RS61661B1 - Il-2rbeta-selektivni agonisti u kombinaciji sa anti-ctla-4 antitelom ili anti-pd-1 antitelom - Google Patents

Description

Opis

OBLAST

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi (između ostalog) na oblast hemoterapije raka i odnosi se na sastave koje sadrže dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja za upotrebu u tretmanu pojedinca koji pati od raka primenom pacijentu dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom ili anti-PD-1 antitelom.

STANJE TEHNIKE

[0002] Interleukin-2 receptor (IL-2R) je heterotrimerni protein eksprimiran na površini određenih imunih ćelija, poput limfocita, koji se vezuje i odgovara na IL-2 citokin. IL-2 receptor čine 3 podjedinice - IL-2Rα, IL-2Rβ i IL-2Rγ, gde svaki od IL-2Rα i IL-2Rβ ima afinitet za vezivanje za IL-2, dok sam IL-2Rγ nema primetan afinitet. Thèze et al. (1994) Immunol. Today 17(10):481-486. Dalje, IL-2Raβ heterodimer ima bržu stopu asocijacije i sporiju brzinu disocijacije kada vezuje IL-2 nasuprot bilo kom samom lancu. Liparoto et al. J. Mol. Recognit.12(5):316-321.

[0003] CD4+ regulatorne T-ćelije, odgovorne za suzbijanje imunog odgovora, poželjno eksprimiraju IL-2Rαβ oblik od IL-2R. Prema tome, može se očekivati da primena jedinjenja koja su agonisti za IL-2Rαβ potiskuje imuni odgovor.

[0004] CD8+ memorijske T-ćelije, koje su odgovorne za jačanje imunog odgovora, poželjno eksprimiraju IL-2Rβ oblik od IL-2R. Prema tome, može se očekivati da primena jedinjenja koja su agonisti za IL-2Rβ poboljšava imuni odgovor (na primer, povećavajući proliferaciju CD8+ memorijskih T-ćelija).

[0005] Prema tome, primena IL-2Rβ-selektivnih agonista bila bi korisna za pacijente koji pate od određenih rakova, jer se na taj način očekuje da smanje imuno-suzbijajuće efekte regulatornih T-ćelija, istovremeno povećavajući CD8+ memorijske T-ćelije, čime regrutuju sopstveni imuni sistem pacijenta za uklanjanje ćelija raka. Optimalno, takav IL-2Rβselektivni agonist takođe bi pokazao relativno dugačku izloženost nakon primene, čime bi dodatno poboljšao odgovor pacijenta na tretman.

[0006] Regrutovanje imunog sistema pacijenta sa rakom pri tretmanu raka primenom IL-2Rβselektivnih agonista - koji su direktno imunoaktivacioni - može se dalje poboljšati primenom antagonista imunosupresivnih puteva (npr. antagonista od CTLA-4 i PD-1).

[0007] Prema tome, predmetni pronalazak pokušava da reši (između ostalog) kontinuiranu potrebu za pružanjem efikasnijeg tretmana raka, na primer, primenom pacijentu koji boluje od raka IL-2Rβ-selektivnog agonista u kombinaciji sa farmakološkim antagonistom imunosupresivnog puta.

[0008] Ovim i drugim potrebama u struci se bavi predmetni pronalazak.

[0009] WO 2012/065086 opisuje konjugate IL-2 dela i jednog ili više nepeptidnih, polimera rastvorljivih u vodi, kao što je poli(etilen glikol), kao i sastave koje sadrže takve konjugate, postupke pravljenja konjugata, postupke primene takvih smeša i slično. WO 2012/065086 opisuje brojne polimerne reagense, uključujući amin-selektivne polimerne reagense, karboksil-specifične polimerne reagense i tiol-selektivne polimerne reagense, kao i brojne IL-2 konjugate, uključujući one koji imaju i oslobađajuća i stabilna vezivanja za IL-2 deo.

[0010] WO 2006/121168 opisuje izolovana monoklonska antitela, kao što su ljudska monoklonska antitela, koja se specifično vezuju za PD-1 sa visokim afinitetom. Takođe su opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju takva antitela, vektori eksprimiranja, ćelije domaćini i postupci za stvaranje antitela, kao i postupci za tretman različitih bolesti korišćenjem anti-PD-1 antitela. Na primer, WO 2006/121168 opisuje postupke za tretman raka koristeći antitela sama ili u kombinaciji sa drugim imunoterapeuticima, kao što su anti-CTLA-4 antitela.

SAŽETAK

[0011] Ovde je pružen sastav koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja za upotrebu u postupku tretmana raka kod pacijenta, gde postupak obuhvata korake: (a) primene smeše koja sadrži dugodelujuća IL-2Rβ- selektivna agonist jedinjenja obuhvaćena formulom:

gde IL-2 jeste ostatak od IL-2 i (n) se kreće od oko 3 do 4000; i njihove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) primene anti-CTLA-4 antitela ili anti-PD-1 antitela, gde kada je antitelo anti-CTLA-4 antitelo, korak (a) se izvodi nakon koraka (b).

[0012] Dodatna otelotvorenja pronalaska navedena su u narednom opisu i patentnim zahtevima.

Kratak opis crteža

[0013]

SLIKE 1, 2 i 3 su grafikoni srednje vrednosti zapremine tumora, relativne zapremine tumora, odnosno telesne težine, povezani sa studijom efikasnosti receptor-selektivnog dugodelujućeg IL-2 agonista u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u CT26 modelu tumora, čija studija je dalje opisana u Primeru 2.

SLIKE 4, 5 i 6 su grafikoni srednje vrednosti zapremine tumora tokom 30 dana, prosečne zapremine tumora tokom 106 dana, odnosno telesne težine, povezane sa studijom efikasnosti receptor-selektivnog dugodelujućeg IL-2 agonista u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u EMT6 modelu tumora, čija studija je dalje opisana u Primeru 3.

SLIKE 7 i 8 su grafikoni zapremine tumora, odnosno telesne težine, povezane sa studijom efikasnosti receptor-selektivnog dugodelujućeg IL-2 agonista u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u poređenju sa onim za PROLEUKIN® sa anti-CTLA- 4 antitelom u EMT6 modelu tumora, čija studija je dalje opisana u Primeru 4.

SLIKE 9 i 10 su grafikoni zapremine tumora, odnosno telesne težine, tokom 11 dana, povezane sa studijom efikasnosti koja uključuje analizu protočne citometrije receptorselektivnog dugodelujućeg IL-2 agonista u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u EMT6 modelu tumora, čija studija je dalje opisana u Primeru 5.

SLIKE 11 i 12 svaki uključuje grafikone populacija imunih ćelija tumora i slezine, respektivno, što odgovara analizi protočne citometrije koja je dalje opisana u Primeru 5. SLIKE 13 i 14 su grafikoni srednje vrednosti zapremine tumora, odnosno telesne težine, povezani sa studijom efikasnosti receptor-selektivnog dugodelujućeg IL-2 agonista u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom u CT26 modelu tumora, čija studija je dalje opisana u Primeru 6.

SLIKA 15 prikazuje dva grafikona srednje zapremine tumora i telesne težine nakon Faze I trofazne studije ponovnog izazivanja koja je dalje opisana u Primeru 7.

SLIKA 16 prikazuje dva grafikona relativne srednje zapremine tumora i promene telesne težine nakon Faze I trofazne studije ponovnog izazivanja koja je dalje opisana u Primeru 7.

SLIKA 17 prikazuje grafikon relativnih promena telesne težine nakon Faze II trofazne studije ponovnog izazivanja koja je dalje opisana u Primeru 7.

SLIKA 18 prikazuje dva grafikona srednje zapremine tumora i telesne težine nakon Faze II trofazne studije ponovnog izazivanja koja je dalje opisana u Primeru 7.

SLIKA 19 prikazuje grafikon srednjih zapremina tumora nakon Faze III trofazne studije ponovnog izazivanja koja je dalje opisana u Primeru 7.

SLIKA 20 prikazuje dva grafikona promena telesne težine i relativne promene telesne težine nakon Faze III trofazne studije ponovnog izazivanja koja je dalje opisana u Primeru 7.

SLIKA 21 prikazuje dva grafikona srednjih zapremina tumora i pojedinačnih zapremina tumora tokom trofazne studije ponovnog izazivanja koja je dalje opisana u Primeru 7.

SLIKA 22 prikazuje dva grafikona srednje zapremine tumora i telesne težine od na dan 0 do dana 11 u vezi sa studijom RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 kombinacije koja je dalje opisana u Primeru 8.

SLIKA 23 prikazuje dva grafikona relativne srednje zapremine tumora i telesne težine od na dan 0 do dana 11 u vezi sa studijom RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 kombinacije koja je dalje opisana u Primeru 8.

SLIKA 24 prikazuje dva grafikona srednje zapremine tumora i telesne težine od na dan 0 do dana 11 u vezi sa studijom RSLAIL-2 i anti-PD-1 kombinacije koja je dalje opisana u Primeru 8.

SLIKA 25 prikazuje dva grafikona relativne srednje zapremine tumora i telesne težine od na dan 0 do dana 11 u vezi sa studijom RSLAIL-2 i anti-PD-1 kombinacije koja je dalje opisana u Primeru 8.

DETALJAN OPIS

[0014] Kao što se koristi u ovoj specifikaciji, oblici jednine uključuju oblike množine, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0015] U opisu i patentnim zahtevima predmetnog pronalaska koristiće se naredna terminologija u skladu sa definicijama opisanim u nastavku.

[0016] „Nepeptidni polimer rastvorljiv u vodi“ odnosi se na polimer koji je najmanje 35% (težine), poželjno više od 70% (težine), i poželjnije više od 95% (težine) rastvorljiv u vodi na sobnoj temperaturi. Tipično, nefiltrirani vodeni preparat polimera „rastvorljivog u vodi“ prenosi najmanje 75%, poželjnije najmanje 95%, količine svetlosti koju propušta isti rastvor nakon filtriranja. Međutim, najpoželjnije je da je polimer rastvorljiv u vodi najmanje 95% (težine) rastvorljiv u vodi, ili potpuno rastvorljiv u vodi. S obzirom na to da je „nepeptidni“, polimer je nepeptidan kada ima manje od 35% (težine) aminokiselinskih ostataka.

