[go: up one dir, main page]

RS63625B1 - Kombinacije irnk koje kodiraju imunomodulirajuće polipeptide i njihova upotreba - Google Patents

Kombinacije irnk koje kodiraju imunomodulirajuće polipeptide i njihova upotreba

Info

Publication number
RS63625B1
RS63625B1 RS20220929A RSP20220929A RS63625B1 RS 63625 B1 RS63625 B1 RS 63625B1 RS 20220929 A RS20220929 A RS 20220929A RS P20220929 A RSP20220929 A RS P20220929A RS 63625 B1 RS63625 B1 RS 63625B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polypeptide
mrna
polynucleotide
combination
encoding
Prior art date
Application number
RS20220929A
Other languages
English (en)
Inventor
Joshua Frederick
Susannah Hewitt
Ailin Bai
Stephen Hoge
Vladimir Presnyak
Lain Mcfadyen
Kerry Benenato
Ellalahewage Sathyajith Kumarasinghe
Original Assignee
Modernatx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Modernatx Inc filed Critical Modernatx Inc
Publication of RS63625B1 publication Critical patent/RS63625B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2006—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5446—IL-16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)

Description

Opis
SRODNE PRIJAVE
[0001] Ova prijava zahteva prvenstvo prema S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/338,496 koja je podneta 18. maja 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/338,506 koja je podneta 18. maja 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/338,467 koja je podneta 18. maja 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/338,483 koja je podneta 18. maja 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/404,173 koja je podneta 4. oktobra 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/404,175 koja je podneta 4. oktobra 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/415,424 koja je podneta 31. oktobra 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.
62/438,945 koja je podneta 23. decembra 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br. 62/438,942 koja je podneta 23. decembra 2016; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br. 62/443,693 koja je podneta 7. januara 2017; S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br. 62/472,513 koja je podneta 16. marta 2017 i S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi serijski br.62/480,400 koja je podneta 1. aprila 2017.
POZADINA
[0002] Kancer je bolest koju karakteriše nekontrolisana deoba i rast ćelija unutar tela. U Sjedinjenim Državama, otprilike trećina svih žena i polovina svih muškaraca doživeće kancer tokom svog života. Uz mnoštvo neželjenih posledica koje izazivaju standardni tretmani kao što su hemioterapija i radioterapija koji se danas upotrebljavaju, genetička terapija za manipulaciju peptidima povezanim sa bolestima i njihovim funkcijama obezbeđuje ciljaniji pristup dijagnozi, lečenju i upravljanju bolešću.
[0003] Wang, T., et al., Journal of Dermatological Science, 36 (2004), raspravlja o sinergističkom antitumorskom efektu kombinovane terapije genskim pištoljem upotrebom IL-23 i IL-18 cDNA. Hara, I., et al., Cancer Gene Therapy, 7(1) (2000), se tiče terapije vakcinom protiv kancera upotrebom ćelija transdukovanih sa interleukin-12 genom u kombinaciji sa sistemskom primenom interleukina-18. Ngiow, S., et al., Trends in Immunology, 34(11) (2013), istražuje aktivnost IL-23 u kancerogenezi i raspravlja o upotrebi anti-IL-12p/23 monoklonalnih antitela u kontekstu tumor-inhibitornih efekata IL-12, i tumor-promovišućih efekata IL-23. Overwijk, W., et al., Journal of Immunology, 176(9) (2006), se tiče imunoloških i antitumorskih efekata IL-23 kao adjuvansa za vakcinu protiv kancera. Wang, X., et al., Cancer Cell, 28 (2015), se tiče IL-36γ koji transformiše mikrookruženje tumora i promoviše antitumorske imunske odgovore posredovane limfocitima tipa 1. Melero, I., et al., Nature Reviews Cancer, 15 (2015), pregledno prikazuje sinergističke kombinacije ciljanih imunoterapija koje se razvijaju za borbu protiv kancera.
[0004] Međutim, genska terapija postavlja višestruke izazove uključujući nepoželjan imunski odgovor i zabrinutost za bezbednost usled inkorporacije gena na nasumične lokacije unutar genoma. Prema tome, postoji potreba za poboljšanim terapijskim pristupom za lečenje tumora. Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
SAŽETAK
[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje iRNK koja kodira IL-23 polipeptid za upotrebu u postupku lečenja kancera, pri čemu je lečenje u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid za upotrebu u postupku lečenja kancera, pri čemu je lečenje u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i kombinaciju iRNK, pri čemu prva iRNK kodira IL-23 polipeptid i druga iRNK kodira IL-36-gama polipeptid. Dodatni aspekti pronalaska definisani su u patentnim zahtevima.
[0006] Predmetna objava se odnosi na oblast iRNK terapeutika za lečenje kancera. iRNK terapeutici iz objave su posebno pogodni za lečenje kancera pošto tehnologija obezbeđuje unutarćelijsku isporuku iRNK koja kodira imunomodulirajuće polipeptide (na primer, polipeptide povezane sa onkologijom, uključujući stimulatore imunskog odgovora, kostimulatorne faktore, inhibitore kontrolne tačke, i slično, koji su korisni u imuno-onkologiji ("IO")), nakon čega sledi de novo sinteza funkcionalnih proteina unutar ciljnih ćelija, npr. unutar ciljnih ćelija u tumorima. Objava predstavlja terapijske iRNK koje imaju modifikovane nukleotide da (1) minimalizuju neželjenu imunsku aktivaciju (npr. urođeni imunski odgovor povezan sa in vivo introdukovanjem stranih nukleinskih kiselina) i (2) optimizuju efikasnost translacije iRNK u protein. Primeri aspekata objave predstavljaju terapijske iRNK koje imaju kombinaciju nukleotidnih modifikacija kako bi redukovale urođeni imunski odgovor i optimizaciju sekvence, posebno, unutar otvorenog okvira čitanja (ORF) terapijskih iRNK koje kodiraju imunomodulirajuće polipeptide za poboljšanje ekspresije proteina.
[0007] U drugim aspektima, terapijska tehnologija iRNK iz objave predstavlja isporuku iRNK koje kodiraju imunomodulirajuće (npr. povezane sa onkologijom) polipeptide putem sistema za isporuku lipidnih nanočestica (LNP). U primerima aspekata, terapijska tehnologija iRNK iz objave predstavlja isporuku iRNK koje kodiraju imunomodulirajuće polipeptide u tumore putem sistema za isporuku lipidnih nanočestica (LNP). Objava takođe predstavlja nove LNP zasnovane na lipidu koji se može jonizovati koje imaju poboljšana svojstva kada se kombinuju sa iRNK koje kodiraju imunomodulirajuće (npr. povezane sa onkologijom) polipeptide i koji se primenjuju in vivo, na primer, ćelijskim preuzimanjem, unutarćelijskim transportom i/ili oslobađanjem iz endozoma ili begom iz endozoma. LNP formulacije iz objave takođe demonstriraju redukovanu imunogenost asociranu sa in vivo primenom LNP.
[0008] U skladu sa tim, predmetna objava predstavlja postupke i kompozicije za lečenje kancera, posebno imunoterapijske postupke i kompozicije. U nekim aspektima, objava predstavlja postupke i kompozicije za lečenje kancera upotrebom kombinovane terapije koja predstavlja dva ili više imunomodulirajućih (npr. povezanih sa onkologijom) polinukleotida (npr. iRNK) koji kodiraju prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora i drugi, različit, polipeptid prajmer imunskog odgovora, i, opciono, polinukleotid koji kodira polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora i, opciono, polinukleotid koji kodira polipeptid inhibitor kontrolne tačke ili polipeptid koji sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke. U nekim aspektima, objava obezbeđuje imunomodulatornu kompoziciju koja sadrži polinukleotid koji kodira interleukin-23 (IL-23) polipeptid, polinukleotid koji kodira interleukin-36 gama (IL-36 gama) polipeptid i, opciono, polinukleotid koji kodira OX40L polipeptid. U drugim aspektima, objava obezbeđuje imunomodulatornu kompoziciju koja sadrži polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji kodira interleukin 18 (IL-18) polipeptid i, opciono, polinukleotid koji kodira OX40L polipeptid.
[0009] Drugi aspekti objave predstavljaju lečenje sa polinukleotidom iRNK koja kodira IL-23 polipeptid u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-36 polipeptid. Drugi aspekti objave predstavljaju lečenje sa iRNK koja kodira IL-23 polipeptid u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-18 polipeptid. Još drugi aspekti objave predstavljaju lečenje sa iRNK koja kodira polipeptide prajmere imunskog odgovora u kombinaciji sa dodatnim terapijskim agensima, kao što je polipeptid inhibitor kontrolne tačke (npr. anti-PD-1 antitelo, anti-PDL-1 antitelo, anti-CTLA4, ili njihova kombinacija). Primeri aspekata predstavljaju lečenje sa iRNK inkapsuliranim u lipidnim nanočesticama (LNP). Primeri aspekata predstavljaju intratumorsku primenu iRNK u LNP zasnovanim na amino lipidu koji se može jonizovati.
[0010] U nekim aspektima, predmetna objava obezbeđuje postupke redukovanja ili smanjenja veličine tumora ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno primenom najmanje dva polinukleotida, pri čemu su najmanje dva polinukleotida odabrana od prvog polinukleotida koji kodira prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora (npr. IL-23 polipeptid) i drugog polinukleotida koji kodira drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora (različit od prvog), npr. IL-36 gama polipeptid ili IL-18 polipeptid i, opciono, trećeg polinukleotida koji kodira polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora (npr. OX40L polipeptid).
[0011] U jednom aspektu, prvi polinukleotid sadrži iRNK koja kodira prvi polipeptid, drugi polinukleotid sadrži iRNK koja kodira drugi polipeptid, i/ili treći polinukleotid sadrži iRNK koja kodira treći polipeptid. U jednom aspektu, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i/ili treći polinukleotid sadrže najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid. U nekim aspektima, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid je odabran iz grupe koja se sastoji od pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitozina, 5-metoksiuridina, i njihove kombinacije.
[0012] U jednom aspektu, objava obezbeđuje kompoziciju, npr. imunomodulatornu kompoziciju, koja sadrži najmanje dva polinukleotida (npr. najmanje dve iRNK), pri čemu su najmanje dva polinukleotida odabrana iz grupe koja se sastoji od:
(i) najmanje jednog polinukleotida koji kodira prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora i najmanje jednog polinukleotida koji kodira drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora (različit od prvog polipeptida prajmera imunskog odgovora) ("dublet");
(ii) najmanje jednog polinukleotida koji kodira prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora, najmanje jednog polinukleotida koji kodira drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora (različit od prvog), i najmanje jednog polinukleotida koji kodira polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora ("triplet").
[0013] U nekim aspektima, kompozicija dodatno sadrži najmanje jedan polinukleotid koji kodira polipeptid inhibitor kontrolne tačke. U nekim aspektima, kompozicija se primenjuje subjektima kojima je to potrebno u kombinaciji sa drugom kancerskom terapijom, kao što je polipeptid koji sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke (npr. anti-PD-1 antitelo, anti-PDL-1 antitelo, anti-CTLA4 antitelo, ili njihova kombinacija).
[0014] U jednom aspektu, kompozicija sadrži najmanje jedan polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora i najmanje jedan polinukleotid (npr.
iRNK) koji kodira drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora (različit od prvog polipeptida prajmera imunskog odgovora), pri čemu prvi i drugi polipeptidi prajmeri imunskog odgovora imaju jednu ili više aktivnosti odabranih iz grupe koja se sastoji od:
(a) prajmovanja dendritskih ćelija;
(b) promovisanja maturacije dendritskih ćelija;
(c) promovisanja proizvodnje citokina i/ili hemokina u antigen prezentujućim ćelijama; (d) umnožavanja ili održavanja Th17 ćelija;
(e) poboljšanja diferencijacije Th1 i/ili Th9; i
(f) bilo koju kombinaciju (a)-(f).
[0015] U jednom aspektu, polipeptid prajmer imunskog odgovora je član porodice IL-12. U jednom aspektu, član porodice IL-12 je polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od IL-12, IL-23, IL-12p40 podjedinice, IL-23p19 podjedinice, IL-27, IL-35, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-23. U jednom aspektu, IL-23 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 140. U jednom aspektu, IL-23 polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 141 ili 142.
[0016] U drugim aspektima, polipeptid prajmer imunskog odgovora je član porodice IL-1. U jednom aspektu, član porodice IL-1 je polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od IL-1α, IL-1β, IL-IRa, IL-18, IL-33, IL-36Ra, IL-36α, IL-36β, IL-36γ, IL-37, IL-38, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid. U jednom aspektu, polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-36-gama polipeptid. U jednom aspektu, IL-36-gama polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 16. U jednom aspektu, IL-36-gama polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 143 ili 144. U jednom aspektu, polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-18. U jednom aspektu, IL-18 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 147, 149, 151 ili 153. U jednom aspektu, IL-18 polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 148 i 155-162.
[0017] U jednom aspektu objava obezbeđuje kompoziciju (npr. imunomodulatornu kompoziciju) koja sadrži najmanje dva polinukleotida (npr. dve iRNK) koji kodiraju prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora i drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora, pri čemu je prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora član porodice IL-12 i drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora je član porodice IL-1. U jednom aspektu, prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-23 polipeptid i drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-36-gama polipeptid. U jednom aspektu, prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-23 polipeptid i drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-18 polipeptid.
[0018] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje kompoziciju (npr. imunomodulatornu kompoziciju) koja sadrži najmanje tri polinukleotida (npr. tri iRNK) koji kodiraju najmanje jedan polinukleotid koji kodira prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora, najmanje jedan polinukleotid koji kodira drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora (različit od prvog), i najmanje jedan polinukleotid koji kodira polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora. U nekim aspektima, polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora ima najmanje jednu aktivnost odabranu iz grupe koja se sastoji od:
(a) aktiviranja, stimulisanja, promovisanja ili poboljšanja proliferacije T ćelija, preživljavanja T ćelija, regrutovanja T ćelija, ili njihove kombinacije; i/ili
(b) aktiviranja, stimulisanja, promovisanja ili poboljšanja proliferacije NK ćelija, preživljavanja NK ćelija, regrutovanja NK ćelija, ili njihove kombinacije.
[0019] U nekim aspektima, polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora ima najmanje jednu aktivnost odabranu iz grupe koja se sastoji od:
(c) promovisanja ili poboljšanja ekspanzije i/ili funkcije T ćelija;
(d) promovisanja ili poboljšanja razvoja Th1, Th2 i/ili Th9 ćelija;
(e) inhibiranja ili suprimiranja razvoja i/ili aktivnosti Treg;
(f) promovisanja ili poboljšanja razvoja i/ili aktivnosti memorijskih ćelija; i
(g) bilo koju kombinaciju (c)-(f).
[0020] U jednom aspektu, polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora je odabran iz grupe koja se sastoji od OX40L, CD80, IL-15, i njihovih kombinacija. U jednom aspektu, polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora je odabran iz grupe koja se sastoji od OX40L, CD80, IL-15, i njihovih kombinacija. U jednom aspektu, polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora je OX40L. U jednom aspektu, OX40L polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 21. U jednom aspektu, OX40L polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 145 ili 146.
[0021] U jednom aspektu, objava obezbeđuje kompoziciju (npr. imunomodulatornu kompoziciju) koja sadrži najmanje tri polinukleotida (npr. tri iRNK) koji kodiraju prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora, drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora i polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora, pri čemu je prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora IL-23 polipeptid, drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-18 polipeptid, i polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora je OX-40L. U sledećem aspektu, objava obezbeđuje kompoziciju (npr. imunomodulatornu kompoziciju) koja sadrži najmanje tri polinukleotida (npr. tri iRNK) koji kodiraju prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora, drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora i polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora, pri čemu je prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora IL-23 polipeptid, drugi polipeptid prajmer imunskog odgovora je IL-36-gama polipeptid, i polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora je OX-40L. U drugim aspektima, kompozicija dodatno sadrži polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira polipeptid inhibitor kontrolne tačke.
[0022] U drugim aspektima, objava obezbeđuje kompoziciju za redukovanje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora, kompozicija sadrži najmanje dva polinukleotida (npr. dve iRNK) koji kodiraju najmanje prvi i drugi polipeptid, pri čemu su najmanje dva polinukleotida odabrana iz grupe koja se sastoji od:
(i) polinukleotida koji kodira IL-23 polipeptid,
(ii) polinukleotida koji kodira IL-36gama polipeptid;
(iii) polinukleotida koji kodira IL-18 polipeptid;
(iv) polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid;
(v) polinukleotida koji kodira CD80 polipeptid; i
(vi) polinukleotida koji kodira anti-CTLA4 antitelo; i,
(vii) njihove kombinacije.
[0023] U jednom aspektu, najmanje dva polinukleotida su odabrana iz grupe koja se sastoji od:
(i) polinukleotida koji kodira IL-23 polipeptid,
(ii) polinukleotida koji kodira IL-36gama polipeptid;
(iii) polinukleotida koji kodira IL-18 polipeptid;
(iv) polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; i
(v) njihove kombinacije.
[0024] U još jednom aspektu, najmanje dva polinukleotida su odabrana iz grupe koja se sastoji od:
(i) polinukleotida koji kodira IL-23 polipeptid,
(ii) polinukleotida koji kodira IL-36gama polipeptid;
(iii) polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; i
(iv) njihove kombinacije.
[0025] U sledećem aspektu, najmanje dva polinukleotida su odabrana iz grupe koja se sastoji od:
(i) polinukleotida koji kodira IL23 polipeptid i polinukleotida koji kodira IL36gama polipeptid;
(ii) polinukleotida koji kodira IL23 polipeptid i polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid;
(iii) polinukleotida koji kodira IL36gama polipeptid i polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid;
(iv) polinukleotida koji kodira IL23 polipeptid i polinukleotida koji kodira IL18 polipeptid;
(v) polinukleotida koji kodira IL36gama polipeptid i polinukleotida koji kodira IL18 polipeptid; i
(vi) polinukleotida koji kodira IL18 polipeptid i polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid.
[0026] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje kompoziciju za redukovanje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora, kompozicija sadrži najmanje tri polinukleotida (npr. tri iRNK) koji kodiraju najmanje prvi, drugi i treći polipeptid, pri čemu su najmanje tri polinukleotida odabrana iz grupe koja se sastoji od:
(i) polinukleotida koji kodira IL23 polipeptid, polinukleotida koji kodira IL36gama polipeptid, i polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; i
(ii) polinukleotida koji kodira IL23 polipeptid i polinukleotida koji kodira IL18 polipeptid, i polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid.
[0027] U nekim aspektima, polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid sadrži: (i) IL-12p40 polipeptid; (ii) IL-23p19 polipeptid; ili (iii) i IL-12p40 polipeptid i IL-23p19 polipeptid. U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid sadrži IL-12p40 polipeptid, IL-23p19 polipeptid i linker koji je operativno pozicioniran između IL-12p40 polipeptida i IL-23p19 polipeptida. U jednom aspektu, linker je Gly/Ser linker (npr. G4S), koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je pokazano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 136-139). U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 140. U drugim aspektima, polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 141.
[0028] U nekim aspektima, polinukleotid koji kodira IL-18 polipeptid sadrži heterolognu signalnu sekvencu. U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-18 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 147, 149, 151 ili 153. U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-18 polipeptid sadrži nukleotidnu sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 148 i 155-162.
[0029] U nekim aspektima, polinukleotid koji kodira IL-36gama polipeptid sadrži heterolognu signalnu sekvencu. U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira IL36-gama polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 16. U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-36gama polipeptid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 143.
[0030] U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira OX40L polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 21. U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira OX40L polipeptid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 145.
[0031] U jednom aspektu, objava obezbeđuje kompoziciju, npr. za redukovanje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora, kompozicija sadrži najmanje tri polinukleotida (npr. tri iRNK) koji kodiraju najmanje prvi, drugi i treći polipeptid, pri čemu najmanje tri polinukleotida sadrže prvi polinukleotid koji kodira OX40L, drugi polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid, i treći polinukleotid koji kodira IL-36gama, pri čemu su prvi, drugi i treći polinukleotidi prisutni u kompoziciji u približnom masenom odnosu od 1:1:2, respektivno. U jednom aspektu, prvi i drugi polinukleotidi, koji kodiraju OX40L i IL-23 respektivno, prisutni su u kompoziciji u približno jednakim masenim količinama i treći polinukleotid, koji kodira
1
IL-36gama, je prisutan u kompoziciji u većoj masenoj količini od prvog i trećeg polinukleotida. Dopunski maseni odnosi za kompoziciju su ovde objavljeni.
[0032] Drugi aspekti objave se odnose na lipidne nanočestice koje sadrže bilo koju od prethodnih ili srodnih kompozicija. U nekim aspektima, lipidna nanočestica je formulisana sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. U nekim aspektima, lipidne nanočestice su formulisane za intratumorsku primenu (iTu).
[0033] U jednom aspektu, objava obezbeđuje lipidne nanočestice koje sadrže: polinukleotid koji kodira humani OX40L polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži ORF koji kodira humani OX40L polipeptid; polinukleotid koji kodira humani IL23 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži ORF koji kodira humani IL-12p40 polipeptid operativno povezan za humani IL-23p19 polipeptid; i polinukleotid koji kodira humani IL-36 gama polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži ORF koji kodira humani IL-36 gama polipeptid.
[0034] U nekim aspektima, humani IL-12p40 polipeptid je operativno povezan za humani IL-23p19 polipeptid pomoću peptidnog linkera. U nekim aspektima, IL-12p40 polipeptid je lociran na 5' terminusu IL-23p19 polipeptida ili linkera (npr. peptidnog linkera). U drugim aspektima, IL-12p40 polipeptid je lociran na 5' terminusu IL-23p19 polipeptida ili linkera (npr. peptidnog linkera). U nekim aspektima, linker je peptidni linker, na primer, Gly/Ser linker (npr. G6S). U nekim aspektima, Gly/Ser linker sadrži (GnS)m, pri čemu je n 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20 i m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20. U nekim aspektima, Gly/Ser linker sadrži (GnS)m, i pri čemu je n 6 i m je 1 (tj. G6S).
[0035] U srodnim aspektima, polinukleotid koji sadrži ORF koji kodira humani IL23 polipeptid ili polinukleotid koji sadrži ORF koji kodira humani IL-36 gama polipeptid dodatno sadrži signalni peptid. U nekim aspektima, signalni peptid je heterologni signalni peptid, na primer signalni peptid izveden iz varijabilnog regiona kapa lakog lanca humanog imunoglobulina, hIGVK4.
[0036] U nekim aspektima, humani OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO: 21. U nekim aspektima, humani IL-12p40 polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, humani IL-23p19 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO: 5. U nekim aspektima, humani IL-36 gama polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO: 16.
[0037] U nekim aspektima, objava obezbeđuje bilo koji od prethodnih ili srodnih polinukleotida koji dodatno sadrže jedno ili više microRNA (miRNA) vezujućih mesta. U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto je miR-122 vezujuće mesto (npr. miR-122-3p vezujuće mesto, miR-122-5p vezujuće mesto ili oba). U nekim aspektima, miR vezujuće mesto je najmanje jedno miR-122-5p vezujuće mesto. U nekim aspektima, polinukleotid sadrži 3' UTR koji sadrži najmanje jedno miR-122-5p vezujuće mesto. U nekim aspektima, miR-122-5p vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 26. U nekim aspektima, polinukleotid sadrži 3' UTR koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 120. U jednom aspektu, polinukleotid sadrži 5' UTR koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u SEQ ID NO: 27.
[0038] U drugim aspektima, objava obezbeđuje upotrebu bilo koje od prethodnih ili prošlih kompozicija ili lipidnih nanočestica kao što je ovde opisano u proizvodnji medikamenta za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca, pri čemu medikament sadrži kompoziciju ili lipidne nanočestice i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač, i pri čemu lečenje sadrži primenu medikamenta u kombinaciji sa kompozicijom koja sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke (npr. anti-PD-1 antitelo, anti-PDL-1 antitelo, anti-CTLA4 antitelo, ili njihova kombinacija), i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0039] U nekim aspektima, objava obezbeđuje komplet koji sadrži kontejner koji sadrži polinukleotidnu (npr. iRNK) kompoziciju ili lipidne nanočestice koje sadrže polinukleotide (npr. iRNK) kao što je ovde objavljeno, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač, i umetak pakovanja koji sadrži uputstva za primenu lipidnih nanočestica ili farmaceutske kompozicije za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca. U nekim aspektima, umetak pakovanja dodatno sadrži uputstva za primenu farmaceutske kompozicije u kombinaciji sa kompozicijom koja sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca.
[0040] U još drugim aspektima, objava obezbeđuje komplet koji sadrži medikament koji sadrži bilo koju od prethodnih ili prošlih kompozicija ili lipidnih nanočestica kao što je ovde opisano i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač, i umetak pakovanja koji sadrži uputstva za primenu medikamenta samog ili u kombinaciji sa kompozicijom koja sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke (npr. anti-PD-1 antitelo, anti-PDL-1 antitelo, anti-CTLA4 antitelo, ili njihovu kombinaciju), i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca. U nekim aspektima, komplet dodatno sadrži umetak pakovanja koji sadrži uputstva za primenu prvog medikamenta i drugog medikamenta za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca.
[0041] Drugi aspekti objave se odnose na kompoziciju koja sadrži bilo koju od prethodnih ili prošlih lipidnih nanočestica kao što je ovde opisano i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije kancera kod pojedinca, pri čemu lečenje sadrži primenu lipidnih nanočestica u kombinaciji sa drugom kompozicijom, pri čemu druga kompozicija sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke (npr. anti-PD-1 antitelo, anti-PDL-1 antitelo, anti-CTLA4 antitelo, ili njihovu kombinaciju), i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0042] U nekim aspektima, polipeptid inhibitor kontrolne tačke inhibira PD1, PD-L1, CTLA4, ili njihovu kombinaciju. U jednom aspektu, polipeptid inhibitor kontrolne tačke je antitelo ili polinukleotid koji kodira antitelo. U jednom aspektu, antitelo je anti-CTLA4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje CTLA4, anti-PD1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje PD1, anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje PD-L1, i njihova kombinacija. U jednom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je atezolizumab, avelumab, ili durvalumab. U jednom aspektu, anti-CTLA-4 antitelo je tremelimumab ili ipilimumab. U jednom aspektu, anti-PD1 antitelo je nivolumab ili pembrolizumab.
[0043] U različitim aspektima kompozicije, polinukleotidi unutar kompozicije su iRNK, pri čemu svaka iRNK uključuje najmanje jednu hemijsku modifikaciju. U jednom aspektu, hemijska modifikacija je odabrana iz grupe koja se sastoji od pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitozina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, 2-tio -1-metil-pseuduridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-2-tio-pseudouridina, 4-metoksipseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metiluridina, 5-metoksiuridina, i 2'-O-metil uridina. U nekim aspektima, iRNK sadrži najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid, pri čemu je najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid odabran iz grupe koja se sastoji od pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitozina, 5-metoksiuridina, i njihove kombinacije. U nekim aspektima, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid je N1-metilpseudouridin. U nekim aspektima, polinukleotid je potpuno modifikovana N1-metilpseudouridin iRNK. Ovde su objavljene dopunske hemijske modifikacije.
[0044] U različitim aspektima kompozicije, kompozicija je formulisana u nosaču lipidnoj nanočestici. Na primer, kompozicija koja sadrži prvi i drugi polinukleotid, i opciono treći polinukleotid, kao što je ovde opisano, formulisana je tako da se svi polinukleotidi unutar kompozicije nose pomoću istog nosača lipidne nanočestice. U jednom aspektu, nosač lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 20-60% amino lipida koji se može jonizovati: 5-25% fosfolipida: 25-55% sterola; i 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida. U jednom aspektu, amino lipid koji se može jonizovati je odabran iz grupe koja se sastoji od na primer, 2,2-dilinoleil-4-
1
dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)-heptadekandioata (L319). U jednom aspektu, amino lipid koji se može jonizovati je Jedinjenje 18.
[0045] U drugim aspektima, lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 20-60% amino lipida koji se može jonizovati: 5-25% fosfolipida: 25-55% sterola; i 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida. U drugim aspektima, nosač lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 20-60% Jedinjenja 18: 5-25% fosfolipida: 25-55% holesterola; i 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida. U drugim aspektima, nosač lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 50% amino lipida koji se može jonizovati: oko 10% fosfolipida: oko 38,5% holesterola; i oko 1,5% PEG-modifikovanog lipida. U drugim aspektima, nosač lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 50% Jedinjenja 18: oko 10% fosfolipida: oko 38,5% holesterola; i oko 1,5% PEG-modifikovanog lipida. U drugim aspektima, nosač lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 49,83% amino lipida koji se može jonizovati: oko 9,83% fosfolipida: oko 30,33% holesterola; i oko 2,0% PEG-modifikovanog lipida. U drugim aspektima, nosač lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 49,83% Jedinjenja 18: oko 9,83% fosfolipida: oko 30,33% holesterola; i oko 2,0% PEG-modifikovanog lipida.
[0046] U sledećem aspektu, objava se odnosi na postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu bilo koje od kompozicija koje su ovde opisane. U jednom aspektu, kompozicija se primenjuje intratumorski. U sledećem aspektu, kompozicija se primenjuje regionalno (tj. u region u kome raste tumor), na primer kompozicija se može primeniti intraperitonealno za tumore u peritonealnoj šupljini. U jednom aspektu, tumor je hepatocelularni karcinom. U sledećem aspektu, tumor je tumor jajnika, tumor kolona ili diseminovani tumor želuca. Drugi pogodni tumori i kanceri za lečenje su ovde objavljeni.
[0047] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid sadrži IL-12p40 podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u TABELI 1, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da se veže za IL-23p19 podjedinicu i formira IL-23, koji ima aktivnost IL-23. U drugim aspektima, IL-23 polipeptid sadrži IL-23p19 podjedinicu koja sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u TABELI 1, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da se veže za IL-12p40 podjedinicu i formira IL-23, koji ima aktivnost IL-23. U nekim aspektima, IL-12p40 podjedinica i IL-23P19 podjedinica su na jednom polipeptidnom lancu ili na dva različita lanca.
[0048] U nekim aspektima, IL-36-gama polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u TABELI 1, pri čemu amino-kiselinska sekvenca ima aktivnost IL-36-gama.
[0049] U nekim aspektima, postupak iz objave dodatno sadrži primenu trećeg proteina ili trećeg polinukleotida koji kodira treći protein. U jednom aspektu, treći protein sadrži OX40L polipeptid. U sledećim aspektima, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u TABELI 1A, pri čemu amino-kiselinska sekvenca ima aktivnost OX40L.
[0050] U određenim aspektima, prvi polinukleotid (npr. iRNK), drugi polinukleotid (npr. iRNK), i/ili treći polinukleotid (npr. iRNK) dodatno sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži miRNA vezujuće mesto, npr. miR-122, npr. aacgccauua ucacacuaaa ua (SEQ ID NO: 23) ili uggaguguga caaugguguu ug (SEQ ID NO: 25).
[0051] Prvi polinukleotid i/ili drugi polinukleotid i/ili treći polinukleotid mogu dodatno da sadrže 5' UTR, 3' UTR, 5' terminusnu kapu, i/ili 3' poliA rep. U drugim aspektima, prvi polinukleotid (npr. iRNK), drugi polinukleotid (npr. iRNK), i/ili treći polinukleotid (npr. iRNK) su kodon optimizovani, in vitro transkribovani, himerni, ili cirkularni.
[0052] U nekim aspektima, prvi polinukleotid (npr. iRNK), drugi polinukleotid (npr. iRNK), i/ili treći polinukleotid (npr. iRNK) je formulisan sa agensom za isporuku, npr. lipidnom nanočesticom. U drugim aspektima, agens za isporuku sadrži jedinjenje koje ima formulu (I)
ili njegovu so ili stereoizomer, pri čemu
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
1
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od karbocikla, heterocikla, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -
N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -
N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i - C(R)N(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13; i
pod uslovom kada je R4-(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, ili -CQ(R)2, tada (i) Q nije -N(R)2 kada je n 1, 2, 3, 4 ili 5, ili (ii) Q nije 5, 6, ili 7-člani heterocikloalkil kada je n 1 ili 2.
[0053] U drugim aspektima, agens za isporuku sadrži jedinjenje koje ima formulu
1
ili njegovu so ili stereoizomer, pri čemu
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od karbocikla, heterocikla, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, i -C(R)N(R)2C(O)OR, i svaki n je nezavisno odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13; i
1
pod uslovom kada je R4-(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, ili -CQ(R)2, tada (i) Q nije -N(R)2 kada je n 1, 2, 3, 4 ili 5, ili (ii) Q nije 5, 6, ili 7-člani heterocikloalkil kada je n 1 ili 2.
[0054] U nekim aspektima, jedinjenje je Formule (IA):
ili njegova so ili stereoizomer, pri čemu
I je odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, i 9;
M1je veza ili M';
R4 je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n 1, 2, 3, 4, ili 5 i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, ili -NHC(O)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroaril ili heterocikloalkil;
M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2 i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0055] U nekim aspektima, m je 5, 7, ili 9.
[0056] U nekim aspektima, jedinjenje je Formule (IA), ili njegova so ili stereoizomer, pri čemu
I je odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, i 9;
M1je veza ili M';
R4 je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n 1, 2, 3, 4, ili 5 i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, ili -NHC(O)N(R)2;
1
M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2 i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0057] U nekim aspektima, m je 5, 7, ili 9.
[0058] U nekim aspektima, jedinjenje je Formule (II):
ili njegova so ili stereoizomer, pri čemu
I je odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
M1je veza ili M';
R4 je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n 1, 2, 3, ili 4 i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, ili -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroaril ili heterocikloalkil;
M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2 i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0059] U nekim aspektima, jedinjenje je Formule (II), ili njegova so ili stereoizomer, pri čemu
I je odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
M1je veza ili M';
R4 je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n 2, 3, ili 4 i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, ili -NHC(O)N(R)2;
M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2 i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
1
[0060] U nekim aspektima, M1je M'.
[0061] U nekim aspektima, M i M' su nezavisno -C(O)O- ili -OC(O)-.
[0062] U nekim aspektima, I je 1, 3, ili 5.
[0063] U nekim aspektima, jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od Jedinjenja 1 do Jedinjenja 232, njihovih soli i stereoizomera, i bilo koje njihove kombinacije. U nekim aspektima, jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od Jedinjenja 1 do Jedinjenja 147, njihovih soli i stereoizomera, i bilo koje njihove kombinacije.
[0064] U određenim aspektima, agens za isporuku sadrži jedinjenje Formule (IIa),
ili njegovu so ili stereoizomer.
[0065] U određenim aspektima, agens za isporuku sadrži jedinjenje Formule (IIb),
ili njegovu so ili stereoizomer.
[0066] U određenim aspektima, agens za isporuku sadrži jedinjenje Formule (IIc) ili (IIe),
2
ili njegovu so ili stereoizomer.
[0067] U nekim aspektima, R4je kao što je ovde opisano. U nekim aspektima, R4je odabran od -(CH2)nQ i -(CH2)nCHQR.
[0068] U određenim aspektima, agens za isporuku sadrži jedinjenje Formule (IId),
ili njegovu so ili stereoizomer,
pri čemu je n odabrano od 2, 3, i 4, i m, R', R", i R2do R6su kao što je ovde opisano. Na primer, svaki od R2i R3može biti nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C5-14alkila i C5-14alkenila.
[0069] U nekim aspektima, jedinjenje je Formule (IId), ili njegova so ili stereoizomer, pri čemu su R2i R3nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od C5-14alkila i C5-14alkenila, n je odabrano od 2, 3, i 4, i R', R", R5, R6i m su kao što je ovde definisano.
[0070] U nekim aspektima, R2je C8alkil.
[0071] U nekim aspektima, R3je C8alkil, C6alkil, C7alkil, C8alkil, ili C9alkil.
[0072] U nekim aspektima, m je 5, 7, ili 9.
[0073] U nekim aspektima, svaki R5je H.
[0074] U nekim aspektima, svaki R6je H.
[0075] U drugim aspektima, agens za isporuku dodatno sadrži fosfolipid, strukturni lipid, PEG lipid, lipid koji se može jonizovati, i/ili jedinjenje kvaternarnog amina.
[0076] Objava dodatno sadrži kompoziciju koja sadrži prvi polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, drugi polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, treći polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde uključen, ili njihove kombinacije, pri čemu su prvi nukleotid, drugi polinukleotid, i/ili treći polinukleotid formulisani u agensu za isporuku koji je ovde objavljen.
[0077] ] Objava dodatno sadrži kompoziciju koja sadrži prvi polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, drugi polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, i treći polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, pri čemu su prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i treći polinukleotid formulisani u agensu za isporuku koji je ovde objavljen.
[0078] Predmetna objava takođe objavljuje komplet koji sadrži kompoziciju koja je ovde objavljena i uputstva za upotrebu u skladu sa postupkom koji je ovde objavljen.
[0079] U nekim aspektima postupka iz predmetne objave, kompozicija iz predmetne objave, ili kompleta iz predmetne objave, primena polinukleotida subjektu kome je to potrebno rezultuje (i) povećanjem nivoa granulocita u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; (ii) povećanjem nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; (iii) povećanjem odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na odnos posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (iv) povećanjem nivoa efektorskih memorijskih T ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (v) povećanjem nivoa ekspresije PDL1 u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; ili (vi) njihovom kombinacijom.
[0080] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži interleukin-23 polipeptid (IL-23), i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži interleukin-36-gama polipeptid (IL-36-gama); ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (OX40L), pri čemu primena dubleta ili tripleta subjektu rezultuje (i) povećanjem nivoa granulocita u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; (ii) povećanjem nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; (iii) povećanjem odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na odnos posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (iv) povećanjem nivoa efektorskih memorijskih T ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (v) povećanjem nivoa ekspresije PDL1 u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; ili (vi) njihovom kombinacijom. U nekim aspektima, pri čemu se povećanje nivoa granulocita kvantifikuje kao (i) granulociti kao procenat CD45+ ćelija, ili (ii) granulociti po mg tumora. U nekim aspektima, unakrsnoprezentujuće dendritske ćelije su CD103+ ćelije. U nekim aspektima, povećanje nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija se kvantifikuje kao (i) unakrsno-prezentujuće dendritske ćelije po mg tumora, (ii) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije u limfnom čvoru koji drenira tumor (TdLN), ili (iii) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije kao procenat CD45+ ćelija. U nekim aspektima, odnos efektorskih prema supresorskim T ćelijama se kvantifikuje kao CD8:Treg odnos. U nekim aspektima, efektorske memorijske T ćelije su CD4+ i/ili CD8+ ćelije. U nekim aspektima, nivo ekspresije PDL1 se kvantifikuje kao (i) broj pozitivnih CD11b+ ćelija, ili (ii) ekspresija PDL1 u CD11b+ ćelijama.
[0081] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje nivoa granulocita kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-
2
36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se nivoi granulocita mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, povećanje nivoa granulocita se meri kao (i) granulociti kao procenat CD45+ ćelija, i/ili (ii) granulociti po mg tumora, u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23 ili jednog polinukleotida koji kodira IL-36-gama.
[0082] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje nivoa unakrsnoprezentujućih dendritskih ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se nivoi unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, unakrsno-prezentujuće dendritske ćelije su CD103+ ćelije. U nekim aspektima, povećanje nivoa unakrsno-prezentujućih CD103+ dendritskih ćelija se meri kao (i) unakrsnoprezentujuće CD103+ dendritske ćelije po mg tumora, (ii) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije u TdLN, (iii) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije kao procenat CD45+ ćelija, ili (iv) njihova kombinacija, u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, jednog polinukleotida koji kodira IL-36-gama, ili jednog polinukleotida koji kodira OX40L.
[0083] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se odnos efektorskih prema supresorskim T ćelijama meri u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, odnos efektorskih prema supresorskim T ćelijama se meri kao CD8:Treg odnos.
[0084] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje nivoa efektorskih memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se nivoi efektorskih memorijskih T ćelija mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, efektorske memorijske T ćelije su CD4+ i/ili CD8+ ćelije. U nekim aspektima, povećanje nivoa efektorskih memorijskih T ćelija se meri kao efektorske memorijske T ćelije unutar tumora u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L.
[0085] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje nivoa PDL1 pozitivnih ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se nivoi PDL1 pozitivnih ćelija mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, PDL1 pozitivne ćelije su CD11b+ ćelije.
[0086] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, uzorak koji je dobijen od subjekta je odabran, na primer, od tumorskog tkiva, tumorskog infiltrata, krvi, plazme, ili njihove kombinacije. Osoba sa iskustvom u struci bi razumela da se bilo koje od ćelija koje se mere u postupcima koji su ovde objavljeni (npr. granulociti, unakrsno-prezentujuće dendritske ćelije, efektorske T ćelije, supresorske T ćelije, PDL1 pozitivne ćelije, itd.), i parametri koji odgovaraju tim merenjima (npr. apsolutni ili relativni nivoi ćelija, odnosi prema drugim ćelijama, nivo specifičnih podtipova, nivoi aktivacije, prisustvo/odsustvo markera, itd.) mogu meriti u bilo kom uzorku tkiva gde su te ćelije prisutne upotrebom postupaka koji su poznati u struci bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0087] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, jedan ili više kontrolnih uzoraka je uzorak ili uzorci koji su dobijeni od zdravog subjekta ili subjekta sa tumorom. U nekim aspektima, nivo praga je unapred određena vrednost ili vrednost dobijena iz jednog ili više uzoraka.
2
[0088] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za određivanje da li da se subjekt koji ima tumorsku bolest leči sa kompozicijom koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid; postupak sadrži (1) primenu inicijalne doze dubleta ili tripleta subjektu koji je podnesen, i (2) lečenje subjekta ukoliko se posle primene inicijalne doze dubleta ili tripleta odredi da subjekt ima povećanje (a) nivoa granulocita, (b) nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija, (c) odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama, (d) nivoa efektorskih memorijskih T ćelija, (e) nivoa PDL1 pozitivnih ćelija, (f) ekspresije PDL1, ili (g) njihove kombinacije, u odnosu na nivo praga.
[0089] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak odabira subjekta sa dijagnozom tumora kao kandidata za lečenje sa kompozicijom koja sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid; postupak sadrži (1) primenu subjektu inicijalne doze dubleta ili tripleta, i (2) odabira subjekta za lečenje ukoliko se posle primene inicijalne doze dubleta ili tripleta odredi da subjekt ima povećanje (a) nivoa granulocita, (b) nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija, (c) odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama, (d) nivoa efektorskih memorijskih T ćelija, (e) nivoa PDL1 pozitivnih ćelija, (f) ekspresije PDL1, ili (g) njihove kombinacije, u odnosu na nivo praga.
[0090] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak merenja efikasnosti kompozicije za lečenje tumora kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu kompozicija sadrži (a) dva polinukleotida u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid; ili, (b) tri polinukleotida u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid; pri čemu postupak sadrži merenje u najmanje jednom uzorku koji je uzet od subjekta (a) nivoa granulocita, (b) nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija, (c) odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama, (d) nivoa efektorskih memorijskih T ćelija, (e) nivoa PDL1
2
pozitivnih ćelija, (f) ekspresije PDL1, ili (g) njihove kombinacije, pri čemu povećanje najmanje jednog merenja u odnosu na nivo praga ukazuje da subjekt reaguje na lečenje sa dubletom ili tripletom.
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
[0091]
SL. 1A i 1B pokazuju efikasnost IL-23 iRNK monoterapije u A20 životinjskom modelu limfoma. SL. 1A pokazuje tretman sa NST-FIX kontrolom (2,5 μg iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 1 od 12 subjekata (8,3%). SL. 1B pokazuje tretman sa mIL-23 bez miR (2,5 μg iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 5 od 12 subjekata (41,6%). Uslovi doziranja: 2,5 µg iRNK, intratumorska (iTu) primena, lipidne nanočestice na bazi Jedinjenja 18 (SM68 LNP). NST-FIX je iRNK negativna kontrola.
SL. 2A i 2B pokazuju efikasnost IL-23 iRNK monoterapije u MC38-C životinjskom modelu kancera kolona. SL. 2A pokazuje tretman sa NST-OX40L (2,5 μg iRNK). SL.
2B pokazuje tretman sa mIL-23 iRNK kojoj nedostaju miR vezujuća mesta u 3' UTR, "bez miR" (2,5 µg iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 4 od 10 subjekata (40%). Delimičan odgovor je uočen kod 2 od 10 subjekata (20%). Uslovi doziranja: 2,5 µg iRNK, iTu, LNP na bazi Jedinjenja 18. NST-OX40L je iRNK negativna kontrola.
SL. 3A-3F pokazuju da dodavanje iRNK koja kodira bilo IL-36-gama ili IL-18 IL-23 iRNK terapiji povećava efikasnost u MC38-C modelu kancera kolona. SL.3A pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 i NST-FIX (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 3 od 10 subjekata (30%). Delimičan odgovor je uočen kod 6 od 10 subjekata (60%). SL. 3B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-36-gama (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 9 od 10 subjekata (90%). Delimičan odgovor je uočen kod 1 od 10 subjekata (10%). SL. 3C pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-18 (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 6 od 10 subjekata (60%). Delimičan odgovor je uočen kod 3 od 10 subjekata (30%). SL. 3D pokazuje tretman sa NST-FIX kontrolom (5 µg iRNK). Uslovi doziranja: 2,5 µg iRNK svake iRNK (5 µg za kontrolu), iTu, LNP na bazi Jedinjenja 18. NST-FIX je iRNK negativna kontrola. SL.
3E, SL. 3F, i SL. 3G pokazuju podatke koji odgovaraju istim eksperimentima
2
predstavljenim na SL. 3A, SL. 3B, i SL. 3D, respektivno, ali produžavajući vremenski okvir eksperimenata do dana 90.
SL. 4A-4C pokazuju efikasnost IL-23 i IL-36-gama ili IL-18 kombinovane iRNK terapije u A20 modelu limfoma. SL. 4A pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 bez miR i NST-FIX (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 8 od 12 subjekata (66,6%). Delimičan odgovor je uočen kod 1 od 12 subjekata (8,3%). SL. 4B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 bez miR u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-36-miR-122 (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 10 od 12 subjekata (83,3%). SL. 4C pokazuje tretman sa IL-23-kodirajućom iRNK "bez miR" i IL-18-kodirajućom iRNK "bez miR" (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 6 od 12 subjekata (50%). SL. 4D pokazuje tretman sa NST-FIX kontrolom (5 µg iRNK). Uslovi doziranja: 2,5 µg iRNK svake RNK (5 µg za kontrolu), iTu, LNP na bazi Jedinjenja 18. NST-FIX je iRNK negativna kontrola.
SL. 5A-5C pokazuju ranu indikaciju superiorne efikasnosti iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira IL-23 u odnosu na samo iRNK koja kodira IL-23 sa fiksnom dozom iRNK od 5 µg u A20 modelu limfoma. SL. 5A pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 (5 µg iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 1 od 10 subjekata (10%). Delimičan odgovor je uočen kod 4 od 10 subjekata (40%). SL. 5B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-36-gama (5 µg iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 2 od 10 subjekata (20%). Delimičan odgovor je uočen kod 1 od 10 subjekata (10%). SL.
5C pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 i iRNK koja kodira IL-36-gama (2,5 µg svaka iRNK). SL. 5D pokazuje tretman sa NST-FIX iRNK kontrolom (5 µg iRNK). Uslovi doziranja: 2,5 µg iRNK svake iRNK (5 µg za kontrolu), iTu, LNP na bazi Jedinjenja 18. NST-FIX je iRNK negativna kontrola. Kombinacija IL-23/IL-36-gama je superiornija od monokonstituenata pri fiksnoj dozi od 5 µg iRNK.
SL. 6A-6C pokazuju poređenje imunskog infiltrata MC38 modela kancera kolona. SL.
6A pokazuje kvantifikaciju infiltracije CD4+, CD8+ i CD11b+ ćelija u MC38 model sistemu u ćelijama po mg tkiva. Rezultati su pokazani za MC38-M (slabo imunogen) i MC38-C (jako imunogen). SL. 6B pokazuje mikrografiju tkiva slabo imunogenog uzorka MC38-M i SL.6C pokazuje mikrografiju tkiva jako imunogenog uzorka MC38-C.
SL. 7A-7D analiziraju efikasnost IL-23 iRNK monoterapije i IL-23/IL-36-gama ili IL-23/IL-18 kombinovane iRNK terapije u MC38-M modelu kancera kolona. SL. 7A pokazuje tretman sa NST-OX40L (2,5 µg iRNK) u LNP na bazi Jedinjenja 18. Nije
2
uočen nikakav odgovor. SL. 7B pokazuje tretman sa IL-23 iRNK "bez miR" (2,5 µg iRNK) u LNP na bazi Jedinjenja 18. Uočen je samo jedan delimičan odgovor (1 od 10, 10%). MC38-M je relativno neosetljiv model u kome su monoterapije OX40L, anti-PD-1 antitela, i IL-23 neefikasne. SL. 7C pokazuje tretman sa iRNK koje kodiraju IL-23 i IL-36-gama (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovori su uočeni kod 2 od 10 subjekata (20%). Delimični odgovori su uočeni kod 5 od 10 subjekata (50%). Stoga, IL-23/IL-36-gama iRNK kombinovana terapija je efikasna kod slabo imunogenog kancera kolona MC38-M. SL. 7E pokazuje tretman sa iRNK koje kodiraju IL-23 i IL-18 (2,5 µg svaka iRNK). Uočen je samo jedan delimičan odgovor (1 od 10, 10%). SL. 7D pokazuje tretman sa NST-FIX kontrolom (5 µg iRNK).
SL. 8 analizira efikasnost OX40L iRNK monoterapije u A20 modelu tumora. iRNK koja kodira OX40L (2,5 µg iRNK) je formulisana u LNP na bazi Jedinjenja 18. Uočena su dva potpuna odgovora.
SL. 9A-9C pokazuju efikasnost monoterapije OX40L iRNK "bez miR" ili anti-PD-1 u MC38-M (slabo imunogenom) modelu kancera kolona. SL. 9A pokazuje tretman sa OX40L iRNK "bez miR" (2,5 µg iRNK) u LNP na bazi Jedinjenja 18. SL. 9B pokazuje tretman sa anti-PD-1 antitelom (5 mg/kg 2x nedeljno IP doziranje). SL. 9C pokazuje mikrofotografiju tkiva MC38-M modela kancera kolona.
SL. 10A-10H pokazuju efekat monoterapije, binarne kombinovane terapije; i trostruke kombinovane terapije (uključujući primenu jedne i više doza pri različitim nivoima doze) upotrebom iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama, i OX40L, pri čemu svaka iRNK sadrži miR122 vezujuće mesto. SL. 10A pokazuje monoterapijski tretman sa IL-23_miR-122. Nisu uočeni potpuni odgovori, već osam begunaca (escapers). SL. 10B pokazuje kombinovani tretman sa IL-23_miR-122 i IL-36-gama_miR-122. Uočena su tri potpuna odgovora (25%). Uočeno je šest begunaca. SL.10C pokazuje tretman sa IL-23_miR-122, IL-36-gama_miR-122 i OX40L_miR-122 trostrukom kombinovanom terapijom. Uočena su tri potpuna odgovora (25%). Uočena su četiri begunca. Za svaki uzorak: 5 µg ukupne iRNK/dozi je primenjeno intratumorski (iTu). Kada su primenjene netranslaciona kontrolna iRNK i IL-36gama_miR-122 same, svi miševi su napredovali do dana 26 (podaci nisu pokazani). SL.10D, SL. 10E, i SL.10F pokazuju podatke koji odgovaraju istim eksperimentima predstavljenim na SL. 10A, SL. 10B, i SL. 10C, respektivno, ali produžavajući vremenski okvir eksperimenata do dana 70. SL. 10G pokazuje tretman sa IL-23_miR-122 i IL-36-gama_miR-122 dublet terapijom u jednoj dozi (8 µg) i IL-23_miR-122, IL-36-gama_miR-122, i OX40L_miR-122 triplet
2
terapijom u jednoj dozi ili više doza (12 µg) u MC38 luciferaza ćelijama u odnosu na lažnu kontrolu. SL. 10H pokazuje preživljavanje do dana 47 nakon tretmana sa jednom dozom od 8 µg IL-23_miR-122 i IL-36-gama_miR-122 dublet terapije, jednom dozom od 12 µg IL-23_miR-122, IL-36-gama_miR-122, i OX40L_miR-122 triplet terapije, ili više doza od 12 µg IL-23_miR-122, IL-36-gama_miR-122, i OX40L_miR-122 triplet terapije. Smrtni slučajevi povezani sa tretmanom uočeni su sa više doza od 12 µg IL-23_miR-122, IL-36-gama_miR-122, i OX40L_miR-122 triplet terapije.
SL. 11 pokazuje bioaktivnost (npr. indukciju ekspresije murinskog interleukina 17 (mIL-17) iz primarnih splenocita miša) IL-23 proteina proizvedenog iz iRNK u poređenju sa rekombinantnim IL-23 proteinom. Puna gornja linija pokazuje mIL-17 (pg/ml) sekretovan iz primarnih splenocita miša posle dodavanja murinskog IL-23 (mIL-23) dobijenog iz HeLa ćelija transfektovanih sa iRNK koja kodira mIL-23; puna donja linija pokazuje ekspresiju mIL-17 (pg/ml) posle dodavanja humanog IL-23 (hIL-23) dobijenog iz HeLa ćelija transfektovanih sa iRNK koja kodira hIL-23. Isprekidana crna linija pokazuje mIL-17 sekretovan iz primarnih splenocita miša posle dodavanja rekombinantnog hIL-23; i isprekidana siva linija pokazuje ekspresiju mIL-17 iz splenocita posle dodavanja rekombinantnog mIL-23. Nivoi IL-23 proteina upotrebljeni u eksperimentu bili su 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 3,3 ng/ml, 10 ng/ml i 100 ng/ml.
SL. 12A pokazuje proizvodnju murinskog interleukina 6 (mIL6) (ng/ml) u dendritskim ćelijama poreklom iz kostne srži kao što je indukovano murinskim IL-36gama (mIL-36γ) proteinom. Prvi panel (NT) je negativna kontrola. Drugi panel pokazuje ekspresiju mIL6 posle dodavanja rekombinantnog mIL-36γ. Treći panel pokazuje ekspresiju mIL6 posle dodavanja mIL-36γ dobijenog iz HeLa ćelija transfektovanih sa iRNK koja kodira mIL-36γ. Četvrti panel (lažni) pokazuje lažnu kontrolu. SL. 12B pokazuje ekspresiju interleukina 8 (IL8) (OD450) u A431 ćelijama pomoću rekombinantnog humanog IL-36-gama i supernatanta iz B16F10 ćelija transfektovanih sa tri iRNK koje kodiraju hIL-36-gama.
SL. 13A-13E pokazuju kostimulatornu biološku aktivnost OX40L eksprimiranog na površini ćelija tretiranih sa OX40L iRNK. SL. 13A pokazuje šematski crtež testa aktivacije T-ćelija. B16F10 ćelije ili HeLa ćelije koje eksprimiraju OX40L su zajedno kultivisane sa CD4+ T-ćelijama i anti-mišjim CD3 antitelom (B16F10 ćelije) ili Dynabeads humanim T-aktivatorom (HeLa ćelije). Proizvodnja IL-2 je izmerena upotrebom ELISA kao korelacija aktivacije T-ćelija. SL. 13B pokazuje rezultate testa aktivacije T-ćelija kao što je izmereno pomoću mišjeg IL-2. SL.13C pokazuje rezultate testa aktivacije T-ćelija kao što je izmereno pomoću humanog IL-2. Y-osa pokazuje ekspresiju mIL-2 u ng/ml. SL. 13D pokazuje podatke sa SL. 13C sa šematskim dijagramom koji pokazuje dodavanje ćelija koje eksprimiraju OX40L u testu aktivacije naivnih T-ćelija. SL. 13E pokazuje test aktivacije T-ćelija upotrebom prethodno stimulisanih T-ćelija kultivisanih u prisustvu ili odsustvu OX40L eksprimirajućih HeLa ćelija i u prisustvu ili odsustvu anti-humanog CD3 antitela.
SL. 14A-14D pokazuju različite tipove imunskih ćelija koje infiltriraju mikrookruženje tumora u A20 tumorima nakon primene polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. SL. 14A pokazuje procenat NK ćelija u tumorskom infiltratu 24 sata posle tretmana, što je detektovano pomoću DX5 markera. SL. 14B pokazuje procenat CD4+ T-ćelija u tumorskom infiltratu 14 dana posle tretmana, što je detektovano pomoću CD4 markera. SL. 14C pokazuje procenat CD8+ T-ćelija u tumorskom infiltratu 14 dana posle tretmana, što je detektovano pomoću CD8 markera. SL. 14D pokazuje procenat CD8+ T-ćelija u tumorskom infiltratu MC38 tumora 24 i 72 sata posle prve i druge doze polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.
SL. 15A i 15B pokazuju in vivo anti tumorsku efikasnost mOX40L_miR-122 isporučene intratumorski. SL. 15A pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorski sa kontrolnom iRNK ("NST-OX40L") (strelice označavaju dane injektiranja). SL. 15B pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorski sa mOX40L_miR-122 iRNK ("OX40L-miR-122") (strelice označavaju dane injektiranja).
SL. 16A-16F pokazuju in vivo antitumorsku efikasnost kombinovane terapije koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i miR-122 vezujuće mesto i anti-PD-1 antitelo. SL. 16A pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane sa intratumorskim injekcijama kontrolne iRNK ("NST_mOX40L_122") i kontrolnog antitela ("Pacovski IgG2a"). SL. 16B pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane sa intratumorskim injekcijama mOX40L_miR-122 ("mOX40L_122") i kontrolnog antitela ("Pacovski IgG2a"). SL. 16C pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane sa intratumorskim injekcijama kontrolne iRNK ("NST_mOX40L_122") i anti-PD-1 antitela ("anti-PD-1"). SL. 16D pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane sa intratumorskim injekcijama mOX40L_miR-122 ("mOX40L_122") i anti-PD-1 antitela ("anti-PD-1"). SL. 16E pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane sa intratumorskim injekcijama anti-PD-1 antitela i PBS.
1
SL. 16F pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane sa PBS i kontrolnim antitelom ("Pacovski IgG2a"). CR = sa potpunim odgovorom.
SL. 17 pokazuje krive preživljavanja za životinje koje su tretirane intratumorski kombinovanom terapijom koja sadrži kontrolnu iRNK i kontrolno antitelo ("NST_mOX40L_122 pacovski IgG2a"), mOX40L_miR-122 i kontrolno antitelo ("mOX40L_122 pacovski IgG2a"), kontrolnu iRNK i anti-PD-1 antitelo ("NST_mOX40L_122 anti-PD-1"), mOX40L_miR-122 i anti-PD-1 antitelo ("mOX40L_122 anti-PD-1"), anti-PD-1 antitelo i PBS ("PBS anti-PD-1"), i PBS i kontrolno antitelo ("PBS pacovski IgG2a").
SL. 18A i 18B pokazuju memorijski imunski odgovor kod životinja koje su tretirane kombinovanom terapijom koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i miR-122 vezujuće mesto i anti-PD-1 antitelo. Životinje su inicijalno tretirane intratumorskim injekcijama mOX40L_miR-122 i anti-PD-1 antitela kao što je pokazano na SL. 16D. Četiri životinje identifikovane kao one sa potpunim odgovorom (CR) ponovo su izazvane sa MC38 tumorskim ćelijama. SL. 18A pokazuje rast tumora kod naivnih životinja koje su bile izazvane sa MC38 tumorskim ćelijama.
SL. 18B pokazuje rast tumora kod četiri CR životinje koje su ponovo izazvane sa MC38 tumorskim ćelijama.
SL. 19A-19G pokazuju in vivo efikasnost za tumor i kod primarno tretiranih i netretiranih distalnih tumora sa dvostrukom iRNK terapijom (kombinacija iRNK koje kodiraju IL-23 i IL-36) i triplet iRNK terapijom (kombinacija iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36, i OX40L). SL. 19A pokazuje šematski opis MC38-S modela dvostrukog boka koji je upotrebljen u eksperimentima. Tumor implantiran u jedan bok se tretira, a efekat se meri i kod primarno tretiranog tumora i kod netretiranog tumora u drugom boku. SL. 19B pokazuje efekat iRNK negativne kontrole (netranslatirajuća iRNK koja kodira za OX40L) na primarno tretirani tumor. SL. 19C pokazuje efekat iRNK negativne kontrole na netretirani tumor. SL. 19D pokazuje efekat dvostruke iRNK terapije (iRNK koja kodira IL-23 i iRNK koja kodira IL-36-gama) na primarno tretirani tumor. SL. 19E pokazuje efekat dvostruke iRNK terapije (iRNK koja kodira IL-23 i iRNK koja kodira IL-36-gama) na distalni netretirani tumor. SL. 19F pokazuje efekat triplet iRNK terapije (iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, i iRNK koja kodira OX40L) na primarno tretirani tumor. SL. 19G pokazuje efekat triplet iRNK terapije (iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, i iRNK koja kodira OX40L) na distalni netretirani tumor. U svakom slučaju, ukupna doza iRNK injektirane
2
u tumor (kontrolna, dvostruka, ili triplet) bila je 5 mikrograma. iRNK su primenjivane intratumorski u jednoj dozi.
SL. 20A-20D pokazuju da triplet iRNK terapija u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom ima poboljšanu efikasnost u B16F10-AP3 modelu tumora koji se teško leči. SL. 20A pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane negativnom kontrolom. SL. 20B pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane anti-PD-L1 antitelom. SL. 20C pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, i iRNK koja kodira OX40L). SL. 20D pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, i iRNK koja kodira OX40L) plus anti-PD-L1 antitelom.
SL. 21A i SL. 21B pokazuju memorijski imunski odgovor kod životinja koje su tretirane dublet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama). Životinje su inicijalno tretirane sa 5 μg ukupne iRNK (2,5 μg iRNK koja kodira IL-23 i 2,5 μg iRNK koja kodira IL-36-gama) primenjene intratumorski Q7D. Deset životinja identifikovanih kao one sa potpunim odgovorom (CR) ponovo je izazvano sa MC38-S tumorskim ćelijama. SL. 21A pokazuje rast tumora kod naivnih životinja koje su bile izazvane sa MC38-S tumorskim ćelijama. SL. 21B pokazuje rast tumora kod deset CR životinja koje su ponovo izazvane sa MC38-S tumorskim ćelijama.
SL. 22A i SL. 22B pokazuju povećanje Ly6G+ granulocita kao odgovor na tretman MC38 tumora sa dublet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama). SL. 22A pokazuje nivo granulocita kao procenat CD45+ ćelija 24 sata, 72 sata, 7 dana, i 14 dana posle tretmana. SL. 22B pokazuje nivo granulocita kao granulocite po mg tumora 24 sata, 72 sata, 7 dana, i 14 dana posle tretmana. Prezentovana merenja odgovaraju tretmanu sa kontrolama ("NoRx" i "NST"), IL-23 i IL-36-gama monoterapijama ("IL23" i "IL36"), i dublet iRNK kombinovanom terapijom ("Kombo", što odgovara miševima koji primaju jednu dozu kombinovane terapije, i "Kombo 2 doze" što odgovara miševima koji primaju dve doze kombinovane terapije). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 23 pokazuje povećanje Ly6G+ granulocita kao procenat CD45+ ćelija 24 sata, 72 sata i 7 dana posle tretmana MC38 tumora sa triplet iRNK kombinovanom terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 24A i SL. 24B pokazuju povećanje CD103+ dendritskih ćelija (DC) kao odgovor na tretman MC38 tumora sa dublet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama). SL. 24A pokazuje nivo CD103+ dendritskih ćelija kao procenat CD45+ ćelija 7 dana posle tretmana. SL. 24B pokazuje nivo CD103+ dendritskih ćelija kao CD103+ dendritske ćelije po mg tumora 7 dana posle tretmana. Prezentovana merenja odgovaraju tretmanu sa kontrolama ("NoRx" i "NST"), IL-23 i IL-36-gama monoterapijama ("IL23" i "IL36"), i dublet iRNK kombinovanom terapijom ("Kombo"). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 25A i SL. 25B pokazuju povećanje CD103+ dendritskih ćelija (DC) kao odgovor na tretman MC38 tumora sa dublet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama) ili triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L). SL. 25A pokazuje nivo CD103+ dendritskih ćelija kao CD8+ ćelije po mg tumora 7 dana posle tretmana. SL.
25B pokazuje nivo CD8+ dendritskih ćelija u limfnom čvoru koji drenira tumor (TdLN) 7 dana posle tretmana. Prezentovana merenja odgovaraju tretmanu sa kontrolama ("Naivne" i "NST"), OX40L monoterapijom ("OX40L"), i dublet i triplet iRNK kombinovanom terapijom ("Dublet" i "Triplet", respektivno). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 26A-26D pokazuju povećanje CD11b+ dendritskih ćelija u MC38 tumorima i drenirajućem limfnom čvoru kao odgovor na tretman sa triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L).
SL. 26A pokazuje nivo CD11+ cDC2 ćelija kao ćelije po mg tumora 7 dana posle tretmana. SL. 26B pokazuje nivo CD11+ cDC2 dendritskih ćelija u limfnom čvoru koji drenira tumor (TdLN) 7 dana posle tretmana. SL. 26C pokazuje aktivaciju CD86 na CD11b+ cDC2 u drenirajućem limfnom čvoru 24 h i 72 h posle intratumorske primene triplet iRNK terapije izmereno kao procenat CD24 cDC2 ćelija. SL. 26D pokazuje aktivaciju CD86 na CD11b+ cDC2 u drenirajućem limfnom čvoru 24 h i 72 h posle intratumorske primene triplet iRNK terapije izmereno kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
4
SL. 27A i SL. 27B pokazuju aktivaciju CD86 na CD8 cDC1 u drenirajućem limfnom čvoru 24 h i 72 h posle intratumorske primene triplet iRNK terapije na MC38 tumore izmereno kao procenat CD8 cDC1 ćelija (SL. 27A) ili kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) (SL. 27B). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 28A-28D pokazuju povećanje inflamatornih dendritskih ćelija (iDC) u MC38 tumorima i drenirajućim limfnim čvorovima kao odgovor na tretman sa triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L). SL. 28A pokazuje nivo iDC u tumoru kao ćelije po mg tumora 7 dana posle tretmana. SL.28B pokazuje nivo iDC u limfnom čvoru koji drenira tumor (TdLN) 7 dana posle tretmana. SL. 28C pokazuje aktivaciju CD86 na iDC u drenirajućem limfnom čvoru 24 h i 72 h posle intratumorske primene triplet iRNK terapije izmereno kao procenat iDC. SL. 28D pokazuje aktivaciju CD86 na iDC u drenirajućem limfnom čvoru 24 h i 72 h posle intratumorske primene triplet iRNK terapije izmereno kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 29 pokazuje povećanje odnosa efektorskih CD8 T ćelija (Ubica) prema regulatornim T ćelijama (Treg) kao odgovor na tretman MC38 tumora sa dublet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama) i triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L). Merenja su uzeta 72 sata i 7 dana posle tretmana. Prezentovana merenja odgovaraju tretmanu sa kontrolama ("NST"), OX40L monoterapijom ("OX40L"), i dublet i triplet iRNK kombinovanom terapijom ("Dublet" i "Triplet", respektivno). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 30A i SL. 30B pokazuju povećanje centralnih i efektorskih CD4 i CD8 ćelija kao odgovor na tretman MC38 tumora sa dublet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama) ili triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L). SL. 30A pokazuje nivo CD4 ćelija kao CD4 ćelije po mg tumora 7 dana i 10 dana posle tretmana. SL.30B pokazuje nivo CD8 ćelija kao CD8 ćelije po mg tumora 7 dana i 10 dana posle tretmana. Prezentovana merenja odgovaraju tretmanu sa kontrolama ("NST"), OX40L monoterapijom ("OX40L"), i dublet i triplet iRNK kombinovanom terapijom ("Dublet" i "Triplet", respektivno). Barovi pokazuju nivoe naivnih, centralnih memorijskih, i efektorskih memorijskih CD4 i CD8 ćelija.
SL. 31 predstavlja krive preživljavanja koje pokazuju efekat uklanjanja CD ćelija na efikasnost tretmana MC38 tumora sa triplet iRNK terapijom (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L). Nivoi CD4 i CD8 ćelija su smanjeni primenom anti-CD4 i anti-CD8 antitela miševima sa MC38 tumorima. Strelica označava primenu triplet terapije. Doze antitela koje ukljanjaju CD ćelije (označene kružićima) primenjene su pre i posle primene triplet terapije.
SL. 32A i 32B pokazuju ekspresiju PD-L1 u kancerskim ćelijama miševa sa MC38 tumorima kao odgovor na primenu triplet iRNK terapije. SL. 32A pokazuje procenat kancerskih ćelija (CD45-, FSchi, MHCII-) pozitivnih na PD-L17 dana posle tretmana sa triplet iRNK terapijom. SL. 32B pokazuje nivo ekspresije PD-L1 u kancerskim ćelijama (CD45-, FSchi, MHCII-) izmeren kao MFI (srednja vrednost intenziteta fluorescencije). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost.
SL. 33A i SL. 33B pokazuju ekspresiju PD-L1 kod miševa sa MC38 tumorima kao odgovor na primenu IL-23 ili IL-36-gama monoterapija ili dublet iRNK terapije (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama). SL. 33A pokazuje procenat CD11b+ ćelija pozitivnih za PD-L1. SL. 33B pokazuje jačinu ekspresije PD-L1 u CD11b+ ćelijama, izmerenu kao MFI (srednja vrednost intenziteta fluorescencije). Prezentovana merenja odgovaraju tretmanu sa kontrolama ("NoRx" i "NST"), IL-23 i IL-36-gama monoterapijama ("IL23" i "IL36"), i dublet iRNK kombinovanom terapijom ("Kombo"). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D. Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost. Sva merenja su obavljena 7 dana posle implantacije tumorskih ćelija.
SL. 34A i SL. 34B pokazuju ekspresiju PD-L1 kod miševa sa MC38 tumorima kao odgovor na primenu OX40L monoterapije ili dublet (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama) ili triplet (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L) iRNK terapije. SL. 34A pokazuje procenat CD11b+ ćelija pozitivnih za PD-L1. SL. 34B pokazuje jačinu ekspresije PD-L1 u CD11b+ ćelijama, izmerenu kao MFI (srednja vrednost intenziteta fluorescencije). Prezentovana merenja odgovaraju tretmanu sa kontrolama ("NoRx"), OX40L monoterapijom ("OX40L"), i dublet i triplet iRNK kombinovanom terapijom ("dublet" i "triplet", respektivno). Vertikalni barovi predstavljaju srednju vrednost sa S.D.
Horizontalni barovi iznad podataka predstavljaju statističku značajnost. Sva merenja su obavljena 7 dana posle implantacije tumorskih ćelija.
SL. 35A-35D pokazuju in vivo antitumorsku efikasnost triplet iRNK terapije u kombinaciji sa anti PD-L1 antitelom (10F.9G2) kod imunosupresivnih MC38 tumora.
SL. 35A pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorskim injekcijama kontrolnog antitela. SL. 35B pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorskim injekcijama samo anti PD-L1 antitela (10F.9G2). SL. 35C pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorskim injekcijama triplet iRNK terapije. SL. 35D pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorskim injekcijama trostruke iRNK terapije plus anti PD-L1 antitela (10F.9G2). Vertikalne isprekidane linije označavaju dan primene kontrolnog antitela, anti PD-L1 antitela, triplet iRNK terapije, ili triplet iRNK terapije plus anti PD-L1 antitelo.
SL. 36A i SL.36B pokazuju in vivo antitumorsku efikasnost triplet iRNK kombinovane terapije (iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira OX40L) u singenom H22 (hepatocelularni karcinom (HCC)) modelu. SL. 36A pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorskim injekcijama kontrolne iRNK ("NST-FIX"). SL. 36B pokazuje rast tumora kod životinja koje su tretirane intratumorskim injekcijama triplet iRNK kombinovane terapije.
SL. 37 pokazuje srednju vrednost zapremine tumora (mm<3>) za svaku grupu miševa koji su tretirani u skladu sa dizajnom koji je pokazan u Tabeli 11. Isprekidane strelice pokazuju nedostatak efikasnosti OX40L primenjene u Grupi 8, i sinergistički efekat kombinacije OX40L sa IL-23 u Grupi 5.
SL. 38A pokazuje srednju vrednost zapremine tumora (mm<3>) za grupe miševa koji su tretirani triplet kombinacijama koje sadrže mišji OX40L, mišji IL-23, i mišji IL-36-gama. U svakom tripletu upotrebljene su različite količine iRNK koja kodira mišji IL-36-gama. Ukupna količina iRNK u svakoj triplet dozi održavana je konstantnom dodavanjem odgovarajuće količine NST kontrolne iRNK.
SL. 38B pokazuje srednju vrednost zapremine tumora (mm<3>) za grupe miševa koji su tretirani triplet kombinacijama koje sadrže mišji OX40L, mišji IL-23, i humani IL-36-gama. U svakom tripletu upotrebljene su različite količine iRNK koja kodira humani IL-36-gama. Ukupna količina iRNK u svakoj triplet dozi održavana je konstantnom dodavanjem odgovarajuće količine NST kontrolne iRNK.
SL. 39A-39O pokazuju zapreminu tumora (mm<3>) za svaku grupu miševa koji su tretirani u skladu sa dizajnom studije koji je pokazan u Tabeli 11. Datumi kada su iRNK primenjene označeni su vertikalnim isprekidanim linijama. Svaki crtež pokazuje broj životinja po grupi (n), broj onih sa potpunim odgovorom (CR), i broj životinja sa tumorima ispod 100 mm<3>zapremine na kraju studije. Svaki crtež takođe pokazuje kompoziciju koja je primenjena svakoj životinji i odnos između svake iRNK u kompoziciji.
SL. 40 pokazuje promene telesne težine (%) za svaku grupu miševa koji su tretirani u skladu sa dizajnom studije koji je pokazan u Tabeli 11. Crtež pokazuje srednje vrednosti telesne težine za svaku grupu.
SL. 41A-41O pokazuju promene telesne težine (%) za svaku grupu miševa koji su tretirani u skladu sa dizajnom studije koji je pokazan u Tabeli 11. Crtež pokazuje pojedinačne promene vrednosti telesne težine za svaku životinju u svakoj grupi.
SL. 42 predstavlja krive preživljavanja koje pokazuju efekat tretmana MC38 tumora u skladu sa dizajnom koji je pokazan u Tabeli 11. Isprekidane strelice pokazuju (i) nedostatak efikasnosti OX40L primenjene u Grupi 8, (ii) umerenu efikasnost IL-23 u Grupi 9, (iii) sinergistički efekat kombinacije OX40L sa IL-23 u Grupi 5, i (iv) najveću uočenu efikasnost, koja je odgovarala Grupi 1 (mOX40L/mIL-23/mIL-36-gama 1:1:1).
SL. 43A pokazuje srednju vrednost zapremine tumora (mm<3>) za miševe koji nose MC38-S tumore i koji su tretirani triplet kombinacijama koje sadrže IL-23, IL-36-gama i OX40L.
SL. 43B pokazuje srednju vrednost zapremine tumora (mm<3>) za miševe koji nose MC38-S tumore i koji su tretirani dublet kombinacijama koje sadrže IL-23 i OX40L. Ukupna količina iRNK u dozi, u poređenju sa miševima koji su tretirani kao na SL.
43A, održavana je konstantnom dodavanjem odgovarajuće količine NST kontrolne iRNK.
SL. 44 je dijagram koji ilustruje apskopalni efekat za tretman kancera.
DETALJAN OPIS
[0092] Posebno uzbudljiv pristup lečenju kancera uključuje prevenciju ili lečenje bolesti supstancama koje stimulišu imunski odgovor, poznatim kao imunoterapija. Imunoterapija, koja se u struci označava i kao imuno-onkologija, izazvala je revoluciju u lečenju kancera, uvođenjem terapija koje ne ciljaju tumor, već imunski sistem domaćina. Ove terapije poseduju jedinstvene profile farmakološkog odgovora, i stoga predstavljaju terapije koje mogu da izleče mnoge različite tipove kancera. Kanceri pluća, bubrega, mokraćne bešike i kože su među onima koji imaju značajnu korist od lečenja imuno-onkologijom u smislu preživljavanja ili tumorskog odgovora, pri čemu melanom verovatno pokazuje najveću korist. Imunoterapija često predstavlja lečenje inhibitora kontrolne tačke sa uzbudljivom novom klasom bioloških lekova koji su poznati kao antitela prema inhibitorima kontrolne tačke.
[0093] Predmetna objava predstavlja postupke i kompozicije za lečenje kancera, posebno imunoterapijske postupke i kompozicije. U nekim aspektima, objava predstavlja postupke i kompozicije za lečenje kancera upotrebom kombinovane terapije koja predstavlja dva ili više polinukleotida (npr. iRNK) koji kodiraju prvi polipeptid prajmer imunskog odgovora i drugi, različit, polipeptid prajmer imunskog odgovora, i, opciono, polinukleotid koji kodira polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora i, opciono, polinukleotid koji kodira polipeptid inhibitor kontrolne tačke ili polipeptid koji sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke. U nekim aspektima, objava obezbeđuje imunomodulatornu kompoziciju koja sadrži polinukleotid koji kodira interleukin-23 (IL-23) polipeptid, polinukleotid koji kodira interleukin-36 gama (IL-36 gama) polipeptid i, opciono, polinukleotid koji kodira OX40L polipeptid. U drugim aspektima, objava obezbeđuje imunomodulatornu kompoziciju koja sadrži polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji kodira interleukin 18 (IL-18) polipeptid i, opciono, polinukleotid koji kodira OX40L polipeptid.
[0094] U nekim aspektima, objava se odnosi na postupke lečenja kancera upotrebom kombinovanog pristupa koji predstavlja iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36 ili IL-18 i/ili OX40L. Bez da bude vezano teorijom, veruje se da je prajmovanje antikancerskog imunskog odgovora moguće primenom, npr. intratumorski, iRNK koje kodiraju člana porodice IL-12 (npr. IL-23) i/ili člana porodice IL-1 (npr. IL-36 ili IL-18). IL-23 je važan u stimulaciji, na primer, T-ćelija, ćelija prirodnih ubica, makrofaga, i/ili dendritskih ćelija. IL-36 je važan u stimulaciji, na primer, T-ćelija, ćelija prirodnih ubica, granulocita, i/ili dendritskih ćelija. IL-18, zajedno sa IL-12, indukuje ćelijski posredovan imunitet i važan je u stimulaciji, na primer, T-ćelija, ćelija prirodnih ubica, i/ili makrofaga. Veruje se da iRNK koja kodira IL-36, ili iRNK koja kodira IL-18, u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-23 obezbeđuje prvi stimulacioni signal imunskom sistemu, na primer, unutar tumorskog okruženja, npr. putem intratumorske injekcije navedenih iRNK. Veruje se da primena iRNK koja kodira polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora, na primer OX40L, obezbeđuje drugi stimulacioni signal, kada je obezbeđena u kombinaciji sa iRNK koje kodiraju IL-23 i IL-36, usled barem delimično, sposobnosti OX40L da stimuliše T ćelije.
[0095] U nekim aspektima, imunoterapijski postupci koji su ovde objavljeni mogu (1) da transformišu mikrookruženje tumora (TME) kako bi se optimizovala imunogenost, i/ili (2) da poboljšaju T ćelijske odgovore da izazovu apskopalnu kontrolu i antikancersku memoriju. Apskopalni efekat, tj. lečenje tumora lokalno uz globalno delovanje, ilustrovano je na SL.44.
[0096] Neki aspekti objave predstavljaju lečenje sa iRNK koja kodira IL-23 u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-36. Drugi aspekti objave predstavljaju lečenje sa iRNK koja kodira IL-23 u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-18. Primeri aspekata predstavljaju lečenje sa iRNK inkapsuliranim u lipidnim nanočesticama (LNP). Primeri aspekata predstavljaju intratumorsku primenu iRNK u LNP zasnovanim na amino lipidu koji se može jonizovati.
[0097] Drugi aspekti objave predstavljaju kompozicije i postupke redukovanja ili smanjenja veličine tumora ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno primenom subjektu efikasne količine kombinacije koja sadrži iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama ili IL-18, i OX40L. U nekim aspektima, iRNK kombinacija sadrži prvi polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid. Jedan aspekt predmetne objave je usmeren na farmaceutske kompozicije koje sadrže dva ili više polinukleotida (npr. iRNK) koji kodiraju IL-23 polipeptid, polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira OX40L polipeptid.
[0098] U sledećem aspektu, kompozicija je lipidna kompozicija koja sadrži amino lipid koji se može jonizovati, kao što je jedinjenje formule (I) kao što je objavljeno u nastavku, npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48. U nekim aspektima predmetne objave, lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije sadrži dodatne lipide/komponente. Na primer, lipidna kompozicija može uključivati jedan ili više fosfolipida, npr. MSPC ili DSPC. Lipidna kompozicija takođe može da sadrži jedinjenje kvaternarnog amina kao što je DOTAP.
[0099] U sledećem aspektu, predmetna prijava obezbeđuje lipidnu kompoziciju (npr. lipidnu nanočesticu (LNP)) koja sadrži: (1) jedinjenje koje ima formulu (I); (2) opciono pomoćni lipid (npr. fosfolipid); (3) opciono strukturni lipid (npr. sterol); (4) opciono lipidni konjugat (npr. PEG-lipid); i (5) opciono jedinjenje kvaternarnog amina.
[0100] Naslovi koji su ovde obezbeđeni nisu ograničenja različitih aspekata ili aspekata objave, koji se mogu definisati pozivanjem na specifikaciju u celini. U skladu sa tim, termini definisani neposredno u nastavku su potpunije definisani pozivanjem na specifikaciju u svojoj celovitosti. Pre detaljnog opisivanja predmetne objave, treba razumeti da ova objava nije ograničena na specifične kompozicije ili korake procesa, pošto oni mogu da variraju.
I. Definicije
4
[0101] Kako bi se predmetna objava mogla lakše razumeti, prvo su definisani određeni termini. Kao što se upotrebljava u ovoj prijavi, osim ukoliko je drugačije izričito obezbeđeno ovde, svaki od sledećih termina će imati značenje izneto u nastavku. Dodatne definicije su iznete duž cele prijave.
[0102] Objava uključuje aspekte u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, angažovan u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili proces. Objava uključuje aspekte u kojima je više od jednog, ili su svi članovi grupe prisutni u, angažovani u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces.
[0103] U ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine neodređenih i određenih članova uključuju pozivanje na množinu osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Termini neodređenih članova, kao i termini "jedan ili više", i "najmanje jedan" mogu se ovde upotrebljavati naizmenično. U određenim aspektima, termin neodređenog člana znači "jedan". U drugim aspektima, termin neodređenog člana uključuje "dva ili više" ili "višestruko".
[0104] Štaviše, "i/ili" gde se ovde upotrebljava treba uzeti kao specifično objavljivanje svake od dva specificirana svojstva ili komponente sa ili bez druge. Stoga, termin "i/ili" kao što se upotrebljava u frazi kao što je "A i/ili B" ovde je namenjen da uključi "A i B", "A ili B", "A" (samo), i "B" (samo). Slično, termin "i/ili" kao što se upotrebljava u frazi kao što je "A, B, i/ili C" namenjen je da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B, i C; A, B, ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo).
[0105] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje koje uobičajeno razume onaj sa prosečnim iskustvom u struci na koju se ova objava odnosi. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; i the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, obezbeđuju onom sa iskustvom opšti rečnik mnogih termina koji se upotrebljavaju u ovoj objavi.
[0106] Gde god su aspekti ovde opisani jezikom "sadrži", inače analogni aspekti opisani terminima "sastoji se od" i/ili "sastoji se suštinski od" su takođe obezbeđeni.
[0107] Jedinice, prefiksi, i simboli su označeni u njihovom Systéme International de Unites (SI) prihvaćenom obliku. Numerički opsezi uključuju brojeve koji definišu opseg. Tamo gde se navodi opseg vrednosti, treba razumeti da se svaka celobrojna međuvrednost, i svaki njen deo, između navedene gornje i donje granice tog opsega, takođe posebno objavljuje, zajedno sa svakim podopsegom između takvih vrednosti. Gornja i donja granica bilo kog opsega mogu nezavisno da budu uključene ili isključene iz opsega, a svaki opseg gde su bilo koja, nijedna ili obe granice uključene takođe je obuhvaćen unutar objave. Tamo gde se vrednost eksplicitno navodi, treba razumeti da su vrednosti koje su oko iste količine ili iznosa kao i navedena vrednost takođe unutar obima objave. Tamo gde se objavljuje kombinacija, svaka podkombinacija elemenata te kombinacije takođe je specifično objavljena i unutar je obima objave. Suprotno tome, kada se različiti elementi ili grupe elemenata pojedinačno objavljuju, njihove kombinacije su takođe objavljene. Tamo gde se bilo koji element objave objavljuje kao da ima više alternativa, primeri te objave u kojoj je svaka alternativa isključena pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji sa drugim alternativama se takođe ovim objavljuju; više od jednog elementa objave može imati takva izuzeća, a sve kombinacije elemenata koji imaju takva izuzeća se ovim objavljuju.
[0108] Nukleotidi se označavaju njihovim opšte prihvaćenim jednoslovnim kodovima. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, nukleinske kiseline se pišu sleva nadesno u orijentaciji od 5' ka 3'. Nukleotidi se ovde označavaju njihovim opšte poznatim jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za biohemijsku nomenklaturu. U skladu sa tim, A predstavlja adenin, C predstavlja citozin, G predstavlja guanin, T predstavlja timin, i U predstavlja uracil.
[0109] Amino-kiseline se ovde označavaju bilo njihovim opšte poznatim troslovnim simbolima ili jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za biohemijsku nomenklaturu. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, amino-kiselinske sekvence se pišu sleva nadesno u orijentaciji amino ka karboksi.
[0110] Oko: Termin "oko" kao što se upotrebljava u vezi sa numeričkom vrednošću duž cele specifikacije i patentnih zahteva označava interval tačnosti, poznat i prihvatljiv osobi sa iskustvom u struci. Generalno, takav interval tačnosti je ± 10%.
[0111] Tamo gde su dati opsezi, uključene su i krajnje tačke. Štaviše, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili na drugi način evidentno iz konteksta i razumevanja onog sa prosečnim iskustvom u struci, vrednosti koje su izražene kao opsezi mogu poprimiti bilo koju specifičnu vrednost ili podopseg unutar navedenih opsega u različitim aspektima objave, do desetog dela jedinice donje granice opsega, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0112] Primenjeno u kombinaciji: Kao što se ovde upotrebljava, termin "primenjeno u kombinaciji", "kombinovana primena", ili "kombinovana terapija" znači da se dva ili više agenasa primenjuju subjektu u isto vreme ili unutar intervala tako da može biti preklapanja efekta svakog agensa na pacijenta. U nekim aspektima, oni se primenjuju ununtar oko 60, 30, 15, 10, 5, ili 1 minut jedan od drugog. U nekim aspektima, primene agenasa su raspoređene dovoljno blisko jedna uz drugu da se postiže kombinatorni (npr. sinergistički) efekat.
[0113] Amino-kiselinska supstitucija: Termin "amino-kiselinska supstitucija" označava zamenu amino-kiselinskog ostatka prisutnog u roditeljskoj ili referentnoj sekvenci (npr. sekvenci divljeg tipa) sa drugim amino-kiselinskim ostatkom. Amino-kiselina može biti supstituisana u roditeljskoj ili referentnoj sekvenci (npr. sekvenci polipeptida divljeg tipa), na primer, putem hemijske peptidne sinteze ili putem rekombinantnih postupaka koji su poznati u struci. U skladu sa tim, pozivanje na "supstituciju na poziciji X" označava supstituciju amino-kiseline prisutne na poziciji X sa alternativnim amino-kiselinskim ostatkom. U nekim aspektima, obrasci supstitucije se mogu opisati u skladu sa šemom AnY, pri čemu je A jednoslovni kod koji odgovara amino-kiselini koja je prirodno ili originalno prisutna na poziciji n, a Y je supstitucioni amino-kiselinski ostatak. U drugim aspektima, obrasci supstitucije se mogu opisati u skladu sa šemom An(YZ), pri čemu je A jednoslovni kod koji odgovara amino-kiselinskom ostatku koji supstituiše amino-kiselinu koja je prirodno ili originalno prisutna na poziciji X, a Y i Z su alternativni supstitucioni amino-kiselinski ostaci.
[0114] U kontekstu predmetne objave, supstitucije (čak i kada su označene kao aminokiselinska supstitucija) se sprovode na nivou nukleinske kiseline, tj. supstitucija aminokiselinskog ostatka sa alternativnim amino-kiselinskim ostatkom se sprovodi supstitucijom kodona koji kodira prvu amino-kiselinu sa kodonom koji kodira drugu amino-kiselinu.
[0115] Životinja: Kao što se ovde upotrebljava, termin "životinja" označava bilo kog člana životinjskog carstva. U nekim aspektima, "životinja" se odnosi na ljude u bilo kojoj fazi razvića. U nekim aspektima, "životinja" se odnosi na ne-humane životinje u bilo kojoj fazi razvića. U određenim aspektima, ne-humana životinja je sisar (npr. glodar, miš, pacov, zec, majmun, pas, mačka, ovca, govedo, primat, ili svinja). U nekim aspektima, životinje uključuju, ali nisu ograničene na, sisare, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, i crve. U nekim aspektima, životinja je transgena životinja, genetički modifikovana životinja, ili klon.
[0116] Približno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "približno", primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, označava vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim aspektima, termin "približno" označava opseg vrednosti koje spadaju unutar 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u bilo kom smeru (veće od ili manje) od navedene referentne vrednosti osim ukoliko nije drugačije navedeno ili na drugi način evidentno iz konteksta (osim kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
4
[0117] Asocirano sa: Kao što se ovde upotrebljava u vezi sa bolešću, termin "asocirano sa" znači da je simptom, mera, karakteristika, ili status u pitanju povezan sa dijagnozom, razvićem, prisustvom, ili progresijom te bolesti. Asocijacija može, ali ne mora, biti uzročno povezana sa bolešću.
[0118] Kada se upotrebljavaju u odnosu na dve ili više funkcionalnih grupa, termini "asocirani sa", "konjugovani", "povezani", "prikačeni", i "privezani", kada se upotrebljavaju u odnosu na dve ili više funkcionalnih grupa, znače da su funkcionalne grupe međusobno fizički asocirane ili povezane, bilo direktno ili putem jedne ili više dodatnih funkcionalnih grupa koje služe kao vezujući agens, kako bi se formirala struktura koja je dovoljno stabilna tako da funkcionalne grupe ostaju fizički asocirane pod uslovima u kojima se struktura upotrebljava, npr. fiziološkim uslovima. "Asocijacija" ne mora biti striktno putem direktnog kovalentnog hemijskog vezivanja. Takođe može sugerisati jonsku ili vodoničnu vezu ili povezanost zasnovanu na hibridizaciji koja je dovoljno stabilna tako da "asocirani" entiteti ostanu fizički asocirani.
[0119] Biokompatibilno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "biokompatibilno" znači kompatibilno sa živim ćelijama, tkivima, organima ili sistemima predstavljajući mali ili nikakav rizik od povrede, toksičnosti ili odbacivanja od strane imunskog sistema.
[0120] Biodegradabilno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "biodegradabilno" znači sposobno da se razloži na neškodljive proizvode delovanjem živih bića.
[0121] Optimizacija sekvence: Termin "optimizacija sekvence" označava proces ili niz procesa kojima se nukleobaze u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline zamenjuju sa alternativnim nukleobazama, što rezultuje sekvencom nukleinske kiseline sa poboljšanim svojstvima, npr. poboljšanom ekspresijom proteina ili smanjenom imunogenošću.
[0122] Generalno, cilj optimizacije sekvence je da se proizvede sinonimna nukleotidna sekvenca koja kodira istu polipeptidnu sekvencu koju kodira referentna nukleotidna sekvenca. Stoga, nema amino-kiselinskih supstitucija (kao rezultat optimizacije kodona) u polipeptidu kodiranom kodon optimizovanom nukleotidnom sekvencom u odnosu na polipeptid kodiran referentnom nukleotidnom sekvencom.
[0123] Supstitucija kodona: Termini "supstitucija kodona" ili "zamena kodona" u kontekstu optimizacije sekvence označavaju zamenu kodona prisutnog u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline sa drugim kodonom. Kodon može biti supstituisan u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline, na primer, putem hemijske peptidne sinteze ili putem rekombinantnih postupaka koji su poznati u struci. U skladu sa tim, pozivanje na "supstituciju" ili "zamenu" na određenoj lokaciji u sekvenci nukleinske kiseline (npr. iRNK) ili unutar određenog regiona ili podsekvence sekvence nukleinske kiseline (npr. iRNK) označava supstituciju kodona na takvoj lokaciji ili regionu sa alternativnim kodonom.
[0124] Kao što se ovde upotrebljava, termini "kodirajući region" i "region koji kodira" i njihove gramatičke varijante označavaju otvoreni okvir čitanja (ORF) u polinukleotidu koji nakon ekspresije daje polipeptid ili protein.
[0125] Jedinjenje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "jedinjenje" podrazumeva da uključuje sve stereoizomere i izotope prikazane strukture. Kao što se ovde upotrebljava, termin "stereoizomer" označava bilo koji geometrijski izomer (npr. cis- i trans-izomer), enantiomer, ili dijastereomer jedinjenja. Predmetna objava obuhvata bilo koji i sve stereoizomere jedinjenja koja su ovde opisana, uključujući stereomerno čiste oblike (npr. geometrijski čiste, enantiomerno čiste, ili dijastereomerno čiste) i enantiomerne i stereoizomerne smeše, npr. racemate. Enantiomerne i stereomerne smeše jedinjenja i načini njihovog razdvajanja u njihove sastavne enantiomere ili stereoizomere su dobro poznati. "Izotopi" označavaju atome koji imaju isti atomski broj, ali različite masene brojeve koji su rezultat različitog broja neutrona u jezgrima. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum. Dodatno, jedinjenje, so, ili kompleks iz predmetne objave mogu se pripremiti u kombinaciji sa molekulima rastvarača ili vode kako bi se formirali solvati i hidrati pomoću rutinskih postupaka.
[0126] Konzervativna amino-kiselinska supstitucija: "Konzervativna amino-kiselinska supstitucija" je ona u kojoj je amino-kiselinski ostatak zamenjen amino-kiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice amino-kiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, ili histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, ili cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, ili triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, ili histidin). Stoga, ukoliko je amino-kiselina u polipeptidu zamenjena drugom amino-kiselinom iz iste porodice bočnih lanaca, smatra se da je aminokiselinska supstitucija konzervativna. U sledećem aspektu, niz amino-kiselina može biti konzervativno zamenjen sa strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili kompoziciji članova porodice bočnih lanaca.
[0127] Nekonzervativne amino-kiselinske supstitucije uključuju one u kojima je (i) ostatak koji ima elektropozitivan bočni lanac (npr. Arg, His ili Lys) supstituisan za, ili pomoću, elektronegativnog ostatka (npr. Glu ili Asp), (ii) hidrofilni ostatak (npr. Ser ili Thr) je
4
supstituisan za, ili pomoću, hidrofobnog ostatka (npr. Ala, Leu, Ile, Phe ili Val), (iii) cistein ili prolin je supstituisan za, ili pomoću, bilo kog drugog ostatka, ili (iv) ostatak koji ima glomazan hidrofobni ili aromatični bočni lanac (npr. Val, His, Ile ili Trp) je supstituisan za, ili pomoću, onog koji ima manji bočni lanac (npr. Ala ili Ser) ili nema bočni lanac (npr. Gly).
[0128] Druge amino-kiselinske supstitucije mogu lako biti identifikovane od strane radnika sa prosečnim iskustvom. Na primer, za amino-kiselinu alanin, supstitucija se može uzeti od bilo koje od D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteina i D-cisteina. Za lizin, zamena može biti bilo koja od D-lizina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina, ili D-ornitina. Generalno, supstitucije u funkcionalno važnim regionima za koje se može očekivati da indukuju promene svojstava izolovanih polipeptida su one u kojima je (i) polarni ostatak, npr. serin ili treonin, supstituisan za (ili pomoću) hidrofobni ostatak, npr. leucin, izoleucin, fenilalanin ili alanin; (ii) cisteinski ostatak je supstituisan za (ili pomoću) bilo koji drugi ostatak; (iii) ostatak koji ima elektropozitivan bočni lanac, npr. lizin, arginin ili histidin, je supstituisan za (ili pomoću) ostatak koji ima elektronegativni bočni lanac, npr. glutaminsku kiselinu ili asparaginsku kiselinu; ili (iv) ostatak koji ima glomazan bočni lanac, npr. fenilalanin, je supstituisan za (ili pomoću) onaj koji nema takav bočni lanac, npr. glicin. Verovatnoća da jedna od prethodnih nekonzervativnih supstitucija može da izmeni funkcionalna svojstva proteina takođe je u korelaciji sa pozicijom supstitucije u odnosu na funkcionalno važne regione proteina: neke nekonzervativne supstitucije u skladu sa tim mogu imati mali ili nikakav efekat na biološka svojstva.
[0129] Konzervirano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "konzervirano" označava nukleotide ili amino-kiselinske ostatke polinukleotidne sekvence ili polipeptidne sekvence, respektivno, koji su oni koji se javljaju neizmenjeni na istoj poziciji dve ili više sekvenci koje se porede. Nukleotidi ili amino-kiseline koje su relativno konzervirane su one koje su konzervirane među više srodnih sekvenci nukleotida ili amino-kiselina koje se pojavljuju drugde u sekvencama.
[0130] U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "potpuno konzervirane" ukoliko su 100% identične jedna drugoj. U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "visoko konzervirane" ukoliko su najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične, ili najmanje 95% identične jedna drugoj. U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "visoko konzervirane" ukoliko su oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90% identične, oko 95%, oko 98%, ili oko 99% identične jedna drugoj. U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "konzervirane" ukoliko su najmanje 30% identične, najmanje 40% identične, najmanje 50% identične, najmanje 60% identične,
4
najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične, ili najmanje 95% identične jedna drugoj. U nekim aspektima, za dve ili više sekvenci se kaže da su "konzervirane" ukoliko su oko 30% identične, oko 40% identične, oko 50% identične, oko 60% identične, oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90% identične, oko 95% identične, oko 98% identične, ili oko 99% identične jedna drugoj. Kozervacija sekvence se može primeniti na celu dužinu polinukleotida ili polipeptida ili se može primeniti na njihov deo, region ili svojstvo.
[0131] Dovođenje u kontakt: Kao što se ovde upotrebljava, termin "dovođenje u kontakt" znači uspostavljanje fizičke veze između dva ili više entiteta. Na primer, dovođenje u kontakt ćelije sisara sa kompozicijom nanočestica znači da su ćelija sisara i nanočestica napravljene da dele fizičku vezu. Postupci dovođenja u kontakt ćelija sa spoljnim entitetima i in vivo i ex vivo su dobro poznati u biološkoj struci. Na primer, dovođenje u kontakt kompozicije nanočestica i ćelije sisara koja se nalazi unutar sisara može da se izvede različitim putevima primene (npr. intravenski, intramuskularno, intradermalno, i subkutano) i može uključivati različite količine kompozicija nanočestica. Štaviše, više od jedne ćelije sisara može biti dovedeno u kontakt sa kompozicijom nanočestica.
[0132] Kontrolisano oslobađanje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "kontrolisano oslobađanje" označava farmaceutsku kompoziciju ili profil oslobađanja jedinjenja koji je u skladu sa određenim obrascem oslobađanja kako bi se postigao terapijski ishod.
[0133] Kovalentni derivat: Termin "kovalentni derivat" kada se poziva na polipeptide uključuje modifikacije nativnog ili početnog proteina sa organskim proteinskim ili neproteinskim derivatizujućim agensom, i/ili posttranslacione modifikacije. Kovalentne modifikacije se tradicionalno introdukuju reagovanjem ciljanih amino-kiselinskih ostataka proteina sa organskim derivatizujućim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili terminusnim ostacima, ili korišćenjem mehanizama posttranslacionih modifikacija koje funkcionišu u odabranim rekombinantnim ćelijama domaćinima. Rezultujući kovalentni derivati su korisni u programima usmerenim na identifikaciju ostataka važnih za biološku aktivnost, za imunotestove, ili za pripremu anti-proteinskih antitela za imunoafinitetno prečišćavanje rekombinantnog glikoproteina. Takve modifikacije su unutar prosečnog iskustva u struci i izvode se bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0134] Ciklični ili ciklizovani: Kao što se ovde upotrebljava, termin "ciklični" označava prisustvo kontinuirane petlje. Ciklični molekuli ne moraju biti cirkularni, samo spojeni tako da formiraju neprekinuti lanac podjedinica. Ciklični molekuli kao što je projektovana RNK ili
4
iRNK iz predmetne objave mogu biti pojedinačne jedinice ili multimeri ili sadržati jednu ili više komponenti složene strukture ili strukture višeg reda.
[0135] Citotoksično: Kao što se ovde upotrebljava, "citotoksično" označava ubijanje ili uzrokovanje povrede, toksičnog, ili smrtonosnog efekta na ćeliju (npr. ćeliju sisara (npr. ljudsku ćeliju)), bakteriju, virus, gljivicu, protozou, parazita, prion, ili njihovu kombinaciju.
[0136] Isporučivanje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "isporučivanje" znači obezbeđivanje entiteta do odredišta. Na primer, isporučivanje polinukleotida subjektu može uključivati primenu kompozicije nanočestica koja uključuje polinukleotid subjektu (npr. intravenskim, intramuskularnim, intradermalnim, ili subkutanim putem). Primena kompozicije nanočestica sisaru ili sisarskoj ćeliji može uključivati dovođenje u kontakt jedne ili više ćelija sa kompozicijom nanočestica.
[0137] Agens za isporuku: Kao što se ovde upotrebljava, "agens za isporuku" označava bilo koju supstancu koja olakšava, barem delimično, in vivo, in vitro, ili ex vivo isporuku polinukleotida do ciljanih ćelija.
[0138] Destabilizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "destabilan", "destabilisati" ili "destabilizujući region" označava region ili molekul koji je manje stabilan od početnog, divljeg tipa ili nativnog oblika istog regiona ili molekula.
[0139] Detektabilni obeleživač: Kao što se ovde upotrebljava, "detektabilni obeleživač" označava jedan ili više markera, signala, ili funkcionalnih grupa koje su prikačene, inkorporisane ili asocirane sa drugim entitetom koji se lako detektuje postupcima koji su poznati u struci uključujući radiografiju, fluorescenciju, hemiluminescenciju, enzimsku aktivnost, apsorbancu i slično. Detektibilni obeleživači uključuju radioizotope, fluorofore, hromofore, enzime, boje, metalne jone, ligande kao što su biotin, avidin, streptavidin i hapteni, kvantne tačke, i slično. Detektibilni obeleživači mogu biti locirani na bilo kojoj poziciji u peptidima ili proteinima koji su ovde objavljeni. Oni mogu biti unutar aminokiselina, peptida, ili proteina, ili locirani na N- ili C-trminusima.
[0140] Dijastereomer: Kao što se ovde upotrebljava, termin "dijastereomer" označava stereoizomere koji nisu slike u ogledalu jedan drugog i koji se ne mogu preklapati jedan sa drugim.
[0141] Digestija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "digestija" znači razbiti na manje delove ili komponente. Kada se poziva na polipeptide ili proteine, digestija rezultuje proizvodnjom peptida.
[0142] Distalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "distalno" znači pozicioniran udaljeno od centra ili udaljeno od tačke ili regiona od interesa.
4
[0143] Domen: Kao što se ovde upotrebljava, kada se poziva na polipeptide, termin "domen" označava motiv polipeptida koji ima jednu ili više strukturnih ili funkcionalnih karakteristika ili svojstava koje se mogu identifikovati (npr. kapacitet vezivanja, služenje kao mesto za protein-protein interakcije).
[0144] Dozni režim: Kao što se ovde upotrebljava, "dozni režim" ili "dozni režim" je raspored primene ili režim lečenja, profilakse ili palijativnog zbrinjavanja koji odredi lekar.
[0145] Efikasna količina: Kao što se ovde upotrebljava, termin "efikasna količina" agensa je ona količina koja je dovoljna da postigne korisne ili željene rezultate, na primer, kliničke rezultate, i, kao takva, "efikasna količina" zavisi od konteksta u kom se primenjuje. Na primer, u kontekstu primene agensa koji leči tumor, efikasna količina agensa je, na primer, količina dovoljna da redukuje ili smanji veličinu tumora ili da inhibira rast tumora, u poređenju sa odgovorom koji se dobija bez primene agensa. Termin "efikasna količina" se može upotrebljavati naizmenično sa "efikasnom dozom", "terapijski efikasnom količinom", ili "terapijski efikasnom dozom".
[0146] Enantiomer: Kao što se ovde upotrebljava, termin "enantiomer" znači svaki pojedinačni optički aktivan oblik jedinjenja iz objave, koji ima optičku čistoću ili enantiomerni višak (kao što je određeno pomoću postupaka koji su standardni u struci) od najmanje 80% (tj. najmanje 90% jednog enantiomera i najviše 10% drugog enantiomera), najmanje 90%, ili najmanje 98%.
[0147] inkapsulirati: Kao što se ovde upotrebljava, termin "inkapsulirati" znači zatvoriti, okružiti ili obmotati.
[0148] Efikasnost inkapsulacije: Kao što se ovde upotrebljava, "efikasnost inkapsulacije" označava količinu polinukleotida koji postaje deo kompozicije nanočestica, u odnosu na početnu ukupnu količinu polinukleotida koji se upotrebljava u pripremi kompozicije nanočestica. Na primer, ukoliko je 97 mg polinukleotida inkapsulirano u kompoziciji nanočestica od ukupno 100 mg polinukleotida inicijalno obezbeđenih kompoziciji, efikasnost inkapsulacije se može dati kao 97%. Kao što se ovde upotrebljava, "inkapsulacija" može označavati potpuno, značajno, ili delimično zatvaranje, zarobljavanje, okruživanje ili obmotavanje.
[0149] Kodirani signal isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "kodirani signal isecanja proteina" označava nukleotidnu sekvencu koja kodira signal isecanja proteina.
[0150] Projektovano: Kao što se ovde upotrebljava, aspekti objave su "projektovani" kada su dizajnirani da imaju osobinu ili svojstvo, bilo strukturno ili hemijsko, koje varira od početne tačke, divljeg tipa ili nativnog molekula.
4
[0151] Poboljšana isporuka: Kao što se ovde upotrebljava, termin "poboljšana isporuka" znači isporuku više (npr. najmanje 1,5 puta više, najmanje 2 puta više, najmanje 3 puta više, najmanje 4 puta više, najmanje 5 puta više, najmanje 6 puta više, najmanje 7 puta više, najmanje 8 puta više, najmanje 9 puta više, najmanje 10 puta više) polinukleotida putem nanočestice u ciljno tkivo od interesa (npr. jetra sisara) u poređenju sa nivoom isporuke polinukleotida pomoću kontrolne nanočestice u ciljno tkivo od interesa (npr. MC3, KC2 ili DLinDMA). Nivo isporuke nanočestice u određeno tkivo može se izmeriti upoređivanjem količine proteina proizvedenog u tkivu sa težinom navedenog tkiva, upoređivanjem količine polinukleotida u tkivu sa težinom navedenog tkiva, upoređivanjem količine proteina proizvedenog u tkivu sa količinom ukupnog proteina u navedenom tkivu, ili upoređivanjem količine polinukleotida u tkivu sa količinom ukupnog polinukleotida u navedenom tkivu. Podrazumeva se da poboljšana isporuka nanočestice u ciljno tkivo ne mora biti određena kod subjekta koji se leči, već se može odrediti u surogatu kao što je životinjski model (npr. pacovski model).
[0152] Egzozom: Kao što se ovde upotrebljava, "egzozom" je vezikula koju sekretuju ćelije sisara ili kompleks uključen u degradaciju RNK.
[0153] Ekspresija: Kao što se ovde upotrebljava, "ekspresija" sekvence nukleinske kiseline označava jedan ili više od sledećih događaja: (1) proizvodnja RNK templata iz DNK sekvence (npr. transkripcijom); (2) obrada RNK transkripta (npr. splajsovanjem, editovanjem, formiranjem 5' kape, i/ili obradom 3' kraja); (3) translacija RNK u polipeptid ili protein; i (4) posttranslaciona modifikacija polipeptida ili proteina.
[0154] Ex vivo: Kao što se ovde upotrebljava, termin "ex vivo" označava događaje koji se dešavaju izvan organizma (npr. životinja, biljka, ili mikrob ili njihova ćelija ili tkivo). Ex vivo događaji se mogu odvijati u okruženju koje je minimalno izmenjeno u odnosu na prirodno (npr. in vivo) okruženje.
[0155] Svojstvo: Kao što se ovde upotrebljava, "svojstvo" označava karakteristiku, osobinu, ili karakteristični element. Kada se poziva na polipeptide, "svojstva" su definisana kao različite komponente molekula zasnovane na amino-kiselinskoj sekvenci. Svojstva polipeptida kodiranih polinukleotidima iz predmetne objave uključuju površinske manifestacije, lokalni konformacioni oblik, nabore, petlje, polupetlje, domene, poludomene, mesta, terminuse ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0156] Formulacija: Kao što se ovde upotrebljava, "formulacija" uključuje najmanje polinukleotid i jedan ili više od nosača, ekscipijensa, i agensa za isporuku.
[0157] Fragment: "Fragment", kao što se ovde upotrebljava, označava deo. Na primer, fragmenti proteina mogu da sadrže polipeptide dobijene digestijom proteina pune dužine izolovanog iz kultivisanih ćelija. U nekim aspektima, fragment je podsekvenca proteina pune dužine (npr. jedna od podjedinica IL-23) pri čemu je izvršena delecija N-terminusne, i/ili C-terminusne, i/ili unutrašnje podsekvence. U nekim poželjnim aspektima predmetne objave, fragmenti proteina iz predmetne objave su funkcionalni fragmenti.
[0158] Funkcionalno: Kao što se ovde upotrebljava, "funkcionalni" biološki molekul je biološki molekul u obliku u kom pokazuje osobinu i/ili aktivnost kojom se karakteriše. Stoga, funkcionalni fragment polinukleotida iz predmetne objave je polinukleotid sposoban da eksprimira funkcionalni fragment interleukina. Kao što se ovde upotrebljava, funkcionalni fragment interleukina označava fragment interleukina divljeg tipa (tj. fragment oblika interleukina koji se javlja u prirodi), ili njegov mutant ili varijantu, pri čemu fragment zadržava najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% biološke aktivnosti odgovarajućeg proteina pune dužine.
[0159] Pomoćni lipid: Kao što se ovde upotrebljava, termin "pomoćni lipid" označava jedinjenje ili molekul koji uključuje lipidnu funkcionalnu grupu (za inserciju u lipidni sloj, npr. lipidni dvosloj) i polarnu funkcionalnu grupu (za interakciju sa fiziološkim rastvorom na površini lipidnog sloja). Tipično pomoćni lipid je fosfolipid. Funkcija pomoćnog lipida je da "komplementira" amino lipid i poveća fuzogenost dvosloja i/ili da pomogne u olakšavanju bega iz endozoma, npr. nukleinske kiseline koja se isporučuje ćelijama. Takođe se veruje da su pomoćni lipidi ključna strukturna komponenta za površinu LNP.
[0160] Homologija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "homologija" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula nukleinske kiseline (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između polipeptidnih molekula. Generalno, termin "homologija" podrazumeva evolucioni odnos između dva molekula. Stoga, dva molekula koja su homologna imaće zajedničkog evolucionog pretka. U kontekstu predmetne objave, termin homologija obuhvata i identičnost i sličnost.
[0161] U nekim aspektima, smatra se da su polimerni molekuli "homologni" jedan drugom ukoliko je najmanje 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% monomera u molekulu identično (potpuno isti monomer) ili je slično
1
(konzervativne supstitucije). Termin "homologan" nužno označava poređenje između najmanje dve sekvence (polinukleotidne ili polipeptidne sekvence).
[0162] Identičnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "identičnost" označava ukupnu konzervaciju monomera između polimernih molekula, npr. između polinukleotidnih molekula (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između polipeptidnih molekula. Izračunavanje procenta identičnosti dve polinukleotidne sekvence, na primer, može da se izvede poravnanjem dve sekvence radi optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu introdukovati u jednu ili obe od prve i druge sekvence nukleinske kiseline za optimalno poravnanje i neidentične sekvence se mogu zanemariti radi poređenja). U određenim aspektima, dužina sekvence koja je poravnata radi poređenja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% dužine referentne sekvence. Zatim se porede nukleotidi na odgovarajućim pozicijama nukleotida. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istim nukleotidom kao i odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence, uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koju treba introdukovati za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići upotrebom matematičkog algoritma. Kada se porede DNK i RNK, timin (T) i uracil (U) se mogu smatrati ekvivalentnim.
[0163] Pogodni softverski programi dostupni su iz različitih izvora, i za poravnanje i proteinskih i nukleotidnih sekvenci. Jedan pogodan program za određivanje procentualne identičnosti sekvence je bl2seq, deo BLAST paketa programa koji je dostupan na web stranici Nacionalnog centra za biotehnološke informacije BLAST američke vlade (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq vrši poređenje između dve sekvence upotrebom bilo BLASTN ili BLASTP algoritma. BLASTN se upotrebljava za upoređivanje sekvenci nukleinskih kiselina, dok se BLASTP upotrebljava za upoređivanje amino-kiselinskih sekvenci. Drugi pogodni programi su, na primer, Needle, Stretcher, Water, ili Matcher, deo EMBOSS paketa bioinformatičkih programa i takođe su dostupni od Evropskog instituta za bioinformatiku (EBI) na www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
[0164] Poravnanja sekvenci se mogu sprovesti upotrebom postupaka koji su poznati u struci kao što su MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X ili Clustal Omega), MUSCLE, itd.
[0165] Različiti regioni unutar jedne polinukleotidne ili polipeptidne ciljne sekvence koja je poravnata sa polinukleotidnom ili polipeptidnom referentnom sekvencom mogu imati svaki svoj procenat identičnosti sekvence. Zapaža se da je procentualna vrednost identičnosti
2
sekvence zaokružena na najbližu desetinu. Na primer, 80,11, 80,12, 80,13, i 80,14 su zaokruženi na 80,1, dok su 80,15, 80,16, 80,17, 80,18, i 80,19 zaokruženi na 80,2. Takođe se zapaža da će vrednost dužine uvek biti ceo broj.
[0166] U određenim aspektima, procenat identičnosti "%ID" prve amino-kiselinske sekvence (ili sekvence nukleinske kiseline) sa drugom amino-kiselinskom sekvencom (ili sekvencom nukleinske kiseline) se izračunava kao %ID = 100 x (Y/Z), gde je Y je broj amino-kiselinskih ostataka (ili nukleobaza) dobijenih kao identična poklapanja u poravnanju prve i druge sekvence (kao što je poravnato vizuelnom inspekcijom ili određenim programom za poravnanje sekvence), a Z je ukupan broj ostataka u drugoj sekvenci. Ukoliko je dužina prve sekvence veća od druge sekvence, procenat identičnosti prve sekvence sa drugom sekvencom biće veći od procenta identičnosti druge sekvence sa prvom sekvencom.
[0167] Onaj sa iskustvom u struci će ceniti da generisanje poravnanja sekvence za izračunavanje procenta identičnosti sekvence nije ograničeno na binarna poređenja sekvenca -sekvenca isključivo vođeno podacima o primarnoj sekvenci. Takođe će biti cenjeno da se poravnanja sekvenci mogu generisati integracijom podataka o sekvenci sa podacima iz heterogenih izvora kao što su strukturni podaci (npr. kristalografske strukture proteina), funkcionalni podaci (npr. lokacija mutacija), ili filogenetski podaci. Pogodan program koji integriše heterogene podatke za generisanje višestrukog poravnanja sekvenci je T-Coffee, dostupan na www.tcoffee.org, a alternativno dostupan, na primer, od EBI. Takođe će biti cenjeno da konačno poravnanje koje se upotrebljava za izračunavanje procenta identičnosti sekvence može biti sprovedeno bilo automatski ili ručno.
[0168] Inhibitor imunske kontrolne tačke: "Inhibitor imunske kontrolne tačke" ili jednostavno "inhibitor kontrolne tačke" označava molekul koji sprečava da ćelije kancera isključe imunske ćelije. Kao što se ovde upotrebljava, termin inhibitor kontrolne tačke označava polipeptide (npr. antitela) ili polinukleotide koji kodiraju takve polipeptide (npr. iRNK) koji neutrališu ili inhibiraju inhibitorne molekule kontrolne tačke kao što su protein 4 asociran sa citotoksičnim T-limfocitima (CTLA-4), receptor programirane smrti 1 (PD-1), ili PD-1 ligand 1 (PD-L1).
[0169] Imunski odgovor: Termin "imunski odgovor" označava delovanje, na primer, limfocita, antigen prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita, i solubilnih makromolekula koje proizvode prethodno navedene ćelije ili jetra (uključujući antitela, citokine, i komplement) koje rezultuje selektivnim oštećenjem, uništavanjem, ili eliminacijom iz ljudskog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, ćelija kancera, ili, u slučajevima autoimunosti ili patološke inflamacije, normalnih humanih ćelija ili tkiva.
[0170] Kostimulatorni signal imunskog odgovora: Termin "kostimulatorni signal imunskog odgovora" označava imunostimulatorni molekul koji promoviše regrutovanje, proliferaciju, aktivaciju, preživljavanje, ili njihovu kombinaciju, T ćelija i/ili NK ćelija. U nekim aspektima, kostimulatorni signal imunskog odgovora je polipeptid koji poboljšava ekspanziju, funkciju i formiranje memorije T-ćelija (npr. OX40L). U nekim aspektima, kostimulatorni signal promoviše razvoj Th1, Th2 i/ili Th9, suprimira razvoj ili aktivnost Treg, poboljšava ekspanziju i/ili preživljavanje CD4 i/ili CD8 T ćelija i/ili promoviše memorijske ćelije. U specifičnim aspektima, polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora je odabran iz grupe koja se sastoji od: OX40L, CD80, i IL-15. U nekim specifičnim aspektima, polipeptid kostimulatorni signal imunskog odgovora je odabran iz grupe koja se sastoji od OX40L i CD80.
[0171] Prajmer imunskog odgovora: Termin "prajmer imunskog odgovora" označava imunostimulatorni molekul koji poboljšava prezentaciju i/ili prepoznavanje antigena. U nekim aspektima, prajmer imunskog odgovora je polipeptid koji prajmuje dendritske ćelije, promoviše maturaciju dendritskih ćelija, promoviše proizvodnju citokina/hemokina u antigen prezentujućim ćelijama, umnožava i/ili održava Thl7 ćelije, poboljšava proliferaciju T ćelija i/ili poboljšava diferencijaciju Th1 i/ili Th9. U nekim aspektima, prajmer imunskog odgovora je član porodice IL-12 (npr. IL-12, IL-23, IL-12p40 podjedinica, IL-23p19 podjedinica, IL-27, IL-35). U drugim aspektima, prajmer imunskog odgovora je član porodice IL-1 (npr. IL-1α, IL-1β, IL-IRa, IL-18, IL-33, IL-36Ra, IL-36α, IL-36β, IL-36γ, IL-37, IL-38). U nekim aspektima, prajmer imunskog odgovora je polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od: IL-23, IL-12p40 podjedinice, IL-23p19 podjedinice, IL-12, IL-36-gama, i IL-18.
[0172] Inflamatorni odgovor: "Inflamatorni odgovor" označava imunske odgovore koji uključuju specifične i nespecifične odbrambene sisteme. Reakcija specifičnog odbrambenog sistema je specifična reakcija imunskog sistema na antigen. Primeri reakcija specifičnog odbrambenog sistema uključuju odgovore antitela. Reakcija nespecifičnog odbrambenog sistema je inflamatorni odgovor koji je posredovan leukocitima koji su generalno nesposobni za imunološku memoriju, na primer, makrofagi, eozinofili i neutrofili. U nekim aspektima, imunski odgovor uključuje sekreciju inflamatornih citokina, što rezultuje povišenim nivoima inflamatornih citokina.
[0173] Inflamatorni citokini: Termin "inflamatorni citokin" označava citokine koji su povišeni u inflamatornom odgovoru. Primeri inflamatornih citokina uključuju interleukin-6 (IL-6), CXCL1 (hemokin (C-X-C motiv) ligand 1; takođe poznat kao GROα, interferon-γ (IFNγ), faktor nekroze tumora α (TNFα), interferon γ-indukovani protein 10 (IP-10), ili faktor
4
stimulacije kolonija granulocita (G-CSF). Termin inflamatorni citokini uključuje i druge citokine asocirane sa inflamatornim odgovorima koji su poznati u struci, npr. interleukin-1 (IL-1), interleukin-8 (IL-8), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interferon α (IFN-α) itd.
[0174] In vitro: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vitro" označava događaje koji se dešavaju u veštačkoj sredini, npr. u epruveti ili reakcionoj posudi, u ćelijskoj kulturi, u Petrijevoj šolji, itd. pre nego unutar organizma (npr. životinja, biljka, ili mikrob).
[0175] In vivo: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vivo" označava događaje koji se dešavaju unutar organizma (npr. životinja, biljka, ili mikrob ili njihova ćelija ili tkivo).
[0176] Insercione i delecione varijante: "Insercione varijante" kada se poziva na polipeptide su one sa izvršenom insercijom jedne ili više amino-kiselina neposredno pored amino-kiseline na određenoj poziciji u nativnoj ili početnoj sekvenci. "Neposredno pored" amino-kiseline znači povezan bilo sa alfa-karboksi ili alfa-amino funkcionalnom grupom amino-kiseline. "Delecione varijante" kada se poziva na polipeptide su one sa izvršenim uklanjanjem jedne ili više amino-kiselina u nativnoj ili početnoj amino-kiselinskoj sekvenci. Uobičajeno, delecione varijante će imati deleciju jedne ili više amino-kiselina u određenom regionu molekula.
[0177] Intaktno: Kao što se ovde upotrebljava, u kontekstu polipeptida, termin "intaktno" znači zadržavanje amino-kiseline koja odgovara proteinu divljeg tipa, npr. ne mutira ili ne supstituiše amino-kiselinu divljeg tipa. Suprotno tome, u kontekstu nukleinske kiseline, termin "intaktno" znači zadržavanje nukleobaze koja odgovara nukleinskoj kiselini divljeg tipa, npr. ne mutira ili ne supstituiše nukleobazu divljeg tipa.
[0178] Amino lipid koji se može jonizovati: Termin "amino lipid koji se može jonizovati" uključuje one lipide koji imaju jedan, dva, tri, ili više lanaca masnih kiselina ili masnih alkila i pH-titracionu amino grupu (npr. alkilamino ili dialkilamino glavenu grupu). Amino lipid koji se može jonizovati je tipično protonovan (tj. pozitivno naelektrisan) pri pH ispod pKa glavene amino grupe i suštinski nije naelektrisan pri pH iznad pKa. Takvi amino lipidi koji se mogu jonizovati uključuju, ali nisu ograničeni na DLin-MC3-DMA (MC3) i (13Z,165Z)-N,N-dimetil-3-nonidokoza-13-16-dien-1-amin (L608).
[0179] In vitro: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vitro" označava događaje koji se dešavaju u veštačkoj sredini, npr. u epruveti ili reakcionoj posudi, u ćelijskoj kulturi, u Petrijevoj šolji, itd. pre nego unutar organizma (npr. životinja, biljka, ili mikrob).
[0180] In vivo: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vivo" označava događaje koji se dešavaju unutar organizma (npr. životinja, biljka, ili mikrob ili njihova ćelija ili tkivo).
[0181] Izolovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "izolovano" označava supstancu ili entitet koji je odvojen od najmanje nekih komponenti sa kojima je bio asociran (bilo u prirodi ili u eksperimentalnom okruženju). Izolovane supstance (npr. nukleotidna sekvenca ili proteinska sekvenca) mogu imati različite nivoe čistoće u odnosu na supstance sa kojima su asocirane. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se odvojiti od najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, ili više drugih komponenti sa kojima su u početku bili asocirani. U nekim aspektima, izolovani agensi su više od oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% čisti. Kao što se ovde upotrebljava, supstanca je "čista" ukoliko je suštinski bez drugih komponenti. Termin "suštinski izolovano" znači da je jedinjenje suštinski odvojeno od sredine u kojoj je formirano ili detektovano. Delimično odvajanje može uključivati, na primer, kompoziciju obogaćenu jedinjenjem iz predmetne objave. Suštinsko odvajanje može uključivati kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% po težini jedinjenja iz predmetne objave, ili njegove soli.
[0182] Polinukleotid, vektor, polipeptid, ćelija, ili bilo koja kompozicija koja je ovde objavljena koja je "izolovana" je polinukleotid, vektor, polipeptid, ćelija, ili kompozicija koja je u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polinukleotidi, vektori, polipeptidi, ili kompozicije uključuju one koje su prečišćene do stepena da više nisu u obliku u kome se nalaze u prirodi. U nekim aspektima, polinukleotid, vektor, polipeptid, ili kompozicija koja je izolovana je suštinski čista.
[0183] Izomer: Kao što se ovde upotrebljava, termin "izomer" znači bilo koji tautomer, stereoizomer, enantiomer, ili dijastereomer bilo kog jedinjenja iz objave. Prepoznato je da jedinjenja iz objave mogu imati jedan ili više hiralnih centara i/ili dvostrukih veza i, prema tome, postojati kao stereoizomeri, kao što su izomeri sa dvostrukom vezom (tj. geometrijski E/Z izomeri) ili dijastereomeri (npr. enantiomeri (tj. (+) ili (-)) ili cis/trans izomeri). U skladu sa objavom, hemijske strukture koje su ovde prikazane, a prema tome i jedinjenja iz objave, obuhvataju sve odgovarajuće stereoizomere, to jest, i stereomerno čist oblik (npr. geometrijski čist, enantiomerno čist, ili dijastereomerno čist) i enantiomerne i stereoizomerne smeše, npr. racemate. Enantiomerne i stereoizomerne smeše jedinjenja iz objave se tipično mogu razdvojiti u svoje sastavne enantiomere ili stereoizomere pomoću dobro koji su poznati postupaka, kao što su gasna hromatografija na hiralnoj fazi, tečna hromatografija visokih performansi na hiralnoj fazi, kristalizacija jedinjenja kao kompleksa hiralne soli, ili kristalizovanje jedinjenja u hiralnom rastvaraču. Enantiomeri i stereoizomeri se takođe mogu dobiti iz stereomerno ili enantiomerno čistih intermedijera, reagenasa, i katalizatora dobro poznatim asimetričnim sintetičkim postupcima.
[0184] Linker: Kao što se ovde upotrebljava, "linker" označava grupu atoma, npr. 10-1.000 atoma, i može sadržati atome ili grupe kao što su, ali ne ograničavajući se na, ugljenik, amino, alkilamino, kiseonik, sumpor, sulfoksid, sulfonil, karbonil, i imin. Linker može biti prikačen za modifikovani nukleozid ili nukleotid na nukleobazi ili funkcionalnoj grupi šećera na prvom kraju, i za korisni tovar, npr. detektabilni ili terapijski agens, na drugom kraju. Linker može biti dovoljne dužine da ne ometa inkorporaciju u sekvencu nukleinske kiseline. Linker se može upotrebljavati za bilo koju korisnu svrhu, kao što je formiranje polinukleotidnih multimera (npr. preko povezivanja dva ili više himernih polinukleotidnih molekula ili IVT polinukleotida) ili polinukleotidnih konjugata, kao i za primenu korisnog tovara, kao što je ovde opisano. Primeri hemijskih grupa koje se mogu inkorporisati u linker uključuju, ali nisu ograničene na, alkil, alkenil, alkinil, amido, amino, etar, tioetar, estar, alkilen, heteroalkilen, aril, ili heterociklil, od kojih svaki može biti opciono supstituisan, kao što je ovde opisano. Primeri linkera uključuju, ali nisu ograničeni na, nezasićene alkane, polietilen glikole (npr. monomerne jedinice etilen ili propilen glikola, npr. dietilen glikol, dipropilen glikol, trietilen glikol, tripropilen glikol, tetraletilen glikol, ili tetraletilen glikol), ili polimere dekstrana i njihove derivate. Drugi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, funkcionalne grupe koje se mogu isecati unutar linkera, kao što je, na primer, disulfidna veza (-S-S-) ili azo veza (-N=N-), koje se mogu isecati upotrebom redukujućeg agensa ili fotolizom. Neograničavajući primeri selektivno isecive veze uključuju amido vezu koja se može isecati na primer upotrebom tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), ili drugih redukujućih agenasa, i/ili fotolizom, kao i estarsku vezu koja se može isecati na primer kiselom ili baznom hidrolizom.
[0185] Postupci primene: Kao što se ovde upotrebljava, "postupci primene" mogu uključivati intravenske, intramuskularne, intradermalne, subkutane, ili druge postupke isporučivanja kompozicije subjektu. Postupak primene se može odabrati tako da cilja isporuku (npr. da se specifično isporuči) u specifični region ili sistem tela.
[0186] Modifikovano: Kao što se ovde upotrebljava, "modifikovano" označava promenjeno stanje ili strukturu molekula iz objave. Molekuli se mogu modifikovati na mnogo načina, uključujući hemijski, strukturno, i funkcionalno. U nekim aspektima, molekuli iRNK iz predmetne objave su modifikovani introdukovanjem neprirodnih nukleozida i/ili nukleotida, npr. kao što se odnosi na prirodne ribonukleotide A, U, G, i C. Nekanonski nukleotidi kao što su strukture kape ne smatraju se "modifikovanim" iako se razlikuju od hemijske strukture A, C, G, U ribonukleotida.
[0187] Kompozicija nanočestica: Kao što se ovde upotrebljava, "kompozicija nanočestica" je kompozicija koja sadrži jedan ili više lipida. Kompozicije nanočestica su tipično reda veličine mikrometara ili manje i mogu uključivati lipidni dvosloj. Kompozicije nanočestica obuhvataju lipidne nanočestice (LNP), lipozome (npr. lipidne vezikule), i lipoplekse. Na primer, kompozicija nanočestica može biti lipozom koji ima lipidni dvosloj, prečnika 500 nm ili manje.
[0188] Koji se javlja u prirodi: Kao što se ovde upotrebljava, "koji se javlja u prirodi" znači postojanje u prirodi bez veštačke pomoći.
[0189] Ne-humani vertebrat: Kao što se ovde upotrebljava, "ne-humani vertebrat" uključuje sve vertebrate osim Homo sapiensa, uključujući divlje i pripitomljene vrste. Primeri nehumanih vertebrata uključuju, ali nisu ograničeni na, sisare, kao što su alpaka, banteng, bizon, kamila, mačka, govedo, jelen, pas, magarac, gajal, koza, zamorac, konj, lama, mazga, svinja, zec, irvas, ovca, vodeni bivo, i jak.
[0190] Sekvenca nukleinske kiseline: Termini "sekvenca nukleinske kiseline", "nukleotidna sekvenca", ili "polinukleotidna sekvenca" upotrebljavaju se naizmenično i označavaju neprekidnu sekvencu nukleinske kiseline. Sekvenca može biti bilo jednolančana ili dvolančana DNK ili RNK, npr. iRNK.
[0191] Termin "nukleinska kiselina", u svom najširem smislu, uključuje bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja sadrži polimer nukleotida. Ovi polimeri se često označavaju kao polinukleotidi. Primeri nukleinskih kiselina ili polinukleotida iz objave uključuju, ali nisu ograničeni na, ribonukleinske kiseline (RNK), dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), treoza nukleinske kiseline (TNA), glikol nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA), zaključane nukleinske kiseline (LNA, uključujući LNA koja ima β-D-ribo konfiguraciju, α-LNA koja ima α-L-ribo konfiguraciju (dijastereomer LNA), 2'-amino-LNA koja ima 2'-amino funkcionalizaciju, i 2'-amino-α LNA koja ima 2'-amino funkcionalizaciju), etilen nukleinske kiseline (ENA), cikloheksenil nukleinske kiseline (CeNA) ili njihove hibride ili kombinacije.
[0192] Fraza "kodiranje nukleotidne sekvence" označava kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline (npr. iRNK ili DNK molekul) koja kodira polipeptid. Kodirajuća sekvenca može dodatno da uključuje signale inicijacije i terminacije koji su operativno povezani sa regulatornim elementima, uključujući promotor i signal poliadenilacije koji su sposobni da usmere ekspresiju u ćelijama pojedinca ili sisara kojima se nukleinska kiselina primenjuje. Kodirajuća sekvenca može dodatno da uključuje sekvence koje kodiraju signalne peptide.
[0193] Nespecifično (Off-target): Kao što se ovde upotrebljava, "nespecifično" označava bilo koji nenamenjeni efekat na bilo koji jedan ili više ciljeva, gena, ili ćelijskih transkripata.
[0194] Otvoreni okvir čitanja: Kao što se ovde upotrebljava, "otvoreni okvir čitanja" ili "ORF" označava sekvencu koja ne sadrži stop kodon u datom okviru čitanja.
[0195] Operativno povezan: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "operativno povezan" označava funkcionalnu vezu između dva ili više molekula, konstrukata, transkripata, entiteta, funkcionalnih grupa ili slično.
[0196] Opciono supstituisan: Ovde je namenjeno da fraza oblika "opciono supstituisani X" (npr. opciono supstituisani alkil) bude ekvivalentna sa "X, pri čemu je X opciono supstituisan" (npr. "alkil, pri čemu je navedeni alkil opciono supstituisan"). Nije namenjeno da znači da je svojstvo "X" (npr. alkil) samo po sebi opciono.
[0197] Deo: Kao što se ovde upotrebljava, "deo" ili "region" polinukleotida je definisan kao bilo koji deo polinukleotida koji je manji od cele dužine polinukleotida.
[0198] Pacijent: Kao što se ovde upotrebljava, "pacijent" označava subjekta koji može da traži ili mu je potrebno lečenje, koji zahteva lečenje, koji se leči, koji će biti na lečenju, ili subjekta koji je pod negom obučenog stručnjaka za određenu bolest ili stanje.
