RS63727B1 - Transficirane t ćelije i t-ćelijski receptori za upotrebu u imunoterapiji protiv malignih tumora - Google Patents

Description

Pronalazak se odnosi na TCR koji se specifično vezuje za IGF2BP3 peptid i na upotrebu TCR-a u vidu leka, konkretno u lečenju raka.

OSNOVNE INFORMACIJE

Imunoterapija zasnovana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumor-asociranih ili tumor-specifičnih proteina koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Ovi tumor-asocirani antigeni (TAA) mogu biti peptidi dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

IGF2BP3 je član familije proteina insulinu sličnog faktora rasta 2 koji vezuju iRNK, uključene u kontrolu lokalizacije, obrta i translacije iRNK. Prisustvo visokih nivoa transkripta IGF2BP3 u brojnim tkivima raka u poređenju sa kontrolnim tkivima ukazuje na to da protein IGF2BP3 može imati funkcionalnu ulogu u proliferaciji transformiranih ćelija. Ekspresija IGF2BP3 je prijavljena u brojnim vrstama malignih tumora, uključujući svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija (RCC), maligni melanom, skvamocelularni karcinom jednjaka, karcinom pankreasa i tumore urotela. Zato, epitopi dobijeni od IGF2BP3 mogu biti korisni za proizvodnju antitumorskih lekova koji ciljaju maligne tumore koji eksprimiraju IGF2BP3.

Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Budući da obe vrste odgovora, CD8- i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena i odgovarajućih T-ćelijskih receptora važna je u razvoju imunoterapija za rak kao što su vakcine i ćelijske terapije.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR-ove). Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine i ćelijske terapije.

Iako je postignut napredak u razvoju lekova za lečenje raka koji ciljaju molekule, u ovoj stručnoj oblasti i dalje ostaje potreba da se razviju novi antitumorski lekovi koji specifično ciljaju molekule koji su visoko specifični za ćelije raka. Predmetni opis usmeren je na tu potrebu tako što obezbeđuje nove TCR-ove, nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine koji se specifično vezuju za epitope IGF2BP3 kao što su peptid KIQEILTQV (IGF2BP3-001; ID BR. SEKV: 1) i njegove varijante, kao i metode za upotrebu takvih molekula u lečenju raka.

SAŽETAK

U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje TCR koji se sastoji od alfa lanca i beta lanca, naznačen time što alfa lanac sadrži TCR alfa varijabilni domen koji sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 2, a beta lanac sadrži TCR beta varijabilni domen koji sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 10; i naznačen time što se TCR specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-MHC molekul naznačen time što peptid IGF2BP3-001 sadrži ID BR. SEKV: 1 i naznačen time što se TCR vezuje za položaje 1 i 3 do 7 dotičnog peptida IGF2BP3-001.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje TCR koji se sastoji od gama lanca i delta lanca, naznačen time što gama lanac sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 2, a delta lanac TCR-a sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 10; i naznačen time što se TCR specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-MHC molekul naznačen time što peptid IGF2BP3-001 sadrži ID BR. SEKV: 1 i naznačen time što se TCR vezuje za položaje 1 i 3 do 7 dotičnog peptida IGF2BP3-001.

U trećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac i/ili beta lanac TCR-a iz prvog aspekta, ili gama lanac i/ili delta lanac TCR-a iz drugog aspekta.

U četvrtom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu iz trećeg aspekta operabilno povezanu sa najmanje jednom promoterskom sekvencom.

U petom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu vektorom ekspresije iz četvrtog aspekta.

U šestom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku smešu koja sadrži TCR iz prvog ili drugog aspekta, nukleinsku kiselinu iz trećeg aspekta, vektor ekspresije iz četvrtog aspekta i/ili ćeliju domaćina iz petog aspekta; i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

U sedmom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje TCR u skladu sa prvim ili drugim aspektom, ili nukleinsku kiselinu u skladu sa trećim aspektom, ili vektor ekspresije u skladu sa četvrtim aspektom, ili ćeliju domaćina u skladu sa petim aspektom, ili farmaceutsku smešu u skladu sa šestim aspektom, za upotrebu u vidu leka.

U osmom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje TCR u skladu sa prvim ili drugim aspektom, ili nukleinsku kiselinu u skladu sa trećim aspektom, ili vektor ekspresije u skladu sa četvrtim aspektom, ili ćeliju domaćina u skladu sa petim aspektom, ili farmaceutsku smešu u skladu sa šestim aspektom, za upotrebu u dijagnostici, prevenciji i/ili lečenju raka.

U devetom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod za proizvodnju TCR-a koji se specifično vezuje za peptid sa ID BR. SEKV: 1 kada ga prezentuje MHC molekul, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina iz petog aspekta pod uslovima koji su prikladni za promovisanje ekspresije TCR-a.

U desetom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod za detekciju raka u biološkom uzorku koji se sastoji od: a) dovođenja u kontakt biološkog uzorka sa TCR-om iz prvog ili drugog aspekta i b) detekcije vezivanja TCR-a za biološki uzorak.

Pronalazak je iznet u priloženom skupu patentnih zahteva. Sledeći su predstavljeni u opisu, ali nisu deo pronalaska:

- TCR koji se specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul bez daljih ograničenja patentnog zahteva 1, naznačen time što peptid IGF2BP3-001 sadrži, ili se alternativno sastoji od, KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1). U jednom otelotvorenju, HLA molekul je HLA-A*02.

- TCR koji se specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul bez daljih ograničenja patentnog zahteva 1, naznačen time što peptid IGF2BP3-001 sadrži, ili se alternativno sastoji od, varijante IGF2BP3-001 koja je najmanje 66%, poželjno najmanje 77%, a još poželjnije najmanje 88% homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1, naznačen time što se navedena varijanta vezuje za HLA molekul klase I ili klase II i/ili indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, naznačen time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.

- TCR koji sadrži TCR alfa varijabilni domen koji ima najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identičnost sekvence, poželjno 90% identičnost sekvence sa TCR alfa varijabilnim domenom prikazanim u tabeli 1; i TCR beta varijabilni domen koji ima najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identičnost sekvence, poželjno 90% identičnost sekvence sa TCR beta varijabilnim domenom prikazanim u tabeli 1, bez daljih ograničenja patentnog zahteva 1.

- TCR alfa lanci koji sadrže jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) alfa lanca predstavljenih u tabeli 1, i njihove varijante koje imaju jednu, dve, tri ili četiri supstitucije u odnosu na CDR-ove prikazane u tabeli 1.

- TCR alfa lanci koji sadrže najmanje jedan CDR izabran od CDR1, CDR2 i CDR3 prikazanih u tabeli 1.

- TCR alfa lanci koji sadrže CDR3 alfa lanca prikazan u tabeli 1.

- TCR beta lanci koji sadrže jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) beta lanca predstavljenih u tabeli 1, i njihove varijante koje imaju jednu, dve, tri ili četiri supstitucije u odnosu na CDR-ove prikazane u tabeli 1.

- TCR beta lanci koji sadrže najmanje jedan CDR izabran od CDR1, CDR2 i CDR3 beta lanca prikazanih u tabeli 1.

- TCR beta lanci koji sadrže CDR3 beta lanca prikazan u tabeli 1, bez daljih ograničenja patentnog zahteva 1.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Sl. 1 prikazuje prezentaciju peptida IGF2BP3-001 u zdravim tkivima i malignim tumorima.

Sl. 2–4 prikazuju ekspresiju IGF2BP3-001 u raku i zdravim tkivima.

Sl. 5 prikazuje bojenje tetramera MHC/IGF2BP3-001 ili tetramera MHC/NYESO1-001 CD8+ T ćelija elektroporisanih sa alfa i beta lancem RNK TCR R10P1A7 (tabela 1). CD8+ T ćelije transformisane sa RNK 1G4 TCR-a koji se specifično vezuje za kompleks MHC/NYESO1-001 i lažne transformacije služile su kao kontrole.

Sl. 6 prikazuje oslobađanje IFNγ iz CD8+ T ćelija elektroporisanih sa alfa i beta lancem RNK TCR R10P1A7 (tabela 1) nakon ko-inkubacije sa ciljnim ćelijama u koje je ubačen peptid IGF2BP3-001 (ID BR. SEKV: 1) ili homologni ali nepovezan peptid CLUA-001 (ID BR. SEKV: 26), CHCHD6-001 (ID BR. SEKV: 27), CDC42BPG-001 (ID BR. SEKV: 28), PARP14-002 (ID BR. SEKV: 29), SYNE2-001 (ID BR. SEKV: 30), IFT7-001 (ID BR. SEKV: 31), DHRS12-001 (ID BR. SEKV: 32), STX12-001 (ID BR. SEKV: 33), EEA-001 (ID BR. SEKV: 34), SENP7-001 (ID BR. SEKV: 35) ili kontrolni peptid NYESO1-001 (ID BR. SEKV: 36). Podaci o oslobađanju IFNγ dobijeni su sa CD8+ T ćelijama dobijenim od dva različita donora. RNK elektroporisane CD8+ T ćelije same ili nakon ko-inkubacije sa nenapunjenim ciljnim ćelijama služile su kao kontrole.

Sl. 7 prikazuje oslobađanje IFNγ iz CD8+ T ćelija elektroporisanih sa alfa i beta lancem RNK TCR R10P1A7 nakon ko-inkubacije sa ciljnim ćelijama u koje je ubačen IGF2BP3-001 (ID BR. SEKV: 1) ili razne varijante IGF2BP3-001 sa supstitucijom alanina na položajima 1–9 ID BR. SEKV: 1. RNK elektroporisane CD8+ T ćelije same ili nakon ko-inkubacije sa ciljnim ćelijama napunjenim sa kontrolnim peptidom NYESO1-001 ili nenapunjene ciljne ćelije služile su kao kontrole. Podaci o oslobađanju IFNγ dobijeni su sa CD8+ T ćelijama dobijenim od dva različita donora.