[0017] Izrazi „monomer“, „monomerna podjedinica“ i „monomerna jedinica“ ovde se koriste naizmenično i odnose se na jednu od osnovnih strukturnih jedinica polimera. U slučaju homopolimera, jedna ponavljajuća strukturna jedinica formira polimer. U slučaju ko-polimera, ponavljaju se dve ili više strukturnih jedinica - bilo u šablonu ili nasumično - kako bi se formirao polimer. Poželjni polimeri koji se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom su homo-polimeri. Nepeptidni polimer rastvorljiv u vodi sadrži jedan ili više monomera koji su serijski vezani da čine lanac monomera.

[0018] „PEG“ ili „polietilen glikol“, kako se ovde koristi, treba da obuhvati bilo koji poli(etilen oksid) rastvorljiv u vodi. Ako nije drugačije naznačeno, „PEG polimer“ ili polietilen glikol je onaj u kom su suštinski sve (poželjno sve) monomerne podjedinice podjedinice etilen oksida, mada polimer može sadržati različite celine ili funkcionalne grupe, na primer za konjugaciju. PEG polimeri za upotrebu u predmetnom pronalasku će sadržati jednu od naredne dve strukture: „-(CH2CH2O)n-“ il „-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-“, u zavisnosti od toga da li su krajnji kiseonici razmešteni ili ne, npr. tokom sintetičke transformacije. Kao što je gore navedeno, za PEG polimere promenljiva (n) se kreće od oko 3 do 4000, i terminalne grupe a arhitektura celokupnog PEG mogu da variraju.

[0019] „Razgranat“, u smislu geometrije ili ukupne strukture polimera, odnosi se na polimer koji ima dva ili više polimernih „krakova“ koji se protežu od tačke grananja.

[0020] „Fiziološki razdvojiva“ ili „hidrolizabilna“ ili „razgradiva“ veza je relativno labilna veza koja reaguje sa vodom (tj. hidrolizuje se) u fiziološkim uslovima. Tendencija veze da hidrolizuje u vodi može zavisiti ne samo od opšteg tipa veze koja povezuje dva atoma unutar datog molekula, već i od supstituenata vezanih za te atome. Odgovarajuće hidrolitički nestabilne ili slabe veze uključuju, ali nisu ograničene na, karboksilatni estar, fosfatni estar, anhidride, acetale, ketale, aciloksialkil etar, imine, ortoestre, peptide, oligonukleotide, tioestre i karbonate.

[0021] „Enzimski razgradiva veza“ označava vezu koja je podložna razgradnji od strane jednog ili više enzima.

[0022] „Stabilna“ veza se odnosi na hemijsku vezu koja je suštinski stabilna u vodi, odnosno ne podvrgava se hidrolizi pod fiziološkim uslovima u primetnoj meri tokom dužeg vremenskog perioda. Primeri hidrolitički stabilnih veza uključuju, ali nisu ograničeni na naredne: ugljenik ugljenik veze (npr. u alifatskim lancima), etre, amide, uretane, amine i slično. Generalno, stabilna veza je ona koja pokazuje stopu hidrolize manju od oko 1-2% dnevno pod fiziološkim uslovima. Stope hidrolize reprezentativnih hemijskih veza mogu se naći u većini standardnih udžbenika iz hemije.

[0023] „Suštinski“ ili „značajno“ znači gotovo potpuno ili u potpunosti, na primer, 95% ili više, poželjnije 97% ili više, još poželjnije 98% ili više, još poželjnije 99% ili više, čak još poželjnije 99,9% ili više, gde je 99,99% ili više najpoželjnije, od neke date količine.

[0024] „Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens“ ili „farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na komponentu koja može biti uključena u sastave pronalaska i ne izaziva značajne štetne toksikološke efekte na pacijenta.

[0025] Izraz „pacijent“ odnosi se na živi organizam koji pati od ili je sklon stanju koje se može sprečiti ili tretirati primenom jedinjenja pronalaska kako je ovde opisano, i uključuje ljude i životinje.

[0026] Kao što je gore naznačeno, predmetni pronalazak je usmeren na sastav koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja za upotrebu u postupku primene pacijentu koji pati od raka, gde postupak sadrži korake: (a) primene sastava koji sadrži količinu dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista koja aktivira IL-2Rβ; i (b) primenu količine anti-CTLA-4 antitela koja inhibira CTLA-4 put ili količine anti-PD-1 koja inhibira PD-1 put, gde kada je antitelo anti-CTLA-4 antitelo, korak (a) se izvodi posle koraka (b). Što se tiče primene koraka (a) i (b), kada korak (b) obuhvata primenu anti-PD-1 antitela, ovi koraci primene mogu se izvesti u bilo kom redosledu (kao i istovremeno). U jednom ili više otelotvorenja pronalaska gde korak (b) obuhvata primenu anti-PD-1 antitela, primena koraka (a) će se izvršiti pre primene koraka (b). U jednom ili više otelotvorenja pronalaska gde korak (b) obuhvata primenu anti-PD-1 antitela, primena koraka (b) će se izvršiti pre primene koraka (a). U jednom ili više otelotvorenja u kojima korak (b) obuhvata primenu anti-PD-1 antitela, primena oba koraka (a) i (b) biće izvedena istovremeno. Dalje, u jednom ili više otelotvorenja, koraci (a) i/ili (b) će se primenjivati više puta. Pored toga, u jednom ili više otelotvorenja, koraci (a) i (b) biće izvedeni samo jednom.

[0027] Ovde opisan postupak tretmana može se nastaviti sve dok kliničar koji nadgleda negu pacijenta smatra da je postupak tretmana efikasan. Neograničavajući parametri koji ukazuju na to da je postupak tretmana efikasan uključuju naredno: skupljanje tumora (u smislu težine i/ili zapremine); smanjenje broja pojedinačnih kolonija tumora; uklanjanje tumora; i preživljavanje bez progresije bolesti.

[0028] Primerne dužine vremena povezane sa tokom terapije u skladu sa postupkom uključuju: oko jedne nedelje; dve nedelje; oko tri nedelje; oko četiri nedelje; oko pet nedelja; oko šest nedelja; oko sedam nedelja; oko osam nedelja; oko devet nedelja; oko deset nedelja; oko jedanaest nedelja; oko dvanaest nedelja; oko trinaest nedelja; oko četrnaest nedelja; oko petnaest nedelja; oko šesnaest nedelja; oko sedamnaest nedelja; oko osamnaest nedelja; oko devetnaest nedelja; oko dvadeset nedelja; oko dvadeset jedne nedelje; oko dvadeset dve nedelje; oko dvadeset tri nedelje; oko dvadeset četiri nedelje; oko sedam meseci; oko osam meseci; oko devet meseci; oko deset meseci; oko jedanaest meseci; oko dvanaest meseci; oko trinaest meseci; oko četrnaest meseci; oko petnaest meseci; oko šesnaest meseci; oko sedamnaest meseci; oko osamnaest meseci; oko devetnaest meseci; oko dvadeset meseci; oko dvadeset jednog meseca; oko dvadeset dva meseca; oko dvadeset tri meseca; oko dvadeset četiri meseca; oko trideset meseci; oko tri godine; oko četiri godine i oko pet godina.

[0029] Što se tiče učestalosti primene dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista, stručnjak će moći da odredi odgovarajuću učestalost. Na primer, kliničar može da odluči da primenjuje dugodelujući IL-2Rβ-selektivni agonist relativno retko (npr. jednom u dve nedelje) i postepeno da skraćuje period između doziranja, ako ga pacijent toleriše. Što se tiče učestalosti primene anti-CTLA-4 antitela i anti-PD-1 antitela, učestalost ovih agenasa može se odrediti na sličan način. Pored toga, kako su neki dugodelujući IL-2Rβ-selektivni agonisti, anti-CTLA-4 antitela, anti-PD-1 antitela bilo u naprednim kliničkim ispitivanjima ili su dostupni na tržištu, takođe je moguće pozvati se na literaturu kako bi se dobila odgovarajuća učestalost primene (imajući na umu da će možda biti potrebno neko prilagođavanje s obzirom na kombinovane efekte režima tretmana).

[0030] Ovde opisani postupak uključuje primenu dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista kako je definisano u patentnim zahtevima. IL-2Rβ-selektivni agonist pokazuje in vitro afinitet vezivanja za IL-2Rβ koji je najmanje 5 puta veći (poželjnije najmanje 10 puta veći) od afiniteta vezivanja za IL-2Rαβ u istom in vitro modelu, i efektivno ima najmanje 10 puta duži in vivo poluživot od IL-2 (poluživot zasnovan na in vivo nestanku IL-2). Kao primer, moguće je meriti afinitete vezivanja protiv IL-2 kao standard. S tim u vezi, RSLAIL-2 na koji se poziva Primer 1 predmetnog obelodanjenja pokazuje oko 60 puta smanjenje afiniteta prema IL-2Rαβ u odnosu na IL-2, ali samo oko 5 puta smanjenje afiniteta prema IL-2Rβ u odnosu na IL-2.

[0031] Neograničavajući primeri dugodelujućih IL-2Rβ-selektivnih agonista opisani su u WO 2012/065086. Primerni dugodelujući IL-2 Rβ-selektivni agonist je RSLAIL-2 na koji se poziva Primer 1 u predmetnoj prijavi. S tim u vezi, RSLAIL-2 je sastav koji sadrži jedinjenja obuhvaćena narednom formulom:

gde IL-2 jeste ostatak od IL-2 i njihove farmaceutski prihvatljive soli. U jednom ili više otelotvorenja, sastav sadrži ne više od 10% (na osnovu molarne količine), poželjno ne više od 5% (na osnovu molarne količine), jedinjenja obuhvaćenih narednom formulom:

gde IL-2 jeste ostatak od IL-2, (n) je ceo broj izabran iz grupe koja se sastoji od 1, 2, 3, 7 i > 7, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0032] Ovde opisani postupak uključuje primenu anti-CTLA-4 antitela ili anti-PD-1 antitela. Što se tiče anti-CTLA-4 antitela, ona su poznata i uključuju tremelimumab i ipilimumab. Što se tiče anti-PD-1 antitela, ona su poznata i uključuju nivolumab, lambrolizumab, AMP-224, MDPL3280A, MEDI4736 i MSB0010718C.

[0033] Testovi za određivanje da li dato jedinjenje može delovati kao anti-CTLA-4 antitelo ili anti-PD-1 antitelo mogu se odrediti rutinskim eksperimentisanjem od strane stručnjaka.

[0034] U skladu sa ovde opisanim postupkom, dugodelujući IL-2Rβ-selektivni agonist se primenjuje pacijentu u količini koja aktivira IL-2Rβ. Stručnjak može odrediti koliki je deo datog dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista dovoljan da pruži klinički relevantnu agonističku aktivnost na IL-2Rβ. Na primer, stručnjak može se pozvati na literaturu i/ili primeniti seriju rastućih količina dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista i odrediti koja količina ili količine pružaju klinički agonističku aktivnost IL-2Rβ.

[0035] U jednom ili više slučajeva, međutim, količina koja aktivira IL-2Rβ je količina obuhvaćena jednim ili više narednih raspona: od oko 0,01 mg/kg do 1 mg/kg; od oko 0,01 mg/kg do oko 0,1 mg/kg; od oko 1 mg/kg do oko 1000 mg/kg; od oko 2 mg/kg do oko 900

1

mg/kg; od oko 3 mg/kg do oko 800 mg/kg; od oko 4 mg/kg do oko 700 mg/kg; od oko 5 mg/kg do oko 600 mg/kg; od oko 6 mg/kg do oko 550 mg/kg; od oko 7 mg/kg do oko 500 mg/kg; od oko 8 mg/kg do oko 450 mg/kg; od oko 9 mg/kg do oko 400 mg/kg; od oko 5 mg/kg do oko 200 mg/kg; od oko 2 mg/kg do oko 150 mg/kg; od oko 5 mg/kg do oko 100 mg/kg; od oko 10 mg/kg do oko 100 mg/kg; i od oko 10 mg/kg do oko 60 mg/kg.

[0036] U skladu sa ovde opisanim postupkom, primenjuje se količina anti-CTLA-4 antitela koja inhibira CTLA-4 put ili se primenjuje količina anti-PD-1 antitela koja inhibira PD-1 put. Stručnjak može odrediti koliko je datog anti-CTLA-4 antitela ili anti-PD-1 antitela dovoljno da pruži klinički relevantnu inhibiciju CTLA-4 puta ili PD-1 puta. Na primer, stručnjak se može pozvati na literaturu i/ili primeniti seriju rastućih količina anti-CTLA-4 antitela ili anti-PD-1 antitela i odrediti koja količina ili količine pružaju klinički relevantnu inhibiciju CTLA-4 puta ili PD-1 puta.

[0037] U jednom ili više slučajeva, međutim, količine koje inhibiraju CTLA-4 put i PD-1 put obuhvaćene su jednim ili više narednih raspona: od oko 1 mg/kg do oko 1000 mg/kg; od oko 2 mg/kg do oko 900 mg/kg; od oko 3 mg/kg do oko 800 mg/kg; od oko 4 mg/kg do oko 700 mg/kg; od oko 5 mg/kg do oko 600 mg/kg; od oko 6 mg/kg do oko 550 mg/kg; od oko 7 mg/kg do oko 500 mg/kg; od oko 8 mg/kg do oko 450 mg/kg; od oko 9 mg/kg do oko 400 mg/kg; od oko 5 mg/kg do oko 200 mg/kg; od oko 2 mg/kg do oko 150 mg/kg; od oko 5 mg/kg do oko 100 mg/kg; od oko 10 mg/kg do oko 100 mg/kg; i od oko 10 mg/kg do oko 60 mg/kg.

[0038] Za potvrdu, kako se ovde koristi u odnosu na količine anti-CTLA-4 antitela i anti-PD-1 antitela koje inhibiraju CTLA-4 put ili PD-1 put, respektivno, količina i obim inhibicije mogu da variraju u velikoj meri i kombinacija bilo kog od ovih sa dugodelujućim IL-2Rβselektivnim agonistom i dalje može biti efikasna. Na primer, količina anti-CTLA-4 antitela ili anti-PD-1 antitela koja samo minimalno inhibira CTLA-4 put ili PD-1 put, respektivno, i dalje može biti inhibirajuća količina kako se ovde koristi, sve dok postupak rezultuje klinički značajnim odgovorom. Takođe, količina dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista koji pokazuje dovoljnu minimalnu agonističku aktivnost na IL-2Rβ tokom dovoljno dugačkog vremenskog perioda može i dalje biti dugodelujući IL-2Rβ-selektivni agonist sve dok postupak rezultuje klinički značajnim odgovorom. U nekim slučajevima, zbog (na primer) sinergijskih odgovora, minimalna inhibicija CTLA-4 puta ili PD-1 puta može biti potrebna samo u prisustvu dugodelujućeg IL-2Rβ-selektivnog agonista. U još nekim drugim slučajevima, zbog (na primer) sinergijskih odgovora, minimalna agonistička aktivnost IL-2Rβ može biti potrebna u prisustvu inhibicije CTLA-4 puta i PD-1 puta.

[0039] Stvarna doza koja će se primenjivati zavisiće od uzrasta, težine i opšteg stanja pacijenta, kao i od težine stanja koje se tretira, procene zdravstvenog radnika i konjugata koji se primenjuje.

[0040] Pronalazak pruža sastav za upotrebu u postupku koji je koristan (između ostalog) za tretman pacijenta koji pati od stanja koje reaguje na tretman jedinjenjem. Na primer, pacijenti mogu reagovati samo na pojedinačne agense, kao i na kombinaciju, ali više reaguju na kombinaciju. Kao dalji primer, pacijenti mogu da ne reaguju na neki od pojedinačnih agenasa, ali da reaguju na kombinaciju. Kao još jedan dalji primer, pacijenti mogu da ne reaguju na bilo koji pojedinačni agens sam, ali da reaguju na kombinaciju.

[0041] Sastav pronalaska je za upotrebu u postupku koji može obuhvatati primenu terapeutski efikasne količine aktivnih agenasa putem injekcije. Takođe se razmatraju i drugi načini primene, kao što su plućni, nazalni, bukalni, rektalni, sublingvalni i transdermalni. Kako se ovde koristi, izraz „parenteralno“ uključuje subkutane, intravenske, intraarterijske, intraperitonealne, intrakardijalne, intratekalne i intramuskularne injekcije, kao i injekcije u infuziju. Svaka farmakološka komponenta postupke može se primenjivati odvojeno.

Alternativno, ako se želi da istovremena primena dve farmakološke komponente - a dve farmakološke komponente su kompatibilne zajedno i u datoj formulaciji - tada se istovremena primena može postići primenom jednog oblika doziranja/formulacije (npr. intravenska primena intravenske formulacije koja sadrži oba farmakološki aktivna sredstva). Stručnjak može rutinskim ispitivanjem utvrditi da li su dve date farmakološke komponente kompatibilne zajedno i u datoj formulaciji.

[0042] Trenutno opisani sastavi za upotrebu u postupku mogu se koristiti za tretman pacijenta koji pati od bilo kog stanja koje se ovom postupkom može popraviti ili sprečiti. Primerna stanja su rakovi, kao što su fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteogeni sarkom, kordom, angiosarkom, endoteliosarkom, limfangiosarkom, limfangioendoteliosarkom, sinovioma, mezotelioma, Evingov tumor, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, rak debelog creva, rak pankreasa, rak dojke, rak jajnika, rak prostate, rak skvamoznih ćelija, rak bazalnih ćelija, adenokarcinom, rak znojnih žlezda, rak lojnih žlezda, papilarni rak, papilarni adenokarcinom, cistadenokarcinom, medularni rak, bronhogeni rak, rak bubrežnih ćelija, hepatom, rak žučnih kanala, horiokarcinom, seminom, embrionalni rak, Vilmsov tumor, rak grlića materice, rak testisa, rak pluća, rak malih ćelija pluća, rak bešike, epitelni rak, gliom, astrocitom, meduloblastom, kraniofaringiom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogm, meningiom, melanom, neuroblastom, retinoblastom i leukemije.

Eksperimentalni odeljak

[0043] Treba razumeti da, iako je pronalazak opisan zajedno sa određenim poželjnim i specifičnim otelotvorenjima, prethodni opis kao i primeri koji slede namenjeni su ilustraciji, a ne ograničavanju obima pronalaska. Ostali aspekti, prednosti i modifikacije u okviru pronalaska biće očigledni stručnjacima u oblasti na koju se pronalazak odnosi.

[0044] Anti-CTLA-4 antitelo na koje se poziva u Primerima 2-7 odgovara anti-mišjem CLTA-4 antitelu prečišćenom iz UC10-4F10-11 ćelijske linije hibridoma (ATCC). Ćelije su održavane u PFHM-II medijumu (Invitrogen) između gustine 1x10<5>i 1 x 10<6>ćelije/ml. Pre prečišćavanja, medijum je centrifugiran kako bi se uklonile ćelije. pH medijuma je podešen na 8 sa NaOH, i njegova provodljivost je razblaživanjem vodom spuštena na 7 mS/cm. Medijum sa prilagođenim pH/provodljivosti stavljen je na Q-FF kolonu, i anti-mišje CLTA-4 antitelo je eluirano pomoću NaCl gradijenta.

[0045] Afinitet anti-CTLA-4 antitela prema svom antigenu određen je površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore) i utvrđeno je da iznosi 20 pM.

