RS61246B1 - Modifikovani meningokokni fhbp polipeptidi - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak je u oblasti inženjeringa proteina, odnosi se naročito na meningokokni faktor H vezujući protein (fHbp), za koji je poznato da je koristan imunogen vakcine.

OSNOVA TEHNIKE

[0002] Neisseria meningitidis je Gram-negativna inkapsulirana bakterija koja kolonizuje gornji deo respiratornog trakta približno 10% humane populacije. Konjugatne vakcine su dostupne protiv serogrupa A, C, W135 i Y, ali jedina vakcina koja je dostupna za zaštitu protiv serogrupe B u režimu od dve doze je BEXSERO™ prroizvod koji je odobren 2013.

[0003] Jedan od zaštitnih imunogena u BEXSERO™ je fHbp, koji je takođe poznat kao protein ’741’ (SEQ ID NO: 2536 u ref. 1; SEQ ID 1 ovde), ’NMB1870’, ’GNA1870’ [2-4, ’P2086’, ’LP2086’ ili ’ORF2086’ [5-7].3D struktura ovog proteina je poznata [8,9], i protein ima dva βbureta povezana sa kratkim linkerom. Mnoge objave su izveštavale o zaštitnoj efikasnosti ovog proteina u meningokoknim vakcinama npr. videti reference 10-14. fHbp lipoprotein je eksprimiran u različitim sojevima u svim serogrupama. fHbp sekvence su grupisane u tri varijante [2] (ovde označene kao v1, v2 i v3), i generalnoj je pronađeno da serum izazvan protiv date varijante je baktericidan protiv sojeva koji eksprimiraju tu varijantu, ali nije aktivan protiv sojeva koji eksprimiraju jednu od druge dve varijante tj. postoji intra-varijantna unakrsna zaštita, ali ne inter-varijantna unakrsna zaštita (izuzev za neke v2 i v3 unakrsne reaktivnosti).

[0004] Da bi se povećala inter-familijalna unakrsna reaktivnost fHbp sekvenca je konstruisana da sadrži specifičnosti za sve tri varijante [15]. Inženjering proteina je takođe korišćen da bi se uklonila fHbp interakcija sa sideroforama [16] i sa faktorom H [17-25]. Disrupcija interakcije sa fH je zabeležena kod sve tri varjante i postulirano je da obezbeđuje superiorni imunogen vakcine [22,26]. Za v2 polipeptide, međutim, reference 23 i 24 prijavljuju inherentnu nestabilnost koja je takođe uočena kod mutanata sa disruptovanim fH-vezivanjem. Izgleda da je nestabilnost izazvana sa N-terminalnim β-bure domenom, i referenca 23 upozorava da bilo koje supstitucije u ovom buretu mogu promovisati nestabilnost. Referenca 35 opisuje specifične modifikovane v2 fHbp polipeptide koji imaju povećanu stabilnost u odnosu na divlji tip v2 polipeptida i manje fH vezivanje.

[0005] Cilj pronalaska je obezbeđivanje dodatnih fHbp v2 i v3 mutanata, ali koji imaju poboljšanu stabilnost.

OPIS PRONALSKA

[0006] fHbp pune dužine iz soja 2996 u v2 ima sledeću aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:

[0007] Zrelom lipoproteinu nedostaje prvih 19 aminokiselina SEQ ID NO: 2 (podvučeno; obezbeđuje SEQ ID NO: 4), i ΔG oblik SEQ ID NO: 2 nema prvih 26 aminokiselina (SEQ ID NO: 5).

[0008] fHbp pune dužine iz soja M1239 u v3 ima sledeću aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID

[0009] Zreli lipoprotein nema prvih 19 aminokiselina SEQ ID NO: 3 (podvučeno; obezbeđuje SEQ ID NO: 40), i ΔG oblik SEQ ID NO: 3 nema prvih 31 aminokiselina (SEQ ID NO: 17).

[0010] Pronalazači su identifikovali ostatke unutar SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3 koji se mogu modifikovati da bi se povećala stabilnost polipeptida. Ovi ostaci su prisutni generalno duž v2 i v3 sekvenci i tako njihova modifikacija može obezbediti v2 i v3 fHbp sekvence sa poboljšanom stabilnošću. Dodatno, pronalazači su pokazali da, kao i povećavanje stabilnosti, mutacija ovih ostataka može korisno smanjiti vezivanje za humani faktor H (fH). Dodatno, međutim, ovde opisane mutacije mogu se kombinovati sa drugim mutacijama npr. Da bi se smanjilo vezivanje sa humanim faktorom H (fH), za koji je u tehnici već poznato nekoliko mutacija.

[0011] Stoga, generalno pronalazak obezbeđuje mutante v2 ili v3 fHbp koji imaju povećanu stabilnost u odnosu na divlji tip fHbp (npr. U odnosu na SEQ ID NOs: 2 ili 3) i koji, izborno, ima niži afinitet za humani faktor H nego divlji tip fHbp (npr. u odnosu na SEQ ID NOs: 2 ili 3). Povećanje stabilnosti i izborno smanjenje fH afiniteta poželjno rezultuje iz iste muatcije(a), ali u nekim slučajevima one mogu biti usled zasebnog efekta kombinovanih mutacija. Mogu biti poželjni mutantni fHbp proteini sa i povećanom stabilnošću i smanjenim fH afinitetom.

[0012] U prvom aspektu pronalazak obezbeđuje polipetid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu mutantnog fHbp v2, gde: (a) aminokiselinska sekvenca ima najmanje k% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 5, i/ili sadrži fragment SEQ ID NO: 5; ali (b) aminokiselinska sekvenca se razlikuje od SEQ ID NO: 5 na ostatku 32 po supstituciji S32V. U poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca se dodatno razlikuje od SEQ ID NO: 5 na ostacima L123, V124, S125, G126, L127, i/ili G128.

[0013] Gde se osobina (a) odnosi na fragment, fragment uključuje ostatak koji odgovara ostatku 32 iz SEQ ID NO: 5. Fragment iz (a) je najmanje dužine 7 aminokiselina npr. 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 uzastopnih aminokiselina ili više iz SEQ ID NO: 5. Fragment će tipično uključivati najmanje jedan epitop iz SEQ ID NO: 5. Identifikacija i mapiranje epitopa je ustanovljeno za fHbp [11; 27-31]. Tipično će biti zajedničko najmanje 30 uzastopnih aminokiselina sa SEQ ID NO: 5, i obično će mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključivati nekoliko (npr. 2, 3, 4, 5 ili više) fragmenata iz SEQ ID NO: 5. Ukupno, mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca ima najmanje k% identičnosti sekvence i može uključivati nekoliko fragmenata SEQ ID NO: 5.

[0014] Vrednost k je najmanje 80, i može biti npr.85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili više. Na primer, može biti 90 (tj. mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 5) ili 95.

[0015] Polipeptid može, nakon primene na životinju domaćina, izazvati antitela koja mogu prepoznati divlji tip meningokoknog polipeptida koji se sastoji od SEQ ID NO: 4. Ova antitela mogu biti baktericidna (videti u nastavku). Ova antitela mogu uključivati neka antitela koja ne prepoznaju v1 ili v3 polipeptid (npr. divlji tip meningokoknog polipepitda koji se sastoji od SEQ ID NO: 46 i divlji tip meningokoknog polipeptida koji se sastoji od SEQ ID NO: 40), iako oni mogu takođe uključiti naka anatitela koja unakrsno reaguju sa v1 i/ili v3 polipeptidima.

[0016] Polipeptid ima, pod istim eksperimentalnim uslovima, višu stabilnost od istog polipeptida ali bez razlike u sekvenci od (b) npr. veću od divljeg tipa meningokoknog polipeptida koji se sastoji od SEQ ID NO: 4. Poboljšanje stabilnosti može se proceniti korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) npr. kao što je razmatrano u referencama 32 & 33. DSC je prethodno korišćena da se proceni stabilnost v2 fHbp [24]. Pogodni uslovi za DSC da se proceni stabilnost mogu koristiti 20mM polipetida u puferovanom rastvoru (npr. 25mM Tris) sa pH između 6 i 8 (npr. 7-7.5) sa 100-200mM NaCl (npr. 150mM).

[0017] U nekim slučajevima, polipetid prema pronalasku može biti skraćen u odnosu na SEQ ID NO: 5. U poređenju sa zrelom sekvencom diljeg tipa, SEQ ID NO: 5 je već skraćena na N-terminusu do i uključujući poli-glicin sekvencu (uporediti SEQ ID NOs: 4 i 5), ali SEQ ID NO: 5 može biti skraćena na C-terminusu i/ili dodatno skraćena na N-terminusu.

[0018] Povećanje stabilnosti je idealno najmanje 5°C npr. najmanje 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C ili više. Ove temperature se odnose na povećanje u srednjoj tački termalne tranzicije (Tm) kao što je procenjeno sa DSC. Divlji tip fHbp pokazuje dva DSC pika tokom raspakivanja (jedan za N-terminalni domen i jedan za C-terminalni domen) i, gde polipetid prema pronalasku uključuje oba takva domena, povećanje se odnosi na stabilnost N-terminalnog domena, koji se može desiti čak ispod 40°C sa sekvencama divljeg tipa v2 [24] (dok C-terminalni domeni mogu imati Tmod 80°C ili više). Stoga mutantne fHbp v2 aminokiselinske sekvence prema pronalasku poželjno imaju N-terminalni domen sa Tmod najmanje 45°C npr. ≥50°C, ≥55°C, ≥60°C, ≥65°C, ≥70°C, ≥75°C, ili čak ≥80°C.

[0019] U drugom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje polipetid koji sadrži mutantnu fHbp v3 aminokiselinsku sekvencu, gde: (a) aminokiselinska sekvenca ima najmanje j% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 17, i/ili sadrži fragment od SEQ ID NO: 17; ali (b) aminokiselinska sekvenca se razlikuje od SEQ ID NO: 17 na ostatku S32 po supstituciji S32V. U poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca se dodatno razlikuje od SEQ ID NO: 17 na ostatku L126.

[0020] Gde se osobina (a) odnosi na fragment, fragment uključuje ostatak koji odgovara ostatku 32 od SEQ ID NO: 17. Fragment od (a) je najmanje dužine 7 aminokiselina npr.7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 uzastopnih aminokiselina ili više od SEQ ID NO: 17. Fragment će tipično uključivati najmanje jedan epitop od SEQ ID NO: 17. Identifikacija i mapiranje epitopa je ustanovljeno za fHbp [11; 27-31]. Tipično je zajedničkih najmanje 30 uzastopnih aminokiselina sa SEQ ID NO: 17, i obično će mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca uključivati nekoliko (npr. 2, 3, 4, 5 ili više) fragmenata od SEQ ID NO: 17. Ukupno, mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca ima najmanje j% identičnosti sekvence i može uključivati nekoliko fragmenata od SEQ ID NO: 17.

[0021] Vrednost j je najmanje 80, i može biti npr.85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili više. Na primer, može biti 90 (tj. mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 17) ili 95.

[0022] Polipetid može, nakon primene na životinju domaćina, izazvati antitela koja mogu prepoznati divlji tip meningokoknog polipetida koji se sastoji od SEQ ID NO: 40. Ova antitela mogu biti baktericidna (videti u nastavku). Ova antitela mogu uključivati neka antitela koja ne prepoznaju v1 ili a v2 polipetid (npr. divlji tip meningokoknog polipetida koji se sastoji od SEQ ID NO: 46 i divlji tip meningokoknog polipetida koji se sastoji od SEQ ID NO: 4), iako takođ emogu uključivati neka antitela koja unakrsno reaguju sa v1 i/ili v2 polipetidima.

[0023] Polipetid ima, pod istim eksperimentalnim uslovima, višu stabilnost od istog polipetida ali bez razlika u sekvenci od (b) npr. višu stabilnost od divljeg tipa meningokoknog polipetida koji se sastoji od SEQ ID NO: 40. Poboljšanje stabilnosti može se proceniti korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) npr. kao što je razmatrano u referencama 32 & 33 DSC je prethodno korišćen da se proceni stabilnost v3 fHbp [23]. Pogodni uslovi za DSC da se proceni stabilnost mogu koristiti 20 mM polipetida u puferovanom rastvoru (npr.25 mM Tris) sa pH između 6 i 8 (npr. 7-7.5) sa 100-200mM NaCl (npr. 150mM).

[0024] U nekim slučajevima, polipetid prema pronalasku se može skratiti u odnosu na SEQ ID NO: 17. U poređenju sa zrelom sekvencom divljeg tipa, SEQ ID NO: 17 je već skraćena na N-terminusu do i uključujući poliglicin sekvencu (uporediti SEQ ID NOs: 40 i 17), ali SEQ ID NO: 17 se može skratiti na C-terminusu i/ili dodatno skratiti na N-terminusu.

[0025] Povećanje stabilnosti je idealno najmanje 5°C npr. najmanje 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C ili više. Ove temperature se odnose na povećanje srednje tačke termalne tranzicije (Tm) kao što je procenjeno sa DSC. Divlji tip fHbp pokazuje dva DSC pika tokom raspakivanja (jedan za N-terminalni domen i jedan za C-terminalni domen) i, gde polipeptid prema pronalasku uključuje oba takva domena, povećanje se odnosi na stabilnost N-terminalnog domena, koje se može desiti na oko 60°C ili manje sa v3 sekvencama divljeg tipa [24] (dok C-terminalni domeni mogu imati Tm od 80°C ili više). Stoga mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca prema pronalasku poželjno ima N-terminalni domen sa Tm od najmanje 65°C npr. ≥70°C, ≥75°C, ili čak ≥80°C.

Mutacije u odnosu na SEQ ID NO: 5

[0026] Polipetidi prema prvom aspektu pronalaska sadrže aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje k% identičnosti sa SEQ ID NO: 5, i/ili sadrži fragment od SEQ ID NO: 5. U poređenju sa SEQ ID NO: 5, međutim, ova aminosekvenca razlikuje se po ostatku 32 po supstituciji S32V, i izborno se dodatno razlikuje od SEQ ID NO: 5 na jednom ili više ostataka L123, V124, S125, G126, L127, G128, npr. na 2, 3, 4, 5 ili više od ovih 6 ostataka. Ovi ostaci su numerisani prema SEQ ID NO: 5; da bi odgovarali nascentnoj sekvenci divljeg tipa (SEQ ID NO: 2), numerisanje treba da promeni 26 (tj. Ser-32 od SEQ ID NO: 5 je Ser-58 od SEQ ID NO: 2), i da odgovara zreloj sekvenci divljeg tipa (SEQ ID NO: 4) numerisanje treba da promeni 7 (koje takođe dozvoljava lako poređenje sa ref.25).

[0027] Dodatno S32V mutaciji, poželjni ostaci za dodatne mutacije su, L123, V124, S125, G126, L127, i/ili G128. Mutacije na ovim ostacima daju proteine koji imaju dobru stabilnost u poređenju sa divljim tipom v2.

[0028] Naznačeni ostatak se može deletirati, ali je poželjno susptituisan sa različitim aminokiselinama. Kada je načinjena supstitucija, aminokiselina koja zamenjuje u nekim slučajevima može biti prosta aminokiselina kao što je glicin ili alanin. U drugim slučajevima, aminokiselina koja zamenjuje je konzervativna supstitucija npr. načinjena je unutar sledeće četiri grupe: (1) kisele tj. aspartat, glutamat; (2) bazne tj. lizin , arginin, histidin; (3) nepolarne tj. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilkalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektirsane polarne tj. glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. U drugim slučajevima supstitucija je nekonzervativna. U nekim slučajevima supstitucija ne mora da koristi alanin.

[0029] Poželjne supstitucije na specifičnim ostacima za dodatne mutacije su kao što sledi: L123R; V124I; S125G ili S125T; G126D; L127I; G128A.

[0030] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na E240; ova supstitucija neće biti sa alaninom ukoliko je samo E240 mutiran, iako može biti alanin ukoliko dodatna aminokiselina navedena u (b) je supstituisana npr. ukoliko ostaci E240 i H239 su oba mutirani. Idealno, E240 nije mutirana sama za sebe, i stoga mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na E240 takođ etreba da uključi supstituciju na drugom ostatku npr. na oba E240 i H239 (videti mutante #1 i #11).

[0031] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na F122; ova supstitucija neće biti sa alaninom ukoliko je samo F122 mutiran, iako to može biti alanin ukoliko dodatna aminokiselina navedena u (b) je supstituisana npr. ukoliko ostaci F122 i S151 su oba mutirana. Idealno, F122 nije mutirana sama po sebi, i tako mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na F122 treba da uključuje supstituciju na drugom ostatku. Kada je F122 supstituisana poželjno je da S151 je takođe supstituisana npr. obe su supstituisane sa cisteinom, da bi se dozvolilo formiranje disulfidnog mosta (videti mutant #10).

[0032] Tamo gde mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju L123, poželjna je supstitucija sa argininom. Kda je L123 supstituisana: (i) S32 je supstituisana, kao što se vidi u mutantu #3, i izborno S125 je takođe supstituisana, kao što se vidi u mutantima #20 i #22; ili (ii) S32 je supstituisana i jedan ili više od ostataka 124-128 je/su takođe supstituisani.