Sl. 8 Oslobađanje IFNγ iz CD8+ T ćelija elektroporisanih sa alfa i beta lancem RNK TCR R10P1A7 (tabela 1) nakon ko-inkubacije sa A-375 ćelijskom linijom melanoma, T98G ćelijskom linijom glioblastoma, odnosno SK-BR-3 ćelijskom linijom karcinoma dojke. RNK elektroporisane CD8+ T ćelije same su služile kao kontrola.

DETALJNI OPIS

Predmetni opis se odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.

Predmetni opis se dalje odnosi na TCR-ove, pojedinačne podjedinice TCR-a (samostalne ili u kombinaciji) i njihove poddomene, rastvorljive TCR-ove (sTCR-ovi), na primer, rastvorljive alfa/beta dimerne TCR-ove koji imaju najmanje jednu međulančanu disulfidnu vezu između ostataka konstantnog domena koje nisu prisutne u nativnim TCR-ovima, i klonirane TCR-ove, pri čemu su navedeni TCR-ovi uvedeni inženjeringom u autologne ili alogene T ćelije ili progenitorske T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i druge ćelije koje nose navedeni TCR.

DEFINICIJE

Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku.

Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul.

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, i duži sa dužinom od 10, 11 ili 12 aminokiselina ili duži, a u slučaju peptida MHC klase II (duže varijante peptida opisa) oni mogu biti dužine od 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Napomenuto je da se soli peptida u skladu sa predmetnim opisom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.

Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za opis, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za opis, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog opisa), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog opisa, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog opisa, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine iz ovog opisa sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) TCR“ odnosi se na jednu ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju TCR uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, T ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.

Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u

1

količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se javlja u prirodi). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. U jednom aspektu, takvi polinukleotidi su deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi su deo smeše, a i dalje su izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim opisom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je obuhvaćen.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim opisom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni opis mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnim opisom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa sekvencom shodno patentnom zahtevu ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili sekvencom shodno patentnom zahtevu („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i

(iv) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

U opisu, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom.

Pod „varijantom“ date aminokiselinske sekvence pronalazači podrazumevaju da bočni lanci, na primer, jednog ili dva aminokiselinska ostatka budu izmenjeni (na primer tako

1

što će biti zamenjeni bočnim lancem drugog aminokiselinskog ostatka koji se prirodno pojavljuje ili nekim drugim bočnim lancem) tako da peptid i dalje bude sposoban da se vezuje za HLA molekul na značajno isti način kao i peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV: 1. Na primer, peptid može biti modifikovan tako da najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost interakcije sa i vezivanja za udubljenje za vezivanje prikladnog MHC molekula, kao što su HLA-A*02 ili -DR, i na taj način najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T limfocita. Slično tome, TCR može biti modifikovan tako da najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost interakcije sa i vezivanja za prikladni kompleks MHC molekul/KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1), kao što su HLA-A*02 ili -DR, i na taj način najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost aktiviranja T ćelija.

Ove T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida, kao što je KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1), kako je definisan u aspektima ovog opisa. Kako se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje. U jednom aspektu, osoba stručna u predmetnoj oblasti će imati mogućnost da prema učenjima iz opisa modifikuje aminokiselinsku sekvencu TCR-a, zadržavanjem poznatih sidrenih ostataka, i biće u stanju da utvrdi da li takve varijante TCR-a zadržavaju sposobnost vezivanja kompleksa MHC klasa I ili II molekuli/KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1). Varijante TCR-a opisa zadržavaju sposobnost vezivanja kompleksa MHC klasa I ili II molekuli/KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1). T ćelije koje eksprimiraju varijante TCR-a opisa mogu posledično da ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida, kao što je KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1).

U jednom aspektu, peptidi ili TCR-ovi koji su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Poželjno, te supstitucije nalaze se na kraju aminokiselinskog lanca navedenog peptida. Za TCR-ove, te supstitucije se poželjno nalaze na varijabilnim domenima alfa lanca TCR-a i beta lanca TCR-a. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koja inače ne bi mogla da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.

U jednom aspektu, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima iz ovog opisa a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, nestandardne aminokiseline (tj. koje nisu uobičajene proteinogene aminokiseline koje se javljaju u prirodi) mogu se takođe koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnim opisom.

1

Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.

T-ĆELIJSKI RECEPTORI (TCR-ovi)

U jednom poželjnom otelotvorenju, opis se odnosi na TCR koji sadrži alfa lanac TCR-a prikazan u tabeli 1 i njegove varijante; i beta lanac TCR-a prikazan u tabeli 1 i njegove varijante. TCR opisan u ovom dokumentu ima sposobnost da se veže ili da se specifično veže za kompleks molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I/KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1) ili kompleks klasa II/KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1).

Tabela 1: Re rezentativni TCR u skladu sa redmetnim o isom

1

Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.

U predmetnom opisu, termin „TCR alfa varijabilni domen“ se tako odnosi na spoj TCR alfa V (TRAV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR alfa J (TRAJ) regiona, a termin „TCR alfa konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRAC region, ili na C-terminalno skraćenu TRAC sekvencu, i opciono alfa transmembranski domen (VIGFRILLLKVAGFNLLMTL (ID BR. SEKV: 18)).

1

Isto tako, termin „TCR beta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR beta V (TRBV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR beta D/J (TRBD/TRBJ) regiona, a termin „TCR beta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRBC region, ili na C-terminalno skraćenu TRBC sekvencu, i opciono beta transmembranski domen (TILYEILLGKATLYAVLVSALVL (ID BR. SEKV: 19)).

U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži ili se sastoji od alfa lanca TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa alfa lancem TCR-a prikazanim u tabeli 1. Alfa lanci TCR-a prikazani u tabeli 1 sadrže vodeći (L) segment, V lanac, tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR1, CDR2 i CDR3), spojni region (J) i konstantni region, kako je definisano u tabeli 1.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži ili se sastoji od alfa varijabilnog domena TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa alfa varijabilnim domenom TCR-a prikazanim u tabeli 1.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži ili se sastoji od alfa konstantnog domena TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 75% identičan sa alfa konstantnim domenom TCR-a prikazanim u tabeli 1.

1

TCR alfa lanci predmetnog opisa mogu dalje sadržati TCR alfa transmembranski domen i/ili TCR alfa unutarćelijski domen. TCR beta lanci predmetnog opisa mogu dalje sadržati TCR beta transmembranski domen i/ili TCR beta unutarćelijski domen.

U naročito poželjnom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži, ili se sastoji od, alfa varijabilnog domena TCR-a koji ima najmanje 90% identičnost sekvence sa alfa varijabilnim domenom TCR-a prikazanim u tabeli 1, i sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 istog alfa varijabilnog domena iz tabele 1.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži, ili se sastoji od, beta lanca TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa beta lancem TCR-a prikazanim u tabeli 1. Beta lanci TCR-a prikazani u tabeli 1 sadrže vodeći (L) segment, V lanac, tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR1, CDR2 i CDR3), spojni region (J) i konstantni region, kako je definisano u tabeli 1.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži, ili se sastoji od, beta varijabilnog domena TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa beta varijabilnim domenom TCR-a prikazanim u tabeli 1.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži, ili se sastoji od, beta konstantnog domena TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 75% identičan sa beta konstantnim domenom TCR-a prikazanim u tabeli 1.

U naročito poželjnom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži, ili se sastoji od, beta varijabilnog domena TCR-a koji ima najmanje 90% ili 95% identičnost sekvence sa beta varijabilnim domenom TCR-a prikazanim u tabeli 1, i sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 istog beta varijabilnog domena TCR-a iz tabele 1.

Alfa lanac TCR-a i beta lanac TCR-a mogu biti spojeni da obrazuju jednolančani TCR. Alternativno, alfa i beta lanci TCR-a mogu biti eksprimirani kao zasebni proteini koji mogu biti spojeni u heterodimer.

1

U jednom otelotvorenju, bilo koji alfa lanac TCR-a iz tabele 1 se uparuje sa bilo kojim drugim beta lancem TCR-a kako bi se proizveo TCR koji se specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul. U drugom otelotvorenju, bilo koji beta lanac TCR-a iz tabele 1 se uparuje sa bilo kojim drugim alfa lancem TCR-a kako bi se proizveo TCR koji se specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul.

TCR R10P1A7

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži, ili se sastoji od, alfa lanca i/ili beta lanca TCR R10P1A7, koji odgovaraju ID BR. SEKV: 2, odnosno ID BR. SEKV: 10.

TCR alfa varijabilni domen TCR R10P1A7 sadrži, ili se alternativno sastoji od, aminokiselina 22 do 130 ID BR. SEKV: 2; TCR alfa konstantni domen TCR R10P1A7 sadrži, ili se alternativno sastoji od, aminokiselina 131 do 271 ID BR. SEKV: 2; TCR beta varijabilni domen TCR R10P1A7 sadrži, ili se alternativno sastoji od, aminokiselina 26 do 139 ID BR. SEKV: 10 i TCR beta konstantni domen sadrži, ili se alternativno sastoji od, aminokiselina 140 do 318 ID BR. SEKV: 10.

U jednom konkretnom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži alfa lanac TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa alfa lancem TCR-a ID BR. SEKV: 2.

U drugom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži alfa varijabilni domen TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa alfa varijabilnim domenom TCR-a ID BR. SEKV: 2.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži alfa konstantni domen TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 75% identičan sa alfa konstantnim domenom TCR-a ID BR. SEKV: 2.

2

U naročito poželjnom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži alfa varijabilni domen TCR-a koji ima najmanje 90% identičnost sekvence sa alfa varijabilnim domenom TCR-a ID BR. SEKV: 2, i sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 2.

