RS62418B1 - 4'-supstituisani nukleozidni-derivati kao inhibitori hiv reverzne transkriptaze - Google Patents

Description

OSNOVA PRONALASKA

Retrovirus označen kao virus humane imunodeficijencije (HIV), naročito sojevi poznati kao HIV tip-1 (HIV-1) i tip-2 (HIV-2), etiološki su povezani sa imunosupresivnom bolešću poznatom kao sindrom stečene imunodeficijencije (SIDA). HIV seropozitivne individue su početno asimptomatske, ali tipično će razviti kompleks povezan sa SIDA-om (ARC) posle SIDA-e. Pogođene individue ispoljavaju tešku imunosupresiju koja ih čini visoko podložnim slabljenju i konačno fatalnim oportunističkim infekcijama. Replikacija HIV-a od strane ćelije domaćina zahteva integraciju virusnog genoma u DNK ćelije domaćina. S obzirom na to da je HIV retrovirus, ciklus replikacije HIV-a zahteva transkripciju virusnog RNK genoma u DNK preko enzima poznatog kao reverzna transkriptaza (RT).

Reverzna transkriptaza ima tri poznate enzimatske funkcije: enzim deluje kao RNK-zavisna DNK polimeraza, kao ribonukleaza i kao DNK zavisna DNK polimeraza. U njenoj ulozi kao RNK-zavisna DNK polimeraza, RT transkribuje jednolančanu DNK kopiju virusne RNK. Kao ribonukleaza, RT uništava originalnu virusnu RNK i oslobađa DNK upravo proizvedenu iz originalne RNK. I kao DNK-zavisna DNK polimeraza, RT gradi drugi, komplementarni DNK lanac upotrebom prvog DNK lanca kao obrasca. Dva lanca formiraju dvolančanu DNK, koja je integrisana u genom ćelije domaćina pomoću enzima integraze.

Poznato je da će jedinjenja koja ispoljavaju enzimatske funkcije HIV RT inhibirati replikaciju HIV-a u inficiranim ćelijama. Ova jedinjenja su korisna u profilaksi ili lečenju HIV infekcije kod ljudi. Među jedinjenjima odobrenim za upotrebu u lečenju HIV infekcije i SIDA-e su nukleozidni inhibitori RT (NRTI) kao što su 3'-azido-3'-deoksitimidin (AZT), 2',3'-dideoksiinozin (ddI), 2',3'-dideoksicitidin (ddC), d4T, 3TC, abakavir, emtricitabin i tenofovir dizoproksil fumarat, kao i nenukleozidni inhibitori RT (nNRTI) kao što su nevirapin, delavirdin i efavirenc.

Iako je svaki od gore navedenih lekova efikasan u lečenju HIV infekcije i SIDA-e, ostaje potreba za razvojem dodatnih antivirusnih lekova protiv HIV-a, uključujući dodatne inhibitore RT. Poseban problem predstavlja razvoj mutiranih sojeva HIV-a koji su otporni na poznate inhibitore. Upotreba anti-retrovirusnih sredstava za lečenje SIDA-e često dovodi do virusa koji su manje osetljivi na inhibitore. Ova rezistencija je tipično rezultat mutacija koje se javljaju u segmentu reverzne transkriptaze pol gena. Nastavak upotrebe antivirusnih jedinjenja za sprečavanje HIV infekcije neizbežno će rezultirati pojavom novih rezistentnih sojeva HIV-a.

Shodno tome, postoji stalna potreba za novim inhibitorima RT koji su efikasni protiv mutiranih sojeva HIV-a.

KRATAK OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak je usmeren na 4'-supstituisane derivate nukleozida i ove derivate za upotrebu u inhibiciji HIV reverzne transkriptaze, profilaksi infekcije HIV-om, lečenju infekcije HIV-om i profilaksi, lečenju i odlaganju početka ili napredovanje SIDA-e i/ili ARC-a.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju strukturnu formulu II ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so:

gde:

X je O;

Y je -C≡CH;

R<1>je -H,

ili pro-lek modifikacija mono-, di- ili trifosfata;

R<2>je -H;

R<3>je -H;

R<4>je -NH2;

R<5>je -H, -Cl, -F ili -NH2;

R<8>je -H; i

R<9>je -H, -F, -Cl, -I, -Br, ili -CH3.

U drugim izvođenjima ovog pronalaska su jedinjenja Formule II, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu

(a) R<1>je -H; ili

(b) R<1>je

ili

(c) R<1>je

U drugim izvođenjima ovog pronalaska su jedinjenja Formule II, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

ili (b) R<1>je

ili pro-lek modifikacija mono-, di- ili trifosfata;

ili (c) R<1>je

ili pro-lek modifikacija trifosfata;

ili (d) R<1>je pro-lek modifikacija od

Sve strukturne formule, njihovi primeri izvođenja i klase opisani ovde obuhvataju farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja definisane ovde. Referenca na jedinjenja formule II ovde obuhvata jedinjenja svih primera izvođenja i njihovih klasa. Referenca na jedinjenja ovog pronalaska kao ona specifične formule ili primera izvođenja, npr., formule II, ili njeni primeri izvođenja, ili bilo koja druga generička strukturna formula ili specifično jedinjenje koje je ovde opisano ili za koje se ovde traži zaštita u zahtevima, određeno je tako da obuhvata specifično jedinjenje ili jedinjenja koja su unutar obima formule ili primera izvođenja, njihove uključujući soli, naročito farmaceutski prihvatljive soli, solvate (uključujući hidrate) takvih jedinjenja i njihove solvatirane oblike soli, gde su takvi oblici mogući, osim ukoliko je naznačeno drugačije.

Predmetni pronalazak obuhvata svaki od Primera opisanih ovde i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Pronalazak takođe obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže efikasnu količinu jedinjenja prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljiva so i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Kada se bilo koja promenljiva (npr. R<7>, R<X>, R<Y>) javlja više puta u bilo kom sastavnom delu ili u formuli II ili u bilo kojoj drugoj formuli koja prikazuje i opisuje jedinjenja ovog pronalaska, njegova definicija za svaku pojavu je nezavisna od njene definicije za svaku drugu pojavu. Takođe, kombinacije supstituenata i/ili promenljivih su dozvoljene samo ako takve kombinacije rezultiraju stabilnim jedinjenjima.

Osim ako nije izričito navedeno suprotno, supstitucija imenovanim supstituentom je dozvoljena na bilo kom atomu u prstenu (npr. cikloalkil, aril ili heteroaril) pod uslovom da je takva supstitucija prstena hemijski dozvoljena i rezultira stabilnim jedinjenjem.

Kao što bi bilo poznato stručnjacima iz date oblasti tehnike, određena jedinjenja ovog pronalaska mogu postojati kao tautomeri. Svi tautomerni oblici ovih jedinjenja, bilo izolovani pojedinačno ili u smešama, nalaze se u okviru ovog pronalaska. Na primer, u slučajevima kada je -OH supstituent dozvoljen na heteroaromatskom prstenu i keto-enol tautomerija je moguća, podrazumeva se da bi supstituent ustvari mogao biti prisutan, u celini ili delimično, u okso (=O) obliku.

"Stabilno" jedinjenje je jedinjenje koje može biti pripremljeno i izolovano i čija struktura i osobine ostaju ili mogu biti uzrokovane da ostanu uglavnom nepromenjene tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da se omogući upotreba jedinjenja za svrhe opisane ovde (npr., terapeutska ili profilaktička primena na subjekta). Jedinjenja prema predmetnom pronalasku su ograničena na stabilna jedinjenja obuhvaćena formulom II i njenim primerima izvođenja.

Jedinjenja Formule II mogu imati jedan ili više hiralnih (asimetričnih) centara. Ovaj pronalazak obuhvata sve stereoizomerne oblike jedinjenja Formule II. Centri asimetrije koji su prisutni u jedinjenjima Formule II mogu svi nezavisno jedan od drugog imati (R) ili (S) konfiguraciju. Kada su veze sa hiralnim ugljenikom prikazane kao prave linije u strukturnim formulama pronalaska, ili kada se naziv jedinjenja izgovara bez (R) ili (S) hiralne oznake za hiralni ugljenik, podrazumeva se da su i (R) i (S) konfiguracije svakog takvog hiralnog ugljenika, pa stoga i svakog enantiomera ili dijastereomera i njihovih smeša, obuhvaćene Formulom ili imenom.

Proizvodnja specifičnih stereoizomera ili njihovih smeša može se identifikovati u primerima gde su takvi stereoizomeri ili smeše dobijeni, ali to ni na koji način ne ograničava uključivanje svih stereoizomera i njihovih smeša unutar obima ovog pronalaska.

Pronalazak uključuje sve moguće enantiomere i dijastereomere i smeše dva ili više stereoizomera, na primer smeše enantiomera i/ili diastereomera, u svim odnosima. Tako su enantiomeri predmet pronalaska u enantiomerno čistom obliku, i kao levorotirajući i kao desnorotirajući antipodi, u obliku racemata i u obliku smeša dva enantiomera u svim odnosima. U slučaju cis/trans izomerije, pronalazak uključuje i cis formu i trans formu, kao i smeše ovih oblika u svim odnosima. Priprema pojedinačnih stereoizomera može se, po želji, izvesti razdvajanjem smeše uobičajenim postupcima, na primer hromatografijom ili kristalizacijom, upotrebom stereohemijski ujednačenih početnih materijala za sintezu ili stereoselektivnom sintezom. Opciono, derivatizacija se može izvršiti pre razdvajanja stereoizomera. Odvajanje smeše stereoizomera može se izvesti u srednjem koraku tokom sinteze jedinjenja formule II ili se može izvršiti na krajnjem racemskom proizvodu. Apsolutna stereohemija se može odrediti rendgenskom kristalografijom kristalnih proizvoda ili kristalnih intermedijera koji se, ako je potrebno, derivatizuju reagensom koji sadrži stereogeni centar poznate konfiguracije. Alternativno, apsolutna stereohemija se može odrediti analizom spektroskopije vibracionog kružnog dihroizma (VCD). Ovaj pronalazak uključuje sve takve izomere, kao i soli, solvate (koji uključuju hidrate) i solvatizovane soli takvih racemata, enantiomera, dijastereomera i tautomera i njihovih smeša.

Atomi u jedinjenju formule II mogu da ispoljavaju njihove prirodne izotopske abundance, ili jedan ili više od atoma mogu biti veštački obogaćeni u određenom izotopu koji ima isti atomski broj, ali atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se pretežno nalazi u prirodi. Predmetni pronalazak je određen tako da obuhvata sve pogodne izotopske varijacije jedinjenja generičke formule II. Na primer, različiti izotopski oblici vodonika (H) obuhvataju protijum (<1>H) i deuterijum (<2>H). Protijum je predominantni izotop vodonika koji se nalazi u prirodi. Obogaćivanje za deuterijum može da pruži određene terapeutske prednosti, kao što je povećanje in vivo polu-života ili smanjenje potrebne doze, ili može da obezbedi jedinjenje korisno kao standard za karakterizaciju bioloških uzoraka. Izotopski-obogaćena jedinjenja unutar generičke formule II mogu biti pripremljena bez nepotrebnog eksperimentisanja pomoću konvencionalnih tehnika dobro poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike ili pomoću postupaka analognih onima opisanim u Šemama i Primerima ovde upotrebom odgovarajućih izotopski-obogaćenih reagenasa i/ili intermedijera.

Jedinjenja mogu biti primenjivana u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Termin "farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja nije biološki ili na drugi način nepoželjna (npr., nije toksična niti na drugi način štetna za njenog primaoca).

Kada jedinjenja formule II sadrže jednu ili više kiselih ili baznih grupa pronalazak takođe obuhvata odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli. Na taj način, jedinjenja formule II koja sadrže kisele grupe (npr., -COOH ili fenolna grupa) mogu biti korišćena prema pronalasku kao, na primer, ali bez ograničenja na, soli alkalnih metala, soli zemnoalkalnih metala ili amonijum soli. Primeri takvih soli obuhvataju, ali bez ograničenja na soli natrijuma, soli kalijuma, soli kalcijuma, soli magnezijuma ili soli sa amonijakom ili organskim aminima kao što su, na primer, etilamin, etanolamin, trietanolamin ili aminokiseline. Jedinjenja formule II koja sadrže jednu ili više baznih grupa, tj. grupa koje mogu biti protonovane, mogu biti korišćena prema pronalasku uobliku njihovih kiselih adicionih soli sa neorganskim ili organskim kiselinama kao što su, na primer, ali bez ograničenja na, soli sa hlorovodonikom, bromovodonikom, fosfornom kiselinom, sumpornom kiselinom, azotnom kiselinom, benzensulfonskom kiselinom, metansulfonskom kiselinom, p-toluensulfonskom kiselinom, naftalendisulfonskim kiselinama, oksalnom kiselinom, sirćetnom kiselinom, trifluorosirćetnom kiselinom, vinskom kiselinom, mlečnom kiselinom, salicilnom kiselinom, benzojevom kiselinom, mravljom kiselinom, propionskom kiselinom, pivalinskom kiselinom, dietilsirćetnom kiselinom, malonskom kiselinom, ćilibarnom kiselinom, pimelinskom kiselinom, fumarnom kiselinom, maleinskom kiselinom, jabučnom kiselinom, sulfaminskom kiselinom, fenilpropionskom kiselinom, glukonskom kiselinom, askorbinskom kiselinom, izonikotinskom kiselinom, limunskom kiselinom, adipinskom kiselinom, itd. Ako jedinjenja formule II istovremeno sadrže kisele i bazne grupe u molekulu prema pronalasku takođe obuhvata, pored navedenih oblika soli, unutrašnje soli ili betaine (cviterjone). Soli mogu biti dobijene od jedinjenja formule II pomoću uobičajenih postupaka koji su poznati sručnjaku iz date oblasti tehnike, na primer kombinacijom sa organskom ili neorganskom kiselinom ili bazom u rastvaraču ili disperzantu, ili preko anjonske izmene ili katjonske izmene od drugih soli. Predmetni pronalazak takođe obuhvata sve soli jedinjenja formule II koje, zahvaljujući niskoj fiziološkoj kompatibilnosti, nisu direktno pogodne za upotrebu u lekovima, ali koje se mogu koristiti, na primer, kao intermedijeri za hemijske reakcije ili za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli.

Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska je jedinjenje formule II, pri čemu je jedinjenje ili njegova so u značajno čistom obliku. Kao što je ovde korišćen "značajno čist" označava pogodno najmanje oko 60 tež.%, tipično najmanje oko 70 tež.%, poželjno najmanje oko 80 tež.%, poželjnije najmanje oko 90 tež.% (npr., od oko 90 tež.% do oko 99 tež. % ), čak poželjnije najmanje oko 95 tež. % (npr., od oko 95 tež. % do oko 99 tež. %, ili od oko 98 tež. % do 100 tež. %), i najpoželjnije najmanje oko 99 tež. % (npr., 100 tež.%) proizvoda koji sadrži jedinjenje formule II ili njegovu so (npr., proizvod izolovan iz reakcione smeše dajući jedinjenje ili so) sastoji se od jedinjenja ili soli. Nivo čistoće jedinjenja i soli može biti određen upotrebom standardnog postupka analize kao što je hromatografija na tankom sloju, gel elektroforeza, tečna hromatografija visokog učinka i/ili masena spektrometrija. Ako je korišćeno više od jednog postupka analize i postupci daju eksperimentalno značajne razlike u određenom nivou čistoće, tada preovlađuje postupak koji daje najveći nivo čistoće. Jedinjenje ili so čistoće 100% je ono koje je bez detektabilnih nečistoća kao što je određeno pomoću standardnog postupka analize. U vezi sa jedinjenjem prema pronalasku koje ima jedan ili više asimetričnih centara i može da se javi kao smeše stereoizomera, značajno čisto jedinjenje može biti značajno čista smeša stereoizomera ili značajno čist pojedinačni dijastereomer ili enantiomer. S obzirom na jedinjenje prema pronalasku koje ima jedan ili više asimetričnih centara i može se pojaviti kao smeša stereoizomera, suštinski čisto jedinjenje može biti ili u osnovi čista smeša stereoizomera ili u osnovi čist pojedinačni dijastereomer ili enantiomer.

Pored toga, jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da postoje u amorfnom obliku i/ili jednom ili više kristalnih oblika, i kao takvi svi amorfni i kristalni oblici i njihove smeše jedinjenja formule II su određeni da budu uključeni unutar obima predmetnog pronalaska. Pored toga, neka od jedinjenja ovog pronalaska mogu da formiraju solvate sa vodom (tj., hidrat) ili uobičajene organske rastvarače. Takvi solvati i hidrati, naročito farmaceutski prihvatljivi solvati i hidrati, predmetnih jedinjenja su slično obuhvaćeni unutar obima ovog pronalaska, zajedno sa nesolvatiranim i anhidrovanim oblicima.

Razume se da je jedinjenje formule II (ili bilo koje njegove varijante i njegove farmaceutski prihvatljive soli) gde, na primer, R<1>je -H, ili modifikacija mono-, di- ili trifosfata pro-lekova, može biti pretvorena unutar ćelije/in vivo pomoću jednog ili više mehanizama (npr. enzimski katalizovane hemijske reakcije) do odgovarajućeg nukleozid 5 'trifosfata (tj. gde R<1>je -P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2). Iako ne želi da bude vezan nekom posebnom teorijom, generalno se razume da je nukleozid 5'trifosfat odgovoran za inhibiranje enzima RT HIV-a i za rezultujuću antivirusnu aktivnost nakon primene jedinjenja formule II na subjekta.

Shodno tome, ovde su opisani prolekovi jedinjenja pronalaska. Diskusija o prolekovima je data u T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) 14 of the A.C.S. Symposium Series, i u Bioreversible Carriers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press. Izraz "prolek" ovde označava jedinjenje (na primer, prekursor leka), koji može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli, koja se transformiše unutar ćelije /in vivo da se obezbedi 4'-supstituisani derivat nukleozida koji je inhibitor HIV reverzne transkriptaze. Nukleozid 5'trifosfat je primer 4'-supstituisanog derivata nukleozida. Do in vivo transformacije može doći različitim mehanizmima, na primer, preko hemijske reakcije katalizovane enzimima, metaboličke hemijske reakcije i/ili spontane hemijske reakcije (npr. solvolize), kao što je, na primer, hidrolizom u krvi. Prolekovi jedinjenja formule (II) pretvaraju se zbog unutarćelijske/in vivo konverzije, u 4'-supstituisani derivat nukleozida jedinjenja formule II koje je inhibitor HIV reverzne transkriptaze. Na primer, 4'-supstituisani derivati nukleozida formule II uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinjenja formule II gde: a) R<1>je -P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2;

b). R<1>je -P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2, i R<2>je -H; i/ili

c) R<1>je -P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2, R<2>je -H, R<4>je -NH2i R<5>je -H ili -NH2.

Prolekovi jedinjenja Formule II mogu pokazivati poboljšanu rastvorljivost, apsorpciju i/ili lipofilnost u poređenju sa jedinjenjima per se, što rezultira povećanom bioraspoloživošću i efikasnošću. Kada jedinjenje sadrži, na primer, hidroksi grupu, prolek može biti derivat hidroksi grupe, kao što je estar (-OC(O)R), estar karbonata (-OC(O)OR), fosfatni estar (-OP(=O)(OH)2), etar (-OR) ili mono-fosfatni prolek kao što je fosforamidat (može se pretvoriti in vivo do odgovarajućeg nukleozid monofosfata).

Na primer, ako jedinjenje Formule II sadrži funkcionalnu grupu alkohola, prolek se može formirati zamenom jednog ili više atoma vodonika u alkoholnim grupama sa grupom kao što je, na primer, (C1-C6) alkanoiloksimetil, 1-((C1-C6)alkanoiloksi)etil, 1-metil-1-((C1-C6) alkanoiloksi) etil, (C1-C6) alkoksikarboniloksimetil, N-(C1-C6)alkoksikarbonilaminometil, sukcinoil, (C1-C6) alkanoil, α-amino (C1-C4) alkil, α-amino (C1-C4) alkilen-aril, arilacil i αaminoacil, ili α-aminoacil-α-aminoacil, pri čemu je svaka α-amino-amino grupa nezavisno izabrana od prirodno prisutnih L-aminokiselina, ili glikozil (radikal koji nastaje uklanjanjem hidroksil grupa hemiacetalnog oblika ugljenog hidrata).

Termin "prolek modifikacija mono-, di- ili trifosfata za lekove", kako se ovde koristi, uključuje, ali se ne ograničava na, prolekove izvedene iz 5'-alkohola, poput -P (O) (-O-C1-C6alkil)2; -P (O) (-NH- (α-aminoacil grupa)) (-O-aril), poznat kao prolekovi tipa "McGuigan"; -P (O) (-O- (C1-C6alkilen) -S-acil) (-NH-arilalkil); S-acil-2-tioetil (SATE) prolekovi; ciklični fosfatni estar koji formira most između dve hidroksilne grupe riboze, kao što je:

gde ciklični fosfatni estar formira most između 3'-OH grupe i 5'-OH grupa; i one opisane u SAD patentu br. 7,879,815; međunarodnom objavama br. WO2005/003047, WO2008/082602, WO2010/0081628, WO2010/075517 i WO2010/075549; Mehellou, Chem. Med. Chem., 5:1841-1842 (2005); Bobeck et al., Antiviral Therapy 15:935-950 (2010); Furman et al., Future Medicinal Chemistry, 1:1429-1452 (2009); i Erion, Microsomes and Drug Oxidations, Proceedings of the International Symposium, 17th, Saratoga Springs, NY, United States, July 6-10, 2008, 7-12 (2008).

Ako 4'-supstituisani derivat uključuje funkcionalnu grupu amina, prolek se može formirati zamenom atoma vodonika u grupi amina sa grupom kao što je, na primer, R-karbonil-, RO-karbonil-, NRR'-karbonil- pri čemu su R i R' svaki nezavisno (C1-C10) alkil, (C3-C7) cikloalkil, benzil, prirodni α-aminoacil, -C(OH)C(O)OY<1>pri čemu Y<1>je H, (C1-C6) alkil ili benzil, -C(OY<2>)Y<3>pri čemu Y<2>je (C1-C4) alkil i Y<3>je (C1-C6) alkil; karboksi (C1-C6) alkil; amino (C1-C4) alkil ili mono-N- ili di-N, N-(C1-C6) alkilaminoalkil; -C(Y<4>)Y<5>pri čemu Y<4>je H ili metil i Y<5>je mono-N- ili di-N, N-(C1-C6) alkilamino morfolino; piperidin-1-il ili pirolidin-1-il, i slično. Farmaceutski prihvatljivi estri ovih jedinjenja uključuju sledeće grupe: (1) estri karboksilne kiseline dobijeni esterifikacijom hidroksi grupe hidroksilnog jedinjenja, u kojoj je nekarbonilni ostatak dela karboksilne kiseline u estarskoj grupi izabran od prave ili granate grupe alkila (na primer, metil, etil, n-propil, izopropil, t-butil, sek-butil ili n-butil), alkoksialkil (na primer, metoksimetil), aril (na primer, benzil), ariloksialkil (na primer, fenoksimetil), aril (na primer, fenil opciono supstituisan sa, na primer, halogenom, C1-4alkil, -O-(C1-4alkil) ili amino); (2) sulfonatni estri, kao što je alkil- ili aralkilsulfonil (na primer, metansulfonil); (3) estri aminokiselina (na primer, L-valil ili L-izoleucil); (4) fosfonatni estri i (5) mono-, di- ili trifosfatni estri. Fosfatni estri se mogu dalje esterifikovati pomoću, na primer, C1-20alkohola ili njegovih reaktivnih derivata, ili pomoću 2,3-di (C6-24) acil glicerola.

Ako 4'-supstituisani derivat deoksiriboze sadrži funkcionalnu grupu karboksilne kiseline, prolek može sadržati estar nastao zamenom atoma vodonika kiselinske grupe sa grupom kao što je, na primer, (C1-C8) alkil, (C2-C12) alkanoiloksimetil, 1- (alkanoiloksi) etil sa 4 do 9 atoma ugljenika, 1-metil-1- (alkanoiloksi) -etil sa 5 do 10 atoma ugljenika, alkoksikarboniloksimetil sa 3 do 6 atoma ugljenika, 1- (alkoksikarboniloksi) etil sa 4 do 7 atoma ugljenika, 1-metil-1-(alkoksikarboniloksi) etil sa 5 do 8 atoma ugljenika, N- (alkoksikarbonil) aminometil sa 3 do 9

1

atoma ugljenika, 1- (N- (alkoksikarbonil) amino ) etil sa 4 do 10 atoma ugljenika, 3-ftalidil, 4-krotonolaktonil, gama-butirolakton-4-il, di-N, N- (C1-C2) alkilamino (C2-C3) alkil (kao što je βdimetilaminoetil), karbamoil-(C1-C2) alkil, N, N-di (C1-C2) alkilkarbamoil-(C1-C2) alkil i piperidino-, pirolidino- ili morfolino (C2-C3) alkil, i slično.

Drugi primeri uključuju sledeće: kada jedinjenje formule II sadrži grupu karboksilne kiseline, prolek može biti estar ili amid, a kada jedinjenje formule II sadrži primarnu amino grupu ili drugi pogodan azot koji se može derivatizovati, prolek može biti amid, karbamat, urea, imin ili Mannich baza. Konvencionalni postupci za izbor i pripremu odgovarajućih derivata prolekova opisani su, na primer, u Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, Elsevier, 1985; J. J. Hale et al., J. Med. Chem. 2000, vol. 43, pp. 1234-1241; C. S. Larsen and J. Ostergaard, "Design and application of prodrugs" in: Textbook of Drug Design and Discovery, 3rd edition, edited by C. S. Larsen, 2002, pp. 410-458; i Beaumont et al., Current DrugMetabolism 2003, vol. 4, pp. 461-458.

Prema tome, jedinjenja unutar generičkih strukturnih formula, primeri izvođenja i specifična jedinjenja koji su ovde opisani i za koje se ovde traži zaštita obuhvataju soli, sve moguće stereoizomere i tautomere, fizičke oblike (npr., amorfne i kristalne oblike), njihove solvatne i hidratne oblike i bilo koju kombinaciju ovih oblika, kao i njihove soli, gde su takvi oblici mogući osim ukoliko je drugačije naznačeno.

Pronalazak takođe obuhvata jedinjenje pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u lečenju ili profilaksi infekcije HIV-om, inhibiciji HIV reverzne transkriptaze ili lečenju, profilaksi ili odlaganju početka SIDA-e.

Pronalazak takođe obuhvata jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u pripremi leka za lečenje ili profilaksu infekcije HIV-om, za inhibiciju HIV reverzne transkriptaze ili za lečenje, profilaksu ili odlaganje u početku SIDA-e kod subjekta kod koga postoji potreba za tim.

Pronalazak takođe obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efikasnu količinu jedinjenja prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač i dalje sadrži efikasnu količinu dodatnog anti-HIV sredstva izabranog iz grupe koja se sastoji od antivirusnih sredstava protiv HIV-a, imunomodulatora i anti-infektivnih sredstava. Unutar ovog primera izvođenja, anti-HIV sredstvo je antivirusno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV proteaze, inhibitora HIV reverzne transkriptaze, inhibitora HIV integraze, inhibitora fuzije HIV-a, inhibicije ulaska HIV-a i inhibitora sazrevanja HIV-a.

Bilo koji gornji opis ili sledeći opis koji se odnosi na jedinjenje Formule II takođe se odnosi na svaki njegov primer izvođenja.

Ostali primeri izvođenja prema predmetnom pronalasku obuhvataju sledeće:

(a) Farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efikasnu količinu jedinjenja formule II kao što je definisan u prethodnom tekstu ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutski prihvatljiv nosač.

(b) Farmaceutsku kompoziciju koja sadrži proizvod pripremljen kombinovanjem (npr., mešanjem) efikasne količine jedinjenja formule II kao što je definisan u prethodnom tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutski prihvatljivog nosača.

(c) Farmaceutsku kompoziciju prema (a) ili (b), koja dodatno sadrži efikasnu količinu jednog ili više anti-HIV sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od antivirusnih sredstava protiv HIV-a, imunomodulatora i anti-infektivnih sredstava.

(d) Farmaceutska kompozicija prema (c), pri čemu je anti-HIV sredstvo izabrano od jednog ili više antivirusnih sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV proteaze, nukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, nenukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, inhibitora HIV integraze, inhibitora fuzije HIV-a, inhibitora ulaska HIV-a i inhibitora sazrevanja HIV-a.

(e) Kombinacija koja je (i) jedinjenje formule II kao što je definisano u prethodnom tekstu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i (ii) anti-HIV sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od antivirusnih sredstava protiv HIV-a, imunomodulatora i anti-infektivnih sredstava; gde su i jedinjenje i anti-HIV sredstvo korišćeni u količini koja čini kombinaciju efikasnom za upotrebu u inhibiciji HIV reverzne transkriptaze, lečenju ili profilaksi infekcije HIV-om, ili lečenju, profilaksi ili odlaganju početka ili napredovanja SIDA-e.

