[go: up one dir, main page]

RS63601B1 - Vektor ekspresije car i t ćelije koje eksprimiraju car - Google Patents

Vektor ekspresije car i t ćelije koje eksprimiraju car

Info

Publication number
RS63601B1
RS63601B1 RS20220895A RSP20220895A RS63601B1 RS 63601 B1 RS63601 B1 RS 63601B1 RS 20220895 A RS20220895 A RS 20220895A RS P20220895 A RSP20220895 A RS P20220895A RS 63601 B1 RS63601 B1 RS 63601B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
car
nucleic acid
cells
ccl19
acid encoding
Prior art date
Application number
RS20220895A
Other languages
English (en)
Inventor
Koji Tamada
Yukimi Sakoda
Keishi Adachi
Original Assignee
Univ Yamaguchi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Yamaguchi filed Critical Univ Yamaguchi
Publication of RS63601B1 publication Critical patent/RS63601B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4221—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4231—Cytokines
    • A61K40/4234—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4231—Cytokines
    • A61K40/4236—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/21—Chemokines, e.g. MIP-1, MIP-2, RANTES, MCP, PF-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na vektor ekspresije CAR, T ćeliju koja eksprimira CAR, u koju je uveden vektor ekspresije CAR i antikancersko sredstvo koje sadrži T ćeliju koja eksprimira CAR.
Stanje tehnike
[0002] Himerni receptor za antigen (dalje u tekstu takođe označen kao "CAR") je veštački himerni protein u kome je jednolančano antitelo koje prepoznaje površinski antigen na ćeliji raka fuzionisano sa regionom signalne transdukcije koji indukuje aktivaciju T ćelije. Kao što je prikazano na slici 1, transfer gena koji kodira CAR u normalnu T ćeliju periferne krvi (T limfocit periferne krvi) koja nije reaktivna na tumor, omogućava pripremu velikih količina CAR-eksprimirajućih T ćelija (u daljem tekstu se jednostavno označavaju kao "CAR-T ćelije"), koje su u stanju da eksprimiraju CAR. CAR-T ćelija je tumor-reaktivna i može da dovede do oštećenja ćelije raka a da ne zavisi od interakcije sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC).
[0003] Imunoterapija raka primenom CAR-T ćelija, specifičnije, terapija koja uključuje sakupljanje T ćelija iz tela pacijenta, transfer gena koji kodira CAR u T ćelije, i prebacivanje T ćelija ponovo u telo pacijenta (videti nepatentni dokument 1) trenutno je u fazi kliničkih ispitivanja širom sveta i produkovala je rezultate koji ukazuju na efikasnost kod, na primer, malignih tumora u hematopoetskim organima, kao što su leukemija ili limfom.
[0004] Poslednjih godina su proučavane različite CAR-T ćelije. Bila je predložena, na primer, farmaceutska kompozicija koja sadrži modifikovane autologe T ćelije koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira CAR sastavljen od antigen-vezujućeg regiona CD19, transmembranskog regiona, kostimulatornog signalnog regiona 4-1BB, i signalnog regiona CD3ζ (videti patentni dokument 1), jednu ili više terapeutski efikasnih populacija T ćelija koje eksprimiraju himerni receptor za antigen sa anti-obeleživačem (AT-CAR) koje se kod subjekta primenjuju istovremeno sa ili odvojeno od formulacije sa jednim ili više obeleženih proteina koji se vezuju za ćelije raka, gde se populacije T ćelija koje eksprimiraju AT-CAR vezuju za obeležene proteine i indukuju smrt ćelija raka (videti patentni dokument 2), ćelije koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira himerni receptor za antigen koji sadrži antigen-vezujući domen humanog antitela 139, vanćelijski zglobni domen, transmembranski domen, i unutarćelijski domen signalne transdukcije T ćelija (videti patentni dokument 3), ćelije koje sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni receptor za antigen, pri čemu himerni receptor za antigen sadrži CD3ζ domen signalne transdukcije koji obuhvata antigen-vezujući domen, transmembranski domen, region za ko-stimulatornu signalnu transdukciju, i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24 (videti patentni dokument 4), genetičkim inženjerstvom izmenjene CD19-specifične T ćelije koje eksprimiraju i zadržavaju CD19-specifični himerni receptor na površini svojih ćelijskih membrana, pri čemu se himerni receptor sastoji od unutarćelijskog signalnog domena za efektorske funkcije imunocita, najmanje jednog transmembranskog domena, i najmanje jednog vanćelijskog domena, i vanćelijski domen sadrži receptor specifičan za CD19 (videti patentni dokument 5), i ćelije koje eksprimiraju himerni receptor za antigen u kojima se nalazi nukleinska kiselina koja kodira himerni receptor za antigen koji kao unutarćelijski domen sadrži unutarćelijski domen receptora za tumorski faktor nekroze (GITR) koji je indukovan glukokortikoidima (videti patentni dokument 6).
[0005] Međutim, nijedna od prethodnih tehnika nije rešila problem niske efikasnosti CAR-T ćelija in vivo ili nedovoljnost aktivacije endogenih T ćelija indukovanu CAR-T ćelijama ili njihovu nedovoljnu lokalnu akumulaciju u blizini tumora, ili probleme imunosupresivnih signala koji se prenose posredstvom PD-L1/PD-1 puta koji predstavlja mehanizam tumorskog izbegavanja imunološkog nadzora kod ćelija raka, i inhibicije aktivnosti CAR-T ćelija imunosupresivnim faktorima kao što su TGF-β ili IL-10 koji se luče u kancerskoj mikrookolini. Dakle, postoje vrste raka ili slučajevi kod kojih nije potvrđen dovoljan terapeutski efekat. Zbog toga je postojala želja da se pripreme efikasnije CAR-T ćelije i vektor ekspresije za pripremu CAR-T ćelija.
Dokumenti vezani za prethodno stanje tehnike
Patentni dokumenti
[0006]
Patentni dokument 1: Objava SAD patentne prijave br.2014/0106449
Patentni dokument 2: Objava japanske neispitane patentne prijave (prevod PCT patentne prijave) br. 2014-504294
Patentni dokument 3: Objava japanske neispitane patentne prijave (prevod PCT patentne prijave) br. 2014-516510
Patentni dokument 4: Objava japanske neispitane patentne prijave (prevod PCT patentne prijave) br. 2014-507118
Patentni dokument 5: Objava japanske neispitane patentne prijave br.2011-004749
Patentni dokument 6: Internacionalna objava br. WO 2013/051718
Nepatentni dokumenti
[0007]
Nepatentni dokument 1: Yozo Nakazawa, The Shinshu Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013) Nepatentni dokument 2: Y. Xu et al. Blood, vol.123, no.24, 29 April 2014, strane 3750-3579.
Kratak opis
Zadatak koji je potrebno rešiti
[0008] Uobičajene CAR-T ćelije osmišljene su tako da pojačavaju sposobnost za aktivaciju T ćelija time što sadrže CD28, 4-1BB, CD3ζ, ili slično, u regionu za signalnu transdukciju CAR-a. Međutim, uobičajene CAR-T ćelije ne pojačavaju u dovoljnoj meri efekat indukcije imunosti CAR-T ćelija kod endogenih T ćelije ili otpornost na imunosupresivni mehanizam tumorskog mikrookruženja. Ove CAR-T ćelije još nisu dostigle terapeutski efekat na čvrste kancere. U skladu sa tim, zadatak je da se obezbede CAR-T ćelije koje koeksprimiraju CAR i faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija i imaju snažan efekat indukovanja imunosti i antitumorske aktivnosti, i da obezbede vektor ekspresije CAR za pripremu CAR-T ćelije.
Sredstva za rešavanje zadatka
[0009] Pronalazači su pokušali da poboljšaju CAR-T ćelije u cilju postizanja boljeg efekta na indukovanje imunosti ili na antitumorsku aktivnost u imunoterapiji raka u kojoj se koriste CAR-T ćelije. U toku ovog procesa, pronalazači su se fokusirali na citokine, hemokine i signalne regulatorne proteine koji predstavljaju faktore koji pojačavaju imune funkcije T ćelija, i konstruisali vektor za koekspresiju CAR i faktora koji pojačavaju imune funkcije T ćelija. Kao rezultat transfera ovog vektora ekspresije u T ćelije, pronalazači su utvrdili da je moguće pripremiti CAR-T ćelije sa superiornim efektom indukovanja imunosti i antitumorske aktivnosti u odnosu na konvencionalne CAR-T ćelije, i time su zaokružili predmetni pronalazak.
[0010] Konkretno, predmetni pronalazak je prikazan u tekstu koji sledi.
(1) Postupak za dobijanje T ćelija koje eksprimuju himerni receptor antigena (CAR), interleukin-7 i CCL19, koji obuhvata uvođenje nukleinske kiseline koja kodira CAR i nukleinske kiseline koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija pomoću jednog ili više vektora u T-ćelije u kojoj nukleinska kiselna koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira interleukin-7 i nukleinske kiseline koja kodira CCL19.
(2) Postupak za dobijanje T ćelija prema stavki (1), koji obuhvata uvođenje u T ćeliju vektora koji se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira CAR, nukleinske kiseline koja kodira interleukin-7 i nukleinske kiseline koja kodira CCL19.
(3) Postupak za dobijanje T ćelije prema stavki (2), u kome nukleinska kiselina koja kodira CAR i nukleinska kiselina koja kodira interleukin-7, i nukleinska kiselina koja kodira interleukin-7 i nukleinska kiselina koja kodira CCL19, su povezane preko nukleinske kiseline koja kodira samoisecajući peptid.
(4) Postupak za dobijanje T ćelija prema stavki (1), koji obuhvata uvođenje u T ćelije vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira interleukin-7, i vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira CCL19.
(5) Postupak za dobijanje T ćelije prema stavki (4), gde nukleinska kiselina koja kodira CAR i nukleinska kiselina koja kodira interleukin-7, i nukleinska kiselina koja kodira CAR i nukleinska kiselina koja kodira CCL19, tim redom, su povezane preko nukleinske kiseline koja kodira samoisecajući peptid.
(6) Postupak za dobijanje T ćelije prema bilo kojoj od stavki (1) do (5), gde CAR sadrži jednolančano antitelo koje prepoznaje antigen izabran iz grupe koju čine CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR varijanta, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mezotelin,
GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171,
MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, IgG kapa lanac, folatni receptoralfa, PSCA, i EpCAM.
(7) Postupak za dobijanje T ćelija prema bilo kojoj stavki (1) do (6), gde nukleinska kiselina koja kodira CAR sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid CD8 transmembranskog regiona.
(8) Postupak za dobijanje T ćelija prema bilo kojoj stavki (1) do (7), gde nukleinska kiselina koja kodira CAR sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide CD28 intracelularnog regiona, 4-1BB intracelularnog regiona, i CD3ζ intracelularnog regiona.
(9) Postupak za dobijanje T ćelija prema bilo kojoj od stavki (2) do (8), gde je vektor retrovirusni vektor.
(10) Antikancersko sredstvo koje sadrži T ćeliju koja eksprimuje CAR, interleukin-7 i CCL19 i farmaceutski prihvatljiv aditiv, gde CAR sadrži jednolančano antitelo koje prepoznaje antigen izabran iz grupe koju čine CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR varijanta, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mezotelin, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34,
CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-
13Ra2, BCMA, Lewis Y, IgG kapa lanac, folatni receptor-alfa, PSCA, i EpCAM.
(11) T ćelija koja eksprimuje CAR, interleukin-7 i CCL19, gde CAR sadrži jednolančano antitelo koje prepoznate antigen izabran iz grupe koju čine CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR varijanta, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mezotelin, GM2,
CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16,
MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, IgG kapa lanac, folatni receptor alfa, PSCA, i EpCAM.
Efekat pronalaska
[0011] Upotreba ovde opisanog vektora ekspresije CAR omogućava pripremu CAR-T ćelija koje imaju i vijabilnost, i sposobnost da nagomilavaju limfocite, i citotoksičnu aktivnost protiv tumorskih ćelija, kao i CAR-T ćelije koja ima otpornost na imunosupresiju u kancerskom mikrookruženju. Očekuje se da imunoterapija upotrebom CAR-T ćelija kod onkoloških pacijenata proizvede snažan terapeutski efekat na kancer i može da služi kao kancerska imunoterapija efikasna čak i kod neresponsivnog ili progresivnog kancera.
Kratak opis crteža
[0012]
Slika 1 je dijagram koji prikazuje strukturu CAR i osnovni sistem kancerske imunoterapije upotrebom CAR-T ćelija.
Slika 2 je dijagram koji prikazuje vektor za ekspresiju CAR, interleukina-7 (IL-7) i CCL19. Slika 3 je dijagram koji prikazuje rezultate-1 potvrde nivoa CAR ekspresije u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 protočnom citometrijom. Levi grafik prikazuje neobojeni CAR uzorak, a desni grafik prikazuje obojeni CAR uzorak.
Slika 4 je dijagram koji prikazuje rezultate-2 potvrde nivoa CAR ekspresije u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 protočnom citometrijom.
Slika 5 je dijagram koji prikazuje rezultate potvrde nivoa CAR ekspresije u T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19, protočnom citometrijom.
Slika 6 je dijagram koji prikazuje rezultate-1 za merenja koncentracija IL-7 i CCL19 u ćelijskom supernatantu T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 ELISA testom.
Slika 7 je dijagram koji prikazuje rezultate-2 za merenja koncentracija IL-7 i CCL19 u ćelijskom supernatantu T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 ELISA testom.
Slika 8 je dijagram koji prikazuje rezultate za merenja koncentracija IL-7 i CCL19 u ćelijskom supernatantu T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19.
Slika 9 je dijagram koji prikazuje broj T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19, stimulisanih i gajenih 3 dana, 5 dana ili 7 dana.
Slika 10 je dijagram koji prikazuje stopu preživljavanja T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19, stimulisanih i gajenih 3 dana, 5 dana ili 7 dana.
Slika 11 je dijagram koji prikazuje broj T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 stimulisanih i gajenih u kulturi 5 dana.
Slika 12 je dijagram koji prikazuje rezultate-1 testa migracije T ćelija upotrebom T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL 7/CCL19.
Slika 13 je dijagram koji prikazuje rezultate-2 testa migracije T ćelija upotrebom T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL 7/CCL19.
Slika 14 je dijagram koji prikazuje rezultate testa migracije dendritskih ćelija upotrebom T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR IL-7/CCL19.
Slika 15 je dijagram koji prikazuje rezultate testa migracije T ćelija upotrebom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR IL-7/CCL19.
Slika 16 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja proliferativnog potencijala T ćelija za T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 (5. dan nakon stimulacije).
Slika 17 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja proliferativnog potencijala T ćelija za T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 (3. i 7. dan nakon stimulacije) .
Slika 18 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja ekspresije CD127 u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19.
Slika 19 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja ekspresije CCR7 u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR IL-7/CCL19.
Slika 20 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja promene zapremine tumora kada su T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 bile primenjene kod miševa koji imaju rak.
Slika 21 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja stope preživljavanja miševa kada su T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 bile primenjene kod miševa koji imaju rak.
Slika 22 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja stope preživljavanja miševa kada su T ćelije koje eksprimiraju CD20 CAR-IL-7/CCL19 bile primenjene kod miševa nakon potkožne inokulacije P815-hCD20 i primene ciklofosfamida nakon toga.
Slika 23 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja zapremine tumora kod miševa kada su T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 bile primenjene kod miševa nakon potkožne inokulacije P815-hCD20 i primene ciklofosfamida nakon toga.
Slika 24 je dijagram koji prikazuje 1/10 brojčanih vrednosti na ordinati grafika za CPA+7x19, na slici 23.
Slika 25 je dijagram koji prikazuje rezultate posmatranja tumorskih tkiva nakon H&E bojenja kada su T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CARIL-7/CCL19 bile primenjene kod miševa nakon potkožne inokulacije P815-hCD20.
Slika 26 je dijagram koji prikazuje rezultate imunohistohemijske analize tumorskih tkiva, kada su T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 bile primenjene kod miševa nakon potkožne inokulacije P815-hCD20.
Slika 27 je dijagram koji prikazuje rezultate kvantifikacije pozitivnog regiona obeleženog fluorescentnim bojenjem na slici 26.
Slika 28 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja zapremine tumora kada su T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7, T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-CCL19, ili T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 bile primenjen kod miševa nakon potkožne inokulacije P815-hCD20.
Slika 29(a) je dijagram koji prikazuje vektor za ekspresiju CAR i dominantno-negativnog mutanta SHP1 (fosfataza-1 koja sadrži domen sa homologijom sa Src regionom 2). Slika 29(b) je dijagram koji prikazuje vektor za ekspresiju CAR i dominantno-negativnog mutanta SHP2 (fosfataza-2 koja sadrži domen sa homologijom sa Src regionom 2).
Slika 30(a) je dijagram koji prikazuje rezultate testiranja citotoksične aktivnosti upotrebom T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-SHP1DN. Slika 30(b) je dijagram koji prikazuje testiranja citotoksične aktivnosti upotrebom T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-SHP2DN.
Slika 31 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja citotoksične aktivnosti protiv tumorskih ćelija mešanjem P815-hCD20 u prisustvu T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 i rituksimaba vezanog za FITC.
Slika 32 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja citotoksične aktivnosti protiv tumorskih ćelija mešanjem P815-hCD20 sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19.
Slika 33 je dijagram koji prikazuje rezultate CD4, CD8, CD44 i CD62L analize površinskih fenotipova leukocita protočnom citometrijom kada su T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 bile primenjene kod miševa nakon potkožne inokulacije P815-hCD20. Slika 34 je dijagram koji prikazuje rezultate ispitivanja proliferacije T ćelija protočnom citometrijom kada su leukociti slezine stimulisani gajenjem tokom 4 dana zajedno sa P815-hCD20 koje su tretirane mitomicinom C.
[0013] Vektor ekspresije CAR nije posebno ograničen sve dok vektor ekspresije CAR sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni receptor za antigen (CAR) i nukleinsku kiselinu koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija, gde je nukleinska kiselina koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija predstavljena nukleinskom kiselinom koja kodira interleukin-7 i nukleinskom kiselinom koja kodira CCL19, nukleinskom kiselinom koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-1, ili nukleinskom kiselinom koja kodira dominantnonegativni mutant SHP-2. Himerni receptor za antigen označava veštački himerni protein u kome je jednolančano antitelo koje prepoznaje površinski ćelijski antigen na ćeliji raka fuzionisano sa regionom za signalnu transdukciju koji preko transmembranskog regiona indukuje aktivaciju T ćelije.
[0014] Nukleinska kiselina koja kodira CAR nije posebno ograničena sve dok nukleinska kiselina kodira polipeptid koji predstavlja CAR. Nukleinska kiselina koja kodira CAR sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide jednolančanog antitela koje prepoznaje površinski ćelijski antigen na ćeliji raka, transmembranski region i region za signalnu transdukciju koji indukuje aktivaciju T ćelija.
[0015] Jednolančano antitelo u CAR sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca i varijabilnog regiona teškog lanca (scFv) izvedenih od antigen-vezujućeg mesta monoklonskog antitela. Primeri ovoga mogu da uključuju oligopeptid ili polipeptid u kojima se linker peptid nalazi između varijabilnog regiona lakog lanca i varijabilnog regiona teškog lanca.
[0016] Ćelijski površinski antigen na ćeliji raka koga prepoznaje jednolančano antitelo može da bude biološki molekul koji je specifično eksprimiran na ćeliji raka i njenoj progenitorskoj ćeliji, biološki molekul koji je de novo eksprimiran usled maligne transformacije ćelije ili biološki molekul čiji je nivo ekspresije povišen u ćeliji raka u poređenju sa normalnom ćelijom. Ovakvi primeri mogu da uključuju CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR varijante, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mezotelin, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, IgG kapa lanac, folatni alfa receptor, PSCA i EpCAM.
[0017] Region za signalnu transdukciju prilikom aktivacije T ćelija je region koji je u stanju da unutar ćelije transdukuje signale, kada jednolančano antitelo prepozna ćelijski površinski antigen na ćeliji raka. Region za signalnu transdukciju prilikom aktivacije T ćelija poželjno sadrži najmanje jedan ili više polipeptida odabranih od polipeptida iz unutarćelijskih regiona CD28, 4-1BB (CD137), GITR, CD27, OX40, HVEM, CD3ζ i γ lanca povezanog sa Fc receptorom, i poželjnije sadrži polipeptide iz tri unutarćelijska regiona CD28, 4-1BB i CD3ζ.
[0018] Ovi polipeptidi unutarćelijskih regiona mogu da budu povezani putem oligopeptidnog linkera ili polipeptidnog linkera koji se sastoji od 2 do 10 aminokiselina. Primeri takve linkerske sekvence mogu da uključuju glicin-serin konsekutivne sekvence.
[0019] Primeri transmembranskog regiona mogu da uključuju polipeptide transmembranskih regiona izvedenih iz CD8, α i β lanaca T-ćelijskih receptora, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 i GITR i mogu poželjno da uključuju polipeptid transmembranskog regiona humanog CD8. CAR je usidren u membranama T ćelija pomoću ovog transmembranskog regiona.
[0020] Transmembranski region može da uključuje zglobni region koji se sastoji od arbitrarnog oligopeptida ili polipeptida i ima dužinu od 1 do 100 aminokiselina, poželjno 10 do 70 aminokiselina. Primeri zglobnog regiona mogu da uključuju zglobni region humanog CD8.
[0021] Spejserski region koji se sastoji od arbitrarnog oligopeptida ili polipeptida može da se nalazi između jednolančanog antitela koje prepoznaje površinski antigen na ćeliji raka i transmembranskog regiona ili između transmembranskog regiona i regiona za signalnu transdukciju pri aktivaciji T ćelija. Primeri dužine spejserskog regiona mogu da uključuju 1 do 100 aminokiselina, poželjno 10 do 50 aminokiselina. Primeri ovakvog spejserskog regiona mogu da uključuju glicin-serin konsekutivne sekvence.
[0022] Nukleinska kiselina koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija nije posebno ograničena sve dok je nukleinska kiselina predstavljena nukleinskom kiselinom koja kodira IL-7 i nukleinskom kiselinom koja kodira CCL19 (u daljem tekstu su takođe zajedno označene kao "prisutna nukleinska kiselina 1"), nukleinskom kiselinom koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-1 (u daljem tekstu takođe označena kao "prisutna nukleinska kiselina 2") ili nukleinskom kiselinom koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-2 (u daljem tekstu takođe označena kao "prisutna nukleinska kiselina 3"). Nukleinska kiselina može da sadrži više nukleinskih kiselina odabranih od prisutnih nukleinskih kiselina 1 do 3 i mogu specifično da sadrže prisutnu nukleinsku kiselinu 1 i prisutnu nukleinsku kiselinu 2, prisutnu nukleinsku kiselinu 1 i prisutnu nukleinsku kiselinu 3, prisutnu nukleinsku kiselinu 2 i prisutnu nukleinsku kiselinu 3, prisutnu nukleinsku kiselinu 1 i prisutnu nukleinsku kiselinu 2 i prisutnu nukleinsku kiselinu 3.
[0023] Nukleinska kiselina koja kodira IL-7 i nukleinska kiselina koja kodira CCL19 u prisutnoj nukleinskoj kiselini 1 mogu da sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira IL-7 i nukleinsku kiselinu koja kodira CCL19, i nukleinska kiselina koja kodira CCL19 može da se nalazi uzvodno ili nizvodno od nukleinske kiseline koja kodira IL-7.
[0024] Nukleinska kiselina koja kodira dominantno-negativni mutant SHP1 nije posebno ograničen sve dok nukleinska kiselina kodira SHP1 mutant koji funkcioniše dominantno u odnosu na SHP1 i može da inhibira efekat SHP1. Primeri mogu da uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira mutantni molekul koji se sastoji od aminokiselinske sekvence dobijene od aminokiselinske sekvence SHP1 supstitucijom najmanje jedne aminokiseline drugom aminokiselinom i može da inhibira efekat SHP1. Nukleinska kiselina koja kodira dominantno-negativni mutant SHP2 nije posebno ograničen sve dok nukleinska kiselina kodira SHP2 mutant koji funkcioniše dominantno u odnosu na SHP2 i može da inhibira efekat SHP2. Primeri mogu da uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira mutantni molekul koji se sastoji od aminokiselinske sekvence dobijene od aminokiselinske sekvence SHP2 supstitucijom najmanje jedne aminokiseline drugom aminokiselinom i može da inhibira efekat SHP2.
[0025] Vektor ekspresije CAR može da sadrži proizvoljnu nukleinsku kiselinu među nukleinskim kiselinama koje kodiraju himerni receptor za antigen i faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija, među više nukleinskih kiselina odabranih od prisutne nukleinske kiseline 1, prisutne nukleinske kiseline 2, i prisutne nukleinske kiseline 3, ili među nukleinskim kiselinama koje kodiraju IL-7 i CCL19 u prisutnoj nukleinskoj kiselini 1, sve dok svaka nukleinska kiselina može da bude eksprimirana. Ove nukleinske kiseline su poželjno povezane preko sekvence koja kodira samoisecajući peptid (2A peptid) ili IRES (interno mesto za ulazak ribozima), poželjno sekvence koja kodira 2A peptid. Povezivanje upotrebom ove sekvence omogućava efikasnu ekspresiju svake nukleinske kiseline.
[0026] 2A peptid je samoisecajući peptid dobijen iz virusa i odlikuje se time što se G-P (pozicija od 1 ostatka od C terminusa) u aminokiselinskoj sekvenci predstavljenoj sekvencom SEQ ID NO: 1 iseca u endoplazmatičnom retikulumu (Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther.5 (5): 627-638 (2005)). Dakle, na taj način se nukleinske kiseline inkorporisane tako da se nalaze sa obe strane 2A peptida eksprimiraju unutar ćelije nezavisno jedna od druge.
[0027] 2A peptid je poželjno 2A peptid dobijen od pikornavirusa, rotavirusa, insektskih virusa, Aphthovirus ili Trypanosoma virusa, poželjnije 2A peptid (F2A) dobijen od pikornavirusa, prikazan u SEQ ID NO: 2.
[0028] Nukleinska kiselina koja kodira himerni receptor za antigen može da se pripremi nekom od tehnika poznatih u oblasti, kao što je postupak hemijske sinteze ili postupak PCR amplifikacije na osnovu nukleotidne sekvence koja kodira polipeptide jednolančanog antitela protiv ćelijskog površinskog antigena na ćeliji raka, transmembranski region, i region signalne transdukcije za aktivaciju T ćelija. Odabrani kodoni za kodiranje aminokiselina mogu da se modifikuju kako bi se u ćeliji domaćina od interesa optimizovala ekspresija nukleinskih kiselina.
[0029] Informacije o nukleotidnim sekvencama koje kodiraju polipeptide jednolančanog antitela protiv površinskog ćelijskog antigena na ćelijama raka, transmembranski region, region signalne transdukcije za aktivaciju T ćelija mogu da se dobiju na odgovarajući način iz dokumenata poznatih u tehnici ili pretraživanjem baze podataka NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) ili na slične načine.
[0030] Na primer, informacije o nukleotidnim sekvencama koje kodiraju polipeptide transmembranskih regiona CD28, 4-1BB i CD3ζ u regionu signalne transdukcije za aktivaciju T ćelija, mogu da se dobiju na odgovarajući način pretraživanjem baze podataka NCBI ili na sličan način. Primeri mogu da uključuju sekvence registrovane kao GenBank No: NM_006139.2 (datum ažuriranja: 10. maj 2014.) za humani CD28, GenBank No: NM_001561.5 (datum ažuriranja: 16. mart 2014.) za humani 4-1BB i GenBank No: NM_000734.3 (datum ažuriranja: 12. avgust 2014.) za humani CD3ζ.
[0031] Informacije o nukleotidnoj sekvenci koja kodira polipeptid transmembranskog regiona humanog CD8 može da se dobije na odgovarajući način pretraživanjem baze podataka NCBI ili na sličan način. Primeri mogu da uključuju sekvencu registrovanu kao GenBank No: NM_001768.6 (datum ažuriranja: 10. maj 2014.).
[0032] Informacije o nukleotidnoj sekvenci koja kodira polipeptid jednolančanog antitela takođe može da se dobije pripremom monoklonskog antitela koje prepoznaje ciljni ćelijski površinski antigen, određivanjem aminokiselinske sekvence monoklonskog antitela postupkom koji je poznat u tehnici, kao što je Edmanov metod, i dobijanjem informacija na osnovu aminokiselinske sekvence. Primeri postupka za pripremu monoklonskog antitela mogu da uključuju postupak pripreme u kome se koriste hibridomi, postupak pripreme koji uključuje transformaciju domaćina vektorom ekspresije koji sadrži gen za antitelo pristupom genetičkog inženjerstva i postupak pripreme koji uključuje imunizaciju transgene životinje željenim antigenom.
[0033] Nukleinska kiselina koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija, tj., nukleinska kiselina koja kodira IL-7 i nukleinska kiselina koja kodira CCL19, nukleinska kiselina koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-1, ili nukleinska kiselina koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-2, mogu da se pripremaju tehnikom poznatom u oblasti, kao što je postupak hemijske sinteze ili postupak PCR amplifikacije na osnovu njihovih respektivnih nukleotidnih sekvenci. Odabrani kodoni za kodiranje aminokiselina mogu da se modifikuju kako bi se optimizovala ekspresija nukleinskih kiselina u ćeliji domaćina od interesa.
[0034] Informacije o nukleinskoj kiselini koja kodira IL-7 i nukleinskoj kiselini koja kodira CCL19, nukleinskoj kiselini koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-1 ili nukleinskoj kiselini koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-2 mogu da se dobiju na odgovarajući način iz dokumenata poznatih u tehnici ili pretraživanjem baze podataka NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) ili na slične načine.
[0035] Nukleinska kiselina koja kodira IL-7 može na odgovarajući način da se odabere u skladu sa tipom ćelije u koju se prenosi vektor ekspresije CAR . Primeri mogu da uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3) humanog IL-7. Nukleotidna sekvenca koja ima 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, dalje poželjno 95% ili više, najpoželjnije 98% ili više identičnosti sa nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 3, može da se koristi sve dok je zadržan efekat pojačavanja ćelijske proliferacije koji ima IL-7.
[0036] Nukleinska kiselina koja kodira CCL19 može na odgovarajući način da se odabere u skladu sa tipom ćelije u koju se prenosi vektor ekspresije CAR . Primeri mogu da uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4) humanog CCL19. Nukleotidna sekvenca koja ima 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, dalje poželjno 95% ili više, najpoželjnije 98% ili više identičnosti sa nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 4 može da se koristi sve dok je zadržan hemoatraktivni efekat CCL19 na T ćeliju.
[0037] Nukleinska kiselina koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-1 može na odgovarajući način da se odabere u skladu sa tipom ćelije u koju se prenosi vektor ekspresije CAR. Primeri mogu da uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5) dominantno-negativnog mutanta humanog SHP-1. Nukleotidna sekvenca koja ima 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, dalje poželjno 95% ili više, najpoželjnije 98% ili više identičnosti sa nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 5 može da se koristi sve dok dominantno-negativni mutant SHP-1 može da inhibira efekat SHP-1. Mutirano mesto u SEQ ID NO: 5 je serin na poziciji 453.
[0038] Nukleinska kiselina koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-2 može pogodno da se odabere u skladu sa vrstom ćelije u koju se prenosi vektor ekspresije CAR . Primeri mogu da uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 6) dominantnonegativnog mutanta humanog SHP-2. Nukleotidna sekvenca koja ima 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, dodatno poželjno 95% ili više, najpoželjnije 98% ili više identičnosti sa nukleotidnom sekvencom pokazanom u SEQ ID NO: 6, može da se koristi sve dok dominantno-negativni mutant SHP 2 može da inhibira SHP-2. Mutirano mesto u SEQ ID NO: 6 je serin na poziciji 459.
[0039] Vektor ekspresije CAR može da bude linearan ili cirkularan i može da bude ne-virusni vektor kao što je plazmid, virusni vektor, ili vektor na bazi transpozona. Ovakav vektor može da sadrži kontrolne sekvence kao što su promotor i terminator, i selektivnu markersku sekvencu kao što je gen za rezistenciju na lek ili reporter gen. Nukleinska kiselina koja kodira CAR ili nukleinska kiselina koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija funkcionalno su smešteni nizvodno od promotorske sekvence tako da svaka nukleinska kiselina može efikasno da se transkribuje. Osim toga, ekspresija nukleinske kiseline koja kodira himerni receptor za antigen može lako da se potvrdi zahvaljujući marker genu koji je u njoj sadržan.
[0040] Vektor ekspresije CAR može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira gen za samouništenje. Pozicija gena za samouništenje nije posebno ograničena, i gen za samouništenje može da se nalazi, preko sekvence koja kodira 2A peptid ili IRES, nizvodno od promotora za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira IL-7, nukleinske kiseline koja kodira CCL19, nukleinske kiseline koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-1, ili nukleinske kiseline koja kodira dominantno-negativni mutant SHP-2 i uzvodno ili nizvodno od svake od ovih nukleinskih kiselina, ili može da se nalazi nizvodno od dodatnog promotora. Vektor ekspresije CAR koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira gen za samouništenje omogućava kontrolu broja T ćelija koje eksprimiraju CAR in vivo tako što se primeni lek koji aktivira funkcije gena za samouništenje u skladu sa tokom lečenja raka, na primer, kada je tumor iščezao.
[0041] Primeri gena za samouništenje mogu da uključuju timidin kinazu herpes simpleks virusa (HSV TK) i inducibilne gene kaspaze 9 koji su navedeni u dokumentima pomenutim u daljem tekstu. Primeri lekova koji aktiviraju funkcije ovih gena mogu da uključuju ganciklovir za prvi i CID (hemijska indukcija dimerizacije) jedinjenje AP1903 za drugi (Cooper LJ., et al., Cytotherapy. 2006; 8 (2): 105-17; Jensen M. C. et al., Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep; 16 (9): 1245-56; Jones BS. Front Pharmacol.2014 Nov 27; 5: 254; Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8; 8 (2): 230-49; i Bole-Richard E., Front Pharmacol.2015 Aug 25; 6: 174).
[0042] Primeri virusnih vektora mogu da uključuju retrovirusne vektore, lentivirusne vektore, adenovirusne vektore, i virusne vektore povezane sa adenovirusnim vektorima, i mogu poželjno da uključuju retrovirusne vektore, poželjnije pMSGV vektor (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) i pMSCV vektor (proizvodi ga kompanija Takara Bio Inc.). Upotrebom retrovirusnog vektora, transgen se integriše u genome ćelija domaćina i može dakle, da bude stabilno eksprimiran tokom dugog perioda.
[0043] T ćelija koja eksprimira CAR prema predmetnom pronalasku nije posebno ograničena sve dok je T ćelija koja eksprimira CAR predstavljena T ćelijom koja je dobijena transferom (a) vektora ekspresije CAR prema predmetnom pronalasku ili T ćelijom koja je dobijena transferom (b) najmanje dva vektora: vektora ekspresije CAR koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira interleukin-7 (vektor ekspresije CAR-IL-7) i vektora ekspresije CAR koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira CCL19 (vektor ekspresije CAR-CCL19). Primeri postupka za transfer vektora ekspresije CAR prema predmetnom pronalasku ili vektora ekspresije CAR-IL-7 i vektora ekspresije CAR-CCL19 u T ćeliju, mogu da uključuju, ali nisu posebno ograničeni na, postupke transfera putem postupaka koji su poznati u tehnici, kao što su postupak virusne infekcije, postupak sa kalcijum fosfatom, lipofekcija, mikroinjeciranje i elektroporacija i mogu poželjno da uključuju postupak virusne infekcije. Vektor ekspresije CAR-IL-7 može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira interleukin-7. Vektor ekspresije CAR CCL19 može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira CCL19. Kao i vektor ekspresije CAR prema predmetnom pronalasku, svaki od ovih vektora ekspresije može da sadrži dodatnu nukleinsku kiselinu kao što je nukleinska kiselina koja kodira 2A peptid, IRES ili „gen za samouništenje“, sve dok svaka nukleinska kiselina može da se eksprimira.
[0044] Primeri postupka sa virusnom infekcijom mogu da uključuju postupak u kome je zastupljen postupak transfekcije ćelije za pakovanje, kao što je GP2-293 ćelija (proizvodi je kompanija Takara Bio Inc.), Plat-GP ćelija (proizvodi je kompanija Cosmo Bio Co., Ltd.), PG13 ćelija (ATCC CRL-10686) ili PA317 ćelija (ATCC CRL-9078) vektorom ekspresije CAR prema predmetnom pronalasku i plazmidom za pakovanje, kako bi se pripremili rekombinantni virusi, i infekcijom T ćelije rekombinantnim virusima. Postupak virusne infekcije može da se izvodi upotrebom komercijalno dostupnog kita kao što je kit po imenu „Retrovirus packaging Kit Eco“ (proizvodi ga kompanija Takara Bio Inc.).
[0045] Transfer vektora ekspresije CAR u T ćeliju može da se potvrdi ispitivanjem ekspresije CAR protočnom citometrijom, Northern-blot testom, Southern-blot testom, PCR metodom kao što je RT-PCR, ELISA testom ili Western-blot testom, ili ispitivanjem ekspresije marker gena koji je ubačen u vektor.
[0046] Primeri T ćelije mogu da uključuju T-ćeliju dobijenu od humane T ćelije i ne-humane sisarske (npr., psa, mačke, svinje ili miša) T ćelije. Alternativno, T ćelija može da se dobije izdvajanjem i prečišćavanjem iz telesne tečnosti kao što je krv ili tečnost iz kosne srži, iz tkiva slezine, timusa, limfnih čvorova, ili slično tome, ili imunocita koji infiltriraju kancerozno tkivo primarnog tumora, metastatskog tumora, kanceroznih ascita, ili slično. Primeri ovih T ćelija mogu da uključuju αβT ćeliju, γδT ćeliju, CD8+ T ćeliju, CD4+ T ćeliju, T ćeliju koja infiltrira tumore, memorijsku T ćeliju, naivnu T ćeliju i NKT ćeliju.
[0047] Jednolančano antitelo koga eksprimira T ćelija prema predmetnom pronalasku koja eksprimira CAR, smešteno je van ćelije. T ćelija koja eksprimira CAR i koja ima ovo jednolančano antitelo, u stanju je da prepoznaje tumor-asocirani antigen (TAA) eksprimiran na površini ćelije raka.
[0048] T ćelija prema predmetnom pronalasku koja eksprimira CAR, može da sadrži vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja osim vektora ekspresije CAR kodira i gen za samouništenje.
[0049] Antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku nije posebno ograničeno sve dok antikancersko sredstvo sadrži T ćeliju prema predmetnom pronalasku koja eksprimira CAR i farmaceutski prihvatljiv aditiv. Primeri aditiva mogu da uključuju fiziološki rastvor, puferovan fiziološki rastvor, medijum za ćelijsku kulturu, dekstrozu, injektabilnu vodu, glicerol, etanol i njihove kombinacije, stabilizatore, solubilizatore i surfaktante, pufere i antiseptike, sredstva za davanje toničnosti, punioce i lubrikante.
[0050] Antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku može da se primenjuje kod test subjekata kojima je potrebno lečenje raka, upotrebom postupka poznatom stručnjacima u oblasti. Primeri postupka primene mogu da uključuju intravensku, intratumorsku, intrakutanu, subkutanu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intraarterijsku, intramedularnu, intrakardijačnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrakranijalnu, intratekalnu i subarahnoidnu (spinalna tečnost) injekciju.
[0051] Količina T ćelije koja eksprimira CAR prema predmetnom pronalasku i koju sadrži antikancersko sredstvo koje se primenjuje, može odgovarajuće da se prilagodi u skladu sa tipom, položajem i ozbiljnošću raka, godinama, telesnom težinom i stanjem testiranog subjekta koji treba da se leči, itd. Primeri mogu poželjno da uključuju 1 x 10<4>do 1 x 10<10>ćelija, poželjno 1 x 10<5>do 1 x 10<9>ćelija, poželjno 5 x 10<6>do 5 x 10<8>ćelija, u jednoj dozi.
[0052] Antikancersko sredstvo koje se primenjuje može da se primeni nezavisno 4 puta, 3 puta, dvaput ili jedanput dnevno u 1-dnevnom, 2-dnevnom, 3-dnevnom, 4-dnevnom, ili 5-dnevnom intervalu, jednom nedeljno, u 7-dnevnom, 8- dnevnom, ili 9-dnevnom intervalu, dva puta nedeljno, jednom mesečno ili dvaput mesečno.
[0053] Primeri raka za antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku ili za postupak za lečenje raka koji se kasnije pominje, mogu da uključuju: kancere kao što su adenokarcinom, rak skvamoznih ćelija, adenoskvamozni kancer, nediferencirani kancer, krupnoćelijski kancer, sitnoćelijski kancer, rak kože, rak dojke, rak prostate, rak mokraćne bešike, vaginalni kancer, kancer vrata, rak materice, rak jetre, rak bubrega, rak pankreasa, rak slezine, rak pluća, trahealni kancer, bronhijalni kancer, rak debelog creva, rak tankog creva, rak želuca, rak jednjaka, rak žučne kese, testis i rak jajnika; kanceri koštanog tkiva, hrskavičavog tkiva, masnog tkiva, mišićnog tkiva, vaskularnog tkiva i hematopoetskog tkiva; sarkome kao što je hondrosarkom, Juingov sarkom, maligni hemangioendoteliom, maligni švanom, osteosarkom i sarkom mekog tkiva; blastomi kao što su hepatoblastom, meduloblastom, nefroblastom, neuroblastom, pankreatoblastom, pleuropulmonarni blastom i retinoblastom; tumor embrionskih ćelija; limfom; i leukemija.
[0054] Antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku može da se koristi u kombinaciji sa dodatnim antikancerskim sredstvom. Primeri dodatnog antikancerskog sredstva mogu da uključuju: alkilujuće agense kao što su ciklofosfamid, bendamustin, Ifosfamid i dakarbazin; antimetabolite kao što su pentostatin, fludarabin, kladribin, metotreksat, 5-fluorouracil, 6-merkaptopurin i enocitabin; lekove za ciljano molekularno delovanje kao što su rituksimab, cetuksimab i trastuzumab; inhibitore kinaza kao što su imatinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib i trametinib; inhibitore proteazoma kao što su bortezomib; inhibitore kalcineurina kao što su ciklosporin i takrolimus; antikancerske antibiotike kao što su idarubicin, doksorubicin mitomicin C; biljne alkaloide kao što su irinotekan i etopozid; lekove sa platinom kao što su cisplatin, oksaliplatin i karboplatin; hormonska tereapeutska sredstva kao što su tamoksifen i bikalutamid; i imunoregulatorne lekove kao što su interferon, nivolumab i pembrolizumab i može poželjno da uključuje alkilujuće agense i antimetabolite, poželjnije ciklofosfamid.
[0055] Postupak za "upotrebu antikancerskog sredstva prema predmetnom pronalasku u kombinaciji sa dodatnim antikancerskim sredstvom" može da uključuje postupak za upotrebu dodatnog antikancerskog sredstva u lečenju, praćen antikancerskim sredstvom prema predmetnom pronalasku, postupak u kome se istovremeno koriste antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku i dodatno antikancersko sredstvo, i postupak u kome se koristi antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku za lečenje, praćen upotrebom dodatnog antikancerskog sredstva i može poželjno da uključuje postupak u kome se koristi dodatno antikancersko sredstvo za lečenje, praćen upotrebom antikancerskog sredstva prema predmetnom pronalasku. Kombinovano antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku i dodatno antikancersko sredstvo dodatno poboljšava terapeutski efekat na kancer i takođe može da smanji neželjene efekte svakog antikancerskog sredstva tako što smanjuje učestalost primene ili dozu antikancerskog sredstva. Takođe, antikancersko sredstvo prema predmetnom pronalasku može da sadrži dodatno antikancersko sredstvo.
[0056] Takođe je opisan 1) postupak za lečenje raka, koji obuhvata primenu T ćelije koja eksprimira CAR kod pacijenta kome je lečenje raka potrebno, 2) T ćeliju koja eksprimira CAR za upotrebu kao antikancerskog sredstva, i 3) upotrebu T ćelije koja eksprimira CAR za pripremu antikancerskog sredstva.
[0057] Takođe je opisan kit za pripremu T ćelije koja eksprimira CAR koja sadrži vektor ekspresije CAR prema predmetnom pronalasku. Kit nije posebno ograničen sve dok sadrži vektor ekspresije CAR . Kit može da sadrži uputstvo za upotrebu za pripremu T ćelije koja eksprimira CAR i reagens za upotrebu prilikom transfera vektora ekspresije CAR u T ćelije.
Primer 1
[Priprema T ćelija koje eksprimiraju IL-7 i CCL19]
(Odabir faktora koji pojačava imune funkcije T ćelija)
[0058] In vivo je prisutno najmanje nekoliko stotina različitih tipova molekula koji mogu da kontrolišu funkcije T ćelija. Pronalazači su najpre odabrali IL-7 i CCL19 od jako velikog broja kombinacija, na osnovu prethodnih nalaza ili eksperimenata, kao kontrolne molekule za dodatno pojačavanje antitumorskog efekta CAR-T ćelija, a takođe su odabrali kombinaciju ova dva molekula, tj. ne svaki pojedinačno. Pronalazači su pripremili vektor za koekspresiju faktora koji pojačavaju imune funkcije T ćelija i CAR.
[0059] IL-7 je citokin esencijalan za preživljavanje T ćelija i proizvode ga nehematopoetske ćelije kao što su stromalne ćelije kosne srži, timusa i limfnih organa ili tkiva. Sa druge strane, skoro da nije utvrđeno da same T ćelije imaju sposobnost da proizvode IL-7.
[0060] CCL19 uglavnom proizvode dendritske ćelije ili makrofagi limfnih čvorova i ima funkciju da preko svog receptora CCR7 izazove migraciju T ćelija, B ćelija, ili zrelih dendritskih ćelija (Priprema of anti-FITC vektor ekspresije CAR za ekspresiju IL-7 i CCL19)
(Priprema anti-FITC vektora ekspresije CAR za ekspresiju IL-7 i CCL19)
[0061] Veštački su sintetisani anti-FITC CAR DNK fragment (SEQ ID NO: 7) koji kodira anti-FITC CAR koji se sastoji od anti-FITC scFv, transmembranskog regiona mišijeg CD8 i unutarćelijskih signalnih motiva mišijih CD28-4-1BB-CD3ζ, F2A-MCS DNK fragment (SEQ ID NO: 8) koji kodira 2A peptid (F2A) prikazan u SEQ ID NO: 1 i mesto za multi-kloniranje (MCS) koje prati peptid i IL 7-F2A-CCL19 DNK fragment (SEQ ID NO: 9) koji kodira mišiji IL-7 (bez stop kodona) i F2A i mišiji CCL19 nakon mišijeg IL-7. U SEQ ID NO: 7, pozicije 1 do 819 predstavljaju sekvencu koja kodira polipeptid anti-FITC scFv, pozicije 829 do 1074 predstavljaju sekvencu koja kodira polipeptid transmembranskog regiona mišijeg CD8, pozicije 1075 do 1197 predstavljaju sekvencu koja kodira polipeptid unutarćelijskog regiona mišijeg CD8, pozicije 1198 do 1332 predstavljaju sekvencu koja kodira polipeptid unutarćelijskog regiona 4-1BB i pozicije 1333 do 1674 predstavljaju sekvencu koja kodira polipeptid unutarćelijskog regiona CD3ζ. U SEQ ID NO: 9, pozicije 1 do 462 predstavljaju sekvencu koja kodira IL-7, pozicije 463 do 537 predstavljaju sekvencu koja kodira F2A i pozicije 538 do 864 predstavljaju sekvencu koja kodira CCL19.
[0062] Da bi bio pripremljen CAR vektor za ekspresiju CAR, IL-7 i CCL19, povezani su anti-FITC CAR DNK fragment i F2A-MCS DNK fragment kako bi se pripremio anti-FITC CAR-F2A-MCS konstrukt. Zatim je pripremljeni konstrukt ukloniran u retrovirusni vektor ekspresije pMSGV (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) kako bi se pripremio pMSGV vektor koji sadrži anti-FITC CAR-F2A-MCS. IL-7-F2A-CCL19 DNK fragment inseriran je u MCS pMSGV vektora pomoću tretmana restrikcionim enzimima (NsiI i SalI) i ligacijom, kako bi se dobio pMSGV vektor koji sadrži anti-FITC CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19 (vektor ekspresije IL 7/CCL19-anti-FITC CAR). Mapa dobijenog vektora je prikazana na slici 2. Takođe, anti-FITC CAR DNK fragment je ukloniran u retrovirusni vektor ekspresije pMSGV kako bi se pripremio pMSGV vektor koji sadrži anti-FITC CAR kao kontrolu (kontrolni anti-FITC CAR vektor).
(Priprema retrovirusa koji nosi vektor ekspresije IL-7/CCL19-anti-FITC CAR)
[0063] Retrovirus je pripremljen za transdukciju mišijih T ćelija. GP2-293 ćelijska linija za pakovanje (koju proizvodi firma Takara Bio Inc.) transfektovana je prethodno pomenutim vektorom ekspresije IL-7/CCL19-anti-FITC CAR ili kontrolnim anti-FITC CAR vektorom i pCL-Eco plazmidom (proizvodi ga kompanija Imgenex Corp.) koristeći Lipofectamine 2000 ili 3000 (proizvodi ga kompanija Life Technologies Corp.) kako bi se pripremio retrovirus koji nosi vektor ekspresije IL-7/CCL19 -anti-FITC CAR ili kontrolni anti-FITC CAR vektor. Nakon 48 sati od transfekcije, izdvojen je supernatant sa retrovirusom.
[0064] DMEM suplementiran sa 10% FCS, 100 U/ml penicilina i 100 mg/ml streptomicina korišćen je kao medijum za ćelijsku kulturu za GP2-293 ćelije. RPMI-1640 suplementiran sa 10% FCS, 100 U/ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina, 50 mM 2-merkaptoetanola i 2 mM L-glutamina korišćen je kao medijum za ćelijsku kulturu za T ćelije koje su korišćene u primerima koji se kasnije pominju.
(Transdukcija mišijih T ćelija)
[0065] Za transdukciju mišijih T ćelija, 3 x 10<6>prečišćenih mišijih T ćelija dobijenih iz slezine i limfnih čvorova, aktivirano je tokom 48 sati pomoću imobilisanog anti-CD3 monoklonskog antitela (3 µg/ml), anti-CD28 monoklonskog antitela (1 µg/ml) i IL-2 (100 IU/ml). Zatim je supernatant koji je sadržao na ovaj način pripremljen retrovirus sa vektorom ekspresije IL-7/CCL19 -anti FITC CAR ili kontrolnim anti-FITC CAR vektorom pomešan sa aktiviranim mišijim T ćelijama (1 x 10<6>ćelija/ml) na ploči obloženoj sa 25 µg/ml RetroNectin(R) (koga proizvodi firma Takara Bio Inc.). Nakon centrifugiranja na 1500 rpm tokom 2 sata, ćelije su gajene tokom 6 sati u prisustvu IL-2 (100 IU/ml). Kako bi se retrovirus uklonio iz ćelijskog medijuma iz kulture, izdvojene su mišije T ćelije, prebačene u svež medijum za gajenje kulture (RPMI) koji je sadržao IL-2 (100 IU/ml) i dodatno gajene tokom 42 sata kako bi se dobile mišije T ćelije sa vektorom ekspresije IL 7/CCL19 -anti-FITC CAR (T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19) ili mišije T ćelije sa anti-FITC CAR vektorom (T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR).
(Priprema vektora ekspresije anti-CD20 CAR za ekspresiju IL-7 i CCL19)
[0066] pMSGV vektor koji sadrži anti-humani CD20 CAR-F2AIL-7-F2A-CCL19 (vektor ekspresije CAR IL-7/CCL19-anti-humani CD20) pripremljen je na isti način kao i vektor ekspresije CAR IL-7/CCL19-anti-FITC koji je prethodno opisan u tekstu osim što je sekvenca anti-FITC scFv regiona, sadržana u sekvenci koju predstavlja SEQ ID NO: 7, zamenjena sekvencom anti-humanog CD20 scFv (SEQ ID NO: 10) koga sintetiše kompanija Life Technologies Corp., na osnovu sekvence rituksimaba. Slično tome, pMSGV vektor koji sadrži anti-humani CD20 CAR (kontrolni anti-humani CD20 CAR vektor) pripremljen je na isti način kao i kontrolni anti-FITC CAR vektor koji je opisan prethodno u tekstu, osim što je sekvenca anti-FITC scFv regiona, sadržana u sekvenci koju predstavlja SEQ ID NO: 7, zamenjena sekvencom anti-humanog CD20 scFv (SEQ ID NO: 10). Vektor ekspresije CAR IL-7/CCL19 -anti-humani CD20 ili kontrolni vektor CAR anti-humani CD20 prebačen je u mišije T ćelije na isti način kao što je prethodno opisano, kako bi se pripremile T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL 7/CCL19 ili T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR.
Primer 2
[Testiranje ekspresije CAR protočnom citometrijom]
(Analiza protočnom citometrijom)
[0067] Nivo ekspresije CAR koji prepoznaje FITC, kao model antigena, analiziran je dvobojnom protočnom citometrijom. Pripremljene T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 gajene su u prisustvu dekstrana vezanog za FITC i anti-CD8 monoklonskog antitela vezanog za alofikocijanin (APC) (53-6.7 proizvod kompanije Affymetrix, Inc.). EC800 (proizvod korporacije Sony) je korišćen u protočnoj citometriji, a podaci su analizirani upotrebom softvera FlowJo (proizvodi ga Tree Star, Inc.).
[0068] Nivo ekspresije humanog CD20 koji prepoznaje CAR takođe je analiziran dvobojnom protočnom citometrijom. Pripremljene T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 analizirane su upotrebom biotinilovanog proteina L i streptavidina vezanog za APC.
(Rezultati)
[0069] Rezultati su prikazani na slikama 3 do 5. Na slici 3, levi grafik prikazuje rezultate u vezi sa neobojenim uzorkom CAR (dekstran vezan za FITC nije dodat) T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL 7/CCL19, a desni grafik prikazuje rezultate u vezi sa obojenim uzorkom CAR (dekstran vezan za FITC je dodat) T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL 7/CCL19. Na slici 4, "transdukcija (-)" prikazuje rezultate u vezi sa netransdukovanim T ćelijama, "kontr." prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR, i "7x19" prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19. Na slici 5, "transdukcija (-)" prikazuje rezultate u vezi sa netransdukovanim T ćelijama, "kontr." prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, i "7x19" prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19. Brojčane vrednosti na ovim crtežima predstavljaju procenat svake populacije. Kao što je prikazano na slikama 3 do 5, ekspresija CAR je potvrđena u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 i T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19.
Primer 3
[Lučenje IL-7 i CCL19]
(Merenje koncentracija IL-7 i CCL19 u supernatantu kulture T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 - 1)
[0070] Pripremljene T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 ili T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR stimulisane su sa 1 µg/ml imobilisanog trastuzumaba vezanog za FITC i gajene u kulturi 3 dana. Supernatant je izdvojen, i koncentracije IL-7 i CCL19 su merene koristeći komercijalno dostupan ELISA Kit (proizvodi ga firma R&D systems, Inc.). Rezultati su prikazani na slici 6.
(Rezultati)
[0071] Kao što je prikazano na slici 6, u supernatantu kulture je detektovano 300 pg/ml ili više IL-7 i detektovano je 75 pg/ml ili više CCL19. Dakle, potvrđeno je da: T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 eksprimiraju IL-7 i CCL19; i eksprimirani IL-7 i CCL19 se luče izvan ćelije. I IL-7 i CCL19 iz kontrolnih T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR pali su ispod granice detekcije (nisu detektovani).
(Merenje koncentracija IL-7 i CCL19 u supernatantu kulture T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 - 2)
[0072] Koncentracije IL-7 i CCL-19 nakon gajenja od 3, 5, ili 7 dana sa ili bez stimulacije imobilisanim trastuzumabom vezanim za FITC ili anti-CD3 monoklonskim antitelom merene su koristeći ELISA Kit. Rezultati su prikazani na slici 7. Na slici 7, svetla kolona prikazuje rezultate dobijeni bez stimulacije, siva kolona prikazuje rezultate dobijene sa stimulacijom trastuzumabom vezanim za FITC, i tamna kolona prikazuje rezultate dobijene sa stimulacijom anti-CD3 monoklonskim antitelom. "Kontr." prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR, i "7x19" prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19.
(Rezultati)
[0073] Kao što je očigledno sa slike 7, pokazano je da T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 luče IL-7 i CCL-19 izvan ćelija kada se gaje ne samo 3 dana nego i 5 dana ili 7 dana.
(Merenje koncentracija IL-7 i CCL19 u supernatantu kulture T ćelija koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR-IL-7/CCL19)
[0074] Kao i kod pripremljenih T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 ili T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, koncentracije IL-7 i CCL-19 posle gajenja tokom 3 dana ili 5 dana sa ili bez stimulacije mastocitomom P815 koji je tretiran mitomicinom C, došlo je do genetičke rekombinacije mastocitoma P815 tako da eksprimira humani CD20 (P815-hCD20), ili imobilisanim anti-CD3 monoklonskim antitelom, slično su merene koristeći ELISA Kit. Rezultati su prikazani na slici 8. Na slici 8, svetla kolona prikazuje rezultate dobijene bez stimulacije, dijagonalno osenčena kolona pokazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815 koje su tretirane mitomicinom C, tamna kolona prikazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815hCD20, i siva kolona prikazuje rezultate dobijene stimulacijom pomoću imobilisanog anti-CD3 monoklonskog antitela. "Kontr." prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR, a "7x19" prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR IL-7/CCL19.
(Rezultati)
[0075] Kao što je očigledno sa slike 8, takođe je pokazano da T ćelije koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR-IL-7/CCL19 luče IL-7 i CCL-19 izvan ćelija.
Primer 4
[Broj ćelija i stopa preživljavanja T ćelija koje eksprimiraju CAR]
(Broj ćelija i stopa preživljavanja T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19)
[0076] Sprovedena je studija u vezi sa tim da li će IL-7 ili CCL19 koje proizvode T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 ispoljiti biološke funkcije ili prikazati efekat indukovanja imunosti. Pripremljene T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 ili T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR stimulisane su sa 1 µg/ml imobilisanog trastuzumaba vezanog za FITC i gajene u kulturi 3 dana, 5 dana ili 7 dana, i izdvojene su ćelije i supernatant. Broj ćelija i stopa preživljavanja analizirani su pomoću bojenja tripan plavim. Rezultati su prikazani na slikama 9 i 10. Na slikama 9 i 10, tamna kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19, svetla kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR, a apscisa prikazuje broj dana gajenja kulture. Statistički značajna razlika proučavana je Studentovim t-testom (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005,
p < 0.001).
(Rezultati)
[0077] Kao što je prikazano na slikama 9 i 10, i proliferacija ćelija i stopa preživljavanja T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 bile su pojačane, što je pokazalo da IL-7 i CCL19 proizvedeni od strane T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19, ispoljava biološke funkcije.
(Broj T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19)
[0078] Uzorak koji sadrži T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 (4 x 10<5>ćelija) ko-stimulisan je pomoću mitomicina C i P815-hCD20 u prisustvu pacovskog IgG2a izotipa kao kontrole, anti-CD127 monoklonskog neutrališućeg antitela, ili anti-CCR7 monoklonskog neutrališućeg antitela. Ćelije su gajene tokom 5 dana, i apsolutni broj živih ćelija određen je upotrebom boje tripan plavo. CD127 predstavlja IL-7 receptor, a CCR7 je CCL19 receptor. Rezultati su prikazani na slici 11. Na slici 11, "kontr. izo." prikazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815-hCD20 u prisustvu pacovskog IgG2a izotipa kao kontrole, "anti-CD127" prikazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815-hCD20 u prisustvu anti CD127 monoklonskog neutrališućeg antitela, i "anti-CCR7" prikazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815-hCD20 u prisustvu anti-CCR7 monoklonskog neutrališućeg antitela. Na slici 11, tamna kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19, a svetla kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR. Za svaki podatak je navedena srednja vrednost ± standardna devijacija za 3 bunarčića. *: P < 0.05,
: P < 0.001.
(Rezultati)
[0079] Kao što je prikazano na slici 11, broj T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 takođe je bio povećan, a njihova stopa ćelijske proliferacije bila je pojačana dok je proliferacija ćelija bila inhibirana sa anti-CD127, čime je pokazano da se pojačanje stope proliferacije odvija preko IL-7 receptora CD127.
Primer 5
[Test migracije T ćelija]
(Test migracije T ćelija upotrebom T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19)
[0080] Hemo-atraktivni efekat CCL19 proučavan je testom migracije ćelija koristeći Transwell sistem. Migraciona svojstva responsivne T ćelije merena su pomoću migracije kroz polikarbonatni filter sa veličinom pore od 5 µm, upotrebom Transwell(R) komora sa 96 bunarčića (Costar, proizvodi kompanija Corning, Inc.). Konkretno, T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL7/CCL19 ili T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR, stimulisane su tokom 3 dana sa 1 µg/ml imobilisanog trastuzumaba vezanog za FITC, u donjoj komori. Responderske T ćelije su pripremljene od slezine ili limfnih čvorova, negativnom selekcijom, uz pomoć (R) (proizvodi firma Miltenyi Biotec GmbH). Responderske T ćelije obeležene su pomoću boje CytoTell Blue (proizvodi je kompanija AAT Bioquest, Inc.) i gajene 3 sata u gornjem sloju. Migracija iz gornje komore u donju komoru ispitivana je protočnom citometrijom. Rezultati su prikazani na slici 12. Na slici 12, tamna kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR IL-7/CCL19, svetla kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR, a ordinata prikazuje apsolutni broj responderskih T ćelija koje su migrirale u donju komoru (isto važi i za slike 13 i 14 u daljem tekstu). Statistički značajna razlika proučavana je Studentovim t-testom (* p < 0.05).
(Rezultati)
[0081] Kao što je prikazano na slici 12, T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 omogućile su da veći broj T ćelija migrira u donju komoru u poređenju sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR. Kod terapije transferom limfocita (npr., T ćelija koje eksprimiraju CAR), oštećenje ćelija raka primenjenim T ćelijama je svakako važno, a osim toga, važno je da se aktiviraju endogene T ćelije (=imunociti domaćina) originalno prisutne kod pacijenta sa rakom i da se time ove ćelije regrutuju kao ćelije koje napadaju ćelije raka. U ovu svrhu, poželjno je, sa tačke gledišta pojačavanja imunoterapeutskih efekata, ne da se limfociti koji imaju antitumorsku aktivnost transferuju ab extra već da se izazove aktivna interakcija između prebačenih T ćelije i endogenih T ćelije nekim pristupom tako da se endogene T ćelije nagomilavaju lokalno u odnosu na rak. Kao što se vidi iz rezultata na slici 12, T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC-CAR-IL-7/CCL19 imale su sposobnost da dovedu do nagomilavanja intrinzičkih T ćelija, pokazujući da aktivna interakcija između prebačenih T ćelija i endogenih T ćelija može da se indukuje.
(Test migracije T ćelija ili dendritskih ćelija upotrebom T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19)
[0082] Uzorak koji sadrži T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 ili T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR (5 x 10<5>ćelija) stimulisan je pomoću imobilisanog trastuzumaba vezanog za FITC ili anti-CD3 monoklonskog antitela u donjoj komori Transwell-a. 3. dana, 4 x 10<5>T ćelije obojenih bojom CytoTell Blue smešteno je na gornju komoru i inkubirano 3 sata ili 5 sati. I ovde je svaki uzorak stimulisan pomoću imobilisanog trastuzumaba vezanog za FITC. 3. dana, 4 x 10<5>dendritskih ćelija obojenih bojom CytoTell Blue smešteno je na gornju komoru i inkubirano 3 sata. Svi tipovi responderskih ćelija koje su migrirale iz gornje komore u donju komoru analizirane su protočnom citometrijom. Rezultati su prikazani na slikama 13 i 14. Na slikama 13 i 14, tamna kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19, a svetla kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR. Na slikama 13 i 14 i slici 15 koja se kasnije pominje, za svaki podatak je navedena srednja vrednost ± standardna devijacija za 3 bunara. *: P < 0.05, **: P < 0.01,
: P < 0.001,
: P < 0.00001,
: P < 5 x 10-5.
(Rezultati)
[0083] Rezultati na slikama 13 i 14 pokazali su da T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 imaju veliku sposobnost da nakupljaju intrinzičke T ćelije i dendritske ćelije.
(Test migracije T ćelija upotrebom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19)
[0084] Uzorak koji sadrži T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 (1 x 10<5>ćelija) gajen je u ko-kulturi sa P815-hCD20 koje su tretirane mitomicinom C, u donjoj Transwell komori. 3. dana, 4 x 10<5>T ćelija obojenih bojom CytoTell Blue smešteno je na gornju komoru i inkubirano 3 sata u prisustvu pacovskog IgG2a izotipa kao kontrole, anti-CD127 monoklonskog antitela ili anti-CCR7 monoklonskog antitela. Responderske T ćelije koje su migrirale iz gornje komore u donju komoru analizirane su protočnom citometrijom. Rezultati su prikazani na slici 15. Na slici 15, "kontr. izo." prikazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815-hCD20 u prisustvu pacovskog IgG2a izotipa kao kontrole, "anti-CD127" prikazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815-hCD20 u prisustvu anti-CD127 monoklonskog neutrališućeg antitela, i "anti-CCR7" prikazuje rezultate dobijene stimulacijom sa P815-hCD20 u prisustvu anti-CCR7 monoklonskog neutrališućeg antitela. Na slici 15, tamna kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19, a svetla kolona prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-human CD20 CAR.
(Rezultati)
[0085] Kao što se vidi iz rezultata na slici 15, T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 takođe su imale veliku sposobnost da nakupljaju intrinzičke T ćelije, a nakupljanje intrinzičkih T ćelija bilo je inhibirano sa anti-CCR7, što pokazuje da nakupljanje intrinzičkih T ćelija funkcioniše preko receptora za CCL19, CCR7.
[0086] Rezultati na slikama 9 do 15 pokazali su da T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 i T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 imaju važne efekte, nezamenjive kad je u pitanju indukovanje imunosti, efikasna proliferacija posredstvom IL-7, visoka stopa preživljavanja, i lokalno nagomilavanje NAKOUPLJANJE T ćelija ili dendritskih ćelija u kanceru posredstvom CCL19, i da imaju odlične efekte na indukovanje imunosti. Ukratko, pokazano je da ekspresija dva kontrolna molekula, tj., "IL-7" i "CCL19", u T ćelijama koje eksprimiraju CAR, omogućava poboljšanje proliferativnog potencijala, stope preživljavanja, i efekata T ćelija koji indukuju imunost.
Primer 6
[Proliferativni potencijal T ćelija]
[0087] Uzorak koji sadrži T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 ili kontrolne T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR (5 x 10<5>ćelija) je obojeno bojom CytoTell Blue (proizvodi je kompanija AAT Bioquest, Inc.), stimulisano imobilisanim trastuzumabom vezanim sa FITC, i zatim analizirano protočnom citometrijom. Rezultati 5. dana po otpočinjanju stimulacije prikazani su na slici 16, a rezultati 3. i 7. dana po otpočinjanju stimulacije prikazani su na slici 17. Na slici 16, brojčane vrednosti na histogramima predstavljaju broj ćelijskih deoba. Na slikama 16 i 17, brojčane vrednosti na kružnim graficima predstavljaju udeo svake merene frakcije (0, 1, 2, 3 ili 4 > broj ćelijskih deoba) na populaciji leukocita.
(Rezultati)
[0088] Rezultati na slikama 16 i 17 pokazali su da je proliferativni potencijal T ćelija koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 povećan u poređenju sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR.
Primer 7
[Ekspresija CD127 ili CCR7 u T ćelijama, dendritskim ćelijama, i T ćelijama koje eksprimiraju CAR]
[0089] Nestimulisane T ćelije slezine (naivne T ćelije), T ćelije slezine stimulisane gajenjem od 2 dana sa anti-CD3 monoklonskim antitelom, anti-CD28 monoklonskim antitelom, i IL-2 (aktivirane T ćelije), nestimulisane dendritske ćelije slezine (dendritske ćelije), i T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR (kontr.) i T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 (7x19) pripremljene aktivacijom na isti način kao u odeljku "Transdukcija mišijih T ćelija" u primeru 1 analizirane su protočnom citometrijom i ispitane na ekspresiju CD127 ili CDR7. T ćelije su bile CD3<+>CD19<->populacija, T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR i T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL 7/CCL19 su bile populacije pozitivne na kuglice dekstrana vezanog za FITC, i dendritske ćelije su bile CD11c<+>populacija. Rezultati ispitivanja ekspresije CD127 su prikazani na slici 18, a rezultati ispitivanja ekspresije CCR7 su prikazani na slici 19. Na ovim crtežima, brojčane vrednosti predstavljaju % pozitivnih ćelija, "kontr." prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR, i "7x19" prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19.
(Rezultati)
[0090] Kao što je prikazano na slici 18, ekspresija CD127 bila je očigledno smanjena u aktiviranim T ćelijama u poređenju sa naivnim T ćelijama, ali je pokazano da je veća u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 nego u aktiviranim T ćelijama i da su predviđene za oporavak naivnih T ćelija. Kao što je prikazano na slici 19, ekspresija CCR7 bila je smanjena aktivacijom u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19, ali je pokazano da se održava na nivou od približno 67% ekspresije naivnih T ćelija. Do sada je bilo poznato da je aktivacijom T ćelija ekspresija CD127 ili CCR7 smanjena na približno 1/2 do 1/3. Dakle, čak i ako se pripreme T ćelije koje eksprimiraju CAR i eksprimiraju IL-7 ili CCL19, smatra se da se efekti IL-7 i CCL19 smanjuju aktivacijom T ćelija koje eksprimiraju CAR. Stoga se obično ne očekuje da ekspresija IL-7 i CCL19 u T ćelijama koje eksprimiraju CAR pojačava efekat indukovanja imunosti ili antitumorsku aktivnost T ćelija koje eksprimiraju CAR. I u ovom testu je bilo moguće potvrditi da je ekspresija CD127 ili CCR7 bila privremeno smanjena 2. dana nakon aktivacije T ćelija. Uprkos tome, pokazano je da je 4. dana uspostavljena prvobitna ekspresija CD127 ili CCR74 u T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19. Ovo pokazuje da je ekspresija IL-7 i CCL19 u T ćelijama koje eksprimiraju CAR korisna za pojačavanje njihovog efekta na indukovanje imunosti ili antitumorsku aktivnost.
Primer 8
[Terapeutski efekat u mišijim modelima tumora]
(Primena T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 kod miševa)
[0091] 5 x 10<5>P815 ćelija mastocitoma koje su genetički modifikovane tako da eksprimiraju humani CD20 (P815-hCD20) inokulisano je potkožno u svakog miša sa rakom (DBA/2 miš). Nakon 3 dana, 3 x 10<6>T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CARIL-7/CCL19 ili T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR primenjeno je intravenski kod miša. Odsustvo tretmana je ustanovljeno kao kontrola tako što je u svakog miša inokulisan P815 mastocitom i nakon toga tretman nije sproveden (bez primene T ćelija koje eksprimiraju CAR). Zapremina mišijeg tumora i stopa preživljavanja mereni su dvaput nedeljno. Prilikom analize zapremine tumora, standardna devijacija je izračunavana za svaku eksperimentalnu grupu. Statistički značajna razlika između 3 grupe, proučavana je Studentovim t-testom u slučaju analize zapremine tumora i logaritamskim testom ranga u slučaju ispitivanja stope preživljavanja (* P < 0.05, ** P < 0.01).
[0092] Rezultati ispitivanja promene zapremina tumora kod miševa, prikazani su na slici 20, a rezultati ispitivanja stope preživljavanja miševa su prikazani na slici 21. Na slikama 20 i 21, svetli krug prikazuje rezultate dobijene primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, tamni krug prikazuje rezultate dobijene primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19, a svetli romboid prikazuje rezultate dobijene u odsustvu primene T ćelija koje eksprimiraju CAR u grupi bez tretmana. Na slici 20, apscisa prikazuje dane nakon intravenske primene ćelija kod miša, a ordinata prikazuje zapreminu tumora (mm<3>) . Na slici 21, apscisa prikazuje nedelje posle intravenske primene ćelija na miša, a ordinata prikazuje stopu preživljavanja (%).
(Rezultati)
[0093] Kao što je prikazano na slikama 20 i 21, potvrđeno je da primena T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 ispoljava efekte smanjenja zapremine tumora i poboljšanje stope preživljavanja (efekat produžavanja perioda preživljavanja) u poređenju sa primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR ili odsustvom primene T ćelija koje eksprimiraju CAR. Pokazano je, dakle, da T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 imaju izvanrednu antitumorsku aktivnost.
(Inokulacija antikancerskog sredstva i T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 u miševe)
[0094] 5 x 10<5>P815-hCD20 ćelija je potkožno inokulisano u svakog miša. Na 10. dan posle inokulacije, antikancersko sredstvo ciklofosfamid (CPA, 100 mg/kg) je primenjeno intraperitonealno kod ovih miševa, i na dan 14., 1 x 10<6>T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 ili T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR T primenjeno je intravenski kod njih. Rezultati ispitivanja stope preživljavanja miševa prikazani su na slici 22, a rezultati ispitivanja zapremine njihovih tumora su prikazani na slikama 23 i 24. Na slikama 22 do 24, apscisa prikazuje dane nakon potkožne inokulacije P815-hCD20 (datum potkožne inokulacije P815-hCD20 kod miševa, definisan je kao dan 0), a ordinata prikazuje stopu preživljavanja (Slika 22) ili zapreminu tumora (duža osa tumora x (kraća osa tumora)<2>/2 (mm<3>)) (slike 23 i 24). "bez tretmana" prikazuje rezultate dobijene u netretiranoj grupi, "CPA" prikazuje rezultate dobijene u grupi kojoj je dat samo CPA, "CPA+kontr." prikazuje rezultate dobijene u grupi kojoj su nakon primene CPA date T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, "CPA+7x19" prikazuje rezultate dobijene u grupi kojoj su nakon primene CPA date T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19, i
označava smrt miša. Slika 24 je dijagram koji prikazuje 1/10 brojčanih vrednosti na ordinati grafika za CPA+7x19, sa slike 23.
(Rezultati)
[0095] Kao što je prikazano na slici 22, pokazano je da kombinovano korišćenje T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 prema predmetnom pronalasku i antikancerskog sredstva ostvaruje veoma visoku stopu preživljavanja. Kao što je prikazano na slikama 23 i 24, pokazano je da kombinovano korišćenje T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 prema predmetnom pronalasku i antikancerskog sredstva dovodi do potpunog iščezavanja tumora. Kao što je prikazano na slici 24, zapremina tumora bila je najveća 10. dana nakon potkožne inokulacije P815-hCD20. U ovom pogledu, kraća osa je bila 4.86 mm do 7.25 mm, duža osa je bila 5.92 mm do 8.39 mm, a zapremina tumora je bila 69.91 mm<3>do 220.50 mm<3>sa prosekom od 140.02 mm<3>. Rezultati opisani prethodno u testu takođe su pokazali da je tumor koji je privremeno proliferisao, nestao uz pomoć tretmana T ćelijama koje eksprimiraju anti humani CD20 CAR-IL-7/CCL19. U slučaju upotrebe T ćelija koje eksprimiraju CAR, prema predmetnom pronalasku, u kombinaciji sa dodatnim antikancerskim sredstvom, poželjno je da se, kako bi se dodatno pojačala antitumorska aktivnost T ćelija koje eksprimiraju CAR prema predmetnom pronalasku, najpre broj limfocita redukuje upotrebom dodatnog antikancerskog sredstva i tek onda primene T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19, kao u postupku koji je prethodno opisan u tekstu. Ovaj postupak može da osnaži in vivo homeostazu T ćelija koje eksprimiraju CAR.
Primer 9
[Efekti infiltracije u tumorska tkiva]
[0096] 5 x 10<5>P815-hCD20 ćelija inokulisano je potkožno u svakog miša. 3. dana nakon inokulacije, 1 x 10<6>T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 primenjeno je na ove miševe. 21. dana nakon inokulacije, tumorska tkiva su isečena. Tkivo svakog miša je podeljeno na dva dela. Jedan od ova dva dela je obojen hematoksilin-eozinom (H&E), a drugi deo je korišćen u imunohistohemijskoj analizi. Imunohistohemijska analiza je sprovedena upotrebom anti-CD4 i anti-CD8 monoklonskih antitela ili kombinacijom anti-CD3 i anti-DEC205 monoklonskih antitela kao primarnih antitela. Alexa Fluor(R) 488-vezan anti-pacovski IgG2a (zeleno) i Alexa Fluor(R) 647-vezan anti-pacovski IgG2b (crveno) korišćeni su kao sekundarna antitela. Jedra ćelija obojena su sa DAPI (plavo). H&E-obojeni uzorci i imuno-obeleženi fragmenti mikroskopom su posmatrani pri uveličanju od x100 ili x200. CD4 i CD8 su markeri T ćelija, a DEC205 je marker za dendritske ćelije. Rezultati H&E bojenja su prikazani na slici 25, a rezultati imunohistohemijske analize su prikazani na slikama 26(a) i 26(b). Rezultati kvantifikacije pozitivnog regiona obeleženog svakom od fluorescentnih boja (CD4 bojenje (crveno), CD8 bojenje (zeleno), CD3 bojenje (crveno), DEC205 bojenje (zeleno), i koegzistencija CD3 i DEC205 (žuto)) upotrebom programa Hybrid Cell Count (proizvodi ga kompanija Keyence Corp.) iz podataka sa slika 26(a) i 26(b), prikazani su na slikama 27(a) i 27(b), redom. Na slikama 25 do 27, "bez tretmana" ili "bez tretm." prikazuje rezultate dobijene u netretiranoj grupi, "kontr." prikazuje rezultate dobijene u grupi tretiranoj T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR i 7x19 prikazuje grupu tretiranu T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19.
(Rezultati)
[0097] Prema rezultatima sa slike 25, tretman T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 ubrzao je nekrozu (regioni označeni strelicama) i uočeni su regioni gde su jedra nestala. Rezultati na slikama 26(a) i 27(a) pokazali su da se T ćelije infiltriraju u tkiva kancera putem tretmana T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL 7/CCL19. Rezultati na slikama 26(b) i 27(b) pokazali su da se dendritske ćelije zajedno sa T ćelijama infiltriraju u tkiva kancera putem tretmana T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19.
Primer 10
[Terapeutski efekat koji nastaje kombinacijom IL-7 i CCL19 na tumor]
[0098] 5 x 10<5>P815-hCD20 ćelija potkožno je inokulisano svakom DBA/2 mišu. 3. dana nakon inokulacije, 1 x 10<6>T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, T ćelija koje eksprimiraju anti-human CD20 CAR-IL-7 koje su eksprimirale samo IL-7 kao faktor koji pojačava imune funkcije (nisu eksprimirale CCL19), T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-CCL19 koje su eksprimirale samo CCL19 kao faktor koji pojačava imune funkcije (nisu eksprimirale IL-7), ili T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 koje su eksprimirale IL-7 i CCL19, intravenski su primenjene kod miševa. Ustanovljena je kontrolna grupa miševa gde nije bilo primene T ćelija koje eksprimiraju CAR koje nisu eksprimirale ni IL-7 ni CCL19. 10. dana nakon primene, izmerene su duža osa i kraća osa tumora, i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata na isti način kao i prethodno. Rezultati su prikazani na slici 28. Na slici 28, "bez tret." prikazuje rezultate dobijene bez primena T ćelija koje eksprimiraju CAR, "kontr. CAR" prikazuje rezultate dobijene primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, "IL-7 CAR" prikazuje rezultate dobijene primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7, "CCL19 CAR" prikazuje rezultate dobijene primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-CCL19, i "IL-7/CCL19 CAR" prikazuje rezultate dobijene primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19.
[0099] T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7 dobijene su pripremom pMSGV vektora koji sadrži anti-humani CD20 CAR-F2A-IL-7 (vektor ekspresije CAR IL-7 -anti-humani CD20) i transferom ovog vektora u mišije T ćelije na isti način kao u odeljku "Transdukcija mišijih T ćelija" primera 1. Slično tome, T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CARCCL19 dobijene su pripremom pMSGV vektora koji sadrži anti-humani CD20 CAR-F2A-CCL19 (vektor ekspresije CAR CCL19 -anti-humani CD20) i transferom ovog vektora u mišije T ćelije na isti način kao u odeljku "Transdukcija mišijih T ćelije" primera 1. Priprema svakog vektora sprovedena je u skladu sa postupkom "Priprema vektora ekspresije anti-FITC CAR za ekspresiju IL-7 i CCL19" ili "Priprema vektora ekspresije anti-CD20 CAR za ekspresiju IL-7 i CCL19" primera 1. Sekvenca na pozicijama 1 do 462 i stop kodon koji sledi iza ovih pozicija iz SEQ ID NO: 9 korišćena je kao sekvenca koja kodira IL-7. Sekvenca na pozicijama 538 do 864 iz SEQ ID NO: 9 korišćena je kao sekvenca koja kodira CCL19. Rezultati su prikazani na slici 28.
(Rezultati)
[0100] Kao što je prikazano na slici 28, primena T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7 ili T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-CCL19, prikazala je inhibitorni efekat na rast tumora samo jednak ili malo manji od efekta dobijenog primenom kontrolnih T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, dok je tumor skoro nestao primenom T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19. Dakle, iako IL-7 ili CCL19 sami skoro da nemaju inhibitorni efekat na rast tumora, pokazano je da kombinacija IL-7 i CCL19 proizvodi veoma veliki inhibitorni efekat na rast tumora.
