRD koristeći CuKα zračenje koji ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj Tabeli 4, a koji posebno ima pikove za 20.5 u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 12.3, 22.2 i 23.1; uz toleranciju za uglove difrakcije od 0.2 stepena.
Tabela 5: pikovi difrakcije X-zraka praška kristalnog Primera 9
(nastavlja se)
PRIMER 10
Kristalna 5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, 4-metilbenzensulfonska kiselina, Izomer 2
[0076]
[0077] Uzmu se zajedno 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3- c]hinolin-2-ol, Izomer 2 (Primer 1B) (204.2 g, 389 mmol) i EtOAc (5 L) i mešaju na 60 °C a nakon toga se doda MeOH (200 mL) na 60 °C da se dobije bistar smeđi rastvor. Doda se naslovljeni produkt (11.48 g) da se zaseje rastvor a nakon toga se doda prethodno izmešani rastvor 4-metilbenzensulfonske kiseline; hidrat (81.4 g, 428 mmol) u EtOAc (800 mL) da se dobije žuta suspenzija. Suspenzija se meša 30 minuta na 50 °C.
Suspenzija se koncentruje do 1⁄2 zapremine. Rastvor se ohladi na sobnu temperaturu u toku 1 sat, filtrira, čvrsta supstanca sakupi i ispere sa EtOAc. Čvrsta supstanca se suši pod vakuumom na 30 °C u toku vikenda da se dobije naslovljeno jedinjenje (239 g, 343 mmol). Za dalje prečišćavanje materijala, dodaju se zajedno naslovljeno jedinjenje (229 g, 328.7 mmol) i 2-propanol (4.6 L) i sagrevaju 2 sata na 60 °C. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu u toku 30 minuta. Čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem i ispere sa iPrOH (100 mL). Čvrsta supstanca se suši u struji N2u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (174.4 g, 76.2%). Kombinuju se različite serije naslovljenog jedinjenja izrađenih u osnovi na isti način i doda se heptan (2 L). Suspenzija se meša 30 minuta, čvrsta supstanca filtrira i ispere sa heptanom (300 mL). Sakupljena čvrsta supstanca se suši u struji N2u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (199.7 g, 99.5%).
XRD, Primer 10
[0078] XRD se izvrši kako je opisano za Primer 1B. Izrađeni uzorak 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoksi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]hinolin-2-ol, 4-metilbenzensulfonska kiselina, Izomer 2 (Primer 10) se karakteriše XRD modelom koristeći CuKα zračenje tako da ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj Tabeli 5, a koji posebno ima pikove za 20.1 u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 12.8, 19.5 i 22.8; uz toleranciju za uglove difrakcije od 0.2 stepena.
Tabela 6: pikovi difrakcije X-zraka praška za kristalni Primer 10
Biološka ispitivanja
[0079] Dokazi za vezu između ekspresije ER i nekih kancera su dobro poznati u praksi.
[0080] Rezultati narednih ispitivanja pokazuju da su jedinjenja Formule I, Formule II i Formule III iz primera aktivni SERDi i smatra se da mogu da budu korisni u lečenju kancera.
Ispitivanje konkurentnosti vezivanja ERα (izvorni tip), ERα (Y537S mutant) i EPβ
[0081] Cilj narednog ispitivanja konkurentnosti vezivanja ER je da se odredi afinitet test jedinjenja u odnosu na ERα (izvorni tip), ERα (Y537S mutant) i EPβ.
[0082] Ispitivanje konkurentnosti vezivanja se izvodi u puferu koji sadrži 50 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1 mg/mL ovalbumin i 5 mM DTT, koristeći 0.025 µCi po udubljenju<3>H-estradiola (118 Ci/mmol, 1 mCi/mL), 7.2 ng/udubeljenje ERα (izvorni tip), ili 7.2 ng/udubljenje ERα (Y537S mutant) ili 7.7 ng/udubljenje EPβ receptora. Doda se test jedinjenje u 10 različitih koncentracija u rasponu od 10,000 nM do 0.5 nM i odredi se nespecifično vezivanje u prisustvu 1 µM 17-β estradiola. Reakcija vezivanja (140 µL) se inkubira 4 sata na sobnoj temperaturi, a nakon toga se za svaku reakciju doda hladan pufer dekstran-drveni ugalj (70 µL) (koji sadrži po 50 mL pufera za analizu, 0.75 g drvenog uglja i 0.25 g dekstrana). Ploče se mešaju 8 minuta na 4 °C na orbitalnom šejkeru a nakon toga centrifugiraju 10 minuta na 4 °C pri 3000 opm. Alikvot (120 µL) smeše se prenese u narednu ploču sa 96 udubljenja sa belim ravnim dnom (Costar) i u svako udubljenje se doda Perkin Elmer Optiphase Supermix tečnost za scintilaciju (175 µL). Ploče se zatvore i intenzivno mućkaju na orbitalnom šejkeru. Nakon 2.5 sati inkubacije, ploče se očitaju u Wallac Microbeta čitaču. IC50se izračunava pomoću 4-parametarske logaritamske krive i izračunava se % inhibicije za 10 µM. Vrednosti IC50za jedinjenje se konvertuju u Kikoristeći Cheng-Prusoff jednačinu. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da se Primeri 1, 1A i 1B (i drugi) vezuju za rekombinantni ERα izvornog tipa i ERα mutanta (Y537S) kako je pokazano u niže datoj Tabeli 7 a za Primer 1B je takođe utvrđeno da se vezuje za EPβ sa Ki(nM) EPβ konkurentski od 0.11 ± 0.07, n=3.
Tabela 7: Rezultati konkurentskog vezivanja ERα (izvorni tip), ERα (Y537S mutant) i EPβ
[0083] Za testirana jedinjenja iz primera, Kiza ERα izvorni tip je u rasponu od približno 0.300 nM do približno 65 nM. Kiza ERα Y537S mutant je u rasponu od približno 2 nM do 300 nM. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju afinitet i potenciju vezivanja jedinjenja iz primera protiv proteina ERα izvornog tipa, mutanta (ESR1 Y537S) i EPβ.
4
Ispitivanje degradacije ERα u MCF7 ćelijama
[0084] Cilj ovog ispitivanja degradacije ERα je da se izmeri degradacija ERα sa test jedinjenjem u ćelijskoj liniji ERα pozitivnog kancera dojke kao što je MCF7.
[0085] MCF7 (nabavljena od ATCC HTB-22) ćelije se uzgajaju u DMEM medijumu obogaćenom sa 10% FBS, 0.01 mg/mL humanog insulina 1 i 1% penicilin/streptomicin antibiotika i prenese u ploče sa 384 udubljenja ravnog dna pri gustini od 4,000 ćelija po udubljenju u DMEM medijumu bez fenol crvenog (20 µL) koji sadrži 10% FBS očišćenog drvenim ugljem. Ćelije se inkubiraju u toku noći u inkubatoru za ćelijske kulture (5% CO2, 95% relativna vlažnost i 37 °C) i ćelije ostave da se vežu za ploču. Narednog dana se u ćelije doda test jedinjenje. Koristi se Echo 555 akustični dispenzer za izradu serijskih razblaženja test jedinjenja (1:3) u rasponu od 6 µM do 0.0003 µM. U ćelije se doda po 5 µL iz ploče sa serijskim rabzlaženjem u ploču sa ćelijama da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% sa finalnom koncentracijom doze test jedinjenja u rasponu između 2 i 0.0001 µM. Za tačku maksimuma, koristi se medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za tačku minimuma se koristi fulvestrant razblažen do finalne koncentracije od 2 µM u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja test jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju 24 sata na 37 °C i 5% CO2. Ćelije se fiksiraju dodavanjem 14% para-formaldehida (10 µL) u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije se jedanput isperu sa PBS (20 µL) i inkubiraju 1 sat sa PBS (20 µL) koji sadrži 0.5% (v/v) TWEEN® 20. Ćelije se isperu sa PBS koji sadrži 0.05% TWEEN® 20 (2x) i blokiraju sa 3% BSA u PBS koji sadrži 0.05% TWEEN® 20 i 0.1% TRITON™ X-100 (20 µL /udubljenje) u toku 1 sat na sobnoj temperaturi. Doda se 1:500 primarno antitelo (20 µL) (ERα (klon SP1) monoklonalno zečije antitelo #RM-9101-S, Thermo Scientific) razblaženo sa 1% BSA u PBS koji sadrži 0.05% TWEEN® 20 po udubljenju, ploče se zatvore i inkubiraju u toku noći na 4 °C. Narednog dana se ćelije isperu sa PBS koji sadrži 0.05% TWEEN® 20 (2x) i inkubiraju sa sekundarnim antitelom (20 (µL /udubljenje) (1:1000 razblaženje, Goat anti-rabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) u PBS sa 1% BSA u toku 105 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja ploča sa PBS (2x20 µL), doda se RNase (Sigma) (20 µL od 50 µg/mL) i razblaženje propidijum jodida 1:1000 u PBS po udubljenju (20 µL). Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi na polici (zaštićeno od svetlosti). Ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD] da se izmeri ERα. Analiza snimka je bazirana na fluorescentnim signalima ćelija za identifikaciju pozitivnih ćelija. ER pozitivne ćelije se identifikuju preko srednjeg intenziteta. Ukupni intenzitet za 575-640 nm od propidijum jodida/DNK se koristi za identifikaciju pojedinačnih ćelija. Učinak ispitivanja je % ER pozitivnih ćelija. Pomoću GENE DATA™ se preko četiri parametarske logaritamske krive odredi IC50za svaki učinak. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju potentnu degradaciju ERα izazvanu jedinjenjima Formule I, Formule II i Formule III kako je ovde opisano u MCF7 ćelijskoj liniji kancera dojke. Relativne IC50vrednosti za Primere 1, 1A i 1B su pokazane u Tabeli 8.
