[go: up one dir, main page]

RS63427B1 - Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti modifikacije ciljnog gena korišćenjem genske reparacije posredovane oligonukleotidom - Google Patents

Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti modifikacije ciljnog gena korišćenjem genske reparacije posredovane oligonukleotidom

Info

Publication number
RS63427B1
RS63427B1 RS20220618A RSP20220618A RS63427B1 RS 63427 B1 RS63427 B1 RS 63427B1 RS 20220618 A RS20220618 A RS 20220618A RS P20220618 A RSP20220618 A RS P20220618A RS 63427 B1 RS63427 B1 RS 63427B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sequence
dna
gron
nucleic acid
gene
Prior art date
Application number
RS20220618A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter R Beetham
Gregory F W Gocal
Christian Schopke
Noel Joy Sauer
James Pearce
Rosa Segami
Jerry Mozoruk
Original Assignee
Cibus Us Llc
Cibus Europe Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cibus Us Llc, Cibus Europe Bv filed Critical Cibus Us Llc
Publication of RS63427B1 publication Critical patent/RS63427B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
OBLAST PREDMETNOG PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak generalno se odnosi na nove postupke za poboljšanje efikasnosti ciljanja modifikacija na specifičnim lokacijama u genomskim ili drugim nukleotidnim sekvencama. Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na ciljanu DNK koja je modifikovana, mutirana ili obeležena pristupima koji su ovde stavljeni na uvid javnosti. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćelije, tkiva, i organizme koji su modifikovani postupcima predmetnog pronalaska.
STANJE TEHNIKE PREDMETNOG PRONALASKA
[0002] Sledeća diskusija o stanju tehnike pronalaska obezbeđena je samo da pomogne čitaocu da razume predmetni pronalazak i nije dozvoljeno da opisuje ili konstituiše stanje tehnike ovog predmetnog pronalaska.
[0003] Modifikacija genomske DNK je u centru napretka u biotehnologiji, uopšte, a posebno medicinskog napreka zasnovanog na biotehnologiji. Efikasni postupci genomske modifikacije usmereni na mesto su poželjni za istraživanje i eventualno za primene genske teperapije. Jedan pristup koristi oligonukleotide koji formiraju tripleks (TFO - triplex-forming oligonucleotides) koji se vezuju kao treći lanci za dupleks DNK na način specifičan za sekvencu, da bi posredovali u usmerenoj mutagenezi. Takav TFO može delovati ili isporukom vezanog mutagena ili, kao što su psoralen ili hlorambucil (Havre i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, SAD 90:7879-7883, 1993; Havre i sarad., J Virol 67:7323-7331, 1993; Wang i sarad., Mol Cell Biol 15:1759-1768, 1995; Takasugi i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, SAD 88:5602-5606, 1991; Belousov i sarad., Nucleic Acids Res 25:3440-3444, 1997), ili vezivanjem sa dovoljnim afinitetom da izazove popravku sklonu greškama (Wang i sarad., Science 271:802-805, 1996).
[0004] Druga strategija za genomsku modifikaciju uključuje indukciju homolognu rekombinaciju između fragmenta egzogene DNK i ciljanog gena. Ovaj pristup je uspešno korišćen za ciljanje i ometanje odabranih gena u ćelijama sisara i omogućio je proizvodnju transgenih miševa koji nose specifične nokaut (eng. knockout) gene (Capeechi i sarad., Science 244:1288-1292, 1989; U.S. Pat. Br.4,873,191 od Wagner-a). Ovaj pristup se, međutim, oslanja na transfer selektivnih markera kako bi se omogućilo izolovanje željenih rekombinanata. Bez selekcije, odnos homologne i nehomologne integracije transficirane DNK u tipičnim eksperimentima prenosa gena je nizak, obično u rasponu od 1:1000 ili manje (Sedivy i sarad., Gene Targeting, W. H. Freeman and Co., Njujork, 1992). Ova niska efikanost homologne integracije ograničava korisnost transfera gena za eksperimentalnu upotrebu ili gensku terapiju. Učestalost homologne rekombinacije može se povećati oštećenjem ciljnog mesta od UV zračenja i odabranih kancerogena (Wang i sarad., Mol Cell Biol 8:196-202, 1988) kao i endonukleazama specifičnim za mesto (Sedivy i sarad., Gene Targeting, W. H. Freeman and Co., Njujork, 1992; Rouet i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, SAD 91:6064-6068, 1994; Segal i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, U.S.A. 92:806-810, 1995). Pored toga, oštećenje DNK izazvano fotoaduktima psoralena usmerenim na tripleks može stimulisati rekonbinaciju unutar i između ekstrahromozomskih vektora (Segal i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, SAD 92:806-810, 1995; Faruqi i sarad., Mol Cell Biol 16:6820-6828, 1996; U.S. Pat. Br.
5,962,426 od Glazer-a).
[0005] Drugi rad je pomogao da se definišu parametri koji utiču na rekombinaciju u ćelijama sisara. Generalno, linearni fragmenti donora su rekombinogeniji od njihovih kružnih parnjaka (Folger i sarad., Mol Cell Biol 2:1372-1387, 1982). Na rekombinaciju takođe utiče dužina neprekinute homologije između donorskog i ciljnog mesta, sa kratkim fragmentima koji izgledaju kao neefikasna podloga za rekombinaciju (Rubnitz i sarad., Mol Cell Biol 4:2253-2258, 1984). Bez obzira na to, nekoliko nedavnih napora je fokusirano na upotrebu kratkih fragmenata DNK ili DNK/RNK hibrida za korekciju gena. (Kunzelmann i sarad., Gene Ther 3:859-867, 1996).
[0006] Svojstva vezivanja TFO-a specifična za sekvencu su korišćena za isporuku serije različitih molekula na ciljna mesta u DNK. Na primer, dijagnostički postupak za ispitivanje tripleks interakcija koristila je TFO spojen sa Fe-EDTA, agensom za cepanje DNK (Moser i sarad., Science 238:645-650, 1987). Drugi su povezivali biološki aktivne enzime kao što su mikrokokna nukleaza i streptokokna nukleaza sa TFO i demonstrirali cepanje DNK specifično za mesto (Pei i sarad., Proc Nat'l Acad Sci SAD 87:9858-9862, 1990; Landgraf i sarad., Biochemistry 33:10607-10615, 1994). Štaviše, oštećenje DNK usmereno na mesto i mutageneza se mogu postići korišćenjem TFO konjugovanog bilo sa psoralenom (Havre i sarad., Proc Nat'l Acad Sci SAD 90:7879-7883, 1993; Takasurgi i sard., Proc Nat'l Acad Sci SAD 88:5602-5606, 1991) bilo sa agensima za alkilovanje (Belousov i sarad., Nucleic Acids Res 25:3440-3444, 1997; Posvic i sarad., J Am Chem Soc 112:9428-9430, 1990).
[0007] WIPO Patentna Prijava WO/2001/025460 opisuje postupke za mutiranje ciljne DNK sekvence biljke koji uključuju korake (1) elektroporacije u mikrosporu biljke rekombinogene oligonukleobaze koja sadrži prvi homologni region koji ima sekvencu identičnu sekvenci od najmanje 6 baznih parova prvog fragmenta ciljne DNK sekvence i drugi homologni region koji ima sekvencu identičnu sekvenci od najmanje 6 baznih parova drugog fragmenta ciljne DNK sekvence, i intervenirajući region koji sadrži najmanje 1 nukleobazu heterolognu za ciljnu DNK sekvencu, pri čemu intervenirajući region povezuje prvi homologni region i drugi homologni region; (2) kultivisanja mikrospore da bi se proizveo embrion; i (3) proizvodnje od embriona biljke koja ima mutaciju koja se nalazi između prvog i drugog fragmenta ciljne DNK sekvence, npr., kultivisanjem mikrospore da bi se proizveo somatski embrion i regenerisanjem biljke iz embriona. U različitim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, rekombinogena oligonukleobaza je MDON i svaki od homolognih regiona sadrži RNK segment od najmanje 6 nukleotida tipa RNK; intervenirajući region je dugačak najmanje 3 nukleotida; prvi i/ili drugi segment RNK sadrži najmanje 8 susednih 2'-supstituisanih ribonukleotida.
[0008] Jedan od glavnih ciljeva biološkog istraživanja je ciljana modifikacija genoma. Kao što je gore navedeno, iako su metode za isporuku gena u ćelije sisara dobro razvijene, učestalost modifikacije i/ili homologne rekombinacije je ograničena (Hanson i sarad., Mol Cell Biol 15:45-51 1995). Kao rezultat toga, modifikacija gena je dugotrajan proces. Brojne metode su razmatrane ili je pokušano da se poboljšaju modifikacija i/ili rekombinacija između donora i genomske DNK. Međutim, sadašnje tehnike često pokazuju niske stope modifikacije i/ili rekombinacije, ili nedoslednost u brzini modifikacije i/ili rekombinacije, čime ometaju istraživanje i tehnologiju genske terapije.
REZIME PREDMETNOG PRONALASKA
[0009] Ovaj predmetni pronalazak obezbeđuje nove postupke i kompozicije za poboljšanje efikasnosti ciljanja modifikacija na specifičnim lokacijama u genomskim ili drugim nukleotidnim sekvencama.
[0010] Predmet ovog predmetnog pronalaska je postupak, kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, za uvođenje mutacije posredovane oligonukleobazom (GRON) za popravku gena u sekvencu ciljne dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) u biljnoj ćeliji. Zavisni patentni zahtevi se odnose na posebna tehnička rešenja istog.
[0011] Postupak obuhvata isporuku GRON-a u biljnu ćeliju; i isporuku endonukleaze specifične za mesto u biljnu ćeliju, pri čemu se endonukleaza specifična za mesto bira između nukleaza cinkovog prsta, efektorskih nukleaza sličnih aktivatoru transkripcije (TALEN - Transcription Activator-Like Effector Nucleases), i kompleksi grupisanih pravilno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR kompleksi).
[0012] GRON sadrži jednu ili više promena iz konvencionalnih RNK i DNK nukleotida izabranih od jednog ili više 2'O-metil nukleotida na njihovom 5' ili 3' kraju, 5' terminalnu kapu, jednu ili više fluorescentnih boja koje su kovalentno vezane za to, jednu ili više fosfotioatnih modifikacija, reverznu bazu na njihovom 3' kraju. Endonukleaza specifična za mesto izaziva prekid jednostrukog ili dvostrukog lanca u blizini mesta ciljanog za konverziju od strane GRON-a.
[0013] Kao što je opisano u daljem tekstu, GRON-ovi za upotrebu u predmetnom pronalasku dalje mogu da sadrže jednu ili više od sledećih izmena konvencionalnih RNK i DNK nukleotida:
GRON je veći od 55 baza u dužini, GRON opciono sadrži dva ili više mesta mutacija za uvođenje u ciljnu DNK;
GRON sadrži jedan ili više abazičnih nukleotida;
GRON sadrži jedan ili više 8'okso dA i/ili 8'okso dG nukleotida;
GRON sadrži jedan ili više 2'O-metil nukleotida na svom 5' kraju;
GRON sadrži najmanje 2'O-metil RNK nukleotide na svom 5' kraju;
GRON sadrži interkalirajuću boju;
GRON sadrži modifikaciju okosnice izabranu iz grupe koja se sastoji od metil fosfonatne modifikacije, modifikacije zaključane nukleinske kiseline (LNA – locked nucleic acid), O -(2-metoksietil) (MOE) modifikacije, di PS modifikacije, i modifikacije peptidne nukleinske kiseline (PNK);
GRON sadrži jednu ili više međulančanih unakrsnih veza;
GRON sadrži jednu ili više baza koje povećavaju energiju hibridizacije. Ova lista ne treba da bude ograničavajuća.
[0014] Kao što je opisano u daljem tekstu, u određenim tehničkim rešenjima kvalitet GRON-a i efikasnost konverzije mogu se poboljšati sintetisanjem celog ili dela GRON-a korišćenjem nukleotidnih multimera, kao što su dimeri, trimeri, tetrameri, itd poboljšavajući njegovu čistoću.
[0015] U određenim tehničkim rešenjima, endonukleaza specifična za mesto je kompleks grupisanih pravilno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR kompleks). U određenim tehničkim rešenjima, endonukleaza specifična za mesto je efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije (TALEN). U određenim tehničkim rešenjima, endonukleaza specifična za mesto je nukleaza cinkovog prsta.
[0016] U određenim tehničkim rešenjima, ciljna sekvenca dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) je unutar genoma biljne ćelije. Biljna ćelija može biti netransgena ili transgena, a ciljna DNK sekvenca može biti transgen ili endogeni gen biljne ćelije.
[0017] Postupci i kompozicije opisani ovde su primenljivi na biljke uopšteno. Samo kao primer, biljne vrste se mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od repice, suncokreta, kukuruza, duvana, šećerne repe, pamuka, kukuruza (eng. maize), pšenice, ječma, pirinča, lucerke, ječma, kineske šećerne trske, paradajza, manga, breskve, jabuke, kruške, jagode, banane, dinje, krompira, šargarepe, zelene salate, crnog luka, zrna soje, soya spp, šećerne trske, graška, leblebije, poljskog graška, boba, sočiva, bele repe, korabe, prokulice, obrnika, karfiola, kelja, poljskog pasulja, topole, bora, eukaliptusa, grožđa, citrusa, tritakale, lucerke, raži, ovsa, travnjaka i krmne trave, lana, uljane repice, slačice, krastavca, ukrasnog slaka, balzamine, bibera, patlidžana, nevena, lotosa, kupusa, bele rade, karanfila, lala, perunike, i ljiljana. Oni se takođe mogu primeniti u celini ili delimično na sve druge biološke sisteme uključujući, ali ne ograničavajući se na bakterije, gljive i ćelije sisara pa čak i njihove organele (npr., mitohondrije i hloroplaste).
[0018] U određenim tehničkim rešenjima, postupci dalje obuhvataju regeneraciju biljke koja ima mutaciju koju je uneo GRON iz biljne ćelije, i mogu da obuhvate sakupljanje semena iz biljke.
[0019] U srodnim aspektima, predmetni pronalazak se odnosi na biljne ćelije koje sadrže genomsku modifikaciju koju je uveo GRON u skladu sa postupcima opisanim ovde, biljku koja sadrži genomsku modifikaciju koju je uveo GRON prema ovde opisanim postupcima, ili seme koje sadrži genomsku modifikaciju koju je uveo GRON prema ovde opisanim postupcima.
[0020] Druga tehnička rešenja predmetnog pronalaska će biti očigledna iz sledećeg detaljnog opisa, primera tehničkih rešenja, i patentnih zahteva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0021]
Slika 1 prikazuje konverziju BFP u GFP posredovanu GRON-ovima obeleženim fosfotioatom (PS) (koji imaju po 3 PS segmenta na svakom kraju GRON-a) i 5'Cy3/ 3'idC obeleženim GRON-ovima.
Slika 2 prikazuje GRON-ove koji sadrže RNK/DNK, koji se ovde pominju kao "GRON-ovi Okazaki fragmenta".
DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA
[0022] Razvijena u poslednjih nekoliko godina, pokazalo se daje ciljana genetska modifikacija posredovana oligonukleotidima vredna tehnika za upotrebu u specifičnoj promeni kratkih delova DNK za stvaranje delecija, kratkih insercija, i tačkastih mutacija. Ovi postupci uključuju DNK uparivanje/anilovanje, nakon čega sledi događaj popravke/rekombinacije DNK. Prvo, nukleinska kiselina se aniluje sa komplementarnim lancem u dvolančanoj DNK u procesu posredovanom ćelijskim proteinskim faktorima. Ovo anilovanje stvara centralno lociran neusklađeno upareni bazni par (u slučaju tačkaste mutacije), što dovodi do strukturne perturbacije koja najverovatnije stimuliše endogenu proteinsku mašineriju da započne drugi korak u procesu popravke: modifikacije specifičnu za mesto hromozomske sekvence pa čak i njihove organele (npr., mitohondrije i hloroplasti). Ova novo uvedena neusklađenost indukuje mašineriju za popravku DNK da izvrši drugi događaj popravke, što dovodi do konačne revizije ciljnog mesta. Predmetni postupci poboljšavaju ove postupke obezbeđivanjem novih pristupa koji povećavaju dostupnost komponenata za popravku DNK, čime se povećava efikasnost i reproduktivnost modifikacija ciljanih nukleinskih kiselina posredovanih popravkom gena.
Definicije
[0023] Da bi se olakšalo razumevanje predmetnog pronalaska, niz pojamova je definisan u nastavku.
[0024] "Sekvenca nukleinske kiseline," "nukleotidna sekvenca" i "polinukleotidna sekvenca" kako se ovde koristi odnose se na oligonukleotid ili polinukleotid, i fragmente ili njihove delove, i na DNK ili RNK genomskog ili sintetičkog porekla koji mogu biti jednolančani ili dvolančani, i predstavljaju čulni (eng. sense) ili antičulni (eng. antisense) lanac.
[0025] Kako se ovde koristi, pojamovi "oligonukleotidi" i "oligomeri" odnose se na sekvencu nukleinske kiseline od najmanje oko 10 nukleotida i čak oko 201 nukleotida, poželjno oko 15 do 30 nukleotida, a poželjnije oko 20-25 nukleotida, koji mogu da se koriste kao proba ili pojačavač.
[0026] Izrazi "molekul za modifikaciju DNK" i "reagens za modifikaciju DNK" kako se ovde koristi odnose se na molekul koji je sposoban da prepozna i specifično se veže za sekvencu nukleinske kiseline u genomu ćelije, i koji je sposoban da modifikuje ciljnu nukleotidnu sekvencu unitary genoma, pri čemu je prepoznavanje specifično vezivanje molekula koji modifikuje DNK za sekvencu nukleinske kiseline nezavisno od proteina. Pojam "nezavisan od proteina" kako se ovde koristi u vezi sa molekulom koji modifikuje DNK znači da molekulu koji modifikuje DNK nije potrebno prisustvo i/ili aktivnost proteina i/ili enzima za prepoznavanje, i/ili specifičnost vezivanja, za sekvencu nukleinske kiseline. Molekuli koji modifikuju DNK su prikazani kao primeri, ali nisu ograničeni na oligonukleotide koji formiraju tripleks, peptidne nukleinske kiseline, poliamide, i oligonukleotide koji su namenjeni da promovišu konverziju gena. Molekuli predmetnog pronalaska koji modifikuju DNK razlikuju se od sekvenci nukleinskih kiselina iz stanja tehnike koji se koriste za homolognu rekombinacija [Wong & Capecchi, Molec. Cell. Biol.
7:2294-2295, 1987] u tome što su sekvence iz stanja tehnike koje se koriste za homolognu rekombinaciju zavisne od proteina. Pojam "zavisan od proteina" kako se ovde koristi u vezi sa molekulom znači da je molekulu potrebno prisustvo i/ili aktivnost proteina i/ili enzima za prepoznavanje, i/ili specifično vezivanje molekula za sekvencu nukleinske kiseline. Postupci za određivanje da li molekul koji modifikuje DNK zahteva prisustvo i/ili aktivnost proteina i/ili enzima za prepoznavanje, i/ili specifično vezivanje za sekvencu nukleinske kiseline su u okviru veštine u ovoj oblasti [videti, npr., Dennis i sarad. Nucl. Acids Res. 27:4734-4742, 1999]. Na primer, molekul koji modifikuje DNK može se inkubirati in vitro sa sekvencom nukleinske kiseline u odsustvu bilo kakvih proteina i/ili enzima. Detekcija specifičnog vezivanja između molekula koji modifikuje DNK i sekvence nukleinske kiseline pokazuje da je molekul koji modifikuje DNK nezavisan od proteiina. S druge strane, odsustvo specifičnog vezivanja između molekula koji modifikuje DNK i sekvence nukleinske kiseline pokazuje da je molekul koji modifikuje DNK zavisan od proteina i/ili zahteva dodatne faktore.
[0027] "Oligonukleotid koji formira tripleks" (TFO - Triplex forming oligonucleotide) je definisan kao sekvenca DNK ili RNK koja je sposobna da se veže u glavnom žlebu dupleksa DNK ili RNK heliksa da bi se formirao trostruki heliks. Iako TFO nije ograničen ni na jednu određenu dužinu, poželjna dužina TFO je 200 nukleotida ili manje, poželjnije 100 nukleotida ili manje, još poželjnije od 5 do 50 nukleotida, čak još poželjnije od 10 do 25 nukleotida, i najpoželjnije od 15 do 25 nukleotida. Iako je stepen specifičnosti sekvence između TFO i dupleksa DNK neophodan za formiranje trostrukog heliksa, nije potreban poseban stepen specifičnosti, sve dok je trostruki heliks sposoban da se formira. Slično, nije potreban nikakav specifičan stepen avidnosti ili afiniteta između TFO i dupleks heliksa sve dok je trostruki heliks sposoban da se formira. Iako nema nameru da ograniči dužinu nukleotidne sekvence za koju se TFO specifično vezuje u jednom tehničkom rešenju, nukleotidna sekvenca za koju se TFO specifično vezuje je od 1 do 100, poželjnije od 5 do 50, još poželjnije od 10 do 25, i najpoželjnije od 15 do 25, nukleotida. Dodatno, "trostruki heliks" je definisan kao dvostruka spirala nukleinske kiseline sa oligonukleotidom vezanim za ciljnu sekvencu unutar dvostruke spirale nukleinske kiseline. "Dvostruka spirala" nukleinske kiseline može biti bilo koja dvolančana nukleinska kiselina uključujući dvolančanu DNK, dvolančanu RNK i mešane duplekse DNK i RNK. Dvolančana nukleinska kiselina nije ograničena na bilo koju određenu dužinu. Međutim, u poželjnim tehničkim rešenjima ona ima dužinu veću od 500 bp, poželjnije veću od 1 kb i najpoželjnije veću od oko 5 kb. U mnogim primenama dvostruka spiralna nukleinska kiselina je ćelijska, genomska nukleinska kiselina. Oligonukleotid koji formira tripleks može da se veže za ciljnu sekvencu na paralelan ili antiparalelan način.
[0028] "Peptidne nukleinske kiseline," "poliamidi" ili "PNK" su nukleinske kiseline u kojima je fosfatna okosnica zamenjena sa poliamidnom strukturom zasnovanom na N-aminoetilglicinu. PNK imaju veći afinitet za komplementarne nukleinske kiseline od njihovih prirodnih parnjaka prema Watson-Crickovim pravilima za uparivanje baza. PNK mogu formirati visoko stabilne trostruke spiralne strukture sa DNK sledeće stehiometrije: (PNK)2.DNK. Iako peptidne nukleinske kiseline i poliamidi nisu ograničeni ni na jednu određenu dužinu, poželjna dužina peptidnih nukleinskih kiselina i poliamida je 200 nukleotida ili manje, poželjnije 100 nukleotida ili manje, i najpoželjnije dužine od 5 do 50 nukleotida. Iako nema nameru da ograniči dužinu nukleotidne sekvence za koju se peptidna nukleinska kiselina i poliamid specifično vezuju, u jednom tehničkom rešenju, nukleotidna sekvenca za koju se peptidna nukleinska kiselina i poliamid specifično vezuju je od 1 do 100, poželjnije od 5 do 50, još poželjnije od 5 do 25, i najpoželjnije od 5 do 20 nukleotida.
[0029] Pojam "ćelija" se odnosi na pojedinačnu ćeliju. Pojam "ćelije" se odnosi na populaciju ćelija. Populacija može biti čista populacija koja se sastoji od jednog tipa ćelija. Slično, populacija može da sadrži više od jednog tipa ćelija. U predmetnom pronalasku, ne postoji ograničenje na broj tipova ćelija koje ćelijska populacija može da sadrži.
[0030] Pojam "sinhronizovati" ili "sinhronizovano," kada se odnosi na uzorak ćelija, ili "sinhronizovane ćelije" ili " sinhronizovanu ćelijsku populaciju" odnosi se na mnoštvo ćelija koje su tretirane da bi se izazvalo da populacija ćelija bude u istoj fazi ćelijskog ciklusa. Nije neophodno da sve ćelije u uzorku budu sinhronizovane. Mali procenat ćelija možda neće biti sinhronizovan sa većinom ćelija u uzorku. Poželjan opseg ćelija koje su sinhronizovane je između 10-100%. Poželjniji opseg je između 30-100%. Takođe, nije neophodno da ćelije budu čista populacija jednog tipa ćelija. Uzorak može da sadrži više od jednog tipa ćelija. U tom smislu, samo jedan od tipova ćelija može biti sinhronizovan ili može biti u različitoj fazi ćelijskog ciklusa u poređenju sa drugim ćelijskim tipom u uzorku.
[0031] Pojam "sinhronizovana ćelija" kada se odnosi na jednu ćeliju znači da je ćelija manipulisana tako da je u fazi ćelijskog ciklusa koja se razlikuje od faze ćelijskog ciklusa ćelije pre manipulacije. Alternativno, "sinhronizovana ćelija" se odnosi na ćeliju kojom je manipulisano da se promeni (tj. poveća ili smanji) trajanje faze ćelijskog ciklusa u kojoj je ćelija bila pre manipulacije u poređenju sa kontrolnom ćelijom (npr. ćelija u odsustvu manipulacije).
[0032] Pojam "ćelijski ciklus" se odnosi na fiziološko i morfološko napredovanje promena koje ćelije prolaze prilikom deljenja (tj. proliferacije). Generalno je poznato da se ćelijski ciklus sastoji od faza koje se nazivaju "interfaza," "profaza," "metafaza," "anafaza," i "telofaza". Pored toga, delovi ćelijskog ciklusa se mogu nazvati "M (mitoza)," "S (sinteza)," "G0," "G1 (praznina 1)" i "G2 (praznina 2)". Štaviše, ćelijski ciklus uključuje periode progresije koji su između gore navedenih faza.
[0033] Pojam "inhibicija ćelijskog ciklusa" se odnosi na prestanak progresije ćelijskog ciklusa u ćeliji ili populaciji ćelija. Inhibicija ćelijskog ciklusa je obično izazvana izlaganjem ćelija agensu (hemijskom, proteinskom ili drugom) koji ometa fiziološke aspekte ćelije da bi sprečio nastavak ćelijskog ciklusa.
[0034] "Proliferacija" ili "ćelijski rast" odnosi se na sposobnost roditeljske ćelije da se deli na dve ćerke ćelije uzastopno što dovodi do povećanja ukupnog broja ćelija u populaciji. Ćelijska populacija može biti u organizmu ili u aparatu za kulturu.
[0035] Pojam "sposoban za modifikaciju DNK" ili "sredstva za modifikaciju DNK" odnosi se na procedure, kao i endogene ili egzogene agense ili reagense koji imaju sposobnost da indukuju, ili mogu pomoći u indukciji, promene u nukleotidnoj sekvenci ciljanog segmenta DNK. Takve promene se mogu izvršiti delecijom, adicijom ili supstitucijom jedne ili više baza na ciljanom segmentu DNK. Nije neophodno da promene DNK sekvenca dovode do funkcionalne promene kod bilo kog gena koji je kodiran ciljanom sekvencom. Štaviše, nije neophodno da se promene DNK vrše na bilo kom delu ili procentu ćelija.
[0036] Pojam "nukleotidna sekvenca od interesa" odnosi se na bilo koju nukleotidnu sekvencu, čija manipulacija se može smatrati poželjnom iz bilo kog razloga, od strane običnog stručnjaka u ovoj oblasti. Takve nukleotidne sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, kodirajuće sekvence strukturnih gena (npr., reporterski geni, geni selekcionih markera, onkogeni, geni otporni na lekove, faktori rasta, itd.), i nekodirajuće regulatorne sekvence koje ne kodiraju iRNK ili proteinski proizvod (npr., sekvence promotora, sekvenca pojačivača, sekvenca poliadenilacije, sekvenca terminacije, regulatorne RNK kao što je miRNK, itd.).
[0037] "Aminokiselinska sekvenca," "polipeptidna sekvenca," "peptidna sekvenca" i "peptid" se ovde koriste naizmenično za označavanje sekvence aminokiselina.
[0038] "Ciljna sekvenca," kako se ovde koristi, se odnosi na dvostruki heliks nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu poželjno veću od 8 nukleotida u dužini ali manju od 201 nukleotida u dužini. U nekim tehničkim rešenjima, ciljna sekvenca je poželjno između 8 do 30 baza. Ciljna sekvenca, generalno, definisana je nukleotidnom sekvencom na jednom od lanaca dvostrukog heliksa nukleinske kiseline.
[0039] Kako se ovde koristi, "sekvenca bogata purinom" ili "polipurinska sekvenca" kada se napravi u odnosu na nukleotidnu sekvencu na jednom od lanaca sekvence dvostrukog heliksa nukleinske kiseline je definisana kao neprekidna sekvenca nukleotida u kojoj više od 50% nukleotida ciljne sekvence sadrže purinsku bazu. Međutim, poželjno je da ciljna sekvenca bogata purinom sadrži više od 60% purinskih nukleotida, poželjnije više od 75% purinskih nukleotida, sledeće najpoželjnije više od 90% purinskih nukleotida i najpoželjnije 100% purinskih nukleotida.
[0040] Kako se ovde koristi, "sekvenca bogata pirimidinom" ili "polipirimidinska sekvenca" kada se napravi u odnosu na nukleotidnu sekvencu na jednom od lanaca sekvence dvostrukog heliksa nukleinske kiseline je definisana kao neprekidna sekvenca nukleotida u kojoj više od 50% nukleotida ciljne sekvence sadrže pirimidinsku bazu. Međutim, poželjno je da ciljna sekvenca bogata pirimidinom sadrži više od 60% pirimidinskih nukleotida i poželjnije više od 75% pirimidinskih nukleotida. U nekim tehničkim rešenjima, sekvenca sadrži poželjno više od 90% pirimidinskih nukleotida i, u drugim tehničkim rešenjima, najpoželjnije je 100% pirimidinskih nukleotida.
[0041] "Varijanta" prve nukleotidne sekvence je definisan kao nukleotidna sekvenca koja se razlikuje od prve nukleotidne sekvence (npr., ima jednu ili više delecija, insercija ili supstitucija koje se mogu detektovati korišćenjem hibridizacionih testova ili korišćenjem DNK sekvenciranja). U okviru ove definicije uključeno je i otkrivanje promena ili modifikacija genomske sekvence prve nukleotidne sekvence. Na primer, hibridizacioni testovi se mogu koristiti za otkrivanje (1) promena u obrascu fragmenata restrikcionog enzima koji su sposobni da se hibridizuju sa prvom nukleotidnom sekvencom kada su sadržani u genomu (tj., RFLP analiza), (2) nemogućnosti da se odabrani deo prve nukleotidne sekvence hibridizuje sa uzorkom genomske DNK koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu (npr., korišćenjem alel-specifičnih oligonukleotidnih proba), (3) nepravilne ili neočekivane hibridizacije, kao što je hibridizacija sa lokusom koji nije normalan hromozomski lokus za prvu nukleotidnu sekvencu (npr., korišćenjem fluorescentne in situ hibridizacije (FISH) do metafaznih širenja hromozoma, itd.). Jedan primer varijante je mutirana sekvenca divljeg tipa.
[0042] Pojmovi "nukleinska kiselina" i "nemodifikovana nukleinska kiselina" kako se ovde koristi odnose se na bilo koju od četiri poznate baze dezoksiribonukleinske kiseline (tj., guanin, adenin, citozin, i timin). Pojam "modifikovana nukleinska kiselina" se odnosi na nukleinsku kiselinu čija je struktura izmenjena u odnosu na strukturu nemodifikovane nukleinske kiseline. Ilustracije takvih modifikacija bi bile zamenske kovalentne modifikacije baza, kao što je alkilacija amino i azota u prstenu kao i zasićenje dvogubih veza.
[0043] Kako se ovde koristi, pojmovi "mutacija" i "modifikacija" i njihovi gramatički ekvivalenti kada se koriste u vezi sa sekvencom nukleinske kiseline koriste se naizmenično za označavanje delecije, insercije, supstitucije, prekida lanca, i/ili uvođenja adukta. "Delecija" je definisan kao promena u sekvenci nukleinske kiseline u kojoj je odsutan jedan ili više nukleotida. "Insercija" ili "adicija" je promena u sekvenci nukleinske kiseline koja je rezultirala dodavanjem jednog ili više nukleotida. "Supstitucija" je rezultat zamene jednog ili više nukleotida molekulom koji je drugačiji od jednog ili više zamenjenih nukleotida. Na primer, nukleinska kiselina može biti zamenjena drugom nukleinskom kiselinom kao što je primer zamene timina citozinom, adeninom, guaninom, ili uridinom. Pirimidin na pirimidin (npr. C na T ili T na C nukleotidne supstitucije) ili purin na purin (npr. G na A ili A na G nukleotidnih supstitucija) se nazivaju prelazima, dok se pirimidin na purin ili purin na pirimidin (npr. G na T ili G na C ili A na T ili A na C) nazivaju transverzijama. Alternativno, nukleinska kiselina može biti zamenjena modifikovanom nukleinskom kiselinom kao što je primer zamene timina, timin glikolom. Mutacije mogu dovesti do nepodudaranja. Pojam "nepodudaranje" se odnosi na nekovalentnu interakciju između dve nukleinske kiseline, pri čemu se svaka nukleinska kiselina nalazi na različitoj sekvenci polinukleinske kiseline, koja ne prati pravila uparivanja baza. Na primer, za delimično komplementarne sekvence 5'-AGT-3' i 5'-AAT-3', G-A prisutna je nepodudarnost (tranzicija). Pojmovi "uvođenje adukta" ili "formiranje adukta" odnose se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu molekula za jedan ili više nukleotida u DNK sekvenci tako da veza dovodi do smanjenja (poželjno od 10% do 100%, poželjnije od 50% do 100%, i najpoželjnije od 75% do 100%) u nivou replikacije i/ili transkripcije DNK.
[0044] Pojam "prekid lanca" kada se odnosi na dvolančanu sekvencu nukleinske kiseline uključuje prekid jednog lanca i/ili dvolančani prekid lanca. Pauza u jednom lancu (eng. nick - urez) se odnosi na prekid na jednom od dva lanca sekvence dvolančane nukleinske kiseline. Ovo je u suprotnosti sa pauzom dvostrukog lanca koja se odnosi na prekid u oba lanca sekvence dvolančane nukleinske kiseline. Pauze u lancu mogu biti uvedene u sekvencu dvolančane nukleinske kiseline ili direktno (npr., jonizujućim zračenjem ili treatmanom određenim hemikalijama) ili indirektno (npr., enzimskim rezom na bazi nukleinske kiseline).
[0045] Pojmovi "mutantna ćelija" i "modifikovana ćelija" odnose se na ćeliju koja sadrži najmanje jednu modifikaciju u genomskoj sekvenci ćelije.
[0046] Pojam "deo" kada se koristi u vezi sa nukleotidnom sekvencom odnosi se na fragmente nukleotidne sekvence. Fragmenti mogu biti u rasponu veličine od 5 nukleotidnih ostataka do cele nukleotidne sekvence minus jedan ostatak nukleinske kiseline.
[0047] Za molekule DNK se kaže da imaju "5' krajeve" i "3' krajeve" jer mononukleotidi reaguju da naprave oligonukleotide na način da je 5' fosfat jednog mononukleotidnog pentoznog prstena vezan za 3' kiseonik svog suseda u jednom smeru preko fosfodiestarske veze. Prema tome, kraj oligonukleotida se naziva "5 ' kraj" ako njegov 5' fosfat nije povezan sa 3' kiseonikom mononukleotidnog pentoznog prstena. Kraj oligonukleotida se naziva "3' kraj" ako njegov 3' kiseonik nije vezan za 5' fosfat drugog mononukleotidnog pentoznog prstena. Kako se ovde koristi, sekvenca nukleinske kiseline, čak iako je unutrašnja za veći oligonukleotid, takođe se može reći da ima 5' i 3' krajeve. Bilo u linearnom ili cirkularnom DNK molekulu, izolovani (diskretni) elementi se nazivaju "uzvodno" ili 5' od "nizvodnih" ili 3' elemenata. Ova terminologija odražava da se transkripcija odvaja u pravcu od 5' do 3' duž lanca DNK. Elementi promotora i pojačivača koji usmeravaju transkripciju povezanog gena se generalno nalaze na 5' ili uzvodno od kodirajućeg regiona. Međutim, elementi pojačivača mogu da ispolje svoj efekat čak i kada se nalaze na 3' od promotorskog elementa i kodirajućeg regiona. Signali terminacije transkripcije i poliadenilacije nalaze se na 3' ili nizvodno od kodirajućeg regiona.
[0048] Pojam "rekombinantni DNK molekul" kako se ovde koristi odnosi se na molekul DNK koji je sačinjen od segmenata DNK spojenih zajedno pomoću molekularno bioloških tehnika.
[0049] Pojam "rekombinantni protein" ili "rekombinantni polipeptid" kako se ovde koristi odnosi se na proteinski molekul koji je eksprimiran korišćenjem rekombinantnog DNK molekula.
[0050] Kako se ovde koristi, pojmovi "vektor" i "nosač" se koriste naizmenično u odnosu na molekule nukleinske kiseline koji prenose DNK segment(e) iz jedne ćelije u drugu.
[0051] Pojmovi "u operativnoj kombinaciji," "u operativnom redosledu" i "operativno povezan" kako se ovde koristi odnose se na vezu nukleokiselinskih sekvenci na takav način da molekul nukleinske kiseline može da usmerava transkripciju datog gena i/ili da se vrši sinteza željenog proteinskog molekula. Pojmovi se takođe odnose na povezivanje aminokiselinskih sekvenci na takav način da se proizvede funkcionalni protein.
[0052] Pojam "transfekcija" kako se ovde koristi odnosi se na uvođenje strane DNK u ćelije. Transfekcija se može postići različitim sredstvima poznatim u oblasti uključujući koprecipitaciju kalcijum fosfat-DNK, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu polibrenom, elektroporaciju, mikroinjekciju, fuziju lipozoma, lipofektin, fuziju protoblasta, retrovirusnu infekciju, biolistiku (tj., bombardovanje česticama) i slično.
[0053] Kako se ovde koristi, pojmovi "komplementarno" ili "komplementarnost" se koriste u odnosu na "polinukleotide" i "oligonukleotide" (koji su zamenljivi pojmovi koji se odnose na sekvencu nukleotida) koji se odnose na pavila uparivanja baza. Na primer, sekvenca "5'-CAGT3'," je komplementarna sekvenci "5'-ACTG-3'." Komplementarnost može biti "delimična" ili "potpuna". "Delimična" komplementarnost je kada se jedna ili više baza nukleinske kiseline ne poklapaju prema pravilima uparivanja baza. "Totalna" ili "potpuna" komplementarnost između nukleinskih kiselina je gde se svaka baza nukleinske kiseline poklapa sa drugom bazom prema pravilima uparivanja baza. Stepen komplementarnosti između lanaca nukleinske kiseline može imati značajne efekte na efikasnost i snagu hibridizacije između lanaca nukleinske kiseline. Ovo može biti od posebnog značaja u reakcijama amplifikacije, kao i metodama detekcije koje zavise od vezivanja između nukleinskih kiselina. Radi pogodnosti, pojmovi "polinukleotidi" i "oligonukleotidi" uključuju molekule koji uključuju nukleozide.
[0054] Pojmovi "homologija" i "homologan" kako se ovde koristi u odnosu na nukleotidne sekvence odnose se na stepen komplementarnosti sa drugim nukleotidnim sekvencama. Može postojati delimična homologija ili potpuna homologija (tj., identitet). Kada se koristi u vezi sa dvolančanom sekvencom nukleinske kiseline kao što je cDNK ili genomski klon, pojam "u suštini homologan" se odnosi na bilo koju sekvencu nukleinske kiseline (npr., proba) koja može hibridizovati sa jednim ili oba lanca dvolančane sekvence nukleinske kiseline pod manje striktnim uslovima kao što je gore opisano. Nukleotidna sekvenca koja je delimično komplementarna, tj., "suštinski homologna," sekvenci nukleinske kiseline je ona koja bar delimično inhibira potpuno komplementarnu sekvencu da hibridizuje do ciljne sekvence nukleinske kiseline. Inhibicija hibridizacije potpuno komplementarne sekvence do ciljne sekvence može se ispitati korišćenjem testa hibridizacije (Southern ili Northern blot, hibridizacija u rastvoru i slično) pod manje striktnim uslovima. U suštini homologna sekvenca ili proba će se takmičiti za i inhibirati vezivanje (tj., hibridizaciju) potpuno homologne sekvence za ciljnu sekvencu pod manje striktnim uslovima. Ovo ne znači da su manje striktni uslovi takvi da je dozvoljeno nespecifično vezivanje; manje striktni uslovi zahtevaju da vezivanje dve sekvence jedna za drugu bude specifična (tj., selektivna) interakcija. Odsustvo nespecifičnog vezivanja može se testirati upotrebom druge ciljne sekvence kojoj nedostaje čak i delimičan stepen komplementarnosti (npr., manje od oko 30% identičnosti); u odsustvu nespecifičnog vezivanja proba se neće hibridizovati sa drugom nekomplementarnom metom.
[0055] Manje striktni uslovi obuhvataju uslove koji su ekvivalentni vezivanju ili hibridizaciji na 68° C. u rastvoru koji se sastoji od 5×SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH2PO4•H2O i 1.85 g/l EDTA, pH podešen na 7.4 sa NaOH), 0.1% SDS, 5× Denhardt-ov reagens (50× Denhardt-ov reagens sadrži na 500 ml: 5 g Ficoll-a (Tip 400, Pharmacia), 5 g BSA (Frakcija V; Sigma)) i 100 µg/ml denaturisane DNK sperme lososa nakon čega sledi ispiranje u rastvoru koji sadrži 2.0×SSPE, 0.1% SDS na sobnoj temperaturi kada se koristi proba dužine od oko 100 do oko 1000 nukleotida.
[0056] Pored toga, uslovi koji promovišu hibridizaciju pod striktnim uslovima (npr., povećanje temperature koraka hibridizacije i/ili ispiranja, upotreba formamida u rastvoru za hibridizaciju, itd.) su dobro poznati u oblasti. Striktni uslovi, kada se koriste u vezi sa hibridizacijom nukleinske kiseline, obuvataju uslove koji su ekvivalentni vezivanju ili hibridizaciji na 68°C. u rastvoru koji se sastoji od 5×SSPE, 1% SDS, 5×Denhardt-ovog reagensa i 100 µg/ml denaturisane DNK sperme lososa nakon čega sledi ispiranje u rastvoru koji sadrži 0.1×SSPE i 0.1% SDS na 68°C. kada se koristi proba dužine od oko 100 do oko 1000 nukleotida.
[0057] U oblasti je dobro poznato da se brojni ekvivalentni uslovi mogu koristiti da obuhvate manje striktne uslove; faktori kao što su dužina i priroda (DNK, RNK, bazni sastav) proba i priroda mete (DNK, RNK, bazni sastav, prisutan u rastvoru ili imobilizovan, itd.) i koncentracija soli i drugih komponenti (npr., prisustvo ili odsustvo formamida, dekstran sulfata, polietilen glikola), kao i komponenti rastvora za hibridizaciju mogu da se menjaju da bi se stvorili manje striktni uslovi hibridizacije koji su različiti od, ali ekvivalentni gore navedenim uslovima.
[0058] Pojam "ekvivalent" kada se koristi u vezi sa uslovom hibridizacije jer se odnosi na uslov hibridizacije od interesa znači da uslov hibridizacije i uslov hibridizacije od interesa rezultiraju hibridizacijom sekvenci nukleinske kiseline koje imaju isti procentualni opseg (%) homologije. Na primer, ako uslov hibridizacije od interesa rezultira hibridizacijom prve sekvence nukleinske kiseline sa drugim sekvencama nukleinskih kiselina koje imaju od 50% do 70% homologije sa prvom sekvencom nukleinske kiseline, onda se za drugi uslov hibridizacije kaže da je ekvivalentan uslovu hibridizacije od interesa ako ovaj drugi uslov hibridizacije takođe rezultira hibridizacijom prve sekvence nukleinske kiseline sa drugim sekvencama nukleinskih kiselina koje imaju od 50% do 70% homologije sa prvom sekvencom nukleinske kiseline.
[0059] Kako se ovde koristi, pojam "hibridizacija" se upotrebjava u odnosu na uparivanje komplementarnih nukleinskih kiselina korišćenjem bilo kog procesa kojim se lanac nukleinske kiseline spaja sa komplementranim lancem kroz uparivanje baza da bi se formirao hibridizacioni kompleks. Hibridizacija i jačina hibridizacija (tj., jačina udruživanja između nukleinskih kiselina) je pod uticajem takvih faktora kao što su stepen komplementarnosti između nukleinskih kiselina, striktnost uključenih uslova, Tm formiranog hibrida, i G:C odnos unutar nukleinskih kiselina.
[0060] Kako se ovde koristi pojam "hibridizacioni kompleks" se odnosi na kompleks formiran između dve sekvence nukleinske kiseline na osnovu formiranja vodoničnih veza između komplementarnih G i C baza i između komplementarnih A i T baza; ove vodonične veze mogu se dalje stabilizovati interakcijama slaganja baza. Dve komplementarne sekvence nukleinske kiseline povezuju se vodoničnom vezom u antiparalelnoj konfiguraciji. Hibridizacioni kompleks se može formirati u rastvoru (npr., Cot ili Rot analiza) ili između jedne sekvence nukleinske kiseline prisutne u rastvoru i druge sekvenca nukleinske kiseline imobilizovane na čvrstu podlogu (npr., najlonska membrana ili nitrocelulozni filter kao što se koristi u Southern i Northern blotting-u, dot blotting-u ili staklena pločica kao što se koristi u hibridizaciji in situ, uključujući FISH (fluorescentna hibridizacija in situ)).
[0061] Kako se ovde koristi, pojam "Tm" se koristi u odnosu na "temperaturu topljenja." Temperatura topljenja je temperatura na kojoj populacija dvolančanih molekula nukleinske kiseline napola disosuje u jednostruke lance. Jednačina za izračunavanje Tm nukleinskih kiselina je dobro poznata u oblasti. Kao što je naznačeno standardnim referencama, jednostavna procena vrednosti Tm može se izračunati jednačinom: Tm=81.5+0.41(% G+C), kada je nukleinska kiselina u vodenom rastvoru 1 M NaCl (videti npr., Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization, 1985). Ostale reference uključuju sofisticiranije proračune koji uzimaju u obzir strukturu kao i karakteristike sekvence za izračunavanje Tm.
[0062] Kako se ovde koristi pojam "striktnost" se upotrebljava u odnosu na temperaturne uslove, jonsku jačinu, i prisustvo drugih jedinjenja kao što su organski rastvarači, pod kojima se sprovode hibridizacije nukleinske kiseline. "Striktnost" se obično javlja u opsegu od oko Tm°C. do oko 20°C. do 25°C. ispod Tm. Kao što će stručnjaci u ovoj oblasti razumeti, striktna hibridizacija može da se koristi da bi se identifikovale ili detektovale identične polinukleotidne sekvence ili identifikovale ili detektovale slične ili povezane polinukleotidne sekvence.