[0046] Anti-PD-1 antitelo je kupljeno od BioXcell. Dobijeno je kao rastvor narednih karakteristika: koncentracija: 4,76 mg/ml; endotoksin: <0,63 EU/mg; formulacija: PBS pH 7; čistoća: >95%; izotip: pacovski IgG2a; i koeficijent izumiranja: 1,33. Afinitet anti-PD-1 antitela prema svom antigenu izmeren je površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore) i utvrđeno je da iznosi 1nM. Kupljeno antitelo je provereno na čistoću pomoću SDS-PAGE i SEC-HPLC i utvrđeno je da je dovoljno čisto za studije efikasnosti bez dalje obrade.

Primer 1

1

PEGilacija rIL-2 sa mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS

[0047] PEGilacija rIL-2 sa mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS je prethodno prijavljena u Primeru 2 od WO 2012/065085. Tamo je, kako se izveštava, sinteza rezultovala smešom od 4-mera, 3-mera, 2-mera i 1-mera. Dalja analiza reakcije, međutim, otkrila je i više stepene vezivanja (npr. 5-mera, 6-mera i 7-mera). Predmetna sinteza predstavlja veću razmeru pristupa za PEGilaciju IL-2 sa mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS.

[0048] Prečišćeni rIL-2 (106,4 ml) sa 1,44 mg/ml napunjen je u prvi sud, i zatim je dodato 53,6 ml pufera za formulaciju (10 mM natrijum acetata, pH 4,5, 5% trehaloze). pH je izmeren da iznosi 4,62, i temperatura 21,2°C. PEG reagens, C2-PEG2-FMOC-NHS-20K (dostupan kako je opisano u WO 2006/138572) (13,1 g), napunjen je u drugu posudu, praćeno dodavanjem 73,3 ml od 2 mM HCI. Dobijeni rastvor je mešan ručno 25 minuta. Natrijum borat (0,5 M, pH 9,8) je dodat u prvu posudu da se pH podigne na oko 9,1, i zatim je u prvu posudu u roku od jednog do dva minuta dodata druga posuda koji sadrži PEG reagens. Zatim je izveden korak ispiranja punjenjem 8,1 ml 2 mM HC1 u drugu posudu, i dodato je prvoj posudi. U reakciji konjugacije konačna koncentracija rIL-2 iznosila je 0,6 mg/ml, koncentracija natrijum borata iznosila je 120 mM, pH 9,1 /- 0,2, temperatura 20-22°C i molarni odnos PEG reagensa prema rIL-2, nakon prilagođavanja aktivnosti reagensa (nivo supstitucije) iznosio je 35: 1. Reakcija konjugacije je ostavljena da traje trideset minuta, i zatim je zaustavljena reakcijom zakiseljavanja upotrebom 75 ml 2N sirćetne kiseline (gde pH pada na 4,01). Proizvod reakcije je razblažen vodom i razblaženi rastvor PEGilovanog rIL-2 je filtriran pomoću filtra od 0,2 mikrona i filtrirani proizvod je stavljen u sterilne posude.

[0049] Posle toga, razblaženi rastvor PEGilovanog rIL-2 je prečišćen punjenjem rastvora na hromatografsku kolonu punu sa SP sefarozna FF smolom (GE Healthcare). Nakon koraka pranja, PEGilovani rIL-2 se eluira koristeći gradijent natrijum hlorida. Fragmenti koji sadrže 1-mer, 2-mer ili 3-mer se eliminišu, dok se fragmenti koje sadrže 4-mer, 5-mer, 6-mer, 7-mer i bilo koji viši stepen PEGilacije udružuju, što rezultuje sastavom koji ima prvenstveno 4-mer, 5-mer i 6-mer (gde je utvrđeno da su 8-mer i viši stepeni PEGilacije uklonjeni tokom koraka pranja povezanog sa hromatografijom). Ovaj sastav je onaj koji se koristi u vezi sa Primerima 2-6 i u njima se pominje kao „RSLAIL-2“.

[0050] Utvrđeno je da su prinosi 4-mer, 5-mer i 6-mer grupa povećani (uz istovremeni pad 1-mer, 2-mer i 3-mer) koristeći pristup opisan u ovom primeru.

Primer 2

Procena efikasnosti RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u CT26 modelu tumora kod ženki BALB/c miševa

[0051] Cilj ove studije bio je da se proceni antitumorska aktivnost RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u CT26 modelu mišjeg tumora raka debelog creva kod ženki BALB/c miševa.

[0052] iznosilo je 5 grupa sa po 12 životinja u svakoj grupi. Uključene su kontrolna grupa za kontrolu nosača tretirana na dan 0, 4, 9 i 14, dve pojedinačne grupe (anti-CTLA-4 antitela tertirana na dan 0, 4, 9, 14 i 18 ili RSLAIL-2 na dan 0 i 9) i dve kombinovane grupe za imunoterapiju (anti-CTLA-4 antitela plus RSLAIL-2) gde je tretman anti-CTLA-4 antitelom (primenjeno na dan 0, 4, 9, 14 i 18) započeto za jednu grupu istovremeno sa RSLAIL-2 (primenjen na dan 0, 4 i 9), i za drugu, četiri dana pre početka RSLAIL-2 tretmana (primenjeno na dan 4, 13 i 22). Iniciranje tretmana za studiju izvedeno je 7 dana nakon inokulacije ćelija CT26 pri 2 x 10<6>ćelija/mesto pri 0,1 ml zapremine injekcije. Ćelije tumora injektirane su potkožno u predelu stomaka. Životinje su distribuirane u skladu sa randomizacijom generisanom pomoću StudyLog® softvera. Srednje zapremine tumora na dan tretmana (dan 0) kretale su se od 111 ± 9 mm<3>do 115 ± 10 mm<3>(Srednja vrednost ± SEM).

[0053] Zapremine tumora (u mm<3>) i telesne težine (u gramima) praćene su 2 do 3 puta nedeljno i predstavljene su na Slikama 1 i 2, respektivno, sa detaljima o rasporedu tretmana. Odgovarajuće relativne vrednosti tumora, standardizovane vrednosti izračunate prema pojedinačnim zapreminama tumora na početku studije i predstavljene kao procenat rasta sažete su na Slici 1 (dan 0 do dan 30). Životinje bez tumora praćene su za ponovni rast tumora tokom 106 dana i uzimane su telesne težine od početka tretmana.

[0054] Poređenje zapremine tumora između kontrolnih životinja sa nosačem i tretiranih životinja na dan 11 (poslednji dan kad su bile prisutne kontrolne životinje) jednosmernim ANOVA Tukeyovim post-testom (GraphPad Prism verzija 6.03 za Windovs, GraphPad

1

Software, San Diego California) pokazala je da su se sve tretirane grupe značajno razlikovale od kontrolne grupe sa nosačem.

[0055] Srednja inhibicija rasta tumora (% TGI) procenjena je na dan 11 (poslednji dan kad su bile prisutne kontrolne životinje) primenom naredne formule:

%TGI = (1-(relativna zapremina tumora(%)<tretman grupa>÷ relativna zapremina tumora(%)<kontrolna grupa>) × 100

[0056] Postojala je 53% srednja inhibicija za tumore tretirane sa anti-CTLA-4 (Gr.2) i 58% za RSLAIL-2 grupu (Gr.3). Kombinovana istovremena primena imunuloške terapije (RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 antitela započeta istovremeno na Dan 0) dala je 74% inhibicije. Kombinovana imunoterapija sa anti-CTLA-4 antitelima započeta na dan 0 i tretman sa RSLAIL-2 započeta na Dan 4 (Gr.5) dali su najveću inhibiciju među tretmanima od 88%.

[0057] Jedna od dvanaest (1/12) životinja u grupi 4 bila je bez tumora do dana 14. Ukupno 4 životinje su bile bez tumora do dana 28. U grupi 5, dve (2/12) životinje su bile bez tumora do dana 14 i ukupno 8 životinja je bez tumora do 25. dana. Pogledati Tabelu 1. Sve ove životinje iz grupe 4 i 5 ostale su bez tumora do završetka studije. (106 dana od početka tretmana).

Tabela 1

1

[0058] Srednje telesne težine kretale su se od 17,4 ± 0,3 g do 18,2 ± 0,3 g (srednja ± SEM) na dan tretmana. Nijedan značajan srednji gubitak telesne težine ispod početne vrednosti tokom faze tretmana nije primećen ni u jednoj od tretiranih grupa (Slika 3).

Primer 3

Procena efikasnosti RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u EMT6 modelu tumora kod ženki BALB/c miševa

[0059] Cilj ove studije bio je da se proceni antitumorska aktivnost RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u EMT6 modelu mišjeg tumora mlečne žlezde kod ženki BALB/c miševa.

[0060] Bilo je 5 grupa sa po 12 životinja u svakoj grupi. Uključene su kontrolna grupa za nosač tretirana na dan 0, 4, 9 i 14, dve grupe sa pojedinačnim agensima (anti-CTLA-4 antitelo tretirana na dan 0, 4, 9, 14 i 18 ili RSLAIL-2 na dan 0 i 9) i dve kombinovane grupe za

1

imunoterapiju (anti-CTLA-4 antitela plus RSLAIL-2) gde je tretman anti-CTLA-4 antitelom (dato na dan 0, 4, 9, 14 i 18) započet za jednu grupu istovremeno sa RSLAIL -2 (dat na dan 0, 4 i 9), a drugi četiri dana pre početka RSLAIL-2 tretmana (dat na dan 4, 13 i 22). Iniciranje tretmana za studiju izvedeno je 7 dana nakon inokulacije EMT6 ćelija pri 2 x 10<6>ćelija/mesto pri 0,1 ml zapremine injekcije. Ćelije tumora injektirane su potkožno u predelu stomaka. Životinje su distribuirane u skladu sa randomizacijom generisanom pomoću StudyLog® softvera. Srednje zapremine tumora na dan tretmana (dan 0) kretale su se od 144 ± 8 mm<3>do 147 ± 10 mm<3>(Srednja vrednost ± SEM).

