RS61640B1 - Piridinsko jedinjenje - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na jedinjenje koje ima selektivnu inhibitornu aktivnost prema RET kinazi, PDGFR kinazi, KIT kinazi, NTRK kinazi, FLT3 kinazi i slično i korisno je u lečenju kancera, ili na njegovu so.

[0002] Predmetni pronalazak odnosi se na sredstvo za prevenciju i/ili sredstvo za lečenje kancera pluća, kancera štitne žlezde, kancera dojke, kancera kolona, sarkoma, leukemije, itd., koje uključuje, kao aktivni sastojak, jedinjenje pomenuto gore ili njegovu so.

[0003] Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na kompoziciju za prevenciju ili lečenje gore pomenutih oboljenja, koja uključuje, kao aktivni sastojak, gore pomenuto jedinjenje ili njegovu so, upotrebu gore pomenutog jedinjenja za proizvodnju leka za prevenciju ili lečenje gore pomenutih oboljenja.

[0004] Postupak za prevenciju ili lečenje gore pomenutih oboljenja, koji uključuje primenu farmakološki efikasne količine gore pomenutog jedinjenja kod sisara (poželjno čoveka) objavljen je u ovom tekstu.

Stanje tehnike

[0005] RET kinaza, PDGFR (platelet-derived growth factor receptor, receptor za faktor rasta krvnih pločica) kinaza, KIT (stem cell factor receptor, receptor za faktor matičnih ćelija) kinaza, NTRK (neurotrophic factor receptor, receptor za neurotrofni faktor) kinaza, FLT3 kinaza, i slično su receptorske tirozin kinaze. Ove kinaze imaju strukturu koja prolazi kroz ćelijsku membranu, i van ćelije imaju mesto za vezivanje faktora rasta i unutar ćelije mesto sa aktivnošću tirozin kinaze. Ove receptorske tirozin kinaze prevode stimulaciju faktorima rasta dospelu na vanćelijsku stranu membrane (= vezivanje za mesto vezivanja faktora rasta) u unutarćelijske signale (= fosforilacija nishodnog proteina), i imaju ulogu u rastu, deobi, diferencijaciji i morfogenezi ćelija). Smatra se da aktivirajuća mutacija (uključujući tačkastu mutaciju, delecionu mutaciju, insercionu mutaciju, fuzionu mutaciju, itd.) ili povećana ekspresija ovih kinaza prouzrokuju veliki broj kancera, sarkoma, leukemija, i slično, tako da se smatra da bi inhibitori ovih kinaza bili efikasni u lečenju kancera, sarkoma, leukemija, i slično (nepatentna literatura 1 do 5 i patentna literatura 1).

[0006] Posebno, u vezi sa RET kinazom, njena aktivirajuća mutacija nađena je kod nekih pacijenata sa kancerom pluća, pacijenata sa kancerom štitne žlezde i slično (nepatentna literatura 6 do 8), i ovi pacijenti nemaju druge mutacije. Prema tome, smatra se da je mutacija RET kinaze vodeća mutacija za ove kancere. Znači, ako se pacijent sa mutacijom RET kinaze precizno detektuje i zatim se kod njega primeni inhibitor RET kinaze sa dovoljnom inhibitornom aktivnošću, smatra se da je verovatnoća za lečenje kancera velika. Nedavno, bilo je sugerisano da aktivirajuća mutacija RET kinaze prouzrokuje rast kancera ne samo kod kancera pluća i kancera štitne žlezde, nego i u nekoliko tipova kancera dojke i kancera kolona (nepatentna literatura 9 do 11).

[0007] Do danas, sredstva sa aktivnošću inhibiranja RET kinaze, kao što su kabozantinib, vandetanib i lenvatinib, bila su korišćena kod pacijenata sa kancerom koji imaju mutaciju RET, ali terapijski efekti takvih sredstava bili su slabi i ograničeni (nepatentna literatura 12). Smatra se da se takvi niski terapijski efekti ovih sredstava mogu pripisati niskoj inhibitornoj aktivnosti ovih jedinjenja prema RET kinazi, i toksičnosti (nepatentna literatura 13) kao što je hipertenzija zasnovana na inhibiciji KDR kinaze (drugačije nazvana: VEGFR2 kinaza) (nepatentna literatura 14).

[0008] Pored toga, ranije saopštena jedinjenja sa aktivnošću inhibicije RET kinaze, uključujući gore pomenuta postojeća sredstva, imaju slabu inhibitornu aktivnost prema kinazi sa "gatekeeper" mutacijom, koja je reprezentativna mutirana kinaza rezistentna na inhibitore kinaze (nepatentna literatura 15), i prema tome, čak i ako se takvo jedinjenje koristi u lečenju, kancer rano stiče rezistenciju na jedinjenje, tako da postaje neizlečiv.

[0009] Do sada je saopšteno nekoliko inhibitora RET (patentna literatura 1 i 2). Međutim, ovi inhibitori RET su problematični u vezi sa niskom aktivnošću inhibiranja RET kinaze, visokom aktivnošću inhibiranja KDR kinaze, nemogućnošću primene kod RET "gatekeeper" mutanata, i slično.

Spisak citirane literature

[Patentna literatura]

[0010]

[Patentna literatura 1] Međunarodna publikacija br. WO 2015/031613

[Patentna literatura 2] Međunarodna publikacija br. WO 2015/079251

[Nepatentna literatura]

[0011]

[Nepatentna literatura 1] Levitzki, A. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2004, 15 (4), str.229-235.

[Nepatentna literatura 2] George, D. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532, str.141-151.

[Nepatentna literatura 3] Ashman, L. K. and Griffith, R. Expert Opinion on Investigational Drugs, 2013, 22 (1), str.103-115.

[Nepatentna literatura 4] Wang, T. et al. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 20 09, 19 (3), str.305-319.

[Nepatentna literatura 5] Heinrich, M. C. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, 4 (3), str.255-271.

[Nepatentna literatura 6] Kohno, T. et al. Nature Medicine, 2012, 18 (3), pp.375-377.

[Nepatentna literatura 7] Matsubara, D. et al. Journal of Thoracic Oncology, 2012, 7 (12), str.1872-1876.

[Nepatentna literatura 8] Agrawal, N. et al. The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 2013, 98 (2), E364-E369.

[Nepatentna literatura 9] Mulligan, L. M. Nature Reviews Cancer, 2014, 14 (3), str.

173-186.

[Nepatentna literatura 10] Le Rolle, A. F. et al. Oncotarget, 2015, 6 (30), pp. 28929-28937.

[Nepatentna literatura 11] Medico, E. et al. Nature Communications, 2015, 6, članak br. 7002.

[Nepatentna literatura 12] Phay, J. E. and Shah, M. H. Clinical Cancer Research, 2010, 16(24), str.5936-5941.

[Nepatentna literatura 13] Hayman, S. R. et al. Current Oncology Reports, 2012, 14 (4), str.285-294.

[Nepatentna literatura 14] Sherman, S. I. Oral Oncology, 2013, 49, str.707-710.

[Nepatentna literatura 15] Kodama, T. et al. Molecular Cancer Therapeutics, 2014, 13, str. 2910-2918.

Kratak opis pronalaska

[0012] Predmetni pronalazak obezbeđuje terapijsko sredstvo, na primer, antikancersko sredstvo, za različite tipove kancera, sarkoma, leukemije i slično prouzrokovane aktivirajućom mutacijom ili povećanom ekspresijom kinaze, pri čemu su ova oboljenja prouzrokovana RET kinazom i postojeći inhibitori ispoljavaju nedovoljne terapijske efekte na ova oboljenja.

[0013] Ovi izumitelji pomislili su da bi, ako bi se sredstvo koje je mnogo snažnije i ima jaču selektivnost prema kinazama nego postojeći lekovi, razvilo i/ili primenilo u oboljenju izazvanom aktivirajućom mutacijom ili povećanom ekspresijom kinaze, na primer RET kinaze, prema kojoj postojeći inhibitori ispoljavaju nedovoljne terapijske efekte, među kinazama čija aktivirajuća mutacija ili povećana ekspresija izazivaju različite tipove kancera, sarkoma, leukemije, itd., sredstvo bi moglo da obezbedi visoke terapijske efekte prema oboljenjima, te su prema tome, sproveli intenzivne studije da bi takvo sredstvo pronašli.

[0014] Sledstveno tome, ovi izumitelji su ustanovili da dole pomenuto jedinjenje predstavljeno formulom (I) ispoljava snažnu i selektivnu inhibitornu aktivnost prema kinazama kao što su RET, PDGFR, KIT, NTRK, i FLT3, i takođe ispoljava snažnu inhibitornu aktivnost prema njihovim "gatekeeper" mutantima. Pored toga, izumitelji su ustanovili i to da je, s obzirom na to da ovo jedinjenje ima slabu inhibitornu aktivnost prema KDR kinazi koja izgleda ispoljava toksičnost kada je inhibirana, i odličnu kinaznu selektivnost, ovo jedinjenje korisno kao farmaceutski proizvod.

[0015] Znači, ovi izumitelji su ustanovili da jedinjenje predstavljeno formulom (I) može da se koristi kao lek koji je bezbedno i korisno preventivno/terapijsko sredstvo za kancere, ili patološka stanja ili bolesti povezane sa kancerom, u kojima postoji aktivirajuća mutacija kinaza kao što su RET, PDGFR, KIT, NTRK i FLT3, ili u kojima se javlja povećana ekspresija ovih kinaza. Na osnovu ovih nalaza, izumitelji su ostvarili ovaj pronalazak.

[0016] Jedinjenje predmetnog pronalaska ima izuzetno snažnu i selektivnu inhibitornu aktivnost, posebno, na RET kinazu, i korisno je kao terapijsko sredstvo za kancere (posebno, kancer pluća, kancer štitne žlezde, itd.).

[0017] Pored toga, pošto jedinjenje predmetnog pronalaska u aromatičnom prstenu ima atom(-e) azota koji pokazuju slabu baznost u njegovoj strukturi, ono je visokorastvorljivo u vodi posebno u kiseloj oblasti, u poređenju sa neutralnim jedinjenjima kao što su jedinjenja objavljena u Međunarodnoj publikaciji br. WO 2015/031613. Pored toga, pošto se soli koje imaju visoku rastvorljivost u vodi mogu formirati korišćenjem atoma azota aromatičnog prstena napred pomenutog jedinjenja, može se očekivati da se jedinjenje veoma dobro apsorbuje posle oralnog unosa i da bude izuzetno korisno kao farmaceutski proizvod.

[0018] Predmetni pronalazak odnosi se na sledeće (1) do (17):

(1) Jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (I):

pri čemu A predstavlja jednog koji se bira od sledećih formula (Ia) do (Id):

pri čemu R<1>predstavlja atom vodonika ili C1-C3 alkil grupu, i R<2>predstavlja atom vodonika ili C1-C3 alkil grupu, ili

njegova farmaceutski prihvatljiva so.

(2) Jedno ili dva ili više jedinjenja odabranih između jedinjenja predstavljenih sledećim strukturnim formulama:

(3) 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[5-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-3-il]acetamid,

(3-1) jedinjenje koje ima sledeću strukturnu formulu ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

(4) 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]acetamid,

(4-1) jedinjenje koje ima sledeću strukturnu formulu ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

(5) 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid,

(5-1) jedinjenje koje ima sledeću strukturnu formulu ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

(6) 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[1-metil-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid,

(6-1) jedinjenje koje ima sledeću strukturnu formulu ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

(7) Farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja prema bilo kojem od gornjih (2) do (6).

(8) Metansulfonatna so jedinjenja prema bilo kojem od gornjih (2) do (6).

(9) Inhibitor RET kinaze koji uključuje, kao aktivni sastojak, jedinjenje prema bilo kojem od gornjih (1) do (8) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

(10) Lek koji uključuje, kao aktivni sastojak, jedinjenje prema bilo kojem od gornjih (1) do (8) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

(11) Lek prema patentnom zahtevu 10 za lečenje bolesti prouzrokovane aktivirajućom mutacijom ili povećanom ekspresijom RET kinaze, bolesti udružene sa aktivirajućom mutacijom RET kinaze, ili bolesti u kojoj dolazi do aktivirajuće mutacije RET kinaze.

(12) Lek prema gornjem (10) za upotrebu u prevenciji ili lečenju kancera.

(12-1) Lek prema gornjem (10) za upotrebu u lečenju kancera.

(13) Lek prema gornjem (10) za upotrebu u lečenju kancera prouzrokovanog aktivirajućom mutacijom ili povećanom ekspresijom RET kinaze.

(14) Lek prema gornjem (10) za upotrebu u lečenju kancera pluća, kancera štitne žlezde, kancera dojke ili kancera kolona.

(15) Upotreba jedinjenja prema bilo kojem od gornjih (1) do (8) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju farmaceutske kompozicije.

(16) Jedinjenje prema bilo kojem od gornjih (1) do (8) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije oboljenja.

[0019] Postupak za lečenje ili prevenciju kancera, koji uključuje primenu farmakološki efikasne količine jedinjenja prema bilo kojem od gornjih (1) do (8) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli kod toplokrvne životinje, objavljen je u ovom tekstu.

[0020] U predmetnom pronalasku, "C1-C3 alkil grupa" označava linearnu ili granatu alkil grupu koja ima 1 do 3 ugljenikova atoma, i primeri C1-C3 alkil grupe mogu uključiti metil, etil, n-propil ili izopropil grupu. U R1 i R2 , C1-C3 alkil grupa je poželjno metil grupa. U P<2>, C1-C3 alkil grupa je poželjno metil grupa ili etil grupa.

[0021] U predmetnom pronalasku, "atom halogena" označava atom fluora, atom hlora, atom broma, ili atom joda. U X1 , X2 , X3 i X4 , atom halogena je poželjno atom hlora ili atom broma.

[0022] U predmetnom pronalasku, "monovalentni metal" je poželjno litijum, natrijum ili kalijum.

[0023] U predmetnom pronalasku, kada predmetno jedinjenje ima baznu grupu kao što je amino grupa, ono može da se konvertuje u so tako što reaguje sa kiselinom, ili kada predmetno jedinjenje ima kiselinsku grupu kao što je karboksilna grupa, ono može da se konvertuje u so tako što reaguje sa bazom. Prema tome, "farmaceutski prihvatljiva so" označava tako formiranu so.