(f) Kombinacija prema (e), gde je anti-HIV sredstvo antivirusno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV proteaze, nukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, nenukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, inhibitora HIV integraze, inhibitora fuzije HIV-a, inhibitora ulaska HIV-a i inhibitora sazrevanja HIV-a.

(g) Jedinjenje formule II ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u inhibiciji HIV reverzne transkriptaze.

(h) Jedinjenje formule II ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u profilaksi ili lečenju infekcije HIV-om (npr., HIV-1).

(i) Jedinjenje za upotrebu prema (h), gde se jedinjenje formule II primenjuje u kombinaciji sa efikasnom količinom najmanje jednog drugog antivirusnog sredstva protiv HIV-a izabranog iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV proteaze, inhibitora HIV integraze, nenukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, nukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, inhibitora fuzije HIV-a, inhibitora ulaska HIV-a i inhibitora sazrevanja HIV-a.

(j) Jedinjenje formule ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u profilaksi, lečenju ili odlaganju početka ili napredovanja SIDA-e.

(k) Jedinjenje za upotrebu prema (j), pri čemu se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa efikasnom količinom najmanje jednog drugog antivirusnog sredstva protiv HIV-a izabranog iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV proteaze, inhibitora HIV integraze, nenukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, nukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, inhibitora fuzije HIV-a, inhibitora ulaska HIV-a i inhibitora sazrevanja HIV-a.

(l) Farmaceutska kompozicija prema (a), (b), (c) ili (d) ili kombinacija prema (e) ili (f) za upotrebu u inhibiciji HIV reverzne transkriptaze.

(m) Farmaceutska kompozicija prema (a), (b), (c) ili (d) ili kombinacija prema (e) ili (f) za upotrebu u profilaksi ili lečenju infekcije HIV-om (npr., HIV-1).

(n) Farmaceutska kompozicija prema (a), (b), (c) ili (d) ili kombinacija prema (e) ili (f) za upotrebu u profilaksi, lečenju ili odlaganju početka ili napredovanja SIDA-e.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata jedinjenje formule II ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, (i) za upotrebu u, (ii) za upotrebu kao lek za, ili (iii) za upotrebu u pripremi leka za: (a) terapiju (npr., ljudskog tela), (b) medicinu, (c) inhibiciju HIV reverzne transkriptaze, (d) lečenje ili profilaksu infekcije HIV-om ili (e) lečenje, profilaksu ili odlaganje u početku ili napredovanju SIDA-e. U ovim upotrebama, jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu izborno biti korišćena u kombinaciji sa jednim ili više anti-HIV sredstava izabranih od antivirusnih sredstava protiv HIV-a, anti-infektivnih sredstava i imunomodulatora.

Dodatni primeri izvođenja prema pronalasku obuhvataju farmaceutske kompozicije, kombinacije i upotrebe navedene u (a)-(n) u prethodnom tekstu i upotrebe (i)(a)-(e) do (ii)(a)-(e) navedene u prethodnom pasusu, gde je jedinjenje prema predmetnom pronalasku tu korišćeno jedinjenje prema jednom od primera izvođenja, aspekata, klasa, podklasa ili karakteristika opisanih u prethodnom tekstu. U svim ovim primerima izvođenja itd., jedinjenje može izborno biti korišćeno u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

1

Dodatni primeri izvođenja prema predmetnom pronalasku obuhvataju svaku od farmaceutskih kompozicija, postupaka i upotreba navedenih u prethodnim pasusima, pri čemu je jedinjenje prema predmetnom pronalasku ili njegova so koji su ovde korišćeni značajno čisto. U vezi sa farmaceutskom kompozicijom koja sadrži jedinjenje formule II ili so i farmaceutski prihvatljiv nosač i izborno jedan ili više ekscipijenasa. Razume se da je termin "značajno čist" u vezi sa jedinjenjem formule II ili njegovom soli per se.

Dodatni primeri izvođenja prema predmetnom pronalasku obuhvataju farmaceutske kompozicije, kombinacije i upotrebe navedene u (a)-(n) u prethodnom tekstu i upotrebe (i)(a)-(e) do (ii)(a)-(e) navedene u prethodnom tekstu, pri čemu HIV od interesa je HIV-1. Na taj način, na primer, u farmaceutskoj kompoziciji (d), jedinjenje formule II je korišćeno u količini koja je efikasna protiv HIV-1 i anti-HIV sredstvo je HIV-1 antivirusno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV-1 proteaze, inhibitora HIV-1 reverzne transkriptaze, inhibitora HIV-1 integraze, inhibitora HIV-1 fuzije i inhibitora ulaska HIV-1. Jedinjenja formule II takođe mogu biti korisna sredstva protiv HIV-2.

Termin "primena" i njegove varijante (npr., "primjenjivati" jedinjenje) u vezi sa jedinjenjem formule II označava obezbeđivanje jedinjenja ili proleka jedinjenja na individuu kod koje postoji potreba za lečenjem ili profilaksom i obuhvata kako samo-primenu i primenu na pacijenta od strane druge osobe. Kada je jedinjenje obezbeđeno u kombinaciji sa jednim ili više drugih aktivnih sredstava (npr., antivirusna sredstva korisna za lečenje ili profilaksu HIV infekcije ili SIDA-e), "primena" i njene varijante se svaka razumeju tako da obuhvataju obezbeđivanje jedinjenja i drugih sredstava u isto vreme ili u različita vremena. Kada se sredstva kombinacije primenjuju istovremeno, ona se mogu primenjivati zajedno u jednoj kompoziciji ili se mogu primenjivati posebno.

Kako se ovde koristi, izraz "kompozicija" ima za cilj da obuhvati proizvod koji sadrži navedene sastojke, kao i bilo koji proizvod koji nastaje kombinovanjem navedenih sastojaka. Sastojci pogodni za uključivanje u farmaceutsku kompoziciju su farmaceutski prihvatljivi sastojci, što znači da sastojci moraju biti međusobno kompatibilni i ne smeju biti štetni za primaoca. Pod "farmaceutski prihvatljivim" podrazumeva se da sastojci farmaceutske kompozicije moraju biti međusobno kompatibilni i ne smeju biti štetni za primaoca.

Termin "subjekat" kao što je ovde korišćen označava životinju, poželjno sisara, najpoželjnije čoveka, koji je bio objekat tretmana, opservacije ili eksperimenta.

Termin "efikasna količina" kao što je ovde korišćen označava količinu dovoljnu za inhibiciju HIV reverzne transkriptaze, inhibiciju HIV replikacije, ispoljava profilaktički efekat i/ili ispoljava terapeutski efekat posle primene. Jedan primer izvođenja "efikasne količine" je "terapeutski efikasna količina" koja je količina jedinjenja koja je efikasna za inhibiciju HIV reverzne transkriptaze, inhibiciju HIV replikacije (bilo koja od gore navedenih, koja se takođe može označiti ovde kao "inhibicija efikasne količine"), lečenje HIV infekcije, lečenje SIDA-e, odlaganje početka SIDA-e i/ili usporavanje napredovanja SIDA-e kod pacijenta. Sledeći primer izvođenja "efikasne količine" je "profilaktički efikasna količina" koja je količina jedinjenja koja je efikasna za profilaksu HIV infekcije ili profilaksu SIDA-e kod pacijenta. Razume se da efikasna količina može istovremeno biti terapeutski efikasna količina, npr., za lečenje HIV infekcije i profilaktički efikasna količina, npr., za prevenciju ili redukciju rizika od razvoja SIDA-e. Kada je jedinjenje formule II primenjeno kao so, pozivanje na količinu jedinjenja se odnosi na slobodan oblik (tj., oblik koji nije so) jedinjenja.

U upotrebi predmetnog pronalaska (tj., inhibicija HIV reverzne transkriptaze, lečenje ili profilaksa HIV infekcije, inhibicija HIV replikacije, lečenje ili profilaksa SIDA-e, odlaganje početka SIDA-e, ili odlaganje ili usporavanje napredovanja SIDA-e), jedinjenja ovog pronalaska, izborno u obliku soli, mogu biti primenjivana pomoću načina koji proizvodi kontakt aktivnog sredstva sa mestom delovanja sredstva. Ona se mogu primenjivati bilo kojim konvencionalnim načinima dostupnim za upotrebu zajedno sa farmaceuticima, bilo kao pojedinačna terapeutska sredstva ili u kombinaciji terapeutskih sredstava. Ona se mogu primenjivati pojedinačno, ali se tipično primenjuju sa farmaceutskim nosačem izabranim na bazi izabranog puta primene i standardne farmaceutske prakse. Jedinjenja prema pronalasku mogu, na primer, biti primenjivana oralno, parenteralno (uključujući subkutane injekcije, intravensku, intramuskularu, intrasternalnu injekciju ili tehnike infuzije), pomoću spreja za inhalaciju, ili rektalno, u obliku jedinične doze farmaceutske kompozicije koja sadrži efikasnu količinu jedinjenja i konvencionalne netoksične farmaceutski prihvatljive nosače, ađuvanse i prenosioce, pri čemu bilo koji od postupaka primene može biti obezbeđen kao jedna doza. Jedna dnevno ili ređe kao što je jednom nedeljno ili jednom mesečno u, na primer, ali bez ograničenja na, opsezima doza i količinama opisanim u daljem tekstu. Tečni preparati pogodni za oralnu primenu (npr., suspenzije, sirupi, eliksiri i slično) mogu biti pripremljeni prema tehnikama poznatim u stanju tehnike i mogu da koriste uobičajene medijume kao što su voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično. Čvrsti preparati pogodni za oralnu primenu (npr., praškovi, pilule, kapsule i tablete) mogu biti pripremljeni prema tehnikama poznatim u stanju tehnike i mogu da koriste takve čvrste ekscipijense kao što su skrobovi, šećeri, kaolin, lubrikanti, vezujuća sredstva, sredstva za raspadanje i slično. Parenteralne kompozicije mogu biti pripremljene prema tehnikama poznatim u stanju tehnike i tipično koriste sterilnu vodu

1

kao nosač i izborno druge sastojke, kao što je pomoćno sredstvo za rastvorljivost. Injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni prema postupcima poznatim u stanju tehnike gde nosač sadrži rastvor soli, rastvor glukoze ili rastvor koji sadrži smešu slanog rastvora i glukoze. Dodatni opis postupaka pogodnih za upotrebu u pripremi farmaceutskih kompozicija za upotrebu u predmetnom pronalasku i sastojaka pogodnih za upotrebu u navedenim kompozicijama je dat u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, edited by A. R. Gennaro, Mack Publishing Co., 1990 i u Remington - The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, objavljen od strane Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy at University of the Sciences, 2012, ISBN 9780 85711-062-6 i prethodna izdanja.

Formulacije jedinjenja opisanih Formulom II koje dovode do superzasićenja leka i/ili brzog rastvaranja mogu se koristiti za olakšavanje oralne apsorpcije leka. Pristupi formulaciji koji izazivaju superzasićenje i/ili brzo rastvaranje leka uključuju, ali nisu ograničeni na, sisteme nanočestica, amorfne sisteme, čvrste rastvore, čvrste disperzije i lipidne sisteme. Takvi pristupi formulisanju i tehnike za njihovo pripremanje dobro su poznati u tehnici. Na primer, čvrste disperzije se mogu pripremiti pomoću pomoćnih supstanci i postupaka opisanih u prikazima (npr. A.T.M. Serajuddin, J Pharm Sci, 88:10, pp. 1058-1066 (1999)). Sistemi nanočestica zasnovani i na iscrpljivanju i na direktnoj sintezi takođe su opisani u pregledima kao što su Vu et al (F. Kesisoglou, S. Panmai, Y. Wu, Advanced Drug Delivery Reviews, 59:7 pp. 631-644 (2007)).

Jedinjenja Formule II i njihove farmaceutski prihvatljive soli su inhibitori HIV reverzne transkriptaze. Ova jedinjenja su korisna za inhibiranje HIV reverzne transkriptaze i za inhibiciju replikacije HIV-a in vitro i in vivo. Tačnije, jedinjenja formule II inhibiraju polimeraznu funkciju HIV-1 reverzne transkriptaze. Testiranje jedinjenja iz Primera pronalaska u testu prikazanom u Analizi polimeraze RT u donjem tekstu, ilustruje sposobnost jedinjenja prema pronalasku da inhibiraju RNK-zavisnu aktivnost DNK polimeraze HIV-1 reverzne transkriptaze. Jedinjenja Formule II mogu takođe biti korisna sredstva protiv HIV-2.

Jedinjenja formule II mogu se primenjivati u rasponu doza od 0,001 do 1000 mg/kg telesne težine sisara (na primer, čoveka) dnevno, ili u drugim vremenskim intervalima prema potrebi, u jednoj dozi ili u podeljenim dozama. Jedan primer raspona doziranja je 0,01 do 500 mg/kg telesne težine dnevno, ili u drugim vremenskim intervalima, prema potrebi, oralno ili na druge načine primene u jednoj dozi ili u podeljenim dozama. Drugi primer raspona doziranja je 0,1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno, ili u drugim vremenskim intervalima, prema potrebi, koji se primenjuju oralno ili na druge načine primene u pojedinačnim ili podeljenim dozama. Za oralnu

1

(npr. tablete ili kapsule) ili druge načine primene, mogu se obezbediti kompozicije koje sadrže 1,0 do 500 miligrama aktivnog sastojka, naročito 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 , 200, 250, 300, 400 i 500 miligrama aktivnog sastojka za simptomatsko prilagođavanje doze pacijentu koji se leči. Specifični nivo doze i učestalost doziranja za svakog određenog pacijenta mogu biti različiti i zavisiće od niza faktora, uključujući aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi, metaboličku stabilnost i dužinu delovanja tog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, ishranu, način i vreme davanja, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova, težinu određenog stanja i domaćina koji je na terapiji. U nekim slučajevima, u zavisnosti od jačine jedinjenja ili individualnog odgovora, može biti potrebno odstupanje nagore ili nadole od date doze. Jedinjenja pronalaska se mogu primenjivati kao pojedinačna doza, jednom dnevno, ili ređe, na primer jednom nedeljno ili jednom mesečno u, na primer, ali bez ograničenja, dozama i količinama koje su gore navedene. Pored toga, jedinjenje se može formulisati za neposredno ili modifikovano oslobađanje, kao što je produženo ili kontrolisano oslobađanje.

Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, predmetni pronalazak je takođe usmeren na upotrebu jedinjenja formule II sa jednim ili više anti-HIV sredstava. "Anti-HIV sredstvo" je bilo koje sredstvo koje je direktno ili indirektno efikasno u inhibiciji HIV-a, lečenje ili profilaksu HIV infekcije i/ili lečenje, profilaksu ili odlaganje početka ili napredovanja SIDA-e. Razume se da je anti-HIV sredstvo efikasno u lečenju, prevenciji ili odlaganju početka ili napredovanja HIV infekcije ili SIDA-e i/ili bolesti ili stanja koji su njihov rezultat ili povezani sa njima. Na primer, jedinjenja ovog pronalaska mogu biti efikasno primenjivana, bilo u periodima pre izlaganja i/ili posle izlaganja, u kombinaciji sa efikasnim količinama jednog ili više anti-HIV sredstava izabranih od antivirusnih sredstava protiv HIV-a, imunomodulatora, anti-infektivnih sredstava ili vakcina korisnih za lečenje HIV infekcije ili SIDA-e. Pogodna antivirusna sredstva protiv HIV-a za upotrebu u kombinaciji sa jedinjenjima prema predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, ona navedena u Tabeli 1 kao što sledi:

Tabela 1 Antivirusna sredstva za lečenje HIV infekcije ili SIDA-e

1

1

Razume se da obim kombinacija jedinjenja ovog pronalaska sa anti-HIV sredstvima nije ograničen na antivirusna sredstva protiv HIV-a navedena u Tabeli A, ali obuhvata u principu bilo koju kombinaciju sa bilo kojom farmaceutskom kompozicijom korisnom za lečenje ili profilaksu SIDA-e. Antivirusna sredstva protiv HIV-a i druga sredstva će tipično biti korišćeni u ovim kombinacijama u njihovim konvencionalnim opsezima i režimima kao što je objavljeno u stanju tehnike, uključujući, na primer, doze opisane u Physicians' Desk Reference, Thomson PDR, Thomson PDR, 57th edition (2003), the 58th edition (2004), ili 59th edition (2005) i trenutni

1

Physicians' Desk Reference (68th ed.). (2014), Montvale, NJ: PDR Network. Opsezi doza za jedinjenje prema pronalasku u ovim kombinacijama mogu biti isti kao oni navedeni u prethodnom tekstu.

Jedinjenja ovog pronalaska su takođe korisna u pripremi i izvođenju skrining testova za antivirusna jedinjenja. Na primer, jedinjenja prema ovom pronalasku su korisna za izolovanje enzima mutanata, koji su odlično oruđe za skrining moćnijih antivirusnih jedinjenja. Štaviše, jedinjenja ovog pronalaska su korisna u ustanovljavanju ili određivanju mesta vezivanja drugih antivirusnih lekova za HIV reverznu transkriptazu, na primer, kompetitivnom inhibicijom.

Skraćenice i akronimi koji se ovde koriste uključuju sledeće:

2

Jedinjenja pronalaska se mogu pripremiti pomoću postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike organske hemije. Videti, na primer, J. March, 'Advanced Organic Chemistry' 6th Edition, John Wiley and Sons. Tokom sintetičkih sekvenci može biti neophodno i/ili poželjno zaštititi osetljive ili reaktivne grupe na bilo kom od dotičnih molekula. Ovo je postignuto pomoću konvencionalnih zaštitnih grupa, kao što su one opisane u T.W. Greene and P.G.M. Wutts 'Protective Groups in Organic Synthesis' 4th Edition, John Wiley and Sons. Zaštitne grupe su izborno uklonjene na pogodnom kasnijem stadijumu upotrebom postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike.

Jedinjenja ovog pronalaska mogu se lako pripremiti prema sledećim šemama reakcija i primerima, ili njihovim modifikacijama, koristeći lako dostupne početne materijale, reagense i konvencionalne postupke sinteze. U ovim reakcijama, takođe je moguće koristiti varijante koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti, ali se ne spominju detaljnije. Štaviše, drugi postupci za dobijanje jedinjenja prema pronalasku biće lako očigledni prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti u svetlu sledećih reakcionih šema i primera. Osim ako nije drugačije naznačeno, sve promenljive su kao što su gore definisane.

Šema 1

Laktol 1-1 može se pretvoriti u 1-2 korišćenjem metanolne HCl. Hidroksi grupe intermedijera 1-2 mogu se zatim zaštititi, nakon čega sledi konverzija 1'-OMe u 1'-Cl upotrebom HCl gasa za dobijanje 1-4. Intermedijer 1-4 može reagovati sa različitim supstituisanim heterociklusima (1-5) u prisustvu odgovarajuće baze za obezbeđivanje intermedijera 1-6. 6-Hloro intermedijer 1-6 može se pretvoriti u R4 koristeći odgovarajući hemijski postupak, nakon čega sledi uklanjanje zaštite hidroksilnih grupa da bi se dobio intermedijer 1-7. Intermedijer 1-7 može biti različito zaštićen za obezbeđivanje 1-8. Oksidacija 1-8 obezbeđuje aldehid 1-9 koji tada može proći kroz aldol reakciju sa formaldehidom nakon čega sledi redukcija da bi se obezbedio 1-10. Selektivna oksidacija alfa strane hidroksi grupe praćena konverzijom aldehida u alkin obezbeđuje 1-11.

Konačna deprotekcija zaštite 3'-alkohola obezbeđuje ciljne proizvode 1-13.

2

Šema 2

Lakton 2-1 mogu se tretirati anjonom različitih heterociklusa kako bi se dobili intermedijeri tipa 2-2. Intermedijer 2-2 može se pretvoriti u 2-3 tretiranjem kiselinom u prisustvu silana. Uklanjanje zaštite sa 2-3 nakon čega sledi diferencijalna zaštita 3 'i 5' hidroksila 2-5.

Deoksigenacija 2-5 pruža 2-6 koja se zatim može ukloniti sa zaštite, nakon čega sledi diferencijalna zaštita 2-8. Oksidacija terminalnog alkohola u 2-9 nakon čega sledi aldolna reakcija sa formaldehidom i redukcija obezbeđuje 2-10. Selektivna oksidacija alfa strane alkohola obezbeđuje aldehid 2-11 koji se zatim može pretvoriti u acetilen 2-12. Opšta deprotekcija pruža 2-13.

Šema 3:

Intermedijeri tipa 3-1 (sintetisani korišćenjem postupaka u šemi 1) prevode se u oksime tipa 3-2.

Dehidratacija oksima dovodi do jedinjenja 3-3 koji mogu da se podvrgnu konačnoj deprotekciji radi obezbeđivanja ciljnih proizvoda 3-4.

Šema 4:

X=CH ili N

Intermedijeri tipa 4-1 (sintetisani korišćenjem postupaka u šemi 2) pretvaraju se u oksime tipa 4-2. Dehidratacija oksima dovodi do jedinjenja 4-3 koji mogu da se podvrgnu konačnoj deprotekciji radi obezbeđivanja ciljnih proizvoda 4-4.

Šema 5:

2

Intermedijeri tipa 5-1 (sintetisani korišćenjem postupaka iz prethodnih šema) može se pretvoriti u trifosfate 5-2 koristeći postupaka poznatih iz literature.

Šema 6:

Intermedijeri tipa 6-1 (sintetisani korišćenjem postupaka prethodnih šema) može se pretvoriti u trifosfate 6-2 koristeći postupaka poznatih iz literature.

Opšti hemijski postupci: Svi reagensi su ili kupljeni iz uobičajenih komercijalnih izvora ili sintetisani prema postupcima iz literature počevši od komercijalnih reagensa. Komercijalni reagensi su korišćeni bez daljeg prečišćavanja. Osim ako nije drugačije naznačeno, procenat je težinski procenat date komponente i ukupne težine kompozicije, temperatura je u °C ili je na temperaturi okoline, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.<1>H NMR spektri su dobijeni na Varian VNMR sistemu 400 (400 MHz) i prikazani su kao ppm nishodno od Me4Si sa brojem protona, multiplicitetima i konst. kuplovanja = ant u Hercima naznačenim u zagradi. Tamo gde su predstavljeni LC/MS podaci, analize su izvedene pomoću Agilent 6110A MSD ili Applied Biosystems API-100 masenog spektrometra. Dat je matični jon. Preparativna HPLC je izvedena na Waters preparativnom HPLC sistemu opremljenom kolonom Waters Xselect.C18, tipično koristeći gradijentno eluiranje sa vodom/acetonitrilom koji sadrži 0,075% trifluorosirćetne kiseline. Fleš hromatografija na koloni je izvedena pomoću prethodno upakovanog silicijum dioksida normalne faze iz kompanije Biotage, Inc. ili masovnog silicijum dioksida iz kompanije Fisher Scientific. Osim ako nije drugačije naznačeno, hromatografija na koloni je izvedena uz gradijentno eluiranje petrol etra/etil acetata, od petrol etra 100% do 100% etil acetata. Termin "sobna temperatura" u primerima odnosi se na temperaturu okoline koja je tipično bila u opsegu od oko 20°C do oko 26°C.

2

INTERMEDIJER A

(2R,3S,5R)-5-hloro-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (Intermedijer A)

Intermedijer A

Korak 1: Sinteza (2R,3S)-2-(hidroksimetil)-5-metoksitetrahidrofuran-3-ola

U mešani rastvor (4S,5R)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2,4-diola (7.0 g, 52.2 mmol) u anhidrovanom metanolu (105 mL) pod atmosferom argona, dodat je acetil hlorid (0.614 g, 7.83 mmol) ukapavanjem uz mešanje na 0°C tokom 5 minuta i dobijena smeša je mešana na 0°C u trajanju od 3 časa. Zatim je dodat čvrsti natrijum bikarbonat da bi se reakciona smeša neutralisala. Organska faza je sakupljena filtracijom i zatim je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak kao sirup. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (100-200 mreža) sa dihlorometanom/metanolom (20/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.

<1>H-NMR (300MHz, CDCl3, ppm): δ 4.98-5.04 (m, 1H), 4.21-4.23 (m, 0.4H), 4.07-4.09 (m, 0.6H), 3.83-3.89 (m, 1H), 3.50-3.66 (m, 2H), 3.27-3.32 (m, 3H), 2.23-2.29 (m, 0.6H), 2.08-2.12 (m, 0.4H), 1.98-2.03 (m, 0.4H), 1.77-1.83 (m, 0.6H).

Korak 2: Sinteza (2R,3S)-5-metoksi-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U mešani rastvor (2R,3S)-2-(hidroksimetil)-5-metoksitetrahidrofuran-3-ola (6.5 g, 43.9 mmol) u suvom piridinu (45 mL) pod atmosferom argona, dodat je 4-metilbenzoil hlorid (20.35 g, 132 mmol) ukapavanjem na 0°C tokom perioda od 15 minuta. Dobijena smeša je postepeno zagrevana do 30°C i zatim mešana u trajanju od 16 časova. Dobijeni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je razblažen etil acetatom (400 mL) i zatim ispran vodenim rastvorom hidrogen hlorida (1 mol/L, 2x100 mL), zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (2 x100 mL) i fiziološkim rastvorom (100 mL) respektivno. Organska faza je sakupljena, sušena preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (100-200 mreža) sa petrol etrom/etil acetatom (20:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3,

2

ppm): δ 7.90-7.99 (m, 4H), 7.20-7.26 (m, 4H), 5.58-5.61 (m, 0.47H), 5.39-5.42 (m, 0.55H), 5.18-5.24 (m, 1H), 4.46-4.65 (m, 3H), 3.43 (s, 1.61H), 3.36 (s, 1.33H), 2.52-2.60 (m, 1H), 2.17-2.43 (m, 7H).

Korak 3: (2R,3S,5R)-5-hloro-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (Intermedijer A)

U mešani rastvor (2R,3S)-5-metoksi-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata (4.0 g, 10.41 mmol) u anhidrovanom dietil etru (20 mL) u posudi od 100 mL sa tri grlića i sa okruglim dnom, uveden je HCl (g). Proizvod je postepeno istaložen tokom perioda od 40 min na 0°C. Čvrsta supstanca je filtrirana i isprana sa suvim dietil etrom (3 x 20 mL), sušena pod visokim vakuumom 2 časa da bi se dobio Intermedijer A kao čvrsta supstanca.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 7.96 (d, J=9.0Hz, 2H), 7.90 (d, J=8.1Hz, 2H), 7.19-7.27 (m, 4H), 6.47 (d, J=5.1Hz, 1H), 5.54-5.58 (m, 1H), 4.85 (dd, J=3.3Hz, J=7.2Hz, 1H), 4.68 (dd, J=3.3Hz, J=12.0Hz, 1H), 4.59 (dd, J=4.2Hz, J=12.0Hz, 1H), 2.83-2.92 (m, 1H), 2.74 (d, J=15.0Hz, 1H), 2.42 (d, J=3.6Hz, 6H).

PRIMER 1: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (1)

2

Korak 1: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U suspenziju natrijum hidrida (60% disperzija u mineralnom ulju, 0.272 g, 6.79 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (50 ml) pod atmosferom argona u posudi od 250 ml sa tri grlića i sa okruglim dnom, dodat je 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (0.948 g, 6.17 mmol) i smeša je mešana na temperaturi sredine u trajanju od 30 minuta. (2R,3S,5R)-5-hloro-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (2.4 g, 6.17 mmol) je dodavan u porcijama uz mešanje. Reakciona smeša je zagrevana do 50°C i mešana 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Isparavanje reakcione smeše je dalo uljasti ostatak, koji je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu sa etil acetatom/petrol etrom (1:6, zapr./zapr.) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.64 (s, 1H), 7.98 (d, J=8.1Hz, 2H), 7.92 (d, J=8.1Hz, 2H), 7.43 (d, J=3.6Hz, 1H), 7.20-7.30 (m, 4H), 6.82 (dd, J=5.7Hz, J=8.1Hz, 1H), 6.60 (d, J=3.9Hz, 1H), 4.60-4.76 (m, 3H), 2.86-2.96 (m, 1H), 2.74-2.82 (m, 1H), 2.43 (d, J=5.4Hz, 6H). LC-MS: (ES, m/z): 506.43 [M+H]<+>.

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

(2R,3S,5R)-5-(4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (2.18 g, 4.31 mmol) dodat je u čeličnu bombu od 80 ml i hlađen do -40°C. U ovo je dodat izopropanoliski amonijak (zasićen na -40°C, 60 ml). Pošto je smeša mešana na 90°C i u trajanju od 15 časova, ona je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela sa dihlorometanom/metanolom (4/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.