[0061] Zapremine tumora (u mm<3>) i telesne težine (u gramima) praćene su 2 do 3 puta nedeljno, i podaci o zapremini tumora predstavljeni su na Slici 4 (dan 0 do dana 30) sa detaljima o rasporedu tretmana. Životinje bez tumora praćene su ponovnim rastom tumora tokom 106 dana, od početka tretmana prikazanog na Slici 5.

[0062] Poređenje zapremine tumora između kontrolnih životinja sa nosačem i i tretiranih životinja na dan 18 (poslednji dan kad su bile prisutne kontrolne životinje) pomoću jednosmernog ANOVA sa Tukeyovim post-testom (GraphPad Prism verzija 6.03 za Windows, GraphPad Software, San Diego California) pokazala je značajnu razlika između kontrole nosača (grupa 1) u odnosu na grupu 2 (tretman anti-CTLA-4 antitelima) i grupu 5 (anti-CTLA-4 antitela započeta na dan 0 RSLAIL-2 započet na dana 4). Nije zabeležena statistička razlika između grupe 1 (kontrola nosača) naspram grupe 3 (sam RSLAIL-2) i grupe 4 (RSLAIL-2 anti-CTLA-4 antitela, oba tretmana započeta dana 0).

[0063] Srednja inhibicija rasta tumora (% TGI) procenjena je na dan 18 (poslednji dan kad su bile prisutne kontrolne životinje) primenom naredne formule:

%TGI = (1-(relativna zapremina tumora(%)<tretman grupa>÷ relativna zapremina tumora(%)<kontrolna grupa>) × 100

[0064] Postojala je 55% srednja inhibicija za tumore tretirane sa anti-CTLA-4 (Gr.2) i 22% za RSLAIL-2 grupu (Gr.3). Kombinovana istovremena primena imunuloške terapije (RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 antitela pokrenuta istovremeno na dan 0) dala je 27% inhibicije. Kombinovana imunoterapija sa anti-CTLA-4 antitelima započeta dan 0 i tretman RSLAIL-2 započet dan 4 (Gr.5) dala je najveću inhibiciju među tretmanima od 92%. Uočeno je da je tumor na jednoj životinji u kontrolnoj grupi nosača potpuno autoregresovao do dana 11.

1

Uprkos tome, srednja zapremina tumora iznosila je 1789 mm<3>± 196 (srednja ± SE, N=12) do dana 18 kada je grupa kolektivno uklonjena iz studije. Jedna od dvanaest životinja u grupi 4 takođe je bila bez tumora do dana 18. Prosečna zapremina tumora za ostatak grupe iznosila je 1361 ± 214 mm<3>kada je cela grupa uklonjena iz studije (na dan 18).

[0065] Pet od dvanaest (5/12) životinja u grupi 5 bilo je bez tumora do dana 14. Ukupno 10 životinja je bilo bez tumora do dana 18. Svih 10 životinja ostalo je bez tumora do završetka studije (106 dana od početka tretmana). Pogledati Tabelu 2.

Tabela 2

1

[0066] Srednje telesne težine kretale su se od 17,8 ± 0,3 g do 18,4 ± 0,4 g (srednja ± SEM) na dan tretmana (Slika 6). Nije primećen značajniji gubitak telesne težine ni u jednoj od tretiranih grupa.

Primer 4

Procena efikasnosti RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u poređenju sa PROLEUKIN® sa tretmanom sa anti-CTLA-4 antitelom u EMT6 modelu tumora kod ženki BALB/c miševa

[0067] Cilj ove studije je da proceni antitumorsku aktivnost RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom i uporedi je sa onom za PROLEUKIN® u EMT6 modelu mišjeg tumora mlečne žlezde kod ženki BALB/c miševa.

[0068] Bilo je 7 grupa sa po 10 životinja. Uključene su kontrola antitela (Gr.1) na dan 0, 4, 8 i 13) i tri grupe pojedinačnih agenasa. To su bila anti-CTLA-4 antitela (Gr.2) data na dan 0, 4, 8, 13 i 18, PROLEUKIN® (Gr.3) data od dana 0 do 4, zatim 7 do 11, i RSLAIL-2 (Gr.4) data na dan 0 i 9. Takođe su obuhvaćene tri grupe kombinovane imunoterapije. Grupa kombinovane imunoterapije koja koristi anti-CTLA-4 antitela sa PROLEUKIN® (Gr.5) i 2 grupe kombinovanog tretmana koji koriste anti-CTLA-4 antitela sa RSLAIL-2 (Gr.6 i 7) na različitim režimima tretmana. Režim anti-CTLA-4 antitela započet je na dan 4 i ponovo je dat na dan 9 i 13, dok je RSLAIL-2 započet na dan 0 i ponovo je dat na dan 9 za grupu 6.

Tretman anti-CTLA-4 antitelima za grupu 7 započet je dana 0 i ponovo je dat na dan 4, 8 i 13, dok je RSLAIL-2 započet na dan 4 i ponovo dat na dan 13 i 22. Iniciranje tretmana (DanO) je određeno kao 7 dana nakon inokulacije miševima EMT6 ćelija pri 2 x 10<6>ćelija/mesto pri 0,1

2

ml zapremine injekcije. Ćelije tumora injektirane su potkožno u predelu stomaka. Životinje su distribuirane u skladu sa danom 0 na osnovu randomizacije generisane StudyLog® softverom. Srednje zapremine tumora na dan tretmana kretale su se od 159 ± 7 mm<3>do 170 ± 8 mm<3>(srednja ± SE).

[0069] Zapremine tumora (u mm<3>) i telesne težine (u gramima) praćene su 2 - 3 puta nedeljno i predstavljene su na Slikama 7 i 8, respektivno (dan 0 do dana 28). Životinje bez tumora praćene su za ponovni rast i zdravstveno stanje tokom 99 dana (od početka tretmana).

[0070] Poređenje zapremine tumora između kontrolnih životinja i tretiranih životinja na dan 18 (poslednji dan kad su bile prisutne kontrolne životinje) jednosmernim ANOVA sa Tukeyovim post-testom (GraphPad Prism verzija 6.03 za Windows, GraphPad Software, San Diego California) pokazala je da su se samo grupa 5 (anti-CTLA-4 antitelo PROLEUKIN®) i grupa 7 (anti-CTLA-4 antitelo RSLAIL-2) značajno razlikovale od kontrole. Međutim, iako se značajno razlikuju od kontrole, srednja zapremina tumora u dve tretirane grupe nije se značajno razlikovao.

[0071] Srednja inhibicija rasta tumora (% TGI) procenjena je na dan 18 (poslednji dan kad su bile prisutne kontrolne životinje) primenom naredne formule:

%TGI = (1-(relativna zapremina tumora(%)<tretman grupa>÷ relativna zapremina tumora(%)<kontrolna grupa>) × 100

[0072] Postojala je 27% srednja inhibicija za tretman samin anti-CTLA-4 antitelom (Gr.2). Inhibicija rasta tumora iznosila je 24% pomoću PROLEUKIN® (Gr.3) i 5% pomoću RSLAIL-2 (Gr.4), kombinovana imunološka terapija anti-CTLA-4 antitelom i PROLEUKIN® (GR 5) dala je 26% inhibicije, RSLAIL-2 sa tretmanom anti-CTLA-4 antitelom (Gr.6) dao je 2% inhibicije, dok je grupa 7 (anti-CTLA-4 antitela sa RSLAIL-2) dala 94% inhibicije.

[0073] Do dana 18 primećeno je da nekoliko životinja nema tumore. Bile su tri (3/10) iz grupe 5, jedna (1/10) iz grupe 6 i pet (5/10) u grupi 7. Završetkom studije (dan 99), ukupan broj životinja bez tumora iz grupa 5, 6 i 7 iznosio 4/10, 1/10 i 7/10, respektivno. Pogledati Tabelu 3.

Tabela 3

Primer 5

Ispitivanje studije efikasnosti RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u EMT6 modelu tumora kod ženki BALB/c miševa (uzimanje uzorka na dan 0,3 i 11 za analizu protočne citometrije)

[0074] Prethodne kombinacije RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 studije efikasnosti antitela sugerišu sinergiju u EMT6 modelu mišje mlečne žlezde. Cilj ove studije bio je da proceni antitumorsku aktivnost RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 antitelom u EMT6 modelu tumora raka mlečne žlezde mišića kod ženki BALB/c miševa. Pored toga, kako bi se identifikovala imunološka populacija odgovorna za kombinatornu efikasnost, tkivo (tumor i slezina) je prikupljeno i obrađeno na dan 0, 3 i 11 nakon početka tretmana. Identifikacija i kvantifikacija imunih ćelija koje su se infiltrirale u tkiva procenjene su analizom protočne citometrije.

Rezultati su upoređeni između tretiranih grupa.

In vivo faza

[0075] U ovoj studiji je bilo 6 tretiranih grupa sa po 3-10 životinje u svakoj grupi. Uključena je kontrola antitela, IgG2a (grupa 1), primenjeno pri 100 µg/miš na dan 0, 4 i 8; tretman anti-CTLA-4 antitelom (Grupa 2), primenjeno pri 100 µg/miš na dan 4 i 8; PROLEUKIN® tretman (grupa 3), primenjeno u dozi od 0,5 mg/kg na dan 4 i 8; i RSLAIL-2 tretman(grupa

2

5), data je jednokratna primena od 0,8 mg/kg na dan 4. Takođe su obuhvaćene dve grupe koje su tretirane kombinacijom anti-CTLA-4 antitela (100 µg/mišu dato 0, 4 dana, i 8) i PROLEUKIN® (0,5 mg/kg dato na dan 4 do 8. dana) (grupa 4) ili RSLAIL-2 (0,8 mg/kg dat na dan 4; 6. grupa).

[0076] Tretman je započeto 7 dana nakon što su životinje inokulirane sa 2 x 10<6>ćelija/mesto EMT6 mišjih ćelija karcinoma mlečne žlezde (0,1 ml) subkutano, u predelu stomaka. Miševi su raspoređeni u grupe za tretman prema količini tumora.