[0024] Poželjni primeri soli zasnovanih na baznoj grupu mogu uključivati: hidrohalide kao što su hidrofluorid, hidrohlorid, hidrobromid i hidrojodid, neorganske kisele soli kao što su nitrat, perhlorat, sulfat i fosfat; niže alkansulfonate kao što su metansulfonat, trifluorometansulfonat i etansulfonat, arilsulfonate kao što su benzensulfonat i p-toluenesulfonat, soli organskih kiselina kao što su acetat, malat, fumarat, sukcinat, adipat, citrat, askorbat, tartrat, oksalat i maleat; i soli amino-kiselina kao što su glicinska so, lizinska so, argininska so, ornitinska so, glutamat i aspartat. Soli zasnovane na baznim grupama poželjno su hidrohalidi ili soli neorganskih kiselina.

[0025] Sa druge strane, poželjni primeri soli zasnovanih na kiselinskim grupama mogu uključivati: soli alkalnih metala kao što su natrijumova so, kalijumova so i litijumova so, soli zemno-alkalnih metala kao što su kalcijumova so i magnezijumova so, soli metala kao što su aluminijumova so i so gvožđa; soli amina koje uključuju neorganske soli kao što je amonijumova so, i organske soli kao što su so tert-butilamina, so t-oktilamina, so diizopropilamina, so dibenzilamina, so morfolina, so glukozamina, so fenilglicin alkil estra, so etilendiamina, so N-metilglukamina, so guanidina, so dietilamina, so trietilamina, so dicikloheksilamina, so N,N’-dibenziletilendiamina, so hloroprokaina, so prokaina, so dietanolamina, so N-benzilfenetilamina, so piperazina, tetrametilamonijumova so i tris(hidroksimetil) aminometanska so; i soli amino-kiselina kao što su su glicinska so, lizinska

1

so, argininska so, ornitinska so, glutamat i aspartat. Poželjniji primeri mogu uključivati magnezijumovu so, kalcijumovu so, so diizopropilamina i so tert-butilamina, a posebno poželjan primer može biti so tert-butilamina.

[0026] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so uključuje stereoizomere istog.

[0027] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, može sadržati neprirodni odnos atomskih izotopa u jednom ili više atoma koji sačinjavaju takvo jedinjenje. Primeri takvih atomskih izotopa mogu uključiti deuterijum (2H), tricijum (3H), jod-125 (125I), ugljenik-13 (13C) i ugljenik-14 (14C). Pored toga, gore opisano jedinjenje može biti radioobeleženo radioizotopom kao što je tricijum (<3>H), jod-125 (125I) ili ugljenik-14 (14C). Radioobeleženo jedinjenje korisno je kao terapijsko ili preventivno sredstvo, reagens za istraživanje kao što je testni reagens, i dijagnostičko sredstvo kao što je dijagnostičko sredstvo za dobijanje slike in vivo. Izotopski mutanti jedinjenja predmetnog pronalaska obuhvaćeni su obimom predmetnog pronalaska, bez obzira na to da li su radioaktivni ili ne.

[0028] Kada se jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ostavi na vazduhu ili rekristalizuje, ono apsorbuje vodu, ili je adsorbovana voda prikačena za njega, ili postaje hidrat u nekim slučajevima. Takav hidrat je takođe uključen u so predmetnog pronalaska.

[0029] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ponekad apsorbuje drugi određeni tip rastvarača i tako postaje solvat. Takav solvat je takođe uključen u so predmetnog pronalaska. Opisana su i jedinjenja koja se metabolišu in vivo i konvertuju u gore opisana piridinska jedinjenja predstavljena formulom (I) ili njihove soli.

[0030] Sledeće, u nastavku će biti opisani reprezentativni postupci za proizvodnju jedinjenja predstavljenog opštom formulom (I). Jedinjenje predmetnog pronalaska može se proizvesti različitim postupcima proizvodnje, i postupci proizvodnje koji slede dati su samo kao primeri predmetnog postupka proizvodnje, i predmetni pronalazak ne bi trebalo da bude ograničen ovim postupcima proizvodnje. Isto tako, treba napomenuti da, posle reakcije, supstituenti mogu da se protektuju pogodnim protektujućim grupama, po potrebi, i da tip te protektujuće grupe nije posebno ograničen. Komercijalno dostupni polazni materijali i reagensi upotrebljavaju se bez dodatnog prečišćavanja, ukoliko nije navedeno drugačije.

[0031] Postupak A: Gore opisano jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) može se sintetisati reakcijom kondenzacije aminskog jedinjenja (1) sa karboksilnokiselinskim jedinjenjem (2), kako je prikazano sledećom formulom 1.

gde je A definisano gore.

(A-1) Aminsko jedinjenje (1)

[0032] Kao aminsko jedinjenje (1) upotrebljeno u predmetnoj reakciji, mogu se koristiti sledeća jedinjenja (1a) do (1d). Jedinjenja (1a) i (1b) mogu se sintetisati prema postupku opisanom u J. Med. Chem., 2012, 55, 1082-1105. Aminska jedinjenja (1c) i (1d) mogu se sintetisati prema postupku opisanom u drugom koraku Primera 42, Odeljak 155 WO 2014/141187.

gde su R1 i R2 definisani gore.

(A-2) Karboksilnokiselinsko jedinjenje (2)

(A-2-1) Postupak proizvodnje 1 karboksilnokiselinskog jedinjenja (2)

[0033]

gde P1 predstavlja atom vodonika ili protektujuću grupu karboksilne kiseline, B<1>predstavlja boronsku kiselinu, estar boronske kiseline, pinakolat boronske kiseline, trifluoroborat kalijumovu so, ciklični triolborat, ili MIDA boronat, i X<1>predstavlja atom halogena.

[0034] Karboksilnokiselinsko jedinjenje (2) može da se sintetiše, na primer, izvođenjem Suzukijeve reakcije kuplovanja korišćenjem derivata 2-halopiridin sirćetne kiseline (3) i derivata hinolin-3-boronske kiseline (4), kako je prikazano u gornjoj formuli (2). Kada je P1 protektujuća grupa karboksilne kiseline, posle okončanja Suzukijeve reakcije kuplovanja, rezultat se izlaže reakciji deprotektovanja kao što je reakcija hidrolize, tako da proizvod reakcije može da se prevede u karboksilnokiselinsko jedinjenje (2).

[0035] U vezi sa protektujućom grupom karboksilne kiseline, pogodne protektujuće grupe mogu da se odrede prema Peter G. M. Wuts, Theodora W. Greene, Greene’s Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th edition, Wiley-Interscience, 2006, i sličnom. Protektujuća grupa P1 je poželjno metil grupa, etil grupa ili t-butil grupa. U vezi sa reakcijom deprotektovanja, pogodni reakcioni uslovi mogu se odrediti u zavisnosti od tipa upotrebljene protektujuće grupe, prema Peter G. M. Wuts, Theodora W. Greene, Greene’s Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th edition, Wiley-Interscience, 2006, i slično.

(A-2-1-1) Postupak proizvodnje 2-halopiridinskog derivata sirćetne kiseline (3)

[0036] U vezi sa 2-halopiridinskim derivatom (3) kao polaznim materijalom upotrebljenim u predmetnoj reakciji, može se koristiti komercijalno dostupno jedinjenje, ili se ono može sintetisati prema poznatom postupku. Alternativno, umesto 2-halopiridinskog derivata (3),

1

može se upotrebiti 2-(trifluorometansulfoniloksi)piridinski derivat, ili 2-(supstituisani sulfoniloksi)piridinski derivat kao što je 2-(p-toluensulfoniloksi)piridinski derivat i 2-(metansulfoniloksi)piridinski derivat.

[0037] Poželjni primeri 2-halopiridinskog derivata (3) uključuju 2-hloropiridin-5-ilsirćetnu kiselinu, metil 2-hloropiridin-5-il acetat, etil 2-hloropiridin-5-il acetat, i t-butil 2-hloropiridin-5-il acetat.

(A-2-1-2) Postupak proizvodnje derivata hinolin-3-boronske kiseline (4)

[0038] Primeri derivata hinolin-3-boronske kiseline (4) mogu uključivati jedinjenja (4a) do (4f), pokazana u sledećoj formuli 3, ali primeri nisu ograničeni na njih.

gde P2 predstavlja C1-C3 alkil grupu, X2 predstavlja atom halogena, i M predstavlja monovalentni metal.

[0039] Derivati hinolin-3-boronske kiseline (4a), (4b) i (4c) mogu se sintetisati od 3-halohinolina (5) prikazanog u gornjoj formuli 3. Na primer, n-butillitijum može da deluje na 3-halohinolin (5) koji može da se sintetiše prema poznatom postupku, da se dobije 3-litiohinolinski derivat, i zatim, dopusti se da trialkil borat kao što je triizopropil borat deluje na 3-litiohinolinski derivat da se sintetiše estarski derivat hinolin-3-boronske kiseline (4a). Pored toga, estarski derivat hinolin-3-boronske kiseline (4a) se hidrolizuje, tako da može da se prevede u derivat hinolin-3-boronske kiseline (4c). Inače, bis(pinakolato)diboron deluje na 3-halohinolin (5) u prisustvu paladijumskog katalizatora, tako da 3-halohinolin (5) može da se prevede u estarski derivat hinolin-3-boronske kiseline (4b).

[0040] Pored toga, umesto estarskog derivata hinolin-3-boronske kiseline (4c) ili estarskih derivata hinolin-3-boronske kiseline (4a) i (4b), mogu se koristiti i trifluoroborat kalijumova so (4d), ciklični triolborat (4e), ili MIDA boronat (4f). Trifluoroborat kalijumova so (4d), ciklični triolborat (4e), ili MIDA boronat (4f) mogu da se sintetišu korišćenjem derivata hinolin-3-boronske kiseline (4c) ili estarskih derivata hinolin-3-boronske kiseline (4a) i (4b) kao sirovih materijala prema poznatom postupku.

[0041] Polse završetka sinteze, derivati hinolin-3-boronske kiseline (4a) do (4f) mogu da se izoluju, ili mogu da se direktno izlože Suzukijevoj reakciji kuplovanja, bez izolacije i prečišćavanja.

(A-2-1-3) Suzukijeva reakcija kuplovanja 2-halopiridinskog derivata sirćetne kiseline (3) sa derivatom hinolin-3-boronske kiseline (4)

[0042] U predmetnoj reakciji, može se koristiti katalizator koji sadrži paladijum. Primeri katalizatora koji se ovde mogu koristiti mogu uključivati tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0), bis[tris(2-metilfenil)fosfin]paladijum(0), bis(tri-tertbutilfosfin) paladijum(0), bis(tricikloheksilfosfin)paladijum(0), bis(trifenilfosfin)paladijum(II) dihlorid, [1,1’-bis(difenilfosfino) ferocen]dihloropaladijum(II), dihlorobis(tri-o-tolilfosfin) paladijum(II), dihloro bis(tricikloheksilfosfin)paladijum(II), dihloro[2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1’-binaftil]paladijum (II), dihloro[9,9-dimetil-4,5-bis(difenilfosfino)ksanten]paladijum(II), [1,3-bis(2,6-diizopropilfenil)imidazol-2-iliden](3-hloropiridil)paladijum(II) dihlorid (PEPSI (registrovani žig)-IPr katalizator), hloro(2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-dimetoksi-1,1’-bifenil)[2-(2-aminoetil)fenil]paladijum(II) (SPhos Pd G1), hloro(2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil)[2-(2-aminoetil)fenil]paladijum(II) (XPhos Pd G1), hloro(trifenilfosfin)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II), hloro[tri(o-tolil)fosfin][2-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II), hloro[(tricikloheksilfosfin)-2-(2’-amino1,1’-bifenil)]

1

paladijum(II) (PCy3 Pd G2), hloro[(tri t-butilfosfin)-2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) (P(tBu)3Pd G2), hloro(2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-dimetoksi-1,1’-bifenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) (SPhos Pd G2), hloro(2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) (XPhos Pd G2), [2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1’-binaftil][2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (rac-BINAP Pd G3), (2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-dimetoksibifenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (SPhos Pd G3), [(4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksanten)-2- amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (XantPhos Pd G3), (2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil)[2- amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (XPhos Pd G3), paladijum(II) acetat, Tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0), i paladijum-ugljenični katalizator.

[0043] Zajedno sa paladijumskim katalizatorima opisanim gore, može se odabrati i upotrebiti ligand, po potrebi. Primeri liganda mogu uključiti trifenilfosfin, tri(o-tolil)fosfin, tri(tbutil)fosfin, tri(cikloheksil)fosfin, 1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen (DPPF), 1,2-bis(difenilfosfino)etan (DPPE), 2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1’-binaftalen (rac-BINAP), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksanten (XantPhos), 2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-dimetoksibifenil (SPhos), i 2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropilbifenil (XPhos).

[0044] U predmetnoj reakciji može se upotrebiti baza, po potrebi. Primeri baze koja se ovde može upotrebiti mogu uključiti natrijum hidrogen karbonat, kalijum hidrogen karbonat, natrijum karbonat, kalijum karbonat, cezijum karbonat, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, talijum hidroksid, kalijum fosfat, cezijum fluorid, kalijum t-butoksid, trietilamin, i diizopropiletilamin, ali se primeri ne ograničavaju na njih.

[0045] U cilju ubrzanja reakcije ili suzbijanja nastanka sporednih proizvoda, u reakcioni sistem se mogu dodati aditivi, kada je pogodno. Na primer, kada se triflatno telo koristi kao sirovi materijal, može se dodati litijum hlorid, i takođe, za suzbijanje nastanka sporednih proizvoda, može se dodati kalijum format ili slično.

[0046] U predmetnoj reakciji poželjno se koristi vodeni rastvarački sistem. Međutim, predmetna reakcija može da se odvija i bez korišćenja vode. Primeri rastvarača mogu uključivati alkohole kao što su metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol i 1-butanol, etre kao što su tetrahidrofuran, 2-metiltetrahidrofuran i 1,4-dioksan, druge rastvarače kao što su N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilacetamid, N-metilpirolidon, dimetil sulfoksid, toluen, benzen, acetonitril, dihlorometan, 1,2-dihloroetan, hloroform i etil acetat, i rastvaračku mešavinu gore pomenutog rastvarača i vode. Tipovi upotrebljenih rastvarača nisu ograničeni na gore pomenute rastvarače.

1

[0047] U pogledu reakcione temperature, reakcija može da se odvija na pogodnoj temperaturi, u zavisnosti od upotrebljenog reakcionog supstrata i reagensa. Reakcija može da se odvija na temperaturi od sobne temperature do 180°C, i poželjnije na temperaturi od 60°C do 140°C.

[0048] U pogledu vremena reakcije, reakcija može da se odvija tokom pogodnog perioda vremena, u zavisnosti od upotrebljenog reakcionog supstrata i reagensa. Vreme reakcije je poželjno od 30 minuta do 6 sati.