Tabela 8: ispitivanje degradacije ERα u MCF7 ćelijama
[0086] Preciznije, rezultati u Tabeli 7 pokazuju potentnu degradaciju ERα sa jedinjenjem iz Primera 1 u MCF7 ćelijskoj liniji kancera dojke. Od testiranih jedinjenja iz primera, relativne IC50u rasponu od 0.003 do >2 mM pokazuju da svi osim Primera 2B ispoljavaju aktivnost pri testiranoj koncentraciji. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da je jedinjenje Formule (I) SERD sa snažnom aktivnošću degradacije ERα u ćelijama.
Ispitivanje indukcije PRα u MCF7 ćelijama
[0087] Cilj narednog ispitivanja indukcije PRα je da se utvrdi da li test jedinjenje ima agonističku aktivnost protiv ERα receptora (od agonista bi se očekivalo da aktivira receptor).
[0088] MCF7 (nabavljene od ATCC HTB-22) se uzgajaju u DMEM medijumu obogaćenom sa 10% FBS, 0.01 mg/mL humanog insulina 1 i 1% penicilin/streptomicin antibioticima i ćelije se (pre nego što dostignu 70% ispunjenosti) prenesu u ploče sa 384 udubljenja ravnog dna u gustini od 4,000 ćelija po udubljenju u 20 µL zapremine DMEM medijuma bez fenol crvenog koji sadrži 10% FBS (prečišćenog drvenim ugljem). Ćelije se inkubiraju u toku noći u inkubatoru za ćelijske kulture (5% CO2, 95% relativna vlažnost na 37 °C) i ostavi da se ćelije vežu za ploču. Narednog dana, u ćelije se doda test jedinjenje. Echo 555 akustični dispenzer se koristi za izradu serijskih razblaženja jedinjenja (1:3) u rasponu od 6 µM do 0.0003 µM. U ćelije se doda nova količina test jedinjenja (5 µL) iz ploče serijskog razblaženja u ploču sa ćelijama da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% sa finalnom koncentracijom doze test jedinjenja u rasponu između 2 i 0.0001 µM. Za tačku maksimuma se koristi medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za tačku minimuma se koristi fulvestrant razblažen do finalne koncentracije od 2 µM u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja test jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju 24 sata na 37 °C i 5% CO2. Ćelije se fiksiraju dodavanjem 14% paraformaldehida (10 µL) u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije se jedanput isperu sa PBS (20 µL) i inkubiraju sa PBS (20 µL) koji sadrži 0.5% (v/v) TWEEN® 20 u toku 1 sat. Ćelije se isperu dva puta sa PBS (20 µL) koji sadrži 0.05% TWEEN® 20 i blokiraju sa 3% BSA u PBS koji sadrži 0.05% TWEEN® 20 i 0.1% TRITON™ X-100 (20 (µL /udubljenje) u toku 1 sat na sobnoj temperaturi. Doda se 1:500 primarnog antitela (20 µL) (PR monoklonalno mouse anti-humano antitelo, klon PgR 636 Dako, M3569) razblaženo u 1% BSA/PBS sa 0.05 TWEEN® 20 po udubljenju, ploče se zatvore i inkubiraju u toku noći na 4 °C.
4
[0089] Narednog dana, ćelije se isperu sa PBS 0.05% TWEEN® 20 (2x20 µL) i inkubiraju 105 minuta sa sekundarnim antitelom (20 µL /udubljenje) (1:1000 razblaženje, Goat antirabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) u PBS sa 1% BSA na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa PBS (2x20 µL), doda se RNase (20 µL od 50 µg/mL) (Sigma) i 1:1000 razblaženje propidijum jodida u PBS po udubljenju. Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi na polici (zaštićeno od svetlosti)). Ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD] da se izmeri PRα. Analiza snimka je bazirana na fluorescentnim signalima ćelija za identifikaciju pozitivnih ćelija. PR pozitivne ćelije se identifikuju preko srednjeg intenziteta. Ukupni intenzitet za 575-640 nm od propidijum jodida/DNK se koristi za identifikaciju pojedinačnih ćelija. Učinak ispitivanja je % PR pozitivnih ćelija. Pomoću GENE DATA™ se preko četiri parametarske logaritamske krive odredi IC50za svaki učinak. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da nema značajne agonističke aktivnost za primere 1, 1A i 1B u MCF7 ćelijama kancera dojke. Za testirana jedinjenja, relativne IC50s u ovom ispitivanju su > 2 µM. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da nema značajne agonističke aktivnosti jedinjenja iz primera testiranih u MCF7 ćelijama kancera dojke. Ovi rezultati takođe pokazuju da su testirana jedinjenja iz primera agonisti za ERα u MCF7 ćelijama kancera dojke (to jest, imaju SERD aktivnost).
Ispitivanje inhibicije PRα (ERα funkcionalnog antagonizma) ćelija u MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR ćelijama
[0090] Cilj ovog ispitivanja inhibicije PRα (ERα funkcionalnog antagonizma) ćelija je da se utvrdi antagonistička aktivnost test jedinjenja na Y537N mutant ERα receptora. Od antagonista u ovom ispitivanju se očekuje da blokira funkciju ERα receptora. PRα je nishodna transkripciona meta ERα i stoga se od antagonista ERα očekuje da inhibira ekspresiju PRα.
[0091] MCF7-ESR1 Y537N-682 (generisane CRISPR/Cas9 genom uređivanjem ESR1 gena u MCF7 ćelijama, klon#682) se uzgajaju u DMEM medijumu obogaćenom sa 10% FBS i 1% penicilin/streptomicin antibioticima i ćelije se (pre dostizanja 70% ispunjenosti) prenesu u ploče sa 384 udubljenja ravnog dna pri gustini od 4,000 ćelija po udubljenju u DMEM medijumu bez fenol crvenog sa 10% FBS (20 mL zapremina) (očišćenog drvenim ugljem). Ćelije se inkubiraju u toku noći u inkubatoru za ćelijsku kulturu (5% CO2, 95% relativna vlažnost i 37 °C) i ostave da se vežu za ploču. Narednog dana se u ćelije doda test jedinjenje.
Echo 555 akustični dispenzer se koristi za izradu serijskih rablaženja jedinjenja (1:3) u rasponu od 6 µM do 0.0003 µM. U ćelije se doda nova količina test jedinjenja (5 µL) iz ploče serijskog razblaženja u ploču sa ćelijama da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% sa finalnom koncentracijom doze test jedinjenja u rasponu između 2 i 0.0001 µM. Za tačku maksimuma se koristi medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za tačku minimuma se koristi fulvestrant razblažen do finalne koncentracije od 2 µM u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja test jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju 72 sata na 37 °C i 5% CO2. Ćelije se fiksiraju dodavanjem 14% paraformaldehida (10 µL) u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije se isperu sa PBS (1x200 µL) i inkubiraju sa PBS (20 µL) koji sadrži 0.5% (v/v) TWEEN® 20, u toku 1 sat. Ćelije se isperu sa PBS (2x20 µL), 0.05% TWEEN® 20 i blokiraju sa 3% BSA/PBS 0.05% TWEEN® 20 i 0.1% TRITON™ X-100 (20 (µL/udubljenje) u toku 1 sat na sobnoj temperaturi. Doda se 1:500 primarnog antitela (20 µL) (PR monoklonalno mouse anti-humano antitelo, klon PgR 636 Dako, M3569) razblaženo u 1% BSA/PBS sa 0.05 TWEEN® 20 po udubljenju, ploče se zatvore i inkubiraju u toku noći na 4 °C.