[0077] Životinje su žrtvovane i tkivo (tumor i slezina) je sakupljeno na Dan 0 (naivne kontrole), Dan 3 (Grupe 1 i 6), životinje Grupe 6 na dan 3 dozirane su samo sa anti-CTLA-4 antitelom, dodavanje RSLAIL-2 započelo je na dan 4, uzorci su uzeti takođe na dan 11 (sve grupe) nakon započinjanja tretmana. Za svaki dan sakupljanja odabrane su tri životinje.

Odabrane životinje su imale netaknute tumore (nisu nekrotični) i zapremine koje su najbolje približile srednju zapreminu tumora u grupi za taj dan.

[0078] Srednja zapremina tumora iznosila je 164 ± 10 mm<3>za naivnu grupu na dan tretmana na dan 0. Na dan 3, srednja zapremina tumora iznosila je 282 ± 7 mm<3>i 333 ± 26 mm<3>(srednja ± SEM) respektivno za Grupu 1 i Grupu 6. Na dan 11, srednja zapremina tumora iznosila je 843 ± 138 mm<3>za grupu 1, 1059 ± 135 mm<3>za grupu 2, 814 ± 70 mm<3>za grupu 3, 832 ± 262 mm<3>za grupu 4, 620 ± 103 mm<3>za grupu 5 i 255 ± 11 mm<3>za grupu 6 (srednja ± SEM). Pogledati Sliku 9.

[0079] Životinje su merene najmanje jednom nedeljno. Srednje telesne težine iznosile su 18,9 ± 0,3, 18,6 ± 0,3, 19,2 ± 0,2, 18,7 ± 0,2, 17,8 ± 0,3 i 18,9 ± 0,3 grama za grupe 1, 2, 3, 4, 5 i 6, respektivno, na dan tretmana (Dan 0). Na dan 3, srednje telesne težine za Grupu 1 i 6 iznosile su 19,1 ± 0,7, 19 ± 0,3 grama, respektivno. Srednje telesne težine na dan 11 iznosile su 19,8 ± 0,2, 19,4 ± 0,2, 19,9 ± 0,2, 20 ± 0,5, 19,6 ± 0,4 i 19,5 ± 0,4 grama (srednja ± SEM) za grupe 1, 2, 3, 4, 5 i 6, respektivno. Pogledati Sliku 10.

Ex vivo faza

[0080] Prikupljeni uzorci tkiva ručno su usitnjeni skalpelom, praćeno 13-minutnom enzimatskom digestijom inkubiranom na 37°C. Komponente pufera za digestiiju iznosile su 2,5 mg/ml kolagenaze tipa II (GIBCO BRL), 2,5 mg/ml kolagenaze tipa IV (GIBCO BRL) i 0,5 mg/ml DNaze (Sigma-Aldrich) u PBS/BSA. Posle inkubacije, digestija je ugašena dodavanjem Waymouth MB (GIBCO BRL) koji sadrži 10% FBS (inaktivirano zagrevanjem; GIBCO BRL) i filtrirano je kroz najlonski filter od 70 uM (Falcon) koji je dao suspenziju od jedne ćelije. Ćelije su isprane u HBSS i centrifugirane, i zatim resuspendovane u svežem HBSS. Iz svakog uzorka je uzet alikvot za brojanje, i zatim obojen eFlour-450 bojom za održivost. Uzorci su zatim postavljeni u ploču sa 96 dubokih komorica, obojeni i sakupljeni za analizu protočne citometrije.

[0081] Uzorci ćelija tumora i slezine prvo su tretirani indikatorom vitalnosti koji se može fiksirati, a zatim obojeni za održive imune ćelije, CD3, CD4, CD8, CD25, CD44, CD122, Foxp3 (unutrašnja mrlja), DKS5 i NKp46 površinski antigeni.

[0082] Ukupna količina živih imunih ćelija prebrojana je za svaki od uzoraka (3 po tretman grupi) i korišćena je za ograđivanje/prikupljanje ukupnih događaja za CD4+, TREG+ ćelije, CD8+, efektorske memorijske CD8+ ćelije, ukupne NK ćelije, zrele NK ćelije (koje su su normalizovani na 1 kubni milimetar tumorskog tkiva), kao i ukupan broj ćelija slezine za svaku od tretiranih grupa. Primarni brojevi izvedeni su iz sumiranih sirovih podataka očitavanja protočnog citometra i analizirani pomoću FlowJo.

Protočna citometrija

[0083] Tri naivne životinje su žrtvovane na dan 0. Tri životinje su žrtvovane iz Grupe 1 (nakon što su primile kontrolu izotipa) i iz Grupe 6 (koje su primile samo tretmane sa anti-CTLA-4 antitelom) na dan 3, i tri životinje iz svih Grupa 1- 6 je žrtvovano na dan 11 nakon početka tretmana.

[0084] Grafički prikaz podataka može se naći na Slici 11 i Slici 12 za dan 11 za tumor i slezinu, respektivno.

[0085] Nema razlike u populaciji CD4+ ili regulatornih T ćelija (od dana 3 do dana 11) kada se tretira samo anti-CTLA-4 antitelom. Prethodni tretman sa anti-CTLA-4 antitelom, praćen sa PROLEUKIN® ili RSLAIL-2, povećava populaciju CD4+; međutim, nema razlike u populaciji regulatornih T ćelija (anti-CTLA-4 antitelo u odnosu na anti-CTLA-4 antitelo

2

RSLAIL-2 ili PROLEUKIN®). Nema razlike u CD4+ ćelijama ZA RSLAIL-2 anti-CTLA-4 antitelu u odnosu na SAN RSLAIL-2; međutim, RSLAIL-2 anti-CTLA-4 antitelo smanjuje populaciju regulatornih T ćelija u poređenju sa RSLAIL-2. Postoji velika populacija CD4+ ćelija u RSLAIL-2 anti-CTLA-4 antitela grupi koja NIJE uračunata; ovi rezultati sugerišu da većina ovih ćelija nije Tregs.

[0086] Predtretman sa anti-CTLA-4 antitelom praćen RSLAIL-2 tretmanom značajno povećava CD8+ populaciju, P = 0,0078, i memorijske efektorske CD8 ćelije, P = 0,0058. (Dvostrani t test anti-CTLA-4 antitelo RSLAIL-2 nasuprot anti-CTLA-4). Pored toga, RSLAIL-2 anti-CTLA-4 antitelo značajno povećavaju CD8+ i memorijske efektorske CD8 ćelije u poređenju sa samim RSLAIL-2.

[0087] Samo anti-CTLA-4 antitelo nije imalo efekat u trendu na ukupnu populaciju NK ćelija; međutim, zrele NK ćelije su značajno smanjene (P = 0,0278 od dana 3 do dana 11).

Predtretman anti-CTLA-4 antitelom praćen RSLAIL-2 tretmanom povećava ukupnu NK populaciju i populaciju zrelih NK ćelija. Nije uočena razlika u zrelim NK ćelijama u RSLAIL-2 anti-CTLA-4 antitelo grupi u poređenju sa RSLAIL-2 grupom.

Primer 6

Efikasnost kombinovane imunološke terapije sa RSLAIL-2 i Anti-PD-1 antitelom na rast tumora mišjeg raka creva debelog creva kod ženki BALB/c miševa

[0088] Cilj ove studije bio je da se proceni antitumorska aktivnost kombinovane imunološke terapije sa RSLAIL-2 i anti-PD-1 antitelom na CT26 modelu mišjeg tumora debelog creva kod ženki BALB/c miševa.

[0089] Bile su 4 grupe sa po 10 životinja. Uključeni su kontrolna grupa za nosač (Gr.1), grupa za tretman anti-PD-1 antitelom, grupa za tretman sa RSLAIL-2 (Gr.3) i grupa za kombinovani tretman koja je prvo tretirana anti-PD-1 antitelom (200 µg ) danima i RSLAIL-2 (0,8 mg/kg) 4 dana posle. CT26 ćelije u 2 x 10<6>ćelija/mesto u injekcionoj zapremini od 0,1 ml implantirane su miševima potkožno u predelu stomaka. Tretman je započeto sedam dana nakon inokulacije ćelija tumora (dan 0). Životinje su distribuirane na dan 0 na osnovu randomizacije generisane StudyLog® softverom. Srednje zapremine tumora na dan tretmana

2

(dan 0) kretale su se od 123 ± 5 mm<3>do 127 ± 6 mm<3>(srednja ± SE).

[0090] Zapremine tumora (u mm<3>) i telesne težine (u gramima) praćene su 2 do 3 puta nedeljno i prikazane su na Slikama 13 i 14, respektivno. Studija je praćena 16 dana.

[0091] Poređenje zapremine tumora između kontrolnih životinja i tretiranih životinja na dan 12 (poslednji dan kad su bile prisutne kontrolne životinje) jednosmernim ANOVA sa Tukeyovim post-testom (GraphPad Prism verzija 6.03 za Windows, GraphPad Software, San Diego California) pokazala je da su se zapremine tumora za sve tretirane grupe značajno razlikovale od onih kod netretiranih kontrola.

[0092] Procenat inhibicije rasta tumora (% TGI) izračunat je pomoću naredne formule:

%TGI = (1-(relativna zapremina tumora(%)<tretman grupa>÷ relativna zapremina tumora(%)<kontrolna grupa>) × 100

[0093] Primećena je 55% i 58% srednja inhibicija rasta tumora kod anti-PD-1 antitela (Gr.2) i RSLAIL-2 (Gr.3), respektivno. Inhibicija rasta tumora za grupu kojoj su data oba tretmana u kombinaciji (Gr.4) primećena je kkod 83%. Pet (5/10) životinja u grupi 4 na kraju ispitivanja imale su tumore sa zapreminom manjom od njihove početne zapremine na Dan 0.