[0199] Farmaceutski prihvatljivo: Fraza "farmaceutski prihvatljivo" se ovde koristi da označi ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne oblike koji su, unutar zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu koristi/riziku.
[0200] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi: Fraza "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens", kao što se ovde upotrebljava, označava bilo koji sastojak drugi nego ovde opisana jedinjenja (na primer, vehikulum sposoban da suspenduje ili rastvori aktivno jedinjenje) i koji ima svojstva da je suštinski netoksičan i neinflamatoran u pacijentu. Ekscipijensi mogu uključivati, na primer: antiadherente, antioksidanse, bajndere, obloge, sredstva za komprimovanje, dezintegrante, farbe (boje), omekšivače, emulgatore, filere (razblaživače), sredstva za formiranje filma ili obloge, arome, mirise, glidante (pojačivače protoka), lubrikante, konzervanse, štamparske boje, sorbente, agense za suspendovanje ili dispergovanje, zaslađivače, i vode za hidrataciju. Primeri ekscipijenasa uključuju, ali nisu ograničeni na: butilisani hidroksitoluen (BHT), kalcijum karbonat, kalcijum fosfat (dibazni), kalcijum stearat, kroskarmelozu, umreženi polivinil pirolidon, limunsku kiselinu, krospovidon, cistein, etilcelulozu, želatin, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, laktozu, magnezijum stearat, maltitol, manitol, metionin, metilcelulozu, metil paraben, mikrokristalnu celulozu, polietilen glikol, polivinil pirolidon, povidon, preželatinizovani skrob, propil paraben, retinil palmitat, šelak, silicijum dioksid, natrijum karboksimetil celulozu, natrijum citrat, natrijum skrob glikolat, sorbitol, skrob (kukuruzni), stearinsku kiselinu, saharozu, talk, titanijum dioksid, vitamin A, vitamin E, vitamin C, i ksilitol.
[0201] Farmaceutski prihvatljive soli: Predmetna objava takođe uključuje farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja koja su ovde opisana. Kao što se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatljive soli" označava derivate jedinjenja koja su objavljena pri čemu je roditeljsko jedinjenje modifikovano konvertovanjem postojeće kiseline ili baze u njen oblik soli (npr. reagovanjem slobodne bazne grupe sa odgovarajućom organskom kiselinom). Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ograničeni na, mineralne ili organske kisele soli baznih ostataka kao što su amini; alkalne ili organske soli kiselih ostataka kao što su karboksilne kiseline; i slično. Reprezentativne kisele adicione soli uključuju acetat, sirćetnu kiselinu, adipat, alginat, askorbat, aspartat, benzensulfonat, benzen sulfonsku kiselinu, benzoat, bisulfat, borat, butirat, kamforat, kamforsulfonat, citrat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptonat, glicerofosfat, hemisulfat, heptonat, heksanoat, hidrobromid, hidrohlorid, hidrojodid, 2-hidroksi-etansulfonat, laktobionat, laktat, laurat, lauril sulfat, malat, maleat, malonat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, nitrat, oleat, oksalat, palmitat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, fosfat, pikrat, pivalat, propionat, stearat, sukcinat, sulfat, tartarat, tiocijanat, toluensulfonat, undekanoat, valeratne soli, i slično. Reprezentativne soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala uključuju natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, i slično, kao i netoksični amonijum, kvaternarni amonijum, i amin katjone, uključujući, ali ne ograničavajući se na amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, trietilamin, etilamin, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli iz predmetne objave uključuju konvencionalne netoksične soli roditeljskog jedinjenja formirane, na primer, od netoksičnih neorganskih ili organskih kiselina. Farmaceutski prihvatljive soli iz predmetne objave mogu se sintetisati iz roditeljskog jedinjenja koje sadrži baznu ili kiselu funkcionalnu grupu pomoću konvencionalnih hemijskih postupaka. Generalno, takve soli se mogu pripremiti reagovanjem slobodnih kiselih ili baznih oblika ovih jedinjenja sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva; generalno, upotrebljavaju se nevodeni medijumi kao što su etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril. Liste pogodnih soli nalaze se u Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, i Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977).
[0202] Farmaceutski prihvatljiv solvat: Termin "farmaceutski prihvatljiv solvat", kao što se ovde upotrebljava, znači jedinjenje iz objave pri čemu su molekuli pogodnog rastvarača inkorporisani u kristalnu rešetku. Pogodan rastvarač je fiziološki podnošljiv u primenjenoj dozi. Na primer, solvati se mogu pripremiti kristalizacijom, rekristalizacijom, ili precipitacijom iz rastvora koji uključuje organske rastvarače, vodu, ili njihovu smešu. Primeri pogodnih rastvarača su etanol, voda (na primer, mono-, di-, i trihidrati), N-metilpirolidinon (NMP), dimetil sulfoksid (DMSO), N,N'-dimetilformamid (DMF), N,N'-dimetilacetamid (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinon (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinon (DMPU), acetonitril (ACN), propilen glikol, etil acetat, benzil alkohol, 2-pirolidon, benzil benzoat, i slično. Kada je voda rastvarač, solvat se označava kao "hidrat".
[0203] Farmakokinetika: Kao što se ovde upotrebljava, "farmakokinetika" označava bilo koje jedno ili više svojstava molekula ili jedinjenja u vezi sa određivanjem sudbine supstanci koje se primenjuju živom organizmu. Farmakokinetika je podeljena na nekoliko oblasti uključujući obim i stopu apsorpcije, distribuciju, metabolizam i izlučivanje. Ovo je uobičajeno označeno kao ADME gde: (A) Apsorpcija je proces ulaska supstance u krvotok; (D) Distribucija je disperzija ili diseminacija supstanci kroz tečnosti i tkiva tela; (M) Metabolizam (ili biotransformacija) je ireverzibilna transformacija roditeljskih jedinjenja u ćerke metabolite; i (E) Izlučivanje (ili Eliminacija) označava eliminaciju supstanci iz tela. U retkim slučajevima, neki lekovi se ireverzibilno akumuliraju u tkivu tela.
[0204] Fizičkohemijsko: Kao što se ovde upotrebljava, "fizičkohemijsko" znači ili se odnosi na fizičko i/ili hemijsko svojstvo.
[0205] Polinukleotid: Termin "polinukleotid" kao što se ovde upotrebljava označava polimere nukleotida bilo koje dužine, uključujući ribonukleotide, dezoksiribonukleotide, njihove analoge, ili njihove smeše. Ovaj termin označava primarnu strukturu molekula. Stoga, termin uključuje trolančanu, dvolančanu i jednolančanu dezoksiribonukleinsku kiselinu ("DNK"), kao i trolančanu, dvolančanu i jednolančanu ribonukleinsku kiselinu ("RNK"). Takođe uključuje modifikovane, na primer alkilacijom, i/ili dodavanjem kape, i nemodifikovane oblike polinukleotida. Konkretnije, termin "polinukleotid" uključuje polidezoksiribonukleotide (koji sadrže 2-dezoksi-D-ribozu), poliribonukleotide (koji sadrže D-ribozu), uključujući tRNA, rRNK, hRNA, siRNA i iRNK, bilo da su splajsovani ili
1
nesplajsovani, bilo koji drugi tip polinukleotida koji je N- ili C-glikozid purinske ili pirimidinske baze, i druge polimere koji sadrže normukleotidne okosnice, na primer, poliamid (npr. peptidne nukleinske kiseline "PNA") i polimorfolino polimere, i druge sintetičke polimere nukleinske kiseline specifične za sekvencu pod uslovom da polimeri sadrže nukleobaze u konfiguraciji koja omogućava sparivanje baza i slaganje baza, kao što se nalazi u DNK i RNK. U posebnim aspektima, polinukleotid sadrži iRNK. U drugom aspektu, iRNK je sintetička iRNK. U nekim aspektima, sintetička iRNK sadrži najmanje jednu neprirodnu nukleobazu. U nekim aspektima, sve nukleobaze određene klase su zamenjene neprirodnim nukleobazama (npr. svi uridini u polinukleotidu koji je ovde objavljen mogu biti zamenjeni neprirodnom nukleobazom, npr. 5-metoksiuridinom). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. sintetička RNK ili sintetička DNK) sadrži samo prirodne nukleobaze, tj. A, C, T, i U u slučaju sintetičke DNK, ili A, C, T, i U u slučaju sintetičke RNK.
[0206] Iskusan stručnjak će ceniti da su T baze u mapama kodona koje su ovde objavljene prisutne u DNK, dok bi T baze bile zamenjene U bazama u odgovarajućim RNK. Na primer, kodon-nukleotidna sekvenca koja je ovde objavljena u obliku DNK, npr. vektor ili templat za in-vitro translaciju (IVT), imaće svoje T baze transkribovane kao U zasnovano na svojoj odgovarajućoj transkribovanoj iRNK. U tom pogledu, obe kodon optimizovane DNK sekvence (koje sadrže T) i njihove odgovarajuće RNK sekvence (koje sadrže U) se smatraju kodon optimizovanom nukleotidnom sekvencom iz predmetne objave. Iskusan stručnjak bi takođe razumeo da se ekvivalentne mape kodona mogu generisati zamenom jedne ili više baza neprirodnim bazama. Stoga, npr. TTC kodon (DNK mapa) odgovarao UUC kodonu (RNK mapa), koji bi zauzvrat odgovarao ΨΨC kodonu (RNK mapa u kojoj je U zamenjen pseudouridinom).
[0207] Standardni A-T i G-C bazni parovi se formiraju pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje vodoničnih veza između N3-H i C4-oksi timidina i N1 i C6-NH2, respektivno, adenozina i između C2-oksi, N3 i C4-NH2, citidina i C2-NH2, N'-H i C6-oksi, respektivno, guanozina. Stoga, na primer, guanozin (2-amino-6-oksi-9-β-D-ribofuranozil-purin) može biti modifikovan da formira izoguanozin (2-oksi-6-amino-9-β-D-ribofuranozil-purin). Takva modifikacija rezultuje nukleozidnom bazom koja više neće efikasno formirati standardni bazni par sa citozinom. Međutim, modifikacija citozina (1-β-D-ribofuranozil-2-oksi-4-aminopirimidin) kako bi se formirao izocitozin (1-β-D-ribofuranozil-2-amino-4-oksi-pirimidin) rezultuje modifikovanim nukleotidom koji se neće efikasno bazno sparivati sa guanozinom, ali će formirati bazni par sa izoguanozinom (S.A.D. pat. br. 5,681,702 od Collins et al.). Izocitozin je dostupan od Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); izocitidin se može pripremiti
2
postupkom koji su opisali Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 i po referencama koje su tamo citirane; 2'-dezoksi-5-metil-izocitidin se može pripremiti postupkom prema Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467, i tamo citiranim referencama; i izoguaninski nukleotidi se mogu pripremiti upotrebom postupka koji su opisali Switzer et al., 1993, supra, i Mantsch et al. (1993) Biochem. 14:5593-5601, ili postupkom koji je opisan u S.A.D. pat. br.5,780,610 od Collins et al. Drugi neprirodni bazni parovi mogu se sintetisati postupkom koji je opisan u Piccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37, za sintezu 2,6-diaminopirimidina i njegovog komplementa (1-metilpirazolo-[4,3]pirimidin-5,7-(4H,6H)-diona. Druge takve modifikovane nukleotidne jedinice koje formiraju jedinstvene bazne parove su poznate, kao što su one opisane u Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc.114:3675-3683 i Switzer et al., supra.
[0208] Sekvenca nukleinske kiseline: Termini "sekvenca nukleinske kiseline", "nukleotidna sekvenca", ili "polinukleotid" se upotrebljavaju naizmenično i označavaju neprekidnu sekvencu nukleinske kiseline. Sekvenca može biti bilo jednolančana ili dvolančana DNK ili RNK, npr. iRNK.
[0209] Fraza "nukleotidna sekvenca koja kodira" i njene varijante označavaju kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline (npr. iRNK ili DNK molekula) koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid ili njegov funkcionalni fragment kao što je ovde izneto. Kodirajuća sekvenca može dodatno da uključuje signale inicijacije i terminacije koji su operativno povezani sa regulatornim elementima, uključujući promotor i signal poliadenilacije koji su sposobni da usmere ekspresiju u ćelijama pojedinca ili sisara kojima se nukleinska kiselina primenjuje. Kodirajuća sekvenca može dodatno da uključuje sekvence koje kodiraju signalne peptide.
[0210] Polipeptid: Termini "polipeptid", "peptid", i "protein" se ovde upotrebljavaju naizmenično da označe polimere amino-kiselina bilo koje dužine. Polimer može da sadrži modifikovane amino-kiseline. Termini takođe obuhvataju polimer amino-kiseline koji je modifikovan prirodnim putem ili intervencijom; na primer, formiranjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Unutar definicije su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga amino-kiseline (uključujući, na primer, neprirodne amino-kiseline kao što su homocistein, ornitin, p-acetilfenilalanin, D-amino-kiseline, i kreatin), kao i druge modifikacije poznate u struci.
[0211] Termin, kao što se ovde upotrebljava, označava proteine, polipeptide, i peptide bilo koje veličine, strukture, ili funkcije. Polipeptidi uključuju genske proizvode, polipeptide koji se javljaju u prirodi, sintetičke polipeptide, homologe, ortologe, paraloge, fragmente i druge ekvivalente, varijante, i analoge prethodnog. Polipeptid može biti pojedinačni polipeptid ili može biti multi-molekulski kompleks kao što je dimer, trimer ili tetramer. Oni takođe mogu da sadrže jednolančane ili višelančane polipeptide. Najčešće se disulfidne veze nalaze u višelančanim polipeptidima. Termin polipeptid se takođe može primeniti na polimere aminokiselina u kojima su jedan ili više amino-kiselinskih ostataka veštački hemijski analog odgovarajuće amino-kiseline koja se javlja u prirodi. U nekim aspektima, "peptid" može biti kraći od ili jednak dužini od 50 amino-kiselina, npr. dužine oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 amino-kiselina.
[0212] Polipeptidna varijanta: Kao što se ovde upotrebljava, termin "polipeptidna varijanta" označava molekule koji se razlikuju u svojoj amino-kiselinskoj sekvenci od nativne ili referentne sekvence. Varijante amino-kiselinske sekvence mogu posedovati supstitucije, delecije, i/ili insercije na određenim pozicijama unutar amino-kiselinske sekvence, u poređenju sa nativnom ili referentnom sekvencom. Uobičajeno, varijante će posedovati najmanje oko 50% identičnosti, najmanje oko 60% identičnosti, najmanje oko 70% identičnosti, najmanje oko 80% identičnosti, najmanje oko 90% identičnosti, najmanje oko 95% identičnosti, najmanje oko 99% identičnosti sa nativnom ili referentnom sekvencom. U nekim aspektima, one će biti najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90% identične nativnoj ili referentnoj sekvenci.
[0213] Polipeptid po jedinici leka (PUD): Kao što se ovde upotrebljava, PUD ili proizvod po jedinici leka, definisan je kao podeljeni deo ukupne dnevne doze, uobičajeno 1 mg, pg, kg, itd. proizvoda (kao što je polipeptid) kao što je izmereno u telesnoj tečnosti ili tkivu, uobičajeno definisano u koncentraciji kao što su pmol/ml, mmol/ml, itd. podeljeno sa merom u telesnoj tečnosti.
[0214] Preveniranje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "preveniranje" označava delimično ili potpuno odlaganje početka infekcije, bolesti, poremećaja i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje početka jednog ili više simptoma, svojstava, ili kliničkih manifestacija određene infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje početka jednog ili više simptoma, svojstava, ili manifestacija određene infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje progresije infekcije, određene bolesti, poremećaja i/ili stanja; i/ili smanjenje rizika od razvoja patologije povezane sa infekcijom, bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.
4
[0215] Prolek: Predmetna objava takođe uključuje prolekove jedinjenja koja su ovde opisana. Kao što se ovde upotrebljava, "prolekovi" označavaju bilo koju supstancu, molekul ili entitet koji je u obliku osnove za tu supstancu, molekul ili entitet da deluje kao terapeutik nakon hemijske ili fizičke izmene. Prolekovi se mogu kovalentno vezati ili sekvestrirati na neki način i koji se oslobađaju ili se konvertuju u aktivni deo leka pre, nakon ili posle primene subjektu sisaru. Prolekovi se mogu pripremiti modifikovanjem funkcionalnih grupa koje su prisutne u jedinjenjima na takav način da se modifikacije isecaju, bilo u rutinskoj manipulaciji ili in vivo, do roditeljskih jedinjenja. Prolekovi uključuju jedinjenja u kojima su hidroksilne, amino, sulfhidrilne, ili karboksilne grupe vezane za bilo koju grupu koja se, kada se primeni subjektu sisaru, iseca kako bi formirala slobodnu hidroksilnu, amino, sulfhidrilnu, ili karboksilnu grupu respektivno. O pripremi i upotrebi prolekova raspravlja se u T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, i u Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
[0216] Proliferisati: Kao što se ovde upotrebljava, termin "proliferisati" znači rasti, umnožiti se ili povećati ili uzrokovati da raste, umnožava se ili raste brzo. "Proliferativno" znači imati sposobnost da proliferiše. "Anti-proliferativno" znači da ima svojstva koja su suprotna ili nepogodna proliferativnim svojstvima.
[0217] Profilaktički: Kao što se ovde upotrebljava, "profilaktički" označava terapeutik ili tok delovanja koji se upotrebljava za preveniranje širenja bolesti.
[0218] Profilaksa: Kao što se ovde upotrebljava, "profilaksa" označava meru preduzetu za održavanje zdravlja i preveniranje širenja bolesti. "Imunska profilaksa" označava meru za stvaranje aktivnog ili pasivnog imuniteta kako bi se preveniralo širenje bolesti.
[0219] Mesto isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "mesto isecanja proteina" označava mesto gde se kontrolisano isecanje lanca amino-kiselina može postići hemijskim, enzimskim ili fotohemijskim načinima.
[0220] Signal isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "signal isecanja proteina" označava najmanje jednu amino-kiselinu koja obeležava ili markira polipeptid za isecanje.
[0221] Protein od interesa: Kao što se ovde upotrebljava, termini "proteini od interesa" ili "željeni proteini" uključuju one koji su ovde obezbeđeni i njihove fragmente, mutante, varijante, i izmene.
[0222] Proksimalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "proksimalno" znači pozicioniran bliže centru ili tački ili regionu od interesa.
[0223] Pseudouridin: Kao što se ovde upotrebljava, pseudouridin označava C-glikozidni izomer nukleozida uridina. "Analog pseudouridina" je bilo koja modifikacija, varijanta, izoforma ili derivat pseudouridina. Na primer, analozi pseudouridina uključuju, ali nisu ograničeni na 1-karboksimetil-pseudouridin, 1-propinil-pseudouridin, 1-taurinometilpseudouridin, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridin, 1-metilpseudouridin (m<1>ψ), 1-metil-4-tiopseuduridin (m<1>s<4>ψ), 4-tio-1-metil-pseudouridin, 3-metil-pseudouridin (m<3>ψ), 2-tio-1-metilpseudouridin, 1-metil-1-deaza-pseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidropseudouridin, 2-tio-dihidropseuduridin, 2-metoksiuridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tio-pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp<3>ψ), i 2'-O-metil-pseudouridin (ψm).
[0224] Prečišćeno: Kao što se ovde upotrebljava, "prečistiti", "prečišćeno", "prečišćavanje" znači učiniti suštinski čistim ili očistiti od neželjenih komponenti, materijalnih nečistoća, primesa ili nesavršenosti.
[0225] Referentna sekvenca nukleinske kiseline: Termin "referentna sekvenca nukleinske kiseline" ili "referentna nukleinska kiselina" ili "referentna nukleotidna sekvenca" ili "referentna sekvenca" označava početnu sekvencu nukleinske kiseline (npr. RNK, npr. iRNK sekvencu) koja može se optimizovati sekvenca. U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline je sekvenca nukleinske kiseline divljeg tipa, njen fragment ili varijanta. U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline je prethodno optimizovana sekvenca nukleinske kiseline.
[0226] Ponovljena transfekcija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "ponovljena transfekcija" označava transfekciju iste ćelijske kulture polinukleotidom više puta. Ćelijska kultura može biti transfektovana najmanje dva puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 11 puta, najmanje 12 puta, najmanje 13 puta, najmanje 14 puta, najmanje 15 puta, najmanje 16 puta, najmanje 17 puta, najmanje 18 puta, najmanje 19 puta, najmanje 20 puta, najmanje 25 puta, najmanje 30 puta, najmanje 35 puta, najmanje 40 puta, najmanje 45 puta, najmanje 50 puta ili više.
[0227] Soli: U nekim aspektima, ovde je objavljena farmaceutska kompozicija za intratumorsku isporuku i sadrži soli nekih od njihovih lipidnih konstituenata. Termin "so" uključuje bilo koji anjonski i katjonski kompleks. Neograničavajući primeri anjona uključuju neorganske i organske anjone, npr. fluorid, hlorid, bromid, jodid, oksalat (npr. hemioksalat), fosfat, fosfonat, hidrogen fosfat, dihidrogen fosfat, oksid, karbonat, bikarbonat, nitrat, nitrit, nitrid, bisulfit, sulfid, sulfit, bisulfat, sulfat, tiosulfat, hidrogen sulfat, borat, format, acetat, benzoat, citrat, tartarat, laktat, akrilat, poliakrilat, fumarat, maleat, itakonat, glikolat, glukonat, malat, mandelat, tiglat, askorbat, salicilat, polimetakrilat, perhlorat, hlorat, hlorit, hipohlorit, bromat, hipobromit, jodat, alkilsulfonat, arilsulfonat, arsenat, arsenit, hromat, dihromat, cijanid, cijanat, tiocijanat, hidroksid, peroksid, permanganat, i njihove smeše.
[0228] Uzorak: Kao što se ovde upotrebljava, termin "uzorak" ili "biološki uzorak" označava podskup njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova (npr. telesne tečnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na krv, sluz, limfnu tečnost, sinovijalnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, amnionsku tečnost, krv amnionske vrpce, urin, vaginalnu tečnost i spermu). Uzorak dodatno može uključivati homogenat, lizat ili ekstrakt pripremljen od celog organizma ili podskupa njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova, ili njihove frakcije ili dela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, na primer, plazmu, serum, spinalnu tečnost, limfnu tečnost, spoljašnje delove kože, respiratorni, crevni, i genitourinarni trakt, suze, pljuvačku, mleko, ćelije krvi, tumore, organe. Uzorak dodatno označava medijum, kao što je hranljivi bujon ili gel, koji može da sadrži ćelijske komponente, kao što su proteini ili molekul nukleinske kiseline.
[0229] Signalna sekvenca: Kao što se ovde upotrebljava, fraze "signalna sekvenca", "signalni peptid", i "tranzitni peptid" se upotrebljavaju naizmenično i označavaju sekvencu koja može da usmeri transport ili lokalizaciju proteina do određene organele, ćelijskog kompartmenta, ili vanćelijskog eksporta. Termin obuhvata i polipeptid signalne sekvence i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signalnu sekvencu. Stoga, pozivanja na signalnu sekvencu u kontekstu nukleinske kiseline odnose se u stvari na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid signalne sekvence.
[0230] Put transdukcije signala: "Put transdukcije signala" označava biohemijski odnos između različitih molekula za transdukciju signala koji igraju ulogu u prenosu signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Kao što se ovde upotrebljava, termin "receptor ćelijske površine" uključuje, na primer, molekule i komplekse molekula koji su sposobni da prime signal i prenesu takav signal preko plazma membrane ćelije.
[0231] Sličnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "sličnost" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između polinukleotidnih molekula (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između polipeptidnih molekula. Izračunavanje procenta međusobne sličnosti polimernih molekula može se izvršiti na isti način kao i izračunavanje procenta identičnosti, osim što izračunavanje procenta sličnosti uzima u obzir konzervativne supstitucije kao što se razume u struci.
[0232] Specifična isporuka: Kao što se ovde upotrebljava, termin "specifična isporuka", "specifično isporučiti", ili "specifično isporučivanje" znači isporuku više (npr. najmanje 1,5 puta više, najmanje 2 puta više, najmanje 3 puta više, najmanje 4 puta više, najmanje 5 puta više, najmanje 6 puta više, najmanje 7 puta više, najmanje 8 puta više, najmanje 9 puta više, najmanje 10 puta više) polinukleotida pomoću nanočestice u ciljno tkivo od interesa (npr. jetra sisara) u poređenju sa nespecifičnim tkivom (npr. slezina sisara). Nivo isporuke nanočestice u određeno tkivo može se meriti upoređivanjem količine proteina proizvedenog u tkivu sa težinom navedenog tkiva, upoređivanjem količine polinukleotida u tkivu sa težinom navedenog tkiva, upoređivanjem količine proteina proizvedenog u tkivu sa količinom ukupnog proteina u navedenom tkivu, ili upoređivanjem količine polinukleotida u tkivu sa količinom ukupnog polinukleotida u navedenom tkivu. Na primer, za renovaskularno ciljno delovanje, polinukleotid se specifično obezbeđuje bubrezima sisara u poređenju sa jetrom i slezinom ukoliko je 1,5, 2 puta, 3 puta, 5 puta, 10 puta, 15 puta, ili 20 puta više polinukleotida po 1 g tkiva isporučeno u bubreg u poređenju sa onim isporučenim u jetru ili slezinu nakon sistemske primene polinukleotida. Razumeće se da sposobnost nanočestice da se specifično isporuči u ciljno tkivo ne mora da bude određena kod subjekta koji se leči, već se može odrediti u surogatu kao što je životinjski model (npr. pacovski model).
[0233] Stabilno: Kao što se ovde upotrebljava, "stabilno" označava jedinjenje koje je dovoljno robusno da preživi izolaciju do korisnog stepena čistoće iz reakcione smeše, i u nekim slučajevima sposobno da se formuliše u efikasan terapijski agens.
[0234] Stabilizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "stabilizovati", "stabilizovano", "stabilizovan region" znači učiniti ili postati stabilno.
[0235] Stereoizomer: Kao što se ovde upotrebljava, termin "stereoizomer" označava sve moguće različite izomerne kao i konformacione oblike koje jedinjenje može da poseduje (npr. jedinjenje bilo koje formule koja je ovde opisana), posebno sve moguće stereohemijske i konformaciono izomerne oblike, sve dijastereomere, enantiomere i/ili konformere osnovne molekulske strukture. Neka jedinjenja iz predmetne objave mogu postojati u različitim tautomernim oblicima, pri čemu su sva potonja uključena unutar obima predmetne objave.
[0236] Subjekt: Pod "subjekt" ili "pojedinac" ili "životinja" ili "pacijent" ili "sisar" podrazumeva se bilo koji subjekt, posebno subjekt sisar, za koga se želi dijagnoza, prognoza, ili terapija. Subjekti sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude, domaće životinje, životinje sa farmi, životinje u zoološkim vrtovima, životinje za sport, kućne ljubimce kao što su psi, mačke, zamorci, zečevi, pacovi, miševi, konji, goveda, krave; primate kao što su čovekoliki majmuni, majmuni, orangutani, i šimpanze; kanide kao što su psi i vukovi; felide kao što su mačke, lavovi, i tigrovi; ekvide kao što su konji, magarci, i zebre; medvede, životinje za hranu kao što su krave, svinje, i ovce; ungulate kao što su jeleni i žirafe; glodare kao što su miševi, pacovi, hrčci i zamorci; i tako dalje. U određenim aspektima, sisar je humani subjekt. U drugim aspektima, subjekt je humani pacijent. U posebnom aspektu, subjekt je humani pacijent kome je potrebno lečenje kancera.
[0237] Suštinski: Kao što se ovde upotrebljava, termin "suštinski" označava kvalitativno stanje ispoljavanja ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Onaj sa prosečnim iskustvom u biološkoj struci razumeće da biološki i hemijski fenomeni retko, ukoliko ikada, idu do kraja i/ili se nastavljaju do kompletnosti ili postižu ili izbegavaju apsolutni rezultat. Termin "suštinski" se stoga ovde upotrebljava da obuhvati potencijalni nedostatak kompletnosti svojstven mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.
[0238] Suštinski jednako: Kao što se ovde upotrebljava kao što se odnosi na vremenske razlike između doza, termin znači plus/minus 2%.
[0239] Suštinski istovremeno: Kao što se ovde upotrebljava kao što se odnosi na više doza, termin znači unutar 2 sekunde.
[0240] Pati od: Pojedincu koji "pati od" bolesti, poremećaja, i/ili stanja je dijagnostikovan ili pokazuje jedan ili više simptoma bolesti, poremećaja, i/ili stanja.
[0241] Podložan: Pojedincu koji je "podložan" bolesti, poremećaju, i/ili stanju nije dijagnostikovan i/ili možda ne pokazuje simptome bolesti, poremećaja, i/ili stanja, ali ima sklonost ka razvoju bolesti ili njenih simptoma. U nekim aspektima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju (na primer, kancer) može se okarakterisati sa jednim ili više od sledećeg: (1) genetska mutacija povezana sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanje; (2) genetski polimorfizam povezan sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (3) povećana i/ili smanjena ekspresija i/ili aktivnost proteina i/ili nukleinske kiseline povezane sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem; (4) navike i/ili stil života povezani sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (5) porodična istorija bolesti, poremećaja, i/ili stanja; i (6) izlaganje i/ili infekcija mikrobom povezanim sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja. U nekim aspektima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju će razviti bolest, poremećaj, i/ili stanje. U nekim aspektima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju i/ili stanju neće razviti bolest, poremećaj i/ili stanje.
[0242] Neprekidno oslobađanje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "neprekidno oslobađanje" označava profil oslobađanja farmaceutske kompozicije ili jedinjenja koji je u skladu sa stopom oslobađanja tokom specifičnog vremenskog perioda.
[0243] Sintetički: Termin "sintetički" znači produkovan, pripremljen, i/ili proizveden rukom čoveka. Sinteza polinukleotida ili drugih molekula iz predmetne objave može biti hemijska ili enzimska.
[0244] Ciljane ćelije: Kao što se ovde upotrebljava, "ciljane ćelije" označavaju bilo koju jednu ili više ćelija od interesa. Ćelije se mogu naći in vitro, in vivo, in situ, ili u tkivu ili organu organizma. Organizam može biti životinja, poželjno sisar, poželjnije čovek i najpoželjnije pacijent.
[0245] Ciljno tkivo: Kao što se ovde upotrebljava, "ciljno tkivo" označava bilo koji jedan ili više tipova tkiva od interesa u kojima bi isporuka polinukleotida rezultovala željenim biološkim i/ili farmakološkim efektom. Primeri ciljnih tkiva od interesa uključuju specifična tkiva, organe, i njihove sisteme ili grupe. U posebnim primenama, ciljno tkivo može biti bubreg, pluća, slezina, vaskularni endotel u sudovima (npr. intra-koronarni ili intrafemoralni), ili tumorsko tkivo (npr. putem intratumorske injekcije). "Nespecifično tkivo" označava bilo koji jedan ili više tipova tkiva u kojima ekspresija kodiranog proteina ne rezultuje željenim biološkim i/ili farmakološkim efektom. U posebnim primenama, nespecifična tkiva mogu uključivati jetru i slezinu.
[0246] Sekvenca ciljnog delovanja: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "sekvenca ciljnog delovanja" označava sekvencu koja može da usmerava transport ili lokalizaciju proteina ili polipeptida.
[0247] Terminus: Kao što se ovde upotrebljava, termini "terminusi" ili "terminus", kada se poziva na polipeptide, označavaju ekstremni deo peptida ili polipeptida. Takav ekstremni deo nije ograničen samo na prvo ili krajnje mesto peptida ili polipeptida, već može uključivati dodatne amino-kiseline u završnim regionima. Molekuli zasnovani na polipeptidima iz objave mogu se okarakterisati tako da imaju i N-terminus (završen amino-kiselinom sa slobodnom amino grupom (NH2)) i C-terminus (završen amino-kiselinom sa slobodnom karboksilnom grupom (COOH)). Proteini iz objave su u nekim slučajevima sačinjeni od više polipeptidnih lanaca spojenih disulfidnim vezama ili nekovalentnim silama (multimeri, oligomeri). Ove vrste proteina će imati više N- i C-terminusa. Alternativno, terminusi polipeptida mogu biti modifikovani tako da počinju ili završavaju, u zavisnosti od slučaja, sa funkcionalnom grupom zasnovanom na ne-polipeptidima kao što je organski konjugat.
[0248] Terapijski agens: Termin "terapijski agens" označava agens koji, kada se primenjuje subjektu, ima terapijski, dijagnostički, i/ili profilaktički efekat i/ili izaziva željeni biološki i/ili farmakološki efekat. Na primer, u nekim aspektima, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid može biti terapijski agens.
[0249] Terapijski efikasna količina: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijski efikasna količina" znači količinu agensa koji će biti isporučen (npr. nukleinska kiselina, lek, terapijski agens, dijagnostički agens, profilaktički agens, itd.) koja je dovoljna, kada se primenjuje subjektu koji pati ili je podložan infekciji, bolesti, poremećaju, i/ili stanju, za lečenje, poboljšanje simptoma, dijagnozu, preveniranje, i/ili odlaganje početka infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja.
[0250] Terapijski efikasan ishod: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijski efikasan ishod" znači ishod koji je dovoljan kod subjekta koji pati ili je podložan infekciji, bolesti, poremećaju, i/ili stanju, za lečenje, poboljšanje simptoma, dijagnozu, preveniranje, i/ili odlaganje početka infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja.
[0251] Ukupna dnevna doza: Kao što se ovde upotrebljava, "ukupna dnevna doza" je količina data ili propisana za period od 24 h. Ukupna dnevna doza se može primeniti kao pojedinačna jedinična doza ili podeljena doza.
[0252] Transkripcioni faktor: Kao što se ovde upotrebljava, termin "transkripcioni faktor" označava protein koji se vezuje za DNK koji reguliše transkripciju DNK u RNK, na primer, pomoću aktivacije ili represije transkripcije. Neki transkripcioni faktori utiču sami na regulaciju transkripcije, dok drugi deluju zajedno sa drugim proteinima. Neki transkripcioni faktori mogu i da aktiviraju i da potisnu transkripciju pod određenim uslovima. Generalno, transkripcioni faktori vezuju specifičnu ciljnu sekvencu ili sekvence veoma slične specifičnoj konsenzus sekvenci u regulatornom regionu ciljnog gena. Transkripcioni faktori mogu regulisati transkripciju ciljnog gena sami ili u kompleksu sa drugim molekulima.
[0253] Transkripcija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "transkripcija" označava postupke za introdukovanje egzogenih nukleinskih kiselina u ćeliju. Postupci transfekcije uključuju, ali nisu ograničeni na, hemijske postupke, fizičke tretmane i katjonske lipide ili smeše.
[0254] Transfekcija: Kao što se ovde upotrebljava, "transfekcija" označava introdukovanje polinukleotida u ćeliju u kojoj se eksprimira polipeptid koji je kodiran polinukleotidom (npr. iRNK) ili polipeptid modulira ćelijsku funkciju (npr. siRNA, miRNA). Kao što se ovde upotrebljava, "ekspresija" sekvence nukleinske kiseline označava translaciju polinukleotida (npr. iRNK) u polipeptid ili protein i/ili posttranslacionu modifikaciju polipeptida ili proteina.
[0255] Lečiti, lečenje, terapija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "lečiti" ili "lečenje" ili "terapija" označava delimično ili potpuno olakšavanje, popravljanje, poboljšanje, ublažavanje, odlaganje početka, inhibiranje progresije, redukovanje ozbiljnosti, i/ili redukovanje incidence jednog ili više simptoma ili svojstava hiper-proliferativne bolesti, npr. kancera. Na primer, "lečiti" kancer može označavati inhibiranje preživljavanja, rasta, i/ili širenja tumora. Lečenje
1
se može primeniti subjektu koji ne pokazuje znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja i/ili subjektu koji pokazuje samo rane znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja u cilju smanjenja rizika od razvoja patologije povezane sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.
[0256] Mikrookruženje tumora: Kao što se ovde upotrebljava, "mikrookruženje tumora" označava ćelijske kompozicije unutar tumora u odnosu na prisustvo ili odsustvo infiltrirajućih imunskih i/ili inflamatornih ćelija, kao i tip(ove) takvih ćelija unutar tumora. U jednom aspektu, mikrookruženje tumora je "inflamirano mikrookruženje tumora", što označava prisustvo imunskih i/ili inflamatornih ćelija infiltriranih u tumor, pri čemu su dominantni tip ćelija granulociti. U sledećem aspektu, mikrookruženje tumora je "imunosupresivno mikrookruženje tumora", što označava prisustvo imunskih i/ili inflamatornih ćelija infiltriranih u tumor, pri čemu su preovlađujući tipovi ćelija monocitne ćelije i makrofagi. U sledećem aspektu, mikrookruženje tumora je "imunološki oskudno mikrookruženje tumora", što označava odsustvo značajne infiltracije imunskih i/ili inflamatornih ćelija u tumor.
[0257] Nemodifikovano: Kao što se ovde upotrebljava, "nemodifikovano" označava bilo koju supstancu, jedinjenje ili molekul pre nego što se promeni na bilo koji način. Nemodifikovano može, ali ne uvek, označavati divlji tip ili nativni oblik biomolekula. Molekuli mogu biti podvrgnuti nizu modifikacija pri čemu svaki modifikovani molekul može poslužiti kao "nemodifikovani" početni molekul za naknadnu modifikaciju.
[0258] Uracil: Uracil je jedna od četiri nukleobaza u nukleinskoj kiselini RNK, i predstavljen je slovom U. Uracil može biti prikačen za ribozni prsten, ili specifičnije, ribofuranozu putem β-N1-glikozidne veze kako bi se dobio nukleozid uridin. Nukleozid uridin se takođe obično skraćuje u skladu sa jednoslovnim kodom njegove nukleobaze, tj. U. Stoga, u kontekstu predmetne objave, kada je monomer u polinukleotidnoj sekvenci U, takvo U se označava naizmenično kao "uracil" ili "uridin".
[0259] Sadržaj uridina: Termini "sadržaj uridina" ili "sadržaj uracila" su zamenjivi i označavaju količinu uracila ili uridina koja je prisutna u određenoj sekvenci nukleinske kiseline. Sadržaj uridina ili sadržaj uracila može se izraziti kao apsolutna vrednost (ukupan broj uridina ili uracila u sekvenci) ili relativna (procenat uridina ili uracila u odnosu na ukupan broj nukleobaza u sekvenci nukleinske kiseline).
[0260] Uridin-modifikovana sekvenca: Termin "uridin-modifikovana sekvenca" označava nukleinsku kiselinu sa optimizovanom sekvencom (npr. sintetička sekvenca iRNK) sa različitim ukupnim ili lokalnim sadržajem uridina (viši ili niži sadržaj uridina) ili sa različitim obrascima uridina (npr. gradijentna distribucija ili grupisanje) u odnosu na sadržaj uridina i/ili obrasce uridina u sekvenci kandidatu nukleinske kiseline. U sadržaju predmetne objave,
2
termini "uridin-modifikovana sekvenca" i "uracil-modifikovana sekvenca" smatraju se ekvivalentnim i zamenjivim.
[0261] "Kodon sa visokim sadržajem uridina" je definisan kao kodon koji sadrži dva ili tri uridina, "kodon sa niskim sadržajem uridina" je definisan kao kodon koji sadrži jedan uridin, a "kodon bez uridina" je kodon bez ijednog uridina. U nekim aspektima, uridin-modifikovana sekvenca sadrži supstitucije kodona sa visokim sadržajem uridina sa kodonima sa niskim sadržajem uridina, supstitucije kodona sa visokim sadržajem uridina sa kodonima bez uridina, supstitucije kodona sa niskim sadržajem uridina sa kodonima sa visokim sadržajem uridina, supstitucije kodona sa niskim sadržajem uridina sa kodonima bez uridina, supstituciju kodona bez uridina sa kodonima sa niskim sadržajem uridina, supstitucije kodona bez uridina sa kodonima sa visokim sadržajem uridina, i njihove kombinacije. U nekim aspektima, kodon sa visokim sadržajem uridina može biti zamenjen drugim kodonom sa visokim sadržajem uridina. U nekim aspektima, kodon sa niskim sadržajem uridina može biti zamenjen drugim kodonom sa niskim sadržajem uridina. U nekim aspektima, kodon bez uridina može biti zamenjen drugim kodonom bez uridina. Uridin-modifikovana sekvenca može biti obogaćena uridinom ili sa razređenim uridinom.
[0262] Uridinom obogaćeno: Kao što se ovde upotrebljava, termini "uridinom obogaćeno" i gramatičke varijante označavaju povećanje sadržaja uridina (izraženo u apsolutnoj vrednosti ili kao procentualna vrednost) u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom (npr. sintetička sekvenca iRNK) u odnosu na sadržaj uridina odgovarajuće sekvence kandidata nukleinske kiseline. Obogaćivanje uridinom se može implementirati supstitucijom kodona u sekvenci kandidatu nukleinske kiseline sa sinonimnim kodonima koji sadrže manje nukleobaza uridina. Obogaćivanje uridinom može biti globalno (tj. u odnosu na celu dužinu sekvence kandidata nukleinske kiseline) ili lokalno (tj. u odnosu na podsekvencu ili region sekvence kandidata nukleinske kiseline).
[0263] Sa razređenim uridinom: Kao što se ovde upotrebljava, termini "sa razređenim uridinom" i gramatičke varijante označavaju smanjenje sadržaja uridina (izraženo u apsolutnoj vrednosti ili kao procentualna vrednost) u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom (npr. sintetička sekvenca iRNK) u odnosu na sadržaj uridina odgovarajuće sekvence kandidata nukleinske kiseline. Razređivanje uridina se može implementirati supstitucijom kodona u sekvenci kandidatu nukleinske kiseline sa sinonimnim kodonima koji sadrže manje nukleobaza uridina. Razređivanje uridina može biti globalno (tj. u odnosu na celu dužinu sekvence kandidata nukleinske kiseline) ili lokalno (tj. u odnosu na podsekvencu ili region sekvence kandidata nukleinske kiseline).
[0264] Varijanta: Termin varijanta kao što se upotrebljava u predmetnoj objavi označava i prirodne varijante (npr. polimorfizmi, izoforme, itd.) i veštačke varijante u kojima je najmanje jedan amino-kiselinski ostatak u nativnoj ili početnoj sekvenci (npr. sekvenca divljeg tipa) uklonjen i druga amino-kiselina insertovana na njegovo mesto na istoj poziciji. Ove varijante se mogu opisati kao "supstitucione varijante". Supstitucije mogu biti pojedinačne, gde je samo jedna amino-kiselina u molekulu supstituisana, ili mogu biti višestruke, gde su dve ili više amino-kiselina supstituisane u istom molekulu. Ukoliko su izvršene insercija ili delecija amino-kiselina, rezultujuća varijanta bi bila "inserciona varijanta" ili "deleciona varijanta" respektivno.
II. Kombinacije koje sadrže polinukleotide koji kodiraju imunomodulatorne polipeptide
[0265] Predmetna objava obezbeđuje kompozicije ("kompozicije iz objave") za lečenje kancera. U jednom aspektu, kompozicije sadrže, u jednoj formulaciji, najmanje dva polinukleotida (npr. iRNK) ili najmanje tri polinukleotida (npr. iRNK), svaka od kompozicija odabrana od prvog polinukleotida koji kodira IL-23, drugog polinukleotida koji kodira IL-36-gama (ili, alternativno, IL-18), i/ili trećeg polinukleotida koji kodira OX40L. U skladu sa tim, predmetna objava obezbeđuje, na primer, (i) prvi polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, (ii) drugi polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (ili IL-18 polipeptid), i (iii) treći polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i treći polipeptid upotrebljavaju u različitim kombinacijama. U jednom aspektu, kompozicija sadrži prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i treći polinukleotid. Termin "polinukleotidi iz objave" označava prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i treći polinukleotid koji su ovde objavljeni.
[0266] Kao što se ovde upotrebljava, termin "kombinacije iz objave" sadrži, npr. kombinaciju (i) prvog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugog polinukleotida koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; (ii) prvog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i trećeg polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid; (iii) drugog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i trećeg polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid; ili (iv) prvog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira drugi
4
protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i trećeg polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid. Podrazumeva se da termin "kombinacije iz objave" nije ograničen na fizičku kombinaciju prvog polinukleotida, drugog polinukleotida, i/ili trećeg polinukleotida, već takođe obuhvata odvojenu primenu oba ova polinukleotida istovremeno ili uzastopno.
[0267] Prema tome, u sledećem aspektu, kompozicija iz predmetne objave sadrži polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira jedan polipeptid, IL-23, IL-36-gama ili IL-18, ili OX40L, ali svaka od kompozicija (npr. kompozicija koja sadrži prvi polinukleotid koji kodira IL-23, kompozicija koja sadrži drugi polinukleotid koji kodira IL-36-gama ili IL-18, i treći polinukleotid koji kodira OX40L) može se upotrebljavati u kombinaciji u postupcima koji su ovde opisani.
[0268] Onaj sa iskustvom u struci bi takođe cenio da alternativni aspekti predmetne objave uključuju kombinovanu terapiju IL-23, IL-36-gama ili IL-18, i/ili OX40 kao polinukleotida i/ili proteina. Na primer, predmetna objava obuhvata kombinovanu terapiju (i) prvog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira IL-23 i drugog proteina koji sadrži IL-36-gama ili IL-18; prvog proteina koji sadrži IL-23 i drugog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36 gama IL-18; ili (iii) prvog proteina koji sadrži IL-23 i drugog proteina koji sadrži IL-36 gama ili IL-18. Slično, predmetna objava dodatno obuhvata kombinovanu terapiju IL-23 polinukleotida (npr. iRNK) ili prvog proteina koji sadrži IL-23 polipeptid, IL-36-gama polinukleotida ili IL-18 polinukleotida (npr. iRNK) ili drugog proteina koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, OX40L polinukleotida (npr. iRNK) ili trećeg proteina koji sadrži OX40L polipeptid, ili njihove kombinacije.
Polinukleotidi koji kodiraju IL-23
[0269] IL-23 je proinflamatorni citokin koji igra važnu ulogu u urođenom i adaptivnom imunitetu. Croxford et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42:2263-2273. IL-23 funkcioniše prvenstveno kao heterodimerni protein od 60 kDa koji se sastoji od disulfidno povezanih p19 i p40 podjedinica. IL-23 je strukturno i funkcionalno sličan proinflamatornom citokinu IL-12. IL-23 sadrži istu p40 podjedinicu kao IL-12, ali uključuje p19 podjedinicu, pre nego p35 iz IL-12. Oppman et al. (2000) Immunity 13:715-725. Prekursorski oblik p19 podjedinice (NCBI referentna sekvenca: NP_057668; NM_016584; Uniprot: Q9NPF7; takođe označen kao IL-23A i IL-23 podjedinica alfa) ima dužinu od 189 amino-kiselina, dok njegov zreli oblik ima dužinu od 170 amino-kiselina. Prekursorski oblik p40 podjedinice (NCBI referentna sekvenca: NM_002187; Uniprot: P29460; takođe se označava kao IL-12B, stimulatorni faktor ćelija prirodnih ubica 2, i faktor maturacije citotoksičnih limfocita 2) ima dužinu od 328 amino-kiselina, njegov zreli oblik ima dužinu od 306 amino-kiselina.
[0270] Mnoge različite imunske ćelije, uključujući dendritske ćelije i makrofage, proizvode IL-23 nakon antigenskih stimulusa. Jedna razlika između IL-12 i IL-23 je u tome što je IL-12 povezan sa razvojem i aktivnošću Th1 T ćelijskih populacija, dok je IL-23 povezan sa razvojem i aktivnošću Th17 T ćelijskih populacija. Videti Vignali et al. (2014) Nat. Immunol.
13:722-728.
[0271] Iako su neke rane studije implicirale IL-23 za antitumorsku terapiju (Belladonna et al. (2002) J. Immunol. 168:5448-5454), skorije studije ukazuju na potencijalnu pro-tumorigenu funkciju za IL-23. Videti, npr. Croxford et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42:2263-2273. Langowski et al. (2007) Trends Immunol. 28:207-212; Langowski et al. (2006) Nature 442:461-465; Teng et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:8328-8333; Teng et al. (2012) Cancer Res. 72:3987-3996. Langowski (2006) je uočio povećanje IL-23 u humanim tumorima. Videti takođe Ngiow et al. (2013) Trends Immunol. 34:548-555; Wilke et al. (2011) Carcinogenesis 32:643-649; Xu et al. (2010) Clin. Dev. Immunol. 2010. Na primer, Wang et al. (2015) Clin. Exp. Reumatol. 33 (Suppl. 92): S87-S90 podučava da povišena ekspresija IL-23 ima patogenu funkciju kod kancera. IL-23 ima uzročnu ulogu u razvoju i progresiji tumora i povezan je sa nepovoljnim prognostičkim ishodom i brzom progresijom do metastatske bolesti, što sugeriše da inhibicija ekspresije IL-23 može biti korisna za terapiju i prevenciju kancera, posebno kolorektalnog kancera. Teng et al. (2015) Nature Medicine 21: 719-29 podučava da IL-23 indirektno ili direktno promoviše tumorigenezu, rast, i metastazu, i ukazuje da bi se inhibicija ekspresije IL-23 mogla upotrebljavati za terapiju i prevenciju kancera.
[0272] Kao što se upotrebljava u predmetnoj objavi, termin "IL-23 polipeptid" označava, npr. IL-12p40 podjedinicu IL-23, IL-23p19 podjedinicu IL-23, ili fuzioni protein koji sadrži polipeptid IL-12p40 podjedinice i polipeptid IL-23p19 podjedinice. U nekim aspektima, fuzioni protein sadrži od N-terminusa do C-terminusa:
(a) IL-12p40 podjedinicu koja sadrži IL-12p40 signalni peptid, peptidni linker, i zrelu IL-23p19 podjedinicu, ili
(b) IL-23p19 podjedinicu koja sadrži IL-23p19 signalni peptid, peptidni linker, i zrelu IL-12p40.
[0273] U jednom posebnom aspektu, IL-23 polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od humanog ili murinskog IL-23 polipeptida iz Tabele 1 (npr. prekursora ili zrelog IL-12p40 ili IL-23p19) ili njihove kombinacije. U jednom posebnom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od polinukleotida koji kodira IL-23 iz Tabele 1.
[0274] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična IL-23 amino-kiselinskoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1 ili amino-kiselinskoj sekvenci kodiranoj nukleotidnom sekvencom koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu IL-23 polipeptid ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-23 polipeptida divljeg tipa. U određenom aspektu, IL-23 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 140 i ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-23 polipeptida divljeg tipa. U sledećem posebnom aspektu, IL-23 polipeptid se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 140 i ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-23 polipeptida divljeg tipa.
[0275] U drugim aspektima, IL-23 polipeptid kodiran polinukleotidom iz objave sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je navedena u Tabeli 1 ili pokazana u SEQ ID NO: 1, 5 ili 140 sa jednom ili više konzervativnih supstitucija, pri čemu konzervativne supstitucije ne utiču značajno na aktivnost vezivanja IL-23 polipeptida na njegov receptor, tj. IL-23 polipeptid se vezuje za IL-23 receptor posle supstitucija.
[0276] U nekim aspektima, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-23 polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira IL-23 polipeptid koja je navedena u Tabeli 1. U određenom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-23 polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 142. U sledećem posebnom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-23 polipeptid sastoji se suštinski od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 142. Treba razumeti da nukleotidna sekvenca (tj. iRNK, npr. SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 71 ili SEQ ID NO: 141) koja kodira otvoreni okvir čitanja (ORF) IL-23 polipeptida može biti jedan element unutar većeg konstrukta, npr. koji dodatno uključuje 5' terminusnu kapu, 5'UTR (npr. SEQ ID NO: 27 ili 44), 3'UTR (npr. SEQ ID NO: 119 ili 120), i/ili poliA rep.
Polinukleotidi koji kodiraju IL-12 polipeptide
[0277] U nekim aspektima, prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-12 polipeptid. Kao što se upotrebljava u predmetnoj objavi, termin "IL-12 polipeptid" označava, npr. IL-12p40 podjedinicu IL-12 (tj. IL12B), IL-12p35 podjedinicu IL-12 (tj. IL12Aa), ili fuzioni protein koji sadrži polipeptid IL-12p40 podjedinice i polipeptid IL-12p35 podjedinice. U nekim aspektima, fuzioni protein sadrži IL12B polipeptid odabran od:
(i) IL12B polipeptida pune dužine (npr. koji ima istu ili suštinski istu dužinu kao divlji tip IL12B);
(ii) funkcionalnog fragmenta IL12B polipeptida pune dužine (npr. skraćena (npr. delecija karboksi, amino terminusa, ili unutrašnjih regiona) sekvenca kraća od divljeg tipa IL12B; ali i dalje zadržava enzimsku aktivnost IL12B) ;
(iii) njegove varijante (npr. IL12B proteini pune dužine ili skraćeni u kojima je zamenjena jedna ili više amino-kiselina, npr. varijante koje zadržavaju svu ili većinu aktivnosti IL12B polipeptida u odnosu na divlji tip IL12B polipeptida (kao što su, npr. V33I, V298F, ili bilo koje druge prirodne ili veštačke varijante koje su poznate u struci); ili
(iv) fuzionog proteina koji sadrži (i) divlji tip IL12B pune dužine, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, i (ii) heterologni protein;
i/ili IL12A polipeptid odabran od:
(i) IL12A polipeptida pune dužine (npr. koji ima istu ili suštinski istu dužinu kao divlji tip IL12A);
(ii) funkcionalnog fragmenta IL12A polipeptida pune dužine (npr. skraćena (npr. delecija karboksi, amino terminusa, ili unutrašnjih regiona) sekvenca kraća od divljeg tipa IL12A; ali i dalje zadržava enzimsku aktivnost IL12A) ;
(iii) njegove varijante (npr. IL12A proteini pune dužine ili skraćeni u kojima je zamenjena jedna ili više amino-kiselina, npr. varijante koje zadržavaju svu ili većinu aktivnosti IL12A polipeptida u odnosu na wtIL12A polipeptid (kao što su prirodne ili veštačke varijante poznate u struci); ili
(iv) fuzionog proteina koji sadrži (i) divlji tip IL12A pune dužine, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, i (ii) heterologni protein.
[0278] U jednom posebnom aspektu, IL-12 polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od humanog ili murinskog IL-12 polipeptida iz Tabele 1 (npr. prekursora ili zrelog IL-12p40 ili IL-12p35) ili njihove kombinacije. U jednom posebnom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-12 polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od polinukleotida koji kodira IL-23 iz Tabele 1.
[0279] U nekim aspektima, IL-12 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična IL-12 amino-kiselinskoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1 ili amino-kiselinskoj sekvenci kodiranoj nukleotidnom sekvencom koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu IL-12 polipeptid ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-12 polipeptida divljeg tipa.
[0280] U drugim aspektima, IL-12 polipeptid kodiran polinukleotidom iz objave sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je navedena u Tabeli 1 sa jednom ili više konzervativnih supstitucija, pri čemu konzervativne supstitucije ne utiču značajno na aktivnost vezivanja IL-12 polipeptida za njegov receptor, tj. IL-12 polipeptid se vezuje za IL-12 receptor posle supstitucija.
[0281] U nekim aspektima, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-12 polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira IL-12 polipeptid koja je navedena u Tabeli 1. U određenom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-12 polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 183. Treba razumeti da nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira otvoreni okvir čitanja (ORF) IL-12 polipeptida može biti jedan element unutar većeg konstrukta, npr. koji dodatno uključuje 5' terminusnu kapu, 5'UTR (npr. SEQ ID NO: 27 ili 44), 3'UTR (npr. SEQ ID NO: 119 ili 120), i/ili poliA rep.
Polinukleotidi koji kodiraju IL-36-gama polipeptide
[0282] U nekim aspektima, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid može se kombinovati sa polinukleotidom koji kodira drugi koji sadrži IL-36 polipeptid.
[0283] IL-36-gama je član interleukin-1 porodice citokina. Kao i drugi članovi interleukin-1 porodice citokina, IL-36-gama zahteva isecanje N-terminusa za punu bioaktivnost. IL-36-gama nema signalnu sekvencu, i prema tome, ne sekretuje se preko endoplazmin retikulum Goldži puta. Videti Gresnigt i van de Veerdonk (2013) Seminars in Immunology 25:458-465). Nije jasno kako se IL-36-gama oslobađa iz ćelija da bi delovao na, npr. imunske ćelije, druge epitelske ćelije, i fibroblaste (Gabay et al. (2015) Journal of Leukocyte Biology 97:645-652). U primerima aspekata objave, polinukleotid koji kodira IL-36, npr. IL-36-gama, uključuje sekvencu koja kodira heterologni signalni peptid. Bez da bude vezano teorijom, veruje se da polinukleotidi koji kodiraju takve "projektovane" signalni peptid-interleukin himerne proteine obezbeđuju generisanje aktivnog proteina kada se eksprimiraju in vivo, u odsustvu aktivacije inflamazoma.
[0284] U jednom aspektu, heterologni signalni peptid je izveden iz teškog ili lakog lanca imunoglobulina. U primeru aspekta, heterologni signalni peptid je izveden iz lakog lanca imunoglobulina, npr. iz varijabilnog regiona navedenog lakog lanca. U primeru aspekta, heterologni signalni peptid je izveden iz varijabilnog regiona kapa lakog lanca humanog imunoglobulina, hIGVK4. U primerima aspekata, polinukleotid iz objave kodira heterologni signalni peptid, operativno vezan za sekvencu koja kodira IL-36-gama polipeptid.
[0285] U jednom posebnom aspektu, IL-36-gama polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od IL-36-gama polipeptida iz Tabele 1. U jednom posebnom aspektu, polinukleotid koji kodira IL-36-gama polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od polinukleotida koji kodira IL-36-gama iz Tabele 1.
[0286] U nekim aspektima, IL-36-gama polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična IL-36-gama aminokiselinskoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1 ili amino-kiselinskoj sekvenci kodiranoj nukleotidnom sekvencom koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu IL-36-gama polipeptid ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-36-gama polipeptida divljeg tipa. U određenom aspektu, IL-36-gama polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 16 i ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-36-gama polipeptida divljeg tipa. U sledećem posebnom aspektu, IL-36-gama polipeptid se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 16 i ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-36-gama polipeptida divljeg tipa.
[0287] U drugim aspektima, IL-36-gama polipeptid kodiran polinukleotidom iz objave sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je navedena u Tabeli 1 ili pokazana u SEQ ID NO: 16 sa jednom ili više konzervativnih supstitucija, pri čemu konzervativne supstitucije ne utiču značajno na aktivnost vezivanja IL-36-gama polipeptida za njegov receptor, tj. IL-36-gama polipeptid se vezuje za IL-36-gama receptor posle supstitucija.
[0288] U nekim aspektima, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-36-gama polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira IL-36-gama polipeptid koja je navedena u Tabeli 1. U određenom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koji kodira IL-36-gama polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 144. U sledećem posebnom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-36-gama polipeptid sastoji se suštinski od SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 144. Treba razumeti da nukleotidna sekvenca (tj. iRNK, npr. SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 143) koja kodira otvoreni okvir čitanja (ORF) IL-23 polipeptida može biti jedan element unutar većeg konstrukta, npr. koji dodatno uključuje 5' terminusnu kapu, 5' UTR (npr. SEQ ID NO: 27 ili 44), 3' UTR (npr. SEQ ID NO: 119 ili 120), i/ili poliA rep.
Polinukleotidi koji kodiraju IL-18 polipeptide
[0289] U nekim aspektima, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid može se kombinovati sa drugim polinukleotidom koji kodira drugi protein, pri čemu drugi protein sadrži IL-18 polipeptid.
[0290] IL-18, takođe poznat kao faktor indukcije interferona-gama (IGIF) i faktor indukcije IFN-γ, član je interleukin-1 porodice citokina. IL-18 ima dve poznate izoforme, izoformu 1 i
1
Izoformu 2. Izoforma 2 se razlikuje od Izoforme 1 po tome što joj nedostaju ostaci 27-30. Kao i drugi članovi interleukin-1 porodice citokina, IL-18 zahteva isecanje N-terminusa za punu bioaktivnost (Dinarello et al. (2013) Frontiers in Immunology 4:289). IL-18 nema signalnu sekvencu, i prema tome, ne sekretuje se preko endoplazmin retikulum Goldži puta. Videti Gresnigt i van de Veerdonk (2013) Seminars in Immunology 25:458-465).
[0291] IL-18 je proinflamatorni agonist koji signalizira preko IL-18α i IL-18β ko-receptora da indukuje signalnu kaskadu koja aktivira NPκB i MAPK (Dinarello et al. (2013). Kao i u slučaju IL-23, postoje suprotstavljeni izveštaji u vezi sa potencijalnom upotrebom IL-18 za antikancersku terapiju. Ma et al. (2016) Clin. Cancer Res. 22:2969-2680 podučava da kotretman sa IL-18 poboljšava antitumorsku aktivnost izazvanu pomoću anti-PD-L1 i/ili anti-CTLA-4. Međutim, Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675 podučava da IL-18 može igrati različite uloge kod kancera, imajući antikancerske aktivnosti u nekim slučajevima i tumor-promovišuće aktivnosti u drugim slučajevima. Fabbi ukazuje da iako pretkliničke studije i neka klinička ispitivanja sugerišu da IL-18 ima antitumorske aktivnosti, druge studije ukazuju da IL-18 može ispoljavati proinvazivne, proangiogene, i imunoregulatorne aktivnosti u različitim modelima tumora. Na primer, Term et al. (2011) Cancer Res. 71: 5393-9 podučava da je IL-18 imunosupresivni citokin kod kancera, i da IL-18 proizveden od strane tumorskih ćelija promoviše razvoj NK-kontrolisanih metastaza na način zavisan od PD-1. Kang et al. (2009) Carcinogenesis 30:1987-86 podučava da IL-18 povećava metastaze i imunski beg kancera želuca.
[0292] U primerima aspekata objave, polinukleotid koji kodira IL-18 uključuje sekvencu koja kodira heterologni signalni peptid. Bez da bude vezano teorijom, veruje se da polinukleotidi koji kodiraju takve "projektovane" signalni peptid-interleukin himerne proteine obezbeđuju generisanje aktivnog proteina kada se eksprimiraju in vivo, u odsustvu aktivacije inflamazoma.
[0293] U jednom aspektu, heterologni signalni peptid je izveden iz teškog ili lakog lanca imunoglobulina. U primeru aspekta, heterologni signalni peptid je izveden iz lakog lanca imunoglobulina, npr. iz varijabilnog regiona navedenog lakog lanca.
[0294] U primeru aspekta, heterologni signalni peptid je izveden iz varijabilnog regiona kapa lakog lanca humanog imunoglobulina, hIGVK4. U primerima aspekata, polinukleotid iz objave kodira heterologni signalni peptid, operativno vezan za sekvencu koja kodira IL-18 polipeptid.
[0295] U jednom posebnom aspektu, IL-18 polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od IL-18 polipeptida iz Tabele 1. U jednom posebnom aspektu, polinukleotid koji
2
kodira IL-18 polipeptid sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od polinukleotida koji kodira IL-18 iz Tabele 1.
[0296] U nekim aspektima, IL-18 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična IL-18 amino-kiselinskoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1 ili amino-kiselinskoj sekvenci kodiranoj nukleotidnom sekvencom koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu IL-18 polipeptid ima najmanje 10% aktivnosti (npr. vezivanje za njegov receptor) odgovarajućeg IL-18 polipeptida divljeg tipa. U određenom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira IL-18 polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 162. U sledećem posebnom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koji kodira IL18 polipeptid sastoji se suštinski od SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 162. Treba razumeti da nukleotidna sekvenca (tj. iRNK, npr. SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 162) koja kodira otvoreni okvir čitanja (ORF) IL-18 polipeptida može biti jedan element unutar većeg konstrukta, npr. koji dodatno uključuje 5' terminusnu kapu, 5'UTR (npr. SEQ ID NO: 27 ili 44), 3'UTR (npr. SEQ ID NO: 119 ili 120), i/ili poliA rep.
Polinukleotidi koji kodiraju OX40L polipeptide
[0297] U nekim aspektima, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid može se kombinovati sa trećim polinukleotidom koji kodira treći protein, pri čemu treći protein sadrži OX40L polipeptid. U drugim aspektima, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid može se kombinovati sa trećim polinukleotidom koji kodira treći protein, pri čemu treći protein sadrži OX40L polipeptid. U određenim aspektima, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid i drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid mogu se kombinovati sa trećim polinukleotidom koji kodira treći protein, pri čemu treći protein sadrži OX40L polipeptid.
[0298] Humani OX40L je prvi put identifikovan na površini humanih limfocita inficiranih sa humanim T-ćelijskim virusom leukemije tipa-I (HTLV-I) od strane Tanaka et al. (Tanaka et al., International Journal of Cancer (1985), 36(5):549-55). OX40L je ligand za OX40 (CD134). OX40L je takođe označen kao CD252 (klaster diferencijacije 252), superfamilija faktora nekroze tumora (ligand), član 4, taks-transkripciono aktiviran glikoprotein 1, TXGP1, ili gp34. Humani OX40L ima dužinu od 183 amino-kiseline i sadrži tri domena: citoplazmatski domen amino-kiselina 1-23; transmembranski domen amino-kiselina 24-50, i vanćelijski domen amino-kiselina 51-183.
[0299] U nekim aspektima, treći polinukleotid sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid sisara. U nekim aspektima, OX40L polipeptid sisara je murinski OX40L polipeptid. U nekim aspektima, OX40L polipeptid sisara je humani OX40L polipeptid. U nekim aspektima, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je izneta u Tabeli 1A.
[0300] U nekim aspektima, svaki polinukleotid iz objave sadrži iRNK, tj. iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U nekim aspektima, iRNK koja kodira IL-23 polipeptid kodira IL-23 polipeptid sisara. U nekim aspektima, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid kodira IL-36-gama polipeptid sisara. U nekim aspektima, iRNK koja kodira OX40L polipeptid kodira OX40L polipeptid sisara. U nekim aspektima, iRNK koja kodira IL-23 polipeptid kodira murinski IL-23 polipeptid. U nekim aspektima, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid kodira murinski IL-36-gama polipeptid. U nekim aspektima, iRNK koja kodira OX40L polipeptid kodira murinski OX40L polipeptid. U nekim aspektima, iRNK koja kodira IL-23 polipeptid kodira humani IL-23 polipeptid. U nekim aspektima, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid kodira humani IL-36-gama polipeptid. U nekim aspektima, iRNK koja kodira OX40L polipeptid kodira humani OX40L polipeptid.
[0301] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid sadrži humanu amino-kiselinsku sekvencu koja je izneta u Tabeli 1. U nekim aspektima, IL-36-gama polipeptid sadrži humanu aminokiselinsku sekvencu koja je izneta u Tabeli 1. U drugim aspektima, OX40L polipeptid sadrži humanu amino-kiselinsku sekvencu koja je izneta u Tabeli 1A.
[0302] U nekim aspektima, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična amino-kiselinskoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1A ili amino-kiselinskoj sekvenci kodiranoj nukleotidnom sekvencom koja je navedena u Tabeli 1A, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da se veže za OX40 receptor. U određenom aspektu, OX40L polipeptid sadrži amino-
4
kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 21 i sposobna je da se veže za OX40 receptor. U sledećem posebnom aspektu, OX40L polipeptid se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 21 i sposoban je da se veže za OX40 receptor.
[0303] U određenim aspektima, OX40L polipeptid kodiran polinukleotidom iz objave sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je navedena u Tabeli 1A ili pokazana u SEQ ID NO: 21 sa jednom ili više konzervativnih supstitucija, pri čemu konzervativne supstitucije ne utiču značajno na aktivnost vezivanja OX40L polipeptida za njegov receptor, tj. OX40L polipeptid se vezuje za OX40 receptor posle supstitucija.
[0304] U drugim aspektima, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira OX40L polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci nukleinske kiseline koja je navedena u Tabeli 1A. U određenom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira OX40L polipeptid sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 146. U sledećem posebnom aspektu, nukleotidna sekvenca (tj. iRNK) koja kodira OX40L polipeptid sastoji se suštinski od SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 146. Treba razumeti da nukleotidna sekvenca (tj. iRNK, npr. SEQ ID NO: 116 ili SEQ ID NO: 145) koja kodira otvoreni okvir čitanja (ORF) OX40L polipeptida može biti jedan element unutar većeg konstrukta, npr. koji dodatno uključuje 5' terminusnu kapu, 5'UTR (npr. SEQ ID NO: 27 ili 44), 3'UTR (npr. SEQ ID NO: 119 ili 120), i/ili poliA rep.
[0305] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koristan za postupke i kompozicije sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L. U drugim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira citoplazmatski domen OX40L. U nekim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira transmembranski domen OX40L. U određenim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L i transmembranski OX40L. U drugim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L i citoplazmatski domen OX40L. U još drugim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira vanćelijski domen OX40L, transmembranski OX40L, i citoplazmatski domen OX40L.
[0306] Tabela 1 ili Tabela 1A predstavljaju, npr. prekursorske i zrele sekvence za IL-23, IL-36-gama, i OX40L, kao i konstrukte koji sadrže IL-23 ili IL-36-gama. U kontekstu predmetne objave, IL-23 polinukleotid ili IL-23 polipeptid obuhvataju i "prekursorske" i "zrele" oblike. Štaviše, konstrukt koji sadrži polinukleotid koji kodira IL-23, IL-36-gama, i OX40L i koji dodatno sadrži komponente kao što su 3' UTR i 5' UTR bi se smatrao polinukleotidom koji kodira IL-23, IL-36-gama, i OX40L. Osoba sa iskustvom u struci bi razumela da se pored nativnih signalnih sekvenci i propeptidnih sekvenci implicitno koje su objavljene u Tabeli 1 ili 1A (sekvence prisutne u prekursorskom obliku i odsutne u zrelom odgovarajućem obliku) i nenativnog signalnog peptida koji je objavljen u Tabeli 1 ili 1A (IgKV4 signalni peptid), mogu upotrebljavati druge signalne sekvence. U skladu sa tim, pozivanja na IL-23, IL-36-gama, i OX40L polipeptid ili polinukleotid u skladu sa Tabelom 1 obuhvataju varijante u kojima je alternativni signalni peptid (ili kodirajuća sekvenca) poznat u struci prikačen za navedeni IL-23, IL-36-gama, i OX40L polipeptid (ili polinukleotid). Takođe se podrazumeva da su pozivanja na sekvence koje su objavljene u Tabeli 1 duž prijave podjednako primenljive i obuhvataju ortologe i funkcionalne varijante (na primer polimorfne varijante) i izoforme onih sekvenci koje su poznate u struci u vreme kada je prijava podneta.
�
�
�
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
11
11
11
11
11
11
11
��
��
��
��
��
��
��
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
��
��
��
��
��
��
��
[0307] Na osnovu RNK sekvenci koje su ovde obezbeđene, i posebno u Tabeli 1 i Tabeli 1A, osoba sa prosečnim iskustvom u struci bi razumela odgovarajuću DNK sekvencu (npr. konverziju uracila u timin). Slično, na osnovu obezbeđenih DNK sekvenci, osoba sa prosečnim iskustvom u struci bi razumela odgovarajuću RNK sekvencu (npr. konverziju timina u uracil).
[0308] U nekim aspektima, prvi polinukleotid sadrži iRNK (npr. SEQ ID NO: 141) koja sadrži kodon optimizovanu sekvencu koja kodira IL-23 polipeptid. U nekim aspektima, drugi polinukleotid sadrži iRNK (npr. SEQ ID NO: 143) koja sadrži kodon optimizovanu sekvencu koja kodira IL-36-gama polipeptid. U drugim aspektima, treći polinukleotid sadrži iRNK (npr. SEQ ID NO: 145) koja sadrži kodon optimizovanu sekvencu koja kodira OX40L polipeptid.
[0309] U nekim aspektima, prvi polinukleotid sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid koji je pune dužine. U nekim aspektima, prvi polinukleotid sadrži iRNK koja kodira humani IL-23 polipeptid kome nedostaje najmanje jedna, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje 10,
1
najmanje 14, ili najmanje 15 amino-kiselina na N-terminusu ili C-terminusu IL-23 polipeptida divljeg tipa.
[0310] U nekim aspektima, drugi polinukleotid sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid koji je pune dužine. U nekim aspektima, drugi polinukleotidi sadrže iRNK koja kodira humani IL-36-gama polipeptid kome nedostaje najmanje jedna, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje 10, najmanje 14, ili najmanje 15 amino-kiselina na N-terminusu ili C-terminusu IL-36-gama polipeptida divljeg tipa.
[0311] U nekim aspektima, polinukleotid sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji je pune dužine. U nekim aspektima, polinukleotid sadrži iRNK koja kodira humani OX40L polipeptid koji ima dužinu od 183 amino-kiseline. U određenim aspektima, OX40L polipeptidu može nedostajati najmanje jedna, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje 10, najmanje 14, ili najmanje 15 amino-kiselina na N-terminusu ili C-terminusu OX40L polipeptida.
[0312] U nekim aspektima, polinukleotidi (npr. iRNK) iz predmetne objave su "strukturno modifikovani" ili "hemijski modifikovani". Kao što se ovde upotrebljava, "strukturna" modifikacija je ona u kojoj su dva ili više povezanih nukleozida insertovana, deletirana, duplicirana, invertovana ili randomizovana u polinukleotidu bez značajne hemijske modifikacije same iRNK. Pošto će hemijske veze nužno biti prekinute i ponovo formirane kako bi se izvršila strukturna modifikacija, strukturne modifikacije su hemijske prirode i stoga su hemijske modifikacije. Međutim, strukturne modifikacije će rezultovati drugačijom sekvencom nukleotida. Na primer, iRNK "AUCG" može biti hemijski modifikovana u "AU-5meC-G". Ista iRNK može biti strukturno modifikovana iz "AUCG" u "AUCCCG". Ovde je insertovan dinukleotid "CC", što je rezultovalo strukturnom modifikacijom polinukleotida.
[0313] U nekim aspektima, polinukleotidi (npr. iRNK) iz predmetne objave, mogu imati uniformnu hemijsku modifikaciju svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ili populacije modifikacija proizvedenih pukom titracijom naniže iste početne modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida, ili izmereni procenat hemijske modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ali sa nasumičnim inkorpisanjem, kao što je slučaj gde su svi uridini zamenjeni analogom uridina, npr. pseudouridinom ili 5-metoksiuridinom. U sledećim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid i/ili iRNK koja kodira OX40L polipeptid) može imati uniformnu hemijsku modifikaciju dva, tri, ili četiri nukleozida istog tipa duž celog polinukleotida (npr. iRNK) (kao
1 1
što su svi uridini i svi citozini, itd. modifikovani na isti način). Kada je polinukleotid (npr. iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid i/ili iRNK koja kodira OX40L polipeptid) iz predmetne objave hemijski i/ili strukturno modifikovan, iRNK se može označiti kao "modifikovana iRNK". Neograničavajući primeri hemijskih modifikacija su opisani ovde na drugom mestu.
[0314] U nekim aspektima, prvi polinukleotid i/ili drugi polinukleotid sadrže najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid. U nekim aspektima, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid je odabran iz grupe koja se sastoji od bilo kog od ovde objavljenih hemijski modifikovanih nukleozida i njihove kombinacije.
[0315] U nekim aspektima, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid je odabran iz grupe koja se sastoji od pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitozina, 5-metoksiuridina, i njihove kombinacije.
[0316] U nekim aspektima, pri čemu su nukleozidi u prvom polinukleotidu, drugom polinukleotidu i/ili trećem polinukleotidu hemijski modifikovani za najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100%.
[0317] U nekim aspektima, hemijski modifikovani nukleozidi u prvom polinukleotidu, drugom polinukleotidu i/ili trećem polinukleotidu su odabrani iz grupe koja se sastoji od uridina, adenina, citozina, guanina, i bilo koje njihove kombinacije. U nekim aspektima, nukleozidi uridina u prvom polinukleotidu, drugom polinukleotidu i/ili trećem polinukleotidu su hemijski modifikovani za najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100%.
[0318] U nekim aspektima, nukleozidi adenozina u prvom polinukleotidu, drugom polinukleotidu i/ili trećem polinukleotidu su hemijski modifikovani za najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko
1 2
80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100%.
[0319] U nekim aspektima, nukleozidi citidina u prvom polinukleotidu, drugom polinukleotidu i/ili trećem polinukleotidu su hemijski modifikovani za najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100%.
[0320] U nekim aspektima, nukleozidi guanozina u prvom polinukleotidu, drugom polinukleotidu i/ili trećem polinukleotidu su hemijski modifikovani za najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100%.
[0321] U nekim aspektima, svaka od iRNK koja kodira prvi protein, iRNK koja kodira drugi protein, i iRNK koja kodira treći protein sadrži otvoreni okvir čitanja.
[0322] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid sadrži IL-12p40 podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična IL-23 polipeptidnoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da se veže za IL-23p19 podjedinicu i formira IL-23, koji ima aktivnost IL-23.
[0323] U nekim aspektima, IL-12p40 podjedinica je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci koja kodira IL-23 polipeptid koja je navedena u Tabeli 1.
[0324] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid sadrži IL-23p19 podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična IL-23 polipeptidnoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da se veže za IL-12p40 podjedinicu i formira IL-23, koji ima aktivnost IL-23.
1
[0325] U nekim aspektima, IL-23p19 podjedinica je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sekvenci koja kodira IL-23 polipeptid koja je navedena u Tabeli 1.
[0326] U nekim aspektima, IL-12p40 podjedinica i IL-23p19 podjedinica IL-23 proteina su na jednom polipeptidnom lancu ili na dva različita lanca. U nekim aspektima, IL-12p40 podjedinica i IL-23p19 podjedinica su fuzionisane pomoću linkera. U nekim aspektima, IL-12p40 podjedinica sadrži signalni peptid. U nekim aspektima, IL-23p19 podjedinica sadrži signalni peptid. U nekim aspektima, IL-12p40 podjedinica je zreli IL-12p40 (tj. ne sadrži signalni peptid). U nekim aspektima, IL-23p19 podjedinica je zreli IL-23p19 (tj. ne sadrži signalni peptid). U nekim aspektima, IL-12p40 podjedinica sadrži nenativni signalni peptid. U nekim aspektima, IL-23p19 podjedinica sadrži nenativni signalni peptid.
[0327] U nekim aspektima, IL-23 je fuzioni polipeptid koji sadrži IL-12p40 podjedinicu i IL-23p19 podjedinicu u skladu sa bilo kojom od sledećih alternativnih formula:
[signalni peptid 1]-[IL-12p40]-[linker]-[IL-23p19]
[signalni peptid 2]-[IL-23p19]-[linker]-[IL-12p40]
pri čemu [signalni peptid 1] može biti signalni peptid IL-12p40 ili nenativni signalni peptid, [signalni peptid 2] može biti signalni peptid IL-23p19 ili nenativni signalni peptid, [IL-12p40] je zreli IL-12p40, [IL-23p19] je zreli IL-23p29, i [linker] je peptidni linker.
[0328] U nekim aspektima, peptidni linker sadrži (GS) linker. U nekim aspektima, (GS) linker sadrži (GnS)m sekvencu, pri čemu je n 1-20 i m je 1-100. U nekim aspektima, (GS) linker sadrži sekvencu GGS, GGGS, GGGGS (SEQ ID NO: 136), GGGGGS (SEQ ID NO: 137), GGGGGGS (SEQ ID NO: 138), GGGGGGGS (SEQ ID NO: 139), GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 183), GGSGGGGG (SEQ ID NO: 184), ili GSGSGSGS (SEQ ID NO: 185). U nekim aspektima, linker može da sadrži (EAAAK)q(SEQ ID NO: 163), pri čemu je q ceo broj od 1 do 5. U jednom aspektu, linker može da sadrži (EAAAK)3, tj. EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 164). U nekim aspektima, linker može biti linker bogat sa Gly, na primer, koji sadrži (Gly)p, pri čemu je p ceo broj od 1 do 40. U nekim aspektima, linker bogat sa Gly može da sadrži GGGGG (SEQ ID NO: 165), GGGGGG (SEQ ID NO: 166), GGGGGGG (SEQ ID NO: 167) ili GGGGGGGG (SEQ ID NO: 168). Dodatni primeri linkera uključuju, ali ne ograničavaju se na, GGGGSLVPRGSGGGGS (SEQ ID NO: 169), GSGSGS (SEQ ID NO:
1 4
170), GGGGSLVPRGSGGGG (SEQ ID NO: 171), GGSGGHMGSGG (SEQ ID NO: 172), GGSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 173), GGSGG (SEQ ID NO: 174), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 175), GGGSEGGGSEGGGSEGGG (SEQ ID NO: 176), AAGAATAA (SEQ ID NO: 177), GGSSG (SEQ ID NO: 178), GSGGGTGGGSG (SEQ ID NO: 179), GSGSGSGSGGSG (SEQ ID NO: 180), GSGGSGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 181), i GSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 182). Linkeri koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati u bilo kom od polinukleotida koji su ovde opisani.
[0329] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid u skladu sa prethodno navedenim formulama (tj. IL-23 polipeptid koji sadrži IL-12p40 podjedinicu i IL-23p19 podjedinicu) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična IL-23 polipeptidnoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu je amino-kiselinska sekvenca sposobna da ima najmanje jednu aktivnost IL-23 (npr. vezivanje za IL-23 receptor).
[0330] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid u skladu sa prethodno navedenim formulama (tj. IL-23 polipeptid koji sadrži IL-12p40 podjedinicu i IL-23p19 podjedinicu) je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sekvenci koja je navedena u Tabeli 1.
[0331] U nekim aspektima, IL-36-gama polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična IL-36-gama polipeptidnoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1, pri čemu je polipeptid sposoban da ima aktivnost IL-36-gama (npr. vezivanje za IL-36 receptor).
[0332] U nekim aspektima, IL-36-gama polipeptid je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sekvenci koja kodira IL-36-gama polipeptid koja je navedena u Tabeli 1.
[0333] U nekim aspektima, IL-18 polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična IL-18 polipeptidnoj sekvenci koja
1
je navedena u Tabeli 1, pri čemu je polipeptid sposoban da ima aktivnost IL-18 (npr. vezivanje za IL-18 receptor).
[0334] U nekim aspektima, IL-18 polipeptid je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sekvenci koja kodira IL-18 polipeptid koja je navedena u Tabeli 1.
[0335] U drugim aspektima, kompozicija iz objave dodatno sadrži treći polinukleotid koji kodira treći protein. U jednom aspektu, treći polinukleotid sadrži iRNK koja kodira treći protein. U sledećim aspektima, treći polinukleotid kodira OX40L polipeptid.
[0336] U nekim aspektima, OX40L polipeptid sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična OX40L polipeptidnoj sekvenci koja je navedena u Tabeli 1A, pri čemu je polipeptid sposoban da ima aktivnost OX40L (npr. vezivanje za OX40L receptor).
[0337] U nekim aspektima, OX40L polipeptid je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sekvenci koja kodira OX40L polipeptid koja je navedena u Tabeli 1A.
[0338] U određenim aspektima, kompozicija dodatno sadrži četvrti polinukleotid koji kodira četvrti protein. U nekim aspektima, četvrti polinukleotid sadrži iRNK koja kodira četvrti protein. U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid dodatno sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži miRNA vezujuće mesto.
[0339] U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto se vezuje za miR-122. U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto se vezuje za miR-122-3p ili za miR-122-5p. U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 24, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122 (miR-122-3p, 22 nts -aacgccauuaucacacuaaaua). U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 26, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122 (miR-122-5p, 22 nts - uggaguguga caaugguguuug). U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid sadrže dva
1
različita miRNA vezujuća mesta ili isto miRNA vezujuće mesto. U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid sadrže najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, ili najmanje deset miRNA vezujućih mesta.
[0340] U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid dodatno sadrže 5' UTR. U nekim aspektima, 5' UTR sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identična 5' UTR sekvenci koja je navedena u Tabeli 3. U određenim aspektima, 5' UTR sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 44. U sledećim posebnim aspektima, 5' UTR se suštinski sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 44. Treba razumeti da 5' UTR može biti jedan element unutar većeg konstrukta, npr. koji dodatno uključuje 5' terminusnu kapu, OFR (npr. SEQ ID NO: 17, 19, 71, 94, i 116), 3' UTR (npr. SEQ ID NO: 119 ili 120), i/ili poliA rep. U nekim aspektima, jedno ili više miRNA vezujućih mesta može biti pozicionirano unutar 5' UTR na jednom ili više mogućih insercionih mesta.
[0341] U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid sadrže 3' UTR. U nekim aspektima, 3' UTR sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identična 3' UTR sekvenci koja je navedena u Tabeli 4A ili 4B. U određenim aspektima, 3' UTR sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 119 ili 120. U sledećim posebnim aspektima, 3' UTR se suštinski sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 120. Treba razumeti da 3' UTR može biti jedan element unutar većeg konstrukta, npr. koji dodatno uključuje 5' terminusnu kapu, 5' UTR (npr. SEQ ID NO: 27 ili 44), OFR (npr. SEQ ID NO: 17, 19, 71, 94, i 116), i/ili poliA rep.
[0342] U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) se insertuje unutar 3' UTR. U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) se insertuje unutar 3' UTR nizvodno od stop kodona kodirajućeg regiona unutar poliribonukleotida iz objave, npr. iRNK, u kom slučaju postoje 3' UTR baze između stop kodona i jednog ili više miR vezujućih mesta. U nekim aspektima, ukoliko postoji više kopija stop kodona u konstruktu, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) se insertuje
1
nizvodno od krajnjeg stop kodona. U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) se insertuje oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 80, oko 90, ili oko 100 baza nizvodno od stop kodona (ili krajnjeg stop kodona ukoliko postoji više stop kodona u konstruktu). U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) se insertuje nizvodno od stop kodona (ili krajnjeg stop kodona ukoliko postoji više stop kodona u konstruktu) tako da postoji 79 3' UTR baza između stop kodona i jednog ili više miR vezujućih mesta.
[0343] U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid dodatno sadrže spejser sekvencu fuzionisanu za miRNA vezujuće mesto. U nekim aspektima, spejser sekvenca sadrži najmanje oko 10 nukleotida, najmanje oko 15 nukleotida, najmanje oko 20 nukleotida, najmanje oko 25 nukleotida, najmanje oko 30 nukleotida, najmanje oko 35 nukleotida, najmanje oko 40 nukleotida, najmanje oko 45 nukleotida, najmanje oko 50 nukleotida, najmanje oko 55 nukleotida, najmanje oko 60 nukleotida, najmanje oko 65 nukleotida, najmanje oko 70 nukleotida, najmanje oko 75 nukleotida, najmanje oko 80 nukleotida, najmanje oko 85 nukleotida, najmanje oko 90 nukleotida, najmanje oko 95 nukleotida, ili najmanje oko 100 nukleotida.
[0344] U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid dodatno sadrže 5' terminusnu kapu. U nekim aspektima, 5' terminusna kapa je Cap0, Cap1, ARCA, inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, 2-azidoguanozin, Cap2, Cap4, 5' metilG kapa, ili njihov analog. U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid sadrže 3' poliA rep. U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid su kodon optimizovani. U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid su in vitro transkribovani (IVT). U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid su himerni. U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, treći polinukleotid, i/ili četvrti polinukleotid su cirkularni.
[0345] U nekim aspektima, IL-23 polipeptid IL-12p40 podjedinica, IL-23 polipeptid IL-23p19 podjedinica, IL-36-gama polipeptid, i/ili OX40L polipeptid su fuzionisani za heterologni polipeptid.
[0346] U nekim aspektima, prvi polinukleotid (npr. iRNK), drugi polinukleotid (npr. iRNK), i treći polinukleotid (npr. iRNK) sadrže, sastoje se suštinski od, ili se sastoje od 5' terminusne kape, 5' UTR, otvorenog okvira čitanja (ORF), 3' UTR, i poliA repa. U jednom aspektu, prvi
1
polinukleotid (npr. iRNK) sadrži, sastoji se suštinski od, ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 27 ili 44, SEQ ID NO: 19, 71 ili 141, i SEQ ID NO: 119 ili 120. U sledećim aspektima, drugi polinukleotid (npr. iRNK) sadrži, sastoji se suštinski od, ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 27 ili 44, SEQ ID NO: 17, 94 ili 143, i SEQ ID NO: 119 ili 120. U još jednom aspektu, treći polinukleotid (npr. iRNK) sadrži, sastoji se suštinski od, ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 27 ili 44, SEQ ID NO: 116 ili 145, i SEQ ID NO: 119 ili 120.
[0347] U određenim aspektima, prvi polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 142. U sledećim posebnim aspektima, prvi polinukleotid se sastoji suštinski od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 142. U još jednom posebnom aspektu, prvi polinukleotid se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 142.
[0348] U određenim aspektima, drugi polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 144. U sledećim posebnim aspektima, drugi polinukleotid se sastoji suštinski od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 144. U još jednom posebnom aspektu, drugi polinukleotid se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 144.
[0349] U određenim aspektima, treći polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 146. U sledećim posebnim aspektima, treći polinukleotid se sastoji suštinski od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 146. U još jednom posebnom aspektu, treći polinukleotid se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 146.
[0350] U nekim aspektima, prvi polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična bilo kojoj od sekvenci koje kodiraju IL-23 koje su objavljene u Tabeli 1.
1
[0351] U nekim aspektima, drugi polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična bilo kojoj od sekvenci koje kodiraju IL-36-gama koje su objavljene u Tabeli 1.
[0352] U nekim aspektima, drugi polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% identična sekvenci koja kodira IL-18, pri čemu navedena sekvenca sadrži sekvencu koja kodira IL-18 koja je objavljena u Tabeli 1.
[0353] U nekim aspektima, treći polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identična sekvenci koja kodira OX40L ili OX40L_miR-122 konstruktu iz Tabele 1A.
[0354] U drugim aspektima, kompozicija za objavu sadrži četvrti protein ili četvrti polinukleotid koji kodira četvrti protein. Na primer, četvrti polinukleotid može da sadrži iRNK koja kodira četvrti protein.
[0355] U nekim aspektima, kompozicije koje su ovde objavljene su za upotrebu u redukovanju ili smanjenju veličine tumora ili inhibiranju rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno. U nekim aspektima, kompozicije koje su ovde objavljene su za upotrebu u redukovanju ili smanjenju veličine tumora ili inhibiranju rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno.
[0356] U nekim aspektima, kompozicije koje su ovde objavljene primenjuju se subjektu kome je to potrebno za lečenje kancera, i primena kompozicije leči ili ublažava simptome kancera.
[0357] U nekim aspektima, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera korteksa nadbubrežne žlezde, uznapredovalog kancera, analnog kancera, aplastične anemije, kancera žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, kancera kostiju, metastaze u kostima, tumora mozga, kancera mozga, kancera dojke, kancera u detinjstvu, kancera nepoznatog primarnog porekla, Kaslmanove (Castleman) bolesti, kancera grlića materice, kancera kolona/rektuma, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, Juing (Ewing) porodice tumora, kancera oka, kancera žučne kese, gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, gastrointestinalnih stromalnih tumora, gastrointestinalne trofoblastne bolesti, Hočkinove (Hodgkin) bolesti, Kapošijevog (Kaposi) sarkoma, karcinoma bubrežnih ćelija, kancera larinksa i hipofarinksa, akutne limfocitne leukemije, akutne mijeloidne leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične
1
mijeloidne leukemije, hronične mijelomonocitne leukemije, kancera jetre, hepatocelularnog karcinoma (HCC), nesitnoćelijskog kancera pluća, sitnoćelijskog kancera pluća, karcinoidnog tumora pluća, limfoma kože, malignog mezotelioma, multipla mijeloma, mijelodisplastičnog sindroma, kancera nosne šupljine i paranazalnih sinusa, kancera nazofarinksa, neuroblastoma, ne-Hočkinovog limfoma, kancera usne duplje i orofarinksa, osteosarkoma, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera penisa, tumora hipofize, kancera prostate, retinoblastoma, rabdomiosarkoma, kancera pljuvačne žlezde, sarkoma mekog tkiva odraslih, kancera bazalnih i skvamoznih ćelija kože, melanoma, kancera tankog creva, kancera želuca, kancera testisa, kancera grla, kancera timusa, kancera štitne žlezde, sarkoma materice, kancera vagine, kancera vulve, Valdenstromove (Waldenstrom) makroglobulinemije, Vilmsovog (Wilms) tumora, sekundarnih kancera uzrokovanih lečenjem kancera, i bilo koje njihove kombinacije.
[0358] U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid i/ili treći polinukleotid su formulisani za isporuku pomoću uređaja koji sadrži pumpu, flastera, rezervoara za lek, uređaja sa kratkom iglom, uređaja sa jednom iglom, uređaja sa više igala, uređaja sa mikro iglom, uređaja za mlazno ubrizgavanje, uređaja za isporuku balističkog praha/čestica, katetera, lumena, krioprobe, kanile, mikrokanile, ili uređaja koji koriste toplotu, RF energiju, električnu struju, ili bilo koje njihove kombinacije. U nekim aspektima, efikasna količina kompozicije koja je ovde objavljena je između oko 0,10 mg/kg do oko 1000 mg/kg. U nekim aspektima, kompozicije koje su ovde objavljene su formulisane za primenu kod humanog subjekta.
[0359] U nekim aspektima, kompozicije i formulacije koje su ovde objavljene su za upotrebu u lečenju kancera. U nekim aspektima, opisane kompozicije i formulacije se upotrebljavaju za proizvodnju medikamenta za lečenje kancera.
[0360] Treba razumeti da nema namere da se ograničavaju kombinacije polinukleotida koje su ovde objavljene (npr. prvi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid i treći polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid) na određene oblike koji su objavljeni. U tom pogledu, objave koje se odnose na određeni polinukleotid i njegov odgovarajući kodirani polipeptid u ovom odeljku su podjednako primenljive na dodatne polinukleotide i njihove odgovarajuće kodirane polipeptide, npr. treći, četvrti, peti, itd. polipeptid, koji se kombinuju sa IL-23, IL-36-gama, IL-18, i/ili OX40L-kodirajućim polinukleotidima koji su ovde objavljeni. Stoga, objave koje se odnose na "prvi polinukleotid" ili "drugi polinukleotid" (ili odgovarajuće kodirane polipeptide) su podjednako primenljive na
1 1
"treći polinukleotid" i sukcesivne polinukleotide (ili njihove odgovarajuće kodirane polipeptide).
[0361] Pored toga, specifične objave koje se odnose na određeni protein kodiran prvim ili drugim polinukleotidom, npr. objava da "drugi polinukleotidi sadrže iRNK koja kodira humani IL-36-gama polipeptid kome nedostaje najmanje jedna, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje 10, najmanje 14, ili najmanje 15 amino-kiselina na N-terminusu ili C-terminusu IL-36-gama polipeptida divljeg tipa", bila bi podjednako primenljiva na treće i sukcesivne proteine. U skladu sa tim, osoba sa iskustvom u struci bi razumela da ukoliko je treći protein, na primer, OX40L, treći polinukleotid može da sadrži iRNK koja kodira humani OX40L polipeptid kome nedostaje najmanje jedna, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje 10, najmanje 14, ili najmanje 15 amino-kiselina na N-terminusu ili C-terminusu OX40L polipeptida divljeg tipa, kao što je prethodno objavljeno u odnosu na prvi ili drugi polipeptid iz predmetne objave.
III. Postupci upotrebe kombinacija polinukleotida koji kodiraju imunomodulatorne polipeptide
[0362] Imunoterapija, takođe poznata kao imuno-onkologija, izazvala je revoluciju u lečenju kancera, uvođenjem terapija koje ne ciljaju tumor, već imunski sistem domaćina, terapija koje poseduju jedinstvene profile neželjenih događaja, i terapija koje bi mogle da izleče mnoge tipove kancera. Kao što se ovde upotrebljava, termin "imunoterapija" označava lečenje bolesti indukovanjem, poboljšavanjem, ili supresijom imunskog odgovora. Imunoterapije dizajnirane da izazovu ili amplifikuju imunski odgovor se označavaju kao "aktivacione imunoterapije", dok se imunoterapije koje redukuju ili suprimiraju imunski odgovor označavaju kao "supresivne imunoterapije".
[0363] Kanceri pluća, bubrega, mokraćne bešike i kože su među onima koji imaju značajnu korist od lečenja sa imuno-onkologijom u smislu preživljavanja ili tumorskog odgovora, pri čemu melanom verovatno pokazuje najveću korist. Imunoterapija često predstavlja lečenje inhibitora kontrolne tačke sa uzbudljivom novom klasom bioloških lekova koji su poznati kao antitela prema inhibitorima kontrolne tačke. Ciljevi uključuju, na primer, PD-1, PD-L1, i CTLA-4.
1 2
[0364] Monoklonalna antitela koja ciljaju PD-1, PD-L1, ili CTLA4 mogu da podstaknu imunski odgovor protiv kancerskih ćelija i pokazala su mnoga obećanja u lečenju određenih kancera. Na primer, pembrolizumab (Keytruda<®>) i nivolumab (Opdivo<®>) ciljaju PD-1; atezolizumab (Tecentriq<®>) cilja PD-L1; i ipilimumab (Yervoy®) se vezuje za i inhibira CTLA-4.
[0365] Jedna zabrinutost sa ovim lekovima je da oni mogu dozvoliti imunskom sistemu da napadne neke normalne organe u telu, što može dovesti do ozbiljnih ili čak životno opasnih neželjenih efekata kod nekih ljudi. Jedan od načina da se redukuju takvi neželjeni efekti je primena drugih agenasa u kombinaciji sa ovim antitelima prema inhibitorima kontrolne tačke, što idealno omogućava lekarima da smanje dozu lečenja antitela.
[0366] Prema tome, predmetna objava obezbeđuje postupke za lečenje kancera (npr. redukovanje ili smanjenje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno) koji sadrže primenu bilo koje od kompozicija koje su objavljene u Odeljku II, supra. Konkretno, predmetna objava obezbeđuje postupke za lečenje kancera (npr. redukovanje ili smanjenje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno) koji sadrže primenu subjektu kome je to potrebno:
(i) najmanje jednog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira protein koji sadrži IL-23 polipeptid,
(ii) najmanje jednog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i/ili
(iii) najmanje jednog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira protein koji sadrži OX40L polipeptid.
[0367] U nekim aspektima, predmetna objava obezbeđuje postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora i/ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu najmanje dva polinukleotida, pri čemu su najmanje dva polinukleotida odabrana od prvog polinukleotida koji kodira IL-23 polipeptid, drugog polinukleotida koji kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptida, i trećeg polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid. U jednom posebnom aspektu, postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora i/ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno sadrži primenu subjektu (i) prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, (ii) drugog polinukleotida koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, (iii) trećeg polipeptida koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, i/ili (iv) bilo
1
koju njihovu kombinaciju. U sledećim posebnim aspektima, postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora i/ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno sadrži primenu subjektu (i) prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 141), (ii) drugog polinukleotida koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 143), i (iii) trećeg polipeptida koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 145), poželjno u masenom odnosu od 1:2:1 tež./tež. U nekim posebnim aspektima, postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora i/ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno dodatno sadrži primenu subjektu efikasnih količina dopunskog polinukleotida, npr. četvrtog ili petog polinukleotida koji kodira četvrti ili peti protein.
[0368] U drugim aspektima, predmetna objava obezbeđuje postupke za promovisanje antitumorskog efekta (npr. indukovati proliferaciju T ćelija, indukovati infiltraciju T ćelija u tumor, indukovati odgovor memorijskih T ćelija, povećati broj NK ćelija, itd.) primenom prvog, drugog, i/ili trećeg polinukleotida (npr. iRNK) koji su ovde opisani.
[0369] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, indukovanja proliferacije T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, indukovanja infiltracije T ćelija u tumor subjekta kome je to potrebno, i/ili indukovanja odgovora memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu prvog polinukleotida koji kodira IL-23, drugog polinukleotida koji kodira IL-36-gama ili IL-18, trećeg polinukleotida koji kodira OX40L, ili njihove kombinacije. U određenim aspektima, postupak aktiviranja T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, indukovanja proliferacije T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, indukovanja infiltracije T ćelija u tumor subjekta kome je to potrebno, i/ili indukovanja odgovora memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno sadrži primenu subjektu (i) prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 141), (ii) drugog polinukleotida koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 143), i (iii) trećeg polipeptida koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 145), poželjno u masenom odnosu od 1:2:1 tež./tež. U određenim aspektima, intratumorska primena prvog polinukleotida (npr. iRNK), drugog polinukleotida (npr. iRNK), i/ili trećeg polinukleotida (npr. iRNK) može povećati efikasnost antitumorskog efekta (npr. infiltracija T ćelija u tumor) u poređenju sa drugim putevima primene.
[0370] U jednom aspektu, aktivirane T ćelije kod subjekta redukuju ili smanjuju veličinu tumora ili inhibiraju rast tumora kod subjekta. Aktivacija T ćelija se može izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što je merenje proliferacije T ćelija; merenje proizvodnje citokina
1 4
pomoću enzimskih imunosorbentnih testova (ELISA) ili enzimskih imunospot testova (ELISPOT); ili detekcija markera na površini ćelije povezanih sa aktivacijom T ćelija (npr. CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154, i CD134) tehnikama kao što je protočna citometrija.
[0371] U jednom aspektu, proliferacija T ćelija kod subjekta je usmerena na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U sledećem aspektu, proliferacija T ćelija kod subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Proliferacija T ćelija se može izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što su brojanje ćelija, bojenje vijabilnosti, testovi optičke gustine, ili detekcija markera na površini ćelije povezanih sa aktivacijom T ćelija (npr. CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154, i CD134) tehnikama kao što je protočna citometrija.
[0372] U jednom aspektu, infiltracija T ćelija u tumor subjekta je usmerena na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U sledećem aspektu, infiltracija T ćelija u tumor subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Infiltracija T ćelija u tumor može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što su pravljenje preseka tkiva i bojenje za ćelijske markere, merenje lokalne proizvodnje citokina na mestu tumora, ili detekcija površinskih markera T ćelija tehnikama kao što je protočna citometrija.
[0373] U jednom aspektu, odgovor memorijskih T ćelija kod subjekta je usmeren na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U sledećem aspektu, odgovor memorijskih T ćelija kod subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Odgovor memorijskih T ćelija može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što su merenje markera T ćelija povezanih sa memorijskim T ćelijama, merenje lokalne proizvodnje citokina povezanih sa memorijskim imunskim odgovorom, ili detektovanje površinskih markera memorijskih T ćelija tehnikama kao što je protočna citometrija.
[0374] U određenim aspektima, aktivirane T ćelije po predmetnim postupcima su CD4<+>ćelije, CD8<+>ćelije, CD62<+>(L-selektin<+>) ćelije, CD69<+>ćelije, CD40L<+>ćelije, CD137<+>ćelije, CD25<+>ćelije, CD71<+>ćelije, CD26<+>ćelije, CD27<+>ćelije, CD28<+>ćelije, CD30<+>ćelije, CD45<+>ćelije, CD45RA<+>ćelije, CD45RO<+>ćelije, CD11b<+>ćelije, CD154<+>ćelije, CD134<+>ćelije, CXCR3<+>ćelije, CCR4<+>ćelije, CCR6<+>ćelije, CCR7<+>ćelije, CXCR5<+>ćelije, Crth2<+>ćelije, gama delta T ćelije, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, T ćelije aktivirane po predmetnim postupcima su Th1ćelije. U drugim aspektima, T ćelije aktivirane po predmetnim postupcima su Th2ćelije. U drugim aspektima, T ćelije aktivirane po predmetnoj objavi su citotoksične T ćelije.
1
[0375] U nekim aspektima, infiltrirajuće T ćelije po predmetnim postupcima su CD4<+>ćelije, CD8<+>ćelije, CD62<+>(L-selektin<+>) ćelije, CD69<+>ćelije, CD40L<+>ćelije, CD137<+>ćelije, CD25<+>ćelije, CD71<+>ćelije, CD26<+>ćelije, CD27<+>ćelije, CD28<+>ćelije, CD30<+>ćelije, CD45<+>ćelije, CD45RA<+>ćelije, CD45RO<+>ćelije, CD11b<+>ćelije, CD154<+>ćelije, CD134<+>ćelije, CXCR3<+>ćelije, CCR4<+>ćelije, CCR6<+>ćelije, CCR7<+>ćelije, CXCR5<+>ćelije, Crth2<+>ćelije, gama delta T ćelije, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, infiltrirajuće T ćelije po predmetnim postupcima su Th1ćelije. U drugim aspektima, infiltrirajuće T ćelije po predmetnim postupcima su Th2ćelije. U drugim aspektima, infiltrirajuće T ćelije po predmetnoj objavi su citotoksične T ćelije.
[0376] U nekim aspektima, memorijske T ćelije indukovane predmetnim postupcima su CD4<+>ćelije, CD8<+>ćelije, CD62<+>(L-selektin<+>) ćelije, CD69<+>ćelije, CD40L<+>ćelije, CD137<+>ćelije, CD25<+>ćelije, CD71<+>ćelije, CD26<+>ćelije, CD27<+>ćelije, CD28<+>ćelije, CD30<+>ćelije, CD45<+>ćelije, CD45RA<+>ćelije, CD45RO<+>ćelije, CD11b<+>ćelije, CD154<+>ćelije, CD134<+>ćelije, CXCR3<+>ćelije, CCR4<+>ćelije, CCR6<+>ćelije, CCR7<+>ćelije, CXCR5<+>ćelije, Crth2<+>ćelije, gama delta T ćelije, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, memorijske T ćelije po predmetnim postupcima su Th1ćelije. U drugim aspektima, memorijske T ćelije po predmetnim postupcima su Th2ćelije. U drugim aspektima, memorijske T ćelije po predmetnoj objavi su citotoksične T ćelije.
[0377] Predmetna objava dodatno obezbeđuje postupak povećanja broja ćelija prirodnih ubica (NK) kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23, i/ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama ili IL-18. U određenim aspektima, postupak povećanja broja ćelija prirodnih ubica (NK) kod subjekta kome je to potrebno, sadrži primenu subjektu (i) prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 141), (ii) drugog polinukleotida koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 143), i (iii) trećeg polipeptida koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 145), poželjno u masenom odnosu od 1:2:1 tež./tež. U jednom aspektu, povećanje broja NK ćelija kod subjekta je usmereno na antitumorski imunski odgovor kod subjekta. U sledećem aspektu, povećanje broja NK ćelija kod subjekta redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora kod subjekta. Povećanje broja NK ćelija kod subjekta može se izmeriti upotrebom aplikacija u struci kao što je detekcija markera na površini NK ćelija (npr. CD335/NKp46; CD336/NKp44; CD337/NPp30) ili unutarćelijskih markera NK ćelija (npr. perforin; granzimi; granulizin).
1
[0378] U određenim aspektima, primena najmanje dve iRNK odabrane od iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama ili iRNK koja kodira IL-18, i iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava ukupan broj NK ćelija kod subjekta u poređenju sa brojem NK ćelija kod subjekta kome se ne primenjuju najmanje dve iRNK ili kome se primenjuje iRNK koja kodira samo IL-23, iRNK koja kodira samo IL-36-gama, iRNK koja kodira IL-18, ili iRNK koja kodira samo OX40L. U drugim aspektima, primena najmanje dve iRNK odabrane od iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, iRNK koja kodira IL-18, i iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava ukupan broj NK ćelija kod subjekta u poređenju sa subjektom kome se primenjuje dendritska ćelija transdukovana sa iRNK koja kodira samo OX40L polipeptid, iRNK koja kodira samo IL-23, ili iRNK koja kodira samo IL-36-gama, ili iRNK koja kodira IL-18. U drugim aspektima, primena najmanje dve iRNK odabrane od iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, iRNK koja kodira IL-18, i iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava broj NK ćelija kod subjekta unutar mikrookruženja tumora u poređenju sa brojem kod subjekta kome nisu primenjene najmanje dve iRNK ili kome se primenjuje iRNK koja kodira samo IL-23, iRNK koja kodira samo IL-36-gama, iRNK koja kodira IL-18, ili iRNK koja kodira samo OX40L polipeptid. U drugim aspektima, primena najmanje dve iRNK odabrane od iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, iRNK koja kodira IL-18, i iRNK koja kodira OX40L polipeptid povećava broj NK ćelija kod subjekta unutar mikrookruženja tumora u poređenju sa brojem kod subjekta kome se primenjuje dendritska ćelija transdukovana sa iRNK koja kodira samo OX40L polipeptid, iRNK koja kodira samo IL-23, iRNK koja kodira samo IL-18, ili iRNK koja kodira samo IL-36-gama. U drugim aspektima, koncentracija NK ćelija unutar mikrookruženja tumora je povećana dok ukupan broj NK ćelija kod subjekta ostaje isti.
[0379] U određenim aspektima objave, broj NK ćelija se povećava najmanje oko dva puta, najmanje oko tri puta, najmanje oko četiri puta, najmanje oko pet puta, najmanje oko šest puta, najmanje oko sedam puta, najmanje oko osam puta, najmanje oko devet puta, ili najmanje oko deset puta u poređenju sa kontrolom (npr. fiziološki rastvor ili iRNK bez ekspresije IL-23, IL-36-gama, ili OX40L). U određenim aspektima, broj NK ćelija se povećava pomoću najmanje dve iRNK odabrane od iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, iRNK koja kodira IL-18, i iRNK koja kodira OX40L polipeptid najmanje oko dva puta u poređenju sa kontrolom (npr. fiziološki rastvor ili iRNK bez ekspresije IL-23, IL-36-gama, IL-18, ili OX40L).
[0380] U jednom aspektu, primena kombinacija koje su ovde objavljene redukuje ili smanjuje veličinu tumora ili inhibira rast tumora najmanje 1,5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 2,5 puta,
1
najmanje 3 puta, najmanje 3,5 puta, najmanje 4 puta, najmanje 4,5 puta, ili najmanje 5 puta bolje od (i) primene prvog polinukleotida koji kodira samo prvi protein (npr. polinukleotid koji kodira protein koji sadrži IL-23 polipeptid), (ii) primene drugog polinukleotida koji kodira samo drugi protein (npr. polinukleotid koji kodira protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid), ili (iii) primene trećeg polinukleotida koji kodira samo treći protein (npr. polinukleotid koji kodira protein koji sadrži OX40L polipeptid). Redukovanje ili smanjenje veličine ili inhibicija rasta tumora može se izmeriti upotrebom bilo kog postupka koji je poznat u struci bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0381] U nekim aspektima, redukovanje ili smanjenje veličine tumora, ili inhibicija rasta tumora je najmanje 1,5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 2,5 puta, najmanje 3 puta, najmanje 3,5 puta, najmanje 4 puta, najmanje 4,5 puta, ili najmanje 5 puta viša od kontrole (npr. tretman sa PBS, tretman sa polinukleotidom koji kodira kontrolni protein, ili tretman sa kontrolnim proteinom).
[0382] U nekim aspektima, prvi polinukleotid koji se primenjuje u skladu sa postupcima koji su ovde objavljeni sadrži RNK, npr. iRNK, koja kodira prvi protein (npr. protein koji sadrži IL-23 polipeptid). U nekim aspektima, drugi polinukleotid koji se primenjuje u skladu sa postupcima koji su ovde objavljeni sadrži RNK, npr. iRNK, koja kodira drugi protein (npr. protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid). U nekim aspektima, treći polinukleotid koji se primenjuje u skladu sa postupcima koji su ovde objavljeni sadrži RNK, npr. iRNK, koja kodira treći protein (npr. protein koji sadrži OX40L polipeptid).
[0383] Postupci koji su ovde objavljeni sadrže primenu bilo koje od kompozicija iz predmetne objave bilo kojim raspoloživim putem, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intratumorski, enteralni, gastroenteralni, epiduralni, oralni, transdermalni, epiduralni (periduralni), intracerebralni (u cerebrum), intracerebroventrikularni (u cerebralne komore), epikutani (nanošenje na kožu), intradermalni (u samu kožu), subkutani (ispod kože), nazalnu primenu (kroz nos), intravenski (u venu), intraperitonealno (u peritoneum), intraarterijski (u arteriju), intramuskularni (u mišić), intrakardijalni (u srce), intraosealnu infuziju (u kostnu srž), intratekalno (u kičmeni kanal), intraperitonealno (infuzija ili injekcija u peritoneum), intravezikalnu infuziju, intravitrealno (kroz oko), intrakavernoznu injekciju (u bazu penisa), intravaginalnu primenu, intrauterino, ekstra-amnionsku primenu, transdermalno (difuzijom kroz intaktnu kožu za sistemsku distribuciju), transmukozno (difuzija kroz mukoznu membranu), insuflaciju (šmrkanje), sublingvalno, sulabijalno, klistir, kapi za oči (na konjuktivu), ili u kapima za uho.
1
[0384] U nekim aspektima, postupci koji su ovde objavljeni sadrže primenu prvog polinukleotida, drugog polinukleotida, i/ili trećeg polinukleotida subkutano, intravenski, intramuskularno, intraartikularno, intrasinovijalno, intrasternalno, intratekalno, intrahepatično, intralezijsko, intrakranijalno, intraventrikularno, oralno, inhalacionim sprejem, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili putem implantiranog rezervoara.
[0385] U nekim aspektima, postupci koji su ovde objavljeni sadrže primenu prvog polinukleotida, drugog polinukleotida, i/ili trećeg polinukleotida kao formulacije za intramuskularnu, subkutanu, intratumorsku, ili intradermalnu isporuku. U nekim aspektima, formulacija za intramuskularnu, subkutanu, intratumorsku, ili intradermalnu isporuku sadrži dopunske polinukleotide, npr. treći, četvrti ili peti polinukleotid. U određenim aspektima, intratumorska primena prvog polinukleotida, drugog polinukleotida, i/ili trećeg polinukleotida može povećati efikasnost antitumorskog efekta u poređenju sa drugim putevima primene. U nekim aspektima, dopunski polinukleotidi, npr. treći, četvrti ili peti polinukleotid, se primenjuju intratumorski povećavajući efikasnost antitumorskog efekta u poređenju sa drugim putevima primene.
[0386] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i/ili treći polinukleotid formulisani su za in vivo isporuku. U nekim aspektima, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i treći polinukleotid mogu se koformulisati u različitim težinskim odnosima, na primer, sa ekvivalentnim količinama (po težini) svakog polinukleotida ili sa bilo kojim od polunukleotida prisutnih u 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 puta većoj količini (po težini) od drugih polinukleotida. U jednom aspektu, IL-23:IL-36gama:OX40L polinukleotidi su koformulisani u težinskom (masenom) odnosu tako da su IL-23 i OX40L polinukleotidi u približno jednakim količinama i da je IL-36gama polinukleotid prisutan u većoj količini težine (mase), kao što je 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 ili 5,0 puta veća količina težine (mase). U jednom posebnom aspektu, IL-23:IL-36gama:OX40L polinukleotidi su koformulisani u težinskom (masenom) odnosu od 1:2:1. U ovde upotrebljenim, maseni odnos se takođe može odnositi na kompoziciju koja sadrži polinukleotide (npr. iRNK) koji kodiraju OX40L:IL-23:IL-36gama formulisane u težinskom (masenom) odnosu od 1:1:2.
[0387] U drugim aspektima, IL-23:IL-36gama:OX40L polinukleotidi su koformulisani u težinskom (masenom) odnosu od 1:1:1, 2:1:1, 1:2:1, 1:1:2, 3:1:1, 1:3:1, 1:1:3, 4:1:1, 1:4:1, 1:1:4, 5:1:1, 1:5:1, 1:1:5, 6:1:1, 1:6:1, 1:1:6, 7:1:1, 1:7:1, 1:1:8, 9:1:1, 1:9:1, 1:1:9, 10:1:1, 1:10:1, 1:1:10, 11:1:1, 1:11:1, 1:1:11, 12:1:1, 1:12:1, 1:1:12, 13:1:1, 1:13:1, 1:1:13, 14:1:1, 1:14:1, 1:1:14, 15:1:1, 1:15:1, 1:1:15, 16:1:1, 1:16:1, 1:1:16, 17:1:1, 1:17:1, 1:1:17, 18:1:1,
1
1:18:1, 1:1:18, 19:1:1, 1:19:1, 1:1:19, 20:1:1, 1:20:1, 1:1:20, 25:1:1, 1:25:1, 1:1:25, 30:1:1, 1:30:1, 1:1:30, 35:1:1, 1:35:1, 1:1:35, 40:1:1, 1:40:1, 1:1:40, 45:1:1, 1:45:1, 1:1:45, 50:1:1, 1:50:1, ili 1:1:50. U drugim aspektima, svaki od tri polinukleotida može biti prisutan u koformulaciji sa različitom težinom. Samo kao primer, IL-23:IL-36gama:OX40L polinukleotidi mogu se koformulisati u težinskom (masenom) odnosu od 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, ili 3:2:1; ili alternativno u težinskom (masenom) odnosu od 1:3:5, 1:5:3, 3:5:1, 3:1:5, 5:1:3, ili 5:3:1; ili alternativno u težinskom (masenom) odnosu od 1:5:10, 1:10:5, 5:1:10, 5:10:1, 10:1:5, ili 10:5:1. U posebnim aspektima, (i) prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 140), (ii) drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 16), i (iii) treći polipeptid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 21) su formulisani u težinskom (masenom) odnosu od 1:2:1. Iako je ovo poželjna formulacija, stručnjak sa iskustvom će lako razumeti da količine bilo kog od tri sastojka van ovog odnosa mogu takođe da obezbede formulacije koje su pogodne za upotrebu u bilo kom od postupaka koji su ovde objavljeni.
[0388] Polinukleotidna koformulacija se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao više doza. Koformulacije sa različitim težinskim (masenim) odnosima, npr. koformulacija #1 u kojoj su prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i treći polinukleotid prisutni u 1:2:1 tež./tež. i koformulacija #2 u kojoj su prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i treći polinukleotid prisutni u 1:1:2 tež./tež. svaka se može primeniti jednom ili više puta uzastopno, u isto vreme, ili istovremeno.
[0389] U jednom aspektu, 1:2:1 koformulacija (i) prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 140), (ii) drugog polinukleotida koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 16), i (iii) trećeg polipeptida koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 21) se primenjuje kao pojedinačna doza ili kao više doza.
[0390] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, primena kompozicije koja je ovde objavljena leči kancer.
[0391] U određenim aspektima postupka koji je ovde objavljen, kompozicije koje su ovde objavljene primenjuju se za lečenje kancera odabranog iz grupe koja se sastoji od kancera korteksa nadbubrežne žlezde, uznapredovalog kancera, analnog kancera, aplastične anemije, kancera žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, kancera kostiju, metastaze u kostima, tumora mozga, kancera mozga, kancera dojke, kancera u detinjstvu, kancera nepoznatog primarnog porekla, Kaslmanove bolesti, kancera grlića materice, kancera kolona/rektuma,
1
kancera endometrijuma, kancera jednjaka, Juing porodice tumora, kancera oka, kancera žučne kese, gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, gastrointestinalnih stromalnih tumora, gastrointestinalne trofoblastne bolesti, Hočkinove bolesti, Kapošijevog sarkoma, karcinoma bubrežnih ćelija, kancera larinksa i hipofarinksa, akutne limfocitne leukemije, akutne mijeloidne leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, hronične mijelomonocitne leukemije, kancera jetre, hepatocelularnog karcinoma (HCC), nesitnoćelijskog kancera pluća, sitnoćelijskog kancera pluća, karcinoidnog tumora pluća, limfoma kože, malignog mezotelioma, multipla mijeloma, mijelodisplastičnog sindroma, kancera nosne šupljine i paranazalnih sinusa, kancera nazofarinksa, neuroblastoma, ne-Hočkinovog limfoma, kancera usne duplje i orofarinksa, osteosarkoma, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera penisa, tumora hipofize, kancera prostate, retinoblastoma, rabdomiosarkoma, kancera pljuvačne žlezde, sarkoma mekog tkiva odraslih, kancera bazalnih i skvamoznih ćelija kože, melanoma, kancera tankog creva, kancera želuca, kancera testisa, kancera grla, kancera timusa, kancera štitne žlezde, sarkoma materice, kancera vagine, kancera vulve, Valdenstromove makroglobulinemije, Vilmsovog tumora, sekundarnih kancera uzrokovanih lečenjem kancera, i bilo koje njihove kombinacije.
[0392] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid, i/ili treći polinukleotid se isporučuju pomoću uređaja koji sadrži pumpu, flastera, rezervoara za lek, uređaja sa kratkom iglom, uređaja sa jednom iglom, uređaja sa više igala, uređaja sa mikro iglom, uređaja za mlazno ubrizgavanje, uređaja za isporuku balističkog praha/čestica, katetera, lumena, krioprobe, kanile, mikrokanile, ili uređaja koji koriste toplotu, RF energiju, električnu struju, ili bilo koje njihove kombinacije. U drugim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, dopunski polinukleotidi, npr. treći, četvrti ili peti polinukleotid se takođe isporučuju pomoću uređaja koji sadrži pumpu, flastera, rezervoara za lek, uređaja sa kratkom iglom, uređaja sa jednom iglom, uređaja sa više igala, uređaja sa mikro iglom, uređaja za mlazno ubrizgavanje, uređaja za isporuku balističkog praha/čestica, katetera, lumena, krioprobe, kanile, mikrokanile, ili uređaja koji koriste toplotu, RF energiju, električnu struju, ili bilo koje njihove kombinacije.
[0393] U nekim aspektima, efikasna količina kompozicija koje su ovde objavljene koje se upotrebljavaju u postupcima iz predmetne objave je između oko 0,10 mg/kg do oko 1000 mg/kg. U nekim aspektima, subjekt je čovek.
[0394] U nekim aspektima, postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji kodira treći protein
1 1
koji sadrži OX40L polipeptid su deo iste kompozicije (npr. rastvor sadrži i prvi, drugi, i treći polinukleotid). U nekim aspektima, postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid su deo različitih kompozicija (npr. svaki polinukleotid može biti u različitom rastvoru, ili se mogu kombinovati u različitim rastvorima).
[0395] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, primenjuju se istovremeno. U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, primenjuju se u isto vreme. U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, primenjuju se uzastopno (tj. prvi polinukleotid se može primeniti prvi, nakon čega sledi primena drugog polinukleotida, ili obrnuto).
[0396] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži OX40L polipeptid, i polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, primenjuju se istovremeno. U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, polinukleotid koji kodira protein koji sadrži OX40L polipeptid, i polinukleotid koji kodira protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, daju se u isto vreme. U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, polinukleotid koji kodira protein koji sadrži OX40L polipeptid, i polinukleotid koji kodira protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, daju se uzastopno (tj. OX40L polinukleotid se može primeniti prvi, nakon čega sledi primena IL-36-gama polinukleotida ili IL-18 polinukleotida, ili obrnuto).
[0397] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid primenjuju se istovremeno. U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid primenjuju se u isto vreme. U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, prvi
1 2
polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid primenjuju se uzastopno (tj. prvi, drugi, i treći polinukleotid se mogu primeniti u skladu sa bilo kojim redosledom primene). U određenom aspektu, prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 140, kodiran sa SEQ ID NO: 141), drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 16, kodiran sa SEQ ID NO: 143), i treći polinukleotid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 21, kodiran sa SEQ ID NO: 145) primenjuju se u krajnjem težinskom (masenom) odnosu od 1:2:1 bez obzira na redosled primene.
[0398] U nekim aspektima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja tumora (npr. redukovanje veličine tumora) koji je lociran distalno u odnosu na lečeni tumor (proksimalni tumor). U nekim aspektima, proksimalni tumor se leči sa prvim polinukleotidom (npr. iRNK) koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugim polinukleotidom (npr. iRNK) koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i trećim polinukleotidom (npr. iRNK) koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, ili njihovom kombinacijom. Postupci koji su ovde objavljeni mogu se upotrebljavati, na primer, za lečenje tumora na lokacijama gde bi primena terapije intratumorski bila nebezbedna ili nepraktična primenom kompozicije koja je ovde objavljena (npr. iRNK koja kodira IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 141), iRNK IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 143), i treća iRNK koja kodira OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 145) intratumorski jednom ili više dostupnih tumora. U nekim aspektima, primena terapije koja je ovde objavljena na proksimalni tumor može se upotrebljavati za lečenje metastaza.
[0399] U nekim aspektima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja tumora koji ne reaguje ili slabo reaguje na inhibitore kontrolne tačke (npr. molekul koji ciljno deluje na PD-1 ili PD-L1 kao što je anti-PD-L1 antitelo) koji sadrži primenu prvog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugog polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i trećeg polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, ili njihove kombinacije, zajedno sa inhibitorom kontrolne tačke (npr. anti-PD-L1 antitelo i/ili anti-PD-1 antitelo i/ili anti-CTLA-4 antitelo). U određenom aspektu, prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 140, kodiran sa SEQ ID NO: 141), drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 16, kodiran sa SEQ ID NO: 143), i treći polinukleotid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid
1
(npr. SEQ ID NO: 21, kodiran sa SEQ ID NO: 145) primenjuju se zajedno sa inhibitorom kontrolne tačke (npr. anti-PD-L1 antitelo i/ili anti-PD-1 antitelo i/ili anti-CTLA-4 antitelo).
[0400] Kao što se ovde upotrebljava, termini "dublet", "dublet terapija", "dublet kombinovana terapija", "dublet iRNK terapija" i njihove gramatičke varijante označavaju kombinovano lečenje u kome se dve iRNK koje kodiraju dva proteina odabrana od IL-23 polipeptida, IL-36-gama polipeptida ili IL-18 polipeptida, i OX40L polipeptida primenjuju pacijentu kome je to potrebno. U nekim aspektima, dublet terapija se suštinski sastoji od ili se sastoji od dve iRNK koje kodiraju IL-23 polipeptid i IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, respektivno. Dublet terapija se može primeniti, npr. (i) kao jedna kompozicija koja sadrži obe iRNK, ili (ii) kao odvojene kompozicije od kojih svaka sadrži jednu iRNK. U nekim aspektima, iRNK u dublet terapiji se primenjuju istovremeno. U drugim aspektima, iRNK u dublet terapiji se primenjuju uzastopno.
[0401] Kao što se ovde upotrebljava, termini "triplet", "triplet terapija", "triplet kombinovana terapija", "triplet iRNK terapija" i njihove gramatičke varijante se upotrebljavaju naizmenično i označavaju kombinovano lečenje u kome se tri iRNK koje kodiraju IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i OX40L polipeptid primenjuju pacijentu kome je to potrebno. U nekim aspektima, triplet terapija se suštinski sastoji od ili se sastoji od tri iRNK koje kodiraju IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i OX40L polipeptid, respektivno. Triplet terapija se može primeniti, npr. (i) kao jedna kompozicija koja sadrži tri iRNK (npr. u krajnjem težinskom (masenom) odnosu od 1:2:1 tež./tež. IL-23:IL-36gama:OX40L), ili (ii) kao odvojene kompozicije od kojih svaka sadrži jednu ili dve iRNK (npr. u krajnjem težinskom (masenom) odnosu od 1:2:1 tež./tež. IL-23:IL-36gama:OX40L). U nekim aspektima, iRNK u triplet terapiji se primenjuju istovremeno. U drugim aspektima, svaka iRNK u triplet terapiji, ili njihove kombinacije se primenjuju uzastopno. U određenom aspektu, triplet terapija sadrži ili se suštinski sastoji od (i) prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid (npr. SEQ ID NO: 140, kodiran sa SEQ ID NO: 141), (ii) drugog polinukleotida koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid (npr. SEQ ID NO: 16, kodiran sa SEQ ID NO: 143), i (iii) trećeg polipeptida koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (npr. SEQ ID NO: 145, kodiran sa SEQ ID NO: 145), poželjno formulisana u težinskom (masenom) odnosu od 1:2:1, primenjena u skladu sa bilo kojim redosledom primene (npr. uzastopno, u isto vreme, ili istovremeno).
[0402] U nekim aspektima, predmetna objava obezbeđuje postupke lečenja pri čemu primena polinukleotida ili kombinacije polinukleotida (npr. iRNK) koji su ovde objavljeni subjektu kome je to potrebno (npr. pacijentu sa kancerom) rezultuje:
1 4
(a) povećanjem nivoa granulocita u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid;
(b) povećanjem nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid;
(c) povećanjem odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na odnos posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid;
(d) povećanjem nivoa efektorskih memorijskih T ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (e) povećanjem nivoa ekspresije PDL1 u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid; ili
(f) njihovom kombinacijom.
[0403] Predmetna objava obezbeđuje postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora ili inhibiranja rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži interleukin-23 polipeptid (IL-23), i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži interleukin-36-gama polipeptid (IL-36-gama) ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid (OX40L), pri čemu primena dubleta ili tripleta subjektu rezultuje:
1
(a) povećanjem nivoa granulocita u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid;
(b) povećanjem nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid;
(c) povećanjem odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na odnos posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid;
(d) povećanjem nivoa efektorskih memorijskih T ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (e) povećanjem nivoa ekspresije PDL1 u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta posle primene dubleta ili tripleta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; ili
(f) njihovom kombinacijom.
[0404] Nivoi granulocita, unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija (npr. CD103+ ćelije), efektorskih T ćelija (npr. CD4+ ili CD8+ ćelije), supresorskih T ćelija (npr. Treg ćelije), efektorskih memorijskih T ćelija (npr. CD4+ ili CD8+ ćelije), CD11b+ ćelija, ekspresija PD-L1, itd. mogu se izmeriti u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta u skladu sa bilo kojim postupkom koji je poznat u struci.
[0405] U nekim aspektima, povećanje nivoa granulocita se kvantifikuje kao (i) granulociti kao procenat CD45+ ćelija, ili (ii) granulociti po mg tumora. U nekim aspektima, unakrsnoprezentujuće dendritske ćelije su CD103+ ćelije. U nekim aspektima, povećanje nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija se kvantifikuje kao (i) unakrsno-prezentujuće dendritske ćelije po mg tumora, (ii) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije u limfnom čvoru koji drenira tumor (TdLN), (iii) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije kao procenat CD45+ ćelija, ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim aspektima, odnos efektorskih prema supresorskim T ćelijama se kvantifikuje kao odnos CD8:Treg. U
1
aspektima, efektorske memorijske T ćelije su CD4+ i/ili CD8+ ćelije. U nekim aspektima, nivo ekspresije PD-L1 se kvantifikuje kao (i) broj pozitivnih CD11b+ ćelija, ili (ii) ekspresija PD-L1 u CD11b+ ćelijama.
[0406] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje nivoa granulocita kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se nivoi granulocita mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, povećanje nivoa granulocita se meri kao (i) granulociti kao procenat CD45+ ćelija, i/ili (ii) granulociti po mg tumora, u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23 ili jednog polinukleotida koji kodira IL-36-gama ili IL-18 polipeptid.
[0407] Takođe je obezbeđen postupak za povećanje nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadri IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se nivoi unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, unakrsno-prezentujuće dendritske ćelije su CD103+ ćelije. U nekim aspektima, povećanje nivoa unakrsno-prezentujućih CD103+ dendritskih ćelija se meri kao (i) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije po mg tumora, (ii) unakrsno-prezentujuće CD103+ dendritske ćelije u TdLN, (iii) unakrsnoprezentujuće CD103+ dendritske ćelije kao procenat CD45+ ćelija, ili (iv) njihova kombinacija, u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, jednog polinukleotida koji kodira IL-36-gama ili IL-18 polipeptid, ili jednog polinukleotida koji kodira OX40L.
1
[0408] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se odnos efektorskih prema supresorskim T ćelijama meri u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, odnos efektorskih T ćelija prema supresorskim T ćelijama se meri kao odnos između CD8+ ćelija i regulatornih T ćelija (Treg), tj. CD8:Treg odnos.
[0409] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje nivoa efektorskih memorijskih T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, pri čemu se nivoi efektorskih memorijskih T ćelija mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, efektorske memorijske T ćelije su CD4+ i/ili CD8+ ćelije. U nekim aspektima, povećanje nivoa efektorskih memorijskih T ćelija se meri kao efektorske memorijske T ćelije unutar tumora u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L.
[0410] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za povećanje nivoa PD-L1 pozitivnih ćelija kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu kompozicije koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L
1
polipeptid, pri čemu se nivoi PD-L1 pozitivnih ćelija mere u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta. U nekim aspektima, PD-L1 pozitivne ćelije su CD11b+ ćelije.
[0411] U nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, uzorak ili uzorci koji su dobijeni od subjekta su odabrani iz grupe koja se sastoji od tumorskog tkiva, tumorskog infiltrata, krvi, plazme, i bilo koje njihove kombinacije. U nekim aspektima, jedan ili više kontrolnih uzoraka su uzorak ili uzorci koji su dobijeni od zdravog subjekta ili subjekta sa tumorom.
[0412] U nekim aspektima, nivo praga je unapred određena vrednost ili vrednost koja je dobijena iz jednog ili više uzoraka, npr. vrednost koja je dobijena iz pula uzoraka iz populacije zdravih pojedinaca ili populacije subjekata sa tumorom.
[0413] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak određivanja da li da se subjekt koji ima tumorsku bolest leči sa kompozicijom koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, ili (iii) bilo kojom kompozicijom koja je ovde objavljena, postupak sadrži