[0092] Narednog dana, ćelije se isperu sa PBS 0.05% TWEEN® 20 (2x20 µL) i inkubiraju 105 minuta sa sekundarnim antitelom (20 µL/udubljenje) (1:1000 razblaženje, Goat antirabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) u PBS sa 1% BSA na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa PBS (2x20 µL), doda se RNase (20 µL od 50 µg/mL) (Sigma) i 1:1000 razblaženje propidijum jodida u PBS po udubljenju. Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi na polici (zaštićeno od svetlosti)). Ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD] da se izmeri PRα. Analiza snimka je bazirana na fluorescentnim signalima ćelija za identifikaciju pozitivnih ćelija. PR pozitivne ćelije se identifikuju preko srednjeg intenziteta. Ukupni intenzitet za 575-640 nm od propidijum jodida/DNK se koristi za identifikaciju pojedinačnih ćelija. Učinak ispitivanja je % PR pozitivnih ćelija. Pomoću GENE DATA™ se preko četiri parametarske logaritamske krive odredi IC50za svaki učinak.
[0093] Rezultati ovog ispitivanja pokazuju potentnu inhibiciju PRα i funkcionalni antagonizam Primera 1, 1A i 1B u MCF7 (ESR1 Y537N, heterozigotni mutant) ćelijama kancera dojke. Relativne IC50Primera 1, 1A i 1B (i drugih) u ovom ispitivanju su pokazane u niže datoj Tabeli 9. Relativne IC50jedinjenja iz primera testiranih u rasponu od približno 0.0118 do > 1.6 µM pokazuju da su jedinjenja iz primera potentni antagonisti ERα mutanta
4
(Y537N) i potentni inhibitori transkripcije u kojoj je posrednik ERα izuzev primera 2B (1.6 µM). PRα (PGR) je takođe transkripciona meta ERα a rezultati iz ovog ispitivanja pokazuju potentnu inhibiciju trasnkripcije PRα u kojoj je posrednik ERα.
Tabela 9: ispitivanje inhibicije PRα (ERα funkcionalni antagonizam) ćelija u MCF7 Y537N 682 CRISPR ćelijama
4
Ispitivanje inhibicije PRα (ERα funkcionalnog antagonizma) ćelija u MCF7 ćelijama
[0094] Cilj ovog ispitivanja inhibicije PRα (ERα funkcionalnog antagonizma) ćelija je da se utvrdi antagonistička aktivnost test jedinjenja na ERα receptor. Od antagonista u ovom ispitivanju se očekuje da blokira funkciju ERα receptora. PRα je nishodna transkripciona meta ERα i stoga se od antagonista ERα očekuje da inhibira ekspresiju PRα.
[0095] Ispitivanje je sprovedeno pod uslovima kako je detaljno opisano u prethodno datom Acumen testu ERα degradacije na bazi ćelija, koristeći MCF7 ćelijsku liniju izuzev što se, pre rastvaranja test jedinjenja, ukloni medijum iz ploče sa ćelijama i sva udubljenja, izuzev udubljenja za negativnu kontrolu (kolona 24 ploče), se prethodno tretiraju sa medijumom za ispitivanje koji sadrži 0.47 nM estradiola u toku 30 minuta. U ovom ispitivanju, vrši se imunobojenje za detekciju PRα i ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD] da se izmeri PRα. Analiza snimka je bazirana na fluorescentnim signalima ćelija za identifikaciju pozitivnih ćelija. PRα pozitivne ćelije se identifikuju preko srednjeg intenziteta. Ukupni intenzitet za 575-640 nm od propidijum jodida/DNK se koristi za identifikaciju pojedinačnih ćelija. Učinak ispitivanja je % PRα pozitivnih ćelija. Pomoću GENE DATA™ se preko četiri parametarske logaritamske krive odredi IC50za svaki učinak. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju potentnu inhibiciju PRα i funkcionalni antagonizam za Primere 1, 1A i 1B u MCF7 ćelijama kancera dojke. Relativne IC50za Primere 1, 1A i 1B u ovom ispitivanju su pokazane u niže datoj Tabeli 10. Relativne IC50za jedinjenja iz primera u rasponu od približno 0.029 do >2 µM pokazuju da su sva testirana jedinjenja iz primera, izuzev 1A i 2B, porentni antagonisti proteina ERα izvornog tipa i potentni inhibitori transkripcije u kojoj je posrednik ERα. PRα (PGR) je takođe transkripciona meta ERα a rezultati ovog ispitivanja pokazuju potentnu inhibiciju transkripcije PRα u kojoj je posrednik Erα za testirane koncentracije.
Tabela 10: ispitivanje inhibicije PRα (ERα funkcionalni antagonizam) ćelija u MCF7 ćelijama
4
(nastavlja se)
Ispitivanje proliferacije u MCF7 i MCF7-ESR1 Y537N-682 ćelijama
[0096] Cilj narednog ispitivanja proliferacije ćelija je generalno da se detektuje da li test jedinjenje ima efekte na proliferaciju ćelija.
[0097] MCF7 (nabavljene od ATCC HTB-22) ćelije se u gustini od 2,000 ćelija po udubljenju zaseju u DMEM medijumu bez fenol crvenog sa 10% FBS (20 µL zapremine) (očišćenog drveni ugljem) u ploči za kulturu ćelija sa 384 udubljenja providnog dna. MCF7-ESRY537N-682 (generisane sa CRISPR/Cas9 genom uređivanjem gena ESr1 u MCF7 ćelijama, klon#682) se prenesu u DMEM medijum obogaćen sa 10% FBS i 1% penicilin/streptomicin antibioticima u gustini od 1000 ćelija po udubljenju. Ploče se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2. Narednog dana se u ćelije doda test jedinjenje. Echo 555 akustični dispenzer se koristi za
4
izradu serijskih razblaženja test jedinjenja (1:3) u rasponu od 60 µM do 0.003 µM. U ćelije se doda nova količina od 5 µL iz ploče sa serijskim razblaženjima u ploču sa ćelijama, da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% uz finalnu koncentraciju test jedinjenja u rasponu od 20 i 0.001 µM. Za tačku maksimuma se uzima medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za tačku minimuma se koristi fulvestrant razblažen do finalne koncentracije od 2 µM u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja test jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2. Sedam dana nakon dodavanja test jedinjenja, ploče se iznesu iz inkubatora i u svako udubljenje se doda hladan EtOH 96% (65 µL). Nakon 30 minuta, medijum se ukloni a u svako udubljenje se dodaju RNase (20 µL od 50 µg/mL) (Sigma) i 1:1000 razblaženje propidijum jodida u PBS. Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi na polici (zaštićeno od svetlosti). Ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD]. MCF-7 ćelijska linija raste formirajući agregate, broj ćelije kao broj objekta možda neće moći da se koristi kao očitavanje; tako da se broj ćelija može sagledati kroz procenjeni broj ćelija (izračunato preko parametra površine (odnos ukupne površine ukupne populacije ćelija) (naznačeni opseg intenziteta pika FL-1 (PI) i srednje površine populacije pojedinačnih ćelija (definisano perimetrom)). Pomoću GENE DATA™ se preko četiri parametarske logaritamske krive odredi IC50za svaki učinak.
Relativna IC50za Primere 1, 1A i 1B (i druge) u MCF7 ESR1 izvorni tip i MCF7-ESR1 Y537N mutant ćelijama su pokazane u niže datoj Tabeli 10. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju potentnu anti-proliferativnu aktivnost i inhibiciju rasta ćelija sa Primerima 1, 1A i 1B (i drugima) u MCF7 (ESR1 izvorni tip) i MCF7 (ESR1 Y537N mutant) ćelijama kancera dojke. Relativna IC50jedinjenja iz primera u rasponu od približno 0.0035 do 1.176 µM u MCF7 ESR1 izvorni tip i 0.014 do 1.86 µM u MCF7 (ESR1 Y537N mutant) ćelijama kancera dojke pokazuje da sva testirana jedinjenja iz primera ispoljavaju potentnu anti-proliferativnu aktivnost i inhibiciju ćelijskog rasta u MCF7 (ESR1 izvorni tip) i MCF7 (ESR1 Y537N mutant) ćelijama kancera dojke.