[0033] Gde mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju na V124, poželjna je supstitucija sa izoleucinom. Kada V124 je supstituisana poželjno je da jedan ili više od 124-128 ostataka je/su takođe supstituisani.

[0034] Tamo gde mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju L127, poželjna je supstitucija sa. Kada L127 je supstituisana poželjno je da jedan ili više od 124-128 ostataka je/su takođe supstituisani.

[0035] Mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju na S32, i supstituisana je sa valinom. Idealno, međutim, S32 nije mutirana sama, i tako mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na S32 treba takođe da uključi supstituciju na drugom ostatku. Kada S32 je supstituisana poželjnoje da (i) L123 je takođe supstituisan npr. kao što se vidi u mutantu #3, i izborno S125 je takođe supstituisan, kao što se vidi u mutantima #20 i #22; ili (ii) S125 je takođe susptituisan npr. kao što se vidi u mutantima #19 i #21.

[0036] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na 1113; ova supstitucija neće biti sa alaninom ukoliko je samo I113 mutirana, iako to može biti alalnin ukoliko je dodatna aminokiselina navedena u (b) supstituisana. Ukoliko je samo I113 mutirana, poželjna je supstitucija sa serinom npr. kao što se vidi u mutantu #7.

[0037] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na V33; ova supstitucija poželjno nije sa izoleucinom. Tamo gde ovde opisana mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju na 1113, ovo poželjno nije sa treoninom ili sa alaninom. Tamo gde ovde opisana mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju na S151, to poželjno nije sa fenilalaninom. Tamo gde ovde opisana mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju i na H239 i na E240, to poželjno nije na R239 i Q240.

[0038] Opis opisuje mutantne fHbp v2 aminokiselinske sekvence gde je načinjena više od jedne supstitucije; ove susptitucije mogu biti izabrane iz grupa 2A do 20 kao što sledi: 2A: ostaci 239 i 240 npr. mutant #1.2B: ostaci 32 i 123 npr. mutant #3.2C: ostaci 125 i 126 npr. mutant #5.2D: ostaci 100, 125 i 126 npr. mutant #6. 2E: ostaci 33 i 39 npr. mutant #8. 2F: ostaci 41 i 69 npr. mutant #9. 2G: ostaci 122 i 151 npr. mutant #10.2H: ostaci 100, 125, 126, 239 i 240 npr. mutant #11. 21: ostaci 32 i 125 npr. mutanti #19 i #21. 2J: ostaci 32, 123 i 125 npr. mutanti #20 i #22.

2K: ostaci 33 i 39, iba susptituisana sa Cys npr. mutant #8. 2L: ostaci 41 i 69, oba supstituisana sa Cys npr. mutant #9. 2M: ostaci 122 i 151, oba supstituisana sa Cys npr. mutant #10. 2N: ostaci 123, 124, 125, 126, 127 i 128 npr. mutant #12. 2O: ostaci 32, 123, 124, 125, 126, 127 i 128.

[0039] Grupa 2B obezbeđuje najpoželjnije mutacije, i naročito S32V i L123R (npr. SEQ ID NOs: 20 i 45). Grupa 20 je sledeći poželjni set mutacija, koji kombinuje 2B, 2C i tri dodatne mutacije (npr. da bi dali SEQ ID NO: 58).

[0040] Aminokiselinski ostaci označeni za mutaciju u v2 sekvenci su numerisani u odnosu na SEQ ID NO: 5 koja je iz soja 2996. Odgovarajući aminokiselinski ostaci u v2 fHbp iz bilo kog drugog soja mogu se lako identifikovati poravnanjem sekvence npr. tako da se aminokiselina koja, kada je poravnata sa SEQ ID NO: 5 korišćenjem algoritma za poravnanje parova (npr. Needleman-Wunsch global alignment algorithm, kao što je detaljno dato u nastavku), poravnava sa aminokiselinom pomenutom ovde. Često će aminokiselina biti ista kao što se vidi u SEQ ID NO: 5 (npr. ostatak 32 biće serin), ali će se poravnanje lako identifikovati ukoliko ovo nije slučaj.

[0041] Dodatno mutaciji (mutacijama) naznačenim prethodno, čiji je cilj povećanje stabilnosti, polipetid prema pronalasku može uključivati jednu ili više dodatnih mutacija npr. da disruptuju interakciju polipetida sa sideroforama ili, poželjnije, da disruptuju sposobnost polipeptida da se vezuju za fH.

[0042] Reference 19 i 25 objavljuju da interakcija između fH i v2 fHbp može biti disruptovana mutacijama na ostacima R80, D211, E218, E248, T220+H222 (dvostruka mutacija), i G236. Numerisano u skladu sa SEQ ID NO: 5, ovi ostaci su R73, D203, E210, E240, T213+H215, i G228. Od ovih položaja, polipetidi mutirani na D203, E210 ili T213+H215 mogu biti poželjni jer referenca 25 objavljuje da nema onesposobljavanja važnih epitopa kod ovih mutanata. Specifične supstitucije razmatrane u referenci 25 bile su R73A, D203A, E210A, T213A+H215A, G228I, i E240A; ove supstitucije mogu biti pogodne za upotrebu prema pronalasku.

[0043] Referenca 24 objavljuje da interakcija između fH i v2 fHbp može biti disruptovana sa mutacijama na ostacima R145, S193, F194, L195, A265, E267, K268, V272, 1273, L274, E283, T286, H288, F292, T304, i E313 i E283+T304 (dvostruka mutacija). Numeriasnjem prema SEQ ID NO: 5, ovi ostaci su R73, S121, F122, L123, A192, E194, K195, V199, 1200, L201, E210, T213, H215, F219, T231, i E240 i E210+T231. Četri od ovih se preklapaju sa referencom 25 (E210, T213, H215, E240). Specifične supstitucije razmatrane u referenci 24 koristile su alanin (izuzev za A265P i T304E), i ove supstitucije mogu biti pogodne za korišćenje prema pronalasku.

[0044] Referenca 24 objavljuje da određene supstitucije u v2 mogu povećati afinitet za fH, i ove treba izbegavati ukoliko je namera da se disruptuje vezivanje sa fH npr. E85 u SEQ ID NO: 5 (ostatak 157 u ref.24).

[0045] Ostaci koji interaguju sa sideroforama mogu biti mutirani, korišćenjem uputstava u referencama 16 i 34 npr. poravnanjem ove SEQ ID NO: 5 sa SEQ ID NO: 4 iz reference 16 da bi se identifikovali ostaci koji mogu interagovati sa sideroforama npr. sa kateholatima, hidroksamatima ili karboksilatima.

[0046] Dodatni ostaci koji mogu biti mutirani uključuju, ali nisu ograničeni na, S23, L24, D30, Q31, R34, D95, i/ili L102 npr. korišćenjem mutacija sugerisanih u referenci 35.

[0047] Polipetid prema prvom aspektu pronalaska može sadržati bilo koju od SEQ ID NOs: 18 do 36. Slično, uzimajući u obzir ’ΔG’ mutaciju (tj. skraćivanje nascentnog N-terminusa do i uključujući nativnu poli-Gly sekvencu), polipetid prema prvom aspektu pronalaska može sadržati bilo koju od SEQ ID NOs: 18 do 36 isključujući njegove aminokiseline 1-26. Na primer, polipetid prema prvom aspektu može sadržati SEQ ID NO: 45, ili može sadržati SEQ ID NO: 58.

[0048] Uzimajući u obzir mogućnost dodatnih tačkastih mutacija (npr. za disrupciju interakcija sa sideroforama i/ili fH) polipetid prema prvom aspektu može sadržati bilo koju od SEQ ID NOs: 19, 20, 33, 34, 35, i 36 (ili bilo koju od SEQ ID NOs: 19, 20, 33, 34, 35, i 36 isključujući njene aminokiseline 1-26, kao što je SEQ ID NO: 45) ali modifikovane sa do 5 promena pojedinačnih aminokiselina (tj. 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačnih aminokiselina) uz uslov da modifikovana sekvenca može, nakon primene na životinju domaćina, izazvati antitela koja se vezuju za meningokokni fHbp polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence od SEQ ID NO: 2. Takve promene aminokiselina ne treba da izazovu reverziju mutacija u ovim sekvencama u ovim sekvencama u odnosu na sekvencu divljeg tipa npr. SEQ ID NO: 45 ne treba da bude mutirana na ostatku V32 ili R123.

SEQ ID NOs: 60 je dodatni primer v2 mutanta, odnosno zreli oblik mutanta #3 za soj 8047. Mutacije u odnosu na SEQ ID NO: 17

[0049] Polipetidi prema drugom aspektu pronalaska sadrže aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje j% identičnosti sa SEQ ID NO: 17, i/ili sadrži fragment od SEQ ID NO: 17. U poređenju sa SEQ ID NO: 17, međutim, ova amino sekvenca razlikuje se na ostatku 32 po supstituciji S32V, i izborno dodatno se razlikuje od SEQ ID NO: 17 na ostatku L126. Ovi ostaci su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 17; da bi se poklopilo sa nascentnom sekvencom divljeg tipa (SEQ ID NO: 3), numerisanje treba da se promeni 31 (tj. Ser-32 od SEQ ID NO: 17 je Ser-63 od SEQ ID NO: 3), i da bi se poklopila zrela sekvenca divljeg tipa (SEQ ID NO: 40) numerisanje treba da se promeni 12.

[0050] Naznačeni ostatak može biti deletiran, ali je poželjno supstituisan sa različitom aminokiselinom. Kada je načinjena supstitucija, zamenska aminokiselina u nekim slučajevima može biti prosta aminokiselina kao što je glicin ili alanin. U drugim slučajevima, zamenska aminokiselina je konzervativna supstitucija npr. napravljena je sa sledeće četiri grupe: (1) kiselom tj. aspartat, glutamat; (2) baznom tj. lizin, arginin, histidin; (3) ne-polarnom tj. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisanom polarnom tj. glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. U drugim primerima izvođenja supstitucija je ne-konzervativna. U nekim slučajevima supstitucija ne mora da koristi alanin.

[0051] Poželjna supstitucija na specifikovanom ostatku za dodatne mutacije je L126R.

[0052] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na E243; ova supstitucija neće biti sa alaninom ukoliko je mutirana samo E243, iako to može biti alalnin ukoliko je dodatna aminokiselina navedena u (b) supstituisana npr. ukoliko su oba ostataka E243 i H242 mutirana. Idealno, nije samo E243 mutiran, i tako mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na E243 treba takođe da uključi supstituciju na drugom ostatku npr. na oba E243 i H242.

[0053] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na F125; ova supstitucija neće biti sa alaninom ukoliko je samo F125 mutiran, iako to može biti alanin ukoliko je dodatana aminokiselina navedena u (b) supstituisana npr. ukoliko su oba ostataka F125 i S154 mutirana. Idealno, F125 nije sama mutirana, tako da mutirana fHbp v3 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na F125 treba takođe da uključi mutaciju na drugom ostatku. Kada F125 je supstituisana poželjno je da S154 je takođe supstituisana npr. obe su supstituisane sa cisteinom, da bi se dozvolilo formiranje disulfidnog mosta.

[0054] Tamo gde fHbp v3 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju na L126, ova susptitucija može biti alanin ukoliko su oba ostatka L126 i S32 mutirana. Poželjna je supstitucija sa argininom. Kada L126 je supstituisana S32 je supstituisan, i izborno S128 je takođe supstituisan.

[0055] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na V127; poželjno je da ova supstitucija ne bude sa alaninom ukoliko je mutiran samo V127, iako može biti alanin ukoliko dodatna aminokiselina navedena u (b) je supstituisana npr. ukoliko jedan ili više od ostataka 126-131 su takođe mutirani. Ukoliko sama V127 mutirana, poželjna je supstitucija sa izoleucinom. Idealno, međutim, V127 nije sama mutirana, tako da mutirana fHbp v3 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na V127 treba takođe da uključi mutaciju na drugom ostatku. Kada je V127 supstituisana poželjno je da jedan ili više od ostataka 127-131 je/su takođe supstituisani.

[0056] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na L130, poželjno je da ova supstitucija ne bude sa alaninom ukoliko je samo L130 mutirana, iako to može biti alanin ukoliko dodatna aminokiselina navedena u (b) je supstituisana npr. ukoliko jedan ili više od ostataka 126-131 su takođe mutirani. Ukoliko je samo L130 mutirana, supstitucija sa izoleucinom je poželjna. Idealno, međutim, L130 nije sama mutirana, tako da mutirana fHbp v3 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na L130 treba takođe da uključi mutaciju na drugom ostatku. Kada L130 je supstituisana poželjno je da jedan ili više od ostataka 127-131 je/su takođe supstituisani.

[0057] Mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca uključuje supstituciju na S32. Supstitucija sa valinom. Idealno, međutim, S32 nije sama mutirana, tako da mutirana fHbp v3 aminokiselinska sekvenca sa supstitucijom na S32 treba takođe da uključi mutaciju na drugom ostatku. Kada je S32 supstituisana poželjno je da L126 je takođe supstituisana, i dodatno S128 može takođe biti supstituisana.

[0058] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na T113; ova supstitucija neće biti sa alaninom ukoliko je samo T113 mutirana, iako to može biti alanin ukoliko dodatna aminokiselina navedena u (b) je supstituisana. Ukoliko je samo T113 mutirana, poželjna je supstitucija sa serinom.

[0059] Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na 133; to poželjno nije sa valinom. Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na T116; to poželjno nije sa izoleucinom. Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na G129; to poželjno nije sa serinom. Ovde je takođe opisana mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca koja uključuje supstituciju na oba H242 i E243; ovo poželjno nije na R242 i Q243.

[0060] Opis opisuje mutantne fHbp v3 aminokiselinske sekvence gde se može napraviti više od jedne supstituicje; one se mogu izabrati iz grupa 3A do 30 kao što sledi: 3A: ostaci 242 i 243.

3B: ostaci 32 i 126.3C: ostaci 128 i 129.3D: ostaci 103, 128 i 129.3E: ostaci 33 i 39.3F: ostaci 41 i 72.3G: ostaci 125 i 154.3H: ostaci 103, 128, 129, 242 i 243.31: ostaci 32 i 128.3J: ostaci 32, 126 i 128.3K: ostaci 33 i 39, oba supstituisana sa Cys. 3L: ostaci 41 i 72, oba supstituisana sa Cys. 3M: ostaci 125 i 154, oba supstituisana sa Cys.3N: ostaci 126, 127, 128, 129, 130 i 131.

3O: ostaci 32, 126, 127, 128, 129, 130 i 131.

[0061] Grupa 3B obezbeđuje najpoželjnije mutacije, i naročito S32V i L126R (npr. sadrži SEQ ID NO: 44). Grupa 30 je sledeća poželjna mutacija, koja kombinuje 3B, 3C i tri dodatne mutacije (npr. da bi dala SEQ ID NO: 61).

[0062] Aminokiselinski ostaci označeni za mutaciju u v3 sekvenci su numerisani u odnosu na SEQ ID NO: 17 koja je iz soja M1239. Odgovarajući aminokiselinski ostaci u v3 fHbp iz bilo kog drugog soja mogu se lako identifikovati sa poravnanjem sekvence npr. tako da se aminokiselina koja, kada je poravnata sa SEQ ID NO: 17 korišćenjem algoritma poravnanja parova (npr. Needleman-Wunsch global alignment algorithm, kao što je detaljno dato u nastavku), poravnava sa mainokiselinom pomenutom ovde. Često aminokiselina će biti ista kao što se vidi u SEQ ID NO: 17 (npr. ostatak 32 će biti serin), ali će poravnanje lako identifikovati ukoliko ovo nije slučaj.

[0063] Dodatno mutaciji (mutacijama) naznačenim prethodno, koja ima za cilj povećanje stabilnosti, polipetid prema pronalasku može uključivati jednu ili više dodatnih mutacija npr. da bi se disruptovala interakcija polipetida sa sideroforama ili, poželjnije, da bi se disruptovala sposobnost polipetida da se vezuje za fH.

[0064] Referenca 24 objavljuje da interakcija između fH i v3 fHbp može biti disruptovana mutacijama na ostacima Q107, 1147, L156, A157, L195, V196, V272, E283, T286, T304, V311, E313 i E283+T304 (dvostruka mutacija). Numerisanjem prema SEQ ID NO: 17, ovi ostaci su: Q35, 178, L87, A88, L126, V127, V202, E213, T216, T234, V241, E243 i E213+T234. Specifične supstitucije razmatrane u referenci 24 koristile su alanin (izuzev za A157E i T231E), i ove susptitucije mogu biti pogodne za upotrebu u skladu sa pronalaskom. Ostaci T216 i E243 su takođe objavljeni u referenci 23. Referenca 36 objavljuje da interakcija između fH i v3 fHbp može biti disruptovana mutacijama na ostacima H288 i G318 (H218 i G248 numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 17), i ove supstitucije mogu biti pogodne za upotrebu prema pronalasku npr. H218R, G248D.

[0065] Ref.24 objavljuje da određene supstitucije u v3 mogu povećati afinitet za fH, i ove treba izbegavati ukoliko je namera da se disruptuje vezivanje za fH npr. P44 u SEQ ID NO: 17 (ostatak 106 u ref.24)

[0066] Ostaci koji interaguju sa sideroforama mogu biti mutirani, korišćenjem uputstava u referencama 16 i 34 npr. poravnanjem ove SEQ ID NO: 17 sa SEQ ID NO: 4 iz reference 16 da bi se identifikovali ostaci koji mogu interagovati sa sideroforama npr. sa kateholatima, hidroksamatima ili karboksilatima.

