RS61137B1 - A22k, desb27, b29r, des b30, na epsilon poziciji lizina 22 acilovanog analoga humanog insulina - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na terapijsku oblast lekova za medicinska stanja koja se odnose na dijabetes. Preciznije, pronalazak se odnosi na nove acilovane derivate analoga humanog insulina. Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže takve derivatizovane analoge insulina, i odnosi se na upotrebu takvih derivata za lečenje ili prevenciju medicinskih stanja u vezi sa dijabetesom.

STANJE TEHNIKE

Insulinska terapija za lečenje dijabetesa koristi se decenijama. Terapija insulinom obično uklјučuje davanje nekoliko injekcija insulina svakog dana. Takva terapija obično uklјučuje primenu dugotrajne bazalne injekcije jednom ili dva puta dnevno i injekciju brzo delujućeg insulina tokom obroka (tj. prandijalnu upotrebu). Jedno od klјučnih pobolјšanja u terapiji insulinom bilo je uvođenje analoga insulina brzog dejstva. Međutim, čak i kod brzo delujućih analoga insulina, vršni nivoi insulina se obično javlјaju tek 50 do 70 minuta nakon injekcije.

Stoga injekcije insulina ne odražavaju prirodni profil vremenskog delovanja insulina. Konkretno, prirodni skok prve faze oslobađanja insulina kod osobe bez dijabetesa dovodi do porasta nivoa insulina u krvi u roku od nekoliko minuta od ulaska glukoze u krv iz obroka. Suprotno tome, injektirani insulin ulazi u krv samo sporo, a vršni nivoi insulina javlјaju se u roku od 80 do 100 minuta nakon injekcije redovnog humanog insulina.

Budući da analozi insulina brzog dejstva ne oponašaju adekvatno prvu fazu oslobađanja insulina, dijabetičari koji koriste insulinsku terapiju i dalјe imaju neadekvatne nivoe insulina prisutne na početku obroka i previše insulina prisutno između obroka. Ovo zaostajanje u isporuci insulina može rezultirati hiperglikemijom rano nakon početka obroka.

Insulin ima svojstva samo-asocijacije, a njegova koncentracija predstavlјa glavni faktor samo-asocijacije. U visokim koncentracijama, posebno u farmaceutskim formulacijama, insulin će se samostalno povezati u dimer, heksamer, dodekamer i kristal. Međutim, fiziološki aktivan oblik insulina je monomer, koji se veže za insulinski receptor i pokreće biološki odgovor.

Brzina delovanja insulina zavisi od toga koliko brzo se insulin apsorbuje iz potkožnog tkiva. Kada se redovni humani insulin ubrizgava supkutano, formulacija se prvenstveno sastoji od heksamera koji sadrže dva jona cinka. Zbog svoje veličine, heksamerni insulin ima nižu brzinu difuzije i shodno tome, stopa apsorpcije je sporija nego kod manjih vrsta.

Unutar heksamera nalaze se dva atoma cinka koja stabilizuju molekul prema hemijskoj i fizičkoj razgradnji. Posle injekcije, u potkožnom tkivu se javlјa dinamička ravnoteža vođena koncentracijom, zbog čega se heksameri razdvajaju na dimere, a zatim i na monomere. Istorijski gledano, ovim redovnim formulacijama humanog insulina je potrebno približno 120 minuta da dostignu maksimalne nivoe koncentracije u plazmi. Preparati cinkinsulina, koji se brže apsorbuju od uobičajenog humanog insulina, su komercijalizovani, npr. insulin aspart i insulin lispro.

Formulacije insulina bez cinka omogućile bi bržu supkutanu apsorpciju, ali za insuline uopšte hemijska i fizička stabilnost formulacija bez cinka predstavlјa izazov.

Različiti derivati insulina su predloženi za različite upotrebe.

WO 1998042749 opisuje kristale insulina bez cinka za plućnu primenu.

US 6960561 opisuje preparate insulina bez cinka i sa niskim sadržajem cinka koji imaju pobolјšanu stabilnost.

WO 2007/096431 opisuje određene derivate humanog insulina, uklјučujući analoge i.a. koji na poziciji A22 imaju acilovani ostatak lizina, na položaju B29 ostatak arginina i koji su desB30, čiji su derivati rastvorlјivi u fiziološkim vrednostima pH i imaju produženi profil delovanja, i namenjeni za upotrebu kao insulin produženog dejstva.

WO 2009/022013 opisuje određene analoge acilovanog insulina, uklјučujući analoge i.a. koji na položaju A22 imaju acilovani lizinski ostatak, na položaju B29 imaju argininski ostatak i koji su desB30, koji poseduje veće afinitete za vezivanje za insulinski receptor i namenjen za upotrebu kao insulin produženog dejstva.

WO 2009/112583 opisuje određene analoge insulina, uklјučujući analoge koji na poziciji A22 imaju ostatak lizina, na poziciji B29 ostatak arginina i koji su desB30, koji pokazuje pobolјšanu stabilnost proteaze. WO 2009/112583 nisu acilovani.

WO 2011/161124 opisuje određene analoge acilovanog insulina koji sadrže dodatne disulfidne veze za pobolјšanu stabilnost, uklјučujući analoge i.a. koji na poziciji A22 imaju ostatak lizina, na poziciji B29 ostatak arginina i koji su desB30.

WO 2012/171994 opisuje određene derivate insulina koji sadrže dve ili više supstitucija, uklјučujući analoge i.a. koji na poziciji A22 imaju acilovani ostatak lizina, na položaju B29 ostatak arginina i koji je desB30, za produženo vreme in vivo aktivnosti.

WO 2013063572 opisuje ultrakoncentrisane formulacije analognog insulina brzog dejstva koje su opciono bez cinka.

Steensgaard at al (2013), Biochemistry, 52:295-309 stavlja na uvid javnosti insulin degludek koji je desB30 analog humanog insulina koji je acilovan na poziciji B29 sa acilacionom grupom koja se sastoji od heksadekanske kiseline i gGlu. Insulin degludek ima produženi profil delovanja.

Štaviše, acilacija peptida i proteina grupama koje vezuju albumine korišćena je za produženje trajanja delovanja peptida i proteina.

Međutim, derivati insulina prema predmetnom pronalasku nisu prijavlјeni i nikada nije predložena njihova upotreba kao brzo delujućih derivata insulina za prandijalnu upotrebu.

PREDMETI PRONALASKA

Cilј pronalaska je da obezbedi analoge insulina koji imaju prandijalni profil nakon supkutane primene.

Sledeći cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su hemijski stabilni u formulaciji.

Treći cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su hemijski stabilni u formulaciji bez dodatka cinka.

Četvrti cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su fizički stabilni u formulaciji.

Peti cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su fizički stabilni u formulaciji bez dodatka cinka.

Šesti cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su hemijski i fizički stabilni u formulaciji.

Sedmi cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su hemijski i fizički stabilni u formulaciji bez dodatka cinka.

Osmi cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su hepatopreferencijalni u odnosu na trenutno plasirane prandijalne insuline na tržištu, nakon supkutane primene.

Deveti cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su hepatoselektivni u odnosu na trenutno plasirane prandijalne insuline na tržištu, nakon supkutane primene.

Deseti cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su manje skloni indukovanju hipoglikemije u odnosu na trenutno dostupne prandijalne insuline nakon prandijalne supkutane primene.

Jedanaesti cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su manje skloni indukovanju povećanja telesne težine u odnosu na trenutno dostupne prandijalne insuline, nakon prandijalne supkutane primene.

Dvanaesti cilј pronalaska je obezbeđivanje analoga insulina koji su manje skloni indukovanju hipoglikemije i povećanja telesne težine u odnosu na trenutno dostupne prandijalne insuline nakon prandijalne supkutane primene.

Dalјi cilјevi predmetnog pronalaska usmereni su ka kombinacijama jednog ili više gore pomenutih ciljeva, a posebno obezbeđivanjem analoga insulina koji pokazuju prandijalni profil nakon supkutane primene, dok su hemijski stabilni u formulacijama, a posebno u formulacijama bez dodavanja cinka.

KRATAK OPIS PRONALASKA

Otkrili smo da derivati A22K acilovanog insulina iz predmetnog pronalaska imaju značajno pobolјšana svojstva u odnosu na slične derivate insulina iz stanja tehnike. Posebno smo otkrili da su derivati insulina prema pronalasku, u formulacijama koje ne sadrže dodate jone cinka i u poređenju sa sličnim derivatima iz stanja tehnike, povezani sa manjom veličinom molekularnih agregata. Poznato je da se manje vrste difunduju brže od većih vrsta, pa se stoga može očekivati i veća apsorpcija. Veličina ovih molekularnih agregata može se npr. izmeriti kako je ovde opisano rentgenskim raspršivanjem sa malim uglom (SAXS) i izvođenjem niza razblaživanja sa SEC-HPLC (HPLC za izuzimanje veličine) kako je opisano u odelјku primera.

Takođe smo otkrili da se derivati insulina prema pronalasku, u odnosu na slične derivate iz stanja tehnike, u formulacijama koje ne sadrže dodate jone cinka, brže apsorbuju nakon supkutanog davanja svinjama, demonstrirajući time potencijalnu kliničku korisnost kao insulini za prehrambenu upotrebu. Otkrili smo da su derivati insulina prema pronalasku, u odnosu na slične derivate iz stanja tehnike, u formulacijama koje ne sadrže dodate jone cinka, povezani sa manje „zadržavanja“ nakon supkutane primene svinjama. Pod manjim zadržavanjem podrazumeva se da se potkožni depo injektiranog insulina apsorbuje brže nego kod sličnih analoga iz stanja tehnike, tako da je srednje vreme zadržavanja (MRT) posle supkutane primene kraće za derivate insulina iz pronalaska u poređenju sa sličnim acilovanim derivatima iz stanja tehnike.

Formulacije bez cinka omogućavaju bržu supkutanu apsorpciju, ali za insuline uopšte predstavlјa izazov hemijska i fizička stabilnost formulacija bez cinka i do sada se pokazalo da je to moguće samo sa insulinom glulisin (Apidra®; B3K, B29E humani insulin), i to samo u prisustvu surfaktanata kada se izdaju u bočicama.

Sada smo otkrili da je podskup derivata A22K acilovanog insulina prema pronalasku, sa supstitucijama na poziciji B3, vrlo neočekivano i bez presedana, i hemijski i fizički stabilan u formulacijama bez dodatih jona cinka i bez dodatih surfaktanata.

Prednost upotrebe acilovanih derivata insulina kao terapije prandijalnim insulinom je postizanje viših koncentracija insulina u plazmi od onih postignutih lečenjem neacilovanim prandijalnim insulinom, poput insulina aspart, insulina lispro ili insulina glulisina.

Derivati A22K acilovanog insulina prema pronalasku imaju profil prandijalnog vremenskog dejstva nakon supkutane primene.

Pokazalo se da derivati A22K acilovanog insulina sa albuminskim vezivima na bazi tetradekanske kiseline, pentadekanske kiseline ili heksadekanske kiseline prema pronalasku ispoljavaju prenošenje vrlo visokog afiniteta vezivanja za receptore insulina, afinitete koji su smanjeni u prisustvu 1,5% humanog serumskog albumina (HSA).

Derivati A22K acilovanog insulina prema pronalasku nemaju smanjenu rastvorlјivost pri fiziološkim koncentracijama soli.

Shodno tome, u svom prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje nove derivate insulina, a su derivati insulina su acilovani derivati analoga humanog insulina, čiji su analozi [A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i analog insulina je derivatizovan acilacijom epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa grupom formule II

[Acyl]-[Linker]-pri čemu je Linker grupa lanac amino-kiseline sastavlјen od 1 do 10 ostataka aminokiseline izabranih između -gGlu- i -OEG-; pri čemu gGlu predstavlјa ostatak gama glutaminske kiseline; OEG predstavlјa ostatak 8-amino-3,6-dioksaoktanske kiseline (tj. grupe formule -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-); a ostaci amino-kiseline mogu biti prisutni u bilo kojem redosledu; i lanac amino-kiseline sadrži najmanje jedan gGlu ostatak; i

pri čemu je Acil grupa ostatak α,ω-di-karboksilne kiseline izabrane iz1,14-tetradekanske kiseline; 1,15-pentadekanske kiseline; i 1,16-heksadekanske kiseline;

a čiji acilovani analog može dodatno sadržati supstitucije A14E i/ili B3E ili B3Q. U još jednom prvom aspektu, pronalazak pruža farmaceutsku kompoziciju koja sadrži derivat insulina prema pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu derivata insulina prema pronalasku kao leka.

U još jednom dalјem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa dijabetesom, dijabetesom tipa 1, dijabetesom tipa 2, narušenom tolerancijom na glukozu, hiperglikemijom, dislipidemijom, gojaznošću, metaboličkim sindromom (metabolički sindrom X , sindrom insulinske rezistencije), hipertenzijom, kognitivnim poremećajima, aterosklerozom, infarktom miokarda, moždanim udarom, kardiovaskularnim poremećajima, koronarnom bolesti srca, sindromom zapaljenih creva, dispepsijom ili čirom na želucu, a postupak uklјučuje davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine derivata insulina prema pronalasku.

Ostali predmeti pronalaska biće stručnjaku poznati iz sledećeg detalјnog opisa i primera.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Derivati insulina

U svom prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje nove derivate insulina, čiji je derivat insulina acilovani analog humanog insulina, a čiji je analog [A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin;

i čiji analog insulina je derivatizovan acilacijom epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa grupom Formule II

[Acyl]-[Linker]-pri čemu je Linker grupa lanac amino-kiseline sastavlјen od 1 do 10 ostataka aminokiseline izabranih između -gGlu- i -OEG-; pri čemu gGlu predstavlјa ostatak gama glutaminske kiseline; OEG predstavlјa ostatak 8-amino-3,6-dioksaoktanske kiseline (tj. grupe formule -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-); ostaci amino-kiseline mogu biti prisutni u bilo kojem redosledu; i lanac amino-kiseline sadrži najmanje jedan gGlu ostatak; i

pri čemu je Acil grupa ostatak α,ω-di- karboksilne kiseline izabrane iz 1,14-tetradekanske kiseline; 1,15-pentadekanske kiseline; i 1,16-heksadekanske kiseline, a acilovani analog može dodatno sadržati supstitucije A14E i/ili B3E ili B3Q.

U jednoj realizaciji, analog humanog insulina je[A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]; ili [A22K, desB27, B29R, desB30]; u odnosu na humani insulin; i analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

U još jednoj realizaciji, analog humanog insulina je [A22K, desB27, B29R, desB30], u odnosu na humani insulin; i analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

U trećoj realizaciji, analog humanog insulina je [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30], u odnosu na humani insulin; i analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

U četvrtoj realizaciji, analog humanog insulina je [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30], u odnosu na humani insulin; i analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

U petoj realizaciji, analog humanog insulina je [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30], u odnosu na humani insulin; i analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

U šestoj realizaciji, analog humanog insulina je [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30], u odnosu na humani insulin; i analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

Kao što je gore opisano, analog insulina je derivatizovan acilovanjem epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa grupom Formule II, kao što je gore opisano, tj. supstituent koji ima acil grupu vezanu za vezujuću grupu.

U kontekstu ovog pronalaska vezujuća grupa prema Formuli II je lanac aminokiseline sastavlјen od 1 do 10 ostataka amino-kiseline izabranih između -gGlu- i -OEG-.

U jednoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je lanac amino-kiselina sastavlјen od 1 do 7 ostataka amino-kiselina odabranih između -gGlu- i -OEG-, koji se sastoji od 1 do 4 gGlu ostataka i od 0 do 3 OEG ostataka.

U još jednoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je izabrana iz -gGlu-;

-2xgGlu-; -3xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -4xgGlu-2xOEG-;

-2xOEG-; i -2xOEG-gGlu-.

U trećoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -gGlu-.

U četvrtoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -2xgGlu-.

U petoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -3xgGlu-.

U šestoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -4xgGlu-.

U sedmoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -gGlu-2xOEG-.

U osmoj realizaciji, grupa koja veže prema formuli II je -gGlu-3x(OEG-gGlu) -.

U devetoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -4xgGlu-2kOEG-.

U desetoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -2xOEG-.

U jedanaestoj realizaciji, vezujuća grupa prema Formuli II je -2xOEG-gGlu-.

U kontekstu ovog pronalaska, acil grupa prema Formuli II je izvedena iz 1,14-tetradekanske kiseline; 1,15-pentadekanske kiseline; ili 1,16-heksadekanske kiseline.

U jednoj realizaciji, acil grupa prema Formuli II je izvedena iz 1,14-tetradekanske kiseline (tj.1,14-tetradekandioila).

U još jednoj realizaciji, acil grupa prema Formuli II je izvedena iz 1,15-pentadekanske kiseline (tj.1,15-pentadekandioila).

U trećoj realizacji, acil grupa prema Formuli II je izvedena iz 1,16-heksadekanske kiseline (tj.1,16-heksadekandioila).

U dalјoj realizaciji, grupa Formule II, kao što je gore opisano, je tetradekandioilgGlu-; tetradekandioil-2xgGlu-; tetradekandioil-3xgGlu-; tetradekandioil-4xgGlu-; tetradekandioil-gGlu-2xOEG-; tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG-; tetradekandioil-2xOEG-; pentadekandioil-4xgGlu; heksadekanandioil-4xgGlu-; heksadekanandioil-gGlu-2xOEG-; ili heksadekanandioil-3x(gGlu-OEG) -gGlu-.

U još jednoj realizaciji, grupa Formule II je tetradekandioil-gGlu-.

U trećoj realizaciji, grupa Formule II je tetradekandioil-2xgGlu-.

U četvrtoj realizaciji, grupa Formule II je tetradekandioil-3xgGlu-.

U petoj realizaciji, grupa Formule II je tetradekandioil-4xgGlu-.

U šestoj realizaciji, grupa Formule II je tetradekandioil-gGlu-2xOEG-.

U sedmoj realizaciji, grupa Formule II je tetradekandioil-2xOEG-.

U osmoj realizaciji, grupa Formule II je tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG-.

U devetoj realizaciji, grupa Formule II je pentadekandioil-4xgGlu-.

U desetoj realizaciji, grupa Formule II je heksadekanandioil-4xgGlu-.

U jedanaestoj realizaciji, grupa Formule II je heksadekanandioil-gGlu-2xOEG-. U dvanaestoj realizaciji, grupa Formule II je heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-. Derivat insulina prema pronalasku naročito može biti onaj izabran iz grupe koju čine A22K(N(eps)- tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)- tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; A14E, A22K(N(eps)- tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- heksadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- heksadekandioil-3x (gGlu-OEG) -gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-4xgGlu), B3K, desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)- heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3K, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- heksadekandioil-3x(gGlu-OEG) -gGlu), B3K, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-2xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)- heksadekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)- heksadekandioil-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- heksadekandioil-3x (gGlu-OEG) -gGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-gGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3K, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)- heksadekandioil-4xgGlu), B3K, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- pentadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-4xgGlu-2kOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A14E, A22K(N(eps)- tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A14E, A22K(N(eps)- tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)- tetradekandioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)- tetradekandioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; i A22K(N(eps)- tetradekandioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin.