[0063] Pojmovi "specifično vezivanje," "specifičnost vezivanja," i njihovi gramatički ekvivalenti kada se odnose na vezivanje prve nukleotidne sekvence za drugu nukleotidnu sekvencu, odnose se na preferencijalnu interakciju između prve nukleotidne sekvence sa drugom nukleotidnom sekvencom kao u poređenju sa interakcijom između druge nukleotidne sekvence sa trećom nukleotidnom sekvencom. Specifično vezivanje je relativan pojam koji ne zahteva apsolutnu specifičnost vezivanja; dugim rečima, pojam "specifično vezivanje" ne zahteva da druga nukleotidna sekvenca intereaguje sa prvom nukleotidnom sekvencom u odsustvu interakcija između duge nukleotidne sekvence i treće nukleotidne sekvence. Umesto toga, dovoljno je da nivo interakcija između prve nukleotidne sekvence i duge nukleotidne sekvence bude veći od nivoa interakcija između druge nukleotidne sekvence sa trećom nukleotidnom sekvencom. "Specifično vezivanje" prve nukleotidne sekvence sa drugom nukleotidnom sekvencom takođe znači da interakcija između prve nukleotidne sekvence i duge nukleotidne sekvence zavisi od prisustva određene strukture na ili unutar prve nukleotidne sekvence; drugim rečima druga nukleotidna sekvenca prepoznaje i vezue se za specifične strukture na ili unutar prve nukleotidne sekvence radije nego za nukleinske kiseline ili za nukleotidne sekvence uopšte. Na primer, ako je druga nukleotidna sekvenca specifična za strukturu "A" to je na ili unutar prve nukleotidne sekvence, prisustvo treće sekvence nukleinske kiseline koja sadrži strukturu A će redukovati količinu druge nukleotidne sekvence koja je vezana za prvu nukleotidnu sekvencu.
[0064] Kako se ovde koristi, pojam "nukleinska kiselina koja se može amplifikovati" se koristi u odnosu na nukleinske kiseline koje se mogu amplifikovati bilo kojom metodom amplifikacije. Smatra se da će "nukleinska kiselina koja se može amplifikovati" obično sadržati "templatni uzorak."
[0065] Pojmovi "heterologone sekvence nukleinske kiseline" ili "heterologna DNK" se koriste naizmenično da označe nukleotidnu sekvencu koja je vezana za sekvencu nukleinske kiseline za koju nije vezana u prirodi, ili za koji je vezana na drugačiji način u prirodi. Heterologna DNK nije endogena ćeliji u koju je uvedena, već je dobijena iz druge ćelije. Generalno, iako nije neophodno, ovakva heterologna DNK kodira RNK i proteine koji nisu normalno proizvedeni od ćelija u kojima se eksprimiraju. Primeri heterologne DNK uključuju reporter gene, transkripcione i translacione regulatorne sekvence, odabrane protein markere (npr., proteini koji pokazuju otpornost na lekove), itd.
[0066] "Amplifikacija" je definisana kao proizvodnja dodatnih kopija sekvence nukleinske kiseline i generalno se sprovodi korišćenjem tehnologija lančane reakcije polimeraze dobro poznate u struci (Dieffenbach C W and G S Dveksler (1995) PCR Primer, Laboratorijski priručnik, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.). Kako se ovde koristi, pojam "lančana reakcija polimeraze" ("PCR" - polymerase chain reaction) se odnosi na metodu u K. B. Mullis U.S. Pat. Br. 4,683,195, i 4,683,202, koji opisuju metod za povećanje koncentracije segmenta ciljne sekvence u mešavini genomske DNK bez kloniranja i prečišćavanja. Dužina amplifikovanog segmenta željene ciljne sekvence određena je relativnim položajima dva oligonukleotidna prajmera jedan u odnosu na drugi, i stoga je ova dužina parametar koji se može kontrolisati. Zbog aspekta ponavljanja procesa, metoda se naziva "lančana reakcija polimeraze" (u daljem tekstu "PCR"). Pošto željeni amplifikovani segmenti ciljne sekvence postaju preovlađujuće sekvence (u smislu koncentracije) u smeši, za njih se kaže da su "PCR amplifikovani."
[0067] Sa PCR, moguće je pojačati jednu kopiju specifične ciljne sekvence u genomskoj DNK do nivoa koji se može detektovati pomoću nekoliko različitih metodologija (npr., hibridizacija sa obeleženim probama; ugradnja biotinilovanih prajmera nakon čega sledi detekcija konjugata avidin-enzim; ugradnja 32P-obeleženih dezoksinukleotid trifosfata, kao što su dCTP ili dATP, u pojačani segment). Pored genomske DNK, bilo koja oligonukleotidna sekvenca može biti amplifikovana sa odgovarajućim skupom molekula prajmera. Konkretno, pojačani segmenti stvoreni samim PCR procesom, su sami po sebi efikasni šabloni za naknadne PCR amplifikacije.
[0068] Jedna takva poželjna metoda, posebno za komercijalne primene, zasnovana je na široko korišćenoj tehnologiji TaqMan<®>PCR-a u realnom vremenu, i kombinuje Alel-Specifični PCR sa Blokirajućim reagensom (ASB-PCR) da bi se suzbila amplifikacija alela divljeg tipa. ASB-PCR se može koristiti za detekciju germinativne linije ili somatskih mutacija u DNK ili RNK ekstrahovanim iz bilo koje vrste tkiva, uključujući uzorke tumora fiksirane u parafinu i umetnute u formalin. Razvijen je skup pravila dizajna reagensa koji omogućava osetljivo i selektivno otkrivanje supstitucija, insercija, ili delecija jedne tačke na pozadini alela divljeg tipa u hiljadu puta ili većem višku. (Morlan J, Baker J, Sinicropi D Mutation Detection by Real-Time PCR: A Simple, Robust and Highly Selective Method. PLoS ONE 4(2): e4584, 2009)
[0069] Pojmovi "lančana rakcija polimeraze reverzne transkripcije" i "RT-PCR" odnose se na metodu za reverznu transkripciju sekvence RNK da bi se stvorila mešavina sekvenci cDNK, nakon čega sledi povećanje koncentracije željenog segmenta transkribovanih cDNK sekvenci u mešavini bez kloniranja ili prečišćavanja. Tipično, RNK se reverzno transkribuje korišćenjem jednog prajmera (npr., oligo-dT prajmera) pre PCR amplifikacije željenog segmenta transkribovane DNK korišćenjem dva prajmera.
[0070] Kako se ovde koristi, pojam "prajmer" se odnosi na oligonukleotid, bilo da se pojavljuje prirodno kao u prečišćenoj digestivnoj restrikciji ili je proizveden sintetički, koji je sposoban da deluje kao tačka inicijacije sinteze kada se stavi u uslove u kojima se odvija sinteza proizvoda produžetka prajmera indukuje se proizvod koji je komplementaran lancu nukleinske kiseline, (tj., u prisustvu nukleotida i indukcionog agensa kao što je DNK polimeraza i na odgovarajućoj temperaturi i pH). Prajmer je poželjno jednolančani radi maksimalne efikasnosti u amplifikaciji, ali alternativno može biti i dvolančan. Ako je dvolančan, prajmer se prvo tretira kako bi se odvojili njegovi lanci pre nego što se koristi za pripremu produžetka. Poželjno, prajmer je oligodezoksiribonukleotid. Prajmer mora biti dovoljno dugačak da bi prajmovao sintezu ekstenzionog produžetka u prisustvu indukcionog agensa. Tačne dužine prajmera će zavisiti od mnogih faktora, uključujući temperaturu, izvor prajmera i upotrebu metode.
[0071] Kako se ovde koristi, pojam "proba" se odnosi na oligonukleotid (tj., sekvencu nukleotida), bilo da se pojavljuje prirodno kao u prečišćenoj digestivnoj restrikciji ili je proizveden sintetički, rekombinantno ili PCR amplifikacijom, koji je sposoban da se hibridizuje sa drugim oligonukleotidom od interesa. Proba može biti jednočančana ili dvolančana. Probe su korisne u detekciji, identifikaciji i izolaciji određenih genskih sekvenci. Predviđeno je da će svaka proba koja se koristi u ovom predmetnom pronalasku biti označena bilo kojim "reporterskim molekulom," tako da se može detektovati u bilo kom sistemu za detekciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na enzim (npr., ELISA, kao i histohemijski test enzimski zasnovan), fluorescentne, radioaktivne, i luminescentne sisteme. Nije predviđeno da predmetni pronalazak bude ograničen na bilo koji određeni sistem detekcije ili oznaku.
[0072] Kako se ovde koristi, pojmovi "restrikcione endonukleaze" i "restrikcioni enzimi" odnosi se na bakterijske enzime, od kojih svaki seče ili urezuje dvolančane ili jednolančane DNK na ili blizu specifične nukleotidne sekvence, na primer, domen endonukleaze tipa IIS restrikcione endonukleaze (npr., Fokl) može da se koristi, kao što misle Kim i sarad., 1996, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 6:1156-60).
[0073] Kako se ovde koristi, pojam "oligonukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira gen" označava sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži kodirajući region gena, tj. sekvencu nukleinske kiseline koja kodira proizvod gena. Kodirajući region može biti prisutan ili u obliku cDNK, genomske DNK ili RNK. Kada je prisutan u obliku DNK, oligonukleotid može biti jednolančan (tj., čulni lanac) ili dvolančan. Dodatno "oligonukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira gen" može uključiti pogodne kontrolne elemente kao što su pojačivači, promotori, čvorovi spajanja, signali poliadenilacije, itd. ako je potrebno da se omogući pravilno pokretanje transkripcije i/ili ispravna obrada primarnog RNK transkripta. Još dalje, kodirajući region ovog predmetnog pronalaska može da sadrži endogene pojačivače, čvorove spajanja, intervenišuće sekvence, signale poliadenilacije, itd.
[0074] Kontrolni signali transkripcije kod eukariota sadrže elemente "pojačivače". Pojačivači se sastoje od kratkih nizova sekvenci DNK koji su u specifičnoj interakciji sa ćelijskim proteinima uključenim u transkripciju (Maniatis, T. i sarad., Science 236:1237, 1987). Elementi pojačivači su izolovani iz različitih eukariotskih izvora uključujući gene u ćelijama biljke, kvasca, insekata i sisara i virusima. Izbor određenog pojačivača zavisi od toga koji tip ćelije će se koristiti za ekspresiju proteina od interesa.
[0075] Prisustvo "signala spajanja" na vektoru ekspresije često dovodi do viših nivoa ekspresije rekombinantnog transkripta. Signali spajanja posreduju u uklanjanju introna iz primarnog RNK transkripta i sastoje se od mesta spajanja donora i akceptora (Sambrook, J. i sarad., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Njujork, str.16.7-16.8, 1989). Uobičajeno korišćeno mesto spajanja donora i akceptora je čvor spajanjaa iz 16S RNK od SV40.
[0076] Efikasna ekspresija rekombinantnih DNK sekvenci u eukariotskim ćelijama zahteva ekspresiju signala koji usmeravaju efikasanu terminaciju i poliadenilaciju rezultujućeg transkripta. Signali terminacije transkripcije se generalno nalaze nizvodno od signala poliadenilacije i dugački su nekoliko stostina nukleotida. Pojam "mesto poli A" ili "sekvenca poli A" kako se ovde koristi označava DNK sekvencu koja usmerava i terminaciju i poliadenilacija novonastalog RNK transkripta. Efikasna poliadenilacija rekombinantnog transkripta je poželjna jer su transkripti kojima nedostaje poli A rep nestabilni i brzo se razgrađuju. Signal poli A koji se koristi u vektoru ekspresije može biti "heterologan " ili "endogen." Endogeni signal poli A je onaj koji se prirodno nalazi na 3' kraju kodirajućeg regiona datog gena u genomu. Heterologni signal poli A je onaj koji je izolovan iz jednog gena i smešten na 3' kraj drugog gena.
[0077] Pojam "promotor," "promotorski element" ili "promotorska sekvenca" kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu DNK koja kada se postavi na 5’ kraj (tj., prethodi) oligonukleotidne sekvence može da kontroliše transkripciju oligonukleotidne sekvence u iRNK. Promotor se tipično nalazi 5' (tj., uzvodno) od oligonukleotidne sekvence čiju transkripciju u iRNK kontroliše i obezbeđuje mesto za specifično vezivanje RNK polimeraze i za inicijaciju transkripcije.
[0078] Pojam "promotorska aktivnost" kada se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline odnosi se na sposobnost sekvence nukleinske kiseline da započne transkripciju oligonukleotidne sekvence u iRNK.
[0079] Pojam "specifičan za tkivo" kada se odnosi na promotor, odnosi se na promotor koji je sposoban da usmeri selektivnu ekspresiju oligonukleotidne sekvence na specifičan tip tkiva u relativnom odsustvu ekspresije istog oligonukleotida u drugom tipu tkiva. Tkivna specifičnost promotora može se proceniti, na primer, operativnim povezivanjem reporterskog gena sa sekvencom promotora da bi se stvorio reporterski konstrukt, uvođenjem reporterskog konstrukta u genom biljke ili životinje tako da je reporterski konstrukt u svakom tkivu dobijene transgene životinje, i detektovanje ekspresije reporter gena (npr., detekcija iRNK, proteina, ili aktivnosti proteina kodiranog reporterskim genom) u različitim tkivima transgene biljke ili životinje. Selektivnost ne mora da bude apsolutna. Detekcija višeg nivoa ekspresiji reporterskog gena u jednom ili više tkiva u odnosu na nivo ekspresije reporterskog gena u drugim tkivima pokazuje da je promotor specifičan za tkiva u kojima se detektuju viši nivoi ekspresije.
[0080] Pojam "specifičan za tip ćelije" primenjen na promotor odnosi se na promotor koji je sposoban da usmerava selektivnu ekspresiju oligonukleotidne sekvence u specifičnom tipu ćelije u relativnom odsustvu ekspresije iste oligonukleotidne sekvence u drugom tipu ćelije unutar istog tkiva. Pojam "specifičan za tip ćelije" kada se primenjuje na promotor takođe označava promotor koji je sposoban da promoviše selektivnu ekspresiju oligonukleotida u regionu unutar jednog tkiva. Opet, selektivnost ne mora biti apsolutna. Specifičnost promotora za ćelijski tip može se proceniti korišćenjem metoda koje su dobro znane u oblasti, npr., imunohistohemijskog bojenja kako je ovde opisano. Ukratko, delovi tkiva su ugrađeni u parafin, i parafinski preseci reaguju sa primarnim antitelom koje je specifično za polipeptidni proizvod koji je kodiran oligonukleotidnom sekvencom čiju ekspresiju kontroliše promotor. Kao alternativa parafinskom preseku, uzorci mogu biti kriosekcionisani. Na primer, preseci mogu biti zamrznuti pre i tokom sečenja čime se izbegavaju potencijalne smetnje zaostalog parafina. Obeleženom (npr., konjugovano sa peroksidazom) sekundarnom antitelu koje je specifično za primarno antitelo je dozvoljeno da se veže za isečeno tkivo i detektuje se specifično vezivanje (npr., sa avidin/biotin) mikroskopijom.
[0081] Pojmovi " selektivna ekspresija," "selektivno eksprimovati" i njihovi gramatički ekvivalenti odnose se na poređenje relativnih nivoa ekspresije u dva ili više regiona od interesa. Na primer, "selektivna ekspresija" kada se koristi u vezi sa tkivima odnosi se na znatno veći nivo ekspresije gena od interesa u određenom tkivu, ili na znatno veći broj ćelija koje eksprimiraju gen unutar tog tkiva, u poređenju, redom, sa nivoom ekspresije, i brojem ćelija koje eksprimiraju, isti gen u drugom tkivu (tj., selektivnost ne mora da bude apsolutna). Selektivna ekspresija ne zahteva, iako može uključivati, ekspresiju gena od interesa u određenom tkivu i potpuno odsustvo ekspresije istog gena u drugom tkivu. Slično, "selektivna ekspresija" kako se ovde koristi u odnosu na tipove ćelija odnosi se na znatno veći nivo ekspresije, ili znatno veći broj ćelija koje eksprimiraju, gen od interesa u određenom tipu ćelije, kada se uporedi, redom, sa nivoima ekspresije gena i brojem ćelija koje eksprimiraju gen u drugom tipu ćelija.
[0082] Pojam "susedni" kada se koristi u odnosu na dve ili više nukleotidnih sekvenci znači da su nukleotidne sekvence vezane u tandemu bilo u odsustvu intervenišuće sekvence, bilo u prisustvu intervenišuće sekvence koje ne sadrže jedan ili više kontrolnih elemenata.
[0083] Kako se ovde koristi, pojmovi "kodiranje molekula nukleinske sekvence," "kodiranje nukleotida," "kodiranje DNK sekvence" i "DNK kodiranje" odnosi se na redosled ili sekvencu dezoksiribonukleotida duž lanca dezoksiribonukleinske kiseline. Redosled ovih dezoksiribonukleotida određuje redosled aminokiselina duž polipeptidnog (proteinskog) lanca. DNK sekvenca tako kodira sekvencu aminokiselina.
[0084] Pojam "izolovan" kada se koristi u vezi sa nukleinskom kiselinom, kao u "izolovanom oligonukleotidu" se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja je odvojena od najmanje jedne zagađene nukleinske kiseline sa kojom je obično povezana u svom prirodnom izvoru. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina prisutna u obliku ili okruženju koje se razlikuje od onog u kome se nalazi u prirodi. Nasuprot tome, neizolovane nukleinske kiseline su nukleinske kiseline kao što su DNK i RNK koje se nalaze u stanju u kome postoje u prirodi. Na primer, data DNK sekvenca (npr., gen) je nađena na hromozomu ćelije domaćina u blizini susednih gena; RNK sekvence, kao što je specifična iRNK sekvenca koja kodira određeni protein, nalaze se u ćeliji kao smeša sa brojnim iRNK koje kodiraju mnoštvo proteina. Međutim, izolovana nukleinska kiselina koja kodira polipeptid od interesa uključuje, kao primer, takvu nukleinsku kiselinu u ćelijama koje obično eksprimiraju polipeptid od interesa gde se nukleinska kiselina nalazi na hromozomskoj ili ekstrahromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od one u prirodnim ćelijama, ili je na drugi način okružena različitom sekvencom nukleinske kiseline od one koja se nalazi u prirodi. Izolovana nukleinska kiselina ili oligonukleotid mogu biti prisutni u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Izolovana nukleinska kiselina može se lako identifikovati (ako je poželjno) različitim tehnikama (npr., hibridizacijom, tačkastim blotingom, itd.). Kada se izolovana nukleinska kiselina ili oligonukleotid koriste da eksprimiraju protein, oligonukleotid će sadržati najmanje čulni ili kodirajući lanac (tj., oligonukleotid može biti jednolančan). Alternativno, može sadržati i čulne i antičulne lance (tj., oligonukleotid može biti dvolančan).
[0085] Kako se ovde koristi, pojam "prečišćen" ili "prečistiti" se odnosi na uklanjanje jedne ili više (neželjenih) komponenti iz uzorka. Na primer, gde se rekombinantni polipeptidi eksprimiraju u bakterijskim ćelijama domaćina, polipeptidi se prečišćavaju uklanjanjem proteina ćelije domaćina čime se povećava procenat rekombinantnih polipeptida u uzorku.
[0086] Kako se ovde koristi, pojam "značajno prečišćen" odnosi se na molekule, bilo nukleinske ili aminokiselinske sekvence, koji su uklonjeni iz svog prirodnog okruženja, izolovani ili odvojeni, i koji su najmanje 60% oslobođeni, poželjno 75% oslobođeni i poželjnije 90% oslobođeni od drugih komponenti sa kojima su prirodno povezani. Prema tome "izolovan polinukleotid" je značajno prečišćen polinukleotid.
[0087] Kako se ovde koristi pojam "kodirajući region" kada se koristi u odnosu na strukturni gen odnosi se na nukleotidne sekvence koje kodiraju aminokiseline koje se nalaze u polipeptidu u nastajanju kao rezultat translacije molekula iRNK. Kodirajući region je omeđen, kod eukariota, na 5' strani generalno nukleotidnim tripletom "ATG" koji kodira inicijator metionin i na 3' strani jednim od tri tripleta koji specifikuju stop kodone (tj., TAA, TAG, TGA).
[0088] Pod "kodirajuća sekvenca" se podrazumeva sekvenca nukleinske kiseline ili njenog komplementa, ili njenog dela, koja može biti transkribovana i/ili translatirana da bi se proizvela iRNK za i/ili polipeptid ili njegov fragment. Kodirajuće sekvence uključuju egzone u genomskoj DNK ili nezrele primarne RNK transkripte, koji su spojeni zajedno pomoću biohemijske mašinerije ćelije da bi se dobila zrela iRNK. Antičulni lanac je komplement takve nukleinske kiseline, a sekvenca za kodiranje može da se izvede iz toga.
[0089] Pod "nekodirajućom sekvencom" se podrazumeva sekvenca nukleinske kiseline ili njenog komplementa, ili njen deo koji nije transkribovan u aminokiselinu in vivo, ili gde tRNK ne stupa u reakciju da bi postavila ili pokušala da postavi aminokiselinu. Nekodirajuće sekvence obuhvataju i intronske sekvence u genomskoj DNK ili nezrele primarne RNK transkripte, i sekvence povezane sa genom kao što su promotori, pojačivači, prigušivači, itd.
[0090] Kako se ovde koristi, pojam "strukturni gen" ili "strukturna nukleotidna sekvenca" se odnosi na DNK sekvencu koja kodira RNK ili protein koji ne kontroliše ekspresiju drugih gena. Nasuprot tome, "regulatorni gen" ili "regulatorna sekvenca" je strukturni gen koji kodira proizvode (npr., faktore transkripcije) koji kontrolišu ekspresiju drugih gena.
[0091] Kako se ovde koristi, pojam "regulatorni element" se odnosi na genetski element koji kontroliše neki aspekt ekspresije sekvenci nukleinskih kiselina. Na primer, promotor je regulatorni element koji olakšava iniciranje transkripcije operativno povezanog kodirajućeg regiona. Drugi regulatorni elementi uključuju signale spajanja, signale poliadenilacije, signale terminacije, itd.
[0092] Kako se ovde koristi, pojam "mesto vezivanja peptidnog faktora transkripcije" ili "mesto vezivanja faktora transkripcije" se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja vezuje proteinske transkripcione faktore i, na taj način kontroliše neki aspekt ekspresije sekvence nukleinskih kiselina. Na primer, mesta vezivanja Sp-1 i API (protein aktivatora 1) su primeri mesta vezivanja peptidnog faktora transkripcije.
[0093] Kako se ovde koristi, pojam "gen" označava dezoksiribonukleotidne sekvence koje sadrže kodirajući region strukturnog gena. "Gen" takođe može uključivati netranslirane sekvence koje se nalaze pored kodirajućeg regiona i na 5' i na 3' krajevima tako da gen odgovara dužini iRNK pune dužine. Sekvence koje se nalaze na 5' kodirajućeg regiona i koje su prisutne na iRNK se nazivaju 5' netranslatirane sekvence. Sekvence koje se nalaze na 3' ili nizvodno od kodirajućeg regiona i koje su prisutne na iRNK nazivaju se 3' netranslatirane sekvence. Pojam "gen" obuhvata i cDNK i genomske forme gena. Genomska forma ili klon gena sadrži kodirajući region prekinut sa nekodirajućim sekvencama koje se nazivaju "introni" ili "intervenišući regioni" ili "intervenišuće sekvence." Introni su segmenti gena koji se transkribuju u heterogenu nuklearnu RNK (hnRNK); introni mogu da sadrže regulatorne elemente kao što su pojačivači. Introni se uklanjaju ili "spajaju" iz nuklearnog ili primarnog transkripta; introni su stoga odsutni u transkriptu infirmacione RNK (iRNK). iRNK funkcioniše tokom translacije da bi odredila sekvencu ili redosled aminokiselina u polipeptidu u nastajanju.
[0094] Pored toga što sadrže introne, genomski oblici gena mogu takođe uključivati sekvence koje se nalaze na 5' i 3' kraju sekvenci koje su prisutne na RNK transkriptu. Ove sekvence se nazivaju "bočne" sekvence ili regioni (ove bočne sekvence se nalaze 5' ili 3' u odnosu na netranslatirane sekvence prisutne na transkriptu iRNK). 5' bočni region može da sadrži regulatorne sekvence kao što su promotori i pojačivači koji kontrolišu ili utiču na transkripciju gena. 3' bočni region može da sadrži sekvence koje usmeravaju terminaciju transkripcije, post-transkripciono cepanje i poliadenilaciju.
[0095] "Životinja koja nije čovek" se odnosi na bilo koju životinju koja nije čovek i uključuje kičmenjake kao što su glodari, primate koji nisu ljudi, ovce, goveda, preživare, dvozupce, svinje, koze, kopitare, pse, mačke, ptice, itd. Poželjne životinje koje nisu ljudi se biraju iz reda Rodentia. "Životinja koja nije čovek" se dodatno odnosi na vodozemce (npr. Xenopus), reptile, insekte (npr. Drosophila) i druge životinjske vrste koje nisu sisari.
[0096] Kako se ovde koristi, pojam "transgenski" se odnosi na organizam ili ćeliju koja ima DNK izvedenu iz drugog organizma ubačenu u ono što se integriše u genom bilo somatskih i/ili ćelija germinativne linije biljke ili životinje. "Transgen" označava DNK sekvencu koja je delimično ili potpuno heterologna (tj., nije prisutna u prirodi) za biljku ili životinju u kojoj se nalazi, ili koja je homologna za endogenu sekvencu (tj., sekvenca koja se nalazi u prirodi u životinji) i ubacuje se u genom biljke ili životinje na lokaciji koja se razlikuje od one za sekvencu koja se nalazi u prirodi. Transgene biljke ili životinje koje uključuju jedan ili više transgena su u okviru domena predmetnog pronalaska. Dodatno, "transgenski" kako se ovde koristi se odnosi na životinju kojoj je jedan ili više gena modifikovano i/ili "nokautirano" (učinjen nefunkcionalnim ili napravljen da funkcioniše na smanjenom nivou, tj., "nokautiran" mutacijom) postupcima predmetnog pronalaska, homolognom rekombinacijom, TFO mutacijom ili sličnim procesima. Na primer, u nekim tehničkim rešenjima, transgenski organizam ili ćelija uključuje umetnutu DNK koja uključuje strani promoter i/ili kodirajući region.
[0097] "Transformisana ćelija" je ćelija ili ćelijska linija koja je stekla sposobnost da raste u ćelijskoj kulturi za više generacija, sposobnost da raste u mekom agaru, i/ili sposobnost da ne inhibira ćelijski rast kontaktom od ćelije do ćelije. S tim u vezi, transformacija se odnosi na unošenje stranog genetskog materijala u ćeliju ili organizam. Transformacija se može postići bilo kojom poznatom metodom koja dozvoljava uspešno uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije, što rezultira ekspresijom unešene nukleinske kiseline. "Transformacija" uključuje ali nije ograničena na takve metode kao što su transfekcija, mikroinjekcija, elektroporacija, nukleofekcija i lipofekcija (transfer gena posredovan lipozomom). Transformacija se može postići korišćenjem bilo kog vektora ekspresije. Na primer, razmatra se upotreba bakulovirusa za uvođenje strane nukleinske kiseline u ćelije insekta. Pojam "transformacija" takođe uključuje metode kao što je transformacija germinativne linije posredovana P-elementom celih insekata. Pored toga, transformacija se odnosi na ćelije koje su transformisane prirodno, obično kroz genetsku mutaciju.
[0098] Kako se ovde koristi "egzogeni" znači da gen koji kodira protein nije normalno eksprimiran u ćeliji. Pored toga, "egzogeni" se odnosi na gen koji je transfektovan u ćeliju da bi se povećao normalan (tj. prirodni) nivo ekspresije tog gena.
[0099] Peptidna sekvenca i nukleotidna sekvenca može biti "endogena" ili "heterologna" (tj., "strana"). Pojam "endogeni" se odnosi na sekvencu koja se prirodno nalazi u ćeliji u koju je uvedena sve dok ne sadrži neku modifikaciju u odnosu na sekvencu koja se javlja u prirodi. Pojam "heterologna" se odnosi na sekvencu koja nije endogena za ćeliju u koju je uvedena. Na primer, heterologna DNK uključuje nukleotidnu sekvencu koja je vezana za, ili kojom se manipuliše da postane vezana za sekvencu nukleinske kiseline za koju nije vezana u prirodi, ili za koju je vezana na drugoj lokaciji u prirodi. Heterologna DNK takođe uključuje nukleotidnu sekvencu koja se prirodno nalazi u ćeliji u koju je uvedena i koja sadrži neku modifikaciju u odnosu na sekvencu koja se javlja u prirodi. Generalno, iako nije neophodno, heterologna DNK kodira heterolognu RNK i heterologne proteine koje normalno ne proizvodi ćelija u koju je uvedena. Primeri heterologne DNK uključuju reporterske gene, transkripcione i translacione regulatorne sekvence, DNK sekvence koje kodiraju selektivne marker proteine (npr., proteine koji pokazuju otpornost na lekove), itd.
Konstrukti
[0100] Molekuli nukleinske kiseline ovde stavljeni na uvid javnosti (npr., nukleaze specifične za mesto, ili vodeća RNK za CRISPR-ove) može da se koristi u proizvodnji rekombinantnih konstrukata nukleinske kiseline. U jednom tehničkom rešenju, molekuli nukleinske kiseline predmetne objave mogu da se koriste u pripremi konstrukata nukleinske kiseline, na primer, ekspresionih kaseta za ekspresiju u biljci od interesa. Ova ekspresija može biti prolazna, na primer, kada konstrukt nije integrisan u genom domaćina ili se održava pod kontrolom koju nudi promotor i položaj konstrukta unutar genoma domaćina ako se integriše.
[0101] Ekspresione kasete mogu uključivati regulatorne sekvence operativno vezane za nukleazu specifičnu za mesto ili vodeće RNK sekvence koje su ovde stavljene na uvid javnosti. Kaseta može dodatno da sadrži najmanje jedan dodatni gen koji se kotransformiše u organizmu. Alternativno, dodatni gen(i) se mogu obezbediti na više ekspresionih kaseta.
[0102] Konstrukti nukleinske kiseline mogu biti obezbeđeni sa mnoštvom restrikcionih mesta za umetanje kodirajućih sekvenci nukleaze specifične za mesto da bi bila pod regulacijom transkripcije regulatornih regiona. Konstrukti nukleinska kiseline mogu dodatno da sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju za selektivne marker gene.
[0103] Bilo koji promotor može da se koristi u proizvodnji konstrukata nukleinske kiseline. Promotor može biti prirodni ili analogni, ili strani ili heterologni sekvencama nukleinske kiseline domaćina biljke koje su ovde stavljene na uvid javnosti. Dodatno, promotor može biti prirodna sekvenca ili alternativno sintetička sekvenca. Tamo gde je promotor "strani" ili "heteroloogan" biljci domaćina, predviđeno je da se taj promotor ne nalazi u nativnoj biljci u koju je uveden. Kako se ovde koristi, himerni gen sadrži kodirajuću sekvencu koja je operativno povezana sa regionom inicijacije koji je heterologan kodirajućoj sekvenci.
[0104] Sekvence nukleaze usmerene na mesto koje su ovde stavljene na uvid javnosti mogu biti eksprimirane korišćenjem heterolognih promotora.
[0105] Bilo koji promotor može da se koristi u pripremi konstrukata za kontrolu ekspresije sekvenci nukleaza usmerenih na mesto, kao što su promotori koji obezbeđuju konstitutivne, tkivno-preferirane, inducibilne, ili druge promotore za ekspresiju u biljkama. Konstitutivni promotori uključuju, na primer, promotorno jezgro Rsyn7 promotora i druge konstitutivne promotore stavljene na uvid javnosti u WO 99/43838 i U.S. Patent Br.6,072,050; jezgro CaMV 35S promotora (Odell i sarad. Nature 313:810-812; 1985); pirinčan aktin (McElroy i sarad., Plant Cell 2:163-171, 1990); ubikvitin (Christensen i sarad., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989 i Christensen i sarad., Plant Mol. Biol.18:675-689, 1992); pEMU (Last i sarad., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); MAS (Velten i sarad., EMBO J. 3:2723-2730, 1984); ALS promotor (U.S. Patent Br. 5,659,026), i slično. Drugi konstitutivni promotori obuhvataju, na primer, U.S. Patent Br.
5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142;
i 6,177,611.
[0106] Promotori koji se preferiraju u tkivu mogu da se koriste za usmeravanje ekspresije nukleaze usmerene na mesto unutar određenog biljnog tkiva. Takvi promotori preferirani u tkivu obuhvataju, ali nisu ograničeni na, promotore poželjnije za list, promotore poželjnije za koren, promotore poželjnije za seme i promotore poželjnije za stablo. Promotori koji se preferiraju u tkivu uključuju Yamamoto i sarad., Plant J.12(2):255-265, 1997; Kawamata i sarad., Plant Cell Physiol.
38(7):792-803, 1997; Hansen i sarad., Mol. Gen Genet. 254(3):337-343, 1997; Russell i sarad., Transgenic Res. 6(2):157-168, 1997; Rinehart i sarad., Plant Physiol. 1 12(3):1331-1341, 1996; Van Camp i sarad., Plant Physiol. 1 12(2):525-535, 1996; Canevascini i sarad., Plant Physiol. 112(2): 513-524, 1996; Yamamoto i sarad., Plant Cell Physiol. 35(5):773-778, 1994; Lam, Results Probl. Cell Differ. 20:181-196, 1994; Orozco i sarad. Plant Mol Biol.
23(6):1129-1138, 1993; Matsuoka i sarad., Proc Nat'l. Acad. Sci. SAD 90(20):9586- 9590, 1993; i Guevara-Garcia i sarad., Plant J.4(3):495-505, 1993.
[0107] Konstrukti nukleinske kiseline mogu takođe uključiti regione za terminaciju transkripcije. Tamo gde se koriste regioni terminacije transkripcije, bilo koji region terminacije može da se koristi u pripremi konstrukata nukleinske kiseline. Na primer, terminacioni region može biti izveden iz drugog izvora (tj., stranog ili heterolognog za promotor). Primeri regiona terminacije koji su dostupni za upotrebu u konstruktima predmetne objave uključuju one iz Ti-plazmida A. tumefaciens, kao što su terminacioni regioni oktopin sintaze i nopalin sintaze. Videti takođe Guerineau i sarad., Mol. Gen. Genet. 262:141-144, 1991; Proudfoot, Cell 64:671-674, 1991; Sanfacon i sarad., Genes Dev. 5:141-149, 1991; Mogen i sarad., Plant Cell 2:1261-1272, 1990; Munroe i sarad., Gene 91:151-158, 1990; Ballas i sarad., Nucleic Acids Res.17:7891-7903, 1989; i Joshi i sarad., Nucleic Acids Res.15:9627-9639, 1987.
[0108] U vezi sa bilo kojim od aspekata, tehničkih rešenja, metoda i/ili kompozicija koje su ovde stavljene na uvid javnosti, nukleinske kiseline mogu biti optimizovane za povećanu ekspresiju u transformisanoj biljci. To jest, nukleinske kiseline koje kodiraju proteine nukleaze usmerene na mesto mogu se sintetisati korišćenjem kodona poželjnih za biljke za poboljšanu ekspresiju. Videti, na primer, Campbell i Gowri, (Plant Physiol.92:1-11, 1990) za diskusiju o korišćenju kodona koje preferira domaćin. U oblasti su dostupne metode za sintetisanje gena poželjnih za biljke. Videti, na primer, američki patent br.5,380,831, i 5,436,391, i Murray i sarad., Nucleic Acids Res.17:477-498, 1989.
[0109] Pored toga, druge modifikacije sekvence se mogu izvršiti na nukleokiselinskim sekvencama koje su ovde stavljene na uvid javnosti. Na primer, poznato je da dodatne modifikacije sekvence poboljšavaju ekspresiju gena u ćelijskom domaćinu. Ovo uključuje eliminaciju sekvenci koje kodiraju lažne signale poliadenilacije, signale mesta spajanja egzon/intron, ponavljanja nalik transpozonu, i druge tako dobro okarakterisane sekvence koje mogu biti štetne za ekspresiju gena. Sadržaj G-C sekvence se takođe može podesiti na prosečne nivoe za ciljnog ćelijskog domaćina, kao što je izračunato pozivanjem na poznate gene eksprimirane u ćeliji domaćinu. Pored toga, sekvenca se može modifikovati da bi se izbegle predviđene sekundarne strukture iRNK.
[0110] Druge nukleokiselinske sekvence se takođe mogu koristiti u pripremi konstrukata predmetne objave, na primer da bi se poboljšala ekspresija sekvence za kodiranje nukleaze usmerene na mesto. Takve nukleokiselinske sekvence uključuju introne kukuruznog AdhI, intronl gene (Callis i sarad., Genes and Development 1:1183-1200, 1987), i vodeće sekvence, (W-sekvenca) iz Virusa Mozaika Duvana (TMV- Tobacco Mosaic virus), Virusa hlorotične pege kukuruza (Maize Chlorotic Mottle Virus) i Virus mozaika lucerke (Alfalfa Mosaic Virus) (Gallie i sarad., Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987; i Skuzeski i sarad., Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Pokazalo se da prvi intron iz skupljenog-1 lokusa kukuruza povećava ekspresiju gena u himernim genskim konstruktima. Američki pat. br. 5,424,412 i 5,593,874 stavljaju na uvid javnosti upotrebu specifičnih introna u konstruktima ekspresije gena, i Gallie i sarad. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) takođe pokazuje da su introni korisni za regulisanje ekspresije gena na osnovu specifičnosti za tkivo. Da bi se dodatno poboljšala ili optimizovala ekspresija gena nukleaze usmerene na mesto, biljni ekspresioni vektori koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu takođe da sadrže DNK sekvence koje sadrže regione vezivanja matrice (MAR - matrix attachment regions). Biljne ćelije transformisane sa takvim modifikovanim sistemima ekspresije, onda, mogu da ispolje prekomernu ekspresiju ili konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence predmetne objave.
[0111] Ekspresioni konstrukti koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu takođe uključivati nukleokiselinske sekvence sposobne da usmere ekspresiju sekvence nukleaze usmerene na mesto do hloroplasta. Takve nukleokiselinske sekvence uključuju sekvence ciljanja hloroplasta koje kodiraju tranzitni peptid hloroplasta da bi se genski proizvod od interesa usmerio na hloroplaste biljne ćelije. Takvi tranzitni peptidi su poznati u oblasti. Što se tiče sekvenci ciljanih na hloroplast, "operativno povezana" znači da je nukleokiselinska sekvenca koja kodira tranzitni peptid (tj., sekvenca koja cilja hloroplast) povezana sa molekulima nukleinske kiseline nukleaze usmerene na mesto koji su ovde stavljeni na uvid javnosti tako da su dve sekvence susedne a u istom okviru čitnja. Videti, na primer, Von Heijne i sarad., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126, 1991; Clark i sarad., J. Biol. Chem.264:17544-17550, 1989; Della-Cioppa i sarad., Plant Physiol. 84:965-968, 1987; Romer i sarad., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421, 1993; i Shah i sarad., Science 233:478-481, 1986.
[0112] Sekvence ciljanja hloroplasta su poznate u oblasti i uključuju hloroplastnu malu podjedinicu ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze (Rubisco) (de Castro Silva Filho i sarad., Plant Mol. Biol. 30:769-780, 1996; Schnell i sarad., J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342, 1991); 5-(enolpiruvil)šikimat-3-fosfat sintazu (EPSPS) (Archer i sarad., J. Bioenerg. Biomemb.22(6):789810, 1990); triptofan sintazu (Zhao i sarad., J. Biol. Chem. 270(1 1):6081- 6087, 1995); plastocianin (Lawrence i sarad., J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363, 1997); horizmat sintazu (Schmidt i sarad., J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457, 1993); i hlorofil a/b vezujući protein koji sakuplja svetlost (LHBP) (Lamppa i sarad., J. Biol. Chem. 263:14996-14999, 1988). Videti takođe Von Heijne i sarad., Plant Mol. Biol. Rep.9:104-126, 1991; Clark i sarad., J. Biol. Chem.
264:17544-17550, 1989; Della-Cioppa i sarad., Plant Physiol. 84:965-968, 1987; Romer i sarad., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421, 1993; i Shah i sarad., Science 233 :478-481, 1986.
[0113] U vezi sa bilo kojim od aspekata, tehničkih rešenja, postupaka i/ili kompozicija ovde stavljenih na uvid javnosti, konstrukti nukleinske kiseline mogu biti pripremljeni da usmere ekspresiju sekvence kodirajuće nukleaze usmerene na mesto mutanta iz hloroplasta biljne ćelije. Metode za transformaciju hloroplasta su poznate u oblasti. Videti, na primer, Svab i sarad., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87:8526-8530, 1990; Svab i Maliga, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:913-917, 1993; Svab i Maliga, EMBO J.12:601-606, 1993. Metoda se oslanja na isporuku česticama DNK koja sadrži selektabilni marker i ciljanje DNK na genom plastida putem homologne rekombinacije. Dodatno, transformacija plastida se može postići transaktivacijom tihog transgena koji se nosi plastidom putem tkivno preferirane ekspresije nuklearno kodirane i plastidom usmerene RNK polimeraze. Takav sistem je prijavljen u McBride i sarad. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:7301-7305, 1994.
[0114] Nukleinske kiseline od interesa za ciljanje na hloroplast mogu biti optimizovane za ekspresiju u hloroplastu da bi se uzele u obzir razlike u upotrebi kodona između biljnog jedra i ove organele. Na ovaj način, nukleinske kiseline od interesa mogu se sintetisati korišćenjem kodona poželjnih za hloroplast. Videt, na primer, američki patent br.5,380,831,
[0115] Konstrukti nukleinske kiseline mogu da se koriste za transformaciju biljnih ćelija i regeneraciju transgenskih biljaka koje sadrže kodirajuće sekvence nukleaze usmerene na mesto. Dostupni su brojni vektori transformacije biljaka i metode za transformaciju biljaka. Videti, na primer, američki patent br.6,753,458, An, G. i sarad., Plant Physiol., 81:301-305, 1986; Fry, J. i sarad., Plant Cell Rep. 6:321-325, 1987; Block, M., Theor. Appl Genet. 76:767-774, 1988; Hinchee i sarad., Stadler. Genet. Symp.203212.203-212, 1990; Cousins i sarad., Aust. J. Plant Physiol.18:481-494, 1991; Chee, P. P. i Slightom, J. L., Gene.118:255-260, 1992; Christou i sarad., Trkrajevi. Biotechnol. 10:239-246, 1992; D'Halluin i sarad., Bio/Technol. 10:309-3 14, 1992; Dhir i sarad., Plant Physiol. 99:81-88, 1992; Casas i sarad., Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 90:11212-11216, 1993; Christou, P., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 29P:119-124, 1993; Davies, i sarad., Plant Cell Rep.12:180-183, 1993; Dong, J. A. i Mc Hughen, A., Plant Sci.91:139-148, 1993; Franklin, C. I. i Trieu, T. N., Plant. Physiol. 102:167, 1993; Golovkin i sarad., Plant Sci.
90:41-52, 1993; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano, i sarad., Plant Cell Rep. 13, 1994; Ayeres N. M. and Park, W. D., Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239, 1994; Barcelo i sarad., Biljka. J.5:583-592, 1994; Becker, i sarad., Plant. J.5:299-307, 1994; Borkowska i sarad., Acta. Physiol Plant. 16:225-230, 1994; Christou, P., Agro. Food. Ind. Hi Tech.5:17-27, 1994; Eapen i sarad., Plant Cell Rep. 13:582-586, 1994; Hartman i sarad., Bio-Technology 12:919923, 1994; Ritala i sarad., Plant. Mol. Biol. 24:317-325, 1994; i Wan, Y. C. i Lemaux, P. G., Plant Physiol. 104:3748, 1994. Konstrukti se takođe mogu transformisati u biljnim ćelijama korišćenjem homologne rekombinacije.
[0116] Pojam "divlji tip" kada se koristi u odnosu na peptidnu sekvencu i nukleotidnu sekvencu odnosi se na peptidnu sekvencu i nukleotidnu sekvencu (lokus/gen/alel), redom, koja ima karakteristike te peptidne sekvence i nukleotidne sekvence kada su izolovane iz prirodnog izvora. Peptidna sekvenca i nukleotidna sekvenca divljeg tipa je ona koja se najčešće primećuje u populaciji i stoga je proizvoljno označena kao "normalni" ili "divlji tip" oblika peptidne sekvence i nukleotidne sekvence, redom. "Divlji tip" se takođe može odnositi na sekvencu na specifičnoj poziciji ili pozicijama nukleotida, ili na sekvencu na određenoj poziciji ili pozicijama kodona, ili sekvencu na određenoj poziciji ili pozicijama aminokiselina.
[0117] "Konsenzus sekvenca" je definisana kao sekvenca aminokiselina ili nukleotida koja sadrži identične aminokiseline ili nukleotide ili funkcionalno ekvivalentne aminokiseline ili nukleotide u najmanje 25% sekvence. Identične ili funkcionalno ekvivalentne aminokiseline ili nukleotidi ne moraju biti susedni.
[0118] Pojam "Brassica" kako se ovde koristi odnosi se na biljke iz roda Brassica genus. Primeri vrsta Brassica uključuju, ali nisu ograničeni na, B. carinata, B. elongate, B. fruticulosa, B. juncea, B. napus, B. narinosa, B. nigra, B. oleracea, B. perviridis, B. rapa (syn B. campestris), B. rupestris, B. septiceps, i B. tournefortii.
[0119] Nukleobaza je baza, koja je u određenim poželjnim tehničkim rešenjima purin, pirimidin, ili njihov derivat ili analog. Nukleozidi su nukleobaze koje sadrže pentozofuranozil deo, npr., opciono supstitusan ribozid ili 2'-dezoksiribozid. Nukleozidi mogu biti povezani jednim od nekoliko spojnih delova, koji mogu a ne moraju da sadrže fosfor. Nukleozidi koji su lukom povezani nesupstituisanim fosfodiestarskim vezama nazivaju se nukleotidi. Pojam "nukleobaza" kako se ovde koristi uključuje peptidne nukleobaze, podjedinice peptidnih nukleinskih kiselina, i morfolinske nukleobaze kao i nukleozide i nukleotide.
[0120] Oligonukleobaza je polimer koji sadrži nukleobaze; poželjno je da bar jedan deo može da se hibridizuje Watson-Crick uparivanjem baza sa DNK koja ima komplementarnu sekvencu. Lanac oligonukleobaze može imati jedan 5' i 3' kraj, koji su krajnje nukleobaze polimera. Određeni lanac oligonukleobaze može sadržati nukleobaze svih tipova. Jedinjenje oligonukleobaze je jedinjenje koje sadrži jedan ili više lanaca oligonukleobaza koji mogu biti komplementarni i hibridizovani Watson-Crick uparivanjem baza. Nukleobaze ribo-tipa uključuju nukleobaze koje sadrže pentozofuranozil u kojima je 2' ugljenik metilen substituisansan hidroksilom, alkoksi ili halogenom. Dezoksiribo-tip nukleobaza su nukleobaze koje nisu nukleobaze ribo tipa i uključuju sve nukleobaze koje ne sadrže pentozofuranozil grupu.