Primer 11
[Citotoksična aktivnost protiv tumorskih ćelija u testu oslobađanja<51>Cr - 1]
(Odabir faktora koji pojačava imune funkcije T ćelija)
[0101] U mikrookolini tkiva raka, inhibitorni signali se provode do imunocita tako da se inhibira antitumorski imuni odgovor čime se prigušuje efekat imunoterapije. Inhibitorni signali se provode do imunocita pomoću SHP-1 ili SHP-2. Dakle, kod T ćelijske terapije raka, antitumorski efekat može da se osnaži tako što će T ćelijama biti omogućeno da same proizvedu dominantni negativni mutant koji inhibira efekat SHP-1 ili SHP-2. U skladu sa tim, pripremljen je vektor za koekspresiju dominantno-negativnog mutanta koji inhibira efekte SHP-1 ili SHP-2 i CAR-a, i ispitana je citotoksična aktivnost protiv tumorskih ćelija.
(Priprema vektora ekspresije CAR za ekspresiju dominantno-negativnog mutanta SHP1 ili SHP2)
[0102] Fragment DNK koji kodira dominantno-negativni mutant mišijeg SHP1 (SHP1DN), a koji sadrži mutaciju katalitičkog cisteinskog ostatka na poziciji 453 u serin (C453S), pripremljen je pomoću PCR-posredovane mesto-specifične mutageneze. Fragment DNK koji kodira dominantno-negativni mutant mišijeg SHP2 (SHP2DN) sadrži mutaciju katalitičkog cisteinskog ostatka na poziciji 459 u serin (C459S) sintetisala je kompanija Life Technologies Corp. i on je korišćen. Nukleotidna sekvenca koji kodira mišiji SHP1DN prikazana je u SEQ ID NO: 11, a nukleotidna sekvenca koji kodira mišiji SHP2DN prikazana je u SEQ ID NO: 12. 3 baze na pozicijama 1357 do 1359 u SEQ ID NO: 11 i na pozicijama 1375 do 1377 u SEQ ID NO: 12 predstavljaju mutirana mesta. DNK fragmenti koji kodiraju SHP1DN ili SHP2DN inserirani su u MCS pMSGV vektora koji sadrži T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 scFv CAR-F2A-MCS tokom pripreme vektora ekspresije CAR IL-7/CCL19-anti-humani CD20 u primeru 2, kako bi se dobili vektor ekspresije CAR SHP1DN-anti-humani CD20 i vektor ekspresije CAR SHP2DN-anti-humani CD20, redom. Mape dobijenih vektora su prikazane na slici 29.
(Transdukcija mišijih T ćelija)
[0103] Vektor ekspresije CAR SHP1DN -anti-humani CD20 ili vektor ekspresije CAR SHP2DN -anti-humani CD20 prebačeni su u mišije T ćelije na isti način kao u primeru 1 kako bi se dobile T ćelije koje eksprimiraju CAR-SHP1DN anti-humani CD20 i T ćelije koje eksprimiraju CAR SHP2DN anti-humani CD20, redom. T ćelije koje eksprimiraju CAR anti-humani CD20, pripremljene u primeru 1, korišćene su kao kontrola.
(Citotoksična aktivnost protiv tumorskih ćelija u testu oslobađanja<51>Cr)
[0104] Citotoksična aktivnost T ćelije koje eksprimiraju CAR, protiv tumora, merena je standardnim 4-časovnim testom oslobađanja<51>Cr. P815 koje eksprimiraju humani CD20 (P815-hCD20) korišćene su kao ciljne ćelije tumora. Ćelije tumora su sakupljene, gajene u kulturi na 37°C tokom 1 sata u prisustvu 100 µCi Na2<51>CrO4, i zatim isprane 3 puta. Tumorske ćelije su zatim gajene u ko-kulturi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, anti-humani CD20 CAR-SHP1DN, ili anti-humani CD20 CAR-SHP2DN kao efektorskim T ćelijama. Odnos efektorske/ciljne ćelije podešavan je na 0.6, 1.25, 2.5, 5, ili 10. Maksimalno oslobađanje i spontano oslobađanje ciljnih ćelija mereno je tako što su ćelije gajene u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži 10% Triton-X (proizvodi ga kompanija Sigma-Aldrich Co. LLC.) ili u samom medijumu za ćelijsku kulturu. Oslobađanje<51>Cr supernatanta mereno je upotrebom scintilacionog brojača TopCount (proizvodi ga kompanija PerkinElmer, Inc.). Procenat specifične citotoksičnosti izračunavan je prema jednačini: specifična citotoksičnost (%) = [(testirano oslobađanje - spontano oslobađanje) / (maksimalno oslobađanje – spontano oslobađanje)] x 100. Rezultati su prikazani na slici 30. Na slici 30(a), svetli krug prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR, a tamni krug prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR-SHP1DN. Na slici 30(b), svetli krug prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, a tamni krug prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR SHP2DN. Apscisa pokazuje odnos između efektorskih (T ćelije) i ciljnih (ćelije tumora) ćelija pomoću E/T odnosa, a ordinata prikazuje specifičnu citotoksičnost (%). Statistički značajna razlika je proučavana Studentovim t-testom (* p < 0.05).
[0105] Kao što je prikazano na slici 30, pokazano je da T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-SHP1DN i T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-SHP2DN, imaju značajno višu citotoksičnu aktivnost protiv tumorskih ćelija nego T ćelije koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR.
Primer 12
[Citotoksična aktivnost protiv tumorskih ćelija u testu oslobađanja<51>Cr -2]
[0106] P815-hCD20 (1 x 10<4>ćelija/bunarčiću) pomešane su sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR (kontr., krug) ili sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 (7x19, kvadrat) pri odnosu efektorske /ciljne (E/T) ćelije od 0.15625, 0.3125, 0.625, 2.5, 5 ili 10 u prisustvu neobeleženog (Ab, svetlo) ili rituksimaba vezanog za FITC (FITC-Ab, tamno). Na isti način kao što je prethodno dato, mereno je oslobađanje<51>Cr u supernatantu i izračunat je procenat citotoksične aktivnosti. Rezultati su prikazani na slici 31. Na slici 31, "taman krug" prikazuje rezultate dobijene mešanjem sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR u prisustvu rituksimaba vezanog za FITC, "svetli krug" prikazuje rezultate dobijene mešanjem sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR u prisustvu neobeleženog rituksimaba, "taman kvadrat" prikazuje rezultate dobijene mešanjem sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 u prisustvu rituksimaba vezanog za FITC, i "svetli kvadrat" prikazuje rezultate dobijene mešanjem sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 u prisustvu neobeleženog rituksimaba.
[0107] 815-hCD20 (1 x 10<4>ćelija/bunarčiću) su pomešane sa T ćelijama koje eksprimiraju antihumani CD20 CAR ili T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 pri odnosu efektorske /ciljne (E/T) ćelije od 0.3125, 0.625, 2.5, 5, 10, ili 20. Na isti način kao što je prethodno dato, mereno je oslobađanje 51Cr u supernatantu i izračunat je procenat citotoksične aktivnosti. Rezultati su prikazani na slici 32. Na slici 32, "taman krug" prikazuje rezultate dobijene mešanjem sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19, i the "svetli krug" prikazuje rezultate dobijene mešanjem sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR.
(Rezultati)
[0108] Kao što je prikazano na slikama 31 i 32, pokazano je da T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR-IL-7/CCL19 zadržavaju citotoksičnu aktivnost po ćeliji, protiv tumorskih ćelija, na istom nivou kao i T ćelije koje eksprimiraju anti-FITC CAR. Slično tome, pokazano je da T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 zadržavaju citotoksičnu aktivnost po ćeliji, protiv tumorskih ćelija, na istom nivou kao i T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR.
Primer 13
[In vivo preživljavanje T ćelija koje eksprimiraju CAR i diferencijacija u memorijske T ćelije]
(Analiza protočnom citometrijom)
[0109] 5 x 10<5>P815-hCD20 ćelija inokulisano je potkožno u svakog DBA/2 miša. 10. dana nakon inokulacije, antikancersko sredstvo ciklofosfamid (CPA, 100 mg/kg) intraperitonealno je primenjeno kod ovih miševa, i na dan 14, 1 x 10<6>T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL 7/CCL19 ili T ćelija koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR primenjeno je intravenski kod ovih miševa. Na dan 21 posle primene T ćelija koje eksprimiraju CAR, izolovani su leukociti iz slezine ili regionalnih limfnih čvorova tumora (subaksilarno područje nadlaktica i prepona).
Rezultati CD4, CD8, CD44 i CD62L analize površinskih fenotipova leukocita protočnom citometrijom prikazani su na slici 33. Leukociti iz slezine stimulisani su gajenjem u toku 4 dana sa P815-hCD20 koje su tretirane mitomicinom C. Rezultati ispitivanja proliferacije T ćelija protočnom citometrijom su prikazani na slici 34. Ekspresija CAR potvrđena je upotrebom biotinilovanog proteina L i APC-vezanog streptavidina. Na slici 33, brojke predstavljaju odnose respektivnih regiona određenih na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama (CD62L<+>CD44-: naivne T ćelije, CD62L<+>CD44<+>: centralne memorijske T ćelije, CD62L-CD44<+>: efektorske memorijske T ćelije). Na slici 34, brojke predstavljaju odnos protein L-pozitivnih T ćelija. Na slikama 33 i 34, "kontr." prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR, a "7x19" prikazuje rezultate u vezi sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19.
(Rezultati)
[0110] Rezultati prikazani na slikama 33 i 34 pokazali su da je broj memorijskih T ćelija povećan u slezinama i limfnim čvorovima miševa kojima su date T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL 7/CCL19 i T ćelije koje eksprimiraju anti-humani CD20 CAR-IL-7/CCL19 i koje preživljavaju u miševima, snažno proliferišu kada se gaje u kulturi zajedno sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju humani CD20. Zajedno sa rezultatima za stopu preživljavanja na slikama 21 i 22, ovi rezultati ukazuju na to da T ćelije koje eksprimiraju CAR prema predmetnom pronalasku efikasno preživljavaju in vivo u recipijentu i da takođe imaju sposobnost da unište ćelije raka i poboljšaju stopu preživljavanja tako što postaju memorijske T ćelije, a takođe su pokazali i da su T ćelije koje eksprimiraju CAR prema predmetnom pronalasku efikasne za sprečavanje recidiva raka.

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Postupak za dobijanje T ćelija koje eksprimuju himerni receptor antigena (CAR), interleukin-7 i CCL19, koji obuhvata uvođenje nukleinske kiseline koja kodira CAR i nukleinske kiseline koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija pomoću jednog ili više vektora u T-ćelije u kojoj nukleinska kiselna koja kodira faktor koji pojačava imune funkcije T ćelija se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira interleukin-7 i nukleinske kiseline koja kodira CCL19.
2. Postupak za dobijanje T ćelija prema zahtevu 1, koji obuhvata uvođenje u T ćeliju vektora koji se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira CAR, nukleinske kiseline koja kodira interleukin-7 i nukleinske kiseline koja kodira CCL19.
3. Postupak za dobijanje T ćelije prema zahtevu 2, u kome nukleinska kiselina koja kodira CAR i nukleinska kiselina koja kodira interleukin-7, i nukleinska kiselina koja kodira interleukin-7 i nukleinska kiselina koja kodira CCL19, su povezane preko nukleinske kiseline koja kodira samoisecajući peptid.
4. Postupak za dobijanje T ćelija prema zahtevu 1, koji obuhvata uvođenje u T ćeliju vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira interleukin-7, i vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR i nukleinsku kiselinu koja kodira CCL19.
5. Postupak za dobijanje T ćelije prema zahtevu 4, gde nukleinska kiselina koja kodira CAR i nukleinska kiselina koja kodira interleukin-7, i nukleinska kiselina koja kodira CAR i nukleinska kiselina koja kodira CCL19, tim redom, su povezane preko nukleinske kiseline koja kodira samoisecajući peptid.
6. Postupak za dobijanje T ćelije prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde CAR sadrži jednolančano antitelo koje prepoznaje antigen izabran iz grupe koju čine CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR varijanta, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mezotelin, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, IgG kapa lanac, folatni receptor-alfa, PSCA, i EpCAM.
7. Postupak za dobijanje T ćelija prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde nukleinska kiselina koja kodira CAR sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid CD8 transmembranskog regiona.
8. Postupak za dobijanje T ćelija prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde nukleinska kiselina koja kodira CAR sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide CD28 intracelularnog regiona, 4-1BB intracelularnog regiona, i CD3ζ intracelularnog regiona.
9. Postupak za dobijanje T ćelija prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde je vektor retrovirusni vektor.
10. Antikancersko sredstvo koje sadrži T ćeliju koja eksprimuje CAR, interleukin-7 i CCL19 i farmaceutski prihvatljiv aditiv, gde CAR sadrži jednolančano antitelo koje prepoznaje antigen izabran iz grupe koju čine CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR varijanta, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mezotelin, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, IgG kapa lanac, folatni receptor-alfa, PSCA, i EpCAM.
11. T ćelija koja eksprimuje CAR, interleukin-7 i CCL19, gde CAR sadrži jednolančano antitelo koje prepoznate antigen izabran iz grupe koju čine CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR varijanta, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mezotelin, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, IgG kapa lanac, folatni receptor alfa, PSCA, i EpCAM.