Poželјne karakteristike jedinjenja pronalaska

Predmetni pronalazak može se dalјe okarakterisati upućivanjem na jednu ili više sledećih karakteristika:

1. Acilovani analog humanog insulina, čiji je analog [A22K, desB27, B29R, desB30]; i čiji je analog insulina opciono supstituisan sa A14E, i/ili B3E, ili B3Q; i analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22 sa grupom Formule II [Acyl]-[Linker]-pri čemu je Linker grupa lanac amino-kiseline sastavlјen od 1 do 10 ostataka aminokiseline izabranih između -gGlu- i -OEG-; pri čemu

gGlu predstavlјa ostatak gama glutaminske kiseline; i

1

OEG predstavlјa ostatak 8-amino-3,6-dioksaoktanske kiseline (tj. grupe formule -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);

ostaci amino-kiseline mogu biti prisutni u bilo kojem redosledu; i

lanac amino-kiseline sadrži najmanje jedan gGlu ostatak; i

pri čemu je Acil grupa ostatak α,ω-di-karboksilne kiseline odabrane iz

1,14-tetradekanske kiseline;

1,15-pentadekanske kiseline; i

1,16-heksadekanske kiseline.

2. Acilovani analog humanog insulina prema tački 1, čiji je analog [A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i čiji je analog insulina supstituisan sa B3E ili B3Q; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

3. Acilovani analog humanog insulina prema tački 1, čiji je analog [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

4. Acilovani analog humanog insulina prema tački 1, čiji je analog [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

5. Acilovani analog humanog insulina prema tački 1, čiji je analog [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

6. Acilovani analog humanog insulina prema tački 1, čiji je analog [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i čiji je analog insulina supstituisan sa B3E ili B3Q; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

7. Acilovani analog humanog insulina prema tački 1, čiji je analog [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi ostatka lizina na poziciji A22.

8. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, gde je Acil grupa dikiselinska grupa izvedena iz 1,14-tetradekanske kiseline; 1,15-pentadekanske kiseline; ili 1,16-heksadekanske kiseline.

9. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, gde je Acil grupa dikiselinska grupa izvedena iz 1,14-tetradekanske kiseline ili 1,16-heksadekanske kiseline.

10. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, gde je Acil grupa dikiselinska grupa izvedena iz 1,14-tetradekanske kiseline.

11. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, gde je Acil grupa dikiselinska grupa izvedena iz 1,16-heksadekanske kiseline.

12. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, gde je Acil grupa dikiselinska grupa izvedena iz 1,15-pentadekanske kiseline.

13. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-10 gGlu ostataka.

14. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-8 gGlu ostataka.

15. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-6 gGlu ostataka.

16. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-4 gGlu ostataka.

17. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-3 gGlu ostataka.

18. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-2 gGlu ostataka.

19. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži jedan gGlu ostatak.

20. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži dva gGlu ostatka.

21. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži tri gGlu ostatka.

22. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži četiri gGlu ostatka.

23. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-6 OEG ostataka.

24. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-4 OEG ostatka.

25. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži 1-3 OEG ostatka.

26. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži jedan OEG ostatak.

27. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži dva OEG ostatka.

28. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa sadrži tri OEG ostatka.

29. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu Vezujuća grupa ne sadrži OEG ostatke.

30. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu je Vezujuća grupa izabrana iz -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -gGlu-3x(OEG-Glu)-; -4xgGlu-; -2xOEG-; -4xgGlu-2xOEG-;-2xOEG-gGlu-; i -gGlu-2xOEG-.

31. Acilovani analog humanog insulina prema klauzuli 7, pri čemu je Vezujuća grupa izabrana iz -gGlu; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; i -gGlu-2xOEG-.

32. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu je Vezujuća grupa izabrana iz -gGlu-; -2xgGlu-; i -4xgGlu-.

33. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu je grupa Formule II [Acyl]-[Linker]- tetradekandioil-gGlu-; tetradekandioil-2xgGlu-; tetradekandioil-3xgGlu-; tetradekandioil-4xgGlu-; tetradekandioil-gGlu-2xOEG-; tetradekandioil-2xOEG-; tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG-; heksadekandioil-4xgGlu-; heksadekandioil-gGlu-2xOEG-; ili heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.

34. Acilovani analog humanog insulina prema tački 7, pri čemu je grupa Formule II [Acyl]-[Linker]- tetradekandioil-gGlu-; tetradekandioil-2xgGlu-; tetradekandioil-4xgGlu-; tetradekandioil-gGlu-2xOEG-; ili tetradekandioil-2xOEG-; heksadekandioil-4xgGlu-; heksadekandioil-gGlu-2xOEG-; ili heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.

Definicije

Nomenklatura

Ovde se imenovanje insulina vrši prema sledećim principima:

Izraz „analog“ se često koristi za protein insulina ili peptid pre nego što se podvrgne dalјoj hemijskoj modifikaciji (derivatizaciji), a naročito acilaciji. Proizvod koji je rezultat takve hemijske modifikacije (derivatizacije) obično se naziva „derivat“ ili „acilovani analog“.

Međutim, u kontekstu ove prijave, izraz „analog“ označava analoge humanog insulina kao i (acilovane) derivate takvih analoga humanog insulina.

Imena su data kao analozi, derivati i modifikacije (acilacije) u odnosu na humani insulin. Za imenovanje acilnog dela (tj. [Acil] - [Linker] - grupe formule II), u nekim slučajevima imenovanje se vrši prema IUPAC nomenklaturi, a u drugim slučajevima imenovanje se vrši kao peptidna nomenklatura.

Kao primer, acilni deo sledeće strukture (Chem.1):

1

može biti nazvan „tetradekandioil-4xgGlu“, „tetradekandioil-4x γGlu“ ili, „1,14-tetradekandioil-4xgGlu“ ili slično, pri čemu je γGlu (i gGlu) kratka notacija amino-kiseline gama glutaminske kiseline u L-konfiguraciji, a „4x“ znači da se ostatak ponavlјa 4 puta.

Slično tome, acilni deo sledeće strukture (Chem.2):

O OH OH na primer može biti imenovan „heksadekandioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, „heksadekandioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, „heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”, „1,16-heksadekandioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, „1,16-heksadekandioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, „1,16-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”, „heksadekandioil-( γGlu-OEG)3- γGlu)”, „heksadekandioil-( γGlu-OEG)3- γGlu)”, ili „heksadekandioil-3x( γGlu-OEG)- γGlu)”;

pri čemu ostatak sledeće strukture (Chem.3):

O

može se na primer nazvati tetradekandioil, 1,14-tetradekandioil ili (kratka notacija) C14-diacid. Slične oznake važe za slične ostatke sa 15 i 16 atoma uglјenika, pentadekandioil, C15 diacid, i heksadekandioil, C16 diacid, tim redosledom.

γGlu (i gGlu) je kratka notacija amino-kiseline gama glutaminske kiseline u L-konfiguraciji.

OEG je kratka notacija ostatka amino-kiseline 8-amino-3,6-dioksa-oktanske kiseline, NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H.

„2x“ i „3x“ znači da se sledeći ostaci ponavlјaju 2, odnosno 3 puta.

Na primer, derivat insulina iz Primera 1 nazvan je „A22K(N(eps)-tetradekanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin“ da ukaže da je A-lanac, koji sadrži 21 ostatak amino-kiseline u humanom insulinu, produžen za 1 amino-kiselinu (pozicija A22), sa lizinom (K), koji je dalјe modifikovan acilacijom na epsilon azotu u lizinskom ostatku A22, označenom N<ε>(ili N(eps)) od dela tetradekandioil-4xgGlu, amino-kiselina na poziciji B27, T u humanom insulinu, je izbrisana, amino-kiselina na poziciji B29, K u humanom insulinu, zamenjena je argininom, R, amino-kiselina na poziciji B30, treonin, T, u humanom insulinu, je izbrisan.

Zvezdice u donjim formulama označavaju da je ostatak u pitanju drugačiji (tj. supstituisan) u poređenju sa humanim insulinom.

Kroz ovu prijavu su date i formule i imena poželјnih insulina prema pronalasku. Pored toga, insulini iz pronalaska su, takođe, imenovani prema IUPAC nomenklaturi (OpenEie, IUPAC stil). Prema ovoj nomenklaturi, derivatu insulina iz Primera 1 dodelјuje se sledeće ime: N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon} [(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-peptid.

Treba imati na umu da formule mogu biti napisane sa ostatkom lizina (koji je modifikovan acilacijom) ili se crtaju sa proširenim ostatkom lizina (kao što je prikazano npr. u primeru 23) ili se crtaju sa skraćenim ostatkom lizina (kao što je prikazano npr. u primeru 1). U svim slučajevima je acil grupa vezana za epsilon azot ostatka lizina.

Radi potpunosti, može se spomenuti da brisanje ostatka u poziciji B27 (desB27) rezultira (formalnim) pomeranjem preostalih ostataka amino-kiselina prema N-terminalnom kraju za jedan ostatak. Shodno tome, takav analog se takođe može nazvati B27P, B28R, desB29-30, jer je ostatak na poziciji B28 prolin, a ostatak na poziciji B29 arginin (videti, na primer, jedinjenje iz primera 1). To je zato što brisanjem B27 sledeća aminokiselina u sekvenci tada menja mesto i time se amino-kiselina u poziciji B28 (prolin) pomera u poziciju B27.

Fizička stabilnost

Izraz „fizička stabilnost“ insulinskog preparata koji se ovde koristi se odnosi na sklonost proteina da formira biološki neaktivne i/ili nerastvorljive agregate proteina kao rezultat izlaganja proteina termomehaničkom naprezanju i/ili interakciji sa destabilizujućim interfejsima i površinama, kao što su hidrofobne površine i interfejsi. Fizička stabilnost vodenih proteinskih preparata se procenjuje pomoću vizuelne inspekcije i/ili merenja zamućenosti nakon izlaganja preparata ispunjenog u pogodnim posudama (npr. patronama ili bočicama) mehaničkom/fizičkom naprezanju (npr. mešanju) na različitim temperaturama tokom različitog vremenskeog trajanja. Vizuelna kontrola preparata vrši se na oštrom usmerenom svetlu sa tamnom pozadinom. Preparat je klasifikovan kao fizički nestabilan u pogledu agregacije proteina, kada pokazuje vizuelnu zamućenost na dnevnom svetlu.

Alternativno, zamućenost preparata može se proceniti jednostavnim merenjem zamućenosti koji je dobro poznat stručnjaku. Fizička stabilnost vodenih proteinskih preparata može se, takođe, proceniti korišćenjem spektroskopskog agensa ili probe konformacionog statusa proteina. Proba je poželjno mali molekul koji se preferentno vezuje za nenativni konformer proteina. Jedan primer male molekularne spektroskopske probe proteinske strukture je tioflavin T. Tioflavin T je fluorescentna boja koja se široko koristi za detekciju amiloidnih fibrila. U prisustvu fibrila, a možda i drugih proteinskih konfiguracija, tioflavin T dovodi do novog maksimuma ekscitacije na oko 450 nm i pojačane emisije na oko 482 nm kada se

1

vezuje za oblik fibrilnog proteina. Nevezani tioflavin T je u suštini nefluorescentan na talasnim dužinama.

Hemijska stabilnost

Izraz „hemijska stabilnost“ proteinskog preparata, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na promene u kovalentnoj strukturi proteina, što dovodi do stvaranja hemijskih proizvoda degradacije sa potencijalno manjom biološkom potentnošću i/ili potencijalno povećanim imunogenim svojstvima u poređenju sa strukturom prirodnog proteina. Različiti proizvodi hemijske degradacije mogu da se formiraju u zavisnosti od tipa i prirode prirodnog proteina i sredine kojoj je protein izložen. Povećane količine hemijskih proizvoda degradacije se često viđaju tokom skladištenja i upotrebe proteinskih preparata. Većina proteina je podložna deamidaciji, procesu u kome se amidna grupa bočnog lanca u glutaminilnim ili asparaginilnim ostacima hidrolizuje da se formira slobodna karboksilna kiselina ili asparaginilni ostaci da bi se formirao IsoAsp derivat. Drugi putevi degradacije uključuju stvaranje proizvoda visoke molekulske mase gde su dva ili više proteinskih molekula kovalentno vezani jedan za drugi preko transamidacije i/ili interakcije disulfida što dovodi do stvaranja kovalentno vezanih dimera, oligomera i polimerskih proizvoda degradacije (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. TJ & Manning MG, Plenum Press, New York 1992). Oksidacija (npr. metioninskih ostataka) može se pomenuti kao druga varijanta hemijske degradacije. Hemijska stabilnost preparata proteina može se proceniti merenjem količine proizvoda hemijske degradacije u različitim vremenskim tačkama nakon izlaganja različitim uslovima okoline (formiranje proizvoda degradacije se često može ubrzati, na primer, povećanjem temperature). Količina svakog pojedinačnog proizvoda degradacije se često određuje razdvajanjem proizvoda degradacije u zavisnosti od veličine molekula, hidrofobnosti, i/ili puni korišćenjem različitih tehnika hromatografije (npr. SEC-HPLC i/ili RP-HPLC). Pošto su HMVP proizvodi potencijalno imunogeni i nisu biološki aktivni, niski nivoi HMVP su prednost.

Postupci sinteze

Derivati insulina prema pronalasku mogu se dobiti konvencionalnim postupcima za pripremu insulina, analoga insulina i derivata insulina, a naročito postupcima opisanim u radnim primerima.

U jednoj realizaciji, derivat insulina prema pronalasku se dobija acilovanjem epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa grupom Formule II koja je tetradekandioil-4xgGlu.

1

U još jednoj realizaciji, derivat insulina prema pronalasku dobija se acilovanjem epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 pri visokom pH, a naročito pri pH u opsegu od 9,5 do 13, sa grupom Formula II koja je tetradekandioil-4xgGlu.

Preciznije, derivat insulina prema pronalasku dobija se acilovanjem epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa jedinjenjem (S)-2-((S)-4- karboksi -4-{(S)-4-karboksi-4-[(S)-4-karboksi-4-(13-karboksi-tridekanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanska kiselina 5-(2,5-diokso-pirolidin-1-il) estar (ili alternativno označen tetradekandioil-4xgGlu-OSu) (Chem.4).

U još jednoj realizaciji, derivat insulina prema pronalasku dobija se acilovanjem epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa jedinjenjem 14 - [[(1S) -1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il) oksi-2-oksoetoksi] etoksi] etil-amino] -2-oksoetoksi] etoksi] etilamino] -4-oksobutil] amino] -14-oksotetradekanska kiselina (ili alternativno označena tetradekandioil-gGlu-2xOEG-OSu) (Chem.5).

Poželјne karakteristike za sintezu jedinjenja pronalaska

Za sintezu derivata insulina prema ovom pronalasku upućeno je na jednu ili više sledećih karakteristika:

1. Jedinjenje (S)-2-((S)-4- karboksi -4-{(S)-4- karboksi-4-[(S)-4-karboksi-4-(13-karboksi -tridekanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanska kiselina 5-(2,5-diokso-pirolidin-1-il) estar (ili alternativno označen tetradekandioil-4xgGlu-OSu) (Chem.4), za upotrebu u procesu acilovanja kao intermedijar u sintezi derivata insulina prema pronalasku.

2. Jedinjenje 14-[[(1S)-1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oxy-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2- oksoetoksi]etoksi]etilamino]-4-oksobutil]amino]-14-oksotetradekanska kiselina (ili alternativno označena tetradekandioil-gGlu-2xOEG-OSu) (Chem.5), za upotrebu u procesu acilovanja kao intermedijer u sintezi derivata insulina prema pronalasku.

3. Jedinjenje prema bilo kojoj od tačaka 1-2 za upotrebu kao intermedijerno jedinjenje u sintezi derivata insulina, čiji je derivat insulina acilovani analog humanog insulina, i čiji analog ima mutaciju A22K u odnosu na humani insulin i na kojoj poziciji je jedinjenje iz bilo koje tačke 1-2 acilovano.

4. Jedinjenje prema bilo kojoj od tačaka 1-2 za upotrebu kao intermedijerno jedinjenje u sintezi derivata insulina, čiji je derivat insulina acilovani analog humanog insulina, čiji je analog [A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin, a analog se aciluje na poziciji A22K jedinjenjem bilo koje od tačaka 1-2.

1

5. Jedinjenje prema bilo kojoj od tačaka 1-2 za upotrebu kao intermedijerno jedinjenje u sintezi derivata insulina, čiji je derivat insulina acilovani analog humanog insulina, čiji je analog [A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin, a acilovani analog može dodatno da sadrži supstitucije A14E, i/ili B3E ili B3Q, i čiji analog se aciluje na poziciji A22K jedinjenjem bilo koje od tačaka 1-2.

6. Jedinjenje prema tački 1 za upotrebu kao intermedijarno jedinjenje u sintezi A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humanog insulina; A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina; ili

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina.

Biološka aktivnost

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje nove derivate insulina za upotrebu kao lekovi ili za upotrebu u proizvodnji lekova ili farmaceutskih kompozicija.

Utvrđeno je da su derivati insulina prema pronalasku kratkoročno i brzo delujući derivati insulina koji se smatraju pogodnim za prandijalnu upotrebu.

Svi derivati insulina prema pronalasku poseduju afinitete receptora insulina adekvatne za aktiviranje insulinskog receptora da bi se dobio potreban glikemijski odgovor, tj. da mogu da smanje glukozu u krvi kod životinja i lјudi.

Utvrđeno je da derivati insulina prema pronalasku imaju uravnotežen odnos afiniteta (IR / IGF-1R) insulinskih receptora (IR) prema faktoru rasta 1 sličnog insulinu (IGF-1R).

U jednom aspektu, A22K acilovani insulin prema pronalasku ima odnos IR / IGF-1R iznad 0,3; iznad 0,4; iznad 0,5; iznad 0,6; iznad 0,7; iznad 0,8; iznad 0,9; od iznad 1; iznad 1,5; ili iznad 2.

U drugom aspektu, A22K analog acilovanog insulina je jedinjenje prema pronalasku, pri čemu je Acil grupa Formule II izvedena iz 1,14-tetradekanske kiseline i čiji acilovani analog insulina ima srednje vreme zadržavanja (MRT) manje od 250 minuta; manje od 200

1

minuta; manje od 175 minuta; manje od 150 minuta; manje od 125 minuta; nakon supkutanog ubrizgavanja 600 uM (približno) formulacije acilovanog analoga insulina prema pronalasku, koja sadrži 1,6% (w/v, približno) glicerola i 30 mM fenola / m-krezola, pH 7,4, svinjama.