Tabela 11: ispitivanje proliferacije u MCF7 i MCF7-ESR1Y537N-682 ćelijama
4
(nastavlja se)
In Vivo ispitivanje ciljane inhibicije (IVTI) (PGR RT-qPCR ispitivanje) u MCF7 tumorima
[0098] Cilj ovog IVTI ispitivanja je da se izmeri sposobnost test jedinjenja (SERD) da inhibira ekspresiju (transkripciju) PRα nishodno od ERα u ksenograft tumorima implantiranim u miševe.
[0099] Ženkama NOD SCID miševa (22-25 g) od Envigo RMS, Inc., Madizon, Wisconsin su subkutano implantirane ćelije 5 x 10<e6>MCF7 ER-pozitivnog kancera dojke (ATCC, # HTB22) u region desnog boka u 1:1 HBSS MATRIGEL™ rastvoru (200 µL). Jedan dan pre implantiranja ćelija tumora, subkutano se implantira 17- β estradiol pelet (0.18 mg/pelet, 90 dana oslobđanja, dobijen od Innovative research). Rast tumora i telesna težina se mere dva puta nedeljno počevši od sedmog dana nakon implantiranja. Kada veličina tumora dostigne 250-350 mm<3>, životinje se nasumice podele u grupe od po pet životinja. Životinjama se daje ili test jedinjenje u višestrukim dozama u specifičnom vehikulumu za test jedinjenje (1% hidroksietilceluloza/0.25% TWEEN® 80/0.05% anti peneće sredstvo u prečišćenoj vodi) ili samo vehikulum, oralno 3 dana i nakon poslednje doze se uzmu tumori i krv u traženim vremenskim intervalima. Životinje se žrtvuju koristeći anesteziju izofluranom plus cervikalnu dislokaciju. Tumori se naglo zamrznu i čuvaju na -80 °C sve do upotrebe za izdvajanje RNK i ispitivanje RT-qPCR. Krv se sakupi u epruvete sa EDTA, centrifugiranjem se izdvoji plazma i zamrzne na -80 °C u ploči sa 96 udubljenja. Masenom spektrometrijom se odredi prisustvo test jedinjenja.
[0100] Tumori se pulverizuju u tečnom azotu i liziraju 1 x u puferu za lizu RNK (iz kitova za izdvajanje RNK) koristeći Matrix D perlice (MP Biomedical, #6913-500) u FASTPREP-24™ mašini za uništavanje ćelija (MP Biomedical). Lizati tumora se prenesu u čiste epruvete nakon 20 minuta centrifugiranja pri 14000 na 4 °C. RNK se izdvoji iz lizata tumora upotrebom PURELINK® RNK Mini Kit (Invitrogen #12183018A) ili RNeasy Mini Kit (Qiagen #74104 and #74106). Kontaminati DNK se uklone pomoću PURELINK® DNase Set (Invitrogen #12185010) ili RNase-Free DNase Set (Qiagen #79254). Koncentracija izolovane RNK se meri razblaživanjem uzoraka u vodi bez RNase i merenjem apsorpcije pri 260 nm na čitaču ploča (SpectraMax190). Prosečno merenje za slepu probu (samo voda bez RNase) na 260 nm se oduzme od merenja svih drugih uzoraka RNK na 260 nm. Uzorci RNK se razblaže do jednakih koncentracija u vodi bez RNase. Od razblažene RNK se sintetiše cDNK pomoću First-Strand Synthesis sistema za RT-PCR (Invitrogen, #18080-051). Za sprovođenje RT-qPCR, prvo se razblaži cDNK u vodi bez RNase. Kombinuju se 2x Absolute Blue qPCR ROX Mix (Thermo, #AB- 4139/A), PGR prajmer (Thermo, Hs01556702_m1) i razblažena cDNK za svaku reakciju u PCR ploči (Applied Biosystems, #4309849). cDNK se pojača inkubiranjem uzoraka 2 minuta na 50 °C a nakon toga 15 minuta na 95 °C u termocikleru (ABI Prism 7900HT Sequence Detection System). Nastavi se inkubacija na 95 °C u toku 15 sekundi a nakon toga 60 sekundi na 50 °C do ukupno 40 ciklusa. Ciklusi se normalizuju na gen za održavanje i koriste za izračunavanje % PGR inhibicije u poređenju sa samim
1
vehikulumom. Svaki uzorak se analizira u duplikatu a za izračunavanje se koriste prosečne vrednosti. Procenat ciljane (PGR) inhibicije se izračunava pomoću Excela i XL Fit.
[0101] Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da Primer 1B inhibira PRα (PGR) ekspresiju u modelu ksenograft tumora. Primer 1B inhibira PRα (PGR) ekspresiju za ~78% u ksenograft modelu tumora u toku 24 sata sa dozom od 30 mg/kg kada se primeni oralno. Ovi rezultati pokazuju značajnu i kontinuiranu inhibiciju antagonističke aktivnosti ERα i transkripcione aktivnosti u kojoj je posrednik ERα in vivo u modelu ksenograft tumora.
In vivo studija inhibicije rasta tumora u modelima ER-pozitivnog (ESR1 izvorni tip) ksenograft tumora kancera dojke implantiranog u miševima
[0102] Cilj narednog ispitivanja inhibicije ksenograft tumora je da se meri redukcija zapremine tumora kao odgovor na primenu test jedinjenja.
[0103] Humane MCF7 (ATCC # HTB-22) i HCC1428 (ATCC # CRL-2327) ćelije kancera dojke odgajane u kulturi se sakupe i injektuju subkutano u količini od 5 x 10<e6>ćelija u 1:1 HBSS+MATRIGEL™ rastvoru (200 µL) na zadnji desni bok ženki NOD SCID miševa (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Dvadeset četiri sata pre implantacije ćelija, subkutano se implantiraju estrogen pelete (0.18 mg/peleta, 17β estradiol, oslobađanje 90 dana, Innovative Research). Humane T47D (ATCC # HTB-22) ćelije kancera dojke odgajane u kulturi se sakupe i subkutano injektuju u količini od 5 x 10<e6>ćelija u 1:1 HBSS+MATRIGEL™ rastvoru (200 µL) na zadnji desni bok ženki NOD SCID miševa (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Dvadeset i četiri sata pre implantacije ćelija, subkutano se implantiraju estrogen pelete (0.38 mg/peleta, 17β estradiol, oslobađanje 90 dana, Innovative Research). Humane ZR-75-1 (ATCC # CRL-1500) ćelije kancera dojke odgajane u kulturi se sakupe i subkutano injektuju u količini od 5 x 10<e6>ćelija u 1:1 HBSS+MATRIGEL™ rastvoru (200 µL) na zadnji desni bok ženki NOD SCID miševa (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Dvadeset i četiri sata pre implantacije ćelija, na životinjama se intramuskularnom injekcijom primeni 50 µL estradiol valerata (Delestrogen®) (10 mg/mL) a nakon toga svakih 14 dana u toku trajanja studije. Merenje rasta tumora i telesne težine dva puta nedeljno se započinje sedmog dana nakon implantacije. Kada veličine tumora dostignu 250-350 mm<3>, životinje se po slučajnom uzorku podele u grupe od po 5 životinja. Pripremi se test jedinjenje, Primer 1B u odgovarajućem vehikulumu (1% hidroksietilceluloza/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipeneće sredstvo u prečišćenoj vodi) i primenjuje oralnom gavažom 28 dana, QD. Određivanje odgovora tumora
2
merenjem zapremine tumora se vrši dva puta nedeljno u toku trajanja tretmana. Telesna težina se uzima kao opšta mera toksičnosti kad god se meri zapremina tumora.
[0104] Nađeno je da jedinjenje iz Primera 1B ima delta T/C% vrednosti kako je navedeno u niže datoj Tabeli 12. Ovi rezultati ukazuju da jedinjenje iz Primera 1B ispoljava dobru oralnu bioraspoloživost u miševima i značajnu anti-tumornu aktivnost ili regresiju tumora u ksenograft modelima ER-pozitivnog (ESR1 izvorni tip) humanog kancera dojke.
Tabela 12: In vivo studija inhibicije rasta tumora u modelima ksenograft tumora ER-pozitivnog kancera dojke implantiranih u miševima
[0105] Velika srednja vrednost svih grupa od početne vrednosti (po slučajnom uzorku) za dan 32 se koristi za izračunavanje % promene T/C.
In vivo studije inhibicije rasta tumora u ESR1 mutantnom (I537S) modelu tumora kancera dojke PDKS (ST941/HI) implantiranih u miševima
[0106] Cilj narednog ispitivanja inhibicije ksenograft tumora je da se meri smanjenje zapremine tumora u odgovoru na primenu test jedinjenja na ksenograft modelu ESR1 mutant i hormon-nezavisnog (HI) kancera dojke dobijenog od pacijenta (PDX).