(A-2-2) Postupak proizvodnje 2 karboksilnokiselinskog jedinjenja (2).

[0049] Karboksilnokiselinsko jedinjenje (2) može da se sintetiše i Suzukijevom reakcijom kuplovanja derivata piridin-2-boronske kiseline (6) sa 3-halohinolinom (5), kako je prikazano u sledećoj formuli 4.

gde B2 predstavlja boronsku kiselinu, estar boronske kiseline, pinakolat boronske kiseline, trifluoroborat kalijumovu so, ciklični triolborat, ili MIDA boronat, P<3>predstavlja atom vodonika ili protektujuću grupu karboksilne kiseline, i X<3>predstavlja atom halogena.

[0050] U ovoj reakciji, boronskokiselinski deo derivata piridin-2-boronske kiseline (6) može biti boronska kiselina, estar boronske kiseline, pinakolat boronske kiseline, trifluoroborat kalijumova so, ciklični triolborat, ili MIDA boronat, kao sa derivatom hinolin-3-boronske kiseline (4) u gore opisanom (A-2-1), i pored toga, mogu se primeniti isti reakcioni uslovi kao oni koji su korišćeni u gore opisanom (A-2-1).

[0051] Takav derivat boronske kiseline može da se sintetiše, na primer, od komercijalno dostupnog 2-halopiridinskog derivata (3) prema postupku u vezi sa derivatom hinolin-3-boronske kiseline (4) koji je opisan u gornjem (A-2-1).

[0052] U pogledu P3 protektujuće grupe karboksilne kiseline, protektovanje i deprotektovanje mogu se obaviti u skladu sa gore opisanim (A-2-1).

1

[0053] Reakcija kuplovanja derivata piridin-2-boronske kiseline (6) sa 3-halohinolinom (5) nije ograničena na gore opisanu Suzukijevu reakciju kuplovanja, i mogu se koristiti i različite druge reakcije unakrsnog kuplovanja. Na primer, mogu se koristiti unakrsno-kuplujuća reakcija uz korišćenje organskog jedinjenja cinka umesto derivata boronske kiseline (Negishijeva reakcija) ili unakrsno-kuplujuća reakcija uz korišćenje organskog kalaja (Stilleova reakcija).

[0054] Reakcija deprotektovanje protektujuće grupe karboksilne kiseline može da se izvede prema postupku iz gore opisanog (A-2-1).

(A-2-3) Postupak proizvodnje 3 karboksilnokiselinskog jedinjenja (2)

[0055] Karboksilnokiselinsko jedinjenje (2) može da se sintetiše i postupkom koji je pokazan u narednoj formuli 5. Specifično, karboksilnokiselinsko jedinjenje (2) može da se sintetiše konstruisanjem hinolinskog prstena prema reakciji između amino aldehidnog derivata (8) i acetilenskog derivata (9).

gde je P1 definisano gore.

[0056] U pogledu P1 karboksilnokiselinske protektiujuće grupe, protektovanjw i deprotektovanje mogu se obaviti u skladu sa gore opisanim postupkom (A-2-1).

1

(A-2-3-1) Sinteza amino aldehidnog derivata (8)

[0057] Amino aldehidni derivat (8) može da se sintetiše, na primer, od nitro aldehidnog derivata (7) ili slično, prema poznatom postupku. Od nitro aldehidnog derivata (7), amino aldehidni derivat (8) može da se sintetiše dobro poznatim postupkom koji se koristi za redukciju nitro grupe. Primeri postupka redukcije mogu uključiti katalitičku hidrogenizacionu redukciju, postupak korišćenja gvožđa u prahu u prisustvu kiseline kao što je hlorovodonična kiselina ili sirćetna kiselina, i postupak korišćenja kalaj(II) hlorida.

(A-2-3-2) Sinteza acetilenskog derivata (9)

[0058] Acetilenski derivat (9) može da se sintetiše izvođenjem Sonogashira reakcije kuplovanja između 2-halopiridinskog derivata (3) ili slično i mono-silil protektovanog acetilena, i zatim uklanjanjem silil grupe sa reakcionog proizvoda.

[0059] Bakarna(I) so se poželjno koristi kao katalizator u ovoj reakciji. Primeri bakarne(I) soli mogu uključiti bakar halide kao što su bakar(I) jodid i bakar(I) bromid, ali tipovi bakarnih katalizatora nisu na njih ograničeni.

[0060] U predmetnoj reakciji, uopšteno, poželjno se koristi paladijumski katalizator. Primeri paladijumskog katalizatora mogu uključiti tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) i bis(trifenilfosfin)paladijum(II) dihlorid, ali tipovi upotrebljenih paladijumskih katalizatora nisu na njih ograničeni.

[0061] U predmetnoj reakciji, poželjno se koristi baza. Primeri baze mogu uključiti trietilamin, diizopropiletilamin, dietilamin, dicikloheksilamin i tert-butilamin, ali tipovi upotrebljenih baza nisu na njih ograničeni.

[0062] U predmetnoj reakciji, poželjno se koristi rastvarač. Tip rastvarača koji se koristi nije posebno ograničen, uz uslov da ne utiče nepovoljno na reakciju. Primeri rastvarača mogu uključiti etre kao što su tetrahidrofuran i 1,4-dioksan, i različite rastvarače kao što su N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilacetamid, N-metilpirolidon, dimetil sulfoksid, toluen, benzen, acetonitril, dihlorometan, 1,2-dihloroetan, hloroform i etil acetat, ali tipovi upotrebljenih rastvarača nisu na njih ograničeni. Pored toga, predmetna reakcija može da se odvija i bez upotrebe rastvarača.

[0063] U pogledu temperature reakcije, reakcija može da se odvija na pogodnoj temperaturi, zavisno od upotrebljenog reakcionog supstrata i reagensa. Reakcija može da se odvija na temperaturi od sobne temperature do 180°C, i poželjnije na temperaturi od 40°C do 120°C.

1

[0064] U pogledu vremena reakcije, reakcija može da traje pogodan period vremena, zavisno od upotrebljenog reakcionog supstrata i reagensa. Vreme reakcije je poželjno od 30 minuta do 6 sati.

[0065] 2-halopiridinski derivat (3) upotrebljen u predmetnoj reakciji može da se sintetiše prema poznatom postupku. Pored toga, umesto 2-halopiridinskog derivata (3), mogu da se koriste i derivat 2-(trifluorometansulfoniloksi)piridina, ili derivati 2-(supstituisani sulfoniloksi)piridina kao što su 2-(p-toluensulfoniloksi)piridinski derivat i 2-(metansulfoniloksi) piridinski derivat.

[0066] Primeri mono-silil protektovanog acetilena koji mogu da se koriste u predmetnoj reakciji mogu uključiti trimetilsililacetilen, trietilsililacetilen, triizopropilsililacetilen, tertbutildimetilsililacetilen i tert-butildifenilsililacetilen, ali nisu na njih ograničeni. Pored toga, umesto mono-silil protektovanog acetilena, može da se koristi i pogodno protektovani monoprotektovani acetilen. U ovom slučaju, potrebno je da posle završetka Sonogashira reakcije, upotrebljeni monoprotektovani acetilen može da se deprotektuje bez oštećenja drugih struktura i onda može da se koristi u sledećoj reakciji.

[0067] U sledećoj reakciji deprotektovanja, opštepoznati uslovi reakcije mogu da se primene u zavisnosti od tipa upotrebljenog mono-silil protektovanog acetilena ili drugih monoprotektovanih acetilena. Na primer, može se primeniti postupak opisan u Peter G. M. Wuts, Theodora W. Greene, Greene’s Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th edition, Wiley-Interscience, 2006, itd. U slučaju korišćenja mono-silil protektovanog acetilena, može se koristiti tetra-n-butil amonijum fluorid ili slično, na primer. Kao rastvarač, mogu se koristiti, etri kao što je tetrahidrofuran. Pored toga, aditivi kao što su voda ili sirćetna kiselina takođe se mogu dodati u reakcioni sistem.

(A-2-3-3) Postupak proizvodnje karboksilnokiselinskog jedinjenja (2) korišćenjem amino aldehidnog derivata (8) i acetilenskog derivata (9)

[0068] Predmetna reakcija može da se odvija, na primer, u prisustvu srebro(I) triflata i anilina. Reagensi upotrebljeni u ovom tekstu i njihove kombinacije nisu time ograničeni.

[0069] Primeri rastvarača koji mogu da se koriste u predmetnoj reakciji mogu uključiti dihlorometan, 1,2-dihloroetan i hloroform, ali nisu na njih ograničeni.

[0070] U pogledu reakcione temperature, reakcija može da se odvija na temperaturi od sobne temperature do 180°C, i poželjnije na temperaturi od 60°C to 140°C.

2

[0071] U pogledu vremena reakcije, reakcija može da se odvija pogodan period vremena, zavisno od upotrebljenog reakcionog supstrata i reagensa. Vreme reakcije je poželjno od 30 minuta do 6 sati.

[0072] Reakcija deprotektovanja karboksil-protektujuće grupe može da se izvede istim postupkom kao što je onaj koji je opisan u gornjem (A-2-1).

(A-3) Reakcija kondenzacije aminskog jedinjenja (1) sa karboksilnokiselinskim jedinjenjem (2)

[0073] Primeri kondenzacionog reagensa koji se može koristiti u predmetnoj reakciji može uključiti dicikloheksilkarbodiimid (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC) i hidrohlorid istog, benzotriazol-1-iloksitris(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat (BOP), (benzotriazol-1-iloksi)tripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat (PyBOP), O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU), O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HBTU), bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfinski hlorid (BOP-Cl), 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfonijum hlorid (DMT-MM), heksafluorofosfat {{[(1-cijano-2-etoksi-2-oksoetiliden)amino]oksi}-4-morfolinometilen}dimetilamonijum heksafluorofosfat (COMU), propilfosfonski anhidrid (T3P), N,N’-karbonildiimidazol (CDI) i difenilfosforil azid (DPPA), ali nisu na njih ograničeni. Kondenzacioni reagens je poželjno propilfosfonski anhidrid (T3P).

[0074] U slučaju korišćenja kondenzacionog reagensa kao što je dicikloheksilkarbodiimid (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) ili njegov hidrohlorid, može se dodati 1-hidroksibenzotriazol (HOBt), 1-hidroksi-7-azabenzotriazol (HOAt) ili slično.

[0075] Pored toga, imože se dodati i baza, kao što je trietilamin, diizopropiletilamin, piridin, 2,6-di-tert-butilpiridin, 2,6-lutidin, kolidin, 2,6-di-tert-butil-4-metilpiridin, 4-dimetilaminopiridin ili imidazol, po potrebi. Međutim, tipovi baza koje se ovde upotrebljavaju nisu na njih ograničeni.

[0076] Primeri reakcionog rastvarača koji može da se koristi mogu uključiti tetrahidrofuran, 1,4-dioksan, 1,2-dimetoksietan, N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilacetamid, N-metilpirolidon, acetonitril, dihlorometan, 1,2-dihloroetan, hloroform i toluen, ali nisu na njih ograničeni. Reakcioni rastvarač je poželjno N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilacetamid, ili N-metilpirolidon.

[0077] U pogledu reakcione temperature, reakcija može da se odvija na pogodnoj temperaturi, zavisno od upotrebljenog reakcionog supstrata i reagensa. Reakcija može da se odvija na temperaturi od -20°C do 120°C, i poželjnije na temperaturi od -5°C do 70°C.

[0078] U pogledu vremena reakcije, reakcija može da se odvija pogodan period vremena, zavisno od upotrebljenog reakcionog supstrata i reagensa. Vreme reakcije je poželjno od 30 minuta do 6 sati.

(A-4) Postupak sintetisanja jedinjenja (I), korišćenjem intermedijara dobijenog konvertovanjem karboksilnokiselinskog jedinjenja (2) u kiseli halid

[0079] Jedinjenje (I) može da se sintetiše i prevođenjem karboksilnokiselinskog jedinjenja (2) u kiseli halid, i zatim kondenzovanjem kiselog halida sa aminom (1). Kiseli halid može da se izoluje, ako je potrebno. Primeri kiselog halogenišućeg reagensa koji ovde može da se koristi mogu uključiti kiseli fluorid, kiseli hlorid, i kiseli bromid.

[0080] Alternativno, jedinjenje (I) može da se sintetiše i prevođenjem karboksilnokiselinskog jedinjenja (2) u simetrični kiseli anhidrid ili mešoviti kiseli anhidrid, i zatim kondenzovanjem toga sa aminom (1). Simetrični kiseli anhidrid ili mešoviti kiseli anhidrid može da se izoluje, ako je potrebno. Kao takav mešoviti kiseli anhidrid, može se koristiti mešoviti kiseli anhidrid dobijen reakcijom karboksilne kiseline (2) sa etil hloroformatom, izobutil hloroformatom, tert-butil hloroformatom, hloridom pivalinske kiseline, itd.

Postupak B

(B-1) Jedinjenje (I) može da se proizvede i formiranjem amidne veze prema kondenzacionoj reakciji aminskog jedinjenja (1) sa karboksilnokiselinskim jedinjenjem (3B), i zatim izvođenjem reakcije unakrsnog kuplovanja.

[0081]

gde X4 predstavlja atom halogena.

[0082] U ovde upotrebljenoj reakciji kondenzacije i reakciji unakrsnog kuplovanja, mogu se primeniti isti reakcioni uslovi kao što su upotrebljeni u gornjoj (A-2).

[0083] U svakoj od gornjih formula, gde svaki od R1 i R2 predstavlja atom vodonika, kao sirovi materijal može se koristiti jedinjenje u kojem je atom azota na pirazolskom prstenu protektovan. U tom slučaju, posle završetka reakcije kondenzacije prikazane u formuli 1, protektujuća grupa se uklanja, tako da reakcioni proizvod može da se prevede u jedinjenje (I). Treba napomenuti da protektujuće grupe i reakcije njihovog dodavanja i uklanjanja mogu da se izvode u skladu sa Peter G. M. Wuts, Theodora W. Greene, Greene’s Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th edition, Wiley-Interscience, 2006, itd.