U još jednoj realizaciji, A22K acilovani analog insulina je jedinjenje prema pronalasku, pri čemu je Acil grupa Formule II izvedena iz 1,16-heksadekanske kiseline i čiji acilovani analog insulina ima srednje vreme zadržavanja (MRT) manje od 700 minuta; manje od 600 minuta; manje od 500 minuta; manje od 400 minuta; manje od 300 minuta; nakon supkutanog ubrizgavanja 600 uM (približno) formulacije acilovanog insulinskog analoga prema pronalasku, koja sadrži 1,6% (w/v, približno) glicerola i 30 mM fenola / m-krezola, pH 7,4, svinjama.

U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na medicinsku upotrebu acilovanog insulinskog analoga prema pronalasku, a naročito na upotrebu takvih derivata insulina za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa dijabetesom, dijabetesom tipa 1, dijabetesom tipa 2, narušenom tolerancijom na glukozu, hiperglikemijom, dislipidemijom, gojaznošću, metaboličkim sindromom (metabolički sindrom X , sindrom insulinske rezistencije), hipertenzijom, kognitivnim poremećajima, aterosklerozom, infarktom miokarda, moždanim udarom, kardiovaskularnim poremećajima, koronarnom bolesti srca, sindromom zapanjenja creva, dispepsijom ili čirom na želucu, a postupak uklјučuje davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine derivata insulina prema pronalasku.

U još jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na upotrebu takvih derivata insulina za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa dijabetesom, dijabetesom tipa 1, dijabetesom tipa 2 ili narušenom tolerancijom glukoze, a postupak uklјučuje davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine derivata insulina prema pronalasku.

U trećoj realizaciji, pronalazak se odnosi na upotrebu takvih derivata insulina za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa dijabetesom, a posebno dijabetesom tipa 1 ili tipa 2.

Farmaceutske kompozicije

Ovaj pronalazak se odnosi na acilovane analoge insulina korisne kao lekovi.

Prema tome, u drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje nove farmaceutske kompozicije koje sadrže terapeutski efikasnu količinu derivata insulina prema ovom pronalasku.

1

Farmaceutska kompozicija prema pronalasku opciono sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatlјivih nosača i/ili razblaživača.

Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može dalјe da sadrži i druge pomoćne supstance koje se obično koriste u farmaceutskim kompozicijama, npr. konzervansi, helatna sredstva, sredstva za toničnost, pojačivače apsorpcije, stabilizatore, antioksidante, polimere, surfaktante, jone metala, masne nosače i proteine (npr. humani serumski albumin, želatin ili proteine).

U jednoj realizaciji pronalaska, farmaceutska kompozicija pronalaska je vodeni preparat, tj. preparat koji sadrži vodu. Takav preparat je obično rastvor ili suspenzija. U sledećoj realizaciji pronalaska, farmaceutska kompozicija je vodeni rastvor.

Izraz „vodeni preparat“ je definisan kao preparat koji sadrži najmanje 50 w/w vode. Slično tome, izraz „vodeni rastvor“ je definisan kao rastvor koji sadrži najmanje 50% w/w vode, a izraz „vodena suspenzija“ je definisan kao suspenzija koja sadrži najmanje 50% w/w vode. Vodene suspenzije mogu sadržati aktivna jedinjenja u smeši sa ekscipijentima pogodnim za proizvodnju vodenih suspenzija.

U jednoj realizaciji pronalaska, preparat insulina sadrži vodeni rastvor derivata insulina predmetnog pronalaska, pri čemu je navedeno jedinjenje insulina prisutno u koncentraciji od oko 0,1 mM do oko 20,0 mM; tačnije od oko 0,2 mM do oko 4,0 mM; od oko 0,3 mM do oko 2,5 mM; od oko 0,5 mM do oko 2,5 mM; od oko 0,6 mM do oko 2,0 mM; ili od oko 0,6 mM do oko 1,2 mM.

U sledećoj realizaciji pronalaska, preparat insulina sadrži vodeni rastvor derivata insulina predmetnog pronalaska, pri čemu je dato jedinjenje insulina prisutno u koncentraciji od oko 0,1 mM, od oko 0,3 mM, od oko 0,4 mM, od oko 0,6 mM od oko 0,9 mM, od oko 1,2 mM, od oko 1,5 mM ili od oko 1,8 mM

Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može dalјe da sadrži puferski sistem. Pufer može da bude izabran iz grupe koja se sastoji, ali ne ograničava, od natrijum acetata, natrijum karbonata, natrijum dihidrogen fosfata, dinatrijum hidrogen fosfata, natrijum fosfata i tris(hidroksimetil) -aminometana, bicina, trikina, jabučne kiseline, glicilglicina, etilen diamina, sukcinske kiseline, maleinske kiseline, fumarne kiseline, vinske kiseline, aspartanske kiseline ili njihove mešavine. Svaki od ovih specifičnih pufera predstavlja alternativnu realizaciju pronalaska.

U jednoj realizaciji, pufer je fosfatni pufer. U još jednoj realizaciji, koncentracija datog fosfatnog pufera je u rasponu od oko 0,1 mM do 20 mM. U još jednom realizaciji koncentracija datog fosfatnog pufera je u rasponu od 0,1 mM do oko 10 mM, ili od oko 0,1 mM do oko 8 mM, od oko 1 mM do oko 8 mM, ili od oko 2 mM do oko 8 mM, ili od 6 mM do 8 mM.

2

PH farmaceutske kompozicije za ubrizgavanje (injekcije) prema pronalasku je u opsegu od 3 do 8.5. Poželјno je da farmaceutski preparat za ubrizgavanje prema pronalasku ima pH u rasponu od oko 6.8 do oko 7.8.

U jednoj realizaciji, pH je u rasponu od oko 7.0 do oko 7.8, ili od 7.2 do 7.6.

Preparati insulina iz predmetnog pronalaska mogu dalјe sadržati sredstvo za toničnost. Sredstvo za toničnost može da bude izabrano iz grupe koja se sastoji od soli (npr. natrijum hlorida), šećera ili šećernog alkohola, amino-kiseline (npr. L-glicin, L-histidin, arginin, lizin, izoleucin, asparaginska kiselina, triptofan, treonin), alditola (npr. glicerol (glicerin), 1,2-propandiol (propilenglikol), 1,3-propandiol, 1,3-butandiol) polietilenglikola (npr. PEG400), ili njihove smeše. Bilo koji šećer, poput mono-, di-, ili polisaharida, ili u vodi rastvorljivih glukana, uključujući na primer fruktozu, glukozu, manozu, sorbozu, ksilozu, maltozu, laktozu, saharozu, trehalozu, dekstran, pululan, dekstrin, ciklodekstrin, rastvorljivi skrob i hidroksietilni skrob i karboksimetilceluloza-Na mogu se koristiti. U jednoj realizaciji, šećerni aditiv je saharoza. Šećerni alkohol uključuje, na primer, manitol, sorbitol, inozitol, galakititol, dulcitol, ksilitol i arabitol. U jednoj realizaciji, aditiv šećernog alkohola je manitol. Gore spomenuti šećeri ili šećerni alkoholi mogu se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji. Svako od ovih specifičnih sredstava za toničnost ili njihove smeše stvara alternativnu realizaciju pronalaska.

U jednoj realizaciji pronalaska, glicerol i/ ili manitol i/ili natrijum hlorid mogu biti prisutni u količini koja odgovara koncentraciji od 0 do 250 mM, od 0 do 200 mM ili od 0 do 100 mM.

Preparati insulina iz ovog pronalaska mogu dalјe da sadrže farmaceutski prihvatlјiv konzervans. Konzervans može biti prisutan u količini dovolјnoj za postizanje efekta očuvanja. Količina konzervansa u farmaceutskoj kompoziciji pronalaska može se odrediti od npr. literatura u oblasti i/ili po poznatoj količini(ama) konzervansa u npr. komercijalnim proizvodima. Svaki od ovih specifičnih konzervansa ili smeša stvara alternativnu realizaciju pronalaska. Upotreba konzervansa u farmaceutskim preparatima je opisana, na primer u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>edition, 1995.

U jednom realizaciji, farmaceutska kompozicija za ubrizgavanje sadrži najmanje jedno fenolno jedinjenje kao konzervans.

U još jednom realizaciji, fenolno jedinjenje za upotrebu prema pronalasku može biti prisutno u oko 6 mg/ml finalne farmaceutske kompozicije za ubrizgavanje, naročito u oko 4 mg/ml finalne farmaceutske kompozicije za ubrizgavanje.

U još jednoj realizaciji, fenolno jedinjenje za upotrebu prema pronalasku može biti prisutno u količini do oko 4,0 mg/ml finalne farmaceutske kompozicije za ubrizgavanje; naročito od oko 0,5 mg/ml do oko 4,0 mg/ml; ili od oko 0,6 mg/ml do oko 4,0 mg/ml.

U drugoj realizaciji, konzervans je fenol.

U još jednom realizaciji, farmaceutska kompozicija za ubrizgavanje sadrži smešu fenola i m-krezol kao konzervans.

U još jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija za ubrizgavanje sadrži oko 16 mM fenola (1,5 mg/ml) i oko 16 mM m-krezol (1,72 mg/ml).

Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može dalјe sadržati helatno sredstvo. Upotreba helatnog sredstva u farmaceutskim preparatima je dobro poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>edition, 1995.

Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može dalјe sadržati pojačivač apsorpcije. Grupa pojačivača apsorpcije može uklјučivati, ali nije ograničena na nikotinska jedinjenja. Izraz nikotinsko jedinjenje uklјučuje nikotinamid, nikotinsku kiselinu, niacin, niacin amid i vitamin B3 i/ili njihove soli i/ili bilo koju njihovu kombinaciju.

U jednom realizaciji, nikotinsko jedinjenje je nikotinamid i/ili nikotinska kiselina i/ili njena so. U drugoj realizaciji nikotinsko jedinjenje je nikotinamid. Nikotinsko jedinjenje za upotrebu prema pronalasku može posebno biti N-metil nikotinamid, N,N-dietilnikotinamid, N-etilnikotinamid, N,N-dimetilnikotinamid, N-propil nikotinamid ili N-butil nikotinamid.

U još jednom realizaciji, nikotinsko jedinjenje je prisutno u količini od oko 5 mM do oko 200 mM; naročito u količini od oko 20 mM do oko 200 mM; u količini od oko 100 mM do oko 170 mM; ili u količini od oko 130 mM do oko 170 mM, kao što je oko 130 mM, oko 140 mM, oko 150 mM, oko 160 mM ili oko 170 mM.

Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može dalјe sadržati stabilizator. Izraz „stabilizator“, kako se ovde koristi, odnosi se na hemikalije dodate farmaceutskim preparatima koji sadrže polipeptid kako bi se stabilizovao peptid, tj. povećao rok trajanja i/ili vreme upotrebe takvih preparata. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>edition, 1995.

Farmaceutska kompozicija iz pronalaska može dalje da sadrži količinu baze aminokiselina dovoljnu da smanji stvaranje agregata od strane polipeptida ili proteina tokom skladištenja kompozicije. Izraz „baza amino-kiselina“ odnosi se na amino-kiselinu ili kombinaciju amino-kiselina, pri čemu je bilo koja data amino-kiselina prisutna ili u svom slobodnom baznom obliku ili u obliku soli. Amino-kiseline mogu biti naročito arginin, lizin, asparaginska kiselina i glutaminska kiselina, aminoguanidin, ornitin i N-monoetil L-arginin, etionin i buthionin i S-metil-L cistein. U jednoj realizaciji pronalaska baza amino-kiselina može biti prisutna u količini koja odgovara koncentraciji od 1 do 100 mM; od 1 do 50 mM; ili od 1 do 30 mM.

U jednoj realizaciji farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može dalje da sadrži surfaktant. Izraz „surfaktant“ koji se ovde koristi odnosi se na sve molekule ili jone koji se sastoje od vodotopljivog (hidrofilnog) dela, glavnog, i dela rastvorljivog u mastima (lipofilnog). Surfaktanti se akumuliraju poželјno na mestima sučeljavanja, i čiji je hidrofilni deo orijentisan prema vodi (hidrofilna faza), a lipofilni deo prema ulјnoj ili hidrofobnoj fazi (tj. staklo, vazduh, ulјe, itd.). Koncentracija pri kojoj surfaktanti počinju da formiraju micele poznata je kao kritična koncentracija micele ili CMC. Dalje, surfaktanti smanjuju površinsku tenziju tečnosti. Surfaktanti su takođe poznati kao amfipatična jedinjenja. Upotreba surfaktanata u farmaceutskim preparatima dobro je poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>edition, 1995.

Pronalazak se dalje odnosi na postupak za pripremu takvih insulinskih preparata. Preparati insulina iz ovog pronalaska mogu se pripremiti korišćenjem bilo koje od brojnih priznatih postupaka. Na primer, preparati se mogu pripremiti mešanjem vodenog rastvora ekscipijenasa sa vodenim rastvorom derivata insulina, nakon čega se pH podešava na želјeni nivo i smeša dopunjava vodom do krajnje zapremine nakon čega sledi sterilna filtracija.

Farmaceutske kompozicije bez cinka

Preparati insulina tradicionalno sadrže cink dodat kao npr. hloridne ili acetatne soli da bi se dobila prihvatlјiva stabilnost farmaceutskog preparata. Međutim, iznenađujuće je utvrđeno da se određeni derivati insulina prema pronalasku, uz održavanje dovolјne hemijske i fizičke stabilnosti, mogu formulisati u farmaceutske kompozicije bez dodavanja cinka, čime se postiže brži početak delovanja od uporedivih analoga insulina kojima su potrebni Zn<2+>joni za održavanje dovolјne hemijske i fizičke stabilnosti. Formulacije bez cinka se brže apsorbuju iz potkožnog tkiva, što omogućava prandijalnu primenu.

U tom pogledu treba napomenuti da je zaista teško dobiti farmaceutsku kompoziciju insulina bez cinka, jer tragovi cinka u manjoj ili većoj meri mogu biti prisutni u pomoćnim supstancama koje se uobičajeno koriste za proizvodnju farmaceutskih kompozicija i naročito u gumenim materijalima koji se koriste u medicinskim ambalažama.

Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže derivat insulina prema pronalasku, formulisane kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, tj. bez odvojenog dodavanja cinka u preparat. Takve farmaceutske smeše obično se nazivaju „kompozicije bez cinka“, mada se u stvari mogu smatrati „kompozicijama sa niskim sadržajem cinka“.

Međutim, pod uslovom da se mogu obezbediti ekscipijensi bez cinka, derivati insulina predmetnog pronalaska u stvari omogućavaju pripremu farmaceutskih kompozicija bez cinka. Prema tome, u drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske

2

kompozicije bez cinka koje sadrže derivat insulina prema pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatlјivih nosača ili razblaživača, lišenih bilo kog cinka.

Štaviše, otkrili smo da podskupina derivata A22K acilovanog insulina pronalaska, koji imaju supstituciju u poziciji B3, dodaje hemijsku i fizičku stabilnost farmaceutskim kompozicijama formulisanim bez dodavanja jona cinka i bez dodavanja surfaktanata. Prema tome, u dalјem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju sa niskim sadržajem cinka ili bez cinka, kao što je gore opisano, koja sadrži derivat insulina prema pronalasku koji sadrži dodatnu supstituciju u poziciji B3 (tj. B3E ili B3Q) i jedan ili više farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač, a u farmaceutskoj kompoziciji, međutim, nije dodat surfaktant.

U jednoj realizaciji pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju formulisanu kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži derivat insulina i jedan ili više farmaceutski prihvatlјivih nosača ili razblaživača, pri čemu je derivat insulina acilovani analog humanog insulina, a analog je

[A22K, B3E ili B3Q, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je derivatizovan acilacijom epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa grupom Formule II

[Acyl]-[Linker]-pri čemu je Linker grupa lanac amino-kiseline sastavlјen od 1 do 10 ostataka aminokiseline izabranih između -gGlu- i -OEG-; pri čemu

gGlu predstavlјa ostatak gama glutaminske kiseline;

OEG predstavlja ostatak 8-amino-3,6-dioksaoktanske kiseline (i.e. grupu formule -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);

čiji ostaci amino-kiseline mogu biti prisutni u bilo kom rasporedu; i čiji lanac amino-kiseline sadrži najmanje jedan gGlu ostatak; i

gde je Acil grupa ostatak α,ω-di-karboksilne kiseline izabran iz

1,14-tetradekanske kiseline;

1,15-pentadekanske kiseline; i

1,16-heksadekanske kiseline;

čiji acilovani analog, može dodatno sadržati supstituciju A14E.

U još jednoj realizaciji, dodatna zamena na poziciji B3 je B3E.

U trećoj realizaciji, dodatna supstitucija na poziciji B3 je B3Q.

U četvrtoj realizaciji pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju, formulisanu kao kompoziciju sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži acilovani analog humanog insulina odabran iz:

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-pentadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina; i

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin. U još jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju sa niskim cinkom kako je gore opisano, pri čemu joni cinka mogu biti prisutni u količini koja odgovara koncenraciji od manje od 0.2 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0.15 Zn<2+>jona

2

na 6 molekula insulina; od manje od 0,12 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; 0,1 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,09 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,08 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,07 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,06 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,05 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,04 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,03 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; od manje od 0,02 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina; ili od manje od 0,01 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina.

U dalјoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju sa niskim sadržajem cinka ili bez cinka, kako je gore opisano, formulisanu kao injekciona kompozicija. Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može se dobiti korišćenjem konvencionalnih postupaka poznatih u tehnici. Na primer, komponente se mogu mešati zajedno u obliku vodenih rastvora, nakon čega se pH podešava na želјeni nivo i smeša dopunjava vodom do krajnje zapremine, nakon čega sledi sterilna filtracija.

Parenteralno davanje može biti izvedeno supkutanom, intramuskularnom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, opciono šprica nalik olovci. Alternativno, parenteralna primena može biti izvedena pomoću infuzione pumpe. Kao dalja opcija, preparati insulina koji sadrže jedinjenje insulina iz pronalaska mogu se, takođe, prilagoditi transdermalnoj primeni, npr. primeni injekcijom bez igle ili iz flastera sa mikroiglicama, opciono jontoforeznog flastera, ili transmukoznog, npr. bukalno.

Preparati insulina prema ovom pronalasku mogu se dati pacijentu kome je potreban takav tretman na više mesta, na primer, na lokalnim mestima, na primer, na koži i sluzokoži, na mestima koja zaobilaze apsorpciju, na primer , davanje u arteriju, venu, srce i na mestima koja uključuju apsorpciju, na primer, unošenje u kožu, ispod kože, u mišiće ili abdomen.

U jednoj realizaciji, insulinski preparati ovog pronalaska su dobro pogodni za primenu u uređajima sličnim penkalu koji se koriste za insulinsku terapiju injekcijama.

Farmaceutska kompozicija pronalaska može se koristiti u lečenju dijabetesa parenteralnom primenom.

U još jednoj realizaciji, insulinski preparati iz ovog pronalaska mogu se, takođe, pripremiti za upotrebu u različitim medicinskim uređajima koji se obično koriste za davanje insulina, uklјučujući kontinuiranu supkutanu terapiju infuzijom insulina upotrebom pumpi i/ili za primenu u bazalnoj terapiji insulinom.