(i) primenu subjektu inicijalne doze dubleta ili tripleta, i
(ii) lečenje subjekta ukoliko se posle primene inicijalne doze dubleta ili tripleta odredi da subjekt ima povećanje
(a) nivoa granulocita,
(b) nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija,
(c) odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama,
(d) nivoa efektorskih memorijskih T ćelija,
(e) nivoa PD-L1 pozitivnih ćelija,
(f) ekspresije PD-L1, ili
(g) njihove kombinacije,
u odnosu na nivo praga.
1
[0414] Takođe je obezbeđen postupak odabira subjekta sa dijagnozom tumora kao kandidata za lečenje sa kompozicijom koja sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), gde prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, ili (iii) bilo kojom kompozicijom koja je ovde objavljena, postupak sadrži
(i) primenu subjektu inicijalne doze dubleta ili tripleta, i
(ii) odabir subjekta za lečenje ukoliko se posle primene inicijalne doze dubleta ili tripleta odredi da subjekt ima povećanje
(a) nivoa granulocita,
(b) nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija,
(c) odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama,
(d) nivoa efektorskih memorijskih T ćelija,
(e) nivoa PD-L1 pozitivnih ćelija,
(f) ekspresije PD-L1, ili
(g) njihove kombinacije,
u odnosu na nivo praga.
[0415] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak merenja efikasnosti kompozicije za lečenje tumora kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu kompozicija sadrži (i) dva polinukleotida (npr. iRNK) u kombinaciji (dublet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid; ili, (ii) tri polinukleotida (npr. iRNK, npr. SEQ ID NO: 141, 143 i 145) u kombinaciji (triplet), pri čemu prvi polinukleotid kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid, ili (iii) bilo koju kompoziciju koja je ovde objavljena, pri čemu postupak sadrži merenje u najmanje jednom uzorku koji je uzet od subjekta (a) nivoa granulocita, (b) nivoa unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija, (c) odnosa efektorskih prema supresorskim T
1
ćelijama, (d) nivoa efektorskih memorijskih T ćelija, (e) nivoa PD-L1 pozitivnih ćelija, (f) ekspresije PD-L1, ili (g) njihove kombinacije, pri čemu povećanje najmanje jednog od merenja u odnosu na nivo praga ukazuje da subjekt reaguje na lečenje sa dubletom ili tripletom.
IV. Bolesti, poremećaji i/ili stanja
[0416] U nekim aspektima, polinukleotidi (npr. iRNK) iz predmetne objave, npr. prvi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i/ili treći polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid mogu se upotrebljavati za redukovanje ili smanjenje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno.
[0417] U nekim aspektima, dopunski polinukleotidi (npr. četvrti polinukleotid) mogu se primenjivati u kombinaciji sa prvim polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugim polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i/ili trećim polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid za redukovanje ili smanjenje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno.
[0418] U skladu sa tim, u nekim aspektima, polinukleotidi (npr. iRNK) iz predmetne objave, tj. prvi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid mogu se upotrebljavati za redukovanje ili smanjenje veličine tumora ili inhibiranje rasta tumora kod subjekta kome je to potrebno.
[0419] U nekim aspektima, tumor je povezan sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem. U određenom aspektu, bolest, poremećaj, i/ili stanje je kancer. Stoga, u jednom aspektu, primena prvog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i/ili trećeg polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, leči kancer.
[0420] U sledećem aspektu, primena prvog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-
1 1
36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i dodatno u kombinaciji sa trećim polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira treći protein, pri čemu treći protein sadrži OX40L polipeptid, leči kancer.
[0421] "Kancer" označava široku grupu različitih bolesti koje su okarakterisane nekontrolisanim rastom abnormalnih ćelija u telu. Neregulisana deoba i rast ćelija rezultuje formiranjem malignih tumora koji vrše invaziju na susedna tkiva i takođe mogu metastazirati u udaljene delove tela kroz limfni sistem ili krvotok. "Kancer" ili "kancersko tkivo" može uključivati tumor u različitim stadijumima. U određenim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma 0, tako da je, npr. kancer ili tumor u veoma ranom razvoju i nije metastazirao. U nekim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma I, tako da je, npr. kancer ili tumor relativno male veličine, nije se proširio u obližnje tkivo, i nije metastazirao. U drugim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma II ili stadijuma III, tako da je, npr. kancer ili tumor veći nego u stadijumu 0 ili stadijumu I, i urastao je u susedna tkiva ali nije metastazirao, osim potencijalno u limfne čvorove. U drugim aspektima, kancer ili tumor je stadijuma IV, tako da je, npr. kancer ili tumor metastazirao. Stadijum IV se takođe može označiti kao uznapredovali ili metastatski kancer.
[0422] U nekim aspektima, kancer može uključivati, ali nije ograničen na, kancer korteksa nadbubrežne žlezde, uznapredovali kancer, analni kancer, aplastičnu anemiju, kancer žučnih kanala, kancer mokraćne bešike, kancer kostiju, metastaze u kostima, tumore mozga, kancer mozga, kancer dojke, kancer u detinjstvu, kancer nepoznatog primarnog porekla, Kaslmanovu bolest, kancer grlića materice, kancer kolona/rektuma, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, Juing porodicu tumora, kancer oka, kancer žučne kese, gastrointestinalne karcinoidne tumore, gastrointestinalne stromalne tumore, gastrointestinalnu trofoblastnu bolest, Hočkinovu bolest, Kapošijev sarkom, karcinom bubrežnih ćelija, kancer larinksa i hipofarinksa, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijelomonocitnu leukemiju, kancer jetre, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancera pluća, karcinoidni tumor pluća, limfom kože, maligni mezoteliom, multipla mijelom, mijelodisplastični sindrom, kancer nosne šupljine i paranazalnih sinusa, kancer nazofarinksa, neuroblastom, ne-Hočkinov limfom, kancer usne duplje i orofarinksa, osteosarkom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer penisa, tumore hipofize, kancer prostate, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer pljuvačne žlezde, sarkom mekog tkiva odraslih, kancer bazalnih i skvamoznih ćelija kože, melanom, kancer tankog creva, kancer želuca, kancer testisa, kancer grla, kancer timusa, kancer štitne
1 2
žlezde, sarkom materice, kancer vagine, kancer vulve, Valdenstromovu makroglobulinemiju, Vilmsov tumor, sekundarne kancere uzrokovane lečenjem kancera.
[0423] U nekim aspektima, tumor je čvrst tumor. "Čvrst tumor" uključuje, ali nije ograničen na, sarkom, melanom, karcinom, ili drugi čvrsti tumor kancer. "Sarkom" označava tumor koji je sačinjen od supstance slične embrionalnom vezivnom tkivu i generalno se sastoji od blisko zbijenih ćelija uklopljenih u fibrilarnu ili homogenu supstancu. Sarkomi uključuju, ali nisu ograničeni na, hondrosarkom, fibrosarkom, limfosarkom, melanosarkom, miksosarkom, osteosarkom, Abemetijev (Abemethy's) sarkom, adipozni sarkom, liposarkom, sarkom alveolarnog mekog dela, ameloblastni sarkom, botrioidni sarkom, hlorom sarkom, horio karcinom, embrionalni sarkom, sarkom Vilmsovog tumora, sarkom endometrijuma, stromalni sarkom, Juingov sarkom, fascijalni sarkom, fibroblastni sarkom, sarkom džinovskih ćelija, granulocitni sarkom, Hočkinov sarkom, idiopatski višestruki pigmentisani hemoragični sarkom, imunoblastni sarkom B ćelija, limfom, imunoblastni sarkom T-ćelija, Džensenov (Jensen's) sarkom, Kapošijev sarkom, Sarkom Kupferovih (Kupffer) ćelija, angiosarkom, leukosarkom, maligni sarkom mezenhimoma, parostealni sarkom, retikulocitni sarkom, Rousov sarkom, serocistični sarkom, sinovijalni sarkom, ili telangiektaltički sarkom.
[0424] Termin "melanom" označava tumor koji nastaje iz melanocitnog sistema kože i drugih organa. Melanomi uključuju, na primer, akra-lentiginozni melanom, amelanotični melanom, benigni juvenilni melanom, Klaudmanov (Cloudman's) melanom, S91 melanom, Harding-Pasi (Harding-Passey) melanom, juvenilni melanom, lentigo maligni melanom, maligni melanom, metastatski melanom, nodularni melanom, subungalni melanom, ili melanom koji se površinski širi.
[0425] Termin "karcinom" označava maligni novi rast koji je sačinjen od epitelnih ćelija koje imaju tendenciju da se infiltriraju u okolna tkiva i daju metastaze. Primeri karcinoma uključuju, npr. acinusni karcinom, acinous carcinoma, adenocistični karcinom, adenoid cystic carcinoma, carcinoma adenomatosum, karcinom korteksa nadbubrežne žlezde, alveolar carcinoma, karcinom alveolarnih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, carcinoma basocellulare, basaloid carcinoma, karcinom bazoskvamoznih ćelija, bronhoalveolarni karcinom, bronhiolarni karcinom, bronhogeni karcinom, cerebriformni karcinom, holangiocelularni karcinom, horioni karcinom, koloidni karcinom, komedo karcinom, korpus karcinom, kribriformni karcinom, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutaneum, cilindrični karcinom, karcinom cilindičnih ćelija, karcinom kanala, carcinoma durum, embrionalni karcinom, encefaloidni karcinom, epiermoidni karcinom, carcinoma epitheliale adenoides, egzofitni karcinom, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibrosum, želatiniformni karcinom, gelatinous
1
carcinoma, karcinom džinovskih ćelija, carcinoma gigantocellulare, glandularni karcinom, karcinom ganuloza ćelija, karcinom matriksa dlake, hematoidni karcinom, hepatocelularni karcinom, karcinom Hurtleovih (Hurthle) ćelija, hijalinski karcinom, hipermefroidni karcinom, infantilni embrionalni karcinom, karcinom in situ, intraepidermalni karcinom, intraepitelni karcinom, Krompeherov (Krompecher's) karcinom, karcinom Kulčicki (Kulchitzky) ćelija, karcinom velikih ćelija, lentikularni karcinom, carcinoma lenticulare, lipomatozni karcinom, limfoepitelni karcinom, carcinoma medullare, medularni karcinom, melanotični karcinom, carcinoma molle, mucinozni karcinom, carcinoma muciparum, carcinoma mucocellulare, mukoepidermoidni karcinom, carcinoma mucosum, mukozni karcinom, carcinoma myxomatodes, karcinom nazofarninksa, karcinom ovsenih ćelija, carcinoma ossificans, osteoidni karcinom, papilarni karcinom, periportalni karcinom, preinvazivni karcinom, karcinom bodljikavih (prickle) ćelija, pultaceozni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom rezervnih ćelija, carcinoma sarcomatodes, šnajderov karcinom, scirozni karcinom, carcinoma scroti, karcinom ćelija pečatnog prstena, karcinom simpleks, karcinom sitnih ćelija, solanoidni karcinom, karcinom sferoidnih ćelija, karcinom vretenastih ćelija, carcinoma spongiosum, skvamozni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, string carcinoma, carcinoma telangiectaticum, karcinom telangiektode, karcinom prelaznih ćelija, carcinoma tuberosum, tuberozni karcinom, verukozni karcinom, ili carcinoma viflosum.
[0426] Dopunski kanceri koji se mogu lečiti uključuju, npr. leukemiju, Hočkinovu bolest, ne-Hočkinov limfom, multipla mijelom, neuroblastom, kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća, rabdomiosarkom, primarnu trombocitozu, primarnu makroglobulinemiju, sitnoćelijske tumore pluća, primarne tumore mozga, kancer želuca, kancer kolona, maligni insulanom pankreasa, maligni karcinoid, kancer mokraćne bešike, premaligne lezije kože, kancer testisa, limfome, kancer štitne žlezde, papilarni kancer štitne žlezde, neuroblastom, neuroendokrini kancer, kancer jednjaka, kancer genitourinarnog trakta, malignu hiperkalcemiju, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer korteksa nadbubrežne žlezde, kancer prostate, Milerijanov (Müllerian) kancer, kancer jajnika, kancer peritoneuma, kancer falopijeve tube, ili papilarni serozni karcinom materice.
[0427] Karcinomi i/ili tumori koji su podložni lečenju u skladu sa postupcima iz trenutne objave uključuju one koji su dostupni putem direktne intratumorske i/ili regionalne primene, tj. primene u region ciljnog tumora. Na primer, tumori dostupni za primenu jednostavnom injekcijom špricem su lako podložni lečenju. Takođe su podložni lečenju tumori kod kojih injekcija zahteva određeno snimanje i/ili vođenu primenu, i/ili oni kod kojih je injekcija
1 4
moguća putem perkutane injekcije vođene slikom, ili katetera/kanile direktno u mesto, ili endoskopije.
[0428] Primeri kancera i/ili tumora koji su podložni lečenju uključuju melanom, kancer dojke, npr. TNBC, kancer glave i vrata, sarkom, CTLC, NHL, karcinom bazalnih ćelija, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), hepatocelularni karcinom (HCC), gliom, kancer želuca, i kancer pankreasa. Posebno podložni lečenju su melanom, kancer dojke, npr. TNBC, i kancer glave i vrata.
Melanom
[0429] Melanom je jedan od najagresivnijih oblika kancera kože. Štaviše, stopa incidence se povećava i postoji nekoliko dostupnih opcija lečenja. Melanom se otkriva po stopi od 132.000 novih slučajeva godišnje širom sveta (76.000 novih slučajeva godišnje u Sjedinjenim Državama) i odgovoran je za približno 10.000 smrtnih slučajeva godišnje u SAD. Oko 25% je kod pacijenata < 40 godina. PD-1 inhibitori (npr. nivolumab, pembrolizumab) su trenutno standard nege i dokaz su postojane stope odgovora od 37%, i preživljavanja bez progresije bolesti od 30% za 2 godine. Međutim, uočena je i brza progresija za one koji ne odgovore (medijana 4m) i ukupno preživljavanje od samo 40% je uočeno za 3 godine bez dokaza platoa, tj. lečeni pacijenti nastavljaju da regresiraju.
[0430] Stoga, postoji jasna potreba za novim, efikasnijim lečenjima u ovoj postavci. Melanom takođe služi kao model tumora za razumevanje imuniteta na kancer. Antigeni asocirani sa tumorom melanoma bili su među prvim antigenima kancera koji su identifikovani i klasifikovani, dok su dodatne studije pokazale da su mnogi od njih takođe eksprimirani od strane drugih tipova tumora. Pored toga, regresija melanoma je povezana sa vitiligom, što vidljivo potvrđuje aktivnu ulogu imunskog sistema u ovom tipu kancera, i u nekim slučajevima je uočena i spontana regresija primarnih melanoma. Ova zapažanja, koja se odnose na aktivnost imunskog sistema kod melanoma, pružila su jake dokaze da bi ovaj tumor trebalo da se pokaže kao podložan imunoterapiji. Protivno ovoj pozadini, melanom je dugo bio na vrhuncu imuno-onkoloških istraživanja i verovatno će nastaviti da se upotrebljava kao model tumora za povećanje našeg razumevanja imuno-onkologije i za informisanje o opcijama lečenja u drugim tipovima kancera koji odgovaraju na imunoterapiju.
Trostruko negativan kancer dojke
1
[0431] Kancer dojke pokazuje različite karakteristike koje zahtevaju različite tipove lečenja. Većina kancera dojke je pozitivna na hormonske receptore, što znači da su ćelije kancera stimulisane da rastu usled izlaganja ženskim hormonima estrogenu i/ili progesteronu. Drugi kanceri dojke su označeni kao HER2-pozitivni, što znači da oni prekomerno eksprimiraju receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2, biološki put koji je uključen u replikaciju i rast ćelije. HER2-pozitivni kanceri dojke čine približno 25% kancera dojke i leče se agensima koji ciljaju receptor za usporavanje rasta i replikacije. Kanceri dojke koji nisu stimulisani da rastu usled izlaganja estrogenu ili progesteronu i koji su HER2-negativni nazivaju se trostruko negativnim kancerima dojke. Trostruko negativni kanceri dojke imaju tendenciju da budu agresivniji od drugih kancera dojke i imaju manje mogućnosti lečenja u poređenju sa drugim kancerima dojke. Iako se kancer dojke istorijski smatrao imunološki tihim, nekoliko pretkliničkih i kliničkih studija sugeriše da imunoterapija ima potencijal da poboljša kliničke ishode za pacijente sa kancerom dojke. Sve u svemu, imunoterapija ima nekoliko ključnih prednosti u odnosu na konvencionalne hemioterapijske i ciljane tretmane usmerene na sam tumor. Prvo, imunoterapija generalno rezultuje sa manje neželjenih efekata, što joj omogućava da se primenjuje tokom dužeg vremenskog perioda i/ili u kombinaciji sa drugim agensima bez dopunske toksičnosti. Takođe je manja verovatnoća da će pacijenti razviti rezistenciju na imunoterapiju zbog sposobnosti imunskog sistema da istovremeno cilja više antigena kancera, i prilagođava se promenama kancerskih ćelija.
Kancer glave i vrata
[0432] Karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC) indukuje imunosupresivno stanje putem različitih mehanizama. Pacijenti sa HNSCC imaju izmenjenu homeostazu limfocita (uglavnom redukovani nivoi CD3+, CD4+, i CD8+ T ćelija) u poređenju sa zdravim kontrolama. Ova neravnoteža ostaje čak 2 godine posle tretmana sa namerom lečenja. Konzistentno, veći broj tumor infiltrirajućih CD4+ i CD8+ limfocita je asociran sa boljim ukupnim preživljavanjem kod pacijenata sa HNSCC. Pored toga, funkcija ćelija prirodnih ubica (NK) je poremećena kod pacijenata sa HNSCC.
[0433] HNSCC ćelije primenjuju određene strategije kako bi izbegle imuno-nadzor i naknadnu eliminaciju. Na primer, one indirektno interaguju sa imunskim sistemom kako bi održale imunosupresivno mikrookruženje. U suštini, HNSCC iskorištava činjenicu da je imunski sistem strogo regulisan preko imunskih kontrolnih tačaka kako bi se izbegla autoimunost ili prekomerna aktivacija imunskog sistema u fiziološkim okolnostima.
1
Imunoterapija usmerena na tumor
[0434] Važni ciljevi za oblast imuno-onkologije su poboljšanje stope odgovora i povećanje broja tumorskih indikacija koje odgovaraju na imunoterapiju, bez povećanja neželjenih sporednih efekata. Jedan pristup za postizanje ovih ciljeva je upotreba imunoterapije usmerene na tumor, tj. fokusiranje imunske aktivacije na najrelevantniji deo imunskog sistema. Ovo može poboljšati antitumorsku efikasnost, kao i redukovati neželjene događaje povezane sa imunitetom. Imunska aktivacija usmerena na tumor može se postići lokalnim injekcijama imunomodulatora direktno u tumor ili u područje tumora. Terapije fokusirane na ciljno delovanje inhibitora kontrolne tačke i kostimulatornih receptora mogu da generišu tumor-specifične T ćelijske odgovore preko lokalizovane imunske aktivacije.
Modulacija mikrookruženja tumora
[0435] U određenim aspektima, kompozicija iz objave (npr. dublet ili triplet iRNK kompozicija) može da se upotrebljava za modulaciju mikrookruženja tumora i/ili može biti odabrana za lečenje na osnovu mikrookruženja tumora u subjektu koji se leči. U jednom aspektu, kompozicija iz objave se upotrebljava za lečenje tumora koji ima inflamirano mikrookruženje tumora. U sledećem aspektu, kompozicija iz objave se upotrebljava za lečenje tumora koji ima imunosupresivno mikrookruženje tumora. U još jednom aspektu, kompozicija iz objave se upotrebljava za lečenje tumora koji ima imunski oskudno mikrookruženje tumora. U situacijama u kojima tumor ima inflamirano mikrookruženje tumora, tj. mikrookruženje tumora već pokazuje infiltraciju imunskih i/ili inflamatornih ćelija, lečenje sa dublet iRNK terapijom može biti dovoljno pre nego lečenje sa triplet iRNK terapijom (videti npr. Primer 23, SL. 45A-B). Na primer, za lečenje tumora sa inflamiranim mikrookruženjem tumora, u jednom aspektu, tumor se leči polinukleotidom koji kodira člana porodice IL-12 (npr. IL-23) i polinukleotidom koji kodira kostimulatorni signal imunskog odgovora (npr. OX40L).
V. Kombinovane terapije
[0436] U određenim aspektima, postupci lečenja koji su ovde objavljeni sadrže primenu prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugog
1
polinukleotida koji kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i/ili trećeg polipeptida koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid i dodatno sadrži primenu jednog ili više antikancerskih agenasa subjektu. U određenim aspektima, postupci lečenja koji su ovde ovde objavljeni sadrže primenu prvog polinukleotida koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugog polinukleotida koji kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, trećeg polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid, i dodatno sadrže primenu jednog ili više antikancerskih agenasa subjektu.
[0437] U nekim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa su iRNK. U određenim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa su iRNK koja kodira tumorski antigen. U drugim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa nisu tumorski antigen ili iRNK koja kodira tumorski antigen. U nekim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa je odobren agens od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država. U drugim aspektima, jedan ili više antikancerskih agenasa je unapred odobren (pre-approved) agens od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država.
[0438] U nekim aspektima, subjekt za predmetne postupke ili kompozicije je lečen sa jednom ili više standardnih terapija nege. U drugim aspektima, subjekt za predmetne postupke ili kompozicije nije odgovorio na jednu ili više standardnih terapija nege ili antikancerskih terapija.
[0439] Poslednjih godina, uvođenje inhibitora imunske kontrolne tačke u terapijske svrhe izazvalo je revoluciju u lečenju kancera. Od interesa su terapije koje predstavljaju kombinacije inhibitora kontrolne tačke sa drugim kostimulatornim ili inhibitornim molekulima.
[0440] Regulacija T ćelija, tj. aktivacija ili inhibicija je posredovana putem kostimulatornih ili koinhibitornih signala. Ova interakcija se ostvaruje putem ligand/receptor interakcije. T ćelije sadrže mnoštvo i aktivirajućih receptora, kao što je OX40, i inhibitornih receptora (tj. imunske kontrolne tačke) kao što su receptor programirane smrti 1 (PD-1) ili protein 4 povezan sa citotoksičnim T limfocitima (CTLA-4) (Mellman et. al 2011 Nature.;480:480-489). Aktivacija ovih imunskih kontrolnih tačaka rezultuje deaktivacijom T ćelija i zauzimanje ovih puteva od strane tumorskih ćelija doprinosi njihovom uspešnom imunskom begu.
[0441] Inhibitori imunske kontrolne tačke kao što su pembrolizumab ili nivolumab, koji ciljaju interakciju između receptora programirane smrti 1/liganda programirane smrti 1 (PD-1/PD-L1) i PD-L2, nedavno su odobreni za lečenje različitih maligniteta i trenutno se istražuju u kliničkim ispitivanjima za kancere uključujući melanom, karcinom skvamoznih
1
ćelija glave i vrata (HNSCC). Podaci dostupni iz ovih ispitivanja ukazuju na značajnu aktivnost praćenu povoljnim profilom bezbednosti i toksičnosti u ovim populacijama pacijenata.
[0442] Na primer, inhibitori kontrolne tačke su testirani u kliničkim ispitivanjima za lečenje melanoma. Konkretno, klinička ispitivanja faze III su otkrila da terapije kao što su ipilimumab i pembrolizumab, koje ciljaju CTLA4 i PD-1 imunske kontrolne tačke, respektivno, povećavaju trogodišnje prživljavanje pacijenata sa melanomom na ~70%, i ukupno preživljavanje (>5 godina) do ~30%.
[0443] Slično tome, inhibitori kontrolne tačke su testirani u kliničkim ispitivanjima za lečenje kancera glave i vrata. U pretkliničkim studijama je pokazano da 45-80% HNSCC tumora eksprimira ligand programirane smrti 1 (PD-L1) (Zandberg et al. (2014) Oral Oncol. 50:627-632). Trenutno postoje desetine kliničkih ispitivanja koja procenjuju efikasnost i bezbednost inhibitora imunske kontrolne tačke kao monoterapije ili u kombinovanim režimima kod HNSCC. Na primer, klinička ispitivanja sa inhibitorima PD 1, PD-L1, i CTLA-4 se testiraju kod HNSCC. Podaci da bi PD-1 antitelo pembrolizumab moglo biti efikasno kod pacijenata sa metastatskim/rekurentnim (R/M) HNSCC generisani su u ispitivanju faze 1b Keynote-012 faza I/II (Cheng. ASCO 2015, oralna prezentacija). Nedavno su predstavljeni podaci randomizovanog kliničkog ispitivanja CheckMate-141 faze III (Gillison. AACR 2016, oralna prezentacija). Ova studija je istraživala efikasnost monoklonalnog PD 1 antitela nivolumaba davanog svake 2 nedelje kod pacijenata sa R/M HNSCC rezistentnim na platinu. Studija je rano prekinuta usled superiornosti nivolumab grupe u studiji.
[0444] U jednom aspektu, subjekt je prethodno lečen sa antagonistom PD-1 pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa monoklonalnim antitelom koje se vezuje za PD-1 pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa terapijom anti-PD-1 monoklonalnim antitelom pre polinukleotida iz predmetnih postupaka ili kompozicija. U drugim aspektima, terapija anti-PD-1 monoklonalnim antitelom sadrži nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa monoklonalnim antitelom koje se vezuje za PD-L1 pre polinukleotida iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa terapijom anti-PD-1 monoklonalnim antitelom pre polinukleotida iz predmetnih postupaka ili kompozicija. U drugim aspektima, terapija anti-PD-L1 monoklonalnim antitelom sadrži durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, aezolizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
1
[0445] U nekim aspektima, subjekt je lečen sa antagonistom CTLA-4 pre lečenja sa kompozicijama iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je prethodno lečen sa monoklonalnim antitelom koje se vezuje za CTLA-4 pre kompozicija iz predmetne objave. U sledećem aspektu, subjekt je lečen sa anti-CTLA-4 monoklonalnim antitelom pre polinukleotida iz predmetne objave. U drugim aspektima, terapija anti-CTLA-4 antitelom sadrži ipilimumab ili tremelimumab.
[0446] U nekim aspektima, objava je usmerena na postupak lečenja kancera i/ili postupak imunoterapije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) prvog, drugog, i/ili trećeg polinukleotida (npr. RNK, npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, ili IL-36gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i OX40L polipeptid, respektivno, u kombinaciji sa antagonistom PD-1, npr. antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1, npr. anti-PD-1 monoklonalno antitelo.
[0447] U jednom aspektu, anti-PD-1 antitelo (ili njegov antigen-vezujući deo) korisno za objavu je pembrolizumab. Pembrolizumab (takođe poznat kao "KEYTRUDA<®>", lambrolizumab, i MK-3475) je humanizovano monoklonalno IgG4 antitelo usmereno prema površinskom receptoru humane ćelije PD-1 (programirana smrt-1 ili programirana ćelijska smrt-1). Pembrolizumab je opisan, na primer, u S.A.D. patentu br. 8,900,587; videti takođe http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789 (poslednji put pristupljeno: 14. decembra 2014). Pembrolizumab je odobren od strane FDA za lečenje relapsiranog ili refraktornog melanoma i uznapredovalog NSCLC.
[0448] U sledećem aspektu, anti-PD-1 antitelo korisno za objavu je nivolumab. Nivolumab (takođe poznat kao "OPDIVO<®>"; ranije označen kao 5C4, BMS-936558, MDX-1106, ili ONO-4538) je potpuno humano IgG4 (S228P) antitelo prema PD-1 inhibitoru imunske kontrolne tačke koje selektivno prevenira interakciju sa PD-1 ligandima (PD-L1 i PD-L2), čime blokira smanjenje antitumorskih funkcija T-ćelija (S.A.D. patent br.8,008,449; Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56). Nivolumab je pokazao aktivnost u različitim uznapredovalim čvrstim tumorima uključujući karcinom bubrežnih ćelija (renalni adenokarcinom, ili hipernefrom), melanom, i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) (Topalian et al., 2012a; Topalian et al., 2014; Drake et al., 2013; WO 2013/173223.
[0449] U drugim aspektima, anti-PD-1 antitelo je MEDI0680 (ranije AMP-514), koje je monoklonalno antitelo prema PD-1 receptoru. MEDI0680 je opisan, na primer, u S.A.D. patentu br. 8,609,089B2 ili na http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047 (poslednji put pristupljeno 14. decembra 2014).
1
[0450] U određenim aspektima, anti-PD-1 antitelo je BGB-A317, koje je humanizovano monoklonalno antitelo. BGB-A317 je opisano u S.A.D. publ. br.2015/0079109.
[0451] U određenim aspektima, antagonist PD-1 je AMP-224, koji je B7-DC Fc fuzioni protein. AMP-224 se razmatra u S.A.D. publ. br. 2013/0017199 ili na http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug?cdrid=700595 (poslednji put pristupljeno 8. jula 2015).
[0452] U drugim aspektima, objava uključuje postupak lečenja kancera i/ili postupak imunoterapije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) prvog, drugog, i/ili trećeg polinukleotida (npr. RNK, npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, ili IL-36gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i OX40L polipeptid, respektivno, zajedno sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1, npr. anti-PD-1 monoklonalno antitelo, npr. anti-PD-1 monoklonalno antitelo koje sadrži nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0453] U nekim aspektima, objava je usmerena na postupak lečenja kancera i/ili postupak imunoterapije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) prvog, drugog, i/ili trećeg polinukleotida (npr. RNK, npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, ili IL-36gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i OX40L polipeptid, respektivno, u kombinaciji sa antagonistom PD-L1, npr. antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-L1, npr. anti-PD-L1 monoklonalno antitelo, npr. anti-PD-L1 monoklonalno antitelo koje sadrži durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, atezolizumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0454] U određenim aspektima, anti-PD-L1 antitelo korisno za objavu je MSB0010718C (takođe nazvano avelumab; videti US 2014/0341917) ili BMS-936559 (ranije 12A4 ili MDX-1105) (videti, npr. S.A.D. patent br.7,943,743; WO 2013/173223). U drugim aspektima, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A (takođe poznato kao RG7446) (videti, npr. Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000. Apstrakt; S.A.D. patent br. 8,217,149), MEDI4736 (takođe nazvano durvalumab); Khleif (2013) U: Proceedings from the European Cancer Congress 2013; September 27-October 1, 2013; Amsterdam, Holandija.
[0455] U drugim aspektima, objava je usmerena na postupak lečenja kancera i/ili postupak imunoterapije kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži primenu subjektu (npr. intratumorski, intraperitonealno, ili intravenski) prvog, drugog, i/ili trećeg polinukleotida (npr. RNK, npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, ili IL-36gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i OX40L polipeptid, respektivno, u kombinaciji sa antagonistom CTLA-4, npr. antitelom ili
1 1
njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za CTLA-4, npr. anti-CTLA-4 monoklonalno antitelo, npr. anti-CTLA-4 monoklonalno antitelo koje sadrži ipilimumab ili tremelimumab, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0456] Primer kliničkog anti-CTLA-4 antitela je humano mAb 10D1 (sada poznato kao ipilimumab i na tržištu kao YERVOY<®>) kao što je objavljeno u S.A.D. patentu br.6,984,720. Sledeće anti-CTLA-4 antitelo korisno za predmetne postupke je tremelimumab (takođe poznato kao CP-675,206). Tremelimumab je humano IgG2 monoklonalno anti-CTLA-4 antitelo. Tremelimumab je opisan u WO/2012/122444, S.A.D. publ. br.2012/263677, ili WO publ. br.2007/113648 A2.
[0457] U jednom aspektu, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36 gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polipeptid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid se primenjuju u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za CTLA-4, antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1 receptor, antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-L1 receptor, polinukleotidom koji ih kodira, ili bilo kojom njihovom kombinacijom.
[0458] U jednom aspektu, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36 gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polipeptid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid se primenjuju u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1 ili PD-L1 receptor ili polinukleotidom koji ih kodira.
[0459] U sledećem aspektu, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36 gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polipeptid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid se primenjuju u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za CTLA-4 ili polinukleotidom koji ih kodira.
[0460] U još jednom aspektu, prvi polinukleotid koji kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji kodira drugi protein koji sadrži IL-36 gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, i treći polipeptid koji kodira treći protein koji sadrži OX40L polipeptid se primenjuju u kombinaciji sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za PD-1 ili PD-L1 receptor i antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji se specifično vezuje za CTLA-4 (ili polinukleotidima istih).
1 2
VI. Polinukleotidne sekvence sa optimizovanom sekvencom koje kodiraju imunomodulatorne polipeptide
[0461] U nekim aspektima, polinukleotid iz objave sadrži nukleotidnu sekvencu sa optimizovanom sekvencom koja kodira polipeptid koji je ovde objavljen, npr. IL-23 (najmanje jedna podjedinica IL-23 ili fuzioni protein koji sadrži obe podjedinice IL-23), IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L. U nekim aspektima, polinukleotid iz objave sadrži otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira IL-23 polipeptid, pri čemu je ORF sa optimizovanom sekvencom (npr. SEQ ID NO: 141). U nekim aspektima, polinukleotid iz objave sadrži otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, pri čemu je ORF sa optimizovanom sekvencom (npr. SEQ ID NO: 143). U nekim aspektima, polinukleotid iz objave sadrži otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira OX40L polipeptid, pri čemu je ORF sa optimizovanom sekvencom (npr. SEQ ID NO: 145).
[0462] U nekim aspektima, sekvence IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptida i/ili OX40L, njihovi fragmenti i varijante sa optimizovanom sekvencom, se upotrebljavaju za praktikovanje postupaka koji su ovde objavljeni. U nekim aspektima, sekvence IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptid i/ili OX40L, njihovi fragmenti i varijante sa optimizovanom sekvencom se kombinuju sa ili su alternative za njihove respektivne sekvence divljeg tipa (pokazane u TABELAMA 1 i 1A).
[0463] Nukleotidne sekvence sa optimizovanom sekvencom koje su ovde objavljene razlikuju se od odgovarajućih sekvenci nukleotidnih kiselina divljeg tipa i od drugih poznatih nukleotidnih sekvenci sa optimizovanom sekvencom, npr. ove nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom imaju jedinstvene kompozicione karakteristike.
[0464] U nekim aspektima, procenat nukleobaza uracila ili timina u nukleotidnoj sekvenci sa optimizovanom sekvencom (npr. koja kodira IL-23, IL-36-gama ili IL-18 polipeptid i/ili OX40L polipeptid, njihov funkcionalni fragment ili varijantu) je modifikovan (npr. redukovan) u odnosu na procenat nukleobaza uracila ili timina u referentnoj nukleotidnoj sekvenci divljeg tipa. Takva sekvenca se označava kao uracil-modifikovana ili timinmodifikovana sekvenca. Procenat sadržaja uracila ili timina u nukleotidnoj sekvenci može se odrediti deljenjem broja uracila ili timina u sekvenci sa ukupnim brojem nukleotida i množenjem sa 100. U nekim aspektima, nukleotidna sekvenca sa optimizovanom sekvencom ima niži sadržaj uracila ili timina od sadržaja uracila ili timina u referentnoj sekvenci divljeg tipa. U nekim aspektima, sadržaj uracila ili timina u nukleotidnoj sekvenci sa optimizovanom sekvencom iz objave je veći od sadržaja uracila ili timina u referentnoj sekvenci divljeg tipa i
1
još uvek održava korisne efekte, npr. povećanu ekspresiju i/ili signalni odgovor u poređenju sa referentnom sekvencom divljeg tipa.
[0465] U nekim aspektima, optimizovane sekvence iz predmetne objave sadrže jedinstvene opsege uracila ili timina (ukoliko je DNK) u sekvenci. Sadržaj uracila ili timina u optimizovanim sekvencama može se izraziti na različite načine, npr. sadržaj uracila ili timina u optimizovanim sekvencama u odnosu na teorijski minimum (%UTMili %TTM), u odnosu na divlji tip (%UWTili %TWT), i u odnosu na ukupan sadržaj nukleotida (%UTLili %TTL). Za DNK se prepoznaje da je timin prisutan umesto uracila, i može se zameniti T tamo gde se pojavljuje U. Stoga, sve objave koje se odnose na, npr. %UTM, %UWT, ili %UTL, u pogledu RNK su podjednako primenljive na %TTM, %TWT, ili %TTLu pogledu DNK.
[0466] Sadržaj uracila ili timina u odnosu na teorijski minimum uracila ili timina, označava parametar koji je određen deljenjem broja uracila ili timina u nukleotidnoj sekvenci sa optimizovanom sekvencom sa ukupnim brojem uracila ili timina u hipotetičkoj nukleotidnoj sekvenci u kojoj su svi kodoni u hipotetičkoj sekvenci zamenjeni sinonimnim kodonima koji imaju najmanji mogući sadržaj uracila ili timina i množenjem sa 100. Ovaj parametar je ovde skraćen kao %UTMili %TTM.
[0467] Uracil- ili timin-modifikovana sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama i/ili OX40L polipeptid iz objave se takođe može opisati u skladu sa njenim sadržajem uracila ili timina u odnosu na sadržaj uracila ili timina u odgovarajućim sekvencama nukleinske kiseline divljeg tipa (%UWTili %TWT). Fraza "sadržaj uracila ili timina u odnosu na sadržaj uracila ili timina u sekvenci nukleinske kiseline divljeg tipa" označava parametar koji je određen deljenjem broja uracila ili timina u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom sa ukupnim brojem uracila ili timina u odgovarajućoj sekvenci nukleinske kiseline divljeg tipa i množenjem sa 100. Ovaj parametar je ovde skraćen kao %UWTili %TWT.
[0468] U nekim aspektima, uracil-modifikovana sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid iz objave ima redukovan broj uzastopnih uracila u odnosu na odgovarajuću sekvencu nukleinske kiseline divljeg tipa. Na primer, dva uzastopna leucina mogu biti kodirana sekvencom CUUUUG, koja uključuje klaster od četiri uracila. Takva podsekvenca može biti supstituisana, npr. sa CUGCUC, koja uklanja klaster uracila. Fenilalanin može biti kodiran sa UUC ili UUU. Stoga, čak i ukoliko su fenilalanini koji su kodirani sa UUU zamenjeni sa UUC, sinonimni kodon i dalje sadrži par uracila (UU). U skladu sa tim, broj fenilalanina u sekvenci uspostavlja minimalni broj parova uracila (UU) koji se ne mogu eliminisati bez izmene broja fenilalanina u kodiranom polipeptidu.
1 4
[0469] U nekim aspektima, uracil-modifikovana sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid iz objave ima redukovan broj tripleta uracila (UUU) u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline divljeg tipa. U nekim aspektima, uracil-modifikovana sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid ima redukovan broj parova uracila (UU) u odnosu na broj parova uracila (UU) u sekvenci nukleinske kiseline divljeg tipa. U nekim aspektima, uracil-modifikovana sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid iz objave ima broj parova uracila (UU) koji odgovara minimalnom mogućem broju parova uracila (UU) u sekvenci nukleinske kiseline divljeg tipa.
[0470] Fraza "parovi uracila (UU) u odnosu na parove uracila (UU) u sekvenci nukleinske kiseline divljeg tipa" označava parametar koji je određen deljenjem broja parova uracila (UU) u nukleotidnoj sekvenci sa optimizovanom sekvencom sa ukupnim brojem parova uracila (UU) u odgovarajućoj nukleotidnoj sekvenci divljeg tipa i množenjem sa 100. Ovaj parametar je ovde skraćen kao %UUwt. U nekim aspektima, uracil-modifikovana sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid ima %UUwtizmeđu ispod 100%.
[0471] U nekim aspektima, polinukleotid iz objave sadrži uracil-modifikovanu sekvencu koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid koji je ovde objavljen. U nekim aspektima, uracil-modifikovana sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid sadrži najmanje jednu hemijski modifikovanu nukleobazu, npr. 5-metoksiuracil. U nekim aspektima, najmanje 95% nukleobaze (npr. uracil) u uracil-modifikovanoj sekvenci koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid iz objave su modifikovane nukleobaze. U nekim aspektima, najmanje 95% uracila u uracil-modifikovanoj sekvenci koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid je 5-metoksiuracil. U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži uracil-modifikovanu sekvencu dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto, npr. miRNA vezujuće mesto koje se vezuje za miR-122. U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži uracil-modifikovanu sekvencu je formulisan sa agensom za isporuku, npr. jedinjenjem koje ima Formulu (I), npr. bilo kojim od Jedinjenja 1-147, ili bilo kojim od Jedinjenja 1-232.
VII. Postupci za optimizaciju sekvence
[0472] U nekim aspektima, polinukleotid iz objave (npr. polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid (npr. sekvenca divljeg tipa, njen funkcionalni fragment, ili varijanta) je sa optimizovanom sekvencom.
1
[0473] Nukleotidna sekvenca sa optimizovanom sekvencom (nukleotidna sekvenca se ovde takođe označava kao "nukleinska kiselina") sadrži najmanje jednu modifikaciju kodona u odnosu na referentnu sekvencu (npr. sekvencu divljeg tipa koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid). Stoga, u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom, najmanje jedan kodon se razlikuje od odgovarajućeg kodona u referentnoj sekvenci (npr. sekvenci divljeg tipa).
[0474] Generalno, nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom se generišu najmanje korakom koji sadrži supstituciju kodona u referentnoj sekvenci sa sinonimnim kodonima (tj. kodoni koji kodiraju istu amino-kiselinu). Takve supstitucije se mogu izvršiti, na primer, primenom kodon supstitucione mape (tj. tabele koja obezbeđuje kodone koji će kodirati svaku amino-kiselinu u kodon optimizovanoj sekvenci), ili primenom skupa pravila (npr. ukoliko je glicin pored neutralne amino-kiseline, glicin bi bio kodiran određenim kodonom, ali ukoliko je pored polarne amino-kiseline, bio bi kodiran drugim kodonom). Pored supstitucija kodona (tj. "kodon optimizacija"), postupci optimizacije sekvence koji su ovde objavljeni sadrže dopunske korake optimizacije koji nisu striktno usmereni na kodon optimizaciju kao što je uklanjanje štetnih motiva (supstitucija destabilizujućih motiva). Kompozicije i formulacije koje sadrže ove nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom (npr. RNK, npr. iRNK) mogu se primenjivati subjektu kome je to potrebno kako bi se olakšala in vivo ekspresija funkcionalno aktivnog IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida.
[0475] Rekombinantna ekspresija velikih molekula u ćelijskim kulturama može biti izazovan zadatak sa brojnim ograničenjima (npr. loši nivoi ekspresije proteina, zastoj translacije što rezultuje skraćenim ekspresionim proizvodima, pogrešnim foldovanjem proteina, itd.) Ova ograničenja se mogu redukovati ili izbeći primenom polinukleotida (npr. RNK, npr. iRNK), koji kodiraju funkcionalno aktivan IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid ili kompozicija ili formulacija koje ih sadrže pacijentu koji boluje od kancera, tako da se sinteza i isporuka IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida za lečenje kancera odvija endogeno.
[0476] Promena sa in vitro ekspresionog sistema (npr. ćelijska kultura) na in vivo ekspresiju zahteva redizajn sekvence nukleinske kiseline koja kodira terapijski agens. Redizajniranje sekvence gena koja se javlja u prirodi izborom različitih kodona bez obavezne izmene kodirane amino-kiselinske sekvence često može dovesti do dramatičnog povećanja nivoa ekspresije proteina (Gustafsson et al., 2004, Journal/Trends Biotechnol 22, 346-53). Pokazalo se da varijable kao što su indeks adaptacije kodona (CAI), sekundarne strukture iRNK, cisregulatorne sekvence, GC sadržaj i mnoge druge slične varijable donekle koreliraju sa
1
nivoima ekspresije proteina (Villalobos et al., 2006, Journal/BMC Bioinformatics 7, 285). Međutim, zbog degeneracije genetičkog koda, postoje brojne različite sekvence nukleinskih kiselina koje sve mogu kodirati isti terapijski agens. Svaka amino-kiselina je kodirana sa do šest sinonimnih kodona; i izbor između ovih kodona utiče na ekspresiju gena. Pored toga, upotreba kodona (tj. učestalost kojom različiti organizmi upotrebljavaju kodone za ekspresiju polipeptidne sekvence) se razlikuje među organizmima (na primer, rekombinantna proizvodnja humanih ili humanizovanih terapijskih antitela se često odvija u kulturama ćelija hrčka).
[0477] U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline može biti optimizovana za sekvencu primenom kodon mape. Stručnjak sa iskustvom će razumeti da su T baze u kodon mapama koje su objavljene u nastavku prisutne u DNK, dok bi T baze bile zamenjene U bazama u odgovarajućim RNK. Na primer, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom koja je ovde objavljena u obliku DNK, npr. vektor ili templat za in-vitro translaciju (IVT), imaće svoje T baze transkribovane kao U baze u svojoj odgovarajućoj transkribovanoj iRNK. U tom pogledu, i DNK sekvence sa optimizovanom sekvencom (koje sadrže T) i njihove odgovarajuće RNK sekvence (koje sadrže U) se smatraju nukleinskom kiselinom sa optimizovanom sekvencom iz predmetne objave. Stručnjak sa iskustvom bi takođe razumeo da se ekvivalentne kodon mape mogu generisati zamenom jedne ili više baza neprirodnim bazama. Tako bi, npr. TTC kodon (DNK mapa) odgovarao UUC kodonu (RNK mapa), koji zauzvrat može odgovarati ΨΨC kodonu (RNK mapa u kojoj je U zamenjen pseudouridinom).
[0478] U jednom aspektu, referentna sekvenca koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može se optimizovati zamenom svih kodona koji kodiraju određenu amino-kiselinu samo jednim od alternativnih kodona koji su obezbeđeni u kodon mapi. Na primer, svi valini u optimizovanoj sekvenci bili bi kodirani pomoću GTG ili GTC ili GTT.
[0479] Polinukleotidi sa optimizovanom sekvencom iz objave mogu biti generisani upotrebom jednog ili više postupaka kodon optimizacije, ili njihovom kombinacijom. Ovde su detaljno opisani postupci optimizacije sekvence koji se mogu upotrebljavati za optimizaciju sekvenci sekvenci nukleinskih kiselina. Ova lista postupaka nije sveobuhvatna niti ograničavajuća.
[0480] Biće cenjeno da se principi i pravila dizajna koji su opisani za svaki od postupaka optimizacije sekvence o kojima se govori u nastavku mogu kombinovati na mnogo različitih načina, na primer optimizacija sekvence sa visokim sadržajem G/C za neke regione ili optimizacija sekvence za sadržaj uridina za druge regione referentne sekvence nukleinske
1
kiseline, kao i ciljane nukleotidne mutacije kako bi se minimalizovala sekundarna struktura u celoj sekvenci ili kako bi se eliminisali štetni motivi.
[0481] Izbor potencijalnih kombinacija postupaka optimizacije sekvence može, na primer, zavisiti od specifične hemije koja se upotrebljava za proizvodnju sintetičkog polinukleotida. Takav izbor takođe može zavisiti od karakteristika proteina koji je kodiran nukleinskom kiselinom sa optimizovanom sekvencom, npr. puna sekvenca, funkcionalni fragment, ili fuzioni protein koji sadrži IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid, itd. U nekim aspektima, takav izbor može zavisiti od specifičnog tkiva ili ćelije koju cilja nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom (npr. terapijska sintetička iRNK).
[0482] Mehanizmi kombinovanja postupaka optimizacije sekvence ili pravila dizajna koja proizilaze iz primene i analize postupaka optimizacije mogu biti jednostavni ili kompleksni. Na primer, kombinacija može biti:
(i) Sekvencijalna: Svaki postupak optimizacije sekvence ili skup pravila dizajna primenjuje se na različitu podsekvencu celokupne sekvence, na primer redukovanje uridina na kodon pozicijama od 1 do 30 i zatim odabir visokoučestalih kodona za ostatak sekvence;
(ii) Hijerarhijska: Nekoliko postupaka optimizacije sekvence ili skupova pravila dizajna kombinuje se na hijerarhijski, deterministički način. Na primer, upotreba kodona koji su najbogatiji sa GC, prekidajući veze (koje su uobičajene) izborom najučestalijih od tih kodona.
(iii) Multifaktorska / Multiparametrijska: Mašinsko učenje ili druge tehnike modeliranja upotrebljavaju se za dizajniranje jedne sekvence koja najbolje zadovoljava višestruko preklapanje i moguće kontradiktorne zahteve. Ovaj pristup bi zahtevao upotrebu računara koji primenjuje brojne matematičke tehnike, na primer, genetičke algoritme.
[0483] Na kraju, svaki od ovih pristupa može rezultovati specifičnim skupom pravila koja se u mnogim slučajevima mogu sažeti u jednu kodon tabelu, tj. sortiranu listu kodona za svaku amino-kiselinu u ciljnom proteinu (tj. IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid), sa specifičnim pravilom ili skupom pravila koja ukazuju kako odabrati specifični kodon za svaku amino-kiselinsku poziciju.
a Optimizacija sadržaja uridina
1
[0484] Prisustvo lokalnih visokih koncentracija uridina u sekvenci nukleinske kiseline može imati štetne efekte na translaciju, npr. sporu ili prerano prekinutu translaciju, naročito kada se modifikovani analozi uridina upotrebljavaju u proizvodnji sintetičkih iRNK. Štaviše, visok sadržaj uridina takođe može redukovati in vivo poluživot sintetičkih iRNK usled aktivacije TLR.
[0485] U skladu sa tim, sekvenca nukleinske kiseline može biti optimizovana za sekvencu upotrebom postupka koji sadrži najmanje jedan korak optimizacije sadržaja uridina. Takav korak sadrži, npr. supstituciju najmanje jednog kodona u referentnoj nukleinskoj kiselini sa alternativnim kodonom kako bi se generisala uridin-modifikovana sekvenca, pri čemu uridinmodifikovana sekvenca ima najmanje jedno od sledećih svojstava:
(i) povećanje ili smanjenje globalnog sadržaja uridina;
(ii) povećanje ili smanjenje lokalnog sadržaja uridina (tj. promene u sadržaju uridina su ograničene na specifične podsekvence);
(iii) promene u distribuciji uridina bez izmene ukupnog sadržaja uridina;
(iv) promene u formiranju klastera uridina (npr. broj klastera, lokacija klastera, ili rastojanje između klastera); ili
(v) njihove kombinacije.
[0486] U nekim aspektima, proces optimizacije sekvence sadrži optimizovanje globalnog sadržaja uridina, tj. optimizovanje procenta nukleobaza uridina u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom u odnosu na procenat nukleobaza uridina u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. Na primer, 30% nukleobaza mogu biti uridini u referentnoj sekvenci i 10% nukleobaza mogu biti uridini u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom.
[0487] U drugim aspektima, proces optimizacije sekvence sadrži redukovanje lokalnog sadržaja uridina u specifičnim regionima referentne sekvence nukleinske kiseline, tj. redukovanje procenta nukleobaza uridina u podsekvenci nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom u odnosu na procenat nukleobaza uridina u odgovarajućoj podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline. Na primer, referentna sekvenca nukleinske kiseline može imati region 5'-kraja (npr.30 kodona) sa lokalnim sadržajem uridina od 30%, i sadržaj uridina u tom istom regionu može biti redukovan na 10% u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom.
[0488] U specifičnim aspektima, kodoni se mogu zameniti u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline kako bi se redukovao ili modifikovao, na primer, broj, veličina, lokacija, ili
1
distribucija klastera uridina koji bi mogli imati štetne efekte na translaciju proteina. Iako je kao opšte pravilo poželjno da se redukuje sadržaj uridina u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline, u određenim aspektima sadržaj uridina, i posebno lokalni sadržaj uridina, u nekim podsekvencama referentne sekvence nukleinske kiseline može se povećati.
[0489] Redukovanje sadržaja uridina kako bi se izbegli štetni efekti na translaciju može da se uradi u kombinaciji sa drugim postupcima optimizacije koji su ovde objavljeni kako bi se postigli drugi ciljevi dizajna. Na primer, optimizacija sadržaja uridina može se kombinovati sa dizajnom rampe, pošto će upotreba najređih kodona za većinu amino-kiselina, uz nekoliko izuzetaka, redukovati sadržaj U.
[0490] U nekim aspektima, uridin-modifikovana sekvenca je dizajnirana da indukuje niži odgovor tol-sličnog receptora (TLR) u poređenju sa referentnom sekvencom nukleinske kiseline. Nekoliko TLR prepoznaje i odgovara na nukleinske kiseline. Pokazano je da dvolančana (ds)RNA, čest sastojak virusa, aktivira TLR3. Videti Alexopoulou et al. (2001) Nature, 413:732-738 i Wang et al. (2004) Nat. Med., 10:1366-1373. Jednolančana (ss)RNA aktivira TLR7. Videti Diebold et al. (2004) Science 303:1529-1531. RNK oligonukleotidi, na primer RNK sa fosforotioatnim internukleotidnim vezama, su ligandi humanog TLR8. Videti Heil et al. (2004) Science 303:1526-1529. DNK koja sadrži nemetilovane CpG motive, karakteristične za DNK bakterija i virusa, aktivira TLR9. Videti Hemmi et al. (2000) Nature, 408: 740-745.
[0491] Kao što se ovde upotrebljava, termin "TLR odgovor" je definisan kao prepoznavanje jednolančane RNK od strane TLR7 receptora, i u nekim aspektima obuhvata degradaciju RNK i/ili fiziološke odgovore uzrokovane prepoznavanjem jednolančane RNK od strane receptora. Postupci za određivanje i kvantifikaciju vezivanja RNK za TLR7 su poznati u struci. Slično, postupci za određivanje da li je RNK pokrenula TLR7-posredovan fiziološki odgovor (npr. sekrecija citokina) su dobro poznati u struci. U nekim aspektima, TLR odgovor može biti posredovan od strane TLR3, TLR8, ili TLR9 umesto TLR7.
[0492] Supresija TLR7-posredovanog odgovora može se postići putem modifikacije nukleozida. RNK podleže preko stotinu različitih modifikacija nukleozida u prirodi (videti bazu podataka o modifikacijama RNK, dostupnu na mods.rna.albany.edu). Humana rRNK, na primer, ima deset puta više pseudouridina (Ψ) i 25 puta više 2'-O-metilovanih nukleozida od bakterijske rRNK. Bakterijska iRNK ne sadrži modifikacije nukleozida, dok iRNK sisara imaju modifikovane nukleozide kao što su 5-metilcitidin (m5C), N6-metiladenozin (m6A), inozin i mnoge 2'-O-metilovane nukleozide pored N7-metilguanozina (m7G).
2
[0493] Uracil i riboza, dva definišuća svojstva RNK, su neophodni i dovoljni za stimulaciju TLR7, i kratka jednolančana RNK (ssRNA) deluje kao agonist TLR7 na način nezavisan od sekvence sve dok sadrži nekoliko blisko pozicioniranih uridina. Videti Diebold et al. (2006) Eur. J. Immunol. 36:3256-3267. U skladu sa tim, jedan ili više od postupaka optimizacije koji su ovde objavljeni sadrže redukovanje sadržaja uridina (lokalno i/ili lokalno) i/ili redukovanje ili modifikovanje formiranja klastera uridina kako bi se redukovao ili suprimirao TLR7-posredovan odgovor.
[0494] U nekim aspektima, TLR odgovor (npr. odgovor posredovan od strane TLR7) uzrokovan uridin-modifikovanom sekvencom je najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 100% niži od TLR odgovora koji je uzrokovan referentnom sekvencom nukleinske kiseline.
[0495] U nekim aspektima, TLR odgovor uzrokovan referentnom sekvencom nukleinske kiseline je najmanje oko 1 puta, najmanje oko 1,1 puta, najmanje oko 1,2 puta, najmanje oko 1,3 puta, najmanje oko 1,4 puta, najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 1,6 puta, najmanje oko 1,7 puta, najmanje oko 1,8 puta, najmanje oko 1,9 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, ili najmanje oko 10 puta viši od TLR odgovora koji je uzrokovan uridin-modifikovanom sekvencom.
[0496] U nekim aspektima, sadržaj uridina (prosečan globalni sadržaj uridina) (apsolutni ili relativni) u uridin-modifikovanoj sekvenci je viši od sadržaja uridina (apsolutnog ili relativnog) u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U skladu sa tim, u nekim aspektima, uridin-modifikovana sekvenca sadrži najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 100% više uridina nego referentna sekvenca nukleinske kiseline.
[0497] U drugim aspektima, sadržaj uridina (prosečan globalni sadržaj uridina) (apsolutni ili relativni) u uridin-modifikovanoj sekvenci je niži od sadržaja uridina (apsolutnog ili relativnog) u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U skladu sa tim, u nekim aspektima, uridin-modifikovana sekvenca sadrži najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko
2 1
15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 100% manje uridina nego referentna sekvenca nukleinske kiseline.
[0498] U nekim aspektima, sadržaj uridina (prosečan globalni sadržaj uridina) (apsolutni ili relativni) u uridin-modifikovanoj sekvenci je manji od 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% od ukupnih nukleobaza u uridinmodifikovanoj sekvenci. U nekim aspektima, sadržaj uridina u uridin-modifikovanoj sekvenci je između oko 10% i oko 20%. U nekim posebnim aspektima, sadržaj uridina u uridinmodifikovanoj sekvenci je između oko 12% i oko 16%.
[0499] U nekim aspektima, sadržaj uridina u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline može se izmeriti upotrebom kliznog prozora. U nekim aspektima, dužina kliznog prozora je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40 nukleobaza. U nekim aspektima, klizni prozor je dužine preko 40 nukleobaza. U nekim aspektima, klizni prozor je dužine 20 nukleobaza. Na osnovu sadržaja uridina koji je izmeren kliznim prozorom, moguće je generisati histogram koji predstavlja sadržaj uridina po celoj dužini referentne sekvence nukleinske kiseline i nukleinskih kiselina sa optimizovanom sekvencom.
[0500] U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline može se modifikovati kako bi se redukovali ili eliminisali pikovi u histogramu koji su iznad ili ispod određene procentualne vrednosti. U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline može se modifikovati kako bi se eliminisali pikovi u prikazu kliznog prozora koji su iznad 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, ili 30% uridina. U sledećem aspektu, referentna sekvenca nukleinske kiseline može se modifikovati tako da nijedan pik ne bude preko 30% uridina u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom, kao što je izmereno upotrebom kliznog prozora od 20 nukleobaza. U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline može se modifikovati tako da ni više ni manje od unapred određenog broja pikova u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom, kao što je izmereno upotrebom kliznog prozora od 20 nukleobaza, ne bude iznad ili ispod određene vrednosti praga. Na primer, u nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline može se modifikovati tako da nijedan pik ili ne više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 pikova u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom
2 2
nije iznad 10%, 15%, 20%, 25% ili 30% uridina. U sledećem aspektu, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom sadrži između 0 pikova i 2 pika sa sadržajem uridina 30% ili višim.
[0501] U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline može se optimizovati za sekvencu kako bi se redukovala incidenca uzastopnih uridina. Na primer, dva uzastopna leucina mogu biti kodirana sekvencom CUUUUG, koja bi uključivala klaster od četiri uridina. Takva podsekvenca bi se mogla supstituisati sa CUGCUC, što bi efikasno uklonilo klaster uridina. U skladu sa tim, referentna nukleinska sekvenca može se optimizovati za sekvencu redukovanjem ili eliminisanjem parova uridina (UU), tripleta uridina (UUU) ili kvadripleta uridina (UUUU). Kombinacije višeg reda U se ne smatraju kombinacijama kombinacija nižeg reda. Stoga, na primer, UUUU se striktno smatra kvadripletom, a ne dva uzastopna U para; ili UUUUUU se smatra sekstupletom, a ne tri uzastopna U para, ili dva uzastopna U tripleta, itd.
[0502] U nekim aspektima, svi parovi uridina (UU) i/ili tripleti uridina (UUU) i/ili kvadripleti uridina (UUUU) mogu se ukloniti iz referentne sekvence nukleinske kiseline. U drugim aspektima, parovi uridina (UU) i/ili tripleti uridina (UUU) i/ili kvadripleti uridina (UUUU) mogu se redukovati ispod određenog praga, npr. ne više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 pojavljivanja u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom. U određenom aspektu, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom sadrži manje od 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 parova uridina. U sledećem posebnom aspektu, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom ne sadrži parove i/ili triplete uridina.
[0503] Fenilalanin kodoni, tj. UUC ili UUU, sadrže par ili triplet uridina i prema tome optimizacija sekvence kako bi se redukovao sadržaj uridina može u najboljem slučaju redukovati fenilalanin U triplet na fenilalanin U par. U nekim aspektima, pojava parova uridina (UU) i/ili tripleta uridina (UUU) označava samo ne-fenilalaninske U parove ili triplete. U skladu sa tim, u nekim aspektima, ne-fenilalaninski parovi uridina (UU) i/ili tripleti uridina (UUU) mogu se redukovati ispod određenog praga, npr. ne više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 pojavljivanja u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom. U određenom aspektu, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom sadrži manje od 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 ne-fenilalaninskog para i/ili tripleta uridina. U sledećem posebnom aspektu, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom ne sadrži ne-fenilalaninske parove i/ili triplete uridina.
2
[0504] U nekim aspektima, redukcija uridin kombinacija (npr. parovi, tripleti, kvadripleti) u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom može se izraziti kao procentualna redukcija u odnosu na uridin kombinacije prisutne u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline.
[0505] U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom može da sadrži oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, ili 65% od ukupnog broja parova uridina koji su prisutni u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom može da sadrži oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, ili 65% od ukupnog broja tripleta uridina koji su prisutni u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom može da sadrži oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, ili 65% od ukupnog broja kvadripleta uridina koji su prisutni u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline.
[0506] U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom može da sadrži oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, ili 65% od ukupnog broja nefenilalaninskih parova uridina koji su prisutni u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom može da sadrži oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, ili 65% od ukupnog broja nefenilalaninskih tripleta uridina koji su prisutni u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline.
[0507] U nekim aspektima, sadržaj uridina u sekvenci sa optimizovanom sekvencom može se izraziti u odnosu na teorijski minimalan sadržaj uridina u sekvenci. Termin "teorijski minimalan sadržaj uridina" definisan je kao sadržaj uridina u sekvenci nukleinske kiseline kao procenat dužine sekvence nakon što su svi kodoni u sekvenci zamenjeni sinonimnim kodonom sa najnižim sadržajem uridina. U nekim aspektima, sadržaj uridina u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom je identičan teorijski minimalnom sadržaju uridina u referentnoj sekvenci (npr. sekvenca divljeg tipa). U nekim aspektima, sadržaj uridina u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom je oko 90%, oko 95%, oko 100%, oko 105%, oko 110%, oko 115%, oko 120%, oko 125%, oko 130%, oko 135%, oko 140%, oko 145%, oko 150%, oko 155%, oko 160%, oko 165%, oko 170%, oko 175%, oko 180%, oko
2 4
185%, oko 190%, oko 195%, ili oko 200% od teorijski minimalnog sadržaja uridina u referentnoj sekvenci (npr. sekvenca divljeg tipa).
[0508] U nekim aspektima, sadržaj uridina u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom je identičan teorijski minimalnom sadržaju uridina u referentnoj sekvenci (npr. sekvenca divljeg tipa).
[0509] Referentna sekvenca nukleinske kiseline (npr. sekvenca divljeg tipa) može sadržati klastere uridina koji usled svog broja, veličine, lokacije, distribucije ili njihovih kombinacija imaju negativne efekte na translaciju. Kao što se ovde upotrebljava, termin "klaster uridina" označava podsekvencu u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline ili nukleinskoj sekvenci sa optimizovanom sekvencom sa sadržajem uridina (uobičajeno opisano kao procenat) koji je iznad određenog praga. Stoga, u određenim aspektima, ukoliko podsekvenca sadrži više od oko 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, ili 65% sadržaja uridina, takva podsekvenca bi se smatrala klasterom uridina.
[0510] Negativni efekti klastera uridina mogu biti, na primer, izazivanje TLR7 odgovora. Stoga, u nekim implementacijama postupaka optimizacije sekvence nukleinske kiseline koji su ovde objavljeni, poželjno je redukovati broj klastera, veličinu klastera, lokaciju klastera (npr. blizu 5' i/ili 3' kraja sekvence nukleinske kiseline), rastojanje između klastera, ili distribuciju klastera uridina (npr. određeni obrazac klastera duž sekvence nukleinske kiseline, distribucija klastera u odnosu na elemente sekundarne strukture u eksprimiranom proizvodu, ili distribucija klastera u odnosu na sekundarnu strukturu iRNK).
[0511] U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline sadrži najmanje jedan klaster uridina, pri čemu je navedeni klaster uridina podsekvenca referentne sekvence nukleinske kiseline pri čemu je procenat ukupnih nukleobaza uridina u navedenoj podsekvenci iznad unapred određenog praga. U nekim aspektima, dužina podsekvence je najmanje oko 10, najmanje oko 15, najmanje oko 20, najmanje oko 25, najmanje oko 30, najmanje oko 35, najmanje oko 40, najmanje oko 45, najmanje oko 50, najmanje oko 55, najmanje oko 60, najmanje oko 65, najmanje oko 70, najmanje oko 75, najmanje oko 80, najmanje oko 85, najmanje oko 90, najmanje oko 95, ili najmanje oko 100 nukleobaza. U nekim aspektima, podsekvenca je duža od 100 nukleobaza. U nekim aspektima, prag je 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ili 25% sadržaja uridina. U nekim aspektima, prag je iznad 25%.
[0512] Na primer, amino-kiselinska sekvenca koja sadrži A, D, G, S i R može biti kodirana sekvencom nukleinske kiseline GCU, GAU, GGU, AGU, CGU. Iako takva sekvenca uopšte ne sadrži parove, triplete ili kvadriplete uridina, jedna trećina nukleobaza bi bili uridini. Takav
2
klaster uridina bi se mogao ukloniti upotrebom alternativnih kodona, na primer, upotrebom GCC, GAC, GGC, AGC, i CGC, koji ne bi sadržali uridine.
[0513] U drugim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline sadrži najmanje jedan klaster uridina, pri čemu je navedeni klaster uridina podsekvenca referentne sekvence nukleinske kiseline u kojoj je procenat nukleobaza uridina navedene podsekvence izmeren upotrebom kliznog prozora koji je iznad unapred određenog praga. U nekim aspektima, dužina kliznog prozora je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40 nukleobaza. U nekim aspektima, klizni prozor je dužine preko 40 nukleobaza. U nekim aspektima, prag je 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ili 25% sadržaja uridina. U nekim aspektima, prag je iznad 25%.
[0514] U nekim aspektima, referentna sekvenca nukleinske kiseline sadrži najmanje dva klastera uridina. U nekim aspektima, uridin-modifikovana sekvenca sadrži manje klastera bogatih uridinom nego referentna sekvenca nukleinske kiseline. U nekim aspektima, uridinmodifikovana sekvenca sadrži više klastera bogatih uridinom nego referentna sekvenca nukleinske kiseline. U nekim aspektima, uridin-modifikovana sekvenca sadrži klastere bogate uridinom koji su kraći od odgovarajućih klastera bogatih uridinom u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U drugim aspektima, uridin-modifikovana sekvenca sadrži klastere bogate uridinom koji su duži od odgovarajućeg klastera bogatog uridinom u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline.
[0515] Videti, Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175; Kormann et al. (2010) Nature Biotechnology 29:154-157; ili Sahin et al. (2014) Nature Reviews Drug Discovery | AOP, objavljeno na mreži 19. septembra 2014. doi:10.1038/nrd4278;
b. Sadržaj guanina/citozina (G/C)
[0516] Referentna sekvenca nukleinske kiseline može biti optimizovana za sekvencu upotrebom postupaka koji sadrže izmenjivanje sadržaja guanina/citozina (G/C) (apsolutnog ili relativnog) referentne sekvence nukleinske kiseline. Takva optimizacija može da sadrži izmenjivanje (npr. povećanje ili smanjenje) globalnog sadržaja G/C (apsolutnog ili relativnog) referentne sekvence nukleinske kiseline; introdukovanje lokalnih promena sadržaja G/C u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline (npr. povećanje ili smanjenje G/C u odabranim regionima ili podsekvencama u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline); izmenjivanje
2
učestalosti, veličine, i distribucije G/C klastera u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline, ili njihove kombinacije.
[0517] U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom koja kodira IL-23, IL-36-gama i/ili OX40L polipeptid sadrži sveukupno povećanje sadržaja G/C (apsolutnog ili relativnog) u odnosu na sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) referentne sekvence nukleinske kiseline. U nekim aspektima, sveukupno povećanje sadržaja G/C (apsolutnog ili relativnog) je najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 100% u odnosu na sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) referentne sekvence nukleinske kiseline.
[0518] U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid sadrži sveukupno smanjenje sadržaja G/C (apsolutnog ili relativnog) u odnosu na sadržaj G /C referentne sekvence nukleinske kiseline. U nekim aspektima, sveukupno smanjenje sadržaja G/C (apsolutnog ili relativnog) je najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 100% u odnosu na sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) referentne sekvence nukleinske kiseline.
[0519] U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid sadrži lokalno povećanje sadržaja guanina/citozina (G/C) (apsolutnog ili relativnog) u podsekvenci (tj. G/C modifikovana podsekvenca) u odnosu na sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) odgovarajuće podsekvence u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U nekim aspektima, lokalno povećanje sadržaja G/C (apsolutno ili relativno) je za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 100% u odnosu na sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) odgovarajuće podsekvence u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline.
2
[0520] U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid sadrži lokalno smanjenje sadržaja guanina/citozina (G/C) (apsolutnog ili relativnog) u podsekvenci (tj. G/C modifikovana podsekvenca) u odnosu na sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) odgovarajuće podsekvence u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline. U nekim aspektima, lokalno smanjenje sadržaja G/C (apsolutno ili relativno) je za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 100% u odnosu na sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) odgovarajuće podsekvence u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline.
[0521] U nekim aspektima, sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) se povećava ili smanjuje u podsekvenci koja je dužine najmanje oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100 nukleobaza.
[0522] U nekim aspektima, sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) se povećava ili smanjuje u podsekvenci koja je dužine najmanje oko 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ili 1000 nukleobaza.
[0523] U nekim aspektima, sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) se povećava ili smanjuje u podsekvenci koja je dužine najmanje oko 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, ili 10000 nukleobaza.
[0524] Povećanja ili smanjenja sadržaja G i C (apsolutnog ili relativnog) koja su ovde opisana mogu se izvesti zamenom sinonimnih kodona sa niskim sadržajem G/C sa sinonimnim kodonima koji imaju viši sadržaj G/C, ili obrnuto. Na primer, L ima 6 sinonimnih kodona: dva od njih imaju 2 G/C (CUC, CUG), 3 imaju jedan G/C (UUG, CUU, CUA), i jedan nema G/C (UUA). Tako da ukoliko je referentna nukleinska kiselina imala CUC kodon na
2
određenoj poziciji, sadržaj G/C na toj poziciji mogao bi se redukovati zamenom CUC sa bilo kojim kodonom koji ima jedan G/C ili kodonom bez G/C.
[0525] Videti, S.A.D. publikacije br. US20140228558, US20050032730 A1; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83: 37-46;
c. Učestalost kodona – sklonost upotrebe kodona
[0526] Brojni postupci kodon optimizacije koji su poznati u struci zasnovani su na supstituciji kodona u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline kodonima koji imaju više učestalosti. Stoga, u nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid koja je ovde objavljena, može biti optimizovana za sekvencu upotrebom postupaka koji sadrže upotrebu modifikacija u učestalosti upotrebe jednog ili više kodona u odnosu na druge sinonimne kodone u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom u odnosu na učestalost upotrebe u ne-kodon optimizovanoj sekvenci.
[0527] Kao što se ovde upotrebljava, termin "učestalost kodona" označava sklonost upotrebe kodona, tj. razlike u učestalosti pojavljivanja sinonimnih kodona u kodiranju DNK/RNK. Opšte je poznato da kodon preferencije odražavaju ravnotežu između mutacionih sklonosti i prirodne selekcije za optimizaciju translacije. Optimalni kodoni pomažu u postizanju bržih stopa translacije i visoke preciznosti. Kao rezultat ovih faktora, očekuje se da će translaciona selekcija biti jača u visoko eksprimiranim genima. U oblasti bioinformatike i računarske biologije, mnogi statistički postupci su predloženi i upotrebljavaju se za analizu sklonosti upotrebe kodona. Videti, npr. Comeron & Aguadé (1998) J. Mol. Evol. 47: 268-74. Postupci kao što su 'učestalost optimalnih kodona' (Fop) (Ikemura (1981) J. Mol. Biol. 151 (3): 389-409), the Relative Codon Adaptation (RCA) (Fox & Eril (2010) DNA Res.17 (3): 185-96) ili 'indeks adaptacije kodona' (CAI) (Sharp & Li (1987) Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95) upotrebljavaju se za predviđanje nivoa ekspresije gena, dok se postupci kao što su 'efikasni broj kodona' (Nc) i Šenonova (Shannon) entropija iz teorije informacija upotrebljavaju za merenje ravnomernosti upotrebe kodona. Multivarijantni statistički postupci, kao što su analiza korespondencije i analiza glavnih komponenti, široko se upotrebljavaju za analizu varijacija u upotrebi kodona među genima (Suzuki et al. (2008) DNA Res. 15 (6): 357-65; Sandhu et al., In Silico Biol., 2008;8(2):187-92).
[0528] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama i/ili OX40L polipeptid koja je ovde objavljena (npr. sekvenca nukleinske kiseline divljeg tipa, mutantna sekvenca nukleinske kiseline, himerna nukleinska sekvenca, itd. koja može biti, na primer, iRNK),
2
može biti kodon optimizovana upotrebom postupaka koji sadrže supstituciju najmanje jednog kodona u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline sa alternativnim kodonom koji ima višu ili nižu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona; pri čemu rezultujuća nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom ima najmanje jedno optimizovano svojstvo u odnosu na referentnu sekvencu nukleinske kiseline.
[0529] U nekim aspektima, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% kodona u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid supstituisano je sa alternativnim kodonima, svaki alternativni kodon ima učestalost kodona višu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0530] U nekim aspektima, najmanje jedan kodon u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid supstituisan je sa alternativnim kodonom koji ima učestalost kodona višu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona, i najmanje jedan kodon u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline supstituisan je sa alternativnim kodonom koji ima učestalost kodona nižu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0531] U nekim aspektima, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, ili najmanje oko 75% kodona u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid supstituisano je sa alternativnim kodonima, svaki alternativni kodon ima učestalost kodona višu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0532] U nekim aspektima, najmanje jedan alternativni kodon koji ima višu učestalost kodona ima najvišu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona. U drugim aspektima, svi alternativni kodoni koji imaju višu učestalost kodona imaju najvišu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0533] U nekim aspektima, najmanje jedan alternativni kodon koji ima nižu učestalost kodona ima najnižu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona. U nekim aspektima, svi alternativni kodoni koji imaju višu učestalost kodona imaju najvišu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona.
21
[0534] U nekim specifičnim aspektima, najmanje jedan alternativni kodon ima drugu najvišu, treću najvišu, četvrtu najvišu, petu najvišu ili šestu najvišu učestalost u skupu sinonimnih kodona. U nekim specifičnim aspektima, najmanje jedan alternativni kodon ima drugu najnižu, treću najnižu, četvrtu najnižu, petu najnižu, ili šestu najnižu učestalost u skupu sinonimnih kodona.
[0535] Optimizacija zasnovana na učestalosti kodona može se primeniti globalno, kao što je prethodno opisano, ili lokalno na referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid. U nekim aspektima, kada se primenjuje lokalno, regioni referentne sekvence nukleinske kiseline mogu se modifikovati na osnovu učestalosti kodona, supstituišući sve ili određeni procenat kodona u određenoj podsekvenci sa kodonima koji imaju više ili niže učestalosti u svojim odgovarajućim skupovima sinonimnih kodona. Stoga, u nekim aspektima, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100% kodona u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline supstituisano je sa alternativnim kodonima, svaki alternativni kodon ima učestalost kodona višu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0536] U nekim aspektima, najmanje jedan kodon u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama i/ili OX40L polipeptid supstituisan je sa alternativnim kodonom koji ima učestalost kodona višu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona, i najmanje jedan kodon u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline supstituisan je sa alternativnim kodonom koji ima učestalost kodona nižu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0537] U nekim aspektima, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, ili najmanje oko 75% kodona u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline koja kodira IL-23 i/ili IL-36-gama, IL-18 polipeptid supstituisano je sa alternativnim kodonima, svaki alternativni kodon ima učestalost kodona višu od učestalosti kodona supstituisanog kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0538] U nekim aspektima, najmanje jedan alternativni kodon koji je supstituisan u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid i koji ima višu učestalost kodona ima najvišu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona. U drugim aspektima, svi alternativni kodoni koji su supstituisani u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline i koji imaju nižu učestalost kodona imaju najnižu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0539] U nekim aspektima, najmanje jedan alternativni kodon koji je supstituisan u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid i koji ima nižu učestalost kodona ima najnižu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona. U nekim aspektima, svi alternativni kodoni koji su supstituisani u podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline i koji imaju višu učestalost kodona imaju najvišu učestalost kodona u skupu sinonimnih kodona.
[0540] U specifičnim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može sadržati podsekvencu koja ima sveukupnu učestalost kodona višu ili nižu od sveukupne učestalosti kodona u odgovarajućoj podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline na specifičnoj lokaciji, na primer, na 5' kraju ili 3' kraju nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom, ili unutar unapred određene udaljenosti od tih regiona (npr. najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 kodona od 5' kraja ili 3' kraja nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom).
[0541] U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može sadržati više od jedne podsekvence koja ima sveukupnu učestalost kodona višu ili nižu od sveukupne učestalosti kodona u odgovarajućoj podsekvenci referentne sekvence nukleinske kiseline. Stručnjak sa iskustvom bi razumeo da podsekvence sa sveukupno višim ili nižim sveukupnim učestalostima kodona mogu biti organizovane u bezbroj obrazaca, u zavisnosti od toga da li je sveukupna učestalost kodona viša ili niža, dužine podsekvence, udaljenosti između podsekvenci, lokacije podsekvenci, itd.
[0542] Videti, S.A.D. patente br. US5082767, US8126653, US7561973, US8401798; S.A.D. publikacije br. US 20080046192, US 20080076161; Međunar. publ. br. WO2000018778; Welch et al. (2009) PLoS ONE 4(9): e7002; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83: 37-46; Chung et al. (2012) BMC Systems Biology 6:134;
d. Supstitucija destabilizujućeg motiva
[0543] Postoji niz motiva koji mogu uticati na optimizaciju sekvence, koji spadaju u različite neekskluzivne kategorije, na primer:
(i) Motivi zasnovani na primarnoj sekvenci: Motivi definisani jednostavnim aranžmanom nukleotida.
(ii) Strukturni motivi: Motivi kodirani aranžmanom nukleotida koji teži da formira određenu sekundarnu strukturu.
(iii) Lokalni motivi: Motivi kodirani u jednoj neprekidnoj podsekvenci.
(iv) Distribuirani motivi: Motivi kodirani u dve ili više nepovezanih podsekvenci.
(v) Povoljni motivi: Motivi koji poboljšavaju strukturu ili funkciju nukleotida.
(vi) Nepovoljni motivi: Motivi sa štetnim efektima na strukturu ili funkciju nukleotida.
[0544] Postoji mnogo motiva koji spadaju u kategoriju nepovoljnih motiva. Neki primeri uključuju, na primer, motive restrikcionog enzima, koji imaju tendenciju da budu relativno kratke, egzaktne sekvence kao što su motivi restrikcionog mesta za Xbal (TCTAGA), EcoRI (GAATTC), EcoRII (CCWGG, gde W znači A ili T, prema IUPAC dvosmislenim kodovima), ili HindIII (AAGCTT); enzimska mesta, koja imaju tendenciju da budu duža i zasnovana na konsenzusnoj neegzaktnoj sekvenci, kao što je u T7 RNK polimerazi (GnnnnWnCRnCTCnCnnWnD, gde n znači bilo koji nukleotid, R znači A ili G, W znači A ili T, D znači A ili G ili T ali ne C); strukturne motive, kao što su GGGG ponovci (Kim et al. (1991) Nature 351(6324):331-2); ili druge motive kao što su CUG-triplet ponovci (Querido et al. (2014) J. Cell Sci.124:1703-1714).
[0545] U skladu sa tim, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid koja je ovde objavljena može biti optimizovana za sekvencu upotrebom postupaka koji sadrže supstituisanje najmanje jednog destabilizujućeg motiva u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline, i uklanjanje takvog nepovoljnog motiva ili njegovu zamenu povoljnim motivom.
[0546] U nekim aspektima, proces optimizacije sadrži identifikaciju povoljnih i/ili nepovoljnih motiva u referentnoj nukleinskoj sekvenci, pri čemu su takvi motivi, npr. specifične podsekvence koje mogu uzrokovati gubitak stabilnosti u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline pre ili tokom procesa optimizacije. Na primer, supstitucija specifičnih baza tokom optimizacije može da generiše podsekvencu (motiv) koju prepoznaje restrikcioni enzim. U skladu sa tim, tokom procesa optimizacije pojava nepovoljnih motiva može se pratiti poređenjem sekvence sa optimizovanovanom sekvencom sa bibliotekom motiva za
21
koje se zna da su nepovoljni. Zatim, identifikacija nepovoljnih motiva bi se mogla upotrebljavati kao post-hoc filter, tj. kako bi se odredilo da li bi određena modifikacija koja bi potencijalno mogla da se introdukuje u referentnu sekvencu nukleinske kiseline zaista trebalo da se implementira ili ne.
[0547] U nekim aspektima, identifikacija nepovoljnih motiva može se upotrebljavati pre primene postupaka optimizacije sekvence koji su ovde objavljeni, tj. identifikacija motiva u referentnoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid i njihova zamena sa alternativnim sekvencama nukleinske kiseline mogu se upotrebljavati kao korak pre obrade, na primer, pre redukcije uridina.
[0548] U drugim aspektima, identifikacija nepovoljnih motiva i njihovo uklanjanje upotrebljava se kao dodatna tehnika optimizacije sekvence integrisana u multiparametarski postupak optimizacije nukleinske kiseline koji sadrži dva ili više postupaka optimizacije sekvence koji su ovde objavljeni. Kada se upotrebljava na ovaj način, nepovoljan motiv identifikovan tokom procesa optimizacije bio bi uklonjen, na primer, supstituisanjem najmanjim mogućim brojem nukleobaza kako bi se očuvao što je bolje moguće princip(i) originalnog dizajna (npr. nizak sadržaj U, visoka učestalost, itd.).
[0549] Videti, npr. S.A.D. publikacije br. US20140228558, US20050032730, ili US20140228558.
e. Optimizacija ograničenog skupa kodona
[0550] U nekim posebnim aspektima, optimizacija sekvence referentne sekvence nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može se sprovesti upotrebom ograničenog skupa kodona, npr. skupa kodona u kome se manje od nativnog broja kodona upotrebljava za kodiranje 20 prirodnih amino-kiselina, podskup od 20 prirodnih amino-kiselina, ili prošireni skup amino-kiselina uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline.
[0551] Genetički kod je veoma sličan među svim organizmima i može se izraziti u jednostavnoj tabeli sa 64 unosa koji bi kodirali 20 standardnih amino-kiselina uključenih u translaciju proteina plus start i stop kodoni. Genetički kod je degenerisan, tj. generalno, više od jednog kodona specificira svaku amino-kiselinu. Na primer, amino-kiselina leucin je specificirana pomoću UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, ili CUG kodona, dok je amino-kiselina serin specificirana pomoću UCA, UCG, UCC, UCU, AGU, ili AGC kodona (razlika u prvoj, drugoj, ili trećoj poziciji). Nativni genetički kodovi sadrže 62 kodona koji kodiraju aminokiseline koje se javljaju u prirodi. Stoga, u nekim aspektima postupaka koji su ovde objavljeni, optimizovani skupovi kodona (genetički kodovi) koji sadrže manje od 62 kodona za kodiranje 20 amino-kiselina mogu da sadrže 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, ili 20 kodona.
[0552] U nekim aspektima, ograničen skup kodona sadrži manje od 20 kodona. Na primer, ukoliko protein sadrži manje od 20 tipova amino-kiselina, takav protein bi mogao biti kodiran skupom kodona sa manje od 20 kodona. U skladu sa tim, u nekim aspektima, optimizovan skup kodona sadrži onoliko kodona koliko je različitih tipova amino-kiselina prisutno u proteinu koji je kodiran referentnom sekvencom nukleinske kiseline. U nekim aspektima, optimizovan skup kodona sadrži 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili čak 1 kodon.
[0553] U nekim aspektima, najmanje jedna amino-kiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, i Val, tj. amino-kiseline koje su prirodno kodirane pomoću više od jednog kodona, kodirana je sa manje kodona od broja sinonimnih kodona koji se javlja u prirodi. Na primer, u nekim aspektima, Ala može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 3, 2 ili 1 kodona; Cys može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Asp može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Glu može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Phe može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Gly može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 3 kodona, 2 kodona ili 1 kodona; His može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Ile može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 2 kodona ili 1 kodona; Lys može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Leu može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 5 kodona, 4 kodona, 3 kodona, 2 kodona ili 1 kodona; Asn može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Pro može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 3 kodona, 2 kodona, ili 1 kodona; Gln može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona; Arg može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 5 kodona, 4 kodona, 3 kodona, 2 kodona, ili 1 kodona; Ser može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 5
21
kodona, 4 kodona, 3 kodona, 2 kodona, ili 1 kodona; Thr može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 3 kodona, 2 kodona, ili 1 kodona; Val može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 3 kodona, 2 kodona, ili 1 kodona; i, Tyr može biti kodirana u nukleinskoj kiselini sa optimizovanom sekvencom pomoću 1 kodona.
[0554] U nekim aspektima, najmanje jedna amino-kiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, i Val, tj. amino-kiselina koje su prirodno kodirane pomoću više od jednog kodona, kodira se pomoću jednog kodona u ograničenom skupu kodona.
[0555] U nekim specifičnim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom je DNK i ograničen skup kodona se sastoji od 20 kodona, pri čemu svaki kodon kodira jednu od 20 amino-kiselina. U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom je DNK i ograničen skup kodona sadrži najmanje jedan kodon odabran iz grupe koja se sastoji od GCT, GCC, GCA, i GCG; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, i AGG; najmanje kodon odabran od AAT ili ACC; najmanje kodon odabran od GAT ili GAC; najmanje kodon odabran od TGT ili TGC; najmanje kodon odabran od CAA ili CAG; najmanje kodon odabran od GAA ili GAG; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od GGT, GGC, GGA, i GGG; najmanje kodon odabran od CAT ili CAC; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od ATT, ATC, i ATA; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, i CTG; najmanje kodon odabran od AAA ili AAG; ATG kodon; najmanje kodon odabran od TTT ili TTC; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od CCT, CCC, CCA, i CCG; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, i AGC; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od ACT, ACC, ACA, i ACG; TGG kodon; najmanje kodon odabran od TAT ili TAC; i, najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od GTT, GTC, GTA, i GTG.
[0556] U drugim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom je RNK (npr. iRNK) i ograničen skup kodona se sastoji od 20 kodona, pri čemu svaki kodon kodira jednu od 20 amino-kiselina. U nekim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom je RNK i ograničen skup kodona sadrži najmanje jedan kodon odabran iz grupe koja se sastoji od GCU, GCC, GCA, i GCG; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, i AGG; najmanje kodon odabran od AAU ili ACC; najmanje kodon odabran od GAU ili GAC; najmanje kodon odabran od UGU ili UGC; najmanje kodon odabran od CAA ili CAG; najmanje kodon odabran od GAA ili GAG; najmanje kodon
21
odabran iz grupe koja se sastoji od GGU, GGC, GGA, i GGG; najmanje kodon odabran od CAU ili CAC; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od AUU, AUC, i AUA; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, i CUG; najmanje kodon odabran od AAA ili AAG; AUG kodon; najmanje kodon odabran od UUU ili UUC; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od CCU, CCC, CCA, i CCG; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, i AGC; najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od ACU, ACC, ACA, i ACG; UGG kodon; najmanje kodon odabran od UAU ili UAC; i, najmanje kodon odabran iz grupe koja se sastoji od GUU, GUC, GUA, i GUG.
[0557] U nekim specifičnim aspektima, ograničen skup kodona je optimizovan za in vivo ekspresiju nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom (npr. sintetičke iRNK) nakon primene u određeno tkivo ili ćeliju.
[0558] U nekim aspektima, optimizovan skup kodona (npr. skup od 20 kodona koji kodira 20 amino-kiselina) je u skladu sa najmanje jednim od sledećih svojstava:
(i) optimizovan skup kodona ima viši prosečni sadržaj G/C od originalnog ili nativnog skupa kodona; ili,
(ii) optimizovan skup kodona ima niži prosečan sadržaj U od originalnog ili nativnog skupa kodona; ili,
(iii) optimizovan skup kodona je sačinjen od kodona sa najvišom učestalošću; ili, (iv) optimizovan skup kodona je sačinjen od kodona sa najnižom učestalošću; ili, (v) njihova kombinacija.
[0559] U nekim specifičnim aspektima, najmanje jedan kodon u optimizovanom skupu kodona ima drugu najvišu, treću najvišu, četvrtu najvišu, petu najvišu ili šestu najvišu učestalost u skupu sinonimnih kodona. U nekim specifičnim aspektima, najmanje jedan kodon u optimizovanom kodonu ima drugu najnižu, treću najnižu, četvrtu najnižu, petu najnižu, ili šestu najnižu učestalost u skupu sinonimnih kodona.
[0560] Kao što se ovde upotrebljava, termin "nativni skup kodona" označava skup kodona koji nativno upotrebljava organizam za kodiranje referentne sekvence nukleinske kiseline. Kao što se ovde upotrebljava, termin "originalni skup kodona" označava skup kodona koji se upotrebljava za kodiranje referentne sekvence nukleinske kiseline pre početka optimizacije sekvence, ili skup kodona koji se upotrebljava za kodiranje optimizovane varijante referentne
21
sekvence nukleinske kiseline na početku nove iteracije optimizacije kada se optimizacija sekvence primenjuje iterativno ili rekurzivno.
[0561] U nekim aspektima, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% kodona u skupu kodona su oni sa najvišom učestalošću. U drugim aspektima, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% kodona u skupu kodona su oni sa najnižom učestalošću.
[0562] U nekim aspektima, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% kodona u skupu kodona su oni sa najvišim sadržajem uridina. U nekim aspektima, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% kodona u skupu kodona su oni sa najnižim sadržajem uridina.
[0563] U nekim aspektima, prosečan sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) skupa kodona je 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% viši od prosečnog sadržaja G/C (apsolutnog ili relativnog) originalnog skupa kodona. U nekim aspektima, prosečan sadržaj G/C (apsolutni ili relativni) skupa kodona je 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% niži od prosečnog sadržaja G/C (apsolutnog ili relativnog) originalnog skupa kodona.
[0564] U nekim aspektima, sadržaj uracila (apsolutni ili relativni) u skupu kodona je 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% viši od prosečnog sadržaja uracila (apsolutnog ili relativnog) originalnog skupa kodona. U nekim aspektima, sadržaj uracila (apsolutni ili relativni) u skupu kodona je 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% niži od prosečnog sadržaja uracila (apsolutnog ili relativnog) originalnog skupa kodona.
[0565] Videti takođe S.A.D. prij. publ. br. 2011/0082055, i Međunar. publ. br. WO2000018778,
VIII. Karakterizacija nukleinskih kiselina sa optimizovanom sekvencom
[0566] U nekim aspektima objave, polinukleotid (npr. RNK, npr. iRNK) koji sadrži nukleinsku kiselinu sa optimizovanom sekvencom koja je ovde objavljena koji kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može se testirati kako bi se odredilo da li je
21
najmanje jedno svojstvo sekvence nukleinske kiseline (npr. stabilnost kada je izloženo nukleazama) ili ekspresiono svojstvo poboljšano u odnosu na nukleinsku kiselinu bez optimizovane sekvence.
[0567] Kao što se ovde upotrebljava, "ekspresiono svojstvo" označava svojstvo sekvence nukleinske kiseline bilo in vivo (npr. efikasnost translacije sintetičke iRNK posle primene subjektu kome je to potrebno) ili in vitro (npr. efikasnost translacije sintetičke iRNK testirano u in vitro model sistemu). Ekspresiona svojstva uključuju ali nisu ograničena na količinu proteina proizvedenog od strane iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid posle primene, i količinu proizvedenog solubilnog ili na drugi način funkcionalnog proteina. U nekim aspektima, nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom koje su ovde objavljene mogu se proceniti u skladu sa vijabilnošću ćelija koje eksprimiraju protein kodiran sekvencom nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom (npr. RNK, npr. iRNK) koja kodira IL-23, IL- 36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid koja je ovde objavljena.
[0568] U posebnom aspektu, mnoštvo nukleinskih kiselina sa optimizovanom sekvencom koje su ovde objavljene (npr. RNK, npr. iRNK) koje sadrže supstitucije kodona u odnosu na neoptimizovanu referentnu sekvencu nukleinske kiseline mogu biti funkcionalno okarakterisane za merenje svojstva od interesa, na primer ekspresiono svojstvo u in vitro model sistemu, ili in vivo u ciljnom tkivu ili ćeliji.
a. Optimizacija unutrašnjih svojstava sekvence nukleinske kiseline
[0569] U nekim aspektima objave, željeno svojstvo polinukleotida je unutrašnje svojstvo sekvence nukleinske kiseline. Na primer, nukleotidna sekvenca (npr. RNK, npr. iRNK) može biti optimizovana za sekvencu za in vivo ili in vitro stabilnost. U nekim aspektima, nukleotidna sekvenca može biti optimizovana za sekvencu za ekspresiju u određenom ciljnom tkivu ili ćeliji. U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline je optimizovana za sekvencu kako bi se povećala njena polovina u plazmi sprečavanjem njene degradacije od strane endo i egzonukleaza.
[0570] U drugim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline je optimizovana za sekvencu kako bi se povećala njena rezistencija na hidrolizu u rastvoru, na primer, kako bi se produžilo vreme u kome se nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom ili farmaceutska kompozicija koja sadrži nukleinsku kiselinu sa optimizovanom sekvencom može skladištiti u vodenim uslovima uz minimalnu degradaciju.
21
[0571] U drugim aspektima, nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom može biti optimizovana kako bi se povećala njena rezistencija na hidrolizu u uslovima suvog skladištenja, na primer, kako bi se produžilo vreme u kome se nukleinska kiselina sa optimizovanom sekvencom može skladištiti posle liofilizacije uz minimalnu degradaciju.
b. Sekvenca nukleinske kiseline optimizovana za ekspresiju proteina
[0572] U nekim aspektima objave, željeno svojstvo polinukleotida je nivo ekspresije IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida koji je kodiran sekvencom sa optimizovanom sekvencom koja je ovde objavljena. Nivoi ekspresije proteina se mogu izmeriti upotrebom jednog ili više ekspresionih sistema. U nekim aspektima, ekspresija se može izmeriti u sistemima ćelijske kulture, npr. CHO ćelije ili HEK293 ćelije. U nekim aspektima, ekspresija se može izmeriti upotrebom in vitro ekspresionih sistema pripremljenih od ekstrakata živih ćelija, npr. lizata retikulocita zeca, ili in vitro ekspresionih sistema pripremljenih asembliranjem prečišćenih pojedinačnih komponenti. U drugim aspektima, ekspresija proteina se meri u in vivo sistemu, npr. miš, zec, majmun, itd.
[0573] U nekim aspektima, ekspresija proteina u obliku rastvora može biti poželjna. U skladu sa tim, u nekim aspektima, referentna sekvenca može biti optimizovana za sekvencu kako bi se dobila sekvenca nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom koja ima optimizovane nivoe eksprimiranih proteina u solubilnom obliku. Nivoi ekspresije proteina i druga svojstva kao što su solubilnost, nivoi agregacije, i prisustvo produkata skraćenja (tj. fragmenata usled proteolize, hidrolize, ili defektne translacije) mogu se izmeriti u skladu sa postupcima koji su poznati u struci, na primer, upotrebom elektroforeze (npr. nativna ili SDS-PAGE) ili hromatografskih postupaka (npr. HPLC, ekskluziona hromatografija, itd.).
c. Optimizacija vijabilnosti ciljnog tkiva ili ciljne ćelije
[0574] U nekim aspektima, ekspresija heterolognih terapijskih proteina kodiranih sekvencom nukleinske kiseline može imati štetne efekte u ciljnom tkivu ili ćeliji, redukujući prinos proteina, ili redukujući kvalitet eksprimiranog proizvoda (npr. usled prisustva fragmenata proteina ili taloženja eksprimiranog proteina u inkluzionim telima), ili uzrokujući toksičnost.
[0575] U skladu sa tim, u nekim aspektima objave, može se upotrebljavati optimizacija sekvence sekvence nukleinske kiseline koja je ovde objavljena, npr. sekvenca nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid, kako bi se povećala
22
vijabilnost ciljnih ćelija koje eksprimiraju protein kodiran nukleinskom kiselinom sa optimizovanom sekvencom.
[0576] Ekspresija heterolognog proteina takođe može biti štetna za ćelije transfektovane sa sekvencom nukleinske kiseline za autolognu ili heterolognu transplantaciju. U skladu sa tim, u nekim aspektima predmetne objave, optimizacija sekvence sekvence nukleinske kiseline koja je ovde objavljena može se upotrebljavati za povećanje vijabilnosti ciljnih ćelija koje eksprimiraju protein kodiran sekvencom nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom. Promene u vijabilnosti, toksičnosti ćelije ili tkiva i druge fiziološke reakcije mogu se izmeriti u skladu sa postupcima koji su poznati u struci.
d. Redukcija imunskog i/ili inflamatornog odgovora
[0577] U nekim slučajevima, primena nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid ili njenog funkcionalnog fragmenta može pokrenuti imunski odgovor, koji može biti uzrokovan od strane (i) terapijskog agensa (npr. iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid), ili (ii) proizvoda ekspresije takvog terapijskog agensa (npr. IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid kodiran od strane iRNK), ili (iv) njihove kombinacije. U skladu sa tim, u nekim aspektima predmetne objave, optimizacija sekvence sekvence nukleinske kiseline (npr. iRNK) koja je ovde objavljena može se upotrebljavati za smanjenje imunskog ili inflamatornog odgovora pokrenutog primenom nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid ili proizvodom ekspresije IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida kodiranog takvom nukleinskom kiselinom.
[0578] U nekim aspektima, inflamatorni odgovor se može izmeriti detektovanjem povećanih nivoa jednog ili više inflamatornih citokina upotrebom postupaka koji su poznati u struci, npr. ELISA. Termin "inflamatorni citokin" označava citokine koji su povišeni u inflamatornom odgovoru.
[0579] Primeri inflamatornih citokina uključuju interleukin-6 (IL-6), CXCL1 (hemokin (C-X-C motiv) ligand 1; takođe poznat kao GROα, interferon-γ (IFNγ), faktor nekroze tumora α (TNFα), interferon γ-indukovani protein 10 (IP-10), ili faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF). Termin inflamatorni citokini uključuje i druge citokine povezane sa inflamatornim odgovorima koji su poznati u struci, npr. interleukin-1 (IL-1), interleukin-8 (IL-8), interleukin-13 (IL-13), interferon α (IFN-α) itd.
IX. Polinukleotidi koji kodiraju imunomodulatorne polipeptide koji sadrže microRNA vezujuća mesta
[0580] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može dodatno da sadrži jedno ili više microRNA vezujućih mesta. microRNA (ili miRNA) su nekodirajuće RNK dužine 19-25 nukleotida koje se vezuju za 3'UTR molekula nukleinske kiseline i smanjuju ekspresiju gena bilo redukovanjem stabilnosti molekula nukleinske kiseline ili inhibiranjem translacije.
[0581] Predmetna objava takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije i formulacije koje sadrže bilo koji od poliribonukleotida koji su prethodno opisani. U nekim aspektima, kompozicija ili formulacija dodatno sadrži agens za isporuku.
[0582] U nekim aspektima, kompozicija ili formulacija mogu da sadrže poliribonukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu sa optimizovanom sekvencom koja je ovde objavljena i koja kodira polipeptid. U nekim aspektima, kompozicija ili formulacija mogu sadržati poliribonukleotid (npr. RNK, npr. iRNK) koji sadrži poliribonukleotid (npr. ORF) koji ima značajnu identičnost sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline sa optimizovanom sekvencom koja je ovde objavljena koja kodira polipeptid. U nekim aspektima, poliribonukleotid dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto, npr. miRNA vezujuće mesto koje vezuje miR-122.
[0583] Projektovanjem ciljnih sekvenci microRNA u polinukleotide (npr. u 3'UTR sličnom regionu ili drugom regionu) iz objave, može se ciljati molekul za degradaciju ili redukovanu translaciju, pod uslovom da je microRNA o kojoj je reč dostupna. Ovo može redukovati nespecifične efekte nakon isporuke poliribonukleotida. Na primer, ukoliko poliribonukleotid iz objave nije namenjen da se isporuči u tkivo ili ćeliju, ali na kraju završi u navedenom tkivu ili ćeliji, onda miRNA koje ima u izobilju u tkivu ili ćeliji može inhibirati ekspresiju gena od interesa ukoliko su jedno ili više miRNA vezujućih mesta projektovana u 5'UTR i/ili 3'UTR poliribonukleotida. Stoga, u nekim aspektima, inkorporisanje jednog ili više miRNA vezujućih mesta u iRNK iz objave može redukovati opasnost od nespecifičnih efekata nakon isporuke molekula nukleinske kiseline i/ili omogućiti tkivno-specifičnu regulaciju ekspresije polipeptida kodiranog od strane iRNK. U još nekim aspektima, inkorporisanje jednog ili više miRNA vezujućih mesta u iRNK iz objave može modulirati imunske odgovore nakon isporuke nukleinske kiseline in vivo. U dodatnim aspektima, inkorporisanje jednog ili više miRNA vezujućih mesta u iRNK iz objave može modulirati ubrzani klirens iz krvi (ABC) jedinjenja i kompozicija koje sadrže lipide koje su ovde opisane.
[0584] Suprotno tome, miRNA vezujuća mesta mogu se ukloniti iz poliribonukleotidnih sekvenci u kojima se prirodno javljaju kako bi se povećala ekspresija proteina u specifičnim tkivima. Na primer, vezujuće mesto za specifičnu miRNA može se ukloniti iz poliribonukleotida kako bi se poboljšala ekspresija proteina u tkivima ili ćelijama koje sadrže miRNA.
[0585] microRNA potiču enzimski iz regiona RNK transkripata koji se preklapaju na sebe kako bi formirali kratke strukture ukosnice koje se često nazivaju pre-miRNA (prekursormiRNA). Pre-miRNA tipično ima viseći kraj od dva nukleotida na svom 3' kraju, i ima 3' hidroksil i 5' fosfatne grupe. Ova prekursor-iRNK se obrađuje u nukleusu i zatim transportuje u citoplazmu gde je dodatno obrađuje DICER (enzim RNaza III), kako bi se formirala zrela microRNA od približno 22 nukleotida. Zrela microRNA se zatim inkorporiše u ribonuklearnu česticu kako bi se formirao RNK-indukovani kompleks za utišavanje, RISC, koji posreduje u utišavanju gena. Nomenklatura prepoznata u struci za zrele miRNA tipično označava krak pre-miRNA od kog zrela miRNA potiče; "5p" znači da je mikroRNA od 5 prim kraka premiRNA ukosnice, i "3p" znači da je microRNA od 3 prim kraja pre-miRNA ukosnice. miR koja je ovde označena brojem može označavati bilo koju od dve zrele microRNA koje potiču od suprotnih krakova iste pre-miRNA (npr. bilo 3p ili 5p microRNA). Sve miR koje se ovde označavaju namenjeno je da uključe i 3p i 5p krake/sekvence, osim ukoliko nije posebno specificirano 3p ili 5p oznakom.
[0586] U jednom aspektu, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) se vezuje za odgovarajuću zrelu miRNA koja je deo aktivnog RNK-indukovanog kompleksa za utišavanje (RISC) koji sadrži Dicer. U sledećem aspektu, vezivanje miRNA vezujućeg mesta za odgovarajuću miRNA u RISC degradira iRNK koja sadrži miRNA vezujuće mesto ili sprečava iRNK da se translatira.
[0587] Kao što se ovde upotrebljava, termin "microRNA vezujuće mesto" označava microRNA ciljno mesto ili microRNA mesto za prepoznavanje, ili bilo koju nukleotidnu sekvencu za koju se microRNA vezuje ili asocira. Treba razumeti da "vezivanje" može da prati tradicionalna pravila Votson-Krik (Watson-Crick) hibridizacije ili može da odražava bilo koju stabilnu asocijaciju microRNA sa ciljnom sekvencom na mestu microRNA ili pored njega.
[0588] Nekih microRNA, npr. miR-122, ima u izobilju u normalnom tkivu, ali su prisutne u mnogo nižim nivoima u tkivu kancera ili tumora. Stoga, projektovanje microRNA ciljnih sekvenci (tj. microRNA vezujuće mesto) u polinukleotide koji kodiraju IL-23 i/ili IL-36-gama, IL-18 i/ili treći protein (npr. OX40L polipeptid) (npr. 3'UTR sličan region ili drugi
22
region) može efikasno ciljati molekul za degradaciju ili redukovanu translaciju u normalnom tkivu (gde je microRNA u izobilju) istovremeno obezbeđujući visoke nivoe translacije u tkivu kancera ili tumora (gde je mikroRNA prisutna u mnogo nižim nivoima). Ovo obezbeđuje pristup ciljanog delovanja na tumor za postupke i kompozicije iz objave.
[0589] U nekim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je u potpunosti komplementarno sa miRNA (npr. miR-122), čime se degradira iRNK fuzionisana za miRNA vezujuće mesto. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto nije u potpunosti komplementarno odgovarajućoj miRNA. U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je iste dužine kao i odgovarajuća miRNA (npr. miR-122). U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je jedan nukleotid kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122, koja ima 22 nt) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili na oba. U još nekim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je dva nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili na oba. U još nekim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je tri nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili na oba. U nekim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je četiri nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili na oba. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je pet nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili na oba.
[0590] U nekim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je šest nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu, 3' terminusu, ili na oba. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je sedam nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je osam nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je devet nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je deset nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je jedanaest nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je dvanaest nukleotida kraće od odgovarajuće microRNA (npr. miR-122) na 5' terminusu ili 3' terminusu. miRNA vezujuća mesta koja su kraća od odgovarajućih miRNA su i dalje sposobna da degraduju iRNK koja inkorporiše jedno ili više miRNA vezujućih mesta ili sprečavaju translaciju iRNK.
[0591] U nekim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima dovoljnu komplementarnost sa miRNA (npr. miR-122) tako da RISC kompleks koji sadrži miRNA (npr. miR-122) iseca polinukleotid koji sadrži microRNA vezujuće mesto. U drugim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima nesavršenu komplementarnost tako da RISC kompleks koji sadrži miRNA (npr. miR-122) indukuje nestabilnost u polinukleotidu koji sadrži microRNA vezujuće mesto. U sledećim aspektima, microRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima nesavršenu komplementarnost tako da RISC kompleks koji sadrži miRNA (npr. miR-122) potiskuje transkripciju polinukleotida koji sadrži microRNA vezujuće mesto.
[0592] miRNA vezujuće mesto koje ima dovoljnu komplementarnost sa miRNA označava stepen komplementarnosti dovoljan da olakša miRNA-posredovanu regulaciju poliribonukleotida, npr. miRNA-posredovanu translacionu represiju ili degradaciju poliribonukleotida. U primerima aspekata objave, miRNA vezujuće mesto koje ima dovoljnu komplementarnost sa miRNA označava stepen komplementarnosti dovoljan da olakša miRNA-posredovanu degradaciju poliribonukleotida, npr. miRNA-vođeno RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC)-posredovano isecanje iRNK. miRNA vezujuće mesto može imati komplementarnost sa, na primer, sekvencom miRNA koja je dužine 19-25 nukleotida, sekvencom miRNA koja je dužine 19-23 nukleotida, ili sa sekvencom miRNA koja je dužine 22 nukleotida. miRNA vezujuće mesto može biti komplementarno samo delu miRNA, npr. delu manje od 1, 2, 3, ili 4 nukleotida od pune dužine miRNA sekvence koja se javlja u prirodi, ili delu manje od 1, 2, 3, ili 4 nukleotida kraćem od miRNA sekvence koja se javlja u prirodi (takvo miRNA vezujuće mesto ima "nesavršenu komplementarnost"). Puna ili potpuna komplementarnost (npr. puna komplementarnost ili potpuna komplementarnost preko cele ili značajnog dela dužine miRNA koja se javlja u prirodi) je poželjna kada je željena regulacija degradacija iRNK.
[0593] U jednom aspektu, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima jedno nepodudaranje sa odgovarajućom miRNA (npr. miR-122). U sledećem aspektu, miRNA vezujuće mesto ima dva nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima tri nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima četiri nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima pet nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA.
22
U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima šest nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima sedam nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima osam nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima devet nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima deset nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima jedanaest nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto ima dvanaest nepodudaranja sa odgovarajućom miRNA.
[0594] U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) ima najmanje oko deset neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko deset neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA (npr. miR-122), najmanje oko jedanaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko jedanaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko dvanaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko dvanaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko trinaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko trinaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, ili najmanje oko četrnaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko četrnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA. U nekim aspektima, miRNA vezujuća mesta imaju najmanje oko petnaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko petnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko šesnaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko šesnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko sedamnaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko sedamnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko osamnaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko osamnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko devetnaest neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko devetnaest neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, najmanje oko dvadeset neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko dvadeset neprekidnih nukleotida odgovarajuće miRNA, ili najmanje oko dvadeset jedan neprekidnih nukleotida koji su komplementarni sa najmanje oko dvadeset jednim neprekidnim nukleotidima odgovarajuće miRNA.
[0595] U nekim aspektima, polinukleotidi sadrže iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid i najmanje jedno miR-122 vezujuće mesto, najmanje dva miR-122 vezujuća mesta, najmanje tri miR-122 vezujuća mesta, najmanje četiri miR-122 vezujuća mesta, ili najmanje pet miR-122 vezujućih mesta. U jednom aspektu, miRNA vezujuće mesto
22
vezuje miR-122 ili je komplementarno sa miR-122. U sledećem aspektu, miRNA vezujuće mesto se vezuje za miR-122-3p ili miR-122-5p. U određenom aspektu, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 24, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122. U sledećem posebnom aspektu, miRNA vezujuće mesto sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 26, pri čemu se miRNA vezujuće mesto vezuje za miR-122. Ove sekvence su pokazane u nastavku u TABELI 2.
Tabela 2. miR-122 i miR-122 vezujuća mesta
[0596] U nekim aspektima, miRNA vezujuće mesto (npr. miR-122 vezujuće mesto) je insertovano u polinukleotid iz objave na bilo kojoj poziciji polinukleotida (npr. 3' UTR); mesto insercije u polinukleotidu može biti bilo gde u polinukleotidu sve dok insercija miRNA vezujućeg mesta u polinukleotid ne ometa translaciju funkcionalnog IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida u odsustvu odgovarajuće miRNA (npr. miR-122); a u prisustvu miRNA (npr. miR-122), insercija miRNA vezujućeg mesta u polinukleotid i vezivanje miRNA vezujućeg mesta za odgovarajuću miRNA su sposobne da degradiraju polinukleotid
22
ili da sprečavaju translaciju polinukleotida. U jednom aspektu, miRNA vezujuće mesto je insertovano u 3'UTR polinukleotida.
[0597] U određenim aspektima, miRNA vezujuće mesto je insertovano u najmanje oko 30 nukleotida nizvodno od stop kodona iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto je insertovano u najmanje oko 10 nukleotida, najmanje oko 15 nukleotida, najmanje oko 20 nukleotida, najmanje oko 25 nukleotida, najmanje oko 30 nukleotida, najmanje oko 35 nukleotida, najmanje oko 40 nukleotida, najmanje oko 45 nukleotida, najmanje oko 50 nukleotida, najmanje oko 55 nukleotida, najmanje oko 60 nukleotida, najmanje oko 65 nukleotida, najmanje oko 70 nukleotida, najmanje oko 75 nukleotida, najmanje oko 80 nukleotida, najmanje oko 85 nukleotida, najmanje oko 90 nukleotida, najmanje oko 95 nukleotida, ili najmanje oko 100 nukleotida nizvodno od stop kodona polinukleotida, npr. iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid. U drugim aspektima, miRNA vezujuće mesto je insertovano u oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida, oko 20 nukleotida do oko 90 nukleotida, oko 30 nukleotida do oko 80 nukleotida, oko 40 nukleotida do oko 70 nukleotida, oko 50 nukleotida do oko 60 nukleotida, oko 45 nukleotida do oko 65 nukleotida, nizvodno od stop kodona polinukleotida, npr. iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid.
Arhitektura IVT polinukleotida
[0598] U nekim aspektima, polinukleotid iz predmetne objave koji sadrži iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid je IVT polinukleotid. Tradicionalno, osnovne komponente iRNK molekula uključuju najmanje kodirajući region, 5'UTR, 3'UTR, 5' kapu i poli-A rep. IVT polinukleotidi iz predmetne objave mogu da funkcionišu kao iRNK, ali se razlikuju od iRNK divljeg tipa po svojim svojstvima funkcionalnog i/ili strukturnog dizajna koja služe, npr. za prevazilaženje postojećih problema efikasne proizvodnje polipeptida upotrebom terapeutika zasnovanih na nukleinskoj kiselini.
[0599] Primarni konstrukt IVT polinukleotida sadrži prvi region povezanih nukleotida koji je omeđen prvim bočnim regionom i drugim bočnim regionom. Ovaj prvi region može uključivati, ali nije ograničen na, kodirani IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid. Prvi bočni region može uključivati sekvencu povezanih nukleozida koji funkcionišu kao 5' netranslatirani region (UTR) kao što je 5' UTR bilo koje od nukleinskih kiselina koje kodiraju nativni 5' UTR polipeptida ili ne-nativni 5' UTR kao što je, ali bez ograničenja na, heterologni
22
5' UTR ili sintetički 5' UTR. IVT koji kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može da sadrži na svom 5' terminusu region signalne sekvence koji kodira jednu ili više signalnih sekvenci. Bočni region može da sadrži region povezanih nukleotida koji sadrži jednu ili više potpunih ili nepotpunih 5' UTR sekvenci. Bočni region takođe može da sadrži 5' terminusnu kapu. Drugi bočni region može da sadrži region povezanih nukleotida koji sadrži jedan ili više potpunih ili nepotpunih 3' UTR koji mogu da kodiraju nativni 3' UTR IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida ili ne-nativni 3' UTR kao što je, ali bez ograničenja na, heterologni 3' UTR ili sintetički 3' UTR. Bočni region takođe može da sadrži 3' repnu sekvencu. 3' repna sekvenca može biti, ali nije ograničena na, poliA rep, poliA-G kvartet i/ili sekvencu ukosnice.
[0600] Premošćenje 5' terminusa prvog regiona i prvog bočnog regiona je prvi operativni region. Tradicionalno, ovaj operativni region sadrži Start kodon. Operativni region može alternativno da sadrži bilo koju sekvencu ili signal inicijacije translacije uključujući Start kodon.
[0601] Premošćenje 3' terminusa prvog regiona i drugog bočnog regiona je drugi operativni region. Tradicionalno ovaj operativni region sadrži Stop kodon. Operativni region može alternativno da sadrži bilo koju sekvencu ili signal inicijacije translacije uključujući Stop kodon. Višestruki serijski stop kodoni se takođe mogu upotrebljavati u IVT polinukleotidu. U nekim aspektima, operativni region iz predmetne objave može da sadrži dva stop kodona. Prvi stop kodon može biti "TGA" ili "UGA" i drugi stop kodon može biti odabran iz grupe koja se sastoji od "TAA", "TGA", "TAG", "UAA", "UGA" ili "UAG".
[0602] Primarni konstrukt IVT polinukleotida sadrži prvi region povezanih nukleotida koji je omeđen prvim bočnim regionom i drugim bočnim regionom. Kao što se ovde upotrebljava, "prvi region" se može označavati kao "kodirajući region" ili "region koji kodira" ili jednostavno "prvi region". Ovaj prvi region može uključivati, ali nije ograničen na, kodirani polipeptid od interesa. U jednom aspektu, prvi region može uključivati, ali nije ograničen na, otvoreni okvir čitanja koji kodira najmanje jedan polipeptid od interesa. Otvoreni okvir čitanja može biti kodon optimizovan u celini ili delimično. Bočni region može da sadrži region povezanih nukleotida koji sadrži jednu ili više potpunih ili nepotpunih 5' UTR sekvenci koje mogu biti u potpunosti kodon optimizovane ili delimično kodon optimizovane. Bočni region može uključivati najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline uključujući, ali bez ograničenja na, miR sekvence, TERZAK<™>sekvence i sekvence kontrole translacije. Bočni region takođe može da sadrži 5' terminusnu kapu 138. 5' terminusni region kape može uključivati kapu koja se javlja u prirodi, sintetičku kapu ili optimizovanu kapu. Drugi bočni
22
region može da sadrži region povezanih nukleotida koji sadrži jedan ili više potpunih ili nepotpunih 3' UTR. Drugi bočni region može biti u potpunosti kodon optimizovan ili delimično kodon optimizovan. Bočni region može uključivati najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline uključujući, ali ne ograničavajući se na, miR sekvence i sekvence kontrole translacije. Posle drugog bočnog regiona, primarni konstrukt polinukleotida može da sadrži 3' repnu sekvencu. 3' repna sekvenca može uključivati sintetički repni region i/ili nukleozid koji završava lanac. Neograničavajući primeri sintetičkog repnog regiona uključuju poliA sekvencu, poliC sekvencu, poliA-G kvartet. Neograničavajući primeri nukleozida koji završavaju lanac uključuju 2'-O metil, F i zaključane nukleinske kiseline (LNA).
[0603] Premošćenje 5' terminusa prvog regiona i prvog bočnog regiona je prvi operativni region. Tradicionalno, ovaj operativni region sadrži Start kodon. Operativni region može alternativno da sadrži bilo koju sekvencu ili signal inicijacije translacije uključujući Start kodon.
[0604] Premošćenje 3' terminusa prvog regiona i drugog bočnog regiona je drugi operativni region. Tradicionalno ovaj operativni region sadrži Stop kodon. Operativni region može alternativno da sadrži bilo koju sekvencu ili signal inicijacije translacije uključujući Stop kodon. U skladu sa predmetnom objavom, višestruki serijski stop kodoni se takođe mogu upotrebljavati.
[0605] U nekim aspektima, prvi i drugi bočni region IVT polinukleotida mogu biti dužine u opsegu nezavisno od 15-1.000 nukleotida (npr. veći od 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5,500 nukleotida ili najmanje 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500 nukleotida).
[0606] U nekim aspektima, repna sekvenca IVT polinukleotida može biti dužine u opsegu od odsutne do 500 nukleotida (npr. najmanje 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ili 500 nukleotida). Tamo gde je repni region poliA rep, dužina se može odrediti u jedinicama ili kao funkcija vezivanja poliA vezujućeg proteina. U ovom aspektu, poliA rep je dovoljno dugačak da vezuje najmanje 4 monomera poliA vezujućeg proteina. Monomeri poliA vezujućeg proteina vezuju se za nizove od približno 38 nukleotida. Kao takvi, uočeno je da su poliA repovi od oko 80 nukleotida i 160 nukleotida funkcionalni.
[0607] U nekim aspektima, region kape IVT polinukleotida može da sadrži jednu kapu ili seriju nukleotida koji formiraju kapu. U ovom aspektu, region kape može biti dužine od 1 do
2
10, npr. 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, ili najmanje 2, ili 10 ili manje nukleotida. U nekim aspektima, kapa je odsutna.
[0608] U nekim aspektima, prvi i drugi operativni region IVT polinukleotida mogu biti dužine u opsegu od 3 do 40, npr. 5-30, 10-20, 15, ili najmanje 4, ili 30 ili manje nukleotida i mogu sadržati, pored Start i/ili Stop kodona, jednu ili više signalnih i/ili restrikcionih sekvenci.
[0609] U nekim aspektima, IVT polinukleotidi mogu biti strukturno modifikovani ili hemijski modifikovani. Kada su IVT polinukleotidi hemijski i/ili strukturno modifikovani, polinukleotidi se mogu označiti kao "modifikovani IVT polinukleotidi".
[0610] U nekim aspektima, ukoliko su IVT polinukleotidi hemijski modifikovani, oni mogu imati uniformnu hemijsku modifikaciju svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ili populacije modifikacija proizvedenih pukom titracijom naniže iste početne modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida, ili izmereni procenat hemijske modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ali sa nasumičnom inkorporacijom, kao što je tamo gde su svi uridini zamenjeni analogom uridina, npr. pseudouridinom ili 5-metoksiuridinom. U sledećem aspektu, IVT polinukleotidi mogu imati uniformnu hemijsku modifikaciju dva, tri, ili četiri ista tipa nukleozida duž celog polinukleotida (kao što su svi uridini i svi citozini, itd. modifikovani na isti način).
[0611] U nekim aspektima, IVT polinukleotidi mogu uključivati sekvencu koja kodira samoisecajući peptid, koji je ovde opisan, kao što je, ali bez ograničenja na 2A peptid. Polinukleotidna sekvenca 2A peptida u IVT polinukleotidu može biti modifikovana ili kodon optimizovana pomoću postupaka koji su ovde opisani i/ili su poznati u struci. U nekim aspektima, ova sekvenca se može upotrebljavati za odvajanje kodirajućeg regiona dva ili više polipeptida od interesa u IVT polinukleotidu.
Arhitektura himernog polinukleotida
[0612] U nekim aspektima, polinukleotid iz predmetne objave je himerni polinukleotid. Himerni polinukleotidi ili RNK konstrukti koji su ovde objavljeni održavaju modularnu organizaciju sličnu IVT polinukleotidima, ali himerni polinukleotidi sadrže jednu ili više strukturnih i/ili hemijskih modifikacija ili izmena koje daju korisna svojstva polinukleotidu. Kao takvi, himerni polinukleotidi koji su modifikovani iRNK molekuli iz predmetne objave nazivaju se "himerna modifikovana iRNK" ili "himerna iRNK".
2 1
[0613] Himerni polinukleotidi imaju delove ili regione koji se razlikuju po veličini i/ili obrascu hemijske modifikacije, poziciji hemijske modifikacije, procentu hemijske modifikacije ili populaciji hemijske modifikacije i kombinacijama prethodnog.
[0614] Primeri delova ili regiona, gde himerni polinukleotid funkcioniše kao iRNK i kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid, ali nisu ograničeni na, netranslatirane regione (UTR, kao što su 5' UTR ili 3' UTR), kodirajuće regione, regione kape, regione poliA repa, start regione, stop regione, regione signalne sekvence, i njihove kombinacije. Regioni ili delovi koji se spajaju ili leže između drugih regiona takođe mogu biti dizajnirani da imaju podregione.
[0615] U nekim aspektima, himerni polinukleotidi iz objave imaju strukturu koja sadrži Formulu X.
5' [An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L3 3' Formula X
pri čemu:
svaki od A i B nezavisno sadrži region povezanih nukleozida;
bilo A ili B ili i A i B kodiraju IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid koji je opisan ovde na drugom mestu;
C je opcioni region povezanih nukleozida;
najmanje jedan od regiona A, B, ili C je poziciono modifikovan, pri čemu navedeni poziciono modifikovani region sadrži najmanje dva hemijski modifikovana nukleozida jednog ili više istog tipa nukleozida adenozina, timidina, guanozina, citidina, ili uridina, i pri čemu su najmanje dve hemijske modifikacije nukleozida istog tipa različite hemijske modifikacije;
n, o i p su nezavisno ceo broj između 15-1000;
x i y su nezavisno 1-20;
z je 0-5;
L1 i L2 su nezavisno opcione linker funkcionalne grupe, navedene linker funkcionalne grupe su bilo zasnovane na nukleinskoj kiselini ili nisu zasnovane na nukleinskoj kiselini; i
L3 je opcioni konjugat ili opciona linker funkcionalna grupa, navedena linker funkcionalna grupa je bilo zasnovana na nukleinskoj kiselini ili nije zasnovana na nukleinskoj kiselini.
2 2
[0616] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida A sadrži sekvencu povezanih nukleozida koji mogu da funkcionišu kao 5' netranslatirani region (UTR). Sekvenca povezanih nukleozida može biti prirodni ili sintetički 5' UTR. Kao neograničavajući primer, himerni polinukleotid može da kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid, i sekvenca povezanih nukleozida A može da kodira nativni 5' UTR IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida ili neheterologni 5' UTR kao što je, ali bez ograničenja na sintetički UTR.
[0617] U sledećem aspektu, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida A je region kape. Region kape može biti lociran 5' od regiona povezanih nukleozida A koji funkcioniše kao 5'UTR. Region kape može da sadrži najmanje jednu kapu kao što su, ali bez ograničenja na, CapO, Cap1, ARCA, inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2 -amino-guanozin, LNA-guanozin, 2-azido-guanozin, Cap2 i Cap4.
[0618] U nekim aspektima, polinukleotid iz objave sadrži Cap15'UTR. U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži 5'UTR sekvencu, npr. Cap1, za kodiranje IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida koji je ovde objavljen povećava ekspresiju IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida u poređenju sa polinukleotidima koji kodiraju IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid koji sadrži različite 5'UTR (npr. CapO, ARCA, inozin, N1-metilguanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, 2-azido-guanozin, Cap2 ili Cap4). U nekim aspektima, polinukleotid sadrži Cap1 5'UTR, pri čemu polinukleotid kodira IL-23, IL-36-gama i/ili OX40L polipeptid. U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži Cap15'UTR, povećava ekspresiju IL-23, IL-36-gama i/ili OX40L polipeptida.
[0619] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida B sadrži najmanje jedan otvoreni okvir čitanja sekvence nukleinske kiseline koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid. Sekvenca nukleinske kiseline može da bude kodon optimizovana i/ili da sadrži najmanje jednu modifikaciju.
[0620] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida C sadrži sekvencu povezanih nukleozida koji mogu da funkcionišu kao 3' UTR. Sekvenca povezanih nukleozida može biti prirodni ili sintetički 3' UTR. Kao neograničavajući primer, himerni polinukleotid može da kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid, i sekvenca povezanih nukleozida C može da kodira nativni 3' UTR IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptida ili neheterologni 3' UTR kao što je, ali bez ograničenja na sintetički UTR.
[0621] U nekim aspektima, najmanje jedan od regiona povezanih nukleozida A sadrži sekvencu povezanih nukleozida koja funkcioniše kao 5' UTR i najmanje jedan od regiona
2
povezanih nukleozida C sadrži sekvencu povezanih nukleozida koja funkcioniše kao 3' UTR. U nekim aspektima, 5' UTR i 3' UTR mogu biti iz iste ili različite vrste. U sledećim aspektima, 5' UTR i 3' UTR mogu kodirati nativne netranslatirane regione od različitih proteina iz iste ili različitih vrsta.
[0622] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave mogu se klasifikovati kao hemimeri, gapmeri, vingmeri (wingmers), ili blokmeri.
[0623] Kao što se ovde upotrebljava, "hemimer" je himerni polinukleotid koji sadrži region ili deo koji sadrži polovinu jednog obrasca, procenat, poziciju ili populaciju hemijske(ih) modifikacije(a) i polovinu drugog obrasca, procenat, poziciju ili populaciju hemijske(ih) modifikacije(a). Himerni polinukleotidi iz predmetne objave takođe mogu da sadrže hemimerne podregione. U nekim aspektima, deo ili region je 50% jednog i 50% drugog.
[0624] U nekim aspektima, ceo himerni polinukleotid je 50% jednog i 50% drugog. Bilo koji region ili deo bilo kog himernog polinukleotida iz objave može biti hemimer. Tipovi hemimera uključuju hemimere obrasca, hemimere populacije ili hemimere pozicije. Po definiciji, hemimeri su 50:50 procenata hemimeri.
[0625] Kao što se ovde upotrebljava, "gapmer" je himerni polinukleotid koji ima najmanje tri dela ili regiona sa prazninom (gap) između delova ili regiona. "Praznina" može da sadrži region povezanih nukleozida ili jedan nukleozid koji se razlikuje od himerne prirode dva dela ili regiona koji ga omeđavaju. Dva dela ili regiona gapmera mogu biti isti ili međusobno različiti.
[0626] Kao što se ovde upotrebljava, "vingmer" je himerni polinukleotid koji ima najmanje tri dela ili regiona sa prazninom između delova ili regiona. Za razliku od gapmera, dva bočna dela ili regiona koji okružuju prazninu u vingmeru su ista po stepenu ili vrsti. Takva sličnost može biti u dužini broja jedinica različitih modifikacija ili u broju modifikacija. Krila (wings) vingmera mogu biti duža ili kraća od praznine. Delovi ili regioni krila mogu biti 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 95% duži ili kraći od regiona koji čini prazninu.
[0627] Kao što se ovde upotrebljava, "blokmer" je polinukleotid sa obrascem gde su delovi ili regioni ekvivalentne veličine ili broja i tipa modifikacija. Regioni ili podregioni u blokmeru mogu biti dužine 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 6162, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,
2 4
172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 ili 500, nukleozida.
[0628] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave koji imaju obrazac hemijske modifikacije označavaju se kao "himere obrasca". Himere obrasca se takođe mogu označavati kao blokmeri. Himere obrasca su oni polinukleotidi koji imaju obrazac modifikacija unutar, duž ili među regionima ili delovima.
[0629] Obrasci modifikacija unutar dela ili regiona su oni koji počinju i zaustavljaju se unutar definisanog regiona. Obrasci modifikacija duž dela ili regiona su oni obrasci koji počinju u jednom delu ili regionu i završavaju se u drugom susednom delu ili regionu. Obrasci modifikacija među delovima ili regionima su oni koji počinju i završavaju se u jednom delu ili regionu i ponavljaju se u drugom delu ili regionu, koji nije nužno u blizini prvog regiona ili dela.