[0084] Posle završetka reakcije u svakom koraku opisanom gore, jedinjenje od interesa sakuplja se iz reakcione mešavine prema uobičajenom postupku. Na primer, reakciona mešavina se neutralizuje po potrebi, ili kada je prisutna nerastvorljiva supstanca, takva nerastvorljiva supstanca se uklanja filtracijom, i rezidui se tada dodaju voda i organski rastvarač koji se ne meša sa njom kao što je etil acetat, tako da se organski sloj koji sadrži jedinjenje od interesa izdvaja. Posle toga, organski sloj se ispere vodom ili slično i zatim suši preko anhidrovanog natrijum sulfata ili slično, i rastvarač se zatim ukloni destilacijom da se dobije jedinjenje od interesa. Pored toga, jedinjenje od interesa može da se dobije i sakupljanjem filtracijom, nerastvorljive supstance nastale u reakcionom rastvoru, ili dodavanjem vode ili organskog rastvarača u reakcioni rastvor i zatim sakupljanjem nastalih nerastvorljivih supstanci filtracijom.

[0085] Ako je potrebno, dobijeni proizvod od interesa može da se izdvoji i prečisti odgovarajućim kombinovanjem uobičajenih postupaka, kao što su rekristalizacija ili reprecipitacija, ili postupci koji se obično koriste u separaciji i prečišćavanju organskih jedinjenja, na primer, postupak korišćenja sintetskih adsorbenata, na primer adsorpciona hromatografija na koloni ili particiona hromatografija na koloni, postupak korišćenja jonoizmenjivačke hromatografije, ili normalno-fazna/reverzno-fazna hromatografija na koloni uz korišćenje alkilisanog silika-gela, i zatim eluiranja odgovarajućim eluentom.

[0086] Pored toga, optički aktivno telo može da se izdvoji i/ili prečisti korišćenjem hiralne kolone, po potrebi.

[0087] Efekat inhibiranja aktivnosti RET kinaze i efekat inhibiranja aktivnosti "gatekeeper" mutanta RET kinaze, jedinjenja predmetnog pronalaska, može se meriti postupkom evaluacije kinazne aktivnosti koju obično koristi stručnjak u oblasti. Takvi efekti mogu se meriti, na primer, testnim postupkom smanjene elektroforetske pokretljivosti. Alternativno, efekti se

2

mogu meriti i alfa-LISA sistemom, postupkom Western blot, ili ELISA postupkom. Pored toga, efekti inhibiranja ne samo RET kinaze, nego i inhibitorni efekat predmetnog jedinjenja na druge kinaze kao što su PDGFR, KIT, NTRK i FLT3, i inhibitorni efekat predmetnog jedinjenja na KDR kinazu udružen sa selektivnošću takođe se mogu meriti istim postupcima kao što je opisano gore.

[0088] Selektivnost jedinjenja predmetnog peonalaska prema drugim kinazama može da se potvrdi i gore opisanim testnim postupkom smanjene elektroforetske mobilnosti, i slično. Na primer, postupak koji je baziran na testnom postupku smanjene elektroforetske mobilnosti obezbeđenom od strane Carna Biosciences, Inc. ili KinomeScan postupkom obezbeđenom od strane DiscoverX primenjuje se na panelu kinaza koji se sastoji od različitih tipova kinaza, tako da može da se meri inhibitorna aktivnost jedinjenja na različite vrste kinaza i može da se potvrdi kinazna selektivnost.

[0089] Efekat inhibiranja aktivnosti RET kinaze, efekat inhibiranja aktivnosti "gatekeeper" mutanta RET kinaze i efekat inhibiranja aktivnosti KDR kinaze, jedinjenja predmetnog pronalaska, koji se ispoljavaju u ćelijama, mogu se meriti postupkom evaluacije kinazne aktivnosti koji obično koristi stručnjak u oblasti. Na primer, efekti se mogu meriti alfa-LISA sistemom, postupkom Western blot, ili ELISA postupkom. Pored toga, ne samo inhibitorni efekat predmetnog jedinjenja na RET i KDR kinazu, nego i inhibitorni efekat na druge kinaze kao što su PDGFR, KIT, NTRK i FLt3 mogu se meriti istim postupcima kao što je opisano gore.

[0090] Aktivnost inhibiranja rasta koju jedinjenje predmetnog pronalaska ima prema ćelijskoj liniji LC-2/ad nesitnoćelijskog kancera pluća i ćelijskoj liniji TT kancera štitne žlezde može se meriti korišćenjem testa inhibicije rasta koji obično koristi stručnjak u oblasti. Na primer, aktivnost se može meriti ATP-Glo testom ili MTT testom. Aktivnost inhibiranja rasta koju jedinjenje predmetnog pronalaska ima prema ćelijskim linijama može se takođe meriti istim postupcima kao što su oni opisani gore.

[0091] Pored toga, in vivo antitumorska aktivnost jedinjenja predmetnog pronalaska može se ispitati korišćenjem postupka antitumorskog testa koji obično koristi stručnjak u oblasti. Na primer, kao u slučaju gore pomenutog postupka, različiti tipovi tumorskih ćelija se transplantiraju u miša, pacova, i slično, i u isto vreme kao transplantacija, ili pošto je adhezija transplantiranih ćelija potvrđena, primeni se jedinjenje predmetnog pronalaska kod subjekta oralnom primenom, intravenskom primenom, itd. Nekoliko dana do nekoliko nedelja posle primene, rast tumora u grupi kod koje nije primenjen lek upoređuje se sa rastom tumora u grupi kod koje je primenjen lek, tako da može da se potvrdi antitumorska aktivnost predmetnog jedinjenja in vivo.

[0092] Rastvorljivost jedinjenje predmetnog pronalaska u vodi može se meriti, na primer, dodavanjem predmetnom jedinjenju medijuma koji će se ispitivati, protresanjem dobijene mešavine, ostavljanjem reakcione mešavine na neko vreme, filtriranjem, i merenjem koncentracije jedinjenja u filtratu. Kao medijum koji se ovde koristi, mogu poslužiti puferski rastvori koji imaju različite pH vrednosti i medijumi koji imitiraju crevni sok u stanju sitosti ili gladovanja.

[0093] Osobine jedinjenja predmetnog pronalaska da prodiru u različita tkiva i/ili organe, na primer prodiranje u mozak, centralno prodiranje i prodiranje u kožu, mogu se meriti primenom jedinjenja kod različitih tipova životinja, isecanjem tkiva ili organa iz životinje pošto prođe unapred određeni period vremena, njegovom odgovarajućom obradom, merenjem koncentracije jedinjenja sadržanog u njemu, i zatim upoređivanjem izmerene koncentracije jedinjenja sa njegovom koncentracijom u krvi. Postoji slučaj kada osobina prodiranja može preciznije da se izmeri, ili može da se izmeri neinvazivno, primenom fluorescentno obeleženog ili radioobeleženog jedinjenja kod životinje.

[0094] Gore opisano piridinsko jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) predmetnog pronalska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, može se koristiti kao lek koji sadrži isto, a poželjno kao antikancersko sredstvo. Primeri bolesti za čije lečenje ili prevenciju se može koristiti jedinjenje predmetnog pronalaska, mogu uključivati razlčite tipove kancera, sarkoma i leukemija, uključujući: kancere kao što su kancer kore nadbubrega, kancer anusa, kancer žučnog kanala, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer cerviksa uterusa, kancer kolona, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, Ewingov sarkom, kancer žučne kesice, kancer hipofarinksa, kancer farinksa, kancer usana i usne duplje, kancer jetre, nesitnoćelijski kancer pluća, melanom, mezoteliom, multipli mijelom, kancer ovarijuma, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer želuca, kancer testisa, i kancer štitne žlezde; leukemije kao što su hronična limfocitna leukemija, akutna limfocitna leukemija, hronična mijelogena leukemija, i akutna mijelogena leukemija; i limfome kao što su Hodgkinov limfom i ne-Hodgkinov limfom.

[0095] Gore opisano piridinsko jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) predmetnog pronalska ili farmaceutski prihvatljiva so, može se primeniti u različitim formama. Njegova dozna forma nije posebno ograničena, i određuje se u zavisnosti od različitih tipova oblika preparata, starosti, pola i drugih uslova u vezi sa pacijentom, jačine bolesti, i slično. Na primer, kada je predmetno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u doznoj formi

2

tablete, pilule, praška, granule, sirupa, tečnosti, suspenzije, emulzije ili kapsule, ono se primenjuje oralno. Sa druge strane, kada je predmetno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u formi injekcije, ono se primenjuje intravenski, samo ili pomešano sa uobičajenim dopunama za tečnost kao što su glukoza ili amino-kiselina. Pored toga, takva injekcija se primenjuje sama intramuskularno, intradermalno, supkutano ili intraperitonealno, po potrebi. U slučaju supozitorija, primenjuje se rektalno. Postupak primene je poželjno oralna primena.

[0096] Različiti tipovi ovih prparata mogu se formulisati dodavanjem, glavnom leku, poznatih pomoćnih sredstava koja se mogu uobičajeno koristiti u oblasti farmaceutskih preparata, kao što su ekscipijent, povezivač, dezintegrišuće sredstvo, lubrikans, sredstvo za razblaživanje, korigent i sredstvo za oblaganje, u skladu sa uobičajenim postupkom.

[0097] Kada je predmetno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, oblikovano u tabletu, nosači koji su konvencionalno poznati u ovoj oblasti tehnike mogu se široko koristiti. Primeri nosača mogu uključivati: ekscipijente kao što su laktoza, saharoza, natrijum hlorid, glukoza, urea, skrob, kalcijum karbonat, kaolin, kristalna celuloza i silicijumova kiselina; povezivače kao što su voda, etanol, propanol, jednostavni sirup, rastvor glukoze, rastvor skroba, rastvor želatina, karboksimetil celuloza, šelak, metil celuloza, kalijum fosfat, i polivinil pirolidon; dezintegratore kao što su suvi skrob, natrijum alginat, agar u prahu, laminarin u prahu, natrijum hidrogen karbonat, kalcijum karbonat, estri masnih kiselina i polioksietilen sorbitana, natrijum lauril sulfat, monoglicerid stearat, skrob, i laktoza; inhibitore dezintegracije kao što su saharoza, stearin, kakao buter, i hidrogenisano ulje; promotore apsorpcije kao što su kvaternarna amonijumska baza i natrijum lauril sulfat; ovlaživače kao što su glicerin i skrob; adsorbente kao što su skrob, laktoza, kaolin, bentonit, i koloidna silicijumova kiselina; i lubrikanse kao što su prečišćeni talk, stearat, boraks u prahu, i polietilen glikol. Pored toga, tableta može dodatno da se obradi u tabletu koja je obložena opštim filmom za oblaganje, kao što je tableta obložena šećerom, tableta obložena želatinom, tableta sa enteričnim omotačem, tableta obložena filmom, ili još, dvostruko obložena tableta ili tableta obložena sa više slojeva, po potrebi.

[0098] Kada je predmetno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, oblikovano u pilulu, nosači koji su konvencionalno poznati u ovoj oblasti tehnike mogu se široko koristiti. Primeri nosača mogu uključivati: ekscipijente kao što su glukoza, laktoza, skrob, kakao buter, hidrogenisano biljno ulje, kaolin, i talk; povezivače kao što je gumiarabika u prahu, tragant u prahu, želatin, i etanol; i dezintegrišuća sredstva kao što su laminarin u prahu.

2

[0099] Kada je predmetno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, oblikovano u supozitoriju, nosači koji su konvencionalno poznati u ovoj oblasti tehnike mogu se široko koristiti. Primeri nosača mogu uključivati polietilen glikol, kakao buter, viši alkohol, viši alkoholni estar, želatin, i polusintetski glicerid.

[0100] Kada je predmetno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so pripremljeno u formi injekcionog sredstva, poželjno je da tečno sredstvo ili suspenziono sredstvo bude sterilisano i izotonično sa krvlju ili slično. Kada je predmetno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so oblikovano u takvo tečno sredstvo, emulziono, ili suspenziono sredstvo, mogu se koristiti svi razblaživači koji se uobičajeno koriste u predmetnoj oblasti tehnike. Primeri razblaživača mogu uključivati vodu, etil alkohol, propilen glikol, etoksilisani izostearil alkohol, polioksilisani izostearil alkohol, i estre masnih kiselina i polioksietilen sorbitana. U ovom slučaju farmaceutski preparat može sadržati uobičajenu so, glukozu ili glicerin u količini dovoljnoj za pripremanje izotoničnog rastvora, i pored toga, uobičajeni solubilizer, pufer, umirujuće sredstvo i slično takođe se mogu dodati u farmaceutski reparat.

[0101] Pored toga, farmaceutski preparat može sadržati sredstvo za davanje boje, prezervans, aromatčno sredstvo, sredstvo za poboljšanje ukusa, zaslađivač i slično, i druge farmaceutske proizvode, po potrebi.

[0102] Količina jedinjenja kao aktivnog sastojka sadržanog u gore opisanom farmaceutskom preparatu nije posebno ograničena, i bira se iz širokog raspona, po potrebi. Uopšteno, odgovarajuće je da jedinjenje kao aktivni sastojak bude sadržano u količini od 1% do 70% po težini, i poželjno 1% do 30% po težini, na bazi težine čitave kompozicije.

[0103] Doza se razlikuje u zavisnosti od simptoma, starosti, telesne težine, načina primene, dozne forme, i slično. Uopšteno, donji limit dnevne doze za odrasle je 0.001 mg/kg (poželjno 0.01 mg/kg, poželjnije 0.1 mg/kg), a njen gornji limit je 200 mg/kg (poželjno 20 mg/kg, poželjnije 10 mg/kg). Jedinjenje predmetnog pronalaska može se primeniti u gore opisanoj dozi, odjednom ili podeljeno u nekoliko doza na dan.

[0104] Jedinjenje predmetnog pronalaska može se upotrebiti u kombinaciji sa različitim sredstvima za lečenje ili prevenciju gore pomenutih oboljenja, za koja se predmetni pronalazak smatra efikasnim. Na primer, jedinjenje predmetnog pronalaska može da se upotrebi u kombinaciji sa takozvanim kancerskim hemioterapijskim sredstvima kao što su alkilirajuća sredstva (ciklofosfamid, bendamustin, temozolomid, mitomicin C, itd.), preparatima platine (cisplatin, karboplatin, itd.), antimetabolitima (pemetreksed, 5-FU, kapecitabin, itd.), inhibitorima tubulina (vinkristin, taksol, eribulin, itd.) i inhibitorima

2

topoizomeraze (irinotekan, doksorubicin, itd.), i različitim formama njihovih preparata. Pored toga, jedinjenje predmetnog pronalaska može da se koristi i u kombinaciji sa različitim tipovima, takozvanih, biofarmaceutskih proizvoda, uključujući preparate antitela kao što su trastuzumab, bevacizumab i nivolumab, kompleksima antitelo-lek kao što je T-DM1, itd. Pored toga, predmetno jedinjenje može da se koristi i u kombinaciji sa različitim tipovima takozvanih molekularno-ciljajućih sredstava male molekularne težine kao što su inhibitori kinaza (imatinib, nilotinib, erlotinib, gefitinib, afatinib, osimertinib, sunitinib, dasatinib, ibrutinib, sorafenib, vemurafenib, trametinib, i palbociklib), inhibitori proteazoma (bortezomib, itd.), inhibitori HDAC (vorinostat, itd.), i inhibitori PARP (olaparib, itd.). Pored gore pomenutih sredstava, predmetno jedinjenje može da se koristi i u kombinaciji sa imunomodulatorima kao što su talidomid, interferoni, i lekovi za hormonsku terapiju (tamoksifen, anastrozol, itd.). Pored toga, ova sredstva se kombinuju jedno sa drugim, tako da predmetno jedinjenje može da se koristi u kombinaciji sa tri ili više sredstava.