Preporučuje se da dozu insulinskih preparata iz ovog pronalaska koja se daje pacijentu, bude izabrana od strane lekara. Trenutno se predviđa da derivat insulina prema pronalasku bude prisutan u konačnoj farmaceutskoj kompoziciji u količini od oko 0,1 mM do oko 20,0 mM; tačnije od oko 0,2 mM do oko 4,0 mM; od oko 0,3 mM do oko 2,5 mM; od oko 0,5 mM do oko 2,5 mM; od oko 0,6 mM do oko 2,0 mM; ili od oko 0,6 mM do oko 1,2 mM.

2

Poželjne karakteristike farmaceutskih kompozicija prema pronalasku

Predmetni pronalazak može se dalјe okarakterisati upućivanjem na jednu ili više sledećih karakteristika:

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži acilovani analog humanog insulina pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatlјivih ekscipijenata.

2. Farmaceutska kompozicija prema tački 1, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka.

3. Farmaceutska kompozicija prema tački 1, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži acilovani analog humanog insulina koji ima supstituciju na poziciji B3.

4. Farmaceutska kompozicija prema tački 1, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži acilovani analog humanog insulina koji ima supstituciju B3E ili B3Q.

5. Farmaceutska kompozicija prema tački 1, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži acilovani analog humanog insulina koji ima supstituciju B3E.

6. Farmaceutska kompozicija prema tački 1, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži acilovani analog humanog insulina koji ima supstituciju B3Q.

7. Farmaceutska kompozicija prema tački 1, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži acilovani analog humanog insulina odabran iz:

A22K(N(eps) tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-pentadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

2

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina; i

A22K(N(eps)-tetradekandioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina.

8. Farmaceutska kompozicija prema tački 1, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodavanja jona cinka, koja sadrži acilovani analog humanog insulina odabran iz:

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina; i

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina.

9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od tačaka 7-8, koja sadrži manje od 0,2 Zn<2+>jona na 6 molekula insulina.

10. Farmaceutska kompozicija sa niskim sadržajem cinka prema bilo kojoj od tačaka 7-8, u koju nije dodat surfaktant.

11. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od tačaka 7-8, koja sadrži nikotinsko jedinjenje.

12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od klauzula 7-8, koja sadrži nikotinsko jedinjenje, fenilalanin i/ili njegovu so, u ukupnoj koncentraciji od oko 20 mM do oko 170 mM.

13. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od tačaka 7-8, koja sadrži nikotinsko jedinjenje, fenilalanin i/ili njegovu so, u ukupnoj koncentraciji od oko 130 mM do oko 170 mM.

2

14. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od tačaka 7-8, koja sadrži farmaceutski prihvatlјiv ekscipijent, razblaživač i/ili adjuvans.

Postupci lečenja

Ovaj pronalazak se odnosi na lekove za terapijsku upotrebu. Preciznije, pronalazak se odnosi na upotrebu acilovanih derivata analoga humanog insulina prema pronalasku za lečenje ili prevenciju medicinskih stanja koja se odnose na dijabetes.

Prema tome, u drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili ublažavanje bolesti ili poremećaja ili stanja živog životinjskog tela, uklјučujući čoveka, a bolest, poremećaj ili stanje mogu biti izabrani od bolesti, poremećaja ili stanja koje se odnosi na dijabetes, dijabetes tipa 1, dijabetes tipa 2, narušenu toleranciju na glukozu, hiperglikemiju, dislipidemiju, gojaznošću, metabolički sindrom (metabolički sindrom X , sindrom insulinske rezistencije), hipertenziju, kognitivne poremećaje, aterosklerozu, infarkt miokarda, moždani udar, kardiovaskularne poremećaje, koronarnu bolest srca, sindrom zapaljenja creva, dispepsiju ili čir na želucu, a postupak uklјučuje davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine derivata insulina prema pronalasku.

U još jednom realizaciji pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili ublažavanje bolesti ili poremećaja ili stanja živog životinjskog tela, uklјučujući čoveka, a bolest, poremećaj ili stanje mogu biti izabrani od bolesti, poremećaja ili stanja u vezi sa dijabetesom, dijabetesom tipa 1, dijabetesom tipa 2, poremećenom tolerancijom na glukozu, hiperglikemijom, dislipidemijom, gojaznošću, metaboličkim sindromom (metabolički sindrom X, sindrom insulinske rezistencije), hipertenzijom, kognitivnim poremećajima, aterosklerozom, infarktom miokarda, moždanim udarom, kardiovaskularnim poremećajima, koronarnom bolesti srca, sindromom zapaljenja creva, dispepsijom ili čirom na želucu, a postupak uklјučuje davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine acilovanog analoga humanog insulina prema pronalasku.

U trećoj realizaciji pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili ublažavanje bolesti ili poremećaja ili stanja živog životinjskog tela, uklјučujući čoveka, a bolest, poremećaj ili stanje mogu biti izabrani između bolesti, poremećaja ili stanja koji se odnose na dijabetes , dijabetes tipa 1, dijabetes tipa 2, poremećenu tolerancija na glukozu, hiperglikemiju, dislipidemiju, gojaznost ili metabolički sindrom (metabolički sindrom X, sindrom rezistencije na insulin).

U četvrtoj realizaciji pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili ublažavanje bolesti ili poremećaja ili stanja živog životinjskog tela, uklјučujući čoveka, a bolest, poremećaj ili stanje mogu biti izabrani između bolesti, poremećaja ili stanja koji se odnose na dijabetes, posebno dijabetes tipa 1 ili dijabetes tipa 2.

2

KRATAK OPIS CRTEŽA

Ovaj pronalazak je dalјe prikazan uz upućivanje na prateći crtež, na kojem:

Slika 1 prikazuje PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) derivata insulina iz Primera 1 formulisanog sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg) u poređenju sa profilom NovoRapid® / NovoLog® (insulin aspart, komercijalna formulacija, 3 cinka na 6 molekula insulina (0,5 i 1 nmol/kg);

Slika 2 prikazuje iste podatke kao na slici 1, ali su prikazana samo prva 2 sata; Slika 3a prikazuje iste podatke kao na slici 1, ali prikazuje samo podatke za insulin iz Primera 1 formulisan sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg) u poređenju sa profilom NovoRapid® / NovoLog® (insulin aspart, komercijalna formulacija, 3 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg);

Slika 3b prikazuje dobijene promene u glukozi u plazmi poreklom iz insulinskih profila sa slike 3a;

Slike 4a i 4b pokazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) insulina iz Primera 2 formulisanog sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg) u poređenju sa profilom NovoRapid® / NovoLog® (insulin aspart, komercijalna formulacija, 3 cinka na 6 molekula insulina (0,5 i 1 nmol/kg) i rezultirajuće promene u glukozi u plazmi, tim redosledom;

Slike 5a i 5b pokazuju iste podatke kao na sl.4a i 4b, ali pokazuju samo podatke za insulin iz Primera 2 formulisan sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg) u poređenju sa profilom NovoRapid® / NovoLog® (insulin aspart, komercijalna formulacija, 3 cinka po 6 molekula insulina (1 nmol/kg) i dobijene promene u glukozi u plazmi, tim redosledom;

Slike 6 i 7 pokazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) insulina iz Primera 11 formulisanog sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg), i dobijene promene u glukozi u plazmi, tim redosledom;

Slike 8 i 9 pokazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) insulina iz Primera 44 formulisanog sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg) i dobijene promene u glukozi u plazmi (1 nmol/kg);

Slike 10 i 11 prikazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) insulina iz stanja tehnike A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 humani insulin (WO 2009/022013 Primer 45) formulisan sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg) i dobijenim promenama u glukozi u plazmi (1 nmol/kg);

Slike 12 i 13 prikazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) analoga tetradekanske kiseline, reprezentativnog iz stanja tehnike (WO 2009/022013, Primer 45, prikazan na sl.10 i 11, formulisan sa 0 cinka na 6 molekula insulina (72 nmol/životinja), i dobijene promene u glukozi u plazmi, tim redosledom;

Slike 14A, 14B i 14C prikazuju fluorescenciju u odnosu na vremenske grafikone, iz kojih se vreme zaostajanja može proceniti kao presek između linearne aproksimacije zone kašnjenja i zone fibrilacije;

Slika 15 prikazuje PK/PD profil derivata insulina iz Primera 2 nakon supkutane injekcije kod gojaznih Zucker pacova u odsustvu / prisustvu 170 mM nikotinamida;

Slike 16-17 prikazuju PK/PD profil derivata insulina iz Primera 7 nakon supkutane injekcije u gojazne Zucker pacove u odsustvu / prisustvu 170 mM nikotinamida;

Slike 18-19 pokazuju PK/PD profil derivata insulina iz Primera 7 nakon supkutane injekcije u gojazne Zucker pacove u odsustvu / prisustvu 170 mM nikotinamida; i

Slike 20-21 prikazuju PK/PD profil derivata insulina iz Primera 4 nakon supkutane injekcije kod gojaznih Zucker pacova u odsustvu / prisustvu 170 mM nikotinamida.

PRIMERI

Pronalazak je dalje ilustrovan pozivanjem na sledeće primere.

Ekspresija insulinskih analoga i prečišćavanje

Ekspresija insulinskih analoga

Analog insulina, tj. dvolančani neacilovani analozi insulina, za upotrebu prema pronalasku, proizvode se rekombinantno ekspresijom DNK sekvence koja kodira dotični analog insulina u pogodnoj ćeliji domaćinu poznatim tehnikama, npr. kako je stavljeno na uvid javnosti u US 6500645. Analog insulina se izražava direktno ili kao molekul prekursora koji može imati N-terminalni produžetak na B-lancu i/ li povezujući peptid (C-peptid) između B-lanca i A-lanca. Ovaj N-terminalni produžetak i C-peptid se odvajaju in vitro pogodnom proteazom, npr. Achromobactor lyticus proteazom (ALP) ili tripsinom, pa će prema tome imati mesto cepanja pored pozicije B1 i A1, tim redosledom. N-terminalni produžeci i C-peptidi tipa pogodnog za upotrebu prema ovom pronalasku otkriveni su u npr. US 5395922, EP 765395 i WO 9828429.

Polinukleotidna sekvenca koja kodira prekursor analognog insulina za upotrebu prema pronalasku može se pripremiti sintetički ustalјenim postupcima, npr. postupkom fosfoamidita koju je opisao Beaucage i sar. (1981) Tetrahedron Letters 221859-1869, or the method described by Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3801-805. Prema fosfoamiditnom postupku, oligonukleotidi se sintetišu u npr. automatskom sintetizatoru DNK, prečišćavaju,

1

dupleksiraju i podvezuju da bi se stvorio sintetički DNK konstrukt. Trenutno poželјan način pripreme DNK konstrukta je lančana reakcija polimeraze (PCR).

Rekombinantni postupak će obično koristiti vektor koji je sposoban da se replicira u izabranom mikroorganizmu ili ćeliji domaćina i koji nosi polinukleotidnu sekvencu koja kodira analogni prekursor insulina za upotrebu prema ovom pronalasku. Rekombinantni vektor može biti autonomno replicirajući vektor, tj. vektor koji postoji kao ekstrahromozomski entitet, čija replikacija je nezavisna od hromozomske replikacije, npr. plazmid, ekstrahromozomski element, mini-hromozom ili veštački hromozom. Vektor može da sadrži bilo koje sredstvo za obezbeđivanje samoreplikacije. Alternativno, vektor može biti onaj koji se, kada se unese u ćeliju domaćina, integriše u genom i replicira zajedno sa hromozomom(ima) u koji je integrisan. Dalјe, može se koristiti pojedinačni vektor ili plazmid ili dva ili više vektora ili plazmida koji zajedno sadrže ukupnu DNK koja se uvodi u genom ćelije domaćina ili transpozon. Vektor mogu biti linearni ili zatvoreni kružni plazmidi i poželјno će sadržati element(e) koji omogućavaju stabilnu integraciju vektora u genom ćelije domaćina ili autonomnu replikaciju vektora u ćeliji nezavisno od genoma.

Rekombinantni ekspresioni vekor može biti onaj koji je sposoban za repliciranje u kvascu. Primeri sekvenci koje omogućavaju vektoru da se replicira u kvascu su plazmidni 2 µm replikacioni geni REP 1-3 i poreklo replikacije.

Vektor može sadržati jedan ili više markera koji se mogu odabrati, što omogućava lak odabir transformisanih ćelija. Marker koji se može odabrati je genski proizvod koji obezbeđuje biocidnu ili virusnu rezistenciju, otpornost na teške metale, prototrofiju na auksotrofe i slično. Primeri bakterijskih selektivnih markera su dal geni iz Bacillus subtilis ili Bacillus licheniformis, ili markeri koji pružaju rezistenciju na antibiotike kao što su rezistencija na ampicilin, kanamicin, levomicetin ili tetraciklin. Markeri koji se mogu izabrati za upotrebu u vlaknastoj glјivičnoj ćeliji domaćina uklјučuju amdS (acetamidazu), argB (ornitin karbamoiltransferaza), pirG (orotidin-5'-fosfat dekarboksilaza) i trpC (antranilat sintaza). Pogodni markeri za ćelije domaćine kvasca su ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 i URA3. Pogodan selektivni marker za kvasac je Schizosaccharomyces pompe TPI gen (Russell (1985) Gene 40125-130).

U vektoru je polinukleotidna sekvenca operativno povezana sa pogodnom promoterskom sekvencom. Promoter može biti bilo koja sekvenca nukleinske kiseline koja pokazuje transkripcionu aktivnost u odabranoj ćeliji domaćina, uklјučujući mutantne, okrnjene i hibridne promotere, a može se dobiti iz gena koji kodiraju vanćelijske ili unutarćelijske polipeptide, homologne ili heterologne u ćeliji domaćinu.

Primeri pogodnih promotera za usmeravanje transkripcije u bakterijskoj ćeliji domaćinu su promoteri dobijeni iz E. coli lac operon, Streptomyces coelicolor gena agaraze

2

(dagA), Bacillus subtilis gena za levansukrazu (sacB), Bacillus licheniformis gena alfa amilaze (amyL), Bacillus stearothermophilus gena za maltogenu amilazu (amyM), Bacillus amyloliquefaciens gena alfa amilaze (amyQ), i Bacillus licheniformis gena penicilinaze (penP). Primeri pogodnih promotera za usmeravanje transkripcije u vlaknastoj glјivičnoj ćeliji domaćinu su promoteri dobijeni iz gena za Aspergillus oryzae TAKA amilazu, Rhizomucor miehei aspartičnu proteinazu, Aspergillus niger neutralu alfa amilazu, i Aspergillus niger kiselo stabilnu alfa amilazu. U domaćinu kvascu, korisni promoteri su Saccharomyces cerevisiae Ma1, TPI, ADH, TDH3 ili PGK promoteri.

Polinukleotidna sekvenca koja kodira kičmu insulinskog peptida za upotrebu prema pronalasku takođe će biti uobičajeno operativno povezana sa pogodnim terminatorom. U kvascu, pogodan terminator je TPI terminator (Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet.1419-434).

Postupci koji se koriste za kombinovanje polinukleotidne sekvence koja kodira analog insulina za upotrebu prema pronalasku, odnosno promotera i terminatora, i za njihovo umetanje u odgovarajući vektor koji sadrži informacije potrebne za replikaciju u izabranom domaćinu, dobro su poznati stručnjacima u tehnici. Razumeće se da se vektor može konstruisati ili tako što će se prvo pripremiti DNK konstrukt koji sadrži celu sekvencu DNK koja kodira kičme insulina za upotrebu prema pronalasku, a zatim ubaciti ovaj fragment u odgovarajući ekspresioni vektor, ili sekvencijalnim umetanjem fragmenata DNK koji sadrže genetske informacije za pojedinačne elemente (kao što su signal i pro-peptid (N-terminalni produžetak B-lanca), C-peptid, A- i B-lanci), praćeno ligacijom.

Vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira analog insulina za upotrebu prema pronalasku uvodi se u ćeliju domaćina, tako da se vektor održava kao hromozomski integrat ili kao samoreplicirajući ekstrahromozomski vektor. Izraz „ćelija domaćin“ obuhvata bilo koje potomstvo matične ćelije koje nije identično matičnoj ćeliji zbog mutacija koje se javlјaju tokom replikacije. Ćelija domaćin može biti jednoćelijski mikroorganizam, npr. prokariota ili nejednoćelijski mikroorganizam, npr. eukariota. Korisne jednoćelijske ćelije su bakterijske ćelije kao što su gram pozitivne bakterije, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na Bacillus ćeliju, a Streptomyces ćeliju, ili gram negativne bakterije kao što je E. coli i Pseudomonas sp. Eukariotske ćelije mogu biti ćelije sisara, insekta, biljke ili ćelije gljiva.

Ćelije domaćina mogu pogodno biti ćelije gljivica (kvasca). Kvasni organizam može biti bilo koji odgovarajući kvasni organizam koji pri kultivaciji izlučuje kičmu insulinskog peptida ili njegov prekursor u medijumu za kultivaciju. Primeri pogodnih gljivičnih ogranizama uključuju sojeve izabrane iz Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., i Geotrichum fermentans.

Transformacija ćelija kvasca može se, na primer, izvršiti formiranjem protoplasta, nakon čega sledi transformacija poznatim postupcima. Medijum koji se koristi za kultivaciju ćelija može biti bilo koji uobičajeni medijum pogodan za uzgoj kvasnih organizama.

Prečišćavanje analoga insulina

Sekretirani (izlučeni) analog insulina ili njegov prekursor mogu se iz medijuma izvaditi uobičajenim postupcima, uklјučujući razdvajanje ćelija kvasca iz medija centrifugiranjem, filtriranjem ili hvatanjem ili adsorpcijom analoga insulina ili njegovog prekursora na matrici jonske razmene ili na apsorpcionoj matrici obrnute faze, taloženje proteinskih komponenata supernatanta ili filtracijom pomoću soli, npr. amonijum sulfatom, praćeno prečišćavanjem različitim hromatografskim postupcima, npr. jonoizmenjivačkom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, itd.

Prečišćavanje i varenje kičmi insulinskog peptida prema ovom pronalasku izvodi se na sledeći način:

Jednolančani analogni prekursor insulina, koji može sadržati N-terminalni produžetak B-lanca i modifikovani C-peptid između B-lanca i A-lanca, prečišćava se i koncentriše iz supernatanta kulture kvasca katjonskom razmenom (Kjeldsen et al. (1998) Prot. Expr. Pur.14309-316).

Jednolančani analogni prekursor insulina sazreva u dvolančanu kičmu insulinskog peptida digestijom sa imobilizovanim ALP specifičnim za lizin (Kristensen et al. (1997) J. Biol. Chem.20 12978-12983) ili upotrebom tripsina za odvajanje N-terminalnog produžetka B-lanca, ako je prisutan, i C-peptida.