[0067] Modifikovani v3 polipetid prema pronalasku može sadržati SEQ ID NO: 44. Razmatrajući mogućnost dodatnih tačkastih mutacija (npr. za disrupciju interakcija sa sideroforama i/ili fH) polipetid prema prvom primeru izvođenja može sadržati SEQ ID NO: 44 ali modifikovan sa do 5 promena pojedinačnih aminokiselina (tj. 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačnih aminokiselina) uz uslov da modifikovana sekvenca može, nakon primene na životinju domaćina, izazvati antitela koja se vezuju sa meningokoknim fHbp polipetidom koji se sastoji od aminokiselinske sekvence od SEQ ID NO: 40. Takve aminokiseline promene ne treba da izazovu reverziju mutacija u ovim sekvencama u odnosu na sekvencu divljeg tipa npr. SEQ ID NO: 44 ne treba da bude mutirana na ostatku V32 ili R126.

Polipetidi

[0068] Polipetidi prema pronalasku mogu se pripremiti različitim načinima npr. hemijskom sintezom (najmanje delom), digestijom dužih polipetida korišćenjem proteaza, translacijom sa RNK, prečišćavanjem iz kulture ćelija (npr. iz rekombinantne ekspresije ili od kulture N. meningitidis), itd. Heterologna ekspresija u E.coli domaćinu je poželjni način ekspresije.

[0069] Polipetidi prema pronalasku su idealno najmanje dužine 100 aminokiselina npr. 150 aa, 175aa, 200aa, 225aa, ili duži. Oni uključuju mutantnu fHbp v2 i/ili v3 aminokiselinsku sekvencu, i mutantna fHbp v2 ili v3 aminokiselinska sekvenca treba slična da bude najmanje dužine 100 aminokiselina npr. 150aa, 175aa, 200aa, 225aa, ili duža.

[0070] fHbp je prirodno lipoprotein u N. meningitidis. Takođe je pronađeno da je lipidovan kada je eksprimiran u E.coli sa svojom prirodnom lider sekvencom ili sa heterolognim lider sekvencama. Polipetidi prema pronalasku mogu imati cisteinski ostatak na N-terminusu, koji može biti lipidovan npr. sadržati palmitoil grupu, obično formirajući tripalmitoil-S glicerilcistein. U drugim slučajevima polipetidi nisu lipidovani.

[0071] Polipetidi su poželjno pripremljeni u suštinski čistom ili suštinski izolovanom obliku (tj. suštinski oslobođeni od drugih Neisseria ili polipeptida ćelije domaćina). Generalno, polipetidi su obezbeđeni u okruženju koje se ne javlja u prirodi npr. razdivjeni su od njihvog prirodnog okruženja. U određenim slučajevima, polipetid može biti prisutan u kompoziciji koja je obogaćena u odnosu na polipetid u poređenju sa početnim materijalom. Stoga prečišćeni polipetid može biti obezbeđen, gde prečišćeni znači da je polipetid prisutan u kompoziciji koja je suštinski oslobođena drugih eksprimiranih polipetida, gde suštinski oslobođen znači da više od 50% (npr. ≥75%, ≥80%, ≥90%, ≥95%, ili ≥99%) ukupnog polipetida u kompoziciji je polipetid prema pronalasku.

[0072] Polipetidi mogu biti različitih oblika (npr. nativni, fuzioni, glikoziklovani, neglikozilovani, lipidovati, sa disulfidnim mostovima, itd.).

[0073] SEQ ID NOs 4, 5, 17 i 40 ne uključuju metionin na N-terminusu. Ukoliko je polipetid prema pronalasku proizveden translacijom u biološkom domaćinu onda je neophodan start kodon, koji će obezbediti N-terminalni metionin u većini domaćina. Stoga polipetid prema pronalasku će, najmanje u nascentnom stadijumu, uključivati metioninski ostatak uzvodno od pomenute SEQ ID NO sekvence.

[0074] Isecanje nascentnih sekvenci znači da će mutantna fHbp v2 ili v3 aminokiselinska sekvenca moći samo da obezbedi N-terminus polipeptida. U drugim slučajevima, međutim, polipetid prema pronalasku može uključivati N-terminalnu sekvencu ushodno od mutantne fHbp v2 ili v3 aminokiselinske sekvence. U nekim slučajevima polipetid može imati jedan metionin na N-terminusu neposredno praćen sa mutantnom fHbp v2 ili v3 aminokiselinskom sekvencom; u drugim slučajevima može se koristiti duža ushodna sekvenca. Takva ushodna sekvenca može biti kratka (npr. 40 ili manje aminokiselina tj. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Primeri uključuju lider sekvence za upravljanje prometom proteina, ili kratke peptidne sekvence koje olakšavaju kloniranje ili prečišćavanje (npr. histidin tag tj. Hisn gde n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više). Druge pogodne N-terminalne aminokiselinske sekvence biće jasne stručnjacima npr. nativne ushodne sekvence prisutne u SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3.

[0075] Polipetid prema pronalasku može takođe uključivati aminokiseline nishodno od finalne aminokiseline mutantne fHbp v2 ili v3 aminokiselinske sekvence. Takve C-terminalne ekstenzije mogu biti kratke (npr.40 ili manje aminokiselina tj.39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Primeri uključuju sekvence za upravljanje prometom proteina, kratke peptidne sekvence koje olakšavaju kloniranje ili prečišćavanje (npr. histidin tag tj. Hisn gde n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više), ili sekvence koje poboljšavaju stabilnost polipetida. Druge pogodne C-terminalne aminokiselinske sekvence biće jasne stručnjacima.

[0076] U nekim slučajevima, pronalazak može isključivati polipetide koji uključuju histidinski tag (cf. ref.24 & 25), i naročito heksahistidinski tag na C-terminusu.

[0077] Termin "polipetid" odnosi se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearni ili granat, može sadržati modifikovane aminokiseline, i može biti prekinut sa neaminokiselinama. Termini takođe obuvhvataju aminokiselinski polimer koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidnog mosta, glikozilacija, lipidacija, acetilacija, fosforilacija, ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Uniutar definicije su takođe uključeni, na primer, polipetidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiselina (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline, itd.), kao i druge modifikacije poiznate u tehnici. Polipetidi se mogu pojaviti kao jedan lanac ili asocijacija lanaca.

[0078] Polipetidi prema pronalasku, mogu biti vezani ili imobilisani za čvrstu podlogu.

[0079] Polipetidi prema pronalasku mogu sadržati detektabilni obeleživač npr. radioaktivni obeleživač, fluorescentni obeleživač, ili biotin obeleživač. Ovo je naročito korisno u tehnikama imunoanalize.

[0080] Kao što je opisano u referenci 164, fHbp se može podeliti na tri domena, označena kao A, B i C. Uzimajući SEQ ID NO: 1, tri domena su (A) 1-119, (B) 120-183 i (C) 184-274:

[0081] Zreli oblik domena ’A’, od Cys-20 na njegovom N-terminusu do Lys-119, je nazvan ’Azreli’.

[0082] Više fHbp sekvenci je poznato i one se mogu lako poravnati korišćenjem standardnih postupaka. Sa takvim poravnavanjima stručnjak može identifikovati (a) domene ’A’ (i ’Azreli’), ’B’ i ’C’ u bilo kojoj datoj fHbp sekvenci poređenjem sa koordinatama u MC58 sekvenci, i (b) pojedinačne ostatke u više fHbp sekvenci npr. za identifikovanje supstitucija. Za lakšu referencu, međutim, domeni su definisani u nastavku: - Domen ’A’ u datoj fHbp sekvenci je fragment one sekvence koja, kada je poravnata sa SEQ ID NO: 1 korišćenjem algoritma poravanja parova, počinje sa aminokiselinom poravnatom sa Met-1 od SEQ ID NO: 1 i završava se sa aminokiselinom poravnatom sa Lys-119 od SEQ ID NO: 1. - Domen ’Azreli’ u datoj fHbp sekvenci je fragment one sequence koja, kada je poravnata sa SEQ ID NO: 1 korišćenjem algoritma poravnanja parova, počinje sa aminokiselinom poravnatom sa Cys-20 of SEQ ID NO: 1 i završava se sa aminokiselinom poravnatom sa Lys-119 od SEQ ID NO: 1. - Domen ’B’ u datoj fHbp sekvenci je fragment one sekvence koja, kada je poravnata sa SEQ ID NO: 1 korišćenjem algoritma poravnanja parova, počinje sa aminokiselinom poravnatom sa Gln-120 od SEQ ID NO: 1 i završava se sa aminokiselinom poravnatom sa Gly-183 of SEQ ID NO: 1. -Domen ’C’ u datoj fHbp sekvenci je fragment one sekvence koja, kada je poravnata sa SEQ ID NO: 1 korišćenjem algoritma poravnanja parova, počinje sa aminokiselinom poravnatom sa Lys184 of SEQ ID NO: 1 i završava se sa aminokiselinom poravnatom sa Gln-274 of SEQ ID NO: 1.

[0083] Poželjni algoritam poravnanja parova za definisanje domena je Needleman-Wunsch global alignment algorithm [158], korišćenjem podrazumevanih parametara (npr. sa Gap opening penalty = 10.0, i sa Gap extension penalty = 0.5, korišćenjem EBLOSUM62 scoring matrix). Ovaj algoritam je pogodno implementiran u needle alat u EMBOSS paketu [159].

[0084] U nekim slučajevima, mutantna fHbp v2 ili v3 aminokiselinska sekvenca prema pronalasku može se skratiti da bi se uklonio njen domen A. Generalno, međutim, poželjno je da mutantna fHbp v2 ili v3 aminokiselinska sekvenca uključuje i N-terminalno β-bure i C-terminalno β-bure.

[0085] U nekim slučajevima, polipetid može sadržati aminokiselinsku sekvencu kao što je opisano prethodno, osim što do 10 aminokiselina (tj.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) na N-terminusu i/ili do 10 aminokiselina (tj.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) na C-terminusu može biti deletirano.

[0086] Polipetidi prema pronalasku tipično se sastoje od veštačke aminokiselinske sekvence, odnosno sekvence koja nije prisutna u bilo kojoj prirodnoj meningokoki.

[0087] Afinitet za faktor H može se kvantitativno proceniti korišćenjem rezonance površinskog plazmona npr. kao što je opisano u referencama 18 i 21-24 sa imobilisanim humanim fH. Mutacije koje obezbeđuju smanjenje afiniteta (tj. povećanje konstamte disocijacije, KD) od najmanje 10-puta, i idealno najmanje 100-puta, su poželjne (kada je mereno pod istim eksperimentalnim uslovima u odnosu na isti polipetid ali bez mutacija).

Nukleinske kiseline

[0088] Pronalazak obezbeđuje nukleionsku kiselinu koja kodira polipetid prema pronalasku kao što je prethodno definisano.

[0089] Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se pripremiti na mnogo načina npr. hemijskom sintezom (npr. fosforamidit sinteza DNK) u celini ili delimično, digestijom dužih nukleinskih kiselina korišćenjem nukleaza (npr. restrikcionih enzima), spajanjen kraćih nukleinskih kiselina ili nukleotida (npr. korišćenjem ligaza ili polimeraza), iz genomskih ili cDNK biblioteka, itd.

[0090] Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti različitog oblika npr. jednolančane, dvolančane, vektori, prajmeri, probe, obeležene, neobeležene, itd.

[0091] Nukleinske kiseline prema pronalasku su poželjno u izolovanom ili suštinski izolovanom obliku.

[0092] Termin "nukleinska kiselina" uključuje DNK i RNK, i takođe njihove analoge, kao što su oni koji sadrže modifikovane kičme, i takođe peptidne nukleinske kiseline (PNA), itd.

[0093] Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti obeležene npr. sa radioaktivnim ili fluorescentnim obeleživačem.

[0094] Pronalazak takođe obezbeđuje vektore (kao što su plazmidi) koji sadrže nukleotidne sekvence prema pronalasku (npr. klonirajuće ili ekspresione vektore, kao što su oni pogodni za imunizaciju nukleinskim kiselinama) i ćelije domaćini transformisani sa takvim vektorima.

Baktericidni odgovori

[0095] Poželjni polipetidi prema pronalasku mogu izazvati odgovore antitela koji su baktericidni protiv meningokoka. Baktericidni odgovori antitela su pogodno mereni u miševima i standardni su indikator efikasnosti vakcine (npr. vidi fusnotu 14 ref.37; takođe ref.38).

[0096] Polipetidi prema prvom aspektu pronalasku mogu poželjno izazvati odgovor antitela koji je baktericidan protiv N. meningitidis soja koji eksprimira v2 fHbp sekvencu npr. jednog ili više od sojeva 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013), e32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, c11, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, i/ili L93/4286. Baktericidni odgovori mogu se na primer proceniti protiv var2 soja M2091 (ATCC 13091).

[0097] Poželjni polipetidi prema prvom aspektu pronalaska mogu izazvati antitela u mišu koja su baktericidna protiv soja M2091 u baktericidnom serumskom testu.

[0098] Polipetidi prema drugom aspektu pronalaska mogu poželjno izazvati odgovor antitela koji je baktericidan protiv N.meningitidis soja koji eksprimira v3 fHbp sekvencu npr. jednog ili više od sojeva M1239, 16889, gb355 (=M01-240355), m3369, m3813, ngp165. Baktericidni odgovori mogu na primer biti procenjeni protiv var3 soja M01-240355, koji je Neisseria MLST referentni soj (id 19265 u ref. 39) koji je u potpunosti sekvenciran (videti EMBL ID CP002422 [40])

[0099] Poželjni polipeptidi prema drugom aspektu pronalaska mogu izazvati antitela u mišu koja su baktericidna protiv soja M01-240355 u baktericidnom serumskom testu.

[0100] Na primer, imunogena kompozicija koja sadrži ove polipetide može obezbediti baktericidni serumski titar od ≥1:4 korišćenjem Goldschneider testa sa humanim komplementom [41-43], i/ili obezbeđivanjem baktericidnog serumskog titra od ≥1:128 korišćenjem komplementa bebe zeca.

Imunizacija

[0101] Polipetidi prema pronalasku se mogu koristiti kao aktivni sastojak imunogenih kompozicija, i na taj način pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju (npr. vakcinu) koja sadrži polipetid prema pronalasku.

[0102] Opis takođe obezbeđuje postupak za izazivanje odgovora antitela kod sisara, koji sadrži primenu imunogene kompozicije prema pronalasku na sisara. Odgovor antitela je poželjno zaštitini i/ili baktericidni odgovor antitela. Pronalazak obezbeđuje imunogene kompozicije koje sadrže polipetide prema pronalasku za upotrebu u postupku za izazivanje odgovora antitela kod sisara.

[0103] Otkriće takođe obezbeđuje postupak za zaštitu sisara od infekcije sa Neisseria (npr. meningokoknu), koji sadrži primenu na sisara imunogene kompozicije prema pronalasku.

[0104] Opis takođe obezbeđuje polipetide prema pronalasku za upotrebu kao medikamenti (npr. kao imunogene kompozicije ili kao vakcine) ili kao dijagnostički reagensi. Opis takođe obezbeđuje upotrebu nukelinskih kiselina ili polipetida prema pronalasku u proizvodnji medikamenta za sprečavanje infekcije sa Neisseria (npr. meningokoknu) kod sisara.

[0105] Sisar može poželjno biti čovek. Čovek može biti adult ili, poželjno, dete. Tamo gde je vakcina za profilaktičku upotrebu, čovek je poželjno dete (npr. mlađe dete ili novorođenče); tamo gde je vakcina za terapeutsku upotrebu, čovek je poželjno adult. Vakcina namenjena deci može se takođe primeniti na odrasle npr. da bi se procenila bezbednost, doza, imunogenost, itd.

[0106] Upotrebe i postupci mogu naročito biti korisni za prevenciju/tretiranje bolesti uključujući, ali se ne ograničavajući, meningitis (naročito bakterijski, kao što je meningokokni, meningitis) i bakteremija. Na primer, pogodni su za aktivnu imunizaciju individua protiv invazivne meningokokne bolesti izvane sa N. meningitidis (na primer u serogrupi B).

[0107] Efikasnost terapeutskog tretmana može se testirati praćenjem infekcije sa Neisseria nakon primene kompozicije prema pronalasku. Efikasnost profilaktičkog tretmana može se testirati praćenjem imunih odgovora protiv fHbp nakon primene kompozicije. Imunogenost kompozicija prema pronalasku može se odrediti njihovom primenom na test subjekte (npr. decu starosti 12-16 meseci, ili životinjske modele) i zatim određivanjem standardnih parametara uključujući titre baktericidnih serumskih antitela (SBA) i ELISA (GMT). Ovi imuni odgovori će se generalno određivati oko 4 nedelje nakon primene kompozicije, i biće upoređivani sa vrednostima određenim pre primene kompozicije. SBA povećanje od najmanje 4-puta ili 8-puta je poželjno. Gde je primenjeno više od jedne doze kompozicije, može se uraditi više od jednog određivanja nakon primene.