[0630] Regioni ili podregioni himera obrasca ili blokmera mogu imati jednostavne naizmenične obrasce kao što je ABAB[AB]n gde svako "A" i svako "B" predstavljaju različite hemijske modifikacije (najmanje jednu za bazu, šećer ili linker okosnicu), različite tipove hemijskih modifikacija (npr. koje se javljaju u prirodi i koje se ne javljaju u prirodi), različite procente modifikacija ili različite populacije modifikacija. Obrazac se može ponoviti n broj puta gde je n=3-300. Dodatno, svaki A ili B može predstavljati od 1-2500 jedinica (npr. nukleozida) u obrascu. Obrasci takođe mogu biti naizmenični višekratnici kao što su AABBAABB[AABB]n (naizmenični dvostruki višekratni) ili AAABBBAAABBB[AAABBB]n (naizmenični trostruki višekratni) obrazac. Obrazac se može ponoviti n broj puta gde je n=3-300.
[0631] Različiti obrasci se takođe mogu mešati zajedno kako bi se formirao obrazac drugog reda. Na primer, jedan naizmenični obrazac se može kombinovati sa trostrukim naizmeničnim obrascem kako bi se formirao naizmenični obrazac drugog reda A'B'. Jedan primer bi bio [ABABAB][AAABBBAAABBB] [ABABAB][AAABBBAAABBB]
2
[ABABAB][AAABBBAAABBB], gde je [ABABAB] A', i [AAABBBAAABBB] je B'. Na sličan način, ovi obrasci se mogu ponoviti n broj puta, gde je n=3-300.
[0632] Obrasci mogu uključivati tri ili više različitih modifikacija kako bi se formirao obrazac ABCABC[ABC]n. Ovi trikomponentni obrasci mogu takođe biti višekratni, kao što je AABBCCAABBCC[AABBCC]n i mogu biti dizajnirani kao kombinacije sa drugim obrascima kao što je ABCABCAABBCCABCABCAABBCC, i mogu biti obrasci višeg reda.
[0633] Regioni ili podregioni modifikacija pozicije, procenta, i populacije ne moraju da odražavaju jednak doprinos svakog tipa modifikacije. Oni mogu formirati serije kao što su "1-2-3-4", "1-2-4-8", gde svaki ceo broj predstavlja broj jedinica određenog tipa modifikacije. Alternativno, oni mogu biti samo neparni, kao što je "1-3-3-1-3-1-5" ili samo parni "2-4-2-4-6-4-8" ili mešavina i neparnog i parnog broja jedinica kao što je "1-3-4-2-5-7-3-3-4".
[0634] Himere obrasca mogu da variraju u svojoj hemijskoj modifikaciji po stepenu (kao što su one prethodno opisane) ili po vrsti (npr. različite modifikacije).
[0635] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave koji imaju najmanje jedan region sa dve ili više različitih hemijskih modifikacija dva ili više nukleozidnih članova istog tipa nukleozida (A, C, G, T, ili U) označavaju se kao "poziciono modifikovane" himere. Poziciono modifikovane himere se ovde takođe označavaju kao himere "selektivnog postavljanja" ili "polinukleotidi selektivnog postavljanja". Kao što naziv implicira, selektivno postavljanje označava dizajn polinukleotida koji, za razliku od polinukleotida u struci gde je modifikacija bilo kog A, C, G, T, ili U ista na osnovu postupka sinteze, može imati različite modifikacije za pojedine A, C, G, T, ili U u polinukleotidu ili njegovom regionu. Na primer, u poziciono modifikovanom himernom polinukleotidu, mogu postojati dve ili više različitih hemijskih modifikacija bilo kog tipa nukleozida A, C, G, T, ili U. Takođe mogu postojati kombinacije dva ili više sa bilo koja dva ili više istog tipa nukleozida. Na primer, poziciono modifikovan ili himerni polinukleotid selektivnog postavljanja može da sadrži 3 različite modifikacije populacije adenina u molekulu i takođe ima 3 različite modifikacije populacije citozina u konstruktu - od kojih sve mogu imati jedinstveno, nenasumično, postavljanje.
[0636] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave koji imaju procenat hemijske modifikacije označavaju se kao "procentualne himere". Procentualne himere mogu imati regione ili delove koji sadrže najmanje 1%, najmanje 2%, najmanje 5%, najmanje 8%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% modifikacija pozicije, obrasca, ili populacije. Alternativno, procentualna
2
himera može biti potpuno modifikovana u pogledu modifikacije pozicije, obrasca, ili populacije. Procenat modifikacije procentualne himere može se podeliti između modifikacija koje se javljaju u prirodi i koje se ne javljaju u prirodi.
[0637] Himerni polinukleotidi, uključujući njihove delove ili regione, iz predmetne objave koji imaju populaciju hemijske modifikacije, označavaju se kao "populacione himere". Populaciona himera može da sadrži region ili deo gde nukleozidi (njihova baza, šećer ili veza okosnice, ili njihova kombinacija) imaju odabranu populaciju modifikacija. Takve modifikacije se mogu odabrati od funkcionalnih populacija kao što su modifikacije koje indukuju, izmenjuju ili modulišu fenotipski ishod. Na primer, funkcionalna populacija može biti populacija ili odabir hemijskih modifikacija koje povećavaju nivo citokina. Druge funkcionalne populacije mogu pojedinačno ili zajedno da funkcionišu da smanje nivo jednog ili više citokina. Upotreba odabira ovih modifikacija sličnih funkcija u himernom polinukleotidu bi prema tome predstavljala "funkcionalnu populacionu himeru". Kao što se ovde upotrebljava, "funkcionalna populaciona himera" može biti ona čije je jedinstveno funkcionalno svojstvo definisano populacijom modifikacija kao što je prethodno opisano ili se termin može primeniti na celokupnu funkciju samog himernog polinukleotida. Na primer, kao celina, himerni polinukleotid može da funkcioniše na drugačiji ili superiorniji način u poređenju sa nemodifikovanim ili nehimernim polinukleotidom.
[0638] Treba zapaziti da polinukleotidi koji imaju uniformnu hemijsku modifikaciju svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ili populaciju modifikacija proizvedenih pukom titracijom naniže iste početne modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida, ili izmereni procenat hemijske modifikacije svih ili bilo kog istog tipa nukleozida ali sa nasumičnom inkorporacijom, kao što je slučaj tamo gde su svi uridini zamenjeni analogom uridina, npr. pseudouridinom ili 5-metoksiuridinom, ne smatraju se himernim polinukleotidima. Slično, polinukleotidi koji imaju uniformnu hemijsku modifikaciju dva, tri, ili četiri ista tipa nukleozida duž celog polinukleotida (kao što su svi uridini i svi citozini, itd. modifikovani na isti način) ne smatraju se himernim polinukleotidima. Jedan primer polinukleotida koji nije himeran je kanonski pseudouridin/5-metil citozin modifikovani polinukleotid. Do ovih uniformnih polinukleotida dolazi se u potpunosti putem in vitro transkripcije (IVT) enzimske sinteze; i usled ograničenja sintetišućih enzima, oni sadrže samo jednu vrstu modifikacije pri pojavi svakog nukleozida istog tipa, tj. adenozina (A), timidina (T), guanozina (G), citidina (C) ili uridina (U), koji se nalaze u polinukleotidu. Takvi polinukleotidi se mogu okarakterisati kao IVT polinukleotidi.
2
[0639] Himerni polinukleotidi iz predmetne objave mogu biti strukturno modifikovani ili hemijski modifikovani. Kada su himerni polinukleotidi iz predmetne objave hemijski i/ili strukturno modifikovani, polinukleotidi se mogu označiti kao "modifikovani himerni polinukleotidi".
[0640] Regioni ili delovi himernih polinukleotida mogu biti razdvojeni linker ili spejser funkcionalnom grupom. Takvi linkeri ili spejseri mogu biti zasnovani na nukleinskoj kiselini ili ne-nukleozidni.
[0641] U nekim aspektima, himerni polinukleotidi mogu uključivati sekvencu koja kodira samoisecajući peptid koji je ovde opisan, kao što je, ali ne ograničavajući se na 2A peptid. Polinukleotidna sekvenca 2A peptida u himernom polinukleotidu može biti modifikovana ili kodon optimizovana pomoću postupaka koji su ovde opisani i/ili su poznati u struci.
[0642] Bez obzira na prethodno navedeno, himerni polinukleotidi iz predmetne objave mogu sadržati region ili deo koji nije poziciono modifikovan ili nije himeran kao što je ovde definisano. Na primer, region ili deo himernog polinukleotida može biti uniformno modifikovan na jednom ili više A, T, C, G, ili U, ali polinukleotidi neće biti uniformno modifikovani duž celog regiona ili dela.
[0643] Himerni polinukleotidi iz predmetne objave mogu biti potpuno poziciono modifikovani ili delimično poziciono modifikovani. Takođe mogu imati podregione koji mogu biti bilo kog obrasca ili dizajna.
[0644] U nekim aspektima, regioni ili podregioni polinukleotida mogu biti dužine u opsegu od odsutnog do 500 nukleotida (npr. najmanje 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ili 500 nukleotida). Tamo gde je region poliA rep, dužina se može odrediti u jedinicama ili kao funkcija vezivanja poliA vezujućeg proteina. U ovom aspektu, poliA rep je dovoljno dugačak da vezuje najmanje 4 monomera poliA vezujućeg proteina. Monomeri poliA vezujućeg proteina vezuju se za nizove od približno 38 nukleotida. Kao takvi, uočeno je da su poliA repovi od oko 80 nukleotida do oko 160 nukleotida funkcionalni. Himerni polinukleotidi iz predmetne objave koji funkcionišu kao iRNK ne moraju da sadrže poliA rep.
[0645] U skladu sa predmetnom objavom, himerni polinukleotidi koji funkcionišu kao iRNK mogu imati region kape. Region kape može da sadrži jednu kapu ili seriju nukleotida koji formiraju kapu. U ovom aspektu, region kape može biti dužine od 1 do 10, npr.2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, ili najmanje 2, ili 10 ili manje nukleotida. U nekim aspektima, kapa je odsutna.
[0646] Predmetna objava razmatra himerne polinukleotide koji su cirkularni ili ciklični. Kao što naziv implicira, cirkularni polinukleotidi su cirkularne prirode, što znači da su krajevi
2
spojeni na neki način, bilo ligacijom, kovalentnom vezom, zajedničkom asocijacijom sa istim proteinom ili drugim molekulom ili kompleksom ili hibridizacijom.
[0647] Himerni polinukleotidi, formulacije i kompozicije koje sadrže himerne polinukleotide, i postupci pravljenja, upotrebe i primene himernih polinukleotida su takođe opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/53907.
[0648] U nekim aspektima, himerni polinukleotid kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid. U nekim aspektima, himerni polinukleotidi iz objave sadrže bilo koju od sekvenci nukleinske kiseline IL-23 i/ili IL-36-gama, IL-18 koje su navedene u TABELI 1 i/ili sekvenci nukleinske kiseline OX40L koje su navedene u TABELI 1A. U nekim aspektima himerni polinukleotid iz objave kodira bilo koji od IL-23 i/ili IL-36-gama, IL-18 koji su navedeni u TABELI 1 i/ili OX40L polipeptida koji su navedeni u TABELI 1A.
Cirkularni polinukleotidi
[0649] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid može biti cirkularni ili ciklični. Kao što se ovde upotrebljava, "cirkularni polinukleotidi" ili "circP" znači jednolančani cirkularni polinukleotid koji deluje u suštini kao RNK i ima svojstva RNK. Termin "cirkularni" takođe je namenjen da obuhvati bilo koju sekundarnu ili tercijarnu konfiguraciju circP. Cirkularni polinukleotidi su cirkularne prirode što znači da su krajevi spojeni na neki način, bilo ligacijom, kovalentnom vezom, zajedničkom asocijacijom sa istim proteinom ili drugim molekulom ili kompleksom ili hibridizacijom.
[0650] Cirkularni polinukleotidi, formulacije i kompozicije koje sadrže cirkularne polinukleotide, i postupci pravljenja, upotrebe i primene cirkularnih polinukleotida su takođe objavljeni u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/53904 (objavljeno kao WO2015034925, videti takođe, US 2016-0194368).
[0651] U nekim aspektima, cirkularni polinukleotid kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, ili OX40L polipeptid. U nekim aspektima, cirkularni polinukleotidi iz objave sadrže bilo koju od sekvenci nukleinske kiseline IL-23, IL-36-gama, IL-18 koje su navedene u TABELI 1, ili sekvenci nukleinske kiseline OX40L koje su navedene u TABELI 1A. U nekim aspektima, cirkularni polinukleotidi iz objave kodiraju bilo koji od IL-23 polipeptida, IL-36-gama, IL-18 polipeptida koji su navedeni u TABELI 1, ili OX40L polipeptida koji su navedeni u TABELI 1A. U nekim aspektima, cirkularni polinukleotid povećava ekspresiju IL-23 polipeptida, IL-36-gama polipeptida, IL-18 ili OX40L polipeptida.
2
Multimeri polinukleotida
[0652] U nekim aspektima, više različitih himernih polinukleotida i/ili IVT polinukleotida mogu biti povezani zajedno preko 3'-kraja upotrebom nukleotida koji su modifikovani na 3'-terminusu. Hemijska konjugacija se može upotrebljavati za kontrolu stehiometrije isporuke u ćelije. Ovo se može kontrolisati hemijskim povezivanjem himernih polinukleotida i/ili IVT polinukleotida upotrebom 3'-azido terminovanog nukleotida na jednoj vrsti polinukleotida i nukleotida koji sadrži C5-etinil ili alkinil na suprotnoj vrsti polinukleotida. Modifikovani nukleotid se dodaje posttranskripciono upotrebom terminusne transferaze (New England Biolabs, Ipswich, MA) u skladu sa protokolom proizvođača. Posle dodavanja 3'-modifikovanog nukleotida, dve vrste polinukleotida se mogu kombinovati u vodenom rastvoru, u prisustvu ili odsustvu bakra, kako bi se formirala nova kovalentna veza putem mehanizma klik hemije, kao što je opisano u literaturi.
[0653] U sledećem primeru, više od dva himerna polinukleotida i/ili IVT polinukleotida mogu biti povezana zajedno upotrebom funkcionalizovanog linker molekula. Na primer, funkcionalizovani molekul saharida može biti hemijski modifikovan tako da sadrži više hemijskih reaktivnih grupa (SH-, NH2-, N3, itd.) da reaguje sa srodnom funkcionalnom grupom na 3'-funkcionalizovanom iRNK molekulu (tj. 3'-maleimid estar, 3'-NHS-estar, alkinil). Broj reaktivnih grupa na modifikovanom saharidu može se kontrolisati na stehiometrijski način kako bi se direktno kontrolisao stehiometrijski odnos konjugovanih himernih polinukleotida i/ili IVT polinukleotida.
[0654] U nekim aspektima, himerni polinukleotidi i/ili IVT polinukleotidi mogu biti povezani zajedno u obrascu. Obrazac može biti jednostavan naizmenični obrazac kao što je CD[CD]x gde svaki "C" i svaki "D" predstavljaju himerni polinukleotid, IVT polinukleotid, različite himerne polinukleotide ili različite IVT polinukleotide. Obrazac se može ponoviti x broj puta, gde je x= 1-300. Obrasci takođe mogu biti naizmenični višekratnici kao što su CCDD[CCDD]x (naizmenični dvostruki višekratni) ili CCCDDD[CCCDDD]x (naizmenični trostruki višekratni) obrazac. Naizmenični dvostruki višekratnik ili naizmenični trostruki višekratnik mogu se ponoviti x broj puta, gde je x= 1-300.
Konjugati i kombinacije polinukleotida
24
[0655] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave može biti dizajniran da bude konjugovan za druge polinukleotide, boje, interkalacione agense (npr. akridini), umreživače (npr. psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, safirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze (npr. EDTA), alkilujuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioaktivno obeležene markere, enzime, haptene (npr. biotin), olakšivače transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze, proteine, npr. glikoproteine, ili peptide, npr. molekule koji imaju specifičan afinitet za koligand, ili antitela, npr. antitelo, koje se vezuje za specificirani tip ćelije kao što je ćelija kancera, endotelna ćelija, ili ćelija koštanog tkiva, hormone i hormonske receptore, nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, ili lek.
[0656] Konjugacija može rezultovati povećanom stabilnošću i/ili poluživotom i može biti posebno korisna u ciljnom delovanju polinukleotida na specifična mesta u ćeliji, tkivu ili organizmu.
[0657] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz objave može dodatno da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više heterolognih polipeptida. U jednom aspektu, jedan ili više heterolognih polipeptida poboljšava farmakokinetička svojstva ili farmakodinamička svojstva IL-23 polipeptida, IL-36-gama polipeptida, IL-18 polipeptida, ili OX40L polipeptida, ili polinukleotida (npr. najmanje jedna iRNK) koji kodiraju IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid. U sledećem aspektu, jedan ili više heterolognih polipeptida sadrže polipeptid koji može produžiti poluživot IL-23 polipeptida, IL-36-gama polipeptida, IL-18 polipeptida, ili OX40L polipeptida.
[0658] Polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave može dodatno da sadrži jedan ili više regiona ili delova koji deluju ili funkcionišu kao netranslatiran region. Po definiciji, netranslatirani regioni (UTR) divljeg tipa gena se transkribuju, ali se ne translatiraju. U iRNK, 5'UTR počinje na mestu početka transkripcije i nastavlja se do start kodona ali ne uključuje start kodon; dok 3'UTR počinje odmah nakon stop kodona i nastavlja se do signala za završetak transkripcije. Sve je više dokaza o regulatornim ulogama koje igraju UTR u smislu stabilnosti molekula nukleinske kiseline i translacije. Regulatorna svojstva UTR mogu biti inkorporisana u polinukleotide iz predmetne objave kako bi se, između ostalog, poboljšala stabilnost molekula. Specifična svojstva takođe mogu biti inkorporisana kako bi se osiguralo kontrolisano smanjenje ekspresije transkripta u slučaju da se pogrešno usmeri na neželjena mesta organa. TABELA 3 i TABELE 4A i 4B obezbeđuju listing primera UTR koji se mogu koristiti u polinukleotidima iz predmetne objave.
5' UTR i inicijacija translacije
[0659] U određenim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave dodatno sadrži 5' UTR i/ili sekvencu inicijacije translacije. Prirodni 5'UTR nose svojstva koja igraju uloge u inicijaciji translacije. Oni nose potpise kao što su Kozak sekvence za koje je opšte poznato da su uključene u postupak kojim ribozom inicira translaciju mnogih gena. Takođe je poznato da 5'UTR formira sekundarne strukture koje su uključene u vezivanje faktora elongacije.
[0660] Projektovanjem svojstava koja se tipično nalaze u obilno eksprimiranim genima specifičnih ciljnih organa, može se poboljšati stabilnost i proizvodnja proteina polinukleotida iz objave. Na primer, introdukovanje 5' UTR iRNK za koju se zna da je sa povećanom ekspresijom kod kancera, kao što je c-myc, može se upotrebljavati za poboljšanje ekspresije molekula nukleinske kiseline, kao što je polinukleotid, u ćelijama kancera. Netranslatirani regioni korisni u dizajnu i proizvodnji polinukleotida uključuju, ali nisu ograničeni, na one koji su objavljeni u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2014/164253 (videti takođe US20160022840).
[0661] Pokazan u TABELI 3 je listing 5'-netranslatiranog regiona iz objave. Mogu se koristiti varijante 5' UTR u kojima je jedan ili više nukleotida dodat ili uklonjen na terminusima, uključujući A, U, C ili G.
Tabela 3. 5ꞌ-netranslatirani regioni
24
[0662] Druge ne-UTR sekvence se takođe mogu upotrebljavati kao regioni ili podregioni unutar polinukleotida. Na primer, introni ili delovi sekvenci introna mogu biti inkorporisani u regione polinukleotida. Inkorporisanje intronskih sekvenci može povećati proizvodnju proteina kao i nivoe polinukleotida.
[0663] Kombinacije svojstava mogu biti uključene u bočne regione i mogu biti sadržane unutar drugih svojstava. Na primer, ORF može biti omeđen sa 5' UTR koji može sadržati jak Kozak signal inicijacije translacije i/ili 3' UTR koji može uključivati oligo(dT) sekvencu za dodavanje po templatu poli-A repa. 5'UTR može sadržati prvi polinukleotidni fragment i drugi polinukleotidni fragment iz istih i/ili različitih gena kao što su 5'UTR opisani u S.A.D. publikaciji patentne prijave br.2010-0293625.
[0664] Ovi UTR ili njihovi delovi mogu biti postavljeni u istoj orijentaciji kao u transkriptu iz kog su odabrani ili mogu biti izmenjeni u orijentaciji ili lokaciji. Dakle, 5' ili 3' UTR može biti invertovan, skraćen, produžen, napravljen sa jednim ili više drugih 5' UTR ili 3' UTR.
[0665] U nekim aspektima, UTR sekvence se mogu promeniti na neki način u odnosu na referentnu sekvencu. Na primer, 3' ili 5' UTR može biti izmenjen u odnosu na UTR divljeg tipa ili nativni UTR promenom orijentacije ili lokacije kao što je prethodno navedeno ili može biti izmenjen uključivanjem dodatnih nukleotida, delecijom nukleotida, zamenom ili transpozicijom nukleotida. Svaka od ovih promena koje proizvode "izmenjeni" UTR (bilo da je 3' ili 5') sadrži varijantu UTR.
[0666] U nekim aspektima, može se upotrebljavati dvostruki, trostruki ili četvorostruki UTR kao što je 5' ili 3' UTR. Kao što se ovde upotrebljava, "dvostruki" UTR je onaj u kome su dve kopije istog UTR kodirane ili u seriji ili suštinski u seriji. Na primer, dvostruki beta-globin 3' UTR se može upotrebljavati kao što je opisano u S.A.D. publikaciji patentne prijave br.2010-0129877.
[0667] U nekim aspektima, bočni regioni mogu biti heterologni. U nekim aspektima, 5' netranslatirani region može biti izveden iz različite vrste od 3' netranslatiranog regiona. Netranslatirani region takođe može uključivati elemente za poboljšanje translacije (TEE). Kao neograničavajući primer, TEE može uključivati one koji su opisani u S.A.D. publikaciji patentne prijave br.2009-0226470.
3' UTR i elementi bogati sa AU
[0668] U određenim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid dodatno sadrži 3' UTR.3'-UTR je deo iRNK koji odmah sledi kodon za terminaciju translacije i često sadrži regulatorne regione koji posttranskripciono utiču na ekspresiju gena. Regulatorni regioni unutar 3'-UTR mogu uticati na poliadenilaciju, efikasnost translacije, lokalizaciju, i stabilnost iRNK. U jednom aspektu, 3'-UTR koristan za objavu sadrži vezujuće mesto za regulatorne proteine ili microRNA. U nekim aspektima, 3'-UTR ima region prigušivača, koji se vezuje za represorske proteine i inhibira ekspresiju iRNK. U drugim aspektima, 3'-UTR sadrži element bogat sa AU. Proteini vezuju ARE kako bi uticali na stabilnost ili stopu raspada transkripata na lokalizovan način ili uticali na inicijaciju translacije. U drugim aspektima, 3'-UTR sadrži sekvencu AAUAAA koja usmerava dodavanje nekoliko stotina ostataka adenina zvanih poli(A) rep na kraj iRNK transkripta.
[0669] TABELA 4A pokazuje listing 3'-netranslatiranih regiona korisnih za iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, ili OX40L polipeptid. Mogu se koristiti varijante 3' UTR u kojima je jedan ili više nukleotida dodat ili uklonjen na terminusima, uključujući A, U, C ili G.
Tabela 4A. Primeri 3ꞌ-netranslatiranih regiona
24
24
24
24
24
2
21
22
[0670] U određenim aspektima, 3' UTR sekvenca korisna za objavu sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko
2
90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% identična sekvenci koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 45-62 i bilo koje njihove kombinacije. U posebnom aspektu, 3' UTR sekvenca dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto, npr. miR-122 vezujuće mesto. U drugim aspektima, 3'UTR sekvenca korisna za objavu sadrži 3' UTR-018 (SEQ ID NO: 62).
[0671] U određenim aspektima, 3' UTR sekvenca sadrži jedno ili više miRNA vezujućih mesta, npr. miR-122 vezujuća mesta, ili bilo koje druge heterologne nukleotidne sekvence u njoj, bez ometanja funkcije 3' UTR. Neki primeri 3' UTR sekvenci koje sadrže miRNA vezujuće mesto su navedeni u TABELI 4B.
Tabela 4B. Primeri 3ꞌ UTR sa miRNA vezujućim mestima
[0672] U određenim aspektima, 3' UTR sekvenca korisna za objavu sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% identična sekvenci koja je izneta kao SEQ ID NO: 63 ili 64.
Regioni koji imaju 5ꞌ kapu
2 4
[0673] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave može dodatno da sadrži 5' kapu.
5' kapa korisna za iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama i IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid može da veže iRNK kapa-vezujući protein (CBP), čime se povećava stabilnost iRNK. Kapa može dodatno pomoći uklanjanju 5' proksimalnih introna tokom iRNK splajsovanja.
[0674] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave sadrži nehidrolizujuću strukturu kape koja sprečava uklanjanje kape i stoga povećava poluživot iRNK. Pošto hidroliza strukture kape zahteva isecanje 5'-ppp-5' fosforodiestarskih veza, modifikovani nukleotidi se mogu upotrebljavati tokom reakcije dodavanja kape. Na primer, enzim za dodavanje kape virusa vakcinije iz New England Biolabs (Ipswich, MA) može se upotrebljavati sa α-tio-guanozin nukleotidima u skladu sa uputstvima proizvođača kako bi se kreirala fosforotioatna veza u 5'-ppp-5' kapi. Mogu se upotrebljavati dodatni modifikovani guanozin nukleotidi kao što su α-metil-fosfonat i seleno-fosfat nukleotidi.
[0675] U određenim aspektima, 5' kapa sadrži 2'-O-metilaciju šećera riboze 5'-terminusnih i/ili 5'-anteterminusnih nukleotida na 2'-hidroksilnoj grupi prstena šećera. U drugim aspektima, kape za iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, ili OX40L polipeptid uključuju analoge kape, koji se ovde takođe označavaju kao sintetički analozi kape, hemijske kape, hemijski analozi kape, ili strukturni ili funkcionalni analozi kape, razlikuju se od prirodnih (tj. endogenih, divljeg tipa ili fizioloških) 5'-kapa po svojoj hemijskoj strukturi, zadržavajući funkciju kape. Analozi kape mogu biti hemijski (tj. neenzimski) ili enzimski sintetisani i/ili povezani za polinukleotide iz objave.
[0676] Na primer, anti-reverzni analog kape (ARCA) kapa sadrži dva guanina povezana 5'-5'-trifosfatnom grupom, pri čemu jedan guanin sadrži N7 metil grupu kao i 3'-O-metil grupu (tj. N7,3'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin (m<7>G-3'mppp-G; koji se ekvivalentno može označiti 3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G). 3'-O atom drugog, nemodifikovanog, guanina postaje povezan za 5'-terminusni nukleotid kapovanog polinukleotida. N7- i 3'-O-metilovani guanin obezbeđuje terminusnu funkcionalnu grupu kapovanog polinukleotida.
[0677] Sledeći primer kape je mCAP, koja je slična ARCA, ali ima 2'-O-metil grupu na guanozinu (tj. N7,2'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin, m<7>Gm-ppp-G).
[0678] U nekim aspektima, kapa je dinukleotidni analog kape. Kao neograničavajući primer, dinukleotidni analog kape može se modifikovati na različitim fosfatnim pozicijama sa
2
boranofosfatnom grupom ili foforoselenoatnom grupom kao što su dinukleotidni analozi kape koji su opisani u S.A.D. patentu br.8,519,110.
[0679] U sledećem aspektu, kapa je analog kape je N7-(4-hlorofenoksietil) supstituisani dinukleotidni oblik analoga kape koji je poznat u struci i/ili je ovde opisan. Neograničavajući primeri N7-(4-hlorofenoksietil) supstituisanog dinukleotidnog oblika analoga kape uključuju N7-(4-hlorofenoksietil)-G(5')ppp(5')G i N7-(4-hlorofenoksietil)-m<3'-O>G(5')ppp(5')G analog kape. Videti, npr. različite analoge kape i postupke sinteze analoga kape koji su opisani u Kore et al. (2013) Bioorganic & Medicinal Chemistry 21:4570-4574. U sledećem aspektu, analog kape iz predmetne objave je 4-hloro/bromofenoksietil analog.
[0680] Dok analozi kape dozvoljavaju istovremeno dodavanje kape polinukleotidu ili njegovom regionu, u in vitro reakciji transkripcije, do 20% transkripata može ostati bez kape. Ovo, kao i strukturne razlike analoga kape od endogenih struktura 5'-kape nukleinskih kiselina koje proizvodi endogena, ćelijska transkripciona mašinerija, može dovesti do redukovane translacione kompetentnosti i redukovane ćelijske stabilnosti.
[0681] iRNK iz predmetne objave koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid takođe se može dodati kapa nakon proizvodnje (bilo da je to IVT ili hemijska sinteza), upotrebom enzima, kako bi se generisale autentičnije strukture 5'-kape. Kao što se ovde upotrebljava, fraza "autentičnije" označava svojstvo koje blisko odražava ili oponaša, bilo strukturno ili funkcionalno, endogeno ili svojstvo divljeg tipa. To jest, "autentičnije" svojstvo je bolji predstavnik endogene, divljeg tipa, prirodne ili fiziološke ćelijske funkcije i/ili strukture u poređenju sa sintetičkim svojstvima ili analozima, itd. iz stanja tehnike, ili koje nadmašuje odgovarajuće endogeno, divljeg tipa, prirodno ili fiziološko svojstvo u jednom ili više aspekata.
[0682] Neograničavajući primeri autentičnijih struktura 5' kape iz predmetne objave su oni koji, između ostalog, imaju poboljšano vezivanje kapa-vezujućeg proteina, produženi poluživot, redukovanu podložnost na 5' endonukleaze i/ili redukovano uklanjanje 5' kape, u poređenju sa sintetičkim strukturama 5' kape koje su poznate u struci (ili sa divljim tipom, prirodnom ili fiziološkom strukturom 5' kape). Na primer, rekombinantni enzim za dodavanje kape virusa vakcinije i rekombinantni enzim 2'-O-metiltransferaza mogu da kreiraju kanonsku 5'-5'-trifosfatnu vezu između 5'-terminusnog nukleotida polinukleotida i guanin kapa nukleotida pri čemu guanin kapa sadrži N7 metilaciju i 5'-terminusni nukleotid iRNK sadrži 2'-O-metil. Takva struktura se naziva struktura Cap1. Ova kapa rezultuje višom translacionom kompetentnošću i ćelijskom stabilnošću i redukovanom aktivacijom ćelijskih proinflamatornih citokina, u poređenju, npr. sa drugim strukturama analoga 5' kape koje su
2
poznateu struci. Strukture kape uključuju, ali nisu ograničene na, 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (cap 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (cap 1), i 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (cap 2).
[0683] U skladu sa predmetnom objavom, 5' terminusne kape mogu uključivati endogene kape ili analoge kape. U skladu sa predmetnom objavom, 5' terminusna kapa može sadržati analog guanina. Korisni analozi guanina uključuju, ali nisu ograničeni na, inozin, N1-metilguanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, i 2-azido-guanozin.
Poli-A repovi
[0684] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave dodatno sadrži poli A rep. U dodatnim aspektima, terminusne grupe na poli-A repu mogu biti inkorporisane za stabilizaciju. U drugim aspektima, poli-A rep sadrži des-3' hidroksil repove. Korisni poli-A repovi mogu takođe uključivati strukturne funkcionalne delove ili 2'-Ometil modifikacije kao što podučavaju Li et al. (2005) Current Biology 15:1501-1507.
[0685] U jednom aspektu, dužina poli-A repa, kada je prisutan, je veća od 30 nukleotida. U sledećem aspektu, poli-A rep je dužine veće od 35 nukleotida (npr. najmanje ili veće od oko 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, i 3.000 nukleotida).
[0686] U nekim aspektima, polinukleotid ili njegov region uključuje od oko 30 do oko 3.000 nukleotida (npr. od 30 do 50, od 30 do 100, od 30 do 250, od 30 do 500, od 30 do 750, od 30 do 1.000, od 30 do 1.500, od 30 do 2.000, od 30 do 2.500, od 50 do 100, od 50 do 250, od 50 do 500, od 50 do 750, od 50 do 1.000, od 50 do 1.500, od 50 do 2.000, od 50 do 2.500, od 50 do 3.000, od 100 do 500, od 100 do 750, od 100 do 1.000, od 100 do 1.500, od 100 do 2.000, od 100 do 2.500, od 100 do 3.000, od 500 do 750, od 500 do 1.000, od 500 do 1.500, od 500 do 2.000, od 500 do 2.500, od 500 do 3.000, od 1.000 do 1.500, od 1.000 do 2.000, od 1.000 do 2.500, od 1.000 do 3.000, od 1.500 do 2.000, od 1.500 do 2.500, od 1.500 do 3.000, od 2.000 do 3.000, od 2.000 do 2.500, i od 2.500 do 3.000).
[0687] U nekim aspektima, poli-A rep je dizajniran u odnosu na dužinu sveukupnog polinukleotida ili dužinu određenog regiona polinukleotida. Ovaj dizajn može biti zasnovan na dužini kodirajućeg regiona, dužini određenog svojstva ili regiona ili na osnovu dužine krajnjeg proizvoda eksprimiranog iz polinukleotida.
2
[0688] U ovom kontekstu, poli-A rep može biti 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% duži od polinukleotida ili njegovog svojstva. Poli-A rep se takođe može dizajnirati kao frakcija polinukleotida kojima pripada. U ovom kontekstu, poli-A rep može biti 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ili 90% ili više od ukupne dužine konstrukta, regiona konstrukta ili ukupne dužine konstrukta minus poli-A rep. Dodatno, projektovana vezujuća mesta i konjugacija polinukleotida za poli-A vezujući protein mogu poboljšati ekspresiju.
[0689] Pored toga, više različitih polinukleotida može se povezati zajedno putem PABP (poli-A vezujući protein) preko 3'-kraja upotrebom modifikovanih nukleotida na 3'-terminusu poli-A repa. Eksperimenti transfekcije se mogu sprovesti u relevantnim ćelijskim linijama i proizvodnja proteina se može testirati pomoću ELISA testa na 12 h, 24 h, 48 h, 72 h i dan 7 nakon transfekcije.
[0690] U nekim aspektima, polinukleotidi iz predmetne objave su dizajnirani da uključuju region poliA-G kvarteta. G-kvartet je ciklični niz od četiri nukleotida guanina povezana vodoničnim vezama koji se mogu formirati pomoću sekvenci bogatih sa G u DNK i RNK. U ovom aspektu, G-kvartet je inkorporisan na kraju poli-A repa. Rezultujući polinukleotid se testira na stabilnost, proizvodnju proteina i druge parametre uključujući poluživot u različitim vremenskim tačkama. Otkriveno je da poliA-G kvartet rezultuje proizvodnjom proteina iz iRNK ekvivalentnom najmanje sa 75% one koja se vidi upotrebom samo poli-A repa od 120 nukleotida.
Region start kodona
[0691] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave dodatno sadrži regione koji su analogni sa ili funkcionišu kao region start kodona.
[0692] U nekim aspektima, translacija polinukleotida se inicira na kodonu koji nije start kodon AUG. Translacija polinukleotida može da se inicira na alternativnom start kodonu kao što je, ali ne ograničavajući se na, ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG. Videti, Touriol et al. (2003) Biology of the Cell 95:169-178 i Matsuda i Mauro (2010) PLoS ONE 5:11. Kao neograničavajući primer, translacija polinukleotida počinje na alternativnom start kodonu ACG. Kao još jedan neograničavajući primer, translacija polinukleotida počinje na alternativnom start kodonu CTG ili CUG. Kao još jedan neograničavajući primer, translacija polinukleotida počinje na alternativnom start kodonu GTG ili GUG.
2
[0693] Poznato je da nukleotidi koji omeđavaju kodon koji inicira translaciju, kao što je, ali ne ograničavajući se na, start kodon ili alternativni start kodon, utiču na efikasnost translacije, dužinu i/ili strukturu polinukleotida. Videti, npr. Matsuda i Mauro (2010) PLoS ONE 5:11. Maskiranje bilo kog od nukleotida koji omeđavaju kodon koji inicira translaciju može se upotrebljavati za izmenu pozicije inicijacije translacije, efikasnosti translacije, dužine i/ili strukture polinukleotida.
[0694] U nekim aspektima, maskirajući agens se upotrebljava u blizini start kodona ili alternativnog start kodona kako bi se maskirao ili sakrio kodon kako bi se redukovala verovatnoća inicijacije translacije na maskiranom start kodonu ili alternativnom start kodonu. Neograničavajući primeri maskirajućih agenasa uključuju polinukleotide antisens zaključanih nukleinskih kiselina (LNA) i komplekse egzon-spojnica (EJC). Videti, npr. Matsuda i Mauro (2010) PLoS ONE 5:11, koji opisuju maskirajuće agense LNA polinukleotide i EJC.
[0695] U sledećem aspektu, maskirajući agens se upotrebljava za maskiranje start kodona polinukleotida kako bi se povećala verovatnoća da će se translacija inicirati na alternativnom start kodonu. U nekim aspektima, maskirajući agens se upotrebljava za maskiranje prvog start kodona ili alternativnog start kodona kako bi se povećala šansa da će se translacija inicirati na start kodonu ili alternativnom start kodonu nizvodno od maskiranog start kodona ili alternativnog start kodona.
[0696] U nekim aspektima, start kodon ili alternativni start kodon je lociran unutar savršenog komplementa za miR vezujuće mesto. Savršeni komplement miR vezujućeg mesta može pomoći u kontroli translacije, dužine i/ili strukture polinukleotida slično maskirajućem agensu. Kao neograničavajući primer, start kodon ili alternativni start kodon je lociran u sredini savršenog komplementa za miR-122 vezujuće mesto. Start kodon ili alternativni start kodon može se locirati posle prvog nukleotida, drugog nukleotida, trećeg nukleotida, četvrtog nukleotida, petog nukleotida, šestog nukleotida, sedmog nukleotida, osmog nukleotida, devetog nukleotida, desetog nukleotida, jedanaestog nukleotideta, dvanaestog nukleotida, trinaestog nukleotida, četrnaestog nukleotida, petnaestog nukleotida, šesnaestog nukleotida, sedamnaestog nukleotida, osamnaestog nukleotida, devetnaestog nukleotida, dvadesetog nukleotida ili dvadeset prvog nukleotida.
[0697] U sledećem aspektu, start kodon polinukleotida se uklanja iz polinukleotidne sekvence kako bi translacija polinukleotida počela na kodonu koji nije start kodon. Translacija polinukleotida može početi na kodonu koji sledi uklonjeni start kodon ili na nizvodnom start kodonu ili alternativnom start kodonu. U neograničavajućem primeru, start kodon ATG ili AUG se uklanja kao prva 3 nukleotida polinukleotidne sekvence kako bi se translacija
2
inicirala na nizvodnom start kodonu ili alternativnom start kodonu. Polinukleotidna sekvenca u kojoj je uklonjen start kodon može dodatno da sadrži najmanje jedan maskirajući agens za nizvodni start kodon i/ili alternativne start kodone kako bi kontrolisao ili pokušao da kontroliše inicijaciju translacije, dužinu polinukleotida i/ili strukturu polinukleotida.
Region stop kodona
[0698] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid iz predmetne objave može dodatno da sadrži najmanje jedan stop kodon ili najmanje dva stop kodona pre 3' netranslatiranog regiona (UTR). Stop kodon se može odabrati od UGA, UAA, i UAG. U nekim aspektima, polinukleotidi iz predmetne objave uključuju stop kodon UGA i jedan dopunski stop kodon. U dodatnom aspektu, dopunski stop kodon može biti UAA. U sledećem aspektu, polinukleotidi iz predmetne objave uključuju tri stop kodona, četiri stop kodona, ili više.
X. Postupci pravljenja polinukleotida
[0699] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupke za pravljenje polinukleotida koji je ovde objavljen ili njegovog komplementa. U nekim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, i koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, ili OX40L polipeptid može biti konstruisan upotrebom in vitro transkripcije.
[0700] U drugim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, i koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid može biti konstruisan hemijskom sintezom upotrebom oligonukleotidnog sintesajzera. U drugim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, i koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid se pravi upotrebom ćelije domaćina. U određenim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji je ovde objavljen, i koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid se pravi pomoću jedne ili više kombinacija IVT, hemijske sinteze, ekspresije ćelije domaćina, ili bilo kojih drugih postupka koji su poznati u struci.
[0701] Nukleozidi koji se javljaju u prirodi, nukleozidi koji se ne javljaju u prirodi, ili njihove kombinacije, mogu potpuno ili delimično prirodno zameniti javljajuće nukleozide prisutne u kandidat nukleotidnoj sekvenci i mogu biti inkorporisani u nukleotidnu sekvencu sa
2
optimizovanom sekvencom (npr. iRNK) koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, ili OX40L polipeptid. Rezultujuće iRNK se zatim mogu ispitati na svoju sposobnost da proizvode protein i/ili da proizvede terapijski ishod.
In vitro transkripcija-enzimska sinteza
[0702] Polinukleotid koji je ovde objavljen može se transkribovati upotrebom sistema in vitro transkripcije (IVT). Sistem tipično sadrži transkripcioni pufer, nukleotide trifosfate (NTP), inhibitor RNaze i polimerazu. NTP se mogu odabrati od, ali nisu ograničeni na, one koji su ovde opisani, uključujući prirodne i neprirodne (modifikovane) NTP. Polimeraza se može odabrati od, ali nije ograničena na, T7 RNK polimerazu, T3 RNK polimerazu i mutantne polimeraze kao što su, ali ne ograničavajući se na, polimeraze koje mogu da inkorporišu modifikovane nukleinske kiseline. Videti S.A.D. publ. br. US2013-0259923.
[0703] IVT sistem tipično sadrži transkripcioni pufer, nukleotide trifosfate (NTP), inhibitor RNaze i polimerazu. NTP se mogu odabrati od, ali nisu ograničeni na, one koji su ovde opisani, uključujući prirodne i neprirodne (modifikovane) NTP. Polimeraza se može odabrati od, ali nije ograničena na, T7 RNK polimerazu, T3 RNK polimerazu i mutantne polimeraze kao što su, ali ne ograničavajući se na, polimeraze koje mogu da inkorporišu polinukleotide koji su ovde opisani.
[0704] Bilo koji broj RNK polimeraza ili varijanti može se upotrebljavati u sintezi polinukleotida iz predmetne objave.
[0705] RNK polimeraze se mogu modifikovati vršenjem insercije ili delecije amino-kiselina iz sekvence RNK polimeraze. Kao neograničavajući primer, RNK polimeraza je modifikovana da pokaže povećanu sposobnost inkorporacije 2'-modifikovanog nukleotid trifosfata u poređenju sa nemodifikovanom RNK polimerazom. Videti Međunarodnu publikaciju WO2008078180 i S.A.D. patent 8,101,385.
[0706] Varijante se mogu dobiti razvijanjem RNK polimeraze, optimizacijom aminokiselinske sekvence i/ili sekvence nukleinske kiseline RNK polimeraze i/ili upotrebom drugih postupaka koji su poznati u struci. Kao neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze su razvijene upotrebom sistema kontinuirane usmerene evolucije koji su postavili Esvelt et al. (2011) Nature 472:499-503, gde klonovi T7 RNK polimeraze mogu da kodiraju barem jednu mutaciju kao što je, ali ne ograničavajući se na, lizin na poziciji 93 supstituisan treoninom (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R,
2 1
T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N ili L864F. Kao sledeći neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze mogu da kodiraju barem mutaciju kao što je opisano u S.A.D. publikacijama br. 20100120024 i 20070117112. Varijante RNK polimeraze takođe mogu uključivati, ali nisu ograničene na, supstitucione varijante, konzervativnu amino-kiselinsku supstituciju, insercione varijante, delecione varijante i/ili kovalentne derivate.
[0707] U jednom aspektu, polinukleotid može biti dizajniran da bude prepoznat od strane RNK polimeraze divljeg tipa ili varijante RNK polimeraze. Pri tome, polinukleotid se može modifikovati da sadrži mesta ili regione promena sekvence od divljeg tipa ili roditeljskog himernog polinukleotida.
[0708] Reakcije sinteze polinukleotida ili nukleinske kiseline mogu se izvesti enzimskim postupcima korišćenjem polimeraza. Polimeraze katalizuju stvaranje fosfodiestarskih veza između nukleotida u polinukleotidu ili lancu nukleinske kiseline. Trenutno poznate DNK polimeraze se mogu podeliti u različite porodice na osnovu poređenja amino-kiselinskih sekvenci i analize kristalne strukture. Porodica DNK polimeraza I (pol I) ili A polimeraza, uključujući Klenov (Klenow) fragmente E. coli, Bacillus DNK polimerazu I, Thermus aquaticus (Taq) DNK polimeraze, i T7 RNK i DNK polimeraze, je među najbolje proučenim od ovih porodica. Druga velika porodica je porodica DNK polimeraza α (pol α) ili B polimeraza, koja uključuje sve eukariotske replicirajuće DNK polimeraze i polimeraze iz faga T4 i RB69. Iako koriste sličan katalitički mehanizam, ove porodice polimeraza se razlikuju po specifičnosti supstrata, efikasnosti inkorporacije analoga supstrata, stepenu i stopi ekstenzije prajmera, načinu sinteze DNK, aktivnosti egzonukleaze, i osetljivosti prema inhibitorima.
[0709] DNK polimeraze se takođe biraju na osnovu optimalnih uslova reakcije koje zahtevaju, kao što su reakciona temperatura, pH, i koncentracije templata i prajmera. Ponekad se koristi kombinacija više od jedne DNK polimeraze kako bi se postigla željena veličina DNK fragmenta i efikasnost sinteze. Na primer, Cheng et al. povećava pH, dodaje glicerol i dimetil sulfoksid, smanjuje vreme denaturacije, povećava vreme ekstenzije, i koristi sekundarnu termostabilnu DNK polimerazu koja poseduje aktivnost 3' do 5' egzonukleaze da efikasno amplifikuje dugačke ciljeve iz kloniranih inserata i humane genomske DNK. Cheng et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699. RNK polimeraze iz bakteriofaga T3, T7, i SP6 se široko upotrebljavaju za pripremu RNK za biohemijske i biofizičke studije. RNK
2 2
polimeraze, enzimi za dodavanje kape, i poli-A polimeraze su objavljene u Međunarodnoj publikaciji br. WO2014028429 (videti takođe US 20150211039).
[0710] U jednom aspektu, RNK polimeraza koja se može upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji su ovde opisani je Syn5 RNK polimeraza. Videti Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552. Zhu et al. su nedavno okarakterisali Syn5 RNK polimerazu iz morskog cijanofaga Syn5, gde su takođe identifikovali sekvencu promotera. Videti Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552. Zhu et al. su pronašli da Syn5 RNK polimeraza katalizuje sintezu RNK u širem opsegu temperatura i saliniteta u poređenju sa T7 RNK polimerazom. Pored toga, pronađeno je da je zahtev za inicijacijskim nukleotidom na promotoru manje strog za Syn5 RNK polimerazu u poređenju sa T7 RNK polimerazom, što čini Syn5 RNK polimerazu obećavajućom za sintezu RNK.
[0711] U jednom aspektu, Syn5 RNK polimeraza se može upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji su ovde opisani. Kao neograničavajući primer, Syn5 RNK polimeraza se može upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji zahteva precizne 3'-terminuse.
[0712] U jednom aspektu, Syn5 promotor se može upotrebljavati u sintezi polinukleotida. Kao neograničavajući primer, Syn5 promotor može biti 5'-ATTGGGCACCCGTAAGGG-3' kao što su opisali Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552.
[0713] U jednom aspektu, Syn5 RNK polimeraza se može upotrebljavati u sintezi polinukleotida koji sadrže najmanje jednu hemijsku modifikaciju koja je ovde opisana i/ili poznata u struci. (videti, npr. inkorporaciju pseudo-UTP i 5Me-CTP koja je opisana u Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552.
[0714] U jednom aspektu, polinukleotidi koji su ovde opisani mogu da se sintetišu upotrebom Syn5 RNK polimeraze koja je prečišćena upotrebom modifikovane i poboljšane procedure prečišćavanja koju su opisali Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552.
[0715] Različiti alati u genetičkom inženjeringu zasnivaju se na enzimskoj amplifikaciji ciljnog gena koji deluje kao templat. Za proučavanje sekvenci pojedinačnih gena ili specifičnih regiona od interesa i druge potrebe istraživanja, neophodno je generisati više kopija ciljnog gena iz malog uzorka polinukleotida ili nukleinskih kiselina. Takvi postupci se mogu primeniti u proizvodnji polinukleotida iz objave.
[0716] Lančana reakcija polimeraze (PCR) ima široke primene u brzoj amplifikaciji ciljnog gena, kao i mapiranju i sekvenciranju genoma. Ključne komponente za sintezu DNK sadrže ciljne DNK molekule kao templat, prajmere komplementarne krajevima ciljnih lanaca DNK, dezoksinukleozid trifosfate (dNTP) kao gradivne blokove, i DNK polimerazu. Kako PCR napreduje kroz korake denaturacije, vezivanja i ekstenzije, novoproizvedeni DNK molekuli
2
mogu delovati kao templat za sledeći krug replikacije, postižući eksponencijalno amplifikaciju ciljne DNK. PCR zahteva ciklus zagrevanja i hlađenja za denaturaciju i vezivanje. Varijacije osnovne PCR uključuju asimetričnu PCR (Innis et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436-9440), inverznu PCR (Ochman et al. (1988) Genetics 120:621-623), PCR nakon reverzne transkripcije (RT-PCR) (Freeman et al. (1999) BioTechniques 26:112-22, 124-5). U RT-PCR, jednolančana RNK je željeni cilj i prvo se konvertuje u dvolančanu DNK pomoću reverzne transkriptaze.
[0717] Razvijene su različite izotermne in vitro tehnike amplifikacije nukleinske kiseline kao alternative ili dopune PCR. Na primer, amplifikacija premeštanja lanaca (SDA) zasniva se na sposobnosti restrikcionog enzima da formira prekid (nick). Walker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396
[0718] Sekvenca koju prepoznaje restrikcioni enzim je insertovana u vezanu sekvencu prajmera. Prajmeri su produženi pomoću DNK polimeraze i dNTP kako bi se formirao dupleks. Restrikcioni enzim iseca samo jedan lanac dupleksa. Svaki jednolančani lanac je tada dostupan kao templat za naknadnu sintezu. SDA ne zahteva komplikovan ciklus kontrole temperature kao PCR.
[0719] Amplifikacija zasnovana na sekvenci nukleinske kiseline (NASBA), takođe nazvana transkripcijom posredovana amplifikacija (TMA), takođe je postupak izotermne amplifikacije koji koristi kombinaciju DNK polimeraze, reverzne transkriptaze, RNAze H, i T7 RNK polimeraze. Compton (1991) Nature 350:91-92. Ciljna RNK se upotrebljava kao templat i reverzna transkriptaza sintetiše njen komplementarni DNK lanac. RNAza H hidrolizuje RNK templat, stvarajući prostor za DNK polimerazu da sintetiše DNK lanac komplementaran prvom lancu DNK koji je komplementaran RNK cilju, formirajući DNK dupleks. T7 RNK polimeraza kontinuirano generiše komplementarne RNK lance ovog DNK dupleksa. Ovi RNK lanci deluju kao templati za nove cikluse sinteze DNK, što rezultuje amplifikacijom ciljnog gena.
[0720] Amplifikacija mehanizmom kotrljajućeg kruga (Rolling-circle amplification - RCA) amplifikuje jednolančani cirkularni polinukleotid i uključuje brojne krugove izotermne enzimske sinteze gde Φ29 DNK polimeraza produžava prajmer kontinuirano napredujući oko polinukleotidnog kruga kako bi replicirala njegovu sekvencu iznova i iznova. Prema tome, postiže se linearna kopija cirkularnog templata. Prajmer se zatim može vezati za ovu linearnu kopiju i može se sintetisati njegov komplementarni lanac. Videti Lizardi et al. (1998) Nature Genetics 19:225-232. Jednolančana cirkularna DNK takođe može poslužiti kao templat za sintezu RNK u prisustvu RNK polimeraze. Daubendiek et al. (1995) JACS 117:7818-7819.
2 4
Inverznu brzu amplifikaciju krajeva cDNA (RACE) RCA su opisali Polidoros et al. Informaciona RNK (iRNK) se reverzno transkribuje u cDNA, nakon čega sledi tretman RNAzom H kako bi se odvojila cDNA. cDNA se zatim cirkularizuje pomoću CircLigase u cirkularnu DNK. Amplifikacija rezultujuće cirkularne DNK se postiže pomoću RCA. Polidoros et al. (2006) BioTechniques 41:35-42.
[0721] Bilo koji od prethodnih postupaka može se koristiti u proizvodnji jednog ili više regiona polinukleotida iz predmetne objave.
[0722] Asembliranje polinukleotida ili nukleinskih kiselina pomoću ligaze se takođe široko upotrebljava. DNK ili RNK ligaze promovišu intermolekulsku ligaciju 5' i 3' krajeva polinukleotidnih lanaca preko formiranja fosfodiestarske veze. Lančana reakcija ligaze (LCR) je obećavajuća tehnika dijagnostike zasnovana na principu da se dve susedne polinukleotidne probe hibridizuju sa jednim lancem ciljnog gena i spajaju jedna sa drugom pomoću ligaze. Ukoliko ciljni gen nije prisutan, ili ukoliko postoji nepodudaranje u ciljnom genu, kao što je polimorfizam jednog nukleotida (SNP), probe ne mogu da se ligiraju. Wiedmann et al. (1994) PCR Methods and Application 3(4):s51-s64. LCR se može kombinovati sa različitim tehnikama amplifikacije kako bi se povećala osetljivost detekcije ili povećala količina proizvoda ukoliko se upotrebljava u sintezi polinukleotida i nukleinskih kiselina.
[0723] Nekoliko kompleta za pripremu biblioteke za nukleinske kiseline je sada komercijalno dostupno. Oni uključuju enzime i pufere za konvertovanje male količine uzoraka nukleinske kiseline u indeksiranu biblioteku za nizvodne aplikacije. Na primer, DNK fragmenti se mogu staviti u NEBNEXT<®>ULTRATM komplet za pripremu DNK biblioteke od NEW ENGLAND BIOLABS<®>za pripremu kraja, ligaciju, odabir veličine, čišćenje, PCR amplifikaciju i krajnje čišćenje.
[0724] Kontinuirani razvoj se nastavlja radi poboljšanja tehnika amplifikacije. Na primer, S.A.D. pat.8,367,328 od Asada et al., podučava o korišćenju pojačivača reakcije za povećanje efikasnosti reakcija sinteze DNK pomoću DNK polimeraza. Pojačivač reakcije sadrži kiselu supstancu ili katjonske komplekse kisele supstance. S.A.D. pat. 7,384,739 od Kitabayashi et al., podučava o supstanci za snabdevanje karboksilatnim jonima koja promoviše enzimsku sintezu DNK, pri čemu je supstanca za snabdevanje karboksilatnim jonima odabrana od oksalne kiseline, malonske kiseline, estara oksalne kiseline, estara malonske kiseline, soli malonske kiseline, i estara maleinske kiseline. S.A.D. pat. 7,378,262 od Sobek et al., objavljuje kompoziciju enzima za povećanje vernosti DNK amplifikacija. Kompozicija sadrži jedan enzim sa aktivnošću 3' egzonukleaze, ali bez aktivnosti polimeraze i drugi enzim koji je
2
polimeraza. Oba enzima su termostabilna i reverzibilno su modifikovana da budu neaktivni na nižim temperaturama.
[0725] S.A.D. pat. br.7,550,264 od Getts et al. podučava da se višestruki krugovi sinteze sens RNK molekula izvode prikačinjanjem oligodezoksinukleotidnih repova na 3' kraj cDNA molekula i inicijalizacijom RNK transkripcije upotrebom RNK polimeraze. S.A.D. pat. publikacija br. 2013/0183718 od Rohayem podučava o sintezi RNK pomoću RNK-zavisnih RNK polimeraza (RdRp) koje pokazuju aktivnost RNK polimeraze na jednolančanim DNK templatima. Oligonukleotidi sa nestandardnim nukleotidima mogu se sintetisati enzimskom polimerizacijom dovođenjem u kontakt templata koji sadrži nestandardne nukleotide sa smešom nukleotida koji su komplementarni nukleotidima templata kao što je objavljeno u S.A.D. pat. br.6,617,106 od Benner.
Hemijska sinteza
[0726] Standardni postupci se mogu primeniti za sintezu izolovane polinukleotidne sekvence koja kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid. Na primer, može se sintetisati pojedinačni DNK ili RNK oligomer koji sadrži kodonoptimizovanu nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni izolovani polipeptid. U drugim aspektima, može se sintetisati i zatim ligirati nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida. U nekim aspektima, pojedinačni oligonukleotidi tipično sadrže 5' ili 3' viseće krajeve za komplementarno asembliranje.
[0727] Polinukleotid koji je ovde objavljen (npr. iRNK) može se hemijski sintetisati upotrebom postupaka hemijske sinteze i potencijalnih supstitucija nukleobaza koji su poznati u struci. Videti, na primer, Međunarodne publikacije br. WO2014093924 (videti takođe US20150307542), WO2013052523 (videti takođe US20130115272); WO2013039857, WO2012135805 (videti takođe US20120251618), WO2013151671 (videti takođe US20150044277); S.A.D. publ. br. US20130115272; ili S.A.D. patente br. US8999380, US8710200.
Prečišćavanje
[0728] Prečišćavanje polinukleotida (npr. iRNK) koji kodiraju IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid koji su ovde opisani može uključivati, ali nije ograničeno na, čišćenje polinukleotida, osiguranje kvaliteta i kontrolu kvaliteta. Čišćenje
2
se može izvesti postupcima koji su poznati u struci kao što su, ali ne ograničavajući se na, AGENCOURT<®>perle (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), poli-T perle, LNA<™>oligo-T probe za hvatanje (EXIQON<®>Inc, Vedbaek, Danska), ili postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC kao što su, ali ne ograničavajući se na, jak anjon-izmenjivačku HPLC, slab anjon-izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC). Termin "prečišćen" kada se upotrebljava u vezi sa polinukleotidom kao što je "prečišćen polinukleotid" označava onaj koji je odvojen od najmanje jednog kontaminanta. Kao što se ovde upotrebljava, "kontaminant" je bilo koja supstanca koja drugu čini neprikladnom, nečistom ili inferiornom. Stoga, prečišćen polinukleotid (npr. DNK i RNK) je prisutan u obliku ili okruženju različitom od onog u kom se nalazi u prirodi, ili u obliku ili okruženju različitom od onog u kom je postojao pre podvrgavanja postupku tretmana ili prečišćavanja.
[0729] U nekim aspektima, prečišćavanje polinukleotida (npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid iz objave uklanja nečistoće koje mogu redukovati ili ukloniti neželjeni imunski odgovor, npr. koje redukuju aktivnost citokina.
[0730] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. iRNK) koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid iz objave prečišćava se pre primene upotrebom hromatografije na koloni (npr. jak anjon-izmenjivačkom HPLC, slab anjonizmenjivačkom HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), ili (LCMS)). U nekim aspektima, hromatografijom na koloni (npr. jak anjon-izmenjivačkom HPLC, slab anjon-izmenjivačkom HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), ili (LCMS)) prečišćen polinukleotid, koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid koji je ovde objavljen povećava ekspresiju IL-23 polipeptida, IL-36-gama polipeptida, IL-18 polipeptida, i/ili OX40L polipeptida u poređenju sa polinukleotidima koji kodiraju IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid koji su prečišćeni drugačijim postupkom prečišćavanja.
[0731] U nekim aspektima, hromatografijom na koloni (npr. jak anjon-izmenjivačkom HPLC, slab anjon-izmenjivačkom HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), ili (LCMS)) prečišćen polinukleotid kodira sisarski IL-23 polipeptid, sisarski IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili sisarski OX40L polipeptid. U nekim aspektima, prečišćen polinukleotid kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid. U nekim aspektima, prečišćen
2
polinukleotid kodira humani IL-23 polipeptid, humani IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili humani OX40L polipeptid.
[0732] U nekim aspektima, prečišćen polinukleotid je najmanje oko 80% čist, najmanje oko 85% čist, najmanje oko 90% čist, najmanje oko 95% čist, najmanje oko 96% čist, najmanje oko 97% čist, najmanje oko 98% čist, najmanje oko 99% čist, ili oko 100% čist.
[0733] Osiguranje kvaliteta i/ili provera kontrole kvaliteta može se sprovesti upotrebom postupaka kao što su, ali ne ograničavajući se na, gel elektroforezu, UV apsorbancu, ili analitičku HPLC.
[0734] U sledećem aspektu, polinukleotidi se mogu sekvencirati postupcima koji uključuju, ali nisu ograničeni na reverzna transkriptaza-PCR.
XI. Hemijske modifikacije
[0735] Kao što se ovde upotrebljava u polinukleotidima koji sadrže iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotidima koji sadrže iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, polinukleotidima koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihovu kombinaciju u skladu sa predmetnom objavom, termini "hemijska modifikacija" ili, kada je prikladno, "hemijski modifikovani" označavaju modifikaciju u odnosu na adenozin (A), guanozin (G), uridin (U), timidin (T) ili citidin (C) ribo- ili dezoksiribonukleotide u jednom ili više od njihove pozicije, obrasca, procenta ili populacije. Generalno, ovde, ovi termini nisu namenjeni da označavaju modifikacije ribonukleotida u 5'-terminusnim iRNK kapa funkcionalnim grupama koje se javljaju u prirodi.
[0736] U polipeptidu, termin "modifikacija" označava modifikaciju u poređenju sa kanonskim skupom od 20 amino-kiselina.
[0737] Modifikacije mogu biti različite distinktne modifikacije. U nekim aspektima, regioni mogu da sadrže jednu, dve, ili više (opciono različitih) modifikacija nukleozida ili nukleotida (nukleobaza). U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, introdukovan u ćeliju, može pokazati redukovanu degradaciju u ćeliji, u poređenju sa nemodifikovanim polinukleotidom. U drugim aspektima, modifikacija je u strukturi nukleobaze i/ili šećera. U još nekim aspektima, modifikacija je u strukturi oskosnice.
Hemijske modifikacije
2
[0738] Neki aspekti predmetne objave obezbeđuju prvi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, i drugi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili IL-18 polipeptid, ili treći polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu iRNK uključuje najmanje jednu hemijsku modifikaciju.
[0739] Drugi aspekti predmetne objave obezbeđuju prvi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili IL-18 polipeptid, i treći polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid pri čemu iRNK uključuje najmanje jednu hemijsku modifikaciju.
[0740] U nekim aspektima, hemijska modifikacija je odabrana od pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitozina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseuduridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-2-tio-pseudouridina, 4-metoksipseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseuduridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina,), 5-metoksiuridina, i 2'-O-metil uridina.
[0741] "Nukleozid" kao što se ovde upotrebljava označava jedinjenje koje sadrži molekul šećera (npr. pentozu ili ribozu) ili njegov derivat u kombinaciji sa organskom bazom (npr. purinom ili pirimidinom) ili njegovim derivatom (takođe se označava ovde kao "nukleobaza"). "Nukleotid" kao što se ovde upotrebljava označava nukleozid, uključujući fosfatnu grupu. Modifikovani nukleotidi mogu da se sintetišu bilo kojim korisnim postupkom, kao što su, na primer, hemijski, enzimski, ili rekombinantno, kako bi se uključio jedan ili više modifikovanih ili neprirodnih nukleozida. Polinukleotidi mogu sadržati region ili regione povezanih nukleozida. Takvi regioni mogu imati varijabilne veze okosnice. Veze mogu biti standardne fosfodiestarske veze, u kom slučaju bi polinukleotidi sadržali regione nukleotida.
[0742] Sparivanje baza modifikovanih nukleotida obuhvata ne samo standardne bazne parove adenozin-timin, adenozin-uracil, ili guanozin-citozin, već i bazne parove koji su formirani između nukleotida i/ili modifikovanih nukleotida koji sadrže nestandardne ili modifikovane baze, pri čemu aranžman donora vodonične veze i akceptora vodonične veze dozvoljava vodoničnu vezu između nestandardne baze i standardne baze ili između struktura dve komplementarne nestandardne baze. Jedan primer takvog nestandardnog sparivanja baza je sparivanje baza između modifikovanog nukleotida inozina i adenina, citozina ili uracila. Bilo koja kombinacija baza/šećer ili linker može biti inkorporisana u polinukleotide iz predmetne objave.
2
[0743] Stručnjak sa iskustvom će ceniti da će, osim tamo gde je drugačije naznačeno, polinukleotidne sekvence iznete u trenutnoj prijavi navoditi "T" u reprezentativnoj DNK sekvenci, ali tamo gde sekvenca predstavlja RNK, "T" će biti zamenjeno sa "U".
[0744] Modifikacije polinukleotida (npr. RNK polinukleotida, kao što su iRNK polinukleotidi) koje su korisne u polinukleotidima, kompozicijama, postupcima i sintetičkim procesima iz predmetne objave uključuju, ali nisu ograničene na sledeće nukleotide, nukleozide, i nukleobaze: 2-metiltio-N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin; 2-metiltio-N6-metiladenozin; 2-metiltio-N6-treonil karbamoiladenozin; N6-glicinilkarbamoiladenozin; N6-izopenteniladenozin; N6-metiladenozin; N6-treonilkarbamoiladenozin; 1,2'-O-dimetiladenozin; 1-metiladenozin; 2'-O-metiladenozin; 2'-O-riboziladenozin (fosfat); 2-metiladenozin; 2-metiltio-N6-izopenteniladenozin; 2-metiltio-N6-hidroksinorvalil karbamoiladenozin; 2'-O-metiladenozin; 2'-O-riboziladenozin (fosfat); izopenteniladenozin; N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin; N6,2'-O-dimetiladenozin; N6,2'-O-dimetiladenozin; N6,N6,2'-O-trimetiladenozin; N6,N6-dimetiladenozin; N6-acetiladenozin; N6-hidroksinorvalilkarbamoiladenozin; N6-metil-N6-treonilkarbamoiladenozin; 2-metiladenozin; 2-metiltio-N6-izopenteniladenozin; 7-deazaadenozin; N1-metil-adenozin; N6, N6 (dimetil) adenin; N6-cis-hidroksi-izopenteniladenozin; α-tio-adenozin; 2 (amino)adenin; 2 (aminopropil)adenin; 2 (metiltio) N6 (izopentenil)adenin; 2-(alkil)adenin; 2-(aminoalkil)adenin; 2-(aminopropil)adenin; 2-(halo)adenin; 2-(halo)adenin; 2-(propil)adenin; 2'-amino-2'-dezoksi-ATP; 2'-azido-2'-dezoksi-ATP; 2'-dezoksi-2'-a-aminoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidoadenozin TP; 6 (alkil)adenin; 6 (metil)adenin; 6-(alkil)adenin; 6-(metil)adenin; 7 (deaza)adenin; 8 (alkenil)adenin; 8 (alkinil)adenin; 8 (amino)adenin; 8 (tioalkil)adenin; 8-(alkenil)adenin; 8-(alkil)adenin; 8-(alkinil)adenin; 8-(amino)adenin; 8-(halo)adenin; 8-(hidroksil)adenin; 8-(tioalkil)adenin; 8-(tiol)adenin; 8-azido-adenozin; aza adenin; deaza adenin; N6 (metil) adenin; N6-(izopentil)adenin; 7-deaza-8-aza-adenozin; 7-metiladenin; 1-deazaadenozin TP; 2'fluoro-N6-Bz-dezoksiadenozin TP; 2'-OMe-2-amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-dezoksiadenozin TP; 2'-a-etiniladenozin TP; 2-aminoadenin; 2-aminoadenozin TP; 2-amino-ATP; 2'-a-trifluorometiladenozin TP; 2-azidoadenozin TP; 2'-betiniladenozin TP; 2-bromoadenozin TP; 2'-b-trifluorometiladenozin TP; 2-hloroadenozin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluoroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-atiometoksiadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hloroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-bfluoroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiadenozin TP; 2-fluoroadenozin TP; 2-jodoadenozin TP; 2-
2
merkaptoadenozin TP; 2-metoksi-adenin; 2-metiltio-adenin; 2-trifluorometiladenozin TP; 3-deaza-3-bromoadenozin TP; 3-deaza-3-hloroadenozin TP; 3-deaza-3-fluoroadenozin TP; 3-deaza-3-jodoadenozin TP; 3-deazaadenozin TP; 4'-azidoadenozin TP; 4'-karbociklični adenozin TP; 4'-etiniladenozin TP; 5'-homo-adenozin TP; 8-aza-ATP; 8-bromo-adenozin TP; 8-trifluorometiladenozin TP; 9-deazaadenozin TP; 2-aminopurin; 7-deaza-2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-2-aminopurin; 2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-adenin, 7-deaza-2-aminopurin; 2-tiocitidin; 3-metilcitidin; 5-formilcitidin; 5-hidroksimetilcitidin; 5-metilcitidin; N4-acetilcitidin; 2'-O-metilcitidin; 2'-O-metilcitidin; 5,2'-O-dimetilcitidin; 5-formil-2'-O-metilcitidin; lizidin; N4,2'-O-dimetilcitidin; N4-acetil-2'-O-metilcitidin; N4-metilcitidin; N4,N4-dimetil-2'-OMe-citidin TP; 4-metilcitidin; 5-aza-citidin; pseudo-izo-citidin; pirolo-citidin; α-tio-citidin; 2-(tio)citozin; 2'-amino-2'-dezoksi-CTP; 2'-azido-2'-dezoksi-CTP; 2'-dezoksi-2'-a-aminocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidocitidin TP; 3 (deaza) 5 (aza)citozin; 3 (metil)citozin; 3-(alkil)citozin; 3-(deaza) 5 (aza)citozin; 3-(metil)citidin; 4,2'-O-dimetilcitidin; 5 (halo)citozin; 5 (metil)citozin; 5 (propinil)citozin; 5 (trifluorometil)citozin; 5-(alkil)citozin; 5-(alkinil)citozin; 5-(halo)citozin; 5-(propinil)citozin; 5-(trifluorometil)citozin; 5-bromo-citidin; 5-jodo-citidin; 5-propinil citozin; 6-(azo)citozin; 6-aza-citidin; aza citozin; deaza citozin; N4 (acetil)citozin; 1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin; 1-metil-pseudoizocitidin; 2-metoksi-5-metil-citidin; 2-metoksi-citidin; 2-tio-5-metil-citidin; 4-metoksi-1-metil-pseudoizocitidin; 4-metoksi-pseudoizocitidin; 4-tio-1-metil-1-deazapseudoizocitidin; 4-tio-1-metil-pseudoizocitidin; 4-tio-pseudoizocitidin; 5-aza-zebularin; 5-metil-zebularin; pirolo-pseudoizocitidin; zebularin; (E)-5-(2-bromo-vinil)citidin TP; 2,2'-anhidro-citidin TP hidrohlorid; 2'fluor-N4-Bz-citidin TP; 2'fluoro-N4-acetil-citidin TP; 2'-O-metil-N4-acetil-citidin TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidin TP; 2'-a-etinilcitidin TP; 2'-atrifluorometilcitidin TP; 2'-b-etinilcitidin TP; 2'-b-trifluorometilcitidin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksicitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hlorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-bjodocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksicitidin TP; 2'-O-metil-5-(1-propinil)citidin TP; 3'-etinilcitidin TP; 4'-azidocitidin TP; 4'-karbociklični citidin TP; 4'-etinilcitidin TP; 5-(1-propinil)ara-citidin TP; 5-(2-hloro-fenil)-2-tiocitidin TP; 5-(4-amino-fenil)-2-tiocitidin TP; 5-aminoalil-CTP; 5-cijanocitidin TP; 5-etinilara-citidin TP; 5-etinilcitidin TP; 5'-homo-citidin TP; 5-metoksicitidin TP; 5-trifluorometil-citidin TP; N4-amino-citidin TP; N4-benzoil-citidin TP; pseudoizocitidin; 7-metilguanozin; N2,2'-O-dimetilguanozin; N2-metilguanozin; viozin; 1,2'-O-dimetilguanozin; 1-metilguanozin; 2'-O-
2 1
metilguanozin; 2'-O-ribozilguanozin (fosfat); 2'-O-metilguanozin; 2'-O-ribozilguanozin (fosfat); 7-aminometil-7-deazaguanozin; 7-cijano-7-deazaguanozin; arheozin; metilviozin; N2,7-dimetilguanozin; N2,N2,2'-O-trimetilguanozin; N2,N2,7-trimetilguanozin; N2,N2-dimetilguanozin; N2,7,2'-O-trimetilguanozin; 6-tio-guanozin; 7-deaza-guanozin; 8-oksoguanozin; N1-metil-guanozin; α-tio-guanozin; 2 (propil)guanin; 2-(alkil)guanin; 2'-amino-2'-dezoksi-GTP; 2'-azido-2'-dezoksi-GTP; 2'-dezoksi-2'-a-aminoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-aazidoguanozin TP; 6 (metil)guanin; 6-(alkil)guanin; 6-(metil)guanin; 6-metil-guanozin; 7 (alkil)guanin; 7 (deaza)guanin; 7 (metil)guanin; 7-(alkil)guanin; 7-(deaza)guanin; 7-(metil)guanin; 8 (alkil)guanin; 8 (alkinil)guanin; 8 (halo)guanin; 8 (tioalkil)guanin; 8-(alkenil)guanin; 8-(alkil)guanin; 8-(alkinil)guanin; 8-(amino)guanin; 8-(halo)guanin; 8-(hidroksil)guanin; 8-(tioalkil)guanin; 8-(tiol)guanin; aza guanin; deaza guanin; N (metil)guanin; N-(metil)guanin; 1-metil-6-tio-guanozin; 6-metoksi-guanozin; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanozin; 6-tio-7-deaza-guanozin; 6-tio-7-metil-guanozin; 7-deaza-8-aza-guanozin; 7-metil-8-okso-guanozin; N2,N2-dimetil-6-tio-guanozin; N2-metil-6-tio-guanozin; 1-Me-GTP; 2'fluoro-N2-izobutil-guanozin TP; 2'O-metil-N2-izobutil-guanozin TP; 2'-a-etinilguanozin TP; 2'-a-trifluorometilguanozin TP; 2'-b-etinilguanozin TP; 2'-b-trifluorometilguanozin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluoroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-atiometoksiguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hloroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-bfluoroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiguanozin TP; 4'-azidoguanozin TP; 4'-karbociklični guanozin TP; 4'-etinilguanozin TP; 5'-homo-guanozin TP; 8-bromo-guanozin TP; 9-deazaguanozin TP; N2-izobutil-guanozin TP; 1-metilinozin; inozin; 1,2'-O-dimetilinozin; 2'-O-metilinozin; 7-metilinozin; 2'-O-metilinozin; epoksikveozin; galaktozil-kveozin; manozilkveozin; kveozin; aliamino-timidin; aza timidin; deaza timidin; dezoksi-timidin; 2'-O-metiluridin; 2-tiouridin; 3-metiluridin; 5-karboksimetiluridin; 5-hidroksiuridin; 5-metiluridin; 5-taurinometil-2-tiouridin; 5-taurinometiluridin; dihidrouridin; pseudouridin; (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin; 1-metil-3-(3-amino-5-karboksipropil)pseudouridin; 1-metilpseduouridin; 1-etil-pseudouridin; 2'-O-metiluridin; 2'-O-metilpseudouridin; 2'-O-metiluridin; 2-tio-2'-O-metiluridin; 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin; 3,2'-O-dimetiluridin; 3-metil-pseudo-uridin TP; 4-tiouridin; 5-(karboksihidroksimetil)uridin; 5-(karboksihidroksimetil)uridin metil estar; 5,2'-O-dimetiluridin; 5,6-dihidro-uridin; 5-aminometil-2-tiouridin; 5-karbamoilmetil-2'-O-metiluridin; 5-karbamoilmetiluridin; 5-karboksihidroksimetiluridin; 5-karboksihidroksimetiluridin metil estar; 5-karboksimetilaminometil-2'-O-metiluridin; 5-
2 2
karboksimetilaminometil-2-tiouridin; 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin; 5-karboksimetilaminometiluridin; 5-karboksimetilaminometiluridin; 5-karbamoilmetiluridin TP; 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metiluridin; 5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin; 5-metoksikarbonilmetiluridin; 5-metiluridin,), 5-metoksiuridin; 5-metil-2-tiouridin; 5-metilaminometil-2-selenouridin; 5-metilaminometil-2-tiouridin; 5-metilaminometiluridin; 5-metildihidrouridin; 5-oksisirćetna kiselina- uridin TP; 5-oksisirćetna kiselina-metil estaruridin TP; N1-metil-pseudo-uracil; N1-etil-pseudo-uracil; uridin 5-oksisirćetna kiselina; uridin 5-oksisirćetna kiselina metil estar; 3-(3-amino-3-karboksipropil)-uridin TP; 5-(izopentenilaminometil)- 2-tiouridin TP; 5-(izo-pentenilaminometil)-2'-O-metiluridin TP; 5-(izopentenilaminometil)uridin TP; 5-propinil uracil; α-tio-uridin; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-pseudouracil; 1 supstituisani 2(tio)-pseudouracil; 1 supstituisani 2,4-(ditio)pseudouracil; 1 supstituisani 4 (tio)pseudouracil; 1 supstituisani pseudouracil; 1-(aminoalkilamino-karboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracil; 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil) pseudouridin TP; 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudo-UTP; 1-metil-pseudo-UTP; 1-etil-pseudo-UTP; 2 (tio)pseudouracil; 2' dezoksi uridin; 2' fluorouridin; 2-(tio)uracil; 2,4-(ditio)pseudouracil; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-guanozin; 2'-amino-2'-dezoksi-UTP; 2'-azido-2'-dezoksi-UTP; 2'-azido-dezoksiuridin TP; 2'-O-metilpseudouridin; 2' dezoksi uridin; 2' fluorouridin; 2'-dezoksi-2'-a-aminouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidouridin TP; 2-metilpseudouridin; 3 (3 amino-3 karboksipropil)uracil; 4 (tio)pseudouracil; 4-(tio)pseudouracil; 4-(tio)uracil; 4-tiouracil; 5 (1,3-diazol-1-alkil)uracil; 5 (2-aminopropil)uracil; 5 (aminoalkil)uracil; 5 (dimetilaminoalkil)uracil; 5 (guanidinijumalkil)uracil; 5 (metoksikarbonilmetil)-2-(tio)uracil; 5 (metoksikarbonilmetil)uracil; 5 (metil) 2 (tio)uracil; 5 (metil) 2,4 (ditio)uracil; 5 (metil) 4 (tio)uracil; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracil; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio)uracil; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracil; 5 (propinil)uracil; 5 (trifluorometil)uracil; 5-(2-aminopropil)uracil; 5-(alkil)-2-(tio)pseudouracil; 5-(alkil)-2,4 (ditio)pseudouracil; 5-(alkil)-4 (tio)pseudouracil; 5-(alkil)pseudouracil; 5-(alkil)uracil; 5-(alkinil)uracil; 5-(alilamino)uracil; 5-(cijanoalkil)uracil; 5-(dialkilaminoalkil)uracil; 5-(dimetilaminoalkil)uracil; 5-(guanidinijumalkil)uracil; 5-(halo)uracil; 5-(1,3-diazol-1-alkil)uracil; 5-(metoksi)uracil; 5-(metoksikarbonilmetil)-2-(tio)uracil; 5-(metoksikarbonil-metil)uracil; 5-(metil) 2(tio)uracil; 5-
2
(metil) 2,4 (ditio)uracil; 5-(metil) 4 (tio)uracil; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracil; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracil; 5-(metil)-4 (tio)pseudouracil; 5-(metil)pseudouracil; 5-(metilaminometil)-2 (tio)uracil; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracil; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracil; 5-(propinil)uracil; 5-(trifluorometil)uracil; 5-aminoalil-uridin; 5-bromo-uridin; 5-jodo-uridin; 5-uracil; 6 (azo)uracil; 6-(azo)uracil; 6-aza-uridin; aliamino-uracil; aza uracil; deaza uracil; N3 (metil)uracil; pseudo-UTP-1-2-etanska kiselina; pseudouracil; 4-tio-pseudo-UTP; 1-karboksimetil-pseudouridin; 1-metil-1-deaza-pseudouridin; 1-propinil-uridin; 1-taurinometil-1-metil-uridin; 1-taurinometil-4-tio-uridin; 1-taurinometil-pseudouridin; 2-metoksi-4-tiopseudouridin; 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin; 2-tio-1-metil-pseudouridin; 2-tio-5-azauridin; 2-tio-dihidropseudouridin; 2-tio-dihidrouridin; 2-tio-pseudouridin; 4-metoksi-2-tiopseudouridin; 4-metoksi-pseudouridin; 4-tio-1-metil-pseudouridin; 4-tio-pseudouridin; 5-azauridin; dihidropseudouridin; (±)1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (2R)-1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (2S)-1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (E)-5-(2-bromovinil)ara-uridin TP; (E)-5-(2-bromo-vinil)uridin TP; (Z)-5-(2-bromo-vinil)ara-uridin TP; (Z)-5-(2-bromo-vinil)uridin TP; 1-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)pseudouridin TP; 1-(2,2-dietoksietil)pseudouridin TP; 1-(2,4,6-trimetilbenzil)pseudouridin TP; 1-(2,4,6-trimetil-benzil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-trimetilfenil)pseudo-UTP; 1-(2-amino-2-karboksietil)pseudo-UTP; 1-(2-amino-etil)pseudo-UTP; 1-(2-hidroksietil)pseudouridin TP; 1-(2-metoksietil)pseudouridin TP; 1-(3,4-bistrifluorometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(3,4-dimetoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(3-amino-3-karboksipropil)pseudo-UTP; 1-(3-amino-propil)pseudo-UTP; 1-(3-ciklopropil-prop-2-inil)pseudouridin TP; 1-(4-amino-4-karboksibutil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-benzil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-azidobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-bromobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-hlorobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-fluorobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-jodobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metansulfonilbenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metoksibenzil)pseudo-UTP; 1-(4-metoksi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-metilbenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metil-benzil)pseudo-UTP; 1-(4-nitrobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-nitro-benzil)pseudo-UTP; 1(4-nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-tiometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-trifluorometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-trifluorometilbenzil)pseudouridin TP; 1-(5-amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-aminoheksil)pseudo-UTP; 1,6-dimetil-pseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]-etoksi}-etoksi)-propionil]pseudouridin TP; 1-{3-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]-propionil } pseudouridin TP; 1-acetilpseudouridin TP; 1-alkil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-alkil-6-(2-propinil)-
2 4
pseudo-UTP; 1-alkil-6-alil-pseudo-UTP; 1-alkil-6-etinil-pseudo-UTP; 1-alkil-6-homoalilpseudo-UTP; 1-alkil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-alilpseudouridin TP; 1-aminometil-pseudo-UTP; 1-benzoilpseudouridin TP; 1-benziloksimetilpseudouridin TP; 1-benzil-pseudo-UTP; 1-biotinil-PEG2-pseudouridin TP; 1-biotinilpseudouridin TP; 1-butil-pseudo-UTP; 1-cijanometilpseudouridin TP; 1-ciklobutilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklobutil-pseudo-UTP; 1-cikloheptilmetil-pseudo-UTP; 1-cikloheptil-pseudo-UTP; 1-cikloheksilmetil-pseudo-UTP; 1-cikloheksil-pseudo-UTP; 1-ciklooktilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklooktil-pseudo-UTP; 1-ciklopentilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklopentil-pseudo-UTP; 1-ciklopropilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklopropil-pseudo-UTP; 1-etil-pseudo-UTP; 1-heksil-pseudo-UTP; 1-homoalilpseudouridin TP; 1-hidroksimetilpseudouridin TP; 1-izo-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tio-pseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-metansulfonilmetilpseudouridin TP; 1-metoksimetilpseudouridin TP; 1-metil-6-(2,2,2-trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(supstituisani fenil)pseudo-UTP; 1-metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-metil-6-azido-pseudo-UTP; 1-metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hloro-pseudo-UTP; 1-metil-6-cijano-pseudo-UTP; 1-metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-etoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-etilkarboksilat-pseudo-UTP; 1-metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1-metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroksiamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-jodo-pseudo-UTP; 1-Metil-6-izo-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-metoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1-metil-6-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-terc-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-trifluorometoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-morfolinometilpseudouridin TP; 1-pentil-pseudo-UTP; 1-fenil-pseudo-UTP; 1-pivaloilpseudouridin TP; 1-propargilpseudouridin TP; 1-propil-pseudo-UTP; 1-propinilpseudouridin; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-terc-butil-pseudo-UTP; 1-tiometoksimetilpseudouridin TP; 1-tiomorfolinometilpseudouridin TP; 1-trifluoroacetilpseudouridin TP; 1-trifluorometilpseudo-UTP; 1-vinilpseudouridin TP; 2,2'-anhidro-uridin TP; 2'-bromo-dezoksiuridin TP; 2'-F-5-metil-2'-dezoksi-UTP; 2'-OMe-5-Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-etiniluridin TP; 2'-a-trifluorometiluridin TP; 2'-b-etiniluridin TP; 2'-b-trifluorometiluridin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksiuridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hlorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiuridin TP; 2-metoksi-4-tiouridin; 2-metoksiuridin; 2'-O-metil-5-(1-propinil)uridin TP; 3-alkil-pseudo-UTP; 4'-
2
azidouridin TP; 4'-karbociklični uridin TP; 4'-etiniluridin TP; 5-(1-propinil)ara-uridin TP; 5-(2-furanil)uridin TP; 5-cijanouridin TP; 5-dimetilaminouridin TP; 5'-homo-uridin TP; 5-jodo-2'-fluoro-dezoksiuridin TP; 5-feniletiniluridin TP; 5-trideuterometil-6-deuterouridin TP; 5-trifluorometil-uridin TP; 5-vinilarauridin TP; 6-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(supstituisani-fenil)-pseudo-UTP; 6-amino-pseudo-UTP; 6-azido-pseudo-UTP; 6-bromo-pseudo-UTP; 6-butil-pseudo-UTP; 6-hloro-pseudo-UTP; 6-cijano-pseudo-UTP; 6-dimetilamino-pseudo-UTP; 6-etoksipseudo-UTP; 6-etilkarboksilat-pseudo-UTP; 6-etil-pseudo-UTP; 6-fluoro-pseudo-UTP; 6-formil-pseudo-UTP; 6-hidroksiamino-pseudo-UTP; 6-hidroksi-pseudo-UTP; 6-jodo-pseudo-UTP; 6-izo-propil-pseudo-UTP; 6-metoksi-pseudo-UTP; 6-metilamino-pseudo-UTP; 6-metilpseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-propil-pseudo-UTP; 6-terc-butilpseudo-UTP; 6-trifluorometoksi-pseudo-UTP; 6-trifluorometil-pseudo-UTP; alfa-tio-pseudo-UTP; pseudouridin 1-(4-metilbenzenesulfonic acid) TP; pseudouridin 1-(4-metilbenzoeva kiselina) TP; pseudouridin TP 1-[3-(2-etoksi)]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoksi)-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-[2-(2-[2-[2(2-etoksi)-etoksi}-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-etoksi ]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-etoksi)-etoksi}] propanska kiselina; pseudouridin TP 1-metilfosfonska kiselina; pseudouridin TP 1-metilfosfonska kiselina dietil estar; pseudo-UTP-Nl-3-propanska kiselinapseudo-UTP-N1-4-butanoic acid; pseudo-UTP-N1-5-pentanska kiselina; pseudo-UTP-N1-6-heksanska kiselina; pseudo-UTP-N1-7-heptanska kiselina; pseudo-UTP-Nl-metil-p-benzoeva kiselina; pseudo-UTP-Nl-p-benzoeva kiselina; vibutozin; hidroksivibutozin; izoviozin; peroksivibutozin; nemodifikovani hidroksivibutozin; 4-demetilviozin; 2,6-(diamino)purin;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il: 1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il;1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioksa)-naftalen;2 (amino)purin; 2,4,5-(trimetil)fenil; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-citidin; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-adenin;2'metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-uridin; 2'-amino-2'-dezoksiriboza; 2-amino-6-hloro-purin; 2-aza-inozinil; 2'-azido-2'-dezoksiriboza; 2'fluoro-2'-dezoksiriboza; 2'-fluoro-modifikovane baze; 2'-O-metil-riboza; 2-okso-7-aminopiridopirimidin-3-il; 2-okso-piridopirimidin-3-il; 2-piridinon; 3 nitropirol; 3-(metil)-7-(propinil)izokarbostirilil; 3-(metil)izokarbostirilil; 4-(fluoro)-6-(metil)benzimidazol; 4-(metil)benzimidazol; 4-(metil)indolil; 4,6-(dimetil)indolil; 5 nitroindol; 5 supstituisane pirimidine; 5-(metil)izokarbostirilil; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidin; 6-(azo)timin; 6-(metil)-7-(aza)indolil; 6-hloro-purin; 6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il;
2
7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-l,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(aza)indolil; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(propinil)izokarbostirilil; 7-(propinil)izokarbostirilil, propinil-7-(aza)indolil; 7-deaza-inozinil; 7-supstituisani 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-supstituisani 1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 9-(metil)-imidizopiridinil; aminoindolil; antracenil; bis-orto-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; bis-ortosupstituisani-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; difluorotolil; hipoksantin; imidizopiridinil; inozinil; izokarbostirilil; izoguanizin; N2-supstituisane purine; N6-metil-2-amino-purin; N6-supstituisane purine; N-alkilovani derivat; naptalenil; nitrobenzimidazolil; nitroimidazolil; nitroindazolil; nitropirazolil; nubularin; O6-supstituisane purine; O-alkilovani derivat; orto-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; orto-supstituisani-6-fenil-pirolopirimidin-2-on-3-il; oksoformicin TP; para-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; para-supstituisani-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; pentacenil; fenantracenil; fenil; propinil-7-(aza)indolil; pirenil; piridopirimidin-3-il; piridopirimidin-3-il, 2-okso-7-aminopiridopirimidin-3-il; pirolo-pirimidin-2-on-3-il; pirolopirimidinil; pirolopirizinil; stilbenzil; supstituisani 1,2,4-triazoli; tetracenil; tubercidin; ksantin; ksantozin-5'-TP; 2-tio-zebularin; 5-aza-2-tio-zebularin; 7-deaza-2-amino-purin; piridin-4-on ribonukleozid; 2-amino-ribozid-TP; formicin A TP; formicin B TP; pirolozin TP; 2'-OH-ara-adenozin TP; 2'-OH-ara-citidin TP; 2'-OH-ara-uridin TP; 2'-OH-ara-guanozin TP; 5-(2-karbometoksivinil)uridin TP; i N6-(19-amino-pentaoksanonadecil)adenozin TP.
[0745] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, uključuje najmanje dve (npr.2, 3, 4 ili više) od prethodno pomenutih modifikovanih nukleobaza.
[0746] U nekim aspektima, modifikovane nukleobaze u polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji odabrane su iz grupe koja se sastoji od pseudouridina (ψ), 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitozina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina,
2
2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tiopseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina,), 5-metoksiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-metil-pseudouridina (m1ψ), 1-etil-pseudouridina (e1ψ), 5-metoksi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), α-tio-guanozina, α-tio-adenozina, 5-cijano uridina, 4'-tio uridina 7-deaza-adenina, 1-metil-adenozina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metiladenozina (m6A), i 2,6-diaminopurina, (I), 1-metil-inozina (m1I), viozina (imG), metilviozina (mimG), 7-deaza-guanozina, 7-cijano-7-deaza-guanozina (preQO), 7-aminometil-7-deazaguanozina (preQ1), 7-metil-guanozina (m7G), 1-metil-guanozina (m1G), 8-okso-guanozina, 7-metil-8-okso-guanozina, 2,8-dimetiladenozina, 2-geraniltiouridina, 2-lizidina, 2-selenouridina, 3-(3-amino-3-karboksipropil)-5,6-dihidrouridina, 3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridina, 3-metilpseudouridina, 5-(karboksihidroksimetil)-2'-O-metiluridin metil estra, 5-aminometil-2-geraniltiouridina, 5-aminometil-2-selenouridina, 5-aminometiluridina, 5-karbamoilhidroksimetiluridina, 5-karbamoilmetil-2-tiouridina, 5-karboksimetil-2-tiouridina, 5-karboksimetilaminometil-2-geraniltiouridina, 5-karboksimetilaminometil-2-selenouridina, 5-cijanometiluridina, 5-hidroksicitidina, 5-metilaminometil-2-geraniltiouridina, 7-aminokarboksipropil-dimetilviozina, 7-aminokarboksipropilviozina, 7-aminokarboksipropilviozin metil estra, 8-metiladenozina, N4,N4-dimetilcitidina, N6-formiladenozina, N6-hidroksimetiladenozina, agmatidina, cikličnog N6-treonilkarbamoiladenozina, glutamil-kveuozina, metilovanog nemodifikovanog hidroksivibutozina, N4,N4,2'-O-trimetilcitidina, geranilovanog 5-metilaminometil-2-tiouridina, geranilovanog 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridina, Qbaze, preQ0baze, preQ1baze, i dve ili više njihovih kombinacija. U nekim aspektima, najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid je odabran iz grupe koja se sastoji od pseudouridina, 1-metilpseudouridina, 1-etil-pseudouridina, 5-metilcitozina, 5-metoksiuridina, i njihove kombinacije. U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) od prethodno pomenutih modifikovanih nukleobaza.
Modifikacije baza
[0747] U određenim aspektima, hemijska modifikacija je na nukleobazama u polinukleotidima (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid). U nekim aspektima, modifikovane nukleobaze u polinukleotidu (npr. RNK polinukleotid, kao što je
2
iRNK polinukleotid) su odabrane iz grupe koja se sastoji od 1-metil-pseudouridina (m1ψ), 1-etil-pseudouridina (e1ψ), 5-metoksi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (ψ), α-tio-guanozina i α-tio-adenozina. U nekim aspektima, polinukleotid uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) od prethodno pomenutih modifikovanih nukleobaza.
[0748] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži pseudouridin (ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 1-metilpseudouridin (m1ψ). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 1-etil-pseudouridin (e1ψ). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 1-metil-pseudouridin (m1ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 1-etil-pseudouridin (e1ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2-tiouridin (s2U). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2-tiouridin i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži metoksi-uridin (mo5U). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 5-metoksi-uridin (mo5U) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2'-O-metil uridin. U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2'-O-metil uridin i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži N6-metil-adenozin (m6A). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži N6-metil-adenozin (m6A) i 5-metil-citidin (m5C).
[0749] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) je uniformno modifikovan (npr. potpuno modifikovan, modifikovan duž cele sekvence) za određenu modifikaciju. Na primer, polinukleotid može biti uniformno modifikovan sa 5-metil-citidinom (m5C), što znači da su svi ostaci citozina u iRNK sekvenci zamenjeni sa 5-metil-citidinom (m5C). Slično, polinukleotid može biti uniformno modifikovan za bilo koji tip nukleozidnog ostatka koji je prisutan u sekvenci zamenom sa modifikovanim ostatkom kao što je bilo koji od onih koji su prethodno izneti.
2
[0750] U nekim aspektima, hemijski modifikovani nukleozidi u otvorenom okviru čitanja odabrani su iz grupe koja se sastoji od uridina, adenina, citozina, guanina, i bilo koje njihove kombinacije.
[0751] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani citozin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani citozin uključuju N4-acetil-citidin (ac4C), 5-metil-citidin (m5C), 5-halo-citidin (npr. 5-jodo-citidin), 5-hidroksimetil-citidin (hm5C), 1-metil-pseudoizocitidin, 2-tio-citidin (s2C), 2-tio-5-metil-citidin.
[0752] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani uridin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani uridin uključuju 5-cijano uridin ili 4'-tio uridin.
[0753] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani adenin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani adenin uključuju 7-deaza-adenin, 1-metiladenozin (m1A), 2-metil-adenin (m2A), N6-metil-adenin (m6A), i 2,6-diaminopurin.
[0754] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani guanin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani guanin uključuju inozin (I), 1-metil-inozin (m1I), viozin (imG), metilviozin (mimG), 7-deaza-guanozin, 7-cijano-7-deaza-guanozin (preQO), 7-aminometil-7-deaza-guanozin (preQ1), 7-metil-guanozin (m7G), 1-metilguanozin (m1G), 8-okso-guanozin, 7-metil-8-okso-guanozin.
[0755] U nekim aspektima, nukleotidi modifikovane nukleobaze u polinukleotidu (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) su 5-metoksiuridin.
[0756] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) modifikovane nukleobaze.
[0757] U nekim aspektima, najmanje 95% nukleobaza jednog tipa (npr. uracil) u polinukleotidu iz objave (npr. iRNK polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid) su modifikovane nukleobaze. U nekim aspektima, najmanje 95% uracila u polinukleotidu iz predmetne objave (npr. iRNK polinukleotid koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, i/ili OX40L polipeptid) je 5-metoksiuracil.
[0758] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 5-metoksiuridin (5mo5U) i 5-metil-citidin (m5C).
[0759] U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) je uniformno modifikovan (npr. potpuno modifikovan, modifikovan duž cele sekvence) za određenu modifikaciju. Na primer, polinukleotid može biti uniformno
2
modifikovan sa 5-metoksiuridinom, što znači da su suštinski svi ostaci uridina u iRNK sekvenci zamenjeni sa 5-metoksiuridinom. Slično, polinukleotid može biti uniformno modifikovan za bilo koji tip nukleozidnog ostatka koji je prisutan u sekvenci zamenom sa modifikovanim ostatkom kao što je bilo koji od onih koji su prethodno izneti.
[0760] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani citozin.
[0761] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani uracil. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani uracil uključuju 5-metoksiuracil.
[0762] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani adenin.
[0763] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani guanin.
[0764] U nekim aspektima, nukleobaze, šećer, okosnica, ili bilo koja njihova kombinacija u otvorenom okviru čitanja koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju, hemijski su modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%.
[0765] U nekim aspektima, nukleozidi uridina u otvorenom okviru čitanja koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju, hemijski su modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%.
[0766] U nekim aspektima, nukleozidi adenozina u otvorenom okviru čitanja koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju, hemijski su modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%.
[0767] ] U nekim aspektima, nukleozidi citidina u otvorenom okviru čitanja koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju, hemijski su modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%.
[0768] ] U nekim aspektima, nukleozidi guanozina u otvorenom okviru čitanja koji kodira IL-23 polipeptid, IL-36-gama polipeptid, IL-18 polipeptid, OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju, hemijski su modifikovani za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100%.
2 1
[0769] U nekim aspektima, polinukleotidi mogu uključivati bilo koji korisni linker između nukleozida. Takvi linkeri, uključujući modifikacije okosnice, koji su korisni u kompoziciji iz predmetne objave uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: 3'-alkilen fosfonati, 3'-amino fosforamidat, okosnice koje sadrže alkene, aminoalkilfosforamidate, aminoalkilfosfotriestre, boranofosfate, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-, -CH2-NH-CH2-, hiralne fosfonate, hiralne fosforotioate, formacetil i tioformacetil okosnice, metilen (metilimino), metilen formacetil i tioformacetil okosnice, metilenimino i metilenhidrazino okosnice, morfolino veze, -N(CH3)-CH2-CH2-, oligonukleozide sa heteroatom internukleozidnom vezom, fosfinate, fosforamidate, fosforoditioate, fosforotioat internukleozidne veze, fosforotioate, fosfotriestre, PNA, siloksan okosnice, sulfamat okosnice, sulfid sulfoksid i sulfon okosnice, sulfonat i sulfonamid okosnice, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre, i tionofosforamidate.
[0770] U nekim aspektima, modifikovane nukleobaze u polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili IL-18 polipeptid, polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji, odabrane su iz grupe koja se sastoji od 1-metil-pseudouridina (m1ψ), 5-metoksi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (ψ), α-tioguanozina i α-tio-adenozina. U nekim aspektima, polinukleotid uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr.2, 3, 4 ili više) od prethodno pomenutih modifikovanih nukleobaza.
[0771] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži pseudouridin (ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 1-metilpseudouridin (m1ψ). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži 1-metil-pseudouridin (m1ψ) i 5-metil-citidin (m5C).
[0772] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži 2-tiouridin, (s2U). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži
2 2
iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži 2-tiouridin i 5-metil-citidin (m5C).
[0773] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži metoksi-uridin (mo5U). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži 5-metoksi-uridin (mo5U) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2'-O-metil uridin.
[0774] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži 2'-O-metil uridin i 5-metil-citidin (m5C). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži N6-metil-adenozin (m6A). U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, sadrži N6-metil-adenozin (m6A) i 5-metil-citidin (m5C).
[0775] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, je uniformno modifikovan (npr. potpuno modifikovan, modifikovan duž cele sekvence) za određenu modifikaciju. Na primer, polinukleotid može biti uniformno modifikovan sa 5-metil-citidinom (m5C), što znači da su svi ostaci citozina u iRNK sekvenci zamenjeni sa 5-metil-citidinom (m5C). Slično, polinukleotid može biti uniformno modifikovan za bilo koji tip nukleozidnog ostatka koji je prisutan u sekvenci zamenom sa modifikovanim ostatkom kao što je bilo koji od onih koji su prethodno izneti.
2
[0776] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani citozin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani citozin uključuju N4-acetil-citidin (ac4C), 5-metil-citidin (m5C), 5-halo-citidin (npr. 5-jodo-citidin), 5-hidroksimetil-citidin (hm5C), 1-metil-pseudoizocitidin, 2-tio-citidin (s2C), 2-tio-5-metil-citidin.
[0777] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani uridin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani uridin uključuju 5-cijano uridin ili 4'-tio uridin.
[0778] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani adenin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani adenin uključuju 7-deaza-adenin, 1-metiladenozin (m1A), 2-metil-adenin (m2A), N6-metil-adenozin (m6A), i 2,6-diaminopurin.
[0779] U nekim aspektima, modifikovana nukleobaza je modifikovani guanin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani guanin uključuju inozin (I), 1-metil-inozin (m1I), viozin (imG), metilviozin (mimG), 7-deaza-guanozin, 7-cijano-7-deaza-guanozin (preQO), 7-aminometil-7-deaza-guanozin (preQ1), 7-metil-guanozin (m7G), 1-metilguanozin (m1G), 8-okso-guanozin, ili 7-metil-8-okso-guanozin.
[0780] Druge modifikacije koje mogu biti korisne u polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave navedeni su u TABELI 5.
Tabela 5. Tipovi dopunskih modifikacija
2 4
2
2
2
[0781] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave može uključivati bilo koji korisni linker između nukleozida. Takvi linkeri, uključujući modifikacije okoskice dati su u TABELI 6.
Tabela 6. Modifikacije linkera
2
[0782] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave, ili bilo koja njihova kombinacija, može uključivati bilo koju korisnu modifikaciju, kao što je šećer, nukleobaza, ili internukleozidna veza (npr. za vezujući fosfat / za fosfodiestarsku vezu / za fosfodiestarsku okosnicu). Jedan ili više atoma pirimidin nukleobaze mogu biti zamenjeni ili supstituisani sa opciono supstituisanim amino, opciono supstituisanim tiolom, opciono supstituisanim alkilom (npr. metil ili etil), ili halo (npr. hloro ili fluoro). U određenim aspektima, modifikacije (npr. jedna ili više modifikacija) prisutne su u svakom od šećera i internukleozidne veze. Modifikacije u skladu sa predmetnom objavom mogu biti modifikacije ribonukleinskih kiselina (RNK) u dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), treoza nukleinske kiseline (TNA), glikol nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA), zaključane nukleinske kiseline (LNA), heksitol nukleinske kiseline (HNA), ili njihove hibride. Dopunske modifikacije su ovde opisane. Modifikovane nukleinske kiseline i njihova sinteza objavljene su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052523 (videti takođe US20130115272).
[0783] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži
2
iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave, ili bilo koja njihova kombinacija, suštinski ne indukuju urođeni imunski odgovor ćelije u koju se introdukuje iRNK. Svojstva indukovanog urođenog imunskog odgovora uključuju 1) povećanu ekspresiju proinflamatornih citokina, 2) aktivaciju unutarćelijskih PRR (RIG-I, MDA5, itd. i/ili 3) terminaciju ili redukciju translacije proteina.
[0784] Bilo koji od regiona polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave, ili bilo koja njihova kombinacija, može se hemijski modifikovati kao što se ovde podučava ili kao što se podučava u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052523 (videti takođe US20130115272).
[0785] U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira IL-23, IL-36-gama, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid i/ili OX40L. U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira humani IL-23, IL-36-gama, IL18 i/ili OX40L.
[0786] U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izneta u TABELI 1. U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira polipeptid koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je izneta u TABELI 1.
[0787] U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave kodira najmanje jedan IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L mutant, fragment, ili njihovu varijantu, npr. IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L funkcionalni fragment od IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L.
[0788] U nekim aspektima, modifikovani polinukleotid, npr. iRNK koja sadrži najmanje jednu modifikaciju koja je ovde opisana, iz objave je odabran od sekvenci nukleinskih kiselina IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L koje su navedene u TABELI 1.
[0789] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, iRNK koja kodira IL-18 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L iz predmetne objave može takođe uključivati gradivne blokove polinukleotidnih molekula, npr. modifikovane ribonukleozide, i modifikovane ribonukleotide,. Na primer, ovi gradivni blokovi mogu biti korisni za pripremu polinukleotida iz objave. O takvim gradivnim blokovima se podučava u Međunarodnoj patentnoj publikaciji
2
br. WO2013052523 (videti takođe US20130115272) i Međunarodnoj prijavnoj publikaciji br. WO2014093924 (videti takođe US20150307542).
Modifikacije na šećeru
[0790] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi (npr. molekuli gradivni blokovi), koji se mogu inkorporisati u polinukleotid (npr. RNK ili iRNK, kao što je ovde opisano) koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid (npr. RNK ili iRNK, kao što je ovde opisano) koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, iRNK koja kodira IL-18 polipeptid ili polinukleotid (npr. RNK ili iRNK, kao što je ovde opisano) koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave, mogu se modifikovati na šećeru ribonukleinske kiseline.
[0791] Na primer, 2' hidroksilna grupa (OH) može biti modifikovana ili zamenjena brojnim različitim supstituenatima. Primeri supstitucija na 2'-poziciji uključuju, ali nisu ograničeni na, H, halo, opciono supstituisani C1-6alkil; opciono supstituisani C1-6alkoksi; opciono supstituisani C6-10ariloksi; opciono supstituisani C3-8cikloalkil; opciono supstituisani C3-8cikloalkoksi; opciono supstituisani C6-10ariloksi; opciono supstituisani C6-10aril-C1-6alkoksi, opciono supstituisani C1-12(heterociklil)oksi; šećer (npr. riboza, pentoza, ili bilo koji ovde opisan); polietilenglikol (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, gde je R H ili opciono supstituisani alkil, i n je ceo broj od 0 do 20 (npr. od 0 do 4, od 0 do 8, od 0 do 10, od 0 do 16, od 1 do 4, od 1 do 8, od 1 do 10, od 1 do 16, od 1 do 20, od 2 do 4, od 2 do 8, od 2 do 10, od 2 do 16, od 2 do 20, od 4 do 8, od 4 do 10, od 4 do 16, i od 4 do 20); "zaključane" nukleinske kiseline (LNA) u kojima je 2'-hidroksil spojen pomoću C1-6alkilenskog ili C1-6heteroalkilenskog mosta za 4'-ugljenik istog šećera riboze, gde su primeri mostova uključivali metilen, propilen, etar, ili amino mostove; aminoalkil, kao što je ovde definisano; aminoalkoksi, kao što je ovde definisano; amino kao što je ovde definisano; i amino-kiselinu, kao što je ovde definisano.
[0792] Generalno, RNK uključuje šećernu grupu ribozu, koja je 5-člani prsten koji ima kiseonik. Neograničavajući primeri modifikovanih nukleotida uključuju zamenu kiseonika u ribozi (npr. sa S, Se, ili alkilenom, kao što su metilen ili etilen); dodavanje dvostruke veze (npr. da zameni ribozu sa ciklopentenilom ili cikloheksenilom); kontrakciju prstena riboze (npr. da se formira 4-člani prsten od ciklobutana ili oksetana); ekspanziju prstena riboze (npr. da se formira 6- ili 7-člani prsten koji ima dodatni ugljenik ili heteroatom, kao što je za anhidroheksitol, altritol, manitol, cikloheksanil, cikloheksenil, i morfolino koji takođe ima
2 1
fosforamidatnu okosnicu); multiciklične oblike (npr. triciklo; i "otključani" oblici, kao što je glikol nukleinska kiselina (GNA) (npr. R-GNA ili S-GNA, gde je riboza zamenjena jedinicama glikola prikačenim za fosfodiestarske veze), treoza nukleinsku kiselinu (TNA), gde je riboza zamenjena sa α-L-treofuranozil-(3'→2')), i peptidnu nukleinsku kiselinu (PNA, gde 2-amino-etil-glicin veze zamenjuju ribozu i fosfodiestarsku okosnicu). Grupa šećera takođe može da sadrži jedan ili više ugljenika koji poseduju suprotnu stereohemijsku konfiguraciju od one odgovarajućeg ugljenika u ribozi. Stoga, polinukleotidni molekul može uključivati nukleotide koji sadrže, npr. arabinozu, kao šećer. O takvim modifikacijama šećera podučava se u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052523 (videti takođe US20130115272) i Međunarodnoj prijavnoj publikaciji br. WO2014093924 (videti takođe US20150307542).
Kombinacije modifikovanih šećera, nukleobaza, i internukleozidnih veza
[0793] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, može uključivati kombinaciju modifikacija šećera, nukleobaze, i/ili internukleozidne veze. Ove kombinacije mogu uključivati bilo koju jednu ili više modifikacija koje su ovde opisane.
[0794] Primeri modifikovanih nukleotida i kombinacija modifikovanih nukleotida obezbeđeni su u nastavku u TABELI 7. Ove kombinacije modifikovanih nukleotida mogu se upotrebljavati za formiranje polinukleotida iz objave. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, modifikovani nukleotidi mogu potpuno supstituisati prirodne nukleotide polinukleotida iz pronalaska. Kao neograničavajući primer, prirodni nukleotid uridin može biti supstituisan sa modifikovanim nukleozidom koji je ovde opisan. U sledećem neograničavajućem primeru, prirodni nukleotid uridin može biti delimično supstituisan (npr. oko 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99,9%) sa najmanje jednim od modifikovanih nukleozida koji su ovde objavljeni. Bilo koja kombinacija baza/šećer ili linker može biti inkorporisana u polinukleotide iz objave i o takvim modifikacijama se podučava u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052523 (videti takođe US20130115272) i Međunarodnoj prijavnoj publikaciji br. WO2014093924 (vidi takođe US20150307542).
2 2
Tabela 7. Kombinacije
2
[0795] Dopunski primeri modifikovanih nukleotida i kombinacija modifikovanih nukleotida obezbeđeni su u nastavku u TABELI 8.
Tabela 8. Dopunske kombinacije
2 4
2
2
2
2
2
1
2
4
XII. Farmaceutske kompozicije: formulacija, primena, isporuka i doziranje
[0796] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koju od kompozicija koje su ovde objavljene, npr. prvi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira prvi protein koji sadrži IL-23 polipeptid, drugi polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira drugi protein koji sadrži IL-36-gama, ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili treći polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira treći protein, pri čemu treći protein sadrži OX40L polipeptid kao što je opisano ovde na drugom mestu.
[0797] U nekim aspektima objave, polinukleotidi su formulisani u kompozicijama i kompleksima u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Farmaceutske kompozicije mogu opciono da sadrže jednu ili više dopunskih aktivnih supstanci, npr. terapijski i/ili profilaktički aktivne supstance. Farmaceutske kompozicije iz predmetne objave mogu biti sterilne i/ili bez pirogena. Opšta razmatranja u vezi sa formulacijom i/ili proizvodnjom farmaceutskih agenasa mogu se pronaći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
[0798] U nekim aspektima, kompozicije se primenjuju ljudima, humanim pacijentima ili subjektima. U svrhe predmetne objave, fraza "aktivni sastojak" generalno označava polinukleotide koji se isporučuju kao što je ovde opisano.
[0799] Iako su opisi farmaceutskih kompozicija koji su ovde obezbeđeni uglavnom usmereni na farmaceutske kompozicije koje su pogodne za primenu ljudima, stručnjak sa iskustvom će razumeti da su takve kompozicije generalno pogodne za primenu bilo kojoj drugoj životinji, npr. ne-humanim životinjama, npr. ne-humanim sisarima. Modifikacija farmaceutskih kompozicija pogodnih za primenu ljudima kako bi se kompozicije učinile pogodnim za primenu različitim životinjama je dobro shvaćena, a veterinarski farmakolog sa prosečnim iskustvom može da dizajnira i/ili izvrši takvu modifikaciju sa običnim, ukoliko ikakvim, eksperimentisanjem. Subjekti kojima se razmatra primena farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude i/ili druge primate; sisare.
[0800] U nekim aspektima, polinukleotid iz predmetne objave je formulisan za subkutanu, intravensku, intraperitonealnu, intratumorsku, intramuskularnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intralezijsku, intrakranijalnu, intraventrikularnu, oralnu, inhalacionim sprejem, topikalnu, rektalnu, nazalnu, bukalnu, vaginalnu, intratumorsku, ili implantiranim rezervoarom intramuskularnu, subkutanu, intratumorsku, ili intradermalnu isporuku. U drugim aspektima, polinukleotid je formulisan za intratumorsku, intraperitonealnu, ili intravensku isporuku. U posebnim aspektima, polinukleotid iz predmetne objave je formulisan za intratumorsku isporuku.
[0801] Formulacije farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane mogu biti pripremljene bilo kojim postupkom koji je poznat ili od sada razvijen u farmakologiji. Generalno, takvi pripremni postupci uključuju korak dovođenja aktivnog sastojka u asocijaciju sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka, i zatim, ukoliko je potrebno i/ili poželjno, podelu, oblikovanje i/ili pakovanje proizvoda u željenu jedinicu sa jednom ili više doza.
[0802] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, i/ili bilo kojih dopunskih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa objavom će varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine, i/ili stanja subjekta koji se leči i dodatno u zavisnosti od puta kojim se kompozicija primenjuje. Putem primera, kompozicija može da sadrži između 0,1% i 100%, npr. između 0,5% i 50%, između 1% i 30%, između 5% i 80%, ili najmanje 80% (tež./tež.) aktivnog sastojka.
Formulacije
[0803] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz objave može se formulisati upotrebom jednog ili više ekscipijenasa.
[0804] Funkcija jednog ili više ekscipijenasa je, npr. da: (1) povećaju stabilnost; (2) povećaju transfekciju ćelija; (3) dozvole produženo ili odloženo oslobađanje (npr. iz depo formulacije polinukleotida); (4) izmene biodistribuciju (npr. ciljaju polinukleotid na specifična tkiva ili tipove ćelija); (5) povećaju translaciju kodiranog proteina in vivo; i/ili (6) izmene profil oslobađanja kodiranog proteina in vivo. Pored tradicionalnih ekscipijenasa kao što su bilo koji i svi rastvarači, disperzioni medijumi, razblaživači, ili drugi tečni vehikulumi, pomoćna sredstva za disperziju ili suspenziju, površinski aktivni agensi, izotonični agensi, agensi za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervansi, ekscipijensi iz predmetne objave mogu uključivati, bez ograničenja, lipidoide, lipozome, lipidne nanočestice, polimere, lipoplekse, jezgro-omotač nanočestice, peptide, proteine, ćelije transfektovane sa polinukleotidima (npr. za transplantaciju u subjekta), hijaluronidazu, mimike nanočestica i njihove kombinacije. U skladu sa tim, formulacije iz pronalaska mogu uključivati jedan ili više ekscipijenasa, svaki u količini koja zajedno povećava stabilnost polinukleotida, povećava ćelijsku transfekciju polinukleotidom, povećava ekspresiju proteina kodiranih polinukleotidima, i/ili menja profil oslobađanja proteina koji su kodirani polinukleotidom. Dodatno, polinukleotidi iz predmetne objave mogu se formulisati upotrebom samo-asemblirajućih nanočestica nukleinske kiseline.
[0805] Formulacije farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane mogu biti pripremljene bilo kojim postupkom koji je poznat ili od sada razvijen u farmakologiji. Generalno, takvi pripremni postupci uključuju korak asociranja aktivnog sastojka sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka.
[0806] Farmaceutska kompozicija u skladu sa predmetnom objavom može se pripremiti, upakovati, i/ili prodati na veliko, kao pojedinačna jedinična doza, i/ili kao više pojedinačnih jediničnih doza. Kao što se ovde upotrebljava, "jedinična doza" označava diskretnu količinu farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka je generalno jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi bila primenjena subjektu i/ili pogodnom delu takve doze kao što je, na primer, jedna polovina ili jedna trećina takve doze.
[0807] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, i/ili bilo kojih dopunskih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa predmetnom objavom mogu varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine, i/ili stanja subjekta koji se leči i dodatno u zavisnosti od puta kojim se kompozicija primenjuje. Na primer, kompozicija može da sadrži između 0,1% i 99% (tež./tež.) aktivnog sastojka. Putem primera, kompozicija može da sadrži između 0,1% i 100%, npr. između 0,5 i 50%, između 1-30%, između 5-80%, najmanje 80% (tež./tež.) aktivnog sastojka.
[0808] U nekim aspektima, formulacije koje su ovde opisane sadrže najmanje jedan polinukleotid. Kao neograničavajući primer, formulacije sadrže 1, 2, 3, 4 ili 5 polinukleotida. U drugim aspektima, polinukleotid iz objave je formulisan za intratumorsku isporuku u tumor pacijenta kome je to potrebno.
[0809] Farmaceutske formulacije mogu dopunski sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kao što se ovde upotrebljava, uključuje, ali nije ograničen na, bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, pomoćna sredstva za disperziju ili suspenziju, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervanse, i slično, kako je pogodno za određeni željeni dozni oblik. Različiti ekscipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija i tehnike za pripremu kompozicije su poznati u struci (videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Upotreba konvencionalnog ekscipijensnog medijuma može se razmatrati unutar obima predmetne objave, osim u meri u kojoj je bilo koji konvencionalni ekscipijensni medijum
1
nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, kao što je da proizvodi bilo kakav neželjeni biološki efekat ili na drugi štetan način interaguje sa bilo kojom drugom komponentom(ama) farmaceutske kompozicije.
[0810] U nekim aspektima, veličina čestica lipidnih nanočestica je povećana i/ili smanjena. Promena veličine čestica može pomoći u suzbijanju biološke reakcije kao što je, ali ne ograničavajući se na, inflamaciju ili može povećati biološki efekat modifikovane iRNK isporučene sisarima.
[0811] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se upotrebljavaju u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, konzervanse, agense za puferisanje, agense za lubrikaciju, i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu se opciono uključiti u farmaceutske formulacije iz objave.
[0812] U nekim aspektima, polinukleotidi se primenjuju u ili sa, formulisani u ili isporučeni sa nanostrukturama koje mogu da sekvestriraju molekule kao što je holesterol. Neograničavajući primeri ovih nanostruktura i postupci pravljenja ovih nanostruktura opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130195759. Primeri struktura ovih nanostruktura su pokazani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130195759, i mogu uključivati jezgro i omotač koji okružuje jezgro.
Lipidoidi
[0813] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid može se formulisati sa lipidoidima. Sinteza lipidoida je opširno opisana i formulacije koje sadrže ova jedinjenja su naročito pogodne za isporuku polinukleotida (videti Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2011 108:12996-3001).
[0814] Dok su ovi lipidoidi upotrebljavani za efikasnu isporuku dvolančanih malih interferirajućih RNK molekula kod glodara i ne-humanihih primata (videti Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105:11915-11920; Akinc et al., Mol Ther. 200917:872-879; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010), predmetna objava opisuje njihovu formulaciju i upotrebu u isporučivanju polinukleotida.
11
[0815] Kompleksi, micele, lipozomi ili čestice mogu se pripremiti tako da sadrže ove lipidoide i prema tome, mogu rezultovati efikasnom isporukom polinukleotida, kao što se sudi po proizvodnji kodiranog proteina, nakon injekcije lipidoidne formulacije putem lokalizovanih i/ili sistemskih puteva primene. Lipidoidni kompleksi polinukleotida mogu se primenjivati na različite načine uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravenske, intraperitonealne, intratumorske, intramuskularne, ili subkutane puteve.
[0816] Na in vivo isporuku nukleinskih kiselina mogu uticati mnogi parametri, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kompoziciju formulacije, prirodu PEGilacije čestica, stepen punjenja, odnos polinukleotida prema lipidu, i biofizičke parametre kao što je, ali ne ograničavajući se na, veličina čestica (Akinc et al., Mol Ther. 200917:872-879). Na primer, male promene u dužini sidrenog lanca poli(etilen glikol) (PEG) lipida mogu rezultovati značajnim efektima na efikasnost in vivo.
[0817] Formulacije sa različitim lipidoidima, uključujući, ali ne ograničavajući se na penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilentetramin hidrohlorid (TETA-5LAP; takođe poznat kao 98N12-5, videti Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (uključujući derivate i varijante), i MD1, mogu se testirati na aktivnost in vivo.
[0818] Lipidoid koji se ovde označava kao "98N12-5" objavili su Akinc et al., Mol Ther. (2009) 17:872-879.
[0819] Lipidoid koji se ovde označava kao "C12-200" objavili su Love et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2010) 107:1864-1869 i Liu i Huang (2010) Molecular therapy. 2010: 669-670. Lipidoidne formulacije mogu uključivati čestice koje sadrže bilo 3 ili 4 ili više komponenti pored polinukleotida.
[0820] Lipidoidi i polinukleotidne formulacije koje sadrže lipidoide opisane su u Međunarodnoj prijavnoj publikaciji br. WO2014093924 (videti takođe US20150307542).
Lipozomi, lipopleksi, i lipidne nanočestice
[0821] Polinukleotidi iz objave mogu se formulisati upotrebom jednog ili više lipozoma, lipopleksa, ili lipidnih nanočestica. U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid uključuju lipozome. Lipozomi su veštački pripremljene vezikule koje se prvenstveno mogu sastojati od lipidnog dvosloja i mogu se upotrebljavati kao vehikulum za isporuku za primenu
12
farmaceutskih formulacija. Lipozomi mogu biti različitih veličina, kao što su, ali ne ograničavajući se na, multilamelarnu vezikulu (MLV) koja može imati stotine nanometara u prečniku i može sadržati niz koncentričnih dvoslojeva razdvojenih uskim vodenim kompartmentima, malu jednoćelijsku vezikulu (SUV) koja može biti manja od 50 nm u prečniku, i veliku unilamelarnu vezikulu (LUV) koja može biti između 50 i 500 nm u prečniku. Dizajn lipozoma može uključivati, ali nije ograničen na, opsonine ili ligande kako bi se poboljšalo prikačinjanje lipozoma za nezdravo tkivo ili kako bi se aktivirali događaji kao što je, ali ne ograničavajući se na, endocitozu. Lipozomi mogu da sadrže nisku ili visoku pH kako bi se poboljšala isporuka farmaceutskih formulacija.
[0822] Formiranje lipozoma može zavisiti od fizičko-hemijskih karakteristika kao što su, ali ne ograničavajući se na, zarobljenu farmaceutsku formulaciju i lipozomske sastojke, prirodu medijuma u kom su lipidne vezikule dispergovane, efikasnu koncentraciju zarobljene supstance i njenu potencijalnu toksičnost, sve dodatne postupke uključene tokom primene i/ili isporuke vezikula, optimizovanu veličinu, polidisperzivnost i vek trajanja vezikula za predviđenu primenu, kao i reproducibilnost od serije do serije i mogućnost proizvodnje u velikoj razmeri bezbednih i efikasnih lipozomskih proizvoda.
[0823] Kao neograničavajući primer, lipozomi kao što su vezikule sa sintetičkom membranom pripremaju se postupcima, aparatima i uređajima koji su opisani u S.A.D. patentnim publikacijama br. US20130177638, US20130177637, US20130177636, US20130177635, US20130177634, US20130177633, US20130183375, US20130183373 i US20130183372.
[0824] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane uključuju, bez ograničenja, lipozome kao što su oni formirani od 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DODMA) lipozoma, DiLa2 lipozoma iz Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2- dilinoleiloksi-3-dimetilaminopropana (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), i MC3 (kao što je opisano u US20100324120) i lipozome koji mogu da isporuče lekove malog molekula kao što je, ali ne ograničavajući se na, DOXIL<®>od Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).
[0825] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu uključivati, bez ograničenja, lipozome kao što su oni koji su formirani sintezom stabilizovanih plazmidlipid čestica (SPLP) ili stabilizovanih nukleinska kiselina-lipidnih čestica (SNALP) koje su prethodno opisane i pokazano je da su pogodne za isporuku oligonukleotida in vitro i in vivo (videti Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281; Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447; Jeffs et al. Pharm Res.2005 22:362-372; Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005
1
2:1002-1007; Zimmermann et al., Nature. 2006 441:111-114; Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287; Semple et al. Nature Biotech.2010 28:172-176; Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 200819:125-132; S.A.D. patentna publikacija br. US20130122104). Originalni postupak proizvodnje od Wheeler et al. je bio postupak dijalize deterdžentom, koji su kasnije poboljšali Jeffs et al. i označava se kao postupak spontanog formiranja vezikula. Formulacije lipozoma sačinjene su od 3 do 4 lipidne komponente pored polinukleotida. Kao primer lipozom može da sadrži, ali nije ograničeno na, 55% holesterola, 20% disteroilfosfatidil holina (DSPC), 10% PEG-S-DSG, i 15% 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA), kao što su opisali Jeffs et al. Kao sledeći primer, određene formulacije lipozoma sadrže, ali nisu ograničene na, 48% holesterola, 20% DSPC, 2% PEG-c-DMA, i 30% lipida koji se može jonizovati, gde lipid koji se može jonizovati može biti 1,2-distearloksi-N,N-dimetilaminopropan (DSDMA), DODMA, DLin-DMA, ili 1,2-dilinoleniloksi-3-dimetilaminopropan (DLenDMA), kao što su opisali Heyes et al.
[0826] U nekim aspektima, formulacije lipozoma sadrže od oko 25,0% holesterola do oko 40,0% holesterola, od oko 30,0% holesterola do oko 45,0% holesterola, od oko 35,0% holesterola do oko 50,0% holesterola i/ili od oko 48,5% holesterola do oko oko 60% holesterola. U drugim aspektima, formulacije sadrže procenat holesterola koji je odabran iz grupe koja se sastoji od 28,5%, 31,5%, 33,5%, 36,5%, 37,0%, 38,5%, 39,0% i 43,5%. U nekim aspektima, formulacije sadrže od oko 5,0% do oko 10,0% DSPC i/ili od oko 7,0% do oko 15,0% DSPC.
[0827] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije uključuju lipozome koji su formirani da isporuče polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Polinukleotidi mogu biti inkapsulirani lipozomom i/ili mogu biti sadržani u vodenom jezgru koje zatim može biti inkapsulirano lipozomom. Videti Međunarodne publikacije br. WO2012031046 (videti takođe US20130189351), WO2012031043 (videti takođe US20130202684), WO2012030901 (videti takođe US20130195969) i WO2012006378 (videti takođe US20130171241) i S.A.D. patentne publikacije br. US20130189351, US20130195969 i US20130202684).
[0828] U sledećem aspektu, lipozomi su formulisani za ciljanu isporuku. Kao neograničavajući primer, lipozom je formulisan za ciljanu isporuku u jetru. Lipozom koji se upotrebljava za ciljanu isporuku može uključivati, ali nije ograničen na, lipozome koji su
14
opisani u i postupke pravljenja lipozoma koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130195967.
[0829] U sledećem aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u katjonskoj emulziji ulje u vodi gde čestica emulzije sadrži uljano jezgro i katjonski lipid koji može da interaguje sa polinukleotidom koji usidrava molekul za česticu emulzije. Videti Međunarodnu pub. br. WO2012006380 (videti takođe US20160256541).
[0830] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u emulziji voda u ulju koja sadrži kontinuiranu hidrofobnu fazu u kojoj je hidrofilna faza dispergovana. Kao neograničavajući primer, emulzija se može napraviti pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013087791 (videti takođe US20140294904).
[0831] U sledećem aspektu, lipidna formulacija uključuje najmanje lipid koji se može jonizovati, lipid koji može da poboljša transfekciju i najmanje jedan lipid koji sadrži hidrofilnu glavenu grupu povezanu za lipidnu funkcionalnu grupu. Videti Međunarodnu publ. br. WO2011076807 i S.A.D. publ. br. 20110200582. U sledećem aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipidnoj vezikuli koja može imati unakrsne veze između funkcionalizovanih lipidnih dvoslojeva (videti S.A.D. publ. br.20120177724).
[0832] U jednom aspektu, polinukleotidi su formulisani u lipozomu kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013086526 (videti takođe US20140356416). Polinukleotidi se mogu inkapsulirati u lipozomu upotrebom reverznih pH gradijenata i/ili optimizovanih internih puferskih kompozicija kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013086526.
[0833] U jednom aspektu, polinukleotidne farmaceutske kompozicije su formulisane u lipozomima kao što su, ali ne ograničavajući se na, DiLa2 lipozomi (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES<®>(Marina Biotech, Bothell, WA), na neutralnom DOPC (1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfoholin) bazirane lipozome (npr. siRNA isporuka za kancer jajnika (Landen et
1
al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713)) i lipozome obložene hijaluronanom (Quiet Therapeutics, Izrael).
[0834] U jednom aspektu, katjonski lipid je katjonski lipid male molekulske težine, kao što su oni koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavi br. 20130090372. U sledećem aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipidnoj vezikuli koja može imati unakrsne veze između funkcionalizovanih lipidnih dvoslojeva.
[0835] U drugim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipozomu koji sadrži katjonski lipid. Lipozom može imati molski odnos atoma azota u katjonskom lipidu prema fosfatima u polinukleotidu (N:P odnos) između 1:1 i 20:1 kao što je opisano u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013006825. U sledećem aspektu, lipozom može imati N:P odnos veći od 20:1 ili manji od 1:1.
[0836] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipid-polikatjon kompleksu. Formiranje lipid-polikatjon kompleksa može se postići postupcima koji su poznati u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. publ. br. 20120178702. Kao neograničavajući primer, polikatjon uključuje katjonski peptid ili polipeptid kao što su, ali ne ograničavajući se na, polilizin, poliornitin i/ili poliarginin i katjonske peptide koji su opisani u Međunarodnoj publ. br. WO2012013326 ili S.A.D. patentnoj publ. br. US20130142818. U sledećem aspektu, polinukleotidi su formulisani u lipid-polikatjon kompleksu koji dodatno može uključivati nekatjonski lipid kao što je, ali ne ograničavajući se na, holesterol ili dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE).
[0837] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u aminoalkoholnom lipidoidu. Aminoalkoholni lipidoidi koji se mogu upotrebljavati u predmetnoj objavi mogu se pripremiti postupcima koji su opisani u S.A.D. patentu br.8,450,298.
1
[0838] Na formulaciju lipozoma može uticati, ali nije ograničeno na, odabir komponente lipida koji se može jonizovati, stepen zasićenosti lipida koji se može jonizovati, priroda PEGilacije, odnos svih komponenti i biofizički parametri kao što je veličina. U jednom primeru od Semple et al. (Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176), formulacija lipozoma je bila sačinjena od 57,1% lipida koji se može jonizovati, 7,1% dipalmitoilfosfatidilholina, 34,3% holesterola, i 1,4% PEG-c-DMA. Kao sledeći primer, promena kompozicije lipida koji se može jonizovati mogla bi efikasnije da isporuči siRNA u različite antigen-prezentujuće ćelije (Basha et al. Mol Ther. 2011 19:2186-2200). U nekim aspektima, formulacije lipozoma sadrže od oko 35 do oko 45% lipida koji se može jonizovati, od oko 40% do oko 50% lipida koji se može jonizovati, od oko 50% do oko 60% lipida koji se može jonizovati i/ili od oko 55% do oko 65% lipida koji se može jonizovati. U nekim aspektima, odnos lipida prema iRNK u lipozomima je od oko 5:1 do oko 20:1, od oko 10:1 do oko 25:1, od oko 15:1 do oko 30:1 i/ili najmanje 30:1.
[0839] U nekim aspektima, odnos PEG u formulacijama lipidnih nanočestica (LNP) je povećan ili smanjen i/ili dužina ugljeničnog lanca PEG lipida je modifikovana sa C14 na C18 kako bi se izmenila farmakokinetika i/ili biodistribucija LNP formulacija. Kao neograničavajući primer, LNP formulacije sadrže od oko 0,5% do oko 3,0%, od oko 1,0% do oko 3,5%, od oko 1,5% do oko 4,0%, od oko 2,0% do oko 4,5%, od oko 2,5% do oko 5,0% i/ili od oko 3,0% do oko 6,0% molskog odnosa lipida PEG-c-DOMG (R-3-[(ω-metoksipoli(etilenglikol)2000)karbamoil)]-1,2-dimiristiloksipropil-3-amin) (koji se ovde takođe označava kao PEG-DOMG) u poređenju sa lipidom koji se može jonizovati, DSPC i holesterolom. U sledećem aspektu, PEG-c-DOMG može biti zamenjen sa PEG lipidom kao što su, ali bez ograničenja na, PEG-DSG (1,2-distearoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol), PEG-DMG (1,2-dimiristoil-sn-glicerol) i/ili PEG-DPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol). Lipid koji se može jonizovati može biti odabran od bilo kog lipida koji je poznat u struci, kao što su, ali bez ograničenja na, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 i DLin-KC2-DMA.
[0840] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipidnoj nanočestici kao što su one koje su opisane u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012170930 (videti takođe US20140294938).
[0841] U sledećem aspektu, formulacija koja sadrži polinukleotid(e) je nanočestica koja može da sadrži najmanje jedan lipid. Lipid može biti odabran od, ali nije ograničen na, DLin-DMA,
1
DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, PEGilovane lipide i aminoalkoholne lipide. U sledećem aspektu, lipid je katjonski lipid kao što su, ali bez ograničenja na, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA i aminoalkoholne lipide. Aminoalkoholni katjonski lipidi mogu biti lipidi koji su opisani u i/ili napravljeni postupcima koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130150625. Kao neograničavajući primer, katjonski lipid može biti 2-amino-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-{[(9Z,2Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 1 u US20130150625); 2-amino-3-[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]-2-{[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 2 u US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-[(oktiloksi)metil]propan-1-ol (Jedinjenje 3 u US20130150625); i 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-{[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 4 u US20130150625); ili bilo koja njihova farmaceutski prihvatljiva so ili stereoizomer.
[0842] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutske kompozicije sa povoljnim svojstvima. Posebno, predmetna prijava obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže:
(i) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid; ili,
(ii) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid; ili,
(iii) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid; ili,
(iv) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid; ili,
(v) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid; ili
(vi) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid; i,
(b) agens za isporuku.
1
[0843] U nekim aspektima, agens za isporuku sadrži jedinjenje koje ima formulu (I)
pri čemu
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od karbocikla, heterocikla, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -
N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -
N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i - C(R)N(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
1
svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njegove soli ili stereoizomere.
[0844] U nekim aspektima, podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima je R1odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od karbocikla, heterocikla, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, i -C(R)N(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13.
2
ili njihove soli ili stereoizomere, pri čemu alkil i alkenil grupe mogu biti linearne ili razgranate.
[0845] U nekim aspektima, podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima kada je R4-(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, ili -CQ(R)2, onda (i) Q nije -N(R)2kada je n 1, 2, 3, 4 ili 5, ili (ii) Q nije 5, 6, ili 7-člani heterocikloalkil kada je n 1 ili 2.
[0846] U sledećim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5-do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -
N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -
N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i 5- do 14-članog heterocikloalkila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S koji je supstituisan sa jednim ili više supstituenata koji su odabrani od okso (=O), OH, amino, i C1-3alkila, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
21
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0847] U sledećim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5-do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, - i 5- do 14-članog heterocikloalkila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S koji je supstituisan sa jednim ili više supstituenata koji su odabrani od okso (=O), OH, amino, i C1-3alkila, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
22
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0848] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5-do 14-članog heterocikla koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -
N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -
N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i -C(=NR9)N(R)2, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; i kada je Q odabrano od 5- do 14-članog heterocikla i (i) R4je -(CH2)nQ u kome je n 1 ili 2, ili (ii) R4je -(CH2)nCHQR u kome je n 1, ili (iii) R4je -CHQR, i -CQ(R)2, tada je Q bilo 5- do 14-člani heteroaril ili 8- do 14-člani heterocikloalkil;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