Varenje tripsina

Eluat iz koraka hromatografije katjonske razmene koji sadrži prekursor analognog insulina se razblaži vodom do koncentracije etanola od 15-20%. Glicin se dodaje koncentraciji od 50 mM i pH se podešava na 9.0-9.5 pomoću NaOH. Tripsin se dodaje u razmeri 1:300 (w:w) i varenje se može nastaviti na 4 stepena. Varenje se analitički nadgleda svakih 20 minuta dok se varenje ne završi. Varenje se završava dodavanjem 1 M limunske kiseline u razmeri 3:100 (v:v).

Reakcija varenja se analizira analitičkim LC na sistemu tečne hromatografije Waters Acquity ultra-performanse primenom kolone C18 i molekularna težina je potvrđena MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF).

4

Dvolančani analog insulina prečišćen je HPLC reverzne faze (sistem Waters 600) na koloni C18 koristeći gradijent acetonitrila. Želјeni analog insulina, npr. A22K, desB27, B29R, desB30 humani insulin, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin ili A22K, B3K, desB27, B29R, desB30 humani insulin se dobija liofilizacijom.

Čistoća se određuje analitičkim LC na sistemu tečne hromatografije ultraperformanse Waters Acquity koristeći kolonu C18, a molekularnu težinu potvrđuje MALDI-TOF MS.

Skraćenice

ALP – Achromobactor lyticus proteaza

C-peptide – povezujući peptid

HPLC - tečna hromatografija visokih performansi

IR – insulinski receptor

IGF-1R receptor za faktor rasta nalik insulinu 1

LC – tečna hromatografija

MALDI-TOF – vreme leta jonizacione laserske desorpcije potpomognute matricom MS - masena spektrometrija

PCR – lančana reakcija polimeraze

PD – farmakodinamika (efekat snižavanja glukoze u krvi/plazmi)

PG – glukoza u plazmi

PK – pharmacodynamics (blood/plasma insulin concentrations versus time profiles) tBu je tercbutil;

DCM je dihlorometan;

DIC je diizopropilkarbodiimid;

DIPEA = DIEA je N,N-dizopropiletilamin;

DMF je N,N-dimetilformamid;

DMSO je dimetil sulfoksid;

EtOAc je etil acetat;

Fmoc je 9-fluorenilmetiloksikarbonil;

γGlu (gGlu) is gama L-glutamil;

HCl je hlorovodonična kiselina;

HOBt je 1-Hidroksibenzotriazol;

NMP je N-metilpirolidon;

MeCN je acetonitril;

OEG je [2-(2-aminoetoksi)etoksi]etilkarbonil;

Su je sukcinimidil-1-il = 2,5-diokso-pirolidin-1-il;

Osu je sukcinimidil-1-iloksi = 2,5-diokso-pirolidin-1-iloksi;

RPC je hromatografija reverzne faze;

RT je sobna temperatura;

TCTU je O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluorborat; TFA je trifluoracetatna kiselina;

THF je tetrahidrofuran;

TNBS je 2,4,6-trinitrobenzensulfonska kiselina;

TRIS je tris(hidroksimetil)aminometan; i

TSTU je O-(N-sukcinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronijum tetrafluoroborat.

Opšta zapažanja

Sledeći primeri i opšti postupci odnose se na intermedijare i konačne proizvode identifikovane u specifikaciji i u shemama sinteze. Priprema jedinjenja iz ovog pronalaska je detalјno opisana koristeći sledeće primere, ali su opisane hemijske reakcije opisane u smislu njihove opšte primenlјivosti na pripremu jedinjenja prema pronalasku.

Povremeno, reakcija možda neće biti primenlјiva kako je opisano za svako jedinjenje koje je obuhvaćeno opisanim obimom pronalaska. Jedinjenja za koja se to dešava biće lako prepoznata od strane stručnjaka u tehnici. U ovim slučajevima reakcije se mogu uspešno izvesti konvencionalnim modifikacijama poznatim stručnjacima, tj. odgovarajućom zaštitom interferirajućih grupa, promenom u druge konvencionalne reagense ili rutinskom modifikacijom reakcionih uslova.

Alternativno, druge reakcije koje su ovde otkrivene ili na neki drugi način uobičajene biće primenlјive za pripremu odgovarajućih jedinjenja prema pronalasku. U svim preparativnim postupcima, svi početni materijali su poznati ili se lako mogu pripremiti od poznatih početnih materijala. Sve temperature su date u stepenima Celzijusa i ukoliko nije drugačije naznačeno, svi delovi i procenti su težinski kada se govori o prinosima, a svi delovi zapreminski kada se odnose na rastvarače i eluente.

Jedinjenja pronalaska se mogu prečistiti primenom jednog ili više sledećih postupaka koji su uobičajeni u tehnici. Ovi postupci se mogu - ako je potrebno - izmeniti s obzirom na gradijente, pH, soli, koncentracije, protok, kolone i tako dalјe. U zavisnosti od faktora kao što su profil nečistoće, rastvorlјivost dotičnih insulina itd., ove modifikacije može lako prepoznati i izvršiti stručnjak u tehnici.

Posle kisele HPLC ili desalinizacije, jedinjenja se izoluju liofilizacijom čistih frakcija. Posle neutralne HPLC ili hromatografije sa izmenjivanjem anjona, jedinjenja se odsoljavaju, talože na izoelektričnom pH ili prečišćavaju kiselom HPLC.

Uobičajene procedure prečišćavanja

RP-HPLC sistem:

Gilson sistem koji se sastoji od sledećeg: Liquid handler Model 215, Pumpa Model 322-H2 i UV Detektor Model 155 (UV 215 nm i 280 nm).

Sistem za razmenu anjona i odsoljavanje:

Äkta Explorer sistem koji se sastoji od sledećeg: Pumpa Model P-900, UV detektor Model UV-900 (UV 214, 254 i 280 nm), pH i detektor provodljivosti Model pH/C-900, Fraction collector Model Frac-950.

Acidic RP-HPLC:

Kolona: Phenomenex Gemini, 5µM 5u C18110Å, 30x250mm Protok: 20 ml/min

Pufer A: 0,1% TFA u vodi

Pufer B: 0,1% TFA u acetonitrilu

Neutralni RP-HPLC:

Kolona: Phenomenex Gemini, 5µM 5u C18110Å, 30x250mm Protok: 20 mL/min

Pufer A: 10 mM Tris, 15 mM (NH4)2SO4, pH = 7.3, 20% acetonitril u milliQ

Pufer B: 20% milliQ u acetonitrilu

Hromatografija razmene anjona:

Materijal u koloni: Poros50HQ ili Source30Q

Protok: zavisan od kolone

Pufer A: 15mM Tris, 25 mM NH4OAc, 50% EtOH, pH = 7.5.

Pufer B: 15 mM Tris, 500 mM NH4OAc, 50% EtOH, pH = 7.5.

Odsoljavanje:

Kolona: HiPrep 26/10

Protok: 20 mL/min

Pufer A: 0,1% TFA u vodi

Pufer B: 0,1% TFA u acetonitrilu

Reagensi acilacije su sintetizovani ili u rastvoru (vidi u daljem tekstu) ili u čvrstoj fazi kako je opisano kao u npr. WO 2009/115469.

Opšte procedure za sintezu čvrste faze reagenasa acilacije opšte Formule III

[Acyl]-[Linker]-Act

pri čemu su Acil i Linker grupe kao što je gore definisano, a Act je odlazeća grupa aktivnog estra, kao što je N-hidroksisukcinimid (OSu), ili 1-hidroksibenzotriazol, i

pri čemu su karboksilne kiseline u Acilnom i Linkernom delu acilnog dela zaštićene kao terc-butil estri.

Jedinjenja opšte formule III mogu se sintetisati na čvrstom nosaču primenom postupaka u tehnici sinteze peptida u čvrstoj fazi poznatih stručnjaku.

Jedan takav postupak obuhvata vezivanje Fmoc zaštićene amino-kiseline na polistirensku 2-hlortritilhloridnu smolu. Vezivanje se može postići upotrebom slobodne N-zaštićene amino-kiseline u prisustvu tercijarnog amina, poput trietil amina ili N,N-diizopropiletilamina (videti reference ispod). C-terminalni kraj (koji je vezan za smolu) ove amino-kiseline nalazi se na kraju sintetičke sekvence koja je povezana sa matičnim insulinima prema pronalasku.

Nakon vezivanja Fmoc amino-kiseline za smolu, uklanja se zaštite sa Fmoc grupe, koristeći, na primer, sekundarne amine, poput piperidina ili dietil amina, nakon čega sledi uparivanje druge (ili iste) Fmoc zaštićene amino-kiseline i uklanjanje zaštite. Sintetička sekvenca se završava spajanjem mono-terc-butil zaštićene masne ( α, ω) dikiseline, poput mono-tert-butil estara heksadekanske, pentadekanske ili tetradekanske kiseline.

Odvajanje jedinjenja od smole se vrši primenom razblažene kiseline poput 0,5-5% TFA / DCM (trifluorosirćetne kiseline u dihlorometanu), sirćetne kiseline (npr.10% u DCM ili HOAc / triflouroetanol / DCM 1:1:8), ili hekafluoroizopropanola u DCM (videti npr. F.Z.

Dörwald: Organic Synthesis on Solid Phase; Wiley-VCH 2000, ISBN 3-527-29950-5; N. Sewald & H.-D. Jakubke: Peptides: Chemistry and Biology; Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3; or The Combinatorial Cheemistry Catalog, 1999, Novabiochem AG i tamo navedene reference). Ovo osigurava da terc-butil esteri prisutni u jedinjenjima kao zaštitne grupe karboksilne kiseline nisu bez zaštite.

Konačno, C-terminalna karboksi grupa (oslobođena od smole) se aktivira, npr. Kao N-hidroksisukcinimid estar (OSu). Ovaj aktivirani estar je uklonjen, npr. korišćenjem čistog TFA i korišćen direktno ili nakon prečišćavanja (kristalizacije) kao reagens za spajanje u vezi sa matičnim insulinima prema pronalasku. Ova procedura je prikazana u daljem tekstu.

Primer koji prikazuje opštu proceduru za sintezu reagensa za acilaciju u čvrstoj fazi:

Sinteza tetradekanedioil-4xgGlu-OSu (Chem.4)

2-Hlortritil smola 100-200 mesh 1,5 mmol/g (15,79 g, 23,69 mmol) ostavljena je da bubri u suvom dihlormetanu (150 mL) tokom 20 minuta. Rastvor Fmoc-Glu-OtBu (6,72 g, 15,79 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (10,46 ml, 60,01 mmol) u suvom dihlorometanu (120 ml) je dodat smoli i smeša je mućkana 16 sati. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) u metanol/dihlormetan smeši (9:1, 150 mL, 5 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL).

Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), 2-propanol (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL). Rastvor Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (7,43 ml, 42,64 mmol) u N,N-dimetilformamidu (120 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 16 sati. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) u metanol/dihlormetan smeši (9:1, 150 mL, 5 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL).

Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), 2-propanolom (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL). Rastvor Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) u N,N-dimetilformamidu (120 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 16 sati. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) u metanol/dihlormetan smeši (9:1, 150 mL, 5 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL).

Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), 2-propanolom (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL). Rastvor Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) i N,Ndiizopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) u N,N-dimetilformamidu (120 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 16 sati. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) u metanol/dihlormetan smeši (9:1, 150 mL, 5 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL).

Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), 2-propanolom (2 x 150 mL), dihlormetanom (2 x 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL). Rastvor mono-terc-butil estar tetradekandiojske kiseline (7,45 g, 23,69 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) u smeši N,N-dimetilformamida (40 mL) i dihlormetana (80 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 16 sati. Smola je filtrirana i isprana dihlormetanom (2 x 150 mL), N,N-dimetilformamidom (2 x 150 mL), metanolom (2 x 150 mL) i dihlormetanom (10 x 150 mL).

Proizvod je odvojen od smole tretiranjem sa trifluoretanolom (150 mL) tokom noći. Smola je filtrirana i isprana dihlormetanom (3 x 100 mL). Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu (gradijent elucije dihlorometan/metanol 100:0 do 95:5) dajući naslovlјeno jedinjenje u obliku bele čvrste supstance.

Proizvod je osušen in vacuo da bi se dobio (S)-2-((S)-4-tert-Butoksikarbonil-4-{(S)-4-tert-butoksikarbonil-4-[(S)-4-tert-butoksikarbonil-4-(13-tert-butoksikarbonil-tridekanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-glutarna kiselina 1-tert-butil estar.

Prinos: 14,77 g (89%).

<1>H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, δH): 7,22 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 6,97 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 6,72 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 6,41 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 4,59-4,43 (m, 4 H); 2,49-2,13 (m, 16 H); 2,06-1,72 (m, 4 H); 1,70-1,52 (m, 4 H); 1,52-1,38 (m, 45 H); 1,35-1,21 (m, 16 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 7,39 min.

LC-MS m/z: 1055,0 (M+H)+.

Dobijeni terc-butyl zaštićeni tetradekanedioil-4xgGlu-OH ((S)-2-((S)-4-terc-Butoksikarbonil-4-{(S)-4-terc-butoksikarbonil-4-[(S)-4-terc-butoksikarbonil-4-(13-tercbutoksikarbonil-tridekanoilamino)-butirilamino]- butirilamino}- butirilamino)-glutarna kiselina 1-terc-butil ester) je rastvoren u tetrahidrofuran. DIPEA je dodat a nakon toga TSTU rastvoren u acetonitrilu. Reakciona smeša je mešana 3 h, a zatim uparena in vacuo, ponovo

4

rastvorena u etil acetatu, isprana sa 0,1M HC1 (aq), osušean preko MgSO4, filtrirana i ispari in vacuo. LC-MS (elektrosprej): m/z = 1174,7 (M+Na<+>). Calc: 1175,4.

Zaštićeno i OSu aktivirano jedinjenje rastvoreno je u 10 ml TFA i mešano na sobnoj temperaturi preko noći. Dodaje se dietil etar i formirani talog se odfiltrira i osuši u vakuumu preko noći da se dobije (S)-2-((S)-4-karboksi-4-{(S)-4- karboksi -4-[(S)-4- karboksi -4-(13-karboksi -tridekanoilamino)- butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)- pentanske kiseline 5-(2,5-diokso-pirolidin-1-il) estar (tetradekandioil-4xgGlu-OSu). LC-MS (elektrosprej): m/z = 872,2 (M+H<+>). Calc: 871.9.

Primer koji prikazuje opštu proceduru za sintezu reagensa acilacije u čvrstoj fazi:

Sinteza tetradekanedioil-gGlu-2xOEG-OSu (Chem.5)

13-{(S)-1-tert-Butoksikrbonil-3-[2-(2-{[2-(2-karboksimetoksi-etoksi)-etilkarbamoil]-metoksi}-etoksi)-etilkarbamoil]-propilkarbamoil}-tridekanska kiseline terc-butil estar

2-Hlortritil smola 100-200 mesh 1,7 mmol/g (79,8 g, 135,6 mmol) ostavljena je da bubri u suvom dihlormetanu (450 mL) tokom 20 minuta. Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 34,9 g, 90,4 mmol) i N,N-diisopropiletilamina (59,9 mL, 343,6 mmol) u suvom dihlormetanu (100 mL) dodat je smoli i smeša je mućkana 4 sata. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-diisopropiletilamina (31,5 mL, 180,8 mmol) u metanol/dihlormetan smeši (4:1, 150 mL, 2 x 5 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 300 mL), dihlormetanom (2 x 300 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 x 300 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretiranjem sa 20% piperidina u dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 300 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 300 mL), 2-propanolom (2 x 300 mL) i dihlormetanom (350 mL, 2 x 300 mL).

Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 52,3 g, 135,6 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluorborat (TCTU, 48,2 g, 135,6 mmol) i N,N-diisopropiletilamin (42,5 mL, 244,1 mmol) u N,N-dimetilformamid (250 mL) dodat je smoli i smeša je mućkana 2 sata. Budući da je ninhidrinski test i dalje poztivan, smola je filtrirana i tretirana istom količinom reagensa još 30 minuta. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 300 mL), dihlormetanom (2 x 300 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 x 300 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretiranjem sa 20% piperidina u dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 300 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 300 mL), 2-propanolom (2 x 300 mL) i dihlormetanom (350 mL, 2 x 300 mL).

Rastvor (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-1-terc-butil estrom pentanske kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 57,7 g, 135,6 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluorborat (TCTU, 48,2 g, 135,6 mmol) i N,N-diisopropiletilamin (42,5 mL, 244,1 mmol) u N,N-dimetilformamidu (250 mL) dodat je smoli i smeša je mućkana 1 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 300 ml), dihlormetanom (2 x 300 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 x 300 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretiranjem sa 20% piperidina u dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 300 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 300 mL), 2-propanolom (2 x 300 mL) i dihlormetanom (350 mL, 2 x 300 mL).

Rastvor mono-terc-butil estar tetradekandiojske kiseline C14(OtBu)-OH, 42.7 g, 135.6 mmol),O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 48,2 g, 135,6 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (42,5 ml, 244,1 mmol) u smeši dichlorometana/N,N-dimetilformamida (4:1, 300 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1,5 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (6 x 300 mL), dihlormetanom (4 x 300 mL), metanolom (4 x 300 mL) i dihlormetanom (7 x 600 mL).

Proizvod je odvojen od smole tretiranjem sa 2,2,2-trifluoroetanolom (600 mL) tokom 18 sati. Smola se isfiltrira i ispere sa dihlormetanom (4 x 300 mL), smešom dihlormetana/2-propanola (1:1, 4 x 300 mL), 2-propanolom (2 x 300 mL) i dihlormetanom (6 x 300 mL). Rastvori su kombinovani; rastvarač uparen, a sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni (silikagel 60A, 0,060-0-0,200 mm; eluent: dihlormetan/metanol 1:0-9:1).

Čist 13-{(S)-1-terc-Butoksikarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-carboksimetoksi-etoski)-etilkarbamoil]- metoksi}- etoski)- etilkarbamoil]-propilkarbamoil}-tridekanske kiseline terc-butil estar je osušen in vacuo i dobijen kao narandžasto ulje.

Prinos: 55,2 g (77%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 9:1): 0,35.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, δH): 7,37 (bs, 1 H); 7,02 (bs, 1 H); 6,53 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 4,54-4,38 (m, 1 H); 4,17 (s, 2 H); 4,02 (s, 2 H); 3,82-3,40 (m, 16 H); 2,37-2,12 (m, 7 H); 2,02-1,82 (m, 1 H); 1,71-1,51 (m, 4 H); 1,47 (s, 9 H); 1,43 (s, 9 H); 1,25 (bs, 16 H).

LC-MS purity: 100%.

LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitril/voda 70:30 do 100:0 0,1% FA): 3,93 min.

LC-MS m/z: 791.0 (M+H)+.