U drugom konkretnom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži beta lanac TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa beta lancem TCR-a ID BR. SEKV: 10.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži beta varijabilni domen TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa beta varijabilnim domenom TCR-a ID BR. SEKV: 10.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži beta konstantni domen TCR-a koji je najmanje 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, poželjno 75% identičan sa beta konstantnim domenom TCR-a ID BR. SEKV: 10.

U naročito poželjnom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa sadrži beta varijabilni domen TCR-a koji ima najmanje 90% identičnost sekvence sa beta varijabilnim domenom TCR-a ID BR. SEKV: 10, i sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 10.

U jednom otelotvorenju HLA molekul je MHC molekul klase I izabran iz grupe koju čine molekuli HLA-A, HLA-B i HLA-C. U jednom otelotvorenju, HLA molekul je HLA-A*02. U drugom otelotvorenju HLA molekul je MHC molekul klase II izabran iz grupe koju čine HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR.

TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetnog pronalaska obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR-ovima predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.

Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.

Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR-a mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.

TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.

U jednom otelotvorenju, alfa varijabilni domen TCR-a ima najmanje jednu mutaciju u odnosu na alfa domen TCR-a prikazan u tabeli 1; i/ili beta varijabilni domen TCR-a ima najmanje jednu mutaciju u odnosu na alfa domen TCR-a prikazan u tabeli 1. U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa varijabilnom domenu TCR-a i/ili beta varijabilnom domenu TCR-a ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk u poređenju sa TCR-om koji sadrži nemutirani alfa domen TCR-a i/ili nemutirani beta varijabilni domen TCR-a.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.

U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR-a i/ili beta lancu TCR-a ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks IGF2BP3-001 peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk u poređenju sa TCR-om koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR-a i/ili nemutirani beta lanac TCR-a. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR-ova, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumor-asocirane autoantigene (Aleksic et al.2012; Kunert et al.2013). Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija (Xing et al. 2012; Ruella et al.2014; Sharpe et al.2015), što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene. Stoga, afinitet TCR-ova ili varijanti predmetnog opisa za IGF2BP3-001 može da se pojača pomoću metoda koje su dobro poznate u predmetnoj oblasti.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše predmetnog opisa takođe obuhvataju najmanje jednu ćeliju domaćina koja eksprimira TCR predmetnog opisa, u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

2

Farmaceutske smeše predmetnog opisa mogu takođe obuhvatati farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz priručnika A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253, koji je ovde u celosti uključen putem reference.

Dalji aspekt opisa obezbeđuje nukleinske kiseline (na primer polinukleotide) koje kodiraju peptid, varijante peptida, TCR-ove i varijante TCR-ova iz ovog opisa. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt opisa obezbeđuje vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira polipeptid u skladu sa ovim opisom.

Opis se dalje odnosi na izolovanu ili rekombinantnu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira TCR predmetnog opisa. U jednom otelotvorenju, nukleinske kiseline opisa kodiraju alfa lanac TCR-a i/ili beta lanac TCR-a kako je prikazano u tabeli 1. Opis se dalje odnosi na rekombinantni vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TCR alfa lanac, beta lanac, ili oba, kako je opisano u ovom dokumentu.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid opisa koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR alfa i/ili TCR beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigenska specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih mononuklearnih ćelija periferne krvi, PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.

U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR alfa i/ili TCR beta lanaca.

TCR lanci uvedeni u perifernu T ćeliju mogu da se takmiče sa endogenim TCR lancima za povezivanje sa CD3 kompleksom, koje je neophodno za površinsku ekspresiju TCR-a. Zbog toga što je visok nivo površinske ekspresije TCR-a nužan za omogućavanje odgovarajuće senzitivnosti za pokretanje od strane ćelija koje eksprimiraju ciljni

2

tumorski antigen (Cooper et al., 2000; Labrecque et al., 2001), strategije koje pojačavaju nivoe ekspresije TCR alfa i TCR beta gena predstavljaju značajno razmatranje u TCR genskoj terapiji.

Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTR-ovi), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), β-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter (Cooper et al., 2004; Jones et al., 2009), faktor elongacije (EF)-1a (Tsuji et al., 2005) i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV) ( Joseph et al., 2008). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira.

Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

Alfa i beta lanci TCR-a predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR alfa i TCR beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR alfa i TCR beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR alfa i TCR beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR alfa i TCR beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR alfa i TCR beta lanaca. (Schmitt et al. 2009).

2

Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni‘‘ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR alfa i TCR beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR alfa i TCR beta gena (Scholten et al., 2006).

Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR alfa i TCR beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR alfa i u TCR beta lanac uvedenog TCR-a (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR alfa i TCR beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR alfa i TCR beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija). (Schmitt et al.2009).

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu iz ovog opisa. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu iz ovog opisa može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida iz ovog opisa. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800,

2

4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648, koji su pomoću reference inkorporirani u ovaj dokument.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje iz ovog opisa može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Opis se dalje odnosi na izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži rekombinantni vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu koja kodira TCR alfa lanac, beta lanac, ili oba, kako je opisano u ovom dokumentu.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK iz ovog opisa se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem

2

mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora replikacije SV40 će rezultovati visokim nivoima replikacije DNK u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže pre-pro-tripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za

2

prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

U drugom otelotvorenju dva ili više peptida ili varijanti peptida opisa su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi ili varijante peptida mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih. Ovi konstrukti mogu takođe da se koriste za antitumorsku terapiju i mogu indukovati imunske odgovore koji uključuju i MHC I i MHC II.

Predmetni opis se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog opisa. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog opisa postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen et al. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012) . Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al. (Sherman et al., 1986) . Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog opisa, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini iz ovog opisa korisne za pripremanje peptida iz ovog opisa, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida iz ovog opisa tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani opis obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa opisom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog karcinoma prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Opis se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa opisom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan.

1

Opis se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa opisom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Opis se dalje odnosi na izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži rekombinantni vektor ekspresije u skladu sa predmetnim opisom, poželjno naznačenu time što je ćelija humana ćelija, poželjno limfocit periferne krvi (PBL), još poželjnije CD4- ili CD8-pozitivan T limfocit.

Opis se dalje odnosi na izolovani PBL koji sadrži rekombinantni vektor ekspresije opisa, naznačen time što je PBL CD8+ T ćelija ili CD4+ T ćelija.

Opis se dalje odnosi na populaciju ćelija koja sadrži najmanje jednu ćeliju domaćina opisanu u ovom dokumentu.

Opis se dalje odnosi na aktivirane T limfocite, proizvedene pomoću metoda u skladu sa ovim opisom, naznačeno time što T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa opisom.

Opis se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida ili njegove varijante, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, TCR-ovi, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije opisa koriste se u medicini. Na primer, peptid ili njegova varijanta mogu biti pripremljeni za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane

2

npr. Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Dalje su opisani aptameri. Aptameri (vidite na primer patent WO 2014/191359 i tamo citiranu literaturu) su kratki jednolančani molekuli nukleinske kiseline koji mogu da se presaviju u definisane trodimenzionalne strukture i prepoznaju specifične ciljne strukture. Ispostavilo se da su pogodne alternative za razvoj ciljanih terapija. Pokazalo se da se aptameri selektivno vezuju za raznolike kompleksne ciljeve sa visokim afinitetom i specifičnošću.

U poslednjoj dekadi su identifikovani aptameri koji prepoznaju molekule koji se nalaze na površini ćelije i obezbeđuju načine za razvoj dijagnostičkih i terapeutskih pristupa. Budući da se pokazalo da aptameri praktično nemaju toksičnost i imunogenost oni su obećavajući kandidati za biomedicinske primene. Aptameri su zaista, na primer aptameri koji prepoznaju membranski antigen specifičan za prostatu, uspešno upotrebljeni za ciljane terapije i pokazalo se da su funkcionalni u in vivo modelima ksenografta. Pored toga, identifikovani su aptameri koji prepoznaju specifične tumorske ćelijske linije.

Mogu da se izaberu DNK aptameri kako bi se otkrila svojstva prepoznavanja širokog spektra za različite ćelije malignih tumora, a naročito one dobijene iz solidnih tumora, dok se netumorogene i primarne zdrave ćelije ne prepoznaju. Ako identifikovani aptameri prepoznaju ne samo specifični podtip tumora već interaguju sa nizom tumora, ovo čini aptamere primenjivim kao takozvana dijagnostička i terapeutska sredstva širokog spektra.

Nadalje, ispitivanje ponašanja ćelijskog vezivanja pomoću protočne citometrije pokazalo je da aptameri pokazuju veoma dobre jasne afinitete koji su u nanomolarnom opsegu.

Aptameri su korisni za dijagnostičke i terapeutske svrhe. U jednom aspektu, tumorske ćelije preuzimaju najmanje jedan ili više aptamera i tako mogu da imaju funkciju kao prenosioci molekula za ciljano dostavljanje antitumorskih agenasa kao što je siRNK u tumorske ćelije.

Mogu da se izaberu aptameri protiv kompleksnih ciljeva kao što su ćelije i tkiva i kompleksi peptida ili TCR-ovi koji sadrže, poželjno sastoje se od, sekvence u skladu sa bilo kojom od ID BR. SEKV 14 do ID BR. SEKV 15, u skladu sa izloženim opisom sa MHC molekulom, koristeći cell-SELEX (sistematska evolucija liganada pomoću eksponencijalnog obogaćivanja) tehniku.

U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.

Opis se dalje odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I ili II tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I ili II.

Opis se dalje odnosi na metod u skladu sa opisom, naznačen time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira ili eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 ili njegovu varijantu.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/IGF2BP3, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko

4

aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/p286-1Y2L, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/p286-1Y2L9L, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRα β genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa IGF2BP3-001, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRα β genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa p286-1Y2L, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)–Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRα β genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa p286-1Y2L9L, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)–Calibur.