Povoljni efekti pronalaska

[0105] Prema predmetnom pronalasku, obezbeđeno je jedinjenje predstavljeno gore opisanom formulom (I) koje ima aktivnost inhibiranja RET kinaze. Takvo jedinjenje je korisno kao terapijsko sredstvo za bolesti prouzrokovane aktivirajućom mutacijom ili povećanom ekspresijom RET kinaze, i/ili bolesti udružene sa aktivirajućom mutacijom ili povećanom ekspresijom RET kinaze, na primer, kao antikancersko sredstvo.

Detaljan opis

[0106] U daljem tekstu, predmetni pronalazak biće opisan detaljnije u narednim primerima i slično. Međutim, svrha ovih primera nije da ograniče obim predmetnog pronalaska, i ovi primeri ne treba tumačiti restriktivno ni u kom smislu. Pored toga, u ovom opisu, upotrebljeni reagensi, rastvarači i polazni materijali se lako nabavljaju iz komercijalno dostupnih izvora, ukoliko nije drugačije navedeno.

[0107] Protonska NMR merena je korišćenjem 400 MHz NMR spektrometra koji proizvodi JEOL, ili 400 MHz NMR spektrometra koji proizvodi Varian. Spektralni podaci za protonsku NMR pokazuju značajen pikove, i podaci su pokazani sa hemijskim pomakom (koji je prikazan kao relativni ppm (δ) tetrametilsilanskog pika), broj protona, i multiplicitet razdvajanja pikova (koji su prikazani kao s: singlet; d: dublet; t: triplet; q: kvartet; m: multiplet; br s: široki singlet; dd: dvostruki dublet, itd.), i dodatno, kuplujuća konstanta je naznačena kao J vrednost (jedinica: Hz), ako može da se eksplicitno opiše. Niskorezolucioni

2

maseno-spektralni podaci prikazani su u odnosu na maksimalni jonizacioni pik (koji odgovara maksimalnom piku UV apsorpcije u skoro svim slučajevima) dobijen posle prolaska kroz kolonu za reverzno-faznu tečnu hromatografiju visokih performansi (Agilent System; kolona: Develosil Combi-RP-5, 2.0 x 50mm, Cadenza CD-18, 3.0 x 75mm, ili ZORBAXSB-C18, 2.1 x 50 mm; rastvarač: sistem acetonitrila koji sadrži 0.1% mravlja kiselina/voda, ili sistem acetonitrila koji sadrži 0.01% trifluorosirćetnu kiselinu/voda), primenom postupka jonizacije elektrosprejom (electrospray ionization method, ESI) ili postupka hemijske jonizacije na atmosferskom pritisku (atmospheric pressure chemical ionization method, APCI).

[0108] Hromatografija na koloni od silika-gela obavljena je primenom postupka u kojem se koriste komercijalno dostupna pakovana kolona i automatski sistem (npr., Biotage SP1 System, itd.), ili postupka koji uključuje punjenje staklene kolone koriščenjem Silica Gel 60 proizvedenog od strane Merck (prečnik čestica: 0.063-0.200 mm), a opisano je više tipova upotrebljenih rastvarača. Količine upotrebljenih rastvarača, odnos rastvarača, vreme zamene rastvarača drugim rastvaračem, i postupak gradijenta nisu opisani u ovom tekstu. Međutim, smantra se da se postupci prečišćavanja i/ili separacije primenjeni u ovom tekstu lako mogu ponoviti uz posedovanje uobičajenog znanja i/ili tehnologije u oblasti hemijske sinteze.

[0109] Treba napomenuti da skraćenice upotrebljene u primerima koji slede imaju sledeća značenja. mg: miligram, g: gram, mL: mililitsr, i MHz: megaherc.

Kratak opis crteža

[0110]

[Slika 1] Slika 1 prikazuje rezultat efekta regresije tumora u testu antitumorske aktivnosti uz korišćenje ksenograftskog modela uspostavljenog sa ćelijskom linijom LC-2/ad nesitnoćelijskog kancera pluća.

[Slika 2] Slika 2 prikazuje rezultat smanjenja efekta RET fosforilacije tirozina na poziciji 905, koji se koristi kao pokazatelj aktivnosti RET kinaze.

Primeri

<Primer 1>

2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[5-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-3-il]acetamid

2

<1-1> (6,7-dimetoksihinolin-3-il)boronska kiselina

[0111] U atmosferi azota, rastvor 3-bromo-6,7-dimetoksihinolina (17.03 g, 63.5 mmol) i triizopropil borata (19.0 mL, 82.3 mmol) u tetrahidrofuranu (170 mL) ohladi se na -78°C, i u rastvor se u kapima dodaje rastvor n-butillitijum heksana (1.60 mol/L, 58.0 mL, 92.8 mmol) tokom 1 sata. Posle toga, mešoviti rastvor se meša 30 minuta na istoj temperaturi kao što je opisano gore. Posle toga, temperatura reakcionog rastvora se poveća na -30°C do -40°C, 1 mol/L hlorovodonične kiseline (170 mL) se polako dodaje u reakcioni rastvor, i temperatura rastvora se zatim povisi na sobnu temperaturu. U reakcioni rastvor se doda 1 mol/L vodenog rastvora natrijum hidroksida (50 mL), i precipitirana čvrsta supstanca se sakupi filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca se rastvori u metanolu, i zatim koncentruje pod sniženim pritiskom. Posle toga, rezidui se doda mešoviti rastvarač hloroform/metanol (9 : 1), i nerastvorljiva supstanca se isfiltrira. Organski sloj se izdvoji iz dobijenog filtarata koji sadrži vodu, i vodeni sloj se zatim zasiti natrijum hloridom, što je praćeno ekstrakcijom mešovitim rastvaračem hloroform/metanol (9 : 1), tri puta. Dobijeni organski slojevi se kombinuju, i kombinovani slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, zatim filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije ciljno jedinjenje (13.74 g, 59.0 mmol, prinos: 72%) u vidu narandžaste čvrste supstance. MS m/z: 234 (M+H)<+>.

<1-2> Metil [6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridil-3-il]acetat

[0112] Rastvor natrijum karbonata (5.96 g, 56.2 mmol) u vodi (18 mL) doda se u suspenziju (6,7-dimetoksihinolin-3-il)boronske kiseline (4.37 g, 18.75 mmol), metil 2-(6-hloropiridil-3-il)acetata (3.47 g, 18.70 mmol) i 2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropilbifenila (895 mg, 1.88 mmol) u 1,4-dioksanu (72 mL), što je praćeno azotnom supstitucijom. Posle toga, tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (849 mg, 0.938 mmol) doda se u reakcionu mešavinu, i ponovo se izvrši azotna supstitucija. Mešavina se meša na 80°C 3 sata. Posle toga, reakcioni rastvor se ohladi na sobnu temperaturu, i u reakcioni rastvor se doda zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (200 mL). Mešoviti rastvor se ekstrahuje etil acetatom tri puta, i kombinovani organski sloj se zatim suši preko anhidrovanog natrijum sulfata. Dobijeni materijal se koncentruje pod sniženim pritiskom, i zatim prečisti hromatografijom na koloni od silika-gela (NH silika-gel, etil acetat/heksan) da se dobije ciljno jedinjenje (4.04 g, 12.46 mmol, prinos: 67%) u vidu žute čvrste supstance.<1>H-NMR(CDCl3) δ: 3.71 (2H, s), 3.74 (3H, s), 4.03 (3H, s), 4.06 (3H, s), 7.14 (1H, s), 7.46 (1H, s), 7.77 (1H, dd, J = 8.2, 2.1 Hz), 7.84 (1H, d, J = 7.3 Hz), 8.62 (1H, d, J = 1.8 Hz), 8.64 (1H, d, J = 1.8 Hz), 9.31 (1H, d, J = 2.4 Hz). MS m/z: 339 (M+H)+ .

<1-3> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridil-3-il]sirćetna kiselina

[0113] Tetrahidrofuran (20 mL), metanol (20 mL), i 1 mol/L vodenog rastvora natrijum hidroksida (20 mL, 20.0 mmol) dodaju se u metil 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]acetat (2.24 g, 6.91 mmol), i dobijena mešavina se zatim meša na sobnoj temperaturi 1.5 sati. Posle toga, 1 mol/L hlorovodonične kiseline (20 mL) doda se u reakcioni rastvor, i mešoviti rastvor se koncentruje pod sniženim pritiskom. Mešoviti rastvarač hloroform/metanol (9 : 1) doda se dobijenoj rezidui, što je praćeno filtracijom. Dobijeni filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom i suši da se dobije grubo prečišćeni proizvod ciljanog jedinjenja. Dobijeni grubo prečišćeni proizvod se ispere dietil etrom, i zatim mešovitim rastvaračem etanol/dietil etar (1 : 1) da se dobije ciljno jedinjenje (1.57 g, 4.83 mmol, prinos: 70%) u vidu bezbojne čvrste supstance.<1>H-NMR(DMSO-d6): 3.69 (2H, s), 3.91 (3H, s), 3.93 (3H, s), 7.40 (1H, s), 7.45 (1H, s), 7.81 (1H, dd, J = 8.2, 2.1 Hz), 8.06 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.58 (1H, d, J = 1.8 Hz), 8.81 (1H, d, J = 1.8 Hz), 9.35 (1H, d, J = 1.8 Hz). MS m/z: 325 (M+H)+ .

<1-4> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[5-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-3-il]acetamid

[0114] Propilfosfonski anhidrid (50% etil acetatni rastvor, približno 1.7 mol/L, 1.80 mL, 3.06 mmol) doda se u suspenziju 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]sirćetne kiseline (486 mg, 1.495 mmol), 5-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-3-amina (320 mg, 1.648 mmol, opisanog u J. Med. Chem., 2012, 55, 1082-1105) i piridina (0.483 mL, 5.97 mmol) u N,N-dimetilformamidu (12 mL), i dobijena mešavina se zatim meša na sobnoj temperaturi 2 sata. Posle toga, reakciona mešavina se sipa u mešavinu vode (90 mL) i zasićenog vodenog rastvora natrijum hidrogen karbonata (60 mL), i dobijena mešavina se zatim ohladi na 0°C. Precipitirana čvrsta supstanca sakupi se filtracijom, i dobijenoj čvrstoj supstanci se zatim dodaju voda i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata. Dobijeni rastvor se ekstrahuje dihlorometanom. Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod sniženim pritiskom. Rezidua se prečisti hromatografijom na koloni od silikagela (dihlorometan/metanol) da se dobije ciljno jedinjenje (654 mg, 1.308 mmol, prinos: 87%) u vidu bezbojne čvrste supstance.

1

<Primer 2>

2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[5-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-3-il]acetamid metansulfonat

[0115] Vodeni rastvor 2.0 mol/L metansulfonske kiseline (0.821 mL, 1.642 mmol) doda se u suspenziju 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[5-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-3-il]acetamida (632 mg, 1.261 mmol) u izopropil alkoholu (12.6 mL) na sobnoj temperaturi, i dobijena mešavina se zatim meša 30 minuta. Posle toga, reakciona mešavina se ohladi na 0°C, i zatim meša 1 sat. Posle toga, dobijena čvrsta supstanca se sakupi filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca se ispere izopropil alkoholom, i zatim suši da se dobije ciljno jedinjenje (734 mg, 1.230 mmol, prinos: 98%) u vidu bezbojne čvrste supstance.

<Primer 3> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]acetamid

[0116] Propilfosfonski anhidrid (50% etil acetatni rastvor, približno 1.7 mol/L, 1.80 mL, 3.06 mmol) doda se u suspenziju 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]sirćetne kiseline (486 mg, 1.495 mmol) dobijene u Primeru 1-3, 3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-amina (320 mg, 1.648 mmol, opisan u J. Med. Chem., 2012, 55, 1082-1105) i piridina (0.483 mL, 5.97 mmol) u N,N-dimetilformamidu (12 mL) na sobnoj temperaturi, i dobijena mešavina se zatim meša na istoj temperaturi kao što je opisano gore, 2 sata. Posle toga, reakciona mešavina se sipa u mešavinu vode (80 mL) i zasićenog vodenog rastvora natrijum hidrogen karbonata (80 mL), i dobijena mešavina se zatim ohladi na 0°C. Precipitirana čvrsta supstanca sakupi se filtracijom, i posle toga, dobijenoj čvrstoj supstanci redom se dodaju dihlorometan, voda, i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata, tako da se organski sloj izdvoji. Dobijeni organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, i zatim koncentruje pod sniženim pritiskom. Rezidua se prečisti hromatografijom na koloni od silika-gela (dihlorometan/metanol) da se dobije ciljno jedinjenje (683 mg, 1.366 mmol, prinos: 91%) u vidu svetložute čvrste supstance.

<Primer 4> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]acetamid metansulfonat

[0117] Vodeni rastvor 2.0 mol/L metansulfonske kiseline (0.883 mL, 1.766 mmol) doda se u suspenziju 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-

2

il)-1,2-oksazol-5-il]acetamida (680 mg, 1.360 mmol) u izopropil alkoholu (20.4 mL) na sobnoj temperaturi, i dobijena mešavina se zatim meša na istoj temperaturi kao što je opisano gore, 30 minuta. Posle toga, reakciona mešavina se ohladi na 0°C, i zatim meša 1 sat. Dobijena čvrsta supstanca se sakupi filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca se ispere izopropil alkoholom, i zatim suši da se dobije ciljno jedinjenje (626 mg, 1.050 mmol, prinos: 77%) u vidu svetložute čvrste supstance.