13-{(S)-1-terc-Butooksikarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-karboksimetoksi-etoksi)-etilkarbamoil]-metoksi}- etoksi)-etilkarbamoil]-propilkarbamoil}-tridekanske kiseline terc-butil estar (tetradekandioil-gGlu-2xOEG-OH, 8.89 g, 11,3 mmol)) rastvoren je u 100 ml acetonitrila i dodani su TSTU (4,07 g, 13,5 mmol) i DIPEA (2,35 ml, 13,5 mmol) mešanom rastvoru i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Rastvarač je uparen, a ostatak je rastvoren u dihlorometanu i ispran dva puta sa 0,05 M HCl.

Organska faza je osušena (MgSO4) i uparena in vacuo. Ovim se dobilo 9,98 g (100%) 13-((S)-1-terc-Butoksikarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-diokso-pirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)-etoksi]-etilkarbamoil}-metoksi)-etoksi]-etilkarbamoil}-propilkarbamoil)-tridekanske kiseline terc-butil estar kao ulje.

13-((S)-1-terc Butoksikarbonil -3-{2-[2-({2-[2-(2,5-diokso-pirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)- etoksi]- etilkarbamoil}- metoksi)- etoksi]- etilkarbamoil}-propilkarbamoil)- tridekanske kiseline tercbuti estar (4 g) je rastvoren u trifluorosirćetnoj kiselini (10 ml) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat i uparena in vacuo. Ostatak je rastvoren u dihlormetanu (10mL) i uparen in vacuo. Dodavanjem hladnog dietil etra (10 ml) došlo je do taloženja bele masne čvrste supstance. Ovo je izolovano dekantiranjem i osušeno in vacuo. Ovim je dobijeno 3,4 g (kvant.) 14-[[(1S)-1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2- oksoetoksi] etoksi] etilamino]-4-oksobutil]amino]-14-oksotetradekanske kiseline (tetradekandioil-gGlu-2xOEG-OSu), koja je čuvana na -18°C.

LC-MS (elektrosprej): m/z = 775,33; calc: 774,8.

Acilacija i prečišćavanje derivata insulina

Opšti postupak (A) za acilaciju i prečišćavanje derivata insulina prema pronalasku je opisan u Primeru 1, u daljem tekstu. Ovaj postupak je takođe primenjen na sintezu jedinjenja Primera 2-25, u daljem tekstu. Prečišćavanje korišćenjem drugih postupaka (kao što je gore opisano) takođe je izvršeno za neke od ovih derivata.

Primer 1; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4- karboksi-4-[[(4S)-4-

4

karboksi -4-(13-karboksitridekanoilamino) butanoil]amino]butanoyl]amino]butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

<H>

A22K, desB27, B29R, desB30 humani insulin (2,0 g) je rastvoren u 40 mL 0,1M Na2CO3(aq), i pH podešen na 11,2 sa 1M NaOH (aq). Tetradekanedioil-4xgGlu-OSu (0,454 g) je rastvoren u 2 ml DMF-a i dodat je kap po kap rastvoru insulina, uz održavanje pH na konstantnom nivou od 11,2 sa 1M NaOH (aq,). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta, zatim je neutralisana do pH = 7,5 upotrebom 0,1M HCl (aq,) i razblažena sa 1:1 EtOH/milliQ vode.

Dobijeni insulin je prečišćen hromatografijom sa izmenjivanjem anjona na koloni Poros50HQ 74mL, eluiranjem sa 25 do 500 mM amonijum acetata u 15 mM Tris, 50 v/v% etanola, pH 7,5 (sirćetna kiselina). Odsoljavanje čistih frakcija je izvedeno na koloni reverzne faze eluiranjem gradijentom acetonitrila u milliQ vodi koja sadrži 0,1% trifluorosirćetne kiseline. Dobijeni čisti insulin je liofilizovan. LC-MS (elektrosprej): m/z = 1629.98 (M+4)/4. Calc: 1630.65.

Acilacioni reagens, tetradekandioil-4xgGlu-OSu, je sintetizovan kako je gore opisano.

Primer 2; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksi tridekanoilamino)butanoil]amino] butanoil] amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

Ovaj analog je pripremljen prema postupku opisanom u Primeru 1.

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1633.9 (M+4H<+>). Calc: 1634.4

Primer 3; Opšti postupak (A)

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluA14,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksi tridekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

<H>F VN Q HL C GS H LV E A L YL VC G ER G F F YP R<OH>

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1622.2 (M+4)/4. Calc: 1622.1

4

Primer 4; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)- peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(15- karboksi pentadekanoilamino) butanoil]amino] butanoil] amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

FVEQHL C G S HLV EA L Y L V C G E R G F F Y P R

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1641.2 (M+4H<+>). Calc: 1641.4.

Primer 5; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(15-karboksipentadekanoilamino) butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] etoksi] etoksi] acetil]Lys,(B)-peptid.

4

HF V<*>EQ H LC G SH L V EA L Y L V C G E R G F F Y P<*>R OH

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1616.6 (M+4)/4. Calc: 1617.1

Primer 6; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(15- karboksi pentadekanoilamino) butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino]butanoyl]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

H F V E* Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y P R * OH LC-MS (elektrosprej): m/z = 1749.9 (M+4)/4. Calc: 1750.3

Primer 7; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

4

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GlnB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksi tridekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1634.2 (M+4)/4. Calc: 1633.1

Primer 8; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GlnB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(15- karboksi pentadekanoilamino) butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] etoksi] etoksi]acetil]Lys,(B)-peptid.

<H>LC-MS (elektrosprej): m/z = 1616.6 (M+4)/4. Calc: 1615.8.

4

Primer 9; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GlnB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(15- karboksi pentadekanoilamino) butanoil] amino]etoksi] etoksi]acetil] amino] butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetyl]amino] butanoil] amino] etoksi] etoksi]acetil] amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

<H>LC-MS (elektr<*>osprej): m/z = 1749.8 (M+4)/4. Calc: 1748.5<*>

Primer 10; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xgGlu), desB27, B29R, desB30 human insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13-karboksitridekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1565.6 (M+4)/4. Calc: 1566.1

4

Primer 11; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-(15- karboksipentadekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]amino]butanoyl]-amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

<H *>LC-MS (elektrosprej): m/z = 1637.4 (M+4)/4. Calc: 1636.6

Primer 12; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(15-karboksipentadekanoilamino) butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] etoksi] etoksi]-acetil]Lys,(B)-peptid.

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1613.2 (M+4)/4. Calc: 1613.4

Primer 13; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi -4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(15- karboksi pentaekanoilamino) butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetyl]amino] butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

H F V N Q H L CG SH L V E A L Y L V CG ERG F F Y P R * OH LC-MS (elektrosprej): m/z = 1746.4 (M+4)/4. Calc: 1746.5.

Primer 14; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksitridekanoilamino) butanoil]Lys,(B)-peptid.

<H>LC-MS (elektrosprej): m/z = 1533.2 (M+4)/4. Calc: 1533.8

Primer 15; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(13-karboksitridekanoilamino) butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] etoksi] etoksi]-acetil]Lys,(B)-peptid.

1

<H>LC-MS (elektrosprej): m/z = 1610.7 (M+4)/4. Calc: 1610.1

Primer 16; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GlnB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] etoksi] etoksi]-acetil]Lys,(B)-peptid.

<H>LC-MS (elektrosprej): m/z = 1609.7 (M+4)/4. Calc: 1609.9

Primer 17; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetyl]amino] etoksi] etoksi]-acetil]Lys,(B)-peptid.

2

<H>LC-MS (elektrosprej): m/z = 1606.3 (M+4)/4. Calc: 1606.4

Primer 18; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GlnB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(15- karboksi pentadekanoilamino)butanoil]amino]butanoil] amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

F VQ SHL V EA L

trosprej): m/z = 1640.9<*>QHL CG Y L V C G E R GF F Y P R LC-MS (elek (M+4)/4. Calc: 1641.1<* OH>

Primer 19; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-pentadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(14- karboksitetradekanoilamino) butanoil]amino] butanoil] amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

<H>FV E HL L V E A L Y L V E R F

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1637.63 (M+4)/4. Calc: 1636.76

Primer 20; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksitridekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]-amino] butanoil]amino] butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] etoksi]-etoksi]acetil]Lys,(B)-peptid.

HF V N Q H LCGSHLVEALYLV CGERGFFYP R * OH

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1703.0 (M+4)/4. Calc: 1703.2

4

Primer 21; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksitridekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetyl]amino] etoksi] etoksi]-acetil]Lys,(B)-peptid.

H F V E* Q H L CG S H L V E A L Y L V CG E RG F F Y P R * OH

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1706.6 (M+4)/4. Calc: 1707.0

Primer 22; Opšti postupak (A)

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluA14,GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksi -tridekanoilamino)butanoil]amino] etoksi] etoksi]acetil]amino] etoksi] etoksi]acetil]Lys,(B)-peptid.

H F V E Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y P R OH

<* *>LC-MS (elektrosprej): m/z = 1601.9 (M+4)/4. Calc: 1601.6

Primer 23; Opšti postupak (A)

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluA14,GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-(13- karboksitridekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

<H OH>LC-MS (electrosprej): m/z = 1625.9 (M+4)/4. Calc: 1625.8

Primer 24; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(humani)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-peptid.

H F V E* Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y P R * OH LC-MS (elektrosprej): m/z = 1537.7 (M+4)/4. Calc: 1537.5

Primer 25; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)-butanoil]Lys,(B)-peptid.

LC-MS (elektrosprej): m/z = 1537.7 (M+4)/4. Calc: 1537.5

Primer 26; Opšti postupak (A)

A22K(N(eps)-tetradekandioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; IUPAC (OpenEye, IUPAC stil) naziv: N{Alpha}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulin(human)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4- karboksi -4-[[(4S)-4-karboksi -4-(13- karboksi tridekanoilamino) butanoil]amino] butanoil]amino] butanoil]Lys,(B)-peptid.

H F V E * Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y P R * OH

Ovaj analog može se pripremiti prema postupku opisanom u Primeru 1.

Primer 27; Afinitet receptora za insulin za odabrane derivate insulina prema pronalasku, mereno na solubilizovanim receptorima

Relativni afinitet vezivanja analoga insulina prema pronalasku za receptor humanog insulina (IR) određuje se kompetitivnim vezivanjem u scintilacijskom testu blizine (SPA) (prema Glendorf T et al. (2008) Biochemistry 474743-4751).

Ukratko, serije razblaživanja humanog insulinskog standarda i analoga insulina koji se ispituju izvode se u Optiplates-u sa 96 ležišta (Perkin-Elmer Life Sciences), a zatim se dodaje [<125>I-A14Y]-humani insulin, anti-IR mišje antitelo 83-7, solubilizovani humani IR-A (poluprečišćen hromatografijom aglutininina pšeničnih klica iz ćelija bubrega beba hrčka (BHK) koje prekomerno eksprimuju IR-A holoreceptor) i SPA perle (Anti -Mišje poliviniltoluenske SPA perlice, GE Healthcare) u puferu za vezivanje koji se sastoji od 100 mM HEPES (pH 7.8), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4,i 0,025% (v/v) Tween-a 20. Ploče se inkubiraju laganim mućkanjem 22-24 h na 22°C, centrifugiraju se na 2000 obrtaja u minuti tokom 2 minuta i broje na TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences).

Podaci iz SPA se analiziraju prema četvoroparametarskom logističkom modelu (Vølund A (1978) Biometrics34357-365), i afiniteti vezivanja analoga izračunati su u odnosu na standard humanog insulina izmeren na istoj ploči.

Takođe se koristi srodni test gde pufer za vezivanje sadrži 1,5% HSA (w/v) (Sigma A1887) kako bi se imitiralo više fizioloških uslova.

Afiniteti receptora insulina i drugi in vitro podaci o odabranim analozima insulina prema pronalasku predstavlјeni su u Tabeli 1 u daljem tekstu.

Primer 28; Afiniteti receptora i faktor 1 rasta za insulin i sličan insulinu odabranih derivata insulina prema pronalasku, mereno na receptorima povezanim sa membranom

Membranski povezani humani IR i IGF-1R se prečišćavaju iz BHK ćelija, stabilno transfektovanih pZem219B vektorom koji sadrži ili humani IR-A, IR-B ili IGF-IR inserciju. BHK ćelije se sakuplјaju i homogenizuju u ledeno hladnom puferu (25 mM HEPES pH 7,4, 25 mM CaCl2i 1 mM MgCl2, 250 mg/L bacitracina, 0,1 mM Pefablock). Homogenati se u slojevima na 41% (w / v) saharoznom jastuku i centrifugiraju 75 minuta na 95000g na 4°C. Membrane plazme se sakuplјaju, razblažuju 1:5 puferom (kao gore) i ponovo centrifugiraju 45 minuta na 40000g na 4°C. Pelet se suspenduje u minimalnoj zapremini pufera i povlači kroz iglu (veličina 23) tri puta pre skladištenja na -80°C do upotrebe.

Relativni afinitet vezivanja za bilo koji od membranski povezanih humanih IR-A, IR-B ili IGF-1R određuje se konkurentskim vezivanjem u SPA postavci. IR testovi se izvode u duplikatu na OptiPlates-u sa 96 ležišta (Perkin-Elmer Life Sciences). Membranski protein se inkubira laganim mešanjem 150 minuta na 25°C sa 50 pM [<125>I-A14Y]-humanim insulinom u ukupnoj zapremini od 200 µL pufera za ispitivanje (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 0,01% Triton X-100, 0,1% (w / v) HSA (Sigma A1887), kompletni inhibitori proteaze bez EDTA), 50 µg PVT mikrosfera obloženih aglutinatom pšeničnih klica (WGA) (GE Healthcare) i sve veće koncentracije liganda. Analize se završavaju centrifugiranjem ploče na 2000 rpm tokom 2 minuta i vezana radioaktivnost kvantifikovana je računanjem na TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences).

IGF-1R testovi se izvode u osnovi kao i za testove IR vezivanja, osim što su korišćeni IGF-1R povezani sa membranom i 50 pM [<125>I-Tyr31]-humani IGF-1. Podaci iz SPA se analiziraju prema četvoroparametarskom logističkom modelu (Vølund A (1978) Biometrics34357-365), a afiniteti vezivanja analoga koji se ispituju izračunati su u odnosu na standard humanog insulina izmeren na istoj ploči.

Podaci o vezivanju IR (A izoforme) i IGF-1R izabranih analoga insulina prema pronalasku dati su u Tabeli 1 u daljem tekstu.

Tabela 1

Podaci o vezivanju IR (A izoform) i IGF-1 receptora izabranih insulinskih analoga pronalaska

*) Solubilizovani klonirani izoform humanog insulinskog receptora A, podaci izraženi u% u odnosu na humani insulin, protokol dat u Primeru 27.

**) Klonirani membranski povezani izoformni receptor A humanog insulina, podaci izraženi u % u odnosu na humani insulin, protokol dat u Primeru 28.

***) Klonirani membranski povezani receptor za faktor-1 rasta sličan humanom insulinu, podaci izraženi u % u odnosu na humani insulin, protokol dat u Primeru 28.

****) Odnos afiniteta IR-A prema IGF-1R iz receptora povezanih sa membranom, protokoli iz Primera 28.

Primer 29; Ravnoteža monomera i dimera analizirana razblaživanjem SEC-HPLC Izvedena je serija razblaživanja sa SEC-HPLC (HPLC za izuzimanje veličine) da bi se procenila ravnoteža monomer-dimera insulina bez cinka. Ubrizgavanjem promenlјive zapremine (2,5-80 µL) od 0,6 mM analoga insulina za ispitivanje na koloni Superose 12 10/300 GL i eluiranjem sa 140 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.7 sa brzinom protoka 0,8 ml/min, uzorak se razblaži praktično proporcionalno zapremini injekcije. Na osnovu pomeranja vremena zadržavanja u funkciji razblaženja, izračunata su dva parametra; porast molekulske težine (Mw-porast) i R-nagib.

R-nagib je izveden kao nagib graničnog vremena zadržavanja u odnosu na log(zapreminska količina ubrizgavanja), dok je povećanje Mw izračunato pomoću skupa referentnih uzoraka kao prividni porast molekularne težine između najniže i najviše zapremine ubrizgavanja. Oba parametra odražavaju tendenciju analognog insulina da se disocira kao odgovor na razblaženje, a time i potencijal za brzu disocijaciju na monomere nakon sc. ubrizgavanja.

1

Rezultati ovih određivanja i rezultata analoga insulina iz stanja tehnike su predstavlјeni u tabelama 2-4, u daljem tekstu.

Tabela 2

Povećanje molekularne mase (Mw-povećanje)

Jedinjenja pronalaska

Tabela 3

Povećanje molekularne mase (Mw-povećanje)

Jedinjenja iz stanja tehnike (WO 2009/022013

)

2

Dati primeri brojeva su A22K acilovani analozi bez delecija B27Thr ostatka (desB27) poznati i opisani u stanju tehnike (e.g. WO 2009/022013).

Tabela 4

Povećanje molekularne mase (Mw-povećanje)

Jedinjenja iz stanja tehnike (WO 2007/096431

)

*) Nisu dobijeni podaci usled loše rastvorljivosti analoga insulina na pH 7.4

Dati primeri brojevi su analizirani A22K acilovani analozi bez brisanja ostatka B27Thr (desB27) poznatog i opisanog u stanju tehnike (npr. WO 2007/096431).

Zaključak

Može se zaklјučiti da su A22K acilovani insulini prema pronalasku, koji su analozi desB27, mnogo skloniji disocijaciji kao odgovor na razblaživanje i stoga su mnogo upotreblјiviji za davanje prandijalnog bolusa od sličnih analiziranih A22K analoga (bez brisanja ostatka B27Thr ) iz stanja tehnike. Dalјe se može zaklјučiti da insulini prema pronalasku u ovom testu podsećaju na insulin aspart (komercijalno dostupan kao NovoRapid® ili NovoLog® (Novo Nordisk A/S), koji se koristi kao prandijalni insulin) više nego na humani insulin (takođe se koristi kao prandijalni insulin, ali sa sporijim akcionim profilom od profila insulina aspart) podvlačeći pobolјšana svojstva derivata pronalaska u odnosu na ona iz stanja tehnike.

Svi analozi pronalaska imaju manje negativan R-nagib -0,13 do -0,02 (Tabela 2), što podseća na insulin aspart (R-nagib -0,04; vidi Tabelu 3) mnogo više od humanog insulina (R-nagib -0,65; vidi Tabelu 3). Suprotno tome, svi testirani slični analozi iz stanja tehnike imaju R-nagib sličan onom humanog insulina (-0,52 do -0,78; Tabele 3 i 4). Shodno tome, svi analozi pronalaska su pokazali manje povećanje Mw od onih iz stanja tehnike (do 10,7% nasuprot 53-83%, respektivno (videti tabele 2, 3 i 4).

Ovi podaci ukazuju da su jedinjenja pronalaska monomernija od sličnih analoga iz stanja tehnike. U tom pogledu, jedinjenja pronalaska podsećaju na insulin aspart, dok slični analozi iz stanja tehnike podsećaju na humani insulin.

Primer 30; Samo-asocijacija izmerena raspršivanjem rentgenskih zraka pod malim uglom (SAXS)

SAXS podaci su korišćeni za procenu stanja samo-asocijacije analoga insulina koji će se testirati nakon supkutane injekcije. SAXS podaci su prikuplјeni iz formulacija bez Zn koje sadrže 0,6 mM analoga insulina za ispitivanje i 140 mM NaCl pri pH 7.4. Za svaki analog, procenjene su odgovarajuće količine monomera, dimera i većih vrsta koristeći činjenicu da profil rasipanja SAXS doprinosi intenzitetu svih pojedinačnih komponenti u višekomponentnoj smeši. Korišćenjem intenziteta (faktora oblika) iz svake komponente moguće je proceniti doprinos zapreminskog udela svake komponente u smeši. Sistem linearnih jednačina koji koristi algoritam nenegativnih ili neograničenih najmanjih kvadrata koristi se kako bi se umanjio nesklad između eksperimentalne i izračunate krive rasejanja. Faktori oblika izračunavaju se na osnovu kristalnih struktura monomera, dimera, heksamera, itd. Zapreminski udeli izraženi su u procentima (%).

Prosečna molekularna težina se aproksimira korišćenjem referentnog uzorka sa poznatom koncentracijom i pretpostavlјajući da je odnos molekulskih masa identičan odnosu raspršenog intenziteta pod nultim uglom, I (0), normalizovanom u odnosu na izmerene koncentracije.

Rezultati dobijeni iz derivata pronalaska i derivata iz stanja tehnike prikazani su u tabelama 5, 6 i 7 u daljem tekstu.

Tabela 5

SAXS podaci o derivatima prema pronalasku

4

Tabela 6

SAXS podaci o derivatima iz stanja tehnike (WO 2009/022013

)

Tabela 7

SAXS podaci o derivatima iz stanja tehnike (WO 2007/096431

)

*) Derivati istaloženi u testnom puferu ukazuju na pristustvo veoma velikih vrsta ili agregata. Nisu dobijeni podaci.

Iz ovih studija može se zaklјučiti da su derivati pronalaska, u uslovima koji imitiraju uslove u potkožnom tkivu nakon injekcije, mnogo skloniji disocijaciji na monomere i zbog toga će se apsorbovati mnogo brže nakon supkutane injekcije nego analozi iz stanja tehnike. Monomerni sadržaj se kreće od 63-83% za analoge pronalaska, naspram 0-48% za analoge iz stanja tehnike. Dalјe se može zaklјučiti da su za analoge iz stanja tehnike najveće zapažene molekularne vrste su obe veće veličine (Rg i Dmax), kao i da su pronađene u većim količinama (42-62% prema 1-22% za analoge pronalaska). Ovo podvlači korisnost analoga za prandijalnu upotrebu u poređenju sa analogima iz stanja tehnike.

Primer 31; Priprema farmaceutskih preparata

Farmaceutski preparati ovog pronalaska mogu se formulisati kao vodeni rastvor. Vodeni rastvor je izotoničan, na primer, sa natrijum hloridom i/ili glicerolom. Dalјe, vodeni medijum može da sadrži pufere i konzervanse. Vrednost pH preparata se podešava na želјenu vrednost i može biti između oko 3 do oko 8.5, između oko 3 i oko 5, ili oko 6.5, ili oko 7.4, ili oko 7.5, u zavisnosti od izoelektrične tačke, pl, predmetnog analoga insulina.

Priprema insulinskih formulacija bez cinka

Analozi insulina bez cinka rastvoreni su u vodenom rastvoru, koji je u konačnoj formulaciji sadržao 0,6 mM analoga insulina, 16 mM m-krezola, 16 mM fenola, 7 mM dinatrijum fosfata, odgovarajuće količine nikotinamida i glicerola i pH je podešen na 7.3-7.5 (izmereno na sobnoj temperaturi) upotrebom 1 N hlorovodonične kiseline / 1 N NaOH.

Dodata je voda do krajnje zapremine i rastvor je sterilno filtriran kroz filter od 0,2 µm.

Formulacija je napunjena u 2ml epruvete i zapečaćena korišćenjem zatvarača na zavijanje.

Tabela 8

Primeri kompozicija insulinskih preparata

Primer 32; - ThT fibrilacioni testovi za procenu fizičke stabilnosti proteinskih formulacija

Niska fizička stabilnost peptida može dovesti do stvaranja amiloidne fibrile, koja se primećuje kao dobro uređena, makromolekularna struktura nalik na konac u uzorku, što na kraju može dovesti do stvaranja gela. Tioflavin T (ThT) ima jasan potpis fluorescencije kada se veže za fibrile [Naiki et al. (1989) Anal. Biochem.177244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol.309274-284].

Formiranje delimično presavijenog intermedijera peptida je predloženo kao opšti mehanizam inicijacije fibrilacije. Nekoliko tih intermedijera se nukleiraju da bi formirali šablon na kojem mogu da se sklapaju dalji intermedijeri i fibrilacija se nastavlja. Vreme kašnjenja odgovara intervalu u kome je izgrađena kritična masa nukleusa i prividna konstanta brzine je brzina kojom se formira sam fibril (Sl.1).

Priprema uzorka

Uzorci su pripremljeni sveže pre svakog ispitivanja. Uzorci svake kompozicije mešani su sa vodenim ThT rastvorom (0,1 mM ThT) u zapreminskom odnosu od 990:10 i prebačeni u mikrotitarnu ploču sa 96 ležišta (Packard Opti-Plate™-96, beli polistiren).

Obično, četiri ili osam replika svakog uzorka (koje odgovaraju jednom uslovu testa) su postavljene u jednu kolonu ležišta. Ploča je zapečaćena sa Scotch 15 Pad-om (Qiagen).

Inkubacija i merenje fluorescencije

Inkubacija na datoj temperaturi, mućkanje i merenje ThT fluorescentne emisije je urađeno u Fluoroskan Ascent FL fluorescentnom čitaču ploča ili Varioskan čitaču ploča (Thermo Labsystems). Temperatura je podešena na 37°C. Orbitalno mućkanje je podešeno na 960 rpm sa amplitudom od 1mm u svim predstavljenim podacima. Merenje fluorescencije je izvršeno korišćenjem ekscitacije kroz 444nm filter i merenje emisije kroz 485 nm filter. Svaka tura je započela sa inkubiranjem ploče na testnoj temperaturi tokom 10 min. Ploča je merena svakih 20 minuta do 45 sati. Između svakog merenja, ploča se mućka i zagreva kako je opisano.

Rukovanje podacima

Grafikoni fluorescencije i vremena generisani su u programu Microsoft Excel i vreme kašnjenja je procenjeno kao presek između linearne aproksimacije zone kašnjenja i zone fibrilacije kao što je prikazano na sl.14A, 14B i 14C (ilustracije 1A, 1B i 1C, respektivno). Porast u vremenu kašnjenja odgovara povećanoj fizičkoj stabilnosti. Tačke podataka su obično prosek od četiri ili osam uzoraka.

Rezultati dobijeni za A22K acilovane analoge pronalaska i slične A22K acilovane analoge iz stanja tehnike bez brisanja ostatka B27Thr (desB27), prikazani su u tabeli 8, u daljem tekstu.

Tabela 8

Fizička stabilnost merena kao ThT vreme kašnjenja preparata bez cinka

*Bez fibrilacije unutar vremenskog raspona ThT testa

Zaklјučeno je da analozi A22K acilovanog insulina prema pronalasku pokazuju bolјu ili sličnu stabilnost prema fibrilaciji (tj. imaju povećanu fizičku stabilnost) u formulaciji bez cinka i sa i bez nikotinamida koji su dodati od sličnih analoga iz stanja tehnike. Ovo je veoma iznenađujuće, jer podaci o razblaženju SAXS i SEC-HPLC ukazuju na to da su analozi insulina prema pronalasku manje veličine (tj. sastavlјeni su od monomera i dimera), što bi stručnjak očekivao da bi dovelo do manje fizičke stabilnosti.

Primer 33; Analiza hemijske stabilnosti insulina

Hromatografija isključivanja veličine

Korišćene formulacije: Vidi Primer 31

Kvantitativno određivanje proteina visoke molekulske težine (HMWP) i monomera analoga insulina izvršeno je na koloni Waters Acquity BEH200 SEC (150 x 2,4 mm, br. dela 186005225) sa eluentom koji sadrži 55% (v / v) acetonitrila, 0,05% TFA na brzini protoka od 0,2 ml/min i temperaturi kolone od 40°C. Detekcija je izvedena pomoću prilagodlјivog detektora apsorbancije (Waters Acquity TUV) na 215 nm. Zapremina injekcije bila je 1,5 µl i 600 µM analognih formulacija insulina i 600 µM standarda humanog insulina. Svaki analogni preparat inkubiran je na 5, 25 i 37°C u epruvetama od 2 ml. U definisanim vremenima HMWP i sadržaj preparata su mereni. Rezultati su prikazani dole u Tabeli 9.

Tabela 9

HMWP sadržaj pri skladištenju na 37°C

*Nije utvrđeno

Zaklјučeno je da je stvaranje proteina visoke molekulske težine (HMWP) skladištenjem u formulaciji bez cinka na 37°C daleko manje za derivate insulina prema pronalasku (stvaranje do 6,8% HMWP posle 8 nedelјa skladištenja insulina pronalazak primera 2, 4 i 7, tim redosledom), dok sličan derivat insulina iz stanja tehnike rezultira stvaranjem 29,1% HMWP). Dalјe se zaklјučuje da derivati insulina prema pronalasku formiraju niske nivoe HMWP u formulaciji bez cinka i u prisustvu nikotinamida kada se čuvaju na 37°C.

Hromatografija obrnute faze (UPLC)

Određivanje nečistoća povezanih sa insulinom izvršeno je na UPLC sistemu pomoću kolone Phenomenex Kinetex C18, veličine 2,1x150 mm, veličine čestica 1,7 µm i veličine pora 100 Å (Phenomenex deo br.00F-4475-AN), sa protokom od 0,3 ml/min na 50°C i sa UV detekcijom na 215 nm. Eluiranje je izvedeno sa mobilnom fazom koja se sastojala od sledećeg: A: 10% (v/v) acetonitrila, 0.09M di-amonijum hidrogen fosfata, pH 3.6, i B: 80% (v/v) acetonitrila. Gradijent: 0-7 min linearna promena sa 15% B na 26% B, 7-34 min linearna promena na 40% B, 34-36 minuta linearna promena na 80% B za ispiranje kolone, pre nego što se vrate u početne uslove za 39 min 15% B. Količina nečistoća je određena kao površina apsorpcije izmerena u procentima od ukupne površine apsorpcije utvrđene nakon eluiranja konzervansa. Svaki preparat analoga inkubiran je na 5, 25 i 37°C u 2ml epruvetama. U definisanim vremenima merene su nečistoće vezane za insulin u preparatima. Rezultati su prikazani dole, u Tabeli 10.

C

37°

a n nju ište d

skla

no 10 pri

rđea utv elać to j<e>ab isi TČ*N Zaklјučeno je da su derivati insulina prema pronalasku daleko stabilniji u formulaciji bez cinka od sličnog A22K acilovanog analoga iz stanja tehnike. Analozi iz stanja tehnike su toliko nestabilni da je manje od 5% (što odgovara gubitku čistoće od 84% tačaka) derivata netaknuto nakon 8 nedelјa skladištenja na 37°C. Analozi insulina prema pronalasku (predstavlјeni jedinjenjima iz primera 2, 4 i 7) imaju manje od 7.7, 5.5 i 15% tačaka gubitka čistoće, respektivno, nakon 8 nedelјa skladištenja na 37°C. Dalјe se zaklјučuje da su derivati insulina prema pronalasku stabilni u formulaciji bez cinka sa dodatkom nikotinamida.

Primer 34; Supkutani PK/PD profili kod LYD svinja

Derivati insulina prema pronalasku mogu se testirati supkutanim davanjem svinjama, npr. poređenjem sa insulinom aspart (NovoRapid) u komercijalnoj formulaciji ili upoređivanjem sa sličnim A22K acilovanim analogima insulina iz stanja tehnike prema ovom protokolu. Derivati mogu biti testirani na farmakokinetičke i/ili farmakodinamičke parametre.

Korišćeni opšti postupci

Ispitivanje ultrazvukom i obeležavanje mesta ubrizgavanja

Tokom anestezije za postavlјanje trajnih intravenskih katetera, svinje se pregledaju ultrazvukom i ultrazvučnim skenerom Esaote model „MiLabFive“ i linearnom sondom tipa „LA4356-18 MHz“. Srednji vrat između uha i lopatice, na desnoj ili levoj strani (nasuprot kateteru), identifikuje se i obeležava tetovažom područje od 2 x 2 cm bez mišića ispod (pogodno za supkutano ubrizgavanje).

Raspored hranjenja

Svinje su izgladnjene (bez doručka) pre eksperimenta.

Svinje su tokom celog eksperimenta u svojim normalnim boksovima i nisu anestezirane. Svinje se izgladnjuju dok se ne uzme 12-satni uzorak krvi, ali uz slobodan pristup vodi. Nakon uzorkovanja krvi nakon 12 sati, svinje su nahranjene hranom i jabukama.

Doziranje

Punjenje za penkalo je montirano na NovoPen®4. Nova igla je korišćena za svaku svinju. Korišćen je zaustavljivač za iglu da bi se obezbedila maksimalna sc penetracija od 5mm ispod epidermisa. Zapremina doze (IU zapremina) se izračunava i beleži za svaku svinju.

Zapremina doze (U) = ((težina x doza nmol/kg) / conc nmol/mL) x 100 U/mL

2

Svinja se dozira u potkožno, bočno sa desne ili leve strane vrata (nasuprot kateteru), a igla se drži u potkožju najmanje 10 sekundi nakon injekcije kako bi se osiguralo taloženje jedinjenja.

Lečenje hipoglikemije

Nakon supkutanog doziranja, rastvor glukoze treba da bude spreman za i.v. injekciju za sprečavanje hipoglikemije, tj.4-5 špriceva (20 ml) napuni se sterilnom 20% glukozom, spremni za upotrebu. Dijagnoza hipoglikemije zasniva se na kliničkim simptomima i merenjima glukoze u krvi na glukometru (Glucocard X-meter).

Tretman se sastoji od sporog i.v. ubrizgavanja 50-100 ml 20% glukoze (10-20 g glukoze). Glukoza se daje u delovima tokom 5-10 minuta do delovanja.

Uzorkovanje krvi

Prohodnost vratnih katetera proverava se pre eksperimenta sa sterilnim 0,9% NaCl bez dodavanja 10 IU / mL heparina.

Pre i posle doziranja, uzorci krvi uzimaće se u štali iz centralnog venskog katetera u sledećim vremenskim tačkama:

Predoze (-10, 0), 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600 i 720 minuta

Uzorci se uzimaju sa 3-krakom zapornom slavinom.4-5 ml otpadne krvi se uzima i baca pre uzimanja uzorka.

Uzorci krvi od 0,8 ml sakuplјaju se u epruvete obložene EDTA za analizu glukoze i insulina.

Posle svakog uzorka krvi kateter je ispran sa najmanje 5 ml sterilnog 0,9% NaCl bez dodatka 10 IE/ml heparina.

. Epruveta se nagne minimalno 10 puta kako bi se osiguralo dovolјno mešanje krvi i antikoagulanta (EDTA) i nakon jednog minuta stavlјa se na vlažni led. Epruvete se vrte 10 min na 3000 rpm i 4°C u roku od 1 sata nakon uzimanja uzoraka. Uzorci se čuvaju na vlažnom ledu do pipetiranja.

Aseptička tehnika je potrebna da bi se izbegao rast bakterija u kateteru sa povećanim rizikom od zgrušavanja.

Zatvaranje katetera nakon eksperimenta

Ako uzimanje uzoraka krvi nije izvršeno aseptičnom tehnikom, može se polako primenjivati pojedinačni intravenski tretman sa 1 ml na 10 kg Pentrexyl®-a (1 g ampicilina rastvorenog u 10 ml 0,9% NaCl) i.v. putem katetera koji je korišćen za uzimanje uzorka krvi. Posle ovog tretmana, kateter se ispere sa 10 ml 0,9% NaCl.

Kateteri se ispiraju sa 5 ml sterilnog 0.9% NaCl sa dodatkom heparina (10 IU/mL). Kateteri se zatvaraju novim luer-lock-om sa lateksnom membranom za ubrizgavanje i 1,0 ml TauroLockHep500 se ubrizgava kroz membranu kao bravu za kateter.

Analiza uzoraka krvi

Glukoza u plazmi: 10 µl plazme se pipetira u 500 µl puferskog rastvora za merenje koncentracije glukoze u plazmi u BIOSEN autoanalizatoru.

Insulin u plazmi: 1 x 50 µl plazme se pipetira u 0,65 ml Micronic® epruvete (ELISA / LOCI / SPA podešavanje) za analizu, koristeći ELISA ili LC-MS.

Plazma je skladištena zamrznuta na -20°C.

Primer 35; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz Primera 1 kod LID svinja Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 1.

Korišćene formulacije

Derivat insulina iz primera 1, pH = 7,4; 609 µM; 1,6% (w / vol) glicerola; 30 mM fenola (0 Zn / heksamer).

Insulin Aspart, komercijalna formulacija, 600 µM; 1,6% (w / vol) glicerola; 7 mM fosfata; 10 mM natrijum hlorida; 300 µM cink acetata; 16 mM fenola; 16 mM m-krezola.

Rezultati ovih određivanja predstavlјeni su na priloženim sl.1-4 i u tabeli 11, u daljem tekstu.

Tabela 11

Farmakokinetički parametri (srednja vrednost±SD)

4

<a>Tmaxdata kao medijana

<b>T1⁄2data kao harmonizovana srednja vrednost±pseudoSD

<c>Bioraspoloživost izračunata na osnovu i.v. podataka (nije prikazano)

Zaključak

Zaklјučeno je da derivat insulina iz Primera 1 u formulaciji bez cinka ima vrlo sličan PK/PD profil kao komercijalna formulacija insulina aspart (NovoRapid®). Dalјe, srednje vreme zadržavanja ovog derivata insulina bilo je 165 minuta. Može se zaklјučiti da je derivat insulina iz Primera 1 koristan kao brzo delujući (prandijalni) insulin.

Primer 36; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz Primera 2 kod LYD svinja Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 2.

Korišćene formulacije

Derivat insulina iz Primera 2, pH=7.367; 607 µM; 1.6% (w/vol) glicerola; 30 mM fenola (0 Zn/heksamer).

Insulin aspart, komercijalna formulacija, 600 µM; 1,6% (w / vol) glicerola; 7 mM fosfata; 10 mM natrijum hlorida; 300 µM cink acetata; 16 mM fenola; 16 mM m-krezola.

Rezultati ovih određivanja predstavlјeni su na priloženim sl.4-5 i u tabeli 12, u daljem tekstu.