<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.04 (s, 1H), 7.34 (d, J=3.6Hz, 1H), 7.04 (br, 2H), 6.58 (d, J=3.6Hz, 1H), 6.48 (dd, J=6.0Hz, J=8.0Hz, 1H), 5.24 (d, J=3.6Hz, 1H), 5.16 (t, J=4.2Hz, 1H), 4.34 (d, J=2.0Hz, 1H), 3.82 (dd, J=4.0Hz, J=6.4Hz, 1H), 3.48-3.58 (m, 2H), 2.48-2.54 (m, 1H), 2.13-2.17 (m, 1H).

Korak 3: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina.

(2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol (950 mg, 3.796 mmol) i imidazol (775.4 mg, 11.388 mmol) su dodati u posudu od 25 mL sa okruglim dnom pod atmosferom argona. U posudu je injektiran anhidrovani DMF (8 mL), zatim je dodat t-butildimetilsilil hlorid (1716.4 mg, 11.388 mmol). Pošto je smeša mešana na 25°C 3 časa, razblažena je etil acetatom (40 mL), isprana vodom (20 mL x 2), vodenim rastvorom

2

NaHCO3(zasićen, 20 mL x 2) i fiziološkim rastvorom (20 mL x 2) respektivno. Organski sloj je sakupljen i sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je zatim prečišćen hromatografijom na silika gelu sa etil acetatom/petrol etrom (35% do 42% etil acetat u petrol etru) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.32 (s, 1H), 7.32 (d, J=3.9Hz, 1H), 6.69 (t, J=6.6Hz, 1H), 6.39 (d, J=3.6Hz, 1H), 5.29 (br, 2H), 4.56-4.61 (m, 1H), 3.96 (dd, J=3.5Hz, J=7.0Hz, 1H), 3.74-3.84 (m, 2H), 2.42-2.51 (m, 1H), 2.30-2.38 (m, 1H), 0.92 (d, J=4.2Hz, 18H), 0.08-0.1 (m, 12H). LC-MS: (ES, m/z): 497.71 [M+H]<+>.

Korak 4: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (1.2 g, 2.506 mmol) u THF (24 mL), dodat je prethodno ohlađeni rastvor trifluorosirćetne kiseline/vode (1/2, zapr./zapr., 9 mL) ukapavanjem na 0°C tokom perioda od 10 minuta. Dobijena smeša je mešana na 0°C u trajanju od 4 časa i zatim je ko-isparavana sa toluenom ispod 25°C tri puta da bi se dobio sirup. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela sa etil acetatom/dihlorometanom (1/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.03 (s, 1H), 7.34 (d, J=3.9Hz, 1H), 7.03 (brs, 2H), 6.58 (d, J=3.6Hz, 1H), 6.46 (dd, J=5.7Hz, 1H), 5.19 (t, J=5.7Hz, 1H), 4.51-4.53 (m, 1H), 3.79-3.83 (m, 1H), 3.47-3.57 (m, 2H), 2.55-2.64 (m, 1H), 2.10-2.17 (m, 1H), 0.9 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).

Korak 5: Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (100 mg, 0.274 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (10 mL) pod atmosferom argona u posudi od 25 mL sa okruglim dnom, dodata je 2-jodoksibenzojeva kiselina (230 mg, 0.823 mmol). Dobijena smeša je refluksovana u trajanju od 0.5 časova i zatim hlađena do sobne temperature. Čvrste supstance su otfiltrirane i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 363.20 [M+H]<+>, 381.20 [M+H+H2O]<+>.

Korak 6: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (100 mg, 0.276 mmol, sirov) u 1,4-dioksanu (1 mL), dodat je rastvor formaldehida (0.3 mL, 4.00 mmol), zatim je ukapavanjem dodat rastvor natrijum hidroksida (0.3 mL, 0.600 mmol, 2 M) za 1 minutu. Dobijena smeša je mešana na 25°C u trajanju od 3 časa. Pošto je reakcija završena, reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem sirćetne kiseline, razblažena etil acetatom i ispirana redom vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i fiziološkim rastvorom, sušena preko Na2SO4i isparavana pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u anhidrovanom etanolu (2 mL) i dodat je natrijum borohidrid (20.87 mg, 0.552 mmol) u porcijama na 0°C. Posle mešanja od 1 časa na 25°C, Reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem sirćetne kiseline, razblažena hloroformom (20 mL), isprana vodom i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je sušen preko Na2SO4, i isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne-TLC sa dihlorometanom/metanolom (20/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.03 (s, 1H), 7.37 (d, J=3.6Hz, 1H), 7.02 (brs, 2H), 6.57 (d, J=3.6Hz, 1H), 6.50 (dd, J=5.7Hz, J=8.1Hz, 1H), 5.12 (dd, J=5.1Hz, J=6.3Hz, 1H), 4.59-4.60 (m, 1H), 4.38 (dd, J=5.1Hz, J=6.3Hz, 1H), 3.46-3.61 (m, 4H), 2.70-2.75 (m, 1H), 2.13-2.20 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 6H). LC-MS: (ES, m/z): 395.20 [M+H]<+>.

Korak 7: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (100 mg, 0.253 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (20 mL) pod atmosferom argona, dodata je 2-jodoksibenzojeva kiselina (284 mg, 1.014 mmol). Dobijena smeša je mešana na 30°C u trajanju od 36 časova. LCMS je pokazala da je mali deo započetog diol-nukleozida ostavljen, i ciljno jedinjenje je bilo glavni proizvod. Smeša je filtrirana, isprana dihlorometanom. Filtrat je sakupljen i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 393.28 [M+H]<+>.

Korak 8: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (100 mg, 0.248 mmol, crude) u anhidrovanom metanolu (10 mL) pod atmosferom argona, dodat je kalijum karbonat (68.04 mg, 0.492 mmol). Smeša je hlađena do 0°C, zatim je ukapavanjem dodavan dimetil (1-

1

diazo-2-oksopropil)fosfonat (94.56 mg, 0.492 mmol) za 2 minuta. Pošto je dobijena smeša mešana na 25°C preko noći, ona je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne-TLC (metanol/dihlorometan = 1/15) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.

<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.24 (s, 1H), 7.04 (d, J=3.6Hz, 1H), 6.35 (d, J=3.6Hz, 1H), 6.31 (dd, J=5.7Hz, J=9.3Hz, 1H), 5.48 (br, 2H), 4.73 (d, J=4.2Hz, 1H), 4.03 (d, J=12.6Hz, 1H), 3.80 (d, J=12.3Hz, 1H), 3.13-3.23 (m, 1H), 2.58 (s, 1H), 2.22-2.28 (m, 1H), 0.95 (s, 9H), 0.15 (d, J=7.2Hz, 6H).

Korak 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (60 mg, 0.154 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) pod atmosferom argona, dodat je 1M tetrabutilamonijum fluorid THF rastvor (0.309 mL, 0.309 mmol) ukapavanjem za 1 minut na temperaturi sredine. Dobijeni rastvor je mešan na ovoj temperaturi 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Pošto je početni nukleozid sav potrošen, smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne-TLC (metanol/dihlorometan = 1/9) da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova koje je dodatno prečišćeno pomoću preparativne-HPLC sa sledećim uslovima: (1#-Pre-HPLC-011(Waters)): kolona, X-select CSH kolona, 19*150mm, 5um; pokretna faza, voda sa 10 mmol amonijum bikarbonatom i acetonitrilom (5% acetonitril do 20% za 7.5 min, do 95% za 2 min); Detektor, UV 254 & 220 nm da bi se dobilo jedinjenje 1 kao čvrsta supstanca.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.05 (s, 1H), 7.31 (d, J=3.6Hz, 1H), 7.03 (brs, 2H), 6.58 (d, J=3.6Hz, 1H), 6.50 (t, J=6.3Hz, 1H), 5.40-5.49 (m, 2H), 4.49 (dd, J=6.0Hz, J=11.4Hz, 1H), 3.51-3.66 (m, 2H), 3.46 (s, 1H), 2.55-2.59 (m, 1H), 2.28-2.39 (m, 1H). LC-MS: (ES, m/z): 275.20 [M+H]<+>.

2

PRIMER 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (2)

Korak 1: Sinteza 4-hloro-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina

4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (5 g, 32.6 mmol) i SELECTFLUOR® (1-hlorometil-4-fluoro-1,4-diazoniabiciklo[2.2.2]oktan bis(tetrafluoroborat)) (17.30 g, 48.8 mmol) postavljeni su u posudu od 500 mL sa okruglim dnom pod atmosferom argona. U to je dodat suvi acetonitril (150 mL) i suva sirćetna kiselina (50 mL). Smeša je zagrevana na 70°C i mešana 16 časova. Posle hlađenja do sobne temperature, rastvarači su uklonjeni pod sniženim pritiskom i ostatak je koisparavan sa toluenom. Sirova čvrsta supstanca je rastvorena u smeši dihlorometana/etil acetata (1:1) i filtrirana kroz čep od silika gela. Kombinovane organske faze su isparavane pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je zatim prečišćen hromatografijom na silika gelu sa dihlorometanom/etil acetatom (5:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 12.48 (brs, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.71 (t, J=2.6Hz, 1H). F-NMR: (376MHz, d6-DMSO, ppm): δ -170.76 (s, 1F). LC-MS: (ES, m/z): 172.00 [M+H]<+>.

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-hloro-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U suspenziju natrijum hidrida 60% disperzija u mineralnom ulju (0.177 g, 4.41 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (40 mL) pod atmosferom argona, dodat je 4-hloro-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (0.688 g, 4.01 mmol) u porcijama i smeša je mešana na temperaturi sredine u trajanju od 30 minuta. Zatim je Intermedijer A (1.56 g, 4.01 mmol) dodat u porcijama. Pošto je Reakciona smeša zagrevana do 50°C i mešana 2 časa, isparljiva materija je uklonjena pod sniženim pritiskom, ostatak je zatim prečišćen hromatografijom na silika gelu sa etil acetatom/petrol etrom (1/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.62-8.68 (m, 1H), 7.91-7.99 (m, 4H), 7.26-7.29 (m, 4H), 7.16-7.18 (m, 2H), 6.84-6.88 (m, 1H), 5.74-5.76 (m, 1H), 4.60-4.74 (m, 3H), 2.74-2.79 (m, 2H), 2.43-2.46 (m, 6H). LC-MS: (ES, m/z): 524.30 [M+H]<+>.

Korak 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U čeličnu bombu od 80 mL, dodat je (2R,3S,5R)-5-(4-hloro-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (2.0 g, 3.82 mmol). Medijum je hlađen do -40°C. U ovo je dodat amonijakom zasićeni i-PrOH (60 mL). Pošto je smeša zagrevana do 80°C i mešana u trajanju od 18 časova, dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu sa dihlorometanom/metanolom (5/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.06 (s, 1H), 7.33 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.99 (brs, 2H), 6.54 (t, J=6.0Hz, 1H), 5.24 (d, J=4.4Hz, 1H), 4.99 (t, J=5.6Hz, 1H), 4.30-4.33 (m, 1H), 3.78-3.81 (m, 1H), 3.47-3.56 (m, 2H), 2.37-2.44 (m, 1H), 2.12-2.17 (m, 1H). F-NMR: (376MHz, d6-DMSO, ppm): δ -167.49 (s, 1F).

Korak 4: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina

(2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol (538 mg, 2.006 mmol) i imidazol (819 mg, 12.03 mmol) su dodati u posudu od 25 mL sa okruglim dnom pod atmosferom argona. U ovo je dodat suvi DMF (5 mL), zatim je dodat terc-butilhlorodimetilsilan (1209 mg, 8.02 mmol) u porcijama. Dobijena smeša je mešana na 25°C u trajanju od 3 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC i LCMS. Pošto je reakcija završena, smeša je razblažena etil acetatom (40 mL), isprana vodom (20

4

mL x 2), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(20 mL x 2) i fiziološkim rastvorom (20 mL x 2) respektivno. Organski sloj je sakupljen, sušen preko anhidrovanog Na2SO4i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je zatim prečišćen hromatografijom na silika gelu sa etil acetatom/petrol etrom (28% do 41% etil acetat u petrol etru) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.

<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.07 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.99 (brs, 2H), 6.54 (t, J=6.0Hz, 1H), 4.49 (s, 1H), 3.60-3.78 (m, 3H), 2.51-2.53 (m, 1H), 2.16-2.20 (m, 1H), 0.88 (d, J=4.2Hz, 18H), 0.11 (s, 6H), 0.04 (s, 6H). LC-MS: (ES, m/z): 497.71 [M+H]<+>.

Korak 5: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (900 mg, 1.812 mmol) u THF (12 mL) dodat je vodeni rastvor trifluorosirćetne kiseline (trifluorosirćetna kiselina/voda = 1/1, zapr./zapr., 6 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C za 10 minuta. Dobijena smeša je mešana na 0°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Pošto je reakcija završena, dobijena smeša je ko-isparavana sa toluenom (50 mL x 3) pod vakuumom dok je temperatura održavana ispod 25°C da bi se uklonile isparljive materije. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu sa etil acetatom/petrol etrom (52% do 58% etil acetata u petrol etru) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.07 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.99 (brs, 2H), 6.53 (t, J=6.9Hz, 1H), 5.04 (t, J=5.6Hz, 1H), 4.47-4.51 (m, 1H), 3.76-3.79 (m, 1H), 3.44-3.57 (m, 2H), 2.45-2.51 (m, 1H), 2.11-2.16 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H). LC-MS: (ES, m/z): 383.26 [M+H]<+>.

Korak 6: Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (360 mg, 0.941 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (12 mL) pod argonom, dodata je 2-jodoksibenzojeva kiselina (791 mg, 2.82 mmol). Dobijena smeša je refluksovana u trajanju od 35 minuta. Reakcija je hlađena do sobne temperature, i čvrste supstance su otfiltrirane. Filtracija je sakupljena i zatim koncentrovana pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja.

Korak 7: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (400 mg, 1.051 mmol, sirov) u 1,4-dioksanu (4 mL), dodat je rastvor formaldehida (1.2 mL, 16.01 mmol), zatim je dodat natrijum hidroksid (1.2 mL, 2 M, 2.400 mmol) ukapavanjem tokom 5 minuta. Dobijena smeša je mešana na 25°C u trajanju od 3 časa, i zatim je reakciona smeša neutralizovana dodavanjem sirćetne kiseline. Dobijena smeša je razblažena etil acetatom, ispirana redom vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i fiziološkim rastvorom. Organska faza je sušena preko Na2SO4i isparavana pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u etanolu (10 mL) i dodat je natrijum borohidrid (80 mg, 2.103 mmol) u porcijama na 0°C. Posle mešanja od 1 časa na 25°C, Reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem sirćetne kiseline i zatim razblažena hloroformom i redom ispirana vodom i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je sušen preko Na2SO4i isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu sa dihlorometanom/metanolom (30/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR. (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.06 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.99 (brs, 2H), 6.57 (t, J=3.6Hz, 1H), 4.99 (t, J=4.8Hz, 1H), 4.55-4.59 (m, 1H), 4.39 (t, J=5.1Hz, 1H), 3.45-3.55 (m, 4H), 2.57-2.65 (m, 1H), 2.17-2.20 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 6H).

Korak 8: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (120 mg, 0.291 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (8 mL) pod atmosferom argona, dodata je 2-jodoksibenzojeva kiselina (326 mg, 1.164 mmol). Dobijena smeša je mešana na 30°C u trajanju od 24 časa i zatim filtrirana i isprana dihlorometanom. Filtrat je sakupljen i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 411.43 [M+H]<+>.

Korak 9: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2- (hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (110 mg, 0.268 mmol, sirov) u anhidrovanom metanolu (8 mL) pod argonom, dodat je kalijum karbonat (111 mg, 0.804 mmol). Smeša je hlađena do 0°C, zatim je ukapavanjem dodavan dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonat (154 mg, 0.804 mmol) tokom 1 minute. Pošto je smeša mešana na 25°C preko noći, dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom, i zatim je prečišćena pomoću preparativne-TLC (metanol/dihlorometan = 1/15) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.07 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.03 (br, 2H), 6.56 (t, J=6.3Hz, 1H), 5.43 (t, J=6.0Hz, 1H), 4.61 (t, J=5.4Hz, 1H), 3.58-3.67 (m, 1H), 3.49-3.53 (m, 1H), 3.47 (s, 1H), 2.52-2.61 (m, 1H), 2.23-2.31 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (d, J=2.4Hz, 6H). LC-MS: (ES, m/z): 407.30 [M+H]<+>.

Korak 10: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (40 mg, 0.098 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) pod atmosferom argona, dodat je rastvor TBAF/THF (0.118 mL, 0.118 mmol) ukapavanjem uz mešanje tokom 1 minute na sobnoj temperaturi i dobijeni rastvor je mešan na ovoj temperaturi u trajanju od 2 časa. Pošto je reakcija završena, dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom, i ostatak je prečišćen pomoću preparativne-TLC (metanol/dihlorometan = 1/10) da bi se dobio sirovi proizvod (28 mg). Sirovi proizvod je dodatno prečišćen pomoću preparativne-HPLC sa sledećim uslovima: (1#-Pre-HPLC-011(Waters)): kolona, X-select CSH kolona, 19*150mm, 5um; pokretna faza, voda sa 10 mmol amonijum bikarbonatom i acetonitrilom (5% acetonitril do 35% za 7.5 min, do 95% za 2 min); Detektor, UV 254 & 220 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane da bi se dobilo jedinjenje 2 kao čvrsta supstanca.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ8.07 (s, 1H), 7.30 (d, J=1.6Hz, 1H), 7.02 (br, 2H), 6.55 (t, J=5.8Hz, 1H), 6.05 (br, 1H), 5.31-5.45 (m, 1H), 4.46 (t, J=6.6Hz, 1H), 3.58 (dd, J=11.8Hz, J=29.4Hz, 2H), 3.47 (s, 1H), 2.44-2.51 (m, 1H), 2.29-2.36 (m, 1H). F-NMR: (376MHz, d6-DMSO, ppm): δ -167.23 (s, IF). LC-MS: (ES, m/z): 293.10 [M+H]<+>, 315.10 [M+Na]<+>.

PRIMER 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (3)

Korak 1: 5-bromo-4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin

4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (1 g, 6.51 mmol) je suspendovan u suvom DCM (20 mL) zatim je dodat NBS (N-bromosukcinimid) (1.275 g, 7.16 mmol) na temperaturi sredine pod atmosferom argona. Smeša je zagrevana do refluksa i mešana 16 časova. Pošto je sav početni deaza-pirimidin potrošen, smeša je hlađena do temperature sredine i održavana u trajanju od 30 min. Talog je sakupljen filtracijom, ispran sa DCM (2 x 20 mL), sušen pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 233.90 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 12.98 (brs, 1H), 8.64 (s, 1H), 7.96 (s, 1H).

Korak 2: Sinteza 4-hloro-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina

5-bromo-4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (232 mg, 0.998 mmol) je rastvoren u suvom THF (10 mL) i hlađen do -78°C pod atmosferom argona. U ovo je dodat rastvor n-butil litijum heksana (2.5 M, 0.88 mL, 2.196 mmol) ukapavanjem uz mešanje 5 minuta. Smeša je mešana oko 40 minuta, zatim je dodat jodometan (212 mg, 1.497 mmol). Rastvor je zatim zagrevan lagano do sobne temperature 2 časa. Dodata je voda (2 mL) da bi se reakcija ugasila. Isparljiva materija je uklonjena in vacuo ispod 40°C da bi se proizvela suspenzija. Suspenzija je ponovo rastvorena u EtOAc (50 mL) i isprana vodom (2 x 15 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL). Organski sloj je sakupljen, sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan in vacuo da bi se proizveo prah koji je rekristalizovan iz MeOH da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 168.00 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 12.22 (brs, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 2.41 (d, J = 0.90 Hz, 1H).

Korak 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-hloro-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U mešanu suspenziju natrijum hidrida (60% disperzija u ulju, 0.453 g, 11.32 mmol) u anhidrovanom ACN (50 mL) dodat je 4-hloro-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (1.724 g, 10.29 mmol) u porcijama pod atmosferom argona i smeša je mešana na 25°C u trajanju od 30 minuta. U dobijeni bistar rastvor dodat je Intermedijer A (4.0 g, 10.29 mmol) u porcijama na 25°C. Dobijena smeša je zagrevana do 50°C i mešana 3 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Smeša je koncentrovana pod vakuumom i dala je čvrstu supstancu, koja je prečišćena hromatografijom na koloni silika-gela upotrebom etil acetata/petrol etra (1:6, zapr./zapr.) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 520.25 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.55 (s, 1H), 7.90-7.99 (m, 4H), 7.20-7.30 (m, 4H), 7.11 (s, 1H), 6.81 (dd, J = 6.0Hz, J = 8.4Hz, 1H), 5.76 (dd, J = 1.5Hz, J = 3.6Hz, 1H), 4.73-4.79 (m, 1H), 4.54-4.64 (m, 2H), 2.79-2.88 (m, 1H), 2.68-2.75 (m, 1H), 2.43(d, J = 3.0Hz, 6H), 2.33 (d, J = 0.9Hz, 3H).

Korak 4: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U čeličnu bombu od 150 mL sipan je (2R,3S,5R)-5-(4-hloro-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (4.5 g, 7.79 mmol). Medijum je hlađen do -40°C. U ovo je dodat 2-propanolski amonijak (i-PrOH/tečni NH3= 1/1, zapr./zapr., 120 mL). Bomba je zapečaćena i smeša je zagrejana na 90°C i mešana 40 sati. Po završetku reakcije, smeša je ohlađena na 0°C i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela koristeći DCM/MeOH (4/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 265.10 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ8.00 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.58 (brs, 2H), 6.45 (dd, J = 6.0Hz, J = 8.1Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.3Hz, 1H), 5.05 (t, J = 5.1Hz, 1H), 4.32-4.36 (m, 1H), 3.78 (d, J = 2.1Hz, 1H), 3.44-3.57 (m, 2H), 2.39-2.51 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.06-2.13 (m, 3H).

Korak 5: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (1.7 g, 6.43 mmol) i 1H-imidazola (1.752 g, 25.7 mmol) u suvom DMF (10 ml) je dodat terc-butilhlorodimetilsilan (2,91 g, 19,30 mmol) uz mešanje na 25°C u atmosferi argona. Dobijena smeša je mešana na 25°C tokom 3 sata i zatim razblažena etil acetatom (100 mL), isprana vodom (2 x 30 mL), vodenim rastvorom NaHCO3(zasićeni, 2 x 30 mL) i fiziološkim rastvorom (30 mL) respektivno. Organski sloj je sakupljen i osušen iznad anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je zatim prečišćen hromatografijom na koloni silika gela korišćenjem etil acetata/petrol etra (28% do 41% EA u PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 493.30 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.24 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.67 (dd, J = 6.3Hz, J = 7.2Hz, 1H), 5.37 (br, 2H), 4.54-4.57 (m, 1H), 3.94 (dd, J = 3.3Hz, J = 6.3Hz, 1H), 3.72-3.82 (m, 2H), 2.37-2.46 (m, 4H), 2.25-2.32 (m, 1H), 0.91 (2s, 18H), 0.10 (s, 12H).

Korak 6: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-(tercbutildimetilsilil)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor 7-((2R,4S,5R)-4-(terc-butildimetilsilil)-5-((tercbutildimetilsilil)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (2.5 g, 5.07 mmol) u THF (30 mL) dodat je prethodno ohlađen rastvor trifluorosirćetne kiseline/vode (1/1, zapr./zapr., 15 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C 10 minuta. Dobijena smeša je mešana na 0°C tokom 3 sata. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Dobijeni rastvor je zajedno uparen sa toluenom (3 x 100 mL) uz održavanje unutrašnje temperature ispod 25°C. Dobijeni sirovi proizvod je zatim prečišćen hromatografijom na koloni silika gela korišćenjem etil acetata/petrol etra (50% do 58% EA u PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 493.30 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ 8.18 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 6.59 (dd, J = 6.0Hz, J = 7.8Hz, 1H), 4.56-4.60 (m, 1H), 3.93 (dd, J = 3.9Hz, J = 6.6Hz, 1H), 3.65-3.70 (m, 2H), 2.45-2.54 (m, 1H), 2.42 (d, J = 0.9Hz, 3H), 2.23-2.31 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (s, 6H). Korak 7: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-(tercbutildimetilsilil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešanu suspenziju ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-(tercbutildimetilsilil)tetrahidrofuran-2-il)metanola (600 mg, 1.585 mmol) u anhidrovanom ACN (12 mL) dodat je IBX (888 mg, 3.17 mmol) pod atmosferom argona. Smeša je zagrevana do refluksa i mešana 55 minuta. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Smeša je ohlađena do sobne temperature, a čvrste supstance su filtrirane. Filtracija je sakupljena i zatim koncentrovana pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku

4

reakcije direktno bez prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 377.15 [M+H]<+>, 409.15 [M+H+MeOH]<+>.

Korak 8: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-(tercbutildimetilsilil)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-(tercbutildimetilsilil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (420 mg, sirov) u 1,4-dioksanu (12 mL) i vodi (3 mL) u posudi od 50 mL sa okruglim dnom, dodat je vodeni rastvor formaldehida (37% tež./tež., 6 mL), zatim je dodat rastvor natrijum hidroksida (2 N, 6 mL, 0.12 mmol) ukapavanjem za 2 minuta. Dobijena smeša je mešana na 25°C 3 časa. Nakon što je započeti nukleozid-aldehid sav potrošen, Reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem AcOH (oko 0.8 mL). Dobijena smeša je razblažena sa AcOEt (50 mL) i isprana uzastopno vodom (30 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(20 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL). Organski sloj je sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je ponovo rastvoren u anhidrovanom EtOH (8 mL) i dodat je natrijum borhidrid (84.4 mg, 2.23 mmol) u porcijama na 0°C. Nakon mešanja tokom 1 sata na 25°C, Reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem AcOH. Smeša je koncentrovana pod vakuumom, podeljena između CHCl3(50 mL) i vode (30 mL). Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa CHCl3(2 x 20 mL). Kombinovani organski sloj je ispran sukcesivno vodom i fiziološkim rastvorom, sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom dihlorometana/metanola (5.5% MeOH u DCM) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 409.35 [M+H]<+>, 431.35 [M+Na]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.00 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.56 (br, 2H), 6.48 (dd, J = 6.0Hz, J = 8.4Hz, 1H), 6.45-6.47(m, 1H), 5.02 (t, J = 5.5Hz, 1H), 4.58 (t, J = 2.7Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 4.5Hz, J = 6.3Hz, 1H), 3.42-3.60 (m, 4H), 2.58-2.63 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.09-2.16 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 6H).

Korak 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

((3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi) tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanol (140 mg, 0.343 mmol) je suspendovan u suvom ACN (15 mL) pod atmosferom argona zatim je dodata 2-jodilbenzojeva kiselina (240 mg, 0.857 mmol). Smeša je mešana na 30°C 20 sati. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa CHCl3(2 x 20 mL). Kombinovani filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 407.25 [M+H]<+>.

Korak 10: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (120 mg, ∼0.236 mmol, sirov) u suvom MeOH (15 mL) dodat je K2CO3(82 mg, 0.590 mmol) na 0°C pod atmosferom argona, zatim je dodat rastvor dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonata (91 mg, 0.472 mmol) u MeOH (2 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C za 2 minuta. Dobijena smeša je postepeno zagrevana do 25°C i mešana 16 časova. Smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen „flash“ hromatografijom na koloni silika gela korišćenjem etil acetata/petrol etra (30%-50% EA u PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 403.25 [M+H]<+>.

<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.01 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.60(br, 2H), 6.49 (dd, J = 6.0Hz, J = 7.2Hz, 1H), 5.48 (t, J = 5.7Hz, 1H), 4.62 (t, J = 5.7Hz, 1H), 3.57-3.68 (m, 1H), 3.48-3.52 (m, 1H), 3.45 (s, 1H), 2.49-2.62 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.21-2.31 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.12 (d, J = 6.0Hz, 6H).

Korak 11: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (3)

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (27 mg, 0.067 mmol) u suvom THF (1 mL) dodat je tetra-butilamonijum fluorid THF rastvor (1.0 M, 0.067 mL, 0.067 mmol) ukapavanjem uz mešanje na 0°C. Dobijena smeša je mešana na 25°C 30 minuta. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Dobijeni rastvor je koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC pod sledećim uslovima (1#-Pre-HPLC-011(Waters)): kolona, XBridge™ C18 kolona, 19*150mm, 5um; pokretna faza, voda sa 10 mmol amonijum bikarbonatom i acetonitrilom (30% acetonitril do 70% za 10 min, do 95% za 2 min, do 5% za 1.5 min); Stopa protoka: 20 mL/min; Detektor, UV 254&220nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizirane da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 289.05 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.00 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.58 (br, 2H), 6.48 (t, J = 6.60Hz, 1H), 5.45 (d, J = 5.1Hz, 1H), 5.38 (t, J = 6.0Hz, 1H), 4.46 (q, J = 5.4Hz, 1H), 3.50-3.64 (m, 2H), 3.44 (s, 1H), 2.44-2.54 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.24-2.32 (m, 1H).