[0108] Poželjne kompozicije prema pronalasku mogu stvoriti titar antitela u pacijentu koji je superioran u odnosu na kriterijum za seroprotekciju za svaku antigenu komponentu za prihvatljivi procenat humanih subjekata. Antigeni sa povezanim titrom antitela za koju domaćin smatra da su serokonvertovani protiv antigena dobro su poznati, i takvi titri su objavljeni od strane organizacija kao što je WHO. Poželjno više od 80% statistički značajnog uzorka subjekata je serokonvertovan, poželjnije više od 90%, poželjnije više od 93% i najpoželjnije 96-100%.

[0109] Kompozicije prema pronalasku će se generalno primenjivati direktno na pacijenta. Direktna isporuka se može postići parenteralnom injekcijom (npr. potkožno, intraperitonealno, intravenski, intramuskularno, ili u intersticijalni prostor tkiva), ili sa rektalnom, oralnom, vaginalnom, topikalnom, transdermalnom, intranazalnom, okularnom, auralnom, pulmonalnom ili drugom primenom na sluzokožu. Intramuskularna primena u butinu ili nadlakticu je poželjna. Injekcija može biti preko igle (npr. hipodermne igle), ali se alternativno može koristiti primena bez igle. Tipična intramuskularna doza je oko 0.5 ml.

[0110] Pronalazak se može koristiti za izazivanjem sistemskog i/ili mukozalnog imuniteta.

[0111] Doza tretmana može biti raspored sa jednom dozom ili raspored sa više doza. Više doza se može korsititi u rasporedu primarne imunizacije i/ili u rasporedu buster imunizacije. Raspored primarne doze može biti praćen sa rasporedom buster doze. Pogodni vremenski razmak između prajming doze (npr. između 4-16 nedelja), i između prajminga i bustinga, može se rutinski odrediti.

[0112] Imunogena kompozicija prema pronalasku može generalno uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač, koji može biti bilo koja supstanca koja sama po sebi ne indukuje proizvodnju antitela štetnih po pacijenta koji prima kompoziciju, i koja se može primeniti bez nepotrebne toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu uključivati tečnosti kao što je voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Pomoćne supstance, kao što su ovlaživači ili emulgatori, pH puferujuće supstance, i slično, takođe mogu biti prisutni u takvim vehikulumima. Detaljno razmatranje pogodnih nosača je dostupno u ref.44.

[0113] Infekcija sa Neisseria pogađa različite delove tela i tako da kompozicije prema pronalasku mogu biti pripremljene u različitim oblicima. Na primer, kompozicije mogu biti pripremljene kao injektabilne, ili kao tečni rastvori ili suspenzije. Čvrsti oblici pogodni za rastvor, ili suspenziju u, tečnim vehikulumima pre injekcije mogu se takođe pripremiti. Kompozicija se može pripremiti za topikalnu primenu npr. kao mast, krema ili prašak. Kompozicija može biti pripremljena za oralnu primenu npr. kao tableta ili kapsula, ili kao sirup (izborno aromatizovan). Kompozcija se može pripremiti za pulmonalnu primenu npr. kao za inhalaciju, korišćenjem finog praška ili spreja. Kompozicija se može pripremiti kao supozitorija ili pesarija. Kompozicija može biti pripremljena za nazalnu, auralnu ili okularnu primenu npr. kao kapi. Mogu biti najpoželjne kompozicije pogodne za parenteralnu injekciju.

[0114] Kompozicija je poželjno sterilna. Poželjno je bez pirogena. Poželjno je puferovana npr. između pH 6 i pH 8, generalno oko pH 7. Gde kompozicija sadrži so aluminijum hidroksida, poželjno je korišćenje histidin pufera [45]. Kompozicije prema pronalasku mogu biti izotonične u odnosu na ljude.

[0115] Imunogene kompozicije sadrže imunološki efikasnu količinu imunogena, kao i bilo koje druge specifične komponente. Pod ’imunološki efikasnom količinom’, podrazumeva se da je primena te količine na individuu, ili u jednoj dozi ili kao deo serije, efikasna za tretman ili prevenciju. Termin "prevencija" označava da je progresija bolesti smanjena i/ili eliminisana, ili da je eliminisana pojava bolesti. Na primer, imuni sistem subjekta može biti prajmovan (npr. sa vakcinacijom) da bi se inicirao imuni odgovor i suzbila infekcija tako da je eliminisana pojava bolesti. Vakcinisani subjekt može stoga biti inficiran, ali je sposoban da suzbije infekciju u odnosu na kontrolnog subjekta. Ova količina varira od zdravstenog i fizičkog stanja individue koja se tretira, starosti, taksonomske grupe individua koje se tretiraju (npr. ne-humani primat, primat, itd.), kapaciteta imunog sistema individue da sinteiše antitela, stepena željene zaštite, formulacije vakcine, procene medicinske situacije od strane odgovornog lekara, i drugih relevantih faktora. Očekuje se da će količina biti u okviru relativno širokog opsega koji se može odrediti rutinskim studijama. Doza tretmana može biti raspored sa jednom dozom ili raspored sa više doza (npr. uključujući buster doze). Kompozicija se može primeniti zajedno sa drugim imunoregulatornim sredstvima.

[0116] Ađuvanti koji se mogu koristiti u kompozicijama prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na nerastvorljive soli metala, emulzije ulje u vodi (npr. MF59 ili AS03, obe sadrže skvalen), saponine, netokisčne derivate LPS (kao što su monofosforil lipid A ili 3-O-deacilovani MPL), imunostimulatorne oligonukleotide, detoksifikovane bakterijske ADPribozilujuće toksine, mikročestice, lipozome, imidazohinolone, ili njihove smeše. Druge supstance koje deluju kao imunostimulišuća sredstva su opisane u poglavlju 7 ref.46.

[0117] Upotreba aluminijum hidroksid i/ili aluminijum fosfat ađuvanta je naročito poželjna, i polipetidi se generalno apsorbuju na ove soli. Ove soli uključuju oksihidrokside i hidroksifosfate (npr. videti poglavlja 8 & 9 ref. 46). Soli mogu biti u bilo kom pogodnom obliku (npr. gel, kristalni, amorfni, itd).

Dodatne antigene komponente

[0118] Kompozicije prema pronalasku uključuju mutantnu v2 i/ili v3 fHbp sekvencu. Može biti korisno ukoliko kompozicija ne uključuje kompleksne ili nedefinisane smeše antigena npr. može biti poželjno da ne uključuje druge membranske vezikule u kompoziciji. Polipetidi prema pronalasku su poželjno eksprimirani rekombinantno u heterolognom domaćinu i zatim prečišćeni.

[0119] Kao što uključuje fHbp polipetid, kompozicija prema pronalasku može takođe uključivati jedan ili više dodatnih imunogena Neisseria, jer vakcina koja targetira više od jednog imunogena po bakteriji smanjuje mogućnost selekcije odbeglih mutanata. Stoga kompozicija može uključivati drugi polipetid koji, kada je primenjen na sisara, izaziva odgovor antitela koji je baktericidan protiv menigokokusa. Drugi polipetid može biti meningokokni fHbp, ali često neće biti fHbp npr. može biti NHBA sekvenca, NadA sekvenca, itd.

[0120] Bilo koji takav dodatni imunogen Neisseria može biti prisutan kao zasebni polipetid u odnosu na mutantnu v2 ili v3 fHbp prema pronalasku ili može biti prisutan kao fuzioni polipetid sa modifikovanom fHbp. Na primer, fuzija meningokoknog 936 polipetida i fHbp polipetida je poznata [55,56]. Fuzioni proteini koji sadrže SEQ ID NO: 44 i/ili SEQ ID NO: 45 mogu biti naročito poželjni, ozborno gde SEQ ID NO: 44 i/ili 45 je/su modifikovane sa promenama do 5 pojedinačnih aminokiselina (tj. 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačnih aminokiselina) kao što je ovde opisano na drugim mestima.

[0121] Kompozicija prema pronalasku može uključivati NHBA antigen. NHBA antigen je uključen u objavljenoj sekvenci genoma za meningokoknu serogrupu B soj MC58 [47] kao gen NMB2132 (GenBank accession number GI:7227388; SEQ ID NO: 6 ovde). Od tada su publikovane sekvence NHBA antigena iz mnogih sojeva. Na primer, alelni oblici NHBA mogu se videti na Slikama 5 i 15 reference 48, i u primeru 13 i Slici 21 reference 1 (SEQ IDs 3179 do 3184 ovde). Različiti imunogeni fragmenti NHBA antigena su takođe objavljeni. Poželjni 287 antigeni za upotrebu sa pronalaskom sadrže aminokiselinsku sekvencu: (a) koja ima 50% ili više identičnosti (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 6; i/ili (b) sadrži fragment od najmanje ’n’ uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO: 6, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 6. Najkorisniji NHBA antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja, nakon primene na subjekta, mogu se vezati za meningokokni polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 6. Pogodni NHBA antigeni za upotrebu sa pronalaskom mogu izazvati baktericidna antimeningokokalna antitela nakon primene na subjekta.

[0122] Kompoziicja prema pronalasku može uključivati NadA antigen. NadA antigen je uključen u objavljenu sekvencu genoma za meningokoknu serogrupu B soja MC58 [47] kao gen NMB1994 (GenBank accession number GI:7227256; SEQ ID NO: 7 ovde). Sekvence NadA antigena iz mnogih sojeva su od tada publikovane, i aktivnost proteina kao adhezina Neisseria je dobro dokumentovana. Različiti imunogeni fragmenti NadA su takođe objavljeni. Poželjni NadA antigeni za upotrebu sa pronalaskom sadrže aminokiselinsku sekvencu: (a) koja ima 50% ili više identičnosti (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 7; i/ili (b) sadrži fragment od najmanje ’n’ uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO: 7, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 7. Najkorisniji NadA antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja se, nakon primene na subjekta, mogu vezati za meningokokni polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7. Pogodni NadA antigeni za upotrebu sa pronalaskom mogu izazvati baktericidna anti-meningokokna antitela nakon primene na subjekta. SEQ ID NO: 15 je jedan takav fragment.

[0123] Kompozicija prema pronalasku može uključivati NspA antigen. NspA antigen je uključen u objavljenu sekvencu genom za menigokoknu serogrupu B soja MC58 [47] kao gen NMB0663 (GenBank accession number GI:7225888; SEQ ID NO: 8 ovde). Antigen je prethodno poznat iz referenci 49 & 50. Sekvence NspA antigena iz mnogih sojeva su publikovane od tada. Različiti imunogeni fragmenti NspA su takođe objavljeni. Poželjni NspA antigeni za upotrebu prema pronalasku sadrže n aminokiselinsku sekvencu: (a) koja ima 50% ili više identičnosti (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 8; i/ili (b) sadrži fragment od najmanje ’n’ uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO: 8, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 8. Najkorisniji NspA antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja se, nakon primene na subjekta, mogu vezati za meniongokokni polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 8. Pogodni NspA antigeni za upotrebu prema pronalasku mogu izavati baktericidna antimeningokokna antitela nakon primene na subjekta.

[0124] Kompozicije prema pronalasku mogu uključivati meningokokni HmbR antigen. HmbR sekvenca pune dužine uključena je u objavljenu sekvencu genoma za meningokoknu serogrupu B soja MC58 [47] kao gen NMB1668 (SEQ ID NO: 9 ovde). Opis može koristiti polipetid koji sadrži HmbR sekvencu pune dužine, ali će često koristiti polipetid koji sadrži delimičnu HmbR sekvencu. Stoga u nekim primerima izvođenja HmbR sekvenca korišćena prema pronalasku može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje i% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9, gde vrednost i je 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 ili više. U drugim primerima izvođenja HmbR sekvenca korišćena prema pronalasku može sadržati fragment od najmanje j uzastopnih aminokiselina iz SEQ ID NO: 9, gde vrednost j je 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više. U drugim primerima izvođenja HmbR sekvenca korišćena prema pronalasku može sadržati aminokiselinsku sekvencu (i) koja ima najmanje i% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 9 i/ili (ii) sadrži fragment od najmanje j uzastopnih aminokiselina iz SEQ ID NO: 9. Poželjni fragmenti j aminokiselina sadrže epitop iz SEQ ID NO: 9. Takvi epitopei će obično sadržati aminokiseline koje su locirane na površini HmbR. Korisni epitopi uključuju one se aminokiselinama uključenim u vezivanje HmbR sa hemoglobinom, jer antitela koje se vezuju za ove epitope mogu blokirati sposobnost bakterije da se vezuje za hemoglobin domaćina. Toplogija HmbR, i njeni kritični funkcionalni ostaci, istraživani su u referenci 51. Najkorisniji HmbR antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja se, nakon primene na subjekta, mogu vezati za meningokokni polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9. Pogodni HmbR antigeni za upotrebu prema pronalasku mogu izazvati baktericidna anti-meningokokna antitela nakon primene na subjekta.

[0125] Kompozicija prema pronalasku može uključivati NhhA antigen. NhhA antigen je uključen u objavljenu sekvencu genoma za meningokoknu serogrupu B soj MC58 [47] kao gen NMB0992 (GenBank accession number GI:7226232; SEQ ID NO: 10 ovde). Sekvence NhhA antigena iz mnogih sojeva su publikovane od tada npr. ref. 48 & 52, i različiti imunogeni fragmenti NhhA su objavljeni. Takođe je poznat kao Hsf. Poželjni NhhA antigeni za upotrebu sa pronalskom sadrže aminokiselinsku sekvencu: (a) koja ima 50% ili više identičnosti (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 10; i/ili (b) sadrži fragment od najmanje ’n’ uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO: 10, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop od SEQ ID NO: 10. Najkorisniji NhhA antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja se, nakon primene na subjekta, mogu vezati za meningokokni polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10. Pogodni NhhA antigeni za upotrebu prema pronalasku mogu izazvati baktericidna anti-meningokokna antitela nakon primene na subjekta.

[0126] Kompozicija prema pronalasku može uključivati App antigen. App antigen je uključen u objavljenu sekvencu genoma za meningokoknu serogrupu B soja MC58 [47] kao gen NMB1985 (GenBank accession number GI:7227246; SEQ ID NO: 11 ovde). Sekvence App antigena iz mnogih sojeva su publikovane od tada. Različiti imunogeni fragmenti App su takođe objavljeni. Poželjni App antigeni za upotrebu prema pronalasku sadrže aminokiselinsku sekvencu: (a) koja ima 50% ili više identičnosti (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) to SEQ ID NO: 11; i/ili (b) sadrži fragment od najmanje ’n’ uzastopnih aminokiselina of SEQ ID NO: 11, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 11. Najkorisniji App antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja se, nakon primene na subjekta, mogu vezati za meningokokni polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 11. Pogodni App antigeni za upotrebu prema pronalasku mogu izazvati baktericidna anti-meningokokna antitela nakon primene na subjekta.

[0127] Kompozicija prema pronalasku može uključivati Omp85 antigen. Omp85 antigen je bio uključen u objavljenu sekvencu genoma meningokoknu serogrupu B soja MC58 [47] kao gen NMB0182 (GenBank accession number GI:7225401; SEQ ID NO: 12 ovde). Sekvence Omp85 antigena iz mnogih sojeva su publikovane od tada. Dodatne informacije o Omp85 mogu se naći u referencama 53 i 54. Različiti imunogeni fragmenti Omp85 su takođe objavljeni. Poželjni Omp85 antigeni za upotrebu prema pronalasku sadrže aminokiselinsku sekvencu: (a) koja ima 50% ili više identičnosti (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 12; i/ili (b) sadrži fragment od najmanje ’n’ uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO: 12, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 12. Najkorisniji Omp85 antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja se, nakon primene na subjekta, mogu vezati za meningokokni polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 12. Pogodni Omp85 antigeni za upotrebu prema pronalasku mogu izazvati baktericidna anti-meningokokna antitela nakon primene na subjekta.

[0128] Kompozicija prema pronalasku može uključivati 936 antigen. 936 antigen je bio uključen u objavljenu sekvencu genoma meningokoknu serogrupu B soja MC58 [47] kao gen NMB2091 (SEQ ID NO: 13 ovde). Poželjni antigeni za upotrebu prema pronalasku sadrže aminokiselinsku sekvencu: (a) koja ima 50% ili više identičnosti (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 13; i/ili (b) sadrži fragment od najmanje ’n’ uzastopnih aminokiselina of SEQ ID NO: 13, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 13. Najkorisniji 936 antigeni prema pronalasku mogu izazvati antitela koja se, nakon primene na subjekta, mogu vezati za meningokokni polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 13. 936 antigen je dobar fuzioni partner za fHbp (npr. videti reference 55 & 56).

[0129] Kompozicija može sadržati: polipetid koji sadrži SEQ ID NO: 14; polipetid koji sadrži SEQ ID NO: 15; i polipetid prema pronalasku koji sadrži mutantnu fHbp v2 aminokiselinsku sekvencu i SEQ ID NO: 13 (cf. ref.55 & 56).

[0130] Kompozicija može sadržati: polipetid koji sadrži SEQ ID NO: 14; polipetid koji sadrži SEQ ID NO: 15; i polipetid prema pronalasku koji sadrži mutantnu fHbp v3 aminokiselinsku sekvencu i SEQ ID NO: 13 (cf. ref.55 & 56).