Tabela 12

Farmakokinetički parametri (srednja vrednost±SD)

<a>Tmaxdata kao medijana

<b>T1⁄2data kao harmonizovana srednja vrednost±pseudoSD

<c>Bioraspoloživost izračunata na osnovu i.v. podataka (nije prikazano)

Zaključak

Zaklјučeno je da derivat insulina iz Primera 2 u formulaciji bez cinka ima vrlo sličan PK/PD profil kao insulin aspart. Dalјe, srednje vreme zadržavanja ovog derivata insulina bilo je 111 minuta, što se nije značajno razlikovalo od vremena NovoRapid® (insulin aspart). Može se zaklјučiti da je derivat insulina iz primera 2 koristan kao brzo delujući (prandijalni) insulin.

Primer 37; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz Primera 11 kod LYD svinja Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 11.

Korišćene formulacije

Derivat insulin iz primera 11, pH=7,44; 689 µM; 1,6% (w/vol) glicerola; 30 mM fenola (0 Zn/heksamer).

Rezultati ovih određivanja predstavlјeni su na priloženim sl.6-7 i u tabeli 13, u daljem tekstu.

Slike 6 i 7 pokazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) insulina iz Primera 11 formulisanog sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg), i dobijene promene u glukozi u plazmi; 1 nmol/kg

Tabela 13

Farmakokinetički parametri (srednja vrednost±SD)

<a>Tmaxdata kao medijana

<b>T1⁄2data kao harmonizovana srednja vrednost±pseudoSD

Zaklјučeno je da derivat insulina iz Primera 11 u formulaciji bez cinka ima PK profil koji se kvalifikuje kao prandijalni insulin. Dalјe, srednje vreme zadržavanja ovog derivata insulina bilo je 334 minuta, znatno kraće od profila dobijenog za sličnu (takođe) 1,16-heksadekansku kiselinu koja sadrži derivat insulina iz stanja tehnike, A22K (N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 humani insulin (WO 2009/022013, Primer 45, (MRT = 1287 minuta), videti u daljem tekstu. Može se zaklјučiti da je derivat insulina iz Primera 11 koristan kao brzo delujući (prandijalni) insulin.

Primer 38; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz Primera 4 kod LYD svinja Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 4.

Korišćene formulacije

Derivat insulina iz Primera 4, pH=7.43; 621 µM; 1.8% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m-kresola, 10 mM natrijum hlorida (0 Zn/heksamer).

Rezultati ovih određivanja predstavlјeni su na priloženim sl.8-9 i u tabeli 14, u daljem tekstu.

Tabela 14

Farmakokinetički podaci

a) Tmaxdata kao medijana

b) T1⁄2data kao harmonizovana srednja vrednost±pseudoSD

Zaklјučeno je da derivat insulina iz Primera 4 u formulaciji bez cinka ima PK profil koji se kvalifikuje kao prandijalni insulin. Dalјe, srednje vreme zadržavanja ovog derivata insulina bilo je 160 minuta, znatno kraće od profila dobijenog za sličnu 1,16-heksadekansku kiselinu koja sadrži derivat insulina iz stanja tehnike, A22K (N(eps) hekadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 humani insulin (WO 2009/022013, Primer 45, (MRT = 1287 minuta), videti u daljem tekstu. Može se zaklјučiti da je derivat insulina iz Primera 4 koristan kao brzo delujući (prandijalni) insulin.

Primer 39; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz stanja tehnike kod LYD svinja U skladu sa gornjim opštim postupkom, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz stanja tehnike, A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2kOEG), B29R, desB30 humani insulin (WO 2009/022013, Primer 45.

Korišćene formulacije

Jedinjenje iz WO 2009/022013, Primer 45, 588 uM µM 1,6% (w / vol) glicerola; 30 mM fenola; 7 mM tris, pH = 7,4 (0 Zn / heksamer), 1 nmol/kg.

Rezultati ovih određivanja predstavlјeni su na priloženim sl.10 i 11, i u tabeli 15, u daljem tekstu.

Slike 10 i 11 prikazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) derivata insulina iz stanja tehnike, tj. A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 humani insulin (WO 2009/022013Primer 45), formulisan sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg), i dobijene promene u glukozi u plazmi, (1 nmol/kg).

Tabela 15

Farmakokinetički parametri nakon sc. doziranja 1 nmol/kg jedinjenja iz WO 2009/0022013, Primer 45

<a>Tmaxdata kao medijana ±SD

<b>T1⁄2data kao harmonizovana srednja vrednost±pseudoSD

Zaklјučeno je da je derivat insulina iz stanja tehnike, WO 2009/022013 Primer 45, u formulaciji bez cinka povezan sa produženim zadržavanjem, koje verovatno potiče od odložene apsorpcije dela potkožnog depoa. Koncentracija ovog insulina u plazmi nakon 24 sata (1440 minuta) je 98 pM. Dalјe, efekat snižavanja glukoze u krvi produžen je da traje najmanje 8 sati (480 minuta). Srednje vreme zadržavanje bilo je 1287 minuta, skoro 1 dan. Ovo čini insulin iz stanja tehnike neodgovarajućim za prandijalnu upotrebu.

Primer 40; Potkožni PK/PD profil bliskog analoga derivata insulina iz stanja tehnike kod LYD svinja

Po gore navedenom opštem postupku, dobijeni su sledeći PK i PD profili za analog C14 diacidaA22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 humani insulin, predstavnik stanja tehnike, kako je opisano u WO 2009/022013 (vidi naročito Primer 45 (A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2kOEG), B29R, desB30 humani insulin).

Korišćene formulacije

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 analog humanog insulina (1,14-tetradekandioil (C14-diacid) analoga 1,16-heksadekandioil-a (C16-diacid) iz WO 2009/022013 Primer 45), 588 µM; 1,6% (w / vol) glicerola; 30 mM fenola; 7 mM tris, pH = 7,4 (0 Zn / heksamer)

Rezultati ovih određivanja su predstavljeni u priloženim Sl.9 i u Tabeli 16, u daljem tekstu.

Slike 12 i 13 prikazuju PK (farmakokinetički) profil (koncentracije insulina u odnosu na vreme) analoga C14 diacida derivata insulina, reprezentativnog iz stanja tehnike, tj. A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 humani insulin (WO 2009/022013 Primer 45), formulisan sa 0 cinka na 6 molekula insulina (1 nmol/kg), i dobijene promene u glukozi u plazmi, odnosno (72 nmol / životinji).

Tabela 16

Farmakokinetički parametri nakon sc. doziranja 1 nmol / kg analoga C14 diacida analoga C16 diacida, jedinjenja iz stanja tehnike WO 2009/0022013. Primer 45 (72 nmol / životinji)

Zaključak

Zaklјučeno je da je verzija C14 diacida derivata insulina iz stanja tehnike, WO 2009/022013 Primer 45, u formulaciji bez cinka povezana sa produženim zadržavanjem, koje verovatno potiče od odložene apsorpcije dela potkožnog depoa. Koncentracija ovog insulina u plazmi u vremenskoj tački od 10 sati (600 minuta) je 24 pM. Utvrđeno je da je srednje vreme zadržavanja (MRT) ovog analoga C14 diacida iz stanja tehnike 271 minut.

Odgovarajući rezultati dobijeni sa analozima C14 diacida iz primera 1 i 2 ovog pronalaska bili su 165, odnosno 111 minuta. Dalјe, efekat snižavanja glukoze u krvi produžen je da traje najmanje 11 sati (660 minuta).

Ovo čini insulin iz stanja tehnike neodgovarajućim za prandijalnu upotrebu.

Primer 41; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz Primera 2 kod gojaznih Zucker pacova, poređenje profila sa i bez 170 mM nikotinamida u formulaciji

Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 2.

Korišćene formulacije

Derivat insulina iz Primera 2, pH=7,43; 621 µM; 1,8% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m-kresola, 10 mM natrijum hlorida (0 Zn/heksamer), sa i bez 170 mM nikotinamida.

Pacovi su dozirani sa 40 nmol/kg

Rezultati ovih utvrđivanja predstavljeni su na priloženoj Sl.15.

Zaklјučeno je da uklјučivanje 170 mM nikotinamida u formulaciju insulina bez cinka iz Primera 2, dozirano supkutano Zucker pacovima, rezultira PK profilom koji deluje još brže, sa ranijim Tmax. Tako je pokazano da uklјučivanje nikotinamida u insulinsku formulaciju iz Primera 2 pronalaska rezultira insulinskom formulacijom koja je još pogodnija za prandijalnu upotrebu.

Primer 42; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz Primera 7 kod gojaznih Zucker pacova, poređenje profila sa i bez 170 mM nikotinamida u formulaciji

Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 7.

Korišćene formulacije:

1

Derivat insulina iz Primera 7, pH=7,39; 604 µM; 1,6% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m- kresola, 7 mM natrijum fosfata, 10 mM natrijum hlorida (0 Zn/heksamer), 170 mM nikotinamid.

Derivat insulina iz Primera 7, pH=7,39; 599 µM; 1,6% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m-kresola; 7 mM natrijum fosfata; 10 mM natrijum hlorida (0 Zn/heksamer).

Pacovi su dozirani sa 40 nmol/kg

Rezultati ovih određivanja su predstavljeni na priloženim Sl.16-17.

Zaklјučeno je da uklјučivanje 170 mM nikotinamida u formulaciju insulina bez cinka iz Primera 7, dozirano supkutano Zucker pacovima, rezultira PK profilom koji ima još brže dejstvo, sa ranijim Tmax. Stoga je pokazano da uklјučivanje nikotinamida u insulinsku formulaciju iz Primera 7 pronalaska rezultira insulinskom formulacijom koja je još pogodnija za prandijalnu upotrebu.

Primer 43; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz primera 16 kod gojaznih Zucker pacova, poređenje profila sa i bez 170 mM nikotinamida u formulaciji

Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 16.

Korišćene formulacije

Derivat insulina iz Primera 16, pH=7,44; 599 µM; 1,6% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m- kresola; 7 mM natrijum fosfat; 10 mM natrijum hlorid (0 Zn/heksamer); 170 mM nikotinamid.

Derivat insulina iz Primera 16, pH=7.40; 581 µM; 1,6% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m-kresola; 7 mM natrijum fosfat; 10 mM natrijum hlorid (0 Zn/heksamer).

Pacovi su dozirani sa 40 nmol/kg

Rezultati ovih određivanja predstavljeni su na priloženim Sl.18-19.

Zaklјučuje se da uklјučivanje 170 mM nikotinamida u formulaciju insulina iz primera 16 bez cinka, koja se supkutano dozira Zucker pacovima, rezultira PK profilom koji deluje još brže, sa ranijim Tmax. Stoga je pokazano da uklјučivanje nikotinamida u insulinsku formulaciju iz Primera 16 pronalaska rezultira insulinskom formulacijom koja je još pogodnija za prandijalnu upotrebu.

Primer 44; Supkutani PK/PD profil derivata insulina iz Primera 4 kod LYD svinja, poređenje profila sa i bez 170 µM nikotinamida u formulaciji

Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 4.

2

Korišćene formulacije

Derivat insulina iz Primera 4, pH=7,42; 0,604 mM derivata insulina; 16 mM fenol; 16 mM m-kresola; 2 % (w/vol) glicerola; 7 mM fosfata (0 Zn/heksamer).

Derivat insulina iz Primera 4, pH=7,43; 0,605 mM derivata insulina; 170 mM nikotinamid; 16 mM fenol; 16 mM m- kresola; 0,6 % (w/vol) glicerola; 7 mM fosfata Svinjama je doziran 1 nmol/kg.

Rezultati ovih određivanja predstavljeni su na priloženoj Sl.20.

Zaklјučeno je da uklјučivanje 170 uM nikotinamida u formulaciju insulina iz primera 4 bez cinka, koja se dozira supkutano svinjama, rezultira PK profilom koji deluje još brže, sa ranijim Tmax. Stoga je pokazano da uklјučivanje nikotinamida u formulaciju insulina iz Primera 4 pronalaska rezultira formulacijom insulina koja je još pogodnija za prandijalnu upotrebu.

Primer 45; Supkutani PK / PD profil derivata insulina iz primera 2 kod LID svinja, poređenje profila sa i bez 170 µM nikotinamida u formulaciji

Sledeći gornji opšti postupak, dobijeni su sledeći PK i PD profili za derivat insulina iz Primera 2.

Korišćene formulacije

Derivat insulina iz Primera 2, pH=7,4; 608 µM; 2% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m-kresola, 7 mM natrijum fosfata (0 Zn/heksamer).

Derivat insulina iz Primera 2, pH=7,4; 614 µM; 170 µM nicotinamide, 0,6% (w/vol) glicerola; 16 mM fenola; 16 mM m- kresola, 7 mM natrijum fosfata (0 Zn/heksamer).

Svinjama je doziran 1 nmol/kg.

Rezultati ovih određivanja predstavljeni su na priloženoj Sl.21.

Zaklјučeno je da uklјučivanje 170 µM nikotinamida u formulaciju insulina iz Primera 2, koja se supkutano dozira svinjama, bez cinka, rezultira PK profilom koji deluje još brže, sa ranijim Tmax. Tako je pokazano da uklјučivanje nikotinamida u insulinsku formulaciju iz Primera 2 pronalaska rezultira insulinskom formulacijom koja je još pogodnija za prandijalnu upotrebu.

Claims (26)

PATENTNI ZAHTEVI

1. DerIvat insulina, a derivat insulina je acilovani analog humanog insulina, čiji analog je

[A22K, desB27, B29R, desB30] u odnosu na humani insulin;

i čiji analog insulina je derivatizovan acilacijom epsilon amino grupe ostatka lizina na poziciji A22 sa grupom Formule II

[Acyl]-[Linker]-pri čemu je Linker grupa lanac amino-kiseline sastavlјen od 1 do 10 ostataka aminokiseline izabranih između -gGlu- i -OEG-; pri čemu

gGlu predstavlja ostatak gama glutaminske kiseline;

OEG predstavlja ostatak 8-amino-3,6-dioksaoktanske kiseline (tj. grupa formule -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);

čiji ostatak amino-kiseline može biti prisutan u bilo kom redosledu; i čiji lanac amino-kiseline sadrži najmanje jedan gGlu ostatak; i

Pri čemu je Acil grupa ostatak α,ω-di-karboksilne kiseline izabran iz

1,14-tetradekanske kiseline;

1,15-pentadekanske kiseline; i

1,16-heksadekanske kiseline;

čiji acilovani analog, može dodatno da sadrži A14E i/ili B3E ili B3Q supstitucije.

2. Derivat insulina prema zahtevu 1, čiji acilovani analog dodatno sadrži B3E ili B3Q supstituciju.

3. Derivat insulina prema zahtevu 1, čiji acilovani analog dodatno sadrži A14E supstituciju.

4. Derivat insulina prema zahtevu 1, čiji acilovani analog dodatno sadrži A14E i B3E supstitucije.

5. Derivat insulina prema zahtevu 1, čiji acilovani analog dodatno sadrži B3E supstituciju.

6. Derivat insulina prema zahtevu 1, čiji acilovani analog dodatno sadrži B3Q supstituciju.

4

7. Derivat insulina prema zahtevu 1, čiji analog je [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]; ili [A22K, desB27, B29R, desB30]; u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi lizinskog ostatka na poziciji A22.

8. Derivat insulina prema zahtevu 7, čiji analog je [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]; ili [A22K, desB27, B29R, desB30]; u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi lizinskog ostatka na poziciji A22.

9. Derivat insulina prema zahtevu 7, čiji analog je [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; u odnosu na humani insulin; i čiji analog insulina je acilovan na epsilon amino grupi lizinskog ostatka na poziciji A22.

10. Derivat insulina prema prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu je Linker grupa izabrana iz -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -4xgGlu-2xOEG-; -2xOEG-; i -2xOEG-gGlu-.

11. Derivat insulina prema zahtevu 10, pri čemu je Linker grupa izabrana iz -gGlu-; -2xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -2xOEG-; i -2xOEG-gGlu-.

12. Derivat insulina prema zahtevu 10, pri čemu je Linker grupa -4xgGlu-.

13. Derivat insulina prema prema bilo kom od zahteva 1-12, pri čemu je Acil grupa di-acidna grupa izvedena iz 1,14-tetradekanske kiseline; 1,15-pentadekanske kiselina; ili 1,16-heksadekanske kiseline.

14. Derivat insulina prema zahtevu 13, pri čemu je Acil grupa 1,14-tetradekanska kiselina.

15. Derivat insulina prema prema bilo kom od zahteva 1-14, pri čemu je grupa Formule II (tj. [Acyl]-[Linker]-) tetradekandioil-gGlu-; tetradekandioil-2xgGlu-; tetradekandioil-3xgGlu-; tetradekandioil-4xgGlu-; tetradekandioil-gGlu-2xOEG-; tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG-; tetradekandioil-2xOEG-; pentadekandioil-4xgGlu-; heksadekandioil-4xgGlu-; heksadekandioil-gGlu-2xOEG-; ili heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.

16. Derivat insulina prema zahtevu 15, pri čemu grupa Formule II (tj. [Acyl]-[Linker]-) je tetradekandioil-4xgGlu-.

17. Derivat insulina prema zahtevu 1, koji je

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-pentadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin; ili A22K(N(eps)-tetradekandioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin.

18. Derivat insulina prema zahtevu 1, koji je

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humani insulin.

19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži derivat insulina prema bilo kom od zahteva 1-18, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i razblaživača.

20. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 19, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodatih jona cinka.

21. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 19, formulisana kao kompozicija sa niskim sadržajem cinka, bez dodatih jona cinka, i koja sadrži acilovani analog humanom insulina izabranog iz:

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-pentadekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-heksadekandioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A14E, A22K(N(eps)-tetradekandioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina;

A22K(N(eps)-tetradekandioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina; i

A22K(N(eps)-tetradekandioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30 humanog insulina.

22. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 20-21, koja sadrži manje od 0.2 Zn<2+>jona po 6 molekula insulina.

23. Farmaceutska kompozicija sa niskim sadržajem cinka prema bilo kom od zahteva 20-21, pri čemu nije dodavan surfaktant.

24. Farmaceutska kompozicija sa niskim sadržajem cinka prema bilo kom od zahteva 20-21, koja sadrži nikotinsko jedinjenje, a posebno nikotinamid.

25. Derivat insulina prema bilo kojem od zahteva 1-18, za upotrebu kao lek.

26. Derivat insulina prema bilo kom od zahteva 1-18, za upotrebu u lečenju ili prevenciji dijabetesa, dijabetesa tipa 1, dijabetesa tipa 2, narušene tolerancije na glukozu, hiperglikemije, dislipidemije, gojaznosti, metaboličkog sindroma (metabolički sindrom X , sindrom insulinske rezistencije), hipertenzije, kognitivnih poremećaja, ateroskleroze, infarkta miokarda, moždanog udara, kardiovaskularnih poremećaja, koronarne bolesti srca, sindroma zapaljenja creva, dispepsije ili čira na želucu.