Predmetni opis se dalje odnosi na metod u skladu sa opisom, naznačen time što T ćelija sadrži vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira TCR u skladu sa predmetnim opisom.

Predmetni opis se dalje odnosi na metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju IGF2BP3, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja TCR-ova, rastvorljivih TCR-ova i/ili T ćelija u skladu sa predmetnim opisom.

Opis se dalje odnosi na metode ubijanja ili smanjivanja broja ćelija raka koji se sastoji od dovođenja u kontakt ćelija raka sa TCR-om, nukleinskom kiselinom, vektorom ili ćelijom domaćinom kako su opisani u ovom dokumentu. Takođe su opisani metodi lečenja raka koji se sastoje od davanja TCR-a, nukleinske kiseline, vektora ili ćelije domaćina kako su opisani u ovom dokumentu pojedincu kojem je to potrebno.

Opis se dalje odnosi na metode ubijanja ćelija raka i/ili suprimiranje ćelija kod pacijenta čije ćelije raka aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa opisom, pri čemu metodi obuhvataju davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih u skladu sa opisom.

Opis se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira TCR u skladu sa opisom, i vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa opisom.

Opis se dalje odnosi na TCR u skladu sa opisom, nukleinsku kiselinu u skladu sa opisom ili vektor ekspresije u skladu sa opisom za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.

Opis se dalje odnosi na TCR-ove ili ćelije domaćine predmetnog opisa za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom bubrežnih ćelija, rak mozga (npr. glioblastom, neuroblastom), rak želuca, kolorektalni karcinom, hepatocelularni karcinom, rak glave i vrata, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese i žučnih puteva i rak jednjaka.

U jednom aspektu, ćelija domaćin je CD8+ T ćelija ili CD4+ T ćelija transficirana sa nukleinskom kiselinom koja kodira najmanje jedan TCR u skladu sa opisom, naznačena time što TCR sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu navedenu u tabeli 1. U drugom aspektu takve ćelije domaćini se koriste u imunoterapiji sitnoćelijskog karcinoma pluća, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, sitnoćelijskog karcinoma pluća, karcinoma bubrežnih ćelija, raka mozga (npr. glioblastom, neuroblastom), raka želuca, kolorektalnog karcinoma, hepatocelularnog karcinoma, raka pankreasa, raka prostate, leukemije, raka dojke, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, raka jajnika, raka mokraćne bešike, raka materice, raka žučne kese i žučnih puteva i raka jednjaka.

Predmetni opis se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog TCR-a, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim opisom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim opisom, ćelije u skladu sa predmetnim opisom, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim opisom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Predmetni opis se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim opisom, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.

Predmetni opis se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa opisom, naznačenu time što su navedene ćelije raka ćelije nesitnoćelijskog karcinoma pluća ili ćelije drugog solidnog ili hematološkog tumora kao što su nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom bubrežnih ćelija, rak mozga, rak želuca, kolorektalni karcinom, hepatocelularni karcinom, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese i žučnih puteva i rak jednjaka.

Predmetni opis se dalje odnosi na metod ubijanja ćelija raka koji se sastoji od dovođenja u kontakt ćelija raka sa ćelijom domaćinom predmetnog opisa. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin eksprimira TCR predmetnog opisa. U jednom otelotvorenju ćelija domaćin je T ćelija ili progenitorska T ćelija. U jednom otelotvorenju, u poželjnom otelotvorenju ćelije raka su izabrane od ćelija nesitnoćelijskog karcinoma pluća ili ćelija drugog solidnog ili hematološkog tumora kao što su nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom bubrežnih ćelija, rak mozga, rak želuca, kolorektalni karcinom, hepatocelularni karcinom, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese i žučnih puteva i rak jednjaka. U nekim otelotvorenjima, TCR je konjugovan sa terapeutski aktivnim agensom. U određenim otelotvorenjima, terapeutski aktivan agens je izabran iz grupe koju čine radionuklid, hemioterapijski agens i toksin.

Predmetni opis se dalje odnosi na metod lečenja raka koji se sastoji od davanja ćelije domaćina predmetnog opisa ispitaniku kojem je to potrebno. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin eksprimira TCR predmetnog opisa. U jednom otelotvorenju ćelija domaćin je T ćelija ili progenitorska T ćelija. U jednom otelotvorenju ćelija domaćin je autologna sa ispitanikom koji treba da se leči. U drugom otelotvorenju ćelija domaćin je alogena sa ispitanikom koji treba da se leči. U poželjnom otelotvorenju ćelije raka su izabrane od ćelija nesitnoćelijskog karcinoma pluća ili ćelija drugog solidnog ili hematološkog tumora kao što su nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom bubrežnih ćelija, rak mozga, rak želuca, kolorektalni karcinom, hepatocelularni karcinom, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese i žučnih puteva i rak jednjaka.

U nekim otelotvorenjima, TCR je konjugovan sa terapeutski aktivnim agensom. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „terapeutski aktivan agens“ znači da se jedinjenje koristi za lečenje ili prevenciju bolesti ili neželjenog zdravstvenog stanja. U jednom otelotvorenju terapeutski aktivan agens se koristi za lečenje ili prevenciju raka. U određenim otelotvorenjima, terapeutski aktivan agens je izabran iz grupe koju čine radionuklid, hemioterapijski agens i toksin.

TCR-ovi, nukleinske kiseline i ćelije domaćini predmetnog opisa, i njihove farmaceutske smeše, mogu da se daju ispitaniku kojem su potrebni putevima primene poznatim u stručnoj oblasti, i mogu se razlikovati u zavisnosti od vrste raka koji se tretira. Putevi primene obuhvataju, na primer, lokalnu primenu (kao što je intratumorska) i parenteralnu primenu kao što su potkožna, intraperitonealna, intramuskularna, intravenska, intraportalna i intrahepatična. U poželjnom otelotvorenju, TCR-ovi, nukleinske kiseline ili ćelije domaćini predmetnog opisa, ili njihove farmaceutske smeše, daju se ispitaniku putem lokalne infuzije, na primer, pomoću infuzione pumpe i/ili sistema katetera, u mesto koje treba da se tretira, kao što je solidni tumor. U jednom otelotvorenju, smeša predmetnog opisa se daje infuzijom u solidni tumor, krvni sud koji ishranjuje solidni tumor i/ili oblast koja okružuje solidni tumor.

U poželjnim otelotvorenjima, smeše predmetnog opisa se daju ispitaniku primenom režima doziranja u vidu najmanje dve primene u razmaku od najmanje 24 časa. Režimi doziranja koji su prikladni za primenu smeša predmetnog opisa uključuju, na primer, jednom dnevno, jednom na svaka dva dana i jednom na svaka tri dana. Poželjniji režimi doziranja uključuju jednom nedeljno, dva puta nedeljno, jednom svake druge nedelje, jednom mesečno i dva puta mesečno. U konkretnim otelotvorenjima, koristi se režim povećavanja doze, naznačen time što se ispitaniku daje serija povećanih doza tokom perioda koji čine dani, sedmice ili meseci.

Efektivne doze ćelija domaćina koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog pronalaska uključuju, na primer, najmanje oko 10<4>, najmanje oko 10<5>, najmanje oko 10<6>, najmanje oko 10<7>, najmanje oko 10<8>, najmanje oko 10<9>i najmanje oko 10<10>ćelija domaćina po dozi. U jednom otelotvorenju, ćelije domaćini predmetnog opisa se daju u dozi od između oko 10<4>do oko 10<10>ćelija po dozi, poželjno u dozi od između oko 10<5>do oko 10<9>ćelija po dozi. U poželjnim otelotvorenjima, doze se daju prema režimu doziranja tokom najmanje dva ili više ciklusa doziranja.

Predmetni opis se takođe odnosi na metod za lečenje raka koji se sastoji od davanja TCR-a, nukleinske kiseline, ili ćelije domaćina predmetnog opisa u kombinaciji sa najmanje jednim hemioterapijskim agensom i/ili zračnom terapijom.

Predstavljen je metod za lečenje raka kod ispitanika kojem je potrebna terapija, koji se sastoji od:

a) izolovanja ćelije iz navedenog ispitanika;

b) transformisanja ćelije sa najmanje jednim vektorom koji kodira TCR predmetnog opisa radi proizvodnje transformisane ćelije;

c) ekspandiranja transformisane ćelije kako bi se proizvelo mnoštvo transformisanih ćelija; i

d) davanja mnoštva transformisanih ćelija navedenom ispitaniku.

Predstavljen je metod za lečenje raka kod ispitanika kojem je potrebna terapija, koji se sastoji od:

a) izolovanja ćelije iz zdravog donora;

b) transformisanja ćelije sa vektorom koji kodira TCR predmetnog opisa radi proizvodnje transformisane ćelije;

c) ekspandiranja transformisane ćelije kako bi se proizvelo mnoštvo transformisanih ćelija; i

d) davanja mnoštva transformisanih ćelija navedenom ispitaniku.

Takođe je obezbeđen metod za detekciju raka u biološkom uzorku koji se sastoji od:

a) dovođenja u kontakt biološkog uzorka sa TCR-om predmetnog opisa; b) detekcije vezivanja TCR-a za biološki uzorak.

U nekim otelotvorenjima, metod za detekciju raka se obavlja in vitro, in vivo ili in situ.

Predmetni opis se dalje odnosi na konkretne markerske proteine i biomarkere zasnovane na peptidima u skladu sa predmetnim opisom, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze i/ili prognoze nesitnoćelijskog karcinoma pluća. Predmetni opis se takođe odnosi na upotrebu ovih novih ciljeva za lečenje raka.

Dalji je aspekt opisa da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja regione koji određuju komplementarnost. U svrhe odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US

4

2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191), ili domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. U drugom aspektu, on se eksprimira u T ćelijama korišćenim za adoptivni transfer. Vidite na primer patente WO 2004/033685A1, WO 2004/074322A1 i WO 2013/057586A1, čiji su sadržaji u celosti uključeni putem reference.

Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetnog opisa mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.

Antitela ili TCR-ovi se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Uopšteno, antitelo ili TCR se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore navedeni proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.

Antitela ili TCR-ovi za dijagnostičku primenu mogu biti obeleženi probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela i/ili TCR-ovi mogu biti direktno ili indirektno obeleženi navedenim probama. Vezivanje proba za antitela i/ili TCR-ove uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo ili TCR, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

Takođe su predstavljeni IGF2BP3-001 peptidi koji su sposobni da se vezuju za TCR-ove i antitela kada ih prezentuje MHC molekul.

Opis se dalje odnosi na upotrebu bilo kog ovde opisanog peptida, ovde opisanih nukleinskih kiselina, ovde opisanih vektora ekspresije, ovde opisanih ćelija, ovde opisanog aktiviranog T limfocita, T-ćelijskih receptora, antitela ili drugih molekula koji vezuju peptid i/ili peptid-MHC u skladu sa predmetnim opisom u vidu leka ili u proizvodnji leka. U jednom aspektu, lek je aktivan protiv raka.

Poželjno, navedeni lek je ćelijska terapija, TCR, rastvorljivi TCR ili antitelo.

Predmetni opis se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim opisom, naznačenu time što su ćelije raka nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom bubrežnih ćelija, rak mozga (npr. glioblastom, neuroblastom), rak želuca, kolorektalni karcinom, hepatocelularni karcinom, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese i žučnih puteva i rak jednjaka, a poželjno nesitnoćelijski karcinom pluća.

Predmetni opis se dalje odnosi na biomarkere zasnovane na peptidima u skladu sa predmetnim opisom, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze raka, poželjno nesitnoćelijskog karcinoma pluća. Marker može da bude prekomerna prezentacija samog(ih) peptida odnosno prekomerna ekspresija odgovarajućeg(ih) gena. Markeri se takođe mogu koristiti za predviđanje verovatnoće uspeha terapije, poželjno imunoterapije, te najpoželjnije imunoterapije čiji je cilj isti kao onaj koji se identifikuje biomarkerom. Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR može da se koristi za bojenje isečaka tumora radi detekcije prisustva peptida od interesovanja u kompleksu sa MHC. Opciono, antitelo ili rastvorljivi TCR nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

Predmetni opis se dalje odnosi na upotrebu ovih novih ciljeva za identifikaciju TCR-ova koji prepoznaju najmanje jedan od navedenih ciljeva, a poželjno identifikaciju navedenih TCR-ova koji aktiviraju T ćelije.

Predmetni opis se dalje odnosi na upotrebu ovih novih ciljeva u kontekstu lečenja raka.

Dalje je opisan peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čini ID BR. SEKV: 1 ili njenu varijantu, koja je najmanje 66%, poželjno najmanje 77%, a još poželjnije najmanje 88% homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1, naznačeno time što navedeni peptid ili njegova varijanta ima ukupnu dužinu između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, a najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.

PRIMERI

Alo-reaktivna okruženja mogu da se koriste kako bi se zaobišla samotolerancija i prinos T ćelija sa većim aviditetom kada se uporede sa T ćelijama dobijenim iz autolognih okruženja, tj. pacijenata. Primeri takvih okruženja uključuju in vitro stvaranje alo-HLA-reaktivnih, peptid-specifičnih T ćelija (Sadovnikova et al. 1998; Savage et al. 2004; Wilde et al.2012), i imunizaciju miševa koji su transgenski za humani MHC ili humani TCR (Stanislawski et al.2001; Li et al.2010).

Primer 1

In vitro stvaranje alo-HLA-reaktivnih, peptid-specifičnih T ćelija (Savage et al.2004) Korišćene su PBMC od HLA-A*02-pozitivnih i HLA-A*02-negativnih zdravih donora nakon pribavljanja informisanog pristanka. Rekombinantni biotinilirani monomeri HLA-A2 klase I i A2 fluorescentni tetrameri koji sadrže IGF2BP3-001 pribavljeni su od kompanije MBLI (Woburn, MA). PBMC su inkubirane sa anti-CD20SA razblaženim u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) 1 čas na sobnoj temperaturi, oprane i inkubirane sa biotiniliranim A2/IGF2BP3-001 monomerima tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, oprane i nanete u mikroploče sa 24 mesta u konc. 3x10<6>ćelija/mesto u

4

medijumu RPMI sa 10% humanim AB serumom. Prvog dana dodat je interleukin 7 (IL-7; R&D Systems, Minneapolis, MN) u konc.10 ng/ml a 4. dana dodat je IL-2 (Chiron, Harefield, Ujedinjeno Kraljevstvo) u konc.10 U/ml. Tokom perioda od 5 sedmica ćelije su restimulisane svake sedmice svežim PBMC, pomešane sa ćelijama responderima u odnosu 1:1 i nanete u mikroploče sa 24 mesta u konc.3x10<6>/mesto.

Da bi se dobile visoko aviditetne T ćelije, približno 10<6>PBMC sa HLA-A2/IGF2BP3-001 tetramer-fikoeritrinom (PE) (dobijene od kompanije MBLI) inkubirano je tokom 30 minuta na 37 °C, nakon čega je sledio anti–CD8-fluorescein izotiocijanat (FITC)/alofikocijanin (APC) tokom 20 minuta na 4 °C, nakon čega je sledila analiza sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)–Calibur. Sortiranje je izvršeno pomoću uređaja FACS-Vantage (Becton Dickinson, Cowley, Oxford, Ujedinjeno Kraljevstvo). Sortirane tetramer-pozitivne ćelije su ekspandirane u mikropločama sa 24 mesta primenom, po mestu, 2x10<5>sortiranih ćelija, 2x10<6>ozračenih A2-negativnih PBMC kao hraniocima, 2x10<4>CD3/CD28 perli/ml (Dynal, Oslo Norveška) i IL-2 (1000 U/ml). Tako dobijene visoko aviditetne T ćelije su zatim korišćene za identifikaciju i izolaciju TCR-ova primenom tehnika poznatih u stručnoj oblasti, kao što je 5’ RACE pojedinačne ćelije (Brza amplifikacija cDNK krajeva). Nesuvišne TCR DNK su zatim analizirane radi utvrđivanja aminokiselina/DNK sekvenci i kloniranja u vektore ekspresije primenom metoda dobro poznatih u predmetnoj oblasti.

Primer 2: Kloniranje TCR-ova

Metodi kloniranja TCR-ova su dobro poznati u predmetnoj oblasti, na primer, kako je opisano u patentu U.S.8,519,100, koji je ovde u celosti uključen putem reference za navedene metode. Za amplifikaciju varijabilnog regiona alfa lanca koriste se oligonukleotid A1 (ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc ID BR. SEKV: 22) koji je specifičan za sekvencu varijabilnog regiona alfa lanca, a koji kodira restrikciono mesto NdeI, uvedeni metionin za efikasnu inicijaciju ekspresije u bakterijama, i oligonukleotid A2 (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg ID BR. SEKV: 23) koji je specifičan za sekvencu konstantnog regiona alfa lanca i koji kodira restrikciono mesto SalI. U slučaju beta lanca, za amplifikaciju varijabilnog regiona beta lanca koriste se oligonukleotid B1 (tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa ID BR. SEKV: 24) koji je specifičan za sekvencu varijabilnog regiona beta lanca, a koji kodira restrikciono mesto NdeI, uvedeni metionin za efikasnu inicijaciju ekspresije u bakterijama, i oligonukleotid B2 (tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc ID BR. SEKV: 25) koji je specifičan za sekvencu konstantnog regiona beta lanca i koji kodira restrikciono mesto AgeI.

DNK sekvence koje kodiraju alfa lanac TCR-a isečen sa NdeI i SalI se ligiraju u vektor pGMT7+Cα koji je isečen sa NdeI i XhoI. DNK sekvence koje kodiraju beta lanac TCR-a isečen sa NdeI i AgeI su bile ligirane u zasebni vektor pGMT7+Cβ koji je takođe isečen sa NdeI i AgeI. Ligirani plazmidi su transformisani u kompetentne XL1 plave ćelije soja Escherichia coli i naneti u LB/agar ploče koje su sadržale 100 μg/ml ampicilina. Nakon inkubacije preko noći na 37 °C sakupljene su pojedinačne kolonije i uzgajane u 10 ml LB koji je sadržao 100 μg/ml ampicilina preko noći na 37 °C uz trešenje. Klonirani plazmidi su prečišćeni pomoću kompleta Miniprep (Qiagen) a umetak je sekvenciran pomoću automatizovanog DNK sekvencera (Lark Technologies).

TCR R10P1A7, koji kodiraju tumor-specifične TCR alfa i TCR beta lance su izolovani i amplifikovani iz T ćelija zdravih donora. Ćelije od zdravih donora su stimulisane in vitro prema metodu opisanom u radu Walter et. al. 2003. Ćelije specifične za cilj su sortirane po pojedinačnim ćelijama primenom ciljno-specifičnih multimera za naknadnu izolaciju TCR-a. TCR sekvence su izolovane pomoću 5’ RACE primenom standardnih metoda kako je opisano u npr. Laboratorijskom priručniku za molekularno kloniranje, četvrto izdanje autora Green i Sambrook. TCR R10P1A7 je izolovan od HLA-A2-negativnog donora. Sekvencirani su alfa i beta varijabilni regioni TCR-ova R20P1H7, R7P1D5 i R10P2G12.

Pronađeno je da R10P1A7 TCR alfa varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara ostacima 22-130 ID BR. SEKV: 2. Pronađeno je da R10P1A7 TCR beta varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara ostacima 26-139 ID BR. SEKV: 10.