[0107] ST941/HI PDX model je dobijen i izveden za South Texas Accelerated Research Therapeutics (San Antonio, TX). Delovi tumora su sakupljeni od životinja domaćina i implantirani u imuno-deficijentne miševe (The Jackson Laboratory) a studija je započeta sa prosečnom zapreminom tumora od približno 125-250 mm<3>. Test jedinjenje, Primer 1B, je pripremljeno u odgovarajućem vehikulumu (1% hidroksietilceluloza/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipeneće sredstvo u prečišćenoj vodi) i primenjivano oralnom gavažom u toku 28 dana. Praćenje odgovora tumora merenjem zapremine tumora je vršeno dva puta nedeljno u toku trajanja tretmana. Telesna težina se uzimala kao opšta mera toksičnosti kad god je merena zapremina tumora.
[0108] Nađeno je da jedinjenje iz Primera 1B ima delta T/C% vrednosti kako je navedeno u niže datoj Tabeli 13. Ovi rezultati ukazuju da jedinjenje iz Primera 1B ispoljava dobru oralnu bioraspoloživost u miševima i značajnu anti-tumornu aktivnost ili regresiju tumora u ESR1 mutantu (Y537S) PDX modela humanog kancera dojke.
Tabela 13: In vivo studija inhibicije rasta tumora u ESR1 mutantu PDX modela tumora kancera dojke impalntiranog u miševima
4
(nastavlja se)
[0109] Velika srednja vrednost svih grupa od početne vrednosti (po slučajnom uzorku) za dan 32 se koristi za izračunavanje % promene T/C.
Kombinovane studije
[0110] Zbog heterogeničnosti tumora i stečene rezistencije na endokrine terapije, kombinovana terapija je postala esencijalna u tretmanu ER-pozitivnih i uznapredovanih/metastazičnih kancera dojke za efikasnu terpiju ili za prevazilaženje stečene rezistencije. Mi smo testirali kombinovani efekat Primera 1B sa CDK4/6 inhibitorom abemaciklibom, mTOR inhibitorom everolimusom, PIK3CA inhibitorom Alpelisibom i PI3K/mTOR inhibitorom 8-[5-(1-hidroksi-1-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoksipropil]-3-metil-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]hinolin-2-onom ("Jedinjenje A") u pet ćelijskih linija ER-pozitivnog kancera dojke in vitro.
Ispitivanje vitalnosti ćelija za kombinovane studije
[0111] Ćelije se zaseju pri gustini pokazanoj u niže datoj Tabeli 14 u 20 µL zapremine medijuma opisanog u tabeli u ploče za ćelijsku kulturu sa 384 udubljenja providnog dna.
Tabela 14: Informacije o ćelijskoj liniji ispitivanjem vitalnosti ćelije
[0112] Ploče se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2. Narednog dana se u ćelije doda test jedinjenje, Primer 1B.
[0113] Jedinjenja se izrade kao 10 mM DMSO osnovni rastvori i koriste za studiju odgovora na dozu sa maksimalnom koncentracijom počevši od 10 ili 1 µM, dva jedinjenja se testiraju zajedno u fiksnom odnosu a nakon toga se pripreme 1:3 serijska razblaženja kao i razblaženja samog jedinjenja za određivanje IC50sa početnom koncentracijom od 20 µM. Ćelije se doziraju sa dodatnih 5 µL iz ploče sa serijskim razblaženjem u ploču sa ćelijama, da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% sa finalnom koncentracijom test jedinjenja u rasponu između 20 i 0.001 µM za pojedinačni tretman ili u nižem opsegu za kombinacije. Za tačku maksimuma se koristi medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za tačku minimuma se koristi staurosporin razblažen do finalne koncentracije od 2 µM u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja test jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2. Nakon dva dvostruka vremena inkubacije sa jedinjenjima, ploče se uklone iz inkubatora i u svako udubljenje se doda hladan EtOH 96% (65 mL). Nakon 30 minuta, medijum se ukloni i doda se RNase (20 µM 50 µg/mL) (Sigma) i 1:1000 razblaženje propidijum jodida u PBS po udubljenju. Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi (zaštićeno od svetlosti). Ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD]. Kako neke ćelijske linije rastu formirajući agregate, broj ćelije kao broj objekta možda neće moći da se koristi kao očitavanje; tako da se ukupna površina populacije (označeni opseg intenziteta pika FL-1 (PI)) ili ukupan intenzitet PI se koristi za procenu broja ćelija.
[0114] In vitro rezultati kombinacija sugerišu sinergiju (kako je niže definisano) za kombinaciju Primera 1B sa abemaciklibom, ili everolimusom u 5 od 5 ćelijskih linija ER-pozitivnog kancera dojke, kako je pokazano u Tabeli 15. Kokmbinacija Primera 1B sa Jedinjenjem A je sinergistična u 4 od 4 testirane linije ER-pozitivnog kancera dojke. Efekat kombinacije Primera 1B sa apelizibom je aditivan u 2 od 4 ćelijske linije ER-pozitivnog kancera dojke a sinergističan u 2 od 4 ćelijske linije ER-pozitivnog kancera dojke.
Tabela 15: In vitro kombinacija Primera 1B sa drugim ciljanim sredstvima u ćelijskim linijama ER pozitivnog kancera dojke
(nastavlja se)
Analiza podataka i interpretacija efekta kombinacije
[0115] Za izračunavanje in vitro efekta kombinacije koriste se postupci koji su obljavljeni u literaturi (L. Zhao, i saradnici, Front Biosci, 2010, 2:241-249 i L. Zhao, i saradnici, Clin Cancer Res, 2004, 10(23):7994-8004). Da bi se identifikovale sinergističke ili antagonističke interakcije između dva leka, izvrši se analiza krive promena korišćenjem prilagođenog XL šablona sa dodacima XSLit 5. Krive pojedinačnih sredstava su podešene pomoću 4 parametarske logaritamske regresije. Kriterijum i ograničenja korišćeni za postavljanje su (i) dna < (-20) su fiksirana na 0 a (ii) vrh>120 je fiksiran na 100. Ako su sva zapažanja niža od praga koji je postavio korisnik, nakon toga se vrši konstantno uklapanje sa vrhom = 0 a IC50se smatra većom od maksimuma za ukjučenu koncentraciju. Jednom kada je dobijena apsolutna IC50za svako pojedinačno sredstvo, ekvivalentna koncentracija za 50% aktivnosti se izračunava za pojedinačna sredstva i za kombinaciju. Korišćenjem ovih ekvivalenata koncentracija zajedno sa izmerenim aktivnostima ponovo se izračunava apsolutna IC50, kriva za pojedinačna sredstva će dostići 50% aktivnosti za vrednosti ek koncentracije jednake 1, dok će sinergističke kombinacije dostići 50% za manje vrednosti što će rezultirati pomeranjem ulevo, a antagonistička kombinacija će pokazati pomeranje udesno. Ekvivalentne koncentracije se takođe koriste za izračunavanje CI50(indeks kombiacije za 50% aktivnosti), gde je CI50jednak apsolutnoj IC50krive kombinacije. Zajedno sa CI50mogu da se izračunaju drugi (indeksi kombinacije) za različite procente aktivnosti (CI10, CI20, CI30, CI40, CI60, CI70, CI80, CI90). Da bi se izračunao CInn, izračunava se ekvivalent koncentracije za različiti procenat aktivnosti. Za svaki procenat aktivnosti se izračunava margina greške koja je granica pouzdanosti za 95% a korišćenjem ove granice pouzdanosti izračunava se gornja granica kao dodavanje margini greške za CI i donja granica kao oduzimanje margini greške za CI. Gornja granica = CI+granica pouzdanosti 95% i donja granica = CI-granica pouzdanosti 95%. Ove granice se nakon toga koriste za tumačenje rezultata.
[0116] Statistička interpretacija za svaki procenat aktivnosti je kako sledi:
[0117] Biološka interpretacija za svaki procenat aktivnosti je kako sledi:
In vivo studije kombinacije
[0118] Zbog heterogeničnosti tumora i stepene rezistencije na endokrine terapije, kombinovana terapija postaje osnova u tretmanu ER-pozitivnog i uznapredovanog/metastazičnog kancera dojke za efektivnu terapiju ili za prevazilaženje stečene rezistencije. Pretpostavka je da kombinovane ciljane terapije imaju potencijal da budu mnogo efikasnije u usporavanju ili čak zaustavljanju ER-pozitivnih kancera dojke.
Kombinacija CDK4/6 inhibitora i fulvestranta je odobrena za tretman ER-pozitivnog metastazičnog kancera dojke ali se kod velikog broja pacijenata razvija rezistencija zbog stečenih mutacija u ESR1 ili PIK3CA. Kao potentni degradator i antagonist ERα, oralni SERD kao što je Primer 1B ima potencijal da bude mnogo efikasniji u usporavanju ili zaustavljanju ESR1 mutanta ili PIK3CA mutanta kancera dojke kao pojedinačno sredstvo ili u kombinaciji sa CDK4/6 inhibitorom kao što je abemaciklib ili PI3K/mTOR inhibitorom kao što je Jedinjenje A. U tom kontekstu, jedinjenje iz Primera 1B je testirano na inhibiciju rasta tumora u kombinaciji sa abemaciklibom (patentna referenca) ili Jedinjenjem A (patentna referenca). Još preciznije, jedinjenje iz Primera 1B je testirano u kombinaciji sa abemaciklibom ili Jedinjenjem A u ksenograft modelu ESR1 izvornog tipa i PIK3Ca mutantu MCF7 kancera dojke.
[0119] Humane MCF7 (ATCC # HTB-22) ćelije kancera dojke se uzgajaju u kulturi, sakupe i injektuju subkutano u količini od 53<10e6>ćelija u 1:1 HBSS+MATRIGEL™ rastvoru (200 µL) na zadnji desni bok ženki NOD SCID miševa (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Dvadeset četiri sata pre implantacije ćelija, subkutano se implantiraju estrogen pelete (0.18 mg/peleta, 17β estradiol, 90-dana oslobađanja, Innovative Research). Rast tumora i telesna težina se mere dva puta nedeljno počevši od sedmog dana nakon implantacije. Kada veličina tumora dostigne 250-350 mm<3>, životinje se po slučajnom uzorku podele po grupama sa po 5 životinja u grupi. Pripremi se test jedinjenje iz Primera 1B u odgovarajućem vehikulumu (1% hidroksietilceluloza/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipeneće sredstvo u prečišćenoj vodi) i primenjuje 42 dana oralnom gavažom. CDK4/6 inhibitor (abemaciclib) se formuliše u 1% HEC u 25 mM puferu natrijum fosfata, pH 2.0. PI3K/mTOR inhibitor (Jedinjenje A) se formuliše u 1% hidroksietilceluloza/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipeneće sredstvo u prečišćenoj vodi. Određivanje odgovora tumora preko merenja zapremine tumora se vrši dva puta nedeljno u toku trajanja tretmana. Telesna težina se uzima kao opšta mera toksičnosti kad god se meri zapremina tumora. Zapremina tumora se utvrđuje preko formule v = 1 x w<2>x 0.535 gde je 1 = veći od izmerenog prečnika a w = manji od perpendikularnog prečnika.
Statističke analize
[0120] Statističke analize podataka o zapremini tumora počinju transformacijom podataka u log skali da se izjednače varijanca kroz vreme i grupe tretmana. Log podataka o zapremini se analiziraju koristeći analize varijanci kroz vreme i tretmana dva puta ponovljenih merenja koristeći MIXED procedure u SAS softveru (Version 9.3). Model korelacije za ponovljena merenja je Spatial Power. Tretirane grupe se porede sa kontrolnom grupom za svaku vremensku tačku. MIXED procedura se takođe odvojeno koristi za svaku tretiranu grupu za izračunavanje prilagođenih srednjih vrednosti i standardnih grešaka za svaku vremensku tačku. Obe analize uzimaju u obzir autokorelaciju za svaku životinju i gubitak podataka koji se javlja kada se životinje sa velikim tumorima rano uklone iz studije. Prilagođene srednje vrednosti i standardne greške (s.e.) se nanose za svaku tretiranu grupu u odnosu na vreme. Analiza zapremine tumora se bazira na log10i strukturi kovarijance Spatial power. P vrednost se bazira na komparaciji između dve specifične grupe.
Postupak analize kombinacije (Bliss Independence za IVEF studije)
[0121] Prvo, uobičajeni model ponovljenih merenja se unese za log zapremine u odnosu na grupu i vreme. Nakon toga se kontrastni rezultati koriste za test efekta interakcije u svakoj vremenskoj tački koristeći 2 specifična tretmana koja su kombinovana. Ovo je ekvivalentno sa Bliss Independence postupkom i pretpostavlja da zapremina tumora može, u teoriji, da dostigne nulu, to jest, da potpuno nestane. Očekivani aditivni odgovor (EAR) za kombinaciju se izračunava na skali zapremine tumora kao: odgovor (EAR) EAR zapremina = V1 * V2/V0, gde su V0, V1 i V2 procenjene srednje zapremine tumora za kontrolu sa vehikulumom, samo za tretman 1 i samo za tretman 2, tim redom. Ukoliko je test interakcije značajan, efekat kombinacije se statistički deklariše više nego aditivan ili manje nego aditivan u zavisnosti od toga da li je srednja zapremina posmatrane kombinacije manja od ili veća od EAR zapremine, tim redom. Inače, statistički zaključak je aditiv. Pored toga, biološki relevantan opseg aditivnosti može da se definiše kao X% iznad ili ispod EAR zapremine. Uobičajeno, X bi bio 25 do 40%. Tada se može doneti biološki zaključak za kombinaciju kao više od aditiva, aditiv, ili manje od aditiva ako je srednja zapremina posmatrane kombinacije ispod, u, ili iznad intervala aditivnosti.
[0122] Mogu da postoje situacije u kojima je zastoj najbolji očekivani odgovor. U tim situacijama, Bliss postupak može da se primeni direktno za %delta T/C vrednosti da se dobije EAR procenat odgovora: EAR % delta T/C = Y1 * Y2/100, gde su Y1 i Y2 procenat delta T/C vrednosti za tretmane jednim sredstvom. Trenutno ne postoji statistički test za poređenje uočenog %delta T/C u kombinovanoj grupi u odnosu na EAR, ali se može primeniti gore opisani biološki kriterijum.
[0123] Kako je pokazano u Tabelama 15 i 16, tretman samo sa jedinjenjem iz Primer 1B ili abemaciklibom kao pojedinačnim sredstvom dovodi do 32% (%dT/C = -32) i 52% (%dT/C = -52) regresije tumora, tim redom, i obe vrednosti su statistički značajne (p <0.001) u poređenju sa vehikulum kontrolom. Efikasnost kombinacije Primera 1B sa abemaciklibom je "manja nego aditiv" ali je efikasnost kombinacije Primera 1B plus abemaciklib značajno bolja nego samog Primera 1B (p <0.001). Međutim, efikasnost abemacikliba kao pojedinačnog sredstva iz kombinacije nije statistički značajna (P=0.055). Kombinacija se toleriše kod životinja bez značajnog gubitka telesne težine.
1
Tabela 15: efikasnost kombinacije Primera 1B sa abemaciklibom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
Tabela 16: Efikasnost kombinacije Primera 1B sa abemaciklibom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
2
[0124] Kako je pokazano u Tabelama 17 i 18, tretman samo sa Primerom 1B ili Jedinjenjem A kao pojedinačnim sredstvom za rezultat ima 32% (%dT/C = -32) i 36% (%dT/C = -36) regresije tumora, tim redom, a oba su statistički značajna (p <0.001) u poređenju sa vehikulum kontrolom. Efikasnost kombinacije Primera 1B sa Jedinjenjem A je "manja nego aditiv" ali je efikasnost kombinacije Primera 1B plus Jedinjenje A značajno bolja nego efikasnost samog Primera 1B (p <0.001) ili samog Jedinjenja A (p=0.002<•>). Kombinacija se toleriše kod životinja bez značajnog gubitka telesne težine.
Tabela 17: Efikasnost kombinacije Primera 1B sa Jedinjenjem A u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
Tabela 18: Efikasnost kombinacije Primera 1B sa abemaciklibom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
[0125] Kako je pokazano u Tabelama 19 i 20, tretman samo sa Primerom 10 ili abemaciklibom kao pojedinačnim sredstvom za rezultat ima 51% (%dT/C = -51) i 70% (%dT/C = -70) regresije tumora, tim redom i oba su statistički značajna (p <0.001) u poređenju sa vehikulum kontrolom. Efikasnost kombinacije Primera 10 sa abemaciklibom je "Manje nego aditiv" ali je efikasnost kombinacije Primera 10 plus abemaciklib značajno bolja nego samog Primera 10 (p =0.039). Međutim, efikasnost kombinacije Primera 10 plus abemaciklib nije značajno različita od samog abemacikliba (p=0.905). Kombinacija se toleriše kod životinja bez značajnog gubitka telesne težine.
Tabela 19: Efikasnost kombinacije Primera 10 sa abemaciklibom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
4
(nastavlja se)
Tabela 20: Efikasnost kombinacije Primera 10 sa abemaciklibom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
[0126] Kako je pokazano u Tabelama 21 i 22, tretman samo sa Primerom 10 ili alpelizibom kao pojedinačnim sredstvom za rezultat ima 51% (%dT/C = -51) i 21% (%dT/C = -21) regresije tumora, tim redom i oba su statistički značajna (p <0.001 i p = 0.013) u poređenju sa vehikulum kontrolom. Efikasnost kombinacije Primera 10 sa alpelizibom je "Aditiv" a efikasnost kombinacije Primera 10 plus alpelizib je značajno bolja nego samog Primera 10 (p = 0.009). Efikasnost kombinacije Primera 10 plus alpelizib je takođe značajno bolja nego samog alpeliziba (p= <0.001). Kombinacija se toleriše kod životinja bez značajnog gubitka telesne težine
Tabela 21: Efikasnost kombinacije Primera 10 sa alpelizibom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
Tabela 22: Efikasnost kombinacije Primera 10 sa alpelizibom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
[0127] Kako je pokazano u Tabelama 23 i 24, tretman samo sa Primerom 10 ili everolimusom kao pojedinačnim sredstvom za rezultat ima 51% (%dT/C = -51) i 50% (%dT/C = -50) regresije tumora, tim redom i oba su statistički značajna (p <0.001 i p = <0.001) u poređenju sa vehikulum kontrolom. Efikasnost kombinacije Primera 10 sa everolimusom je "Aditiv" a efikasnost kombinacije Primera 10 plus everolimus je značajno bolja nego samog Primera 10 (p = 0.004). Efikasnost kombinacije Primera 10 plus everolimus je takođe značajno bolja nego samog everolimusa (p= <0.04). Kombinacija se toleriše kod životinja bez značajnog gubitka telesne težine.
Tabela 23: Efikasnost kombinacije Primera 10 sa everolimusom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
(nastavlja se)
Tabela 24: Efikasnost kombinacije Primera 1o sa everolimusom u MCF7 modelu ER-pozitivnog kancera dojke
Ispitivanje oralne bioraspoloživosti kod pacova
[0128] Cilj ovog ispitivanja je da pokaže da li je test jedinjenje oralno bioraspoloživo.
[0129] Test jedinjenje se primeni IV u količini od 1 mg/kg (koristeći vehikulume ili: 20% CAPTISOL® u 25 mM puferu natrijum fosfata, pH2 quantum satis; ili 25% DMA, 15% EtOH, 10% propilen glikol, 25% 2- pirolidon i 25% prečišćene vode) i PO u količini od 10 mg/kg (koristeći vehikulum: 1% hidroksietil celuloza, 0.25% polisorbat 80, 0.05% antipeneće sredstvo 1510-US i prečišćena voda quantum satis) na Sprague-Dawley pacovima. Uzmu se serijski uzorci krvi za 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 i 12 sati nakon doze za IV bolus i za 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 i 12 sati nakon oralne primene doze. Nakon tretmana sa EDTA koagulantom, centrifugiranjem se dobije plazma i čuva na -70 °C do analize pomoću LC-MS/MS. Odredi se koncentracija test jedinjenja u plazmi i unese u Watson LIMS™ sistem gde se koristi nonkompartmentalna analiza za izračunavanje oblasti ispod krive (AUC) i za IV i PO deo. Oralna bioraspoloživost (%F) se izračunava po sledećoj jednačini:
%F = (AUCPOX DozaIV) / (AUCIVX DozaPO) X 100
[0130] Jedinjenja iz Primera 1B ispoljavaju %F vrednost od ~50% u prethodno navedenom ispitivanju. Ovo ispitivanje pokazuje da jedinjenje iz Primera 1B ima dobru oralnu bioraspoloživost.

Claims (16)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:
  2. naznačeno time što je ili R<1>ili R<2>nezavisno izabran od Cl, F, -CF3, ili -CF3a drugi je vodonik, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to jedinjenje
  3. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to jedinjenje
  4. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je to jedinjenje
  5. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što je to jedinjenje
  6. 6. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 3, naznačeno time što je to jedinjenje
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  7. 7. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 6, naznačeno time što je farmaceutski prihvatljiva so so benzensulfonske kiseline.
  8. 8. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 6, naznačeno time što je farmaceutski prihvatljiva so so 4-metilbenzensulfonske kiseline.
  9. 9. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačeno time što je to jedinjenje 1
  10. 10. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 9 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivom podlogom, nosačem ili razblaživačem.
  11. 11. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačena time što uključuje jedno ili više drugih terapeutskih sredstava.
  12. 12. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 11, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
  13. 13. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 9, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu kancera dojke, kancera jajnika, kancera endometrijuma, kancera prostate, kancera materice, kancera želuca ili kancera pluća.
  14. 14. Jedinjenje ili njegova so, naznačeno time što je za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13 u tretmanu ER-pozitivnog kancera dojke.
  15. 15. Jedinjenje ili njegova so, naznačeno time što je za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13 u tretmanu ER-pozitivnog kancera želuca.
  16. 16. Jedinjenje ili njegova so, naznačeno time što je za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13 u tretmanu ER-pozitivnog kancera pluća. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 2
RS20221142A 2018-07-12 2019-07-11 Selektivni degradatori estrogenskih receptora RS63809B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862697100P 2018-07-12 2018-07-12
EP19745925.8A EP3820873B1 (en) 2018-07-12 2019-07-11 Selective estrogen receptor degraders
PCT/US2019/041334 WO2020014435A1 (en) 2018-07-12 2019-07-11 Selective estrogen receptor degraders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63809B1 true RS63809B1 (sr) 2023-01-31

Family

ID=67470734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221142A RS63809B1 (sr) 2018-07-12 2019-07-11 Selektivni degradatori estrogenskih receptora

Country Status (37)

Country Link
US (4) US10654866B2 (sr)
EP (2) EP3820873B1 (sr)
JP (6) JP6995241B2 (sr)
KR (3) KR102589886B1 (sr)
CN (2) CN112638916B (sr)
AR (2) AR115694A1 (sr)
AU (2) AU2019299947B2 (sr)
BR (1) BR122023025061A2 (sr)
CA (1) CA3105501C (sr)
CL (1) CL2021000045A1 (sr)
CO (1) CO2021000043A2 (sr)
CR (1) CR20210007A (sr)
DK (1) DK3820873T3 (sr)
EA (1) EA202092975A1 (sr)
EC (1) ECSP21001770A (sr)
ES (1) ES2933980T3 (sr)
FI (1) FI3820873T3 (sr)
HR (1) HRP20230009T1 (sr)
HU (1) HUE060963T2 (sr)
IL (3) IL289871B2 (sr)
JO (1) JOP20210005A1 (sr)
LT (1) LT3820873T (sr)
MA (2) MA53124B1 (sr)
MD (1) MD3820873T2 (sr)
MX (2) MX2021000375A (sr)
MY (1) MY198962A (sr)
PE (1) PE20210400A1 (sr)
PH (1) PH12021550049A1 (sr)
PL (1) PL3820873T3 (sr)
PT (1) PT3820873T (sr)
RS (1) RS63809B1 (sr)
SA (1) SA521421008B1 (sr)
SG (1) SG11202100148TA (sr)
SI (1) SI3820873T1 (sr)
TW (1) TWI702219B (sr)
UA (1) UA127507C2 (sr)
WO (1) WO2020014435A1 (sr)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3355884T (lt) 2015-10-01 2021-07-26 Olema Pharmaceuticals, Inc. Tetrahidro-1h-pirido[3,4-b]indolo antiestrogeniniai vaistai
SI3820874T1 (sl) * 2018-07-12 2023-02-28 Eli Lilly And Company Selektivni razgrajevalci estrogenskih receptorjev
TWI702219B (zh) * 2018-07-12 2020-08-21 美商美國禮來大藥廠 選擇性雌激素受體降解劑
KR20220034129A (ko) 2019-07-07 2022-03-17 올레마 파마슈티컬스 인코포레이티드 에스트로겐 수용체 길항제 요법
US12545640B2 (en) 2019-10-01 2026-02-10 Sanofi Substituted 6,7-dihydro-5H-benzo[7]annulene compounds, processes for their preparation and therapeutic uses thereof
WO2021116074A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Sanofi Crystalline form of a 7h-benzo[7]annulene-2-carboxylic acid derivative
TW202146007A (zh) * 2020-02-27 2021-12-16 法商賽諾菲公司 包含阿培利司（ａｌｐｅｌｉｓｉｂ）與６－（２，４－二氯苯基）－５－［４－［（３ｓ）－１－（３－氟丙基）吡咯啶－３－基］氧苯基］－８，９－二氫－７ｈ－苯并［７］輪烯－２－羧酸之組合
US20230404971A1 (en) * 2020-11-23 2023-12-21 Sanofi Combination Comprising Abemaciclib and 6-(2,4-Dichlorophenyl)-5-[4-[(3S)-1-(3-Fluoropropyl)Pyrrolidin-3-yl]Oxyphenyl]-8,9-Dihydro-7H-Benzo[7]Annulene-2-Carboxylic Acid
WO2022177843A1 (en) * 2021-02-16 2022-08-25 Genentech, Inc. Treatment of breast cancer using combination therapies comprising gdc-9545 and abemaciclib or ribociclib
CN114957114A (zh) * 2021-02-26 2022-08-30 冷志 一种4-溴-3-氯-7-甲氧基喹啉的合成方法
TWI837605B (zh) 2021-03-09 2024-04-01 美商美國禮來大藥廠 使用serd組合給藥方案治療癌症之方法
CN117042771A (zh) * 2021-03-09 2023-11-10 伊莱利利公司 使用serd给药方案的组合治疗癌症的方法
TWI894443B (zh) * 2021-03-16 2025-08-21 美商美國禮來大藥廠 選擇性雌激素受體降解劑
US11926634B2 (en) * 2022-02-01 2024-03-12 Eli Lilly And Company Processes for the preparation of selective estrogen receptor degraders
KR20250089532A (ko) 2022-10-17 2025-06-18 아스트라제네카 아베 암 치료를 위한 serd의 조합
TWI863667B (zh) 2022-11-02 2024-11-21 美商佩特拉製藥公司 用於治療疾病之磷酸肌醇3-激酶(pi3k)異位色烯酮抑制劑
JP2025539034A (ja) 2022-11-11 2025-12-03 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 癌の治療のための併用療法
US20240180893A1 (en) 2022-11-17 2024-06-06 Astrazeneca Ab Methods of treatment of breast cancer
KR20260005985A (ko) 2023-05-05 2026-01-12 일라이 릴리 앤드 캄파니 Er+ 유방암을 갖는 대상체에서 중추 신경계 (cns) 전이를 치료 및 예방하는 데 사용하기 위한 임루네스트란트 또는 그의 염
WO2024231548A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Astrazeneca Ab Combination of a parp1 inhibitor and a selective estrogen degrader for treating cancer

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7056931B2 (en) * 2001-05-22 2006-06-06 Eli Lilly And Company 2-substituted 1,2,3,4-tetrahydroquinolines and derivatives thereof, compositions and methods
US7329654B2 (en) * 2001-12-19 2008-02-12 Janssen Pharmaceutica N.V. Heteroatom containing tetracyclic derivatives as selective estrogen receptor modulators
EP1497277A1 (en) * 2002-04-19 2005-01-19 Signal Pharmaceuticals, Inc. Benzopyranone compounds, compositions thereof, and methods of treatment therewith
US20090023917A1 (en) * 2004-01-22 2009-01-22 Eli Lilly And Company Selective Estrogen Receptor Modulators for the Treatment of Vasomotor Symptoms
US20080221163A1 (en) * 2005-01-18 2008-09-11 Jeffrey Alan Dodge Selective Estrogen Receptor Modulators
MX2015016171A (es) 2013-06-19 2016-08-08 Seragon Pharmaceuticals Inc Moduladores del receptor de estrogeno de azetidina y usos de los mismos.
IL311006A (en) * 2014-12-18 2024-04-01 Hoffmann La Roche Tetrahydro-pyrido[3, 4-b]indole estrogen receptor modulators and their uses
JP6807841B2 (ja) 2014-12-18 2021-01-06 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト エストロゲン受容体モジュレーター及びその使用
WO2018108954A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the preparation of 2-(3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl)ethan-1-ol
SI3820874T1 (sl) * 2018-07-12 2023-02-28 Eli Lilly And Company Selektivni razgrajevalci estrogenskih receptorjev
TWI702219B (zh) * 2018-07-12 2020-08-21 美商美國禮來大藥廠 選擇性雌激素受體降解劑

Also Published As

Publication number Publication date
ECSP21001770A (es) 2021-02-26
PT3820873T (pt) 2022-12-23
HUE060963T2 (hu) 2023-04-28
KR20230005404A (ko) 2023-01-09
PL3820873T3 (pl) 2023-02-13
KR102550538B1 (ko) 2023-07-04
KR20210019065A (ko) 2021-02-19
IL289871A (en) 2022-03-01
JP7009672B1 (ja) 2022-01-25
JP6995241B2 (ja) 2022-01-14
HRP20230009T1 (hr) 2023-02-17
MA53124B1 (fr) 2023-02-28
IL289871B2 (en) 2023-02-01
WO2020014435A1 (en) 2020-01-16
AU2019299947B2 (en) 2022-03-17
AR115694A1 (es) 2021-02-17
MD3820873T2 (ro) 2023-05-31
MX2023006047A (es) 2023-06-02
US11993608B2 (en) 2024-05-28
US20230234960A1 (en) 2023-07-27
CN112638916B (zh) 2023-09-12
IL280065B (en) 2022-04-01
MX2021000375A (es) 2021-05-27
MA53124A (fr) 2021-05-19
JP2021530484A (ja) 2021-11-11
TWI702219B (zh) 2020-08-21
CA3105501A1 (en) 2020-01-16
SG11202100148TA (en) 2021-02-25
CA3105501C (en) 2023-10-31
UA127507C2 (uk) 2023-09-13
JP2022050591A (ja) 2022-03-30
NZ771718A (en) 2024-05-31
US11634426B2 (en) 2023-04-25
KR102589886B1 (ko) 2023-10-17
BR112020025654A2 (pt) 2021-04-06
JP2022037102A (ja) 2022-03-08
JP2025186400A (ja) 2025-12-23
MA53126B1 (fr) 2023-02-28
KR20230148386A (ko) 2023-10-24
US10654866B2 (en) 2020-05-19
IL280065A (en) 2021-03-01
US20200017516A1 (en) 2020-01-16
JP7241211B2 (ja) 2023-03-16
MA53126A (fr) 2021-05-19
US20210403480A1 (en) 2021-12-30
EA202092975A1 (ru) 2021-04-14
US11117902B2 (en) 2021-09-14
JP2024169490A (ja) 2024-12-05
CL2021000045A1 (es) 2021-07-19
CN117379428A (zh) 2024-01-12
FI3820873T3 (fi) 2023-03-02
EP3820873A1 (en) 2021-05-19
LT3820873T (lt) 2023-01-10
PE20210400A1 (es) 2021-03-02
AU2022203969A1 (en) 2022-06-30
JOP20210005A1 (ar) 2021-01-10
EP4155310A1 (en) 2023-03-29
ES2933980T3 (es) 2023-02-15
IL295598B2 (en) 2023-09-01
IL289871B (en) 2022-10-01
AR134487A2 (es) 2026-01-21
SI3820873T1 (sl) 2023-02-28
MY198962A (en) 2023-10-05
SA521421008B1 (ar) 2022-10-30
JP7557564B2 (ja) 2024-09-27
EP3820873B1 (en) 2022-11-23
KR102783756B1 (ko) 2025-03-21
US20200347073A1 (en) 2020-11-05
AU2019299947A1 (en) 2021-01-07
CN112638916A (zh) 2021-04-09
JP2023081954A (ja) 2023-06-13
TW202019935A (zh) 2020-06-01
PH12021550049A1 (en) 2021-09-20
AU2022203969B2 (en) 2024-02-15
IL295598B1 (en) 2023-05-01
IL295598A (en) 2022-10-01
CO2021000043A2 (es) 2021-01-18
JP7746496B2 (ja) 2025-09-30
DK3820873T3 (da) 2022-12-12
BR122023025061A2 (pt) 2024-02-20
CR20210007A (es) 2021-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7746496B2 (ja) 選択的エストロゲン受容体分解剤
EA045961B1 (ru) Селективные супрессоры рецептора эстрогена
HK40041679B (en) Selective estrogen receptor degraders
HK40041679A (en) Selective estrogen receptor degraders
EA049132B1 (ru) Селективные супрессоры рецептора эстрогена
BR112020025654B1 (pt) Degradadores de receptor de estrogênio seletivo, composição farmacêutica e seus usos
EA040517B1 (ru) Селективные супрессоры рецептора эстрогена