<Primer 5> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid

<5-1> tert-butil 5-amino-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilat

[0118] Rastvor kalijum hidroksida (7.0 g, 125 mmol) rastvorenog u vodi (15 mL) doda se u rastvor 3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-amina (2.6 g, 13.5 mmol, jedinjenja sintetisanog drugim korakom Primera 42 u Odeljku 155, WO 2014/141187) u dihlorometanu (100 mL) na sobnoj temperaturi, i posle toga, dobijena mešavina se intenzivno meša na istoj temperaturi kao što je opisano gore. U ovaj reakcioni rastvor, doda se ditertbutil dikarbonat (3.0 g, 13.8 mmol) na sobnoj temperaturi, i tako dobijeni rastvor se meša na istoj temperaturi kao što je opisano gore, 4 sata. Izdvojeni organski sloj se ispere zasićenim slanim rastvorom, i zatim suši preko natrijum sulfata. Nerastvorljive supstance se uklone filtracijom, a rastvarač se zatim ukloni destilacijom pod sniženim pritiskom. Rezidua se prečisti hromatografijom na koloni od silika-gela (heksan/dihlorometan) da se dobije jedinjenje iz naslova (2.2 g, 7.5 mmol, prinos: 56%) u vidu svetložute čvrste supstance.<1>H-NMR(CDCl3) δ: 1.49 (6H, s), 1.64 (9H, s), 5.15 (2H, brs), 5.46-5.47 (1H, m). MS m/z: 194 (M+H-Boc)+ .

<5-2> tert-butil 5-({[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]acetil}amino)-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilat

[0119] Propilfosfonski anhidrid (50% etil acetatni rastvor, približno 1.7 mol/L, 46.0 mL, 78.2 mmol) doda se u rastvor tert-butil 5-amino-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilata (8.10 g, 27.6 mmol), 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]sirćetne kiseline (8.5 g, 26.2 mmol) dobijene u Primeru 1-2, i piridina (21 mL, 261 mmol) u N,N-dimetilformamidu (80 mL) na sobnoj temperaturi, i dobijeni rastvor se zatim meša na istoj temperaturi kao što je opisano gore, 5 sati. Posle toga, reakciona mešavina se sipa u mešavinu vode (200 mL) i zasićenog vodenog rastvora natrijum hidrogen karbonata (100 mL), i dobijena mešavina se zatim meša na sobnoj temperaturi 30 minuta. Posle toga, precipitirana čvrsta supstanca se sakupi filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca se ispere vodom i zatim heksanom, i zatim suši na sniženom pritisku. Tako dobijeni sirovi proizvod se suspenduje u diizopropil etru (200 mL), i nerastvorljive supstance se zatim sakupe filtracijom da se dobije ciljno jedinjenje (15.21 g, 25.4 mmol, prinos: 97%) u vidu skoro bezbojne čvrste supstance.

1H-NMR(CDCl3) δ: 1.51 (6H, s), 1.61 (9H, s), 3.83 (2H, s), 4.04 (3H, s), 4.07 (3H, s), 6.91 (1H, s), 7.16 (1H, s), 7.47 (1H, s), 7.83-7.90 (2H, m), 8.63 (1H, d, J = 2.4 Hz), 8.70 (1H, d, J = 1.8 Hz), 9.32 (1H, d, J = 1.8 Hz), 10.34 (1H, s). MS m/z: 600 (M+H)+ .

<5-3> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid

[0120] Trifluorosirćetna kiselina (5.0 mL) se doda u rastvor tert-butil 5-({[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]acetil}amino)-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilata (0.81 g, 1.351 mmol) u dihlorometanu (20 mL) uz hlađenje na ledu, i temperatura dobijene mešavine se zatim povisi na sobnu temperaturu, što je praćeno mešanjem mešavine. Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 24 sata, i isparljive komponente se zatim uklone destilacijom pod sniženim pritiskom. Rezidua se prečisti hromatografijom na koloni od silika-gela (NH silika-gel, dihlorometan/etil acetat, i zatim dihlorometan/metanol). Dobijeni sirovi proizvod se ispere mešovitim rastvaračem etil acetat/heksan da se dobije jedinjenje iz naslova (0.64 g, 1.283 mmol, prinos: 95%) u vidu svetložute čvrste supstance.

<Primer 6> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid metansulfonat

[0121] Vodeni rastvor 2.0 mol/L metansulfonske kiseline (6.00 mL, 12.00 mmol) doda se u suspenziju 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamida (4.00 g, 8.02 mmol) u izopropil alkoholu (80 mL) na sobnoj temperaturi, i dobijena mešavina se zatim meša na 60°C dok reakcioni rastvor ne postane rastvor. Posle toga, dobijeni rastvor se ostavi da odstoji na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcioni rastvor, zajedno sa precipitiranom čvrstom supstancom, meša se na sobnoj temperaturi 4 sata, i nastala čvrsta supstanca se sakupi filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca se suši pod sniženim pritiskom da se dobije ciljno jedinjenje (4.14 g, 6.95 mmol, prinos: 87%) u vidu svetložute čvrste supstance.

4

<Primer 7> 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[1-metil-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid

[0122] Propilfosfonski anhidrid (50% etil acetatni rastvor, približno 1.7 mol/L, 0.18 mL, 0.306 mmol) doda se u rastvor 1-metil-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-amina (48 mg, 0.313 mmol, jedinjenja sintetisanog drugim korakom Primera 41 u Odeljku 153, WO 2014/141187), 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]sirćetne kiseline (68 mg, 0.208 mmol) dobijene u Primeru 1-3, i piridina (0.050 mL, 0.618 mmol) u N,N-dimetilformamidu (1 mL), i dobijena mešavina se zatim meša na 80°C 2.5 sata. Reakcioni rastvor se ohladi na sobnu temperaturu, i meša preko noći. Posle toga, u reakcioni rastvor dodaju se piridin (0.017 mL, 0.210 mmol) i propilfosfonski anhidrid (50% etil acetatni rastvor, približno 1.7 mol/L, 0.061 mL, i 0.104 mmol), i dobijena mešavina se zatim meša na 80°C 2.5 sata. Reakcioni rastvor se ohladi na sobnu temperaturu, i doda mu se zatim zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (10 mL). Mešoviti rastvor se ekstrahuje etil acetatom tri puta, i dobijeni ekstrakti se zatim kombinuju. Kombinovani ekstrakti se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i zatim koncentruju pod sniženim pritiskom. Rezidua se redom prečisti hromatografijom na koloni od silika-gela (metanol/dihlorometan), a zatim hromatografijom na koloni od silika-gela (NH silika-gel, metanol/dihlorometan). Dobijeni sirovi proizvod se suspenduje u dietil etru, i čvrsta supstanca se zatim sakupi filtracijom da se dobije ciljno jedinjenje (48.9 mg, 0.095 mmol, prinos: 46%) u vidu bezbojne čvrste supstance.

<Primer 8> Alternativni postupak za sintezu metil [6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il) piridil-3-il] acetata

<8-1> 2-amino-4,5-dimetoksibenzaldehid

[0123] Suspenzija 4,5-dimetoksi-2-nitrobenzaldehida (5.00 g, 23.7 mmol), 0.1 mol/L hlorovodonične kiseline (10 mL), i 150 μm gvožđa u prahu (5.17 g, 92.6 mmol) u etanolu (70 mL) meša se na 80°C 2.5 sata. Posle toga, reakcioni rastvor se ohladi na sobnu temperaturu, i zatim filtrira kroz Celite (KANTO KAGAKU, Celite 545). Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom. Etil acetat se doda rezidui, i mešavina se zatim filtrira kroz silika-gel. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom, i zatim suši da se dobije ciljno jedinjenje (3.96 g, 21.9 mmol, prinos: 92%) u vidu crvene čvrste supstance.<1>H-NMR(CDCl3) δ: 3.85 (3H, s), 3.89 (3H, s), 6.00-6.17 (3H, m), 6.88 (1H, s), 9.69 (1H, s). MS m/z: 182 (M+H)+ .

<8-2> Metil (6-{[tri(propan-2-il)silil]etinil}piridin-3-il)acetat

[0124] Azot se u mehurićima uvede u suspenziju bakar(I) jodida (15.1 mg, 0.079 mmol), bis(trifenilfosfin)paladijum(II) dihlorida (58.0 mg, 0.083 mmol), metil 2-(6-hloropiridin-3-il)acetata (517 mg, 2.79 mmol), trietilamina (1.20 mL, 8.61 mmol), i triizopropilsililacetilena (1.20 mL, 5.35 mol) u N,N-dimetilformamidu (1 mL). Posle toga, reakcioni sistem se supstituiše azotom, i suspenzija se zatim meša na 80°C 5.5 sati. Reakcioni rastvor se ohladi na sobnu temperaturu, i zatim mu se doda zasićeni slani rastvor, što je praćeno ekstrakcijom etil acetatom. Ekstrakt se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, i zatim koncentruje pod sniženim pritiskom. Rezidua se prečisti hromatografijom na koloni od silika-gela (heksan/etil acetat) da se dobije ciljno jedinjenje (888 mg, 2.55 mmol, prinos: 92%) u vidu svetložute uljane supstance. 1H-NMR(CDCl3) δ: 1.06-1.18 (21H, m), 3.62 (2H, s), 3.69 (3H, s), 7.40-7.45(1H, m), 7.54-7.61 (1H, m), 8.44-8.48 (1H, m). MS m/z: 332 (M+H)+ .

<8-3> Metil (6-etinilpiridin-3-il)acetat

[0125] Tetrabutilamonijum fluorid (1 mol/L tetrahidrofuranski rastvor, 17 mL) doda se u rastvor metil (6-{[tri(propan-2-il)silil]etinil}piridin-3-il)acetata (3.76 g, 10.82 mmol) i sirćetne kiseline (1 mL) u tetrahidrofuranu (8.5 mL) na 0°C u atmosferi azota, i dobijena mešavina se zatim meša 5 minuta. Temperatura reakcionog rastvora se povisi na sobnu temperaturu, i rastvor se zatim meša 30 minuta. Posle toga, reakcioni rastvor se koncentruje pod sniženim pritiskom, i 3 mol/L hlorovodonične kiseline (12 mL) se zatim doda u koncentrat. Vodena faza se ispere heksanom, i zatim mu se doda 5 mol/L natrijum hidroksid (7 mL), što je praćeno ekstrahovanjem mešavine etil acetatom tri puta. Organski slojevi se kombinuju, i kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i zatim koncentruje pod sniženim pritiskom. Etil acetat se doda rezidui, i dobijena mešavina se zatim filtrira kroz NH silika-gel. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije ciljano jedinjenje (1.83 g, 9.57 mmol, prinos: 88%) u vidu braon čvrste supstance.<1>H-NMR(CDCl3) δ: 3.15 (1H, s), 3.65 (2H, s), 3.72 (3H, s), 7.43-7.49 (1H, m), 7.60-7.66(1 H, m), 8.47-8.52 (1H, m). MS m/z: 176 (M+H)+.

<8-4> Metil [6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridil-3-il]acetat

[0126] Anilin (0.110 mL, 1.207 mmol) se doda u suspenziju metil (6-etinilpiridin-3-il)acetata (103 mg, 0.539 mmol), 2-amino-4,5-dimetoksibenzaldehida (130 mg, 0.715 mmol) i srebro trifluorometansulfonata (29.4 mg, 0.114 mmol) u dihloroetanu (1 mL), i dobijena mešavina se zatim meša u atmosferi azota na 80°C 2 sata. Reakcioni rastvor se ohladi na sobnu temperaturu, i zatim prečisti hromatografijom na koloni od silika-gela (etil acetat). Hloroform se doda da se dobije grubo prečišćeni proizvod, i nerastvorljive supstance se zatim uklone filtracijom. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije ciljno jedinjenje (135 mg, 0.398 mmol, prinos: 74%) u vidu zelene čvrste supstance.<1>H-NMR(CDCl3) δ: 3.72 (2H, s), 3.75 (3H, s), 4.04 (3H, s), 4.07 (3H, s), 7.16 (1H, s), 7.47 (1H, s), 7.75-7.82 (1H, m), 7.82-7.89 (1H, m), 8.59-8.68 (2H, m), 9.29-9.35 (1H, m). MS m/z: 339 (M+H)+ .

[0127] Fizički podaci za jedinjenja opisana u Primerima 1 do 7 i strukture odgovarajućih slobodnih formi jedinjenja biće pokazani u nastavku.

[Tabela 1]

<Referentni primer 1>

[0128]

<Korak 1 > Etil [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]acetat

[0129] U rastvor 3-bromo-6,7-dimetoksi-hinolina (2.0 g, 7.5 mmol), pinakol estra 4-(etoksikarbonilmetil)-fenilboronske kiseline (2.6 g, 9.0 mmol) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]-paladijum(II) dihlorid dihlorometanskog adukta (0.61 g, 0.75 mmol) u 1,4-dioksanu (36 mL) doda se rastvor natrijum karbonata (2.4 g, 22 mmol) u vodi (4.0 mL) i reakciona mešavina se meša na 100°C 3 h. Reakciona mešavina se raspodeli između vode (0.15 L) i dihlorometana (2 x 0.15 L). Kombinovani organski sloj se ispere vodom (80 ml), što je praćeno zasićenim rastvorom soli (30 ml). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i evaporiše do suvog. Prečišćavanje "flash" hromatografijom na koloni (dihlorometan/metanol) daje etil 2-[4-(6,7-dimetoksi-3-hinolil)fenil]acetat (2.5 g, 7.0 mmol, prinos 94%) u vidu svetlobraon čvrste supstance.

1H-NMR (CDCl3) δ: 1.29 (3H, t, J = 7.2 Hz), 3.69 (2H, s), 4.04 (3H, s), 4.06 (3H, s), 4.19 (2H, q, J = 7.2 Hz), 7.11 (1H, s), 7.43-7.44 (3H, m), 7.66 (2H, d, J = 7.8 Hz), 8.15 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.97 (1H, d, J = 2.0 Hz). MS m/z: 352 (M+H)+ .

<Korak 2> [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]sirćetna kiselina

[0130] [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]sirćetna kiselina se pripremi u vidu žute čvrste supstance korišćenjem procedure analogne onoj koja je opisana u <Primeru 1-3>, korišćenjem etil [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-fenil]acetata umesto metil [6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]acetata upotrebljenog u <Primeru 1-3>.

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 3.65 (2H, s), 3.93 (3H, s), 3.95 (3H, s), 7.41-7.42 (4H, m), 7.77 (2H, d, J = 8.3 Hz), 8.44 (1H, d, J = 2.0 Hz), 9.01 (1H, d, J = 2.0 Hz), 12.38 (1H, s). MS m/z: 324 (M+H)+ .