2
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0849] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5-do 14-članog heterocikla koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; i kada je Q 5- do 14-člani heterocikl i (i) R4je -(CH2)nQ u kome je n 1 ili 2, ili (ii) R4je -(CH2)nCHQR u kome je n 1, ili (iii) R4je -CHQR, i -CQ(R)2, tada je Q bilo 5- do 14-člani heteroaril ili 8- do 14-člani heterocikloalkil;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
24
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0850] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5-do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -
N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -
N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i -C(=NR9)N(R)2, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
2
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0851] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5-do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
2
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0852] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C2-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je -(CH2)nQ ili -(CH2)nCHQR, gde je Q -N(R)2, i n je odabrano od 3, 4, i 5; svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C1-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0853] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
2
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C2-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je -(CH2)nQ ili -(CH2)nCHQR, gde je Q -N(R)2, i n je odabrano od 3, 4, i 5; svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C1-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0854] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q -N(R)2, i n je odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
2
M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C1-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0855] U još nekim aspektima, sledeći podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R';
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4 je odabran iz grupe koja se sastoji od -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q -N(R)2, i n je odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H;
svaki R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C1-12alkenila;
2
svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihove soli ili stereoizomere.
[0856] U određenim aspektima, podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona Formule (IA):
ili njihovu so ili stereoizomer, pri čemu je l odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; m je odabrano od 5, 6, 7, 8, i 9; M1je veza ili M'; R4je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je Q OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroaril ili heterocikloalkil; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0857] U nekim aspektima, podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona Formule (IA), ili njihovu so ili stereoizomer,
pri čemu
l je odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
m je odabrano od 5, 6, 7, 8, i 9;
M1je veza ili M';
R4 je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je Q OH, -NHC(S)N(R)2, ili -NHC(O)N(R)2;
M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0858] U određenim aspektima, podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona Formule (II):
ili njihovu so ili stereoizomer, pri čemu je l odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; M1je veza ili M'; R4je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n 2, 3, ili 4, i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroaril ili heterocikloalkil; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0859] U nekim aspektima, podskup jedinjenja Formule (I) uključuje ona Formule (II), ili njihovu so ili stereoizomer, pri čemu
l je odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5;
M1je veza ili M';
R4 je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n 2, 3, ili 4, i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, ili -NHC(O)N(R)2;
M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, aril grupe, i heteroaril grupe; i
R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0860] U nekim aspektima, jedinjenje formule (I) je formule (IIa),
ili njegova so, pri čemu je R4kao što je prethodno opisano.
[0861] U nekim aspektima, jedinjenje formule (I) je formule (IIb),
1
ili njegova so, pri čemu je R4kao što je prethodno opisano.
[0862] U nekim aspektima, jedinjenje formule (I) je formule (IIc),
ili njegova so, pri čemu je R4kao što je prethodno opisano.
[0863] U nekim aspektima, jedinjenje formule (I) je formule (IIe),
ili njegova so, pri čemu je R4kao što je prethodno opisano.
[0864] U nekim aspektima, jedinjenje formule (IIa), (IIb), (IIc), ili (IIe) sadrži R4koji je odabran od -(CH2)nQ i -(CH2)nCHQR, pri čemu su Q, R i n kao što je prethodno definisano.
[0865] U nekim aspektima, Q je odabran iz grupe koja se sastoji od -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R), i heterocikla, pri čemu je R kao što je prethodno definisano. U nekim aspektima, n je 1 ili 2. U nekim aspektima, Q je OH, -NHC(S)N(R)2, ili -NHC(O)N(R)2.
[0866] U nekim aspektima, jedinjenje formule (I) je formule (IId),
2
ili njegova so, pri čemu su R2i R3nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od C5-14alkila i C5-14alkenila, n je odabrano od 2, 3, i 4, i R', R", R5, R6i m su kao što je prethodno definisano.
[0867] U nekim aspektima jedinjenja formule (IId), R2je C8alkil. U nekim aspektima jedinjenja formule (IId), R3je C5-C9alkil. U nekim aspektima jedinjenja formule (IId), m je 5, 7, ili 9. U nekim aspektima jedinjenja formule (IId), svaki R5je H. U nekim aspektima jedinjenja formule (IId), svaki R6je H.
[0868] U sledećem aspektu, predmetna prijava obezbeđuje lipidnu kompoziciju (npr. lipidne nanočestice (LNP)) koja sadrži: (1) jedinjenje koje ima formulu (I); (2) opciono pomoćni lipid (npr. fosfolipid); (3) opciono strukturni lipid (npr. sterol); (4) opciono lipidni konjugat (npr. PEG-lipid); i (5) opciono jedinjenje kvaternarnog amina. U primerima aspekata, lipidna kompozicija (npr. LNP) dodatno sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihovu kombinaciju, npr. polinukleotid ili polinukleotide inkapsulirane u njoj.
[0869] U jednom posebnom aspektu, lipidna kompozicija (npr. LNP) dodatno sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U sledećem posebnom aspektu, lipidna kompozicija (npr. LNP) dodatno sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.
[0870] Kao što se ovde upotrebljava, termin "alkil" ili "alkil grupa" označava linearni ili razgranati, zasićeni ugljovodonik koji uključuje jedan ili više atoma ugljenika (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest, dvadeset, ili više atoma ugljenika).
[0871] Oznaka "C1-14alkil" označava linearni ili razgranati, zasićeni ugljovodonik koji uključuje 1-14 atoma ugljenika. Alkil grupa može biti opciono supstituisana.
[0872] Kao što se ovde upotrebljava, termin "alkenil" ili "alkenil grupa" označava linearni ili razgranati ugljovodonik koji uključuje dva ili više atoma ugljenika (npr. dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest, dvadeset, ili više atoma ugljenika) i najmanje jednu dvostruku vezu.
[0873] Oznaka "C2-14alkenil" označava linearni ili razgranati ugljovodonik koji uključuje 2-14 atoma ugljenika i najmanje jednu dvostruku vezu. Alkenil grupa može uključivati jednu, dve, tri, četiri, ili više dvostrukih veza. Na primer, C18alkenil može uključivati jednu ili više dvostrukih veza. C18alkenil grupa koja uključuje dve dvostruke veze može biti linoleil grupa. Alkenil grupa može biti opciono supstituisana.
[0874] Kao što se ovde upotrebljava, termin "karbocikl" ili "karbociklična grupa" označava mono- ili multiciklični sistem koji uključuje jedan ili više prstenova atoma ugljenika. Prstenovi mogu biti tro, četvoro, peto, šesto, sedmo, osmo, deveto, deseto, jedanaesto, dvanaesto, trinaesto, četrnaesto, ili petnaesto-člani prstenovi.
[0875] Oznaka "C3-6karbocikl" označava karbocikl koji uključuje jedan prsten koji ima 3-6 atoma ugljenika. Karbocikli mogu uključivati jednu ili više dvostrukih veza i mogu biti aromatični (npr. aril grupe). Primeri karbocikla uključuju ciklopropil, ciklopentil, cikloheksil, fenil, naftil, i 1,2-dihidronaftil grupe. Karbocikli mogu biti opciono supstituisani.
[0876] Kao što se ovde upotrebljava, termin "heterocikl" ili "heterociklična grupa" označava mono- ili multiciklični sistem koji uključuje jedan ili više prstenova, gde najmanje jedan prsten uključuje najmanje jedan heteroatom. Heteroatomi mogu biti, na primer, atomi azota, kiseonika, ili sumpora. Prstenovi mogu biti tro, četvoro, peto, šesto, sedmo, osmo, deveto, deseto, jedanaesto, ili dvanaesto-člani prstenovi. Heterocikli mogu uključivati jednu ili više dvostrukih veza i mogu biti aromatični (npr. heteroaril grupe). Primeri heterocikla uključuju imidazolil, imidazolidinil, oksazolil, oksazolidinil, tiazolil, tiazolidinil, pirazolidinil, pirazolil, izoksazolidinil, izoksazolil, izotiazolidinil, izotiazolil, morfolinil, pirolil, pirolidinil, furil, tetrahidrofuril, tiofenil, piridinil, piperidinil, kvinolil, i izokvinolil grupe. Heterocikli mogu biti opciono supstituisani.
[0877] Kao što se ovde upotrebljava, "biodegradabilna grupa" je grupa koja može olakšati brži metabolizam lipida kod subjekta. Biodegradabilna grupa može biti, ali nije ograničena
4
na, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, - S(O)2-, aril grupu, i heteroaril grupu.
[0878] Kao što se ovde upotrebljava, "aril grupa" je karbociklična grupa koja uključuje jedan ili više aromatičnih prstenova. Primeri aril grupa uključuju fenil i naftil grupe.
[0879] Kao što se ovde upotrebljava, "heteroaril grupa" je heterociklična grupa koja uključuje jedan ili više aromatičnih prstenova. Primeri heteroaril grupa uključuju pirolil, furil, tiofenil, imidazolil, oksazolil, i tiazolil. I aril i heteroaril grupe mogu biti opciono supstituisane. Na primer, M i M' mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog fenila, oksazola, i tiazola. U formulama ovde, M i M' mogu biti nezavisno odabrani sa prethodne liste biodegradabilnih grupa.
[0880] Alkil, alkenil, i ciklil (npr. karbociklil i heterociklil) grupe mogu biti opciono supstituisane osim ukoliko nije drugačije specificirano. Opcioni supstituenti mogu biti odabrani iz grupe koja se sastoji od, ali nisu ograničeni na, atom halogena (npr. hlorid, bromid, fluorid ili jodid grupa), karboksilnu kiselinu (npr. -C(O)OH), alkohol (npr. hidroksil, -OH), estar (npr. -C(O)OR ili -OC(O)R), aldehid (npr. -C(O)H), karbonil (npr. C(O)R, alternativno predstavljen pomoću C=O), acil halid (npr. -C(O)X, u kome je X halid odabran od bromida, fluorida, hlorida, i jodida), karbonat (npr. -OC(O)OR), alkoksi (npr. -OR), acetal (npr. -C(OR)2R", u kome su svake OR alkoksi grupe koje mogu biti iste ili različite i R" je alkil ili alkenil grupa), fosfat (npr. P(O)4<3->), tiol (npr. -SH), sulfoksid (npr. -S(O)R), sulfinsku kiselinu (npr. -S(O)OH), sulfonsku kiselinu (npr. -S(O)2OH), tial (npr. -C(S)H), sulfat (npr. S(O)4<2->), sulfonil (npr. S(O)2-), amid (npr. -C(O)NR2, ili -N(R)C(O)R), azido (npr. -N3), nitro (npr. -NO2), cijano (npr. -CN), izocijano (npr. -NC), aciloksi (npr. -OC(O)R), amino (npr. -NR2, -NRH, ili -NH2), karbamoil (npr. -OC(O)NR2, -OC(O)NRH, ili -OC(O)NH2), sulfonamid (npr. -S(O)2NR2, -S(O)2NRH, -S(O)2NH2, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)S(O)2H, ili -N(H)S(O)2H), alkil grupu, alkenil grupu, i ciklil (npr. karbociklil ili heterociklil) grupu.
[0881] U bilo kom od prethodnih, R je alkil ili alkenil grupa, kao što je ovde definisano. U nekim aspektima, same supstituentske grupe mogu biti dodatno supstituisane sa, na primer, jednim, dva, tri, četiri, pet, ili šest supstituenata kao što je ovde definisano. Na primer, C1-6alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa jednim, dva, tri, četiri, pet, ili šest supstituenata kao što je ovde opisano.
[0882] Jedinjenja bilo koje od formula (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), i (IIe) uključuju jedno ili više od sledećih svojstava kada je primenljivo.
[0883] U nekim aspektima, R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karocikla, -(CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q odabrano od C3-6karocikla, 5- do 14-članog aromatičnog ili nearomatičnog heterocikla koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, S, i P, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, i -C(R)N(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5.
[0884] U sledećem aspektu, R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karocikla -CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q odabrano od C3-6karocikla, 5- do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, i 5- do 14-članog heterocikloalkila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S koji su supstituisani sa jednim ili više supstituenata koji su odabrani od okso (=O), OH, amino, i C1-
3alkila, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5.
[0885] U sledećem aspektu, R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karocikla, -CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q odabrano od C3-6karocikla, 5- do 14-članog heterocikla koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; i kada je Q 5- do 14-člani heterocikl i (i) R4je -(CH2)nQ u kome je n 1 ili 2, ili (ii) R4je -CH2)nCHQR u kome je n 1, ili (iii) R4je -CHQR, i -CQ(R)2, tada je Q bilo 5- do 14-člani heteroaril ili 8- do 14-člani heterocikloalkil.
[0886] U sledećem aspektu, R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q odabrano od C3-6karocikla, 5- do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, i svako n je nezavisno odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5.
[0887] U sledećem aspektu, R4je nesupstituisani C1-4alkil, npr. nesupstituisani metil.
[0888] U određenim aspektima, objava obezbeđuje jedinjenje koje ima Formulu (I), pri čemu je R4-CH2)nQ ili -CH2)nCHQR, gde je Q -N(R)2, i n je odabrano od 3, 4, i 5.
[0889] U određenim aspektima, objava obezbeđuje jedinjenje koje ima Formulu (I), pri čemu je R4odabran iz grupe koja se sastoji od -CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q -N(R)2, i n je odabrano od 1, 2, 3, 4 i 5.
[0890] U određenim aspektima, objava obezbeđuje jedinjenje koje ima Formulu (I), pri čemu su R2i R3nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od C2-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl, i R4je -CH2)nQ ili -CH2)nCHQR, gde je Q -N(R)2, i n je odabrano od 3, 4, i 5.
[0891] U određenim aspektima, R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od C2-
14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR", -YR", i -R<∗>OR", ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl.
[0892] U nekim aspektima, R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-20alkila i C5-20alkenila.
[0893] U drugim aspektima, R1je odabran iz grupe koja se sastoji od -R<∗>YR", -YR", i -R"M'R'.
[0894] U određenim aspektima, R1je odabran od -R<∗>YR" i -YR". U nekim aspektima, Y je ciklopropil grupa. U nekim aspektima, R<∗>je C8alkil ili C8alkenil. U određenim aspektima, R" je C3-12alkil. Na primer, R" može biti C3alkil. Na primer, R" može biti C4-8alkil (npr. C4, C5, C6, C7, ili C8alkil).
[0895] U nekim aspektima, R1je C5-20alkil. U nekim aspektima, R1je C6alkil. U nekim aspektima, R1je C8alkil. U drugim aspektima, R1je C9alkil. U određenim aspektima, R1je C14alkil. U drugim aspektima, R1je C18alkil.
[0896] U nekim aspektima, R1je C5-20alkenil. U određenim aspektima, R1je C18alkenil. U nekim aspektima, R1je linoleil.
[0897] U određenim aspektima, R1je razgranat (npr. dekan-2-il, undekan-3-il, dodekan-4-il, tridekan-5-il, tetradekan-6-il, 2-metilundekan-3-il, 2-metildekan-2-il, 3-metilundekan-3-il, 4-metildodekan-4-il, ili heptadeka-9-il). U određenim aspektima, R1je
[0898] U određenim aspektima, R1je nesupstituisani C5-20alkil ili C5-20alkenil. U određenim aspektima, R' je supstituisani C5-20alkil ili C5-20alkenil (npr. supstituisan sa C3-6karbociklom kao što je 1-ciklopropilnonil).
[0899] U drugim aspektima, R1je -R"M'R'.
[0900] U nekim aspektima, R' je odabran od -R<∗>YR" i -YR". U nekim aspektima, Y je C3-8cikloalkil. U nekim aspektima, Y je C6-10aril. U nekim aspektima, Y je ciklopropil grupa. U nekim aspektima, Y je cikloheksil grupa. U određenim aspektima, R<∗>je C1alkil.
[0901] U nekim aspektima, R" je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-12alkila i C3-12alkenila. U nekim aspektima, R" pored Y je C1alkil. U nekim aspektima, R" pored Y je C4-9alkil (npr. C4, C5, C6, C7ili C8ili C9alkil).
[0902] U nekim je R' odabran od C4alkila i C4alkenila. U određenim aspektima, R' je odabran od C5alkila i C5alkenila. U nekim aspektima, R' je odabran od C6alkila i C6alkenila. U nekim aspektima, R' je odabran od C7alkila i C7alkenila. U nekim aspektima, R' je odabran od C9alkila i C9alkenila.
[0903] U drugim aspektima, R' je odabran od C11alkila i C11alkenila. U drugim aspektima, R' je odabran od C12alkila, C12alkenila, C13alkila, C13alkenila, C14alkila, C14alkenila, C15alkila, C15alkenila, C16alkila, C16alkenila, C17alkila, C17alkenila, C18alkila, i C18alkenila. U određenim aspektima, R' je razgranat (npr. dekan-2-il, undekan-3-il, dodekan-4-il, tridekan-5-il, tetradekan-6-il, 2-metilundekan-3-il, 2-metildekan-2-il, 3-metilundekan-3-il, 4-metildodekan-4-il ili heptadeka-9-il). U određenim aspektima, R' je
[0904] U određenim aspektima, R' je nesupstituisani C1-18alkil. U određenim aspektima, R' je supstituisani C1-18alkil (npr. C1-15alkil supstituisan sa C3-6karbociklom kao što je 1-ciklopropilnonil).
[0905] U nekim aspektima, R" je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila. U nekim aspektima, R" je C3alkil, C4alkil, C5alkil, C6alkil, C7alkil, ili C8alkil. U nekim aspektima, R" je C9alkil, C10alkil, C11alkil, C12alkil, C13alkil, ili C14alkil.
[0906] U nekim aspektima, M' je -C(O)O-. U nekim aspektima, M' je -OC(O)-.
[0907] U drugim aspektima, M' je aril grupa ili heteroaril grupa. Na primer, M' može biti odabrano iz grupe koja se sastoji od fenila, oksazola, i tiazola.
[0908] U nekim aspektima, M je -C(O)O-. U nekim aspektima, M je -OC(O)-. U nekim aspektima, M je -C(O)N(R')-. U nekim aspektima, M je -P(O)(OR')O-.
[0909] U drugim aspektima, M je aril grupa ili heteroaril grupa. Na primer, M može biti odabrano iz grupe koja se sastoji od fenila, oksazola, i tiazola.
[0910] U nekim aspektima, M je isto kao M'. U drugim aspektima, M je različito od M'.
[0911] U nekim aspektima, svaki R5je H. U određenim takvim aspektima, svaki R6je takođe H.
[0912] U nekim aspektima, R7je H. U drugim aspektima, R7je C1-3alkil (npr. metil, etil, propil, ili i-propil).
[0913] U nekim aspektima, R2i R3su nezavisno C5-14alkil ili C5-14alkenil.
[0914] U nekim aspektima, R2i R3su isti. U nekim aspektima, R2i R3su C8alkil. U određenim aspektima, R2i R3su C2alkil. U drugim aspektima, alkil. U nekim aspektima, R2i R3su C4alkil. U određenim aspektima, R2i R3su C5alkil. U drugim aspektima, R2i R3su C6alkil. U nekim aspektima, R2i R3su C7alkil.
[0915] U drugim aspektima, R2i R3su različiti. U određenim aspektima, R2je C8alkil. U nekim aspektima, R3je C1-7(npr. C1, C2, C3, C4, C5, C6, ili C7alkil) ili C9alkil.
[0916] U nekim aspektima, R7i R3su H.
[0917] U određenim aspektima, R2je H.
[0918] U nekim aspektima, m je 5, 7, ili 9.
[0919] U nekim aspektima, R4je odabran od -(CH2)nQ i -(CH2)nCHQR.
[0920] U nekim aspektima, Q je odabran iz grupe koja se sastoji od -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R), -C(R)N(R)2C(O)OR, karbocikla, i heterocikla.
[0921] U određenim aspektima, Q je -OH.
[0922] U određenim aspektima, Q je supstituisani ili nesupstituisani 5- do 10-člani heteroaril, npr. Q je imidazol, pirimidin, purin, 2-amino-1,9-dihidro-6H-purin-6-on-9-il (ili guanin-9-il), adenin-9-il, citozin-1-il, ili uracil-1-il. U određenim aspektima, Q je supstituisani 5- do 14-člani heterocikloalkil, npr. n je odabrano od supstituisan sa jednim ili više supstituenata koji su odabrani od okso (=O), OH, amino, i C1-3alkila. Na primer, Q je 4-metilpiperazinil, 4-(4-metoksibenzil)piperazinil, ili izoindolin-2-il-1,3-dion.
[0923] U određenim aspektima, Q je nesupstituisani ili supstituisani C6-10aril (kao što je fenil) ili C3-6cikloalkil.
[0924] U nekim aspektima, n je 1. U drugim aspektima, n je 2. U dodatnim aspektima, n je 3. U nekim drugim aspektima, n je 4. Na primer, R4može biti -(CH2)2OH. Na primer, R4može biti -(CH2)3OH. Na primer, R4može biti -(CH2)4OH. Na primer, R4može biti benzil. Na primer, R4može biti 4-metoksibenzil.
[0925] U nekim aspektima, R4je C3-6karbocikl. U nekim aspektima, R4je C3-6cikloalkil. Na primer, R4može biti cikloheksil opciono supstituisan sa npr. OH, halo, C1-6alkilom, itd. Na primer, R4može biti 2-hidroksicikloheksil.
[0926] U nekim aspektima, R je H.
[0927] U nekim aspektima, R je nesupstituisani C1-3alkil ili nesupstituisani C2-3alkenil. Na primer, R4može biti -CH2CH(OH)CH3 ili -CH2CH(OH)CH2CH3.
[0928] U nekim aspektima, R je supstituisani C1-3alkil, npr. CH2OH. Na primer, R4može biti -CH2CH(OH)CH2OH.
[0929] U nekim aspektima, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl. U nekim aspektima, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju 5- do 14-člani aromatični ili nearomatični heterocikl koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, S, i P. U nekim aspektima, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju opciono supstituisani C3-20karbocikl (npr. C3-18karbocikl, C3-15karbocikl, C3-12karbocikl, ili C3-10karbocikl), bilo aromatični ili nearomatični. U nekim aspektima, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju C3-6karbocikl. U drugim aspektima, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju C6karbocikl, kao što je cikloheksil ili fenil grupa. U određenim aspektima, heterocikl ili C3-6karbocikl je supstituisan sa jednom ili više alkil grupa (npr. na istom atomu u prstenu ili na susednim ili nesusednim atomima u prstenu). Na primer, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, mogu da formiraju cikloheksil ili fenil grupu koja nosi jednu ili više C5alkil supstitucija. U određenim aspektima, heterocikl ili C3-6karbocikl koji formiraju R2i R3, supstituisan je sa karbocikl grupama. Na primer, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, mogu da formiraju cikloheksil ili fenil grupu koja je supstituisana sa cikloheksilom. U nekim, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju C7-15karbocikl, kao što je cikloheptil, ciklopentadekanil, ili naftil grupa.
[0930] U nekim aspektima, R4je odabran od -(CH2)nQ i -(CH2)nCHQR. U nekim aspektima, Q je odabran iz grupe koja se sastoji od -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R), i heterocikla. U drugim aspektima, Q je odabran iz grupe koja se sastoji od imidazola, pirimidina, i purina.
[0931] U nekim aspektima, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl. U nekim aspektima, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju C3-6karbocikl, kao što je fenil grupa. U određenim aspektima, heterocikl ili C3-6karbocikl je supstituisan sa jednom ili više alkil grupa (npr. na istom atomu u prstenu ili na susednim ili nesusednim atomima u prstenu). Na primer, R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, mogu da formiraju fenil grupu koja nosi jednu ili više C5alkil supstitucija.
[0932] U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije iz predmetne objave, jedinjenje formule (I) je odabrano iz grupe koja se sastoji od:
4
41
42
�
44
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
i njihovih soli ili stereoizomera.
[0933] U drugim aspektima, jedinjenje Formule (I) je odabrano iz grupe koja se sastoji od Jedinjenja 1-Jedinjenja 147, ili njihove soli ili stereoizomera.
[0934] Funkcionalne grupe amina lipidnih jedinjenja koja su ovde objavljena mogu se protonovati pod određenim uslovima. Na primer, centralna funkcionalna grupa amina lipida u skladu sa formulom (I) je tipično protonovana (tj. pozitivno naelektrisana) na pH ispod pKa funkcionalne grupe amina i suštinski nije naelektrisana na pH iznad pKa. Takvi lipidi se mogu označavati kao amino lipidi koji se mogu jonizovati. U nekim aspektima, lipid koji se može jonizovati je amino lipid koji se može jonizovati, koji se u struci ponekad označava kao "katjonski lipid koji se može jonizovati".
[0935] U nekim aspektima, količina amino lipida koji se može jonizovati, npr. jedinjenja formule (I), je u opsegu od 1 mol % do 99 mol % u lipidnoj kompoziciji.
[0936] U jednom aspektu, količina amino lipida koji se može jonizovati, npr. jedinjenja formule (I) je najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ili 99 mol % u lipidnoj kompoziciji.
[0937] U jednom aspektu, količina amino lipida koji se može jonizovati, npr. jedinjenja formule (I), je u opsegu od oko 30 mol % do oko 70 mol %, od oko 35 mol % do oko 65 mol %, od oko 40 mol % do oko 60 mol %, i od oko 45 mol % do oko 55 mol % u lipidnoj kompoziciji.
[0938] U jednom specifičnom aspektu, količina amino lipida koji se može jonizovati, npr. jedinjenja formule (I), je oko 50 mol % u lipidnoj kompoziciji.
[0939] Pored amino lipida koji se može jonizovati, npr. jedinjenja formule I, lipidna kompozicija farmaceutskih kompozicija koje su ovde objavljene može da sadrži dopunske komponente kao što su fosfolipidi, strukturni lipidi, jedinjenja kvaternarnih amina, PEG-lipidi, i bilo koju njihovu kombinaciju.
Dopunske komponente u lipidnoj kompoziciji
A. Fosfolipidi
[0940] Lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena može da sadrži jedan ili više fosfolipida, na primer, jedan ili više zasićenih ili (poli)nezasićenih fosfolipida ili njihovu kombinaciju. Generalno, fosfolipidi sadrže funkcionalnu grupu fosfolipida i jednu ili više funkcionalnih grupa masnih kiselina. Na primer, fosfolipid može biti lipid u skladu sa formulom (VII):
u kojoj Rppredstavlja funkcionalnu grupu fosfolipida i R1i R2predstavljaju funkcionalne grupe masnih kiselina sa ili bez nezasićenosti koje mogu biti iste ili različite.
[0941] Funkcionalna grupa fosfolipida može biti odabrana, na primer, iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od fosfatidil holina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil glicerola, fosfatidil serina, fosfatidne kiseline, 2-lizofosfatidil holina, i sfingomijelina.
[0942] Funkcionalna grupa masne kiseline može biti odabrana, na primer, iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od laurinske kiseline, miristinske kiseline, miristoleinske kiseline, palmitinske kiseline, palmitoleinske kiseline, stearinske kiseline, oleinske kiseline, linolne kiseline, alfa-linolne kiseline, erukinske kiseline, fitanske kiseline, arahidne kiseline, arahidonske kiseline, eikozapentaenoične kiseline, behenske kiseline, dokozapentaenoične kiseline, i dokozaheksaensoične kiseline.
[0943] Određeni fosfolipidi mogu olakšati fuziju sa membranom. Na primer, katjonski fosfolipid može da interaguje sa jednim ili više negativno naelektrisanih fosfolipida membrane (npr. ćelijske ili unutarćelijske membrane). Fuzija fosfolipida sa membranom može dozvoliti da jedan ili više elemenata (npr. terapijski agens) kompozicije koja sadrži lipide (npr. LNP) prođe kroz membranu omogućavajući, npr. isporuku jednog ili više elemenata do ciljnog tkiva (npr. tumorsko tkivo).
[0944] Takođe se razmatraju neprirodne fosfolipidne vrste koje uključuju prirodne vrste sa modifikacijama i supstitucijama uključujući grananje, oksidaciju, ciklizaciju, i alkine. Na primer, fosfolipid može biti funkcionalizovan sa ili unakrsno povezan sa jednim ili više alkina (npr. alkenil grupa u kojoj je jedna ili više dvostrukih veza zamenjeno trostrukom vezom). Pod odgovarajućim reakcionim uslovima, alkin grupa može biti podvrgnuta bakromkatalizovanoj cikloadiciji nakon izlaganja azidu. Takve reakcije mogu biti korisne u funkcionalizaciji lipidnog dvosloja kompozicije nanočestica kako bi se olakšala permeacija membrane ili ćelijsko prepoznavanje ili u konjugovanju kompozicije nanočestica sa korisnom komponentom kao što je funkcionalna grupa za ciljno delovanje ili snimanje (npr. boja).
[0945] Fosfolipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, glicerofosfolipide kao što su fosfatidilholini, fosfatidiletanolamini, fosfatidilserini, fosfatidilinozitoli, fosfatidil gliceroli, i fosfatidne kiseline. Fosfolipidi takođe uključuju fosfosfingolipide, kao što je sfingomijelin. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija za intratumorsku isporuku koja je ovde objavljena može da sadrži više od jednog fosfolipida. Kada se upotrebljava više od jednog fosfolipida, takvi fosfolipidi mogu pripadati istoj klasi fosfolipida (npr. MSPC i DSPC) ili različitim klasama (npr. MSPC i MSPE).
[0946] Fosfolipidi mogu biti simetričnog ili asimetričnog tipa. Kao što se ovde upotrebljava, termin "simetrični fosfolipid" uključuje glicerofosfolipide koji imaju odgovarajuće funkcionalne grupe masnih kiselina i sfingolipide u kojima varijabilna funkcionalna grupa masne kiseline i ugljovodonični lanac sfingozinske okosnice uključuju uporediv broj atoma ugljenika. Kao što se ovde upotrebljava, termin "asimetrični fosfolipid" uključuje lizolipide, glicerofosfolipide koji imaju različite funkcionalne grupe masnih kiselina (npr. funkcionalne grupe masnih kiselina sa različitim brojem atoma ugljenika i/ili nezasićenosti (npr. dvostruke veze)), i sfingolipide u kojima varijabilna funkcionalna grupa masne kiseline i ugljovodonični lanac sfingozinske okosnice ne uključuju sličan broj atoma ugljenika (npr. varijabilna funkcionalna grupa masne kiseline uključuje najmanje dva atoma ugljenika više od ugljovodoničnog lanca ili najmanje dva atoma ugljenika manje od ugljovodoničkog lanca).
[0947] U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena sadrži najmanje jedan simetrični fosfolipid. Simetrični fosfolipidi mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od 1,2-dipropionil-sn-glicero-3-fosfoholina (03:0 PC), 1,2-dibutiril-sn-glicero-3-fosfoholina (04:0 PC), 1,2-dipentanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (05:0 PC), 1,2-diheksanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (06:0 PC), 1,2-diheptanoil-snglicero-3-fosfoholina (07:0 PC), 1,2-dioktanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (08:0 PC), 1,2-dinonanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (09:0 PC), 1,2-didekanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (10:0
1
PC), 1,2-diundekanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (11:0 PC, DUPC), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoholina (12:0 PC), 1,2-ditridekanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (13:0 PC), 1,2-dimiristoilsn-glicero-3-fosfoholina (14:0 PC, DMPC), 1,2-dipentadekanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (15:0 PC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0 PC, DPPC), 1,2-difitanoil-snglicero-3-fosfoholina (4ME 16:0 PC), 1,2-diheptadekanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (17:0 PC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0 PC, DSPC), 1,2-dinonadekanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (19:0 PC), 1,2-diarahidoil-sn-glicero-3-fosfoholina (20:0 PC), 1,2-dihenarahidoil-sn-glicero-3-fosfoholina (21:0 PC), 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfoholina (22:0 PC), 1,2-ditrikozanoil-sn-glicero-3-fosfoholina (23:0 PC), 1,2-dilignoceroil-sn-glicero-3-fosfoholina (24:0 PC), 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (14:1 (Δ9-cis) PC), 1,2-dimiristelaidoil-sn-glicero-3-fosfoholina (14:1 (Δ9-trans) PC), 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:1 (Δ9-cis) PC), 1,2-dipalmitelaidoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:1 (Δ9-trans) PC), 1,2-dipetroselenoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:1 (Δ6-cis) PC), 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfoholina (18:1 (Δ9-cis) PC, DOPC), 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:1 (Δ9-trans) PC), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:2 (cis) PC, DLPC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:3 (cis) PC, DLnPC), 1,2-dieikozenoil-sn-glicero-3-fosfoholina (20:1 (cis) PC), 1,2-diarahidonoil-sn-glicero-3-fosfoholina (20:4 (cis) PC, DAPC), 1,2-dierukoil-sn-glicero-3-fosfoholina (22:1 (cis) PC), 1,2-didokozaheksaenoil-snglicero-3-fosfoholina (22:6 (cis) PC, DHAPC), 1,2-dinervonoil-sn-glicero-3-fosfoholina (24:1 (cis) PC), 1,2-diheksanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (06:0 PE), 1,2-dioktanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (08:0 PE), 1,2-didekanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (10:0 PE), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (12:0 PE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (14:0 PE), 1,2-dipentadekanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (15:0 PE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0 PE), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (4ME 16:0 PE), 1,2-diheptadekanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (17:0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0 PE, DSPE), 1,2-dipalmitoleoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (16:1 PE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 (Δ9-cis) PE, DOPE), 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 (Δ9-trans) PE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:2 PE, DLPE), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:3 PE, DLnPE), 1,2-diarahidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (20:4 PE, DAPE), 1,2-didokozaheksaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (22:6 PE, DHAPE), 1,2-di-O-oktadecenil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0 dietar PC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforac-(1-glicerol) natrijum so (DOPG), i bilo koje njihove kombinacije.
2
[0948] U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena sadrži najmanje jedan simetrični fosfolipid odabran iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od DLPC, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, DUPC, 18:0 dietar PC, DLnPC, DAPC, DHAPC, DOPE, 4ME 16:0 PE, DSPE, DLPE, DLnPE, DAPE, DHAPE, DOPG, i bilo koje njihove kombinacije.
[0949] U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena sadrži najmanje jedan asimetrični fosfolipid. Asimetrični fosfolipidi mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od
1-miristoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfoholina (14:0-16:0 PC, MPPC),
1-miristoil-2-stearoil-sn-glicero-3-fosfoholina (14:0-18:0 PC, MSPC),
1-palmitoil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0-02:0 PC),
1-palmitoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0-14:0 PC, PMPC),
1-palmitoil-2-stearoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0-18:0 PC, PSPC),
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0-18:1 PC, POPC),
1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0-18:2 PC, PLPC),
1-palmitoil-2-arahidonoil-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0-20:4 PC),
1-palmitoil-2-dokozaheksaenoil-sn-glicero-3-fosfoholina (14:0-22:6 PC),
1-stearoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0-14:0 PC, SMPC),
1-stearoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0-16:0 PC, SPPC),
1-stearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0-18:1 PC, SOPC),
1-stearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0-18:2 PC),
1-stearoil-2-arahidonoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0-20:4 PC),
1-stearoil-2-dokozaheksaenoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0-22:6 PC),
1-oleoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:1-14:0 PC, OMPC),
1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:1-16:0 PC, OPPC),
1-oleoil-2-stearoil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:1-18:0 PC, OSPC),
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-18:1 PE, POPE),
1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-18:2 PE),
1-palmitoil-2-arahidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-20:4 PE),
1-palmitoil-2-dokozaheksaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-22:6 PE),
1-stearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-18:1 PE),
1-stearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-18:2 PE),
1-stearoil-2-arahidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-20:4 PE),
1-stearoil-2-dokozaheksaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-22:6 PE),
1-oleoil-2-holesterilhemisukcinoil-sn-glicero-3-fosfoholina (OHemsPC), i
bilo koje njihove kombinacije.
[0950] Asimetrični lipidi korisni u lipidnoj kompoziciji takođe mogu biti lizolipidi. Lizolipidi mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od
1-heksanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (06:0 Lizo PC),
1-heptanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (07:0 Lizo PC),
1-oktanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (08:0 Lizo PC),
1-nonanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (09:0 Lizo PC),
1-dekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (10:0 Lizo PC),
1-undekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (11:0 Lizo PC),
1-lauroil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (12:0 Lizo PC),
1-tridekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (13:0 Lizo PC),
1-miristoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (14:0 Lizo PC),
1-pentadekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (15:0 Lizo PC),
1-palmitoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (16:0 Lizo PC),
1-heptadekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (17:0 Lizo PC),
1-stearoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0 Lizo PC),
1-oleoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (18:1 Lizo PC),
1-nonadekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (19:0 Lizo PC),
1-arahidoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (20:0 Lizo PC),
1-behenoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (22:0 Lizo PC),
1-lignoceroil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (24:0 Lizo PC),
1-heksakozanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoholina (26:0 Lizo PC),
1-miristoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (14:0 Lizo PE),
1-palmitoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0 Lizo PE),
1-stearoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0 Lizo PE),
1-oleoil-2-hidroksi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 Lizo PE),
1-heksadecil-sn-glicero-3-fosfoholina (C16 Lizo PC), i
bilo koje njihove kombinacije.
4
[0951] U nekom aspektu, lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena sadrži najmanje jedan asimetrični fosfolipid odabran iz grupe koja se sastoji od MPPC, MSPC, PMPC, PSPC, SMPC, SPPC, i bilo koje njihove kombinacije. U nekim aspektima, asimetrični fosfolipid je 1-miristoil-2-stearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (MSPC).
[0952] U nekim aspektima, lipidne kompozicije koje su ovde objavljene mogu da sadrže jedan ili više simetričnih fosfolipida, jedan ili više asimetričnih fosfolipida, ili njihovu kombinaciju. Kada je prisutno više fosfolipida, oni mogu biti prisutni u ekvimolarnim odnosima, ili u neekvimolarnim odnosima.
[0953] U jednom aspektu, lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena sadrži ukupnu količinu fosfolipida (npr. MSPC) koja je u opsegu od oko 1 mol % do oko 20 mol %, od oko 5 mol % do oko 20 mol %, od oko 10 mol % do oko 20 mol %, od oko 15 mol % do oko 20 mol %, od oko 1 mol % do oko 15 mol %, od oko 5 mol % do oko 15 mol %, od oko 10 mol % do oko 15 mol %, od oko 5 mol % do oko 10 mol % u lipidnoj kompoziciji. U jednom aspektu, količina fosfolipida je od oko 8 mol % do oko 15 mol % u lipidnoj kompoziciji. U jednom aspektu, količina fosfolipida (npr. MSPC) je oko 10 mol % u lipidnoj kompoziciji.
[0954] U nekim aspektima, količina specifičnog fosfolipida (npr. MSPC) je najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 mol % u lipidnoj kompoziciji.
B. Jedinjenja kvaternarnog amina
[0955] Lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena može da sadrži jedno ili više jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP). Termin "jedinjenje kvaternarnog amina" se upotrebljava da uključi ona jedinjenja koja imaju jednu ili više kvaternarnih amino grupa (npr. trialkilamino grupe) i koja trajno nose pozitivno naelektrisanje i postoje u obliku soli. Na primer, jedna ili više kvaternarnih amino grupa mogu biti prisutne u lipidu ili polimeru (npr. PEG). U nekim aspektima, jedinjenje kvaternarnog amina sadrži (1) kvaternarnu amino grupu i (2) najmanje jednu hidrofobnu repnu grupu koja sadrži (i) ugljovodonični lanac, linearan ili razgranat, i zasićen ili nezasićen, i (ii) opciono etar, estar, karbonil, ili ketal vezu između kvaternarne amino grupe i ugljovodoničnog lanca. U nekim aspektima, kvaternarna amino grupa može biti trimetilamonijum grupa. U nekim aspektima, jedinjenje kvaternarnog amina sadrži dva identična ugljovodonična lanca. U nekim aspektima, jedinjenje kvaternarnog amina sadrži dva različita ugljovodonična lanca.
[0956] U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena sadrži najmanje jedno jedinjenje kvaternarnog amina. Jedinjenje kvaternarnog amina može biti odabrano iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od
1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propana (DOTAP),
N-[1-(2,3-dioleoiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorida (DOTMA),
1-[2-(oleoiloksi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroksietil)imidazolinijum hlorida (DOTIM), 2,3-dioleiloksi-N-[2(sperminkarboksamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminijum trifluoroacetata (DOSPA),
N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromida (DDAB),
N-(1,2-dimiristiloksiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroksietil amonijum bromida (DMRIE),
N-(1,2-dioleoiloksiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroksietil amonijum bromida (DORIE), N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorida (DODAC),
1,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfoholina (DLePC),
1,2-distearoil-3-trimetilamonijum-propana (DSTAP),
1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonijum-propana (DPTAP),
1,2-dilinoleoil-3-trimetilamonijum-propana (DLTAP),
1,2-dimiristoil-3-trimetilamonijum-propana (DMTAP)
1,2-distearoil-sn-glicero-3-etilfosfoholina (DSePC)
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfoholina (DPePC),
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfoholina (DMePC),
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfoholina (DOePC),
1,2-di-(9Z-tetradecenoil)-sn-glicero-3-etilfosfoholina (14:1 EPC),
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfoholina (16:0-18:1 EPC),
i bilo koje njihove kombinacije.
[0957] U jednom aspektu, jedinjenje kvaternarnog amina je 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijumpropan (DOTAP).
[0958] Jedinjenja kvaternarnog amina su poznata u struci, kao što su ona opisana u S.A.D. publikacijama patentnih prijava br. US2013/0245107 i US2014/0363493, S.A.D. pat. br.
8,158,601 i Međunarodnim publikacijama br. WO2015/123264 i WO2015/148247.
[0959] U jednom aspektu, količina jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je u opsegu od oko 0,01 mol % do oko 20 mol %.
[0960] U jednom aspektu, količina jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je u opsegu od oko 0,5 mol % do oko 20 mol %, od oko 0,5 mol % do oko 15 mol %, od oko 0,5 mol % do oko 10 mol %, od oko 1 mol % do oko 20 mol %, od oko 1 mol % do oko 15 mol %, od oko 1 mol % do oko 10 mol %, od oko 2 mol % do oko 20 mol %, od oko 2 mol % do oko 15 mol %, od oko 2 mol % do oko 10 mol %, od oko 3 mol % do oko 20 mol %, od oko 3 mol % do oko 15 mol %, od oko 3 mol % do oko 10 mol %, od oko 4 mol % do oko 20 mol %, od oko 4 mol % do oko 15 mol %, od oko 4 mol % do oko 10 mol %, od oko 5 mol % do oko 20 mol %, od oko 5 mol % do oko 15 mol %, od oko 5 mol % do oko 10 mol %, od oko 6 mol % do oko 20 mol %, od oko 6 mol % do oko 15 mol %, od oko 6 mol % do oko 10 mol %, od oko 7 mol % do oko 20 mol %, od oko 7 mol % do oko 15 mol %, od oko 7 mol % do oko 10 mol %, od oko 8 mol % do oko 20 mol %, od oko 8 mol % do oko 15 mol %, od oko 8 mol % do oko 10 mol %, od oko 9 mol % do oko 20 mol %, od oko 9 mol % do oko 15 mol %, od oko 9 mol % do oko 10 mol %.
[0961] U jednom aspektu, količina jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je u opsegu od oko 5 mol % do oko 10 mol %.
[0962] U jednom aspektu, količina jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je oko 5 mol %. U jednom aspektu, količina jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je oko 10 mol %.
[0963] U nekim aspektima, količina jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP) je najmanje oko 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 ili 20 mol % u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena.
[0964] U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutskih kompozicija koja je ovde objavljena sadrži jedinjenje formule (I). U jednom aspektu, molski odnos jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48) prema jedinjenju kvaternarnog amina (npr. DOTA) je oko 100:1 do oko 2,5:1. U jednom aspektu, molski odnos jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48) prema jedinjenju kvaternarnog amina (npr. DOTAP) je oko 90:1, oko 80:1, oko 70:1, oko 60:1, oko 50:1, oko 40:1, oko 30:1, oko 20:1, oko 15:1, oko 10:1, oko 9:1, oko 8:1, oko 7:1, oko 6:1, oko 5:1, ili oko 2,5:1. U jednom aspektu, molski odnos jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48) prema jedinjenju kvaternarnog amina (npr. DOTAP) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je oko 10:1.
[0965] U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutskih kompozicija koja je ovde objavljena ne sadrži jedinjenje kvaternarnog amina. U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutskih kompozicija koja je ovde objavljena ne sadrži DOTAP.
C. Strukturni lipidi
[0966] Lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena može da sadrži jedan ili više strukturnih lipida. Kao što se ovde upotrebljava, termin "strukturni lipid" označava sterole i takođe lipide koji sadrže funkcionalne grupe sterola. U nekim aspektima, strukturni lipid je odabran iz grupe koja se sastoji od holesterola, fekosterola, sitosterola, ergosterola, kampesterola, stigmasterola, brasikasterola, tomatidina, tomatina, ursolne kiseline, alfa-tokoferola, i njihovih smeša. U nekim aspektima, strukturni lipid je holesterol.
[0967] U jednom aspektu, količina strukturnog lipida (npr. sterola kao što je holesterol) u lipidnoj kompoziciji farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena je u opsegu od oko 20 mol % do oko 60 mol %, od oko 25 mol % do oko 55 mol %, od oko 30 mol % do oko 50 mol %, ili od oko 35 mol % do oko 45 mol %.
[0968] U jednom aspektu, količina strukturnog lipida (npr. sterola kao što je holesterol) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je u opsegu od oko 25 mol % do oko 30 mol %, od oko 30 mol % do oko 35 mol %, ili od oko 35 mol % do oko 40 mol %.
[0969] U jednom aspektu, količina strukturnog lipida (npr. sterola kao što je holesterol) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je oko 23,5 mol %, oko 28,5 mol %, oko 33,5 mol %, ili oko 38,5 mol %.
[0970] U nekim aspektima, količina strukturnog lipida (npr. sterola kao što je holesterol) u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je najmanje oko 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, ili 60 mol %.
[0971] U nekim aspektima, objavljena komponenta lipidne kompozicije farmaceutskih kompozicija za intratumorsku isporuku ne sadrži holesterol.
D. Polietilen glikol (PEG)-lipidi
[0972] Lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena može da sadrži jedan ili više polietilen glikol (PEG) lipida.
[0973] Kao što se ovde upotrebljava, termin "PEG-lipid" označava polietilen glikol (PEG)-modifikovane lipide. Neograničavajući primeri PEG-lipida uključuju PEG-modifikovani fosfatidiletanolamin i fosfatidnu kiselinu, PEG-ceramid konjugate (npr. PEG-CerC14 ili PEG-CerC20), PEG-modifikovane dialkilamine i PEG-modifikovane 1,2-diaciloksipropan-3-amine. Takvi lipidi se takođe označavaju kao PEGilovani lipidi. Na primer, PEG lipid može biti PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, ili PEG-DSPE lipid.
[0974] U nekim aspektima, PEG-lipid uključuje, ali nije ograničen na 1,2-dimiristoil-snglicerol metoksipolietilen glikol (PEG-DMG), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polietilen glikol)] (PEG-DSPE), PEG-disteril glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleil, PEG-dioleil, PEG-distearil, PEG-diacilglikamid (PEG-DAG), PEG-dipalmitoil fosfatidiletanolamin (PEG-DPPE), ili PEG-1,2-dimiristiloksipropil-3-amin (PEG-c-DMA).
[0975] U jednom aspektu, PEG-lipid je odabran iz grupe koja se sastoji od PEG-modifikovanog fosfatidiletanolamina, PEG-modifikovane fosfatidne kiseline, PEG-modifikovanog ceramida, PEG-modifikovanog dialkilamina, PEG-modifikovanog diacilglicerola, PEG-modifikovanog dialkilglicerola, i njihovih smeša.
[0976] U nekim aspektima, funkcionalna grupa lipida PEG-lipida uključuje one koje imaju dužinu od oko C14do oko C22, poželjno od oko C14do oko C16. U nekim aspektima, PEG funkcionalna grupa, na primer mPEG-NH2, ima veličinu od oko 1000, 2000, 5000, 10.000, 15.000 ili 20.000 daltona. U jednom aspektu, PEG-lipid je PEG2k-DMG.
[0977] U jednom aspektu, lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu da sadrže PEG lipid koji je nedifuzioni PEG. Neograničavajući primeri nedifuzionih PEG uključuju PEG-DSG i PEG-DSPE.
[0978] PEG-lipidi su poznati u struci, kao što su oni koji su opisani u S.A.D. patentu br.
8158601 i Međunarodnoj publ. br. WO2015/130584.
[0979] U jednom aspektu, količina PEG-lipida u lipidnoj kompoziciji farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena je u opsegu od oko 0,1 mol % do oko 5 mol %, od oko 0,5 mol % do oko 5 mol %, od oko 1 mol % do oko 5 mol %, od oko 1,5 mol % do oko 5 mol %, od oko 2 mol % do oko 5 mol % mol %, od oko 0,1 mol % do oko 4 mol %, od oko 0,5 mol % do oko 4 mol %, od oko 1 mol % do oko 4 mol %, od oko 1,5 mol % do oko 4 mol %, od oko 2 mol % do oko 4 mol %, od oko 0,1 mol % do oko 3 mol %, od oko 0,5 mol % do oko 3 mol %, od oko 1 mol % do oko 3 mol %, od oko 1,5 mol % do oko 3 mol %, od oko 2 mol % do oko 3 mol %, od oko 0,1 mol % do oko 2 mol %, od oko 0,5 mol % do oko 2 mol %, od oko 1 mol % do oko 2 mol %, od oko 1,5 mol % do oko 2 mol %, od oko 0,1 mol % do oko 1,5 mol %, od oko 0,5 mol % do oko 1,5 mol %, ili od oko 1 mol % do oko 1,5 mol %.
[0980] U jednom aspektu, količina PEG-lipida u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je oko 1,5 mol %.
[0981] U jednom aspektu, količina PEG-lipida u lipidnoj kompoziciji koja je ovde objavljena je najmanje oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, ili 5 mol %.
[0982] U nekim aspektima, lipidna kompozicija farmaceutskih kompozicija koja je ovde objavljana ne sadrži PEG-lipid.
[0983] U nekim aspektima, lipidna kompozicija koja je ovde objavljena sadrži amino lipid koji se može jonizovati, npr. jedinjenje formule (I), i asimetrični fosfolipid. U nekim aspektima, lipidna kompozicija sadrži Jedinjenje 18 i MSPC.
[0984] U nekim aspektima, lipidna kompozicija koja je ovde objavljena sadrži amino lipid koji se može jonizovati, npr. jedinjenje formule (I), i jedinjenje kvaternarnog amina. U nekim aspektima, lipidna kompozicija sadrži Jedinjenje 18 i DOTAP.
[0985] U nekim aspektima, lipidna kompozicija koja je ovde objavljena sadrži amino lipid koji se može jonizovati, npr. jedinjenje formule (I), asimetrični fosfolipid, i jedinjenje kvaternarnog amina. U nekim aspektima, lipidna kompozicija sadrži Jedinjenje 18, MSPC i DOTAP.
[0986] U jednom aspektu, lipidna kompozicija sadrži oko 50 mol % jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48), oko 10 mol % DSPC ili MSPC, oko 33,5 mol % holesterola, oko 1,5 mol % PEG-DMG, i oko 5 mol % DOTAP. U jednom aspektu, lipidna kompozicija sadrži oko 50 mol % jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48), oko 10 mol % DSPC ili MSPC, oko 28,5 mol % holesterola, oko 1,5 mol % PEG-DMG, i oko 10 mol % DOTAP.
[0987] Komponente lipidnih nanočestica mogu biti skrojene za optimalnu isporuku polinukleotida na osnovu željenog ishoda. Kao neograničavajući primer, lipidna nanočestica može da sadrži 40-60 mol % amino lipida koji se može jonizovati (npr. jedinjenje formule (I)), 8-16 mol % fosfolipida, 30-45 mol % holesterola, 1-5 mol % PEG lipida, i opciono 1-15 mol % jedinjenja kvaternarnog amina.
[0988] U nekim aspektima, lipidna nanočestica može da sadrži 45-65 mol % amino lipida koji se može jonizovati (npr. jedinjenje formule (I)), 5-10 mol % fosfolipida, 25-40 mol % holesterola, 0,5-5 mol % PEG lipida, i opciono 1-15 mol % jedinjenja kvaternarnog amina.
[0989] Neograničavajući primer nukleinska kiselina-lipidnih čestica objavljeni su u S.A.D. patentnoj publikaciji br.20140121263.
E. Drugi amino lipidi koji se mogu jonizovati
[0990] Lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena može da sadrži jedan ili više amino lipida koji se mogu jonizovati pored lipida u skladu sa formulom (I).
[0991] Lipidi koji se mogu jonizovati mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinetanamina (KL10), N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazindietanamina (KL22), 14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza-oktatriakontana (KL25), 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolana (DLin-K-DMA), heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoata (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA), (13Z,165Z)-N,N-dimetil-3-nonidokoza-13-16-dien-1-amina (L608), 2-({8-[(3β)-holest-5-en-3-iloksi]oktil}oksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-1-amina (Oktil-CLinDMA), (2R)-2-({8-[(3β)-holest-5-en-3-iloksi]oktil}oksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-1-amina (Oktil-CLinDMA (2R)), i (2S)-2-({8-[(3β)-holest-5-en-3-iloksi]oktil}oksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-1-amina (Oktil-CLinDMA (2S)). Pored ovih, amino lipid koji se može jonizovati takođe može biti lipid koji uključuje cikličnu amino grupu.
[0992] Lipidi koji se mogu jonizovati takođe mogu biti jedinjenja koja su objavljena u Međunarodnoj publikaciji br. WO2015/199952 (videti takođe US20150376115) Na primer, amino lipidi koji se mogu jonizovati uključuju, ali nisu ograničeni na:
1
�
i bilo koje njihove kombinacije.
F. Druge komponente lipidne kompozicije
[0993] Lipidna kompozicija farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena može uključivati jednu ili više komponenti pored onih koje su prethodno opisane. Na primer, lipidna kompozicija može uključivati jedan ili više molekula za poboljšanje permeabilnosti, ugljene hidrate, polimere, agense za menjanje površine (npr. surfaktante), ili druge komponente. Na primer, molekul za poboljšanje permeabilnosti može biti molekul koji je opisan u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. 2005/0222064. Ugljeni hidrati mogu uključivati jednostavne šećere (npr. glukozu) i polisaharide (npr. glikogen i njegove derivate i analoge). Lipidna kompozicija može uključivati pufer kao što je, ali bez ograničenja na, citratni ili fosfatni sa pH od 7, so i/ili šećer. So i/ili šećer se mogu uključivati u formulacije koje su ovde opisane radi izotoničnosti.
[0994] Polimer se može uključiti u i/ili upotrebljavati za inkapsuliranje ili delimično inkapsuliranje farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena (npr. farmaceutska kompozicija u obliku lipidnih nanočestica). Polimer može biti biodegradabilan i/ili biokompatibilan. Polimer može biti odabran od, ali nije ograničen na, poliamine, polietre, poliamide, poliestre, polikarbamate, poliuree, polikarbonate, polistirene, poliimide, polisulfone, poliuretane, poliacetilene, polietilene, polietilenimine, poliizocijanate, poliakrilate, polimetakrilate, poliakrilonitrile, i poliarilate.
[0995] Odnos između lipidne kompozicije i polinukleotida je u opsegu od oko 10:1 do oko 60:1 (tež./tež.).
[0996] U nekim aspektima, odnos između lipidne kompozicije i polinukleotida može biti oko 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1 ili 60:1 (tež./tež.). U nekim aspektima, tež./tež. odnos lipidne kompozicije prema polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili polinukleotidu koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, je oko 20:1 ili oko 15:1.
[0997] U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija koja je ovde objavljena može da sadrži više od jednog polipeptida, npr. dva, tri ili više polipeptida. Na primer, farmaceutska kompozicija koja je ovde objavljena može da sadrži dva, tri, ili više polinukleotida (npr. iRNK).
[0998] U jednom aspektu, lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu da sadrže polinukleotide (npr. iRNK) u lipid:polinukleotid težinskom odnosu od 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1 ili 70:1, ili opsegu bilo kojih od ovih odnosa kao što su, ali ne ograničavajući se na, 5:1 do oko 10:1, od oko 5:1 do oko 15:1, od oko 5:1 do oko 20:1, od oko 5:1 do oko 25:1, od oko 5:1 do oko 30:1, od oko 5:1 do oko 35:1, od oko 5:1 do oko 40:1, od oko 5:1 do oko 45:1, od oko 5:1 do oko 50:1, od oko 5:1 do oko 55:1, od oko 5:1 do oko 60:1, od oko 5:1 do oko 70:1, od oko 10:1 do oko 15:1, od oko 10:1 do oko 20:1,
4
od oko 10:1 do oko 25:1, od oko 10:1 do oko 30:1, od oko 10:1 do oko 35:1, od oko 10:1 do oko 40:1, od oko 10:1 do oko 45:1, od oko 10:1 do oko 50:1, od oko 10:1 do oko 55:1, od oko 10:1 do oko 60:1, od oko 10:1 do oko 70:1, od oko 15:1 do oko 20:1, od oko 15:1 do oko 25:1, od oko 15:1 do oko 30:1, od oko 15:1 do oko 35:1, od oko 15:1 do oko 40:1, od oko 15:1 do oko 45:1, od oko 15:1 do oko 50:1, od oko 15:1 do oko 55:1, od oko 15:1 do oko 60:1 ili od oko 15:1 do oko 70:1.
[0999] U jednom aspektu, lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu da sadrže polinukleotid u koncentraciji od približno 0,1 mg/ml do 2 mg/ml, kao što je, ali nije ograničeno na, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,6 mg/ml, 1,7 mg/ml, 1,8 mg/ml, 1,9 mg/ml, 2,0 mg/ml ili više od 2,0 mg/ml.
[1000] U jednom aspektu, formulacije koje sadrže polinukleotide i lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu da sadrže 0,15 mg/ml do 2 mg/ml polinukleotida koji je ovde opisan (npr. iRNK). U nekim aspektima, formulacija može dodatno da sadrži 10 mM citratni pufer i formulacija može dodatno da sadrži do 10% tež./tež. saharoze (npr. najmanje 1% tež./tež., najmanje 2% tež./tež., najmanje 3% tež./tež., najmanje 4% tež./tež., najmanje 5% tež./tež., najmanje 6% tež./tež., najmanje 7% tež./tež., najmanje 8% tež./tež., najmanje 9 % tež./tež. ili 10 % tež./tež.).
Kompozicije nanočestica
[1001] U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije koje su ovde objavljene formulisane su kao lipidne nanočestice (LNP). U skladu sa tim, predmetna objava takođe obezbeđuje kompozicije nanočestica koje sadrže (i) lipidnu kompoziciju koja sadrži agens za isporuku kao što je jedinjenje formule (I) kao što je ovde opisano, i (ii) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U takvoj kompoziciji nanočestica, lipidna kompozicija koja je ovde objavljena može da inkapsulira polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[1002] U jednom posebnom aspektu, (i) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid su inkapsulirane odvojeno (tj. u dve populacije nanočestica). U sledećem posebnom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid inkapsulirane su odvojeno (tj. u tri populacije nanočestica). U jednom posebnom aspektu, (i) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, (ii) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili (iii) polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid inkapsulirani su zajedno (tj. u jednoj populaciji nanočestica). U sledećem posebnom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid inkapsulirani su zajedno (tj. u jednoj populaciji nanočestica).
[1003] Kompozicije nanočestica su tipično reda veličine mikrometara ili manje i mogu uključivati lipidni dvosloj. Kompozicije nanočestica obuhvataju lipidne nanočestice (LNP), lipozome (npr. lipidne vezikule), i lipoplekse. Na primer, kompozicija nanočestica može biti lipozom koji ima lipidni dvosloj prečnika 500 nm ili manje.
[1004] Kompozicije nanočestica uključuju, na primer, lipidne nanočestice (LNP), lipozome, i lipoplekse. U nekim aspektima, kompozicije nanočestica su vezikule koje uključuju jedan ili više lipidnih dvoslojeva. U određenim aspektima, kompozicija nanočestica uključuje dva ili više koncentričnih dvoslojeva razdvojenih vodenim kompartmentima. Lipidni dvoslojevi mogu biti funkcionalizovani i/ili međusobno umreženi. Lipidni dvoslojevi mogu uključivati jedan ili više liganada, proteina, ili kanala.
[1005] Kompozicije nanočestica iz predmetne objave sadrže najmanje jedno jedinjenje u skladu sa formulom (I). Na primer, kompozicija nanočestica može uključivati jedno ili više od Jedinjenja 1-147, ili jedno ili više od Jedinjenja 1-232. Kompozicije nanočestica takođe mogu uključivati niz drugih komponenti. Na primer, kompozicija nanočestica može uključivati jedan ili više drugih lipida pored lipida u skladu sa formulom (I), (II), ili (IIa)-(IId), kao što je (i) najmanje jedan fosfolipid, (ii) najmanje jedno jedinjenje kvaternarnog amina, (iii) najmanje jedan strukturni lipid, (iv) najmanje jedan PEG-lipid, ili (v) bilo koju njihovu kombinaciju.
[1006] U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži jedinjenje formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48). U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži jedinjenje formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48) i fosfolipid (npr. DSPC ili MSPC). U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži jedinjenje formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48), fosfolipid (npr. DSPC ili MSPC), i jedinjenje kvaternarnog amina (npr. DOTAP). U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži jedinjenje formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48), i jedinjenje kvaternarnog amina (npr. DOTAP).
[1007] U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži lipidnu kompoziciju koja se sastoji ili se suštinski sastoji od jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48). U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži lipidnu kompoziciju koja se sastoji ili se suštinski sastoji od jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48) i fosfolipida (npr. DSPC ili MSPC). U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži lipidnu kompoziciju koja se sastoji ili se suštinski sastoji od jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48), fosfolipida (npr. DSPC ili MSPC), i jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP). U nekim aspektima, kompozicija nanočestica sadrži lipidnu kompoziciju koja se sastoji ili se suštinski sastoji od jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48), i jedinjenja kvaternarnog amina (npr. DOTAP).
[1008] U jednom aspektu, kompozicija nanočestica sadrži (1) lipidnu kompoziciju koja sadrži oko 50 mol % jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48); oko 10 mol % DSPC ili MSPC; oko 33,5 mol % holesterola; oko 1,5 mol % PEG-DMG (npr. PEG2k-DMG); oko 5 mol % DOTAP; i (2) polinukleotid.
[1009] U jednom aspektu, kompozicija nanočestica sadrži (1) lipidnu kompoziciju koja sadrži oko 50 mol % jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48); oko 10 mol % DSPC ili MSPC; oko 28,5 mol % holesterola; oko 1,5 mol % PEG-DMG (npr. PEG2k-DMG); oko 10 mol % DOTAP; i (2) polinukleotid.
[1010] U jednom aspektu, kompozicija nanočestica sadrži (1) lipidnu kompoziciju koja sadrži oko 50 mol % jedinjenja formule (I) (npr. Jedinjenja 18, 25, 26 ili 48); oko 10 mol % DSPC ili MSPC; oko 23,5 mol % holesterola; oko 1,5 mol % PEG-DMG (npr. PEG2k-DMG); oko 15 mol % DOTAP; i (2) polinukleotid.
[1011] Kao što je ovde generalno definisano, termin "lipid" označava mali molekul koji ima hidrofobna ili amfifilna svojstva. Lipidi mogu biti oni koji se javljaju u prirodi ili sintetički. Primeri klasa lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, masti, voskove, metabolite koji sadrže sterol, vitamine, masne kiseline, glicerolipide, glicerofosfolipide, sfingolipide, saharolipide, i poliketide, i prenol lipide. U nekim slučajevima, amfifilna svojstva nekih lipida dovode ih do formiranja lipozoma, vezikula, ili membrana u vodenom medijumu.
[1012] U nekim aspektima, lipidna nanočestica (LNP) može da sadrži lipid koji se može jonizovati. Kao što se ovde upotrebljava, termin "lipid koji se može jonizovati" ima svoje uobičajeno značenje u struci i može označavati lipid koji sadrži jednu ili više naelektrisanih funkcionalnih grupa. U nekim aspektima, lipid koji se može jonizovati može biti pozitivno ili negativno naelektrisan. Lipid koji se može jonizovati može biti pozitivno naelektrisan, u kom slučaju se može označavati kao "katjonski lipid". Na primer, molekul koji se može jonizovati može da sadrži amino grupu, koji se označava kao amino lipidi koji se mogu jonizovati. Kao što se ovde upotrebljava, "naelektrisana funkcionalna grupa" je hemijska funkcionalna grupa koji nosi formalno elektronsko naelektrisanje, npr. monovalentno (+1, ili -1), dvovalentno (+2, ili -2), trovalentno (+3 ili -3), itd. Naelektrisana funkcionalna grupa može biti anjonska (tj. negativno naelektrisana) ili katjonska (tj. pozitivno naelektrisana). Primeri pozitivno naelektrisanih funkcionalnih grupa uključuju amino grupe (npr. primarne, sekundarne, i/ili tercijarne amine), amonijum grupe, piridinijum grupu, guanidin grupe, i imidizolijum grupe. U posebnom aspektu, naelektrisane funkcionalne grupe sadrže amino grupe. Primeri negativno naelektrisanih grupa ili njihovih prekursora uključuju karboksilatne grupe, sulfonatne grupe, sulfatne grupe, fosfonatne grupe, fosfatne grupe, hidroksilne grupe, i slično. Naelektrisanje naelektrisane funkcionalne grupe može da varira, u nekim slučajevima, u zavisnosti od uslova okruženja, na primer, promene u pH mogu da izmene naelektrisanje funkcionalne grupe, i/ili da prouzrokuju da funkcionalna grupa postane naelektrisana ili nenaelektrisana. Generalno, gustina naelektrisanja molekula može se odabrati po želji.
[1013] Treba razumeti da termini "naelektrisana" ili "naelektrisana funkcionalna grupa" ne označavaju "delimično negativno naelektrisanje" ili "delimično pozitivno naelektrisanje" na molekulu. Terminima "delimično negativno naelektrisanje" i "delimično pozitivno naelektrisanje" dato je uobičajeno značenje u struci. "Delimično negativno naelektrisanje" može da nastane kada funkcionalna grupa sadrži vezu koja postaje polarizovana tako da se elektronska gustina povlači ka jednom atomu veze, stvarajući delimično negativno naelektrisanje atoma. Oni sa prosečnim iskustvom u struci će, generalno, prepoznati veze koje mogu da postanu polarizovane na ovaj način.
[1014] U nekim aspektima, lipid koji se može jonizovati je amino lipid koji se može jonizovati, koji se u struci ponekad označava kao "katjonski lipid koji se može jonizovati". U jednom aspektu, amino lipid koji se može jonizovati može imati pozitivno naelektrisanu hidrofilnu glavu i hidrofobni rep koji su povezani putem linker strukture.
[1015] Kompozicije nanočestica mogu se okarakterisati pomoću različitih postupaka. Na primer, mikroskopija (npr. transmisiona elektronska mikroskopija ili skenirajuća elektronska mikroskopija) se može upotrebljavati za ispitivanje morfologije i distribucije veličine kompozicije nanočestica. Dinamičko rasejanje svetlosti ili potenciometrija (npr. potenciometrijske titracije) se mogu upotrebljavati za merenje zeta potencijala. Dinamičko rasejanje svetlosti se takođe može koristiti za određivanje veličine čestica. Instrumenti kao što je Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) se takođe mogu upotrebljavati za merenje više karakteristika kompozicije nanočestica, kao što su veličina čestica, indeks polidisperznosti, i zeta potencijal.
[1016] Veličina nanočestica može pomoći u suzbijanju bioloških reakcija kao što je, ali ne ograničavajući se na, inflamaciju, ili može povećati biološki efekat polinukleotida.
[1017] Kao što se ovde upotrebljava, "veličina" ili "srednja vrednost veličine" u kontekstu kompozicija nanočestica označava srednju vrednost prečnika kompozicije nanočestica.
[1018] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipidnim nanočesticama. U nekim aspektima, lipidne nanočestice imaju prečnik od oko 10 do oko 100 nm, kao što je, ali nije ograničeno na, oko 10 do oko 20 nm, oko 10 do oko 30 nm, oko 10 do oko 40 nm, oko 10 do oko 50 nm, oko 10 do oko 60 nm, oko 10 do oko 70 nm, oko 10 do oko 80 nm, oko 10 do oko 90 nm, oko 20 do oko 30 nm, oko 20 do oko 40 nm, oko 20 do oko 50 nm, oko 20 do oko 60 nm, oko 20 do oko 70 nm, oko 20 do oko 80 nm, oko 20 do oko 90 nm, oko 20 do oko 100 nm, oko 30 do oko 40 nm, oko 30 do oko 50 nm, oko 30 do oko 60 nm, oko 30 do oko 70 nm, oko 30 do oko 80 nm, oko 30 do oko 90 nm, oko 30 do oko 100 nm, oko 40 do oko 50 nm, oko 40 do oko 60 nm, oko 40 do oko 70 nm, oko 40 do oko 80 nm, oko 40 do oko 90 nm, oko 40 do oko 100 nm, oko 50 do oko 60 nm, oko 50 do oko 70 nm, oko 50 do oko 80 nm, oko 50 do oko 90 nm, oko 50 do oko 100 nm, oko 60 do oko 70 nm, oko 60 do oko 80 nm, oko 60 do oko 90 nm, oko 60 do oko 100 nm, oko 70 do oko 80 nm, oko 70 do oko 90 nm, oko 70 do oko 100 nm, oko 80 do oko 90 nm, oko 80 do oko 100 nm i/ili oko 90 do oko 100 nm.
[1019] U jednom aspektu, nanočestice imaju prečnik od oko 10 do 500 nm. U jednom aspektu, nanočestica ima prečnik veći od 100 nm, veći od 150 nm, veći od 200 nm, veći od 250 nm, veći od 300 nm, veći od 350 nm, veći od 400 nm, veći od 450 nm, veći od 500 nm, veći od 550 nm, veći od 600 nm, veći od 650 nm, veći od 700 nm, veći od 750 nm, veći od 800 nm, veći od 850 nm, veći od 900 nm, veći od 950 nm ili veći od 1000 nm.
[1020] U nekim aspektima, najveća dimenzija kompozicije nanočestica je 1 µm ili kraća (npr.
1 µm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, ili kraća).
[1021] Kompozicija nanočestica može biti relativno homogena. Indeks polidisperznosti može da se upotrebljava da ukaže na homogenost kompozicije nanočestica, npr. distribuciju veličine čestica kompozicije nanočestica. Mali (npr. manji od 0,3) indeks polidisperznosti generalno ukazuje na usku distribuciju veličine čestica. Kompozicija nanočestica može imati indeks polidisperznosti od oko 0 do oko 0,25, kao što je 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, ili 0,25. U nekim aspektima, indeks polidisperznosti kompozicije nanočestica koja je ovde objavljena može biti od oko 0,10 do oko 0,20.
[1022] Zeta potencijal kompozicije nanočestica može se upotrebljavati da ukaže na elektrokinetički potencijal kompozicije. Na primer, zeta potencijal može da opiše površinsko naelektrisanje kompozicije nanočestica. Kompozicije nanočestica sa relativno niskim naelektrisanjem, pozitivnim ili negativnim, generalno su poželjne, pošto vrste sa većim naelektrisanjem mogu nepoželjno interagovati sa ćelijama, tkivima, i drugim elementima u telu. U nekim aspektima, zeta potencijal kompozicije nanočestica koja je ovde objavljena može biti od oko -10 mV do oko 20 mV, od oko -10 mV do oko 15 mV, od oko -10 mV do oko 10 mV, od oko -10 mV do oko 5 mV, od oko -10 mV do oko 0 mV, od oko -10 mV do oko -5 mV, od oko -5 mV do oko 20 mV, od oko -5 mV do oko 15 mV, od oko -5 mV do oko 10 mV, od oko -5 mV do oko 5 mV, od oko -5 mV do oko 0 mV, od oko 0 mV do oko 20 mV, od oko 0 mV do oko 15 mV, od oko 0 mV do oko 10 mV, od oko 0 mV do oko 5 mV, od oko 5 mV do oko 20 mV, od oko 5 mV do oko 15 mV, ili od oko 5 mV do oko 10 mV.
[1023] U nekim aspektima, zeta potencijal lipidnih nanočestica može biti od oko 0 mV do oko 100 mV, od oko 0 mV do oko 90 mV, od oko 0 mV do oko 80 mV, od oko 0 mV do oko 70 mV, od oko 0 mV do oko 60 mV, od oko 0 mV do oko 50 mV, od oko 0 mV do oko 40 mV, od oko 0 mV do oko 30 mV, od oko 0 mV do oko 20 mV, od oko 0 mV do oko 10 mV, od oko 10 mV do oko 100 mV, od oko 10 mV do oko 90 mV, od oko 10 mV do oko 80 mV, od oko 10 mV do oko 70 mV, od oko 10 mV do oko 60 mV, od oko 10 mV do oko 50 mV, od oko 10 mV do oko 40 mV, od oko 10 mV do oko 30 mV, od oko 10 mV do oko 20 mV, od oko 20 mV do oko 100 mV, od oko 20 mV do oko 90 mV, od oko 20 mV do oko 80 mV, od
4
oko 20 mV do oko 70 mV, od oko 20 mV do oko 60 mV, od oko 20 mV do oko 50 mV, od oko 20 mV do oko 40 mV, od oko 20 mV do oko 30 mV, od oko 30 mV do oko 100 mV, od oko 30 mV do oko 90 mV, od oko 30 mV do oko 80 mV, od oko 30 mV do oko 70 mV, od oko 30 mV do oko 60 mV, od oko 30 mV do oko 50 mV, od oko 30 mV do oko 40 mV, od oko 40 mV do oko 100 mV, od oko 40 mV do oko 90 mV, od oko 40 mV do oko 80 mV, od oko 40 mV do oko 70 mV od oko 40 mV do oko 60 mV, i od oko 40 mV do oko 50 mV. U nekim aspektima, zeta potencijal lipidnih nanočestica može biti od oko 10 mV do oko 50 mV, od oko 15 mV do oko 45 mV, od oko 20 mV do oko 40 mV, i od oko 25 mV do oko 35 mV. U nekim aspektima, zeta potencijal lipidnih nanočestica može biti oko 10 mV, oko 20 mV, oko 30 mV, oko 40 mV, oko 50 mV, oko 60 mV, oko 70 mV, oko 80 mV, oko 90 mV, i oko 100 mV.
[1024] Termin "efikasnost inkapsulacije" polinukleotida opisuje količinu polinukleotida koja je inkapsulirana ili na drugi način asocirana sa kompozicijom nanočestica posle pripreme, u odnosu na količinu koja je inicijalno obezbeđena. Kao što se ovde upotrebljava, "inkapsulacija" može označavati potpuno, suštinsko, ili delimično zatvaranje, zarobljavanje, okruživanje, ili oblaganje.
[1025] Efikasnost inkapsulacije je poželjno visoka (npr. blizu 100%). Efikasnost inkapsulacije se može izmeriti, na primer, upoređivanjem količine polinukleotida u rastvoru koji sadrži kompoziciju nanočestica pre i posle razbijanja kompozicije nanočestica sa jednim ili više organskih rastvarača ili deterdženata.
[1026] Fluorescencija se može upotrebljavati za merenje količine slobodnog polinukleotida u rastvoru. Za kompozicije nanočestica koje su ovde opisane, efikasnost inkapsulacije polinukleotida može biti najmanje 50%, na primer 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%. U nekim aspektima, efikasnost inkapsulacije može biti najmanje 80%. U određenim aspektima, efikasnost inkapsulacije može biti najmanje 90%.
[1027] Količina polinukleotida koji je prisutan u farmaceutskoj kompoziciji koja je ovde objavljena može zavisiti od više faktora kao što su veličina polinukleotida, željeni cilj i/ili primena, ili druga svojstva kompozicije nanočestica, kao i od svojstava polinukleotida.
[1028] Na primer, količina iRNK korisne u kompoziciji nanočestica može zavisiti od veličine (izražene kao dužina, ili molekulska masa), sekvence, i drugih karakteristika iRNK. Relativne količine polinukleotida u kompoziciji nanočestica takođe mogu da variraju.
[1029] Relativne količine lipidne kompozicije i polinukleotida koji su prisutni u lipidnoj kompoziciji nanočestica iz predmetne objave mogu se optimizovati u skladu sa razmatranjima
4 1
efikasnosti i podnošljivosti. Za kompozicije koje uključuju iRNK kao polinukleotid, N:P odnos može poslužiti kao korisna metrika.
[1030] Kako N:P odnos kompozicije nanočestica kontroliše i ekspresiju i podnošljivost, poželjne su kompozicije nanočestica sa niskim N:P odnosima i jakom ekspresijom. N:P odnosi variraju u skladu sa odnosom lipida prema RNK u kompoziciji nanočestica.
[1031] Generalno, poželjan je niži N:P odnos. Jedna ili više RNK, lipidi, i njihove količine mogu biti odabrani da obezbede N:P odnos od oko 2:1 do oko 30:1, kao što je 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26:1, 28:1, ili 30:1. U određenim aspektima, N:P odnos može biti od oko 2:1 do oko 8:1. U drugim aspektima, N:P odnos je od oko 5:1 do oko 8:1. U određenim aspektima, N:P odnos je između 5:1 i 6:1. U jednom specifičnom aspektu, N:P odnos je oko 5,67:1.
[1032] Pored obezbeđivanja kompozicija nanočestica, predmetna objava takođe obezbeđuje postupke proizvodnje lipidnih nanočestica koje sadrže inkapsuliranje polinukleotida. Takav postupak sadrži upotrebu bilo koje od farmaceutskih kompozicija koje su ovde objavljene i proizvodnju lipidnih nanočestica u skladu sa postupcima proizvodnje lipidnih nanočestica koji su poznati u struci. Videti, npr. Wang (et al. 2015) Adv. Drug Deliv. Rev. 87:68-80; Silva et al. (2015) Curr. Pharm. Technol. 16: 940-954; Naseri et al. (2015) Adv. Pharm. Bull. 5:305-13; Silva et al. (2015) Curr. Pharm. Biotechnol. 16:291-302, i tamo citirane reference.
[1033] U nekim aspektima, polinukleotid iz objave je formulisan u lipidnoj nanočestici, pri čemu polinukleotid sadrži iRNK koja je objavljena u TABELI 1. U nekim aspektima, polinukleotid iz objave je formulisan u lipidnoj nanočestici, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je izneta u TABELI 1.
[1034] Formulacije lipidnih nanočestica tipično sadrže lipid, posebno amino lipid koji se može jonizovati, na primer, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4- dimetilaminobutirat (DLin-MC3-DMA), ili di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioat (L319), i dodatno sadrže neutralni lipid, sterol i molekul koji je sposoban da redukuje agregaciju čestica, na primer PEG ili PEG-modifikovani lipid.
[1035] U jednom aspektu, formulacija lipidnih nanočestica se suštinski sastoji od (i) najmanje jednog lipida koji je odabran iz grupe koja se sastoji od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319); (ii) neutralnog lipida koji je odabran od DSPC, DPPC, POPC, DOPE i SM; (iii) sterola, npr. holesterola; i (iv) PEG-lipida, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA, u molskom odnosu od oko 20-
4 2
60% amino lipida koji se može jonizovati: 5-25% neutralnog lipida: 25-55% sterola; 0,5-15% PEG-lipida.
[1036] U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 25% do oko 75% na molskoj osnovi amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), npr. od oko 35 do oko 65%, od oko 45 do oko 65%, oko 60%, oko 57,5%, oko 50% ili oko 40% na molskoj osnovi.
[1037] U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 0,5% do oko 15% na molskoj osnovi neutralnog lipida, npr. od oko 3 do oko 12%, od oko 5 do oko 10% ili oko 15%, oko 10%, ili oko 7,5% na molskoj osnovi. Primeri neutralnih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, DSPC, POPC, DPPC, DOPE i SM. U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 5% do oko 50% na molskoj osnovi sterola (npr. oko 15 do oko 45%, oko 20 do oko 40%, oko 40%, oko 38,5%, oko 35%, ili oko 31% na molskoj osnovi. Primer sterola je holesterol. U jednom aspektu, formulacija uključuje od oko 0,5% do oko 20% na molskoj osnovi PEG ili PEG-modifikovanog lipida (npr. oko 0,5 do oko 10%, oko 0,5 do oko 5%, oko 1,5%, oko 0,5%, oko 1,5%, oko 3,5%, ili oko 5% na molskoj osnovi. U jednom aspektu, PEG ili PEG modifikovani lipid sadrži PEG molekul prosečne molekulske težine od 2.000 Da. U drugim aspektima, PEG ili PEG modifikovani lipid sadrži PEG molekul prosečne molekulske težine manje od 2.000, na primer oko 1.500 Da, oko 1.000 Da, ili oko 500 Da. Primeri PEG-modifikovanih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, PEG-distearoil glicerol (PEG-DMG) (koji se ovde takođe označava kao PEG-C14 ili C14-PEG), PEG-cDMA (dodatno diskutovano u Reyes et al. (2005) J. Controlled Release 107:276-287).
[1038] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju 25-75% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), 0,5-15% neutralnog lipida, 5-50% sterola, i 0,5-20% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
[1039] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju 35-65% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), 3-12% neutralnog lipida, 15-45% sterola, i 0,5-10% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
4
[1040] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju 45-65% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), 5-10% neutralnog lipida, 25-40% sterola, i 0,5-10% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
[1041] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 60% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 7,5% neutralnog lipida, oko 31% sterola, i oko 1,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
[1042] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 50% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 10% neutralnog lipida, oko 38,5% sterola, i oko 1,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
[1043] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 50% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 10% neutralnog lipida, oko 35% sterola, oko 4,5% ili oko 5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida, i oko 0,5% lipida koji ciljno deluje na molskoj osnovi.
[1044] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 40% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 15% neutralnog lipida, oko 40% sterola, i oko 5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
[1045] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 57,2% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), oko 7,1% neutralnog lipida, oko 34,3% sterola, i oko 1,4% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
[1046] U jednom aspektu, formulacije iz objave uključuju oko 57,5% amino lipida koji se može jonizovati koji je odabran od PEG lipida je PEG-cDMA (PEG-cDMA je dodatno
4 4
diskutovan u Reyes et al. (2005) J. Controlled Release 107:276-287, oko 7,5% neutralnog lipida, oko 31,5% sterola, i oko 3,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi.
[1047] U nekim aspektima, formulacija lipidnih nanočestica se suštinski sastoji od smeše lipida u molskim odnosima od oko 20-70% amino lipida koji se može jonizovati: 5-45% neutralnog lipida: 20-55% holesterola: 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida; npr. u molskom odnosu od oko 20-60% amino lipida koji se može jonizovati: 5-25% neutralnog lipida: 25-55% holesterola: 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida.
[1048] U određenim aspektima, molski odnos lipida je približno 50/10/38,5/1,5 (mol % amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG, PEG-DSG ili PEG-DPG), 57,2/7,1134,3/1,4 (mol % amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DPPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-cDMA), 40/15/40/5 (mol % amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG), 50/10/35/4,5/0,5 (mol % amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DSG), 50/10/35/5 (amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG), 40/10/40/10 (mol % amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA), 35/15/40/10 (mol % amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA) ili 52/13/30/5 (mol % amino lipid koji se može jonizovati/neutralni lipid, npr. DSPC/Hol/PEG-modifikovani lipid, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA).
[1049] Primeri kompozicija lipidnih nanočestica i postupci pravljenja istih opisani su, na primer, u Semple et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176; Jayarama et al. (2012) Angew. Chem. Int. Ed.51:8529-8533; i Maier et al. (2013) Molecular Therapy 21:570-1578.
[1050] U jednom aspektu, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane sadrže amino lipid koji se može jonizovati, PEG lipid i strukturni lipid i opciono sadrže nekatjonski lipid. Kao neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 40-60% amino lipida koji se može jonizovati, oko 5-15% nekatjonskog lipida, oko 1-2% PEG lipida i oko 30-50% strukturnog lipida. Kao sledeći neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 50% amino lipida koji se može jonizovati, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 1,5% PEG lipida i oko 38,5% strukturnog lipida. Kao još jedan neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 55% amino lipida koji se može jonizovati, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 2,5% PEG lipida i oko 32,5% strukturnog lipida. U jednom aspektu, amino lipid koji se može
4
jonizovati je bilo koji amino lipid koji se može jonizovati koji je ovde opisan, kao što su, ali bez ograničenja na, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA i L319.
[1051] U jednom aspektu, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane su 4 komponentne lipidne nanočestice. Lipidna nanočestica može da sadrži amino lipid koji se može jonizovati, nekatjonski lipid, PEG lipid i strukturni lipid. Kao neograničavajući primer, lipidna nanočestica može da sadrži oko 40-60% amino lipida koji se može jonizovati, oko 5-15% nekatjonskog lipida, oko 1-2% PEG lipida i oko 30-50% strukturnog lipida. Kao sledeći neograničavajući primer, lipidna nanočestica može da sadrži oko 50% amino lipida koji se može jonizovati, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 1,5% PEG lipida i oko 38,5% strukturnog lipida. Kao još jedan neograničavajući primer, lipidna nanočestica može da sadrži oko 55% amino lipida koji se može jonizovati, oko 10% nekatjonskog lipida, oko 2,5% PEG lipida i oko 32,5% strukturnog lipida. U jednom aspektu, amino lipid koji se može jonizovati može biti bilo koji amino lipid koji se može jonizovati koji je ovde opisan kao što su, ali bez ograničenja na, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA i L319.
[1052] U jednom aspektu, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane sadrže amino lipid koji se može jonizovati, nekatjonski lipid, PEG lipid i strukturni lipid. Kao neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 50% amino lipida koji se može jonizovati DLin-KC2-DMA, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 1,5% PEG lipida PEG-DOMG i oko 38,5% strukturnog lipida holesterola. Kao neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 50% amino lipida koji se može jonizovati DLin-MC3-DMA, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 1,5% PEG lipida PEG-DOMG i oko 38,5% strukturnog lipida holesterola. Kao neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 50% amino lipida koji se može jonizovati DLin-MC3-DMA, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 1,5% PEG lipida PEG-DMG i oko 38,5% strukturnog lipida holesterola. Kao još jedan neograničavajući primer, lipidna nanočestica sadrži oko 55% amino lipida koji se može jonizovati L319, oko 10% nekatjonskog lipida DSPC, oko 2,5% PEG lipida PEG-DMG i oko 32,5% strukturnog lipida holesterola.
[1053] U jednom aspektu, lipid je lipid koji se može isecati, kao što su oni opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012170889. U sledećem aspektu, lipid je katjonski lipid kao što je, ali nije ograničen na, Formulu (I) iz S.A.D. patentne prijave br. US20130064894.
[1054] U jednom aspektu, lipid je sintetisan pomoću postupaka koji su poznati u struci i/ili kao što je opisano u Međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259,
4
WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2013086373 i WO2013086354.
[1055] U sledećem aspektu, katjonski lipid je trialkil katjonski lipid. Neograničavajući primeri trialkil katjonskih lipida i postupci pravljenja i upotrebe trialkil katjonskih lipida opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013126803.
[1056] U jednom aspektu, LNP formulacije polinukleotida sadrže PEG-c-DOMG u lipidnom molskom odnosu od 3%. U sledećem aspektu, LNP formulacije polinukleotida sadrže PEG-c-DOMG u lipidnom molskom odnosu od 1,5%.
[1057] U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije polinukleotida koji sadrže iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i/ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid uključuju najmanje jedan od PEGilovanih lipida koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012099755.
[1058] U jednom aspektu, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000). U jednom aspektu, LNP formulacija može da sadrži PEG-DMG 2000, amino lipid koji se može jonizovati poznat u struci i najmanje jednu drugu komponentu. U sledećem aspektu, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000, amino lipid koji se može jonizovati poznat u struci, DSPC i holesterol. Kao neograničavajući primer, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol. Kao još jedan neograničavajući primer, LNP formulacija sadrži PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol u molskom odnosu 2:40:10:48 (videti, npr. Geall et al. (2012) Proc. Nat' l. Acad. Sci. USA 109:14604-9).
[1059] U jednom aspektu, LNP formulacija je formulisana pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji su ovde opisani inkapsulirani su u LNP formulacije kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276; videti takođe, S.A.D. patentne prij. publ. br. US20130037977 i US20100015218.
[1060] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji su ovde opisani formulisani su u nanočestici koja se isporučuje parenteralnim putem kao što je opisano u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20120207845.
4
[1061] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipidnoj nanočestici napravljenoj pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130156845 ili Međunarodnoj publikaciji br. WO2013093648 ili WO2012024526.
[1062] Lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu se napraviti u sterilnom okruženju pomoću sistema i/ili postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130164400.
[1063] U jednom aspektu, LNP formulacija je formulisana u nanočestici kao što je nukleinska kiselina-lipidna čestica koja je opisana u S.A.D. patentu br.8,492,359. Kao neograničavajući primer, lipidna čestica sadrži jedan ili više aktivnih agenasa ili terapijskih agenasa; jedan ili više amino lipida koji se mogu jonizovati koji sadrže od oko 50 mol % do oko 85 mol % ukupnog lipida koji je prisutan u čestici; jedan ili više nekatjonskih lipida koji sadrže od oko 13 mol % do oko 49,5 mol % ukupnog lipida koji je prisutan u čestici; i jedan ili više konjugovanih lipida koji inhibiraju agregaciju čestica koji sadrže od oko 0,5 mol % do oko 2 mol % ukupnog lipida koji je prisutan u čestici.
[1064] Nukleinska kiselina u nanočestici mogu biti polinukleotidi koji su ovde opisani i/ili su poznati u struci.
[1065] U jednom aspektu, LNP formulacija je formulisana pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, modifikovana RNK koja je ovde opisana je inkapsulirana u LNP formulacijama kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276.
[1066] U jednom aspektu, LNP formulacije koje su ovde opisane sadrže polikatjonsku kompoziciju. Kao neograničavajući primer, polikatjonska kompozicija je odabrana od formula 1-60 iz S.A.D. patentne publikacije br. US20050222064. U sledećem aspektu, LNP formulacije koje sadrže polikatjonsku kompoziciju se upotrebljavaju za in vivo i/ili in vitro isporuku modifikovane RNK koja je ovde opisana.
[1067] U jednom aspektu, LNP formulacije koje su ovde opisane dodatno sadrže molekul koji poboljšava permeabilnost. Neograničavajući molekuli koji poboljšavaju permeabilnost opisani su u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20050222064.
[1068] U jednom aspektu, polinukleotidne farmaceutske kompozicije su formulisane u lipozomima kao što su, ali ne ograničavajući se na, DiLa2 lipozome (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES<®>(Marina Biotech, Bothell, WA), na neutralnom DOPC (1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfoholin) bazirane lipozome (npr. siRNA isporuka za kancer jajnika (Landen et
4
al. (2006) Cancer Biology & Therapy 5:1708-1713) i lipozome obložene hijaluronanom (Quiet Therapeutics, Izrael).
[1069] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u lipozomskoj kompoziciji u liofilizovanoj gel-fazi kao što je opisano u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US2012060293.
[1070] Formulacije nanočestica mogu da sadrže fosfatni konjugat. Fosfatni konjugat može povećati in vivo vremena cirkulacije i/ili povećati ciljanu isporuku nanočestice. Fosfatni konjugati za upotrebu sa predmetnom objavom mogu se napraviti pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnoj prijavi br. WO2013033438 ili S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130196948. Kao neograničavajući primer, fosfatni konjugati mogu uključivati jedinjenje bilo koje od formula koje su opisane u Međunarodnoj prijavi br. WO2013033438; videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130066086.
[1071] Formulacija nanočestica može da sadrži polimerni konjugat. Polimerni konjugat može biti konjugat solubilan u vodi. Polimerni konjugat može imati strukturu kao što je opisano u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. 20130059360. U jednom aspektu, polimerni konjugati sa polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotidom koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave mogu biti napravljeni upotrebom postupaka i/ili segmentiranih polimernih reagenasa koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130072709. U sledećem aspektu, polimerni konjugat može imati viseće bočne grupe koje sadrže funkcionalne grupe prstena kao što su, ali ne ograničavajući se na, polimerne konjugate koji su opisani u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130196948.
[1072] Formulacije nanočestica mogu da sadrže konjugat za poboljšanje isporuke nanočestica iz predmetne objave kod subjekta. Dodatno, konjugat može inhibirati fagocitni klirens nanočestica kod subjekta. U jednom aspektu, konjugat je "sopstveni" peptid dizajniran od humanog membranskog proteina CD47, npr. "sopstvene" čestice koje su opisali Rodriguez et al. (2013) Science 339:971-975. Kao što su pokazali Rodriguez et al. sopstveni peptidi su odložili klirens nanočestica posredovan makrofagima, što je poboljšalo isporuku nanočestica. U sledećem aspektu, konjugat je membranski protein CD47. Videti, npr. Rodriguez et al. (2013) Science 339:971-975. Rodriguez et al. su pokazali da, slično "sopstvenim" peptidima,
4
CD47 može povećati odnos cirkulišućih čestica kod subjekta u poređenju sa skremblovanim peptidima i PEG obloženim nanočesticama.
[1073] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave formulisani su u nanočesticama koje sadrže konjugat za poboljšanje isporuke nanočestica iz predmetne objave kod subjekta. Konjugat može biti CD47 membranski ili konjugat može biti izveden iz CD47 membranskog proteina, kao što je "sopstveni" peptid koji je prethodno opisan. U sledećem aspektu, nanočestica može da sadrži PEG i konjugat CD47 ili njegov derivat. U još jednom aspektu, nanočestica sadrži i "sopstveni" peptid koji je prethodno opisan i membranski protein CD47.
[1074] U sledećem aspektu, "sopstveni" peptid i/ili CD47 protein je konjugovan za virusu sličnu česticu ili pseudovirion, kao što je ovde opisano za isporuku polinukleotida iz predmetne objave.
[1075] U sledećem aspektu, farmaceutske kompozicije koje sadrže polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave, mogu da sadrže konjugat sa degradabilnom vezom. Neograničavajući primeri konjugata uključuju aromatičnu funkcionalnu grupu koja sadrži atom vodonika koji se može jonizovati, spejser funkcionalnu grupu, i polimer solubilan u vodi. Kao neograničavajući primer, farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat sa degradabilnom vezom i postupci za isporuku takvih farmaceutskih kompozicija opisani su u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130184443.
[1076] Formulacije nanočestica mogu biti ugljenohidratne nanočestice koje sadrže ugljenohidratni nosač i polinukleotid. Kao neograničavajući primer, ugljenohidratni nosač uključuje, ali nije ograničen na, anhidrid-modifikovani fitoglikogen ili materijal tipa glikogena, fitoglikogen oktenil sukcinat, fitoglikogen beta-dekstrin, anhidrid-modifikovani fitoglikogen beta-dekstrin. Videti, npr. Međunarodnu publikaciju br. WO2012109121; videti takođe S.A.D. pat. prij. publ. br. US20140066363.
[1077] Formulacije nanočestica iz predmetne objave mogu biti obložene surfaktantom ili polimerom kako bi se poboljšala isporuka čestice. U jednom aspektu, nanočestica je obložena hidrofilnom oblogom kao što su, ali bez ograničenja na, PEG obloge i/ili obloge koje imaju neutralno površinsko naelektrisanje. Hidrofilne obloge mogu pomoći da se isporuče nanočestice sa većim korisnim tovarom, kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide
41
unutar centralnog nervnog sistema. Kao neograničavajući primer, nanočestice koje sadrže hidrofilnu oblogu i postupci pravljenja takvih nanočestica opisani su u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130183244.
[1078] U jednom aspektu, lipidne nanočestice iz predmetne objave su hidrofilne polimerne čestice. Neograničavajući primeri hidrofilnih polimernih čestica i postupci pravljenja hidrofilnih polimernih čestica opisani su u S.A.D. patentnoj prijavnoj publikaciji br. US20130210991.
[1079] U sledećem aspektu, lipidne nanočestice iz predmetne objave su hidrofobne polimerne čestice. Formulacije lipidnih nanočestica mogu se poboljšati zamenom katjonskog lipida koji se može jonizovati sa biodegradabilnim katjonskim lipidom koji se može jonizovati koji je poznat kao brzo eliminisana lipidna nanočestica (reLNP). Pokazano je da se katjonski lipidi koji se mogu jonizovati, kao što su, ali bez ograničenja na, DLinDMA, DLin-KC2-DMA, i DLin-MC3-DMA, akumuliraju u plazmi i tkivima tokom vremena i mogu biti potencijalni izvor toksičnosti. Brzi metabolizam brzo eliminisanih lipida može poboljšati podnošljivost i terapijski indeks lipidnih nanočestica za red veličine od 1 mg/kg doze do 10 mg/kg doze kod pacova. Uključivanje enzimski degradirane estarske veze može poboljšati profil degradacije i metabolizma katjonske komponente, dok i dalje održava aktivnost reLNP formulacije. Estarska veza može biti interno locirana unutar lipidnog lanca ili može biti terminusno locirana na terninusnom kraju lipidnog lanca. Unutrašnja estarska veza može da zameni bilo koji ugljenik u lipidnom lancu.
[1080] U jednom aspektu, unutrašnja estarska veza je locirana sa bilo koje strane zasićenog ugljenika.
[1081] U jednom aspektu, imunski odgovor se izaziva isporučivanjem lipidne nanočestice koja može uključivati nanovrste, polimer i imunogen. Videti, npr. S.A.D. patentnu prijavnu publikaciju br. US20120189700 i Međunarodnu publikaciju br. WO2012099805. Polimer može inkapsulirati nanovrste ili delimično inkapsulirati nanovrste. Imunogen može biti rekombinantni protein, modifikovana RNK i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid koji je ovde opisan, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid koji je ovde opisan, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid koji je ovde opisan.
[1082] Lipidne nanočestice se mogu projektovati tako da se izmene površinska svojstva čestica tako da lipidne nanočestice mogu da penetriraju kroz mukusnu barijeru. Mukus je lociran na mukoznom tkivu kao što je, ali nije ograničeno na, oralno (npr. bukalne i ezofagusne membrane i tkivo krajnika), oftalmološko, gastrointestinalno (npr. želudac, tanko crevo, debelo crevo, kolon, rektum), nazalno, respiratorno (npr. nazalne, faringealne, trahealne i bronhijalne membrane), genitalno (npr. vaginalne, cervikalne i uretralne membrane). Smatra se da su nanočestice veće od 10-200 nm koje su poželjne zbog veće efikasnosti inkapsulacije leka i sposobnosti da obezbede neprekidnu isporuku širokog spektra lekova prevelike da bi brzo difundovale kroz mukusne barijere. Mukus se kontinuirano sekretuje, skida, odbacuje ili digestira i reciklira, tako da se većina zarobljenih čestica može ukloniti iz mukoznog tkiva unutar nekoliko sekundi ili nekoliko sati. Velike polimerne nanočestice (200 nm-500 nm u prečniku) koje su gusto obložene polietilen glikolom male molekulske težine (PEG) difunduju kroz mukus samo 4 do 6 puta sporije od istih čestica koje difunduju u vodi (Lai et al. (2007) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 104:1482-487; Lai et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61:158-171). Transport nanočestica se može odrediti upotrebom stopa permeacije i/ili tehnika fluorescentne mikroskopije uključujući, ali ne ograničavajući se na, oporavak fluorescencije posle fotobeljenja (FRAP) i praćenje više čestica u visokoj rezoluciji (MPT). Kao neograničavajući primer, kompozicije koje mogu da penetriraju kroz mukusnu barijeru mogu se napraviti kao što je opisano u S.A.D. pat. br.
8,241,670 ili Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013110028 (videti, takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20150297531).
[1083] Lipidna nanočestica projektovana da penetrira kroz mukus može da sadrži polimerni materijal (tj. polimerno jezgro) i/ili polimer-vitamin konjugat i/ili tri-blok kopolimer. Polimerni materijal može uključivati, ali nije ograničen na, poliamine, polietre, poliamide, poliestre, polikarbamate, poliuree, polikarbonate, poli(stirene), poliimide, polisulfone, poliuretane, poliacetilene, polietilene, polietienimine, poliizocijanate, poliakrilate, polimetakrilate, poliakrilonitrile, i poliarilate. Polimerni materijal može biti biodegradabilan i/ili biokompatibilan. Neograničavajući primeri biokompatibilnih polimera opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013116804; videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130203713. Polimerni materijal se može dodatno zračiti. Kao neograničavajući primer, polimerni materijal može biti gama zračen. Videti, npr. Međunarodnu prij. br. WO2012082165; videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130101609.
[1084] Neograničavajući primeri specifičnih polimera uključuju poli(kaprolakton) (PCL), etilen vinil acetat polimer (EVA), poli(mlečna kiselina) (PLA), poli(L-mlečna kiselina) (PLLA), poli(glikolna kiselina) (PGA), poli(mlečna kiselina-ko-glikolna kiselina) (PLGA), poli(L-mlečna kiselina-ko-glikolna kiselina) (PLLGA), poli(D,L-laktid) (PDLA), poli(L-laktid) (PLLA), poli(D,L-laktid-ko-kaprolakton), poli(D,L-laktid-ko-kaprolakton-ko-glikolid), poli(D,L-laktid-ko-PEO-ko-D,L-laktid), poli(D,L-laktid-ko-PPO-ko-D,L-laktid), polialkil cijanoakralat, poliuretan, poli-L-lizin (PLL), hidroksipropil metakrilat (HPMA), polietilenglikol, poli-L-glutaminska kiselina, poli(hidroksi kiseline), polianhidride, poliortoestre, poli(estar amide), poliamide, poli(estar etre), polikarbonate, polialkilene kao što su polietilen i polipropilen, polialkilen glikole kao što je poli(etilen glikol) (PEG), polialkilen okside (PEO), polialkilen tereftalate kao što je poli(etilen tereftalat), polivinil alkohole (PVA), polivinil etre, polivinil estre kao što je poli(vinil acetat), polivinil halide kao što je poli(vinil hlorid) (PVC), polivinilpirolidon, polisiloksane, polistirene (PS), poliuretane, derivatizovane celuloze kao što su alkil celuloze, hidroksialkil celuloze, celuloza etri, celuloza estri, nitro celuloze, hidroksipropilceluloza, karboksimetilceluloza, polimere akrilne kiseline, kao što su poli(metil(met)akrilat) (PMMA), poli(etil(met)akrilat), poli(butil(met)akrilat), poli(izobutil(met)akrilat), poli(heksil(met)akrilat), poli(izodecil(met)akrilat), poli(lauril(met)akrilat), poli(fenil(met)akrilat), poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), poli(izobutil akrilat), poli(oktadecil akrilat) i njihove kopolimere i smeše, polidioksanone i njegove kopolimere, polihidroksialkanoate, polipropilen fumarate, polioksimetilen, poloksamere, poli(orto)estre, poli(buterna kiselina), poli(valerinska kiselina), poli(laktid-kokaprolakton), PEG-PLGA-PEG i trimetilen karbonat, polivinilpirolidon. Lipidna nanočestica može biti obložena ili asocirana sa kopolimerom kao što su, ali ne ograničavajući se na, blok kopolimer (kao što je razgranati polietar-poliamid blok kopolimer koji je opisan u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013012476), i (poli(etilen glikol))-(poli(propilen oksid))-(poli(etilen glikol)) triblok kopolimer. Videti, npr. S.A.D. patentne prijavne publikacije br. US20120121718 i US20100003337, i S.A.D. pat. br.8,263,665.
[1085] Kopolimer može biti polimer koji se generalno smatra bezbednim (GRAS) i formiranje lipidne nanočestice može biti na takav način da se ne kreiraju novi hemijski entiteti. Na primer, lipidna nanočestica može da sadrži poloksamere koji oblažu PLGA nanočestice bez formiranja novih hemijskih entiteta koja i dalje može brzo penetrirati kroz humani mukus. Yang et al. (2011) Angew. Chem. Int. Ed. 50:2597-2600. Neograničavajući skalabilni postupak za proizvodnju nanočestica koje mogu penetrirati kroz humani mukus opisali su Xu et al. (2013) J. Control Release 170:279-86.
[1086] Vitamin iz polimer-vitamin konjugata može biti vitamin E. Vitaminski deo konjugata može biti supstituisan sa drugim pogodnim komponentama kao što su, ali ne ograničavajući se na, vitamin A, vitamin E, druge vitamine, holesterol, hidrofobnu funkcionalnu grupu, ili hidrofobnu komponentu drugih surfaktanata (npr. lanci sterola, masne kiseline, lanci ugljovodonika i lanci alkilen oksida).
41
[1087] Lipidna nanočestica projektovana da penetrira kroz mukus može uključivati agense za menjanje površine kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide, anjonske proteine (npr. goveđi serumski albumin), surfaktante (npr. katjonski surfaktanti kao što su na primer dimetildioktadecil-amonijum bromid), šećere ili derivate šećera (npr. ciklodekstrin), nukleinske kiseline, polimere (npr. heparin, polietilen glikol i poloksamer), mukolitičke agense (npr. N-acetilcistein, pelin, bromelain, papain, klerodendrum, acetilcistein, bromheksin, karbocistein, eprazinon, mesna, ambroksol, sobrerol, domiodol, letostein, stepronin, tiopronin, gelsolin, timozin β4 dornaza alfa, nelteneksin, erdostein) i razne DNaze uključujući rhDNazu. Agens za menjanje površine može biti ugrađen ili upleten u površinu čestice ili raspoređen (npr. oblaganjem, adsorpcijom, kovalentnim povezivanjem, ili drugim postupkom) na površini lipidne nanočestice. Videti, npr. S.A.D. patentne prijavne publikacije br. US20100215580, US20080166414, i US20130164343.
[1088] U jednom aspektu, lipidne nanočestice koje penetriraju kroz mukus sadrže najmanje jedan polinukleotid koji je ovde opisan. Polinukleotid može biti inkapsuliran u lipidnoj nanočestici i/ili raspoređen na površini čestice. Polinukleotid se može kovalentno vezati za lipidnu nanočesticu. Formulacije lipidnih nanočestica koje penetriraju kroz mukus mogu da sadrži veći broj nanočestica. Dodatno, formulacije mogu da sadrže čestice koje mogu da interaguju sa mukusom i izmene strukturna i/ili adhezivna svojstva okolnog mukusa kako bi se smanjila mukoadhezija što može povećati isporuku lipidnih nanočestica koje penetriraju kroz mukus do mukoznog tkiva.
[1089] U sledećem aspektu, lipidne nanočestice koje penetriraju kroz mukus su hipotonična formulacija koja sadrži oblogu koja poboljšava mukoznu penetraciju. Formulacija može biti hipotonična za epitel u koji se isporučuje. Neograničavajući primeri hipotoničnih formulacija mogu se pronaći u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013110028; videti takođe S.A.D. pat. prij. publ. br. US20150297531.
[1090] U jednom aspektu, kako bi se poboljšala isporuka kroz mukusnu barijeru polinukleotidna formulacija sadrži ili je hipotonični rastvor. Pronađeno je da hipotonični rastvori povećavaju stopu kojom su mukoinertne čestice, kao što su, ali ne ograničavajući se na, čestice koje penetriraju kroz mukus, mogle da dođu do površine vaginalnog epitela. Videti, npr. Ensign et al. (2013) Biomaterials 34:6922-9.
[1091] U jednom aspektu, polinukleotid je formulisan kao lipopleks, kao što su, bez ograničenja, ATUPLEX<™>sistem, DACC sistem, DBTC sistem i druga siRNA-lipopleks tehnologija od Silence Therapeutics (London, Ujedinjeno Kraljevstvo), STEMFECT<™>od STEMGENT<®>(Cambridge, MA), i polietilenimin (PEI) ili ciljana i neciljana isporuka nukleinskih kiselina na bazi protamina. Videti Aleku et al. (2008) Cancer Res. 68:9788-9798; Strumberg et al. (2012) Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 50:76-78; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1222-1234; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1360-1370; Gutbier et al. (2010) Pulm. Pharmacol. Ther. 23:334-344; Kaufmann et al. (2010) Microvasc. Res. 80:286-293; Weide et al. (2009) J. Immunother. 32:498-507; Weide et al. (2008) J. Immunother.
31:180-188; Pascolo (2004) Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al. (2011) J. Immunother. 34:1-15; Song et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:709-717; Peer et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6:104:4095-4100; deFougerolles (2008) Hum. Gene Ther.
19:125-132).
[1092] U jednom aspektu, takve formulacije se takođe konstruišu ili kompozicije menjaju tako da su pasivno ili aktivno usmerene na različite tipove ćelija in vivo, uključujući, ali ne ograničavajući se na hepatocite, imunske ćelije, tumorske ćelije, endotelske ćelije, antigenprezentujuće ćelije, i leukocite (Akinc et al. (2010) Mol. Ther. 18:1357-1364; Song et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:709-717; Judge et al. (2009) J. Clin. Invest. 119:661-673; Kaufmann et al. (2010) Microvasc. Res. 80:286-293; Santel et al. (2006) Gene Ther.
13:1222-1234; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1360-1370; Gutbier et al. (2010) Pulm. Pharmacol. Ther. 23:334-344; Basha et al. (2011) Mol. Ther. 19:2186-2200; Fenske and Cullis (2008) Expert Opin. Drug Deliv.5:25-44; Peer et al. (2008) Science 319:627-630; Peer and Lieberman (2011) Gene Ther. 18:1127-1133). Jedan primer pasivnog ciljnog delovanja formulacija na ćelije jetre uključuje formulacije lipidnih nanočestica na bazi DLin-DMA, DLin-KC2-DMA i DLin-MC3-DMA za koje se pokazalo da se vezuju za apolipoprotein E i promovišu vezivanje i unos ovih formulacija u hepatocite in vivo (Akinc et al. (2010) Mol. Ther. 18:1357-1364).
[1093] Formulacije takođe mogu selektivno ciljati preko ekspresije različitih liganada na njihovoj površini kao što je pokazano putem primera, ali nije ograničeno na, pristupe ciljanja pomoću folata, transferina, N-acetilgalaktozamina (GalNAc), i antitela. Videti, npr. Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci.
2011 16:1388-1412; Yu et al., Mol Membr Biol. 201027:286-298; Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319; Akinc et al., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan et al., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:4095-4100; Kim et al., Methods Mol Biol.2011 721:339-353; Subramanya et al., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song et al., Nat Biotechnol. 2005
41
23:709-717; Peer et al., Science. 2008319:627-630; i, Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133.
[1094] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz objave formulisani su kao čvrsta lipidna nanočestica.
[1095] Čvrsta lipidna nanočestica (SLN) može biti sferna sa prosečnim prečnikom između 10 i 1.000 nm. SLN poseduje čvrsti matriks lipidnog jezgra koji može da solubilizuje lipofilne molekule i može da bude stabilizovan surfaktantima i/ili emulgatorima. U dodatnom aspektu, lipidna nanočestica može biti samo-asemblirajuća lipid-polimer nanočestica. Videti Zhang et al. (2008) ACS Nano 2:1696-1702. Kao neograničavajući primer, SLN može biti SLN koja je opisana u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013105101. Kao sledeći neograničavajući primer, SLN se može napraviti pomoću postupaka ili procesa koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013105101.
[1096] Lipozomi, lipopleksi, ili lipidne nanočestice se mogu upotrebljavati za poboljšanje efikasnosti polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, i bilo koju njihovu kombinaciju pošto ove formulacije mogu da povećaju ćelijsku transfekciju od strane polinukleotida; i/ili povećaju translaciju kodiranih IL-23, IL-36, IL-18, i OX40L. Jedan takav primer uključuje upotrebu inkapsulacije lipida kako bi se omogućila efikasna sistemska isporuka polipleksa DNK plazmida. Videti Heyes et al. (2007) Mol. Ther. 15:713-720. Lipozomi, lipopleksi, ili lipidne nanočestice se takođe mogu upotrebljavati za povećanje stabilnosti polinukleotida.
[1097] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid iz predmetne objave formulisani su za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku.
[1098] Kao što se ovde upotrebljava, "kontrolisano oslobađanje" označava profil oslobađanja farmaceutske kompozicije ili jedinjenja koji je u skladu sa određenim obrascem oslobađanja kako bi se postigao terapijski ishod. U jednom aspektu, polinukleotidi su inkapsulirani u agens za isporuku koji je ovde opisan i/ili poznat u struci za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku. Kao što se ovde upotrebljava, termin "inkapsulirati" znači zatvoriti, okružiti
41
ili obložiti. Kako se odnosi na formulaciju jedinjenja iz objave, inkapsulacija može biti suštinska, potpuna ili delimična. Termin "suštinski inkapsuliran" znači da najmanje više od 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 ili više od 99,999% farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave može biti zatvoreno, okruženo ili obloženo u agensu za isporuku. "Delimična inkapsulacija" znači da manje od 10, 10, 20, 30, 40 50 ili manje farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave može biti zatvoreno, okruženo ili obloženo u agensu za isporuku. Povoljno, inkapsulacija se može odrediti merenjem bega ili aktivnosti farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave upotrebom fluorescencije i/ili elektronske mikrografije. Na primer, najmanje 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ili više od 99,99% farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave inkapsulirano je u agensu za isporuku.
[1099] U jednom aspektu, formulacija za kontrolisano oslobađanje uključuje, ali nije ograničena na, tri-blok kopolimere. Kao neograničavajući primer, formulacija uključuje dva različita tipa tri-blok kopolimera. Videti Međunarodne publikacije br. WO2012131104 i WO2012131106; videti takođe S.A.D. pat. prij. publ. br. US20140219923 i US20150165042.
[1100] U sledećem aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid inkapsuliraju se u lipidnu nanočesticu ili brzo eliminisanu lipidnu nanočesticu i lipidne nanočestice ili brzo eliminisana lipidna nanočestica mogu zatim biti inkapsulirane u polimer, hidrogel i/ili hirurški zaptivač koji je ovde opisan i/ili poznat u struci. Kao neograničavajući primer, polimer, hidrogel ili hirurški zaptivač je PLGA, etilen vinil acetat (EVAc), poloksamer, GELSITE<®>(Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX<®>(Halozyme Therapeutics, San Dijego, CA), hirurški zaptivači kao što su fibrinogen polimeri (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL), zaptivači na bazi PEG, ili COSEAL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL).
[1101] U sledećem aspektu, lipidna nanočestica je inkapsulirana u bilo koji polimer koji je poznat u struci koji može da formira gel kada se ubrizga u subjekta. Kao sledeći neograničavajući primer, lipidna nanočestica je inkapsulirana u polimerni matriks koji može biti biodegradabilan.
[1102] U jednom aspektu, formulacija za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18
41
polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid takođe uključuje najmanje jednu oblogu za kontrolisano oslobađanje.
[1103] Obloge za kontrolisano oslobađanje uključuju, ali nisu ograničene na, OPADRY<®>, polivinilpirolidon/vinil acetat kopolimer, polivinilpirolidon, hidroksipropil metilcelulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksietil celulozu, EUDRAGIT RL<®>, EUDRAGIT RS<®>i derivate celuloze kao što su vodene disperzije etilceluloze (AQUACOAT<®>i SURELEASE<®>).
[1104] U jednom aspektu, formulacija polinukleotida za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku sadrži najmanje jedan degradabilni poliestar koji može da sadrži polikatjonske bočne lance. Degradabilni poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktidko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove kombinacije. U sledeće,m aspektu, degradabilni poliestri mogu uključivati PEG konjugaciju kako bi se formirao PEGilovani polimer.
[1105] U jednom aspektu, formulacija polinukleotida za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku koja sadrži najmanje jedan polinukleotid sadrži najmanje jedan derivat PEG i/ili PEG-srodnog polimera kao što je opisano u S.A.D. patentu br.8,404,222.
[1106] U sledećem aspektu, formulacija polinukleotida za kontrolisano oslobađanje koja sadrži najmanje jedan polinukleotid je polimerni sistem za kontrolisano oslobađanje koji je opisan u S.A.D. prij. publ. br. US20130130348.
[1107] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, iz predmetne objave inkapsulirani su u terapijskoj nanočestici.
[1108] Terapijske nanočestice mogu biti formulisane pomoću postupaka koji su ovde opisani i poznati u struci, kao što su, ali nije ograničeno na, Međunarodne publikacije br. WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, S.A.D. patentne prij. publ. br. US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20130123351 i US20130230567, i S.A.D. patente br. 8,206,747, 8,293,276, 8,318,208 i 8,318,211. U sledećem aspektu, terapijske polimerne nanočestice se mogu identifikovati pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20120140790.
[1109] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su za neprekidno oslobađanje.
41
[1110] Kao što se ovde upotrebljava, "neprekidno oslobađanje" označava farmaceutsku kompoziciju ili jedinjenje koje je u skladu sa stopom oslobađanja tokom određenog vremenskog perioda. Vremenski period može uključivati, ali nije ograničen na, sate, dane, nedelje, mesece i godine. Kao neograničavajući primer, nanočestica za neprekidno oslobađanje sadrži polimer i terapijski agens kao što je, ali nije ograničeno na, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid iz predmetne objave. Videti Međunarodnu publ. br. WO2010075072 i S.A.D. patentne prij. publ. br. US20100216804, US20110217377 i US20120201859. U sledećem neograničavajućem primeru, formulacija za neprekidno oslobađanje sadrži agense koji dozvoljavaju perzistentnu bioraspoloživost, kao što su, ali bez ograničenja na, kristale, makromolekulske gelove i/ili suspenzije čestica. Videti S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130150295.
[1111] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid mogu biti formulisani tako da budu specifični za cilj.
[1112] Kao neograničavajući primer, terapijske nanočestice uključuju kortikosteroid. Videti Međunarodnu pub. br. WO2011084518. Kao neograničavajući primer, terapijske nanočestice su formulisane u nanočesticama koje su opisane u Međunarodnim publ. br. WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 i S.A.D. patentnim prij. publ. br. US20100069426, US20120004293 i US20100104655.
[1113] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave sadrže polimerni matriks. Kao neograničavajući primer, nanočestica sadrži dva ili više polimera kao što su, ali ne ograničavajući se na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksikiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, polilizin, poli(etilen imin), poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije.
[1114] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži diblok kopolimer. U jednom aspektu, diblok kopolimer uključuje PEG u kombinaciji sa polimerom kao što su, ali ne ograničavajući se na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksikiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate,
41
polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, polilizin, poli(etilen imin), poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije. U još jednom aspektu, diblok kopolimer je diblok kopolimer sa visokim X, kao što su oni koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013120052; videti takođe S.A.D. pat. prij. publ. br. US20150337068.
[1115] Kao neograničavajući primer, terapijska nanočestica sadrži PLGA-PEG blok kopolimer. Videti S.A.D. pat. prij. publ. br. US20120004293 i S.A.D. pat. br. 8,236,330. U sledećem neograničavajućem primeru, terapijska nanočestica je stelt nanočestica koja sadrži diblok kopolimer PEG i PLA ili PEG i PLGA. Videti S.A.D. pat. br. 8,246,968 i Međunarodnu publikaciju br. WO2012166923. U još jednom neograničavajućem primeru, terapijska nanočestica je stelt nanočestica ili stelt nanočestica specifična za cilj kao što je opisano u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130172406.
[1116] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži multiblok kopolimer. Videti, npr. S.A.D. patente br. 8,263,665 i 8,287,910 i S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130195987. U još jednom neograničavajućem primeru, lipidna nanočestica sadrži blok kopolimer PEG-PLGA-PEG. Videti, npr. Lee et al. (2003) Pharmaceutical Research 20:1995-2000; Li et al. (2003) Pharmaceutical Research 20:884-888; i Chang et al. (2007) J. Controlled Release. 118:245-253.
[1117] Polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama i/ili OX40L polipeptid iz predmetne objave mogu se formulisati u lipidnim nanočesticama koje sadrže PEG-PLGA-PEG blok kopolimer.
[1118] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži multiblok kopolimer. Videti, npr. S.A.D. patente br.8,263,665 i 8,287,910 i S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130195987.
[1119] U jednom aspektu, blok kopolimeri koji su ovde opisani uključeni su u polijonski kompleks koji sadrži nepolimernu micelu i blok kopolimer. Videti, npr. S.A.D. pat. prij. publ. br. US20120076836.
[1120] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži najmanje jedan akrilni polimer. Akrilni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na, akrilnu kiselinu, metakrilnu kiselinu, kopolimere akrilne kiseline i metakrilne kiseline, kopolimere metil metakrilata, etoksietil metakrilate, cijanoetil metakrilat, amino alkil metakrilat kopolimer, poli(akrilnu kiselinu), poli(metakrilnu kiselinu), policijanoakrilate i njihove kombinacije.
[1121] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan poli(vinil estar) polimer. Poli(vinil estar) polimer može biti kopolimer kao što je nasumični kopolimer. Kao
42
neograničavajući primer, nasumični kopolimer ima strukturu kao što su one koje su opisane u Međunarodnoj prijavi br. WO2013032829 ili S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130121954. U jednom aspektu, poli(vinil estar) polimeri mogu biti konjugovani za polinukleotide koji su ovde opisani.
[1122] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži najmanje jedan diblok kopolimer. Diblok kopolimer može biti, ali nije ograničen na, poli(mlečna) kiselina-poli(etilen)glikol kopolimer. Videti, npr. Međunarodnu patentnu publikaciju br. WO2013044219.
[1123] Kao neograničavajući primer, terapijske nanočestice se upotrebljavaju za lečenje kancera. Videti Međunarodnu publikaciju br. WO2013044219; videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20150017245.
[1124] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan katjonski polimer koji je ovde opisan i/ili poznat u struci.
[1125] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan polimer koji sadrži amin kao što su, ali ne ograničavajući se na, polilizin, polietilen imin, poli(amidoamin) dendrimere, poli(beta-amino estre) i njihove kombinacije. Videti, npr. S.A.D. pat. br.
8,287,849.
[1126] U sledećem aspektu, nanočestice koje su ovde opisane sadrže amin katjonski lipid kao što su oni koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO2013059496. U jednom aspektu katjonski lipidi imaju amino-aminsku ili amino-amidnu funkcionalnu grupu.
[1127] U jednom aspektu, terapijske nanočestice sadrže najmanje jedan degradabilni poliestar koji može da sadrži polikatjonske bočne lance. Degradabilni poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove kombinacije. U sledećem aspektu, degradabilni poliestri mogu uključivati PEG konjugaciju kako bi se formirao PEGilovani polimer.
[1128] U sledećem aspektu, terapijska nanočestica uključuje konjugaciju najmanje jednog ciljno delujućeg liganda. Ciljno delujući ligand može biti bilo koji ligand koji je poznat u struci, kao što je, ali nije ograničeno na, monoklonalno antitelo. Videti Kirpotin et al (2006) Cancer Res.66:6732-6740.
[1129] U jednom aspektu, terapijska nanočestica je formulisana u vodenom rastvoru koji se može upotrebljavati za ciljanje kancera (videti Međunarodnu publ. br. WO2011084513 i S.A.D. pat. prij. publ. br. US20110294717).
[1130] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, formulisani su upotrebom postupaka koji su opisani u S.A.D. patentu br.8,404,799.
[1131] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, inkapsulirani su, povezani za i/ili asocirani sa sintetičkim nanonosačima.
[1132] Sintetički nanonosači uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2010005740, WO2010030763, WO201213501, WO2012149252, WO2012149255, WO2012149259, WO2012149265, WO2012149268, WO2012149282, WO2012149301, WO2012149393, WO2012149405, WO2012149411, WO2012149454 i WO2013019669, i S.A.D. patentnim prij. publ. br. US20110262491, US20100104645, US20100087337 i US20120244222. Sintetički nanonosači mogu biti formulisani upotrebom postupaka koji su poznati u struci i/ili ovde opisani. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači mogu biti formulisani pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2010005740, WO2010030763 i WO201213501 i S.A.D. patentnim prij. publ. br. US20110262491, US20100104645, US20100087337 i US2012024422. U sledećem aspektu, formulacije sintetičkih nanonosača mogu biti liofilizovane pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnoj publ. br. WO2011072218 i S.A.D. pat. br. 8,211,473. U još jednom aspektu, formulacije iz predmetne objave, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sintetičke nanonosače, mogu biti liofilizovane ili rekonstituisane pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130230568.
[1133] U jednom aspektu, sintetički nanonosači sadrže reaktivne grupe za oslobađanje polinukleotida koji su ovde opisani (videti Međunarodnu publ. br. WO20120952552 i S.A.D. pat. prij. publ. br. US20120171229).
[1134] U jednom aspektu, sintetički nanonosači sadrže imunostimulatorni agens za poboljšanje imunskog odgovora od isporuke sintetičkog nanonosača. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosač može da sadrži Th1 imunostimulatorni agens koji može poboljšati odgovor imunskog sistema zasnovan na Th1 (videti Međunarodnu publ. br. WO2010123569 i S.A.D. pat. prij. publ. br. US20110223201).
[1135] U jednom aspektu, sintetički nanonosači su formulisani za ciljano oslobađanje. U jednom aspektu, sintetički nanonosač je formulisan tako da oslobađa polinukleotide pri specificiranoj pH i/ili posle željenog vremenskog intervala. Kao neograničavajući primer, sintetičke nanočestice su formulisane tako da oslobađaju polinukleotide posle 24 sata i/ili pri pH od 4,5 (videti Međunarodne publikacije br. WO2010138193 i WO2010138194 i S.A.D. patentne prij. publ. br. US20110020388 i US20110027217).
[1136] U jednom aspektu, sintetički nanonosači su formulisani za kontrolisano i/ili neprekidno oslobađanje polinukleotida koji su ovde opisani. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači za neprekidno oslobađanje formulisani su pomoću postupaka koji su poznati u struci, koji su ovde opisani i/ili kao što je opisano u Međunarodnoj publ. br. WO2010138192 i S.A.D. pat. prij. publ. br.20100303850.
[1137] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, formulisani su za kontrolisano i/ili neprekidno oslobađanje pri čemu formulacija sadrži najmanje jedan polimer koji je polimer kristalnog bočnog lanca (CYSC). CYSC polimeri su opisani u S.A.D. patentu br.8,399,007.
[1138] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, inkapsulirani su u, povezani za i/ili asocirani sa cviterjonskim lipidima. Neograničavajući primeri cviterjonskih lipida i postupci upotrebe cviterjonskih lipida opisani su u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130216607. U jednom aspektu, cviterjonski lipidi se mogu upotrebljavati u lipozomima i lipidnim nanočesticama koje su ovde opisane.
[1139] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, formulisani su u koloidnim nanonosačima kao što je opisano u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130197100.
[1140] U jednom aspektu, nanočestica je optimizovana za oralnu primenu. Nanočestica može da sadrži najmanje jedan katjonski biopolimer kao što je, ali ne ograničavajući se na, hitozan ili njegov derivat. Kao neograničavajući primer, nanočestica se može formulisati pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20120282343.
[1141] U nekim aspektima, LNP sadrže lipid KL52 (amino-lipid koji je objavljen u S.A.D. pat. prij. publ. br. US2012/0295832). Aktivnost i/ili bezbednost (izmerena ispitivanjem jednog ili više od ALT/AST, broja belih krvnih zrnaca i indukcije citokina) primene LNP
42
mogu se poboljšati inkorporacijom takvih lipida. LNP koje sadrže KL52 mogu se primenjivati intravenski i/ili u jednoj ili više doza. U nekim aspektima, primena LNP koje sadrže KL52 rezultuje jednakom ili poboljšanom ekspresijom iRNK i/ili proteina u poređenju sa LNP koje sadrže MC3.
[1142] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, isporučuju se upotrebom manjih LNP. Takve čestice mogu sadržati prečnik od ispod 0,1 um do 100 nm, kao što je, ali ne ograničavajući se na, manje od 0,1 um, manje od 1,0 um, manje od 5 um, manje od 10 um, manje od 15 um, manje od 20 um, manje od 25 um, manje od 30 um, manje od 35 um, manje od 40 um, manje od 50 um, manje od 55 um, manje od 60 um, manje od 65 um, manje od 70 um, manje od 75 um, manje od 80 um, manje od 85 um, manje od 90 um, manje od 95 um, manje od 100 um, manje od 125 um, manje od 150 um, manje od 175 um, manje od 200 um, manje od 225 um, manje od 250 um, manje od 275 um, manje od 300 um, manje od 325 um, manje od 350 um, manje od 375 um, manje od 400 um, manje od 425 um, manje od 450 um, manje od 475 um, manje od 500 um, manje od 525 um, manje od 550 um, manje od 575 um, manje od 600 um, manje od 625 um, manje od 650 um, manje od 675 um, manje od 700 um, manje od 725 um, manje od 750 um, manje od 775 um, manje od 800 um, manje od 825 um, manje od 850 um, manje od 875 um, manje od 900 um, manje od 925 um, manje od 950 um, ili manje od 975 um.
[1143] U sledećem aspektu, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, isporučuju se upotrebom manjih LNP koje mogu sadržati prečnik od oko 1 nm do oko 100 nm, od oko 1 nm do oko 10 nm, oko 1 nm do oko 20 nm, od oko 1 nm do oko 30 nm, od oko 1 nm do oko 40 nm, od oko 1 nm do oko 50 nm, od oko 1 nm do oko 60 nm, od oko 1 nm do oko 70 nm, od oko 1 nm do oko 80 nm, od oko 1 nm do oko 90 nm, od oko 5 nm do oko 100 nm, od oko 5 nm do oko 10 nm, oko 5 nm do oko 20 nm, od oko 5 nm do oko 30 nm, od oko 5 nm do oko 40 nm, od oko 5 nm do oko 50 nm, od oko 5 nm do oko 60 nm, od oko 5 nm do oko 70 nm, od oko 5 nm do oko 80 nm, od oko 5 nm do oko 90 nm, oko 10 do oko 50 nm, od oko 20 do oko 50 nm, od oko 30 do oko 50 nm, od oko 40 do oko 50 nm, od oko 20 do oko 60 nm, od oko 30 do oko 60 nm, od oko 40 do oko 60 nm, od oko 20 do oko 70 nm, od oko 30 do oko 70 nm, od oko 40 do oko 70 nm, od oko 50 do oko 70 nm, od oko 60 do oko 70 nm, od oko 20 do oko 80 nm, od oko 30 do oko 80 nm, od oko 40 do oko 80 nm, od oko 50 do oko 80 nm, od oko 60 do oko 80 nm, od oko 20 do oko 90 nm, od oko 30 do oko 90 nm, od oko 40 do oko 90 nm, od oko 50 do oko 90 nm, od oko 60 do oko 90 nm i/ili od oko 70 do oko 90 nm.
[1144] U nekim aspektima, takve LNP se sintetišu upotrebom postupaka koji sadrže mikrofluidne miksere. Primeri mikrofluidnih miksera mogu uključivati, ali nisu ograničeni na interdigitalni mikromikser sa prorezom, uključujući, ali ne ograničavajući se na one koje proizvodi Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austrija) i/ili mikromikser sa rasporedom riblje kosti (SHM). Videti Zhigaltsev et al. (2012) Langmuir 28:3633-40; Belliveau et al. (2012) Molecular Therapy-Nucleic Acids 1:e37; Chen et al. (2012) J. Am. Chem. Soc.
134:6948-51.
[1145] U nekim aspektima, postupci generisanja LNP koji sadrže SHM, dodatno sadrže mešanje najmanje dva ulazna toka pri čemu se mešanje dešava mikrostrukturomindukovanom haotičnom advekcijom (MICA). U skladu sa ovim postupkom, tokovi fluida teku kroz kanale prisutne u obliku riblje kosti uzrokujući rotacioni tok i međusobno preklapanje fluida. Ovaj postupak takođe može da sadrži površinu za mešanje fluida pri čemu površina menja orijentaciju tokom kruženja fluida. Postupci generisanja LNP upotrebom SHM uključuju one koji su objavljeni u S.A.D. patentnim prij. publ. br. US2004/0262223 i US2012/0276209.
[1146] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, iz predmetne objave formulisani su u lipidnim nanočesticama kreiranim upotrebom mikromiksera kao što je, ali ne ograničavajući se na, interdigitalni mikrostrukturirani mikser sa prorezom (SIMM-V2) ili standardni interdigitalni mikro mikser sa prorezom (SSIMM) ili Caterpillar (CPMM) ili Impinging-jet (IJMM) iz Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz, Nemačka.
[1147] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, iz predmetne objave formulisani su u lipidnim nanočesticama kreiranim upotrebom mikrofluidne tehnologije. Videti Whitesides (2006) Nature 442: 368-373; i Abraham et al. (2002) Science 295:647-651. Kao neograničavajući primer, kontrolisana mikrofluidna formulacija uključuje pasivni
42
postupak za mešanje tokova vođenih stabilnim pritiskom u mikro kanalima pri niskom Rejnoldsovom broju. Videti, npr. Abraham et al. (2002) Science 295: 647-651.
[1148] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija, mogu se formulisati u lipidnim nanočesticama kreiranim upotrebom mikromikser čipa kao što su, ali ne ograničavajući se na, one iz Harvard Apparatus (Holliston, MA) ili Dolomite Microfluidics (Royston, UK). Mikromikser čip se može upotrebljavati za brzo mešanje dva ili više tokova fluida sa podeli i rekombinuj mehanizmom.
[1149] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su za isporuku upotrebom mikrosfera za inkapsulaciju leka koje su opisane u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013063468 ili u S.A.D. patentu br. 8,440,614. Mikrosfere mogu da sadrži jedinjenje formule (I), (II), (III), (IV), (V) ili (VI) kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013063468. U sledećem aspektu, amino-kiselina, peptid, polipeptid, lipidi (APPL) su korisni u isporuci polinukleotida iz objave ćelijama. Videti Međunarodnu patentnu publikaciju br. WO2013063468; videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130158021.
[1150] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u lipidnim nanočesticama koje imaju prečnik od oko 10 do oko 100 nm, kao što su, ali ne ograničavajući se na, oko 10 do oko 20 nm, oko 10 do oko 30 nm, oko 10 do oko 40 nm, oko 10 do oko 50 nm, oko 10 do oko 60 nm, oko 10 do oko 70 nm, oko 10 do oko 80 nm, oko 10 do oko 90 nm, oko 20 do oko 30 nm, oko 20 do oko 40 nm, oko 20 do oko 50 nm, oko 20 do oko 60 nm, oko 20 do oko 70 nm, oko 20 do oko 80 nm, oko 20 do oko 90 nm, oko 20 do oko 100 nm, oko 30 do oko 40 nm, oko 30 do oko 50 nm, oko 30 do oko 60 nm, oko 30 do oko 70 nm, oko 30 do oko 80 nm, oko 30 do oko 90 nm, oko 30 do oko 100 nm, oko 40 do oko 50 nm, oko 40 do oko 60 nm, oko 40 do oko 70 nm, oko 40 do oko 80 nm, oko 40 do oko 90 nm, oko 40 do oko 100 nm, oko 50 do oko 60 nm, oko 50 do oko 70 nm, oko 50 do oko 80 nm, oko 50 do oko 90 nm, oko 50 do oko 100 nm, oko 60 do oko 70 nm, oko 60 do oko 80 nm, oko 60 do oko 90 nm, oko 60 do oko