Može da se koristi prikaz faga da bi se generisale biblioteke varijanti TCR-a kako bi se identifikovali mutanti visokog afiniteta. Prikaz TCR faga i metode za skrining opisane u radu (Li et al, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) mogu da se primene na referentni TCR izabran od TCR-ova opisanih u tabeli 1.

4

Na primer, sva tri CDR regiona sekvence alfa lanca ID BR. SEKV: 2 i sva tri CDR regiona sekvence beta lanca ID BR. SEKV: 10 mogu da se ciljaju mutagenezom, i svaka CDR biblioteka da se zasebno pomera i skrinira.

U skladu sa tim, mogu da se identifikuju TCR-ovi sa afinitetima i/ili poluživotima vezivanja koji su najmanje dva puta veći od istih referentnog TCR-a (te samim tim podrazumevano i najmanje dva puta veći od istih nativnog TCR-a).

Heterodimeri TCR-a su ponovo presavijeni primenom metoda koji uključuje uvedene cisteine u konstantnim regionima kako bi se obezbedila veštačka međulančana disulfidna veza. Na taj način se pripremaju TCR-ovi koji imaju (a) referentni TCR beta lanac, zajedno sa mutiranim alfa lancima; (b) referentni TCR alfa lanac, zajedno sa mutiranim beta lancima; i (c) razne kombinacije beta i alfa lanaca uključujući mutantne varijabilne domene.

Interakcija između visoko afinitetnih rastvorljivih TCR-ova sa disulfidnom vezom i varijanti TCR-a, i kompleksa nativni peptid KIQEILTQV (ID BR. SEKV: 1)-HLA može da se analizira pomoću metoda BIAcore.

Visoko afinitetne varijante TCR-a mogu takođe da se izaberu iz biblioteke CDR mutanata pomoću prikaza kvasnica ili T ćelije (Holler et al.2003; Chervin et al.2008). Kandidatske varijante TCR-a tako obezbeđuju smernice za dizajniranje mutacija CDR-ova TCR-a kako bi se dobile varijante TCR-a visokog aviditeta (Robbins et al.

2008; Zoete et al.2007).

Primer 3: Inženjering autologniih T ćelija

Inženjeringom se mogu stvoriti T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove visokog aviditeta (tzv. TCR terapije) ili himerne antigenske receptore dobijene fuzijom proteina (CAR-ovi) koje imaju povećanu antigensku specifičnost za kompleks MHC I/IGF2BP3-001 ili kompleks MHC II/IGF2BP3-001. U jednom aspektu, ovaj pristup prevazilazi neka od ograničenja povezanih sa centralnom i perifernom tolerancijom i stvara T ćelije koje će biti efikasnije u ciljanju tumora bez zahteva za de novo aktivacijom T ćelija kod pacijenta.

4

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju identifikovane i izolovane tumor-specifične TCR alfa i/ili TCR beta lance, kako su opisani u Primerima 1-2, se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigenska specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.

U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetisane su TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK su zatim uvedene u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR alfa i/ili TCR beta lanaca.

Da bi se testiralo da li su egzogeni TCR-ovi bili funkcionalno eksprimirani na površini ćelije transformisanih T ćelija, korišćena je tehnika bojenja tetramera za detekciju T ćelija koje vezuju MHC/IGF2BP3-001. Kako je prikazano na sl.5 i u tabeli 2, veći procenat CD3-pozitivne specifične T-ćelijske populacije, tj.6,78% je zabeležen kod CD8+ T ćelija koje eksprimiraju TCR pomoću bojenja fluorescentno obeleženih MHC/IGF2BP3-001 tetramera nego sa tetramerima MHC/nepovezan peptid (npr. NYESO1-001), npr. 1,53% ili lažnom kontrolom, npr. 1,73%. Kao kontrola, primarne CD8+ T ćelije transformisane pomoću kontrolnog TCR-a, 1G4 TCR, za koji je poznato da se specifično vezuje za kompleks MHC/NYESO1-001, lako su detektovane pomoću tetramera MHC/NYESO1-001, tj. 17,69%. Ovi rezultati ukazuju na to da se TCR R10P1A7 eksprimira na površini T ćelije i da može specifično da se vezuje za kompleks MHC/IGF2BP3-001. Alfa i beta lanci TCR 1G4 prikazani su u ID BR. SEKV: 20, odnosno ID BR. SEKV: 21:

1G4 alfa lanac (ID BR. SEKV: 20):

METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQ DPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPT SGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSK

4

DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC DVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

1G4 beta lanac (ID BR. SEKV: 21):

MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWY RQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFC ASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATG FYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQN PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVL SATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

Da bi se utvrdila specifičnost i afinitet TCR-ova, transformisane CD8+ T ćelije su koinkubirane sa ciljnim ćelijama u koje je ubačen IGF2BP3-001 ili sa ciljnim ćelijama u koje je ubačen homologni ali nepovezan peptid CLUA-001 (ID BR. SEKV: 26), CHCHD6-001 (ID BR. SEKV: 27), CDC42BPG-001 (ID BR. SEKV: 28), PARP14-002 (ID BR. SEKV: 29), SYNE2-001 (ID BR. SEKV: 30), IFT7-001 (ID BR. SEKV: 31), DHRS12-001 (ID BR. SEKV: 32), STX12-001 (ID BR. SEKV: 33), EEA-001 (ID BR. SEKV: 34), SENP7-001 (ID BR. SEKV: 35) ili kontrolni peptid NYESO1-001 (ID BR. SEKV: 36), nakon čega je sledio esej oslobađanja IFN-γ. Ciljne ćelije bez punjenja i same CD8+ T ćelije služile su kao kontrole. Sekrecija IFN-γ iz CD8+ T ćelija je indikativna za aktivaciju T ćelija sa citotoksičnom aktivnošću.

Tabela 2

Kako je prikazano na sl.6 primarne CD8+ T ćelije elektroporisane sa RNK koja kodira TCR R10P1A7 predmetne objave, nakon ko-inkubacije sa ciljnim ćelijama u koje je ubačen IGF2BP3-001, oslobađale su mnogo veće nivoe IFN-γ nego one koje su stimulisane ciljnim ćelijama u koje je ubačen kontrolni peptid i kontrole. Analiza titracije

4

ciljnog peptida pokazala je EC50 pri oko 1 nmol/l (tabela 2). Ovi rezultati ukazuju na to da TCR R10P1A7 predmetnog pronalaska može da aktivira citotoksičnu aktivnost T ćelija, npr. oslobađanje IFN-γ, preko specifične interakcije sa kompleksom MHC/IGF2BP3-001.

Da bi se utvrdio vezujući motiv TCR R10P1A7 za kompleks MHC/IGF2BP3-001, izvršena je analiza pozicionog skeniranja alanina na svakoj od 9 aminokiselina peptida IGF2BP3-001. IGF2BP3-001 peptidi sa supstitucijom alanina prikazani su u tabeli 3.

Tabela 3

Ukratko, CD8+ T ćelije transformisane sa TCR R10P1A7 su ko-inkubirane sa ciljnim ćelijama u koje je ubačen IGF2BP3-001, IGF2BP3-001-A1 do IGF2BP3-001-A9, ili kontrolni peptid NYESO1-001, nakon čega je urađen esej oslobađanja IFNγ kako je opisano ranije.

Rezultati analize pozicionog skeniranja alanina na TCR R10P1A7 prikazani su na sl.

7 i sažeto prikazani u tabeli 4.

4

Tabela 4

Skrining čitavog genoma na peptide koji vezuju A*02 za TCR R10P1A7 sa identičnim motivom nije otkrila nijedan potencijalno unakrsno-reagujući peptid. Ovi rezultati ukazuju na to da TCR opisan u ovom dokumentu iskazuje veoma specifičan obrazac prepoznavanja sa smanjenim rizikom od neciljnih efekata.

Da bi se utvrdila efikasnost T ćelija koje eksprimiraju ovde opisane TCR-ove, primarne CD8+ T ćelije elektroporisane sa RNK TCR R10P1A7 su bile ko-inkubirane sa različitim humanim tumorskim ćelijskim linijama, npr. A-375 (ćelijska linija humanog melanoma) i T98G (ćelijska linija humanog glioblastoma) koje su HLA-A2-pozitivne i IGF2BP3-001 (cilj)-pozitivne, te SK-BR-3 (ćelijska linija humanog raka dojke) koja je HLA-A2-negativna i IGF2BP3-001-negativna, nakon čega je sledio esej oslobađanja IFNγ.

Kako je prikazano na sl.8, oslobađanje IFNγ je zabeleženo i za A-375 ćelije i za T98G ćelije koje su HLA-A2-pozitivne i IGF2BP3-001-pozitivne, ali ne i za ćelije SK-BR-3 koje imaju osnovne nivoe oslobađanja IFNγ koji je uporediv sa nivoom kontrole samo sa efektorskom ćelijom. Ovi rezultati ukazuju na to da T ćelije koje eksprimiraju TCR R10P1A7 mogu specifično da indukuju citotoksičnu aktivnost ciljajući ćelije raka na HLA-A2/IGF2BP3-001-specifičan način.

Predmetni opis obezbeđuje TCR-ove koji su korisni u lečenju raka/tumora, poželjno melanoma i glioblastoma koji prekomerno ili isključivo prezentuju IGF2BP3-001.

Primer 5: Inženjering alogenih T ćelija

Gama delta (γδ) Τ ćelije koje su nekonvencionalni T limfocitni efektori koji su uključeni u prvu liniju odbrane protiv patogena mogu da interaguju sa i da unište tumorske ćelije na MHC-nezavisan način preko aktivacije receptora, između ostalih, TCR gama i TCR delta lanaca. Ove γδ Τ ćelije pokazuju unapred aktiviran fenotip koji omogućava brzu proizvodnju citokina (IFN-γ, TNF-α) i snažan citotoksični odgovor nakon aktivacije. Ove T ćelije imaju antitumorsku aktivnost protiv mnogih malignih tumora i ukazuju na to da je imunoterapija posredovana γδ Τ ćelijama izvodljiva i da može da indukuje objektivne tumorske odgovore. (Braza et al.2013).

Skorašnji pokušaji sa primenom imobilisanih antigena, agonističkih monoklonalnih antitela (mAt), veštačkih antigen-prezentujućih ćelija dobijenih iz tumora (aAPĆ) ili kombinacija aktiviranja mAt i aAPĆ bili su uspešni u proširivanju gama delta T ćelija sa oligoklonalnim ili poliklonalnim TCR repertoarima. Na primer, imobilisani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti klasa I lanac-povezani A je bio stimulus za γδ T ćelije koje eksprimiraju TCRδ1 izotipove, a aktivirajuća antitela vezana na pločicu su ekspandirala Vδ1 i Vδ2 ćelije ex vivo. Klinički dovoljne količine TCRδ1, TCRδ2 i TCRδ1<neg>T-CRδ2<neg>su proizvedene nakon ko-kultivisanja na aAPĆ, a ovi podskupovi su pokazali razlike u fenotipu memorije i reaktivnosti na tumore in vitro i in vivo. (Deniger et al.

2014).

Pored toga, γδ T ćelije su podložne genetskoj modifikaciji što se može videti uvođenjem TCR alfa i TCR beta lanaca. (Hiasa et al.2009). Drugi aspekt predmetnog opisa odnosi se na proizvodnju γδ T ćelija koje eksprimiraju TCR alfa i TCR beta koji se vezuju za IGF2BP3-001. Da bi se to učinilo, γδ T ćelije se ekspandiraju pomoću metoda opisanih od strane Deniger et al. 2014, nakon čega sledi transdukcija rekombinantnih virusa koji eksprimiraju TCR-ove koji se vezuju za IGF2BP3-001 (kako je opisano u primeru 3) u ekspandirane γδ T ćelije. γδ T ćelije u koje je transdukovan virus se zatim daju infuzijom pacijentu.

Primer 6: Lentivirusni konstrukti i analiza ekspresije

Ukratko, napravljena su dva testna konstrukta („R10“). Ovi konstrukti su zatim korišćeni za proizvodnju lentivirusnih supernatanata sa dobrim titrom i dobrom produktivnošću. Lentivirusni supernatanti su zatim korišćeni za transdukciju primarnih T ćelija (2 donora) sa naknadnom površinskom ekspresijom TCR-a zasnovanoj na vezivanju tetramera pomoću protočne citometrije.

Tabela 5A: Lentivirusni konstrukti i kontrole – dotični donori kako su testirani (linije tabela odgovaraju konstruktima

1

Lista referenci

Adair SJ, Hogan KT (2009). Treatment of ovarian cancer cell lines with 5-aza-2'-deoxycytidine upregulates the expression of cancer-testis antigens and class I major histocompatibility complex-encoded molecules. Cancer Immunol. Immunother.58, 589-601.

Alves PM, Levy N, Bouzourene H, Viatte S, Bricard G, Ayyoub M, Vuilleumier H, Givel JC, Halkic N, Speiser DE, Romero P, Levy F (2007). Molecular and immunological evaluation of the expression of cancer/testis gene products in human colorectal cancer. Cancer Immunol. Immunother.56, 839-847.

2

Andrade VC, Vettore AL, Felix RS, Almeida MS, Carvalho F, Oliveira JS, Chauffaille ML, Andriolo A, Caballero OL, Zago MA, Colleoni GW (2008). Prognostic impact of cancer/testis antigen expression in advanced stage multiple myeloma patients. Cancer Immun.8, 2.

Barrow C, Browning J, MacGregor D, Davis ID, Sturrock S, Jungbluth AA, Cebon J (2006). Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage. Clin Cancer Res 12, 764-771.

Bellati F, Napoletano C, Tarquini E, Palaia I, Landi R, Manci N, Spagnoli G, Rughetti A, Panici PB, Nuti M (2007). Cancer testis antigen expression in primary and recurrent vulvar cancer: association with prognostic factors. Eur. J Cancer 43, 2621-2627.

Bergeron A, Picard V, LaRue H, Harel F, Hovington H, Lacombe L, Fradet Y (2009).

Bode PK, Thielken A, Brandt S, Barghorn A, Lohe B, Knuth A, Moch H (2014). Cancer testis antigen expression in testicular germ cell tumorigenesis. Mod. Pathol.27, 899-905.

Chitale DA, Jungbluth AA, Marshall DS, Leitao MM, Hedvat CV, Kolb D, Spagnoli GC, Iversen K, Soslow RA (2005). Expression of cancer-testis antigens in endometrial carcinomas using a tissue microarray. Mod. Pathol.18, 119-126.

Coral S, Parisi G, Nicolay HJ, Colizzi F, Danielli R, Fratta E, Covre A, Taverna P, Sigalotti L, Maio M (2013). Immunomodulatory activity of SGI-110, a 5-aza-2'-deoxycytidine-containing demethylating dinucleotide. Cancer Immunol. Immunother.

62, 605-614.

Cuffel C, Rivals JP, Zaugg Y, Salvi S, Seelentag W, Speiser DE, Lienard D, Monnier P, Romero P, Bron L, Rimoldi D (2011). Pattern and clinical significance of cancertestis gene expression in head and neck squamous cell carcinoma. Int. J Cancer 128, 2625-2634.

Forghanifard MM, Gholamin M, Farshchian M, Moaven O, Memar B, Forghani MN, Dadkhah E, Naseh H, Moghbeli M, Raeisossadati R, Abbaszadegan MR (2011). Cancer-testis gene expression profiling in esophageal squamous cell carcinoma: identification of specific tumor marker and potential targets for immunotherapy. Cancer Biol Ther.12, 191-197.

Gerdemann U, Katari U, Christin AS, Cruz CR, Tripic T, Rousseau A, Gottschalk SM, Savoldo B, Vera JF, Heslop HE, Brenner MK, Bollard CM, Rooney CM, Leen AM (2011). Cytotoxic T lymphocytes simultaneously targeting multiple tumor-associated antigens to treat EBV negative lymphoma. Mol. Ther.19, 2258-2268.

Gunda V, Cogdill AP, Bernasconi MJ, Wargo JA, Parangi S (2013). Potential role of 5-aza-2'-deoxycytidine induced MAGE-A4 expression in immunotherapy for anaplastic thyroid cancer. Surgery 154, 1456-1462.

Gure AO, Chua R, Williamson B, Gonen M, Ferrera CA, Gnjatic S, Ritter G, Simpson AJ, Chen YT, Old LJ, Altorki NK (2005). Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 11, 8055-8062.

Hoffmann NE, Sheinin Y, Lohse CM, Parker AS, Leibovich BC, Jiang Z, Kwon ED (2008). External validation of IMP3 expression as an independent prognostic marker for metastatic progression and death for patients with clear cell renal cell carcinoma. Cancer 112, 1471-1479.

Jacobs JF, Grauer OM, Brasseur F, Hoogerbrugge PM, Wesseling P, Gidding CE, van de Rakt MW, Figdor CG, Coulie PG, de Vries IJ, Adema GJ (2008). Selective cancer-germline gene expression in pediatric brain tumors. J Neurooncol. 88, 273-280.

Kang J, Lee HJ, Kim J, Lee JJ, Maeng LS (2015). Dysregulation of X chromosome inactivation in high grade ovarian serous adenocarcinoma. PLoS. ONE.10, e0118927.

Kim K, Cho YM, Park BH, Lee JL, Ro JY, Go H, Shim JW (2015). Histological and immunohistochemical markers for progression prediction in transurethrally resected high-grade non-muscle invasive bladder cancer. Int. J Clin Exp. Pathol. 8, 743-750.

Kubuschok B, Xie X, Jesnowski R, Preuss KD, Romeike BF, Neumann F, Regitz E, Pistorius G, Schilling M, Scheunemann P, Izbicki JR, Lohr JM, Pfreundschuh M (2004). Expression of cancer testis antigens in pancreatic carcinoma cell lines, pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis. Int. J Cancer 109, 568-575.

Li M, Yuan YH, Han Y, Liu YX, Yan L, Wang Y, Gu J (2005). Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue. Clin Cancer Res 11, 1809-1814.

Lifantseva N, Koltsova A, Krylova T, Yakovleva T, Poljanskaya G, Gordeeva O (2011). Expression patterns of cancer-testis antigens in human embryonic stem cells and their cell derivatives indicate lineage tracks. Stem Cells Int.2011, 795239.

Luftl M, Schuler G, Jungbluth AA (2004). Melanoma or not? Cancer testis antigens may help. Br. J Dermatol.151, 1213-1218.

Mischo A, Kubuschok B, Ertan K, Preuss KD, Romeike B, Regitz E, Schormann C, de BD, Wadle A, Neumann F, Schmidt W, Renner C, Pfreundschuh M (2006). Prospective study on the expression of cancer testis genes and antibody responses in 100 consecutive patients with primary breast cancer. Int. J Cancer 118, 696-703.

Mitchell RT, Camacho-Moll E, MacDonald J, Anderson RA, Kelnar CJ, O'Donnell M, Sharpe RM, Smith LB, Grigor KM, Wallace WH, Stoop H, Wolffenbuttel KP, Donat R, Saunders PT, Looijenga LH (2014). Intratubular germ cell neoplasia of the human testis: heterogeneous protein expression and relation to invasive potential. Mod. Pathol. 27, 1255-1266.

Mizukami Y, Kono K, Daigo Y, Takano A, Tsunoda T, Kawaguchi Y, Nakamura Y, Fujii H (2008). Detection of novel cancer-testis antigen-specific T-cell responses in TIL, regional lymph nodes, and PBL in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Sci.