<Korak 3> 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il-acetamid

[0131] 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]-acetamid dobija se u vidu žute čvrste supstance korišćenjem procedure analogne onoj koja je opisana u <Primeru 3>, korišćenjem [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]sirćetne kiseline umesto [6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-piridin-3-il]sirćetne kiseline upotrebljene u <Primeru 3>.

1H-NMR (CDCl3) δ: 1.54 (6H, s), 3.86 (2H, s), 4.05 (3H, s), 4.07 (3H, s), 6.49 (1H, s), 7.12 (1H, s), 7.44-7.46 (3H, m), 7.72-7.74 (2H, m), 8.11 (1H, s), 8.17 (1H, d, J = 2.4 Hz), 8.95 (1H, d, J = 2.4 Hz). MS m/z: 500 (M+H)+ .

<Korak 4> 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]-acetamid mezilat

[0132] 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]-acetamid mezilat se priprema korišćenjem procedure analogne onoj koja je opisana u <Primeru 4>, korišćenjem 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]-N-[3-(1,1,1trifluoro-2-metilpropan-2-il) 1,2-oksazol-5-il]acetamida umesto 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]acetamida upotrebljenog u <Primeru 4>

1H-NMR (CDCl3) δ: 1.49 (6H, s), 3.05 (3H, s), 3.88 (2H, s), 4.11 (3H, s), 4.16 (3H, s), 6.41 (1H, s), 7.35 (1H, s), 7.49 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.55 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.90 (1H, s), 8.71 (1H, s), 8.92 (1H, s), 9.78 (1H, s). MS m/z: 500 (M+H-96)+ .

<Referentni primer 2>

[0133]

<Korak 1> tert-butil 5-({[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]acetil}amino)-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilat

[0134] tert-butil 5-({[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]acetil}amino)-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilat dobija se u vidu bezbojne čvrste supstance korišćenjem procedure analogne onoj koja je opisana u <Primeru 5-2>, korišćenjem [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]sirćetne kiseline umesto [6-(6,7-dimetoksi- hinolin-3-il)piridin-3-il]sirćetne kiseline upotrebljene u <Primeru 5-2>.

1H-NMR (CDCl3) δ: 1.51 (6H, s), 1.59 (9H, s), 3.83 (2H, s), 4.05 (3H, s), 4.07 (3H, s), 6.92 (1H, s), 7.11 (1H, s), 7.46-7.49 (3H, m), 7.70-7.72 (2H, m), 8.16 (1H, d, J = 1.8 Hz), 8.97 (1H, d, J = 2.4 Hz), 10.23 (1H, s). MS m/z: 599 (M+H)+ .

<Korak 2> 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]-acetamid

[0135] 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]-acetamid priprema se u vidu bezbojne čvrste supstance korišćenjem procedure analogne onoj koja je opisana u <Primeru 5-3>, korišćenjem tert-butil 5-({[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)fenil]acetil}amino)-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilata umesto tert-butil 5-({[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]acetil}amino)-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-1-karboksilata upotrebljenog u <Primeru 5-3>.

4

1H-NMR (CDCl3) δ: 1.53 (6H, s), 3.81 (2H, s), 4.05 (3H, s), 4.06 (3H, s), 6.47 (1H, br s), 7.12 (1H, s), 7.25-7.29 (1H, m), 7.43-7.46 (3H, m), 7.69 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.93 (1H, s), 8.15 (1H, s), 8.94 (1H, s). MS m/z: 499 (M+H)+ .

<Referentni primer 3>

[0136]

<Korak 1 > Metil (4-bromo-2-fluorofenil)acetat

[0137] U mešani rastvor 4-bromo-2-fluorofenilsirćetne kiseline (2.5 g, 11 mmol) i kalijum karbonata (4.5 g, 32 mmol) u N,N-dimetilformamidu (30 mL) doda se jodometan (0.80 mL, 13 mmol) na 0°C i reakciona mešavina se ostavi da se meša na sobnoj temperaturi 1 h. Reakciona mešavina se ostavi preko noći. Mešanje na sobnoj temperaturi se ponovi još 1 h. Reakciona mešavina se raspodeli između zasićenog vodenog rastvora NaHCO3(150 mL) i etil acetata (2 x 100 mL). Kombinovani etil acetatni sloj ispere se vodom (60 ml), zatim zasićenim rastvorom soli (30 ml). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i evaporiše do suvog da se dobije metil (4-bromo-2-fluorofenil)acetat (2.5 g, 10 mmol, 96% prinos) u vidu bezbojne tečnosti.

1H-NMR (CDCl3) δ: 3.63 (2H, s), 3.71 (3H, s), 7.14-7.15 (1H, m), 7.24-7.25 (1H, m), 7.27-7.27 (1H, m).

<Korak 2> Metil [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-2-fluorofenil]acetat

[0138] Rastvor metil 2-(4-bromo-2-fluoro-fenil)acetata (0.58 g, 2.3 mmol), bis(pinakolato)diborona (0.65 g, 2.6 mmol), [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]paladijum(II) dihlorid dihlorometanskog adukta (0.19 g, 0.23 mmol) i kalijum acetata (0.69 g, 7.0 mmol) u 1,4-dioksanu (8.0 mL) greje se na 100°C 1h. U ovako dobijenu mešavinu dodaju se 3-bromo-6,7-dimetoksi-hinolin (0.50 g., 1.9 mmol) i natrijum karbonat (0.74 g, 7.0 mmol) rastvoreni u vodi (2.0 mL) i mešanje na 100°C nastavlja se 3 h. Reakciona mešavina se raspodeli između vode (70 mL) i dihlorometana (2 x 70 mL). Kombinovani organski sloj se ispere vodom (40 mL), zatim zasićenim rastvorom soli (20 mL). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i evaporiše do suvog. Prečišćavanje "fleš" hromatografijom na koloni (dihlorometan/metanol) daje I metil 2-[4-(6,7-dimetoksi-3-hinolil)-2-fluorofenil] acetat (0.64 g, 1.8 mmol) u vidu svetlobraon čvrste supstance.

1H-NMR (CDCl3) δ: 3.74-3.76 (5H, m), 4.05 (3H, s), 4.06 (3H, s), 7.11 (1H, s), 7.40-7.44 (4H, m), 8.14 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.95 (1H, d, J = 2.0 Hz). MS m/z: 356 (M+H)+ .

<Korak 3> [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-2-fluorofenil]sirćetna kiselina

[0139] [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-2-fluorofenil]sirćetna kiselina dobija se u vidu žute čvrste supstance korišćenjem procedure analogne onoj koja je opisana u <Primeru 1-3>, korišćenjem metil [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-2-fluorofenil]acetata umesto metil [6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]acetata upotrebljenog u <Primeru 1-3>.

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 3.70 (2H, s), 3.93 (3H, s), 3.96 (3H, s), 7.40-7.41 (2H, m), 7.49 (1H, t, J = 8.1 Hz), 7.64-7.65 (1H, m), 7.68-7.70 (1H, m), 8.51 (1H, s), 9.04 (1H, d, J = 2.0 Hz), 12.52 (1H, s). MS m/z: 342 (M+H)+ .

<Korak 4> 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-2-fluorofenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]acetamid

[0140] 2-[4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-2-fluorofenil]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]acetamid priprema se u vidu žute čvrste supstance korišćenjem procedure analogne onoj koja je opisana u <Primeru 3>, korišćenjem [4-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)-2-fluorofenil]sirćetne kiseline umesto [6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]sirćetne kiseline upotrebljene u <Primeru 3>.

1H-NMR (CDCl3) δ: 1.54 (6H, s), 3.87 (2H, s), 4.05 (3H, s), 4.07 (3H, s), 6.49 (1H, s), 7.12 (1H, s), 7.46-7.47 (3H, m), 7.51-7.52 (1H, m), 8.15 (1H, d, J = 2.4 Hz), 8.34 (1H, s), 8.93 (1H, d, J = 2.4 Hz). MS m/z: 518 (M+H)+ .

<Testni primeri>

<Testni primer 1> Evaluacija aktivnosti inhibiranja RET kinaze (nećelijski sistem)

[0141] Reakcioni pufer (100 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM MgCl2, 0.003% Brij-35, 0.004% Tween-20, i 1mM DTT) pomeša se sa RET rekombinantnim proteinom (RET - divlji tip; Invitrogen #PV3819, finalna koncentracija: 80 pg/ul, ili RET - "Gatekeeper" mutacija (V804L); Invitrogen #PV4397, finalna koncentracija: 80 pg/ul) za pripremanje rastvora RET kinaze. Testno jedinjenje se pripremi tako da ima finalnu koncentraciju od 4000 nm, sa DMSO, a pored toga, pripremaju se uzorci testnog jedinjenja u 12 različitih koncentracija uz povećanje razblaženja od √10. U svaku liniju A do P na ploči sa 384 bunarčića doda se 19 uL rastvora RET kinaze, i posle toga se testno jedinjenje u svakoj od koncentracija dodaje u linije C do N, i zatim se 1 uL dimetil sulfoksida (u daljem tekstu označen kao DMSO) dodaje u svaku od linija A, B, O i P. Posle toga, dobijene mešavine se preinkubiraju na sobnoj temperaturi 20 minuta. Pored toga, naprave se supstratni rastvor A koji sadrži ATP (finalna koncentracija: 1mM) i supstratni rastvor B koji ne sadrži ATP, oba sa reakcionim puferom i FL-Peptide 22 (PerkinElmer, #760366, finalna kconcentracija: 1.5 uM). Supstratni rastvor A doda se, u količini od 5 uL, linijama B do O, dok se supstratni rastvor B dodaje, u količini od 5 uL, linijama A i P. Dobijene mešavine se inkubiraju na 28°C 45 minuta. Rastvor za prekidanje reakcije (100 mM HEPES (pH 7.4), 0.015% Briji-35, 40 mM EDTA, i 0.1% reagens za oblaganje 3) dodaju se u reakcionu mešavinu u količini od 40 ul, tako da se reakcija okonča.

[0142] Korišćenjem EZ Reader II (Perkin Elmer), supstratni peptid se odvaja od fosforilisanog peptida u reakcionom rastvoru, i odnos proizvoda (P / (P S)) izračunat na osnovu pika (S) supstratnog peptida i pika (P) fosforilisanog peptida koristi se za evaluaciju. Inhibicija koja se postiže svakom od koncentracija testnog jedinjenja dobija se sledećom formulom (automatsko izračunavanje korišćenjem softvera EZ Reader II sistema).

Ci: Stopa konverzije reakcije testnog jedinjenja sa supstratnim rastvorom A - stopa konverzije reakcije DMSO sa supstratnim rastvorom B

Co: Stopa konverzije reakcije DMSO sa supstratnim rastvorom A - stopa konverzije reakcije DMSO sa supstratnim rastvorom B

[0143] Na osnovu stopa inhibicije 12 različitih koncentracija testnog jedinjenja prema formuli (a), konstruiše se 4-parametarska logistička regresiona kriva. Zatim, 4-parametarska logistička regresiona jednačina izražava se na sledeći način.

Vrh: Asimptota nagore

Nagib: Parametar nagiba

4

IC50: Vrednost X (Vrh Dno) / 2

Dno: Asimptota nadole

X: Koncentracija testnog jedinjenja

[0144] Prvo, svaka inicijalna vrednost unese se u Vrh, Nagib, IC50, Dno (Vrh = 100, Nagib = -1, IC50 = pribl. IC50, i Dno = 0), tako da se nacrta regresiona kriva. Potom, postupak najmanjih kvadrata se izvodi na zbiru kvadrata razlike između izmerene vrednosti i procenjene vrednosti dobijene iz formule (b) da bi se izračunao koeficijent 4-parametarske logističke regresione jednačine, tako da se izračuna IC50.

[Tabela 2]

<Testni primer 2> Evaluacija aktivnosti inhibiranja KDR kinaze (ćelijski sistem)

[0145] HUVEC ćelije zaseju se na ploče pri gustini ćelija od 1500 ćelija po bunarčiću, i zatim kultivišu preko noći. Testno jedinjenje (10 uM, 2.5 uM, 625 nM, 156 nM, 50 nM, 10 nM, 2.5 nM, ili 0.6 nM) doda se u svaki bunarčić, što je praćeno kultivisanjem dobijene mešavine tokom 2 sata. Posle toga, VEGF165 (Peprotech, #100-20) doda se u kulturu u finalnoj koncentraciji od 50 ng/ml, i dobijena mešavina zatim reaguje na 37°C, 5 minuta. Posle toga, rezultujuće ćelije se liziraju korišćenjem 50 ul pufera za lizu sadržanog u AlphaLISA SureFire Ultra (Perkin Elmer, #ALSU-PVGFRA500), i zatim se dodaju akceptorske perlice i donorske perlice do 10 ul ćelijskog lizata prema uputstvu za rukovanje koje se nalazi u gore pomenutom kitu. Tako dobijena mešavina reaguje na sobnoj temperaturi preko noći, i posle toga, meri se stopa aktivnosti inhibiranja KDR kinaze korišćenjem Envision (Perkin Elmer).

[0146] Vrednost za bunarčić u koji je dodat samo pufer za lizu oduzima se kao pozadinski signal od svake vrednosti. Posle toga, vrednost za bunarčić u koji je dodat VEGFR, a testno jedinjenje nije bilo dodato, definiše se kao KDR kinazna aktivnost od 100%, i dobijena vrednost se koriguje. Korišćenjem funkcije "rast" ("Growth") u Microsoft Excel 2010, procenjena je vrednost 50% inhibicije svakog testnog jedinjenja i upotrebljena je kao vrednost IC50.

[Tabela 3]

<Testni primer 3> Evaluacija inhibitorne aktivnosti RET kinaze (ćelijski sistem)

[0147] Ba/F3 ćelije u kojima je Myc-obeleženi RET gen ili RET (V804L) mutantni gen prekomerno eksprimiran, zaseju se na ploču pri gustini ćelija od 500,000 ćelija po bunarčiću, i zatim se u svaki bunarčić doda testno jedinjenje (10 uM, 2.5 uM, 625 nM, 156 nM, 50 nM, 10 nM, 2.5 nM, ili 0.6 nM), posle čega se dobijena mešavina kultiviše 2 sata. Posle toga, 1 mL pufera za lizu ćelija (Cell signaling technology, #9803), jedna tableta inhibitora fosfataze (Roche, #04906837001), i jedna tableta inhibitora proteaze (Roche, #0469312400) dodaju se u 9 mL MilliQ, i 20 ul dobijene mešavine se zatim doda u svaki bunarčić. Tako dobijena mešavina se stavi na led 20 minuta, da se ćelije liziraju. Alikvoti od 5 ul uzmu se iz ćelijskog lizata, i zatim, 64 nl Myc antitela (Cell signaling technology, #3946) i Streptavidin donorske perlice u jednakoj količini od 102 nl P-Tyr-100 akceptorskih perlica sadržanih u Alpha Screen Phosphotyrosine (P-Tyr-100) testnom kitu (Perkin Elmer, #6760620C) dodaju se u alikvot u skladu sa uputstvom za upotrebu sadržanim u gore pomenutom testnom kitu. Dobijena mešavina reaguje na sobnoj temperaturi preko noći, i stopa aktivnosti inhibiranja RET kinaze meri se korišćenjem Envision.