PRIMER 4: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (4)

Korak 1: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(2,4-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U mešanu suspenziju natrijum hidrida (60% disperzija u mineralnom ulju, 0.509 g, 12.73 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (125 mL) dodat je 2,4-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (2.176 g, 11.57 mmol) u porcijama pod atmosferom argona i smeša je mešana na temperaturi sredine u trajanju od 30 minuta. U gore navedeni bistar rastvor dodat je Intermedijer A (4.5 g, 11.57 mmol) u serijama uz mešanje. Reakciona smeša je ostavljena da se meša na temperaturi sredine 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Uparavanjem reakcione smeše dobije se uljasti ostatak, koji je prečišćen hromatografijom na koloni silika-gela upotrebom etil acetat/petrol etra (1/6, zapr./zapr.) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 540.20 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, CDCl3, ppm): δ 8.01 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.93 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.43 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.22-7.37 (m, 4H), 6.80 (dd, J = 6.0Hz, J = 8.0Hz, 1H), 6.61 (d, J = 4.0Hz, 1H), 5.76 (t, J = 2.8Hz, 1H), 4.76 (dd, J = 3.6Hz, J = 12.0Hz, 1H), 4.63-4.69 (m, 2H), 2.76-2.86 (m, 2H), 2.47,2.45 (2s, 6H).

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U čeličnu bombu od 250 mL dodat je (2R,3S,5R)-5-(2,4-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (5 g, 9.25 mmol). Medijum je

4

hlađen do -40°C. Ovome je dodat izopropanolski amonijak (izopropanol/tečni amonijak = 1/3, zapr./zapr., 150 mL). Medijum je zapečaćen, zagrejan na 90°C i mešan 16 sati. Dobijena smeša je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je ponovo rastvoren u MeOH (100 mL), nakon čega sledi dodavanje rastvora natrijum metoksida u MeOH (1.0 M, 16.89 mL, 16.89 mmol) ukapavanjem na 0°C. Dobijena smeša je zagrejana do 25°C i mešana 2 časa. Po završetku reakcije, smeša je neutralizovana dodavanjem sirćetne kiseline (0.01 mL) i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je suspendovan u DCM/MeOH (zapr./zapr., 100/1, 150 mL). Nakon 20 minuta mešanja, istaložena je čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je sakupljena filtriranjem, isprana sa DCM i osušena in vacuo da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 285.20 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400MHz, CD3OD,ppm): δ 7.31 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.45 (t, J = 6.8Hz, 1H), 4.52-4.53 (m, 1H), 3.98-4.01 (m, 1H), 3.81 (dd, J = 2.4Hz, J = 12.0Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 3.2Hz, J = 12.0Hz, 1H), 2.63-2.70 (m, 1H), 2.29-2.34 (m, 1H).

Korak 3: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (3.2 g, 6.74 mmol) i imidazola (1.836 g, 27.0 mmol) u suvom DMF (10 mL) pod atmosferom argona dodat je TBS-Cl (3.05 g, 20.23 mmol) na temperaturi sredine. Dobijena smeša je mešana preko noći. Reakciona smeša je razblažena etil acetatom (100 mL), isprana vodom (2 x 20 mL), vodenim rastvorom NaHCO3(zasićeni, 2 x 20 mL) i fiziološkim rastvorom (2 x 20 mL) redom. Organski sloj je sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom etil acetata/petrol etra (35% do 42% EA u PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 513.20 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, CDCl3, ppm): δ7.32 (s, 1H), 6.61 (t, J = 6.8Hz, 1H), 6.38 (s, 1H), 5.44 (br, 2H), 4.59-4.61 (m, 1H), 3.91-3.99 (m, 1H), 3.77-3.88 (m, 2H), 2.44-2.51 (m, 1H), 2.34-2.37 (m, 1H), 0.93-0.95 (m, 18H), 0.11-0.12 (m, 12H).<1>H-NMR: (400MHz, CD3OD,ppm): δ 7.31 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.45 (t, J = 6.8Hz, 1H), 4.52-4.53 (m, 1H), 3.98-4.01 (m, 1H), 3.81 (dd, J = 2.4Hz, J = 12.0Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 3.2Hz, J = 12.0Hz, 1H), 2.63-2.70 (m, 1H), 2.29-2.34 (m, 1H).

Korak 4: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (2.3 g, 4.48 mmol) u THF (40 mL) dodat jeprethodno ohlađeni rastvor trifluorosirćetne kiseline/vode (zapr./zapr., 1/1, 20 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C za 10 minuta. Dobijena smeša je mešana 2 sata na 0°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Dobijeni rastvor je koisparavan sa toluenom (3 x 60 mL) uz održavanje unutrašnje temperature ispod 25°C dajući roze sirup. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom etil acetata/dihlorometana (1/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 399.20 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.53 (br, 2H), 7.35 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.35 (t, J = 6.8Hz, 1H), 4.95 (t, J = 5.4Hz, 1H), 4.51-4.54 (m, 1H), 3.73-3.79 (m, 1H), 3.46-3.55 (m, 2H), 2.54-2.59 (m, 1H), 2.16-2.20 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.53 (br, 2H), 7.35 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.35 (t, J = 6.8Hz, 1H), 4.95 (t, J = 5.4Hz, 1H), 4.51-4.54 (m, 1H), 3.73-3.79 (m, 1H), 3.46-3.55 (m, 2H), 2.54-2.59 (m, 1H), 2.16-2.20 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).

Korak 5: Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (600 mg, 1.504 mmol) u anhidrovanom DMSO (3 mL) i acetonitrilu (15 mL) pod atmosferom argona dodat je IBX (632 mg, 2.256 mmol). Smeša je mešana na temperaturi sredine 2.5 časa. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom (20 mL), isprana fiziološkim rastvorom (2 x 10 mL), sušena preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirana. Filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 415.40 [M+H2O]<+>.

Korak 6: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanol

U mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (700 mg, sirov) u 1,4-dioksanu (28 mL) i vodi (7 mL) dodat je rastvor formaldehida (7 mL, 93 mmol), zatim je ukapavanjem dodat vodeni rastvor natrijum hidroksida (7 mL, 2 N, 14.00 mmol) za 5 minuta. Dobijena smeša je mešana na 25°C 3 časa. Pošto je početni nukleozid-aldehid sav potrošen, Reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem sirćetne kiseline (0.5 mL). Smeša je razblažena etil acetatom (100 mL) i ispirana redom vodom (2 x 20 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(20 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL). Organski sloj je sušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je ponovo rastvoren u anhidrovanom EtOH (4 mL) i dodat je natrijum

4

borohidrid (133 mg, 3.53 mmol) pod atmosferom argona u porcijama na 0°C. Posle mešanja od 1 časa na 25°C, smeša je neutralizovana dodavanjem sirćetne kiseline (1.0 mL). Smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je razblažen sa CHCl3(100 mL) i ispiran redom vodom (2 x 20 mL) i fiziološkim rastvorom (1 x 20 mL). Organski sloj je sušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela using DCM/MeOH (30/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 429.30 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.51 (br, 2H), 7.38 (d, J = 3.9Hz, 1H), 6.60 (d, J = 3.6Hz, 1H), 6.40 (t, J = 6.9Hz, 1H), 4.88 (t, J = 5.5Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 3.3Hz, J = 5.5Hz, 1H), 4.39 (t, J = 5.7Hz, 1H), 3.43-3.63 (m, 4H), 2.61-2.70 (m, 1H), 2.21-2.29 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.10 (s, 6H).

Korak 7: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (150 mg, 0.350 mmol) u suvom acetonitrile (15 mL) dodat je IBX (294 mg, 1.049 mmol) pod atmosferom argona. Dobijena smeša je mešana na 30°C 2 časa. Smeša je filtrirana, isprana sa CHCl3(3 x 15 mL). Filtrat je sakupljen i zatim koncentrovan pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 427.30 [M+H]<+>.

Korak 8: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

(2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid (200 mg, 0.468 mmol) je rastvoren u anhidrovanom MeOH (9 mL) zatim je dodat kalijum karbonat (162 mg, 1.171 mmol) na 0°C pod atmosferom argona. U suspenziju je dodat rastvor dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonata (180 mg, 0.937 mmol) u MeOH (1 mL) ukapavanjem uz mešanje za 1 minut. Dobijena smeša je zagrevana do 30°C i mešana 16 časova. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je podeljen između etil acetata (30 mL) i vode (10 mL). Organski sloj je sakupljen, ispran fiziološkim rastvorom (2 x 10 mL), sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je zatim prečišćen pomoću preparativne-TLC (MeOH/DCM = 1/15) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 423.60 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.55 (br, 2H), 7.34 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.38 (t, J =

4

6.4Hz, 1H), 5.32 (t, J = 6.0Hz, 1H), 4.67 (t, J = 6.0Hz, 1H), 3.58-3.61 (m, 1H), 3.48-3.52 (m, 1H), 3.47 (s, 1H), 2.60-2.63 (m, 1H), 2.31-2.35 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (d, J = 3.6Hz, 6H). Korak 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (60 mg, 0.142 mmol) u THF (1 mL) dodat je TBAF THF rastvor (1 M, 0.28 mL, 0.284 mmol) ukapavanjem uz mešanje na temperaturi sredine. Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi sredine 2 časa. Smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je zatim prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima (1#-Pre-UPLC-011(Waters)): kolona, SunFire Prep C18 OBD kolona, 5 um, 19*150 mm; pokretna faza, voda (sa 10 mmol amonijum bikarbonatom) i acetonitril (8% acetonitril do 40% za 6 min, do 95% za 1.5 min, do 5% za 1 min); Detektor, uv 254&220 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane da bi se dobilo jedinjenje 4 kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 309.00 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.54 (br, 2H), 7.33 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.60 (d, J= 3.6 Hz, 1H), 6.41 (t, J = 6.4Hz, 1H), 5.52-5.53 (m, 1H), 5.26 (t, J = 6.0Hz, 1H), 4.47-4.48 (m, 1H), 3.61 (dd, J = 5.2Hz, J = 11.6Hz, 1H), 3.53 (dd, J = 6.2Hz, J = 11.8Hz, 1H), 3.48 (s, 1H), 2.41-2.50 (m, 1H), 2.32-2.38 (m, 1H)

PRIMER 5: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (5)

4

Korak 1: Sinteza (2R,3S,5S)-5-(5-bromo-4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

Natrijum hidrid (0.479 g, 11.98 mmol) je dodat u mešani rastvor 5-bromo-4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina (2.32 g, 9.98 mmol, sinteza opisana u Primeru 3, Korak 1) u acetonitrilu (30 mL). Dobijena smeša je mešana 30 minuta na 0°C, i zatim je dodat (2R,3S,5R)-5-hloro-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (4.27 g, 10.98 mmol). Pošto je dobijena smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 čas, razblažena je sa 200 mL etil acetata, isprana zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (60 mL) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (60 mL), sušena preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela sa petrol etrom\etil acetatom (1 : 2) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova:<1>H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.65 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.24-7.39 (m, 4H), 6.76-6.79 (m, 1H), 5.74-5.76 (m, 1H), 4.51-4.68 (m, 3H), 3.05-3.15 (m, 1H), 2.74-2.79 (m, 1H), 2.37 (d, J = 1.8 Hz, 6H).

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

(2R,3S,5R)-5-(5-bromo-4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (4.50 g, 7.69 mmol) dodat je u NH3zasićeni i-PrOH(15 mL) na -60°C. Dobijena smeša je mešana na 80°C 12 časova, i zatim hlađena do sobne temperature i isparavana pod vakuumom da bi se dobio (2R,3 S,5R)-5-( 4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (4.2 g, 7.43 mmol) kao čvrsta supstanca. Ovo sirovo jedinjenje je rastvoreno u 30 mL MeOH, i zatim je dodat natrijum metanolat (14.86 mL, 14.86 mmol). Pošto je dobijeni rastvor mešan na sobnoj temperaturi 2 časa, on je ugašen sirćetnom kiselinom (0.1 mL) i koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela pomoću petrol etra/etil acetata (1:2) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova:<1>H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.12 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 6.78 (s, 2H), 6.48-6.51 (m, 1H), 5.25 (s, 1H), 5.01 (s, 1H), 4.32 (s, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.17(s, 1H), 2.35-2.50 (m, 1H), 2.12-2.19 (m, 1H).

Korak 3: Sinteza 5-bromo-7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina Terc-butilhlorodimetilsilan (1.786 g, 11.85 mmol) dodat je u mešani rastvor (2R,3 S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (1.3 g, 3.95 mmol), 1H-imidazola (1.076 g, 15.80 mmol) u DMF (8 mL). Dobijena smeša je mešana na

4

sobnoj temperaturi u trajanju od 4 časa, i zatim razblažena sa 400 mL etil acetata, isprana zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (80 mL) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (80 mL), sušena preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovana u vakuumu. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela sa etil acetatom/petrol etrom (1:4) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova:<1>H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.10 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 6.79 (s, 2H), 6.48-6.53 (m, 1H), 4.50 (s, 1H), 3.62-3.76 (m, 3H), 2.43-2.50 (m, 1H), 2.17-2.16 (m, 1H), 0.88 (d, J = 2.7 Hz, 18H), 0.10 (s, 6H), 0.05 (s, 6H).

Korak 4: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-ila)

5-bromo-7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amin (1.55 g, 2.78 mmol) je rastvoren u THF (4 mL) i zatim tretiran prethodno ohlađenim rastvorom trifluorosirćetne kiseline/vodom (zapr./zapr. = 1/1, 4 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C za 10 minuta. Pošto je dobijena smeša mešana na 0°C 2 časa, ona je koisparavana sa toluenom ispod 25°C da bi se dobio roze sirup. Ostatak je nanet na kolonu silika gela, eluiran sa etil acetatom/dihlorometanom (1/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova:<1>H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.19 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.28 (s, 2H), 6.50 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 4.51 (q, J = 2.7 Hz, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.47-3.57 (m, 2H), 2.49-2.58 (m, 1H), 2.17-2.22 (m, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.09 (s, 6H).

Korak 5: Sinteza (2R,3S)-2-(((terc-butildifenilsilil)oksi)metil)-5-metoksi-2-feniltetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

2-Jodoksibenzojeva kiselina (839 mg, 3.00 mmol) je dodata u rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (443 mg, 0.999 mmol) u acetonitrilu (45 mL). Dobijeni rastvor je mešan na 80°C 2 časa, zatim hlađen do 0°C, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ovo je rezultiralo u jedinjenju iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno bez dodatnog prečišćavanja: MS(ES,m/z): 441.08[M+H]<+>.

Korak 6: Sinteza ((2S,4R)-4-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-((tercbutildimetilsilil)oksi)ciklopentan-1,1-diil)dimetanola

Natrijum hidroksid (4.03 mL, 8.07 mmol) je dodat u mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (445 mg, 1.008 mmol) i formaldehida (1009 mg, 10.08 mmol) u dioksanu (6 mL). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 časa, i zatim razblažena sa 150 mL etil

4

acetata, isprana zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (30 mL) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (30 mL), sušena preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovana pod vakuumom da bi se dobila čvrsta supstanca. Natrijum borohidrid (109 mg, 2.88 mmol) je dodat u rastvor prethodne čvrste supstance u etanolu (15 mL) na 0°C. Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 2 časa, zatim ugašen sirćetnom kiselinom (0.1 mL) i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je nanet na hromatografsku kolonu silika gela pomoću petrol etra\etil acetata (1:2) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. MS(ES,m/z): 473.43[M+H<+>.

Korak 7: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

2-Jodoksibenzojeva kiselina (302 mg, 1.077 mmol) dodata je u rastvor ((3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (170 mg, 0.359 mmol) u acetonitrilu (40 mL). Pošto je dobijeni rastvor mešan na 0°C u trajanju od 12 časova, on je hlađen do 0°C i zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno bez dodatnog prečišćavanja. MS (ES,m/z): 471.43[M+H]<+>.

Korak 8: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

Dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonat (139 mg, 0.721 mmol) dodat je u rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (170 mg, 0.361 mmol), kalijum karbonata (125 mg, 0.902 mmol) u metanolu (8 mL) na 0°C. Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 12 časova, zatim je filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovo jedinjenje je prečišćeno pomoću Prep-TLC pomoću petrol etra\etil acetata (1:2) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD, ppm) δ 8.00 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.44-6.47 (m, 1H), 4.62-4.66 (m, 1H), 3.61-3.71 (m, 2H), 2.90 (s, 1H), 2.25-2.55 (m, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.57 (d, J = 3 Hz, 6H). Korak 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksim etil)tetrahidrofuran-3-ola

((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-bromo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanol (40 mg, 0.086 mmol) i TBAF (0.086 mL, 0.086 mmol) je rastvoren u THF (1 mL). Dobijeni rastvor je mešan 2 časa na 30°C, zatim isparavan i prečišćen prema sledećim uslovima: kolona: X Bridge C18, 19* 150 mm, 5 um; Pokretna faza A: voda/0.05% TFA, Pokretna faza B: ACN; Stopa protoka: 20 mL/min; Gradijent: 30%B do 70% B za 10 min; 254nm. Ovo je rezultovalo u jedinjenju 5 kao čvrsta supstanca:<1>H-NMR (300 MHz, DMSO, ppm) δ 8.11 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 6.52 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.53-3.64 (m, 2H), 3.44 (s, 1H), 2.33-2.52 (m, 2H); MS (ES,m/z): 353.17 [M+H]<+>.

PRIMER 6: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (6)

Korak 1: Sinteza 4,5-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina

U smešu 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina (2.5 g, 16.28 mmol) u suvom DCM (100 mL) dodat je NCS (N-hlorosukcinimid) (4.35 g, 32.6 mmol) na 25°C. Dobijena smeša je mešana 16 časova na 40°C pod atmosferom argona. Kada je 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin potrošen, smeša je filtrirana direktno bez hlađenja. Čvrsta supstanca je sakupljena, isprana sa DCM (20 mL), sušena pod vakuumom da bi se dobio 4,5-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 188.01 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 12.90 (br, 1H), 8.65 (s, 1H), 7.93 (d, J = 2.7Hz, 1H).

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4,5-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U suspenziju NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 0.538 g, 13.46 mmol) u anhidrovanom ACN (100 mL) pod atmosferom argona u posudi od 250 mL sa trigrlića i sa okruglim dnom,

1

dodat je 4,5-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (2.3 g, 12.23 mmol) u porcijama i smeša je mešana na temperaturi sredine u trajanju od 30 minuta. Mutna smeša je postala bistra i zatim je u porcijama dodavan (2R,3S)-5-hloro-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il-4-metilbenzoat (Intermedijer A, 4.76 g, 12.23 mmol) uz mešanje tokom 5 minuta. Dobijena smeša je zagrevana do 50°C i mešana 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Isparljiva materija je uklonjena pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 10%-40% etil acetata u petrol etru da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 540.39 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.64 (s, 1H), 7.91-7.99 (m, 4H), 7.39 (s, 1H), 7.25-7.30 (m, 4H), 6.80 (t, J = 6.9Hz, 1H), 5.75 (dd, J = 3.6Hz, J = 6.0Hz, 1H), 4.60-4.78 (m, 3H), 2.76-2.80 (m, 2H), 2.44 (d, J = 4.8Hz, 6H).

Korak 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U čeličnu bombu od 150 mL, sipan je (2R,3S,5R)-5-(4,5-dihloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (3.6 g, 6.66 mmol). Medijum je hlađen do -40°C. U ovo je dodat izopropanolski amonijak (izopropanol/tečni amonijak= 1/3, zapr./zapr., 120 mL). Medijum je zapečaćen, zagrevan do 90°C i mešan 16 časova. TLC je pokazala da je početni nukleozid sav potrošen i ciljni proizvod je zabeležen kao glavni proizvod. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom 2%-10% metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 284.70 [M+H]<+>.<1>H-NMR (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.09 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 6.87 (br, 2H), 6.51 (dd, J = 6.3Hz, J = 7.8Hz, 1H), 5.25 (d, J = 4.2Hz, 1H), 5.03 (t, J = 5.6Hz, 1H), 4.30-4.34 (m, 1H), 3.81 (dd, J = 4.3Hz, J = 6.8Hz, 1H), 3.46-3.60 (m, 2H), 2.40-2.48 (m, 1H), 2.13-2.20 (m, 1H).

Korak 4. Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (1.7 g, 5.97 mmol) u DMF (10 mL) dodat je 1H-imidazol (1.423 g, 20.90 mmol) i TBDMS-Cl (2.70 g, 17.91 mmol) redom na 0°C pod atmosferom argona. Dobijena smeša je zagrevana do 25°C i mešana 2 časa. Dobijeni rastvor je razblažen etil acetatom (100 mL), ispran vodom (100 mL). Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa etil acetatom (2x100 mL). Organski slojevi su kombinovani, isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(2x100 mL) i fiziološkim rastvorom (2x100 mL) redom, sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni

2

silika gela upotrebom 2%-10% etil acetata u petrol etru da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 513.22 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.10 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 6.85 (br, 2H), 6.51 (t, J = 6.8Hz, 1H), 4.48-4.52 (m, 1H), 3.62-3.80 (m, 3H), 2.55-2.60 (m, 1H), 2.17-2.24 (m, 1H), 0.89 (s, 18H), 0.08 (d, J = 13.6Hz, 12H).

Korak 5. Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (2.42 g, 4.72 mmol) u THF (48 mL) dodat je prethodno ohlađeni rastvor trifluorosirćetne kiseline/vode (1/1, zapr./zapr., 24 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C tokom 10 minuta. Dobijena smeša je mešana na 0°C u trajanju od 4 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Dobijeni rastvor je ko-isparavan sa toluenom (3x100 mL) uz održavanje unutrašnje temperature ispod 25°C. Dobijeni sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela upotrebom 2%-10% metanola u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 398.96 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.28 (s, 1H), 7.86 (br, 2H), 7.78 (s, 1H), 6.52 (t, J = 6.8Hz, 1H), 4.53 (t, J = 2.6Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 4.5Hz, J = 6.9Hz, 1H), 3.48-3.60 (m, 2H), 2.50-2.58 (m, 1H), 2.18-2.25 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).

Korak 6. Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (300 mg, 0.752 mmol) u anhidrovanom ACN (30 mL) dodata je 2-jodoksibenzojeva kiselina (632 mg, 2.256 mmol) pod atmosferom argona. Smeša je zagrevana do 85°C i mešana 20 minuta. Čvrsta supstanca je otfiltrirana. Filtrat je koncentrovan in vacuo da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 396.94 [M+H]<+>.

Korak 7. Sinteza ((3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (434 mg, 0.820 mmol) u 1,4-dioksanu (25 mL) u posudi od 100 mL sa okruglim dnom, dodat je rastvor formaldehida (5 mL), zatim je dodat rastvor natrijum hidroksida (2 N, 5 mL, 10.00 mmol) ukapavanjem na 0°C tokom 5 minuta. Dobijena smeša je zagrevana do 25°C i mešana 3 časa. Pošto je početni nukleozidaldehid sav potrošen, Reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem AcOH. Smeša je razblažena etil acetatom (60 mL) i ispirana redom vodom (2x20 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(2x20 mL) i fiziološkim rastvorom (2x20 mL). Organski sloj je sušen preko Na2SO4i isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u anhidrovanom EtOH (30 mL) i dodat je natrijum tetrahidroborat (62.0 mg, 1.640 mmol) u porcijama na 0°C pod atmosferom argona. Posle mešanja od 16 časova na 25°C, Reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem AcOH. Smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je suspendovan u CHCl3(40 mL) i ispiran redom vodom (2x15 mL) i fiziološkim rastvorom (2x15 mL). Organski sloj je sušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela sa dihlorometanom/metanolom (30/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 428.99 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.10 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 6.86 (br, 2H), 6.54 (t, J = 6.9Hz, 1H), 5.01 (t, J = 5.3Hz, 1H), 4.59 (dd, J = 3.0Hz, J = 5.4Hz, 1H), 4.40 (t, J = 5.6Hz, 1H), 3.42-3.61 (m, 4H), 2.60-2.69 (m, 1H), 2.18-2.25 (m, 1H), 0.89 (s, 9H), 0.09 (s, 6H).

Korak 8. Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

((3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanol (166 mg, 0.387 mmol) je rastvoren u anhidrovanom ACN (20 mL) pod atmosferom argona i zatim je dodat IBX (325 mg, 1.161 mmol). Dobijena smeša je zagrevana do 30°C i mešana 20 časova. Čvrsta supstanca je otfiltrirana. Filtrat je koncentrovan in vacuo da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 426.97 [M+H]<+>.

Korak 9: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (160 mg, 0.375 mmol) u suvom MeOH (8 mL) dodat je K2CO3(129 mg, 0.937 mmol) zatim je dodat dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonat (144 mg, 0.749 mmol) na 0°C ukapavanjem uz mešanje pod atmosferom argona. Dobijena smeša je postepeno zagrevana do 25°C i mešana 16 časova. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom 30%-50% etil acetata u petrol etru da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 422.98 [M+H]<+>.<1>H-NMR (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.10 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 6.90

4

(br, 2H), 6.52 (t, J = 6.6Hz, 1H), 5.42-5.46 (m, 1H), 4.64 (t, J = 5.7Hz, 1H), 3.59-3.67 (m, 1H), 3.50-3.54 (m, 1H), 3.48 (s, 1H), 2.59-2.64 (m, 1H), 2.27-2.31 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.12 (s, 6H).

Korak 10: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (6)

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (64 mg, 0.151 mmol) u THF (3 mL) dodat je TBAF rastvor (1.0 M, 151 µl, 0.151 mmol) ukapavanjem uz mešanje pod atmosferom argona. Dobijeni rastvor je mešan 1 čas na 25°C. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela i eluiran sa DCM/MeOH (20/1 do 5/1) da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je dalje prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima (1#-Pre-UPLC-01 1 (Waters)): kolona, SunFire Prep C18 OBD (Optimum Bed Density) kolona, 5 um, 19*150 mm; pokretna faza, voda (sa 10 mmol amonijum bikarbonatom) i acetonitril (10% acetonitril do 45% za 5 min, do 95% za 1.5 min, do 5% za 1 min); Detektor, uv 254&220 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane da bi se dobilo jedinjenje 6 kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 308.72 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.10 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 6.88 (br, 2H), 6.52 (t, J = 6.4Hz, 1H), 5.39-5.52 (m, 2H), 4.48 (t, J = 6.6Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 12.0 Hz, J = 28.8Hz, 2H), 3.48 (s, 1H), 2.47-2.54 (m, 1H), 2.31-2.37 (m, 1H).

INTERMEDIJER B

Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (Intermedijer B)

Korak 1: Sinteza 4-hloro-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina

U smešu 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina (5 g, 32.6 mmol) u DMF (60 mL) pod argonom dodat je NIS (N-jodosukcinimid) (7.33 g, 32.6 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 15 časova na 25°C pod atmosferom argona u mraku. Reakciona smeša je sipana u hladnu vodu i smeša je filtrirana, čvrsta supstanca je isprana hladnom vodom (3 x 50 mL) i sušena na 25°C da bi se dobio 4-hloro-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 279.9 [M+H]<+1>.<1>H-NMR: (400MHz, CD3SOCD3, ppm): 12.96 (brs, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.95 (d, J = 1.8 Hz, 1H)

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-hloro-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U smešu natrijum hidrida (0.845 g, 21.13 mmol) i 4-hloro-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina (5.37 g, 19.21 mmol) u acetonitrilu (150 mL) pod argonom dodat je (2R,3S,5R)-5-hloro-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (7.47g, 19.21 mmol) na 20°C. Dobijena smeša je mešana 2 časa na 50°C pod atmosferom argona i zatim je rastvarač isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela 100-200, eluiranjem sa EA / PE (1/5) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 613.9 [M+H]<+1>. : (400MHz, CDCl3, ppm): 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.95 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.60 (s, 1H), 7.32-7.25 (m, 4H), 6.82 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 6.4 Hz, 4 Hz, 1H), 4.80-4.76 (m, 1H), 4.71-4.62 (m, 2H), 2.46 (s, 6H), 1.66-1.31 (m, 2H)

Korak 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

(2R,3S,5R)-5-(4-hloro-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoat (12 g, 18.99 mmol) dodat je u mešanu, ohlađenu -50°C smešu amonijaka (120 mL, 240 mmol) u 2-propanolu (30 mL) i smeša je mešana na 90°C u trajanju od 48 časova. Rastvarač je isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela 100-200, eluiranjem sa DCM / MeOH (10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 377.0 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, CD3SOCD3, ppm): 8.10 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 6.79 (brs, 2H), 6.79-6.51 (dd, J = 8.1 Hz, 3 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.05 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.33 (brs, 1H), 3.81 (brs, 1H), 3.60-3.46 (m, 2H), 2.51-2.44 (m, 1H), 2.19-2.10 (m, 1H)

Korak 4: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina U smešu (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (6 g, 15.95 mmol) i imidazola (4.34 g, 63.8 mmol) u DMF (30 mL) pod argonom dodat je TBS-Cl (44.7 mL, 44.7 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 2 časa na 23°C pod atmosferom argona. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ugašena vodom (150 mL) i ekstrahovana etil acetatom (3 x 200 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (5 x 200 mL), sušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen kolonom silika gela, eluiranjem sa EA / PE (3:7) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 605.3 [M+H]<+ 1>.<1>H-NMR: (400MHz, CD3SOCD3, ppm): 8.10 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 6.67 (brs.2H), 6.49 (t, J = 6.8 Hz,1H), 4.50 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 3.88-3.81 (m, 1H), 3.74 (dd, J = 10.8 Hz, 5.6 Hz, 1H), 3.65 (dd, J = 10.8 Hz, 4 Hz, 1H), 2.50-2.49 (m, 1H), 2.25-2.14 (m, 1H), 0.89 (s, 18H), 0.10-0.07 (m, 12H).

Korak 5: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U smešu -7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (6.6 g, 10.92 mmol) u THF (66 mL) dodat je rastvor TFA (16 mL, 208 mmol) u vodi (16 mL) na 0°C.

Dobijena smeša je mešana 4 časa na 0°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Rastvarač je isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u DCM / MeOH (10/1, 150 mL) i pH vrednost rastvora je podešena do 7 sa natrijum hidrogen karbonatom (5.0 g), filtriran i rastvarač je isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela 100-200, eluiranjem sa 40 - 50% EA u PE da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 491.1 [M+H]<+1>.<1>H-NMR: (400MHz, CD3SOCD3, ppm): 8.14 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 6.88 (brs, 2H), 6.47 (dd, J = 8.4 Hz, 6 Hz, 1H), 4.51 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 3.80-3.79 (m, 1H), 3.54-3.50 (m, 2H), 2.57-2.53 (m, 1H), 2.18-2.13 (m, 1H), 0.89 (s, 9H), 0.10 (s, 6H).

Korak 6: Sinteza (2S,3S,5R)-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-{4-[(dimetil-Si{4}-sulfaniliden)amino]-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il}oksolan-2-karbaldehida

U smešu ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tert butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (4.682 g, 9.55 mmol) i DCC (N,N-dicikloheksilkarbodiimida) (6.1 g, 29.6 mmol) u DMSO (40 mL) pod argonom dodati su piridin (0.850 mL, 10.51 mmol) i TFA (0.515 mL, 6.68 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 14 časova na 20°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ugašena vodom (150 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (3 x 100 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (120 mL), sušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 567.0 [M+H2O+H]<+>

Korak 7: Sinteza smeše [(3S,5R)-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-{4-[(dimetil-Si{4}-sulfaniliden)amino]-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-(hidroksimetil)oksolan-2-il] metanola

U smešu (2S,3S,5R)-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-{4-[(dimetil-Si{4}-sulfaniliden)amino]-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il}oksolan-2-karbaldehida (80 mg, 0.146 mmol) i formaldehida (0.5 mL, 0.146 mmol) u 1,4-dioksanu (4 mL) dodat je 2 M natrijum hidroksid (0.5 mL, 1.000 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 4 časa na 20°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ugašena sirćetnom kiselinom (0.2 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (3 x 40 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim NaHCO3(30 mL) zatim fiziološkim rastvorom (40 mL), sušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, ostatak je rastvoren u etanolu (4 mL). U ovu smešu je dodat natrijum tetrahidroborat (20 mg, 0.529 mmol) pod argonom. Ova smeša je mešana u trajanju od 36 časova na 20°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ugašena sirćetnom kiselinom (0.05 mL) i ekstrahovana sa CHCl3(3 x 40 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim NaHCO3 (30 mL) zatim fiziološkim rastvorom (40 mL), sušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, prečišćen pomoću TLC, eluiranjem sa DCM / MeOH (12 : 1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 581.1 [M H]<+1>.<1>H-NMR (300MHz, CD3SOCD3, ppm): 8.09 (s, 0.6H), 7.97 (s, 0.4H), 7.69 (s, 0.6H), 7.46 (s, 0.4H), 6.66 (brs, 0.8H), 6.53-6.42 (m, 1H), 5.10 (t, J = 5.4 Hz, 0.4H), 5.02 (t, J = 5.4 Hz, 0.6H), 4.58 (brs, 1H), 4.42-4.37 (m, 1H), 3.58-3.49 (m, 4H), 2.78 (d, J = 2.7 Hz, 3H), 2.68-2.61 (m, 1H), 2.23-2.16 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.10 (s, 6H).

Korak 8: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U rastvor [(3S,5R)-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-{4-[(dimetil-Si{4}-sulfaniliden)amino]-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-(hidroksimetil)oksolan-2-il]metanola (230 mg, 0.396 mmol) u DCM (2 mL) dodat je TFA (2 mL, 26.0 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 3 časa na 20°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa DCM / MeOH (95 : 5) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 521.2 [M H]<+ 1>.<1>H-NMR: (400MHz, CD3SOCD3, ppm): 8.12 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.10 (brs, 2H), 6.43 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.50 (dd, J = 6 Hz, 3.2 Hz, 1H), 3.50-3.37 (m, 4H), 2.59-2.52 (m, 1H), 2.17-2.11 (m, 1H), 0.80 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).

Korak 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)- 2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran- 2-karbaldehida

U rastvor ((3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (960 mg, 1.845 mmol) u acetonitrilu (25 mL) pod argonom dodat je IBX (1550 mg, 5.53 mmol) na 18°C. Dobijena smeša je mešana 18 časova na 18°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je filtrirana. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobio sirovi proizvod kao čvrsta supstanca. Ovaj sirovi proizvod je korišćen za sledeći korak direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 519.1 [M H]<+>

Korak 10: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (Intermedijer B)

U smešu (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (190 mg, 0.366 mmol) i K2CO3(127 mg, 0.916 mmol) u MeOH (10 mL) pod argonom dodat je dimetil (1-diazo-2oksopropil)fosfonat (141 mg, 0.733 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 16 časova na 18°C pod argonom. Boja smeše se promenila iz žute u plavu. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS / TLC. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa DCM / MeOH (97 : 3) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 515.1 [M H]<+ 1>. . (400MHz, CDCl3, ppm): 8.22 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.25 (dd, J = 8.8 Hz, 5.6 Hz, 1H), 5.84 (brs, 2H), 4.71 (dd, J = 5.6 Hz, 2 Hz,1H), 4.01 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 3.80 (d, J = 16 Hz, 1H), 3.17-3.10 (m, 1H), 2.59 (s, 1H), 2.27-2.21 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (s, 6H)

PRIMER 7: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (7)

U rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-jodo-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (Intermedijer B, 20 mg, 0.039 mmol) u tetrahidrofuranu (3 mL) pod argonom dodat je TBAF (0.05 mL, 0.050 mmol) na 18°C. Dobijena smeša je mešana 0.5 časova na 18°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (7 : 1), da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima: Instrument, Water-1 (26); kolona: Xbridge RP18, 5 um, 19 x 150 mm; pokretna faza: voda (0.05% amonijum bikarbonat ugljen dioksid) i acetonitril (10% acetonitril do 40% za 8 min, zadržavanje 100% tokom 2 min, do 10% za 2 min); Detektor, UV 220 i 254 nm. Sakupljene frakcije su kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje 7 kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 401.0[M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, CD3OD): δ8.10 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 6.68 (s, 2H), 6.49 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 5.52 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.48 (q, J = 6.0 Hz, 1H), 3.64-3.60 (m, 1H), 3.57-3.52 (m, 1H), 3.48 (s, 1H), 2.53-2.47 (m, 1H), 2.35-2.29 (m, 1H).

PRIMER 8: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(2,4-diamino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (8)

Korak 1: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(2-amino-4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

Smeša 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2-amina (2.0 g, 11.86 mmol) i NaH (0.524 g, 13.09 mmol) u acetonitrilu (60 mL) pod argonom mešana je 0.5 časova na sobnoj temperaturi pod argonom. U smešu je zatim dodat Intermedijer A (4.628 g, 11.90 mmol), mešana 10 minuta na sobnoj temperaturi, zatim na 50°C 2 časa. Postupak je praćen pomoću LCMS. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (92 : 8) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 521.1[M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, DMSO-d6): δ 7.93(dd, J = 8.1 Hz, 4H), 7.68-7.21(m, 5H), 6.78(s, 2H), 6.57(q, J = 5.85 Hz, 1H), 6.39(d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.69(d, J= 5.7 Hz, 1H), 4.63-4.43(m, 3H), 3.04-2.94(m, 1H), 2.66(dd, J = 4.95 Hz, 1H), 2.41(d, J = 7.8 Hz, 6H), 1.99(s, 1H).

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(2,4-diamino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

Smeša (2R,3S,5R)-5-(2-amino-4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata (1.0 g, 0.960 mmol) i amonijaka (50

1

mL, 0.960 mmol) u 2-Propanolu (5 mL) je mešana 20 časova na 100°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Reakciona smeša je ostavljena da se hladi do temperature sredine, i koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (82 : 18) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 266.0[M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, DMSO-d6): δ 6.93(d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.76(s, 2H), 6.40(d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.32(q, J = 5.85 Hz, 1H), 5.70(s, 2H), 5.20(d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.29(d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.78-3.74(m, 1H), 3.55-3.41(m, 2H), 3.16(s, 1H), 2.49-2.34(m, 1H), 2.08-2.01(m, 1H). Korak 3: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diamina U smešu (2R,3S,5R)-5-(2,4-diamino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (1.39 g, 5.24 mmol) i TBDMS-Cl (2.369 g, 15.72 mmol) u DMF (6 mL) pod argonom dodat je imidazol (1.784 g, 26.2 mmol). Dobijena smeša je mešana 16 časova na 20°C pod atmosferom argona. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS/TLC. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (92 : 8) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 494.4 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3): δ 7.58 (s, 2H), 7.04 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 6.52 (s, 2H), 6.32 (dd, J = 6.0 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 3.78 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.68 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.17 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 2.49-2.42 (m, 1H), 2.17-2.10 (m, 1H), 0.89 (s, 18H), 0.10-0.09 (m, 12H).

Korak 4: Sinteza N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida

U smešu 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diamina (138 mg, 0.279 mmol) i DMAP (5 mg, 0.041 mmol) u piridinu (5 mL) pod argonom dodat je benzoil hlorid (158 mg, 1.124 mmol). Dobijena smeša je mešana 4 časa na 0°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS/TLC. Reakciona smeša je ugašena vodom (50 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (3 x 30 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (40 mL), sušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa PE/EA (2 : 1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 702.3[M+H]<+>,<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3): δ 11.11 (s, 1H), 10.80 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.2 Hz,

2

2H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.66-7.43 (m, 8H), 6.62-6.54 (m, 2H), 4.56 (s, 1H), 3.84-3.64 (m, 4H), 2.81-2.72 (m, 1H), 2.26-2.22 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 18H), 0.11-0.01 (m, 12H).

Korak 5: Sinteza N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida

U smešu N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida (110 mg, 0.157 mmol) u THF (4 mL) dodat je rastvor TFA (0.5 mL, 6.49 mmol) u vodi (0.5 mL) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 4 časa na 0°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (95 : 5) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 588.6[M+H]<+>,<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3): δ 11.11 (s, 1H),10.81 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.65-7.46 (m, 8H), 6.62-6.56( m,2H), 4.96 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.58 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 3.82-3.77 (m, 2H), 3.56-3.51 (m, 2H), 2.72-2.67 (m, 1H), 2.27-2.21 (m, 1H), 0.88 (s, 9H), 0.09 (s, 6H).

Korak 6: Sinteza N,N'-(7-((2R,4S,5S)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-formiltetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida

U smešu N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida (35 mg, 0.060 mmol) u acetonitrilu (5 mL) pod argonom dodat je IBX (42 mg, 0.150 mmol). Dobijena smeša je mešana 50 minuta na 50°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ostavljena da se hladi do temperature sredine i filtrirana. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod je korišćen za sledeći korak direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 618.3[M+CH3OH]

Korak 7: Sinteza N,N'-(7-((2R,4S)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5,5-bis(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida U rastvor N,N'-(7-((2R,4S,5S)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-formiltetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida (35 mg, 0.060 mmol) u 1,4-dioksanu (5 mL), dodat je formaldehid (1 mL, 0.060 mmol), NaOH (1mL, 2.000 mmol). Smeša je mešana 4 časa na 20°C, hlađena do 0°C, ugašena sa AcOH do pH 6, dodata je voda (40 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (3 x 40 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (30 mL), sušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, ostatak je rastvoren u etanolu (5.00 mL), dodat je NaBH4(5.65 mg, 0.149 mmol) pod argonom. Dobijena smeša je mešana 16 časova na 20°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ostavljena da se hladi do temperature sredine, ugašena sa AcOH do PH 6, dodata je voda (40 mL) i ekstrahovana sa etil acetate (3 x 40 mL). Organski slojevi su koncentrovani i prečišćeni pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (20 : 1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 618.2 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, CDCl3): δ 11.11 (s, 1H), 10.80 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.66-7.43 (m, 8H), 6.62-6.54 (m, 2H), 4.56 (s, 1H), 3.84-3.64 (m, 4H), 2.81-2.72 (m, 1H), 2.26-2.22 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 18H), 0.11- 0.01 (m, 12H).

Korak 8: Sinteza N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-formil-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida

U rastvor N,N'-(7-((2R,4S)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5,5-bis(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida (30 mg, 0.049 mmol) u acetonitrilu (10 mL) pod argonom dodat je IBX (40 mg, 0.143 mmol) na 20°C. Dobijena smeša je mešana 3 časa na 25°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ostavljena da se hladi do temperature sredine i filtrirana. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod kao čvrsta supstanca korišćena za sledeći korak direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 616.2 [M+H]<+>

Korak 9: Sinteza N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-etinil-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida

U smešu N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-formil-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida (70 mg, 0.114 mmol) i K2CO3(39.3 mg, 0.284 mmol) u MeOH (5 mL) pod argonom dodat je rastvor dimetil (2-diazo-3-oksobutanoil)fosfonata (50.0 mg, 0.227 mmol) u MeOH (0.25 mL) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 16 časova na 25°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću TLC, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (20 : 1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 612.4[M+H]<+>

Korak 10: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(2,4-diamino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (8)

U rastvor N,N'-(7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-etinil-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2,4-diil)dibenzamida (40 mg, 0.065 mmol) u MeOH (4 mL) pod argonom dodat je rastvor NaOCH3u MeOH (0.065 mL, 0.065M) na 20°C. Dobijena smeša je mešana 48 časova na 40°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je ostavljena da se hladi do temperature

4

sredine, i koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću TLC, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (20 : 1) da bi se dobio sirovi intermedijer (27 mg) kao čvrsta supstanca koja je razblažena u THF (3 mL) pod argonom. Rastvor TBAF (1M, 0.040 mL, 0.04 mmol) je dodat na 20°C. Dobijena smeša je mešana 0.5 časova na 20°C pod argonom. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS/TLC. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je prečišćen pomoću TLC, eluiranjem sa CH2Cl2/MeOH (5 : 1) da bi se dobio sirovi proizvod (15mg) koji je zatim prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima: Instrument, Waters-2767-Prep; kolona: Xbridge RP18, 5 um, 19 x 150 mm; pokretna faza: voda (0.05% amonijum bikarbonat (ugljen dioksid) i acetonitril (5% acetonitril do 40% tokom 8 min); Detektor, UV 220 i 254 nm. Sakupljene frakcije su spojene i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje 8 kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 618.2 [M+H]<+>,<1>H-NMR (400MHz, CDCl3): δ 6.85 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.55 (s, 2H), 6.36 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 5.56 (s, 2H), 5.48-5.43 (m, 2H), 4.42 (q, J = 5.6 Hz, 1H), 3.61-3.49 (m, 2H), 3.44 (s, 1H), 2.47-2.40 (m, 1H), 2.26-2.21 (m, 1H).

PRIMER 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (9)

Korak 1: Sinteza 4-azido-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2-amina

U mešani rastvor 4-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2-amina (3.5 g, 20.76 mmol) u anhidrovanom DMSO (35 mL) pod atmosferom argona, dodat je rastvor natrijum azida (2.025 g, 31.1 mmol) u vodi (3.50 mL). Smeša je zagrevana do 100°C i mešana preko noći. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Dobijena smeša je hlađena do temperature sredine. Dodato je 250 g izmrvljenog leda i smeša je mešana na 0°C u trajanju od 30 minuta. Formiran je talog. Talog je sakupljen filtracijom, ispran hladnom vodom i sušen preko P2O5pod vakuumom preko noći da bi se dobio 4-azido-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2-amin kao čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 11.91 (brs, 1H), 7.96 (brs, 2H), 7.13 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 2.0 Hz, J = 3.2 Hz, 1H). LC-MS: (ES, m/z): 176.00 [M H]<+>.

Korak 2: Sinteza 4-azido-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidina

Vodonik fluorid-piridin (70% HF u 30% Py) (12 mL, 133 mmol) je sipan u teflonsku bocu pod atmosferom argona. U ovo je dodat 4-azido-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-2-amin (3.1 g, 17.70 mmol). Smeša je mešana na temperaturi sredine sve dok nije postala bistar rastvor, zatim je hlađena do -60°C, zatim je dodat terc-butil nitrit (2.5 mL, 21.02 mmol) ukapavanjem tokom 10 minuta. Dobijena smeša je mešana između -60°C do -40°C u trajanju od 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Smeša je sipana u hladan vodeni rastvor NaHCO3 (150 mL, zasićen). Sirovi proizvod je ekstrahovan sa etil acetatom (100 mL × 3), ispran fiziološkim rastvorom (100 mL × 2), sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio ostatak. Ostatak je zatim prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom etil acetata / petrol etra (1 / 4) da bi se dobio 4-azido-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d] kao čvrsta supstanca.<1>H-NMR: (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 12.43 (brs, 1H), 7.48 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 6.50 (d, J= 3.6 Hz, 1H). F-NMR: (282 MHz, d6-DMSO, ppm): δ -54.57 (s, IF). LC-MS: (ES, m/z): 179.20 [M H]<+>.

Korak 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-azido-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U mešanu suspenziju natrijum hidrida 60% disperzija u mineralnom ulju (0.272 g, 6.79 mmol) u anhidrovanom DMF (20 mL) pod atmosferom argona u posudi od 50 mL sa dva grlića i okruglim dnom, dodat je 4-azido-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin (1.1 g, 6.18 mmol) u porcijama na 0°C i smeša je mešana na ovoj temperaturi 5 minuta. Intermedijer A (2.4 g, 6.17 mmol) je dodat uz mešanje. Reakciona smeša je zagrevana do 25°C i mešana 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Smeša je razblažena etil acetatom (100 mL), isprana vodom (70 mL). Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa etil acetatom (60 mL × 2). Kombinovani organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom (100 mL × 3), sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom etil acetata / petrol etra (1 / 10) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32-7.23 (m, 4H), 6.74 (dd, J = 6.4 Hz, J = 8.0 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.75-5.74 (m, 1H), 4.75-4.54 (m, 3H), 2.85-2.74 (m, 2H), 2.47-2.43 (m, 6H). F-NMR: (376 MHz, CDCl3, ppm): δ -52.26 (s, IF, β izomer), -52.48 (s, IF, α izomer). LC-MS: (ES, m/z): 531.42 [M H]<+>.

Korak 4: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-azido-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata (2.0 g, 3.77 mmol) u smeši MeOH (10 mL) i DCM (15 mL) pod atmosferom argona, dodat je propan-1,3-ditiol (0.816 g, 7.54 mmol), zatim je dodat trietilamin (0.763 g, 7.54 mmol) ukapavanjem uz mešanje tokom 10 minuta na 25°C. Smeša je mešana na 25°C u trajanju od 30 minuta. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je zatim prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gelu upotrebom etil acetata / petrol etra (42% EA u PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao prah.<1>H-NMR: (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.00 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.33-7.26 (m, 4H), 7.12 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 6.2 Hz, J = 8.2 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.75-5.72 (m, 1H), 5.36 (brs, 2H), 4.73-4.57 (m, 3H), 2.79-2.74 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.44 (s, 3H). F-NMR: (376 MHz, CDCl3, ppm): δ -52.97 (s, IF, β izomer), -53.10 (s, IF, α izomer). LC-MS: (ES, m/z): 505.63 [M H]<+>.

Korak 5: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(((4-metilbenzoil)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il 4-metilbenzoata (1.75 g, 3.47 mmol) u anhidrovanom MeOH (10 mL) pod atmosferom argona, injektiran je natrijum metoksid-MeOH rastvor (1.0 M, 3.47 mL, 3.47 mmol) uz mešanje na 0°C tokom 5 minuta. Dobijena smeša je ostavljena da se meša na 0°C do 10°C u trajanju od 4 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Dobijena smeša je neutralizovana dodavanjem AcOH, zatim je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je zatim prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom dihlorometana / metanola (6% MeOH u DCM) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.55 (brs, 2H), 7.31 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.34 (dd, J = 6.4 Hz, J = 8.0 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.92 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.32 (d, J= 2.4 Hz, 1H), 3.82-3.79 (m, 1H), 3.58-3.46 (m, 2H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.19-2.13 (m, 1H). F-NMR: (376 MHz, d6-DMSO, ppm): δ -53.77 (s, IF, β izomer), -53.98 (s, IF, α izomer). LC-MS: (ES, m/z): 269.20 [M H]<+>.

Korak 6: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina

(2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol (850 mg, 3.17 mmol) i imidazol (863 mg, 12.68 mmol) su sipani u posudu od 50 mL sa okruglim dnom pod atmosferom argona. U posudu je injektiran anhidrovani DMF (10 mL), zatim je dodat TBS-Cl (1433 mg, 9.51 mmol) u porcijama. Smeša je mešana na 25°C u trajanju od 2 časa. Pošto je reakcija završena, smeša je razblažena etil acetatom (60 mL), isprana vodom (30 mL × 2), vodenim rastvorom NaHCO3 (zasićen, 30 mL × 2) i fiziološkim rastvorom (30 mL × 2) respektivno. Organski sloj je sakupljen i sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod. Ostatak je zatim prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom etil acetata / petrol etra (20% EA u PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (300MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.55 (brs, 2H), 7.26 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 6.31 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.55-4.50 (m, 1H), 3.80-3.61 (m, 4H), 2.64-2.55 (m, 1H), 2.23-2.17 (m, 1H), 0.90-0.87 (m, 18H), 0.11-0.06 (m, 12H). F-NMR: (282 MHz, d6-DMSO, ppm): δ -53.64 (s, IF, β izomer), -53.78 (s, IF, α izomer). LC-MS: (ES, m/z): 497.58 [M H]<+>.

Korak 7: ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (1.4 g, 2.82 mmol) u THF (24 mL) dodat je vodeni rastvor TFA (TFA / H2O = 1 / 1, zapr. / zapr., 12 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C tokom 10 minuta. Dobijena smeša je ostavljena da se meša na 0°C. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Posle mešanja od 5 časova, početni di-TBS zaštićeni nukleozid je sav potrošen, zatim je reakciona smeša ko-isparavana sa toluenom (50 mL × 3). Ostatak je ponovo rastvoren u smeši MeOH / DCM (15% MeOH u DCM, 50 mL). Čvrsti NaHCO3 (2 g) je dodat na 0°C, zatim je dodata voda (1 mL). Dobijena smeša je mešana 30 minuta. Pošto je pH vrednost podešena do 7, čvrste supstance su otfiltrirane, filtrat je sakupljen i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom etil acetata / petrol etra (40% EA u PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.57 (brs, 2H), 7.32 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.32 (dd, J = 6.0 Hz, J = 8.0 Hz, 1H), 4.99-4.96 (m, 1H), 4.52 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 3.79 (q, J = 2.4 Hz, 1H), 3.54-3.49 (m, 2H), 2.57-2.53 (m, 1H), 2.19-2.13 (m, 1H), 0.91-0.88 (m, 9H), 0.13-0.11 (m, 6H). F-NMR: (376 MHz, d6-DMSO, ppm): δ -53.71 (s, IF, β izomer), -53.89 (s, IF, α izomer). LC-MS: (ES, m/z): 383.36 [M H]<+>.

Korak 8: Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

TFA (0.051 mL, 0.659 mmol) je injektiran u mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (360 mg, 0.941 mmol), DCC (N,N-dicikloheksilkarbodiimida) (602 mg, 2.92 mmol) i piridina (0.084 mL, 1.035 mmol) u anhidrovanom DMSO (2 mL) pod atmosferom argona na sobnoj temperaturi za 2 min, i smeša je mešana preko noći. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Smeša je filtrirana da bi se uklonila dicikloheksilurea i filtrat je podeljen sa etil acetatom (30 mL) i H2O (30 mL). Organski sloj je sakupljen i ispran fiziološkim rastvorom (20 mL × 2), sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je isparavan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 381.20 [M H]<+>, 413.20 [M MeOH H]<+>.

Korak 9: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (400 mg, 1.051 mmol) u 1,4-dioksanu (8 mL) u posudi od 50 mL sa okruglim dnom, dodat je rastvor formaldehida (1.2 mL, 16.01 mmol), zatim je dodat rastvor natrijum hidroksida (1.2 mL, 2.400 mmol) ukapavanjem za 2 minuta. Dobijena smeša je mešana na 25°C u trajanju od 7 časova. Pošto je početni nukleozid sav potrošen, the reakcionas meša je neutralizovana dodavanjem AcOH. Dobijena smeša je razblažena sa AcOEt (100 mL) i ispirana redom vodom (2 × 40 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 (2 × 40 mL) i fiziološkim rastvorom (50 mL). Organski sloj je sušen preko Na2SO4i isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren in EtOH (3 mL) i dodat je natrijum borohidrid (199 mg, 5.26 mmol) u porcijama na 0°C. Posle mešanja od 5 časova na 25°C, reakciona smeša je neutralizovana dodavanjem AcOH. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak je podeljen između CHCl3(100 mL) i vode (50 mL). Organski sloj je ispiran redom vodom i fiziološkim rastvorom, sušen preko Na2SO4, i isparavan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom dihlorometana / metanola (30 / 1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.55 (brs, 2H), 7.34 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.35 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.90 (t, J = 3.6 Hz, 1H), 4.60 (q, J = 2.8 Hz, 1H), 4.41 (t, J = 3.6 Hz, 1H), 3.60-3.43 (m, 4H), 2.69-2.62 (m, 1H), 2.23-2.17 (m, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.09 (s, 6H). F-NMR: (376 MHz, d6-DMSO, ppm): δ -53.80 (s, IF, β izomer). LC-MS: (ES, m/z): 413.32 [M H]<+>, 435.34 [M Na]<+>.

Korak 10: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-( (tercbutildim etilsilil)oksi)- 2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran- 2-karbaldehida

U mešani rastvor ((3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (180 mg, 0.436 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (15 mL) i suvom DMSO (1.5 mL) u posudi od 50 mL sa okruglim dnom pod atmosferom argona, dodat je IBX (367 mg, 1.309 mmol). Dobijena smeša je mešana na 20°C u trajanju od 8 časova. Reakciona smeša je filtrirana, isprana dihlorometanom. Filtrat je sakupljen i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u etil acetatu (40 mL), ispran vodom (3 × 15 mL) i fiziološkim rastvorom (2 × 20 mL) redom, sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno u sledećem koraku reakcije direktno bez prečišćavanja.<1>H-NMR: (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 9.65 (s, 1H), 7.60 (d, J= 3.6 Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 5.6 Hz, J = 9.6 Hz, 1H), 6.39 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.56-5.43 (m, 3H), 4.96 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.08 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.81 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 3.27-3.19 (m, 1H), 2.25 (dd, J = 5.4 Hz, J = 13.0 Hz, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (d, J = 5.2 Hz, 6H).

F-NMR: (376 MHz, CDCl3, ppm): δ -53.14 (s, IF). LC-MS: (ES, m/z): 411.21 [M H]<+>.

Korak 11: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (190 mg, 0.463 mmol) u anhidrovanom MeOH (8 mL) pod atmosferom argona, dodat je kalijum karbonat (160 mg, 1.157 mmol). Smeša je hlađena do 0°C, zatim je dodat dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonat (178 mg, 0.926 mmol) ukapavanjem tokom 1 minute. Dobijena smeša je zagrevana do 25°C i mešana preko noći. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, i zatim prečišćena pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom metanola / dihlorometana (4.8% MeOH u DCM) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.<1>H-NMR: (400 MHz, CDCl3, ppm): 86.99 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.28 (dd, J = 6.0 Hz, J = 8.8 Hz, 1H), 5.45-5.33 (m, 3H), 4.76 (q, J = 2.8 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 2.0 Hz, J = 12.4 Hz, 1H), 8.16-3.79 (m, 1H), 3.12-3.06 (m, 1H), 2.70 (s, 1H), 2.33-2.27 (m, 1H), 0.94 (s, 9H), 0.16 (d, J = 8.0 Hz, 6H). F-NMR: (376 MHz, CDCl3, ppm): δ -53.26 (s, IF). LC-MS: (ES, m/z): 407.30 [M H]<+>

1

Korak 12: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (9)

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (15 mg, 0.037 mmol) u anhidrovanom THF (1 mL) pod atmosferom argona dodat je TBAF THF rastvor (0.037 mL, 0.037 mmol) ukapavanjem uz mešanje tokom 1 minute na temperaturi sredine. Medijum je mešan na temperaturi sredine 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Pošto je početni nukleozid sav potrošen, smeša je koncentrovana pod vakuumom, Ostatak je zatim prečišćen pomoću preparativne-TLC (MeOH / DCM = 1 / 15) da bi se dobio sirovi proizvod (10 mg). Sirovi proizvod je dodatno prečišćen pomoću preparativne-HPLC sa sledećim uslovima: (1#-Pre-HPLC-011(Waters)): kolona, X-bridge C18 kolona, 19*150mm, 5um; pokretna faza, voda sa 10 mmol amonijum bikarbonatom i acetonitrilom (5% acetonitril do 30% tokom 5 min, do 95% za 2 min); Detektor, uv 254&220nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane da bi se dobilo jedinjenje 9 kao čvrsta supstanca.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.57 (brs, 2H), 7.28 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.35 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.27 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 6.4 Hz, J = 12.0 Hz, 1H), 3.61 (dd, J = 5.6 Hz, J = 11.6 Hz, 1H), 3.53 (dd, J = 6.4 Hz, J = 12.0 Hz, 1H), 3.48 (s, 1H), 2.50-2.46 (m, 1H), 2.37-2.31 (m, 1H). F-NMR: (376MHz, d6-DMSO, ppm): δ -53.67 (s, IF). LC-MS: (ES, m/z): 293.15 [M H]<+>, 315.15 [M Na]<+>.

REFERENTNI PRIMER 10: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-hidroksi-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila (10)

Korak 1: Sinteza 5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid oksima

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (Primer 1, Intermedijer C, 50 mg, 0.127 mmol, 1.0 ekv.) u suvom piridinu (2.5 mL) dodat je hidroksilamin hidrohlorid (26.6 mg, 0.382 mmol, 3.0 ekv.) pod atmosferom argona. Dobijena smeša je mešana na 30°C tokom 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom, ostatak je zatim rastvoren u etil acetatu (50 mL), ispran vodom

2

(2 x 30 mL) i fiziološkim rastvorom (35 mL) redom, sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i filtrat je koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne-TLC (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 408.20 [M+H]<+>.

Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila

U mešanu smešu 5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid oksima (40 mg, 0.098 mmol) i trietilamina (105 mg, 1.038 mmol) u suvom DCM (5 mL) dodat je anhidrid 2,2,2-trifluorosirćetne kiseline (110 mg, 0.524 mmol) ukapavanjem uz mešanje na 20°C pod atmosferom argona. Dobijena smeša je mešana na 20°C 20 časova. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (30 mL), ispran zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 (25 mL) i fiziološkim rastvorom (25 mL) redom, sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne-TLC (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: (ES, m/z): 390.11 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ 8.10 (s, 1H), 7.30 (d, J = 3.6Hz, 1H), 6.68 (t, J = 6.9Hz, 1H), 6.64 (d, J = 3.6Hz, 1H), 4.90 (t, J = 6.3Hz, 1H), 3.85(dd, J = 12.0Hz, J = 21.6Hz, 2H), 2.85-2.94 (m, 1H), 2.42-2.49 (m, 1H), 1.02 (s, 9H), 0.26 (d, J = 9.0Hz, 6H).

Korak 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-dlpirimidin-7-il)-3-hidroksi-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila (10)

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila (35 mg, 0.090 mmol) u suvom THF (5 mL) dodat je TBAF THF rastvor (1.0 M, 0.108 mL, 0.108 mmol) ukapavanjem uz mešanje pod atmosferom argona na 15°C. Dobijena smeša je mešana na 15°C u trajanju od 0.5 časova. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću LCMS i TLC. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću preparativne-TLC (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobio sirup. Sirovi proizvod je dalje prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima: (1#-Pre-UPLC-011(Waters)): kolona, SunFire C18 reverzna kolona, 19*150mm, 5um; pokretna faza, voda sa 10 mmol amonijum bikarbonatom i acetonitrilom (5% acetonitril do 20% tokom 7.5 min, do 95% tokom 2 min, do 5% tokom 1 min); Detektor, uv 254&220nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 10 kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 276.10 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.07 (s, 1H), 7.34 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.33 (br, 2H), 7.08 (s, 1H), 6.64 (t, J = 7.0Hz, 1H), 6.61 (d, J = 3.6Hz, 1H), 6.27 (d, J = 4.8Hz, 1H), 5.82 (t, J = 6.0Hz, 1H), 4.61 (dd, J = 4.8Hz, J = 10.0Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 5.6Hz, J = 12.0Hz, 1H), 3.62 (dd, J = 6.0Hz, J = 11.6Hz, 1H), 2.74-2.81 (m, 1H), 2.33-2.38 (m, 1H).

REFERENTNI PRIMER 11: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4triazin-7-il)-2-ethnl-2-hidroksimetil)tetrahdrofuran-3-ola (11)

Korak 1: Sinteza 4-(metiltio)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazina

Sinteza 4-hloropirolo[2,1-f][1,2,4]triazina je opisana u WO2011/150356A1, 2011. U posudu od 500 mL sa okruglim dnom, sipan je rastvor 4-hloropirolo[2,1-f][1,2,4]triazina (17 g, 110.70 mmol) i (metilsulfanil)natrijuma (15 g, 214.01 mmol u tetrahidrofuranu (300 mL). Dobijeni rastvor je mešan 1 preko noći na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance su otfiltrirane. Dobijena

4

smeša je koncentrovana in vacuo. Ostatak je nanet na kolonu silika gela sa etil acetatom/petrol etrom (1:10). Ovo je rezultiralo u jedinjenju iz naslova. LC-MS (ES, m/z): 166 [M+H]<+>Korak 2: (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)-2-(4-(metiltio)pirolo[2,1-f]

[1,2,4]triazin-7-il)tetrahidrofuran-2-ol

U rastvor 4-(metiltio)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazina (1.650 g, 9.99 mmol) u THF (30 mL) dodat je litijum diizopropilamid (7.5 mL, 15.00 mmol) na -78°C pod atmosferom argona i dobijena smeša je mešana 30 minuta na -78°C. Nakon toga, (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)dihidrofuran-2(3H)-on (4.18 g, 9.99 mmol) u THF (10 mL) dodat je na -78°C pod atmosferom argona i mešan 120 minuta na -78 do -50°C. Reakcija je ugašena dodatnim amonijum hloridom (vodeni rastvor, 10 mL), i ekstrahovana sa etil acetatom (300 mL). Organski sloj je ispran sa (3 x 50 mL) fiziološkim rastvorom, sušen preko natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela, eluiran sa etil acetatom/petrol etrom (1:5) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 584.2 [M+H]<+>

Korak 3: Sinteza 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-4-(metiltio)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazina

U rastvor (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)-2-(4-(metiltio)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)tetrahidrofuran-2-ola (3.00 g, 5.14 mmol) u DCM (30 mL) dodat je trietilsilan (2.390 g, 20.56 mmol) i trifluoroboran (0.697 g, 10.28 mmol) na 0°C pod atmosferom argona. Dobijeni rastvor je mešan 30 minuta na 0°C i zatim ugašen dodatnim natrijum bikarbonatom (vodeni rastvor, 20 mL), ekstrahovan sa DCM (200 mL). Organski sloj je ispran sa 3 x 50 mL fiziološkim rastvorom, sušen preko natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela, eluiran etil acetatom/petrol etrom (1:10) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 568.4 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, CDCl3, ppm): δ 8.21 (s, 1H), 7.23-7.36 (m, 15H), 6.81 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 5.69 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 4.37-4.62 (m, 7H), 4.22-4.26 (m, 1H), 4.10-4.13 (m, 1H), 3.66-3.67 (m, 1H), 3.62-3.63 (m, 1H), 2.75 (s, 3H).

Korak 4: Sinteza 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirolo[2,1-f] [1,2,4]triazin-4-amina

Rastvor 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-4-(metiltio)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazina (4.6 g, 8.10 mmol) u 2-propanolu (5 mL) je ispran amonijakom (1350 mg, 79 mmol) na -400°C u trajanju od 60 minuta u hermetički zatvorenoj epruveti. Pošto je dobijena smeša mešana 16 časova na 80°C, ona je isparavana da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 537.3 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, DMSO, ppm): δ 7.80(s, 1H), 7.69(s, 2H), 7.24-7.36(m, 15H), 6.88(d, J = 4.5 Hz, 1H), 6.80(d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.44(d, J = 5.4 Hz, 1H), 4.49-4.62(m, 6H), 4.31(t, J = 5.1 Hz,1H), 4.15-4.18(m, 1H), 4.09-4.12(m, 1H), 3.29-3.67(m, 2H).

Korak 5: Sinteza (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diola

U rastvor 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina (100 mg, 0.186 mmol) u sirćetnoj kiselini (2 mL) dodat je Pd(OH)2(10 mol %) /C (100 mg, 0.130 mmol) pod vodonikom na 25°C u trajanju od 4 časa. Smeša je filtrirana kroz čep od celita i filtrat je isparavan. Ostatak je nanet na kolonu silika gela, eluiran sa MeOH/DCM (1:8) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 267.2 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (300MHz, DMSO, ppm): δ 7.79(s, 1H), 7.77(s, 2H), 6.84(d, J = 4.2 Hz, 1H), 6.68(d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.10(d, J = 6.6 Hz, 1H), 4.95(d, J = 6.6 Hz, 1H), 4.84(d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.76(t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.20-4.25(m, 1H), 3.94(d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.78(d, J = 4.2 Hz, 1H), 3.41-3.64(m, 2H).

Korak 6: Sinteza (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ola

(2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diol (790 mg, 2.97 mmol) i 1H-imidazol (606 mg, 8.90 mmol) su rastvoreni u DMF (20 mL) pod argonom. Ukapavanjem je dodat 1,3-dihloro-1,1,3,3-tetraizopropildisiloksan (936 mg, 2.97 mmol) na 0°C. Pošto je dobijena smeša mešana 5 časova na 25°C pod argonom, dodata je voda (10 mL) i dobijena smeša je razblažena etil acetatom (400 mL). Organska faza je isprana sa (3 x 60 mL) vode i 60 mL fiziološkog rastvora, sušena preko Na2SO4i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je nanet na silika gel, eluiran sa MeOH/DCM (1:20) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 509.3 [M+H]<+>.<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ 7.81(s, 1H), 7.70(s, 2H), 6.82(d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.61(d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.20(d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.16(d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.31-4.35(m, 1H), 4.12-4.15(m, 1H), 4.00-4.03(m, 1H), 3.88-3.91(m, 1H), 0.96-1.05(m, 28H)

Korak 7: Sinteza O-((6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-il) O-fenil karbonotioata (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ol (210 mg, 0.413 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amin (202 mg, 1.651 mmol) su rastvoreni u DCM (10 mL) pod argonom. O-fenil karbonohloridotioat (143 mg, 0.826 mmol) je dodat ukapavanjem na 0°C. Pošto je reakcija mešana na 25°C pod argonom 2 časa, dobijena smeša je razblažena sa DCM (100 mL), i zatim isprana sa 3 x 30 mL vode i 30 mL fiziološkog rastvora. Organski sloj je sušen preko Na2SO4i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela i eluiran sa etil acetatom/petrol etrom (3:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 645.2 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ 7.83(s, 2H), 7.79(s, 1H), 7.48(t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.33(t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.14(d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.80(d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.71(d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.16(dd, J = 2.4 Hz, J = 5.6 Hz, 1H), 5.46(d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.90(dd, J = 5.6 Hz, J = 8.8Hz, 1H), 3.95-4.06(m, 2H), 3.85-3.87(m, 1H), 0.96-1.06(m, 28H).

Korak 8: Sinteza 7-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina

O-((6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-il) O-fenil karbonotioat (1.45 g, 2.248 mmol), AIBN (0.738 g, 4.50 mmol) i tributilstanan (3.93 g, 13.49 mmol) su rastvoreni u toluenu (20 mL) pod argonom. Pošto je reakcija mešana na 80°C pod argonom 3 časa, dobijeni rastvor je koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela i eluiran sa etil acetatom/petrol etrom (2.5:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 493.4 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ 7.81 (s, 1H), 7.79 (s, 2H), 6.81 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.46 (t, 1H), 4.58-4.62 (m, 1H), 3.90-4.00 (m, 1H), 3.75-3.80 (m, 2H), 2.20-2.30 (m, 1H), 2.30-2.40 (m, 1H), 0.98-1.06 (m, 28H).

Korak 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

7-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amin (1.0 g, 2.029 mmol) je rastvoren u THF (10 mL) pod argonom. TBAF (0.531 g, 2.029 mmol) je dodat u reakcioni rastvor ukapavanjem na 20°C. Pošto je dobijeni rastvor mešan na 20°C pod argonom 2 časa, on je koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela i eluiran sa DCM/MeOH (20:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 251.2 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ 7.83(s, 1H), 7.81(s, 2H), 6.84(d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.82(d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.47-5.51(m, 1H), 5.06(d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.73(t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.22(m, 1H), 3.74-3.78(m, 1H), 3.32-3.45(m, 2H), 2.16-2.20(m, 1H), 2.09-2.14(m, 1H).

Korak 10: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol (300 mg, 1.199 mmol), 1H-imidazol (490 mg, 7.19 mmol) i terc-butilhlorodimetilsilan (723 mg, 4.80 mmol) rastvoreni su u DMF (4.0 mL) pod argonom. Pošto je reakciona smeša mešana na 20°C pod argonom 5 časova, dobijena smeša je razblažena etil acetatom (100 mL), isprana sa (3 X 30 mL) vode i 30 mL fiziološkog rastvora. Organski sloj je sušen sa Na2SO4i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela i eluiran sa etil acetatom/petrol etrom (2:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 479.3 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (300MHz, DMSO, ppm): δ 7.82 (s, 1H), 7.75 (s, 2H), 6.82 (d, J= 4.5 Hz, 1H), 6.61 (d, J= 4.5 Hz, 1H), 5.48-5.53 (m, 1H), 4.42 (m, 1H), 3.78 (m, 1H), 3.48-3.62 (m, 2H), 2.22-2.27 (m, 1H), 2.04-2.10 (m, 1H), 0.78-0.89 (m, 18H), 0.00-0.10 (m, 12H)

Korak 11: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amin (500 mg, 1.044 mmol) je rastvoren u THF (8.0 mL), H2O (2.0 mL) i TFA (2.0 mL) i mešan na 0°C u trajanju od 4 časa. Reakciona smeša je podešena do pH 7 sa natrijum bikarbonatom i zatim je ekstrahovana sa etil acetatom (30 mL x3), isprana sa (3 x20 mL) vode i 20 mL fiziološkog rastvora. Organski sloj je sušen preko Na2SO4i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gela i eluiran sa etil acetatom/petrol etrom (2:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 365.3 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ 7.82(s, 1H), 7.68(s, 2H), 6.82(d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.65(d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.46-5.50(m, 1H), 4.80(t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.42(d, J = 4.2 Hz, 1H), 3.74-3.78(m, 1H), 3.32-3.44(m, 2H), 2.24-2.28(m, 1H), 2.02-2.06(m, 1H), 0.85-0.90(m, 9H), 0.00-0.10(m, 6H).

Korak 12: Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanol (270 mg, 0.741 mmol) i IBX (270 mg, 0.963 mmol) je rastvoren u acetonitrilu (20.0 mL) pod argonom. Pošto je reakciona smeša mešana na 80°C pod argonom 1 čas, čvrsta supstanca je otfiltrirana i filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova koje je korišćeno za sledeći korak direktno. LC-MS: 363.2 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ 9.59 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.73(s, 2H), 6.86 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.67-5.71 (m, 1H), 4.71 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.25 (s, 1H), 2.25-2.32 (m, 1H), 2.12-2.17 (m, 2H), 0.84-0.91 (m, 9H), 0.00-0.13 (m, 6H).

Korak 13: Sinteza ((3S,SR)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

(2S,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (200 mg, 0.552 mmol) je rastvoren u 1,4-dioksanu (10 mL) na 20°C. Zatim su dodati formaldehid (2.0 mL, 0.552 mmol) i natrijum hidroksid (2.0 mL, 4.00 mmol). Pošto je dobijena smeša mešana na 20°C u trajanju od 4 časa, ona je podešena do pH 7 sa sirćetnom kiselinom. Smeša je razblažena etil acetatom (150 mL), zatim isprana sa 3 x 30 mL vode i 30 mL fiziološkog rastvora. Organski sloj je sušen preko Na2SO4, i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je rastvoren u etanolu (10 mL) na 0°C, i zatim je dodat NaBH4(41.7 mg, 1.103 mmol) na 0°C. Pošto je dobijena smeša je mešana na 20°C 16 časova, on je podešen do pH=7 sa sirćetnom kiselinom i smeša je ekstrahovana sa etil acetatom (150 mL), zatim isprana sa (3 x 30 mL) vode i 30 mL fiziološkog rastvora. Organski sloj je sušen preko Na2SO4i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je nanet na kolonu silika gelu i eluiran sa DCM/MeOH (10:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 395.2 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ7.82 (s, 1H), 7.70 (s, 2H), 6.82 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.50-5.60 (m, 1H), 4.68 (t, 1H), 4.52 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.22 (t, 1H), 3.53-3.60 (m, 2H), 2.35-2.45 (m, 1H),2.00-2.10 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.08-0.09 (m, 6H).

Korak 14: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

((3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanol (90 mg, 0.228 mmol) i IBX (256 mg, 0.912 mmol) su rastvoreni u acetonitrilu (15.0 mL) pod argonom. Pošto je reakciona smeša mešana na 30°C pod argonom u trajanju od 48 časova, čvrsta supstanca je otfiltrirana. Filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, koje je korišćeno za sledeći korak direktno.

Korak 15: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4|triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

(2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid (80 mg, 0.204 mmol) i K2CO3(85 mg, 0.611 mmol) rastvoreni su u metanolu (10 mL) pod argonom. Dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonat (78 mg, 0.408 mmol) dodat je u reakcionu smešu ukapavanjem na 0°C. Pošto je reakciona smeša mešana na 25°C pod argonom 16 časova, ona je filtrirana i koncentrovana pod vakuumom.

Ostatak je nanet na kolonu silika gela i eluiran sa DCM/MeOH (10:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 389.3 [M+H]<+>

Korak 16: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (11)

((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanol (50 mg, 0.129 mmol) i TBAF (33.6 mg, 0.129 mmol) su rastvoreni u THF (5.0 mL) pod argonom. Pošto je dobijeni rastvor mešan na 25°C pod argonom 2 časa, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima (1#-Pre-HPLC-011(Waters)): kolona, Xbridge Prep C18 kolona, 19*150mm; pokretna faza, voda (10 mmoL/L NH4HCO3) i acetonitril (5.0% acetonitril do 25.0% tokom 8 min, do 95.0% tokom 1.5 min, do 5.0% tokom 1.5 min); Detektor, UV254 & 220 nm) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 11 kao čvrsta supstanca. LC-MS: 275.1 [M+H]<+>,<1>H-NMR: (400MHz, DMSO, ppm): δ7.82 (s, 1H), 7.69 (s, 2H), 6.82 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.60 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 4.2 Hz,1H), 5.06 (d, J = 6.8 Hz, J = 6.0 Hz, 1H), 4.30-4.34 (m, 1H), 3.45-3.56 (m, 2H), 3.38 (s, 1H), 2.30-2.37 (m, 1H), 2.17-2.13 (m, 1H).

REFERENTNI PRIMER 12: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-hidroksi-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila (12)

Korak 1: Sinteza 5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid oksima

U smešu Intermedijera D (videti Primer 11) (70 mg, 0.178 mmol) u piridinu (5 mL) pod argonom dodat je hidroksilamin hidrohlorid (37.17 mg, 0.543 mmol) na 25°C. Pošto je dobijena smeša mešana 2 časa na 25°C, reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen etil acetatom (100 mL), ispran vodom (3 x 20 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL), sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova koje je korišćeno bez prečišćavanja. LC-MS: 408.2 [M+H]<+>Korak 2: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila

U smešu 5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid oksima (70 mg, 0.172 mmol) u DCM (15 mL) pod argonom dodat je Et3N (69.5 mg, 0.687 mmol) i anhidrid 2,2,2-trifluorosirćetne kiseline (72.2 mg, 0.344 mmol) na 25°C. Dobijena smeša je mešana 16 časova na 25°C i zatim je reakciona smeša razblažena sa DCM (100 mL), isprana zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (3 x 20 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL), sušena preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću kolone silika gela, eluiranjem sa DCM/MeOH (15 : 1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova. LC-MS: 309.2 [M+H]<+>.

Korak 3: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4|triazin-7-il)-3-hidroksi-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila (12)

U smešu (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbonitrila (50 mg, 0.128 mmol) u THF(10 mL) pod argonom dodat je TBAF (33.6 mg, 0.128 mmol) na 25°C. Dobijena smeša je mešana 2 časa na 25°C i i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima: Instrument, (1#-Pre-HPLC-011(voda)); kolona: Xbridge C18, 5 um, 19 x 150 mm; pokretna faza: voda (0.05% NH4CO3) i ACN (5.0% ACN do 40% za 10 min, zadržavanje 95% tokom 2 minuta, do 5% tokom 2 minuta); Detektor, UV 220 i 254nm. Sakupljene frakcije su kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 12 kao čvrsta supstanca. LC-MS: 276.0 [M+H]<+>,<1>H-NMR (400MHz, DMSO, ppm): δ7.86 (s, 1H), 7.74-7.84 (s, 2H), 6.88 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.10 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 5.72-5.79 (m, 1H), 5.62-5.63 (m, 1H), 4.44-4.61 (s, 1H), 3.53-3.62 (m, 2H), 2.42-2.49 (m, 1H), 2.19-2.24 (m, 1H).

1

PRIMER 13: amonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfata (13)

Korak 1: 2-((4,4,6,6-tetraoksido-1,3,5,2,4,6-trioksatrifosfinan-2-il)oksi)benzoat (Intermedijer E)

U kutiji za rukavice pod atmosferom argona, suvi tributilamin (0.4 mL, 1.679 mmol) dodat je u posudu koja sadrži tributilamonijum pirofosfat (112 mg, 0.205 mmol) rastvoren u 0.4 mL dimetilformamida (DMF) da bi se dobio bistar rastvor. Bistar rastvor je zatim injektiran u posudu koja sadrži suvi 2-hloro-4H-benzo[d][1,3,2]dioksafosfin-4-on (27.6 mg, 0.136 mmol) u dimetilformamidu (0.4 mL) uz snažno mešanje. Dobijena smeša je mešana na 30°C u trajanju od 30 minuta da bi se dobio rastvor Intermedijera E koji je korišćen u sledećoj reakciji direktno bez bilo kakve obrade.

Korak 2: Sinteza amonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfata (13)

(2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil) tetrahidrofuran-3-ol (Jedinjenje 1, 8 mg, 0.029 mmol) je sipano u posudu sa okruglim dnom (10 mL) i zatim je sušen preko P2O5pod visokim vakuumom preko noći. U ovu posudu dodata su aktivirana molekulska sita 4Å (100 mg). Medijum je promenjen sa argonom i zatim je rastvor Intermedijera E (2.0 ekv., sveže pripremljen) u suvom DMF (0.15 mL) prebačen u gore navedenu posudu pomoću špriceva i smeša je mešana na 25°C 3 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC (acetonitril : 0.1 M amonijum hlorid = 7 : 3). Pošto je početni nukleozid potrošen, smeša je hlađena do 0°C, rastvor joda [3% u 0.1 mL piridina/vode (9:1)] je zatim injektiran u reakcionu smešu. Kada je jod potrošen, dodavanje ukapavanjem rastvora joda je nastavljeno sve dok se održavala stalna braon boja joda. Posle 15 minuta, trietilamonijum

2

bikarbonatni pufer (1.0 M, 2 mL) je dodat uz mešanje na 10°C dodatnih 15 minuta. Isparljiva materija je uklonjena pod vakuumom (unutrašnja temperatura nije prelazila 25°C). Ostatak je ponovo rastvoren u vodi (2 mL) i ekstrahovan sa hloroformom (2 x 2 mL). Sakupljeni vodeni sloj koji sadrži sirovi proizvod je zatim prečišćen pomoću preparative-HPLC sa sledećim uslovima (1#-Pre-HPLC-011(Waters)): kolona, XBridge™ Prep OBD (Optimum Bed Density) T3 kolona, 19*150mm, 5um; pokretna faza, voda sa 50 mmol amonijum bikarbonatom i acetonitrilom (2% acetonitril do 5.2% tokom 5 min, do 95% tokom 2 min, do 5% tokom 1.5 min); Detektor, UV 254 & 220nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 13 kao čvrsta supstanca. LC-MS: (ES, m/z): 512.90 [M-H-4NH3]-.<1>H-NMR: (400MHz, D2O, ppm): δ 8.06 (s, 1H), 7.38 (d, J = 3.6Hz, 1H), 6.63 (t, J = 7.6Hz, 1H), 6.58 (d, J = 3.6Hz, 1H), 4.06-4.14 (m, 2H), 2.67-2.72 (m, 1H), 2.54-2.59 (m, 1H). P-NMR: (161MHz, D2O,ppm): δ - 5.86 (s, 1P), -11.49--11.39 (d, J = 15.13Hz, 1P), -19.29 (s, 1P). Sledeća jedinjenja 14- 21 su sintetisana upotrebom postupka opisanog u Primeru 13:

PRIMER 14: amonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (14). LC-MS: (ES, m/z): 530.85 [M-H-4NH3]-.<1>H-NMR: (400MHz, D2O, ppm): δ 8.00 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.62 (dd, J = 4.8Hz, J = 6.0Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 5.6Hz, J = 11.2Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 5.0Hz, J = 11.4Hz, 1H), 2.48-2.64 (m, 2H). P-NMR: (161MHz, D2O, ppm): δ -5.97--5.89 (d, J = 13.85Hz, IP), -11.52--11.43 (d, J = 14.81Hz, IP), -19.31 (s, IP).

PRIMER 15: amonijum (2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-metil-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (15). LC-MS: (ES, m/z): 527.00 [M - H - 4NH3]-.<1>H-NMR: (400MHz, D2O, ppm): δ 7.96 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.55 (t, J = 6.6Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 6.2Hz, J = 11.4Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 5.8Hz, J = 12.0Hz, 1H), 2.59-2.66 (m, 1H), 2.48-2.53 (m, 1H), 2.78(s, 3H). P-NMR: (161MHz, D2O, ppm): δ -5.90 (s, IP), -11.48--11.39 (d, J = 14.49Hz, IP), -19.32 (s, 1P).

PRIMER 16: bis-trietilamonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (16). LC-MS: (ES, m/z): 546.95 [M-H-2TEA]-.<1>H-NMR: (400MHz, D2O, ppm): δ 7.31 (d, J = 4.0Hz, 1H), 6.53 (d, J = 4.0Hz, 1H), 6.50 (t, J = 6.4Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 5.8Hz, J = 10.6Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 4.8Hz, J = 11.2Hz, 1H), 2.62-2.67 (m, 1H), 2.53-2.58 (m, 1H). P-NMR: (161MHz, D2O, ppm): δ -5.86--5.77(d, J = 14.81Hz, IP), -11.45--11.35(d, J= 15.13Hz, 1P), -19.24(s, IP).

PRIMER 17: amonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (17). LC-MS: (ES, m/z): 546.70 [M-H-4NH3]-.<1>H-NMR: (400MHz, D2O, ppm): δ 7.97 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.54 (t, J = 6.0Hz, 1H), 4.01-4.13 (m, 2H), 2.52-2.62 (m, 2H). P-NMR: (161MHz, D2O, ppm): δ -5.81 (s, 1P), -11.42 (s, 1P), -19.25 (s, 1P).

REFERENCE PRIMER 18: bis-trietilamonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-cijano-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (18). LC-MS: (ES, m/z): 514.35 [M - H - 2TEA]-.<1>H-NMR: (400 MHz, D2O, ppm): δ 8.04 (s, 1H), 7.29 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.70 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.87 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.21-4.16 (m, 2H), 2.99 (q, J = 7.2 Hz, 15H), 2.80-2.76 (m, 1H), 2.58-2.54 (m, 1H), 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 26H). P-NMR: (161 MHz, D2O, ppm): δ -5.85 (s, 1P), -11.84 (d, J = 15.30 Hz, 1P), -19.38 (s, 1P).

REFERENCE PRIMER 19: amonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (19). LC-MS: (ES, m/z): 512.90 [M-H-4NH3]-.<1>H-NMR: (400MHz, D2O, ppm): δ 7.73 (s, 1H), 6.77 (dd, J = 4.4Hz, J = 7.4Hz, 2H), 5.73 (t, J = 7.4Hz, 1H), 4.52-4.56 (m, 1H), 3.98-4.03 (m, 2H), 2.56-2.63 (m, 1H), 2.34-2.40 (m, 1H). P-NMR: (161MHz, D2O,ppm): δ -5.79 (s, IP), -11.24 (s, IP), -19.21 (s, IP).

REFERENCE PRIMER 20: amonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (20). LC-MS: (ES, m/z): 513.95 [M - H - 4 NH3]-.<1>H-NMR: (400 MHz, D2O, ppm): δ 8.22 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 5.53 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 4.60-4.57 (m, 1H), 4.12-4.03 (m, 2H), 2.56-2.49 (m, 1H), 2.35-2.29 (m, 1H). P-NMR: (161 MHz, D2O,ppm): δ -5.82 (s, IP), -11.32-11.23 (d, J = 13.69 Hz, 1P), -19.24 (s, 1P).

REFERENCE PRIMER 21: amonijum ((2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil trifosfat (21). LC-MS: (ES, m/z): 513.95 [M - H - 4NH3]-.<1>H-NMR: (400 MHz, D2O, ppm): δ 8.23 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 5.66 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.61-4.58 (m, 1H), 4.05 (brs, 2H), 2.68-2.61 (m, 1H), 2.46-2.42 (m, 1H). P-NMR: (161 MHz, D2O, ppm): δ -5.81 (s, IP), -11.33-11.24 (d, J = 13.85 Hz, IP), -19.19 (s, IP).

4

Nazivi odgovarajućih oblika jedinjenja 13-21 bez soli su, respektivno:

REFERENTNI PRIMER 22: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f] [1,2,4]triazin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (22)

Korak 1: Sinteza (aminooksi)difenilfosfin oksida

U mešani rastvor hidroksilamin hidrohlorida (70 g, 1007 mmol) u smeši 1,4-dioksana (100 mL) i vode (100 mL) dodat je rastvor NaOH (38.3 g, 957 mmol) u vodi (400 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C tokom 30 minuta. Dobijeni rastvor je mešan na 0°C 20 minuta. U gore navedeno injektiran je rastvor difenilfosfin hlorida (77 mL, 403 mmol) u 1,4-dioksanu (100 mL) brzo na 0°C. Dobijena smeša je snažno mešana na temperaturi sredine 10 minuta. Talog je formiran i sakupljen filtracijom. Čvrsta supstanca je resuspendovana u vodenom rastvoru NaOH (0.25 N, 1000 mL) i mešana na 4°C u trajanju od 1.5 časa. Smeša je filtrirana i filter kolač je ispran vodom (3 × 1000 mL) i etrom (2 × 500 mL) redom. Čvrsta supstanca je sušena pod vakuumom preko noći da bi se dobio (aminooksi)difenilfosfin oksid. LC-MS: (ES, m/z): 233.9 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.82-7.69 (m, 4H), 7.58-7.40 (m, 6H) P-NMR: (121 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 21.53 (s, IP).

Korak 2: Sinteza etil 1-amino-1H imidazole-2-karboksilata

U mešani rastvor etil 1H-imidazol-2-karboksilata (6 g, 30.9 mmol) u DMF (250 mL) pod atmosferom argona dodat je LiHMDS THF rastvor (93 mL, 93 mmol, 1 M) ukapavanjem na -10°C u trajanju od 60 minuta. Dobijena smeša je mešana na -10°C dodatnih 30 min, i zatim je (aminooksi)difenilfosfin oksid (21.63 g, 93 mmol) dodat u porcijama tokom 30 minuta dok je temperatura održavana između 0°C do 10°C. Dobijena smeša je zagrevana do sobne temperature i snažno mešana 16 časova. Reakcija je ugašena ledenom vodom (600 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (2 × 800 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio etil 1-amino-1H-imidazol-2-karboksilat koji je korišćen za sledeći korak reakcije direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 156.1 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 7.37 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.57 (br s, 2H), 4.33-4.27 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

Korak 3: Sinteza imidazo [2,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-ona

U mešanu smešu etil 1-amino-1H-imidazol-2-karboksilata (6 g, 30.9 mmol) u EtOH (60 mL) pod atmosferom argona dodat je formamidin acetat (17.71 g, 170 mmol). Dobijena smeša je zagrevana do refluksa i mešana preko noći. Reakciona smeša je hlađena do temperature sredine i filtrirana. Filter kolač je ispran vodom (3 × 10 mL) i EtOAc (2 × 10 mL) redom. Sakupljena čvrsta supstanca je sušena pod visokim vakuumom preko noći da bi se dobio imidazo [2,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-on. LC-MS: (ES, m/z): 136.9 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 12.31 (br s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.98 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 0.8 Hz, 1H).

Korak 4: Sinteza 4-hloroimidazo [2,1-f][1,2,4]triazin

Imidazo [2,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-on (2.4 g, 17.63 mmol) je sipan u posudu od 100 mL sa okruglim dnom pod atmosferom argona, zatim je injektiran POCl3(20 mL) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrevana do refluksa i mešana 16 h. Isparljiva materija je uklonjena pod sniženim pritiskom. Ostatak je podeljen između EtOAc (100 mL) i vode (30 mL). Organski sloj je ispran hladnim vodenim rastvorom NaHCO3(zasićen, 3 × 20 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL) redom, sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (5 / 1) da bi se dobio 4-hloroimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin. LC-MS: (ES, m/z): 155.0 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.81 (s, 1H), 8.65 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 0.8 Hz, 1H).

Korak 5. Sinteza 4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin

U mešani rastvor 4-hloroimidazo[2,1-f][1,2,4]triazina (20 g, 129 mmol) u THF (500 mL) pod atmosferom argona dodat je NaSMe (13.60 g, 194 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 72 časa. Reakciona smeša je ugašena sa vodenim rastvorom NH4Cl (zasićen, 200 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (2 × 500 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (2 × 200 mL), sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (1 / 1) da bi se dobio 4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin. LC-MS: (ES, m/z): 167.2 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.47 (s, 1H), 7.90 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 0.4 Hz, 1H), 2.73 (s, 3H). Korak 6: Sinteza (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)-2-(4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)tetrahidrofuran-2-ola

U mešani rastvor 4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazina (1 g, 6.02 mmol) u THF (25 mL) pod atmosferom argona injektiran je LDA THF rastvor (4.5 mL, 9.0 mmol, 2 M) na -78°C tokom 5 minuta. Dobijena smeša je održavana na -78°C u trajanju od 30 minuta, i zatim je injektiran (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)dihidrofuran-2(3H)-on (komercijalni, 3.27 g, 7.82 mmol) u THF (15 mL) i dobijena smeša je mešana između -78°C do -50°C u trajanju od 2 časa. Reakcija je ugašena vodenim rastvorom NH4Cl (zasićen, 20 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (2 × 50 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (2 × 20 mL), sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (5 / 1) da bi se dobio (3R,4R,5R)- 3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi) metil)-2-(4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4] triazin-7-il)tetrahidrofuran-2-ol. LC-MS: (ES, m/z): 585.1 [M H]<+>.

Korak 7: Sinteza 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazina

U mešani rastvor (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)-2-(4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)tetrahidrofuran-2-ola (1.7 g, 2.91 mmol) u DCM (30 mL) pod atmosferom argona injektirani su bor trifluorid-dietil eterat (825.3 mg, 5.82 mmol) i trietilsilan (1.35 g, 11.63 mmol) na 0°C redom. Dobijena smeša je mešana na 0°C dodatnih 16 časova. Reakcija je ugašena vodenim rastvorom NaHCO3(zasićen, 20 mL) i ekstrahovana sa DCM (2 × 30 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (30 mL), sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (10 / 1) da bi se dobio 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin. LC-MS: (ES, m/z): 570.0 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.38 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.37-7.26 (m, 15H), 5.56 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 4.70-4.49 (m, 6H), 4.39 (q, J = 4.2 Hz, 1H), 4.34 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.15 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 3.6 Hz, J = 10.5 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 3.9 Hz, J = 10.8 Hz, 1H), 2.70 (s, 3H).

Korak 8: Sinteza 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina

U čeličnu bombu od 80 mL, sipan je 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-4-(metiltio)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin (1.4 g, 2.462 mmol). Medijum je hlađen do -60°C. U ovo je dodat izopropanolski amonijak (izopropanol / tečni amonijak = 2 / 3, mešan na -60°C, 50 mL). Dobijena smeša je zagrevana do 90°C i mešana 16 časova. Reakciona smeša je hlađena do sobne temperature i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (1 / 1) da bi se dobio 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amin. LC-MS: (ES, m/z): 538.3 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.24 (br s, 1H), 8.15 (br s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.36-7.28 (m, 15H), 5.35 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.56 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 4.52 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 4.45 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.22-4.16 (m, 2H), 3.65 (dd, J = 3.2 Hz, J = 10.8 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 4.4 Hz, J = 10.8 Hz, 1H).

Korak 9: Sinteza (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diola

U mešani rastvor 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi) -5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina (1.2 g, 2.232 mmol) u AcOH (10 mL) dodat je 20% Pd(OH)2/ C (1.2 g). Medijum je napunjen vodonikom (2 atm) i mešan na 25°C u trajanju od 24 časa. Čvrsta supstanca je otfiltrirana i isprana sa AcOH (2 × 15 mL). Kombinovani filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom DCM / MeOH (8 / 1) da bi se dobio (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diol. LC-MS: (ES, m/z): 290.0 [M Na]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.22 (br s, 1H), 8.15 (br s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 5.13-5.09 (m, 2H), 5.03 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.78 (br s, 1H), 4.32 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.99 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.81 (q, J = 4.4 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 3.2 Hz, J = 11.2 Hz, 1H), 3.46 (dd, J = 3.6 Hz, J = 11.2 Hz, 1H).

Korak 10: Sinteza (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ola

U mešani rastvor (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diola (3.2 g, 11.97 mmol) i 1H-imidazola (3.26 g, 47.9 mmol) u DMF (65 mL) pod atmosferom argona injektiran je 1,3-dihloro-1,1,3,3-tetraizopropildisiloksan (3.97 g, 12.57 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je zagrevana do 30°C i mešana 5 časova. Reakcija je ugašena vodom (70 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (3 × 100 mL). Kombinovani organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom (3 × 100 mL), sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (3 / 1) da bi se dobio (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ol. LC-MS: (ES, m/z): 510.4 [M H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.12 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.03 (br s, 1H), 6.39 (br s, 1H), 5.31 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.68 (dd, J = 6.0 Hz, J = 7.0 Hz, 1H), 4.47 (q, J = 2.8 Hz, 1H), 4.10-4.05 (m, 3H), 3.20 (br s, 1H), 1.15-1.05 (m, 28H).

Korak 11: Sinteza O-((6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-il) O-fenil karbonotioata U mešani rastvor (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ola (4.0 g, 7.85 mmol) i DMAP (3.83 g, 31.4 mmol) u DCM (160 mL) pod atmosferom argona injektiran je O-fenil karbonohloridotioat (2.71 g, 15.69 mmol) na 0°C. Dobijena smeša je mešana na 0°C dodatna 3 časa. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (1 / 3) da bi se dobio O-((6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-il) O-fenil karbonotioat. LC-MS: (ES, m/z): 646.3 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.37 (br s, 1H), 8.28 (br s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.49 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.34 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.22 (dd, J = 2.0 Hz, J = 5.2 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 5.2 Hz, J = 8.8 Hz, 1H), 4.07-3.96 (m, 2H), 3.91-3.88 (m, 1H), 1.07-1.04 (m, 28H).

Korak 12: Sinteza 7-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina

U mešani rastvor O-((6aR,8S,9S,9aR)-8-(4-aminoimidazo [2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-il) O-fenil karbonotioata (350 mg, 0.542 mmol) i AIBN (133 mg, 0.813 mmol) u degaziranom toluenu (10 mL) pod atmosferom argona injektiran je tri-n-butilkalaj hidrid (314 mg, 1.084 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrevana do 80°C i mešana 3 časa. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (1 / 3) da bi se dobio 7-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amin. LC-MS: (ES, m/z): 494.5 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.23 (br s, 1H), 8.16 (br s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 5.42 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.63 (dd, J = 5.8 Hz, J = 13.0 Hz, 1H), 3.95 (dd, J = 3.2 Hz, J = 11.6 Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 6.8 Hz, J = 12.0 Hz, 1H), 3.78-3.75 (m, 1H), 2.55-2.51 (m, 1H), 2.37-2.32 (m, 1H), 1.07-1.01 (m, 28H). Korak 13: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U mešani rastvor 7-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina (2.7 g, 5.47 mmol) u THF (60 mL) injektiran je vodonik fluorid-piridin (5.42 g, 54.7 mmol) na 0°C. Smeša je zagrevana do temperature sredine i mešana 20 časova. Reakciona smeša je hlađena do 0°C, neutralizovana sa čvrstim NaHCO3i zatim razblažena sa MeOH (50 mL). Čvrsta supstanca je otfiltrirana i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je tretiran sa DCM / MeOH (20 mL, 100 / 1, zapr. / zapr.) i mešana 30 minuta. Beli talog je sakupljen i sušen pod vakuumom preko noći da bi se dobio (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.20 (br s, 1H), 8.13 (br s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 5.42 (dd, J = 5.8 Hz, J = 10.2 Hz, 1H), 5.12 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.74 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.28-4.25 (m, 1H), 3.81-3.78 (m, 1H), 3.42 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.33-2.26 (m, 1H), 2.13-2.09 (m, 1H).

Korak 14: Sinteza 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amina (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol (200 mg, 0.796 mmol) i 1H-imidazol (217 mg, 3.18 mmol) su sipsani u posudu od 10 mL pod atmosferom argona. U smešu je injektiran anhidrovani DMF (2.5 mL), zatim je dodat terc-

1

butilhlorodimetilsilan (360 mg, 2.388 mmol) na 0°C. Smeša je mešana na 25°C u trajanju od 3 h. Dobijena smeša je razblažena sa EtOAc (50 mL), isprana vodenim rastvorom NaHCO3(zasićen, 2 × 15 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL) respektivno. Organski sloj je sakupljen i sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom pet. etra / EtOAc (35%-52% EtOAc u pet. etru) da bi se dobio 7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amin. LC-MS: (ES, m/z): 480.1 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.20 (br s, 1H), 8.13 (br s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 5.43 (dd, J = 5.6 Hz, J = 10.0 Hz, 1H), 4.46-4.44 (m, 1H), 3.81 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 3.63-3.51 (m, 2H), 2.45-2.36 (m, 1H), 2.16-2.10 (m, 1H), 0.89 (s, 9H), 0.86 (s, 9H), 0.10 (s, 6H), 0.02 (d, J = 3.6 Hz, 6H).

Korak 15: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

7-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amin (350 mg, 0.730 mmol) je sipan u posudu od 25 mL sa okruglim dnom, zatim je injektiran THF (4 mL). Medijum je hlađen do 0°C. U ovo je dodat prethodno ohlađeni rastvor trifluorosirćetne kiseline/vode (1/1, zapr./zapr., 2 mL) ukapavanjem uz mešanje na 0°C tokom 10 min. Dobijena smeša je mešana na 0°C u trajanju od 2 časa. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Dobijeni rastvor je ko-isparavan sa toluenom (3 × 20 mL) i ostatak je resuspendovan u vodenom rastvoru NaHCO3(zasićen, 4 mL) i zatim isparavan do sušenja. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela sa EtOAc / DCM (1 / 1) da bi se dobio ((2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanol. LC-MS: (ES, m/z): 366.2 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.09 (br s, 1H), 8.03 (br s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 5.31 (q, J = 5.4 Hz, 1H), 4.70 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 3.69 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 3.33-3.28 (m, 2H), 2.34-2.24 (m, 1H), 2.01-1.96 (m, 1H), 0.79 (s, 9H), 0.01 (s, 6H).

Korak 16: Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešani rastvor ((2R,3S,SR)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (280 mg, 0.766 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu (20 mL) pod atmosferom argona dodat je IBX (644 mg, 2.298 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrevana do 80°C i mešana 25 minuta. LCMS je pokazala da je početni

2

nukleozid sav potrošen. Dobijena smeša je hlađena do sobne temperature. Čvrste supstance su otfiltrirane i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio (2S,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehid, koji je korišćen za sledeći korak reakcije direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 363.7 [M H]<+>.

Korak 17: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (300 mg, sirov) u 1,4-dioksanu (4 mL) u posudi od 25 mL sa okruglim dnom, injektiran je 37% vodeni rastvor formaldehida (1.0 mL), zatim vodeni rastvor NaOH (1.0 mL, 2.0 mmol, 2 N) na 0°C. Dobijena smeša je zagrevana do temperature sredine i mešana 16 časova. Pošto je početni nukleozid sav potrošen, reakciona smeša je neutralizovana sa AcOH (∼0.2 mL). Smeša je razblažena sa EtOAc (100 mL) i ispirana redom vodom (2 × 25 mL), vodenim rastvorom NaHCO3(zasićeni, 25 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL). Organski sloj je sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je ponovo rastvoren u EtOH (5 mL) pod atmosferom argona i dodat je natrijum borohidrid (153 mg, 4.04 mmol) u porcijama na 0°C. Posle mešanja na temperaturi sredine 16 časova, reakciona smeša je neutralizovana sa AcOH (∼0.2 mL) i isparavana do sušenja. Ostatak je podeljen između CHCl3(50 mL) i vode (25 mL). Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa CHCl3(2 × 25 mL). Kombinovani organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom (40 mL), sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom DCM / MeOH (30 / 1) da bi se dobio ((3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanol. LC-MS: (ES, m/z): 395.8 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.18 (br s, 1H), 8.12 (br s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 5.47 (q, J = 5.2 Hz, 1H), 4.68 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.60-3.55 (m, 1H), 3.53-3.51 (m, 2H), 3.34-3.31 (m, 1H), 2.56-2.53 (m, 1H), 2.11-2.07 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (d, J = 2.8 Hz, 6H).

Korak 18: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešanu smešu ((3S,SR)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (180 mg, 0.455 mmol) u acetonitrilu (20 mL) i DMSO (2 mL) pod atmosferom argona dodat je IBX (382 mg, 1.365 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je zagrevana do 30°C i mešana 2 časa. Čvrsta supstanca je otfiltrirana, isprana sa CHCl3(2 × 20 mL) i kombinovani filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u EtOAc (30 mL), ispiran redom vodenim rastvorom NaHCO3(zasićeni, 2 × 15 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL), sušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid, koji je korišćen za sledeći korak reakcije direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 393.8 [M H]<+>.

Korak 19: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7aH-pirolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešanu smešu (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (250 mg, 0.286 mmol, sirov) i K2CO3(120 mg, 0.86 mmol) u MeOH (10 mL) pod atmosferom argona injektiran je rastvor dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonata (110 mg, 0.58 mmol) u MeOH (1 mL) na 0°C. Dobijena smeša je zagrevana do 30°C i mešana 16 časova. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom DCM / MeOH (30 / 1) da bi se dobio ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7aH-pirolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanol. LC-MS: (ES, m/z): 390.2 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.23 (br s, 1H), 8.15 (br s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 5.54 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.16 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 4.53 (dd, J = 4.6 Hz, J = 6.2 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 5.2 Hz, J = 11.6 Hz, 1H), 3.45 (dd, J = 7.0 Hz, J= 11.8 Hz, 1H), 3.42 (s, 1H), 2.56-2.53 (m, 1H), 2.23-2.17 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.10 (d, J = 3.2 Hz, 6H).

Korak 20. Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (22)

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-aminoimidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (150 mg, 0.385 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL) pod atmosferom argona injektiran je TBAF THF rastvor (0.385 mL, 0.385 mmol, 1 M) na 0°C. Smeša je zagrevana do sobne temperature i mešana 16 časova. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC & LCMS. Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela upotrebom DCM / MeOH (24 / 1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 22. LC-MS: (ES, m/z): 309.00 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.21 (br s, 1H), 8.14 (br s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.64

4

(s, 1H), 5.53 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.34 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.07 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.35 (q, J = 6.0 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 5.6 Hz, J = 12.0 Hz, 1H), 3.48 (dd, J = 7.0 Hz, J = 11.8 Hz, 1H), 3.41 (s, 1H), 2.46-2.41 (m, 1H), 2.28-2.21 (m, 1H).

REFERENTNI PRIMER 23: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a] [1,3,5]triazin-8-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (23)

Korak 1: Sinteza (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-ola:

U mešanu suspenziju NaH 60% dispergovanu u mineralnom ulju (1.878 g, 46.9 mmol) u anhidrovanom DME (dimetiletar) (150 mL) pod atmosferom argona injektiran je dietil (cijanometil)fosfonat (11.88 g, 67.1 mmol) na 0°C tokom 10 minuta. Smeša je zagrevana do 25°C i održavana u trajanju od 0.5 h i zatim je ukapavanjem dodat rastvor (3R,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-ol (14.1 g, 33.5 mmol) u suvom DME (100 mL) uz mešanje na 0°C tokom 30 minuta. Dobijena smeša je zagrevana do 25°C ponovo i održavana u trajanju od 2 časa. Dobijena smeša je razblažena sa H2O (300 mL) i ekstrahovana sa Et2O (3 × 500 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (500 mL), sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom EtOAc / pet. etra (5%-20% EtOAc u pet. etru) da bi se dobio 2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)acetonitril. LC-MS: (ES, m/z): 444.21 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, CDCl3,ppm): δ 7.33-7.31 (m, 15H), 4.63-4.43 (m, 6H), 4.25-4.13 (m, 2H), 3.95 (dd, J= 3.0 Hz, J= 4.8 Hz, 1H), 3.77 (dd, J= 5.4 Hz, J= 6.9 Hz, 1H), 3.53-3.45 (m, 2H), 2.78-2.75 (m, 0.4 H), 2.66 (dd, J= 4.8 Hz, J= 16.8 Hz, 0.8 H), 2.50 (dd, J = 4.8 Hz, J= 16.8 Hz, 0.8 H).

Korak 2: Sinteza 2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-3-(dimetilamino)akrilonitrila

U mešani rastvor 2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)acetonitrila (12.6 g, 28.4 mmol) u DCM (90 mL) pod atmosferom argona injektirani su suvi DMF (2.54 mL, 32.8 mmol), a zatim 1-terc-butoksi-N,N,N',N'-tetrametilmetandiamin (19.80 g, 114 mmol) na 0°C tokom 5 minuta. Dobijena smeša je zagrevana do 25°C i mešana 16 časova. Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom EtOAc / pet. etra (15%-35% EtOAc u pet. etru) da bi se dobio 2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-3-(dimetilamino)akrilonitril. LC-MS: (ES, m/z): 499.25 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, CDCl3, ppm): δ 7.33-7.30 (m, 15H), 6.47 (s, 1H), 4.65-4.53 (m, 6H), 4.32 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.19-4.15 (m, 1H), 4.00-3.90 (m, 2H), 3.59-3.46 (m, 2H), 3.04 (s, 6H).

Korak 3. Sinteza 2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-3-hidrazinilakrilonitrila

U mešani rastvor 2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi) metil)tetrahidrofuran-2-il)-3-(dimetilamino)akrilonitrila (12.9 g, 25.9 mmol) u MeOH (90 mL) dodati su hidrazin hidrat (21.15 g, 647 mmol), H2O (3.0 mL, 167 mmol) i hidrazin hidrohlorid (2.66 g, 38.8 mmol) redom na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je zagrevana do 65°C i mešana 16 časova. Finalna smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen sa H2O (500 mL) i ekstrahovan sa EtOAc (3 × 500 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (500 mL), sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio 2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-3-hidrazinilakrilonitril, koji je korišćen za sledeći korak reakcije direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 486.23 [M H]<+>.

Korak 4: Sinteza 4-[(2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-[(benziloksi)metil]oksolan-2-il]-1H-pirazol-5-amina

2-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-3-hidrazinilakrilonitril (18 g, 37.1 mmol) je sipan u posudu od 1000 mL sa okruglim dnom, a zatim je injektiran ACN (200 mL). Smeša je refluksovana u trajanju od 48 časova. Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom MeOH / DCM (2% do 10% MeOH u DCM) da bi se dobio 4-[(2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-[(benziloksi)metil]oksolan-2-il]-1H-pirazol-5-amin. LC-MS: (ES, m/z): 486.23 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 7.40-7.24 (m, 16H), 4.97 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 4.68 (d, J= 12.0 Hz, 1H), 4.62-4.44 (m, 5H), 4.24-4.22 (m, 1H), 4.10-4.04 (m, 2H), 3.71 (dd, J= 3.0 Hz, J= 10.2 Hz, 1H), 3.63-3.50 (m, 1H).

Korak 5. Sinteza 8-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirazolo[1,5-a] [1,3,5]triazin-4-amina

U mešanu smešu cijanamida (50 g, 1189 mmol) dodat je trimetoksimetan (505 g, 4757 mmol) i smeša je zagrevana do 105°C i mešana 5 minuta. U gore navedeno je injektirana mravlja kiselina (4.38 g, 95 mmol) na 105°C tokom 5 minuta. Pošto je dobijeni rastvor mešan na 105°C u trajanju od 5 časova, reakcionas meša je hlađena do sobne temperature. Čvrste supstance su otfiltrirane i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Proizvod je sakupljen destilacijom (0.1 mm Hg, 60°C do 70°C) da bi se dobio (E)-metil N-cijanoformimidat (50 g, 0.595 mol).

U mešani rastvor (E)-metil N-cijanoformimidata (21.82 g, 259 mmol) u toluenu (150 mL) pod atmosferom argona dodat je rastvor 4-((3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)-1H-pirazol-5-amina (21 g, 43.2 mmol) u toluenu (30 mL) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je zagrevana do 90°C i mešana 20 časova. Dobijeni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom EtOAc / pet. etra (30% do 50% EtOAc u pet. etru) da bi se dobio 8-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil) tetrahidrofuran-2-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-amin. LC-MS: (ES, m/z): 538.24 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.05 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.31-7.23 (m, 15H), 6.67 (br s, 2H), 5.33 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 4.67-4.50 (m, 6H), 4.35-4.29 (m, 2H), 4.15-4.11 (m, 1H), 3.72 (dd, J = 3.9 Hz, J = 10.5 Hz, 1H), 3.62 (dd, J = 4.2 Hz, J = 10.8 Hz, 1H).

Korak 6: Sinteza (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diola

U mešanu smešu 8-((2S,3S,4R,5R)-3,4-bis(benziloksi)-5-((benziloksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-amina (10 g, 18.60 mmol) u AcOH (250 mL) dodat je paladijum hidroksid 20% na uglju. Smeša je napunjena vodonikom (1.5-2 atm) i mešana na 25°C u trajanju od 14 časova. Čvrste supstance su otfiltrirane. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je triturisan sa DCM (150 mL) da bi se formirao beo talog. Talog je sakupljen filtracijom, ispran sa DCM i sušen in vacuo preko noći da bi se dobio (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diol. LC-MS: (ES, m/z): 268.10 [M H]<+>.<1>H-NMR (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.76 (br s, 1H), 8.41 (br s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 4.96-4.91 (m, 2H), 4.86-4.81 (m, 2H),4.20 (q, J = 6.0 Hz, 1H), 3.98 (q, J = 4.5 Hz, 1H), 3.78 (q, J = 3.9 Hz, 1H), 3.61-3.55 (m, 1H), 3.49-3.43 (m, 1H).

Korak 7: Sinteza (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ola

U mešani rastvor (2S,3R,4S,5R)-2-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3,4-diola (2.2 g, 8.23 mmol) i 1H-imidazola (1.681 g, 24.70 mmol) u suvom DMF (100 mL) pod atmosferom argona injektiran je 1,3-dihloro-1,1,3,3-tetraizopropildisiloksan (2.86 g, 9.06 mmol) na 0°C tokom 4 minuta. Dobijena smeša je zagrevana do 25°C i mešana 3 časa. Ostatak je razblažen sa H2O (50 mL) i ekstrahovan sa EtOAc (3 × 50 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (2 × 50 mL), sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom EtOAc / pet. etra (30%-50% EtOAc u pet. etru) da bi se dobio (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ol. LC-MS: (ES, m/z): 510.25 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.72 (br s, 1H), 8.42 (br s, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 5.08 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 5.4 Hz, J = 8.1 Hz, 1H), 4.30-4.28 (m, 1H), 3.99-3.86 (m, 3H), 1.04-1.00 (m, 28H).

Korak 8:. Sinteza 8-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-amina

U mešani rastvor (6aR,8S,9S,9aS)-8-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-9-ola (3.90 g, 7.65 mmol) u suvom DCE (120 mL) pod atmosferom argona dodat je 1,1'-tiokarbonildiimidazol (1.704 g, 9.56 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je zagrevana do 85°C i mešana 1.5 čas. TLC je pokazala da je početni nukleozid sav potrošen. Dobijeni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi imidazolil intermedijer koji je neposredno ponovo rastvoren u degaziranom toluenu (120 mL) pod atmosferom argona. U gore navedeno dodat je AIBN (1.88 g, 11.48 mmol), zatim je injektiran tributilstanan (4.45 g, 15.30 mmol) na 25°C tokom 2 minuta. Dobijena smeša je zagrevana do 80°C i mešana 3 časa. Dobijeni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom EtOAc / pet. etra (30%-50% EtOAc u pet. etru) da bi se dobio 8-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-amin. LC-MS: (ES, m/z): 494.25 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.18 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 6.61 (br s, 2H), 5.40 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.70-4.65 (m, 1H), 4.10 (dd, J = 3.0 Hz, J = 10.8 Hz, 1H), 3.95-3.81 (m, 2H), 2.52-2.38 (m, 2H), 1.08-1.05 (m, 28H).

Korak 9: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola

U mešani rastvor 8-((6aR,8R,9aS)-2,2,4,4-tetraizopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioksadisilocin-8-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-amina (1.5 g, 3.04 mmol) u anhidrovanom THF (35 mL) pod atmosferom argona injektiran je HF-piridin rastvor (1.5 mL, 11.65 mmol) na 0°C tokom 5 minuta. Smeša je zagrevana do 25°C i mešana 4 časa. Dobijena smeša je neutralizovana dodavanjem čvrstog NaHCO3i zatim je razblažena sa MeOH (30 mL). Nerastvorena čvrsta supstanca je otfiltrirana. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i zatim triturisan sa EtOAc (20 mL). Beli talog je formiran i sakupljen filtracijom, zatim sušen in vacuo preko noći da bi se dobio (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol. LC-MS: (ES, m/z): 252.10 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.71 (br s, 1H), 8.39 (br s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 5.25 (q, J = 5.4 Hz, 1H), 5.03 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.87 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.26-4.24 (m, 1H), 3.76-3.74 (m, 1H), 3.52-3.40 (m, 2H), 2.32-2.22 (m, 1H), 2.04-1.98 (m, 1H)

Korak 10: Sinteza 8-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirazolo[1,5-a] [1,3,5]triazin-4-amina

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (540 mg, 2.149 mmol) i 1H-imidazola (512 mg, 7.52 mmol) u DMF (10 mL) pod atmosferom argona dodat je TBS-Cl (972 mg, 6.45 mmol) na 0°C tokom 1 minuta. Dobijena smeša je zagrevana do 25°C i mešana 2 časa. Dobijeni rastvor je razblažen sa H2O (50 mL) i ekstrahovan sa EtOAc (3 × 50 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (2 × 50 mL), sušeni preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom EtOAc / pet. etra (20% EtOAc u pet. etru) da bi se dobio 8-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-amin. LC-MS: (ES, m/z): 480.27 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.18 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 6.80 (br s, 2H), 5.49 (q, J = 5.2 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.98 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 3.74 (dd, J = 3.8 Hz, J = 10.6 Hz, 1H), 3.63 (dd, J = 6.4 Hz, J = 10.8 Hz, 1H), 2.39-2.32 (m, 1H), 2.22-2.17 (m, 1H), 0.93-0.92 (m, 18H), 0.11-0.05 (m, 12H).

Korak 11: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor 8-((2R,4S,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-amina (800 mg, 1.667 mmol) u THF (16 mL) injektiran je prethodno ohlađeni rastvor TFA / H2O (8 mL, zapr. / zapr., 1 / 1) na 0°C tokom 5 minuta. Dobijena smeša je mešana na 0°C tokom 1.5 čas. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Dobijeni rastvor je ko-isparavan sa toluenom (3 × 50 mL) ispod 25°C i ostatak je ponovo rastvoren u MeOH / DCM (20 mL, zapr. / zapr., 1 / 2) i smeša je neutralizovana sa čvrstim NaHCO3. Čvrsta supstanca je otfiltrirana i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom MeOH / DCM (2% do 10% MeOH u DCM) da bi se dobio ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanol. LC-MS: (ES, m/z): 366.19 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.70 (br s, 1H), 8.38 (br s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 5.24 (q, J = 5.4 Hz, 1H), 4.92 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 3.6 Hz, J = 4.8 Hz, 1H), 3.46-3.43 (m, 2H), 2.39-2.30 (m, 1H), 2.00-1.94 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).

Korak 12: Sinteza (2S,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešanu suspenziju ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metanola (350 mg, 0.958 mmol) u anhidrovanom ACN (40 mL) pod atmosferom argona dodat je IBX (804 mg, 2.87 mmol) na 25°C. Dobijena smeša je zagrevana do 80°C i mešana 1 čas. Čvrsta supstanca je otfiltrirana. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio (2S,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5] triazin-8-il)-3-

1

((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehid, koji je korišćen za sledeći korak reakcije direktno bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 364.17 [M H]<+>.

Korak 13: Sinteza ((3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola

U mešani rastvor (2S,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (349 mg, 0.960 mmol) u 1,4-dioksanu (25 mL) u posudi od 100 mL sa okruglim dnom, injektiran je vodeni rastvor formaldehida 37% (5 mL), zatim je usledila injekcija vodenog rastvora NaOH (5 mL, 2 N) na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 5 časova. Pošto je početni nukleozid sav potrošen, reakciona smeša je neutralizovana sa AcOH (∼ 0.5 mL). Smeša je razblažena sa EtOAc (50 mL) i ispirana redom sa H2O (2 × 20 mL), vodenim rastvorom NaHCO3(zasićeni, 2 × 20 mL) i fiziološkim rastvorom (20 mL). Organski sloj je sušen preko Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u anhidrovanom EtOH (40 mL) i dodat je natrijum tetrahidroborat (72.6 mg, 1.920 mmol) u porcijama na 0°C pod atmosferom argona. Posle mešanja na 25°C u trajanju od 16 časova, reakciona smeša je neutralizovana sa AcOH (∼ 0.2 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je podeljen između CHCl3(30 mL) i H2O (15 mL). Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa CHCl3(2 × 15 mL). Kombinovani organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom (20 mL), sušen preko Na2SO4, filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom MeOH / DCM (3.5% MeOH u DCM) da bi se dobio ((3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5] triazin-8-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanol. LC-MS: (ES, m/z): 396.20 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.70 (br s, 1H), 8.38 (br s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 5.30 (dd, J = 5.1 Hz, J = 11.1 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.50 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 4.22 (dd, J = 5.1 Hz, J = 6.3 Hz, 1H), 3.62-3.48 (m, 3H), 3.41-3.31 (m, 1H), 2.57-2.50 (m, 1H), 1.95 (dd, J = 5.1 Hz, J = 12.6 Hz, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).

Korak 14: Sinteza (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida

U mešanu suspenziju ((3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2,2-diil)dimetanola (190 mg, 0.480 mmol) u ACN / DMSO (8 mL, zapr. / zapr., 10 / 1) pod atmosferom argona dodat je IBX (404 mg, 1.441 mmol) na 25°C. Dobijena smeša je mešana na 30°C u trajanju od 7 časova. Čvrsta supstanca je otfiltrirana. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio (2R,3S,5R)-5-(4-

1 1

aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehid koji je korišćen za sledeći korak reakcije bez dodatnog prečišćavanja. LC-MS: (ES, m/z): 394.18 [M H]<+>.

Korak 15: Sinteza ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola

U mešani rastvor (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-karbaldehida (189 mg, 0.480 mmol) u suvom MeOH (6 mL) pod atmosferom argona dodat je K2CO3(199 mg, 1.441 mmol) nakon čega sledi injekcija rastvora dimetil (1-diazo-2-oksopropil)fosfonat (185 mg, 0.961 mmol) u MeOH (1.5 mL) na 0°C tokom 3 minuta. Reakciona smeša je lagano zagrevana do 25°C i zatim mešana na 25°C u trajanju od 16 časova. Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom MeOH / DCM (2% do 10% MeOH u DCM) da bi se dobio ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanol. LC-MS: (ES, m/z): 390.19 [M H]<+>.<1>H-NMR: (300 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.17 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 6.43 (br s, 2H), 5.54 (dd, J = 5.7 Hz, J = 10.5 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 3.97 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 3.76 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.70-2.61 (m, 1H), 2.54 (s, 1H), 2.20-2.14 (m, 1H), 0.95 (s, 9H), 0.12 (d, J = 6.0 Hz, 6H).

Korak 16: (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol (23)

U mešani rastvor ((2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-etiniltetrahidrofuran-2-il)metanola (120 mg, 0.308 mmol) u THF (5 mL) pod atmosferom argona injektiran je TBAF THF rastvor (0.462 mL, 0.462 mmol, 1.0 M) na 0°C tokom 2 minuta. Smeša je mešana na 20°C u trajanju od 26 časova. Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni silika gela upotrebom MeOH / DCM (5% do 10% MeOH u DCM) da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod (90 mg) je dalje prečišćen pomoću Prep-HPLC sa sledećim uslovima (1#-Pre-HPLC-011(Waters)): kolona, X-bridge C18 19 × 150 mm; pokretna faza, voda sa NH4HCO3(10 mmol/L) i ACN (4% ACN do 9% tokom 6 min, zadržavanje 95% tokom 2 minuta, do 5% tokom 2 minuta); Detektor, UV 254 & 220 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane preko noći da bi se dobio (2R,3S,5R)-5-(4-aminopirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-8-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol. LC-MS: (ES, m/z): 276.10 [M H]<+>.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.71 (br s, 1H), 8.43 (br s, 1H), 8.20 (s, 1H),

1 2

8.05 (s, 1H), 5.36 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.26-5.22 (m, 2H), 4.34 (dd, J = 4.8 Hz, J = 11.2 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 5.2 Hz, J = 11.6 Hz, 1H), 3.49 (dd, J = 7.6 Hz, J = 11.6 Hz, 1H), 3.37 (s, 1H), 2.44-2.37 (m, 1H), 2.16-2.12 (m, 1H).

Analiza RT polimeraze

RT proteini pune dužine i divljeg tipa i 2 mutantna RT proteina su eksprimirani u Escherichia coli BL21(DE3) ćelijama i prečišćeni. Ukratko, heterodimerni nukleinsko kiselinski supstrat korišćen u reakcijama HIV-1 RT polimeraze je generisan anilingom biotinilovanog DNK prajmera za RNK templejt od 500 nukleotida. HIV-1 RT enzim (finalna koncentracija od 50 pM) je kombinovan sa inhibitornim jedinjenjem ili DMSO (10 % DMSO u finalnoj reakcionoj smeši) u puferu za analizu (62.5 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1.25 mM ditiotreitol, 7.5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0.03% CHAPS, 0.125 mM EGTA). Ova smeša je prethodno inkubirana u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi u mikrotitarskim pločama. Reakcija polimerizacije je započeta dodavanjem obrasca/prajmerskog supstrata (finalna koncentracija: 16.6 nM) i dNTPs (finalna koncentracija: 2 µM dCTP, dGTP, dATP i 66.6 nM Ru-dUTP). Posle 90 min inkubacije na 37°C, reakcije su ugašene dodavanjem EDTA (25 mM). Dobijena smeša je inkubirana dodatnih 5 minuta na sobnoj temperaturi, zatim je rastvor (50 µL) prebačen u blokiranu avidin ploču iz Meso Scale Discovery (MSD). Smeše su inkubirane na sobnoj temperaturi u trajanju od 60 min pre kvantitativnog određivanja reakcionog proizvoda preko ECL 6000 imadžer instrumenta. Dobijeni podaci su prikazani u Tabeli.

TABELA 2

1

14

Viking analiza/CTG

Viking analiza:

Procena antivirusnog potencijala u višestrukom testu infekcije HIV-1. Replikacija HIV-1 praćena je korišćenjem MT4-gag-GFP klona D3 (u daljem tekstu označen kao MT4-GFP), koji su MT-4 ćelije modifikovane da sadrže GFP reporterski gen, čija ekspresija zavisi od proteina koja eksprimira HIV-1, tat i rev. Produktivna infekcija ćelije MT4-GFP sa HIV-1 dovodi do ekspresije GFP približno 24 sata nakon infekcije.

Ćelije MT4-GFP su održavane na 37°C/5% CO2/90% relativne vlažnosti u RPMI 1640 dopunjeno sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina/streptomicina i 400 μg/mL G418 za održavanje reporterskog gena. Za infekcije, ćelije MT4-GFP su stavljene u isti medijum bez G418 i inficirane preko noći virusom H9IIIB pri približnom multiplicitetu infekcije od 0,01 u istim uslovima inkubacije. Ćelije su zatim isprane i ponovo suspendovane u RPMI 1640 koji sadrži 10% ili 50% normalnog humanog seruma na 1,6 x 10<5>ćelija/mL (10% ili 50% NHS stanja) ili u 100% normalnom humanom serumu na 2 x 10<5>ćelija/mL (100% NHS uslovi). Ploče za jedinjenje su pripremljene raspršivanjem jedinjenja rastvorenih u DMSO u bunarčiće ploča sa 384 bunarića obloženih poli D lizinom (0,2 µl/bunarčiću) pomoću ECHO akustičnog dozatora. Svako jedinjenje je testirano u serijskom trostrukom razblaženju u 10 tačaka (tipične krajnje koncentracije: 8,4 µM - 0,43 nM). Kontrole nisu uključivale inhibitor (samo DMSO) i kombinaciju tri antivirusna sredstva (efavirenc, indinavir i inhibitor prenosa lanca integraze pri

1

krajnjim koncentracijama od po 4 µM). Ćelije su dodavane (50 µL/bunarčiću) u ploče za jedinjenje i inficirane ćelije su održavane na 37°C/5% CO2/90% relativne vlažnosti.

Inficirane ćelije su kvantifikovane u dve vremenske tačke, ∼48h i ∼72h nakon infekcije, prebrojavanjem broja zelenih ćelija u svakom bunarčiću pomoću skenera Acumen eX3. Povećanje broja zelenih ćelija tokom perioda od ∼24h daje reproduktivni odnos Ro, koji je tipično 5-15 i eksperimentalno se pokazalo da je u logaritamskoj fazi (podaci nisu prikazani). Inhibicija R0izračunava se za svaki bunarčić, i IC50su određivani nelinearnim podešavanjem krive sa 4 parametra.

CTG analiza:

Procena citotoksičnosti u CellTiter-Glo luminiscentnoj analizi vijabilnosti ćelija (CTG).

[0240] Ćelije MT4-GFP su zasejane u RPMI 1640 dopunjene sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina/streptomicina preko noći na 37°C/5% CO2/90% relativne vlažnosti. Ćelije su zatim isprane i resuspendovane u RPMI 1640 koji sadrži 10% normalnog humanog seruma pri gustini od 0,8 x 10<5>ćelija/mL. Ploče za jedinjenje su pripremljene raspršivanjem jedinjenja rastvorenih u DMSO u bunarčiće čvrstih crnih ploča od 384 bunarčića (Corning 3571) upotrebom ECHO akustičnog dozatora (0,2 µl/bunarčiću). Svako jedinjenje je testirano u serijskom trostrukom razblaživanju od 10 tačaka (krajnje koncentracije: 8,4 µM - 0,43 nM). Kontrole su uključivale DMSO. Ćelije su dodavane (50 uL/bunarčiću) u ploče za jedinjenje i održavane na 37°C/5% CO2/90% relativne vlažnosti. CTG reagens (Promega, G7573) je dodat u ćelijske ploče nakon 48 h inkubacije prema opisu proizvođača. Luminescentni signali snimljeni su na čitaču ploča En Vision (PerkinElmer). LD50su određivani nelinearnim podešavanjem krive sa 4 parametra. Dobijeni podaci prikazani su u Tabeli 3 sa inhibitorom HIV nukleozidne reverzne transkriptaze AZT (azidotimidin, zidovudin) koji je se nalazi na tržištu, koji je uključen kao kontrola.

TABELA 3

1

1

1

Antivirusna postojanost

[0241] Replikacija HIV-1 praćena je korišćenjem MT4-gag-GFP klona D3 (u daljem tekstu označen kao MT4-GFP), koji su MT-4 ćelije modifikovane da sadrže GFP reporterski gen, čija ekspresija zavisi od proteina koje HIV-1 eksprimira, tat i rev. Produktivna infekcija ćelije MT4-GFP sa HIV-1 dovodi do ekspresije GFP približno 24 sata nakon infekcije. Ćelije MT4-GFP su održavane na 37°C/5% CO2/90% relativne vlažnosti u RPMI 1640 dopunjeno sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina/streptomicina i 400 μg/mL G418 za održavanje reporterskog gena. Za 72-časovni test postojanosti u vremenskoj tački (ploča od 72 sata) i ispitivanje kontrole vremenske tačke od 24 sata (ploča od 24 sata), ćelije MT4-GFP su isprane i ponovo suspendovane u RPMI 1640 koji sadrži 10% normalnog humanog seruma na 1,6 x 10<5>ili 2,4 x 10<5>ćelija/mL (10% NHS). Složene ploče su pripremljene raspršivanjem jedinjenja rastvorenih u DMSO u bunarčiće ploča sa ćelijskom kulturom od 384 bunarčića (0,205 µl/bunarčiću) pomoću ECHO akustičnog dozatora. Svako jedinjenje je testirano u serijskom trostrukom razblaženju u 10 tačaka (tipične krajnje koncentracije: 4,2 µM - 0,21 nM). Kontrole nisu uključivale inhibitor (samo DMSO) i kombinaciju tri antivirusna sredstva (efavirenc,

1

indinavir i inhibitor prenosa lanca integraze pri krajnjim koncentracijama od po 4 µM). Ćelije su dodavane (50 ul/bunarčiću) u složene ploče i inkubirane na 37°C/5% CO2/90% relativne vlažnosti tokom 24 sata. Ćelije su isprane sa 5 x 40 uL RPMI 1640 dopunjenog sa 10% NHS i 100 U/mL penicilina/streptomicina. 72h ploča je vraćena u inkubator na 37°C tokom dodatnih 48 sati inkubacije. 40 uL ćelija iz svakog bunarčića 24-satne ploče ili 72-satne ploče (nakon 48-časovne inkubacije nakon ispiranja) prebačeno je na ploču obloženu poli-D-lizinom. Ćelije su zatim inficirane virusom H9IIIB pri približnom multiplicitetu infekcije od 0,1 u istim uslovima inkubacije.

Inficirane ćelije su kvantifikovane ∼24h nakon infekcije, prebrojavanjem broja zelenih ćelija u svakom bunarčiću pomoću skenera Acumen eX3. IC50 za jedinjenja u Tabeli 4 određivane su nelinearnim podešavanjem krive sa 4 parametra.

Analiza antivirusne postojanosti ima za cilj da proceni postojanost antivirusne aktivnosti nakon uklanjanja nukleozida. Podaci u Tabeli 4 pokazuju antivirusnu postojanost jedinjenja ovog pronalaska u poređenju sa nukleozidom AZT koji se prodaje na tržištu. Publikacija AIDS Research and Therapy, 2009, 6:5, ističe vrednost antivirusne postojanosti.

TABELA 4

11

Polu-život adenozin deaminaze (ADA)

Podaci u Tabeli 5 su dobijeni reakcijom supstratnog jedinjenja sa humanim ADA tipom 1 u prisustvu Tris-HCl pufera (pH 7,5) na 40°C i praćenjem LCMS-a potrošnje polaznog materijala. Vreme potrebno za 50% konverziju u odgovarajući inozinski proizvod označeno je kao T1/2u Tabeli 5. Poznato je da deaminacija adenozin deaminazom smanjuje terapeutski potencijal inhibitora nukleozida sličnih adenozinu, posebno in vivo (videti reference ispod). Pokazano je da jedinjenja prikazana u Tabeli 5 imaju različite stepene stabilnosti prema adenozin deaminazi u poređenju sa EDA ((2R,3S,5R)-5-(6-amino-9H.-purin-9-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil) tetrahidrofuran-3-ol) i prirodni deoksiadenozin. Moguće je da će jedinjenja koja su otpornija na ADA imati bolja farmakokinetička svojstva.

Reference: Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39, 19, 3847; Chemical Pharmaceutical Bulletin. 1994, 42, 8, 1688-1690; Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2013), 57(12), 6254-6264; Collection of Czechoslovak Chemical Communications (2006), 71(6), 769-787 Microbiologica (1995), 18(4), 359-70; J Antivir Antiretrovir S10.doi:10.4172/jaa.S10-002.

Konverzija jedinjenja 2 u inozin proizvod 2A

7-((2R,4S,5R)-5-etinil-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-3H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4(7H)-on (2A)

Tris-HCl pufer (pH 7.5, 5 mL) je injektiran u posudu od 25 mL sa okruglim dnom. Smeša je zagrevana do refluksa u trajanju od 30 minuta. Zatim je smeša hlađena do 30°C i (2R, 3S, 5R)-5-

11

(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ol (Primer jedinjenje 2, 7 mg, 0.024 mmol) je dodat, zatim je dodata adenozin deaminaza (3 mg, ∼ 33 jedinice). Dobijena smeša je mešana na 40°C i mešana 4 dana. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i ostatak je prečišćen pomoću preparativne-HPLC sa sledećim uslovima: kolona: X-Bridge C18, 19*150 mm, 5 um; pokretna faza, voda sa 10 mmol amonijum bikarbonatom i acetonitrilom (6% acetonitril do 30% tokom 5 min, zadržavanje 95% tokom 2 min, do 40% tokom 2 min); Detektor, uv 254&220nm. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i liofilizovane da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 2A kao čvrsta supstanca.<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 11.58 (brs, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.22 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.44 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.26-5.22 (m, 1H), 4.39-4.35 (m, 1H), 3.55-3.45 (m, 2H), 3.42 (s, 1H), 2.41-2.24 (m, 2H).<19>F-NMR: (376 MHz, d6-DMSO, ppm): δ - 165.50 (s, IF). LC-MS: (ES, m/z): 294.15 [M H]<+>.

Opšti postupci opisani u prethodnom tekstu za konverziju jedinjenja 2 u 2A primenjeni su za svako od supstratnih jedinjenja u Tabeli 5, i rezultovali su u proizvodnji inozin proizvoda prikazanih za deoksi-adenozin i EDA, kao i inozin proizvoda 1A, 2A, 11A, 22A i 23A. Upotrebom opisanih postupaka, konverzija jedinjenja 4, 8 i 9 u 4A, 8A i 9A, respektivno, nije detektovana (NA = supstrat neosetljiv na adenozin deaminazu).

Jedinjenje 1A: 7-((2R,4S,5R)-5-etinil-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-3H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4(7H)-on:<1>H-NMR: (400 MHz, CD3OD, ppm): δ 8.31 (s, 1H), 7.37 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.62 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.69 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 12.0 Hz, J = 30.0 Hz, 2H), 3.09 (s, 1H), 2.67-2.54 (m, 2H). LC-MS: (ES, m/z): 276.00 [M H]<+>.

Jedinjenje 11A: 7-((2R,4S,5R)-5-etinil-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-on:<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 10.25 (brs, 1H), 7.86 (s, 1H), 6.83 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.53 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.31-5.25 (m, 1H), 5.09-5.05 (m, 1H), 4.31-4.27 (m, 1H), 3.55-3.45 (m, 2H), 3.33 (s, 1H), 2.35-2.18 (m, 2H). LC-MS: (ES, m/z): 298.00 [M Na]<+>.

Jedinjenje 22A: 7-((2R,4S,5R)-5-etinil-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)imidazo[2,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-on :<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.12 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 5.45 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.06 (brs, 1H), 4.33 (brs, 1H), 3.56 -3.46 (m, 2H), 3.32 (s, 1H), 2.42-2.33 (m, 1H), 2.28-2.22 (m, 1H). LC-MS: (ES, m/z): 277.10 [M H]<+>.

Jedinjenje 23A: 8-((2R,4S,5R)-5-etinil-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4(3H)-on:<1>H-NMR: (400 MHz, d6-DMSO, ppm): δ 8.08 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 5.30 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.24-5.11 (m, 1H), 4.32 (q, J = 5.2 Hz, 1H), 3.53 (dd, J1= 11.6 Hz, J2= 32.0 Hz, 2H), 3.36 (s, 1H), 2.36-2.29 (m, 1H), 2.16-2.10 (m, 1H). LC-MS: (ES, m/z): 274.80 [M - H]-.

TABELA 5

11

11 Dok prethodna specifikacija podučava principe ovog pronalaska, sa primerima datim u svrhu ilustracije, izvođenje pronalaska obuhvata sve uobičajene varijacije, adaptacije i/ili modifikacije koje spadaju u opseg sledećih zahteva. Navođenje ili prikaz specifičnog jedinjenja u patentnim zahtevima (tj. vrste) bez posebne oznake stereokonfiguracije, ili sa takvom oznakom za manje od svih hiralnih centara, ima za cilj da obuhvati racemate, racemske smeše, svaki pojedinačni enantiomer, dijastereoizomernu smešu i svakog pojedinačnog dijastereomera jedinjenja gde su takvi oblici mogući zbog prisustva jednog ili više asimetričnih centara.

11

Claims (27)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje strukturne formule II
2. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde: X je O; Y je -C=CH; R<1>je -H,
3. ili pro-lek modifikacija mono-, di- ili trifosfata; R<2>je -H; R<3>je -H; R<4>je -NH2; R<5>je -H, -Cl, -F ili -NH2, i; R<9>je -H, -F, -Cl, -I, -Br ili CH3. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: R<1>je -H. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 koje je:
4. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 11 4. Jedinjenje prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, izabrano iz grupe koja se sastoji od:
5. i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. 5. Jedinjenje prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu koje je:
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu koje je farmaceutski prihvatljiva so od:
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je:
8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je farmaceutski prihvatljiva so od: 12
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je:
10. 10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je farmaceutski prihvatljiva so od:
11. 11. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je:
12. 12. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je farmaceutski prihvatljiva so od:
13. 13. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 izabrano iz grupe koja se sastoji od: ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrogen trifosfata; ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrogen trifosfata, i; ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrogen trifosfata.
14. 14. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je: ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrogen trifosfat.
15. 15. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je: ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-5-fluoro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrogen trifosfat.
16. 16. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 koje je: ((2R,3S,5R)-5-(4-amino-2-hloro-7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-etinil-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrogen trifosfat.
17. 17. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
18. 18. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 za upotrebu u terapiji.
19. 19. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 za upotrebu u inhibiciji HIV reverzne transkriptaze, lečenju ili profilaksi infekcije HIV-om, ili lečenje, profilaksu ili odlaganje početka SIDA-e.
20. 20. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 17, koja dalje sadrži jedno ili više anti-HIV sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od HIV antivirusnih sredstava, imunomodulatora i anti-infektivnih sredstava.
21. 21. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 20, naznačena time što anti-HIV sredstvo je izabrano od jednog ili više antivirusnih sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV proteaze, nukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, nenukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, inhibitora HIV integraze, inhibitora fuzije HIV-a, inhibitora ulaska HIV-a i inhibitora sazrevanja HIV-a.
22. 22. Kombinacija koja sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 i jedno ili više anti-HIV sredstava izabranih od HIV antivirusnih sredstava, anti-infektivnih sredstava i imunomodulatora za upotrebu u inhibiciji HIV reverzne transkriptaze, lečenju ili profilaksi infekcije HIV-om, ili lečenju ili profilaksi, ili odlaganju početka ili napredovanja SIDA-e.
23. 23. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, naznačena time što anti-HIV sredstvo je antivirusno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od inhibitora HIV proteaze, nukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, nenukleozidnih inhibitora HIV reverzne transkriptaze, inhibitora HIV integraze, inhibitora fuzija HIV-a, inhibitora ulaska HIV-a i inhibitora sazrevanja HIV-a.
24. 24. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 20 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, naznačena time što je anti-HIV sredstvo izabrano od sledećih

    12

    sledeći lekovi navedeni u tabeli su u obliku soli: abakavir sulfat, delavirdin mezilat, indinavir sulfat, atazanavir sulfat, nelfinavir mezilat i sakvinavir mezilat.
25. 25. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 20 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, naznačena time što anti-HIV sredstvo je doravirin.
26. 26. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 20 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, naznačena time što anti-HIV sredstvo je tenofovir dizoproksil fumarat.
27. 27. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 20 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, naznačena time što anti-HIV sredstvo je tenofovir alafenamid fumarat. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 12