Nishikawa H, Maeda Y, Ishida T, Gnjatic S, Sato E, Mori F, Sugiyama D, Ito A, Fukumori Y, Utsunomiya A, Inagaki H, Old LJ, Ueda R, Sakaguchi S (2012). Can-

4

cer/testis antigens are novel targets of immunotherapy for adult T-cell leukemia/lymphoma. Blood 119, 3097-3104.

Oba-Shinjo SM, Caballero OL, Jungbluth AA, Rosemberg S, Old LJ, Simpson AJ, Marie SK (2008). Cancer-testis (CT) antigen expression in medulloblastoma. Cancer Immun. 8, 7.

Peikert T, Specks U, Farver C, Erzurum SC, Comhair SA (2006). Melanoma antigen A4 is expressed in non-small cell lung cancers and promotes apoptosis. Cancer Res 66, 4693-4700.

Peng JR, Chen HS, Mou DC, Cao J, Cong X, Qin LL, Wei L, Leng XS, Wang Y, Chen WF (2005). Expression of cancer/testis (CT) antigens in Chinese hepatocellular carcinoma and its correlation with clinical parameters. Cancer Lett.219, 223-232.

Perez D, Herrmann T, Jungbluth AA, Samartzis P, Spagnoli G, Demartines N, Clavien PA, Marino S, Seifert B, Jaeger D (2008). Cancer testis antigen expression in gastrointestinal stromal tumors: new markers for early recurrence. Int. J Cancer 123, 1551-1555.

Prasad ML, Jungbluth AA, Patel SG, Iversen K, Hoshaw-Woodard S, Busam KJ (2004). Expression and significance of cancer testis antigens in primary mucosal melanoma of the head and neck. Head Neck 26, 1053-1057.

Pryor JG, Bourne PA, Yang Q, Spaulding BO, Scott GA, Xu H (2008). IMP-3 is a novel progression marker in malignant melanoma. Mod. Pathol.21, 431-437.

Rammensee HG, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50, 213-219.

Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. (Heidelberg, Germany: Springer-Verlag).

Resnick MB, Sabo E, Kondratev S, Kerner H, Spagnoli GC, Yakirevich E (2002). Cancer-testis antigen expression in uterine malignancies with an emphasis on carcinosarcomas and papillary serous carcinomas. Int. J Cancer 101, 190-195.

Sarcevic B, Spagnoli GC, Terracciano L, Schultz-Thater E, Heberer M, Gamulin M, Krajina Z, Oresic T, Separovic R, Juretic A (2003). Expression of cancer/testis tumor associated antigens in cervical squamous cell carcinoma. Oncology 64, 443-449.

Schirmer U, Fiegl H, Pfeifer M, Zeimet AG, Muller-Holzner E, Bode PK, Tischler V, Altevogt P (2013). Epigenetic regulation of L1CAM in endometrial carcinoma: comparison to cancer-testis (CT-X) antigens. BMC. Cancer 13, 156.

Shafer JA, Cruz CR, Leen AM, Ku S, Lu A, Rousseau A, Heslop HE, Rooney CM, Bollard CM, Foster AE (2010). Antigen-specific cytotoxic T lymphocytes can target chemoresistant side-population tumor cells in Hodgkin lymphoma. Leuk. Lymphoma 51, 870-880.

Sharma P, Shen Y, Wen S, Bajorin DF, Reuter VE, Old LJ, Jungbluth AA (2006). Cancer-testis antigens: expression and correlation with survival in human urothelial carcinoma. Clin Cancer Res 12, 5442-5447.

Shigematsu Y, Hanagiri T, Shiota H, Kuroda K, Baba T, Mizukami M, So T, Ichiki Y, Yasuda M, So T, Takenoyama M, Yasumoto K (2010). Clinical significance of cancer/testis antigens expression in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer 68, 105-110.

Shirakura Y, Mizuno Y, Wang L, Imai N, Amaike C, Sato E, Ito M, Nukaya I, Mineno J, Takesako K, Ikeda H, Shiku H (2012). T-cell receptor gene therapy targeting melanoma-associated antigen-A4 inhibits human tumor growth in non-obese diabetic/SCID/gammacnull mice. Cancer Sci.103, 17-25.

Soga N, Hori Y, Yamakado K, Ikeda H, Imai N, Kageyama S, Nakase K, Yuta A, Hayashi N, Shiku H, Sugimura Y (2013). Limited expression of cancer-testis antigens in renal cell carcinoma patients. Mol. Clin Oncol 1, 326-330.

Su C, Xu Y, Li X, Ren S, Zhao C, Hou L, Ye Z, Zhou C (2015). Predictive and prognostic effect of CD133 and cancer-testis antigens in stage Ib-IIIA non-small cell lung cancer. Int. J Clin Exp. Pathol.8, 5509-5518.

Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Bühring HJ, Rammensee HG, Stevanović S. (2003). Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol.171(10), 4974-8

Wang M, Li J, Wang L, Chen X, Zhang Z, Yue D, Ping Y, Shi X, Huang L, Zhang T, Yang L, Zhao Y, Ma X, Li D, Fan Z, Zhao L, Tang Z, Zhai W, Zhang B, Zhang Y (2015). Combined cancer testis antigens enhanced prediction accuracy for prognosis of patients with hepatocellular carcinoma. Int. J Clin Exp. Pathol.8, 3513-3528.

Yamada R, Takahashi A, Torigoe T, Morita R, Tamura Y, Tsukahara T, Kanaseki T, Kubo T, Watarai K, Kondo T, Hirohashi Y, Sato N (2013). Preferential expression of cancer/testis genes in cancer stem-like cells: proposal of a novel sub-category, cancer/testis/stem gene. Tissue Antigens 81, 428-434.

Yantiss RK, Cosar E, Fischer AH (2008). Use of IMP3 in identification of carcinoma in fine needle aspiration biopsies of pancreas. Acta Cytol.52, 133-138.

1

2

4

1

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. TCR koji se sastoji od alfa lanca i beta lanca, naznačen time što alfa lanac sadrži TCR alfa varijabilni domen koji sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 2, a beta lanac sadrži TCR beta varijabilni domen koji sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 10; i naznačen time što se TCR specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-MHC molekul naznačen time što peptid IGF2BP3-001 sadrži ID BR. SEKV: 1 i naznačen time što se TCR vezuje za položaje 1 i 3 do 7 dotičnog peptida IGF2BP3-001.

2. TCR iz patentnog zahteva 1, naznačen time što alfa lanac sadrži TCR alfa varijabilni domen koji je najmanje 90% identičan sa TCR alfa varijabilnim domenom ID BR. SEKV: 2 i naznačen time što TCR alfa lanac sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 2, a beta lanac sadrži TCR beta varijabilni domen koji je najmanje 90% identičan sa TCR beta varijabilnim domenom ID BR. SEKV: 10 i naznačen time što TCR beta lanac sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 10.

3. TCR iz patentnog zahteva 1 ili 2, koji dalje sadrži TCR alfa konstantni domen i TCR beta konstantni domen, naznačen time što je TCR alfa konstantni domen najmanje 70% identičan sa TCR alfa konstantnim domenom ID BR. SEKV: 2, a beta konstantni domen je najmanje 70% identičan sa TCR beta konstantnim domenom ID BR. SEKV: 10.

4. TCR iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što alfa konstantni domen sadrži alfa transmembranski domen VIGFRILLLKVAGFNLLMTL (ID BR. SEKV: 18) a beta konstantni domen sadrži beta transmembranski domen TILYEILLGKATLYAVLVSALVL (ID BR. SEKV: 19).

5. TCR iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što su alfa lanac i beta lanac spojeni da obrazuju jednolančani TCR.

6. TCR iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što alfa lanac i/ili beta lanac sadrže detektabilnu oznaku.

2

7. TCR iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što su alfa lanac i/ili beta lanac konjugovani sa terapeutski aktivnim agensom.

8. TCR koji se sastoji od gama lanca i delta lanca, naznačen time što gama lanac sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 2, a delta lanac TCR-a sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 ID BR. SEKV: 10; i naznačen time što se TCR specifično vezuje za kompleks IGF2BP3-001 peptid-MHC molekul naznačen time što peptid IGF2BP3-001 sadrži ID BR. SEKV: 1 i naznačen time što se TCR vezuje za položaje 1 i 3 do 7 dotičnog peptida IGF2BP3-001.

9. Nukleinska kiselina ili nukleinske kiseline koje kodiraju alfa lanac i beta lanac TCR-a iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 7, ili gama lanac i delta lanac TCR-a iz patentnog zahteva 8.

10. Vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 9 operabilno povezanu sa najmanje jednom promoterskom sekvencom.

11. Ćelija domaćin transformisana vektorom ekspresije iz patentnog zahteva 10.

12. Ćelija domaćin iz patentnog zahteva 11 koja je T ćelija ili progenitorska T ćelija.

13. Farmaceutska smeša koja sadrži TCR iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 8, nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 9, vektor ekspresije iz patentnog zahteva 10, i/ili ćeliju domaćina iz patentnih zahteva 11 ili 12; i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

14. TCR u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 8, ili nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 9, ili vektor u skladu sa patentnim zahtevom 10, ili ćelija domaćin u skladu sa patentnim zahtevom 11 ili 12, ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 13, za upotrebu u vidu leka.

15. TCR u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 8, ili nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 9, ili vektor u skladu sa patentnim zahtevom 10, ili ćelija domaćin u skladu sa patentnim zahtevom 11 ili 12, ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 13, za upotrebu u dijagnostikovanju, prevenciji i/ili lečenju raka.

16. Metod za proizvodnju TCR-a koji se specifično vezuje za peptid sa ID BR. SEKV:

1 kada ga prezentuje MHC molekul, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina iz patentnog zahteva 11 ili 12 pod uslovima koji su prikladni za promovisanje ekspresije TCR-a.

17. Metod za detekciju raka u biološkom uzorku koji se sastoji od:

a) dovođenja u kontakt biološkog uzorka sa TCR-om iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 8, i

b) detekcije vezivanja TCR-a za biološki uzorak.

4