[0121] U određenim tehničkim rešenjima, lanac oligonukleobaze može uključivati i lance oligonukleobaze i segmente ili regione lanaca oligonukleobaza. Lanac oligonukleobaze može imati 3' kraj i 5’ kraj, a kada je lanac oligonukleobaze koekstenzivan sa lancem, 3' i 5' krajevi lanca su takođe 3' i 5' krajevi lanca.
[0122] Pojam "oligonukleobaza za popravku gena" kako se ovde koristi označava oligonukleobaze, uključujući mešovite dupleks oligonukleotide, molekule koji ne sadrže nukleotid, jednolančane oligodezoksinukleotide i druge molekule za popravku molekula.
[0123] Kako se ovde koristi pojam "kodon" se odnosi na sekvencu od tri susedna nukleotida (bilo RNK ili DNK) koji čine genetski kod koji određuje umetanje specifične aminokiseline u polipeptidni lanac tokom sinteze proteina ili signala za zaustavljanje sinteze proteina. Pojam "kodon" se takođe koristi za označavanje odgovarajućih (i komplementarnih) sekvenci od tri nukleotida u informacionoj RNK u koju je transkribovana originalna DNK.
[0124] Kako se ovde koristi, pojam "homologija" se odnosi na sličnost sekvence između proteina i DNK. Pojam "homologija" ili "homologan" odnosi se na stepen identičnosti. Može postojati delimična ili potpuna homologija. Delimično homologna sekvenca je ona koja ima manje od 100% identičnosti sekvence u poređenju sa drugom sekvencom.
[0125] "Heterozigot" se odnosi na postojanje različitih alela na jednom ili više genetskih lokusa u homolognim segmentima hromozoma. Kako se ovde koristi "heterozigot" se takođe može odnositi na uzorak, ćeliju, ćelijsku populaciju ili organizam u kome se mogu detektovati različiti aleli na jednom ili više genetskih lokusa. Heterozigotni uzorci se takođe mogu odrediti preko metoda koje su poznate u oblasti kao što je, na primer, sekvenciranje nukleinske kiseline. Na primer, ako elektroferogram sekvenciranja pokazuje dva pika na jednom lokusu i oba pika su otprilike iste veličine, uzorak se može okarakterisati kao heterozigot. Ili, ako je jedan pik manji od drugog, ali je najmanje oko 25% veličine većeg pika, uzorak se može okarakterisati kao heterozigot. U nekim tehničkim rešenjima, manji pik je najmanje oko 15% većeg pika. U drugim tehničkim rešenjima, manji pik je najmanje oko 10% većeg pika. U drugim tehničkim rešenjima, manji pik je najmanje oko 5% većeg pika. U drugim tehničkim rešenjima, detektuje se minimalna količina manjeg pika.
[0126] Kako se ovde koristi, "homozigot" se odnosi na postojanje identičnih alela na jednom ili više genetskih lokusa u homolognim segmentima hromozoma. "Homozigot" se takođe može odnositi na uzorak, ćeliju, ćelijsku populaciju ili organizam u kome se mogu detektovati isti aleli na jednom ili više genetskih lokusa. Homozigotni uzorci se takođe mogu odrediti preko metoda koje su poznate u oblasti, kao što je, na primer, sekvenciranje nukleinske kiseline. Na primer, ako elektroferogram sekvenciranja pokazuje jedan pik na određenom lokusu, uzorak se može nazvati "homozigotom" u odnosu na taj lokus.
[0127] Pojam "hemizigot" se odnosi na gen ili segment gena koji je prisutan samo jednom u genotipu ćelije ili organizma jer je drugi alel izbrisan. Kako se ovde koristi "hemizigot" se takođe može odnositi na uzorak, ćeliju, ćelijsku populaciju ili organizam u kome se alel na jednom ili više genetskih lokusa može detektovati samo jednom u genotipu.
[0128] Pojam "status zigoziteta" kako se ovde koristi se odnosi na uzorak, ćelijsku populaciju, ili organizam koji izgleda kao heterozigot, homozigot, ili hemizigot kao što je utvrđeno metodama ispitivanja poznatim u oblasti i opisanim ovde. Pojam "status zigoziteta nukleinske kiseline" znači određivanje da li izvor nukleinske kiseline izgleda kao heterozigot, homozigot, ili hemizigot. "Status zigoziteta" može se odnositi na razlike u jednom nukleotidu u sekvenci. U nekim metodama, status zigoziteta uzorka u odnosu na pojedinačnu mutaciju može biti kategorisan kao homozigotni divlji tip, heterozigot (tj., jedan alel divljeg tipa i jedan mutantni alel), homozigotni mutant, ili hemizigot (tj., jedna kopija bilo divljeg tipa bilo mutantnog alela).
[0129] Kako se ovde koristi, pojam "RTDS" se odnosi na sistem za brzi razvoj osobina (Rapid Trait Development System<™>-RTDS) koji je razvio Cibus. RTDS je sistem genske modifikacije specifičan za mesto koji je efikasan u vršenju preciznih promena u sekvenci gena bez ugradnje stranih gena ili kontrolnih sekvenci.
[0130] Pojam "oko" kako se ovde koristi znači u kvantitativnom smislu plus ili minus 10%. Na primer, "oko 3%" bi obuhvatalo 2.7-3.3% a "oko 10%"bi obuhvatalo 9-11%.
Popravka Oligonukleotida
[0131] Predmetni pronalazak generalno se odnosi na nove postupke za poboljšanje efikasnosti ciljanja modifikacija na specifičnim lokacijama u genomskim ili drugim nukleotidnim sekvencama. Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na ciljnu DNK koja je modifikovana, mutirana ili obeležena pristupima koji su ovde stavljeni na uvid javnosti. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćelije, tkiva, i organizme koji su modifikovani postupcima predmetnog pronalaska. Predmetni pronalazak se zasniva na građenju kompozicija i postupaka koji se delimično odnose na uspešan sisitem konverzije, sistem za brzi razvoj osobina (RTDS<™>, Cibus US LLC).
[0132] RTDS se zasniva na promeni ciljanog gena korišćenjem sopstvenog sistema za popravku gena ćelije da bi se specifično modifikovala sekvenca gena in situ i da se ne bi ubacila strana DNK i sekvence kontrole ekspresije gena. Ova procedura utiče na preciznu promenu genetske sekvence dok ostatak genoma ostaje nepromenjen. Za razliku od konvencionalnih transgenih GMO, nema integracije stranog genetskog materijala, niti je bilo kakav strani genetski materijal ostavljen u biljci. Promene u genetskoj sekvenci koje je uveo RTDS nisu nasumično umetnute. Pošto pogođeni geni ostaju na svojoj matičnoj lokaciji, ne dolazi do slučajnog, nekontrolisanog ili nepovoljnog obrasca ekspresije.
[0133] RTDS koji utiče na ovu promenu je hemijski sintetisan oligonukleotid koji može biti sastavljen i od DNK i od modifikovanih RNK baza kao i od drugih hemijskih delova, i dizajniran je da hibridizuje na ciljanoj lokaciji gena kako bi stvorio neusklađen bazni par(ove). Ovaj neusklađeni bazni par deluje kao signal za privlačenje sopstvenog prirodnog sistema za popravku gena ćelije na to mesto i ispravljanje (zamena, umetanje ili brisanje) naznačenih nukleotida unutar gena. Kada se proces korekcije završi, RTDS molekul se razgrađuje i sada novomodifikovani ili popravljeni gen se eksprimira pod normalnim endogenim kontrolnim mehanizmima tog gena.
[0134] Postupci i kompozicije koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu se primeniti ili napraviti sa "oligonukleobazama za popravku gena" (GRON) koje imaju konformacije i hemijske osobine kao što je detaljno opisano u nastavku. "Oligonukleobaze za popravku gena" kako se ovde razmatraju su takođe opisane u objavljenoj naučnoj i patentnoj literaturi koristeći druge nazive uključujući "rekonbinogene oligonukleobaze;" "RNK/DNK himerni oligonukleotidi;" "himerni oligonukleotidi;" "mešoviti dupleks oligonukleotidi" (MDON); "RNK DNK oligonukleotidi (RDO);" "oligonukleotidi koji ciljaju gen;" "genoplasti;" "jednolančani modifikovani oligonukleotidi;" "jednolančani oligodezoksinukleotidni mutacioni vektori" (SSOMV); "dupleks mutacioni vektori;" i "heterodupleks mutacioni vektori." Oligonukleobaza za popravku gena može se uvesti u biljnu ćeliju korišćenjem bilo kog postupka koji se uobičajeno koristi u oblasti, uključujući ali nisu ograničeni na, mikronosače (biolističku isporuku), mikrovlakna, preuzimanje posredovano polietilen glikololom (PEG), elektroporaciju, i mikroinjektiranje.
[0135] U jednom tehničkom rešenju, oligonukleobaza za popravku gena je mešoviti dupleks oligonukleotidi (MDON) u kojima su nukleotidi tipa RNK mešovitog dupleks oligonukleotida napravljeni otpornim na RNazu zamenom 2'~hidroksil sa fluoro, hloro ili bromo funkcionalnošću ili stavljanjem supstituenta na 2'-O. Pogodni supstituenti uključuju supstituente opisane u Kmiec II. Alternativni supstituenti uključuju supstituente opisane u američkom pat. br. 5,334,71 1 (Sproat) i supstituente opisane u patentnim publikacijama EP 629 387 i EP 679 657 (zajedno, Martinove aplikacije), Kako se ovde koristi, 2'-fluoro, hloro ili bromo derivat ribonukleotida ili ribonukleotid koji ima T- OH supstituisan sa supstituentom opisanim u Martinovim aplikacijama ili Sproat-u naziva se "T- supstituisani ribonukleotid." Kako se ovde koristi izrsz "nukleotid tipa RNK" označava T- hidroksil ili 2 '-supstituisani nukleotid koji je vezan za druge nukleotide mešovitog dupleks oligonukleotida nesupstituisanom fosfodiestarskom vezom ili bilo kojom od veza koje nisu prirodne opisane u Kmiec I ili Kmiec II. Kako se ovde koristi pojam "nukleotid dezoksiribo-tipa" označava nukleotid koji ima T-H, koji može biti povezan sa drugim nukleotidima oligonukleobaze za popravku gena nesupstituisanom fosfodiestarskom vezom ili bilo kojom od veza koje nisu prirodne koje su opisane u Kmiec I ili Kmiec II.
[0136] U posebnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, oligonukleobaza za popravku gena je mešoviti dupleks oligonukleotid (MDON) koji je vezan isključivo nesupstituisanim fosfodiestarskim vezama. U alternativnim tehničkim rešenjima, veza je supstituisanim fosfodiestrima, derivatima fosfodiestara i vezama koje nisu zasnovane na fosforu opisane kod Kmiec II. U još jednom tehničkom rešenju, svaki nukleotid tipa RNK u mešovitom dupleks oligonukleotidu je 2 '-supstituisani nukleotid. Naročito poželjna tehnička rešenja 2'-supstituisanih ribonukleotida su 2'-fluoro, T- metoksi, 2'-propiloksi, 2'-aliloksi, 2'-hidroksiletiloksi, 2'-metoksietiloksi, T- fluoropropiloksi i 2'-trifluoropropiloksi supstituisani ribonukleotidi. Poželjnija tehnička rešenja 2'-supstituisanih ribonukleotida su 2'-fluoro, 2'-metoksi, 2'-metoksietiloksi, i 2'-aliloksi supstituisani nukleotidi. U drugom tehničkom rešenju mešoviti dupleks oligonukleotid je vezan nesupstituisanim fosfodiestarskim vezama,
[0137] Iako se pogodnije sintetišu mešoviti dupleks oligonukleotidi (MDON) koji imaju samo jedan tip 2'- supstituisanog nukleotida tipa RNK, postupci predmetnog pronalaska se mogu primeniti sa mešovitim dupleks oligonukleotidima koji imaju dva ili više tipova nukleotida tipa RNK. Na funkciju RNK segmenta možda neće uticati prekid izazvan uvođenjem dezoksinukleotida između dva trinukleotida tipa RNK, shodno tome, pojam RNK segment obuhvata pojmove kao što je "prekinuti RNK segment." Neprekinuti RNK segment se naziva susedni RNK segment. U alternatvnom tehničkom rešenju RNK segment može da sadrži naizmenično otporne na RNazu i nesupstituisane 2'-OH nukleotide. Mešoviti dupleks oligonukleotidi poželjno imaju manje od 100 nukleotida i poželjnije manje od 85 nukleotida, ali više od 50 nukleotida. Prvi i drugi lanac su upareni sa bazom prema Watson-Crick uparivanju. U jednom tehničkom rešenju lanci mešovitog dupleks oligonukleotida su kovalentno vezani povezivačem, kao što je jednolančani heksa, penta ili tetranukleotid, tako da su prvi i drugi lanci segmenti jednog oligonukleotidnog lanca koji ima jedan 3' i jedan 5’ kraj.3' i 5' krajevi mogu biti zaštićeni dodatkom "kape za matičnu petlju" (eng. hairpin cap) pri čemu su 3' i 5' terminalni nukleotidi Watson-Crick upareni sa susednim nukleotidima. Druga kapa za matičnu petlju može se dodatno postaviti na spoj, između prvog i drugog lanca dalje od 3' i 5' krajeva, tako da se Watson-Crick uparivanje stabilizuje između prvog i drugog lanca.
[0138] Prvi i drugi lanac sadrže dva regiona koji su homologni sa dva fragmenta ciljnog gena, tj., imaju istu sekvencu kao ciljni gen. Homologni region sadrži nukleotide RNK segmenta i može da sadrži jedan ili više nukleotida tipa DNK, spajajućeg segmenta DNK i takođe može sadržati nukleotide tipa DNK koji se ne nalaze unutar interventnog segmenta DNK. Dva regiona homologije su odvojena pomoću, i svaki je pored, regiona koji ima sekvencu koja se razlikuje od sekvence ciljnog gena, nazvanog "heterologni region." Heterologni region može da sadrži jedan, dva ili tri neusklađena nukleotida. Neusklađeni nukleotidi mogu biti susedni ili alternativno mogu biti razdvojeni pomoću jednom ili dva nukleotida koji su homologni sa ciljnim genom. Alternativno, heterologni region takođe može da sadrži inserciju ili jedan, dva, tri ili pet ili manje nukleotida. Alternativno, sekvenca mešovitog dupleks oligonukleotida može da se razlikuje od sekvence ciljnog gena samo delecijom jednog, dva, tri, ili pet ili manje nukleotida iz mešovitog dupleks oligonukleotida. Dužina i položaj heterolognog regiona se, u ovom slučaju, smatra dužinom delecije, iako se nijedan nukleotidid mešovitog dupleks oligonukleotida ne nalazi unutar heterolognog regiona. Razdaljina između fragmenata ciljnog gena koji su komplementarni sa dva homologna regiona je identična dužina heterolognog regiona gde se namerava supstitucija ili supstitucije. Kada heterologni region sadrži inserciju, homologni regioni su na taj način odvojeni, u mešovitom dupleks nukleotidu, više nego što su njihovi komplementarni homologni fragmenti u genu, i obrnuto je primenljivo kada heterologni region kodira deleciju.
[0139] RNK segmenti mešovitih dupleks oligonukleotida su svaki deo homolognog regiona, tj., regiona koji je identičan po sekvenci sa fragmentom ciljnog gena, a ti segmenti zajedno poželjno sadrže najmanje 13 nukleotida tipa RNK i poželjno od 16 do 25 nukleotida tipa RNK ili još poželjnije 18-22 nukleotida tipa RNK ili najpoželjnije 20 nukleotida. U jednom tehničkom rešenju, RNK segmenti homolognih regiona su razdvojeni i susedni, tj., "povezani" sa interventnim DNK segmentom. U jednom tehničkom rešenju, svaki nukleotid heterolognog regiona je nukleotid interventnog DNK segmenta. Interventni segment DNK koji sadrži heterologni region mešovitog dupleks oligonukleotida naziva se "segment mutatora."
[0140] U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, oligonukleobaza za popravku gena (GRON) je jednolančani oligodezoksinukleotidni mutacioni vektor (SSOMV), koji je stavljen na uvid javnosti u međunarodnoj prijavi patenta PCT/USOO/23457, američkim pat. sa br.
6,271,360, 6,479,292, i 7,060,500. Sekvenca SSOMV je zasnovana na istim principima kao mutacioni vektori opisani u američkim pat. br.
5,756,325; 5,871,984; 5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5,780,296; 5,945,339; 6,004,804;
i 6,010,907 i u međunarodnim publikacijama sa br. WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; i WO 99/40789. Sekvenca SSOMV sadrži dva regiona koja su homologna sa ciljnom sekvencom odvojena regionom koji sadrži željenu genetsku promenu nazvanu region mutatora. Region mutatora može imati sekvencu koja je iste dužine kao sekvenca koja razdvaja homologne regione u ciljnoj sekvenci, ali ima drugačiju sekvencu. Takav mutatorski region može izazvati supstituciju. Alternativno, homologni regioni u SSOMV mogu biti susedni jedan drugom, dok su regioni u ciljnom genu koji imaju istu sekvencu razdvojeni pomoću jednog, dva ili više nukleotida. Takav SSOMV izaziva deleciju iz ciljnog gena nukleotida koji su odsutni u SSOMV. Najzad, sekvenca ciljnog gena koja je identična homolognim regionima može biti susedna u odnosu na ciljni gen ali odvojena pomoću jednog, dva, ili više nukleotida u sekvenci SSOMV. Takav SSOMV izaziva inserciju u sekvencu ciljnog gena.
[0141] Nukleotidi SSOMV su dezoksiribonukleotidi koji su povezani nemodifikovanim fosfodiestarskim vezama osim što 3' terminalna i/ili 5' terminalna internukleotidna veza ili alternativno dve 3' terminalne i/ili 5' terminalne internukleotidne veze mogu biti fosfortioatna ili fosfoamidna. Kako se ovde koristi internukleotidna veza je veza između nukleotida SSOMV i ne uključuje vezu između 3' kraja nukleotida ili 5’ kraja nukleotida i supstituenta za blokiranje. U specifičnom tehničkom rešenju dužina SSOMV je između 21 i 55 dezoksinukleotida i dužine regiona homologije su, shodno tome, ukupna dužina od najmanje 20 dezoksinukleotida i najmanje dva regiona homologije treba da imaju dužinu od najmanje 8 dezoksinukleotida.
[0142] SSOMV može biti dizajniran da bude komplementaran bilo kodirajućem ili nekodirajućem lancu ciljnog gena. Kada je željena mutacija supstitucija jedne baze, poželjno je da i nukleotid mutatora i ciljni nukleotid budu pirimidin. U meri koja je u skladu sa postizanjem željenog funkcionalnog rezultata, poželjno je da i nukleotid mutatora i ciljani nukleotid u komplementranom lancu budu pirimidini. Naročito poželjni su SSOMV-ovi koji kodiraju transverzione mutacije, tj., nukleotid C ili T mutatora nije usklađen, redom, sa nukleotidom C ili T u komplementranom lancu.
Poboljšanje efikasnosti
[0143] Predmetni pronalazak opisuje brojne pristupe za povećanje efikasnosti konverzije ciljnog gena korišćenjem reparacionih oligonukleotida, i koji se mogu koristiti sami ili u kombinaciji jedan sa drugim. Ovo uključuje:
1. Uvođenje modifikacija u oligonukleotide za popravku koji privlače mašineriju za popravku DNK na ciljano (nepodudarno) mesto.
A. Uvođenje jednog ili više abazičnih mesta u oligonukleotid (npr., unutar 10 baza, a poželjnije sa 5 baza na željenom mestu neusklađenosti) stvara leziju koja je međuproizvod u popravci ekscizije baze (BER - base excision repair), i koja privlači BER mašineriju u blizini mesta ciljanog za konverziju pomoću reparacionog oligonukleotida. dSpejser (dSpacer - abazični furan) modifikovani oligonukleotidi mogu biti pripremljeni kako je opisano u, na primer, Takeshita i sarad., J. Biol. Chem., 262:10171-79, 1987.
B. Uvođenje jedinjenja koja izazivaju jednostruke ili dvostruke prekide lanca, bilo u oligonukleotidu ili zajedno sa oligonukleotidom, stvara leziju koja se popravlja pomoću nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ - non-homologous end joining), mikrohomologijom-posredovanog spajanja krajeva (MMEJ - microhomologymediated end joining), i homologne rekombinacije. Na primer, familija bleomicin antibiotika, cinkovi prsti, Fokl (ili bilo kog tipa IIS klasa restrikcionog enzima) i druge nukleaze mogu biti kovalentno spregnute sa 3' ili 5’ krajem reparacionih oligonukleotida, kako bi se uveo dvostruki prekid lanaca u blizini mesta ciljanog za konverziju pomoću reparacionog oligonukleotida. Familija bleomicin antibiotika su glikopeptidi koji cepaju DNK uključujući bleomicin, zeocin, fleomicin, talizomicin, pepleomicin i drugi.
C. Uvođenje jednog ili više 8'okso dA ili dG ugrađenih u oligonukleotid (npr., unutar 10 baza, i poželjnije sa 5 baza na željenom mestu neusklađenosti) stvara leziju koja je slična lezijama koje stvaraju reaktivne vrste kiseonika. Ove lezije izazivaju takozvani sistem"popravke guranjem". Videti, npr., Kim i sarad., J. Biochem. Mol. Biol.37:657-62, 2004.
ljšanje stabilnosti reparacionih oligonukleotida:
Uvođenje reverzne baze (idC) na 3' kraju oligonukleotida da bi se stvorio 3' blokirani kraj na reparacionom oligonukleotidu.
Uvođenje jednog ili više 2'O-metil nukleotida ili baza koji povećavaju energiju hibridizacije (videti, npr., WO2007/073149) na 5' i/ili 3' reparacionog oligonukleotida.
Uvođenje većeg broja 2'O-metil RNK nukleotida na 5’ kraju reparacionog oligonukleotida, što dovodi do DNK baza koje obezbeđuju željeno mesto neslaganja, stvarajući tako strukturu nukleinske kiseline sličnu Okazaki fragmentu. Konjugovane (5' ili 3') interkalirajuće boje kao što su akridin, psoralen, etidijum bromid i Siber boje.
Uvođenje 5' terminalne kape kao što su T/A spona, segment holesterola, SIMA (HEX), riboC i amidit.
Modifikacije okosnice kao što su fosfotioat, 2'-O metil, metil fosfonati, zaključana nukleinska kiselina (LNA - locked nucleic acid), MOE (metoksietil), di PS i peptidna nukleinska kiselina (PNA).
Unakrsno povezivanje reparacionog oligonukleotida, npr., sa reagensima za intralančano unakrsno povezivanje kao što su cisplatina i mitomicin C.
Konjugacija sa fluorescentnim bojama kao što su Cy3, DY547, Cy3.5, Cy3B, Cy5 i DY647.
3. Povećanje energije hibridizacije reparacionog oligonukleotida kroz ugradnju baza koje povećavaju energiju hibridizacije (videti, npr., WO2007/073149).
4. Povećanje kvaliteta sinteze reparacionog oligonukleotida korišćenjem nukleotidnih multimera (dimera, trimera, tetramera, itd.) kao gradivnih blokova za sintezu. Ovo rezultira manjim brojem koraka kuplovanja i lakšim odvajanjem proizvoda pune dužine od gradivnih blokova.
5. Upotrebu dugih oligonukleotida popravke (tj., dužine veće od 55 nukleotida, poželjno između 75 i 300 nukleotida dužine, poželjnije najmanje 100 nukleotida dužine, još poželjnije najmanje 150 nukleotida dužine, i najpoželjnije najmanje 200 nukleotida dužine), poželjno sa dve ili više mutacija usmerenih na reparacioni oligonukleotid.
[0144] Primeri prethodnih pristupa dati su sledećoj tabeli
Tabela 1. Hemijske karakteristike GRON-a koje treba testirati..