42
100 nm, oko 70 do oko 80 nm, oko 70 do oko 90 nm, oko 70 do oko 100 nm, oko 80 do oko 90 nm, oko 80 do oko 100 nm i/ili oko 90 do oko 100 nm.
[1151] U jednom aspektu, lipidne nanočestice imaju prečnik od oko 10 do 500 nm. U jednom aspektu, lipidna nanočestica ima prečnik veći od 100 nm, veći od 150 nm, veći od 200 nm, veći od 250 nm, veći od 300 nm, veći od 350 nm, veći od 400 nm, veći od 450 nm, veći od 500 nm, veći od 550 nm, veći od 600 nm, veći od 650 nm, veći od 700 nm, veći od 750 nm, veći od 800 nm, veći od 850 nm, veći od 900 nm, veći od 950 nm ili veći od 1000 nm.
[1152] U jednom aspektu, lipidna nanočestica je lipidna nanočestica granične veličine opisana u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013059922 (videti takođe S.A.D. pat. prij. publ. br. US20140328759). Lipidna nanočestica granične veličine može da sadrži lipidni dvosloj koji okružuje vodeno jezgro ili hidrofobno jezgro; gde lipidni dvosloj može da sadrži fosfolipid kao što je, ali ne ograničavajući se na, diacilfosfatidilholin, diacilfosfatidiletanolamin, ceramid, sfingomijelin, dihidrosfingomijelin, cefalin, cerebrozid, C8-C20 masna kiselina diacilfosfatidilholin, i 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilholin (POPC). U sledećem aspektu, lipidna nanočestica granične veličine može da sadrži polietilen glikol-lipid kao što je, ali ne ograničavajući se na, DLPE-PEG, DMPE-PEG, DPPC-PEG i DSPE-PEG.
[1153] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, isporučuje se, lokalizuje i/ili koncentriše na specifičnoj lokaciji upotrebom postupaka za isporuku koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013063530. Videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20140323907. Kao neograničavajući primer, subjektu se može primenjivati prazna polimerna čestica pre, istovremeno sa ili posle primene polinukleotida subjektu. Prazna polimerna čestica podleže promeni zapremine kada je u kontaktu sa subjektom i postaje smeštena, uklopljena, imobilizovana ili zarobljena na specifičnoj lokaciji u subjektu.
[1154] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u sistemu za oslobađanje aktivne supstance (videti, npr. S.A.D. patentnu prij. publ. br. US20130102545). Sistem za oslobađanje aktivne supstance može da sadrži 1) najmanje jednu nanočesticu vezanu za lanac inhibitora oligonukleotida koji je hibridizovan sa katalitički aktivnom nukleinskom kiselinom i 2) jedinjenje vezano za najmanje jedan molekul supstrata koji je vezan za terapijski aktivnu
42
supstancu (npr. ovde opisane polinukleotide), gde se terapijski aktivna supstanca oslobađa isecanjem molekula supstrata katalitički aktivnom nukleinskom kiselinom.
[1155] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u nanočestici koja sadrži unutrašnje jezgro koje sadrži nećelijski materijal i spoljašnju površinu koja sadrži ćelijsku membranu. Ćelijska membrana može biti izvedena iz ćelije ili membrana izvedena iz virusa. Kao neograničavajući primer, nanočestica je napravljena pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052167. Kao još jedan neograničavajući primer, nanočestica opisana u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013052167 upotrebljava se za isporuku polinukleotida koji su ovde opisani. Videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130337066.
[1156] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u poroznim nanočesticama podržanim lipidnim dvoslojevima (protoćelijama). Protoćelije su opisane u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013056132 (videti takođe S.A.D. pat. prij. publ. br. US20150272885).
[1157] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, koji su ovde opisani formulisani su u polimernim nanočesticama kao što je opisano u ili napravljeno pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentima br.8,420,123 i 8,518,963 i Evropskom patentu br. EP2073848B1. Kao neograničavajući primer, polimerne nanočestice imaju visoku temperaturu staklastog prelaza kao nanočestice koje su opisane u ili nanočestice koje su napravljene pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentu br. 8,518,963. Kao sledeći neograničavajući primer, polimerna nanočestica za oralne i parenteralne formulacije je napravljena pomoću postupaka koji su opisani u Evropskom patentu br. EP2073848B1.
[1158] U sledećem aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L
42
polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, koji su ovde opisani formulisani su u nanočesticama koje se upotrebljavaju u snimanju. Nanočestice mogu biti lipozomske nanočestice kao što su one koje su opisane u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130129636. Kao neograničavajući primer, lipozom može da sadrži gadolinijum(III)2-{4,7-bis-karboksimetil-10-[(N,N-distearilamidometil-N'-amido-metil]-1,4,7,10-tetra-aza-ciklododek-1-il}-sirćetnu kiselinu i neutralnu, potpuno zasićenu fosfolipidnu komponentu (videti, npr. S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130129636).
[1159] U jednom aspektu, nanočestice koje se mogu upotrebljavati u predmetnoj objavi formiraju se pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130130348.
[1160] Nanočestice iz predmetne objave mogu dodatno da uključuju nutritijente kao što su, ali ne ograničavajući se na, one čiji nedostaci mogu dovesti do opasnosti po zdravlje od anemije do defekata nervne cevi. Videti, npr. nanočestice koje su opisane u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013072929; videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20150224035. Kao neograničavajući primer, nutritijent je gvožđe u obliku fero, feri soli ili elementarnog gvožđa, jod, folna kiselina, vitamini ili mikronutrijenti.
[1161] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u bubrećoj nanočestici. Bubreća nanočestica može biti, ali nije ograničena na, one koje su opisane u S.A.D. patentu br.
8,440,231. Kao neograničavajući aspekt, bubreća nanočestica se upotrebljava za isporuku polinukleotida iz predmetne objave pulmonarnom sistemu (videti, npr. S.A.D. patent br.
8,440,231).
[1162] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u polianhidridnim nanočesticama kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koje su opisane u S.A.D. patentu br.8,449,916.
[1163] Nanočestice i mikročestice iz predmetne objave mogu biti geometrijski projektovane da modulišu makrofage i/ili imunski odgovor. U jednom aspektu, geometrijski projektovane čestice mogu imati različite oblike, veličine i/ili površinska naelektrisanja kako bi inkorporisale polinukleotide iz predmetne objave za ciljanu isporuku kao što je, ali ne ograničavajući se na, pulmonarnu isporuku (videti, npr. Međunarodnu publikaciju br. WO2013082111). Druga fizička svojstva koja geometrijski projektovane čestice mogu imati
42
uključuju, ali nisu ograničena na, fenestracije, ugaone krakove, asimetriju i rapavost površine, naelektrisanje koje može da promeni interakcije sa ćelijama i tkivima. Kao neograničavajući primer, nanočestice iz predmetne objave napravljene su pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013082111 (videti takođe S.A.D. pat. prij. publ. br. US20150037428).
[1164] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave su nanočestice solubilne u vodi, kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koje su opisane u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013090601 (videti takođe, S.A.D. pat. prij. publ. br. US20130184444). Nanočestice mogu biti neorganske nanočestice koje imaju kompaktan i cviterjonski ligand kako bi pokazale dobru solubilnost u vodi. Nanočestice takođe mogu imati male hidrodinamičke prečnike (HD), stabilnost u odnosu na vreme, pH, i salinitet i nizak nivo nespecifičnog vezivanja za proteine.
[1165] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave razvijene su pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj prij. publ. br. US20130172406.
[1166] U jednom aspektu, nanočestice iz predmetne objave su stelt nanočestice ili stelt nanočestice specifične za cilj kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koje su opisane u S.A.D. patentnoj prij. publ. br. US20130172406. Nanočestice iz predmetne objave mogu biti napravljene pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj prij. publ. br. US20130172406.
[1167] U sledećem aspektu, stelt ili stelt nanočestice specifične za cilj sadrže polimerni matriks. Polimerni matriks može da sadrži dva ili više polimera kao što su, ali ne ograničavajući se na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksikiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, poliestre, polianhidride, polietre, poliuretane, polimetakrilate, poliakrilate, policijanoakrilate ili njihove kombinacije.
[1168] U jednom aspektu, nanočestica je hibridna struktura nanočestica-nukleinska kiselina koja ima sloj nukleinske kiseline velike gustine. Kao neograničavajući primer, hibridna struktura nanočestica-nukleinska kiselina je napravljena pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj prij. publ. br. US20130171646. Nanočestica može da sadrži nukleinsku kiselinu kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide koji su ovde opisani i/ili poznati u struci.
[1169] Najmanje jedna od nanočestica iz predmetne objave može biti uklopljena u jezgro nanostrukture ili obložena sa poroznom 3-D strukturom male gustine ili oblogom koja je
4
sposobna da nosi ili da se asocira sa najmanje jednim korisnim tovarom unutar ili na površini nanostrukture. Neograničavajući primeri nanostruktura koje sadrže najmanje jednu nanočesticu opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013123523. Videti takođe S.A.D. patentnu prij. publ. br. US20150037249.
Hijaluronidaza
[1170] Intramuskularna, intratumorska ili subkutana lokalizovana injekcija polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koje njihove kombinacije, može uključivati hijaluronidazu, koja katalizuje hidrolizu hijaluronana.
[1171] Katalizujući hidrolizu hijaluronana, koji je sastojak intersticijumske barijere, hijaluronidaza snižava viskozitet hijaluronana, čime se povećava permeabilnost tkiva (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Korisno je ubrzati njihovu disperziju i sistemsku distribuciju kodiranih proteina koje proizvode transfektovane ćelije. Alternativno, hijaluronidaza se može upotrebljavati za povećanje broja ćelija izloženih polinukleotidu iz objave koji se primenjuje intramuskularno, intratumorski, ili subkutano.
Mimici nanočestica
[1172] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu biti inkapsulirani unutar i/ili apsorbovani u mimik nanočestice. Mimik nanočestica može oponašati funkcije isporuke organizama ili čestica kao što su, ali ne ograničavajući se na, patogene, viruse, bakterije, gljivice, parazite, prione i ćelije. Kao neograničavajući primer, polinukleotidi iz objave mogu biti inkapsulirani u česticu bez viriona koja može da oponaša funkciju isporuke virusa (videti Međunarodnu publ. br. WO2012006376 i S.A.D. patentne prij. publ. br. US20130171241 i US20130195968).
Nanotube
4 1
[1173] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu biti prikačeni ili na drugi način vezani za najmanje jednu nanotubu kao što su, ali ne ograničavajući se na, rozeta nanotube, rozeta nanotube koje imaju dvostruke baze sa linkerom, ugljenične nanotube i/ili ugljenične nanotube sa jednim zidom. Polinukleotidi mogu biti vezani za nanotube preko sila kao što su, ali ne ograničavajući se na, sterične, jonske, kovalentne i/ili druge sile. Nanotube i formulacije nanotuba koje sadrže polinukleotide opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077 (objavljeno kao WO2014152211).
Samo-asemblirane nanočestice
[1174] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu se formulisati u samo-asembliranim nanočesticama. Samo-asemblirane nanočestice nukleinske kiseline opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077 (objavljeno kao WO2014152211), kao što je u paragrafima [000740]-[000743]. Samo-asemblirane nanočestice na bazi polimera opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077. Videti takođe S.A.D. patentnu prij. publ. br. US20160038612.
Samo-asemblirani makromolekuli
[1175] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu se formulisati u amfifilnim makromolekulima (AM) za isporuku. AM sadrže biokompatibilne amfifilne polimere koji imaju alkilovanu šećernu okosnicu kovalentno vezanu sa poli(etilen glikolom). U vodenom rastvoru, AM se sami asembliraju kako bi formirali micele. Neograničavajući primeri postupaka za formiranje AM i AM opisani su u S.A.D. patentnoj prij. publ. br. US20130217753.
4 2
Neorganske nanočestice
[1176] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu se formulisati u neorganskim nanočesticama (S.A.D. pat. br. 8,257,745). Neorganske nanočestice mogu uključivati, ali nisu ograničene na, glinene supstance koje bubre u vodi. Kao neograničavajući primer, neorganske nanočestice uključuju sintetičke smektitne gline koje su napravljene od jednostavnih silikata (videti, npr. S.A.D. patente br.
5,585,108 i 8,257,745).
[1177] U nekim aspektima, neorganske nanočestice sadrže jezgro od polinukleotida koji su ovde objavljeni i polimerni omotač. Polimerni omotač može biti bilo koji od polimera koji su ovde opisani i poznati su u struci. U dodatnom aspektu, polimerni omotač se može upotrebljavati za zaštitu polinukleotida u jezgru.
Poluprovodne i metalne nanočestice
[1178] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu biti formulisani u nanočestici koja se disperguje u vodi koja sadrži poluprovodni ili metalni materijal (S.A.D. patentna prij. publ. br. US20120228565) ili formirani u magnetnoj nanočestici (S.A.D. patentne prij. publ. br. US20120265001 i US20120283503). Nanočestice koje se disperguju u vodi mogu biti hidrofobne nanočestice ili hidrofilne nanočestice.
[1179] U nekim aspektima, poluprovodne i/ili metalne nanočestice mogu da sadrže jezgro od polinukleotida koji su ovde objavljeni i polimerni omotač. Polimerni omotač može biti bilo koji od polimera koji su ovde opisani i poznati su u struci. U dodatnom aspektu, polimerni omotač se može upotrebljavati za zaštitu polinukleotida u jezgru.
Hirurški zaptivači: gelovi i hidrogelovi
[1180] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži
4
iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, inkapsulirani su u bilo koji hidrogel poznat u struci koji formira gel kada se injektira u subjekta. Hirurški zaptivači kao što su gelovi i hidrogelovi opisani su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2014/027077.
Formulacije suspenzija
[1181] U nekim aspektima, obezbeđene su formulacije suspenzija koje sadrže polinukleotide, depoe ulja koji nisu mešljivi sa vodom, surfaktante i/ili kosurfaktante i/ili korastvarače. Kombinacije ulja i surfaktanata mogu omogućiti formulaciju suspenzije sa polinukleotidima. Isporuka polinukleotida u depou koji nije mešljiv sa vodom može se upotrebljavati za poboljšanje bioraspoloživosti kroz neprekidno oslobađanje iRNK iz depoa u okolno fiziološko okruženje i sprečavanje degradacije polinukleotida nukleazama.
[1182] U nekim aspektima, formulacije suspenzije iRNK pripremaju se upotrebom kombinacija polinukleotida, rastvora na bazi ulja i surfaktanata. Takve formulacije se mogu pripremiti kao dvodelni sistem koji sadrži vodenu fazu koja sadrži polinukleotide i fazu na bazi ulja koja sadrži ulje i surfaktante. Primeri ulja za formulacije suspenzije mogu uključivati, ali nisu ograničeni na susamovo ulje i migliol (koji sadrži estre zasićenih kaprilnih i kaprinskih masnih kiselina poreklom od kokosovih i palminih zrna i glicerina ili propilen glikola), kukuruzno ulje, sojino ulje, ulje od kikirikija, pčelinji vosak i/ili ulje palminog semena. Primeri surfaktanata mogu uključivati, ali nisu ograničeni na Cremophor, polisorbat 20, polisorbat 80, polietilen glikol, transcutol, CAPMUL<®>, labrasol, izopropil miristat, i/ili Span 80. U nekim aspektima, suspenzije mogu da sadrže korastvarače uključujući, ali ne ograničavajući se na etanol, glicerol i/ili propilen glikol.
[1183] Suspenzije se mogu formirati tako što se prvo priprema formulacija polinukleotida koja sadrži vodeni rastvor polinukleotida i fazu na bazi ulja koja sadrži jedan ili više surfaktanata. Formiranje suspenzije se dešava kao rezultat mešanja dve faze (vodene i na bazi ulja). U nekim aspektima, takva suspenzija se može isporučiti u vodenu fazu kako bi se formirala ulje u vodi emulzija. U nekim aspektima, isporuka suspenzije u vodenu fazu rezultuje formiranjem ulje u vodi emulzije u kojoj faza na bazi ulja koja sadrži polinukleotide formira kapljice koje mogu biti u opsegu veličine od kapljica veličine nanometra do kapljica veličine mikrometra. U nekim aspektima, specifične kombinacije ulja, surfaktanata, kosurfaktanata i/ili korastvarača mogu da se koriste za suspendovanje polinukleotida u uljnoj fazi i/ili da se formiraju ulje u vodi emulzije nakon isporuke u vodeno okruženje.
4 4
[1184] U nekim aspektima, suspenzije obezbeđuju modulaciju oslobađanja polinukleotida u okolno okruženje. U takvim aspektima, oslobađanje polinukleotida može biti modulisano difuzijom iz depoa koji nije mešljiv sa vodom, nakon čega sledi resolubilizacija u okolno okruženje (npr. vodeno okruženje).
[1185] U nekim aspektima, polinukleotidi unutar depoa koji nije mešljiv sa vodom (npr. suspendovani unutar uljne faze) rezultuju izmenjenom stabilnošću polinukleotida (npr. izmenjena degradacija nukleazama).
[1186] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su tako da se nakon injektiranja spontano formira emulzija (npr. kada se isporuči u vodenu fazu). Takvo formiranje čestica može da obezbedi visok odnos površine prema zapremini za oslobađanje polinukleotida iz uljne faze u vodenu fazu.
[1187] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u nanoemulziji kao što su, ali ne ograničavajući se na, nanoemulzije koje su opisane u S.A.D. patentu br. 8,496,945. Nanoemulzije mogu da sadrže nanočestice koje su ovde opisane. Kao neograničavajući primer, nanočestice mogu da sadrže tečno hidrofobno jezgro koje može biti okruženo ili obloženo slojem lipida ili surfaktanta. Sloj lipida ili surfaktanta može da sadrži najmanje jedan peptid kojim se integriše u membranu i takođe može da sadrži ciljno delujući ligand (videti, npr. S.A.D. patent br.8,496,945).
Katjoni i anjoni
[1188] Formulacije polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koje njihove kombinacije, mogu uključivati katjone ili anjone. U nekim aspektima, formulacije uključuju metalne katjone kao što su, ali ne ograničavajući se na, Zn<2+>, Ca<2+>, Cu<2+>, Mg<2+>i njihove kombinacije. Kao neograničavajući primer, formulacije uključuju
4
polimere i polinukleotide u kompleksu sa metalnim katjonom (videti, npr. S.A.D. patente br.
6,265,389 i 6,555,525).
[1189] U nekim aspektima, katjonske nanočestice koje sadrže kombinacije dvovalentnih i jednovalentnih katjona formulisane su sa polinukleotidima. Takve nanočestice se mogu spontano formirati u rastvoru tokom datog perioda (npr. sati, dani, itd.). Takve nanočestice se ne formiraju u prisustvu samo dvovalentnih katjona ili u prisustvu samo jednovalentnih katjona. Isporuka polinukleotida u katjonskim nanočesticama ili u jednom ili više depoa koji sadrže katjonske nanočestice može poboljšati bioraspoloživost polinukleotida delujući kao dugo-delujući depo i/ili redukujući stopu degradacije nukleazama.
Oblikovane nanočestice i mikročestice
[1190] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira polipeptid IL-18, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu se formulisati u nanočesticama i/ili mikročesticama. Kao primer, nanočestice i/ili mikročestice se mogu napraviti upotrebom PRINT<®>tehnologije od strane LIQUIDA TECHNOLOGIES<®>(Morrisville, NC) (videti, npr. Međunarodnu publ. br. WO2007024323).
[1191] U nekim aspektima, nanočestice sadrže jezgro od polinukleotida koji su ovde objavljeni i polimerni omotač. Polimerni omotač može biti bilo koji od polimera koji su ovde opisani i poznati su u struci. U dodatnom aspektu, polimerni omotač se može upotrebljavati za zaštitu polinukleotida u jezgru.
[1192] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u mikročesticama. Mikročestice mogu da sadrže jezgro od polinukleotida i korteks od biokompatibilnog i/ili biodegradabilnog polimera. Kao neograničavajući primer, mikročestice koje se mogu upotrebljavati sa predmetnom objavom mogu biti one koje su opisane u S.A.D. patentu br. 8,460,709, S.A.D. patentnoj prij. publ. br. US20130129830 i Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013075068. Kao još jedan neograničavajući primer, mikročestice mogu biti dizajnirane da produže oslobađanje polinukleotida iz predmetne objave tokom željenog vremenskog
4
perioda (videti npr. produženo oslobađanje terapijskog proteina u S.A.D. patentnoj prij. publ. br. US20130129830).
Nanojakne (Nanojackets) i nanolipozomi
[1193] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira polipeptid IL-18, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu se formulisati u nanojaknama i nanolipozomima od Keystone Nano (State College, PA). Nanojakne su napravljene od jedinjenja koja se prirodno nalaze u telu uključujući kalcijum, fosfat i mogu takođe da uključuju malu količinu silikata. Nanojakne mogu biti u opsegu veličine od 5 do 50 nm i mogu se upotrebljavati za isporuku hidrofilnih i hidrofobnih jedinjenja kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide.
[1194] Nanolipozomi su napravljeni od lipida kao što su, ali ne ograničavajući se na, lipide koji se prirodno javljaju u telu. Nanolipozomi mogu biti u opsegu veličine od 60-80 nm i mogu se upotrebljavati za isporuku hidrofilnih i hidrofobnih jedinjenja kao što su, ali ne ograničavajući se na, polinukleotide. U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid formulisani su u nanolipozomu kao što je, ali ne ograničavajući se na, ceramid nanolipozome.
Minićelije
[1195] U jednom aspektu, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, mogu se formulisati u bakterijskim minićelijama. Kao neograničavajući primer, bakterijske minićelije su one koje su opisane u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013088250 ili S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130177499. Bakterijske minićelije koje sadrže terapijske agense kao što su polinukleotidi koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati za isporuku terapijskih agenasa u tumore mozga.
Polučvrste kompozicije
4
[1196] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su sa hidrofobnim matriksom kako bi se formirala polučvrsta kompozicija. Kao neograničavajući primer, polučvrsta kompozicija ili kompozicija nalik pasti je napravljena pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO201307604. Polučvrsta kompozicija može biti formulacija za neprekidno oslobađanje kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO201307604.
[1197] U sledećem aspektu, polučvrsta kompozicija dodatno ima mikro-poroznu membranu ili biodegradabilni polimer formiran oko kompozicije (videti npr. Međunarodnu patentnu publikaciju br. WO201307604).
[1198] Polučvrsta kompozicija koja upotrebljava polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koju nihovu kombinaciju, može imati karakteristike polučvrste smeše kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO201307604 (npr. modul elastičnosti od najmanje 10<-4>N•mm<-2>, i/ili viskozitet od najmanje 100mPa•s).
Egzozomi
[1199] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u egzozomima. Egzozomi mogu biti napunjeni sa najmanje jednim polinukleotidom i isporučeni u ćelije, tkiva i/ili organizme. Kao neograničavajući primer, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, može se napuniti u egzozome koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013084000.
Isporuka na bazi svile
4
[1200] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u sistemu isporuke na bazi svile za neprekidno oslobađanje. Sistem isporuke na bazi svile može se formirati dovođenjem u kontakt rastvora fibroina svile sa terapijskim agensom kao što je, ali ne ograničavajući se na, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Kao neograničavajući primer, sistem isporuke na bazi svile za neprekidno oslobađanje koji se može upotrebljavati u premetnoj objavi i postupci pravljenja takvog sistema opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br.20130177611.
Mikročestice
[1201] U nekim aspektima, formulacije koje sadrže polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 ponukleotid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju, sadrže mikročestice. Mikročestice mogu da sadrže polimer koji je ovde opisan i/ili poznat u struci, kao što su, ali ne ograničavajući se na, poli(α-hidroksi kiselinu), polihidroksi buternu kiselinu, polikaprolakton, poliortoestar i polianhidrid. Mikročestica može imati adsorbujuće površine za adsorbovanje biološki aktivnih molekula kao što su polinukleotidi. Kao neograničavajući primer mikročestica za upotrebu sa predmetnom objavom i postupci pravljenja mikročestica opisani su u S.A.D. patentnim publikacijama br. US2013195923 i US20130195898 i S.A.D. patentima br.8,309,139 i 8,206,749.
[1202] U sledećem aspektu, formulacija je mikroemulzija koja sadrži mikročestice i polinukleotide. Kao neograničavajući primer, mikroemulzije koje sadrže mikročestice opisane su u S.A.D. patentnim publikacijama br. 2013195923 i 20130195898 i S.A.D. patentima br.
8,309,139 i 8,206,749.
Amino-kiselinski lipidi
4
[1203] U nekim aspektima, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, formulisani su u amino-kiselinskim lipidima. Amino-kiselinski lipidi su lipofilna jedinjenja koja sadrže amino-kiselinski ostatak i jedan ili više lipofilnih repova. Neograničavajući primeri amino-kiselinskih lipida i postupci pravljenja amino-kiselinskih lipida opisani su u S.A.D. patentu br.8,501,824.
[1204] U nekim aspektima, amino-kiselinski lipidi imaju hidrofilni deo i lipofilni deo. Hidrofilni deo može biti amino-kiselinski ostatak, a lipofilni deo može da sadrži najmanje jedan lipofilni rep.
[1205] U nekim aspektima, formulacije amino-kiselinskih lipida upotrebljavaju se za isporuku polinukleotida subjektu.
[1206] U sledećem aspektu, formulacije amino-kiselinskih lipida isporučuju polinukleotid u obliku koji se može osloboditi koji sadrži amino-kiselinski lipid koji vezuje i oslobađa polinukleotide. Kao neograničavajući primer, oslobađanje polinukleotida može biti obezbeđeno kiselo-labilnim linkerom, kao što su, ali ne ograničavajući se na, one koji su opisani u S.A.D. patentima br. 7,098,032, 6,897,196, 6,426,086, 7,138,382, 5,563,250, i 5,505,931.
Mikrovezikule
[1207] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid, formulisani su u mikrovezikulama. Neograničavajući primeri mikrovezikula uključuju one koje su opisane u US20130209544.
[1208] U nekim aspektima, mikrovezikula je mikrovezikula posredovana ARRDC1 (ARMM). Neograničavajući primeri ARMM i postupci pravljenja ARMM opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013119602.
Interpolielektrolitni kompleksi
[1209] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid formulisani su u interpolielektrolitnom kompleksu. Interpolielektrolitni kompleksi se formiraju kada se polimeri sa dinamičkim naelektrisanjem kompleksuju sa jednim ili više anjonskih molekula. Neograničavajući primeri polimera sa
44
dinamičkim naelektrisanjem i interpolielektrolitnih kompleksa i postupci pravljenja interpolielektrolitnih kompleksa opisani su u S.A.D. patentu br.8,524,368.
Kristalni polimerni sistemi
[1210] U nekim aspektima, polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid formulisani su u kristalnim polimernim sistemima. Kristalni polimerni sistemi su polimeri sa kristalnim funkcionalnim grupama i/ili terminusnim jedinicama koje sadrže kristalne funkcionalne grupe. Neograničavajući primeri polimera sa kristalnim funkcionalnim grupama i/ili terminusnim jedinicama koje sadrže kristalne funkcionalne grupe koji se nazivaju "CYC polimeri", kristalnih polimernih sistema i postupci pravljenja takvih polimera i sistema opisani su u S.A.D. patentu br.8,524,259.
Ekscipijensi
[1211] Farmaceutske formulacije mogu dodatno da sadrže farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kao što se ovde upotrebljava, uključuje, ali nije ograničen na, bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, disperzione ili suspenzione pomoćne supstance, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervanse, čvrste bajndere, lubrikante, agense za ukus, stabilizatore, antioksidanse, agense za podešavanje osmolalnosti, agense za podešavanje pH i slično, kao što je pogodno za određeni željeni dozni oblik. U struci su poznati različiti ekscipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija i tehnike za pripremanje kompozicije (videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Upotreba konvencionalnog ekscipijensnog medijuma može se razmatrati unutar obima predmetne objave, osim u meri u kojoj je bilo koji konvencionalni ekscipijensni medijum nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, kao što je da proizvodi bilo kakav neželjeni biološki efekat ili na drugi štetan način interaguje sa bilo kojom drugom komponentom(ama) farmaceutske kompozicije, njegova upotreba se smatra da je unutar obima ove objave.
[1212] U nekim aspektima, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% čist. U nekim aspektima, ekscipijens je odobren za upotrebu kod ljudi i za veterinarsku upotrebu. U nekim aspektima, ekscipijens može biti odobren od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država. U nekim aspektima, ekscipijens može biti farmaceutskog kvaliteta. U nekim aspektima, ekscipijens može da zadovolji standarde farmakopeje Sjedinjenih Država (USP), Evropske farmakopeje (EP), Britanske farmakopeje, i/ili Međunarodne farmakopeje.
[1213] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se upotrebljavaju u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, agense za dispergovanje i/ili granulisanje, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, agense za dezintegraciju, vezujuće agense, konzervanse, agense za puferisanje, agense za lubrikaciju, i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono biti uključeni u farmaceutske kompozicije. Kompozicija takođe može uključivati ekscipijense kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije, agensi za bojenje, agensi za oblaganje, agensi za zaslađivanje, aromu, i/ili parfemisanje.
[1214] Primeri razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, kalcijum karbonat, natrijum karbonat, kalcijum fosfat, dikalcijum fosfat, kalcijum sulfat, kalcijum hidrogen fosfat, natrijum fosfat, laktozu, saharozu, celulozu, mikrokristalnu celulozu, kaolin, manitol, sorbitol, inozitol, natrijum hlorid, suvi skrob, kukuruzni skrob, šećer u prahu, itd. i/ili njihove kombinacije.
[1215] Primeri agenasa za granulisanje i/ili dispergovanje uključuju, ali nisu ograničeni na, krompirov skrob, kukuruzni skrob, skrob tapioke, natrijum skrob glikolat, gline, alginsku kiselinu, guar gumu, pulpu citrusa, agar, bentonit, celulozu i proizvode od drveta, prirodni sunđer, katjonske izmenjivačke smole, kalcijum karbonat, silikate, natrijum karbonat, umreženi poli(vinil-pirolidon) (krospovidon), natrijum karboksimetil skrob (natrijum skrob glikolat), karboksimetil celulozu, umreženu natrijum karboksimetil celulozu (kroskarmeloza), metilcelulozu, preželatinizovani skrob (skrob 1500), mikrokristalni skrob, skrob nesolubilan u vodi, kalcijum karboksimetil celulozu, magnezijum aluminijum silikat (VEEGUM<®>), natrijum lauril sulfat, jedinjenja kvaternarnog amonijuma, itd. i/ili njihove kombinacije.
[1216] Primeri površinski aktivnih agenasa i/ili emulgatora uključuju, ali nisu ograničeni na, prirodne emulgatore (npr. akacija, agar, alginska kiselina, natrijum alginat, tragakant, hondruks, holesterol, ksantan, pektin, želatin, žumance jajeta, kazein, mast vune, holesterol, vosak, i lecitin), koloidne gline (npr. bentonit [aluminijum silikat] i VEEGUM<®>[magnezijum aluminijum silikat]), derivate amino-kiselina dugog lanca, alkohole velike molekulske težine (npr. stearil alkohol, cetil alkohol, oleil alkohol, triacetin monostearat, etilen glikol distearat, gliceril monostearat, i propilen glikol monostearat, polivinil alkohol), karbomere (npr. karboksi polimetilen, poliakrilna kiselina, polimer akrilne kiseline, i karboksivinil polimer), karagenan, derivate celuloze (npr. karboksimetilceluloza natrijum, celuloza u prahu, hidroksimetil celuloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, metilceluloza), estre sorbitan masnih kiselina (npr. polioksietilen sorbitan monolaurat [TWEEN<®>20], polioksietilen sorbitan [TWEEN<®>60], polioksietilen sorbitan monooleat [TWEEN<®>80], sorbitan monopalmitat [SPAN<®>40], sorbitan monostearat [SPAN<®>60], sorbitan tristearat [SPAN<®>65], gliceril monooleat, sorbitan monooleat [SPAN<®>80]), polioksietilen estre (npr. polioksietilen monostearat [MYRJ<®>45], polioksietilen hidrogenizovano ricinusovo ulje, polietoksilovano ricinusovo ulje, polioksimetilen stearat, i SOLUTOL<®>), estre saharoza masnih kiselina, estre polietilen glikol masnih kiselina (npr. CREMOPHOR<®>), polioksietilen etre, (npr. polioksietilen lauril etar [BRIJ<®>30]), poli(vinil-pirolidon), dietilen glikol monolaurat, trietanolamin oleat, natrijum oleat, kalijum oleat, etil oleat, oleinsku kiselinu, etil laurat, natrijum lauril sulfat, PLUORINC<®>F 68, POLOXAMER<®>188, cetrimonijum bromid, cetilpiridinijum hlorid, benzalkonijum hlorid, dokusat natrijum, itd. i/ili njihove kombinacije.
[1217] Primeri vezujućih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, skrob (npr. kukuruzni skrob i skrobnu pastu); želatin; šećere (npr. saharoza, glukoza, dekstroza, dekstrin, melasa, laktoza, laktitol, manitol); amino-kiseline (npr. glicin); prirodne i sintetičke gume (npr. akacija, natrijum alginat, ekstrakt irske mahovine, panvar guma, gati guma, sluz isapol ljuski, karboksimetilceluloza, metilceluloza, etilceluloza, hidroksietilceluloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, mikrokristalna celuloza, celuloza acetat, poli(vinilpirolidon), magnezijum aluminijum silikat (VEEGUM<®>) i arabogalaktan ariša); alginate; polietilen oksid; polietilen glikol; neorganske soli kalcijuma; silicijumsku kiselinu; polimetakrilate; voskove; vodu; alkohol; itd. i njihove kombinacije.
[1218] Primeri konzervanasa mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, antioksidanse, helatne agense, antimikrobne konzervanse, antifungalne konzervanse, alkoholne konzervanse, kisele konzervanse, i/ili druge konzervanse. Oksidacija je potencijalni put degradacije za iRNK, naročito za tečne formulacije iRNK. Kako bi se sprečila oksidacija, u formulaciju se mogu dodati antioksidansi. Primeri antioksidanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, alfa tokoferol, askorbinsku kiselinu, akorbil palmitat, benzil alkohol, butilovani hidroksianizol, EDTA, mkrezol, metionin, butilovani hidroksitoluen, monotioglicerol, kalijum metabisulfit, propansku kiselinu, propil galat, natrijum askorbat, natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, tioglicerol i/ili natrijum sulfit. Primeri helatnih agenasa uključuju etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA), monohidrat limunske kiseline, dinatrijum edetat, dikalijum edetat, edetinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, jabučnu kiselinu, fosfornu kiselinu, natrijum edetat, vinsku kiselinu, i/ili trinatrijum edetat. Primeri antimikrobnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, bronopol, cetrimid,
44
cetilpiridinijum hlorid, hlorheksidin, hlorobutanol, hlorokrezol, hloroksilenol, krezol, etil alkohol, glicerin, heksetidin, imidureu, fenol, fenoksietanol, feniletil alkohol, fenilživin nitrat, propilen glikol, i/ili timerosal. Primeri antifungalnih konzervansa uključuju, ali nisu ograničeni na, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, benzoevu kiselinu, hidroksibenzoevu kiselinu, kalijum benzoat, kalijum sorbat, natrijum benzoat, natrijum propionat, i/ili sorbinsku kiselinu. Primeri alkoholnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, etanol, polietilen glikol, fenol, fenolna jedinjenja, bisfenol, hlorobutanol, hidroksibenzoat, i/ili feniletil alkohol. Primeri kiselih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, vitamin A, vitamin C, vitamin E, beta-karoten, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, askorbinsku kiselinu, sorbinsku kiselinu, i/ili fitinsku kiselinu. Drugi konzervansi uključuju, ali nisu ograničeni na, tokoferol, tokoferol acetat, deteroksim mezilat, cetrimid, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), etilendiamin, natrijum lauril sulfat (SLS), natrijum lauril etar sulfat (SLES), natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, kalijum sulfit, kalijum metabisulfit, GLYDANT PLUS<®>, PHENONIP<®>, metilparaben, GERMALL<®>115, GERMABEN<®>II, NEOLONE<™>, KATHON<™>, i/ili EUXYL<®>.
[1219] U nekim aspektima, pH rastvora polinukleotida održava se između pH 5 i pH 8 kako bi se poboljšala stabilnost. Primeri pufera za kontrolu pH mogu uključivati, ali nisu ograničeni na natrijum fosfat, natrijum citrat, natrijum sukcinat, histidin (ili histidin-HCl), natrijum karbonat, i/ili natrijum malat. U sledećem aspektu, primeri pufera koji su prethodno nabrojani mogu se upotrebljavati sa dodatnim jednovalentnim kontrajonima (uključujući, ali ne ograničavajući se na kalijum). Dvovalentni katjoni se takođe mogu upotrebljavati kao puferski kontrajoni; međutim, oni nisu poželjni zbog formiranja kompleksa i/ili degradacije iRNK.
[1220] Primeri agenasa za puferovanje takođe mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, rastvore citratnog pufera, rastvore acetatnog pufera, rastvore fosfatnog pufera, amonijum hlorid, kalcijum karbonat, kalcijum hlorid, kalcijum citrat, kalcijum glubionat, kalcijum gluceptat, kalcijum glukonat, D-glukonsku kiselinu, kalcijum glicerofosfat, kalcijum laktat, propansku kiselinu, kalcijum levulinat, pentansku kiselinu, dvobazni kalcijum fosfat, fosfornu kiselinu, trobazni kalcijum fosfat, kalcijum hidroksid fosfat, kalijum acetat, kalijum hlorid, kalijum glukonat, smeše kalijuma, dvobazni kalijum fosfat, jednobazni kalijum fosfat, smeše kalijum fosfata, natrijum acetat, natrijum bikarbonat, natrijum hlorid, natrijum citrat, natrijum laktat, dvobazni natrijum fosfat, jednobazni natrijum fosfat, smeše natrijum fosfata, trometamin, magnezijum hidroksid, aluminijum hidroksid, alginsku kiselinu, vodu bez pirogena, izotonični fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, etil alkohol, itd. i/ili njihove kombinacije.
[1221] Primeri agensa za lubrikaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, magnezijum stearat, kalcijum stearat, stearinsku kiselinu, silicijum dioksid, talk, slad, gliceril behanat, hidrogenizovana biljna ulja, polietilen glikol, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid, leucin, magnezijum lauril sulfat, natrijum lauril sulfat, itd. i njihove kombinacije.
[1222] Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na, ulja badema, jezgra kajsije, avokada, babase, bergamota, semena crne ribizle, boražine, kleke, kamilice, repice, kima, karnaube, ricinusa, cimeta, kakao puter, kokosa, jetre bakalara, kafe, kukuruza, semena pamuka, emua, eukaliptusa, žutog noćurka, ribe, semena lana, geraniola, tikve, semena grožđa, lešnika, isopa, izopropil miristat, jojobe, kukui oraha, lavandina, lavande, limuna, Litsea cubeba, makadamija oraha, sleza, semena manga, semena bele limnante, kune, muškatnog oraščića, masline, narandže, atlantske sluzoglavke, palme, palmine jezgre, jezgra breskve, kikirikija, semena maka, semena bundeve, semena repice, pirinčanih mekinja, ruzmarina, šafranike, sandalovine, kamelije, satureje, pasijeg trna, susama, ši puter, silikon, soje, suncokreta, čajnog drveta, čička, cubakija, vetivera, oraha, i pšeničnih klica. Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na, butil stearat, kaprilni triglicerid, kaprični triglicerid, ciklometikon, dietil sebakat, dimetikon 360, izopropil miristat, mineralno ulje, oktildodekanol, oleil alkohol, silikonsko ulje, i/ili njihove kombinacije.
[1223] Ekscipijensi kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije, agensi za bojenje, agensi za oblaganje, agensi za zaslađivanje, aromu, i/ili parfemisanje mogu biti prisutni u kompoziciji, u skladu sa procenom formulatora.
[1224] Primeri aditiva uključuju fiziološki biokompatibilne pufere (npr. trimetilamin hidrohlorid), adiciju helata (kao što su, na primer, DTPA ili DTPA-bisamid) ili kalcijum helatnih kompleksa (kao na primer kalcijum DTPA, CaNaDTPA-bisamid), ili, opciono, adicije kalcijumovih ili natrijumovih soli (na primer, kalcijum hlorid, kalcijum askorbat, kalcijum glukonat ili kalcijum laktat). Pored toga, mogu se upotrebljavati antioksidansi i agensi za suspendovanje.
Krioprotektanti za iRNK
[1225] U nekim aspektima, polinukleotidne formulacije sadrže krioprotektante. Kao što se ovde upotrebljava, termin "krioprotektant" označava jedan ili više agenasa koji kada se kombinuju sa datom supstancom, pomažu da se redukuje ili eliminiše oštećenje te supstance
44
koje se javlja pri zamrzavanju. U nekim aspektima, krioprotektanti se kombinuju sa polinukleotidima kako bi ih stabilizovali tokom zamrzavanja. Skladištenje zamrznute iRNK između -20 °C i -80 °C može biti povoljno za dugotrajnu (npr. 36 meseci) stabilnost polinukleotida. U nekim aspektima, krioprotektanti su uključeni u polinukleotidne formulacije kako bi stabilizovali polinukleotid kroz cikluse zamrzavanja/odmrzavanja i pod uslovima skladištenja u zamrznutom stanju. Krioprotektanti iz predmetne objave mogu uključivati, ali nisu ograničeni na saharozu, trehalozu, laktozu, glicerol, dekstrozu, rafinozu i/ili manitol. Trehaloza je navedena od strane Uprave za hranu i lekove da se generalno smatra bezbednom (GRAS) i uobičajeno se upotrebljava u komercijalnim farmaceutskim formulacijama.
Agensi za povećanje zapremine
[1226] U nekim aspektima, polinukleotidne formulacije sadrže agense za povećanje zapremine. Kao što se ovde upotrebljava, termin "agens za povećanje zapremine" označava jedan ili više agenasa koji su uključeni u formulacije da daju željenu konzistenciju formulaciji i/ili stabilizaciju komponenata formulacije. U nekim aspektima, agensi za povećanje zapremine su uključeni u liofilizovane polinukleotidne formulacije kako bi se dobio "farmaceutski elegantan" kolač, stabilizujući liofilizovane polinukleotide tokom dugotrajnog (npr. 36 meseci) skladištenja. Agensi za povećanje zapremine iz predmetne objave mogu uključivati, ali nisu ograničeni na saharozu, trehalozu, manitol, glicin, laktozu i/ili rafinozu. U nekim aspektima, kombinacije krioprotektanata i agenasa za povećanje zapremine (na primer, saharoza/glicin ili trehaloza/manitol) mogu biti uključene kako bi se stabilizovali polinukleotidi tokom zamrzavanja i obezbedio agens za povećanje zapremine za liofilizaciju.
[1227] Neograničavajući primeri formulacija i postupaka za formulisanje polinukleotida iz predmetne objave su takođe obezbeđeni u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013090648, koja je podneta 14. decembra 2012. godine.
Gola isporuka
[1228] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihova kombinacija može biti isporučena u ćeliju (npr. u tumorsku ćeliju) gola. Kao što se ovde upotrebljava, "gola" označava isporuku polinukleotida bez agenasa koji promovišu
44
transfekciju. Na primer, polinukleotidi koji se isporučuju u ćeliju, npr. tumorsku ćeliju, ne mogu da sadrže modifikacije. Goli polinukleotidi koji sadrže iRNK koja kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18, i/ili OX40L polipeptid mogu se isporučiti u tumorsku ćeliju upotrebom puteva primene koji su poznati u struci, npr. intratumorska primena, i ovde opisani.
Parenteralna i injektabilna primena
[1229] Tečni dozni oblici za parenteralnu primenu, npr. intratumorsku, uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu da sadrže inertne razblaživače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci, kao što su, na primer, voda ili drugi rastvarači, agensi za solubilizovanje i emulgatori kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulja semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslina, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. Pored inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu uključivati adjuvanse kao što su agensi za vlaženje, agensi za emulgovanje i suspendovanje, agensi za zaslađivanje, aromu, i/ili parfemisanje. U određenim aspektima za parenteralnu primenu, kompozicije se mešaju sa agensima za solubilizovanje kao što su CREMOPHOR<®>, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.
[1230] Farmaceutska kompozicija za parenteralnu primenu, npr. intratumorsku primenu, može da sadrži najmanje jedan neaktivan sastojak. Bilo koji ili nijedan od upotrebljenih neaktivnih sastojaka može biti odobren od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država (FDA). Nepotpuna lista neaktivnih sastojaka za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama za parenteralnu primenu uključuje hlorovodoničnu kiselinu, manitol, azot, natrijum acetat, natrijum hlorid i natrijum hidroksid.
[1231] Injektabilni preparati, na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu se formulisati u skladu sa poznatim u struci upotrebom pogodnih agenasa za dispergovanje, agenasa za vlaženje, i/ili agenasa za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu biti sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor, U.S.P. i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno
44
ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline kao što je oleinska kiselina mogu se upotrebljavati u pripremi injektabila. Sterilna formulacija takođe može sadržati adjuvanse kao što su lokalni anestetici, konzervansi i agensi za puferisanje.
[1232] Injektabilne formulacije, npr. intratumorske, mogu se sterilisati, na primer, filtriranjem kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu pre upotrebe.
[1233] Injektabilne formulacije, npr. intratumorske, mogu biti za direktnu injekciju u region tkiva, organa i/ili subjekta, npr. tumor.
[1234] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, često je poželjno da se uspori apsorpcija aktivnog sastojka iz intratumorske injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije leka tada zavisi od stope njegovog rastvaranja koja, zauzvrat, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog oblika leka postiže se rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljnom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave formiranjem mikroinkapsuliranih matriksa leka u biodegradabilnim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, stopa oslobađanja leka se može kontrolisati. Primeri drugih biodegradabilnih polimera uključuju poli(ortoestre) i poli(anhidride). Formulacije za depo injektabile se pripremaju zarobljavanjem leka u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.
Dozni oblici
[1235] Farmaceutska kompozicija koja je ovde opisana može se formulisati u dozni oblik koji je ovde opisan, kao što je topikalni, intranazalni, intratrahealni, ili injektabilni (npr. intravenski, intratumorski, intraokularni, intravitrealni, intramuskularni, intrakardijalni, intraperitonealni, subkutani).
Tečni dozni oblici
[1236] Tečni dozni oblici za parenteralnu primenu (npr. intratumorsku) uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu da sadrže inertne razblaživače
44
koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci uključujući, ali ne ograničavajući se na, vodu ili druge rastvarače, agense za solubilizovanje i emulgatore kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulja semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslina, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikole i estre masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. U određenim aspektima za parenteralnu primenu, kompozicije se mogu mešati sa agensima za solubilizovanje kao što su CREMOPHOR<®>, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.
Injektabili
[1237] Injektabilni preparati (npr. intratumorski), na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu se formulisati u skladu sa poznatim u struci i mogu uključivati pogodne agense za dispergovanje, agense za vlaženje, i/ili agense za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu biti sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti su, ali nisu ograničeni na, vodu, Ringerov rastvor, U.S.P. i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline kao što je oleinska kiselina mogu se upotrebljavati u pripremi injektabila.
[1238] Injektabilne formulacije se mogu sterilisati, na primer, filtriranjem kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agensa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu pre upotrebe.
[1239] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, može biti poželjno da se uspori apsorpcija aktivnog sastojka iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije polinukleotida tada zavisi od stope njegovog rastvaranja koja, zauzvrat, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenih polinukleotida može da se postigne rastvaranjem ili suspendovanjem polinukleotida u uljnom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave
44
formiranjem mikroinkapsuliranih matriksa polinukleotida u biodegradabilnim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa polinukleotida prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, stopa oslobađanja polinukleotida se može kontrolisati. Primeri drugih biodegradabilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(ortoestre) i poli(anhidride). Formulacije za depo injektabile mogu se pripremiti zarobljavanjem polinukleotida u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.
Postupci intratumorske isporuke
[1240] Farmaceutske kompozicije koje su ovde objavljene pogodne su za primenu tumorima. Termin "tumor" se ovde upotrebljava u širokom smislu i označava bilo koji abnormalni novi rast tkiva koji ne poseduje fiziološku funkciju i nastaje usled nekontrolisane uobičajeno brze ćelijske proliferacije. Termin "tumor" kao što se ovde upotrebljava odnosi se i na benigne tumore i na maligne tumore.
[1241] U određenim aspektima, objava obezbeđuje postupak isporučivanja polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihove kombinacije, tumoru koji sadrži formulisanje polinukleotida u farmaceutskoj kompoziciji koja je ovde opisana, npr. u obliku lipidnih nanočestica, i primenu farmaceutske kompozicije tumoru. Primena farmaceutske kompozicije tumoru može se izvesti upotrebom bilo kog postupka koji je poznat u struci (npr. bolus injekcija, perfuzija, hirurška implantacija, itd.).
[1242] Isporuka polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, samog ili u kombinaciji, tumoru upotrebom farmaceutskih kompozicija za intratumorsku primenu koje se ovde objavljuju može:
(i) povećati zadržavanje polinukleotida u tumoru;
(ii) povećati nivoe eksprimiranog polipeptida u tumoru u poređenju sa nivoima eksprimiranog polipeptida u peritumorskom tkivu;
(iii) smanjiti curenje polinukleotida ili eksprimiranog proizvoda u nespecifično tkivo (npr. peritumorsko tkivo, ili na udaljene lokacije, npr. tkivo jetre); ili,
(iv) bilo koja njihova kombinacija,
4
pri čemu je povećanje ili smanjenje uočeno za određeno svojstvo u odnosu na odgovarajuću referentnu kompoziciju (npr. kompoziciju u kojoj jedinjenja formule (I) nisu prisutna ili su supstituisana drugim amino lipidom koji se može jonizovati, npr. MC3).
[1243] U jednom aspektu, smanjenje curenja se može kvantifikovati kao povećanje odnosa ekspresije polipeptida u tumoru prema ekspresiji polipeptida u netumorskim tkivima, kao što je peritumorsko tkivo ili u drugom tkivu ili organu, npr. tkivu jetre.
[1244] Isporuka polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili njihove kombinacije tumoru uključuje primenu farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, npr. u obliku nanočestica, koje uključuju polinukleotid koji kodira IL-23, IL-36-gama, IL-18 i/ili OX40L polipeptid subjektu, gde primena farmaceutske kompozicije uključuje dovođenje u kontakt tumora sa kompozicijom.
[1245] U slučaju da je polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, iRNK, nakon dovođenja u kontakt ćelije u tumoru sa farmaceutskom kompozicijom, translatabilna iRNK se može translatirati u ćeliji kako bi se proizveo polipeptid od interesa. Međutim, iRNK koje suštinski nisu translatabilne mogu takođe biti isporučene tumorima. Suštinski netranslatabilne iRNK mogu biti korisne kao vakcine i/ili mogu da sekvestriraju translacione komponente ćelije kako bi redukovale ekspresiju drugih vrsta u ćeliji.
[1246] Farmaceutske kompozicije koje su ovde objavljene mogu da povećaju specifičnu isporuku. Kao što se ovde upotrebljava, termin "specifična isporuka" označava isporuku više (npr. najmanje 1,5 puta više, najmanje 2 puta više, najmanje 3 puta više, najmanje 4 puta više, najmanje 5 puta više, najmanje 6 puta više, najmanje 7 puta više, najmanje 8 puta više, najmanje 9 puta više, najmanje 10 puta više) polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pomoću farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena (npr. oblik nanočestica) ciljnom tkivu od interesa (npr. tumor) u poređenju sa nespecifičnim tkivom (npr. jetra sisara).
[1247] Nivo isporuke nanočestice određenom tkivu može se izmeriti, na primer, poređenjem
4 1
(i) količine proteina eksprimiranog iz polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, u tkivu sa težinom navedenog tkiva;
(ii) poređenjem količine polinukleotida u tkivu sa težinom navedenog tkiva; ili
(iii) poređenjem količine proteina eksprimiranog iz polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, u tkivu sa količinom ukupnog proteina u navedenom tkivu.
[1248] Specifična isporuka tumoru ili određenoj klasi ćelija u tumoru implicira da se veći udeo farmaceutske kompozicije koja uključuje polinukleotid koji kodira IL-23, IL-36-gama, i/ili OX40L polipeptid, isporučuje ciljnoj destinaciji (npr. ciljno tkivo) u odnosu na druge nespecifične destinacije nakon primene farmaceutske kompozicije subjektu.
Postupci za poboljšanu intratumorsku isporuku
[1249] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupke za postizanje poboljšane intratumorske isporuke polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, kada se farmaceutska kompozicija koja je ovde objavljena (npr. u obliku nanočestica) primenjuje tumoru. Poboljšanje isporuke može biti usled, na primer,
(i) povećanog zadržavanja polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, u tumoru;
(ii) povećanih nivoa eksprimiranog polipeptida u tumoru u poređenju sa nivoima eksprimiranog polipeptida u peritumorskom tkivu;
(iii) smanjenog curenja polinukleotida ili eksprimiranog proizvoda u nespecifično tkivo (npr. peritumorsko tkivo, ili na udaljene lokacije, npr. tkivo jetre); ili,
4 2
(iv) bilo koje njihove kombinacije,
pri čemu je povećanje ili smanjenje uočeno za određeno svojstvo u odnosu na odgovarajuću referentnu kompoziciju (npr. kompoziciju u kojoj jedinjenja formule (I) nisu prisutna ili su supstituisana drugim amino lipidom koji se može jonizovati, npr. MC3).
[1250] U jednom aspektu, smanjenje curenja se može kvantifikovati kao povećanje odnosa ekspresije polipeptida u tumoru prema ekspresiji polipeptida u netumorskim tkivima, kao što je peritumorsko tkivo ili u drugom tkivu ili organu, npr. tkivu jetre.
[1251] Sledeće poboljšanje isporuke uzrokovano kao rezultat upotrebe ovde objavljenih farmaceutskih kompozicija je redukcija imunskog odgovora u odnosu na imunski odgovor uočen kada se druge lipidne komponente upotrebljavaju za isporuku istog terapijskog agensa ili polinukleotida koji kodira terapijski agens.
[1252] U skladu sa tim, predmetna objava obezbeđuje postupak povećanja zadržavanja terapijskog agensa (npr. polipeptida koji se primenjuje kao deo farmaceutske kompozicije) u tumorskom tkivu kod subjekta, koji sadrži intratumorsku primenu tumorskom tkivu farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, pri čemu je zadržavanje terapijskog agensa u tumorskom tkivu povećano u poređenju sa zadržavanjem terapijskog agensa u tumorskom tkivu posle primene odgovarajuće referentne kompozicije.
[1253] Takođe je obezbeđen postupak povećanja zadržavanja polinukleotida u tumorskom tkivu kod subjekta, koji sadrži intratumorsku primenu tumorskom tkivu farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, pri čemu je zadržavanje polinukleotida u tumorskom tkivu povećano u poređenju sa zadržavanjem polinukleotida u tumorskom tkivu posle primene odgovarajuće referentne kompozicije.
[1254] Takođe je obezbeđen postupak povećanja zadržavanja eksprimiranog polipeptida u tumorskom tkivu kod subjekta, koji sadrži primenu tumorskom tkivu farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži polinukleotid koji kodira eksprimirani polipeptid, i pri čemu je zadržavanje eksprimiranog polipeptida u tumorskom tkivu povećano u poređenju sa zadržavanjem polipeptida u tumorskom tkivu posle primene odgovarajuće referentne kompozicije.
[1255] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak smanjenja ekspresionog curenja polinukleotida koji se intratumorski primenjuje subjektu kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu navedenog polinukleotida tumorskom tkivu kao farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, pri čemu je nivo ekspresije polipeptida u netumorskom
4
tkivu smanjen u poređenju sa nivoom ekspresije polipeptida u netumorskom tkivu posle primene odgovarajuće referentne kompozicije.
[1256] Takođe je obezbeđen postupak smanjenja ekspresionog curenja terapijskog agensa (npr. polipeptida koji se primenjuje kao deo farmaceutske kompozicije) intratumorski primenjenog subjektu kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu navedenog terapijskog agensa tumorskom tkivu kao farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, pri čemu je količina terapijskog agensa u netumorskom tkivu smanjena u poređenju sa količinom terapijskog agensa u netumorskom tkivu posle primene odgovarajuće referentne kompozicije.
[1257] Takođe je obezbeđen postupak smanjenja ekspresionog curenja eksprimiranog polipeptida u tumoru kod subjekta, koji sadrži primenu tumorskom tkivu farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži polinukleotid koji kodira eksprimirani polipeptid, i pri čemu je količina eksprimiranog polipeptida u netumorskom tkivu smanjena u poređenju sa količinom eksprimiranog polipeptida u netumorskom tkivu posle primene odgovarajuće referentne kompozicije.
[1258] U nekim aspektima, netumorsko tkivo je peritumorsko tkivo. U drugim aspektima, netumorsko tkivo je tkivo jetre.
[1259] Predmetna objava je takođe obezbedila postupak za redukovanje ili preveniranje imunskog odgovora koji je uzrokovan intratumorskom primenom farmaceutske kompozicije, npr. farmaceutske kompozicije koja sadrži lipide koji su poznati u struci, zamenom jednog ili svih lipida u takvoj kompoziciji sa jedinjenjem Formule (I). Na primer, imunski odgovor koji je uzrokovan primenom polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži MC3 (ili druge lipide poznate u struci) može se prevenirati (izbeći) ili poboljšati zamenom MC3 sa jedinjenjem Formule (I), npr. Jedinjenjem 18.
[1260] U nekim aspektima, imunski odgovor uočen pošto je polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, primenjen u farmaceutskoj kompoziciji koja je ovde objavljena nije povišen u poređenju sa imunskim odgovorom uočenim kada je terapijski agens ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid,
4 4
polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, primenjen u fosfatnom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) ili drugom fiziološkom puferskom rastvoru (npr. Ringerov rastvor, Tirodov (Tyrode's) rastvor, Hankov (Hank's) balansirani rastvor soli, itd.).
[1261] U nekim aspektima, imunski odgovor uočen pošto je terapijski agens ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koja njihova kombinacija, primenjen u farmaceutskoj kompoziciji koja je ovde objavljena nije povišen u poređenju sa imunskim odgovorom uočenim kada je PBS ili drugi fiziološki puferski rastvor primenjen sam.
[1262] U nekim aspektima, nije uočen imunski odgovor kada se ovde objavljena farmaceutska kompozicija intratumorski primenjuje subjektu.
[1263] U skladu sa tim, predmetna objava takođe obezbeđuje postupak isporučivanja terapijskog agensa ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid subjektu kome je to potrebno, koji sadrži intratumorsku primenu subjektu farmaceutske kompozicije koja je ovde objavljena, pri čemu imunski odgovor koji je uzrokovan primenom farmaceutske kompozicije nije povišen u poređenju sa imunskim odgovorom koji je uzrokovan intratumorskom primenom
(i) samog PBS, ili dugog fiziološkog puferskog rastvora (npr. Ringerov rastvor, Tirodov rastvor, Hankov balansirani rastvor soli, itd.);
(ii) terapijskog agensa ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, u PBS ili drugom fiziološkom puferskom rastvoru; ili terapijskog agensa ili polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polinukleotid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u PBS ili drugom fiziološkom puferskom rastvoru; ili,
4
(iii) odgovarajuće referentne kompozicije, tj. iste farmaceutske kompozicije u kojoj je jedinjenje Formule (I) supstituisano drugim amino lipidom koji se može jonizovati, npr. MC3.
XIII. Kompleti i uređaji
Kompleti
[1264] Objava obezbeđuje niz kompleta za pogodno i/ili efikasno sprovođenje postupaka ili kompozicija iz predmetne objave. Tipično kompleti će sadržati dovoljne količine i/ili broj komponenti kako bi se omogućilo korisniku da izvrši višestruke tretmane subjekta(ata) i/ili da izvede više eksperimenata.
[1265] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje komplete koji sadrže polinukleotide iz objave. U nekim aspektima, komplet sadrži jedan ili više polinukleotida.
[1266] Kompleti mogu biti za proizvodnju proteina, koji sadrže polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid. Komplet može dodatno da sadrži pakovanje i uputstva i/ili agens za isporuku za formiranje formulacije kompozicije. Agens za isporuku može da sadrži fiziološki rastvor, puferisani rastvor, lipidoid ili bilo koji agens za isporuku koji je ovde objavljen.
[1267] U nekim aspektima, objava obezbeđuje komplet koji sadrži kontejner koji sadrži polinukleotidnu (npr. iRNK) kompoziciju ili lipidne nanočestice koje sadrže polinukleotide (npr. iRNK) kao što je ovde objavljeno, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač, i umetak pakovanja koji sadrži uputstva za primenu lipidnih nanočestica ili farmaceutske kompozicije za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca. U nekim aspektima, umetak pakovanja dodatno sadrži uputstva za primenu farmaceutske kompozicije u kombinaciji sa kompozicijom koja sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca.
[1268] U drugim aspektima, objava obezbeđuje komplet koji sadrži medikament koji sadrži lipidne nanočestice koje sadrže polinukleotide (npr. iRNK) kao što je ovde objavljeno, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač, i umetak pakovanja koji sadrži uputstva za primenu medikamenta samog ili u kombinaciji sa kompozicijom koja sadrži polipeptid inhibitor kontrolne tačke i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač za lečenje ili odlaganje progresije
4
kancera kod pojedinca. U nekim aspektima, komplet dodatno sadrži umetak pakovanja koji sadrži uputstva za primenu prvog medikamenta i drugog medikamenta za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca.
[1269] U srodnim aspektima, polipeptid inhibitor kontrolne tačke inhibira PD1, PD-L1, CTLA4, ili njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, polipeptid inhibitor kontrolne tačke je antitelo, kao što je anti-CTLA4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje CTLA4, anti-PD1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje PD1, anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje PD-L1, i njihova kombinacija. U nekim aspektima, polipeptid inhibitor kontrolne tačke je anti-PD-L1 antitelo odabrano od atezolizumaba, avelumaba, ili durvalumaba. U nekim aspektima, polipeptid inhibitor kontrolne tačke je anti-CTLA-4 antitelo odabrano od tremelimumaba ili ipilimumaba. U nekim aspektima, polipeptid inhibitor kontrolne tačke je anti-PD1 antitelo odabrano od nivolumaba ili pembrolizumaba.
[1270] U nekim aspektima, komplet sadrži puferski rastvor koji uključuje, na primer, natrijum hlorid, kalcijum hlorid, fosfat i/ili EDTA. U sledećem aspektu, puferski rastvor uključuje, ali nije ograničen na, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor sa 2 mM kalcijumom, 5% saharozu, 5% saharozu sa 2 mM kalcijumom, 5% manitol, 5% manitol sa 2 mM kalcijumom, Ringerov laktat, natrijum hlorid, natrijum hlorid sa 2 mM kalcijumom i manozu (videti npr. S.A.D. publ. br. 20120258046). U dodatnom aspektu, puferski rastvor se precipitira ili se liofilizuje. Količina svake komponente može da varira kako bi se omogućila konzistentna, reproducibilna veća koncentracija formulacije fiziološkog rastvora ili jednostavnog pufera. Komponente takođe mogu varirati kako bi se povećala stabilnost modifikovane RNK u puferskom rastvoru tokom određenog vremenskog perioda i/ili pod različitim uslovima. U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže: polinukleotid koji sadrži translatabilni region, obezbeđen u količini efikasnoj da proizvede željenu količinu proteina kodiranog translatabilnim regionom kada se introdukuje u ciljnu ćeliju; drugi polinukleotid koji sadrži inhibitornu nukleinsku kiselinu, obezbeđenu u količini efikasnoj da suštinski inhibira urođeni imunski odgovor ćelije; i pakovanje i uputstva.
[1271] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i/ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, pri čemu polinukleotidi pokazuju redukovanu degradaciju ćelijskom nukleazom, i pakovanje i uputstva.
4
[1272] U nekim aspektima, jedan polinukleotid sadrži (i) iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, (ii) iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili (iii) iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i iRNK koja kodira OX40L polipeptid. U nekim aspektima, jedan polinukleotid sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, iRNK koja kodira treći protein (npr. OX40L polipeptid), ili bilo koju njihovu kombinaciju.
Uređaji
[1273] Predmetna objava obezbeđuje uređaje koji mogu da inkorporišu polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid. Na primer, uređaj može da inkorporše polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Ovi uređaji sadrže u stabilnoj formulaciji reagense za sintetisanje polinukleotida u formulaciji koja je dostupna da se odmah isporuči subjektu kome je to potrebno, kao što je humani pacijent. U nekim aspektima, jedan polinukleotid sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid. U nekim aspektima, jedan polinukleotid sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid, iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, ili polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, iRNK koja kodira OX40L polipeptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[1274] Uređaji za primenu se mogu koristiti za isporuku polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid, polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-18 polipeptid, i polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid u skladu sa režimima pojedinačnog, višestrukog ili podeljenog doziranja o kojima se ovde podučava. O takvim uređajima podučava se u, na primer, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013151666 A2.
[1275] Postupak i uređaji koji su poznati u struci za višestruku primenu ćelijama, organima i tkivima razmatrani su za upotrebu u vezi sa postupcima i kompozicijama koje su ovde
4
objavljene u predmetnoj objavi. Oni uključuju, na primer, one postupke i uređaje koji imaju više igala, hibridne uređaje koji koriste, na primer, lumene ili katetere kao i uređaje koji koriste mehanizme pokretane toplotom, električnom strujom ili zračenjem.
[1276] U skladu sa predmetnom objavom, ovi uređaji za višestruku primenu mogu se koristiti za isporuku pojedinačnih, višestrukih ili podeljenih doza koje su ovde razmatrane. O takvim uređajima podučava se na primer u Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013151666 A2.
Ekvivalenti i obim:
[1277] U patentnim zahtevima, članovi kao što su neodređeni i određeni članovi mogu značiti jedan ili više od jednog osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Patentni zahtevi ili opisi koji uključuju "ili" između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovoljenim ukoliko je jedan, više od jednog, ili su svi članovi grupe prisutni u, korišćeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak, osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Objava uključuje aspekte u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, korišćen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Objava uključuje aspekte u kojima je više od jednog, ili su svi članovi grupe prisutni u, korišćeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak.
[1278] Takođe se zapaža da je termin "sadrži" namenjen da bude otvoren i dozvoljava ali ne zahteva uključivanje dodatnih elemenata ili koraka. Kada se ovde upotrebljava termin "sadrži", termin "koji se sastoji od" je stoga takođe obuhvaćen i objavljen.
[1279] Tamo gde su dati opsezi, krajnje tačke su uključene. Štaviše, treba razumeti da osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili na drugi način očigledno iz konteksta i razumevanja onog sa prosečnim iskustvom u struci, vrednosti koje su izražene kao opsezi mogu da poprime bilo koju specifičnu vrednost ili podopseg unutar navedenih opsega u različitim aspektima objave, do desetine jedinice donje granice opsega, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[1280] Pored toga, treba razumeti da se bilo koji određeni aspekt predmetne objave koji spada u stanje tehnike može eksplicitno isključiti iz bilo kog jednog ili više od patentnih zahteva. Pošto se smatra da su takvi aspekti poznati onom sa prosečnim iskustvom u struci, oni se mogu isključiti čak i ukoliko isključenje nije eksplicitno izneto ovde. Bilo koji određeni aspekt kompozicija iz pronalaska (npr. bilo koja nukleinska kiselina ili protein koji je njom kodiran; bilo koji postupak proizvodnje; bilo koji postupak upotrebe, itd.) može biti isključen iz bilo kog jednog ili više patentnih zahteva, iz bilo kog razloga, bez obzira da li je vezano za postojanje stanja tehnike.
4
[1281] U slučaju suprotstavljenih izjava citiranog izvora i trenutne prijave, prednost ima izjava u trenutnoj prijavi.
[1282] Naslovi odeljaka i tabela nisu namenjeni da budu ograničavajući.
PRIMERI
Primer 1
Sinteza jedinjenja u skladu sa Formulom I
A. Opšta razmatranja
[1283] Svi rastvarači i reagensi koji su upotrebljavani nabavljeni su komercijalno i upotrebljavani kao takvi osim ukoliko nije drugačije naznačeno.<1>H NMR spektri su snimljeni u CDCl3, na 300 K upotrebom Bruker Ultrashield 300 MHz instrumenta. Hemijski pomaci su saopšteni kao delovi po milionu (ppm) u odnosu na TMS (0,00) za<1>H. Hromatografije na silika gelu su izvedene na ISCO CombiFlash Rf+ Lumen instrumentima upotrebom ISCO RediSep Rf Gold Flash kartridža (veličina čestica: 20-40 mikrona). Hromatografije na reverznim fazama su izvedene na ISCO CombiFlash Rf+ Lumen instrumentima upotrebom RediSep Rf Gold C18 kolone visokih performansi. Određeno je da su sva krajnja jedinjenja čistoće veće od 85% putem analize UPLC-MS na reverznim fazama (vremena zadržavanja, RT, u minutima) upotrebom Waters Acquity UPLC instrumenta sa DAD i ELSD i ZORBAX kolonom brze rezolucije visoke definicije (RRHD) SB-C18 LC, 2,1 mm, 50 mm, 1,8 µm, i gradijenta od 65 do 100% acetonitrila u vodi sa 0,1% TFA tokom 5 minuta pri 1,2 ml/min. Injekciona zapremina je bila 5 µl, a temperatura kolone je bila 80 °C. Detekcija je zasnovana na elektrosprej jonizaciji (ESI) u pozitivnom režimu upotrebom Waters SQD masenog spektrometra (Milford, MA, SAD) i detektora evaporativnog rasejanja svetlosti.
[1284] Reprezentativne procedure opisane u nastavku korisne su u sintezi Jedinjenja 1-232.
[1285] Ovde se upotrebljavaju sledeće skraćenice:
THF: tetrahidrofuran
DMAP: 4-dimetilaminopiridin
LDA: litijum diizopropilamid
rt: sobna temperatura
4
DME: 1,2-dimetoksietan
n-BuLi: n-butillitijum
B. Jedinjenje 2: Heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)(tetradecil)amino) oktanoat
Reprezentativna procedura 1:
[1286]
Heptadekan-9-il 8-bromooktanoat (Postupak A)
[1287]
[1288] Rastvoru 8-bromooktanske kiseline (1,04 g, 4,6 mmol) i heptadekan-9-ola (1,5 g, 5,8 mmol) u dihlorometanu (20 ml) dodati su N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (1,1 g, 5,8 mmol), N,N-diizopropiletilamin (3,3 ml, 18,7 mmol) i DMAP (114 mg, 0,9 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na rt tokom 18 h. Reakcija je razblažena sa dihlorometanom i isprana zasićenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je odvojen i ispran slanim rastvorom, i osušen preko MgSO4. Organski sloj je filtriran i evaporisan in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-10% etil acetata u heksanima) kako bi se dobio heptadekan-9-il 8-bromooktanoat (875 mg, 1,9 mmol, 41%).
[1289]<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,89 (m, 1H); 3,42 (m, 2H); 2,31 (m, 2H); 1,89 (m, 2H); 1,73-1,18 (br. m, 36H); 0,88 (m, 6H).
4 1
Heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)amino)oktanoat (Postupak B)
[1290]
[1291] Rastvoru heptadekan-9-il 8-bromooktanoata (3,8 g, 8,2 mmol) i 2-aminoetan-1-ola (15 ml, 248 mmol) u etanolu (3 ml) je omogućeno da se meša na 62 °C tokom 18 h. Reakciona smeša je koncentrovana in vacuo i ostatak je prenet u etil acetat i vodu. Organski sloj je odvojen i ispran vodom, slanim rastvorom i osušen preko Na2SO4. Smeša je filtrirana i evaporisana in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-100% (smeša 1% NH4OH, 20% MeOH u dihlorometanu) u dihlorometanu) kako bi se dobio heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)amino)oktanoat (3,1 g, 7 mmol, 85%). UPLC/ELSD: RT = 2,67 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 442,68 za C27H55NO3
[1292]<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,89 (p, 1H); 3,67 (t, 2H); 2,81 (t, 2H); 2,65 (t, 2H); 2,30 (t, 2H); 2,05 (br. m, 2H); 1,72-1,41 (br. m, 8H); 1,40-1,20 (br. m, 30H); 0,88 (m, 6H).
Heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)(tetradecil)amino)oktanoat (Postupak C)
[1293]
Hemijska formula: C41H83NO3
Molekulska težina: 638,12
[1294] Rastvoru heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)amino)oktanoata (125 mg, 0,28 mmol), 1-bromotetradekana (94 mg, 0,34 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (44 mg, 0,34 mmol) u etanolu je omogućeno da se meša na 65 °C tokom 18 h. Reakcija je ohlađena do sobne
4 2
temperature i rastvarači su evaporisani in vacuo. Ostatak je prenet u etil acetat i zasićeni natrijum bikarbonat. Organski sloj je odvojen, osušen preko Na2SO4i evaporisan in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-100% (smeša 1% NH4OH, 20% MeOH u dihlorometanu) u dihlorometanu) kako bi se dobio heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)(tetradecil)amino)oktanoat (89 mg, 0,14 mmol, 50%). UPLC/ELSD: RT = 3,61 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 638,91 za C41H83NO3.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,86 (p, 1H); 3,72-3,47 (br. m, 2H); 2,78-2,40 (br. m, 5H); 2,28 (t, 2H); 1,70-1,40 (m, 10H); 1,38-1,17 (br. m, 54H); 0,88 (m, 9H).
Sinteza intermedijera:
Intermedijer A: 2-oktildekanska kiselina
[1295]
[1296] Rastvor diizopropilamina (2,92 ml, 20,8 mmol) u THF (10 ml) je ohlađen na -78 °C i dodat je rastvor n-BuLi (7,5 ml, 18,9 mmol, 2,5 M u heksanima). Reakciji je omogućeno da se zagreje na 0 °C. Rastvoru dekanske kiseline (2,96 g, 17,2 mmol) i NaH (754 mg, 18,9 mmol, 60% tež./tež.) u THF (20 ml) na 0 °C dodat je rastvor LDA i smeši je omogućeno da se meša na rt tokom 30 min. Posle ovog vremena dodat je 1-jodooktan (5 g, 20,8 mmol) i reakciona smeša je zagrevana na 45 °C tokom 6 h. Reakcija je ugašena sa 1N HCl (10 ml). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i evaporisan in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% etil acetata u heksanima) kako bi se dobila 2-oktildekanska kiselina (1,9 g, 6,6 mmol, 38%).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 2,38 (br, m, 1H); 1,74-1,03 (br, m, 28H); 0,91 (m, 6H).
Intermedijer B: 7-bromoheptil 2-oktildekanoat
[1297]
4
[1298] 7-bromoheptil 2-oktildekanoat je sintetisan upotrebom Postupka A iz 2-oktildekanske kiseline i 7-bromoheptan-1-ola.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,09 (br. m, 2H); 3,43 (br. m, 2H); 2,48-2,25 (br. m, 1H); 1,89 (br. m, 2H); 1,74-1,16 (br. m, 36H); 0,90 (m, 6H).
Intermedijer C: (2-heksilciklopropil)metanol
[1299]
[1300] Rastvoru dietil cinka (20 ml, 20 mmol, 1 M u heksanima), u dihlorometanu (20 ml) je omogućeno da se ohladi na -40 °C tokom 5 min. Zatim je kap po kap dodat rastvor dijodometana (3,22 ml, 40 mmol) u dihlorometanu (10 ml). Pošto je reakciji omogućeno da se meša tokom 1 h na -40 °C, dodat je rastvor trihlor-sirćetne kiseline (327 mg, 2 mmol) i DME (1 ml, 9,6 mmol) u dihlorometanu (10 ml). Reakciji je omogućeno da se zagreje na -15 °C i meša na ovoj temperaturi tokom 1 h. Rastvor (Z)-non-2-en-1-ola (1,42 g, 10 mmol) u dihlorometanu (10 ml) je zatim dodat u rastvor na -15 °C. Reakciji je zatim omogućeno da se polako zagreje do rt i meša tokom 18 h. Posle ovog vremena dodat je zasićeni NH4Cl (200 ml) i reakcija je ekstrahovana sa dihlorometanom (3X), isprana slanim rastvorom, i osušena preko Na2SO4. Organski sloj je filtriran, evaporisan in vacuo i ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-50% etil acetat u heksanima) kako bi se dobio (2-heksilciklopropil)metanol (1,43 g, 9,2 mmol, 92%).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,64 (m, 2H); 1,57-1,02 (m, 12H); 0,99-0,80 (m, 4H); 0,72 (m, 1H), 0,00 (m, 1H).
C. Jedinjenje 18: Heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino) oktanoat
[1301]
4 4
Hemijska formula: C44H87NO5
Molekulska težina: 710,18
[1302] Jedinjenje 18 je sintetisano u skladu sa opštom procedurom i reprezentativnom procedurom 1 koje su prethodno opisane.
[1303] UPLC/ELSD: RT = 3,59 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 710,89 za C44H87NO5.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,86 (m, 1H); 4,05 (t, 2H); 3,53 (br, m, 2H); 2,83-2,36 (br. m, 5H); 2,29 (m, 4H); 0,96-1,71 (m, 64H); 0,88 (m, 9H).
D. Jedinjenje 136: Nonil 8-((2-hidroksietil)((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)oktanoat
Reprezentativna procedura 2:
Nonil 8-bromooktanoat (Postupak A)
[1304]
[1305] Rastvoru 8-bromooktanske kiseline (5 g, 22 mmol) i nonan-1-ola (6,46 g, 45 mmol) u dihlorometanu (100 ml) dodati su N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (4,3 g, 22 mmol) i DMAP (547 mg, 4,5 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na rt tokom 18 h. Reakcija je razblažena sa dihlorometanom i isprana zasićenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je odvojen i ispran slanim rastvorom, osušen preko MgSO4. Organski sloj je filtriran i evaporisan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-10% etil acetat u heksanima) kako bi se dobio nonil 8-bromooktanoat (6,1 g, 17 mmol, 77%).
4
[1306]<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,06 (t, 2H); 3,40 (t, 2H); 2,29 (t, 2H); 1,85 (m, 2H); 1,72-0,97 (m, 22H); 0,88 (m, 3H).
Nonil 8-((2-hidroksietil)amino)oktanoat
[1307]
[1308] Rastvoru nonil 8-bromooktanoata (1,2 g, 3,4 mmol) i 2-aminoetan-1-ola (5 ml, 83 mmol) u etanolu (2 ml) je omogućeno da se meša na 62 °C tokom 18 h. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu i ostatak je ekstrahovan sa etil acetatom i vodom. Organski sloj je odvojen i ispran vodom, slanim rastvorom i osušen preko Na2SO4. Organski sloj je filtriran i evaporisan in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-100% (smeša 1% NH4OH, 20% MeOH u dihlorometanu) u dihlorometanu) kako bi se dobio nonil 8-((2-hidroksietil)amino)oktanoat (295 mg, 0,9 mmol, 26%).
[1309] UPLC/ELSD: RT = 1,29 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 330,42 za C19H39NO3
[1310]<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,07 (t, 2H); 3,65 (t, 2H); 2,78 (t, 2H); 2,63 (t, 2H); 2,32-2,19 (m, 4H); 1,73-1,20 (m, 24H); 0,89 (m, 3H)
Nonil 8-((2-hidroksietil)((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)oktanoat
[1311]
Hemijska formula: C37H71NO3
Molekulska težina: 577,98
[1312] Rastvoru nonil 8-((2-hidroksietil)amino)oktanoata (150 mg, 0,46 mmol), (6Z,9Z)-18-bromooktadeka-6,9-diena (165 mg, 0,5 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (65 mg, 0,5 mmol)
4
u etanolu (2 ml) je omogućeno da se meša na refluksu tokom 48 h. Reakciji je omogućeno da se ohladi do rt i rastvarači su evaporisani pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-10% MeOH u dihlorometanu) kako bi se dobio nonil 8-((2-hidroksietil)((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)oktanoat (81 mg, 0,14 mmol, 30%) kao HBr so.
[1313] UPLC/ELSD: RT = 3,24 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 578,64 za C37H71NO3
[1314]<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 10,71 (br., 1H); 5,36 (br. m, 4H); 4,04 (m, 4H); 3,22-2,96 (br. m, 5H); 2,77 (m, 2H); 2,29 (m, 2H); 2,04 (br. m, 4H); 1,86 (br. m, 4H); 1,66-1,17 (br. m, 40H); 0,89 (m, 6H)
E. Jedinjenje 138: Dinonil 8,8'-((2-hidroksietil)azandiil)dioktanoat
Reprezentativna procedura 3:
Dinonil 8,8'-((2-hidroksietil)azandiil)dioktanoat
[1315]
Hemijska formula: C36H71NO5
Molekulska težina: 597,97
[1316] Rastvoru nonil 8-bromooktanoata (200 mg, 0,6 mmol) i 2-aminoetan-1-ola (16 mg, 0,3 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (74 mg, 0,6 mmol) u THF/CH3CN (1:1) (3 ml) je omogućeno da se meša na 63 °C tokom 72 h. Reakcija je ohlađena do rt i rastvarači su evaporisani pod vakuumom. Ostatak je ekstrahovan sa etil acetatom i zasićenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je odvojen, osušen preko Na2SO4i evaporisan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-10% MeOH u dihlorometanu) kako bi se dobio dinonil 8,8'-((2-hidroksietil)azandiil)dioktanoat (80 mg, 0,13 mmol, 43%).
[1317] UPLC/ELSD: RT = 3,09 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 598,85 za C36H71NO5
4
[1318]<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,05 (m, 4H); 3,57 (br. m, 2H); 2,71-2,38 (br. m, 6H); 2,29 (m, 4H), 1,71-1,01 (br. m, 49H), 0,88 (m, 6H).
[1319] Sva druga lipidna jedinjenja koja su ovde objavljena mogu se dobiti postupkom analognim reprezentativnim procedurama 1-3 kao što je prethodno opisano i/ili postupkom koji je poznat u struci.
Primer 2
Proizvodnja kompozicija nanočestica
A. Proizvodnja kompozicija nanočestica
[1320] Nanočestice se mogu napraviti postupcima mešanja kao što su mikrofluidika i mešanje T-spojem dva toka fluida, od kojih jedan sadrži polinukleotid, a drugi ima lipidne komponente.
[1321] Lipidne kompozicije su pripremljene kombinovanjem amino lipida koji se može jonizovati koji je ovde objavljen, npr. lipida u skladu sa Formulom (I), fosfolipida (kao što su DOPE ili DSPC, koji se mogu nabaviti od Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), PEG lipida (kao što je npr. 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoksipolietilen glikol, takođe poznat kao PEG-DMG, koji se može nabaviti od Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), i strukturnog lipida (kao što su holesterol, koji se može nabaviti od Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Nemačka, ili kortikosteroid (kao što su prednizolon, deksametazon, prednizon, i hidrokortizon), ili njihova kombinacija) u koncentracijama od oko 50 mM u etanolu. Rastvori treba da su ohlađeni za skladištenje na, na primer, -20 °C. Lipidi su kombinovani kako bi se dobili željeni molski odnosi i razblaženi vodom i etanolom do krajnje koncentracije lipida od između oko 5,5 mM i oko 25 mM.
[1322] Kompozicije nanočestica koje uključuju polinukleotid i lipidnu kompoziciju pripremljene su kombinovanjem rastvora lipida sa rastvorom koji uključuje polinukleotid pri tež./tež. odnosima lipidne kompozicije prema polinukleotidu između oko 5:1 i oko 50:1. Rastvor lipida je brzo injektiran upotrebom NanoAssemblr mikrofluidnog sistema sa stopama protoka između oko 10 ml/min i oko 18 ml/min u rastvor polinukleotida kako bi se proizvela suspenzija sa odnosom vode prema etanolu između oko 1:1 i oko 4:1.
4
[1323] Za kompozicije nanočestica koje uključuju RNK, rastvori RNK pri koncentracijama od 0,1 mg/ml u dejonizovanoj vodi razblaženi su u 50 mM natrijum citratnom puferu na pH između 3 i 4 kako bi se formirao štok rastvor.
[1324] Kompozicije nanočestica se mogu obraditi dijalizom kako bi se uklonio etanol i postigla izmena pufera. Formulacije su dijalizirane dva puta nasuprot fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora (PBS), pH 7,4, u zapreminama 200 puta većim od zapremine primarnog proizvoda upotrebom Slide-A-Lyzer kaseta (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) sa graničnom molekulskom težinom od 10 kD. Prva dijaliza je izvedena na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Formulacije su zatim dijalizirane preko noći na 4 °C. Rezultujuća suspenzija nanočestica filtrirana je kroz 0,2 µm sterilne filtere (Sarstedt, Nümbrecht, Nemačka) u staklene bočice i zapečaćena crimp kapicama. Generalno su dobijeni rastvori kompozicije nanočestica od 0,01 mg/ml do 0,10 mg/ml.
[1325] Prethodno opisani postupak indukuje nano-precipitaciju i formiranje čestica. Alternativni postupci uključujući, ali ne ograničavajući se na, T-spoj i direktno injektiranje, mogu se upotrebljavati za postizanje iste nano-precipitacije.
B. Karakterizacija kompozicija nanočestica
[1326] Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) se može upotrebljavati za određivanje veličine čestica, indeksa polidisperznosti (PDI) i zeta potencijala kompozicija nanočestica u 1xPBS za određivanje veličine čestica i 15 mM PBS za određivanje zeta potencijala.
[1327] Ultraljubičasta-vidljiva spektroskopija se može upotrebljavati za određivanje koncentracije polinukleotida (npr. RNK) u kompozicijama nanočestica. 100 µl razblažene formulacije u 1xPBS dodato je u 900 µl 4:1 (zapr./zapr.) smeše metanola i hloroforma. Posle mešanja, spektar apsorbance rastvora se beleži, na primer, između 230 nm i 330 nm na DU 800 spektrofotometru (Beckman Coulter, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Koncentracija polinukleotida u kompoziciji nanočestica može se izračunati na osnovu koeficijenta ekstinkcije polinukleotida koji se upotrebljava u kompoziciji i na osnovu razlike između apsorbance na talasnoj dužini od, na primer, 260 nm i osnovne vrednosti na talasnoj dužini od, na primer, 330 nm.
[1328] Za kompozicije nanočestica koje uključuju RNK, može se upotrebljavati QUANT-IT™ RIBOGREEN<®>RNK test (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA) za procenu inkapsulacije RNK od strane kompozicije nanočestica. Uzorci su razblaženi do koncentracije
4
od približno 5 µg/ml u TE puferskom rastvoru (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5). 50 µl razblaženih uzoraka je preneto na polistirensku ploču sa 96 bunarića i u bunariće je dodato bilo 50 µl TE pufera ili 50 µl 2% rastvora Triton X-100. Ploča je inkubirana na temperaturi od 37 °C tokom 15 minuta. RIBOGREEN<®>reagens je razblažen 1:100 u TE puferu, i 100 µl ovog rastvora je dodato u svaki bunarić. Intenzitet fluorescencije se može izmeriti upotrebom fluorescentnog čitača ploča (Wallac Victor 1420 Multilablel Counter; Perkin Elmer, Waltham, MA) na talasnoj dužini ekscitacije od, na primer, oko 480 nm i talasnoj dužini emisije od, na primer, oko 520 nm. Vrednosti fluorescencije samog reagensa se oduzimaju od vrednosti svakog od uzoraka i procenat slobodne RNK se određuje deljenjem intenziteta fluorescencije intaktnog uzorka (bez dodavanja Triton X-100) sa vrednošću fluorescencije narušenog uzorka (uzrokovano dodavanjem Triton X-100).
[1329] Primeri formulacija kompozicija nanočestica predstavljeni su u Tabeli 9 u nastavku.
Tabela 9: Primeri formulacija kompozicija nanočestica
4
Primer 3
Efikasnost IL-23 iRNK monoterapije u modelima A20 (limfom) i MC38-C (kancer kolona)
[1330] Efikasnost monoterapije upotrebom IL-23 iRNK monoterapije procenjena je na modelu limfoma A20 i na modelu kancera kolona MC38-C. MC-38 tumori adenokarcinoma kolona uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa. Videti Rosenberg et al., Science 233(4770):1318-21 (1986). A20 ćelije B-ćelijskog limfoma miša (A20, ATCC br. TIB-208; ATCC, Manassas, VA) kultivisane su u skladu sa uputstvima prodavca. A20 ćelije su inokulisane subkutano u BALB/c miševe kako bi se generisali subkutani tumori. Tumor je praćen u pogledu veličine i palpabilnosti. Videti Kim et al., Journal of Immunology 122(2):549-554 (1979); Donnou et al., Advances in Hematology 2012: 701704 (2012).
4 1
[1331] Polinukleotidi koji odgovaraju iRNK koje kodiraju IL-23 (iRNK bez miR-122 vezujućeg mesta) i NST-FIX iRNK kontrola pripremljeni su kao što je opisano u predmetnoj specifikaciji. iRNK su formulisane u LNP sa Jedinjenjem 18.
[1332] Kada su MC-38 ili A20 tumori dostigli srednju vrednost veličine od približno 100 mm3, životinje su tretirane pojedinačnim intratumorskim dozama iRNK (2,5 µg/dozi).
[1333] Kontrolne životinje su tretirane sa ekvivalentnom dozom iRNK negativne kontrole. "NST" kontrole su netranslatabilne verzije iRNK koja kodira kontrolni protein, pri čemu iRNK sadrži više stop kodona.
[1334] Zapremina tumora je izmerena u naznačenim vremenskim tačkama upotrebom ručnih kalipera. Zapremina tumora je zabeležena u kubnim milimetrima.
[1335] Efikasnost IL-23 iRNK monoterapije u modelu limfoma A20 pokazana je na SL. 1A i 1B. SL. 1A pokazuje tretman sa NST-FIX iRNK kontrolom (2,5 μg iRNK). Potpuni odgovor ("CR") je uočen kod 1 od 12 ispitanika (8,3%). SL.1B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira mIL-23 bez miRNA vezujućeg mesta "bez miR" (2,5 μg iRNK). Tretman sa IL-23 iRNK je izazvao potpune odgovore kod 5 od 12 subjekata (41,6%). Efikasnost IL-23 iRNK monoterapije u modelu kancera kolona MC38-C pokazana je na SL. 2A i 2B. SL. 2A pokazuje tretman sa NST-OXL40 iRNK kontrolom (2,5 μg iRNK). SL. 2B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira mIL-23 bez miRNA vezujućeg mesta "bez miR" (2,5 μg iRNK). Primena IL-23 iRNK izazvala je potpune odgovore kod 4 od 10 subjekata (40%). Delimičan odgovor je uočen kod 2 od 10 subjekata (20%).
Primer 4
Dodavanje iRNK koja kodira IL-36 gama ili IL-18 u iRNK koja kodira IL-23 povećava efikasnost u MC38-C modelu
[1336] Efekat dodavanja iRNK koje kodiraju interleukin 36-gama ili interleukin 18 IL-23 iRNK tretmanu takođe je procenjen u modelu kancera kolona MC38-C. Kao u primeru 3, MC-38 tumori adenokarcinoma kolona uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa kako bi se generisali subkutani tumori.
[1337] Polinukleotidi koji odgovaraju iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama i IL-18 iRNK pripremljeni su kao što je opisano u predmetnoj specifikaciji. iRNK su formulisane u LNP sa Jedinjenjem 18. Kada su MC38 tumori dostigli srednju vrednost veličine od približno 100
4 2
mm3, životinje su tretirane pojedinačnim intratumorskim dozama iRNK. Kontrolne životinje su tretirane sa ekvivalentnom dozom iRNK negativne kontrole.
[1338] Zapremina tumora je izmerena u naznačenim vremenskim tačkama upotrebom ručnih kalipera. Zapremina tumora je zabeležena u kubnim milimetrima. Studija in vivo efikasnosti je sprovedena do dana 50 nakon doziranja.
[1339] Podaci su pokazali da je dodavanje IL-36-gama ili IL-18 tretmanu koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 povećao efikasnost tretmana u modelu kancera kolona MC38-C. SL. 3A pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 i NST-FIX iRNK kontrolom (2,5 μg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 3 od 10 subjekata (30%). Delimičan odgovor je uočen kod 6 od 10 subjekata (60%). Prošireni podaci do dana 90 pokazani su na SL. 3E.
[1340] SL. 3B pokazuje tretman sa iRNK koje kodiraju IL-23 i IL-36-gama (2,5 μg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 9 od 10 subjekata (90%). Delimičan odgovor je uočen kod 1 od 10 subjekata (10%). Prošireni podaci do dana 90 pokazani su na SL. 3F.
[1341] SL. 3C pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 i drugom iRNK koja kodira IL-18 (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 6 od 10 subjekata (60%). Delimičan odgovor je uočen kod 3 od 10 subjekata (30%).
[1342] SL. 3D pokazuje tretman samo sa NST-FIX iRNK kontrolom (5 µg iRNK). Prošireni podaci do dana 70 pokazani su na SL.3G.
[1343] Podaci ukazuju da je kombinacija iRNK koja kodira IL-23 sa drugom iRNK koja kodira IL-36-gama bila efikasnija od IL-23 iRNK monoterapije. Štaviše, kombinovana terapija IL-23 i IL-36-gama bila je efikasnija od IL-36-gama monoterapije plus iRNK negativne kontrole (nije pokazano). Podaci takođe ukazuju da je kombinacija iRNK koja kodira IL-23 iRNK sa drugom iRNK koja kodira IL-18 bila efikasnija od monoterapije sa iRNK koja kodira IL-23. Štaviše, kombinacija iRNK koja kodira IL-23 sa iRNK koja kodira IL-18 bila je efikasnija od monoterapije sa iRNK koja kodira IL-18 plus iRNK negativne kontrole (nije pokazano).
Primer 5
Efekat dodavanja miR-122 vezujućeg mesta na IL-36-gama i IL-18 kombinovanu terapiju
4
[1344] Procenjena je efikasnost kombinovanja iRNK koja kodira IL-36-gama sa IL-23 iRNK terapijom, kao i efekat dodavanja miR-122 na iRNK koja kodira IL-36-gama koja se upotrebljava u kombinovanoj terapiji sa iRNK koja kodira IL-23.
[1345] Efikasnost upotrebe IL-23 iRNK kombinovanih terapija procenjena je na modelu limfoma A20 kao što je prethodno opisano. A20 ćelije B-ćelijskog limfoma miša kultivisane su u skladu sa uputstvima prodavca, inokulisane subkutano u BALB/c miševe kako bi se generisali subkutani tumori, a kada su A20 tumori dostigli srednju vrednost veličine od približno 100 mm3, životinje su tretirane pojedinačnim intratumorskim dozama iRNK.
[1346] Polinukleotidi koji odgovaraju iRNK koja kodira NST-FIX kontrolu, iRNK koja kodira IL-23 ili IL-18 bez miR-122 "bez miR", i iRNK koja kodira IL-36-gama ili IL-18 sa miR-122, pripremljeni su kao što je opisano u predmetnoj specifikaciji. iRNK su formulisane u LNP sa Jedinjenjem 18. Zapremina tumora je izmerena u naznačenim vremenskim tačkama upotrebom ručnih kalipera. Zapremina tumora je zabeležena u kubnim milimetrima. Studija in vivo efikasnosti je sprovedena do dana 80 nakon doziranja.
[1347] SL. 4A-4C pokazuju da dodavanje iRNK koja kodira IL-36-gama u iRNK koja kodira IL-23 povećava efikasnost u modelu limfoma A20. SL. 4A pokazuje tretman kombinovanom terapijom koja sadrži iRNK koja kodira IL-23 bez miR-122 "bez miR" i NST-FIX iRNK (2,5 µg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 8 od 12 subjekata (66,6%). Delimičan odgovor je uočen kod 1 od 12 subjekata (8,3%). SL. 4B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 bez miR-122 "bez miR" i iRNK koja kodira IL-36-gama sa miR-122 (2,5 μg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 10 od 12 subjekata (83,3%). SL. 4C pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 bez miR122 vezujućeg mesta "bez miR" i iRNK koja kodira IL-18 bez miR122 vezujućeg mesta "bez miR" (2,5 μg svaka iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 6 od 12 subjekata (50%). SL. 4D pokazuje tretman sa NST-FIX iRNK kontrolom (5 µg iRNK). iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama ili IL-18 kombinacije bile su superiornije od monokonstituenata plus iRNK negativne kontrole (IL-1 monoterapije nisu pokazane). Efikasnost kombinacije iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama koja sadrži mR122 vezujuće mesto u 5' UTR regionu iRNK bila je posebno visoka u poređenju sa kombinacijom koja sadrži bez miR iRNK (tj. iRNK bez miR-122 vezujućeg mesta u 5'-UTR regionu).
Primer 6
4 4
Efikasnost iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira IL-23 u modelu limfoma A20
[1348] Efikasnost iRNK koja kodira IL-36-gama plus iRNK koja kodira IL-23 u odnosu na samu iRNK koja kodira IL-23 sa fiksnom dozom iRNK od 5 mg procenjena je na modelu limfoma A20. Eksperimenti su sprovedeni kao što je prethodno detaljno opisano.
[1349] SL.5A pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 (5 μg iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 1 od 10 subjekata (10%). Delimičan odgovor je uočen kod 4 od 10 subjekata (40%). SL. 5B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-36-gama (5 μg iRNK). Potpuni odgovor je uočen kod 2 od 10 subjekata (20%). Delimičan odgovor je uočen kod 1 od 10 subjekata (10%). SL. 5C pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 i iRNK koja kodira IL-36-gama (2,5 μg svaka iRNK). SL. 5D pokazuje tretman sa NST-FIX iRNK kontrolom (5 µg iRNK). Podaci pokazuju da je kombinacija IL-23/IL-36-gama iRNK bila superiornija od primene monokonstituentne terapije pri fiksnoj dozi od 5 µg iRNK.
Primer 7
Efikasnost iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama ili IL-18 u modelu kancera kolona MC38-M
[1350] Efikasnost kombinovane terapije koja sadrži iRNK koja kodira IL-23 plus iRNK koja kodira IL-36-gama ili IL-18 procenjena je u modelu kancera kolona MC38 kao što je prethodno opisano. Eksperimenti u prethodnim primerima sprovedeni su upotrebom MC38-C modela (jako imunogenog). Nasuprot tome, eksperimenti u trenutnom primeru sprovedeni su upotrebom MC38-M modela (slabo imunogenog). Razlike u imunskim infiltratima i histološke razlike između oba modela pokazane su na SL.6A i 6B.
[1351] SL. 7A i 7B pokazuju nedostatak ubedljive efikasnosti IL-23 iRNK monoterapije u modelu kancera kolona MC38-M. SL. 7A pokazuje tretman sa NST-OX40L iRNK kontrolom (2,5 μg iRNK) u LNP na bazi Jedinjenja 18. Nije uočen nikakav odgovor. SL. 7B pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 bez miR-122 "bez miR" (2,5 μg iRNK) u LNP na bazi Jedinjenja 18. Uočen je samo jedan delimičan odgovor (1 od 10, 10%). MC38-M je relativno neosetljiv model u kome su OX40L, anti-PD-1 antitelo, i IL-23 monoterapije neefikasne.
[1352] SL. 7C pokazuje da je kombinacija iRNK koja kodira IL-23 sa iRNK koja kodira IL-36-gama efikasna kod slabo imunogenog kancera kolona MC38-M. Slika pokazuje tretman sa
4
iRNK koja kodira IL-23 i iRNK koja kodira IL-36-gama (2,5 µg svaka iRNK). Tretman sa iRNK koja kodira IL-23 i iRNK koja kodira IL-36-gama izazvao je potpune odgovore kod 2 od 10 subjekata (20%), a delimični odgovori su uočeni kod 5 od 10 subjekata (50%).
[1353] SL. 7E pokazuje da je kombinacija iRNK koja kodira IL-23 sa iRNK koja kodira IL-18 efikasna kod slabo imunogenog kancera kolona MC38-M. Slika pokazuje tretman sa iRNK koja kodira IL-23 i iRNK koja kodira IL-18 (2,5 µg svaka iRNK). SL. 7D pokazuje tretman sa NST-FIX iRNK kontrolom (5 μg iRNK).
Primer 8
Efikasnost trostruke kombinacije iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama, i OX40L u modelu kancera kolona MC38-M
[1354] Efikasnost trostruke kombinovane terapije koja sadrži iRNK koja kodira IL-23, iRNK koja kodira IL-36-gama, i iRNK koja kodira OX40L procenjena je u modelu kancera kolona MC38 kao što je prethodno opisano. Eksperimenti u trenutnom primeru sprovedeni su upotrebom MC38-M modela (slabo imunogenog), videti SL.9C.
[1355] SL. 8 pokazuje da je OX40L bio efikasan u modelu tumora A20. Nasuprot tome, nedostajala je ubedljiva efikasnost kada je OX40L upotrebljen u modelu kancera kolona MC38-M (SL. 9A). Uočeni efekat je sličan onom uočenom kada je isti model tretiran anti-PD-1 antitelom (SL. 9B).
[1356] Nasuprot tome, uočena je efikasnost u modelu kancera kolona MC38-M kada iRNK koja kodira IL-23 sadrži miR-122 vezujuće mesto (5 µg iRNK u LNP na bazi Jedinjenja 18) (SL. 10A). Nije uočen potpuni odgovor, ali je uočeno 8 begunaca. Eksperimentalni podaci produženi do dana 70 pokazani su na SL.10D.
[1357] Kada je iRNK koja kodira IL-23 koja sadrži miR-122 vezujuće mesto (2,5 µg iRNK) kombinovana sa iRNK koja kodira IL-36-gama koja sadrži miR-122 vezujuće mesto (2,5 µg iRNK) (SL. 10B), uočena su tri potpuna odgovora (25%), a broj begunaca je redukovan sa osam na šest. Eksperimentalni podaci produženi do dana 70 pokazani su na SL.10E.
[1358] Kada je iRNK koja kodira IL-23 koja sadrži miR-122 vezujuće mesto (1,7 µg iRNK) kombinovana sa iRNK koja kodira IL-36-gama koja sadrži miR-122 vezujuće mesto (1,7 µg iRNK) i sa iRNK koja kodira OX40L koja sadrži miR-122 vezujuće mesto (1,7 µg iRNK) (SL. 10C), uočena su tri potpuna odgovora (25%), a broj begunaca je dodatno redukovan sa šest na četiri. Eksperimentalni podaci produženi do dana 70 pokazani su na SL.10F.
4
[1359] Dodatni eksperiment je procenio pojedinačno doziranje dubleta i jednu ili više doza tripleta u modelu MC38 upotrebom MC38 ćelija luciferaze. iRNK koja kodira IL-23 koja sadrži miR-122 vezujuće mesto je kombinovana sa iRNK koja kodira IL-36-gama koja sadrži miR-122 vezujuće mesto i primenjena u jednoj dozi (8 μg). iRNK koja kodira IL-23 koja sadrži miR-122 vezujuće mesto, iRNK koja kodira IL-36-gama koja sadrži miR-122 vezujuće mesto, i iRNK koja kodira OX40L koja sadrži miR-122 vezujuće mesto, primenjena je u jednoj dozi ili više doza od 12 µg. U odnosu na kontrolu, bioluminescenca je redukovana sa jednom dozom dvostruke kombinacije, i jednom i više doza sa trostrukom kombinacijom, sa značajnijom redukcijom uočenom u trostrukoj kombinaciji (SL. 10G). Međutim, preživljavanje tokom 45 dana je redukovano kod miševa tertiranih sa više doza trostruke kombinacije, što odgovara smrtnim slučajevima povezanim sa tretmanom (SL.10H).
Primer 9
Bioaktivnost IL-23 proizvedenog iz iRNK
[1360] Aktivnost IL-23 proteina proizvedenog iz iRNK introdukovane u ćeliju procenjena je u biotestu i upoređena sa aktivnošću rekombinantnog IL-23 proteina. Polinukleotidi koji odgovaraju iRNK koje kodiraju murinski IL-23 ili humani IL-23 pripremljeni su kao što je opisano u predmetnoj specifikaciji. HeLa ćelije su transfektovane sa iRNK koja kodira murinski IL-23 (iRNK mIL-23), iRNK koja kodira humani IL-23 (iRNK hIL-23), ili su lažno transfektovane, a supernatant je sakupljen iz transfektovanih ćelija. Količina IL-23 proteina u sakupljenim supernatantima izmerena je pomoću ELISA, zatim su dodati različiti nivoi (lažno (0 ng/ml), 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 3,3 ng/ml, 10 ng/ml, ili 100 ng/ml) iRNK-proizvedenih proteina, ili rekombinantnog murinskog IL-23 (rec mIL-23), ili rekombinantnog humanog IL-23 (iRNK hIL-23) kultivisanim primarnim mišjim splenocitima. Splenociti su kultivisani sa supernatantima koji sadrže IL-23, ili rekombinantnim proteinima tokom 3 dana, a zatim je izmerena količina IL-17 proizvedenog od strane splenocita. Proizvodnja IL-17 služi kao indikator bioaktivnosti IL-23.
[1361] SL. 11 pokazuje da IL-23 proizveden iz iRNK ima ekvivalentnu bioaktivnost, tj. indukciju ekspresije IL-17 iz primarnih mišjih splenocita, kao i rekombinantni IL-23 proteini (npr. proteinski oblik iRNK hIL-23 u poređenju sa rec hIL-23). Pored toga, određeno je da je in vivo ekspresija iz humane IL-23 iRNK veća od ekspresije iz mišjeg ortologa (podaci nisu pokazani).
4
Primer 10
Bioaktivnost IL-36-gama proizvedenog iz iRNK
[1362] Aktivnost IL-36-gama proteina proizvedenog iz iRNK introdukovane u ćeliju procenjena je u biotestu i upoređena sa aktivnošću rekombinantnog IL-36-gama proteina. Polinukleotidi koji odgovaraju iRNK koje kodiraju murinski IL-36-gama ili humani IL-36-gama pripremljeni su kao što je opisano u predmetnoj specifikaciji.
[1363] Za eksperimente sa murinskim IL-36-gama, HeLa ćelije su transfektovane sa iRNK koja kodira murinski IL-36-gama protein (mIL-36γ mRNA-_v1) ili su lažno transfektovane, a supernatanti su sakupljeni iz transfektovanih ćelija. Dendritske ćelije poreklom iz kostne srži (BMDC) bile su izložene sakupljenim supernatantima koji sadrže sekretovani zreli murinski IL-36-gama ili rekombinantnom murinskom IL-36-gama (rmIL-36γ) u različitim koncentracijama, i procenjena je proizvodnja IL6 od strane izloženih BMDC. Proizvodnja IL6 služi kao indikator aktivnosti murinskog IL-36-gama. SL. 12A pokazuje da iRNK koja kodira murinski IL-36-gama protein ima ekvivalentnu bioaktivnost kao i rekombinantni humani IL-36-gama protein (rmIL-36γ u poređenju sa mIL-36γ).
[1364] Za eksperimente sa humanim IL-36-gama, bioaktivnost IL-36-gama procenjena je upotrebom ćelija epidermoidnog karcinoma (npr. A431). B16F10 ćelije su transfektovane sa iRNK koja kodira humani IL-36-gama sa različitim signalnim peptidima (hIL-36γ mRNA_v1; hIL-36γ mRNA_v2; ili hIL-36γ mRNA_v3) i supernatanti su sakupljeni iz transfektovanih ćelija. Koncentracije hIL-36γ u supernatantima određene su pomoću ELISA. A431 ćelije su bile izložene supernatantima koji sadrže hIL-36γ ili rekombinantnom humanom IL-36-gama proteinu (rhIL-36γ) na različitim nivoima i izmerena je proizvodnja IL8 u supernatantima tretiranih A431 ćelija. Proizvodnja IL8 služi kao indikator aktivnosti humanog IL-36-gama.
SL. 12B pokazuje da humani IL-36-gama protein poreklom iz iRNK ima ekvivalentnu bioaktivnost kao i rekombinantni humani IL-36-gama protein (hIL-36γ mRNA_v1; hIL-36γ mRNA_v2; ili hIL-36γ mRNA_v3- u poređenju sa hIL-36γ).
Primer 11
In vitro biološka aktivnost OX40L
4
[1365] Aktivacija T-ćelija uključuje dva istovremena događaja ćelijske signalizacije: primarni signal iz kompleksa receptora T-ćelija (npr. CD3 stimulacija) i drugi signal iz kostimulatorne ligand-receptor interakcije (npr. interakcija OX40L/OX40R). Kober et al., European Journal of Immunology 38:2678-2688 (2008). U ovom primeru je procenjena kostimulatorna biološka aktivnost OX40L eksprimiranog na površini ćelija tretiranih sa mOX40L_miR-122 ili hOX40L_miR-122.
A. Priprema OX40L-eksprimirajućih ćelija
[1366] Ćelije mišjeg melanoma (B16F10, ATCC br. CRL-6475; ATCC, Manassas, VA) zasejane su u ploče sa 6 bunarića pri gustini od 300.000 ćelija po bunariću. Ćelije humanog karcinoma grlića materice (HeLa) su zasejane u ploče sa 6 bunarića kao što je prethodno opisano. Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i koji dodatno sadrži miR-122 vezujuće mesto (mišji OX40L, mOX40L_miR-122, SEQ ID NO: 66; humani OX40L, hOX40L_miR-122, SEQ ID NO: 65) formulisan je u L2K kao što je prethodno opisano u Primeru 2. 24 sata posle zasejavanja ćelija, u svaki bunarić su dodate formulacije koje sadrže 3 µg mOX40L_miR-122 ili hOX40L_miR-122 iRNK. Kontrolne ćelije su ili lažno tretirane ili tretirane negativnom kontrolom iRNK (netranslatabilna verzija iste iRNK osim što je bez inicijalnih kodona). Ćelije su inkubirane tokom 24 sata na 37 °C.
B. Priprema naivnih CD4+ T-ćelija
[1367] Slezine Balb/c miševa su uklonjene i obrađene upotrebom standardnih tehnika u struci kako bi se dobile suspenzije pojedinačnih ćelija splenocita. Ukupne CD4<+>T-ćelije su izolovane iz suspenzija splenocita upotrebom kompleta za izolaciju CD4 T ćelija miša (Miltenyi, San Diego, CA). Naivne humane CD4<+>T-ćelije su izolovane iz humanih mononukleusnih ćelija periferne krvi (PBMC) uklanjanjem ne-CD4 ćelija upotrebom komercijalno dostupnog kompleta za izolaciju T ćelija sa magnetnim perlama.
C. Test aktivacije T-ćelija
[1368] 200.000 T-ćelija je dodato u svaki bunarić transfektovanih B16F10 ćelija ili HeLa ćelija u prisustvu agonističkog anti-mišjeg CD3 antitela (R&D Systems, Minneapolis, MN) ili
4
Dynabeads humanog T-aktivatora; i ćelije su zajedno kultivisane tokom 72 sata (mišje) ili 120 sati (humane). Šema testova pokazana je na SL.13A.
[1369] Posle zajedničke kultivacije sa T-ćelijama, proizvodnja mišjeg IL-2 izmerena je upotrebom mišjeg IL-2 ELISA testa (mouse IL-2 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN). Količina IL-2 koju proizvode CD4<+>T-ćelije služi kao indikator aktivacije T-ćelija. Rezultati su pokazani na SL. 13B. Proizvodnja humanog IL-2 izmerena je upotrebom humanog IL-2 ELISA testa (human IL-2 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN). Rezultati su pokazani na SL. 13A, 13B, i 13C.
D. Rezultati
[1370] SL. 13B pokazuje da ekspresija OX40L na površini B16F10 ćelija tretiranih sa mOX40L_miR-122 izaziva T-ćelijski IL-2 odgovor in vitro. mOX40L_miR-122 iRNK indukovala je oko 12 ng/ml IL-2. B16F10 ćelije tretirane sa netranslatiranom negativnom kontrolom iRNK pokazale su osnovne nivoe aktivacije T-ćelija uporedive sa lažno tretiranim ćelijama (tj. oko 6 ng/ml IL-2). Prema tome, mOX40L_miR-122 iRNK indukovala je oko dva puta veću ekspresiju IL-2 u poređenju sa kontrolom (lažno tretirana ili netranslatirana iRNK).
[1371] SL. 13C i 13D pokazuju da je, u prisustvu Dynabeads humanog T-aktivatora kao primarnih aktivatora T-ćelija, zajednička kultivacija sa OX40L iRNK transfektovanim HeLa ćelijama u velikoj meri povećala proizvodnju IL-2. Bez ekspresije OX40L, detektovana je mala ili nikakva proizvodnja IL-2. SL. 13E pokazuje sličan nivo povećane proizvodnje humanog IL-2 kada je isti eksperiment izveden sa prethodno stimulisanim (tj. nenaivnim) CD4<+>T-ćelijama.
[1372] Ovi rezultati pokazuju da je OX40L polipeptid biološki aktivan kao kostimulatorni molekul.
Primer 12
Modulacija populacija imunskih ćelija unutar tumora tretiranih sa OX40L iRNK
[1373] S obzirom na demonstriranu aktivnost OX40L na urođenim imunskim ćelijama prirodnim ubicama (NK) i adaptivnim CD4+/CD8+ T ćelijama, cilj sledećih studija bio je da se procene farmakodinamički efekti intratumorskog tretmana OX40L na populacije imunskih
4
ćelija povezanih sa tumorom. Modeli tumora miša A20 i MC38 uspostavljeni su kao što je prethodno opisano.
A. Diferencijacija ćelija pomoću protočne citometrije
[1374] A20 tumori su tretirani sa jednom dozom od 12,5 µg mOX40L_miR-122 ili kontrolne iRNK (RNK/LNP) formulisane u lipidnim nanočesticama. Uzorci tumora su prvobitno analizirani 24 sata nakon tretmana. NK ćelije su diferencirane upotrebom antitela prema površinskom markeru zrelih NK ćelija, DX5. Rezultati su pokazani na SL. 14A. Drugi uzorci tumora su analizirani 14 dana posle tretmana sa mOX40L_miR-122. CD4<+>i CD8<+>T-ćelije su identifikovane upotrebom anti-mišjih CD4 i anti-mišjih CD8 antitela, respektivno. Rezultati su pokazani na SL.14B-14C.
[1375] Sličan eksperiment je izveden u modelu tumora MC38. Miševima sa MC38 tumorima primenjena je jedna intratumorska injekcija mOX40L_miR-122 ili NST-OX40L. Kod nekih životinja druga doza iRNK primenjena je 6 dana posle prve doze. Infiltrat imunskih ćelija je procenjen na CD8<+>ćelije 24 sata i 72 sata posle svake doze iRNK. Rezultati su pokazani na SL. 14D.
B. Rezultati
[1376] SL. 14A pokazuje da se 24 sata posle primene mOX40L_miR-122 A20 tumorima, infiltracija NK ćelija značajno povećala kod životinja koje su dozirane sa OX40L u poređenju sa kontrolama. SL. 14B-14C pokazuju da se 14 dana posle primene mOX40L_miR-122 A20 tumorima, infiltracija i CD4<+>(SL. 14B) i CD8<+>(SL. 14C) T-ćelija u mikrookruženje tumora značajno povećala u poređenju sa kontrolnim uzorcima tumora.
[1377] SL.14D pokazuje značajno povećanje infiltrirajućih CD8<+>T-ćelija 72 sata posle druge doze mOX40L-miR-122 u MC38 tumorima u poređenju sa tumorima koji su tretirani kontrolom.
[1378] Ovi podaci iz dva modela tumora demonstriraju da primena polinuleotida koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid promoviše povećan broj i urođenih i adaptivnih imunskih ćelija unutar tumorskog mikrookruženja.
4 1
Primer 13
In vivo aktivnost polinukleotida koji kodira OX40L nakon intratumorske primene
A. Priprema OX40L modifikovane iRNK
[1379] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR-122; SEQ ID NO: 66). Takođe je pripremljena iRNK negativne kontrole (netranslatabilna verzija iste iRNK koja sadrži više stop kodona: NST_OX40L_122).
B. Model tumora akutne mijeloidne leukemije (AML)
[1380] Tumori akutne mijeloidne leukemije (AML) uspostavljeni su subkutano kod DBA/2 miševa. AML ćelije miša P388D1, ATCC br. CCL-46; ATCC, Manassas, VA) kultivisane su u skladu sa uputstvima prodavca. Ćelije su inokulisane subkutano kod miševa kako bi se generisali subkutani tumori. Tumori su praćeni u pogledu veličine i palpabilnosti.
[1381] Kada su tumori uspostavljeni, životinje su podeljene u dve grupe, tj. mOX40L_miR-122 grupu i kontrolnu grupu. Intratumorsko doziranje za svaku grupu bilo je svakih 7 dana (Q7D), počevši 7 dana posle implantacije tumora. Grupa I je tretirana sa intratumorskim dozama mOX40L_miR-122 u dozi od 12,5 μg (fiksna doza) iRNK po kg telesne težine. Grupa II je tretirana sa intratumorskim dozama kontrolne NST_OX40L_122 iRNK po istom režimu doziranja.
C. Rezultati
[1382] Rezultati su pokazani na SL. 15A i 15B. SL. 15A pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama kontrolne NST_OX40L_122 iRNK. SL.
15B pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama mOX40L_miR-122 iRNK. Ovi rezultati pokazuju da intratumorska primena polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid koji sadrži miRNA vezujuće mesto redukuje ili inhibira rast tumora u poređenju sa tretmanom sa kontrolnom iRNK ili PBS.
Primer 14
In vivo efikasnost kombinacije iRNK koja kodira OX40L polipeptid, i anti-PD-1 antitela
4 2
A. Priprema OX40L modifikovane iRNK i anti-PD-1
[1383] Polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid (murinski OX40L) i koji dodatno sadrži miRNA vezujuće mesto (miR-122) pripremljen je kao što je prethodno opisano (mOX40L_miR-122; SEQ ID NO: 66). Takođe je pripremljena iRNK negativne kontrole (NST_OX40L_122).
[1384] Anti-PD-1 (BioXcell BE0146, anti-mPD-1, klon RMP1-14, partija br.5792-599016J1) rastvori za doziranje pripremljeni su razblaživanjem alikvota štoka (6,37 mg/ml) do 0,5 mg/ml u sterilnom PBS. Rastvor za doziranje od 0,5 mg/ml obezbedio je dozu od 5 mg/kg u doznoj zapremini od 10 ml/kg. Anti-PD-1 rastvor za doziranje pripreman je svež svakodnevno i skladišten zaštićen od svetlosti na 4 °C.
[1385] Pacovski IgG2a (BioXcell BE0089, pacovski IgG2a, klon 2A3, partija br.601416M1) rastvori za doziranje pripremljeni su razblaživanjem alikvota štoka (7,38 mg/ml) do 0,5 mg/ml u sterilnom PBS. Rastvor za doziranje od 0,5 mg/ml obezbedio je dozu od 5 mg/kg u doznoj zapremini od 10 ml/kg. Anti-PD-1 rastvor za doziranje pripreman je svež svakodnevno i skladišten zaštićen od svetlosti na 4 °C.
B. MC38 model adenokarcinoma kolona
[1386] MC-38 tumori adenokarcinoma kolona uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa kao što je prethodno opisano.
[1387] Kada su tumori uspostavljeni, životinje su podeljene u grupe i primale su intratumorske doze jedne od sledećih kombinovanih terapija pokazanih u tabeli u nastavku:
Tabela 10: Kombinacija doziranja i interval
4
[1388] Miševi su primali intratumorske doze iRNK svakih 7 dana (Q7D). Miševi su primali intratumorske doze antitela svake dve nedelje (BIWx2).
C. Rezultati
[1389] Rezultati su pokazani na SL. 16A-16E i SL. 17. SL. 16A pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama kontrolne NST_OX40L_122 iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama kontrolnog antitela. U kontrolnoj grupi bilo je 0/15 potpunih odgovora (CR). SL.16B pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama mOX40L_miR-122 iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama kontrolnog antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 0/15 za ovu grupu. SL. 16C pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskom kontrolnom iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama anti-PD-1 antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 2/15 za ovu grupu. SL. 16D pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama mOX40L_miR-122 iRNK u kombinaciji sa intratumorskim dozama anti-PD-1 antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 6/15 za grupu sa dvostrukom kombinacijom. SL. 16E pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama PBS u kombinaciji sa intratumorskim dozama anti-PD-1 antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR je bio 0/15 za ovu grupu. SL. 16F pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja tretiranih sa intratumorskim dozama PBS u kombinaciji sa intratumorskim dozama kontrolnog antitela. Do dana 90 nakon implantacije, CR za ovu grupu tretmana bio je 0/14.
[1390] Ovi rezultati pokazuju da je kombinovana terapija koja sadrži polinukleotid koji sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid i imunoterapijski agens, kao što je anti-PD-1 antitelo, efikasna in vivo za inhibiranje ili redukovanje rasta tumora u mišjem modelu tumora MC38.
4 4
Kombinacija mOX40L_miR-122 sa anti-PD-1 pokazala je sinergističku in vivo antitumorsku efikasnost. Ovi rezultati takođe pokazuju da se niže doze iRNK mogu upotrebljavati u kombinovanoj terapiji.
[1391] SL. 17 pokazuje krive preživljavanja za životinje u istim grupama tretmana. Ovi rezultati pokazuju da kombinovanje intratumorskog doziranja modifikovane OX40L iRNK sa intratumorskim doziranjem anti-PD-1 antitela efikasno povećava preživljavanje u mišjem modelu tumora u poređenju sa kontrolnim grupama tretmana.
Primer 15
In vivo memorijski imunski odgovor nakon tretmana sa kombinovanom terapijom
[1392] Miševi su tretirani sa mOX40L_miR-122 u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom kao što je prethodno opisano u Primeru 14. Na dan 90 nakon inokulacije tumora, četiri životinje sa potpunim odgovorom (CR) iz grupe kombinovane terapije mOX40L_miR-122 anti-PD-1 ponovo je izazvano sa 5 x 10<5>MC38 tumorskih ćelija. Kao kontrola, 10 naivnih životinja je takođe inokulisano sa 5 x 10<5>MC38 ćelija. Rezultati analize su pokazani na SL. 18A i 18B.
[1393] SL. 18A pokazuje pojedinačni rast tumora kod naivnih životinja izazvanih sa MC38 ćelijama. Naivni miševi su počeli da razvijaju tumore koji se mogu detektovati približno 5 dana posle implantacije, i tumori su nastavili da rastu tokom studije. SL. 18B pokazuje pojedinačni rast tumora kod životinja sa potpunim odgovorom kojima je prethodno data intratumorska doza kombinovane terapije mOX40L_miR-122 i anti-PD-1 antitela. Životinje sa potpunim odgovorom nisu pokazale rast tumora (0/4 životinje) tokom 23 dana posle ponovnog izazivanja tumorskim ćelijama. Nasuprot tome, naivne životinje su pokazale visok procenat rasta tumora. Ovi rezultati pokazuju da intratumorsko doziranje iRNK koja kodira OX40L polipeptid u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom indukuje memorijski imunski odgovor sa antitumorskim efektima.
Primer 16
Izražena efikasnost i kod primarno tretiranih i netretiranih distalnih tumora sa triplet iRNK terapijom
4
[1394] Eksperimenti su sprovedeni upotrebom MC38-S mišjeg modela tumora. Tumor je implantiran u svaki bok svake životinje. Videti SL. 19A. Primarni tumor na jednom boku tretiran je sa kontrolnom iRNK (netranslatabilna iRNK koja kodira za OX40L), kombinacijom iRNK koje kodiraju IL-23 i IL36-gama, ili trostrukom kombinacijom iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama, i OX40L. Zatim je izmeren efekat tretmana prvog tumora na drugi (netretirani) tumor. SL. 19A. Ukupna doza iRNK po tretmanu bila je 5 µg iRNK. iRNK su primenjene kao pojedinačne intratumorske doze.
[1395] SL.19B i 19C pokazuju velike zapremine tumora i u tretiranim tumorima i u distalnim tumorima kod miševa tretiranih sa kontrolnom iRNK. Kada je dublet iRNK terapija primenjena na proksimalni tumor (SL. 19D), uočeno je 9 potpunih odgovora (50%) u ovom distalnom tumoru (SL. 19E). Kada je triplet iRNK terapija primenjena na proksimalni tumor (SL. 19F), uočeno je 15 potpunih odgovora (83,3%) u distalnom tumoru (SL. 19G).
[1396] Ovi podaci ukazuju da tretman tumora sa iRNK terapijskom kompozicijom može efikasno lečiti tumor na drugim lokacijama.
Primer 17
Triplet iRNK plus anti-PD-L1 Ab pokazuje poboljšanu efikasnost u modelu tumora B16F10-AP3 koji se teško leči
[1397] Kako bi se procenila poboljšana efikasnost triplet terapije (trostruka kombinacija iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama, i OX40L) u modelu koji se teško leči i koji ne reaguje na inhibitore kontrolne tačake, upotrebljen je B16F10-AP3 ćelijski model murinskog melanoma. Kao i u prethodnom primeru, ukupno doziranje iRNK je bilo 5 ug ukupne iRNK, primenjeno intratumorski kao pojedinačna doza. Anti-PD-L1 antitelo je dozirano intraperitonealno dva puta nedeljno u dozi od 10 mg/kg.
[1398] SL.20A pokazuje zapreminu tumora kod miševa tretiranih sa kontrolnom iRNK. Nisu uočeni odgovori kada je anti-PD-L1 antitelo primenjeno samo (SL. 20B). Kada je primenjena triplet iRNK terapija (iRNK koje kodiraju IL23, IL36 gama, i OX40L), takođe nisu uočeni potpuni odgovori (SL. 20C). S druge strane, kada je triplet iRNK terapija primenjena u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom, uočeno je 5 potpunih odgovora od 15 (33%). Pored potpunih odgovora kod jednog miša tumor je redukovao veličinu na manje od 60 mm<3>(SL.
20D).
4
[1399] Ovi podaci ukazuju da se tumori otporni na tretman sa konvencionalnom terapijom, npr. anti-PD-L1 antitelom, mogu efikasno tretirati kombinovanjem takve terapije sa nekoliko iRNK koje su ovde objavljene (npr. trostruka terapija koja sadrži iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama, i OX40L).
Primer 18
Memorijski imunski odgovor posle tretmana sa IL-23:IL-36-gama dublet terapijom i IL23:IL-36-gama:OX40L triplet terapijom
[1400] Procenjen je memorijski imunski odgovor kod životinja tretiranih sa dublet kombinovanom terapijom. Miševi inokulisani sa MC38-S tumorskim ćelijama tretirani su sa dublet kombinovanom terapijom koja se sastoji od polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-23 polipeptid i drugog polinukleotida koji sadrži iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid. Pet mikrograma ukupne iRNK je injektirano intratumorski nedeljno tokom 4 nedelje (Q7D).
[1401] Deset od deset miševa je sa potpunim odgovorom. Kada su naivne životinje bile izazvane istim kancerom, svi miševi (petnaest od petnaest) su bili begunci (SL. 21A). Nasuprot tome, kada su miševi sa potpunim odgovorom ponovo izazvani istim kancerom, nije uočen rast tumora ni kod jednog od miševa koji su ponovo izazvani (SL. 21B).
[1402] Generisanje antikancerske memorije nakon lokalne terapije (tj. tumor nije rastao kod ponovo izazvanih miševa sa potpunim odgovorom na inicijalni tretman) uočeno je kod miševa tetiranih sa dublet iRNK terapijom (IL-23:IL-36-gama), kao što je prethodno diskutovano, kao i kod miševa tretiranih sa triplet iRNK terapijom (IL23:IL-36-gama:OX40L) (tumori nisu rasli kod 5 od 5 ponovo izazvanih miševa sa potpunim odgovorom na inicijalni tretman; nije pokazano).
Primer 19
Efekat dublet i triplet terapije na nivoe imunskih ćelija
[1403] Kako bi se procenila efikasnost dublet terapije (dvostruka kombinacija iRNK koje kodiraju IL-23 i IL-36-gama, respektivno) i triplet terapije (trostruka kombinacija iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama, i OX40L, respektivno), procenjeni su nivoi imunskih ćelija.
4
[1404] Tretman miševa inokulisanih sa MC38-R tumorskim ćelijama sa dublet terapijom uzrokovao je izraženo povećanje nivoa Ly6G+ granulocita u MC38-R tumoru, mereno kao granulociti kao procenat CD45+ ćelija (SL.22A) ili kao granulociti po mg tumora (SL.22B). Dramatično povećanje granulocita je takođe uočeno posle tretmana sa triplet terapijom (SL.
23).
[1405] Tretman sa dublet i triplet terapijom povećao je nivoe unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija (videti SL. 24A i 24B).
[1406] Tretman sa dublet terapijom povećao je nivoe unakrsno-prezentujućih CD103+ dendritskih ćelija u MC28-R tumorima, mereno kao CD103+ dendritske ćelije kao procenat CD45+ ćelija (SL. 24A) ili kao CD103+ dendritske ćelije po mg tumora (SL. 24B). Tretman miševa inokulisanih sa MC38-R tumorskim ćelijama sa triplet terapijom pokazao je sličan porast unakrsno-prezentujućih dendritskih ćelija i u tumoru i u drenirajućem limfnom čvoru (videti SL. 25A i SL.25B). Ova povećanja dendritskih ćelija uočena su u analizama u kojima su kvantifikovane CD103+ dendritske ćelije po mg tumora (SL. 25A), kao i u analizama u kojima su kvantifikovane CD8+ dendritske ćelije u tumor drenirajućem limfnom čvoru (SL.
25B).
[1407] Tretman sa triplet terapijom je povećao nivoe CD11b+ dendritskih ćelija u tumorima, mereno kao CD11b+ dendritske ćelije po mg tumora (SL. 26A). Povećanje CD11b+ dendritskih ćelija je takođe uočeno u drenirajućem limfnom čvoru (SL. 26B). Primena triplet terapije uzrokovala je izmenu aktivacije CD86 u CD11b+ dendritskim ćelijama u drenirajućem limfnom čvoru (videti SL. 26C i SL.26D).
[1408] SL. 27A i SL. 27B pokazuju aktivaciju CD86 na CD8 cDC1 u drenirajućem limfnom čvoru 24 h i 72 h nakon intratumorske primene triplet iRNK terapije na MC38 tumore mereno kao procenat CD8 cDC1 ćelija (SL. 27A) ili kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) (SL.27B).
[1409] Pored toga, posle primene dublet i triplet terapija, uočeno je rano povećanje CD86 i MHCI. CD86 i MHCI su bili viši na CD8+ dendritskim ćelijama nakon dublet tretmana na 7 sati, ali je MHCI bio viši nakon triplet tretmana na 7 dana. U CD103+ dendritskim ćelijama uočeno je rano povećanje CD86 i MHCI nakon primene. U CD8+ DC ćelijama u drenirajućem limfnom čvoru takođe je došlo do povećanja CD86 i MHCI nakon primene. CD 86 i MHCI su bili viši u odnosu na CD8+ drenirajući limfni čvor nakon dubleta na 72 sata, ali je MHCI bio viši nakon tripleta na 7 dana (podaci nisu pokazani).
[1410] Primena triplet terapije takođe je uzrokovala povećanje inflamatornih dendritskih ćelija (iDC) i u tumoru (SL. 28A) i u drenirajućem limfnom čvoru (SL. 28B). Posle primene
4
triplet terapije, povećanje CD86 je takođe uočeno na inflamatornim dendritskim ćelijama (SL.
28C i SL. 28D).
[1411] Tretman sa dublet terapijom ili triplet terapijom je takođe povećao odnos CD8:Treg kod MC38-R tumora, demonstrirajući poboljšan odnos efektorskih prema supresorskim T ćelijama (SL.29). Ovaj efekat je bio izraženiji 7 dana posle primene dublet ili triplet terapije.
[1412] Nakon aktivacije, podgrupe naivnih T ćelija podležu proliferaciji i diferencijaciji u efektorske ćelije, nakon čega sledi generisanje pula memorijskih T ćelija. Na osnovu obrasca migracije i funkcija, one su klasifikovane u centralne memorijske (pretežno usmerene ka limfnim čvorovima) i efektorske memorijske (pretežno usmerene ka ekstralimfoidnim mestima) podskupove. Tretman sa dublet terapijom ili triplet terapijom povećao je CD4+ (SL.
30A) i CD8+ (SL. 30B) centralne i efektorske memorijske T ćelije unutar tumora. OX40L:IL-23:IL-36-gama triplet terapija uzrokovala je veće povećanje efektorskih memorijskih ćelija u tumorima nego IL-23:IL-36-gama dublet.
[1413] SL. 31 pokazuje efekat uklanjanja citotoksičnih T ćelija na preživljavanje miševa inokulisanih sa MC38-R tumorskim ćelijama. Miševi su tretirani sa dozama od 5 mikrograma iRNK tripleta primenjenim intratumorski. Strelica na crtežu označava datum primene iRNK triplet terapije. Uklanjanje antitelom (krugovi) počelo je 2 dana pre primene iRNK. Najduže preživljavanje je uočeno kod miševa tretiranih samo tripletom, tripletom plus kontrolnim antitelom, ili tripletom plus anti-CD4 antitelom. Zajednička primena tripleta plus anti-CD8 antitela rezultovala je dramatičnim smanjenjem stope preživljavanja, demonstrirajući da su citotoksične T ćelije bile suštinske za benefit preživljavanja od OX40L:IL-23:IL-36-gama triplet terapije.
Primer 20
Efikasnost kombinovanog tretmana koji sadrži triplet iRNK terapiju i anti-PDL1 antitela u MC38 modelu
[1414] Primena dublet i triplet terapije povećala je nivoe PD-L1. Blago povećanje nivoa PD-L1 uočeno je u ćelijama kancera, npr. CD45-, FsChi i MHCII-, posle primene triplet terapije (SL. 32A i 32B).
[1415] Primena dubleta IL-23:IL-36-gama takođe je rezultovala povećanim procentom CD11b+ ćelija pozitivnih na PD-L1 (SL. 33A). Ovo zapažanje je u korelaciji sa povećanjem ekspresije PD-L1 u CD11b+ ćelijama (SL. 33B). Primena triplet kombinacije je takođe
4
rezultovala povećanim procentom CD11b+ ćelija pozitivnih na PDL1 (SL. 34A) i povećanjem ekspresije PDL1 u CD11b+ ćelijama (SL.34B).
[1416] Povećanje ekspresije PD-L1 u MC38 modelu kao odgovor na tretman sa triplet iRNK terapijom obezbedilo je rezonovanje za kombinovanje triplet terapije sa anti-PD-L1 antitelima. Ukupna doza iRNK bila je 5 ug ukupne iRNK, primenjene intratumorski kao pojedinačna doza. Antitelo (anti-PD-L1 antitelo 10F.9G2 ili kontrola) je dozirano intraperitonealno dva puta nedeljno u dozi od 10 mg/kg. Nisu uočeni odgovori kada su antitelo negativne kontrole (SL. 35A) ili anti-PD-L1 antitelo (SL. 35B) primenjena sama. Kada je primenjena triplet iRNK terapija (iRNK koje kodiraju IL23, IL36 gama, i OX40L), nisu uočeni potpuni odgovori (SL. 35C), ali 4 od 15 miševa je pokazalo tumore smanjene veličine. S druge strane, kada je triplet iRNK terapija primenjena u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom, 12 od 15 miševa je doživelo smanjenu veličinu tumora ili potpune odgovore (SL.
35D). Ovi podaci ukazuju da se tumori otporni na tretman sa konvencionalnom terapijom, npr. anti-PD-L1 antitelom, mogu efikasno lečiti kombinovanjem takve terapije sa nekoliko iRNK koje su ovde objavljene (npr. trostruka terapija koja sadrži iRNK koje kodiraju IL-23, IL-36-gama, i OX40L).
Primer 21
Efikasnost dublet i triplet terapija u HCC singenom modelu
[1417] Eksperimenti koji su prethodno pokazani ukazuju da su iRNK kombinovane terapije, npr. kombinovane terapije IL-23/IL-36-gama (dublet) i IL-23/IL-36-gama/OX40L (triplet), efikasne u modelima MC38 adenokarcinoma kolona, A20 mišjeg B-ćelijskog limfoma, ili B16F10-AP3 melanoma. Svaka od ćelijskih linija koje su upotrebljene u predmetnoj objavi, npr. H22, MC38, i B16F10 ćelijske linije, mogu se upotrebljavati za modelovanje različitih tumorskih mikrookruženja. MC38 ćelije modeluju imunosupresivno okruženje, dok B16F10 ćelije modeluju imunski oskudno okruženje. U predmetnom eksperimentu efikasnost kombinovanih dublet i triplet terapija procenjena je u singenoj H22 ćelijskoj liniji, ćelijskoj liniji hepatoma koja modeluje inflamirano tumorsko mikrookruženje.
[1418] Miševima je primenjeno 2,5 ug svake iRNK u triplet kombinovanoj terapiji (IL-23/IL-36-gama/OX40L), tj. ukupno 7,5 ug formulisanih u lipidnim nanočesticama sa Jedinjenjem 18, ili 7,5 ug kontrolne iRNK (NST-FIX). iRNK su dozirane intratumorski Q7Dx3 (N=10 miševa/grupi). Posle 30 dana, svi kontrolni miševi su imali tumore zapremine iznad 1.500
4
mm<3>(SL. 36A). Nasuprot tome, nijedan od miševa tretiranih sa trostrukom terapijom nije imao tumore zapremine iznad 1.500 mm<3>(SL. 36B), što ukazuje da je triplet kombinovana terapija takođe bila efikasna u HCC singenom modelu.
Primer 22
Efikasnost humanog IL-36 naspram mišjeg IL-36 kao deo OASIS u MC38-M(R)
[1419] Kako bi se odredila efikasnost humanog IL-36 gama naspram mišjeg IL-36 u triplet iRNK terapiji, dizajnirana je studija u kojoj je testirano više kombinacija iRNK koje kodiraju OX40L, IL-23, i bilo mišji IL-36-gama ili humani IL-36-gama. Dizajn studije je pokazan u Tabeli 11.
[1420] MC-38-M tumori adenokarcinoma kolona uspostavljeni su subkutano kod C57BL/6 miševa kao što je prethodno opisano.
[1421] Kada su tumori uspostavljeni, životinje su podeljene u grupe i primale su intratumorske doze jedne od sledećih kombinovanih terapija pokazanih u tabeli u nastavku. Svaka grupa je uključivala 15 životinja. Svaka životinja je dozirana qdx4 sa ukupnom dozom iRNK od 5 ug/mišu u ukupnoj doznoj zapremini od 25 ul.
TABELA 11
4 1
42
[1422] Redukcija veličine tumora uočena je kada je upotrebljen bilo humani IL-36-gama ili mišji IL-36-gama; međutim, efikasnost triplet terapije sa upotrebljenim mišjim IL-36 gama bila je superiorna (SL. 37). Podaci pokazuju da OX40L monoterapija nije rezultovala redukcijom veličine tumora. IL-23 monoterapija rezultovala je redukcijom veličine tumora. Međutim, odgovor tumora na IL-23 bio je sporiji od odgovora na sinergističku kombinaciju IL-23 i OX40L. Redukcije veličine tumora uočene su pri svim testiranim odnosima mIL-36-gama prema OX40 i IL-23 (SL. 38A). Sličan efekat je uočen u vezi sa triplet iRNK kombinacijom koja sadrži hIL-36-gama, iako je efekat ovih kompozicija na srednju vrednost zapremine tumora bio manje izražen (SL. 38B). Podaci koji odgovaraju svakoj grupi u studiji i svakoj pojedinačnoj životinji predstavljeni su na SL. 39A-39O. Sve životinje u Grupi 8 (OX40L monoterapija) bile su begunci (SL. 39H). Četiri životinje u grupi (IL-23 monoterapija) su sa potpunim odgovorom (SL. 39I). Kombinacija OX40L i IL-23 monoterapije rezultovala je sa 9 potpunih odgovora (SL. 39E). Stoga, kombinacija OX40L i IL-23 monoterapije nije bila aditivna već sinergistička. Najefikasnija kombinovana terapija je bila trostruka terapija koja je sadržala iRNK koja kodira OX40L, iRNK koja kodira IL-23, i mišju iRNK koja kodira IL-36 gama u odnosu 1:1:0,125 (SL. 39D). Takva triplet terapija je rezultovala sa 10 potpunih odgovora plus dve životinje sa zapreminom tumora ispod 100 mm<3>. Od 15 životinja u grupi, jedna 2 su bile begunci. SL.40 i SL. 41A-41O pokazuju efekat različitih testiranih terapija na telesnu težinu.
[1423] SL. 42 pokazuje efekat različitih testiranih terapija na stopu preživljavanja. Nijedna životinja koja je tretirana sa OX40L monoterapijom nije preživela dan 30 u studiji. Posle dana 50, stopa preživljavanja životinja tretiranih sa IL-23 monoterapijom bila je nešto ispod 40%. Međutim, stopa preživljavanja za životinje koje su tretirane i sa OX40L i sa IL-23 bila je blizu 70% posle dana 50, što ponovo ukazuje na sinergističko dejstvo kombinacije OX40L i IL-23. Najveća stopa preživljavanja odgovarala je životinjama tretiranim sa triplet terapijom mOX40L:mIL-23:mIL-36-gama u odnosu 1:1:1 (procenat preživljavanja iznad 90%) ili
4
1:1:0,5 (stopa preživljavanja 80%). Stope preživljavanja uočene kada je upotrebljen mišji IL-36-gama bile su značajno veće od stopa preživljavanja koje su uočene kada je upotrebljen humani IL-36-gama.
Primer 23
Dublet iRNK terapija jednako efikasna kao i triplet iRNK terapija u modelu inflamiranog tumorskog mikrookruženja
[1424] Eksperimenti su sprovedeni upotrebom MC38-S mišjeg modela tumora kao modela za inflamirano tumorsko mikrookruženje. Tumori su implantirani i životinje su tretirane bilo sa dublet iRNK terapijom, koja kodira IL-23 i OX40L (tj. jedan prajmer imunskog odgovora i jedan kostimulatorni signal imunskog odgovora) ili sa triplet iRNK terapijom, koja kodira IL-23, IL-36-gama i OX40L (tj. dva prajmera imunskog odgovora i jedan kostimulatorni signal imunskog odgovora). Ukupna doza iRNK po tretmanu bila je 5 µg iRNK. Ukupna količina iRNK u svakoj dozi je održavana konstantnom dodavanjem odgovarajuće količine NST kontrolne iRNK. iRNK su primenjivane kao pojedinačne intratumorske doze. Zapremina tumora je merena tokom vremena nakon implantacije. Rezultati su pokazani na SL. 43A (triplet iRNK terapija) i SL. 43B (dublet iRNK terapija). Rezultati demonstriraju da su i dublet i triplet iRNK terapije bile efikasne u inhibiranju rasta tumora kod životinja.
[1425] Ovi podaci ukazuju da se efikasan tretman tumora koji ima inflamirano tumorsko mikrookruženje može postići upotrebom jedne ili više iRNK koje kodiraju jedan prajmer imunskog odgovora i jedan kostimulatorni signal imunskog odgovora (tj. dublet iRNK terapija).
4 4