[0148] Od svih vrednosti oduzima se vrednost za bunarčić u koji je dodat samo pufer za lizu, kao vrednost pozadinskog signala, i zatim se koriguje dobijena vrednost, pri čemu se vrednost za bunarčić u koji testno jedinjenje nije bilo dodato definiše kao aktivnost RET kinaze od 100%. Uz korišćenje funkcije "rast" u Microsoft Excel 2010, procenjuje se vrednost 50% inhibicije za svako testno jedinjenje i upotrebljava kao vrednost IC50.

[Tabela 4]

<Testni primer 4> Merenje aktivnosti inhibicije rasta ćelija uz korišćenje ćelijske linije LC-2/ad nesitnoćelijskog kancera pluća

4

[0149] Merena je inhibitorna aktivnost testnog jedinjenja na rast ćelija ćelijske linije LC-2/ad nesitnoćelijskog kancera pluća koje imaju CCDC6-RET fuzioni gen (RIKEN, J Thorac Oncol. 2012 Dec, 7(12), 1872-6).

[0150] LC-2/ad ćelije zaseju se na ploču sa 96 bunarčića pri gustini od 5,000 ćelija po bunarčiću, i zatim kultivišu na 37°C u prisustvu 5% CO2preko noći u medijumu pripremljenom mešanjem RPMI-1640 koji sadrži 15% FBS i 25mM HEPES sa Hamovom F12 mešavinom, pomešanim u odnosu 1 : 1. Posle toga, testno jedinjenje se razblaži, i zatim doda ploči sa 96 bunarčića. Kao negativna kontrola, doda se dimetil sulfoksid (u nastavku teksta označen kao DMSO). Dobijena mešavina se kultiviše na 37°C u prisustvu 5% CO2, 9 dana, i posle toga, kulturi se doda reagens za brojanje ćelija CellTiter-Glo(R) testa luminescencije za određivanje broja vijabilnih ćelija (Promega, #G7571), što je praćeno mešanjem mešavine. Posle toga, uz korišćenje uređaja za merenje luminescencije Envision, meri se intenzitet luminescencije. Vrednost merenja za bunarčić u koji je dodat samo medijum definiše se kao stopa preživljavanja od 0%, a vrednost merenja za bunarčić u koji je dodat DMSO definiše se kao stopa preživljavanja od 100%. Izračunava se stopa preživljavanja LC-2/ad ćelija u prisustvu svake koncentracije testnog jedinjenja. Uz korišćenje funkcije "rast" u Microsoft Excel 2010, procenjuje se vrednost 50% inhibicije za svako testno jedinjenje i koristi kao vrednost IC50.

[Table 5]

<Testni primer 5> Merenje aktivnosti inhibiranja rasta ćelija uz korišćenje ćelijske linije TT kancera štitne žlezde

[0151] Merena je inhibitorna aktivnosti testnog jedinjenja na rast ćelija ćelijske linije TT kancera štitne žlezde koje imaju RET aktivacionu mutaciju (C634W) (Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995 Feb 27 (207), 1022-1028).

[0152] TT ćelije se zaseju na ploču sa 96 bunarčića pri gustini od 5,000 ćelija po bunarčiću, i zatim kultivišu na 37°C u prisustvu 5% CO2preko noći u medijumu sa F-12K hranljivom

4

mešavinom koji sadrži 10% FBS. Posle toga, jedinjenje se razblaži i doda na ploču sa 96 bunarčića. Kao negativna kontrola, doda se dimetil sulfoksid (u nastavku teksta označen kao DMSO). Dobijena mešavina se kultiviše na 37°C u prisustvu 5% CO2, 9 dana, i posle toga, kulturi se doda reagens za brojanje ćelija CellTiter-Glo(R) testa luminescencije za određivanje broja vijabilnih ćelija, što je praćeno mešanjem mešavine. Posle toga, uz korišćenje uređaja za merenje luminescencije Envision (Perkin Elmer), meri se intenzitet luminescencije. Vrednost merenja za bunarčić u koji je dodat samo medijum definiše se kao stopa preživljavanja od 0%, a vrednost merenja za bunarčić u koji je dodat DMSO definiše se kao stopa preživljavanja od 100%. Izračunava se stopa preživljavanja TT ćelija u prisustvu svake od koncentracija testnog jedinjenja. Uz korišćenje funkcije "rast" u Microsoft Excel 2010, procenjuje se vrednost 50% inhibicije za svako testno jedinjenje i upotrebljava kao vrednost IC50.

[Tabela 6]

<Testni primer 6> Evaluacija antitumorske aktivnosti korišćenjem ksenograftskog modela uspostavljenog sa ćelijskom linijom LC-2/ad nesitnoćelijskog kancera pluća

[0153] Ćelije ćelijske linije nesitnoćelijskog kancera pluća LC-2/ad (RIKEN, J Thorac Oncol.

2012 Dec, 7(12), 1872-6) suspendovane u DPBS (Gibco, #14190) pomešaju se sa jednakom količinom Corning Matrigel matriksa bazalne membrane (Corning, #354234), i dobijena mešavina se zatim supkutano transplantira u NOG miševe da se formira tumor. (Posle dobavljanja od In Vivo Science Inc., NOG miševi su bili aklimatizovani i zatim su ćelije transplantirane u miševe kada su bili stari 9 nedelja. Kao hrana, korišćen je FR-2 (proizvođač: Funabashi Farm Co., Ltd.).) Kada je tumor dostigao veličinu od 100 do 200 mm<3>, miševi su nasumično raspoređeni u odnosu na dijametar tumora i počelo se sa oralnom primenom jedinjenja iz Primera 4 (ovde kasnije označeno kao Jedinjenje A). Kao rastvarač za rastvaranje Jedinjenja A, korišćena je 1% hidroksipropil metil celuloza. Oralna primena Jedinjenja A u dozi od 3 mg/kg ili 1 mg/kg po telesnoj težini miša, tri puta na dan, nastavlja se tokom 9 dana [pri čemu je grupa kojoj je 3 mg/kg Jedinjenja A davano tri puta na dan

4

označena kao grupa primene a (■), grupa kojoj je 1 mg/kg Jedinjenja A davan tri puta na dan označena kao grupa primene b (▲) i grupa kojoj je davan samo prenosnik označena je kao grupa Prenosnik (♦)]. Kao rezultat, zapažena je dozno-zavisna regresija tumora (Slika 1). Tokom ovog testa, nije zapaženo značajnije smanjenje telesne težine u grupama koje su primale Jedinjenje A u poređenju sa grupom Prenosnik. Pored toga, tumor je izolovan (primena nije vršena u grupi Prenosnik) dva sata i šest sati posle poslednje primene Jedinjenja A, i RET fosforilacija na poziciji tirozin 905 upotrebljena kao pokazatelj RET kinazne aktivnosti (pRET(Y905), Nature Medicine, 18, 375-377 (2012)) detektuje se postupkom Western blota. Kao rezultat, bilo je potvrđeno dozno-zavisno suzbijanje fosforilacije Y905 (Slika 2).

[Uporedni podaci 1]

[0154] RET IC50i KDR IC50vrednosti (ćelijski sistem) jedinjenja pronalaska (Tabela 7) i uporednog jedinjenja (Tabela 8) dati su u nastavku. Iz Tabele 8 vidi se da je uporedno jedinjenje ekvipotentno prema RET i KDR. Nasuprot tome, Tabela 7 pokazuje da su jedinjenja pronalaska selektivna prema RET u odnosu na KDR.

Tabela 7

4

[Uporedni podaci 2] PKPD analiza jedne doze

[0155] Mišje pro-B ćelije, Ba/F3, koje eksprimiraju fuzioni protein ets varijante 6 (ETV)-RET i ETV-RET-V804L konstruisane su od strane Daiichi Sankyo RD Novare Co., Ltd., i kultivisane u RPMI1640 medijumu (Thermo Fisher Scientific K.K.) dopunjenom 10% (zapr./zapr.) toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (fetal bovine serum, FBS, GE Healthcare) i 1.5 μg/mL puromicina u CO2inkubatoru koji je podešen na 37°C u atmosferi sa 5% CO2. Ćelije se suspenduju u DPBS i zatim inokulišu supkutano u miševe pri 1.0 x 107 ćelija po mišu. Kada je tumor dostigao veličinu od 100 do 200 mm<3>, miševi su nasumično raspoređeni u odnosu na dijametar tumora, i testno jedinjenje (10 mg/kg, Jedinjenje 229 ili Primer 3) rastvoreno u 1% (tež./zapr.) rastvoru hidroksipropil metilceluloze primeni se oralno. Kontrolnoj grupi davan je 1% (tež./zapr.) rastvor hidroksipropil metilceluloze. Šest sati posle primene, tumori se izoluju i odmah zamrznu u tečnom azotu. Zamrznuti uzorci se homogenizuju korišćenjem homogenizera sa kuglicama (Biomedical Science Co., Ltd., i Yasui Kikai Corporation) sa litičkim puferom (Cell Signaling Technology, Inc.) i koktelom inhibitora proteaze i fosfataze (Roche Diagnostics GmbH). Koncentracija proteina tumorskog lizata kvantifikuje se kolorimetrijskim reagensom (Thermo Fisher Scientific K.K.) i svi se razblaže litičkim puferom do iste koncentracije. Tumorski lizat se doda u uzorački pufer sa redukujućim reagensom (Thermo Fisher Scientific K.K.) i denaturiše toplotom (70°C, 10 minuta). 30 μg, 15 μg i 15 μg proteina koristi se za detektovanje ekspresije fosfo-RET, RET i aktina, respektivno. Protein se razdvoji na 5% do 20% tris HCl gelovima (DRC Co., Ltd.) i prenese na nitrocelulozne membrane (Thermo

4

Fisher Scientific K.K.). Membrane se blotuju korišćenjem primarnog anti-RET zečjeg monoklonskog antitela (razblaženje 1:1000, kat. br. 14698, Cell Signaling Technology, Inc.), antifosfo RET (Y905) zečjeg poliklonskog antitela (razblaženje 1:250, kat. br. 3221, Cell Signaling Technology, Inc.), i antiaktinskog zečjeg poliklonskog antitela (razblaženje 1:4000, kat. br. sc-1616R, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), praćeno antizečjim IgG antitelom koze konjugovanim sa HRP, kao sekundarnim antitelom (1:2000 razblaženje, kat. br. 7074, Cell Signaling Technology, Inc.). Reakcija hemiluminescencije HRP i supstrata (Pierce ECL Plus Western Blotting supstrat, kat. br. 32132, Thermo Fisher Scientific K.K.) detektuje se skenerom slike Typhoon 9400 (GE Healthcare). Intenziteti signala za fosforilisani RET (pRET) i RET kvantifikovani su i izračunati sledećim postupcima.

Odnos fosforilacije RET: (Intenzitet signala pRET) / (Intenzitet signala RET)

Relativna fosforilacija RET (%): [(prosečna stopa fosforilacije RET u uzorcima tretiranim jedinjenjem) / (prosečna stopa fosforilacije RET u uzorcima tretiranim prenosnikom)] × 100

Tabela 9

[0156] Jedinjenje 229 nije suprimiralo fosforilisani RET (pRET) u Ba/F3-RET-V804M tumorima zbog slabe izloženosti u tumorima (podaci dostupni), iako je Jed. 229 pokazalo snažan inhibitorni efekat in vitro. Slaba izloženost mogla bi biti glavni razlog slabe potencije in vivo Jedinjenja 229. Sa druge strane, jedinjenje iz Primera 3 jasno je inhibiralo pRET u Ba/F3-RET tumorima.

<Primeri formulacije >

<Primer formulacije 1> Sredstvo za kapsule

[0157]

[0158] Prašak koji ima gornju recepturu pomeša se i zatim propusti kroz sito sa 60 okaca. Posle toga, ovaj prašak se stavi u 250 mg-ske želatinske kapsule da se pripremi sredstvo za kapsule.

< Primer formulacije 2> Sredstvo za tablete

[0159]

[0160] Prašak koji ima gornju recepturu pomeša se, i posle toga, mešavina se granuliše korišćenjem paste kukuruznog skroba i zatim suši. Korišćenjem mašine za pravljenje tableta, od reakcione mešavine se naprave tablete (jedna tableta: 200 mg). Ove tablete po potrebi mogu da se oblože šećerom.

Industrijska primena

1

[0161] Novo piridinsko jedinjenje predstavljeno gore opisanom opštom formulom (I) predmetnog pronalaska, ili njegova so, ili solvat istog, ima odlično dejstvo inhibiranja RET kinaze i korisno je kao lek.

2

Claims (15)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (I):

   pri čemu A predstavlja jednog odabranog od sledećih formula (Ia) do (Id):

   pri čemu R<1>predstavlja atom vodonika ili C1-C3alkil grupu, i R2 predstavlja atom vodonika ili C1-C3alkil grupu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što se bira između jedinjenja predstavljenih sledećim strukturnim formulama:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[5-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-3-il]acetamid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1,2-oksazol-5-il]acetamid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. 6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je 2-[6-(6,7-dimetoksihinolin-3-il)piridin-3-il]-N-[1-metil-3-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)-1H-pirazol-5-il]acetamid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva 2 do 6 u vidu farmaceutski prihvatljive soli.
8. 8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što je farmaceutski prihvatljiva so metansulfonat.
9. 9. Inhibitor RET kinaze, naznačen time što uključuje, kao aktivni sastojak, jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
10. 10. Upotreba jedinjenja prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju farmaceutske kompozicije. 4
11. 11. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što sadrži jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 8 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata.
12. 12. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u terapiji.
13. 13. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera.
14. 14. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 13 naznačeno time što se kancer bira između kancera pluća, kancera štitne žlezde, kancera dojke i kancera kolona.
15. 15. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time što je kancer nesitnoćelijski kancer pluća .