RS20220895A 2014-10-09 2015-10-06 Vektor ekspresije car i t ćelije koje eksprimiraju car RS63601B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014208200 2014-10-09
EP19196196.0A EP3597742B1 (en) 2014-10-09 2015-10-06 Car expression vector and car-expressing t cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63601B1 true RS63601B1 (sr) 2022-10-31

Family

ID=55652864

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191315 RS59441B1 (sr) 2014-10-09 2015-10-06 Car ekspresioni vektor i t ćelije koje eksprimiraju car
RS20220895A RS63601B1 (sr) 2014-10-09 2015-10-06 Vektor ekspresije car i t ćelije koje eksprimiraju car

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191315 RS59441B1 (sr) 2014-10-09 2015-10-06 Car ekspresioni vektor i t ćelije koje eksprimiraju car

Country Status (29)

Country Link
US (3) US10316102B2 (sr)
EP (2) EP3205720B1 (sr)
JP (6) JP6161098B2 (sr)
KR (1) KR101890638B1 (sr)
CN (1) CN107109421B (sr)
AU (1) AU2015329444B2 (sr)
BR (1) BR112017006710B1 (sr)
CA (1) CA2962375C (sr)
CY (1) CY1122324T1 (sr)
DK (2) DK3597742T3 (sr)
ES (2) ES2927366T3 (sr)
HR (2) HRP20191839T1 (sr)
HU (2) HUE046710T2 (sr)
IL (1) IL251504B (sr)
LT (2) LT3597742T (sr)
MX (1) MX358472B (sr)
MY (1) MY167722A (sr)
NZ (1) NZ730382A (sr)
PH (1) PH12017500596B1 (sr)
PL (2) PL3597742T3 (sr)
PT (2) PT3205720T (sr)
RS (2) RS59441B1 (sr)
RU (1) RU2670147C1 (sr)
SG (1) SG11201702391RA (sr)
SI (2) SI3205720T1 (sr)
SM (1) SMT201900663T1 (sr)
TW (1) TWI688651B (sr)
WO (1) WO2016056228A1 (sr)
ZA (1) ZA201701968B (sr)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20191839T1 (hr) * 2014-10-09 2020-01-24 Yamaguchi University Car ekspresijski vektor i t stanice koje eksprimiraju car
GB201509413D0 (en) * 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
CA3013479A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Carl NOVINA Immunotherapy compositions and methods
MY190565A (en) * 2016-03-17 2022-04-27 Univ Yamaguchi Immunocompetent cell and expression vector expressing regulatory factors of immune function
CA3048312A1 (en) * 2017-01-01 2018-07-05 Chi-Yu Gregory Lee Rp215 chimeric antigen receptor construct and methods of making and using same
US11718663B2 (en) 2017-01-10 2023-08-08 Yamaguchi University Anti-GPC3 antibody
EP4495141A3 (en) 2017-03-27 2025-04-23 Noile-Immune Biotech, Inc. Chimeric antigen receptor
CN108484777B (zh) * 2017-03-31 2022-07-12 李吉祐 人源化rp215单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用
EP4265634A3 (en) * 2017-10-10 2024-01-24 National University Corporation Tottori University Enhancer for t-cells or b-cells having memory function, malignant tumor recurrence inhibitor, and inducer for inducing memory function in t-cells or b-cells
US20200323920A1 (en) 2017-12-24 2020-10-15 Noile-Immune Biotech, Inc. Immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, il-7 and ccl19
US20210052646A1 (en) * 2017-12-27 2021-02-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleic-acid containing lipid nano-particle and use thereof
CN108641001A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 结肠癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108641000A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 肝癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108659133A (zh) * 2018-04-26 2018-10-16 上海怡豪生物科技有限公司 肺癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CA3100446A1 (en) * 2018-05-15 2019-11-21 Carsgen Therapeutics Co., Ltd. Genetically engineered cell and application thereof
KR20190141511A (ko) * 2018-06-14 2019-12-24 주식회사 녹십자랩셀 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포
CN108866004A (zh) * 2018-06-26 2018-11-23 奥妙生物技术（广州）有限公司 Shp-1敲除的t细胞及其构建方法
WO2020006312A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeting of multiple antigens with multiplex car t cells in solid and liquid malignancies
JPWO2020017479A1 (ja) * 2018-07-17 2021-08-02 ノイルイミューン・バイオテック株式会社 抗ｇｐｃ３一本鎖抗体を含むｃａｒ
CN109055430A (zh) * 2018-08-14 2018-12-21 杭州荣泽生物科技有限公司 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法
JPWO2020045610A1 (ja) * 2018-08-31 2021-08-26 ノイルイミューン・バイオテック株式会社 Ｃａｒ発現ｔ細胞及びｃａｒ発現ベクター
EP3848387A4 (en) * 2018-09-05 2022-06-22 Kong, Seogkyoung CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR SOLID TUMOR AND T-CELLS EXPRESSING A CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR
US20220096544A1 (en) * 2018-09-20 2022-03-31 Cafa Therapeutics Limited Chemokine expressing cell and use thereof
EP3864142A4 (en) * 2018-10-12 2023-07-19 iCell Gene Therapeutics LLC CHEMERA ANTIGEN RECEPTORS (CARs), COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CN109504660B (zh) * 2018-11-02 2021-08-06 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
CN113286813A (zh) * 2018-11-19 2021-08-20 得克萨斯大学体系董事会 用于car和tcr转导的模块化多顺反子载体
CA3131839A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Autolus Limited Compositions and methods comprising engineered chimeric antigen receptor and modulator of car
JP7585228B2 (ja) * 2019-04-04 2024-11-18 上海医薬集団股▲フン▼有限公司 腫瘍抗原認識受容体を有する免疫細胞とその応用
CN112080526A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 表达il-7和car的表达载体及免疫细胞
CN112080525A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种改良型嵌合抗原受体t细胞的制备
JP7769325B2 (ja) * 2019-07-23 2025-11-13 株式会社東芝 Ｃａｒ－ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
JP7436056B2 (ja) 2019-10-28 2024-02-21 ノイルイミューン・バイオテック株式会社 がんを治療するための医薬、組み合わせ医薬、医薬組成物、免疫応答性細胞、核酸送達媒体、及び製品
CN110922490B (zh) * 2019-12-05 2023-03-03 浙江启新生物技术有限公司 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用
US20230212254A1 (en) * 2020-02-14 2023-07-06 Beijing Yongtai Ruike Biotechnology Company Ltd Immune cells overexpressing cell signaling regulatory factor introduced from outside and use thereof
JP2021142158A (ja) * 2020-03-12 2021-09-24 株式会社三洋物産 遊技機
JP2021142159A (ja) * 2020-03-12 2021-09-24 株式会社三洋物産 遊技機
JP2021142156A (ja) * 2020-03-12 2021-09-24 株式会社三洋物産 遊技機
CN113528483B (zh) * 2020-04-22 2024-08-16 复星凯特生物科技有限公司 Shp2特异性失活突变蛋白及其在car-t治疗中应用
GB202006820D0 (en) * 2020-05-07 2020-06-24 Autolus Ltd Cell
US20230257705A1 (en) 2020-06-17 2023-08-17 Kyoto University Chimeric antigen receptor-expressing immunocompetent cells
KR102297396B1 (ko) 2020-07-29 2021-09-06 (주)티카로스 면역시냅스를 안정화시키는 키메라 항원 수용체(car) t 세포
US20250270320A1 (en) 2020-12-10 2025-08-28 Eutilex Co., Ltd. Anti-pd-1 antibody and uses thereof
CN114717203B (zh) * 2020-12-22 2023-06-27 广东东阳光药业有限公司 一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途
CN114716548B (zh) 2021-01-05 2024-11-05 (株)爱恩德生物 抗-fgfr3抗体及其用途
CN112961248B (zh) * 2021-02-22 2022-03-18 广州百暨基因科技有限公司 共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用
WO2022245098A1 (ko) 2021-05-18 2022-11-24 주식회사 바이오솔루션 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법
WO2023007431A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Engineered immune cell that specifically targets mesothelin and uses thereof
CN113913385A (zh) * 2021-09-01 2022-01-11 苏州璞惠卓越生物科技有限公司 一种抑制蛋白阻断型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其用途
CN113921082B (zh) * 2021-10-27 2023-04-07 云舟生物科技(广州)股份有限公司 基因搜索权重调整方法、计算机存储介质及电子设备
US20250230215A1 (en) * 2021-11-08 2025-07-17 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Immune cells expressing glucose transporter 5 (glut5) and compositions and methods including the same
WO2023223292A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of producing engineered immune cells
US12006353B2 (en) 2022-07-25 2024-06-11 Long Chen Application of SCFV protein, car gene expression vector, CAR-T cell and application thereof
IL318546A (en) 2022-07-26 2025-03-01 Aimed Bio Inc Anti-ROR1 antibody and its uses
CN115505601B (zh) * 2022-10-17 2024-05-28 深圳市先康达生命科学有限公司 一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5857318A (ja) * 1981-10-01 1983-04-05 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 癌細胞障害性リンパ球の製造法
CA2425862C (en) 2000-11-07 2013-01-22 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
KR20050118057A (ko) * 2004-04-24 2005-12-15 김상희 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로함유하는 항암제 및 건강식품
TWI436775B (zh) * 2007-08-24 2014-05-11 Oncotherapy Science Inc 以抗原胜肽合併化療藥劑治療胰臟癌
KR101361416B1 (ko) 2008-10-08 2014-02-21 인트렉손 코포레이션 다수의 면역조절자를 발현하는 조작된 세포 및 그 용도
PH12013501201A1 (en) * 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CA2821080C (en) 2010-12-14 2021-02-02 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
ES2872077T3 (es) 2011-04-08 2021-11-02 Us Health Receptor de antígenos quiméricos anti-variante III del receptor de factor de crecimiento epidérmico y uso de los mismos para el tratamiento de cáncer
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
ES2795023T3 (es) * 2011-09-16 2020-11-20 Baylor College Medicine Reconocimiento específico del microambiente tumoral mediante el uso de células NKT manipuladas
WO2013051718A1 (ja) 2011-10-07 2013-04-11 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
JP6850528B2 (ja) 2012-02-13 2021-03-31 シアトル チルドレンズ ホスピタル ドゥーイング ビジネス アズ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート 二重特異性キメラ抗原受容体およびその治療的使用
ES2959443T3 (es) 2012-02-22 2024-02-26 Univ Pennsylvania Uso del dominio de señalización de CD2 en receptores de antígenos quiméricos de segunda generación
CN102625373A (zh) 2012-02-22 2012-08-01 中兴通讯股份有限公司 一种智能载波管理方法及装置
HRP20191839T1 (hr) * 2014-10-09 2020-01-24 Yamaguchi University Car ekspresijski vektor i t stanice koje eksprimiraju car

Also Published As

Publication number Publication date
MX2017004393A (es) 2017-06-22
US10316102B2 (en) 2019-06-11
JP7527049B2 (ja) 2024-08-02
SI3205720T1 (sl) 2020-01-31
KR101890638B1 (ko) 2018-08-22
JP7755890B2 (ja) 2025-10-17
TW201619377A (zh) 2016-06-01
IL251504B (en) 2020-03-31
MX358472B (es) 2018-08-21
MY167722A (en) 2018-09-21
AU2015329444A1 (en) 2017-04-13
JP2020108398A (ja) 2020-07-16
PL3597742T3 (pl) 2022-11-14
SI3597742T1 (sl) 2022-11-30
ES2751945T3 (es) 2020-04-02
PH12017500596A1 (en) 2017-08-30
ES2927366T3 (es) 2022-11-04
EP3597742B1 (en) 2022-07-13
KR20170067773A (ko) 2017-06-16
DK3597742T3 (da) 2022-10-03
JP2017153487A (ja) 2017-09-07
PT3205720T (pt) 2019-10-28
RU2670147C1 (ru) 2018-10-18
SG11201702391RA (en) 2017-04-27
ZA201701968B (en) 2019-06-26
HRP20221211T1 (hr) 2022-12-09
PL3205720T3 (pl) 2020-02-28
AU2015329444B2 (en) 2017-11-23
PH12017500596B1 (en) 2018-10-05
DK3205720T3 (da) 2019-10-07
BR112017006710A2 (pt) 2017-12-12
LT3597742T (lt) 2022-09-12
RS59441B1 (sr) 2019-11-29
HUE046710T2 (hu) 2020-03-30
CA2962375C (en) 2020-07-14
EP3597742A1 (en) 2020-01-22
JP2023116674A (ja) 2023-08-22
CA2962375A1 (en) 2016-04-14
US10906984B2 (en) 2021-02-02
NZ730382A (en) 2019-01-25
JP6683990B2 (ja) 2020-04-22
US20170291953A1 (en) 2017-10-12
JPWO2016056228A1 (ja) 2017-06-01
EP3205720B1 (en) 2019-09-11
JP2022048153A (ja) 2022-03-25
WO2016056228A1 (ja) 2016-04-14
SMT201900663T1 (it) 2020-01-14
HUE060047T2 (hu) 2023-01-28
CY1122324T1 (el) 2021-01-27
HRP20191839T1 (hr) 2020-01-24
LT3205720T (lt) 2019-12-10
IL251504A0 (en) 2017-05-29
CN107109421A (zh) 2017-08-29
JP6161098B2 (ja) 2017-07-12
EP3205720A4 (en) 2018-07-04
TWI688651B (zh) 2020-03-21
US20210253726A1 (en) 2021-08-19
EP3205720A1 (en) 2017-08-16
BR112017006710B1 (pt) 2020-01-21
CN107109421B (zh) 2018-09-25
JP7008350B2 (ja) 2022-02-10
JP7300763B2 (ja) 2023-06-30
PT3597742T (pt) 2022-08-30
US20190322755A1 (en) 2019-10-24
JP2024150546A (ja) 2024-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7527049B2 (ja) Ｃａｒ発現ベクター及びｃａｒ発現ｔ細胞
US20240307451A1 (en) Immunocompetent cell and expression vector expressing regulatory factors of immune function, and chimeric antigen receptor
KR102830462B1 (ko) 인간 메소텔린을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, il-7, 및 ccl19 를 발현하는 면역 담당 세포
CA3057811A1 (en) Chimeric antigen receptor
CN115885038A (zh) 表达嵌合抗原受体的免疫活性细胞
HK1235426B (en) Car expression vector and car-expressing t cells
HK1235426A1 (en) Car expression vector and car-expressing t cells