[0145] Prethodne modifikacije takođe mogu uključiti poznate modifikacije nukleotida kao što su metilacija, 5' interkalirajuće boje, modifikacije na 5' i 3' krajevima, modifikacije okosnice, umrežioce, ciklizaciju i 'kape' i supstituciju jednog ili više nukleotida koji se javljaju u prirodi sa analogom kao što je inozin. Modifikacije nukleotida uključuju dodavanje akridina, amina, biotina, kaskadne plave boje, holesterola, Cy3@, Cy5@, Cy5.5@ Daboila, digoksigenina, dinitrofenila, Edansa, 6-FAM, fluoresceina, 3'- glicerila, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfat psoralena, rodamina, ROX, tiola (SH), spejsera, TAMRA, TET, AMCA-S", SE, BODIPY°, Marina Blue@, Pacific Blue@, Oregon Green@, Rhodamine Green@, Rhodamine Red@, Rhodol Green@ i Texas Red@. Modifikacije polinukleotidne okosnice uključuju metilfosfonat, 2'-OMemetilfosfonat RNK, fosforotiorat, RNK, 2'-OMeRNK. Modifikacije baze uključuju 2-amino-dA, 2-aminopurin, 3'- (ddA), 3'dA (kordicepin), 7-deaza-dA, 8-Br-dA, 8- okso-dA, N6-Me-dA, abazično mesto (dSpejser), biotin dT, 2'-OMe-5Me-C, 2'-OMe-propinil-C, 3'- (5-Me-dC), 3'-(ddC), 5-Br-dC, 5-1-duc, 5-Me-dC, 5-F-dC, karboksi-dT, konvertibilni dA, konvertibilni dC, konvertibilni dG, konvertibilni dT, konvertibilni dU, 7-deaza-dG, 8-Br-dG, 8- okso-dG, O6-MedG, S6-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2'-OMe-inozin, 2'-dl, o6- fenil-dl, 4-metil-indol, 2'-dezoksinebularin, 5-nitroindol, 2-aminopurin, dP (purinski analog), dK (pirimidinski analog), 3-nitropirol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotin-dT, karboksi-dT, 04-Me-dT, 04-triazol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5-Br-dU, 2'-dU, 5-F-dU, 5-l-dU, 04-triazol dU. Navedeni pojmovi takođe obuhvataju peptidne nukleinske kiseline (PNK), analoge DNK u kojima je okosnica pseudopeptid koji se sastoji od jedinica N- (2-aminoetil)-glicina, umesto šećera. PNK oponašaju ponašanje DNK i vezuju komplementarne lance nukleinske kiseline. Neutralna okosnica PNK resultira jačim vezivanjem i većom specifičnošću nego što se normalno postiže. Pored toga, jedinstvena hemijska, fizička i biološka svojstva PNK su iskorišćena za proizvodnju moćnih biomolekularnih alata, antičulnih i antigenskih agenasa, molekularnih proba i biosenzora.
[0146] Oligonukleobaze mogu imati urez(e), pukotinu(e), modifikovane nukleotide kao što su modifikovane okosnice oligonukleotida, abazični nukleotidi, ili drugi hemijski ostaci. U daljem tehničkom rešenju, najmanje jedan lanac oligonukleobaze uključuje najmanje jedan dodatni modifikovani nukleotid, npr., 2'-O-metil modifikovani nukleotid kao što je MOE (metoksietil), nukleotid koji ima 5'-fosforotioatnu grupu, terminalni nukleotid vezan za derivate holesterola, 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovan nukleotid, 2'-dezoksi-modifikovan nukleotid, zaključani nukleotid, abazični nukleotid (nukleobaza nedostaje ili ima hidroksilnu grupu na svom mestu (videti, npr., Glen Research, http:// www.glenresearch.com/GlenReports/GR21-14.html)), 2'-aminomodifikovani nukleotid, 2'-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidit, i nukleotid koji sadrži bazu koja nije prirodna. Uključene su takođe i različite soli, mešovite soli i oblici slobodnih kiselina.
[0147] Poželjna modifikovana oligonukleotidna okosnica uključuje, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforo-ditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate, 5'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3'-amino fosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkil-fosfonate, tionoalkilfosfotriestre, selenofosfate i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, 2'-5' njihove povezane analoge, i one sa obrnutim polaritetom gde je jedna ili više internukleotidnih veza 3' sa 3', 5' sa 5' ili 2' sa 2' veza. Poželjni oligonukleotidi sa obrnutim polaritetom sadrže jednu vezu 3' sa 3' na 3' najviše internukleotidnoj vezi tj. jedan invertovani nukleozidni ostatak koji može biti abazičan (nukleobaza nedostaje ili ima hidroksilnu grupu na svom mestu). Najčešća upotreba inverzije veze je dodavanje 3'-3' veze na kraj antičulnog oligonukleotida sa fosforotioatnom okosnicom.3'-3' veza dalje stabilizuje antičulni oligonukleotid na degradaciju egzonukleaze stvaranjem oligonukleotida sa dva 5'-OH kraja i bez 3'-OH kraja. Inverzije veze mogu se uvesti na određene lokacije tokom sinteze oligonukleotida korišćenjem "obrnutih fosforamidita". Ovi reagensi imaju fosforamiditne grupe na 5'-OH položaju i dimetoksitritil (DMT) zaštitnu grupu na 3'-OH položaju. Normalno, zaštitna DMT grupa je na 5'-OH i fosforamidit je na 3'-OH.
[0148] Primeri modifikovanih baza uključuju, ali nisu ograničeni na, 2-aminopurin, 2'-aminobutiril piren-uridin, 2'-aminouridin, 2'-dezoksiuridin, 2'-fluoro-citidin, 2'-fluoro-uridin, 2,6-diaminopurin, 4-tio-uridin, 5-bromo-uridin, 5-fluoro-citidin, 5-fluorouridin, 5-indo-uridin, 5-metil-citidin, inozin, N3-metil-uridin, 7-deaza-guanin, 8-aminoheksil-amino-adenin, 6-tio-guanin, 4-tio-timin, 2-tio-timin, 5-jodo-uridin, 5-jodo-citidin, 8-bromo-guanin, 8-bromo-adenin, 7-deazaadenin, 7-diaza-guanin, 8-okso-guanin, 5,6-dihidro-uridin, i 5-hidroksimetil-uridin. Ove sintetičke jedinice su komercijalno dostupne; (na primer, kupljen od Glen Research Company) i mogu se ugraditi u DNK hemijskom sintezom.
[0149] Primeri modifikacije šećernog dela su 3'-dezoksilacija, 2'-fluorinacija, i arabanozidacija, međutim, ne treba ih tumačiti kao ograničene na te. Inkorporacija ovih molekula u DNK je takođe moguća hemijskom sintezom.
[0150] Primeri modifikacije 5’ kraja su 5'-aminacija, 5'-biotinilacija, 5'-fluoresceinilacija, 5'-tetrafluoro-fluoreceinilacija, 5'-tionacija, i 5'-dabsilacija, međutim ne treba ih tumačiti kao ograničene na te.
[0151] Primeri modifikacije 3' kraja su 3'-aminacija, 3'-biotinilacija, 2,3-didezoksidacija, 3'-tionacija, 3'-dabsilacija, 3'-karboksilacija, i 3'-holesterilacija, međutim, ne treba ih tumačiti kao ograničene na te.
[0152] U jednom poželjnom tehničkom rešenju, oligonukleobaza može da sadrži 5' blokirajući supstituent koji je vezana za 5' terminalne ugljenike preko veznika. Hemija veznika nije kritična sem njegove dužine, koja bi poželjno trebalo da bude duga najmanje 6 atoma i što veznik treba da bude fleksibilan. Mogu se koristiti različiti netoksični supstituenti kao što su biotin, holesterol ili drugi steroidi ili neinterkalirajuća katjonska fluorescentna boja. Posebno poželjni reagensi za pravljenje oligonukleobaza su reagensi koji se prodaju kao Cy3<™>i Cy5<™>od strane Glen Research, Sterling Va. (sada GE Healthcare), koji su blokirani fosforoamiditi koji po ugradnji u oligonukleotid daju 3,3,3',3'-tetrametil N,N'-izopropil supstituisane indomonokarbocijaninske i indodikarbocijaninske boje, redom. Cy3 je posebno poželjan. Kada je indokarbocijanin supstituisan sa N-oksialkilom može se zgodno povezati sa 5' terminalnim oligodezoksinukleotidom kao fosfodiestar sa 5' terminalnim fosfatom. Kada se komercijalno dostupan Cy3 fosforamidit koristi prema uputstvima, rezultirajuća 5' modifikacija se sastoji od blokirajućeg supstituenta i veznika zajedno koji su N-hidroksipropil, N'-fosfatidilpropil 3,3,3',3'-tetrametil indomonokarbocijanin. Druge boje koje se razmatraju uključuju Rodamin6G, Tetrametilrodamin, Sumporhodamin 101, Merocijanin 540, Atto565, Atto55026, Cy3.5, Dy547, Dy548, Dy549, Dy554, Dy555, Dy556, Dy560, m Strawberry i mCherry.
[0153] U poželjnom tehničkom rešenju indokarbocijaninska boja je tetra supstituisana na 3 i 3' polozicijama indolovog prstena. Bez ograničenja u pogledu teorije, ove supstitucije sprečavaju da boja bude interkalirajuća boja. Identičnost supstituenata na ovim pozicijama nije kritična.
[0154] Ovde opisani oligo dizajni takođe mogu da se koriste kao efikasniji šabloni donora u kombinaciji sa drugim tehnologijama za uređivanje ili rekombinaciju DNK uključujući, ali ne ograničavajući se na, ciljanje gena korišćenjem homologne rekombinacije specifične za mesto pomoću cinkov prst nukleaze, efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN -Transcription Activator-Like Effector Nucleases) ili grupisanog pravilno isprekidanog kratkog palindromskog ponavljanja (CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats).
[0155] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na postupke za efikasnu modifikaciju genomske ćelijske DNK i/ili rekombinaciju DNK u genomsku DNK ćeliju. Iako nisu ograničeni na bilo koju posebnu upotrebu, postupci predmetnog pronalaska su korisni u, na primer, uvođenju modifikacije u genome ćelije u svrhu određivanja efekta modifikacije na ćeliju. Na primer, modifikacija se može uvesti u nukleotidnu sekvencu koja kodira enzim da bi se utvrdilo da li modifikacija menja enzimsku aktivnost enzima, i/ili odredila lokacija katalitičkog regiona enzima. Alternativno, modifikacija se može uvesti u kodirajuću sekvencu proteina koji se vezuje za DNK da bi se utvrdilo da li je aktivnost vezivanja proteina za DNK izmenjena, i da bi se na taj način opisao određeni DNK-vezujući region unutar proteina. Još jedna alternativa je uvođenje modifikacije u nekodirajuću regulatornu sekvencu (npr., promotor, pojačivač, regulatorna RNK sekvenca (miRNK), itd.) kako bi se odredio efekat modifikacije na nivo ekspresije druge sekvence koja je operativno povezana sa nekodirajućom regulatornom sekvencom. Ovo može biti poželjno da se, na primer, definše određena sekvenca koja poseduje regulatornu aktivnost.
[0156] Jedna strategija za stvaranje ciljanog poremećaja gena je kroz stvaranje jednolančanih ili dvolančanih prekida DNK uzrokovanih endonukleazama specifičnim za mesto. Endonukleaze se najčešće koriste za ciljani poremećaj gena u organizmima koji su tradicionalno bili refrakcioni na konvencionalnije postupke ciljanja gena, kao što su alge, biljke, i veliki životinjski modeli, uključujući ljude. Na primer, trenutno su u toku klinička ispitivanja na ljudima koja uključuju nukleaze cinkovog prsta za lečenje i prevenciju HIV infekcije. Dodatno, endonukleazni inženjering se trenutno koristi u pokušajima da se poremete geni koji proizvode nepoželjne fenotipove u usevima.
[0157] Homing endonukleaze, takođe poznate kao meganukleaze, su endonukleaze specifične za sekvencu koje stvaraju prekid dvostrukih lanaca u genomskoj DNK sa visokim stepenom specifišnosti zbog svojih velikih (npr., >14 bp) mesta cepanja. Dok specifičnost homing endonukleaza za njihova ciljna mesta omogućava precizno ciljanje indukovanih prekida DNK, mesta cepanja homing endonukleaze su retka i verovatnoća pronalaženja prirodnog mesta cepanja u ciljanom genu je mala.
[0158] Jedna klasa veštačkih endonukleaza su cinkov prst endonukleaze. Cinkov prst endonukleaze kombinuju domen nespecifičnog cepanja, tipično onaj od Fokl endonukleaze, sa domenima proteina cinkovog prsta koji su projektovani da se vezuju za specifične DNK sekvence. Modularna struktura zinkov prst endonukleaza čini ih raznovrsnom platformom za isporuku u genom dvolančanih prekida specifičnih za lokaciju. Jedno ograničenje cinkov prst endonukleaza je da niska specifičnost za ciljno mesto ili prisustvo više ciljnih meta u genomu može dovesti do događaja cepanja van cilja. Kako FokI endonukleaza cepa kao dimer, jedna od strategija za sprečavanje događaja cepanja van cilja je dizajniranje domena cinkovog prsta koji se vezuju na mestima susednih 9 baznih parova.
[0159] TALEN-i su ciljane nukleaze koje se koriste da izazovu jednolančane i dvolančane prekide na specifičnim DNK mestima, koji se zatim popravlju mehanizmima koji se mogu iskoristiti za stvaranje promena sekvence na mestu cepanja.
[0160] Osnovni gradivni blok koji se koristi za projektovanje regiona TALEN-a koji se vezuju za DNK je visoko konzervirani ponovljeni domen koji potiče od prirodnih TALE-a kodiranih od strane Xanthomonas spp. proteobakterije. TALEN vezivanje za DNK je posredovano nizovima viskoko konzerviranih ponavljanja od 33-35 aminokiselina koji su okruženi dodatnim domenima izvedenim iz TALE-a na amino-terminalnim i karboksi-terminalnim krajevima ponavljanja.
[0161] Ova TALE ponavljanja se specifično vezuju za jednu bazu DNK, čiji identitet je određen sa dva hipervarijabilna ostatka koji se tipično nalaze na položajima 12 i 13 ponavljanja, pri čemu broj ponavljanja u nizu odgovara dužini željene ciljne nukleinske kiseline, identitet ponavljanja je odabran da odgovara ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline. Ciljna nukleinska kiselina je poželjno između 15 i 20 baznih parova da bi se maksimizirala selektivnost ciljnog mesta. Cepanje ciljne nukleinske kiseline se obično dešava unutar 50 baznih parova TALEN vezivanja. Kompijuterski programi za dizajn mesta za prepoznavanje TALEN-a opisani su u oblasti. Videti, npr., Cermak i sarad., Nucleic Acids Res.2011 Juli; 39(12): e82.
[0162] Jednom dizajnirani da odgovaraju željenoj ciljnoj sekvenci, TALENS se mogu rekombinantno eksprimirati i uvesti u protoplaste kao egzogeni proteini, ili eksprimirati iz plazmida unutar protoplasta.
[0163] Druga klasa veštačkih endonukleaza su projektovane meganukleaze. Konstruisane homing endonukleaze se generišu modifikacijom specifičnosti postojećih homing endonukleaza. U jednom pristupu, varijacije se uvode u aminokiselinsku sekvencu homing endonukleaza koje se prirodno pojavljuju, a zatim se rezultujuće konstruisane homing endonukleaze pregledaju da bi se odabrali funkcionalni proteini koji cepaju ciljano mesto vezivanja. U drugom pristupu, himerne homing endonukleaze su konstruisane kombinovanjem mesta prepoznavanja dve različite homing endonukleaze da bi se stvorilo novo mesto za prepoznavanje sačinjeno od polovine mesta svake homing endonukleaze.
[0164] Drugi molekuli koji modifikuju molekule DNK mogu se koristiti u ciljanoj rekombinaciji gena. Na primer, peptidne nukleinske kiseline mogu da se koriste da izazovu modifikacije genoma ciljne ćelije ili ćelija (videti, npr., američki patent sa br. 5,986,053, Ecker). Ukratko, sintetički nukleotidi koji sadrže, barem, delimičnu peptidnu okosnicu koriste se za ciljanje homologne genomske nukleotidne sekvence. Nakon vezivanja za dvostruki heliks DNK, ili preko mutagena vezanog za peptidnu nukleinsku kiselinu, dolazi do modifikacije ciljne DNK sekvence i/ili rekombinacije. Specifičnost ciljanja je određena stepenom homologije sekvence između ciljane sekvence i genomske sekvence.
[0165] Osim toga, predmetni pronalazak nije ograničen na posebne postupke koji se ovde koriste za izvođenje modifikacije genomskih sekvenci. Zapravo, razmatra se nekoliko postupaka. Na primer, geni se mogu ciljati korišćenjem oligonukleotida koji formiraju trostruki heliks (TFO). TFO se mogu generisati sintetički, na primer, PCR-arom ili upotrebom aparata za sintetisanje gena. Pored toga, TFO se mogu izolovati iz genomske DNK ako se pronađu odgovarajuće prirodne sekvence. TFO se mogu koristiti na više načina, uključujući, na primer, vezivanje za mutagen kao što je, ali ne ograničavajući se na, psoralen ili hlorambucil (videti, npr., Havre i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, U.S.A.90:7879-7883, 1993; Havre i sarad., J Virol 67:7323-7331, 1993; Wang i sarad., Mol Cell Biol 15:1759-1768, 1995; Takasugi i sarad., Proc Nat'l Acad Sci, SAD 88:5602-5606, 1991; Belousov i sarad., Nucleic Acids Res 25:3440-3444, 1997). Štaviše, na primer, TFO mogu biti vezani za DNK dupleks donora (videti, npr., Chan i sarad., J Biol Chem 272:11541-11548, 1999). TFO takođe mogu delovati tako što se vezuju sa dovoljnim afinitetom da izazovu popravku sklonu greškama (Wang i sarad., Science 271:802-805, 1996).
[0166] Postupci ovde stavljeni na uvid javnosti nisu ograničeni na prirodu ili tip reagensa za modifikaciju DNK koji se koristi. Na primer, takvi reagensi za modifikaciju DNK oslobađaju radikale koji dovode do prekida lanca DNK. Alternativno, reagensi alkiluju DNK da bi formirali adukte koji bi blokirali replikaciju i transkripciju. U drugoj alternativi, reagensi stvaraju poprečne veze ili molekule koji inhibiraju ćelijske enzime što dovodi do prekida lanca. Primeri reagenasa za modifikaciju molekula DNK koji su povezani sa oligonukleotidima da bi formirali TFO-e uključuju, ali nisu ograničeni na, indolokarbazole, naftalen diimide (NDI), transplatinu, bleomicin, analoge ciklopropapiroloindola, i fenantodihidrodioksine. Posebno, indolokarbazoli su inhibitori topoizomeraze I. Inhibicija ovih enzima dovodi do prekida lanaca i formiranja adukata DNK proteina [Arimondo i sarad., Bioorganic and Medicinal Chem. 8, 777, 2000]. NDI je fotooksidant koji može da oksiduje guanine koji mogu izazvati mutacije na mestima guanin ostataka [Nunez, i sarad., Biochemistry, 39, 6190, 2000]. Pokazalo se da transplatina reaguje sa DNK u tripleks meti kada je TFO vezan za reagens. Ova reakcija izaziva formiranje adukata DNK koji bi bili mutageni [Columbier, i sarad., Nucleic Acids Research, 24: 4519, 1996]. Bleomicin je onaj koji prekida DNK, koji se široko koristi kao mimetik zračenja. Povezan je sa oligonukleotidima i u tom format se pokazao kao aktivan razbijač [Sergeyev, Nucleic Acids Research 23, 4400, 1995; Kane, i sarad., Biochemistry, 34, 16715, 1995]. Analozi ciklopropapiroloindola su povezani sa TFO-ima i pokazano je da alkiluju DNK u tripleks ciljnoj sekvenci. Alkilovana DNK bi tada sadržala hemijske adukte koji bi bili mutageni [Lukhtanov, i sarad., Nucleic Acids Research, 25, 5077, 1997]. Fenantodihidrodioksini su maskirani hinoni koji oslobađaju vrste radikala nakon fotoaktivacije. Oni su povezani sa TFO-ima i pokazalo se da uvode prekide u dupleks DNK pri fotoaktivaciji [Bendinskas i sarad., Bioconjugate Chem. 9, 555, 1998].
[0167] Drugi postupci za izazivanje modifikacija i/ili rekombinacije razmatrani su u predmetnom pronalaskum. Na primer, drugo tehničko rešenje uključuje indukciju homologne rekombinacije između fragmenta egzogene DNK i ciljanog gena (videti npr., Capecchi i sarad., Science 244:1288-1292, 1989) ili korišćenjem peptidnih nukleinskih kiselina (PNK) sa afinitetom za ciljano mesto. Još drugih postupaka uključuje prepoznavanje sekvence specifične DNK i ciljanje od strane poliamida (videti npr., Dervan i sarad., Curr Opin Chem Biol 3:688-693, 1999; Biochemistry 38:2143-2151, 1999) i upotrebu nukleaza sa specifičnom aktivnošću za mesto (npr., protein cinkovog prsta, TALEN-i, Meganukleaze i/ili CRISPR-i).
[0168] Predmetni pronalazak nije ograničen ni na jednu određenu učestalost modifikacije i/ili rekombinacije. Postupci predmetnog pronalazka dovode do učestalosti modifikacije u ciljnoj nukleotidnoj sekvenci od 0.2% do 3%. Bez obzira na to, bilo koja učestalost (tj., između 0% i 100%) modifikacije i/ili rekombinacije smatra se da je unutar obima predmetnog pronalaska. Učestalost modifikacije i/ili rekombinacije zavisi od postupka koji se koristi za izazivanje modifikacije i/ili rekombinacije, tipa ćelija koji se koristi, ciljanog specifičnog gena i korišćenog reagensa za mutaciju DNK, ako postoji. Dodatno, postupak koji se koristi za otkrivanje modifikacije i/ili rekombinacije, zbog ograničenja u postupku detekcije, možda neće otkriti sve pojave modifikacije i/ili rekombinacije. Osim toga, neki događaji modifikacije i/ili rekombinacije mogu biti tihi, ne dajući uočljive indikacije da je došlo do modifikacije i/ili rekombinacije. Nemogućnost otkrivanja događaja tihe modifikacije i/ili rekombinacije daje veštački nisku procenu modifikacije i/ili rekombinacije. Zbog ovih i drugih razloga, predmetni pronalazak nije ograničen ni na jednu određenu učestalost modifikacije i/ili rekombinacije. U jednom tehničkom rešenju, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.01% i 100%. U drugom tehničkom rešenju, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.01% i 50%. U još jednom tehničkom rešenju, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.1% i 10%. U još jednom tehničkom rešenju, učestalost modifikacije i/ili rekombinacije je između 0.1% i 5%.
[0169] Pojam "učestalost mutacije" kako se ovde koristi u odnosu na populaciju ćelija koje su tretirane molekulom koji modifikuje DNK koji je sposoban da uvede mutaciju u ciljno mesto u genomu ćelije, odnosi se na broj ćelija u tretiranoj populaciji koja sadrži mutaciju na ciljnom mestu u poređenju sa ukupnim brojem ćelija koje su tretirane molekulom koji modifikuje DNK. Na primer, u odnosu na populaciju ćelija koje su tretirane molekulom TFO, koji modifikuje DNK, vezanim za psoralen koji je dizajniran da uvede mutaciju na ciljno mesto u genom ćelije, učestalost mutacije od 5% znači da od ukupno 100 ćelija koje su tretirane sa TFO-psoralenom, 5 ćelija sadrži mutaciju na ciljnom mestu.
[0170] Iako predmetni pronalazak nije ograničen na bilo koji stepen preciznosti u modifikaciji i/ili rekombinaciji DNK u ćeliji, smatra se da neka tehnička rešenja predmetnog pronalaska zahtevaju više stepene preciznosti, u zavisnosti od željenog rezultata. Na primer, specifične promene sekvence potrebne za popravku gena (npr., određene promene baze) zahtevaju veći stepen preciznosti u poređenju sa proizvodnjom nokaut gena pri čemu je neophodan samo poremećaj gena. Sa postupcima predmetnog pronalaska, postizanje viših nivoa preciznosti u tehnikama modifikacije i/ili homologne rekombinacije je veći neko kod prethodnih postupaka.
Isporuka oligonukleobaza za popravku gena u biljne ćelije
[0171] Bilo koji opšte poznati postupak koji se koristi za transformaciju biljne ćelije može da se koristi za isporuku oligonukleobaza za popravku gena. Ilustrativni postupci su navedeni u nastavku. Predmetni pronalazak razmatra mnoge postupke za transfekciju ćelija sa reagensom ili reagensima za modifikaciju DNK. Zaista, predmetni pronalazak nije ograničen ni na jedan poseban postupak. Postupci za uvođenje reagenasa za modifikaciju DNK u ćeliju ili ćelije su dobro poznati u oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroinjekciju, elektroporaciju, pasivnu adsorpciju, koprecipitaciju kalcijum fosfat-DNK, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju lipozoma, lipofektin, nukleofekciju, fuziju protoblasta, retrovirusnu infekciju, biolistike (tj., bombardovanje česticama) i slično.
[0172] Upotreba metalnih mikronosača (mikrosfera) za uvođenje velikih fragmeanta DNK u biljne ćelije koje imaju celulozne ćelijske zidove prodiranjem projektila je dobro poznato stručnjacima u relevantnoj oblasti (u daljem tekstu biolistička isporuka). Američki pat. sa br.
4,945,050; 5,100,792 i 5,204,253 opisuju opšte tehnike za izbor mikronosača i uređaja za njihovo projektovanje.
[0173] Specifični uslovi za korišćenje mikronosača u postupcima predmetnog pronalaska su opisani u međunarodnoj publikaciji WO 99/07865. U ilustrativnoj tehnici, ledeno hladni mikronosači (60 mg/mL), mešoviti dupleks oligonukleotid (60 mg/mL) 2.5 M CaCl2i 0.1 M spermidin se dodaju redom; smeša je lagano mešana, npr., vorteksovanjem, tokom 10 minuta i zatim je ostavljena na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, nakon čega su mikronosači razblaženi u 5 zapremina etanola, centrifugirani i resuspendovani u 100% etanolu. Dobri rezultati se mogu postići sa koncentracijom u prijanjajućem rastvoru od 8-10 µg/µL mikronosača, 14-17 µg/mL mešovitog dupleks oligonukleotida, 1.1-1.4 M CaCl2i 18-22 mM spermidina. Optimalni rezultati su primećeni u uslovima od 8 µg/µL mikronosača, 16.5 µg/mL mešovitog dupleks oligonukleotida, 1.3 M CaCl2i 21 mM spermidina.
[0174] Oligonukleobaze za popravku gena se takođe mogu uvesti u biljne ćelije radi primene predmetnog pronalaska korišćenjem mikrovlakna da prodru u ćelijski zid i ćelijsku membranu. Američki pat. sa br.5,302,523 od Coffee i sarad. opisuje upotrebu silicijum karbidnih vlakana da da bi se olakšala transformacija suspenzijskih kultura crnog meksičkog slatkog kukuruza. Bilo koja mehanička tehnika koja se može koristiti za uvođenje DNK za transformaciju biljne ćelije pomoću mikrovlakna može se koristiti za isporuku oligonukleobaza za popravku gena za transmutaciju.
[0175] Ilustrativna tehnika za isporuku mikrovlakna oligonukleobaze za popravku gena je sledeća: Sterilna mikrovlakna (2 µg) su suspendovana u 150 µL medijuma za kulturu biljaka koji sadrži oko 10 µg mešovitog dupleksa oligonukleotida. Kultura suspenzije je ostavljena da se slegne i jednake zapremine upakovanih ćelija i sterilna suspenzija vlakno/nukleotid su vorteksovani tokom 10 minuta i postavljeni na ploče. Selektivna podloga se primenjuje odmah ili sa zakašnjenjem do oko 120 h što odgovara određenom svojstvu.
[0176] U alternativnom tehničkom rešenju, oligonukleobaze za popravku gena mogu biti dostavljene u biljnu ćeliju elektroporacijom protoplasta dobijenog iz dela biljke. Protoplasti se formiraju enzimskim tretmanom biljnog dela, posebno lista, prema tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u oblasti. Videti, npr., Gallois i sarad., 1996, u Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp i sarad., 1999, u Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, NJ. Protoplasti ne moraju biti kultivisani u medijumu za rast pre elektroporacije. Ilustrativni uslovi za elektroporaciju su 3. puta.10. sup.5 protoplasta u ukupnoj zapremini od 0.3 mL sa koncentracijom oligonukleobaze za popravku gena od između 0.6-4 µg/mL.
[0177] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline preuzimaju biljni protoplasti u prisustvu polietilen glikola, agensa za modifikaciju membrane, prema tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. U drugom alternativnom tehničkom rešenju, oligonukleobaze za popravku gena mogu se isporučiti ubrizgavanjem mikrokapilarom u biljne ćelije ili u protoplaste.
[0178] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline su ugrađene u mikroperle sačinjene od kalcijum alginata i preuzete od biljnih protoplasta u prisustvu polietilen glikol agensa za modifikaciju membrane (videti, npr., Sone i sarad., 2002, Liu i sarad., 2004).
[0179] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline su zamrznute u vodi i uvedene u biljne ćelije bombardovanjem u obliku mikročestica (videti, npr., Gilmore, 1991, U.S. Patent 5,219,746; Brinegar i sarad.).
[0180] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline vezane za nanočestice se unose u intaktne biljne ćelije inkubacijom ćelija u suspenziji koja sadrži nanočestice (videti, npr., Pasupathy i sarad., 2008) ili njihovim unošenjem u intaktne ćelije bombardovanjem česticama ili u protoplaste koinkubacijom (videti, npr., Torney i sarad., 2007).
[0181] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline stvaraju kompleks sa penetrirajućim peptidima i isporučuju se u ćelije zajedničkom inkubacijom (videti, npr., Chugh i sarad., 2008, WO 2008148223 A1; Eudes i Chugh.
[0182] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline se uvede u intaktne ćelije putem elektroporacije (videti, npr., He i sarad., 1998, US 2003/0115641 A1, Dobres i sarad.).
[0183] U alternativnom tehničkom rešenju, nukleinske kiseline se isporučuju u ćelije suvih embriona tako što se oni potapaju u rastvor sa nukleinskim kiselinama (natapanjem suvih embriona u (videti, npr., Töpfer i sarad., 1989, Senaratna i sarad., 1991).
Izbor biljaka
[0184] U raznim tehničkim rešenjima, biljke kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti mogu biti od bilo koje vrste dikotiledonih, monokotiledonih ili biljaka golosemenica, uključujući bilo koju drvenastu biljnu vrstu koja raste kao drvo ili žbun, bilo koju zeljastu vrstu, ili bilo koju vrstu koja proizvodi jestivo voće, semena ili povrće, ili bilo koju vrstu koja daje šareno ili aromatično cveće. Na primer, biljka može biti odabrana od vrste biljke iz grupe koja se sastoji od repice, suncokreta, kukuruza, duvana, šećerne repe, pamuka, kukuruza (eng. maize), pšenice, ječma, pirinča, lucerke, ječma, kineske šećerne trske, paradajza, manga, breskve, jabuke, kruške, jagode, banane, dinje, krompira, šargarepe, zelene salate, crnog luka, zrna soje, soya spp, šećerne trske, graška, leblebije, poljskog graška, boba, sočiva, bele repe, korabe, prokulice, obrnika, karfiola, kelja, poljskog pasulja, topole, bora, eukaliptusa, grožđa, citrusa, tritakale, lucerke, raži, ovsa, travnjaka i krmne trave, lana, uljane repice, slačice, krastavca, ukrasnog slaka, balzamine, bibera, patlidžana, nevena, lotosa, kupusa, bele rade, karanfila, lala, perunike, ljiljana, i biljka koje proizvode orašaste plodove ukoliko nisu već posebno pomenute.
[0185] Biljke i biljne ćelije se mogu testirati na otpornost ili toleranciju na herbicide korišćenjem opšte poznatih postupaka u oblasti, npr., uzgajanjem biljke ili biljne ćelije u prisustvu herbicida i merenjem brzine rasta u poređenju sa brzinom rasta u odsustvu herbicida.
[0186] Kako se ovde koristi, značajno normalan rast biljke, biljnog organa, biljnog tkiva ili biljne ćelije se definiše kao stopa rasta ili stopa ćelijske deobe biljke, biljnoga organa, biljnog tkiva, ili biljne ćelije koja iznosi najmanje 35%, najmanje 50%, najmanje 60%, ili najmanje 75% stope rasta ili stope deobe ćelije u odgovarajućoj biljci, biljnom organu, biljnem tkivu ili biljnoj ćelije koja eksprimira divlji tip AHAS proteina.
[0187] Kako se ovde koristi, značajno normalan razvoj biljke, biljnog organa, biljnog tkiva ili biljne ćelije definiše se kao pojava jednog ili više razvojnih događaja u biljci, biljnom organu, biljnom tkivu ili biljnoj ćeliji koji su suštinski isti kao oni koji se javljaju u odgovarajućoj biljci, biljnom organu, biljnom tkivu ili biljnoj ćeliji koja eksprimira protein divljeg tipa.
[0188] U određenim tehničkim rešenjima biljni organi koji su ovde dati uključuju, ali nisu ograničeni na, listove, stabljike, korenove, vegetativne pupoljke, cvetne pupoljke, meristeme, embrione, kotiledone, endosperme, čašične listiće, latice, tučkove, oplodne listiće, prašnike, polenove kesice, mikrospore, polen, polenske cevčice, jajne ćelije, plodnike i plodove, ili delove, kriške ili diskove uzete iz njih. Biljna tkiva uključuju, ali nisu ograničena na, tkiva kalusa, prizemna tkiva, vaskularna tkiva, tkiva za skladištenje, meristematska tkiva, tkiva lista, tkiva izdanka, tkiva korena, tkiva gale, tkiva tumora biljke, i reproduktivna tkiva. Biljne ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovane ćelije sa ćelijskim zidovima, njihove agregate različite veličine, i protoplaste.
[0189] Biljke su značajno "tolerantne" na relevantni herbicid kada su mu podvrgnute i daju krivu doza/odgovor koja je pomerena udesno u poređenju sa onom koju daje slično podvrgnuta netolerantna biljka. Takve krive doza/odgovor imaju "dozu" ucrtanu na X-osi i "procenat ubijanja", "herbicidalni efekat", itd., ucrtane na y-osi. Tolerantnim biljkama će biti potrebno više herbicida nego biljkama koje nisu tolerantne da bi se proizveo dati herbicidni efekat. Biljke koje su značajno "otporne" na herbicid pokazuju malo, ako ih ima, nekrotičnih, litičkih, hlorotičnih ili drugih lezija, kada su podvrgnute herbicidu u koncentracijama i stopama koje obično koristi agrohemijska zajednica za uništavanje korova na polju. Biljke koje su otporne na herbicid takođe su tolerantne na herbicid.
Generisanje biljaka
[0190] Poznata je kultura tkiva različitih tkiva biljnih vrsta i regeneracija biljaka iz njih. Na primer, razmnožavanje sorte repice kulturom tkiva je opisano u bilo kom od sledećeg ali nije ograničeno na bilo šta od sledećeg: Chuong i sarad., "A Simple Culture Method for Brassica hypocotyls Protoplasts," Plant Cell Reports 4:4-6, 1985; Barsby, T. L., i sarad., " A Rapid and Efficient Alternative Procedure for the Regeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts of Brassica napus,," Plant Cell Reports (Spring, 1996); Kartha, K., i sarad., " In vitro Plant Formation from Stem Explants of Rape," Physiol. Plant, 31:217-220, 1974; Narasimhulu, S., i sarad., " Species Specific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants of Brassicas,," Plant Cell Reports (Spring 1988); Swanson, E., "Microspore Culture in Brassica," Methods in Molecular Biology, tom 6, poglavlje 17, str.159, 1990.
[0191] Dalja reprodukcija sorte može da se desi kulturom tkiva ili regeneracijom. Kultura tkiva različitih tkiva soje i regeneracija biljaka iz njih je dobro poznata i široko publikovana. Na primer, može se pozvati na Komatsuda, T. i sarad., " Genotype X Sucrose Interactions for Somatic Embryogenesis in Soybeans," Crop Sci.31:333-337, 1991; Stephens, P. A., i sarad., " Agronomic Evaluation of Tissue-Culture-Derived Soybean Plants," Theor. Appl. Genet. 82:633-635, 1991; Komatsuda, T. i sarad., " Maturation and Germination of Somatic Embryos as Affected by Sucrose and Plant Growth Regulators in Soybeans Glycine gracilis Skvortz and Glycine max (L.) Merr " Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 28:103-113, 1992; Dhir, S. i sarad., "Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Soybean (Glicin max L. Merr.); Genotypic Differences in Culture Response," Plant Cell Reports 11:285-289, 1992; Pandey, P. i sarad., " Plant Regeneration from Leaf and Hypocotyl Explants of Glycine wightii (W. i A.) VERDC. var. longicauda," Japan J. Breed. 42:1-5, 1992; i Shetty, K., i sarad., "Stimulation of In Vitro Shoot Organogenesis in Glycine max (Merrill.) by Allantoin i Amides," Plant Science 81:245-251, 1992. Predmetne objave američkog pat. sa br.5,024,944 odobrenog 18. juna, 1991. Collins-u i sarad., i američkog pat. sa br. 5,008,200 odobrenog 16. aprila 1991. Ranch-u i sarad.
PRIMERI
Primer 1: dužina GRON-a
[0192] Sommer i sarad., (Mol Biotechnol.33:115-22, 2006) opisuju reporterski sistem za detekciju in vivo konverzije gena koji se oslanja na jednu promenu nukleotida za pretvaranje između varijanti plave i zelene fluorescencije u zeleni fluorescentni protein (GFP). Ovaj reporterski sistem je prilagođen za primenu u sledećim eksperimentima koristeći Arabidopsis thaliana kao model vrstu da bi se procenila efikasnost GRON konverzije nakon modifikacije dužine GRON-a.
[0193] Ukratko, za ovaj i sledeće primere, linija Arabidopsis sa višestrukim kopijama gena plavog fluorescentnog proteina stvorena je postupcima poznatim stručnajcima u oblasti (videti, npr., Clough i Brent, 1998). Meristemske kulture tkiva dobijene iz korena uspostavljene su ovom linijom, koja je korišćena za izolaciju i kulturu protoplasta (videti, npr., Mathur i sarad., 1995). Isporuka GRON-a u protoplaste postignuta je putem unosa GRON-a u protoplaste posredovanog polietilen glikolom (PEG). Korišćen je postupak koji koristi format sa 96-bunara, sličan onom opisanom u srodnom postupku koji su opisali Fujiwara i Kato (2007). U nastavku je ukratko opisan protokol. Date zapremine su one primenjene na pojedinačnim bunarima ploče sa 96 bunara.
1. Pomešati 6.25 µl GRON-a (80 µM) sa 25 µl Arabidopsis BFP protoplasta iz meristematskog tkiva dobijenog iz transgenskog korena pri 5×10<6>ćelija/ml u svakom bunaru ploče sa 96 bunara.
2. Dodato je 31.25 µl 40% PEG rastvora i protoplasti su pomešani.
3. Treatirane ćelije su inkubirane na ledu tokom 30 min.
4. U svaki bunar je dodato 200 µl W5 rastvora i ćelije su pomešane.
5. Ploče su ostavljene da se inkubiraju na ledu tokom 30 min omogućavajući protoplastima da se slegnu na dno svakog bunara.
6. Uklonjeno je 200 µl medijuma iznad staloženih protoplasta.
7. Dodato je 85 µl medijuma za kulturu (MSAP, videti Mathur i sarad., 1995)
8. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi u mraku tokom 48 sati. Konačna koncentracija GRON-a nakon dodavanja medijuma za kulturu je 8 µM.
[0194] Četrdeset osam sati nakon isporuke GRON-a, uzorci su analizirani protočnom citometrijom kako bi se otkrili protoplasti čija se zelena i žuta fluorescencija razlikuje od one kontrolnih protoplasta (BFP0 ukazuje na GRON-ove koji nisu ciljani bez promene u poređenju sa BFP metom; C je dizajn kodirajućeg lanca i NC je dizaj nekodirajućeg lanca). Jedina razlika nukleotida C u T (kodirajući lanac) ili ciljana mutacija nukleotida G u A (nekodirajući lanac) u centru molekula BFP4. Zelena fluorescencija je uzrokovana uvođenjem ciljane mutacije u BFP gen, što rezultira sintezom GFP. Rezultati su prikazani na Slici 1.
[0195] Sledeća tabela pokazuje sekvencu primera 101-mernog i 201-mernog BFP4/NC 5'-3PS/ 3'-3PS GRON-a dizajniranih za konverziju gena plavog fluorescentnog proteina (BFP) u zelenu fluorescenciju. (3PS označava 3 fosfotioatne veze na svakom 5' i 3' oligo kraju).
Tabela 1:
Primer 2: Stope konverzije korišćenjem 5'Cy3/ 3'idC obeleženih GRON-ova
[0196] Svrha ove serije eksperimenata je da uporedi efikasnost GRON-ova obeleženih fosfotioatom (PS) (imaju 3 PS dela na svakom kraju GRON-a) sa 5'Cy3/ 3'idC obeleženim GRON-ima. GRON-i obeleženi 5'Cy3/ 3'idC imaju 5' Cy3 fluorofor (amidit) i 3' idC reverznu bazu. Efikasnost je procenjena korišćenjem konverzije plavog fluorescentnog proteina (BFP) u zelenu fluorescenciju.
[0197] U sva tri eksperimenta, obavljena je ili PEG isporuka GRON-a u protoplaste u pojedinačnim Falkon epruvetama (označenim "Epruvete") ili u pločama sa 96-bunara (označenim sa "ploča sa 96-bunara"), nije bilo značajnih razlika između različitih GRON hemija u efikasnosti konverzije BFP u GFP kao što je utvrđeno citometrijom (Sli.1) .
Primer 3: Poređenje izmedju 41-mernog BFP4/NC 5'-3PS/ 3'-3PS GRON-a i Okazaki fragmenta GRON-a
[0198] Svrha ove serije eksperimenata je da uporedi efikasnosti konverzije GRON-a obeleženih fosfotioatom (PS) sa 3PS grupama na svakom kraju GRON-a sa "GRON Okazaki fragmenta" u prisustvu i odsustvu člana familije bleomicina, Zeocin<™>(1 mg/ml) za izazivanje prekida DNK. Dizajn ovih GRON-a je prikazan na Sli. 2. GRON-ovi su dostavljeni u Arabidopsis BFP protoplaste PEG tretmanom i određena je konverzija BFP u GFP 24 h nakon tretmana citometrijom. Uzorci tretirani zeocinom (1 mg/ml) su inkubirani zeocinom 90 min na ledu pre tretmana PEG-om.
[0199] Generalno prisustvo zeocina (1 mg/ml) povećava konverziju BFP u GFP kao što je utvrđeno citometrijom (Tabela 2). I u prisustvu i u odsustvu zeocina, NC Okazaki GRON koji sadrži jednu 2'-O Me grupu na prvoj bazi RNK na 5’ kraju GRON-a bio je efikasniji u pretvaranju BFP u GFP u poređenju sa NC Okazaki GRON-om koji sadrži jednu 2'-O Me grupu na svakoj od prvih devet 5' RNK baza (Slika 2 i Tabela 2).
[0200] U svim eksperimentima, nije bilo značajne razlike između 41-mernog BFP4/NC 5'3PS/ 3'3PS i 71-mernog Okazaki fragmenta BFP4/NC GRON-a koji sadrži jednu 5' 2'-O me grupu na prvoj 5' RNK bazi (označena kao BFP471-mer (1) NC) u konverziji BFP u GFP u prisustvu ili odsustvu 1 mg/ml zeocina kao što je utvrđeno citometrijom (Slika 2 i Tabela 2). Važno je napomenuti da u prisustvu zeocina (očekuje se i za bleomicin, fleomicin, talizomicin, pepleomicin i druge članove ove familije antibiotika) ta konverzija postaje nezavisna od lanca (tj., i C i NC GRON-ovi sa dizajnom testiranim u ovim eksperimentima pokazuju približno jednaku aktivnost).
Tabela 2: Poređenje standardnog GRON dizajna sa GRON dizajnom Okazaki fragmenta u prisustvu i odsustvu glikopeptidnog antibiotika zeocina.
Primer 4: Poređenje između GRON-ova 41-mer, 101-mer i 201-mer BFP4/NC 5'-3PS/ 3'-3PS
[0201] Svrha ove serije eksperimenata je bila da se uporede efikasnosti konverzije (u prisustvu i odsustvu zeocina) GRON-ova obeleženih fosfotioatom (PS) sa 3PS grupama na svakom kraju GRON-a različite dužine: 41-mer, 101-mer i 201-mer prikazani u Tabeli 1. Prisustvo zeocina (1 mg/ml) je opet povećalo stope konverzije BFP u GFP kao što je utvrđeno citometrijom (Tabela 3). Ukupni trend u sva tri eksperimenta bio je linearan sa povećanjem dužine NC GRON i u prisustvu i u odsustvu zeocina. Osim za BFP-4/NC/101 i BFP-4/C/101 u prisustvu zeocina, ovo je imalo stope konverzije koje su bile skoro jednake ali niže od 41-mernog NC GRON-a. Ovo je u suprotnosti sa svim prethodnim eksperimentima u kojima su korišćeni BFP-4/41 kodirajući i nekodirajući GRON-ovi, pri čemu je kodirajući uvek bio daleko bolji od nekodirajućeg GRON-a. Ova asimetrija u učestalosti konverzije takođe se odnosi na BFP-4/201 GRON-ove korišćene u ovoj eksperimentalnoj seriji.
Tabela 3:
Primer 5: CRISPR-ovi u kombinaciji sa GRON-ima za poboljšanje konverzije u biljkama.
[0202] Tri komponente dizajna moraju se uzeti u obzir prilikom stvaranja CRISPR kompleksa: Cas9, gRNK (vodeća RNK) i ciljani region (proto-spejser u endogenom ciljnom genu).
Cas 9
[0203]
- Prolazna ekspresija Cas9 gena iz kodona Streptococcus pyogenes optimizovanog za Arabidopsis ili kukuruz pokrenut od 35S ili kukuruznim ubikvitinom redom. Optimizovani geni sintetisani pomoću Genewiz ili DNK 2.0. Napomena (NB) mora se osigurati da se ne stvaraju kriptični introni.
- RBCSE9 terminator prema G1155
- Pojedinačni SV40 NLS (PKKRKV) kao spoj C-terminala
- Vektorska okosnica bi bila kao u svim našim sistemima prolazne ekspresije - G1155.
gRNK
[0204]
- Predložena je upotreba himerne tracrRNK - pre-creRNK prema Le Cong i sarad., 2013 i Jinek i sarad., 2013. Imajte na umu da su LeCong i sarad. Pokazali da se prirodni tracr pre-crRNK kompleks pune dužine cepao mnogo efikasnije od himerne verzije. Opcija bi stoga bila da se napravi himera koristeći (89bp) tracrRNK pune dužine.
- Sekvenca gRNK ( (N)20predstavlja vodeću sekvencu). Sekvenca u zagradama obuhvata formu pune dužine od 89bp.
[0205] Slika ispod od Cong i sarad. prikazuje nativni kompleks i himeru:
- gRNK bi se eksprimirala pod AtU6 RNK pol III promotorom u Arabidopsis (sekvenca je data u nastavku). U kukuruzu se može koristiti promotor ZmU6 RNK pol III. Ovi izbori su zasnovani na Wang i sarad. 2008.
- RBCSE9 terminator prema G1155 ili niz T-ova prema Wang i sarad. 2013 i jednokomponentni pristup prikazani u nastavku.
Kod U6 promotorske sekvence od Wang i sarad
Ciljani region
- Specifičnost vodećih sekvenci je definisana sekvencom ciljanog regiona. Bez obzira na izbor modela organizma ovo će biti Y66H lokus od BFP-a. PAM (NGG) sekvenca u blizini Y66H je samo ograničenje dizajna. Takodje, uključivanje Y66H pozicije u 3' 12bp vodeće sekvence ("sekvenca semena") značilo bi da kada se popravka postigne, mesto neće biti ponovo presečeno.
Tc gtg acc acc ttc acc cac ggc
V T T F T Y
G
61 62 63 64 65 66 67
Biće potrebna posebna vektorska okosnica od G1155 da bi se omogućila istovremena isporuka Cas9 i gRNK. Ovaj problem će biti izbegnut jednokomponentnim pristupom:
Jednokomponentni pristup
[0207] Le Cong i sarad. (2013) su koristili pojednostavljen pristup, eksprimirajući i gRNK i Cas9 kao jedan prolazan konstrukt, koji je pokrenut od strane pol III U6 promotora, kako je navedeno u nastavku. Na ovaj način, za dati usev, više gena može biti ciljano jednostavnom zamenom vodeće sekvence inserta. Zamenili bismo promotor EF1α za onaj koji je pogodan za usev (pMAS za At, Ubi za Zm). Za terminator bismo koristili RBCSE9. NLS koji se koristi u biljkama bi bio jedan C-terminalni SV40 kao što je gore navedeno.
[0208] Imajte na umu da se u konstruktu ispod koristi skraćena gRNK gde nije uključen region RNK za praćenje. Autori su pokazali da je kod ljudi ovo bilo manje efikasno pri vođenju Cas9 u odnosu na verziju pune dužine. Stoga je predloženo da se ovde koristi gRNK pune dužine. Posebno u sledećem radu koji koristi CRISPR-ove u kvascu, DiCarlo i sarad. (2013) su koristili verziju u punoj dužini. Kaseta bi bila klonirana u pozadinu G1155.
[0209] Shema ekspresionog vektora za himernu crRNK. Vodeća sekvenca se može umetnuti izmedju dva BbsI mesta korišćenjem komplementarno sparenih (annealed) oligonukleotida. Vektor već sadrži sekvence delimičnog direktnog ponavljanja (siva) i delimične tracrRNK (crvena). WPRE, Woodchuck virus hepatitisa post transkripcioni regulatorni element.
In vivo test
Prelazna opcija
[0210]
- Jedan pristup za potvrđivanje prepoznavanja mete i aktivnost nukleaze u biljci bio bi oponašati test komplementarnog spajanja (annealing assay) jednolančanog YFP koji je kod Zhang i sarad. (2013) korišćen za TALEN-e. Spejser sekvenca (ciljna sekvenca) plus PAM bi trebalo da se ubace u YFP ili ekvivalentni gen.
- Prelazna opcija
- TALEN - BFP sistem se može koristiti kao kontrola.
- Dok bi pristup opisan gore bio stalni alat za potvrđivanje funkcionalnosti datog CRISPR sistema za datu spejser sekvencu, dokaz koncepta aktivnosti CRISPR-a u biljkama bi bio korišćenje GFP sistema.
- Ovde se dizajni koji se koriste za BFP→GFP mogu kontransformisati u At zajedno sa G1155 i bez GRON-a. Ako bi sečenje bilo dovoljno efikasno, smanjenje GFP ekspresije bi moglo biti očigledno. Ovo bi verovatno zahtevalo optimizaciju punjenja plazmidom.
- Kada se aktivnost potvrdi, genomska BFP meta bi bila ciljana vizuelnim očitavanjem zasnovanim na sekvenci.
In vitro test
[0211]
- Da bi se brzo potvrdila aktivnost CRISPR sistema, može se koristiti in vitro test prema Jinek i sarad. 2012. Ovde je unapred n apravljen i prečišćen S.pyogenes, Cas9 je inkubiran sa sintetisanim gRNK i plazmidom koji sadrži sekvencu prepoznavanja. Uspešno cepanje se analizira gel elektroforezom da bi se pronašli isečeni plazmidi. Detaljan protokol:
[0212] Test cepanja plazmidne DNK. Sintetička ili in vitro-transkribovana tracrRNK i crRNK su prethodno komplementarno spajane pre reakcije zagrevanjem do 95°C i polaganim hlađenjem do sobne temperature. Nativna ili restrikcijski digestivno linearizovana plazmidna DNK (300 ng (~8 nM)) je inkubirana tokom 60 min na 37°C sa prečišćenim Cas9 proteinom (50-500 nM) i tracrRNK:crRNK dupleksom (50-500 nM, 1:1) u puferu za cepanje plazmida Cas9 (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) sa ili bez 10 mM MgCl2. Reakcije su zaustavljene sa 5X puferom za učitavanje DNK koji sadrži 250 mM EDTA, rastvorene sa 0.8 ili 1% agaroznim gelom elektroforeze i vizuelizovane bojenjem etidijum bromidom. Za testove cepanja mutanta Cas9, reakcije su zaustavljene sa 5X SDS puferom za učitavanje (30% glicerol, 1.2% SDS, 250 mM EDTA) pre stavljanja na agarozni gel.
Osobina meta u usevima
[0213] S obzirom na fleksibilnost CRISPR sekvence prepoznavanja, nije teško pronaći potencijalne protospejser sekvence kako je definisano sekvencom 3' NGG PAM.
ZmEPSPS
[0214] Primer ispod pokazuje odgovarajuću protospejser sekvencu (žuta) i PAM (plava) kako bi se stvorio DS prekid u katalitičkom mestu ZmEPSPS gde je poznato da mutacije na T97 i P101 izazivaju toleranciju na glifosat. Naknadna oligoposredovana popravka (ODM) prekida bi rezultirala željenim promenama.
T A M R P L T V A A V
act gca atg cgg cca ttg aca gca gct gtt act gct gct gg
[0215] Tabela ispod daje protospejser sekvence gena od interesa u usevima od interesa:
[0216] Limitiranost dizajn ograničenja je to što je teško pronaći NGG sekvencu unutar 12 bp od nukleotida koji se menja od strane ODM. Ovo je značajno jer da je to slučaj, uspešan ODM bi značio da naknadno sečenje ne bi bilo moguće jer bi protospejser sekvenca semena bila izmenjena. Jinek i sarad. (2012) su pokazali da je ovo štetno za efikasnost sečenja.
Reference
[0217]
LeCong i sarad. 2013 Science: tom 339 br.6121 str.819-823.
Jinek i sarad.2012 Science.337:816-21
Wang i sarad. 2008 RNA 14: 903-913
Zhang i sarad. 2013. Plant Physiol.161: 20-27
[0218] Stručnjak u ovoj oblasti lako razume da je ovaj predmetni pronalazak dobro prilagođen za izvođenje ciljeva i postizanje navedenenih završetaka i prednosti, kao i onih koji su mu svojstveni. Primeri koji su ovde dati su reprezentativni za poželjna tehnička rešenja, predstavljaju primere i nisu namenjeni kao ograničenja obima zaštite pronalaska.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Postupak za uvođenje mutacije posredovane oligonukleobazom (GRON) za popravku gena u ciljnu sekvencu dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) u biljnoj ćeliji, koji obuhvata:
isporuku GRON-a u biljnu ćeliju; i
isporuku endonukleaze specifične za mesto u biljnu ćeliju, pri čemu je endonukleaza specifična za mesto odabrana od nukleaza cinkovog prsta, efektorskih nukleaza sličnih aktivatoru transkripcije (TALEN-i), i kompleksa grupisanih pravilno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR kompleksi);
pri čemu GRON sadrži jednu ili više promena iz konvencionalnih RNK i DNK nukleotida izabranih od jednog ili više 2'O-metil nukleotida na njegovom 5' ili 3' kraju, 5' terminalnu kapu, jednu ili više fluorescentnih boja koje su kovalentno vezane za njih, jednu ili više fosfotioatnih modifikacija, reverzne baze na njihovom 3' kraju; i
pri čemu endonukleaza specifična za mesto indukuje prekid jednostrukog ili dvostrukog lanca u blizini mesta ciljanog za konverziju od strane GRON-a.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu GRON dalje sadrži jednu ili više od sledećih karakteristika:
GRON je duži od 55 baza u dužini, GRON po izboru sadrži dva ili više mesta mutacije za uvođenje u ciljnu DNK;
GRON sadrži jedan ili više abazičnih nukleotida
GRON sadrži jedan ili više 8'okso dA i/ili 8'okso dG nukleotida;
GRON sadrži jedan ili više 2'O-metil RNK nukleotida na svom 5’ kraju;
GRON sadrži najmanje dva 2'-O-metil RNK nukleotida na svom 5’ kraju;
GRON sadrži interkalirajuću boju;
GRON sadrži modifikaciju okosnice odabranu iz grupe koja sadrži metil fosfonatne modifikacije, modifikaciju zaključane nukleinske kiseline (LNA), modifikaciju O - (2-metoksietil) (MOE), di PS modifikaciju, i modifikaciju peptidne nukleinske kiseline (PNA);
GRON sadrži jednu ili više unutarlančanih unakrsnih veza;
GRON sadrži jednu ili više baza koje povećavaju energiju hibridizacije.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu postupak dalje obuhvata sintezu celog ili dela GRON-a korišćenjem nukleotidnih multimera.
4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu je endonukleaza specifična za mesto kompleks grupisanih pravilno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR kompleks).
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu je endonukleaza specifična za mesto efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije (TALEN).
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu je endonukleaza specifična za mesto nukleaza cinkovog prsta.
7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je ciljna sekvenca dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) unutar genoma biljne ćelije.
8. Postupak prema prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen tume što je biljna ćelija vrsta odabrana izgrupe koju čine repica, suncokret, kukuruz, duvan, šećerna repa, pamuk, kukuruz, pšenica, ječam, pirinač, lucerka, ječam, kineska šećerna trska, paradajiz, mango, breskva, jabuka, kruška, jagoda, banana, dinja, krompir, šargarepa, zelena salata, crni luk, soja, vrste soje, šećerna trska, grašak, leblebija, poljski grašak, bob, sočivo, bela repa, keleraba, prokelj, lupina, karfiol, kelj, poljski pasulj, topola, bor, eukaliptus, groždje, citrus, tritakale, lucerka, raž, ovas, krmna trava i trava za travnjake, lan, uljana repica, slačica, krastavac, vodeni spanać, kaloper, biber, patlidžan, neven, lotus, kupus, bela rada, karanfil, lala, perunika, ljiljan, i biljke koje proizvode orašaste plodove.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je biljna ćelija transgenska.
10. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je ciljna DNK sekvenca endogeni gen biljne ćelije.
11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu dalje obuhvata regeneraciju biljke iz biljne ćelije.
12. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je biljna ćelija protoplast.
RS20220618A 2013-03-15 2014-03-14 Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti modifikacije ciljnog gena korišćenjem genske reparacije posredovane oligonukleotidom RS63427B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361801333P 2013-03-15 2013-03-15
EP19151652.5A EP3527068B1 (en) 2013-03-15 2014-03-14 Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63427B1 true RS63427B1 (sr) 2022-08-31

Family

ID=51537837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220618A RS63427B1 (sr) 2013-03-15 2014-03-14 Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti modifikacije ciljnog gena korišćenjem genske reparacije posredovane oligonukleotidom

Country Status (24)

Country Link
US (2) US10287594B2 (sr)
EP (3) EP4136963B1 (sr)
JP (5) JP6591394B2 (sr)
KR (6) KR20250076674A (sr)
CN (2) CN108823238B (sr)
AU (3) AU2014233519B2 (sr)
BR (1) BR112015022829B1 (sr)
CA (2) CA3206344A1 (sr)
CL (1) CL2015002648A1 (sr)
DK (1) DK3527068T3 (sr)
EA (1) EA201591445A1 (sr)
ES (1) ES2921207T3 (sr)
HR (1) HRP20220803T1 (sr)
HU (1) HUE059269T2 (sr)
IL (4) IL307456B1 (sr)
LT (1) LT3527068T (sr)
MY (1) MY183741A (sr)
PL (1) PL3527068T3 (sr)
PT (1) PT3527068T (sr)
RS (1) RS63427B1 (sr)
SI (1) SI3527068T1 (sr)
UA (1) UA120033C2 (sr)
WO (1) WO2014144951A1 (sr)
ZA (2) ZA201507555B (sr)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
AU2014233519B2 (en) 2013-03-15 2020-05-14 Cibus Europe B.V. Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene
US12331303B2 (en) 2013-03-15 2025-06-17 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
MX2016002118A (es) 2013-08-22 2016-06-28 Du Pont Modificacion del genoma de plantas por medio del uso de sistemas de ácido ribonucléico (arn) guía/ endonucleasa cas y metodos de uso.
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
HRP20240186T1 (hr) 2014-03-14 2024-05-10 Cibus Us Llc Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti ciljane modifikacije gena korištenjem reparacije gena posredovane oligonukleotidima
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US12359197B2 (en) 2014-12-12 2025-07-15 Etagen Pharma, Inc. Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
JP2016202038A (ja) * 2015-04-17 2016-12-08 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 塩基置換手段をスクリーニングする方法
WO2016186953A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Pioneer Hi Bred International Inc Guide rna/cas endonuclease systems
WO2016196887A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
CA3014036A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
EP3452055A4 (en) * 2016-05-06 2019-11-06 Tod M. Woolf IMPROVED METHODS FOR GENERIC MODIFICATION WITH AND WITHOUT PROGRAMMABLE NUCLEASES
KR20250103795A (ko) 2016-08-03 2025-07-07 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018030536A1 (ja) * 2016-08-12 2018-02-15 国立大学法人徳島大学 ゲノム編集方法
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
AU2017342543B2 (en) 2016-10-14 2024-06-27 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
WO2018108272A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
WO2018109101A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
BR112019019655A2 (pt) 2017-03-23 2020-04-22 Harvard College editores de nucleobase que compreendem proteínas de ligação a dna programáveis por ácido nucleico
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
AU2018352592C1 (en) 2017-10-16 2025-09-25 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
CN114127285B (zh) 2019-03-19 2024-09-10 布罗德研究所股份有限公司 编辑核苷酸序列的方法和组合物
EP3956349A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
CN112042542A (zh) * 2020-09-15 2020-12-08 上海市农业科学院 一种茄子高效再生体系的建立方法
US20240247287A1 (en) * 2021-05-27 2024-07-25 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Genome editing method
WO2024160989A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants
WO2024218220A1 (en) 2023-04-19 2024-10-24 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5024944A (en) 1986-08-04 1991-06-18 Lubrizol Genetics, Inc. Transformation, somatic embryogenesis and whole plant regeneration method for Glycine species
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US5008200A (en) 1988-05-08 1991-04-16 United Agriseeds, Inc. Propagating multiple whole fertile plants from immature leguminous
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5219746A (en) 1990-07-19 1993-06-15 Chris Brinegar Ice-mediated introduction of substances into biological material
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
US5641625A (en) 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5604121A (en) 1991-08-27 1997-02-18 Agricultural Genetics Company Limited Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
TW261517B (sr) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
IT230274Y1 (it) 1993-06-11 1999-06-02 Silc Spa Pannolone assorbente sagomato per incontinenza
US5962426A (en) 1993-06-25 1999-10-05 Yale University Triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
JP3585238B2 (ja) 1993-12-09 2004-11-04 トーマス ジェファーソン ユニバーシティー 真核細胞における部位特異的突然変異誘発のための化合物および方法
PT679657E (pt) 1994-04-27 2003-11-28 Novartis Ag Nucleosidos e oligonucleotidos com grupos 2'-eter
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5780296A (en) 1995-01-17 1998-07-14 Thomas Jefferson University Compositions and methods to promote homologous recombination in eukaryotic cells and organisms
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5888983A (en) 1996-05-01 1999-03-30 Thomas Jefferson University Method and oligonucleobase compounds for curing diseases caused by mutations
US5760012A (en) 1996-05-01 1998-06-02 Thomas Jefferson University Methods and compounds for curing diseases caused by mutations
US5731181A (en) 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
KR20010020375A (ko) 1997-04-30 2001-03-15 무레 미카엘 에프. 간세포에서 유전적 병소를 교정하기 위한 재조합에 의해 만들어진 올리고뉴클레오염기의 ｉｎ ｖｉｖｏ에서의 용도
US6524613B1 (en) 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
EP1007712A4 (en) 1997-08-05 2004-06-30 Kimeragen Inc USE OF DUPLEX OLIGONUCLEOTIDES TO AFFECT LOCAL GENETIC CHANGES IN PLANTS
EP1019516B1 (en) 1997-10-07 2004-06-09 EMBRAPA-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria A process for obtaining transgenic leguminous plants (leguminosae) containing exogenous dna
ATE342985T1 (de) 1998-02-26 2006-11-15 Pioneer Hi Bred Int Mais alpha-tubulin 3-18 promoter
US6004804A (en) 1998-05-12 1999-12-21 Kimeragen, Inc. Non-chimeric mutational vectors
US6010907A (en) 1998-05-12 2000-01-04 Kimeragen, Inc. Eukaryotic use of non-chimeric mutational vectors
AU5336999A (en) * 1998-08-05 2000-02-28 Trustees Of Tufts College Novel rrn operon altered bacteria and uses thereof
US6271360B1 (en) 1999-08-27 2001-08-07 Valigen (Us), Inc. Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors
EP1218524A2 (en) 1999-10-07 2002-07-03 Valigen Inc. Compositions and methods for plant genetic modification
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
US20030115641A1 (en) 2001-07-24 2003-06-19 Dobres Michael S. Transformation of plants by electroporation of cultured explants
WO2007073149A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange
NZ597682A (en) * 2006-01-12 2014-02-28 Incima Ipco B V Epsps mutants
AU2008258254B2 (en) 2007-06-07 2014-07-03 Agriculture And Agri-Food Canada Nanocarrier based plant transfection and transduction
EA036997B1 (ru) * 2007-10-05 2021-01-25 СИБАС ЕУРОП Би.Ви. Растение и семя ярового масличного рапса brassica napus, содержащие мутированные гены синтазы ацетогидроксикислот
CN102083303A (zh) 2008-06-20 2011-06-01 乔治亚大学研究基金会公司 抗除草剂的草类物种的开发
CN102257147A (zh) * 2008-12-22 2011-11-23 凯津公司 在植物原生质体中使用双链rna提高靶基因改变的效率
EP2462230B1 (en) * 2009-08-03 2015-07-15 Recombinetics, Inc. Methods and compositions for targeted gene modification
HUE034245T2 (en) 2009-11-23 2018-02-28 Nucelis Llc Methods and preparations for the preparation of squalene using yeast
EP2550358A1 (en) * 2010-03-22 2013-01-30 Philip Morris Products S.A. Modifying enzyme activity in plants
US9512444B2 (en) * 2010-07-23 2016-12-06 Sigma-Aldrich Co. Llc Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
UA112969C2 (uk) * 2010-08-03 2016-11-25 Сібас Юс Ллс Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх)
US20120122223A1 (en) * 2010-08-03 2012-05-17 Cibus Us Llc Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes
EP2847338B1 (en) 2012-05-07 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
PT3241902T (pt) * 2012-05-25 2018-05-28 Univ California Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição
JP6473419B2 (ja) 2012-12-13 2019-02-20 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 部位特異的ヌクレアーゼ活性のｄｎａ検出方法
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
AU2014233519B2 (en) 2013-03-15 2020-05-14 Cibus Europe B.V. Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene

Also Published As

Publication number Publication date
US10287594B2 (en) 2019-05-14
HK1222507A1 (zh) 2017-07-07
JP6947784B2 (ja) 2021-10-13
JP2023011803A (ja) 2023-01-24
HUE059269T2 (hu) 2022-11-28
EP3527068A1 (en) 2019-08-21
JP7532473B2 (ja) 2024-08-13
US20160289691A1 (en) 2016-10-06
JP2024153846A (ja) 2024-10-29
US11421240B2 (en) 2022-08-23
JP2016512695A (ja) 2016-05-09
AU2020217388B2 (en) 2023-09-07
WO2014144951A1 (en) 2014-09-18
EP3527068B1 (en) 2022-06-01
EA201591445A1 (ru) 2016-03-31
KR20210010954A (ko) 2021-01-28
IL241143B (en) 2019-09-26
ES2921207T3 (es) 2022-08-19
IL290273B2 (en) 2024-03-01
EP4136963B1 (en) 2026-01-21
JP2022023040A (ja) 2022-02-07
IL290273B1 (en) 2023-11-01
JP6591394B2 (ja) 2019-10-16
MY183741A (en) 2021-03-10
LT3527068T (lt) 2022-08-10
AU2014233519A1 (en) 2015-09-03
KR20240036153A (ko) 2024-03-19
NZ751577A (en) 2021-08-27
NZ711145A (en) 2021-08-27
ZA201507555B (en) 2020-01-29
KR102207728B1 (ko) 2021-01-27
CN105431039A (zh) 2016-03-23
CN108823238A (zh) 2018-11-16
ZA201902245B (en) 2020-12-23
NZ751574A (en) 2021-08-27
SI3527068T1 (sl) 2022-10-28
KR20250076674A (ko) 2025-05-29
EP2966980A4 (en) 2016-12-28
CN105431039B (zh) 2018-10-26
KR102339732B1 (ko) 2021-12-15
BR112015022829B1 (pt) 2022-06-14
CL2015002648A1 (es) 2016-03-28
US20190264219A1 (en) 2019-08-29
IL307456A (en) 2023-12-01
CA3206344A1 (en) 2014-09-18
IL241143A0 (en) 2015-11-30
KR20210154873A (ko) 2021-12-21
JP2020010706A (ja) 2020-01-23
IL290273A (en) 2022-04-01
AU2014233519B2 (en) 2020-05-14
EP2966980A1 (en) 2016-01-20
HRP20220803T1 (hr) 2022-09-30
JP7170807B2 (ja) 2022-11-14
PL3527068T3 (pl) 2022-10-10
EP4136963A1 (en) 2023-02-22
CA2905391A1 (en) 2014-09-18
IL269368B (en) 2022-03-01
KR102647792B1 (ko) 2024-03-14
IL269368A (en) 2019-11-28
KR102451570B1 (ko) 2022-10-06
KR20220139435A (ko) 2022-10-14
AU2020217388A1 (en) 2020-09-03
AU2023216834A1 (en) 2023-09-28
UA120033C2 (uk) 2019-09-25
IL307456B1 (en) 2025-11-01
CN108823238B (zh) 2022-02-01
PT3527068T (pt) 2022-07-04
BR112015022829A2 (pt) 2017-11-07
DK3527068T3 (da) 2022-06-27
CA2905391C (en) 2023-09-12
KR20150128854A (ko) 2015-11-18
KR102811093B1 (ko) 2025-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7532473B2 (ja) オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物
KR102569558B1 (ko) 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
US12331303B2 (en) Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
HK40006536B (en) Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
HK40006536A (en) Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
HK1262710A1 (en) Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
HK1262710B (zh) 采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物
HK1222507B (zh) 采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物
NZ751577B2 (en) Methods And Compositions For Increasing Efficiency Of Targeted Gene Modification Using Oligonucleotide-Mediated Gene Repair