[0131] U nekim slučajevima, polipetid prema pronalasku može se kombinovati sa dodatnom meningokoknom fHbp sekvencom. Naročito, v2 polipetid se može kombinovati sa v1 i/ili v3 polipetidom da bi se povećao spektar pokrivenosti sojeva [162]. Stoga kompozicija može sadržati: (i) polipetid prema pronalasku koji sadrži mutantnu fHbp v2 aminokiselinsku sekvencu; i (ii) v1 fHbp polipetid i/ili v3 fHbp polipetid. U drugim primerima izvođenja, polipetid prema pronalasku može sadržati (i) mutantnu fHbp v2 aminokiselinsku sekvencu i (ii) v1 fHbp aminokiselinsku sekvencu i/ili v3 fHbp aminokiselinsku sekvencu. Stoga v1 i/ili v3 sekvence se mogu kombinovati sa mutantnom v2 sekvencom kao zasebni entiteti u kompoziciji, ili unutar fuzionog polipeptida.

[0132] Slično, v3 polipetid se može kombinovati sa v1 i/ili v2 polipetidom da bi se povećao spektar pokrivenosti sojeva [162]. Stoga kompozicija može sadržati: (i) polipetid prema pronalasku koji sadrži mutantnu fHbp v3 aminokiselinsku sekvencu; i (ii) v1 fHbp polipetid i/ili v2 fHbp polipetid. U drugim primerima izvođenja, polipetid prema pronalasku može sadržati (i) mutantnu fHbp v3 aminokiselinsku sekvencu i (ii) v1 fHbp aminokiselinsku sekvencu i/ili v2 fHbp aminokiselinsku sekvencu. Stoga v1 i/ili v2 sekvence se mogu kombinovati sa mutantnom v3 sekvencom kao zasebni entiteti u kompoziciji, ili unutar fuzionog polipeptida.

[0133] Dodatno, mutantni v2 i v3 polipetidi se mogu kombinovati međusobno da bi se povećala pokrivenost sojeva. Stoga kompozicija može sadržati: (i) polipetid prema pronalasku koji sadrži mutantnu fHbp v2 aminokiselinsku sekvencu; (ii) polipetid prema pronalasku koji sadrži mutantnu fHbp v3 aminokiselinsku sekvencu; i (iii) fHbp v1 polipetid. Alternativno, polipetid prema pronalasku može sadržati (i) mutantnu fHbp v2 aminokiselinsku sekvencu (ii) mutantnu v3 fHbp aminokiselinsku sekvencu i (iii) fHbp v1 aminokiselinsku sekvencu. Stoga mutantne v2 i v3 sekvence se mogu kombinovati sa v1 sekvencom kao zasebni entiteti u kompoziciji, ili unutar fuzionog polipetida. v1 sekvenca može biti sekvenca divljeg tipa ili mutantna sekvenca.

[0134] v1 fHbp može sadržati (a) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje k% identičnosti sa SEQ ID NO: 16, i/ili (b) fragment of SEQ ID NO: 16. Informacije o’k’ i fragmentima su date prethodno. Fragment će tipično uključivati najmanje jedan epitop iz SEQ ID NO: 16, i v1 fHbp polipetid će uključivati najmanje jedan epitop koji nije prisutan u v2 ili v3 aminokiselinskoj sekvenci prema pronalasku, tako da antitela izazvana sa v1 fHbp mogu preopznati v1 sojeve.

Idealno, v1 fHbp mogu izazvati antitela koja su baktericidna protiv v1 sojeva npr. protiv soja MC58 (dostupnog od ATCC kao ’BAA-335’). v1 fHbp može uključivati aminokiselinsku mutaciju koja disruptuje njenu sposobnost da se veže za fH.

[0135] v2 fHbp može sadržati (a) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje k% identičnosti sa SEQ ID NO: 5, i/ili (b) fragment od SEQ ID NO: 5. Informacija o ’k’ i fragmenti su dati prethodno. Fragment će tipično uključivati najmanje jedan epitop iz SEQ ID NO: 5, i v2 fHbp polipetid će uključivati najmanje jedan epitop koji nije prisutan u v3 aminokiselinskoj sekvenci prema pronalasku, tako da antitela izazvana sa v2 fHbp mogu prepoznati v2 sojeve. Idealno, v2 fHbp mogu izazvati antitela koja su baktericidna against v2 strains npr. against strain M2091 (ATCC 13091). The v2 fHbp can be a polipetid of the first embodiment.

[0136] v3 fHbp može sadržati (a) aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje k% identičnosti sa SEQ ID NO: 17, i/ili (b) fragment SEQ ID NO: 17. Informacije o ’k’ i fragmentima su date prethodno. Fragment će tipično uključivati najmanje jedan epitop iz SEQ ID NO: 17, i v3 fHbp polipetid će uključivati najmanje jedan epitop koji nije prisutan u v2 aminokiselinskoj sekvenci prema pronalasku, tako da antitela izazvana sa v3 fHbp mogu prepoznati v3 sojeve. Idealno, v3 fHbp mogu izazvati antitela koja su baktericidna protiv v3 sojeva npr. protiv soja M01-240355. v3 fHbp može biti polipetid drugog primera izvođenja.

[0137] Stoga, na primer, opis može obezbediti polipetid koji sadrži, unutar jednog polipetidnog lanca, svaki od: (i) fHbp v1 aminokiselinska sekvenca; (ii) mutantna fHbp v2 aminokiselinska sekvenca; i (iii) mutantna fHbp v3 aminokiselinska sekvenca. Polipetid može, nakon primene na životinju domaćina, izazvati antitela koja se vezuju za svaki od: meningokokni fHbp polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 46; meningokokni fHbp polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4; i meningokokni fHbp polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 40. Sekvenca iz (i) može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje k% identičnosti sa SEQ ID NO: 16. Sekvenca iz (ii) može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje k% identičnosti sa SEQ ID NO: 5, ali se razlikuje od SEQ ID NO: 5 na ostatku S32 po supstituciji S32V i izborno na jednom ili više od sledećih ostataka: V33, L39, L41, F69, V100, 1113, F122, L123, V124, S125, G126, L127, G128, S151, H239, i/ili E240. Sekvenca iz (iii) može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje k% identičnosti sa SEQ ID NO: 17, ali se razlikuje od SEQ ID NO: 17 na ostatku S32 po supstituciji S32V i izborno na jednom ili više od sledećih ostataka: 133, L39, L41, F72, V103, T116, F125, L126, V127, S128, G129, L130, G131, S154, H242, i/ili E243. Poželjno: sekvenca iz (i) sadrži SEQ ID NO: 16, izborno modifikovanu sa promenama do 5 pojedinačnih aminokiselina (tj. 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačne aminokiseline); sekvenca iz (ii) sadrži SEQ ID NO: 45, izborno modifikovanu sa promenama do 5 pojedinačnih aminokiselina (tj. 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačne aminokiseline), uz uslov da takve promene aminokiselina ne vrše reverziju mutacija u ovim sekvencama u odnosu na divlji tip sekvence; i sekvenca iz (iii) sadrži SEQ ID NO: 44, izborno modifikovanu sa promenama do 5 pojedinačnih aminokiselina, uz uslov da takve promene aminokiselina ne vrše reverziju mutacija u ovim sekvencama u odnosu na divlji tip sekvence. Aminokiselinske sekvence (i), (ii) i (iii) mogu se rasporediti u bilo kom redosledu od N- do C-terminusa u polipetidu, ali su poželjno u redosledu (ii), zatim (iii), zatim (i). Na primer, opis obezbeđuje polipetid formule -A-B-C- gde: A sadrži SEQ ID NO: 45, izborno modifikovanu sa do 3 supstitucije pojedinačne aminokiseline; B sadrži SEQ ID NO: 44, izborno modifikovanu sa do 3 supstitucije pojedinačne aminokiseline; i C sadrži SEQ ID NO: 16, izborno modifikovanu sa do 3 supstitucije pojedinačne aminokiseline (npr. supstitucija (supstitucije) da bi se disruptovalo vezivanje sa fH). Poželjno C sadrži SEQ ID NO: 49, gde je ostatak Arg-34 mutiran u Ser kao što je objavljeno za’R41S’ mutaciju u ref.21.

[0138] Naročito poželjan polipetid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47. Ova sekvenca uključuje, od N-terminusa do C-terminusa: mutantnu v2 (SEQ ID NO: 45); mutantnu v3 (SEQ ID NO: 44); i mutantnu v1 (SEQ ID NO: 49). Između ove tri mutantne fHbp sekvence u svakom slučaju postoji linker sekvenca, SEQ ID NO: 50. U jednom slučaju, polipetid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, koja ima metionin na N-terminusu, zatim SEQ ID NO: 37, i zatim SEQ ID NO: 47.

[0139] SEQ ID NO: 47 (zasebno, ili unutar SEQ ID NO: 48) može biti izborno modifikovana sa promenom do 5 poejdinačnih aminokiselina (tj. 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačne aminokiseline), uz uslov da takve promene aminokiselina ne vrše reverziju mutacija u v1, v2, i v3 sekvencama u odnosu na divlji tip sekvence tj. aminokiselinki ostaci V32, R123, V285, R379, i S543 of SEQ ID NO: 47 ne smeju biti mutirani u S32, L123, S285, L379, i R543.

[0140] Mutantna fuzija može idealno izazavati antitela koja se vezuju za svaki od: divlji tip v1 meningokoknog fHbp polipetida koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 46; divlji tip v2 meningokoknog fHbp polipetida koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4; i divlji tip v3 meningokoknog fHbp polipetida koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 40.

[0141] Dodatno polipeptidnim antigenima Neisseria, kompozicija može uključivatiti gene za imunizaciju protiv drugih bolesti ili infekcija. Na primer, kompozicija može uključivati jedan ili više od sledećih dodatnih antigena: - saharidni antigen iz N.meningitidis serogrupe A, C, W135 i/ili Y, kao što je saharid opisan u ref.57 iz serogrupe C (videti takođe ref.58) ili u ref.59.

– saharidni antigen iz Streptokokus pneumoniae [npr. 60, 61, 62].

– antigen iz hepatitis A virusa, kao što je inaktivirani virus [npr.63, 64].

– antigen iz hepatitis B virusa, kao što su natigeni sa površine i/ili jezgra [npr.64, 65].

– antigen difterije, kao što je toksoid difterije [npr. poglavlje 3 ref. 66] npr. CRM197 mutant [npr. 67].

– tetanus antigen, kao što je tetanus toksoid (npr. poglavlje 4 ref.66).

– antigen iz Bordetella pertussis, kao što je pertuzis holotoksin (PT) i filamentozni hemaglutinin (FHA) iz B.pertussis, izborno takođe u kombinaciji sa pertaktinom i/ili aglutinogenima 2 i 3 (npr. ref.68 & 69).

– saharidni antigen iz Haemophilus influenzae B [npr.58].

– polio antigen(i) [npr. 70, 71] kao što je IPV.

– antigeni morbila, zauški i/ili rubeole (npr. poglavlja 9, 10 & 11 ref.66).

– influenca antigen(i) (npr. poglavlje 19 ref. 66), kao što su hemaglutinin i/ili neuraminidaza površinski proteini.

– antigen iz Moraxella catarrhalis [npr. 72].

– proteinski antigen iz Streptokokus agalactiae (grupa B streptokokus) [npr.73, 74].

–saharidni antigen iz Streptokokus agalactiae (grupa B streptokokus).

–antigen iz Streptokokus pyogenes (grupa A streptokokus) [npr. 74, 75, 76].

– antigen iz Staphylokokus aureus [npr.77].

[0142] Kompozicija može sadržati jedan ili više od ovih dodatnih antigena.

[0143] Toksični proteinski antigeni mogu se detoksifikovati gde je neophodno (npr. detoksifikacija pertuzis toksina sa hemijskim i/ili gnetičkim sredstvima [69]).

[0144] Gde je antigen difterije uključen u kompoziciju takođe je poželjno da uključuju tetanus antigen i pertuzis antigene. Slično, gde je uključen tetanus antigen takođe je poželjno da se uključe antigeni difterije i pertuzisa. Slično, gde je uključen pertuzis antigen poželjno je takođe uključiti antigene difterije i tetanusa. DTP kombinacije su stoga poželjne.

[0145] Saharidni antigeni su poželjno u obliku konjugata. Proteini nosača za konjugate su razmatrani detaljnije u nastavku.

[0146] Svaki od antigena u kompoziciji će tipično biti prisutan u koncentraciji od najmanje 1 µg/ml. Generalno, koncentracija bilo kog datog antigena biće dovoljna da izazove imuni odgovor protiv tog antigena.

[0147] Imunogene kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti terapeutski (tj. da bi se tretirala postojeća infekcija) ili profilaktički (tj. da se spreči buduća infekcija).

[0148] Kao alternativa korišćenju proteinskih antigena u imunogenim kompozicijama prema pronalasku, može se koristiti nukleinska kiselina (koja može biti RNK, sao što je samo replicirajuća RNK, ili DNK, kao što je plazmid) koje kodiraju antigen.

[0149] U nekim slučajevima kompozicija prema pronalasku može sadržati dodatno fHbp sekvenci, konjugovane kapsularne saharidne antigene iz 1, 2, 3 ili 4 od meningokoknih serogrupa A, C, W135 i Y. U drugom slučaju, kompozicija prema pronalasku može sadržati dodatno fHbp sekvenci, najmanje jedan konjugovani pneumokokni kapsularni saharidni antigen.

Meningokokus serogrupe Y, W135, C i A

[0150] Sadašnje vakcine serogrupe C (Menjugate™ [57,78], Meningitec™ i NeisVac-C™) uključuju konjugovane saharide. Menjugate™ i Meningitec™ imaju oligosaharidne antigene konjugovane sa CRM197 nosačem, dok Neis- Vac-C™ koriste kompletne polisaharide (de-O-acetilovani) konjugovane sa tetanus toksoid nosačem. Menactra™ vakcina sadrži konjugovane kapsularne saharidne antigene iz svake od serogrupa Y, W135, C i A.

[0151] Kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu uključivati kapsularne saharidne antigene iz jedne ili više od meningokoknih serogrupa Y, W135, C i A, gde su antigeni konjugovani sa nosačkim proteinom (proteinima) i/ili su oligosaharidi. Na primer, kompozicija može uključivati kapsularni saharidni antigen iz: serogrupe C; serogrupa A i C; serogrupa A, C i W135; serogrupa A, C i Y; serogrupa C, W135 i Y; ili iz sve četiri od serogrupa A, C, W135 i Y.

[0152] Tipična količina svakog meningokoknog saharidnog antigena po dozi je između 1µg i 20 µg npr. oko 1 µg, oko 2.5 µg, oko 4 µg, oko 5 µg, ili oko 10 µg (eksprimiranog kao saharid).

[0153] Gde smeša sadrži kapsularne saharide iz obe serogrupe A i C, odnos (tež/tež) MenA saharid:MenC saharid može biti veći od 1 (npr. 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ili veći). Gde smeša sadrži kapsularne saharide iz serogrupe Y i jedne ili obe od serogrupa C i W135, odnos (tež/tež) MenY saharid: MenW135 saharid može biti veći od 1 (npr. 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ili veći) i/ili taj odnos (tež/tež) MenY saharid:MenC saharid može biti manji od 1 (npr. 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, ili manji). Poželjni odnosi (tež/tež) za saharide iz serogrupa A:C:W135:Y su: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; i 2:2:2:1. Poželjni odnosi (tež/tež) za saharide iz serogrupa C:W135:Y su: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; i 2:1:1. Korišćenje suštinski jednake mase svakog saharida je poželjno.

[0154] Kapsularni saharidi se mogu koristiti u obliku oligosaharida. Oni su pogodno formirani fragmentacijom prečišćenog kasularnog polisaharida (npr. hidrolizom), koja će obično biti praćena sa prečišćavanjem fragmenata željene veličine.

[0155] Fragmentacija polisaharida je poželjno izvedena da bi se dobio finalni prosečni stepen polimerizacije (DP) u oligosaharidu od manjen od 30 (npr. između 10 i 20, poželjno oko 10 za serogrupu A; između 15 i 25 za serogrupe W135 i Y, poželjno oko 15-20; između 12 i 22 za serogrupu C; itd.). DP se pogodno može meriti jonoizmenjivačkom hromatografijom ili kolorimetrijskim analizama [79].

[0156] Ukoliko je izvedena hidroliza, hidrolizat će generalno biti takve veličine da bi se uklonili oligosaharidi male dužine [58]. Ovo se može postići na različite načine, kao što je ultrafiltracija praćena sa jonoizmenjivačkom hromatogtrafijom. Oligosaharidi sa stepenom polimerizacije manje od ili jednako oko 6 su poželjno uklonjeni iz serogrupe A, i oni manji od oko 4 su poželjno uklonjeni iz serogrupa W135 i Y.

[0157] Poželjni MenC saharid antigeni su opisani u referenci 78, kao što je korišćeno u Menjugate™.

[0158] Saharidni antigen može biti hemijski modifikovan. Ovo je naročito korisno za smanjenje hidrolize za serogrupu A

[80]. Međe se izvesti de-O-acetilacija meningokoknih saharida. Za oligosaharide, modifikacija se može odigrati pre ili posle depolimerizacije.

[0159] Gde kompozicija prema pronalasku uključuje MenA saharidni antigen, antigen je poželjno modifikovani saharid u kojem je jedna ili više od hidroksil grupa na nativnom saharidu zamenjena sa blokirajućom grupom [80]. Ova modifikacija poboljšava rezistenciju na hidrolizu.

Kovalentna konjugacija

[0160] Kapsularni saharidi u kompozicijama prema pronalasku će obično biti konjugovani sa proteinima nosačima. Generalno, konjugacija poboljšava imunogenost saharida jer ih konvertuje iz T-nezavisnih antigena u T-zavisne antigene, čime se omogućava prajming za imunološku memoriju. Konjugacija je naročito korisna za pedijatrijske vakcine i dobro je poznata tehnika.

[0161] Tipični nosački proteini su bakterijski toksini, kao što su difterija ili tetanus toksini, ili toksoidi ili njihovi mutanti. CRM197 difterija toksin mutant [81] je koristan, i nosač je u PREVNAR™ proizvodu. Drugi pogodni nosački proteini uključuju proteinski kompleks spoljne membrane N.meningitidis [82], sintetičke peptide [83,84], proteine toplotnog šoka [85,86], pertuzis proteine [87,88], citokine [89], limfokine [89], hormone [89], faktore rasta [89], veštačke proteine koji sadrže više humanih CD4+ T ćelijskih epitopa iz različith patogenizvedenih antigena [90] kao što su N19 [91], protein D iz H.influenzae [92-94], pneumolizin [95] ili njegovi netoksični derivati [96], pneumokokni površinski protein PspA [97], proteini za preuzimanje gvožđa [98], toksin A ili B iz C.difficile [99], rekombinantni P.aeruginosa egzoprotein A (rEPA) [100], itd.

[0162] Bilo koja pogodna reakcija konjugacije se može koristiti, sa bilo kojim pogodnim linkerom gde je neophodno.

[0163] Saharid će biti tipično aktiviran ili funkcionalizovan pre konjugacije. Aktivacija može uključivati, na primer, cijanilacione reagense kao što je CDAP (npr. 1-cijano-4-dimetilamino pridinijum tetrafluoroborat [101,102,itd.]). Druge pogodne tehnike koriste karbodiimide, hidrazide, aktivne estre, norboran, p-nitrobenzojevu kiselinu, N-hidroksisukcinimid, S-NHS, EDC, TSTU, itd.

[0164] Veze preko linker grupe mogu se napraviti korišćenjem bilo koje poznate procedure, na primer, procedura opisanih u referencama 103 i 104. Jedan tip veza uključuje redukcionu aminaciju polisaharida, kuplovanje rezultujuće amino grupe sa krajem linker grupe adipinske grupe, i zatim kuplovanjem proteina sa drugim krajem linker grupe adipinske kiseline [105,106]. Drugi linkeri uključuju B-propionamido [107], nitrofenil-etilamin [108], haloacil halide [109], glikozidne veze [110], 6-aminoheksansku kiselinu [111], ADH [112], C4 do C12 delove [113] itd. Kao alternativa korišćenju linkera, može se koristiti direktna veza. Direktne veze sa proteinom mogu sadržati oksidaciju polisaharida praćenu reduktivnom aminacijom sa proteinom, kao što je opisano u, na primer, referencama 114 i 115.

[0165] Proces koji uključuje introdukciju amino grupa u saharid (npr. zamenom terminalnih =O grupa sa -NH2) praćeno sa derivatizacijom sa adipinskim diestrom (npr. N-hidroksisukcinimido diestar adipinske kiseline) i reakcija sa nosačkim proteinom je poželjna. Druga poželjna reakcija koristi CDAP aktivaciju sa protein D nosačem npr. za MenA ili MenC.

Vezikule spoljne membrane (OMV)

[0166] Neke kompozicije prema pronalasku ne moraju uključivati kompleks ili nedefinisane smeše antigena, koji su tipične karakteristike OMV. Međutim, pronalazak se može koristiti zajedno sa OMVs, jer je nađeno da fHbp poboljšava njihovu efikasnost [4], naročito prekomernom ekspresijom polipetida prema pronalasku u sojevima korišćenim za pripremu OMV. Videti takođe u nastavku.

[0167] Ovaj pristup se može koristiti generalno da se poboljšaju preparati mikrovezikule N.meningitidis serogrupe B [116], ’nativni OMVs’ [117], vezikule ili vezikule spoljne membrane [npr. ref. 118 do 123, itd.]. One se mogu pripremiti od bakterija koje su gentički manipulisane [124-127] npr. da se poveća imunogenost (npr. hiper-ekspresija imunogena), da bi se smanjila toksičnost, da bi se inhibirala sinteza kapsularnog polisaharida, da bi se nishodno regulisala PorA ekspresija, itd. One se mogu pripremiti iz sojeva sa hipervezikulama [128-131]. Mogu se uključiti vezikule iz ne-patogene Neisseria [132]. OMVs se mogu pripremiti bez upotrebe deterdženata [133,134]. One mogu eksprimirati ne-Neisseria proteine na njihovoj površini [135]. One mogu biti LPS-depletirane. One mogu biti pomešane sa rekombinantnim antigenima [118,136]. Vezikule iz bakterija sa različitim subtipovima proteina klase I spoljne membrane mogu se koristiti npr. šest različitih subtipova [137,138] korišćenjem dve različite gentički konstruisane populacije vezikula gde svaka prikazuje tri subtipa, ili devet različtih subtipova korišćenjem tri različite genetički konstruisane populacije vezikula pri čemu svaka prikazuje tri subtipa, itd. Korisni subtipovi uključuju: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1; P1.18-1,3,6.

Ćelije domaćini

[0168] Pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transfektovanu sa plazmidom koji kodira mutantni v2 ili v3 polipetid prema pronalasku. Kada je ćelija domaćin bakterija, može biti meningokokus ili E.coli. Ćelija domaćin može konstitutivno eksprimirati polipetid, ali u nekim slučajevima ekspresija može biti pod kontrolom inducibilnog promotora. Ćelija domaćin može hiper-eksprimirati polipetid (cf. ref.139). Ekspresija polipetida idealno nije fazno varijabilna.

[0169] Pronalazak takođe obezbeđuje vezikule spoljne membrane pripremljen od bakterije prema pronalasku (naročito iz meningokokusa). Opis može takođe obezbediti proces za proizvodnju vezikula iz bakterije prema pronalasku. Vezikule pripremljene iz ovih sojeva poželjno uključuju polipetid prema pronalasku, koji treba da bude u imunoprihvatljivom obliku u vezikulama tj. antielo koje se može vezati za prečišćen polipetid prema pronalasku treba takođe da bude sposobno da se vezuje za polipetid koji je prisutan u vezikulama.

[0170] Ove vezikule spoljne membrane uključuju bilo koju proteolipozomnu vezikulu dobijenu disrupcijom ili egzocitozom iz meningokokne spoljne membrane da bi se od nje formirale vezikule koje uključuju proteinske komponente spoljne membrane. Stoga termin uključuje OMVs (nekada označene kao ’vezikule’), mikovezikule (MVs [116]) i ’nativne OMVs’ (’NOMVs’ [117]).

[0171] MVs i NOMVs prirodne membranske vezikule koje se spontano formiraju tokom rasta bakterije i oslobađaju se u medijum kulture. MVs se mogu dobiti kultivisanjem Neisseria u medijumu kulture sa buljonom, odvajanjem celih ćelija od manjih MVs u medijumu kulture sa buljonom (npr. filtracijom ili sa centrifugiranjem na maloj brzini da bi se peletirale samo ćelije ali ne i manje vezikule), i zatim sakupljanjem MVs iz ćeloijski depletiranog medijuma (npr. filtracijom, diferencijalnim taloženjem ili agregacijom MVs, centrifugiranjem na velikoj brzini da bi se peletirale MVs). Sojevi za upotrebu u proizvodnji MVs genralno se mogu izabrati na osnovu količine MVs proizvedenih u kulturi npr. ref. 130 & 131 opisuju Neisseria sa visokom proizvodnjom MV.

[0172] OMVs su pripremljene veštački iz bakterija, i mogu se pripremiti korišćenjem tretmana deterdžentom (npr. sa dezoksiholatom), ili načinima bez deterdženta (npr. videti referencu 134). Tehnike za formiranje OMVs uključuju tretiranje bakterija sa deterdženmtom soli žučne kiseline (npr. soli litoholinske kiseline, henodezoksiholinske kiseline, ursodeoksiholinske kiseline, dezoksiholne kiseline, holinske kiseline, ursoholinske kiseline, itd., sa tim da je poželjna natrijum dezoksiholat [140 & 141] za tretiranje Neisseria) na pH dovoljno visokoj da se ne istaloži deterdžent [142]. Druge tehnike mogu se izvesti suštinski u odsustvu deterdženta [134] korišćenjem tehnika kao što su sonikacija, homogenizacija, mikrofluidizacija, kavitacija, osmotski šok, mlevenje, fransucka presa, blendiranje, itd. Postupci koji ne koriste ili korite malo deterdženta mogu zadržati korisne antigene kao što su NspA i fHbp [134]. Stoga postupak može koristiti OMV ekstrakcioni pufer sa oko 0.5% deozksiholata ili manje npr. oko 0.2%, oko 0.1%, <0.05% ili nula.

[0173] Koristan proces za pripremu OMV je opisan u referenci 143 i uključuje ultrafiltraciju na sirovim OMVs, pre nego centrifugiranje na velikoj brzini. Proces može uključiti korak ultracentrifugiranja nakon ultrafiltracije. OMVs se takođe mogu prečistiti korišćenjem procesa filtracije na osnovu veličine u dva stadijuma opisanog u ref.154.

[0174] Vezikule za upotrebu prema pronalasku se mogu pripremiti iz bilo kog meningokoknog soja. Vezikule će obično biti iz serogrupe B soja, ali je moguće da se pripreme iz serogrupa različitih od B (npr. referenca 142 opisuje proces za serogrupu A), kao što su A, C, W135 ili Y. Soj može biti bilo kog serotipa (npr.1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, itd.), bilo koji serosubtip, i bilo koji imunotip (npr. L1; L2; L3; L3,3,7; L10; itd.). Meningokoke mogu biti iz bilo koje pogodne linije, uključujući hiperinvazivne i hipervirulentne linije npr. bilo koje od sledećih hipervirulentnih linija: subgrupa I; subgrupa III; subgrupa IV-1; ET-5 kompleks; ET-37 kompleks; A4 klaster; linija 3.

[0175] Ćelija domaćin prema pronalasku može, dodatno kodiranju polipetida prema pronalasku, imati jednu ili više dodatnih modifikacija. Na primer, one mogu imati modifikovani fur gen [144]. Ekspresija nspA može biti ushodno reguilisana sa istovremenim porA i cps nokautom. Dodatni nokaut mutanti N.meningitidis za proizvodnju OMV su opisani npr. u referenci 150. Referenca 145 opisuje konstrukciju vezikula iz sojeva modifikovanih da eksprimiraju šest različitih PorA subtipova. Može se takođe koristiti mutantna Neisseria sa niskim nivoima endotoksina, postignutim sa nokautom enzima uključenih u biosintezu LPS [146,147]. Prema pronalasku se može koristiti mutantna Neisseria konstruisana da smanji ili isključi ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u davanje toksičnosti lipid A delu LPS, naročito Lpxl1 gena [148]. Slično, prema pronalasku se može koristiti mutantna Neisseria konstruisana da smanji ili isključi ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u sintezu ili eksport kapsularnog polisaharida, naročito synX i/ili ctrA gena. Svi ovi ili drugi mutanti mogu se koristiti sa pronalaskom.

[0176] Stoga soj korišćen prema pronalsku može na primer eksprimirati više od jednog PorA subtipa. 6-valentni i 9-valentni PorA sojevi su prethodno konstruisani. Soj može eksprimirati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 PorA subtipova: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; PI.7-1,1 i/ili PI.18-1,3,6. Alternativno, soj može biti nishodno regulisan u odnosu na PorA ekspresiju npr. in kojem je količina PorA smanjena najmanje 20% (npr. ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95%, itd.), ili čak je izbačena, u odnosu na nivoe kod divljeg tipa (npr. u odnosu na soj H44/76).

[0177] U nekim slučajevima soj može hiper eksprimirati (u odnosu na odgovarajući soj divljeg tipa) određene proteine. Na primer, sojevi mogu hiper eksprimirati NspA, protein 287 [118], fHbp [139] (uključujući fHbp prema pronalasku), TbpA i/ili TbpB [136], Cu,Zn-superoksid dismutazu, HmbR, itd.

[0178] Gen koji kodira polipetid prema pronalasku može biti integrisan u bakterijski hromozom ili može biti prisutan u epizomalnom obliku npr. unutar plazmida.

[0179] Pogodno za proizvodnju vezikula, meningokokus može biti genetički konstruisan da bi se obezbedilo da ekspresija polipetida nije podložna faznoj varijaciji. Postupci za smanjenje ili eliminisanje fazne varijabilnosti genske ekspresije kod meningokokusa su opisni u referenci 149. Na primer, gene može biti stavljen pod kontrolu konstitutivnog ili inducibilnog promotora, ili uklanjanjem ili zamenom DNK motiva koji je odgovoran za njegovu faznu varijabilnost.

[0180] U nekim slučajevima soj može uključivati jedan ili više od nokaut i/ili hiper ekspresionih mutacija opisanih u referencama 122, 124, 128, i 150. Na primer, prateći uputstva i nomenklaturu u ova četiri dokumenta, korisni geni za nishodnu regulaciju i/ili nokaut uključuju: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, i/ili TbpB; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, i/ili TbpB ; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, i/ili TbpB; ili (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX i/ili SynC.

[0181] Gde je korišćen mutantni soj, u nekim slučajevima on može imati jednu ili više, ili sve, od sledećih karaakteristika: (i) nishodno regulisan ili nokautiran LgtB i/ili GalE da bi se skratio meningokokni LOS; (ii) ushodno regulisani TbpA; (iii) ushodno regulisani NhhA; (iv) ushodno regulisani Omp85; (v) ushodno regulisani LbpA; (vi) ushodno regulisani NspA; (vii) nokautirani PorA; (viii) nishodno regulisani ili nokautirani FrpB; (ix) nishodno regulisani ili nokautirani Opa; (x) nishodno regulisani ili nokautirani Opc; (xii) deletirani cps genski kompleks. Skraćeni LOS može biti onaj koji ne uključuje sialil-lakto-N-neotetraoza epitop npr. on može biti galaktoza-deficijentni LOS. LOS može nedostajati α lanac.

[0182] U zavisnosti od meningokoknog soja korišćenog za pripremanje vezikula, oni mogu ili ne moraju uključivati nativni fHbp antigen soja [151].

[0183] U jednom poželjnom slučaju, meningokokus ne eksprimira funkcionalni MltA protein. Kao što je razmatrano u ref. 152 & 153, nokaut MltA (membranski-vezana litička transgllikozilaza, takođe poznata kao GNA33) u meningokokusu obezbeđuje bakterije koje spontano oslobađaju velike količine membranskih vezikula u medijum kulture, iz koje se mogu lako prečistiti. Na primer, vezikule se mogu prečistii korišćenjem procesa filtracije na osnovu veličine iz dva koraka iz ref. 154, koji sadrži: (i) prvi korak filtracije u kojem su vezikule izdvojene iz bakterija na osnovu njihovih različitih veličina, sa vezikulama koje prelaze u filtrat; i (ii) drugi korak filtracije u kojem su vezikule zadržane u retentatu. MltA mutacija (nishodno regulisana ili nokaut) je korišćena u ’GMMA’ vakcinama [155], i može se pogodno kombinovati sa dodatnom nishodnom regulacijom ili nokautom naročito najmanje jednog gena uključenog u stvaranju toksičnosti kod lipid A dela LPS, naročtio lpxl1 i/ili najmanje jednog gena uključenog u sintezu ili eksport kapsularnog polisaharida, naročito synX i/ili ctrA gena. GMMA (genealizovani moduli za mebranske antigene) su genetički detoksifikovani OMV koji su proizvedeni iz meningokoknih sojeva koji su konstruisani da oslobode GMMA sa smanjenom reaktivnošću i povećanom imunogenošću. GMMA indukuju manje proinflamatornih citokina od OMV kada su testirani u testu aktivacije monocita (MAT).

[0184] Poželjni meningokokni soj za ’GMMA’ vakcinu korišćenjem ovog pristupa može eksprimirati mutantnu v2 fHbp i/ili mutantnu v3 fHbp prema pronalasku, i ekspresija može biti vođena jakim promotorima. Vezikule oslobođene od strane ovog soja mogu uključivati mutantne v2 i/ili v3 fHbp proteine u imunogenom obliku, i primena vezikula može obezbediti odgovor baktericidnih antitela kao što je razmatrano u referenci 155. Soj može takođe eksprimirati v1 fHbp, ili v1 fHbp može umesto toga biti obezbeđen kao zasebni rekombinantni protein u rastvorljivom obliku (i v1 fHbp može biti divljeg tipa ili mutantna sekvenca npr. mutirana da disruptuje njegovu sposobnost da se vezuje za fH, kao što je prethodno razmatrano). Pronalazak može obezbediti takve sojeve, i može takođe obezbediti vezikule koje ovi sojevi oslobađaju npr. kao što su prečišćeni iz medijuma kulture nakon rasta sojeva. Poželjni v2 mutant za ekspresiju u ovim sojevima ima mutaciju na S32V i dodatno L123 kao što je ovde razmatrano, i poželjna v3 mutant za ekspresiju u ovim sojevima ima mutaciju na S32 i dodatno L126 kao što je ovde razmatrano. Stoga vezikule pripremljene od meningokoka koji eksprimiraju ove v2 i v3 mutantne fHbp sekvence su naročito poželjni imunogeni za upotrebe u vakcinama prema pronalasku. Korisne v2 sekvence divljeg tipa za mutagenezu na ovaj način mogu sadržati SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 (sadrži ΔG iz SEQ ID NO: 55), i korisna v3 sekvenca divljeg tipa za mutagenezu na ovaj način može sadržati SEQ ID NO: 52.

[0185] Korisni promotori za upotrebu u rakvim sojevima uključuju one opisane u referencama 156 i 157. Na primer, promotor može biti: (a) promotor iz porin gena, poželjno porA ili porB, naročito iz N.meningitidis; ili (b) rRNK genski promotor (kao što je 16S rRNK gen), naročito iz N.meningitidis. Gde je korišćen meningokokni porin promotor, poželjno je iz porA, i još specifičnije -10 region iz meningokoknog porA genskog promotora, i/ili -35 region iz meningokoknog porA genskog promotora (poželjno gde -10 region i -35 region su razdvojeni sa međusekvencom od 12-20 nukleotida, i gde međusekvenca ili ne sadrži poli-G sekvencu ili uključuje poli-G sekvencu koja nemsa više od osam uzastopnih G nukleotida). Gde je korišćen rRNK genski promotor, on može sadržati specifičnije (i) -10 region iz meningokoknog rRNK genskog promotora i/ili (ii) -35 region iz meningokoknog rRNK genskog promotora. Takođe je moguće koristiti hibrid (a) i (b), Na primer da bi se imao -10 region iz porA promotora i -35 region iz rRNK promotor (koji može biti konsenzus -35 region). Korisni promotor može stoga biti promotor koji uključuje ili (i) -10 region iz (naročito meningokoknog) rRNK gena i -35 region iz (naročito meningokoknog) porA gena, ili (ii) -10 region iz (naročito meningokoknog) porA gena i -35 region iz (naročito meningokoknog) rRNK gena.

[0186] Ukoiko je LOS prisutan u vezikuli moguće je tretirati vezikulu tako da veže svoj LOS i proteinske komponente ("intra-vezikularna" konjugacija [150]).

Opšte

[0187] Termin "sadrži" obuhvata "uključuje" kao i "sastoji se" npr. kompozicija "sadrži" X može se sadržati iskljčivo od X ili može uključivati nešto dodatno npr. X Y. Reference na "sadrži " (ili "koji sadrži", itd.) mogu biti izborno zamenjene referencama " sastoji se" (ili " sastoji se od’, itd.). termin "suštinski se sastoji’ ograničava obim patentnog zahteva specifikovane materijale ili korake "i one koji materijalno ne utiču na osnovne i nove karakteristike" pronalaska za koji se traži zaštita.

[0188] Termin "oko" u odnosu na numeričku vrednost x je izborni i označava, na primer, x±10%.

[0189] Reč "suštinski" ne isključuje "kompletno" npr. kompozicija koja je "suštinski bez" Y može biti kompletno bez Y. Gde je neophodno, reč "suštnski" se može izostaviti iz definicije prema pronalasku.

[0190] "Identičnost sekvence" se može odrediti Smith-Waterman algoritmom homologe pretrage kao što je implementiran u MPSRCH programu (Oxford Molecular), korišćenjem affine gap search sa parameterima gap open penalty=12 i gap extension penalty=1, ali je poželjno određen sa Needleman-Wunsch algoritmom globalnog poravnanja [158], korišćenjem podrazumevanih parametara (npr. sa Gap opening penalty = 10.0, i sa Gap extension penalty = 0.5, korišćenjem EBLOSUM62 skoring matriksa). Ovaj algoritam je pogodno implementiran u needle alat u EMBOSS paketu [159]. Gde se prijava odnosi na identičnosi sekvence sa određenom SEQ ID, identičnost treba izračunati u celoj dužini te SEQ ID.

[0191] Termim "fragment" u odnosu na polipetidne sekvence označava da je polipetid deo proteina pune dužine. Takvi fragmenti mogu posedovati kvalitativnu biološku aktivnost zajedničku sa proteinom pune dužine, na primer, fragment može sadržati ili kodirati jedan ili više epitopa, kao što su imunodominantni epitopei, koji omogućavaju podizanje sličnog imunog odgovora na fragment kao na sekvencu pune dužine. Polipetidni fragmenti generalno imaju amino (N) terminalni deo i/ili karboksi (C) terminalnmi deo deletiran u poređenju sa nativnim proteinom, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca fragmenta identična aminokiselinskoj sekvenci nativnog proteina. Polipetidni fragmenti mogu sadržati, na primer: oko 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 uzatopnih aminokiselina, uključujući sve celobrojne vrednosti između, referentne polipetidne sekvence, na primer između 50 i 260, 50 i 255, 50 i 250, 50 i 200, 50 i 150 uzastopnih aminokiselina referentne polipetidne sekvence. Termin fragment eksplicitno isključuje fHbp polipetide pune dužine i njihove zrele lipoproteine.

[0192] Po serogrupama, meningokokna klasifikacija uključuje serotip, serosubtip i zatim imunotip, i standardna nomenklatura navodi serogrupe, serotip, serosubtip, i imunotip, svaki razdvojen sa zarezom npr. B:4:P1.15:L3,7,9. Unutar serogrupe B, neke linije izazivaju često bolest (hiperinvazivne), neke linije izazivaju teže oblike bolesti od drugih (hipervirulentne), i druge retko uopšte izazivaju bolest. Sedam hipervirulentnih linija je prepoznato, odnosno subgrupe I, III i IV-1, ET-5 kompleks, ET-37 kompleks, A4 klaster i linija 3. One su definisane sa elektroforezom multilokusnih enzima (MLEE), ali je takođe korišćena tipizacija multilokusne sekvence (MLST) za klasifikaciju meningokoka. Četiri glavna hipervirulentna klastera su ST32, ST44, ST8 i ST11 kompleksi.

[0193] Generalno, opis ne obuhvata različite fHbp sekvence specifično opisane u referencama 2, 3, 5, 6, 7, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, i 167.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0194]

Slika 1 prikazuje različitu osetljivost fHbp varijanti na isecanje himotripsinom. Strelica prikazuje položaj fHbp proteina pune dužine.

Slika 2 prikazuje western blot analizu v2 mutanatna. Staze su: (1 & 2) Rekombinantni prečiđženi v2 divlji tip; (4) lizat v2 divljeg tipa; (5) mutantna #1; (6) mutantna #2; (7) mutantna #4; (8) mutantna #5; (9) mutantna #7; (10) mutantna #8; (11) mutantna #12; (12) mutantna #14 (13) mutantna #15; (14) fHbp var2 NΔG-trx kontrola tj. v2 protein gde je N-terminalna sekvenca GPDSDRLQQRR (SEQ ID NO: 37) zamenjena sa GSKDISS (SEQ ID NO: 38). Staze 2-14 uključuju himotripsin. M je molekulski marker.

Slika 3 prikazuje dodatnu western blot analizu v2 mutanata. Staze su: (1&2) mutantna #3; (3&4) mutantna #6; (5&6) mutantna #9; (7&8) mutantna #10; (9&10) mutantna #13; (11&12) Δgono; (13&14) v2 divlji tip; (15&16) mutantna #22. Neparne staze su za proteine koji su inkubirani bez himotripsina, dok su parne staze bile za proteine inkubirane sa himotripsinom.’Δgono’ protein je rekombinantni v2 gde je N-terminalna sekvenca (SEQ ID NO: 37) uklonjena.

Slika 4 prikazuje dodatnu western blot analizu v2 mutanata. Staze su: (1&2) mutantna #11; (3&4) N-trx; (5-7) mutantna #19; (8&9) mutantna #20; (10&11) mutantna #21. Staze 2, 4, 7, 9 i 11 su proteini koi su bili inkubirani sa himotripsinom, dok druge staze nisu imale himotripsin.’N-trx’ protein je rekombinantni v2 gde je N-terminalna sekvenca (SEQ ID NO: 37) zamenjena sa SEQ ID NO: 39.

Slika 5 prikazuje DSC rezultate za divlji tip i S58V/L149R mutant v2 fHbp. C-terminalni domen nije bio pogođen mutacijom, ali je TmN-terminalnog domena povećana za >20°C (obeleženo sa strelicom). Y-osa prikazuje Cp (kcal/mol/°C), i x-osa prikazuje temperaturu (°C).

Slika 6 prikazuje SPR odgovor divljeg tipa (puna) i mutanta (isprekidana) v2 fHbp.

Slika 7 prikazuje SPR odgovor v3 fHbp, ili kao divlji tip (vrh) ili sa različitim mutacijama.

Slika 8 prikazuje DSC rezultate za trostruki fuzioni protein iz SEQ ID NO: 48. Ose su kao na Sl.

5.

NAČINI IZVOĐENJA PRONALASKA

fHbp mutacije

[0195] v2 fHbp je prepoznata kao nestabilna. Da bi se analizirali strukturni razlozi u osnovi ove neželjene osobine, uz osvrt na konstruisanje sekvence da bi se poboljšala stabilnost, pronalazači su analizirali poravnanja sekvence i 3D strukture fHbp polipetida. Jedna oblast od naročitog interesa bio je strukturni interfejs između N-terminalnih i C-terminalnih domen [168].

[0196] Pronalazači su identifikovali mutacije objašnjene u Tabeli 1. Tri od identifikovanih položaja za mutaciju preklapaju se sa referencama 24 i 25, ali pronalazak ne obuhvata polipetide objavljene u prethodnoj tehnici tj. gde polipetidi uključuju supstitucije samo na ovim položajima sa alaninom. Na primer, opis opisuje polipetide gde E240 može biti susptituisan sa histidinom da bi se poklopio sa v1, i idealno je uparen sa supstitucijom na ostatku H239 (mutanti #1 i #11). Slično, ukoliko je F122 supstituisan onda je poželjno uparen sa supstitucijom na S151, i sa cisteinom da bi se dozvolilo formiranje disulfidnog mosta (mutant #10). Takođe, ukoliko L123 je supstituisan onda može biti supstituisan sa argininom (pre nego alaninom), ili može biti uparen sa supstitucijom na drugim ostacima npr. na S32 (videti mutant #3), na S125 (videti mutant #20 i #22), ili sa supstitucijom na ostacima 124-128 (videti mutant #12).

Studije stabilnosti

[0197] Nestabilni proteini imaju tendenciju da budu manje spakovani i iz tog razloga skloniji isecanju i degradaciji sa proteazama. Slika 1 prikazuje da je v2 fHbp osetljivija na degradaciju sa himotripsinom od v1 i v3, i stoga se ovaj test može koristiti da se proceni stabilnost mutantnih proteina.

[0198] Za Sliku 1, divlji tip fHbp v1, v2 i v3 su pripremljeni na 0.5 µg/mL u 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8. Himotripsin je dodat na 1:100 (tež/tež) odnosu. Uzorci su inkubirani na 24°C, 50 mL zapremine, bez šejkiranja. Uzorci su ekstrahovani i ključall su 0, 1, 3, ili 6 časova; zatim su pušteni na 12% bis-Tris gel (MES pufer). Leva staza, označena *, označava uzorak inkubiran 6 časova bez proteaze. ;[0199] Ćelijski lizati E. coli koji eksprimiraju rekombinatne proteine inkubirani su sa 1:100 tež/tež odnosom himotripsina 3 časa na 25 °C. Obrazac degradacije je anliziran sa Western blotingom nakon inkubacije sa imunim poliklonskim serumom izazvanim kod zeca protiv sve tri fHbp varijante. Prisustvo proizvoda isecanja na manjoj prividnoj molekulskoj težini (Slike 2-4) je interpretirano kao indikacija nestabilnosti, dok je perzistentnost trake koja odgovara prividnoj MW od -30 kDa interpretirano kao povećana stabilnost. Mutantni #1-6, #12 i #22 su svi pokazali povećanu rezistenciju na cepanje himotripsinom u poređenju sadivljim tipom v2. ;[0200] DSC ja korišćena kao nezavisni pristup da bi se procenili efekti mutacija na stabilnost prečišćenih rekombinantnih fHbp v2 proteina. Tm(temperatura topljenja) merena sa DSC odgovara temperaturi na kojoj je analizirani protein 50% u spakovanom stanju i 50% u raspakovanom stanju. Promene koje stabilizuju konformaciju proteina povećaće Tm, dok će destabilizujuće promene sniziti Tm. Kao što se vidi na Slici 3D ref.24, DSC profil divljeg tipa v2 fHbp pokazuje dve Tmvrednosti: Tm1na ∼40°C, koja odgovara temperaturi topljenja N-terminalnog domena, i Tm2na ∼80°C koja odgovara temperaturi topljenja C-terminalnog domena. Vrednosti Tm1i Tm2za analizirane mutante su prikazane u Tabeli 1. Mutanti #2, #4, #5, #12, #19 i #21 pokazali su povećanu TmN-terminalnog domena u odnosu na protein divljeg tipa, i ovaj efekat je izraženiji za mutante #2, #4 i #12. ;[0201] Ekskluziona hromatografija (SEC) je korišćena za procenu procenta monomernog proteina, i rezultati su takođe prikazani u Tabeli 1. ;;Mutanti #2, #3, i #4 ;[0202] Mutantni #3 (grupa 2B) dali najbolje ukupne rezultate u studijama stabilnosti v2. Ovaj protein (SEQ ID NO: 20) uključuje mutacije na Ser-58 (S32 in SEQ ID NO: 5) i Leu-149 (L123 in SEQ ID NO: 5), sa supstitucijama sa Val i Arg, respektivno. Mutantni v2 protein (SEQ ID NO: 20, koji sadrži SEQ ID NO: 45) analiziran je sa DSC i, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa, Tmnjenog N-terminalnog domena je >20°C veća (Slika 5). ;[0203] U analizi baktericidnog seruma ovaj v2 mutant je mogao biti u kompeticiji za vezivanje humanih antitela koja su izazvana korišćenjem v2 sekvence divljeg tipa. ;[0204] Iako su S58V i L149R mutacije introdukovane da bi se poboljšala stabilnost, i zaista su postigle ovaj cilj, Slika 6 pokazuje da mutantni v2 polipetid (tačkasta linija) izmenađujuće je pokazao veoma smanjeno vezivanje sa fH u poređenju sa v2 sekvencom divljeg tipa (puna linija) kada je mereno rezonancom površinskog plazmona protiv imobilisane fH. S58V mutacija sama po sebi je imala mali uticaj na fH vezivanje, i S58V/L149R dvostruki mutantn je pokazao veće vezivanje fH od fHbp koji nosi samo L149R mutant. ;[0205] Kada je mutant #3 dodatno kombinovan sa’E313A’ mutacijom u v2 postojao je kompletan gubitak fH vezivanja kao što je procenjeno sa SPR. ;[0206] Ekvivalentne mutacije su introdukovane u v3 sekvencu (SEQ ID NO: 17), da bi se dobila v3 mutantna SEQ ID NO: 44. Efekti pojedinačnih S58V i L149R mutacija na fH vezivanje su proučavani u v3 (tj. v3 ekvivalentima v2 mutanata #2 i #4). Stoga, numerisanjem u skladu sa SEQ ID NO: 17, mutacija S32V ili L126R je introdukovana u v3 sekvencu. Ova dva mitanta su poređena sa dve različite v3 sekvence divljeg tipa, i takođe se ’E313A’ mutantom za koji je poznato da disruptuje fH vezivanje u v3 [23]. ;[0207] Kao što je prikazano na Slici 7, divlji tip v3 vezuje fH (dve gornje linije). S58V mutacija, koja je dizajnirana da se poboljša stabilnost, smanjila je SPR pik vrenost oko 2-puta. Iznenađujuće, L149R mutacija (ponovo, dizajnirana da poboljša stabilnost) smanjila je fH afinitet do sličnog nivoa kao poznati E313A mutant (donje dve linije). ;[0208] S58V i L149R mutacije u v3 su takođe studirane sa DSC, i nađeno je da povećavaju N-terminalu Tmza 5.5°C (S58V) ili za 6.7°C (L149R) u odnosu na divlji tip. Tmoba mutanta je bila veća nego što jeuočeno kod i v2 dvostrukog mutanta (63.5°C – videti Tabelu 1). L149R v3 mutant je takođe pokazao veću Tmvrednost za svoj C-terminalni domen, dok skoro da ovde nije bilo pomeranja za S58V v3 mutant. SPR je pokazala da je fH vezivanje sa mutantom #2 bilo smanjeno za oko polovinu, ali za mutant #4 fH afinitet je smanjen do sličnog nivoa u odnosu na poznati E313A mutant (što je takođe uočeno sa v2). Kada su dve mutacije kombinovane (tj. mutant #3) povećanje Tmu poređenju sa divljim tipom bilo je 11.2°C. Kada je ’E313A’ mutacija dodata mutantu #3 fH vezivanje je bilo skoro potpuno eliminisano, iako je TmN-terminalnog domena takođe smanjena za 2.9°C u poređenju sa mutantom #3 (s tim da je ostala 8.3°C veća od v3 divljeg tipa). Sama ’E313A’ mutacija je bila mnogo manje stabilna od dicljeg tipa, pokazujući smanjenje Tmod 6.3°C. ;[0209] Stoga se mutacija #2 može koristiti samostalno, ili u kombinaciji sa mutantom #4 (tj. mutantom #3), izborno sa dodatnim mutacijama, da bi se stabilizovali v2 ili v3 fHbp ali takođe da se disruptuje fH afinitet. ;[0210] Analiza baktericidnog seruma korišćena je za procenu imunogene efikasnosti mutanata #3 i #4 u v2 i v3. Dodatno,’E313A’ mutant je takođe testiran u v2 i v3, ili zasebno ili u kombinaciji sa #3 mutacijama.Divlji tip v2 i v3 fHbp je takođe testiran radi poređenja. Proteini su primenjeni na 20 µg/doza sa ađuvantom aluminijum hidroksidom i rezultujući serumi su testirani u odnosu na baktericidnu aktivnost protiv panela od sedam sojeva (četiri v2 soja, tri v3 soja) uključujući sojeve koji eksprimiraju isti fHbp kao startne fHbp sekvence divljeg tipa (tj. v2 sekvence 2.16 i v3 sekvence 3.42). ;;[0211] Rezultati za v2 proteine bili su kao što sledi (SEQ ID je za ΔG oblik; * = homologa fHbp):

[0212] Rezultati za v3 proteine bili su kao što sledi:

Kombinacija mutanata #2 i #12

[0213] Svaki od mutanata #2 i #12 pokazao je poboljšanja u v2 stabilnosti, tako da su ova dva mutanta kombinovana u jedan fHbp (SEQ ID NO: 58, ΔG oblik). U poređenju sa mutantom #12 N-terminalna Tmovog kombinovanog mutanta povećala se dodatnih 4.2°C, dajući najveću Tmbilko kog od testiranih mutantnih v2 proteina. Dodatno, pokazala je smanjeno fH vezivanje (SPR pik vrednosti smanjen oko 8x).

Mutantni fuzioni protein

[0214] Mutantne v2 i v3 sekvence su fuzionisani preko GSGGGG linkera (SEQ ID NO: 50), takođe sa mutantnom v1 sekvencom, da bi se dobila SEQ ID NO: 48. Ova sekvenca uključuje S58V i L149R mutacije za obe v2 i v3, i R41S mutaciju [21] za v1. SEQ ID NO: 47 uključuje, od N-terminusa do C-terminusa: v2 mutant #3 (SEQ ID NO: 45); v3 mutant #3 (SEQ ID NO: 44); i v1 ’R41S’ mutant (SEQ ID NO: 49), vezanu sa linker sekvencu bogatu glicinom, SEQ ID NO: 50. Fuzioni protein može biti pogodno eksprimiran dodavanjem N-terminalne sekvence od Met-[SEQ ID NO: 37]-, čime se obeztbeđuje zreli protein SEQ ID NO: 48.

[0215] Ovaj fuzioni protein stoga koristi prednost opservacije da mutant #3 obezbeđuje i v2 i v3 veliko povećanje stabilnosti (Tm) i veliko smanjenje u fH afinitetu. Za v1 R41S mutacija ima mali efekat na termičku stabilnost ali nsažno smanjuje fH vezivanje.

[0216] DSC studije na trostrukom fuzionom proteinu (Slika 8) pokazuju da tri N-terminalne tranzicije potpadaju pod široki pik centriran na 68°C. Tri C-terminalne tranzicije takođe potpadaju zajedno. UPLC je pokazala da je protein bio 94.9% čist, i HPLC analiza je pokazala <1.5% oligomera.

Mutantni proteini eksprimirani u ’GMMA’ membranskim vezikulama

[0217] v1 meningokokni soj je pripremljen sa nokautom mltA, lpxL1 i synX da bi se obezbedila genetička osnova za hiperekspresiju v2 i v3 fHbp lipoproteina pod kontrolom ’ST2’ promotora [157] u ’GMMA’ vakcini. v2 geni su integrisani u genom na deletiranom lpxL1 lokusu dok su v3 geni integrisani na synX lokusu. Dodatno, nativni v1 fHbp gen je deletiran tako da v2 i v3 mogu biti proučavane bez interferencije.

[0218] Mutanti #3 i #4 su testitani za v2, i mutantnu #4 su testirani za v3. Dodatno, pripremljen je soj i sa v2 i sa v3 #4 mutantima. Za ove bakterije fHbp ekspresija i fH vezivanje su procenjeni sa FACS.

[0219] Za sojeve koji eksprimiraju samo v2 fHbp FACS je pokazala da su različiti proteini eksprimirani na sličnim nivoima, na nivoima 2 log većim od osnovnog Δfhbp soja. U odnosu na fH vezivanje, međutim, mutanti #3 i #4 pokazali su mnogo manje vezivanje, pri čemu je vezivanje kod mutanta #4 bilo samo malo iznad osnovnog nivoa. Ovi rezultati odražavaju SPR podatke dobijene sa rekombinantnim v2 proteinima.

[0220] Za soj koji eksprimira v3 mutant #4 FACS je pokazala punu ekspresiju fHbp, ali njegovo vezivanje fH bilo je ukinuto (pokalapa se sa fH vezivanjem uočenim kod ’H222R’ mutacije [19,25]).

[0221] Za soj koji eksprimira mutant #4 iz v2 i v3, oba fHbp proteina mogla su se detektovati sa FACS ali fH vezivanje je bilo samo neznatno veće od onoga uočenog kod osnovnog Δfhbp soja.

[0222] Western blot analiza je korišćena za testiranje stabilnosti fHbp ekspresije u ovim bakterijama kad su uzgajane u tečnoj kulturi 6 dana. Ekspresija mutantnih v2 proteina ostala je stabilna tokom vremena, čak i kada je v3 koeksprimirana. Ekspresija mutantnih v3 proteina takođe je ostala stabilna, osim u soju koji eksprimira i v2 i v3 mutant, gde je v3 ekspresija opadala tokom vremena.

>SEQ ID NO: 50 [linker] GSGGGG

REFERENCE

[0224]

[1] WO99/57280.

[2] Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799.

[3] Welsch et al. (2004) J Immunol 172:5605-15.

[4] Hou et al. (2005) J Infect Dis 192(4):580-90.

[5] WO03/063766.

[6] Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100.

[7] Zhu et al. (2005) Infect Immun 73(10):6838-45.

[8] Cendron et al. (2011) Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 67:531-5.

[9] Mascioni et al. (2009) J Biol Chem 284:8738-46.

[10] Pizza et al. (2008) Vaccine 26 Suppl 8:146-8.

[11] Malito et al. (2013) PNAS USA 110:3304-9.

[12] Marshall et al. (2012) Pediatr Infect Dis J 31:1061-8.

[13] McNeil et al. (2013) Microbiol Mol Biol Rev 77:234-52.

[14] Serruto et al. (2012) Vaccine 30 Suppl 2: B87-97.

[15] Scarselli et al. (2011) Sci Transl Med 3:91ra62.

[16] WO2011/051893.

[17] WO2010/046715.

[18] Schneider et al. (2009) Nature 458:890-5.

[19] WO2011/126863.

[20] Beernink et al. (2010) Clin Vaccine Immunol 17:1074-8.

[21] Beernink et al. (2011) J Immunol 186:3606-14.

[22] Rossi et al. (2013) Vaccine 31:5451-7.

[23] van der Veen et al. (2014) Infect Immun PMID 24379280.

[24] Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981.

[25] Pajon et al. (2012) Infect Immun 80:2667-77.

[26] Granoff et al. (2013) Clin Vaccine Immunol 20:1099-107.

[27] Beernink et al. (2008) Infect Immun 76:4232-40.

[28] Scarselli et al. (2009) J Mol Biol 386:97-108.

[29] Giuntini et al. (2012) PLoS One 7:e34272.

[30] Vu et al. (2012) Sci Rep 2:341.

[31] Faleri et al. (2013) FASEB J fj.13-239012.

[32] Johnson (2013) Arch Biochem Biophys 531:100-9.

[33] Bruylants et al. (2005) Current Medicinal Chemistry 12:2011-20.

[34] Veggi et al. (2012) Biochemistry 51:9384-93.

[35] WO2014/030003.

[36] Jongerius et al. (2013) PLoS Pathog 9(8): e1003528.

[37] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.

[38] WO2007/028408.

[39] http://pubmlst.org/neisseria/

[40] Budroni et al. (2011) PNAS USA 108:4494-99.

[41] Goldschneider et al. (1969) J. Exp. Med.129:1307-26.

[42] Santos et al. (2001) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 8:616-23.

[43] Frasch et al. (2009) Vaccine 27S:B112-6.

[44] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[45] WO03/009869.

[46] Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.

[47] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

[48] WO00/66741.

[49] Martin et al. (1997) J Exp Med 185(7):1173-83.

[50] WO96/29412.

[51] Perkins-Balding et al. (2003) Microbiology 149:3423-35.

[52] WO01/55182.

[53] WO01/38350.

[54] WO00/23595.

[55] Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 103:10834-9.

[56] WO2004/032958.

[57] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698.

[58] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263.

[59] WO03/007985.

[60] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[61] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

[62] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[63] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[64] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.

[65] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.

[66] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0.

[67] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.

[68] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med.334:349-355.

[69] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238.

[70] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.

[71] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.

[72] McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101-107.

[73] Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6.

[74] WO02/34771.

[75] Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.

[76] Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663.

[77] Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; see also pages 1218-1219.

[78] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.

[79] Ravenscroft et al. (1999) Vaccine 17:2802-2816.

[80] WO03/080678.

[81] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002).

[82] EP-A-0372501.

[83] EP-A-0378881.

[84] EP-A-0427347.

[85] WO93/17712.

[86] WO94/03208.

[87] WO98/58668.

[88] EP-A-0471177.

[89] WO91/01146.

[90] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[91] Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7.

[92] EP-A-0594610.

[93] Ruan et al. (1990) J Immunol 145:3379-3384.

[94] WO00/56360.

[95] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.

[96] Michon et al. (1998) Vaccine.16:1732-41.

[97] WO02/091998.

[98] WO01/72337.

[99] WO00/61761.

[100] WO00/33882

[101] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198.

[102] WO95/08348.

[103] US patent 4,882,317

[104] US patent 4,695,624

[105] Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919.s

[106] EP-A-0208375

[107] WO00/10599

[108] Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165 : 171-288 (1979).

[109] US patent 4,057,685.

[110] US patents 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.

[111] US patent 4,459,286.

[112] US patent 4,965,338

[113] US patent 4,663,160.

[114] US patent 4,761,283

[115] US patent 4,356,170

[116] WO02/09643.

[117] Katial et al. (2002) Infect Immun 70:702-707.

[118] WO01/52885.

[119] European patent 0301992.

[120] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096.

[121] Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2951-2958.

[122] WO02/09746.

[123] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand.92:323-333.

[124] WO01/09350.

[125] European patent 0449958.

[126] EP-A-0996712.

[127] EP-A-0680512.

[128] WO02/062378.

[129] WO99/59625.

[130] US patent 6,180,111.

[131] WO01/34642.

[132] WO03/051379.

[133] US patent 6,558,677.

[134] WO2004/019977.

[135] WO02/062380.

[136] WO00/25811.

[137] Peeters et al. (1996) Vaccine 14:1008-1015.

[138] Vermont et al. (2003) Infect Immun 71:1650-1655.

[139] WO2006/081259.

[140] European patent 0011243.

[141] Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann.14(2):67-80.

[142] WO01/91788.

[143] WO2005/004908.

[144] WO98/56901.

[145] Claassen et al. (1996) 14(10):1001-8.

[146] WO99/10497.

[147] Steeghs et al. (2001) The EMBO Journal 20:6937-6945.

[148] Fisseha et al. (2005) Infect Immun 73:4070-80.

[149] WO2004/015099.

[150] WO2004/014417.

[151] WO2004/046177.

[152] WO2006/046143.

[153] Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun 72:1914-19.

[154] WO2011/036562.

[155] Koeberling et al. (2014) Vaccine 32:2688-95.

[156] WO2013/033398.

[157] WO2013/113917.

[158] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48, 443-453.

[159] Rice et al. (2000) Trends Genet 16:276-277.

[160] WO01/64920.

[161] WO03/020756.

[162] WO2004/048404.

[163] WO2004/094596

[164] WO2006/024954.

[165] WO2007/060548.

[166] WO2009/104097.

[167] WO2013/132452.

[168] Krissinel & Henrick (2007) J. Mol. Biol.372:774-97.

TABELA 1

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Mutantna v3 ili v2 fHbp koja je:

(A) polipetid koji sadrži mutantnu fHbp v2 aminokiselinsku sekvencu, naznačen time da:

(i) aminokiselinska sekvenca ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 5 i/ili sadrži fragment SEQ ID NO: 5 koji je najmanje dugačak 7 aminokiselina i uključuje ostatak koji odgovara ostatku 32 od SEQ ID NO: 5; ali (ii) aminokiselinska sekvenca se razlikuje od SEQ ID NO: 5 na ostatku 32 po supstituciji S32V,

gde polipetid može izazvati antitela koja mogu prepoznati divlji tip meningokoknog polipetida koji se sastoji od SEQ ID NO.4,

ili

(B) polipetid koji sadrži mutantnu fHbp v3 aminokiselinska sekvenca, naznačen time da:

(i) aminokiselinska sekvenca ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 17 i/ili sadrži fragment od SEQ ID NO: 17 koji je najmanje dugačak 7 aminokiselina i uključuje ostatak koji odgovara ostatku 32 od SEQ ID NO: 17; ali (ii) aminokiselinska sekvenca se razlikuje od SEQ ID NO: 17 na ostatku 32 po supstituciji S32V,

gde polipetid može izazvati antitela koja mogu prepoznati divlji tip meningokoknog polipetida koji se sastoji od SEQ ID NO.40.

2. Polipetid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da:

(A) aminokiselinska sekvenca se dodatno razlikuje od SEQ ID NO: 5 po supstituciji na jednom ili više od L123, V124, S125, G126, L127 i/ili G128; gde su supstitucija (supstitucije) izabrane iz grupe koja se sastoji od: L123R; V124I; S125G or S125T; G126D; L127I; G128A; ili

(B) aminokiselinska sekvenca se dodatno razlikuje od SEQ ID NO: 17 po supstituciji na L126, gde je supstitucija L126R.

3. Polipetid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji takođe uključuje jednu ili više dodatnih mutacija koje disruptuju sposobnost polipetida da se vezuje za humani faktor H; na primer, u v2 uključuje supstituciju na jednom ili više od ostataka R73, D203, E210, G228, S121, F122, A192, E194, V199, I200, L201, T213, H215, F219, T231, i E240, ili u v3 uključuje supstituciju na jednom ili više od ostataka Q35, 178, L87, A88, V127, V202, E213, T216, H218, T234, V241, E243, i G248.

4. Polipetid koji sadrži:

i. aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45, izborno sa 1, 2, 3, 4, ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačne aminokiseline, naznačeno time da polipetid može izazvati antitela koja se vezuju za meningokokni fHbp polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 (na primer, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 sa 1, 2, ili 3 supstitucije pojedinačne aminokiseline), ali nije mutirana na ostatku V32 ili R123; i/ili

ii. aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 44, izborno sa 1, 2, 3, 4, ili 5 supstitucija, delecija i/ili insercija pojedinačne aminokiseline, naznačeno time da polipetid može izazvati antitela koja se vezuju za meningokokni fHbp polipetid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 40 (na primer, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 sa 1, 2, ili 3 supstitucije pojedinačne aminokiseline), ali nije mutirana na ostatku V32 ili R126.

5. Polipetid prema patentnom zahtevu 4 koji sadrži ili koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45.

6. Polipetid prema patentnom zahtevu 4 koji sadrži ili koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 44.

7. Plazmid ili druga nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipetid prema bilo kom od patetntnih zahteva 1 do 6.

8. Ćelija domaćin transformisana sa plazmidom prema patentnom zahtevu 7; na primer, naznačeno time da je ćelija meningokokna bakterija, kao što je meningokokna bakterija koja ima nishodnu regulaciju ili nokaut mltA i takođe izborno ima nishodnu regulaciju ili nokaut: (i) najmanje jednog gena uključenog u stvaranje lipid A dela LPS toksičnim, naročito od IpxI1; i/ili (ii) najmanje jednog gena uključenog u sintezu ili eksport kapsularnog polisaharida, naročito od synX i/ili ctrA.

9. Membranske vezikule pripremljene od ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time da vezikule uključuju polipetid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6.

10. Imunogena kompozicija koja sadrži polipetid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, ili vezikulum prema patentnom zahtevu 9.

11. Kompozicija prema patentnom zahtevu 10, koja dodatno sadrži drugi polipetid koji, kada je primenjen na sisara, izaziva odgovor antitela koji je baktericidan protiv meningokokusa.

12. Kompozicija prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, koja dodatno sadrži (i) konjugovani kapsularni saharid iz N. meningitidis serogrupe A, C, W135 i/ili Y i/ili (ii) konjugovani kapsularni saharid iz S. pneumoniae.

13. Imunogena kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 12 za upotrebu u postupku za izazivanje odgovara antitela kod sisara.