[0094] Srednje vreme četvorostrukog povećanja zapremine tumora (TVQT), vreme u danima kojima je potrebno da tumori porastu do 4 puta više od njihove početne zapremine, interpolirano je pomoću nelinearne polinomske analize drugog stepena (GraphPad Prism verzija 6.03 za Windows, GraphPad Software, San Diego California) za procenu Odlaganje rasta tumora (TGD). Srednje vreme četvorostrukog povećanja zapremine tumora za kontrolne tumore iznosilo je 5,2 dana, 7,6 dana za grupu 2 (anti-PD-1 antitela), 8,2 dana za Grupu 3 (RSLAIL-2) i 15,6 za grupu kombinovane imunoterapije (Gr.4). Srednje odlaganje rasta tumora za Grupu 2, Grupu 3 i Grupu 4 iznosilo je 2,4 dana, 3,0 dana i 10,4 dana, respektivno. Pogledati Tabelu 4.

Tabela 4

2

[0095] Srednje telesne težine kretale su se od 17,5 ± 0,2 g do 18,1 ± 0,2 g (srednja ± SEM) na Dan 0 (Slika 13). Nije primećen značajniji gubitak telesne težine (Slika 14), osim kod jedne životinje iz Grupe 2 koja je uklonjena iz studije na dan 12. Nekropsijom je otkrivena metastatska lezija u plućnoj šupljini.

[0096] Veća inhibicija rasta tumora (TGI) i zastoj rasta tumora (TGD) primećeni su kod životinja kojima je data kombinacija anti-PD-1 i RSLAIL-2, nego kod onih tretiranih bilo kojim pojedinačnim agensom.

Primer 7

Studija ponovnog izazivanja: Ponovno izazivanje životinja bez tumora sa EMT6 tumorom mišjih mlečnih žlezda nakon efektivne kombinovane imunološke terapije sa

2

RSLAIL-2 i anti-CTLA-4

[0097] Cilj ovog primera bio je da se proceni obim i trajanje efikasnosti kod tretmana miševa implantiranih sa EMT6 tumorima raka mlečnih žlezda sa kombinovanom imunološkom terapijom korišćenjem RSLAIL-2 i komercijalno dostupnog glodarskog anti-CTLA-4 čekpoint blokadnog antitela. Kao što je prethodno demonstrirano u Primerima 2-6, ova kombinacija daje značajan broj životinje bez tumora i, ponovnim izazivanjem životinja bez tumora sa EMT6 ćelijama tumora ili CT26 ćelijama tumora, procenjena je sposobnost ove kombinacije da izazove specifične tumorske odgovore.

[0098] Ova studija ponovnog izazivanja sprovedena je u tri faze.

[0099] Početni deo studije („Faza I“) koristio je 80 ženki BALB/c miševa koji su nosili EMT6 (mišji rak mlečnih žlezda). Deset (10/80) životinja je nasumično odabrano i dodeljeno grupi kontrole antitela (100 µg na dane 0, 4, 9, 13 i.p.). Ostale životinje (70/80) su tretirane kombinacijom anti-CTLA-4 i.p. (100 µg na dane 0, 4, 9, 13 i 18) i RSLAIL-2 i.v. (0,8 mg/kg na dane 4, 13 i 22).

[0100] Iniciranje tretmana (Dan 0) je označeno kao sedam dana nakon inokulacije EMT6 ćelija pri 2 x 10<6>ćelija/mesto u injekcionim količinama od 0,1 ml, injektirano subkutano u područje trbuha. Srednje zapremine tumora na početku tretmana iznosile su 206 ± 15 i 222 ± 8 (MEAN ± SE) za kontrolnu grupu i tretman grupu.

[0101] Faza I praćena je do dana 48. Zapremine tumora (u mm<3>) i telesne težine (u gramima) izmerene su 2 do 3 puta nedeljno i predstavljene na Slici 15. Odgovarajuće relativne zapremine tumora, standardizovane vrednosti izračunate prema pojedinačnim zapreminama tumora na početku studije (dan 0) i predstavljene kao procenat rasta, a relativne promene telesne težine su sumirane na Slici 16.

[0102] Rezultati iz Faze I studije pokazali su inhibiciju rasta tumora (TGI) od 73% (P<0,0001), izračunato koristeći srednje relativne zapremine tumora između kontrolnih životinja (698%) i tretiranih životinja (189%) na dan 14 (poslednji dan kad su bile prisutne sve kontrolne životinje), i zatim su upoređene korišćenjem neuparenog t-testa sa Welchesovim korekcionim faktorom (GraphPad Prism verzija 6.03 za Windows, GraphPad

2

Software, San Diego California).

[0103] Srednje odlaganje rasta tumora (TGD) životinja (N=39) u Fazi I koje nisu pokazale potpun odgovor na kombinovanu imunološku terapiju iznosilo je 12,7 dana (P <0,0001). Vreme četvorostrukog povećanja zapremine tumora (TVQT) izračunato je korišćenjem interpoliranog individualnog vremena tumora do rasta od 400% uz polinomsku nelinearnu regresionu analizu drugog reda (GraphPad Prism). Životinje bez tumora (potpuni odgovor) nisu bile uključene u procenu za TGD.

[0104] U Fazi I, tretirane životinje su primećene sa grubim slojevima (blagim) oko 5 dana nakon prve i druge primene RSLAIL-2. Grubi slojevi nisu primećeni nakon treće primene. Nisu primećeni značajni gubici telesne težine (Slika 16).

[0105] Sažetak rezultata iz Faze I studije dat je u Tabeli 5.

Tabela 5

[0106] Naredni deo studije („Faza započet je na dan 49. Ukupno 40 životinja (10 naivnih životinja odgovarajućeg uzrasta i 30 životinja koje su u potpunosti odgovorile na RSLAIL-2 Anti-CTLA-4 kombinovanu imunološku terapiju) su korišćene za 3 grupe i distribuirane kako je opisano u Tabeli 6.

Tabela 6

[0107] Na dan 49, životinjama su ugrađene EMT6 ili CT26 tumorske ćelije (2 x 10<6>u medijumu od 0,1 ml), injektirano subkutano u trbušnu regiju.

[0108] Rezultati iz Faze II studije pokazali su da su prihvatanje i rast tumora na životinjama očigledni pet dana nakon inokulacije (dan 54). Sve životinje iz Grupe 1 (naivne odgovarajućeg uzrasta) i Grupe 2 (životinje bez EMT6 tumora ponovo izazvane sa CT26) nosile su tumore sa srednjim zapreminama od 167 ± 22, 177 ± 11, respektivno (srednja ± SE).

1

Samo 85% stope uzimanja tumora primećeno je u Grupi 3 (životinje bez EMT6 tumora ponovo izazvane sa EMT6) pet dana nakon inokulacije. Primećeno je da su zapremine tumora relativno manje od onih u ostalim grupama. Srednja zapremina tumora iznosila je 62 ± 8 mm<3>. Četrnaest od dvadeset (70%) životinja u ovoj grupi bilo je bez tumora (potpuno odbijeni EMT6 tumorski implanti) 17 dana nakon ponovnog izazivanja, i ostale su bez tumora do kraja Faze II (dan 109).

[0109] Životinje iz Grupe 2, životinje bez EMT6 tumora nakon kombinovane imunoterapije u Fazi I i ponovo izazvane sa CT26 tumorima, imale su srednju zapreminu tumora 1257 ± 201 (srednja ± SE) 14 dana nakon ponovnog izazivanja, i srednje vreme da poraste na 1000 mm<3>zapreminu od 13,6 ± 0,8 dana. Izgleda da na rast tumora nije uticala terapija Faze I koja podrazumeva specifičnost imunog odgovora za tumorski tip. Pogledati sažetak rezultata iz Faze II studije dat u Tabeli 7.

[0110] Pronađena je jedna životinja iz Grupe 1 koja je uginula na dan 14. Nekropsija je otkrila metastatske lezije u plućima (što histologija nije verifikovala) i krvavu tečnost u grudnoj šupljini. Osim ovog, nisu zabeležena nikakva druga klinička zapažanja ili značajan gubitak telesne težine. Pogledati Sliku 17.

[0111] Srednje zapremine tumora (Slika 18) između naivnih životinja odgovarajuće starosti (1541 ± 144 mm<3>) i životinja bez EMT6 tumora ponovo izazvanih sa EMT6 (192 ± 107) upoređene su 21 dan nakon implantacije kako bi se procenio TGI (87,5%).

[0112] TVQT nije mogao da se proceni zbog nedostatka početne tačke zapremine tumora. Na njegovom mestu, vreme za rast tumora do 1000 mm<3>zapremine za svaku od životinja koje nose tumor su interpolirane (koristeći polinomsku nelinearnu regresionu analizu drugog reda od GraphPad Prism) kako bi se pomoglo u proceni i približnom odlaganju rasta tumora.

Vreme (u danima) potrebno za rast do 1000 mm<3>zapremina tumora iznosilo je 16,9 ± 1 i 13,6 ± 0,8 (srednja ± SE) dana za Grupe 1 i 2, respektivno. Samo za životinje (6/20) koje nisu u potpunosti odbile ponovni izazov sa EMT6 u Grupi 3 procenjeno je vreme do 1000 mm<3>rasta, koje je iznosilo 30,3 ± 5,5 dana. Odlaganje srednjeg rasta tumora na 1000 mm<3>za ove životinje izračunat je da iznosi 13,4 dana.

Tabela 7

2

[0113] Završni deo studije (Faza III) određen je od Dana 109 do 168 Životinje (N=14) koje su u potpunosti odbile ponovni EMT6 izazov iz Faze II ponovo su inokulirane/ponovo izazvane (na dan 109) sa 2 x 10<6>EMT6 tumorskih ćelija (Grupa 2) i praćene 59 dana. Životinje odgovarajućeg uzrasta (N=5) takođe su istovremeno inokulirane za kontrolu (Grupa 1).