Claims (5)

  1. Patentni zahtevi 1. iRNK koja kodira IL-23 polipeptid za upotrebu u postupku lečenja kancera, naznačeno time što je lečenje u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid.
  2. 2. iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid za upotrebu u postupku lečenja kancera, naznačeno time što je lečenje u kombinaciji sa iRNK koja kodira IL-23 polipeptid.
  3. 3. Kombinacija iRNK, naznačena time što prva iRNK kodira IL-23 polipeptid i druga iRNK kodira IL-36-gama polipeptid.
  4. 4. Kombinacija iRNK prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što dodatno sadrži iRNK koja kodira OX40L polipeptid.
  5. 5. Kombinacija iRNK kao što je definisano u patentnom zahtevu 3 ili 4, za upotrebu u postupku lečenja kancera. 6. iRNK za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačano time što lečenje dodatno sadrži primenu iRNK koja kodira OX40L polipeptid. 7. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što lečenje i/ili kombinacija dodatno predstavlja polipeptid inhibitor kontrolne tačke ili iRNK koja kodira polipeptid inhibitor kontrolne tačke, pri čemu je opciono polipeptid inhibitor kontrolne tačke anti-PD-1 antitelo, anti-PDL-1 antitelo, anti-CTLA4, ili antigen-vezujući fragment takvog antitela koji specifično vezuje PD-1, PD-L1, ili CTLA4, ili njihova kombinacija, dodatno opciono pri čemu je polipeptid inhibitor kontrolne tačke odabran od anti-PD1 antitela nivolumaba ili pembrolizumaba, od anti-PD1-L1 antitela atezolizumaba, avelumaba, durvalumaba, ili od anti-CTLA-4 antitela tremelimumaba ili ipilimumaba, ili njihove kombinacije. 4 8. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što je najmanje jedna iRNK formulisana tako da bude inkapsulirana u lipidnoj nanočestici. 9. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time što lipidna nanočestica sadrži amino lipid koji se može jonizovati, pri čemu opciono lipidna nanočestica sadrži molski odnos od 20-60% amino lipida koji se može jonizovati; 5-25% fosfolipida; 25-55% sterola; i 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida; i/ili opciono amino lipid koji se može jonizovati je Jedinjenje 18:
    10. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što su najmanje dve iRNK formulisane u odvojenim kompozicijama. 11. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što su sve iRNK formulisane tako da budu inkapsulirane u istoj lipidnoj nanočestici. 12. iRNK za upotrebu ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1, 2, ili 5-10, naznačeno time što postupak obuhvata odvojenu primenu jedne ili više iRNK istovremeno ili uzastopno. 13. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što (a) iRNK koja kodira IL-23 polipeptid (i) kodira i IL-12p40 polipeptid i IL-23p19 polipeptid; i/ili 4 (ii) kodira IL-12p40 polipeptid, IL-23p19 polipeptid i linker koji je operativno pozicioniran između IL-12p40 polipeptida i IL-23p19 polipeptida, pri čemu opciono linker je Gly/Ser linker, pri čemu opciono Gly/Ser linker sadrži (GnS)m, pri čemu je n 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20 i m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20, pri čemu dodatno opciono n je 6 i m je 1, ili dodatno opciono linker ima amino-kiselinsku sekvencu kao što je pokazano u bilo kojoj od SEQ ID NO: 136-139; ili (iii) sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, ili 140, ili (iv) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 141, ili je najmanje 70% ili 80% identična nukleotidnoj sekvenci koja je pokazana u SEQ ID NO: 141, ili (v) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 142, ili je najmanje 70% ili 80% identična nukleotidnoj sekvenci koja je pokazana u SEQ ID NO: 142; i/ili (b) iRNK koja kodira IL-36-gama polipeptid (i) sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 10, 12 ili 16, ili (ii) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 143, ili je najmanje 70% ili 80% identična nukleotidnoj sekvenci koja je pokazana u SEQ ID NO: 143, ili (iii) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 144, ili je najmanje 70% ili 80% identična nukleotidnoj sekvenci koja je pokazana u SEQ ID NO: 144. 14. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 4-13, naznačeno time što iRNK koja kodira OX40L polipeptid (i) sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira amino-kiselinsku sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 2 i 21, ili 4 (ii) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 145, ili je najmanje 70% ili 80% identična nukleotidnoj sekvenci koja je pokazana u SEQ ID NO: 145, ili (iii) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je pokazana u ili je najmanje 70% ili 80% identična sa SEQ ID NO: 146, ili je najmanje 70% ili 80% identična nukleotidnoj sekvenci koja je pokazana u SEQ ID NO: 146. 15. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što bilo koja od navedenih iRNK dodatno sadrži jedno ili više microRNA (miR) vezujućih mesta, pri čemu opciono (a) jedno ili više od navedenih miR vezujućih mesta je locirano u 3' UTR; i/ili (b) jedno ili više od navedenih miR vezujućih mesta je miR-122 vezujuće mesto, dodatno opciono miR-122-3p vezujuće mesto, miR-122-5p vezujuće mesto ili oba; i/ili (c) iRNK sadrži 3' UTR koji sadrži najmanje jedno miR-122-5p vezujuće mesto. 16. iRNK za upotrebu, kombinacija, ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što jedna ili više iRNK sadrži najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid, opciono pri čemu je najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid odabran iz grupe koja se sastoji od pseudouridina, N1-metilpseuduridina, 5-metilcitozina, 5-metoksiuridina, i njihove kombinacije, dodatno opciono pri čemu je najmanje jedan hemijski modifikovan nukleozid N1-metilpseudouridin, dodatno opciono pri čemu je iRNK potpuno modifikovana N1-metilpseudouridin iRNK. 17. iRNK za upotrebu ili kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1, 2, ili 5-15, naznačeno time što (a) postupak je postupak redukovanja ili smanjenja veličine tumora ili inhibiranja rasta tumora; i/ili (b) postupak je postupak indukovanja proliferacije T ćelija, indukovanja infiltracije T ćelija u tumor, indukovanja odgovora memorijskih T ćelija, povećanja broja NK ćelija; i/ili (c) postupak je postupak (i) prajmovanja dendritskih ćelija; (ii) promovisanja maturacije dendritskih ćelija; (iii) promovisanja proizvodnje citokina i/ili hemokina u antigen prezentujućim ćelijama; (iv) umnožavanja ili održavanja Th17 ćelija; (v) poboljšanja diferencijacije Th1 i/ili Th9; i (vi) bilo koja kombinacija (c)(i)-(v); (d) postupak je postupak aktiviranja, stimulisanja, promovisanja ili poboljšanja proliferacije T ćelija, preživljavanja T ćelija, regrutovanja T ćelija, ili njihova kombinacija; i/ili (e) postupak je postupak aktiviranja, stimulisanja, promovisanja ili poboljšanja proliferacije NK ćelija, preživljavanja NK ćelija, regrutovanja NK ćelija, ili njihova kombinacija; (f) postupak je postupak (i) promovisanja ili poboljšanja ekspanzije i/ili funkcije T ćelija; (ii) promovisanja ili poboljšanja razvoja Th1, Th2 i/ili Th9 ćelija; (iii) inhibiranja ili suprimiranja razvoja i/ili aktivnosti Treg; (iv) promovisanja ili poboljšanja razvoja i/ili aktivnosti memorijskih ćelija; i (v) bilo koja kombinacija (f)(i)-(iv); (g) primena iRNK ili kombinacije subjektu rezultuje (i) povećanjem nivoa granulocita u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; (ii) povećanjem nivoa unakrsnoprezentujućih dendritskih ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; (iii) povećanjem odnosa efektorskih prema supresorskim T ćelijama u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na odnos posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (iv) 4 povećanjem nivoa efektorskih memorijskih T ćelija u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira OX40L polipeptid; (v) povećanjem nivoa ekspresije PDL1 u jednom ili više uzoraka koji su dobijeni od subjekta u odnosu na nivo praga ili u odnosu na nivo posle primene jednog polinukleotida koji kodira IL-23, IL-36-gama, ili OX40L polipeptid; ili (vi) njihovom kombinacijom; i/ili (h) jedno ili više od (i) infiltracije T ćelija u tumor subjekta, (ii) infiltracije T ćelija u tumor subjekta; i/ili (iii) odgovora memorijskih T ćelija kod subjekta, je/ili je usmeren na antitumorski imunski odgovor; i/ili (i) postupak sadrži intratumorsku primenu jedne ili više navedenih iRNK.
RS20220929A 2016-05-18 2017-05-18 Kombinacije irnk koje kodiraju imunomodulirajuće polipeptide i njihova upotreba RS63625B1 (sr)