[0114] Iz završnog dela studije, primećeno je da su preuzimanje i rast tumora očigledni tri dana nakon inokulacije sa srednjim zapreminama tumora od 101 ± 14 i 69 ± 6 za Grupu 1 i 2, respektivno. Životinje kojima je dat drugi izazov bile su potpuno bez tumora (potpuno odbacivanje) 21 dan nakon implantacije tumorskih ćelija, dok je svih 5 njihovih pandana odgovarajućeg uzrasta imalo srednju zapreminu tumora od 1550 ± 401 mm<3>. Životinje iz Grupe 2 ostale su bez tumora do kraja studije (Dan 168) i nije primećen značajan gubitak telesne težine.

[0115] Ova studija pokazuje efikasnost kombinovanja imunološke terapije upotrebom RSLAIL-2 i anti-CTLA 4 kod EMT6 tumora mišje mlečne žlezde (Faza I) kao i trajnost i specifičnost odgovora, kao i dugoročni efekat terapije na životinje koje dobro reaguju na tretman (Faza II i III). Pogledati Sliku 21 za sažetak studije od početka do kraja i individualni rast tumora za svaku fazu.

Primer 8

In vivo studija osiromašenja: Procena doprinosa citotoksičnih imunih ćelija antitumorskom imunitetu protiv EMT6 tumora mišjih mlečnih žlezda nakon efikasne kombinovane imunološke terapije sa RSLAIL-2 i Anti-CTLA-4 ili anti-PD-1

[0116] Cilj ovog primera bio je da se proceni relativni doprinos ćelija prirodnih ubica (NK) i CD8+ citotoksičnih T limfocita antitumorskoj efikasnosti kada se RSLAIL-2 kombinuje sa inhibicijom imunološkog čekpointa kroz blokadu antitela od CTLA-4 ili PD-1.

[0117] Ova studija koristila je 58 ženki BALB/c miševa koji su nosili EMT6 (mišji rak mlečne žlezde). Deset (10/58) životinja je nasumično odabrano i dodeljeno kontrolnoj grupi sa nosačem (dani 0, 4, 8, i.p.). Osam (8/58) životinja je raspoređeno u tretman grupu koja je primala kombinaciju anti-CTLA-4 i.p. (100 µg na dane 0, 4 i 8) i RSLAIL-2 i.v. (0,8 mg/kg na dan 4). Osam (8/58) životinja je dodeljeno grupi za osiromašenje CD8, gde su pored tretmana sa RSLAIL-2 i anti-CTLA-4, CD8 T ćelije osiromašene serijskim ubrizgavanjem pacovskog anti-mišjeg CD8a (100 µg i,p. Ba Dane -2, 0, 7). Osam (8/58) dodatnih životinja dodeljeno je grupi za osiromašenje NK, gde su pored tretmana sa RSLAIL-2 i anti-CTLA-4, NK ćelije osiromašene serijskim ubrizgavanjem zečjeg anti-goveđeg Asialo-GM1 (50 µl i.p. na Dane -2, 0, 7).

[0118] Osam (8/58) životinja je raspoređeno u tretman grupu koja je primala kombinaciju

4

anti-PD-1 i.p. (100 µg na dane 0, 4 i 8) i RSLAIL-2 i.v. (0,8 mg/kg na dan 4). Osam (8/58) životinja je dodeljeno grupi za osiromašenje CD8, gde su pored tretmana sa RSLAIL-2 i anti-PD-1, CD8 T ćelije osiromašene serijskim ubrizgavanjem pacovskog anti-mišjeg CD8a (100 µg i.p. na Dane -2, 0, 7). Osam (8/58) dodatnih životinja dodeljeno je grupi za osiromašenje NK, gde su pored tretmana sa RSLAIL-2 i anti-PD-1, NK ćelije osiromašene serijskim ubrizgavanjem zečjeg anti-goveđeg Asialo-GM1 (50 µl i.p. na dane -2, 0, 7).

[0119] Iniciranje tretmana (Dan 0) je označeno kao sedam dana nakon inokulacije EMT6 ćelija pri 2 x 10<6>ćelija/mesto pri zapremini injekcije od 0,1 ml, injektirano subkutano u predelu stomaka, i studija je trajala 11 dana. Zapremine tumora (u mm<3>) i telesne težine (u gramima) izmerene su 2 do 3 puta nedeljno. Tabela 8 prikazuje početnu i srednju relativnu zapreminu tumora za svaku grupu na dan 11. Za kombinacije sa RSLAIL-2 i anti-CTLA-4, zapremina tumora i telesna težina su predstavljeni na Slici 22, dok su relativna zapremina tumora i procenat promene telesne težine od na dan 0 predstavljeni su na Slici 23. Za kombinacije sa RSLAIL-2 i anti-PD-1, zapremina tumora i telesna težina su predstavljeni na Slici 24, dok su relativna zapremina tumora i procenat promene telesne težine u odnosu na Dan 0 prikazani na Slici 25.

[0120] Rezultati studije pokazali su inhibiciju rasta tumora (TGI) od 76,9% (p <0,05) u RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 tretman grupi, izračunato koristeći srednje relativne zapremine tumora između kontrolnih životinja (553%) i tretiranih životinje (128%) na dan 11 koristeći jednosmernu ANOVA i Tukeyovo višestruko poređenje nakon testa (GraphPad Prism verzija 6.03 za Windows, GraphPad Software, San Diego California).

[0121] Kada se tretman RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 kombinovao sa serijskim injekcijama neutrališućih CD8a antitela, što je dovelo do in vivo osiromašenja citotoksičnih CD8 T ćelija, rezultat je ukidanje efikasnosti tretmana sa srednjom relativnom zapreminom tumora od 520% i inhibicijom rasta tumora od 5,98% na dan 11, što nije dostiglo statističku značajnost u poređenju sa kontrolom nosača.

[0122] Kada je RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 tretman kombinovan sa serijskim injekcijama neutrališućih anti-Asialo-GMl antitela, što je dovelo do in vivo iscrpljivanja NK ćelija, rezultat je ukidanje efikasnosti tretmana sa srednjom relativnom zapreminom tumora od 483% i inhibicijom rasta tumora od 12,7% na dan 11, što nije dostiglo statističku značajnost u poređenju sa kontrolom nosača.

[0123] Kada se RSLAIL-2 kombinovao sa anti-PD-1, srednja relativna zapremina tumora na dan 100 bila je 285% što je rezultovalo inhibicijom rasta tumora (TGI) od 48,5% (p<0.05).

[0124] Kada se RSLAIL-2 i PD-1 tretman kombinovao sa serijskim injekcijama neutrališućih CD8a antitela, rezultat je bio ukidanje efikasnosti tretmana sa srednjom relativnom zapreminom tumora od 539% i inhibicijom rasta tumora od 2,53% na dan 11, što nije dostiglo statističku značajnost u poređenju sa kontrolom nosačem.

[0125] Kada je RSLAIL-2 i anti-PD-1 tretman kombinovan sa serijskim injekcijama neutrališućih anti-Asialo-GMl antitela, rezultat je ukidanje efikasnosti tretmana sa srednjom relativnom zapreminom tumora od 364% i inhibicijom rasta tumora od 34,2% na dan 11 što nije dostiglo statističku značajnost u poređenju sa kontrolom nosačem.

[0126] Iako nije primećen značajniji gubitak telesne težine od RSLAIL-2 u kombinaciji sa anti-CTLA-4 ili anti-PD-1, ili kada je tretman kombinovan sa dodatkom CD8 ili anti-Asialo-GMl antitelo ablacije, kombinacija sa anti-Asialo-GM1 dovela je do toga da su dve životinje uginule na Dan 8 studije u grupi koja je takođe primala RSLAIL-2 i anti-CTLA-4, i tri životinje su uginule na Dan 8 studije u grupi koja je takođe primila RSLAIL-2 i anti-PD-1.

Tabela 8

[0127] Ova studija pokazuje efikasnost kombinovanja imunološke terapije upotrebom RSLAIL-2 i anti-CTLA-4 ili RSLAIL-2 i anti-PD-1 kod EMT6 mišjeg tumora raka mlečnih žlezda. Pored toga, gubitak antitumorske efikasnosti nakon in vivo osiromašenja NK i CD8 T ćelija sugeriše na ulogu oba tipa ćelija u ovoj efikasnosti.

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Sastav, koji sadrži dugodelujuća interleukin-2 receptorβ (IL-2Rβ)-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu u postupku tretmana raka kod pacijenta, gde postupak obuhvata korake: (a) primenu smeše koja sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja obuhvaćena formulom:

   gde IL-2 jeste ostatak interleukina-2, i (n) je u rasponu od oko 3 do 4000; i njihove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) primenu anti-CTLA-4 antitela ili anti-PD-1 antitela gde, kada je antitelo anti-CTLA-4 antitelo, korak (a) se izvodi nakon koraka (b).
2. 2. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je pacijent čovek.
3. 3. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je rak čvrsti rak.
4. 4. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde je čvrsti rak odabran iz grupe koju čine rak dojke, rak jajnika, rak debelog creva, kolorektalni rak, rak želuca, maligni melanom, rak jetre, rak malih ćelija pluća, rak ne-malih ćelija pluća, rak štitaste žlezde, rak bubrega, rak žučnog kanala, rak mozga, rak grlića materice, rak maksilarnog sinusa, rak bešike, rak jednjaka, Hodžkinova bolest i rak nadbubrežne žlezde.
5. 5. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde je rak rak debelog creva.
6. 6. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde je rak rak dojke.
7. 7. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde se korak (a) izvodi pre nego što se izvede korak (b), i korak (b) obuhvata primenu anti PD-1 antitela.
8. 8. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde se korak (a) izvodi nakon nego što se izvede korak (b).
9. 9. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde korak (b) obuhvata primenu anti-PD-1 antitela, i koraci (a) i (b) se izvode istovremeno.
10. 10. Sastav, koji sadrži dugodelujuća IL-2Rβ-selektivna agonist jedinjenja, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde sastav sadrži ne više od 10% (na osnovu molarne količine), poželjno ne više od 5% (na osnovu molarne količine), jedinjenja obuhvaćenih formulom:

    gde IL-2 jeste ostatak interleukina-2, i njegove farmaceutski prihvatljive soli. 4