Applications Claiming Priority (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662338506P 2016-05-18 2016-05-18
US201662338467P 2016-05-18 2016-05-18
US201662338483P 2016-05-18 2016-05-18
US201662338496P 2016-05-18 2016-05-18
US201662404173P 2016-10-04 2016-10-04
US201662404175P 2016-10-04 2016-10-04
US201662415424P 2016-10-31 2016-10-31
US201662438945P 2016-12-23 2016-12-23
US201662438942P 2016-12-23 2016-12-23
US201762443693P 2017-01-07 2017-01-07
US201762472513P 2017-03-16 2017-03-16
US201762480400P 2017-04-01 2017-04-01
PCT/US2017/033395 WO2017201325A1 (en) 2016-05-18 2017-05-18 Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
EP17727999.9A EP3458474B1 (en) 2016-05-18 2017-05-18 Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63625B1 true RS63625B1 (sr) 2022-10-31

Family

ID=59009786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220929A RS63625B1 (sr) 2016-05-18 2017-05-18 Kombinacije irnk koje kodiraju imunomodulirajuće polipeptide i njihova upotreba

Country Status (19)

Country Link
US (10) US10172808B2 (sr)
EP (2) EP3458474B1 (sr)
JP (2) JP7194594B2 (sr)
KR (2) KR20230008243A (sr)
CN (2) CN116726203A (sr)
AU (2) AU2017266929B2 (sr)
CA (1) CA3024917A1 (sr)
DK (1) DK3458474T3 (sr)
ES (1) ES2932516T3 (sr)
HR (1) HRP20221135T8 (sr)
HU (1) HUE059955T2 (sr)
LT (1) LT3458474T (sr)
MA (1) MA45035B1 (sr)
PL (1) PL3458474T3 (sr)
PT (1) PT3458474T (sr)
RS (1) RS63625B1 (sr)
SI (1) SI3458474T1 (sr)
SM (1) SMT202300003T1 (sr)
WO (1) WO2017201325A1 (sr)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105980401A (zh) 2013-10-03 2016-09-28 现代治疗公司 编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸
EP3350157B1 (en) 2015-09-17 2022-01-05 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
JP7114465B2 (ja) 2015-12-22 2022-08-08 モデルナティエックス インコーポレイテッド 薬剤の細胞内送達のための化合物および組成物
HRP20220525T1 (hr) 2015-12-23 2022-05-27 Modernatx, Inc. Postupci uporabe polinukleotida koji kodiraju ligand ox40
KR20230008243A (ko) 2016-05-18 2023-01-13 모더나티엑스, 인크. 면역 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 조합물 및 이의 용도
AU2017268399B2 (en) 2016-05-18 2023-01-12 Modernatx, Inc. mRNA combination therapy for the treatment of cancer
WO2017223176A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Modernatx, Inc. Methods and apparatus for filtration
EP3538067A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
EP3596042B1 (en) 2017-03-15 2022-01-12 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
SMT202300097T1 (it) * 2017-03-15 2023-05-12 Modernatx Inc Composto e composizioni per il rilascio intracellulare di agenti terapeutici
JP7332478B2 (ja) 2017-03-15 2023-08-23 モデルナティエックス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤
EP3638678B1 (en) 2017-06-14 2025-12-03 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
US11517530B2 (en) 2017-09-27 2022-12-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Therapeutic agents specifically delivered by exosomes for cancer treatment
CA3082570A1 (en) * 2017-11-14 2019-05-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Il-36 secreting immunoresponsive cells and uses thereof
US20200347410A1 (en) * 2018-01-19 2020-11-05 Carsgen Therapeutics Co., Ltd. Synnotch receptor-regulated expression of il12
US20210061843A1 (en) * 2018-01-22 2021-03-04 Modernatx, Inc. Multimeric polynucleotides and uses thereof
CN111954535A (zh) * 2018-02-19 2020-11-17 联合治疗公司 用于编码核糖核酸的器官保护性表达和调节的组合物和方法
EP3849589A1 (en) * 2018-09-14 2021-07-21 ModernaTX, Inc. Methods and compositions for treating cancer using mrna therapeutics
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US20220001026A1 (en) * 2018-11-08 2022-01-06 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
US12042527B2 (en) 2019-01-08 2024-07-23 Modernatx, Inc. Use of mRNAs encoding OX40L, IL-23 and IL-36gamma in combination with immune checkpoint blockade for treating particular cancers
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
CN113747925B (zh) * 2019-03-21 2024-10-15 隆萨销售股份公司 胞外囊泡缀合物及其用途
CA3134945A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Ohio State Innovation Foundation Combination immunoregulation and uses thereof
AU2020283592A1 (en) * 2019-05-29 2022-01-20 Orbis Health Solutions, Llc Delivery vectors and particles for expressing chimeric receptors and methods of using the same
US20220249389A1 (en) 2019-07-12 2022-08-11 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use
JP2022540652A (ja) 2019-07-12 2022-09-16 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ 分裂期キナーゼ阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤との同時送達のための治療用構築物
BR112022004759A2 (pt) 2019-09-19 2022-06-21 Modernatx Inc Composições e compostos lipídicos com cauda ramificada para entrega intracelular de agentes terapêuticos
EP4031165A4 (en) * 2019-09-20 2023-10-11 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education ONCOLYTIC VIRUSES EXPRESSING IL-36 CYTOKINE FOR THE TREATMENT OF CANCER
US12076438B2 (en) 2019-10-09 2024-09-03 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger RNA
US20240123034A1 (en) 2019-10-15 2024-04-18 Modernatx, Inc. Mrnas encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for treating parkinson's disease
EP4061405A1 (en) 2019-11-18 2022-09-28 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
WO2021204179A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Nucleic acid vaccines for coronavirus
ES2992639T3 (en) 2020-04-09 2024-12-16 Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd Lipid nanoparticle composition
EP4149435A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Modernatx, Inc. Lnp compositions comprising an mrna therapeutic and an effector molecule
US20230233474A1 (en) * 2020-05-28 2023-07-27 Modernatx, Inc. Use of mrnas encoding ox40l, il-23 and il-36gamma for treating cancer
IL299196A (en) 2020-06-23 2023-02-01 Modernatx Inc LNP preparations that include mRNA treatments with extended lifespan
US11611540B2 (en) * 2020-07-01 2023-03-21 Vmware, Inc. Protection of authentication data of a server cluster
US12295997B2 (en) 2020-07-06 2025-05-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
CN111931428B (zh) * 2020-07-06 2023-06-20 武汉第二船舶设计研究所(中国船舶重工集团公司第七一九研究所) 一种用于优化海洋核动力平台的方法及系统
CN114073677B (zh) * 2020-08-20 2023-06-09 深圳深信生物科技有限公司 一种脂质纳米颗粒
CN112516378B (zh) * 2020-12-02 2022-02-11 浙江工业大学 一种植酸/丝素蛋白/煅烧白云石骨粘合剂的制备方法
WO2022120560A1 (zh) * 2020-12-08 2022-06-16 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种mRNA剂型的免疫抑制剂及其在制备肿瘤治疗药物中的应用
US20220226465A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 ConserV Bioscience Coronavirus Immunogenic Compositions, Methods and Uses Thereof
AU2022220328A1 (en) 2021-02-12 2023-08-17 Modernatx, Inc. Lnp compositions comprising payloads for in vivo therapy
WO2022204371A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
US20240216288A1 (en) 2021-03-24 2024-07-04 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
US20240189449A1 (en) 2021-03-24 2024-06-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
US20240384277A1 (en) 2021-06-15 2024-11-21 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
US20240376445A1 (en) 2021-06-22 2024-11-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
CN115611757A (zh) * 2021-07-16 2023-01-17 江苏慧聚药业股份有限公司 mRNA传递剂的合成
CN115703713B (zh) * 2021-08-13 2025-06-10 广州谷森制药有限公司 阳离子脂质化合物
US20240398940A1 (en) 2021-09-03 2024-12-05 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
EP4408871A1 (en) 2021-10-01 2024-08-07 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
CN116829578B (zh) * 2021-10-08 2025-03-21 苏州艾博生物科技有限公司 编码白细胞介素-12(il-12)的多核苷酸以及其相关组合物和方法
CN114231624A (zh) * 2021-10-28 2022-03-25 苏州大学附属第一医院 一种环状非编码rna在肾癌骨转移早期诊断及治疗中的应用
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
US20250041393A1 (en) 2021-11-01 2025-02-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding integrin beta-6 and methods of use thereof
NL2030022B1 (en) 2021-12-03 2023-06-21 Wisdom Pharmaceutical Co Ltd SYNTHESIS OF mRNA TRANSMITTER
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
CN115304756B (zh) * 2022-01-30 2023-05-09 上海科技大学 一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
JP2025507571A (ja) 2022-02-18 2025-03-21 モデルナティエックス インコーポレイテッド チェックポイントがんワクチンをコードするｍＲＮＡ及びその使用
WO2023183909A2 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023196399A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding argininosuccinate lyase for the treatment of argininosuccinic aciduria
JP2025517508A (ja) 2022-05-25 2025-06-05 キュアバック エスイー 核酸ベースのワクチン
CN119486749A (zh) * 2022-06-22 2025-02-18 武汉厚先生物医药有限公司 Il-12和ox40l组合物在肿瘤免疫治疗中的应用
EP4551704A1 (en) * 2022-07-10 2025-05-14 Precigen, Inc. Polycistronic mirna constructs for immune checkpoint inhibition
MA71619A (fr) 2022-07-26 2025-05-30 Modernatx, Inc. Polynucléotides modifiés pour la régulation temporelle de l'expression
EP4590830A2 (en) * 2022-09-22 2025-07-30 The Board of Regents of the University of Texas System Novel secretory signal peptides
CN115869332A (zh) * 2022-10-27 2023-03-31 北京新合睿恩生物医疗科技有限公司 递送至体内后在肝脏少表达的mRNA药物及其制备方法
US12186389B2 (en) 2022-10-28 2025-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid base vaccine against emerging SARS-CoV-2 variants
WO2024130158A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding extended serum half-life interleukin-22 for the treatment of metabolic disease
CN115671045B (zh) * 2022-12-30 2023-04-07 华南理工大学 非肝靶向的核酸纳米制剂及其制备方法和应用
WO2024182301A2 (en) 2023-02-27 2024-09-06 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase (galt) for the treatment of galactosemia
AU2024233180A1 (en) 2023-03-08 2025-09-25 CureVac SE Novel lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2024206329A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 Modernatx, Inc. Nucleic acid molecules encoding bi-specific secreted engagers and uses thereof
WO2024229321A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2024230934A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 CureVac SE Therapeutic nucleic acid for the treatment of ophthalmic diseases
CN119101681A (zh) * 2023-06-09 2024-12-10 仁景(苏州)生物科技有限公司 表达可调控的工程化rna分子
WO2025184429A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Modernatx, Inc. Bromodomain and extra-terminal domain (bet) epigenetic reader decoy
WO2025231407A1 (en) * 2024-05-03 2025-11-06 Nutech Ventures Lipid nanoparticles and methods of making and using
WO2025255199A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Modernatx, Inc. Argininosuccinate synthase 1 and argininosuccinate lyase polypeptides and polynucleotides and uses thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5082767A (en) 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
US6140496A (en) 1990-10-09 2000-10-31 Benner; Steven Albert Precursors for deoxyribonucleotides containing non-standard nucleosides
US5681702A (en) 1994-08-30 1997-10-28 Chiron Corporation Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
KR100519895B1 (ko) 1998-04-23 2005-10-13 다카라 바이오 가부시키가이샤 Ｄｎａ 의 합성방법
WO2000018778A1 (en) 1998-09-29 2000-04-06 Phylos, Inc. Synthesis of codon randomized nucleic acids
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
EP1604688B1 (de) 2001-06-05 2010-02-03 CureVac GmbH Stabilisierte Tumorantigen-mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt
ATE427992T1 (de) 2001-11-14 2009-04-15 Toyo Boseki Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon
CA2409775C (en) 2001-12-03 2010-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro
AU2003228440B2 (en) 2002-04-01 2008-10-02 Walter Reed Army Institute Of Research Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
DE10260805A1 (de) 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
AU2006244885B2 (en) 2005-05-09 2011-03-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
US7550264B2 (en) 2005-06-10 2009-06-23 Datascope Investment Corporation Methods and kits for sense RNA synthesis
MX2007016561A (es) 2005-06-30 2008-03-10 Archemix Corp Materiales y metodos para la generacion de transcriptos de acido nucleico completamente modificados en la posicion 2.
US8101385B2 (en) 2005-06-30 2012-01-24 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
CN101248089A (zh) 2005-07-01 2008-08-20 米德列斯公司 抗程序性死亡配体1（pd-l1）的人单克隆抗体
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
WO2007113648A2 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Ctla4 antibody combination therapy
US20080046192A1 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Richard Lathrop Polypepetide-encoding nucleotide sequences with refined translational kinetics and methods of making same
AU2007337810B2 (en) 2006-12-22 2014-02-13 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
CA2691357C (en) 2007-06-18 2014-09-23 N.V. Organon Antibodies to human programmed death receptor pd-1
RU2524431C2 (ru) 2007-09-26 2014-07-27 Интрексон Корпорейшн Синтетические 5 utr (нетранслируемые области), экспрессионные векторы и способ повышения трансгенной экспрессии
EP2217263A2 (en) * 2007-11-07 2010-08-18 Genentech, Inc. Compositions and methods for treatment of microbial disorders
US8785611B2 (en) 2007-12-11 2014-07-22 The Scripps Research Institute Compositions and methods related to mRNA translational enhancer elements
NZ588583A (en) * 2008-04-15 2012-08-31 Protiva Biotherapeutics Inc Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2288336B8 (en) 2008-04-25 2017-03-22 Northwestern University Nanostructures suitable for sequestering cholesterol
US7561973B1 (en) 2008-07-31 2009-07-14 Dna Twopointo, Inc. Methods for determining properties that affect an expression property value of polynucleotides in an expression system
US8401798B2 (en) 2008-06-06 2013-03-19 Dna Twopointo, Inc. Systems and methods for constructing frequency lookup tables for expression systems
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
US8126653B2 (en) 2008-07-31 2012-02-28 Dna Twopointo, Inc. Synthetic nucleic acids for expression of encoded proteins
JP5798919B2 (ja) 2008-08-25 2015-10-21 アンプリミューン、インコーポレーテッドＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅ， Ｉｎｃ． Ｐｄ−１アンタゴニストの組成物および使用方法
HUE034832T2 (hu) 2008-12-09 2021-12-28 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1 antitestek és alkalmazásuk T-sejt-funkció fokozására
US20110082055A1 (en) 2009-09-18 2011-04-07 Codexis, Inc. Reduced codon mutagenesis
WO2011066342A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Amplimmune, Inc. Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
WO2012038448A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 Riboxx Gmbh Method for synthesizing rna using dna template
WO2012122444A1 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Provectus Pharmaceuticals, Inc. Combination of local and systemic immunomodulative therapies for enhanced treatment of cancer
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP2755986A4 (en) 2011-09-12 2015-05-20 Moderna Therapeutics Inc MANIPULATED NUCLEIC ACIDS AND METHOD OF APPLICATION THEREFOR
RS62993B1 (sr) 2011-10-03 2022-03-31 Modernatx Inc Modifikovani nukleozidi, nukleotidi, i nukleinske kiseline, i njihove upotrebe
CA2850575C (en) * 2011-10-11 2020-12-15 Universitat Zurich Prorektorat Mnw Combination medicament comprising il-12 and an agent for blockade of t-cell inhibitory molecules for tumour therapy
BR112014012819B1 (pt) 2011-11-28 2022-08-16 Merck Patent Gmbh Anticorpo anti-pd-l1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e composição
BR112014020019A8 (pt) 2012-02-14 2022-07-12 Merial Ltd vetores poxvirais recombinantes expressando tanto proteínas da raiva e ox40 e vacinas feitas a partir destes
JP2015513912A (ja) 2012-04-02 2015-05-18 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
CA2873402C (en) 2012-05-15 2023-10-24 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
WO2014093924A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
US20140200261A1 (en) 2013-01-17 2014-07-17 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
HK1220122A1 (zh) 2013-03-09 2017-04-28 Modernatx, Inc. Mrna的异源未转录区域
EP3041938A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
PL3702373T3 (pl) 2013-09-13 2022-12-05 Beigene Switzerland Gmbh Przeciwciała anty-PD1 i ich zastosowanie jako środki terapeutyczne i diagnostyczne
EP3527587A1 (en) 2013-12-17 2019-08-21 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-l1 binding antagonists
SG11201608798YA (en) * 2014-04-23 2016-11-29 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
EP3137105A4 (en) * 2014-04-30 2017-12-27 President and Fellows of Harvard College Combination vaccine devices and methods of killing cancer cells
SG10201907164SA (en) 2015-04-22 2019-09-27 Curevac Ag Rna containing composition for treatment of tumor diseases
KR20230008243A (ko) * 2016-05-18 2023-01-13 모더나티엑스, 인크. 면역 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 조합물 및 이의 용도
AU2017268399B2 (en) 2016-05-18 2023-01-12 Modernatx, Inc. mRNA combination therapy for the treatment of cancer
KR102019331B1 (ko) 2017-07-05 2019-09-09 한국과학기술연구원 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법

Also Published As

Publication number Publication date
PT3458474T (pt) 2022-11-08
US11185510B2 (en) 2021-11-30
JP7586883B2 (ja) 2024-11-19
US20200113844A1 (en) 2020-04-16
US20210038529A1 (en) 2021-02-11
US10322091B2 (en) 2019-06-18
US11596609B2 (en) 2023-03-07
MA45035A (fr) 2019-03-27
WO2017201325A8 (en) 2018-08-30
US20230041964A1 (en) 2023-02-09
CA3024917A1 (en) 2017-11-23
US11344504B1 (en) 2022-05-31
AU2017266929A1 (en) 2019-01-17
US20190111003A1 (en) 2019-04-18
JP2019519517A (ja) 2019-07-11
HUE059955T2 (hu) 2023-01-28
CN116726203A (zh) 2023-09-12
US11071716B2 (en) 2021-07-27
SI3458474T1 (sl) 2022-10-28
AU2017266929B2 (en) 2023-05-11
HRP20221135T1 (hr) 2022-11-25
WO2017201325A1 (en) 2017-11-23
LT3458474T (lt) 2022-10-10
US20190060246A1 (en) 2019-02-28
US10322090B2 (en) 2019-06-18
JP2023022326A (ja) 2023-02-14
US10172808B2 (en) 2019-01-08
US20180318229A1 (en) 2018-11-08
EP4137509A1 (en) 2023-02-22
EP3458474B1 (en) 2022-07-06
PL3458474T3 (pl) 2022-11-14
US10406113B2 (en) 2019-09-10
EP3458474A1 (en) 2019-03-27
KR102482867B1 (ko) 2023-01-02
AU2023210606A1 (en) 2023-08-24
AU2017266929A8 (en) 2019-03-14
SMT202300003T1 (it) 2023-03-17
CN109476718A (zh) 2019-03-15
ES2932516T3 (es) 2023-01-20
DK3458474T3 (da) 2022-09-26
HRP20221135T8 (hr) 2023-02-03
KR20230008243A (ko) 2023-01-13
JP7194594B2 (ja) 2022-12-22
US10285950B2 (en) 2019-05-14
US20190105280A1 (en) 2019-04-11
MA45035B1 (fr) 2024-11-29
KR20190020299A (ko) 2019-02-28
US20190105281A1 (en) 2019-04-11
CN109476718B (zh) 2023-07-04
US20230026381A1 (en) 2023-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7586883B2 (ja) 免疫調節ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの組み合わせ及びその使用
US11660341B2 (en) mRNA combination therapy for the treatment of cancer
RS63912B1 (sr) Polinukleotidi koji kodiraju interleukin-12 (il12) i njihove upotrebe
HK40086833A (en) Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
HK40004825B (en) Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
HK40004825A (en) Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof