RS60388B1 - Antitela usmerena na beta-amiloid - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovo otkriće odnosi se na antitela koja se vezuju za humani beta-amiloidni peptid 1-42 i njegove N-terminalno skraćene oblike, zajednički označene kao Aβn-42 peptidi, gde n iznosi 1 do 29. Odnosi se na antitela koja se selektivno vezuju za beta-amiloidni peptid n-42 u odnosu na beta-amiloidni peptid 1-40. Predmetno otkriće takođe se odnosi na upotrebu anti-Aβn-42 antitela u lečenju stanja povezanih sa amiloidozom, uključujući Alchajmerovu bolest.

Osnova pronalaska

[0002] Alchajmerova bolest (AD) odlikuje se pogoršanjem kognitivnog oštećenja koje utiče na pamćenje, koje slabi pacijentovo socijalno i profesionalno funkcionisanje. Degenerativna bolest izaziva gubitak nervnih ćelija u mozgu, što dovodi do kognitivnih teškoća povezanih sa govorom i višim funkcijama, kao što su sposobnost rasuđivanja, planiranja, organizovanja i razmišljanja, što na kraju može dovesti do promena ličnosti. Završne stadijume bolesti karakteriše potpuni gubitak sposobnosti za samostalno funkcionisanje.

[0003] Histološki, AD (sporadična i familijarna) se definiše prisustvom intracelularnih neurofibrilarnih klupka (NFT's) i ekstracelularnih plakova. Plakovi su agregati β-amiloidnog peptida (Aβ) koji potiče od nepravilnog cepanja amiloidnog prekursorskog proteina (APP), transmembranskog proteina nađenog u neuronima i astrocitima u mozgu. Naslage Aβ nađene su i u krvnim sudovima pacijenata sa AD.

[0004] Holinergički neuroni su posebno ranjivi kod AD, a posledični pad neurotransmitera utiče na druge sisteme neurotransmitera. Ostali simptomi bolesti uključuju oksidativni stres, zapaljenje i apoptozu neurona (programiranu ćelijsku smrt). Kod pacijenta sa AD, intenzivno umiranje neuronskih ćelija dovodi do kognitivnog pada i, na kraju, smrti pacijenta. (Younkin, 1995; Borchelt et al., 1996; Selkoe, 1999).

[0005] Lečenje je, za sada, samo simptomatsko i javlja se kao minimalno efikasno sa malim poboljšanjima simptoma tokom ograničenog vremena trajanja. Međutim, smatra se da su prekomerna proizvodnja ili promene nivoa Aβ ključni događaji u patogenezi sporadične i rane AD. Iz tog razloga, Aβ je postao glavni cilj za razvoj lekova koji su dizajnirani da smanje njegovo stvaranje (Vassar et al., 1999), ili da aktiviraju mehanizme koji ubrzavaju njegov klirens iz mozga.

[0006] Hipoteza amiloidne kaskade predlaže da proizvodnja Aβ peptida negativno utiče na funkciju neurona, dovodeći, na taj način, do smrti neurona i demencije kod AD. Aβ se proizvodi iz amiloidnog prekursorskog proteina (APP) koji se sekvencijalno cepa pomoću sekretaza da bi se dobile vrste različitih dužina. Glavna komponenta plakova je izoforma Aβ1-42 od 42 aminokiseline koja je uključena u formiranje neurotoksičnih oligomera i formiranje plakova u patogenezi AD. Brojne izoforme Aβ uključujući Aβ1-42, pGluAβ3-42, Aβ3-42 i 4-42 preovlađuju u mozgu obolelom od AD, od kojih su Aβ1-42 i Aβ4-42 glavne forme u hipokampusu i korteksu kod familijarne i sporadične AD (Portelius et al., 2010).

[0007] Aβ koji se završava reziduom 42 je minorna komponenta vrste Aβ proizvedena obradom APP. Drugi oblici uključuju Aβ1-40 i N-terminalno skraćene oblike Aβn-40. Međutim, Aβ koji se završava reziduom 42 je najskloniji agregaciji i pokreće taloženje u amiloidne plakove. Pored toga što je skloniji agregaciji, peptid Aβ1-42 formira rastvorljive polimere sa malim brojem n (ili oligomere) za koje se pokazalo da su toksični za neurone u kulturi. Za razliku od velikih vidljivih vlaknastih naslaga, oligomeri se ne detektuju u tipičnim patološkim testovima. Oligomeri koji imaju slična svojstva izolovani su iz mozgova sa AD i oni su bliže povezani sa progresijom bolesti nego plakovi (Younkin, 1998; Walsh et al., 2005a; Walsh et al., 2005b).

[0008] Eksperimentalno generisani oligomeri naneti na isečke mozga ili ubrizgani in vivo izazivaju izostanak dugotrajne potencijacije hipokampusa (LTP) koja predstavlja oblik sinaptičkog skladištenja informacija dobro poznat kao paradigma mehanizama pamćenja (Lambert et al., 1998; Walsh et al., 2002; Wang et al., 2002). Rastvorljivi oligomeri su uključeni u fizičku degeneraciju sinapsi (Mucke et al., 2000). Oporavak gubitka pamćenja pomoću antitela u mišjim modelima potvrdio je nastali koncept da oligomeri imaju glavnu ulogu u zatajenju sinapsi.

[0009] Genetski dokaz sugeriše da se povećane količine Aβ1-42 i njegovih N-terminalno skraćenih oblika (Aβn-42) proizvode kod mnogih, ako ne svih, genetskih stanja koja izazivaju familijarnu AD (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Scheuner et al., 1996; Citron et al., 1998), ukazujući na mogućnost da formiranje amiloida može da bude izazvano povećanim stvaranjem Aβn-42 ili smanjenom razgradnjom, ili putem oba mehanizma (Glabe, 2000). Konkretno, familijarna AD koja izaziva genetske mutacije u genu za APP i/ili u genu koji kodira komponentu kompleksa γ-sekretaze presenilin povećava proizvodnju Aβ1-42 u odnosu na Aβ1-40. Takođe je predloženo da apsolutna količina peptida proizvedenih u mozgu može da bude manje važna nego odnos Aβ peptida (koji se ogleda u izmenjenom odnosu Aβ1-42 prema Aβ1-40) za stvaranje toksičnih vrsta Aβ (De Strooper, 2007; Kuperstein et al., 2010). Pored toga, životinjski modeli taloženja amiloida, mišji i Drosophila, sugerišu da je Aβ1-42 potreban za formiranje amiloidnih naslaga (Greeve et al., 2004; lijima et al., 2004; McGowan et al., 2005).

[0010] Rezultati studije vakcinacije iz 2000. godine sugerišu moguće nove strategije lečenja AD. Transgeni miš PDAPP, koji prekomerno eksprimira mutantni humani APP (u kome je aminokiselina na poziciji 717 fenilalanin umesto normalnog valina), progresivno razvija mnoge od neuropatoloških karakteristika AD na način zavisan od starosti i regiona mozga. Transgene životinje su imunizovane peptidom Aβ1-42 pre pojave neuropatologija tipa AD (sa 6 nedelja starosti) ili u starijem uzrastu (11 meseci), kada su taloženje Aβ i nekoliko sledstvenih neuropatoloških promena već dobro uspostavljene. Imunizacija mladih životinja suštinski je sprečila razvoj formiranja plakova, neuritsku distrofiju i astrogliozu. Lečenje starijih životinja takođe je upadljivo smanjilo stepen i progresiju ovih neuropatologija sličnih AD. Pokazano je da je imunizacija sa Aβ1-42 rezultovala stvaranjem anti-Aβ antitela i da su se Aβ-imunoreaktivni monociti/ćelije mikroglije pojavili u oblasti preostalih plakova (Schenk et al., 1999; Schenk et al., 2000). Međutim, pristup aktivne imunizacije je, kada je primenjen na ljude, rezultovao u nekoliko slučajeva meningoencefalitisa, najverovatnije zbog T-ćelijskog odgovora, i ona je prekinuta, iako su početni rezultati efikasnosti bili obećavajući (Orgogozo et al., 2003; Gilman et al., 2005; Pride et al., 2008).

[0011] Nakon ovoga, ispitivano je nekoliko strategija pasivne imunizacije. Periferna primena antitela protiv Aβ bila je dovoljna da redukuje amiloidno opterećenje (Bard et al., 2000). Uprkos relativno umerenim serumskim nivoima antitela postignutim u ovim eksperimentima, pasivno primenjena antitela mogla su da prođu krvno-moždanu barijeru i uđu u centralni nervni sistem, oboje plakove i indukuju klirens prethodno postojećeg amiloida. Poređenjem između Aβ1-40-specifičnog antitela, Aβ1-42-specifičnog antitela i antitela usmerenog protiv rezidua 1-16 iz Aβ, pokazano je da sva antitela redukuju nakupljanje Aβ u mozgu miša (Levites et al., 2006).

[0012] Nedavno je sugerisano da je prodiranje u CNS najverovatniji put postizanja klirensa Aβ za pasivno primenjena antitela (Golde et al., 2009). Međutim, pored sposobnosti antitela da prođu krvno-moždanu barijeru, kao mogući mehanizam delovanja predložena je hipoteza eliminacije.

[0013] Hipoteza eliminacije tvrdi da Aβ može da se ukloni iz CNS indirektno, snižavanjem koncentracije peptida u plazmi. U eksperimentima koji to opisuju, upotrebljeno je antitelo koje vezuje Aβ u plazmi i time sekvestrira Aβ iz CNS. Ovo se postiže tako što antitelo sprečava prelazak Aβ iz plazme u CNS i/ili menja ravnotežu između plazme i CNS zbog snižavanja koncentracije slobodnog Aβ u plazmi (DeMattos et al., 2001). Pokazano je i da su agensi koji vezuju amiloid koji nisu srodni antitelima efikasni u uklanjanju Aβ iz CNS putem vezivanja u plazmi. Pokazano je da dva agensa koja vezuju Aβ, gelsolin i GM1, koji sekvestriraju Aβ u plazmi redukuju ili sprečavaju amiloidozu mozga (Matsuoka et al., 2003).

[0014] Što se tiče sigurnosti, cerebralna amiloidna angiopatija (CAA) je jedan od znakova patogeneze AD, kod koje postoji zamena vaskularnih glatkih mišićnih ćelija sa Aβ, uglavnom Aβ1-40, u zidovima cerebralnih arterija (Weller et al., 2003). Pokazano je da lečenje pacijenata sa AD pomoću pan-AI3 antitela dovodi do mikro-krvarenja koja odražavaju uklanjanje Aβ iz zida krvnih sudova (Wilcock et al., 2009) što može da bude štetno za pacijente. Jedan od načina da se to prevaziđe bio je generisanje deglikozilisanih antitela koja mogu da redukuju mehanizme klirensa koji doprinose mikro-krvarenjima i/ili da redukuju brzinu kojom se Aβ uklanja iz vaskularnih naslaga, sprečavajući zasićenje puteva efluksa (Wilcock et al., 2006).

[0015] Ciljno delovanje antitelom specifičnim za Aβ42 na n-42β peptidne vrste bilo bi usmereno na vrstu koja predstavlja ključni peptidni kompozit u mozgu sa AD i pokretač formiranja plakova. Antitelo sa primarnom specifičnošću za monomerne i oligomerne vrste n-42 sa malim brojem n ne bi smanjilo samo brojnost ovih vrsta, već bi takođe moglo da spreči stvaranje drugih oligomernih vrsta za koje se pokazalo da su toksične za neurone.

[0016] WO 03/015691 opisuje postupak za postizanje brzog poboljšanja kognicije kod subjekata koji pate od stanja ili bolesti povezanih sa Aβ peptidom, uključujući Alchajmerovu bolest, Daunov sindrom, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, blago kognitivno oštećenje, i slično. Postupak obuhvata davanje subjektu anti-Aβ antitela, posebno antitela koja imaju visok afinitet za rastvorljive oblike Aβ. X-15240.

[0017] WO 09/85200 opisuje kompozicije za lečenje neurodegenerativnih ili amiloidogenih poremećaja kao što je Alchajmerova bolest. Konkretnije, opisana su i antitela protiv betaamiloida, kompozicije koje sadrže takva antitela, odgovarajuće nukleinske kiseline, vektori i ćelije-domaćini, i postupci za pravljenje takvih antitela.

Rezime pronalaska

[0018] Pronalazak je opisan priloženim patentnim zahtevima. Obezbeđen je molekul antitela protiv humanog Aβ1-42 kao što je opisano u patentnom zahtevu 1. Obezbeđena je i kompozicija za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti kao što je opisano u patentnom zahtevu 5. Kompozicija za upotrebu u poboljšanju kognicije ili smanjenju kognitivnog pada kod pacijenta sa Alchajmerovom bolešću ili Daunovim sindromom takođe je opisano u patentnom zahtevu 6. Ostala svojstva koja predstavljaju prednost prikazana su u preostalim zavisnim patentnim zahtevima.

[0019] Predmetno otkriće odnosi se na potpuno humana antitela koja su specifična za Aβ1-42 i njegove N-terminalno skraćene oblike i vezuju se za epitop između aminokiselina 29-42 peptida Aβ42. Antitela prema predmetnom otkriću mogu da se koriste za preventivno i/ili terapijsko lečenje stanja povezanih sa beta-amiloidom kao što je AD, uključujući blago kognitivno oštećenje (MCI) zbog AD i Daunov sindrom.

[0020] Predmetno otkriće odnosi se na upotrebu potpuno humanog antitela u suzbijanju izoformi Aβ peptida (n-42) u plazmi, mozgu i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) za sprečavanje nakupljanja ili reverziju nakupljanja Aβ n-42 izoformi unutar mozga i cerebralne vaskulature i za poboljšanje kognicije.

[0021] U ovom dokumentu opisana je proizvodnja potpuno humanih antitela protiv peptida Aβ n-42, koja prepoznaju monomerne i oligomerne oblike sa malim brojem n (do, i uključujući, pentamer) Aβ n-42 i epitopski su mapirana u regionu koji obuhvata aminokiseline 17-42 u Aβ42 peptidu, specifičnije u regionu koji obuhvata aminokiseline 29 do 42 u Aβ42 peptidu.

[0022] Antitela u skladu sa predmetnim otkrićem su specifična za Aβ n-42 vrste (u kojima je n ceo broj u opsegu od 1 do 29) i prema tome se može očekivati da selektivno redukuju ključni pokretač progresije AD. Antitela u skladu sa predmetnim otkrićem efikasno vezuju Aβ42 (ne i Aβ40) u humanoj plazmi, mozgu i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) što vodi povećanom klirensu Aβ n-42 izoformi iz mozga. Antitela u skladu sa predmetnim otkrićem takođe efikasno redukuju vezivanje rastvorljivih agregata Aβ42 za neurone i na taj način će deo antitela koji ulazi u mozak ispoljiti dejstvo na zdravlje neurona.

[0023] U ovom dokumentu opisana su snažna, visokoafinitetna antitela, uključujući antitelo sa KDod 320 pM za monomer. Tako visok afinitet može da omogući efikasnu supresiju Aβ n-42 do nivoa koji omogućavaju prevenciju i modifikaciju bolesti AD.

[0024] Nivoi rastvorljivih vrsta Aβ42 i Aβ40 mogu da budu detektovani u mozgu, CSF i krvi standardizovanim testovima koji koriste antitela usmerena protiv epitopa na peptidu Aβ. Kao što je prikazano u PK:PD pacova opisanom u ovom dokumentu, dozno-zavisna supresija slobodnog Aβ42 zapažena je u CSF pacova nakon periferne primene antitela. Pokazano je i dozno-zavisno povećanje ukupnog Aβ42 u mozgu pacova sa zanemarljivim dejstvom na peptid Aβ40.

[0025] Prema tome, u ovom dokumentu opisana su antitela koja imaju kapacitet da prodru u mozak (0.1% od ukupne periferne primene u CSF) i specifično suprimiraju ključnu toksičnu vrstu Aβ42 (ne i Aβ40) u CSF.

[0026] Specifičnost i mehanizam delovanja antitela prema predmetnom otkriću može da omogući kako profilaktičko, tako i terapijsko lečenje brojnih bolesti vezanih za nakupljanje amiloida koji se akumulira u organima u telu, uključujući različite stadijume procesa oboljevanja od AD: prodromalnu, blagu i umerenu AD, Daunov sindrom, kao i makularnu degeneraciju.

[0027] Antitela prema predmetnom otkriću mogu da imaju kapacitet za reverziju kognitivnog pada, lečenje kognitivnog pada i sprečavanje kognitivnog pada kod subjekata kojima je dijagnostikovana prodromalna, blaga do umerena AD i Daunov sindrom.

[0028] Prema tome, prvi aspekt predmetnog otkrića odnosi se na vezujuće elemente za humani Aβ1-42, posebno na molekule antitela.

[0029] Vezujući elementi, npr. molekuli antitela, prema predmetnom otkriću mogu da imaju bilo koje, ili sva sledeća svojstva:

− Vezivanje za rastvorljivi monomerni humani Aβ1-42 i/ili oligomerni Aβ1-42;

− Selektivnost u vezivanju Aβ1-42 u odnosu na Aβ1-40. Mogu da ne ispolje vezivanje Aβ1-40, ili vezivanje može da bude zanemarljivo. Na primer, molekuli antitela prema predmetnom otkriću mogu da vezuju monomerni Aβ1-42 sa konstantom disocijacije (KD) od 500 pM ili manje. Mogu da ne vezuju Aβ1-40, ili mogu da vežu Aβ1-40 sa KDvećom od 1 mM;

− Vezivanje za humani Aβ17-42. Prema tome, molekul antitela može da prepozna epitop između aminokiselina 17-42 u peptidu Aβ1-42, specifičnije, molekul antitela može da prepozna epitop između aminokiselina 29-42 u peptidu Aβ1-42;

− Vezivanje za rastvorljivi monomerni humani 3pyro-42 (piroglutamat 3) i 11 pyro-42 (piroglutamat 11)

− Vezivanje za humani Aβ1-43; i

− Unakrsna reaktivnost sa mišjim Aβ1-42.

[0030] Vezujući element može da sadrži set HCDR i/ili set LCDR regiona iz molekula antitela kao što je ovde opisano. Primeri molekula antitela prema predmetnom otkriću sadrže VH domen koji sadrži set HCDR regiona (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i VL domen koji sadrži set LCDR regiona (LCDR1, LCDR2 i LCDR3), gde HCDR i LCDR regioni predstavljaju redom HCDR i LCDR regione bilo kog od antitela Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383, ili njihovu GL verziju, čije sekvence su prikazane u priloženoj listi sekvenci. Korelacija između molekula antitela i identifikatora sekvenci u listi sekvenci prikazana je u tabeli 16.

[0031] Molekul antitela za humani Aβ1-42 može da sadrži

(i) VH domen koji sadrži set HCDR regiona: HCDR1, HCDR2 i HCDR3, ispresecan okvirnim regionima, pri čemu su aminokiselinske sekvence seta HCDR regiona kao što je prikazano u tabeli 16 za bilo koje od antitela Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383 ili njegovu GL verziju,

ili može da sadrži taj set HCDR regiona sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije; i

(ii) VL domen koji sadrži set LCDR regiona: LCDR1, LCDR2 i LCDR3, ispresecan okvirnim regionima, pri čemu su aminokiselinske sekvence seta LCDR regiona kao što je prikazano u tabeli 16 za bilo koje od antitela Abet0380, Abet0007, Abet0144, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0344, Abet0368, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383, ili njegovu GL verziju,

ili može da sadrži taj set LCDR regiona sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije.

[0032] Molekul antitela prema predmetnom otkriću može da sadrži

(i) VH domen koji sadrži set HCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380 GL, gde su aminokiselinske sekvence HCDR regiona iz Abet0380

HCDR1 SEQ ID NO: 525,

HCDR2 SEQ ID NO: 526, i

HCDR3 SEQ ID NO: 527,

ili može da sadrži set HCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380 GL sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije, i

(ii) VL domen koji sadrži set LCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380 GL, gde su aminokiselinske sekvence LCDR regiona iz Abet0380

LCDR1 SEQ ID NO: 534

LCDR2 SEQ ID NO: 535, i

LCDR3 SEQ ID NO: 536,

ili može da sadrži set LCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380 GL sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije.

[0033] Molekul antitela može da sadrži

(i) VH domen koji sadrži set HCDR regiona: HCDR1, HCDR2 i HCDR3, ispresecan okvirnim regionima, gde su aminokiselinske sekvence HCDR regiona

HCDR1 SEQ ID NO: 525,

HCDR2 SEQ ID NO: 526, i

HCDR3 SEQ ID NO: 527,

ili može da sadrži taj set HCDR regiona sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, gde su jedna ili više supstitucija izabrane od onih koje su prikazane u tabeli 12 ili tabeli 14; i

(ii) VL domen koji sadrži set LCDR regiona: LCDR1, LCDR2 i LCDR3, ispresecan okvirnim regionima, gde su aminokiselinske sekvence LCDR regiona

LCDR1 SEQ ID NO: 534

LCDR2 SEQ ID NO: 535, i

LCDR3 SEQ ID NO: 536,

ili može da sadrži taj set LCDR regiona sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, gde su jedna ili više supstitucija izabrane od onih koje su prikazane u tabeli 13 ili tabeli 15.

[0034] VH domen molekula antitela može da sadrži FW1 region u kome su aminokiselinske rezidue na pozicijama 26-30 prema Kabatu odabrane od onih prikazanih u tabeli 14.

[0035] VH domen molekula antitela može da sadrži okvirne regione FW1, FW2, FW3 i FW4 teškog lanca, u kojima su aminokiselinske sekvence okvirnih regiona teškog lanca

FW1 SEQ ID NO: 528

FW2 SEQ ID NO: 529

FW3 SEQ ID NO: 530, i

FW4 SEQ ID NO: 531

ili gde FW1 sadrži SEQ ID NO: 528 sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, gde je jedna ili više supstitucija u FW1 odabrana od onih prikazanih u tabeli 12 ili tabeli 14.

[0036] VL domen molekula antitela može da sadrži okvirne regione FW1, FW2, FW3 i FW4 lakog lanca, gde su aminokiselinske sekvence okvirnih regiona lakog lanca

FW1 SEQ ID NO: 537

FW2 SEQ ID NO: 538

FW3 SEQ ID NO: 539, i

FW4 SEQ ID NO: 540.

[0037] Molekul antitela prema predmetnom otkriću može da sadrži

(i) aminokiselinsku sekvencu VH domena kao što je prikazano u tabeli 16 za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njegovu GL verziju, ili može da sadrži tu aminokiselinsku sekvencu sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije; i

(ii) aminokiselinsku sekvencu VL domena kao što je prikazano u tabeli 16 za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njegovu GL verziju, ili može da sadrži tu aminokiselinsku sekvencu sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije.

[0038] Molekul antitela prema predmetnom otkriću može da sadrži VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu sa SEQ ID NO: 524 i VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu sa SEQ ID NO: 533, gde u VH domenu:

aminokiselina 26 je M, G ili S;

aminokiselina 27 je G, F ili D;

aminokiselina 28 je N, T, D ili H,

aminokiselina 29 je F

aminokiselina 30 je N, S, K, ili P;

aminokiselina 31 je Y, V, R, E, ili T;

aminokiselina 32 je Q, Y, D, S, ili E;

aminokiselina 33 je T, P, I, ili V;

aminokiselina 34 je M;

aminokiselina 35 je W;

aminokiselina 50 je V;

aminokiselina 51 je I;

aminokiselina 52 je G;

aminokiselina 52a je K, S, ili A;

aminokiselina 53 je T, S, N, D, G, ili Q;

aminokiselina 54 je N, G, T, ili P;

aminokiselina 55 je E, G, N, K, ili T;

aminokiselina 56 je N, T, R, ili K;

1

aminokiselina 57 je I, T, K, ili V; aminokiselina 58 je A, V, ili T; aminokiselina 59 je Y; aminokiselina 60 je A; aminokiselina 61 je D; aminokiselina 62 je S; aminokiselina 63 je V; aminokiselina 64 je K; aminokiselina 65 je G; aminokiselina 95 je E; aminokiselina 96 je W; aminokiselina 97 je M aminokiselina 98 je D; aminokiselina 99 je H; aminokiselina 100 je S; aminokiselina 100a je R; aminokiselina 100b je P; aminokiselina 100c je Y; aminokiselina 100d je Y; aminokiselina 100e je Y; aminokiselina 100f je Y; aminokiselina 100g je G; aminokiselina 100h je M; aminokiselina 101 je D; aminokiselina 102 je V;

VL domenu:

aminokiselina 24 je S; aminokiselina 25 je G; aminokiselina 26 je H; aminokiselina 27 je N; aminokiselina 28 je L, ili I; aminokiselina 29 je E, ili G; aminokiselina 30 je D; aminokiselina 31 je K;

aminokiselina 32 je F, ili W;

aminokiselina 33 je A, ili V;

aminokiselina 34 je S;

aminokiselina 50 je R;

aminokiselina 51 je D;

aminokiselina 52 je D;

aminokiselina 53 je K;

aminokiselina 54 je R;

aminokiselina 55 je P;

aminokiselina 56 je S;

aminokiselina 89 je S, ili Q;

aminokiselina 90 je S, ili A;

aminokiselina 91 je Q;

aminokiselina 92 je D;

aminokiselina 93 je T, ili S;

aminokiselina 94 je V, ili T;

aminokiselina 95 je T;

aminokiselina 96 je R;

aminokiselina 97 je V.

[0039] Molekul antitela prema predmetnom otkriću može da sadrži VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu sa SEQ ID NO: 524 i VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 85 % identičnu sa SEQ ID NO: 533, gde u VH domenu:

aminokiselina 26 je M, G, S, V, A, N, T, ili H;

aminokiselina 27 je G, F, S, Y, E, D, ili P;

aminokiselina 28 je N, Q, H, V, E, T, A, S, D, M, ili P;

aminokiselina 29 je F, I, Y, S, L, ili W;

aminokiselina 30 je N, S, T, Q, K, H, R, G, P, E, K, A, ili D;

aminokiselina 31 je Y, H, K, E, N, T, R, V, P, M, F, I, D, ili W;

aminokiselina 32 je Q, Y, D, N, S, E, ili T;

aminokiselina 33 je T, P, I, ili V;

aminokiselina 34 je M, ili L;

aminokiselina 35 je W;

aminokiselina 50 je V;

aminokiselina 51 je I;

aminokiselina 52 je G;

aminokiselina 52a je K, S, P, A, N, G, E, D, V, ili T; aminokiselina 53 je T, S, N, H, Q, D, G, ili E; aminokiselina 54 je N, G, P, T, Q, E, M, K, ili A; aminokiselina 55 je E, G, K, N, Q, T, H, D, ili A; aminokiselina 56 je N, T, A, R, ili K; aminokiselina 57 je I, T, N, S, K, F, Q, V, ili L; aminokiselina 58 je A, V, S, T, ili N; aminokiselina 59 je Y;

aminokiselina 60 je A;

aminokiselina 61 je D;

aminokiselina 62 je S, A, ili T;

aminokiselina 63 je V;

aminokiselina 64 je K;

aminokiselina 65 je G;

aminokiselina 95 je E;

aminokiselina 96 je W;

aminokiselina 97 je M

aminokiselina 98 je D, ili G;

aminokiselina 99 je H, ili R;

aminokiselina 100 je S;

aminokiselina 100a je R;

aminokiselina 100b je P;

aminokiselina 100c je Y;

aminokiselina 100d je Y;

aminokiselina 100e je Y;

aminokiselina 100f je Y;

aminokiselina 100g je G;

aminokiselina 100h je M, ili I;

aminokiselina 101 je D;

aminokiselina 102 je V, ili A;

VL domenu:

aminokiselina 24 je S, ili T;

aminokiselina 25 je G, ili T;

1

aminokiselina 26 je H, R, ili P;

aminokiselina 27 je N, ili H;

aminokiselina 28 je L, I, V, F, ili T;

aminokiselina 29 je E, M, G, S, ili N;

aminokiselina 30 je D, A, S, G, ili H;

aminokiselina 31 je K, ili S;

aminokiselina 32 je F, ili W;

aminokiselina 33 je A, V, M, T, ili I;

aminokiselina 34 je S, T, ili A;

aminokiselina 50 je R;

aminokiselina 51 je D;

aminokiselina 52 je D;

aminokiselina 53 je K;

aminokiselina 54 je R;

aminokiselina 55 je P;

aminokiselina 56 je S;

aminokiselina 89 je S, Q, ili A;

aminokiselina 90 je S, A, ili T;

aminokiselina 91 je Q

aminokiselina 92 je D, ili G;

aminokiselina 93 je T, Q, S, N, ili K;

aminokiselina 94 je V, T, ili F;

aminokiselina 95 je T;

aminokiselina 96 je R;

aminokiselina 97 je V, S, ili A.

[0040] Molekul antitela prema predmetnom otkriću može da sadrži:

(i) VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom VH domena prikazanom u tabeli 16 za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njegovu GL verziju; i (ii) VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom VL domena prikazanom u tabeli 16 za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njegovu GL verziju.

[0041] Molekul antitela može da sadrži VH domen i VL domen najmanje 90% identičan sa VH domenom odnosno VL domenom, bilo kog od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njegove GL verzije.

[0042] Navedeni procenat identičnosti VH i/ili VL domena može da bude najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0043] Molekul antitela može da sadrži VH domen i VL domen bilo kog od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382 ili njegove GL verzije.

[0044] Na primer, molekul antitela može da sadrži Abet0380-GL aminokiselinsku sekvencu VH domena SEQ ID NO: 524 i Abet0380-GL aminokiselinsku sekvencu VL domena SEQ ID NO: 533.

[0045] Molekul antitela prema predmetnom otkriću može da bude onaj koji kompetira u vezivanju za Aβ1-42 sa:

(i) molekulom antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH domena SEQ ID NO: 524 i aminokiselinsku sekvencu VL domena SEQ ID NO: 533,

(ii) molekulom antitela kodiranim nukleinskom kiselinom koja je deponovana pod pristupnim brojem NCIMB 41890, 41891 ili 41892.

[0046] Molekul antitela može da sadrži VH domen i VL domen kodiran sa:

(i) sekvencom nukleinske kiseline Abet0380-GL koja je deponovana pod pristupnim brojem 41890;

(ii) sekvencom nukleinske kiseline Abet0144-GL koja je deponovana pod pristupnim brojem 41891; ili

(ii) sekvencom nukleinske kiseline Abet0377-GL koja je deponovana pod pristupnim brojem 41892.

[0047] Molekul antitela može da sadrži VH domen i VL domen koji sadrži HCDR regione, odnosno LCDR regione, gore pomenutog deponovanog antitela. Molekul antitela može da bude antitelo kodirano gore pomenutom deponovanom nukleinskom kiselinom.

[0048] U ovom dokumentu opisani su i molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju vezujuće elemente prema predmetnom otkriću, ćelije-domaćine koje sadrži nukleinsku kiselinu, i postupci za proizvodnju vezujućih elemenata eksprimiranjem nukleinske kiseline i izdvajanjem vezujućeg elementa.

[0049] Sledeći aspekti predmetnog otkrića odnose se na kompozicije koje sadrže molekul antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i jednu ili više dodatnih komponenata,

1

kao što je farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, i na takve kompozicije za medicinsku upotrebu. Kompozicije koje sadrže vezujuće elemente prema predmetnom otkriću mogu da budu obezbeđene za upotrebu u postupku za lečenje čoveka ili životinje.

[0050] Vezujući elementi koji su ovde opisani mogu da se koriste u postupcima dijagnoze ili lečenje humanih ili životinjskih subjekata, npr. ljudi. Vezujući elementi predmetnog otkrića mogu da se koriste za sniženje nivoa Aβ1-42 kod osobe i/ili za redukciju amiloidoze. Vezujući elementi mogu da se koriste za redukciju amiloidoze i za lečenje, redukciju ili prevenciju stanja povezanih sa amiloidozom. Stanja i bolesti koje mogu da se leče uključuju Alchajmerovu bolest, kao što je prodromalna, blaga ili umerena AD. AD koja se leči pomoću predmetnog otkrića može da bude familijarna ili sporadična AD. Predmetno otkriće može da se koristi za prevenciju, redukovanje ili reverziju blagog kognitivnog oštećenja (MCI) povezanog sa AD. Kognicija može da bude poboljšana, i/ili kognitivni pad može da bude umanjen, kod pacijenata sa AD ili pacijenata sa Daunovim sindromom. Predmetno otkriće može takođe da se koristi za lečenje ili prevenciju makularne degeneracije, koja je povezana sa beta-amiloidom (Ding et al. PNAS 108(28):E279-287 2011).

[0051] Prema tome, u sledećem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za redukciju amiloidoze, lečenje Alchajmerove bolesti, poboljšanje kognicije ili smanjenja kognitivnog pada kod Alchajmerove bolesti ili Daunovog sindroma, i/ili lečenje makularne degeneracije kod osobe, koji obuhvata primenu vezujućeg elementa prema predmetnom otkriću kod osobe.

[0052] Ovi i drugi aspekti predmetnog otkrića opisani su detaljnije u tekstu ispod.

Kratak opis crteža

[0053]

Slika 1 prikazuje rezultate testa direktnog vezivanja HTRF™ između prečišćenog Abet0007 Fab i serije beta-amiloidnih peptida. Klon Abet0007 (■) pokazuje vezivanje za humani beta-amiloidni peptid 1-42 (Slika 1A) i mišji beta-amiloidni peptid 1-42 (Slika 1C) ali ne pokazuje vezivanje za humani beta-amiloidni peptid 1-40 (Slika 1B) ili humani beta-amiloidni peptid 1-42 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (Slika 1D). Pozitivna kontrola antitela (●) i negativna kontrola antitela (▲) korišćene su za potvrđivanje integriteta testa.

Slika 2 prikazuje inhibiciju formiranja biotinilisanog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 i Abet0007 IgG2 kompleksa rastućim koncentracijama kompetitorskih peptida. Formiranje kompleksa inhibirano je humanim beta-amiloidnim peptidima 1-42 (●), 11-42

1

(▲), 17-42 (▼) i 1-43 (◆). Ono nije inhibirano humanim beta-amiloidnim peptidom 1-40 (■) ili negativnom kontrolom peptida (○).

Slika 3 prikazuje tragove rezonancije površinskog plazmona (BIAcore) za vezivanje humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 sa imobilisanim Abet0007 IgG2 u koncentracijama od 100 nM (gornji trag), 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.2 nM i 3.1 nM (donji trag) peptida. Svaki trag je prilagođen 1:1 modelu Langmuira.

Slika 4 prikazuje uzorke slika in vitro imunohistohemijskog bojenja Abet0007 IgG2. (A) Pozitivna kontrola antitela pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 4) na isečcima mozga sa AD čoveka (ApoE genotip 3/3; Brakov stadijum 6; 20 µg/ml antitela). (B) Vodeći klon Abet0007 IgG2 ne pokazuje prepoznavanje plakova (skor = 0) na srodnom isečku mozga (20 µg/ml). (C) Pozitivna kontrola istog antitela pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 4) na isečcima mozga miša Tg2576 (18 meseci stari miševi; 20 µg/ml antitela). (D) Vodeći klon Abet0007 IgG2 ne pokazuje prepoznavanje plakova (skor = 0) na srodnom isečku mozga miša (20 µg/ml).

Slika 5 prikazuje inhibiciju formiranja humanog beta-amiloida 1-42 i Abet0042 IgG kompleksa rastućim koncentracijama Abet0007 scFv (●) i Abet0144 scFv (▲). Klon Abet0144 je značajno aktivniji od parentalnog klona Abet0007 u ovom testu. Negativna kontrola antitela (■) uključena je zbog poređenja.

Slika 6 prikazuje tragove rezonancije površinskog plazmona (BIAcore) za vezivanje prečišćenog Abet0144 scFv sa imobilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-42 u koncentracijama od 400 nM (gornji trag), 200 nM, 100 nM, 50 nM i 12.5 nM (donji trag) scFv. Svaki trag je prilagođen 1:1 modelu Langmuira.

Slika 7 prikazuje tragove rezonancije površinskog plazmona (BIAcore) za vezivanje humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 sa imobilisanim Abet0144-GL IgG1-TM antitelom u koncentracijama od 50 nM (gornji trag), 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.13 nM i 1.56 nM (donji trag) peptida. Svaki trag je prilagođen 1:1 modelu Langmuira.

Slika 8 prikazuje tragove rezonancije površinskog plazmona (BIAcore) za vezivanje serija beta-amiloidnih peptida pri 400 nM sa imobilisanim Abet0144-GL IgG1-TM antitelom. Postoji jasno vezivanje sa biotinilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-42 (gornji trag) i neobeleženim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-42 (drugi trag). Nema prepoznatljivog vezivanja sa biotinilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-42 sa nasumičnim redosledom aminokiselina, biotinilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-40, neobeleženim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-40 ili biotinilisanim insulinom (ravne linije).

1

Slika 9 prikazuje određivanje profila specifičnosti Abet0144-GL IgG1-TM upotrebom biohemijskog testa epitopske kompeticije u kome se meri inhibicija formiranja kompleksa između biotinilisanog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 i Abet0144-GL IgG1-TM rastućim koncentracijama kompetitorskih peptida. Formiranje kompleksa je inhibirano humanim beta-amiloidnim 1-42 (●), pyro 3-42 (◆) i pyro 11-42 (○) peptidima. Nije zapažena značajna inhibicija humanim beta-amiloidnim peptidom 1-40 (■), skraćenim oblicima peptida 1-16 (▲) i 12-28 (▼) ili negativnom kontrolom peptida (□). Slika 10 prikazuje primere slika in vitro imunohistohemijskog bojenja Abet0144-GL IgG1-TM. (A) Pozitivna kontrola antitela pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 4) na isečcima mozga sa AD čoveka (ApoE genotip 3/3; 20 µg/ml antitela). (B) Vodeći klon Abet0144-GL IgG1-TM pokazuje izvesno prepoznavanje plakova (skor = 1.5) na srodnom isečku mozga (20 µg/ml). (C) Pozitivna kontrola istih antitela pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 4) na isečcima mozga miša Tg2576 (18 meseci stari miševi; 20 µg/ml antitela). (D) Vodeći klon Abet0144-GL IgG1-TM pokazuje izvesno prepoznavanje plakova (skor = 1) na srodnom isečku mozga miša (20 µg/ml).

Slika 11 prikazuje inhibiciju formiranja humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 i Abet0144-GL IgG1-TM kompleksa rastućim koncentracijama prečišćenog kompetitora scFv (●). Četiri od najaktivnijih klonova scFv, Abet0369 (Slika 11A), Abet0377 (Slika 11B), Abet0380 (Slika 11C) i Abet0382 (Slika 11D) svi pokazuju značajno poboljšanje aktivnosti u odnosu na parentalnu Abet0144-GL scFv sekvencu (■).

Slika 12 prikazuje tragove rezonancije površinskog plazmona (BIAcore) za vezivanje humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 sa imobilisanim Abet0380-GL IgG1-TM antitelom u koncentracijama od 1024 nM (gornji trag) do 63 pM (donji trag) peptida. Svaki trag je prilagođen 1:1 modelu Langmuira.

Slika 13 prikazuje tragove rezonancije površinskog plazmona (BIAcore) za vezivanje serija beta-amiloidnih peptida sa imobilisanim Abet0380-GL IgG1-TM antitelom. Postoji jasno vezivanje sa biotinilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-42 (gornji trag) i neobeleženim mišjim beta-amiloidnim peptidom 1-42 (drugi trag). Nema prepoznatljivog vezivanja sa biotinilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-40 ili neobeleženim mišjim beta-amiloidnim peptidom 1-40 (ravne linije).

Slika 14 prikazuje primere slika in vitro imunohistohemijskog bojenja Abet0380-GL IgG1-TM. (A) Pozitivna kontrola antitela pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 4) na isečcima mozga sa AD čoveka (ApoE genotip 3/3, Brakov stadijum 6; 5 µg/ml antitela). (B) Vodeći klon Abet0380-GL IgG1-TM pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 3) na srodnom isečku mozga (10 µg/ml). (C) Pozitivna kontrola istog

1

antitela pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 4) na isečcima mozga miša Tg2576 (22 meseci stari miševi; 20 µg/ml antitela). (D) Vodeći klon Abet0380-GL IgG1-TM pokazuje snažno prepoznavanje plakova (skor = 4) na srodnom isečku mozga miša (20 µg/ml).

Slika 15 prikazuje Western Blot analizu pripreme i detekcije Abeta 42 agregata upotrebom Abet0380-GL IgG1TM. (A) Abet0380-GL IgG1TM detekcija Aβ42 agregata koji nisu umreženi pomoću svetlosti (ne PICUP). (B) Abet0380-GL IgG1TM detekcija Aβ42 agregata umreženih pomoću svetlosti (PICUP). Ovde pokazujemo da Abet0380-GL IgG1TM specifično prepoznaje Aβ1-42 monomer i vrste oligomera sa malim brojem n, do, i uključujući pentamer.

Slika 16 prikazuje dozno-zavisnu redukciju nivoa slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 u CSF (A), povećanje ukupnog beta-amiloidnog peptida 1-42 u tkivu mozga (B) i neizmenjene nivoe ukupnog beta-amiloidnog peptida 1-40 u tkivu mozga (C) pomoću rastućih doza Abet0380-GL IgG1-TM antitela kod pacova Sprague-Dawley koji primaju ponovljene nedeljne doze tokom 14 dana.

Slika 17 prikazuje primere slika imunohistohemijskih analiza vezivanja Abet0380-GL IgG1-TM sa beta-amiloidnim plakovima in vivo 168 časova posle periferne doze kod starih miševa Tg2576. Pozitivna kontrola antitela data u koncentraciji od 30 mg/kg pokazuje snažno in vivo prepoznavanje plakova (A), dok Abet0380-GL IgG1-TM dato u koncentraciji od 30(B) ili 10(C) mg/kg ne pokazuje nikakvo in vivo bojenje plakova. Slika 18 prikazuje specifičnost Abet0380-GL IgG1-TM u eksperimentima kompetitivnog vezivanja sa opsegom različitih koncentracija (10uM naniže do 0.17nM) panela humanih Abeta peptida cele dužine, skraćenih i pyro (Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta pyro-3-42, ili Abeta pyro-11-42). Ključ:

Abeta 1-42

Abeta 1-43

▼ Abeta 1-16

◆ Abeta 12-28

Abeta 17-42

Abeta Pyro-3-42

Abeta Pyro 11-42

◇ Vehikulum 1 (DMSO)

Vehikulum 2 (NH4OH)

1

X-osa pokazuje koncentraciju Abeta peptida u log M, y-osa prikazuje % specifičnog vezivanja. Inhibicija Abet0380-GL IgG1-TM: vezivanje N-terminalnog Biotin Abeta 1-42 zapaženo je sa Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 17-42, Abeta Pyro-3-42 i Abeta Pyro-11-42 sa IC50vrednostima u opsegu 10<-8>do 10<-9>molova za ovu grupu. Nema inhibicije Abet0380-GL IgG1-TM: vezivanje N-terminalnog Biotin Abeta 1-42 zapaženo je sa Abeta 1-16 ili Abeta 12-28.

Slika 19 prikazuje sposobnost antitela Abet0144-GL da sekvestriraju beta-amiloid 1-42 u studiji PK-PD na normalnim pacovima. X-osa prikazuje vehikulum ili koncentraciju Abet0144-GL (10mg/kg, ili 40 mg/kg), y-osa prikazuje koncentraciju ukupnog betaamiloida 1-42 u CSF u pg/ml. Slobodni beta-amiloid 1-42 u CSF nije značajno izmenjen ni sa 10, ni sa 40 mg/kg Abet0144-GL (5 i 18% povećanja redom u poređenju sa vehikulumom). Ukupni beta-amiloid 1-42 u CSF bio je značajno povećan za 38% pri 10 mg/kg, i za 139% pri 40 mg/kg. Ukupni beta-amiloid 1-42 u tkivu mozga bio je takođe značajno povećan, za 16% i 50% pri 10 i 40 mg/kg, redom. Podaci iz ove studije na normalnim pacovima pokazuju da Abet0144-GL nema značajan efekat na nivoe slobodnog beta-miloida 1-42 u CSF, dok povećava nivoe ukupnog beta-amiloida 1-42 i u CSF i u mozgu.

Detaljan opis

[0054] Vezivanjem izoformi Aβ peptida 1-42 i njegovih N-terminalno skraćenih oblika (n-42) u plazmi, mozgu i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF), vezujući element prema predmetnom otkriću može da spreči nakupljanje ili da ostvari reverziju taloženja Aβ n-42 izoformi u mozgu i cerebralnoj vaskulaturi. Vezujući elementi prema predmetnom otkriću mogu da vežu i precipitiraju rastvorljivi Aβ1-42 u krvnoj plazmi i/ili u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF), čime se redukuje koncentracija Aβ1-42 u serumu i/ili CSF, redom. Ovo predstavlja terapijski pristup kod Alchajmerove bolesti i drugih stanja povezanih sa amiloidozom.

[0055] Vezujući elementi su specifični za ciljni epitop u Aβ17-42, specifičnije u Aβ29-42, i vezuju ovaj ciljni epitop sa visokim afinitetom u odnosu na epitope koji nisu ciljni, na primer epitope iz Aβ1-40, čime ciljno deluju na glavnu toksičnu vrstu povezanu sa formiranjem amiloidnih plakova. Na primer, vezujući element može da ispolji afinitet vezivanja za Aβ1-42 koji je najmanje 10 puta, najmanje 100 puta, najmanje 1000 puta ili najmanje 10 000 puta veći od afiniteta prema Aβ1-40. Prema tome, vezujući element je selektivan za vezivanje Aβ1-42 u odnosu na Aβ1-40. Kao što je gore navedeno, vezujući element može da veže Aβ1-42 sa konstantom disocijacije (KD) od 500 pM ili manje. Poželjno, on ne ispoljava značajno vezivanje

2

za Aβ1-40. Afinitet i vezivanje mogu da se odrede upotrebom rezonancije površinskog plazmona korišćenjem monomernog Aβ peptida, kao što je opisano u primerima.

[0056] Vezivanje za Aβ može da se meri i pomoću testa homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF™), da bi se odredilo da li antitelo može da kompetira za vezivanje sa Aβ sa referentnim molekulom antitela za Aβ peptid, kao što je opisano u primerima.

[0057] Test HTRF™ predstavlja tehnologiju homogenog testa koja koristi rezonantni transfer energije fluorescencije između donorskog i akceptorskog fluorofora koji se nalaze u neposrednoj blizini. Takvi testovi mogu da se koriste za merenje makromolekulskih interakcija direktnim ili indirektnim kuplovanjem molekula od interesa sa donorskim fluoroforom, europijum (Eu3+) kriptatom, i kuplovanjem drugog molekula od interesa sa akceptorskim fluoroforom XL665, (stabilno umreženi alofikocijanin). Ekscitacija molekula kriptata (na 337 nm) rezultuje emisijom fluorescencije na 620 nm. Energija iz ove emisije može da bude preneta na XL665 u bliskom okruženju kriptata, što rezultuje emisijom specifične dugoživuće fluorescencije (na 665 nm) iz XL665. Specifični signali donora (na 620 nm) i akceptora (na 665 nm) se mere, što omogućava izračunavanje odnosa 665/620 nm koji kompenzuje prisustvo obojenih jedinjenja u testu.

[0058] Vezujući element prema predmetnom otkriću može da kompetira za vezivanje za Aβ1-42 i tako inhibira vezivanje referentnog antitela u kompetitivnom testu HTFR™ sa Aβ1-42, ali ne i sa Aβ1-40. Vezujući element može da ispolji najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85% ili najmanje 90% inhibicije Abet0144GL za vezivanje sa Aβ1-42 u testu HTRF™.

[0059] Aktivnost inhibiranja vezivanja može da se izrazi kao IC50vrednost, u nM osim ako nije drugačije navedeno. U funkcionalnim testovima, IC50je koncentracija molekula antitela koja redukuje biološki odgovor za 50% njegovog maksimuma. U studijama vezivanja liganda, IC50je koncentracija koja redukuje vezivanje receptora za 50% od maksimalnog nivoa specifičnog vezivanja. IC50može da se izračuna grafičkim predstavljanjem % maksimalnog biološkog odgovora u funkciji log koncentracije vezujućeg elementa, i upotrebom kompjuterskog programa, kao što je Prism (GraphPad) ili Origin (Origin Labs) za prilagođavanje sigmoidne funkcije podacima za generisanje vrednosti IC50. Pogodni testovi za merenje ili određivanje aktivnosti su dobro poznati u stanju tehnike.

[0060] Vezujući element može da ima IC50od 5 nM ili manje, npr.2 nM ili manje, npr.1 nM ili manje, u HTRF™ testu kompeticije za epitop sa Abet0144-GL i Aβ1-42. Abet0144-GL je molekul antitela koji ima VH domen sekvence SEQ ID NO: 20 i VL domen sekvence SEQ ID NO: 29. Može da se upotrebi u testu u istom formatu kao molekul antitela koji se ispituje, na primer u scFv ili IgG, npr. IgG1 format. Tako, IgG molekuli antitela prema predmetnom otkriću mogu da kompetiraju sa Abet0144-GL IgG za vezivanje sa humanim Aβ1-42 u HTRF testu kompeticije za epitop. Aktivnost u takvom testu može da bude manja od 1 nM.

[0061] Vezujući element prema predmetnom otkriću može da ispolji specifično vezivanje za Aβ1-42 u odnosu na Aβ1-40, određeno testom kompeticije HTRF™. U takvom testu, Aβ1-40 može da ne ispolji značajnu inhibiciju vezivanja vezujućeg elementa sa Aβ1-42 peptidom, npr. može da ispolji manje od 20%, npr. manje od 10% ili manje od 5%, inhibicije u takvom testu, i poželjno ne ispoljava značajnu inhibiciju u takvom testu.

[0062] Vezujući elementi prema predmetnom otkriću prepoznaju epitop u humanom Aβ17-42, specifičnije u humanom Aβ29-42 i mogu takođe da prepoznaju svoj ciljni epitop u Aβ iz druge vrste, npr. miša ili pacova. Aktivnost vezujućeg elementa izračunata u HTRF™ testu kompeticije upotrebom Aβ1-42 iz prve vrste (npr. čoveka) može da se uporedi sa aktivnošću vezujućeg elementa u istom testu upotrebom Aβ1-42 iz druge vrste (npr. mišji Aβ1-42), kako bi se procenio stepen unakrsne reaktivnosti vezujućeg elementa za Aβ1-42 dve vrste. Aktivnost, određena merenjima IC50, može da bude unutar 10-strukog ili unutar 100-strukog opsega. Kao što je gore navedeno, Abet0144GL može da se upotrebi kao referentno antitelo u HTRF™ testu kompeticije. Vezujući elementi opisani u ovom dokumentu mogu da imaju veću aktivnost u testu sa humanim Aβ1-42, nego u testu sa nehumanim Aβ1-42.

[0063] Vezujući element može da sadrži molekul antitela koji ima jedan ili više CDR regiona, npr. set CDR regiona, u okviru okvirnog regiona antitela (tj. antigen-vezujući domen antitela). Na primer, molekul antitela može da sadrži VH i/ili VL domen antitela. VH i VL domeni molekula antitela su takođe obezbeđeni kao deo predmetnog otkrića. Kao što je dobro poznato, VH i VL domeni sadrže regione za određivanje komplementarnosti, ("CDR" regione), i okvirne regione, ("FW" regione). VH domen sadrži set HCDR regiona i VL domen sadrži set LCDR regiona. Molekul antitela može da sadrži VH domen antitela koji sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 i/ili VL domen antitela koji sadrži VL CDR1, CDR2 i CDR3. VH ili VL domeni mogu dodatno da sadrže okvirni region. Okvirni region VH ili VL domena tipično sadrži četiri okvirna regiona, FW1, FW2, FW3 i FW4, koji su ispresecani CDR regionima sledeće strukture: FW1 -CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4.

[0064] Primeri VH i VL domena antitela, FW regiona i CDR regiona prema aspektima predmetnog otkrića navedeni su u tabelama 5 i 6 i priloženom listingu sekvenci koji čini deo predmetnog otkrića. Sve VH i VL sekvence, CDR sekvence, setovi CDR regiona, setovi HCDR regiona i setovi LCDR regiona koji su ovde opisani, kao i kombinacije ovih elemenata, predstavljaju aspekte predmetnog otkriće. Kao što je ovde opisano, "set CDR " sadrži CDR1, CDR2 i CDR3. Tako, set HCDR regiona odnosi se na HCDR1, HCDR2 i HCDR3, a set LCDR regiona odnosi se na LCDR1, LCDR2 i LCDR3. Osim ako nije drugačije navedeno, "set CDR regiona" uključuje HCDR regione i LCDR regione. Tipični molekuli antitela predmetnog otkrića su monoklonska antitela.

[0065] U drugim primerima izvođenja, vezujući element može da sadrži antigen-vezujuće mesto u molekulu koji nije antitelo, normalno obezbeđeno pomoću jednog ili više CDR regiona npr. seta CDR regiona u skafoldu proteina koji nije antitelo, kao što je dalje diskutovano u tekstu ispod.

[0066] U ovom dokumentu opisana je izolacija parentalnog molekula antitela označenog kao Abet0007, praćena usmerenom mutacijom CDR3 i selekcijom optimizovanog antitela Abet0144, modifikovanog prema sekvenci klicine linije (eng. – „germlined“) u Abet0144-GL sa setom CDR sekvenci i okvirnih sekvenci kao što je prikazano u tabelama 5, 6 i listingu sekvenci. Pomoću intenzivnog postupka dalje optimizacije i rekombinacije višestrukih biblioteka kao što je opisano u primerima, iz Abet0144GL stvoren je panel klonova antitela. Ovi dodatno optimizovani klonovi označeni su kao Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383. Njihove CDR sekvence i sekvence varijabilnog domena navedene su u tabelama 5 i 6 i prikazane u listingu sekvenci. Sekvence VH i VL domena modifikovane prema sekvenci klicine linije Abet0380GL, Abet0377GL, Abet0343GL, Abet0369GL i Abet0382GL prikazane su u tabeli 8 i tabeli 9.

[0067] Na primer, tabele 5 i 6 pokazuju da Abet0380 ima set CDR regiona, u kojima je HCDR1 SEQ ID NO: 525 (Kabatove rezidue 31-35), HCDR2 je SEQ ID NO: 526 (Kabatove rezidue 50-65), HCDR3 je SEQ ID NO: 527 (Kabatove rezidue 95-102), LCDR1 je SEQ ID NO: 534 (Kabatove rezidue 24-34), LCDR2 je SEQ ID NO: 535 (Kabatove rezidue 50-56) i LCDR3 je SEQ ID NO: 536 (Kabatove rezidue 89-97). Drugi optimizovani klonovi antitela prikazani su u tabelama 5 i 6 na sličan način i takođe su date kao aspekti predmetnog otkrića.

[0068] Vezujući element za humani Aβ1-42 u skladu sa predmetnim otkrićem može da sadrži jedan ili više CDR regiona kao što je ovde opisano, npr. set CDR regiona. CDR ili set CDR regiona može da bude Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383 set CDR regiona, ili njegova verzija modifikovana prema sekvenci klicine linije, ili može da bude njegova varijanta kao što je ovde opisano.

[0069] U nekim primerima izvođenja;

HCDR1 može da bude dužine 5 aminokiselina, i da se sastoji od Kabatovih rezidua 31-35;

HCDR2 može da bude dužine 17 aminokiselina, i da se sastoji od Kabatovih rezidua 50-65; HCDR3 može da bude dužine 16 aminokiselina, i da se sastoji od Kabatovih rezidua 95-102; LCDR1 može da bude dužine 11 aminokiselina, i da se sastoji od Kabatovih rezidua 24-34;

2

LCDR2 može da bude dužine 7 aminokiselina, i da se sastoji od Kabatovih rezidua 50-56; i/ili LCDR3 može da bude dužine 9 aminokiselina, i da se sastoji od Kabatovih rezidua 89-97.

[0070] Vezujući elementi mogu da sadrže HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3 i/ili LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3 bilo kog od antitela navedenih u tabelama 5 i 6, npr., set CDR regiona bilo kog od antitela navedenih u tabeli 5 ili 6. Vezujući element može da sadrži set VH CDR regiona bilo kog od ovih antitela. Opciono, on takođe može da sadrži set VL CDR regiona jednog od ovih antitela. VL CDR regioni mogu da budu iz istog ili različitih antitela u odnosu na VH CDR regione. Obezbeđeni su i VH domen koji sadrži set HCDR regiona bilo kog od antitela navedenih u tabeli 5, i/ili VL domen koji sadrži set LCDR regiona bilo kog od antitela navedenih u tabeli 6.

[0071] Vezujući element može da sadrži set H i/ili L CDR regiona bilo kog od antitela navedenih u tabelama 5 i 6 sa jednom ili više aminokiselinskih mutacija, npr. do 5, 10 ili 15 mutacija, unutar opisanog seta H i/ili L CDR regiona. Mutacija može da bude aminokiselinska supstitucija, delecija ili insercija. Na primer, molekul antitela predmetnog otkrića može da sadrži set H i/ili L CDR regiona iz bilo kog od Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383, ili njihovu verziju modifikovanu prema sekvenci klicine linije, sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije, npr. supstitucije.

[0072] Na primer, vezujući element može da sadrži VH domen koji sadrži set HCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380GL, pri čemu su aminokiselinske sekvence HCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380GL

HCDR1 SEQ ID NO: 525,

HCDR2 SEQ ID NO: 526, i

HCDR3 SEQ ID NO: 527,

ili sadrži set HCDR regiona iz Abet0380 sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije, i

(ii) VL domen koji sadrži set LCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380GL, gde su aminokiselinske sekvence LCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380GL

LCDR1 SEQ ID NO: 534

LCDR2 SEQ ID NO: 535, i

LCDR3 SEQ ID NO: 536,

ili sadrži set LCDR regiona iz Abet0380 ili Abet0380GL sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije.

[0073] Mutacije mogu potencijalno da budu uvedene na bilo kojoj rezidui unutar seta CDR regiona. U nekim primerima izvođenja, supstitucije mogu da budu uvedene na pozicijama supstituisanim u bilo kom od Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383 u poređenju sa Abet0144GL, ili na pozicijama supstituisanim u bilo kom od Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 i Abet0383 u poređenju sa Abet0380, ili njihovim verzijama modifikovanim prema sekvenci klicine linije, kao što je prikazano u tabelama 5 i 6.

[0074] Na primer, jedna ili više supstitucija mogu da budu na jednoj ili više od sledećih Kabatovih rezidua:

26, 27, 28, 29 ili 30 u VH FW1;

31, 32, 33, 34 ili 35 u VH CDR1;

52a, 53, 54, 55, 56, 57, 58 ili 62 u VH CDR2;

98, 99, 100h ili 102 u VH CDR3;

24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 u VL CDR1;

89, 90, 92, 93, 94 ili 97 u VL CDR3.

[0075] Primeri mogućih aminokiselinskih supstitucija na određenim pozicijama Kabatovih rezidua prikazani su u tabelama 12 i 14 za VH domen i tabelama 13 i 15 za VL domen.

[0076] Kao što je gore opisano, vezujući element može da sadrži molekul antitela koji ima jedan ili više CDR regiona, npr. set CDR regiona, unutar okvirnih regiona antitela. Na primer, jedan ili više CDR regiona ili set CDR regiona antitela može da bude nakalemljen u okvirni region (npr. humani okvirni region) da bi se dobio molekul antitela. Okvirni regioni mogu da budu iz sekvence genskog segmenta humane klicine linije. Prema tome, okvirni region može da bude modifikovan prema sekvenci klicine linije, pri čemu su jedna ili više rezidua unutar okvirnog regiona izmenjene tako da odgovaraju rezidui na ekvivalentnoj poziciji u segmentu najsličnijem okvirnom regionu humane klicine linije. Stručnjak u datoj oblasti može da odabere segment klicine linije koji je najbliži po sekvenci sa sekvencom okvirnog regiona antitela pre modifikovanja prema sekvenci klicine linije (eng. – „germlining“) i ispita afinitet ili aktivnost antitela da bi potvrdio da modifikovanje prema sekvenci klicine linije nije značajno redukovalo vezivanje antigena ili aktivnost u testovima koji su ovde opisani. Sekvence genskog segmenta

2

humane klicine linije poznate su stručnjaku u datoj oblasti i može da im se pristupi, na primer, iz kompilacije VBASE (VBASE, MRC Centre of Protein Engineering, VB, 1997, http//mrccpe.cam.ac.uk).

[0077] Vezujući element kao što je ovde opisano može da bude izolovani humani molekul antitela koji ima VH domen koji sadrži set HCDR regiona u okvirnom regionu humane klicine linije, npr. Vh3-23 DP-47. Prema tome, okvirni regioni VH domena FW1, FW2 i/ili FW3 mogu da sadrže okvirne regione genskog segmenta Vh3-23 DP-47 humane klicine linije i/ili mogu da budu modifikovani prema sekvenci klicine linije mutiranjem rezidua okvirnog regiona tako da odgovaraju reziduama okvirnog regiona ovog genskog segmenta humane klicine linije. FW4 može da sadrži okvirni region j segmenta humane klicine linije.

[0078] Aminokiselinska sekvenca VH FW1 može da bude SEQ ID NO: 528. VH FW1 sadrži serije rezidua na Kabatovim pozicijama 26-30 za koje se smatra da doprinose vezivanju antigena i/ili da su značajne za strukturnu konformaciju petlje CDR1. Supstitucije mogu da budu uključene u SEQ ID NO: 528, na primer da bi postigle sinergiju sa odabranom sekvencom HCDR1. Jedna ili više supstitucija mogu opciono da budu odabrane od onih prikazanih u tabeli 12 ili tabeli 14.

[0079] Aminokiselinska sekvenca VH FW2 može da bude SEQ ID NO: 529. Aminokiselinska sekvenca VH FW3 može da bude SEQ ID NO: 530. Aminokiselinska sekvenca VH FW4 može da bude SEQ ID NO: 531.

[0080] Normalno, vezujući element ima i VL domen koji sadrži set LCDR regiona, npr. u okvirnom regionu humane klicine linije, npr. V lambda 23-3 DPL-23. Prema tome, okvirni regioni VL domena mogu da sadrže okvirne regione FW1, FW2 i/ili FW3 genskog segmenta humane klicine linije V lambda 23-3 DPL-23 i/ili mogu da budu modifikovani prema sekvenci klicine linije mutiranjem rezidua okvirnog regiona tako da odgovaraju reziduama okvirnog regiona ovog genskog segmenta humane klicine linije. FW4 može da sadrži okvirni region j segmenta humane klicine linije. Aminokiselinska sekvenca VL FW1 može da bude SEQ ID NO: 537. Aminokiselinska sekvenca VL FW2 može da bude SEQ ID NO: 538. Aminokiselinska sekvenca VL FW3 može da bude SEQ ID NO: 539. Aminokiselinska sekvenca VL FW4 može da bude SEQ ID NO: 540.

[0081] VH ili VL domen modifikovan prema sekvenci klicine linije može, ali ne mora, da bude modifikovan prema sekvenci klicine linije na jednoj ili više Vernier rezidua, ali normalno nije.

[0082] Na primer, molekul antitela ili VH domen kao što je ovde opisano može da sadrži sledeći set okvirnih regiona teškog lanca:

FW1 SEQ ID NO: 528;

2

FW2 SEQ ID NO: 529;

FW3 SEQ ID NO: 530;

FW4 SEQ ID NO: 531;

ili može da sadrži navedeni set okvirnih regiona teškog lanca sa 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 aminokiselinskih mutacija, npr. supstitucija.

[0083] Molekul antitela ili VL domen kao što je ovde opisano može da sadrži sledeći set okvirnih regiona lakog lanca:

FW1 SEQ ID NO: 537;

FW2 SEQ ID NO: 538;

FW3 SEQ ID NO: 539;

FW4 SEQ ID NO: 540;

ili može da sadrži navedeni set okvirnih regiona lakog lanca sa 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih mutacija, npr. supstitucija.

[0084] Molekul antitela koji nije modifikovan prema sekvenci klicine linije ima iste CDR regione, ali drugačije okvirne regione, u poređenju sa molekulom antitela modifikovanim prema sekvenci klicine linije. Od sekvenci antitela prikazanih ovde u priloženom listingu sekvenci, sekvence Abet0144-GL, Abet0380-GL, Abet0377-GL, Abet0343-GL, Abet0369-GL, i Abet0382-GL su modifikovane prema sekvenci klicine linije. Antitela modifikovana prema sekvenci klicine linije drugih molekula antitela čije sekvence su ovde opisane mogu da budu proizvedena modifikovanjem prema sekvenci klicine linije okvirnih regiona sekvenci njihovih VH i VL domena, opciono prema Vh3-23 DP-47 u VH domenu i V lambda 23-3 DPL-23 u VL domenu.

[0085] Tipično, VH domen se sparuje sa VL domenom da bi stvorio antigen-vezujuće mesto antitela, iako, kao što je razmatrano u tekstu iznad, sam VH ili VL domen može da bude upotrebljen za vezivanje antigena. Na primer, VH domen Abet0380-GL (SEQ ID NO: 524) može da bude sparen sa VL domenom Abet0380-GL (SEQ ID NO:533), tako da se formira antigen-vezujuće mesto antitela koje sadrži i VH i VL domene Abet0380-GL. Obezbeđeni su analogni primeri izvođenja za VH i VL domene drugih antitela koja su ovde opisana. U drugim primerima izvođenja, VH Abet0380-GL sparuje se sa VL domenom drugačijim od VL Abet0380-GL. Neselektivnost lakog lanca dobro je poznata u stanju tehnike. Ponovo, predmetnim otkrićem obezbeđeni su analogni primeri izvođenja za druge VH i VL domene koji su ovde opisani. Prema tome, VH domen koji sadrži VH CDR regione ili sekvencu VH domena modifikovanu prema sekvenci klicine linije bilo kog od Abet0319, Abet0321b, Abet0322b,

2

Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 i Abet0383 može da bude sparen sa VL domenom koji sadrži VL CDR regione ili VL domenom modifikovanim prema sekvenci klicine linije iz drugog antitela, npr. VH i VL domeni mogu da budu iz drugih antitela odabranih od Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 i Abet0383.

[0086] Vezujući element može da sadrži

(i) aminokiselinsku sekvencu VH domena kao što je prikazano u tabeli 16 ili u priloženom listingu sekvenci za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njenu verziju modifikovanu prema sekvenci klicine linije,

ili da sadrži tu aminokiselinsku sekvencu sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije; i (ii) aminokiselinsku sekvencu VL domena kao što je prikazano u tabeli 16 ili u priloženom listingu sekvenci za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njenu verziju modifikovanu prema sekvenci klicine linije,

ili da sadrži tu aminokiselinsku sekvencu sa jednom ili dve aminokiselinske mutacije.

[0087] Molekul antitela može da sadrži:

(i) VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 95% ili 98% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom VH domena prikazanom u tabeli 16 za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njenu verziju modifikovanu prema sekvenci klicine linije; i

(ii) VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 95% ili 98% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom VL domena prikazanom u tabeli 16 za bilo koje od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njenu verziju modifikovanu prema sekvenci klicine linije.

[0088] On može da sadrži VH domen i VL domen najmanje 90%, 95% ili 98% identičan sa VH domenom i VL domenom, redom, bilo kog od Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 i Abet0382, ili njihove verzije modifikovane prema sekvenci klicine linije.

[0089] Vezujući element može da sadrži VH domen i VL domen u kome;

(i) aminokiselinska sekvenca VH domena je prikazana u SEQ ID NO: 524 i aminokiselinska sekvenca VL domena prikazana je u SEQ ID NO: 533.

2

(ii) aminokiselinska sekvenca VH domena ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO: 524 i aminokiselinska sekvenca VL domena ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO: 533; ili

(iii) aminokiselinska sekvenca VH domena ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 524 i aminokiselinska sekvenca VL domena ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 533.

[0090] U nekim primerima izvođenja, molekulu antitela mogu da nedostaju konstantni regioni antitela, na primer scFv.

[0091] U drugim primerima izvođenja, molekul antitela može da sadrži konstantni region antitela. Molekul antitela može da bude celo antitelo kao što je IgG, tj. IgG1, IgG2, ili IgG4, ili može da bude fragment ili derivat antitela, kao što je opisano ispod. Molekuli antitela mogu takođe da imaju druge formate, npr. IgG1 sa YTE (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunology, 169: 5171-5180; Dall'Acqua et al. (2006) J Biol. Chem. 281 (33):23514-24) i/ili TM mutacije (Oganesyan et al. (2008) Acta Cryst D64:700-4) u Fc regionu.

[0092] Predmetno otkriće obezbeđuje vezujući element predmetnog otkrića sa varijantom Fc regiona, u kome varijanta sadrži fenilalaninsku (F) reziduu na poziciji 234, fenilalaninsku (F) reziduu ili reziduu glutaminske kiseline (E) na poziciji 235 i serinsku (S) reziduu na poziciji 331, numerisano EU indeksom kao što je prikazano kod Kabata. Takve kombinacije mutacija su u nastavku teksta označene kao trostruki mutant (TM).

[0093] Vezujući element kao što je ovde opisano može da sadrži CDR, VH domen, VL domen, antigen-vezujuće mesto antitela ili molekul antitela koji je kodiran sekvencom nukleinske kiseline i/ili vektor bilo kog od:

(i) deponovanog pristupnog broja NCIMB 41889 (Abet0007);

(ii) deponovanog pristupnog broja NCIMB 41890 (Abet0380-GL);

(iii) deponovanog pristupnog broja NCIMB 41891 (Abet0144-GL);

(iv) deponovanog pristupnog broja NCIMB 41892 (Abet0377-GL).

[0094] Vezujući element kao što je ovde opisano može da bude proizveden ili pogodan za proizvodnju iz nukleinske kiseline, vektora ili ćelijske linije deponovanog pristupnog broja NCIMB 41889, 41890, 41891 ili 41892. Na primer, vezujući element može da bude proizvede ekspresijom nukleinske kiseline ili vektora ćelijske linije deponovanog pristupnog broja NCIMB 41890. Nukleinska kiselina ili vektor može da bude eksprimiran u pogodnom ekspresionom

2

sistemu. Alternativno, vezujući element može da bude eksprimiran u ćelijskoj liniji deponovanog pristupnog broja NCIMB 41889, 41890, 41891 ili 41892.

[0095] Aspekti predmetnog otkrića takođe obezbeđuju nukleinsku kiselinu koja kodira VH i/ili VL domene, koja je sadržana u ćelijskoj liniji pristupnog broja 41889, 41890, 41891 ili 41892; vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu, koja je sadržana u ćelijskoj liniji pristupnog broja 41889, 41890, 41891 ili 41892; i ćelije ili ćelijsku liniju pristupnog broja 41889, 41890, 41891 ili 41892.

[0096] Vezujući element prema predmetnom otkriću može da sadrži antigen-vezujuće mesto antitela ili molekul antitela koji kompetira za vezivanje sa humanim Aβ1-42 sa bilo kojim molekulom antitela kodiranim nukleinskom kiselinom deponovanom pod pristupnim brojem 41889, 41890, 41891 ili 41892, ili u molekulu antitela koji sadrži aminokiselinske sekvence VH domena i VL domena iz Abet007, Abet0380-GL, Abet0144-GL ili Abet0377-GL kao što je prikazano u priloženom listingu sekvenci.

Vezujući element

[0097] Pojam vezujući element opisuje jedan element para molekula koji se vezuju jedan za drugi. Elementi vezujućeg para mogu da budu prirodnog porekla ili potpuno ili delimično sintetski proizvedeni. Jedan element para molekula ima oblast na svojoj površini, ili udubljenje, koje se vezuje sa, i stoga je komplementarno, određenoj prostornoj i polarnoj organizaciji drugog elementa para molekula. Primeri tipova vezujućih parova su antigen-antitelo, biotin-avidin, hormon-hormonski receptor, receptor-ligand, enzim-supstrat. Predmetno otkriće se bavi reakcijama tipa antigen-antitelo.

[0098] Vezujući element normalno sadrži molekul koji ima antigen-vezujuće mesto. Na primer, vezujući element može da bude molekul antitela ili protein koji nije antitelo koji sadrži antigenvezujuće mesto.

[0099] Antigen-vezujuće mesto može da bude obezbeđeno uređenjem CDR regiona na proteinskim skafoldima koji ne potiču od antitela, kao što je fibronektin ili citohrom B itd. [Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469i], ili randomizacijom ili mutiranjem aminokiselinskih rezidua petlje unutar proteinskog skafolda da bi se postigla specifičnost vezivanja za željeni cilj. Skafoldi za konstruisanje novih vezujućih mesta u proteinima detaljno su prikazani kod Nygren et al. [iznad]. Proteinski skafoldi za imitiranje antitela opisani su u WO00/34784, u kome pronalazači opisuju proteine (koji imitiraju antitelo) koji uključuju domen fibronektina tipa III koji ima najmanje jednu randomizovanu petlju.

Pogodni skafold u koji se kalemi jedan ili više CDR regiona, npr. set HCDR regiona ili HCDR3 i/ili LCDR3, može da bude snabdeven bilo kojim domenom koji je član superfamilije imunoglobulinskih gena. Skafold može da bude humani ili nehumani protein. Prednost proteinskog skafolda koji ne potiče od antitela je to što on može da obezbedi antigen-vezujuće mesto u molekulu skafolda koje je manje i/ili se lakše proizvodi od bar nekih molekula antitela. Mala veličina vezujućeg elementa može da doprinese korisnim fiziološkim svojstvima, kao što je sposobnost ulaska u ćelije, prodiranje duboko u tkiva ili dostizanje ciljnih molekula unutar drugih struktura, ili vezivanje unutar udubljenja proteina ciljnog antigena. Upotreba antigenvezujućih mesta u proteinskim skafoldima koji ne potiču od antitela prikazana je u Wess, 2004 [Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004]. Tipični su proteini koji imaju stabilan osnovni lanac i jednu ili više varijabilnih petlji, u kojima je aminokiselinska sekvenca petlje ili petlji specifično ili nasumično mutirana da bi se stvorilo antigen-vezujuće mesto koje vezuje ciljni antigen. Takvi proteini uključuju IgG-vezujuće domene proteina A iz S. aureus, transferin, tetranektin, fibronektin (npr.10. domen fibronektina tipa III), lipokaline, kao i gama-kristalin i druge Affilin™ skafolde (Scil Proteins). Primeri drugih pristupa uključuju sintetska "mikro-tela" zasnovana na ciklotidima - malim proteinima koji imaju unutarmolekulske disulfidne veze, mikroproteine (Versabodies™, Amunix) i proteine sa ankirinskim ponovcima (DARPins, Molecular Partners).

[0100] Pored sekvence antitela i/ili antigen-vezujućeg mesta, vezujući element može da sadrži druge aminokiseline, npr. one koje formiraju peptid ili polipeptid, kao što je savijeni domen, ili dodaju molekulu još jednu funkcionalnu karakteristiku, pored sposobnosti vezivanja antigena. Vezujući elementi mogu da nose detektabilnu oznaku, ili mogu da budu konjugovani sa toksinom ili usmerenim fragmentom ili enzimom (npr. preko peptidne veze ili linkera). Na primer, vezujući element može da sadrži katalitičko mesto (npr. u enzimskom domenu), kao i antigen-vezujuće mesto, pri čemu antigen-vezujuće mesto vezuje antigen i prema tome usmerava katalitičko mesto prema antigenu. Katalitičko mesto može da inhibira biološku funkciju antigena, npr. cepanjem.

[0101] Iako, kao što je navedeno, CDR regione mogu da nose skafoldi koji ne potiču od antitela, struktura koja nosi CDR, npr. CDR3, ili set CDR regiona predmetnog otkrića uopšteno će biti sekvenca teškog ili lakog lanca antitela ili njen suštinski deo u kome je CDR ili set CDR regiona smešten na lokaciji koja odgovara CDR ili setu CDR regiona prirodnih VH i VL varijabilnih domena antitela kodirana preuređenim imunoglobulinskim genima. Strukture i lokacije imunoglobulinskih varijabilnih domena mogu da budu određene prema Kabat, et al., 1987 [Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987] i njihovim ispravkama. Brojni akademski i komercijalni

1

onlajn izvori dostupni su za pretraživanje baze podataka. Na primer, videti Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133 i povezane onlajn izvore, trenutno na veb adresi http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html.

[0102] Pojam CDR region ili CDR, namenjen je da označi hipervarijabilne regione teškog i lakog lanca imunoglobulina kao što je definisano kod Kabat et al.1991 [Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington], i u kasnijim izdanjima. Antitelo tipično sadrži 3 CDR regiona teškog lanca i 3 CDR regiona lakog lanca. Pojam CDR ili CDR regioni u ovom dokumentu se koristi da označi, u zavisnosti od slučaja, jedan od ovih regiona ili nekoliko, ili čak sve, od ovih regiona koji sadrže većinu aminokiselinskih rezidua odgovornih za afinitetno vezivanje antitela sa antigenom ili epitopom koji ono prepoznaje.

[0103] Među šest kratkih CDR sekvenci, treći CDR teškog lanca (HCDR3) ima veću varijabilnost dužine (veća raznolikost u osnovi zbog mehanizama raspoređivanja gena koji je povećava). On može da ima samo 2 aminokiseline, mada je njegova najveća poznata dužina 26. Dužina CDR može takođe da varira u skladu sa dužinom koja može da se smesti na konkretan okvirni region u njegovoj osnovi. Funkcionalno, HCDR3 delimično ima ulogu u određivanju specifičnosti antitela (Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233:747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342:877- 883, 1989; Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 199; Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; i Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).

Molekul antitela

[0104] Pojam opisuje imunoglobulin koji je bilo prirodan, ili delimično ili potpuno sintetski proizveden. Pojam takođe obuhvata bilo koji polipeptid ili protein koji sadrži antigen-vezujuće mesto antitela. Ovde treba razumeti da se predmetno otkriće ne odnosi na antitela u prirodnom obliku, odnosno, da ona nisu u svom prirodnom okruženju, ali su mogla da budu izolovana ili dobijena prečišćavanjem iz prirodnih izvora, ili drugačije dobijena genetskom rekombinacijom, ili hemijskom sintezom, i da ona mogu tada da sadrže neprirodne aminokiseline kao što će kasnije biti opisano. Fragmenti antitela koji sadrže antigen-vezujuće mesto antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, molekule kao što su Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb i Fd. Različiti drugi molekuli antitela koji uključuju jedno ili više antigen-vezujućih mesta antitela su konstruisani, uključujući na primer Fab2, Fab3, di-antitela, tri-antitela, tetra-antitela i mini-tela. Molekuli

2

antitela i postupci za njihovo konstruisanje i upotreba opisani su kod Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9): 1126-11362005.

[0105] Moguće je uzeti monoklonska i druga antitela i upotrebiti tehnike rekombinantne DNK tehnologije da bi se proizvela druga antitela ili himerni molekuli koji vezuju ciljni antigen. Takve tehnike mogu da uključuju uvođenje DNK koja kodira varijabilni region imunoglobulina, ili CDR regione antitela u konstantne regione, ili konstantne regione i okvirne regione, drugačijeg imunoglobulina. Videti, na primer, EP-A-184187, GB 2188638A ili EP-A-239400, i brojnu povezanu literaturu. Hibridom ili druge ćelije koje proizvode antitelo mogu da budu podvrgnute genetskoj mutaciji ili drugim promenama, koje mogu, ali ne moraju da izmene specifičnost vezivanja proizvedenog antitela.

[0106] Budući da antitela mogu da budu modifikovana na brojne načine, pojam "molekul antitela" treba shvatiti tako da obuhvata bilo koji vezujući element ili supstancu koja ima antigen-vezujuće mesto antitela sa traženom specifičnošću i/ili se vezuje za antigen. Prema tome, ovaj pojam obuhvata fragmente i derivate antitela, uključujući bilo koji polipeptid koji sadrži antigen-vezujuće mesto antitela, bilo prirodan, ili potpuno ili delimično sintetski. Prema tome, obuhvaćeni su himerni molekuli koji sadrže antigen-vezujuće mesto antitela, ili ekvivalent, fuzionisan sa drugim polipeptidom (npr. poreklom od druge vrste ili koji pripada drugoj klasi ili potklasi antitela). Kloniranje i ekspresija himernih antitela opisano je u EP-A-0120694 i EP-A-0125023, i brojnoj povezanoj literaturi.

[0107] Sledeće tehnike dostupne u oblasti konstruisanja antitela omogućile su izolovanje humanih i humanizovanih antitela. Na primer, humani hibridomi mogu da se naprave kao što je opisano kod Kontermann & Dubel [Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545]. Prikaz na fagu, još jedna tehnika uspostavljena za stvaranje vezujućih elemenata, detaljno je opisana u mnogim publikacijama, kao što je Kontermann & Dubel [iznad] i WO92/01047 (dodatno razmatrana u tekstu ispod), i SAD patenti US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404.

[0108] Transgeni miševi u kojima su geni za mišje antitelo inaktivirani i funkcionalno zamenjeni genima humanog antitela, dok su ostale komponente mišjeg imunskog sistema netaknute, mogu da se koriste za izolovanje humanih antitela [Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156]. Humanizovana antitela mogu da se proizvedu upotrebom tehnika poznatih u ovoj oblasti, kao što su one opisane, na primer, u WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 i WO93/17105. Dalje, WO2004/006955 opisuje postupke za humanizaciju antitela, zasnovane na selekciji sekvenci okvirnih regiona varijabilnog regiona iz gena za humano antitelo poređenjem tipova kanonskih CDR struktura za CDR sekvence varijabilnog regiona nehumanog antitela sa tipovima kanonskih CDR struktura za odgovarajuće CDR regione iz biblioteke sekvenci humanih antitela, npr. genskih segmenata klicine linije koji kodiraju antitela. Varijabilni regioni humanog antitela koji imaju slične tipove kanonskih CDR struktura kao nehumani CDR regioni obrazuju podgrupe članova sekvenci humanog antitela iz kojih treba izabrati sekvence humanog okvirnog regiona. Članovi podgrupe mogu da budu dalje rangirani prema sličnosti aminokiselina između humanih i nehumanih CDR sekvenci. U postupku prema WO2004/006955, odabiraju se najbolje rangirane humane sekvence da obezbede sekvence okvirnog regiona za konstruisanje himernog antitela koje funkcionalno zamenjuju humane CDR sekvence nehumanim CDR ekvivalentima upotrebom odabranog člana podgrupe humanih okvirnih regiona, obezbeđujući tako humanizovano antitelo visokog afiniteta i niske imunogenosti, bez potrebe za poređenjem sekvenci okvirnog regiona između nehumanih i humanih antitela. Himerna antitela napravljena ovim postupkom su takođe opisana.

[0109] Sintetski molekuli antitela mogu da budu stvoreni ekspresijom sa gena generisanih pomoću oligonukleotida sintetisanih i sklopljenih unutar pogodnih ekspresionih vektora, na primer kao što je opisano kod Knappik et al. [Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86] ili Krebs et al. [Krebs et al. Journal of Immunological Methods 2542001 67-84].

[0110] Pokazano je da fragmenti celog antitela mogu da ostvare funkciju vezivanja antigena. Primeri vezujućih fragmenata su (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iii) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog antitela; (iv) dAb fragment [Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], koji se sastoji od VH ili VL domena; (v) izolovani CDR regioni; (vi) F(ab')2 fragmenti, bivalentni fragment koji sadrži dva vezana Fab fragmenta (vii) jednolančani Fv molekuli (scFv), u kojima su VH domen i VL domen vezani peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena povežu tako da obrazuju antigen-vezujuće mesto [Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]; (viii) bispecifični jednolančani Fv dimeri (PCT/US92/09965) i (ix) "di-antitela", multivalentni ili multispecifični fragmenti konstruisani genskom fuzijom (WO94/13804; Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993). Molekuli Fv, scFv ili di-antitela mogu da budu stabilizovani ugradnjom disulfidnih mostova koji vezuju VH i VL domene [Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]. Mini-tela koja sadrže scFv spojen sa CH3 domenom mogu takođe da se naprave [Hu, S. et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]. Drugi primeri vezujućih fragmenata su Fab', koji se razlikuju od Fab fragmenata po dodatku nekoliko rezidua na karboksilnom kraju CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela, i Fab'-SH,

4

koji predstavlja Fab' fragment u kome cisteinska rezidua/rezidue konstantnog domena nose slobodnu tiol-grupu.

[0111] Qui et al. [Qui et al., Nat. Biotechnol. 25:921-929 2007] su opisali molekule antitela koji sadrže samo dva CDR regiona povezana okvirnim regionom. CDR3 iz VH ili VL domena vezan je za CDR1 ili CDR2 petlju drugog domena. Vezivanje je ostvareno preko C-terminalnog kraja odabranog CDR1 ili CDR2 za N-terminalni kraj CDR3, preko FR regiona. Qui et al. su odabrali FR region koji ima najmanje hidrofobnih zakrpa. Nađeno je da je najbolja kombinacija za ispitivano antitelo VL CDR1 vezan pomoću VH FR2 za VH CDR3 (VHCDR1-VHFR2-VLCDR3). Sa molekulskom težinom od oko 3 kDa, ovi molekuli antitela nude prednosti u smislu poboljšanog prodiranja u tkivo u poređenju sa celim imunoglobulinima (pribl. 150 kDa) ili scFv (pribl.28 kDa).

[0112] Fragmenti antitela predmetnog otkrića mogu da se dobiju polazeći od bilo kog od ovde navedenih antitela, postupcima kao što je enzimska digestija, npr. pepsinom ili papainom i/ili cepanjem disulfidnih mostova hemijskom redukcijom. Na drugi način, fragmenti antitela obuhvaćeni predmetnim otkrićem mogu da se dobiju tehnikama genetske rekombinacije kao što je dobro poznato stručnjacima u datoj oblasti ili drugačije, peptidnom sintezom pomoću, na primer, automatskih uređaja za sintezu peptida, kao što su oni kompanije Applied Biosystems, itd., ili sintezom i ekspresijom nukleinske kiseline.

[0113] Funkcionalni fragmenti antitela prema predmetnom otkriću uključuju bilo koji funkcionalni fragment čiji polu-život je povećan hemijskom modifikacijom, posebno PEGilacijom, ili ugradnjom u lipozom.

[0114] dAb (domensko antitelo) je mali monomerni antigen-vezujući fragment antitela, naime varijabilni region teškog ili lakog lanca antitela. VH dAbs se prirodno javljaju kod kamelida (npr., kamila, lama) i mogu da se proizvedu imunizacijom kamelida ciljnim antigenom, izolovanjem antigen-specifičnih B ćelija i direktnim kloniranjem gena koji kodiraju dAb iz pojedinačnih B ćelija. dAbs takođe mogu da se proizvedu u ćelijskoj kulturi. Njihova mala veličina, dobra rastvorljivost i temperaturna stabilnost čini ih posebno fiziološki korisnim i pogodnim za selekciju i sazrevanje afiniteta. VH dAbs kamelida su razvijena za terapijsku upotrebu pod nazivom "nanobodies™". Vezujući element predmetnog otkrića može da bude dAb koje sadrži VH ili VL domen suštinski kao što je prikazano u ovom dokumentu, ili VH ili VL domen koji sadrži set CDR regiona suštinski kao što je prikazano u ovom dokumentu.

[0115] Bispecifična ili bifunkcionalna antitela formiraju drugu generaciju monoklonskih antitela u kojoj su dva različita varijabilna regiona kombinovana u istom molekulu [Holliger and Bohlen (1999) Cancer and Metastasis Rev. 18: 411-419]. Njihova upotreba demonstrirana je i na polju dijagnostike, i na polju terapije zbog njihove sposobnosti regrutovanja novih efektorskih funkcija ili ciljnog delovanja na nekoliko molekula na površini tumorskih ćelija. Kada treba da se koriste bispecifična antitela, ona mogu da budu konvencionalna bispecifična antitela, koja mogu da se proizvedu na razne načine [Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449.

1993], npr., hemijski ili iz hibridnih hibridoma, ili mogu da budu bilo koji od gore pomenutih bispecifičnih fragmenata antitela. Ova antitela mogu da se dobiju hemijskim metodama [Glennie M J et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382] ili somatskim metodama [Staerz U. D. and Bevan M. J. 1986 PNAS 83; Suresh M. R. et al., 1986 Methods Enzymol. 121: 210-228] ali isto tako poželjnim tehnikama genetskog inženjeringa koje omogućavaju da heterodimerizacija bude forsirana i prema tome olakšavaju postupak prečišćavanja traženog antitela [Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681]. Primeri bispecifičnih antitela uključuju ona dobijena BiTE™ tehnologijom u kojoj vezivanje domena dva antitela sa različitim specifičnostima mogu da se upotrebe i direktno vežu preko kratkih fleksibilnih peptida. Ovo kombinuje dva antitela na kratkom jednolančanom polipeptidu. Diantitela i scFv mogu da budu konstruisana bez Fc regiona, upotrebom samo varijabilnih domena, što potencijalno redukuje dejstva antiidiotipske reakcije.

[0116] Bispecifična antitela mogu da budu konstruisana kao ceo IgG, kao bispecifični Fab'2, kao Fab'PEG, kao di-antitela ili drugačije kao bispecifični scFv. Dalje, dva bispecifična antitela mogu da se povežu upotrebom rutinskih postupaka poznatih u ovoj oblasti da bi obrazovala tetravalentna antitela.

[0117] Bispecifična di-antitela, nasuprot bispecifičnim celim antitelima, mogu takođe da budu posebno korisna jer mogu lako da se konstruišu i eksprimiraju u E. coli. Di-antitela (i mnogi drugi polipeptidi, kao fragmenti antitela) sa odgovarajućim specifičnostima vezivanja mogu lako da se selektuju upotrebom prikaza na fagu (WO94/13804) iz biblioteka. Ako jedna ručica diantitela treba da se održi konstantnom, na primer, sa specifičnošću usmerenom prema betaamiloidu kao što je ovde opisano, tada može da se napravi biblioteka u kojoj se druga ručica varira i selektuje antitelo odgovarajuće specifičnosti. Bispecifična cela antitela mogu da se naprave alternativnim postupcima za konstruisanje opisanim kod Ridgeway et al., 1996 [Ridgeway, J. B. B. et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996].

[0118] U stanju tehnike dostupni su različiti postupci za dobijanje antitela. Antitela mogu da budu monoklonska antitela, posebno humanog, mišjeg, himernog ili humanizovanog porekla, i mogu da se dobiju standardnim postupcima koji su dobro poznati stručnjaku u datoj oblasti.

[0119] Uopšteno, za pripremu monoklonskih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata, posebno mišjeg porekla, može se pozvati se na tehnike koje su posebno opisane u uputstvu "Antibodies" [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp.726, 1988] ili tehniku pripreme iz hibridoma opisanu kod Köhler i Milstein [Köhler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975].

[0120] Monoklonska antitela mogu da se dobiju, na primer, iz ćelije životinje imunizovane humanim Aβ1-42, ili jednim od njegovih fragmenata koji sadrže epitop koji prepoznaju navedena monoklonska antitela, npr. Aβ17-42. Pogodni fragmenti i peptidi ili polipeptidi koji ih sadrže opisani su u ovom dokumentu, i mogu da se upotrebe za imunizaciju životinja za stvaranje antitela protiv Aβ1-42. Navedeni antigen, ili jedan od njegovih fragmenata, može posebno da se proizvede uobičajenim postupcima rada, genetskom rekombinacijom polazeći od sekvence nukleinske kiseline sadržane u cDNK sekvenci koja kodira Aβ1-42 ili njegov fragment, sintezom peptida polazeći od sekvence aminokiselina sadržanih u peptidnoj sekvenci Aβ1-42 i/ili njegovog fragmenta.

[0121] Monoklonska antitela mogu, na primer, da budu prečišćena na afinitetnoj koloni na kojoj je humani Aβ1-42 ili jedan od njegovih fragmenata koji sadrži epitop koji prepoznaju navedena monoklonska antitela, npr. Aβ17-42, prethodno imobilisan. Konkretnije, monoklonska antitela mogu da budu prečišćena hromatografijom na proteinu A i/ili G, praćenom, ili ne, jonoizmenjivačkom hromatografijom namenjenom da ukloni zaostale proteinske kontaminante, kao i DNK i LPS, u njemu, praćenom, ili ne, ekskluzionom hromatografijom na sefaroznom gelu u cilju uklanjanja eventualnih agregata zbog prisustva dimera ili drugih multimera. U jednom primeru izvođenja, sve ove tehnike mogu da se koriste istovremeno ili uzastopno.

Antigen-vezujuće mesto

[0122] Ovaj pojam opisuje deo molekula koji se vezuje za ciljni antigen, i komplementaran je celom ili delu ciljnog antigena. U molekulu antitela, odnosi se na antigen-vezujuće mesto antitela, i sadrži deo antitela koji se vezuje za, i komplementaran je celom ili delu ciljnog antigena. Kada je antigen velik, antitelo može da se veže samo za određeni deo antigena, koji je označen kao epitop. Antigen-vezujuće mesto antitela može da bude obezbeđeno pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela. Antigen-vezujuće mesto antitela može da sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) antitela i varijabilni region teškog lanca (VH) antitela.

[0123] WO 2006/072620 opisuje konstruisanje antigen-vezujućih mesta u strukturnim (ne-CDR) petljama koje se pružaju između beta lanaca imunoglobulinskih domena. Antigen-vezujuće mesto može da bude konstruisano u regionu molekula antitela odvojenom od prirodne lokacije CDR regiona, npr. u okvirnom regionu VH ili VL domena, ili u konstantnom domenu antitela, npr., CH1 i/ili CH3. Antigen-vezujuće mesto konstruisano u strukturnom regionu može da bude uvedeno dodatno, ili umesto, antigen-vezujućeg mesta koje formiraju setovi CDR regiona VH i VL domena. Kada su prisutna višestruka antigen-vezujuća mesta u molekulu antitela, ona mogu da vezuju isti antigen (ciljni antigen), povećavajući tako valencu vezujućeg elementa. Alternativno, višestruka antigen-vezujuća mesta mogu da vezuju različite antigene (ciljni antigen i jedan ili više drugih antigena), i ovo može da se upotrebi za dodavanje efektorskih funkcija, produžavanje polu-života ili poboljšanje in vivo isporuke molekula antitela.

Izolovani

[0124] Ovaj pojam odnosi se na stanje u kome će vezujući elementi predmetnog otkrića, ili nukleinska kiselina koja kodira takve vezujuće elemente, biti uopšteno u skladu sa predmetnim otkrićem. Prema tome, vezujući elementi, VH i/ili VL domeni, i kodirajući molekuli nukleinske kiseline i vektori prema predmetnom otkriću mogu da budu obezbeđeni i/ili prečišćeni, npr. iz njihovog prirodnog okruženja, u suštinski istom ili homogenom obliku, ili, u slučaju nukleinske kiseline, bez, ili suštinski bez nukleinske kiseline ili gena drugačijeg porekla od sekvence koja kodira polipeptid sa traženom funkcijom. Izolovani elementi i izolovana nukleinska kiselina biće bez, ili suštinski bez materijala sa kojim su prirodno povezani, kao što su drugi polipeptidi ili nukleinske kiseline sa kojim se mogu naći u prirodnom okruženju, ili okruženju u kome su pripremljeni (npr. ćelijska kultura) kada je takva priprema pomoću rekombinantne DNK tehnologije sprovedene in vitro ili in vivo. Elementi i nukleinska kiselina mogu da budu formulisani sa razblaživačima ili adjuvansima i dalje u praktične svrhe izolovani - na primer elementi će normalno biti pomešani sa želatinom ili drugim nosačima ako se koriste za oblaganje mikrotitar-ploča za upotrebu u imunološkim testovima, ili će biti pomešani sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima kada se koriste u dijagnostici ili terapiji. Vezujući elementi mogu da budu glikozilisani, prirodno ili pomoću sistema heterologih eukariotskih ćelija (npr. CHO ili NS0 (ECACC 85110503) ćelija, ili mogu da budu (na primer ako su proizvedeni ekspresijom u prokariotskim ćelijama) neglikozilisani.

[0125] Heterogeni preparati koji sadrže molekule antitela takođe čine deo predmetnog otkrića. Na primer, takvi preparati mogu da budu smeše antitela sa teškim lancima cele dužine i teškim lancima kojima nedostaje C-terminalni lizin, sa različitim stepenima glikozilacije i/ili sa derivatizovanim aminokiselinama, kao što je ciklizacija N-terminalne glutaminske kiseline da bi se obrazovala rezidua piroglutaminske kiseline.

[0126] Kako se ovde koristi, izraz "suštinski kako je navedeno" odnosi se na to da će karakteristika/karakteristike relevantnih CDR regiona VH ili VL domena vezujućih elemenata kao što je ovde opisano biti ili identične, ili veoma slične navedenim regionima čija je sekvenca navedena u ovom dokumentu. Kao što je ovde opisano, pod izrazom "veoma sličan" u odnosu na naznačeni region/regione jednog ili više varijabilnih domena, podrazumeva se da 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih supstitucija mogu da budu uvedene u CDR i/ili VH ili VL domen.

[0127] Kao što je gore navedeno, vezujući element u skladu sa predmetnim otkrićem vezuje humani Aβ1-42. Kao što je ovde opisano, vezujući elementi predmetnog otkrića mogu da budu optimizovani u pogledu afiniteta i/ili aktivnosti inhibicije u HTRF™ testu kompeticije. Uopšteno, aktivnost optimizacije uključuje mutiranje sekvence odabranog vezujućeg elementa (normalno sekvence varijabilnog domena antitela) za stvaranje biblioteke vezujućih elemenata, kojima se zatim ispituje aktivnost i odabiraju se aktivniji vezujući elementi. Prema tome, selektovani vezujući elementi "sa optimizovanom aktivnošću" imaju tendenciju da imaju veću aktivnost nego vezujući element iz koga je biblioteka stvorena. Pored toga, veća aktivnost vezujućih elemenata može da se dobije bez optimizacije, na primer vezujući element sa velikom aktivnošću može da se dobije direktno iz početnog skrininga. Testovi i aktivnosti su detaljnije opisani na drugom mestu u ovom dokumentu. Stručnjak u datoj oblasti može prema tome da stvori vezujuće elemente koji imaju veliku aktivnost.

[0128] U sledećem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za dobijanje jednog ili više vezujućih elemenata koji mogu da vežu antigen, gde postupak uključuje dovođenje u kontakt biblioteke vezujućih elemenata prema predmetnom otkriću i navedenog antigena, i odabir jednog ili više vezujućih elemenata biblioteke koji mogu da vežu navedeni antigen.

[0129] Biblioteka može da bude prikazana na česticama ili molekulskim kompleksima, npr. genetskim paketima koji mogu da se repliciraju, kao što je kvasac, čestice bakterija ili bakteriofaga (npr. T7), virusi, ćelije ili kovalentni, ribozomalni ili drugi in vitro sistemi za prikaz, gde svaka čestica ili molekulski kompleks sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira VH varijabilni domen antitela prikazan na njemu, i opciono takođe prikazani VL domen, ako je prisutan. Prikaz na fagu opisan je u WO92/01047 i npr. SAD patentima US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 i US6521404, od kojih je svaki u celosti obuhvaćen ovim dokumentom po referenci. Ribozomalni prikaz opisan je kod Hanes J and Plückthun A. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 May 13;94(10):4937-42; WO01/75097 i WO2006/072773, od kojih je svaki u celosti obuhvaćen ovim dokumentom po referenci.

[0130] Nakon selekcije vezujućih elemenata koji mogu da vežu antigen i prikazivanja na bakteriofagu ili drugim česticama ili molekulskim kompleksima biblioteke, nukleinska kiselina može da bude izdvojena iz bakteriofaga ili druge čestice ili molekulskog kompleksa koji ispoljava navedeni selektovani vezujući element. Takva nukleinska kiselina može da se upotrebi u narednoj proizvodnji vezujućeg elementa ili VH ili VL varijabilnog domena antitela ekspresijom sa nukleinske kiseline sa sekvencom nukleinske kiseline uzete iz bakteriofaga ili druge čestice ili molekulskog kompleksa koji ispoljava navedeni selektovani vezujući element.

[0131] VH varijabilni domen antitela sa aminokiselinskom sekvencom VH varijabilnog domena antitela navedenog selektovanog vezujućeg elementa može da bude obezbeđen u izolovanom obliku, kao i vezujući element koji sadrži takav VH domen.

[0132] Sposobnost vezivanja humanog Aβ1-42 i Aβ1-40 može da bude dodatno ispitana, kao i sposobnost kompeticije sa, npr., bilo kojim od ovde navedenih antitela (npr. u scFv formatu i/ili IgG formatu, npr. IgG2 ili IgG1) za vezivanje za humani Aβ1-42. Može da se ispita i sposobnost neutralizacije Aβ1-42, kao što je razmatrano kasnije u ovom dokumentu.

[0133] Vezujući element može da veže humani Aβ1-42 sa afinitetom bilo kog od antitela navedenih u tabelama 5 i 6, npr. scFv, IgG2, IgG1TM ili IgG1, ili sa afinitetom koji je bolji. Afiniteti vezivanja antitela prikazani su u tabeli 7. Afinitet vezivanja i aktivnost neutralizacije koju imaju različiti vezujući elementi mogu da se ispitaju pod odgovarajućim uslovima.

[0134] Varijante VH i VL domena i CDR regiona koje su ovde opisane, uključujući one za koje su ovde naznačene aminokiselinske sekvence, i koje mogu da se koriste u vezujućim elementima za Aβ1-42 mogu da se dobiju pomoću postupaka izmene ili mutacije sekvence i skrininga za antigen-vezujuće elemente sa željenim karakteristikama. Primeri željenih karakteristika uključuju, ali nisu ograničeni na: povećan afinitet vezivanja za antigen u odnosu na poznata antitela koja su specifična za antigen, povećanu neutralizaciju aktivnosti antigena u odnosu na poznata antitela koja su specifična za antigen ako je aktivnost poznata, naznačena kompetitivna sposobnost sa poznatim antitelom ili ligandom za antigen u specifičnom molarnom odnosu, sposobnost imunoprecipitacije kompleksa, sposobnost vezivanja za naznačeni epitop: linearni epitop, npr., peptidnu sekvencu identifikovanu upotrebom skeniranja vezivanja peptida kao što je ovde opisano, npr., upotrebom peptida podvrgnutih skriningu u linearnoj i/ili ograničenoj konformaciji, ili konformacioni epitop, formiran pomoću rezidua koje nisu kontinuirane; i sposobnost modulacije nove biološke aktivnosti humanog Aβ1-42. Takvi postupci su takođe obezbeđeni u ovom dokumentu.

[0135] Ovde opisane varijante molekula antitela mogu da budu proizvedene i upotrebljene u predmetnom otkriću. Koristeći računarsku hemiju u primeni tehnika analize multivarijantnih podataka na odnose struktura/svojstvo-aktivnost [videti na primer, Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski); D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6] kvantitativni odnosi aktivnost-svojstvo antitela mogu da budu izvedeni upotrebom dobro poznatih matematičkih tehnika, kao što je statistička regresija, prepoznavanje obrasca i klasifikacija [videti na primer Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience;

4

3rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828; Kandel, Abraham et al. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847; Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000), ISBN: 0198507089; Witten, Ian H. et al Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999), ISBN: 1558605525; Denison David G. T. (Editor) et al Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369; Ghose, Arup K. et al. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8]. Svojstva antitela mogu da se izvedu iz empirijskih i teoretskih modela (na primer, analiza verovatnih kontaktnih rezidua ili izračunato fizikohemijsko svojstvo) sekvence, funkcionalnih i trodimenzionalnih struktura antitela, i ova svojstva mogu da se razmatraju pojedinačno i u kombinaciji.

[0136] Antigen-vezujuće mesto antitela sačinjeno od VH domena i VL domena tipično formira šest petlji polipeptida: tri iz varijabilnog domena lakog lanca (VL) i tri iz varijabilnog domena teškog lanca (VH). Analiza antitela poznate atomske strukture razjasnila je odnose između sekvence i trodimenzionalne strukture paratopa [Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948]. Ovi odnosi impliciraju da, osim kod trećeg regiona (petlje) u VH domenima, petlje vezujućeg mesta imaju jednu od malog broja konformacija glavnog lanca: kanonske strukture. Pokazalo se da je kanonska struktura formirana u određenoj petlji određena njenom veličinom i prisustvom određenih rezidua na ključnim mestima u petlji, kao i u okvirnim regionima.

[0137] Ova studija odnosa sekvenca-struktura može da se koristi za predviđanje onih rezidua u antitelu poznate sekvence, ali nepoznate trodimenzionalne strukture, koje su važne za održavanje trodimenzionalne strukture njegovih CDR petlji i stoga za održavanje specifičnosti vezivanja. Ova predviđanja mogu se podupreti poređenjem predviđanja sa rezultatima preliminarnih eksperimenata optimizacije. U strukturnom pristupu, može da se napravi model molekula antitela [Chothia, et al. Science, 223,755-758 (1986)] upotrebom besplatno dostupnog ili komercijalnog paketa, kao što je WAM [Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824]. Programski paket za vizualizaciju i analizu proteina, kao Insight II (Accelrys, Inc.) ili Deep View [Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723] mogu zatim da se koriste za procenu mogućih supstitucija na svakoj poziciji u CDR. Ova informacija može zatim da se koristi za uvođenje supstitucija koje bi mogle da imaju minimalno ili povoljno dejstvo na aktivnost.

[0138] Tehnike potrebne za uvođenje supstitucija u aminokiselinske sekvence CDR regiona, VH ili VL domena antitela i vezujućih elemenata uglavnom su dostupne u stanju tehnike. Mogu da budu napravljene varijante sekvenci, sa supstitucijama za koje može, ali ne mora da bude predviđeno da imaju minimalno ili povoljno dejstvo na aktivnost, i njihova sposobnost da vezuju Aβ1-42 i/ili bilo koje drugo željeno svojstvo može da bude ispitana.

[0139] Varijante aminokiselinske sekvence varijabilnog domena bilo kog od VH i VL domena čije su sekvence specifično opisane u ovom dokumentu mogu da se koriste u skladu sa predmetnim otkrićem, kao što se ovde razmatra.

[0140] Kao što je gore opisano, aspekti predmetnog otkrića obezbeđuju vezujući element, kao što je molekul antitela, koji sadrži VH domen koji ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa VH domenom bilo kog od antitela navedenih u ovom dokumentu, za koja su sekvence VH domena prikazane u priloženom listingu sekvenci ispod u tekstu; i/ili koji sadrži VL domen koji ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa VL domenom bilo kog od antitela navedenih u tabeli 11, za koja su sekvence VL domena prikazane u priloženom listingu sekvenci.

[0141] Aspekti predmetnog otkrića obezbeđuju vezujući element, kao što je molekul antitela, koji sadrži VH domen koji ima set VH CDR regiona koji imaju najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa setom VH CDR regiona bilo kog od antitela navedenih u ovom dokumentu, za koja su VH CDR sekvence prikazane u ovom dokumentu; i/ili koji sadrži VL domen koji ima set VL CDR regiona koji imaju najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa setom VL CDR regiona bilo kog od antitela navedenih u ovom dokumentu, za koja su VL CDR sekvence prikazane u ovom dokumentu.

[0142] Algoritmi koji mogu da se koriste za izračunavanje % identičnosti dve aminokiselinske sekvence uključuju npr. BLAST [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410], FASTA [Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448], ili Smith-Waterman algoritam [Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol.147: 195-197] npr., upotrebom zadatih parametara.

[0143] Određeni varijabilni domeni mogu da uključuju jednu ili više mutacija aminokiselinskih sekvenci (supstitucija, delecija, i/ili insercija aminokiselinske rezidue), i manje od oko 15 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili 2.

[0144] Mutacije mogu da se izvedu u jednom ili više okvirnih regiona i/ili jednom ili više CDR regiona. Mutacije normalno ne rezultuju gubitkom funkcije, tako da vezujući element koji sadrži na taj način izmenjenu aminokiselinsku sekvencu može da zadrži sposobnost da veže humani Aβ1-42. Može da zadrži isto kvantitativno vezivanje i/ili sposobnost neutralizacije kao vezujući element u kome izmena nije napravljena, npr., mereno ovde opisanim testovima. Vezujući element koji sadrži na taj način izmenjenu aminokiselinsku sekvencu može da ima poboljšanu sposobnost da veže humani Aβ1-42.

[0145] Mutacija može da sadrži zamenu jedne ili više aminokiselinskih rezidua neprirodnom ili nestandardnom aminokiselinom, modifikovanjem jedne ili više aminokiselinskih rezidua u neprirodnu ili nestandardnu formu, ili inserciju jedne ili više neprirodnih ili nestandardnih aminokiselina u sekvencu. Primeri broja i lokacija izmena u sekvencama predmetnog otkrića opisani su na drugom mestu u ovom dokumentu. Prirodne aminokiseline uključuju 20 "standardnih" L-aminokiselina identifikovanih kao G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E njihovim standardnim kodovima od jednog slova. Nestandardne aminokiseline uključuju bilo koju drugu reziduu koja može da bude ugrađena u osnovni polipeptidni lanac ili rezultuje iz modifikacije postojeće aminokiselinske rezidue. Nestandardne aminokiseline mogu da budu prirodne ili neprirodne. Nekoliko prirodnih nestandardnih aminokiselina je poznato u stanju tehnike, kao što su 4-hidroksiprolin, 5-hidroksilizin, 3-metilhistidin, N-acetilserin, itd.

[Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995]. One aminokiselinske rezidue koje su izmenjene na svojoj N-alfa poziciji biće smeštene samo na N-terminalnom kraju aminokiselinske sekvence. Normalno, u predmetnom otkriću aminokiselina je L-aminokiselina, ali to može da bude i D-aminokiselina. Izmene mogu prema tome da sadrže modifikaciju L-aminokiseline u, ili zamenu sa, D-aminokiselinom. Metilovane, acetilovane i/ili fosforilisane forme aminokiselina su takođe poznate, i aminokiseline u predmetnom otkriću mogu da budu predmet takvih modifikacija.

[0146] Aminokiselinske sekvence u domenima antitela i vezujućim elementima predmetnog otkrića mogu da sadrže ovde opisane neprirodne ili nestandardne aminokiseline. Nestandardne aminokiseline (npr. D-aminokiseline) mogu da budu ugrađene u aminokiselinsku sekvencu tokom sinteze, ili modifikacijom ili zamenom "originalne" standardne aminokiseline posle sinteze aminokiselinske sekvence.

[0147] Upotreba nestandardnih i/ili neprirodnih aminokiselina povećava strukturnu i funkcionalnu raznolikost, i može prema tome da poveća potencijal za postizanje željenog vezivanja i svojstava neutralizacije u vezujućem elementu predmetnog otkrića. Dodatno, pokazalo se da D-aminokiseline i analozi imaju različite farmakokinetičke profile u poređenju sa standardnim L-aminokiselinama, usled in vivo degradacije polipeptida koji imaju L-

4

aminokiseline posle primene kod životinje, npr., čoveka, što znači da D-aminokiseline imaju prednost kod nekih in vivo primena.

[0148] Novi VH ili VL regioni koji nose sekvence poreklom od CDR predmetnog otkrića mogu da budu generisane upotrebom nasumične mutageneze jednog ili više selektovanih VH i/ili VL gena za generisanje mutacija u celom varijabilnom domenu. Takva tehnika opisana je kod Gram et al. [Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580], u kojima je korišćen PCR sklon greškama. U nekim primerima izvođenja jedna ili dve aminokiselinske supstitucije su napravljene u celom varijabilnom domenu ili setu CDR regiona.

[0149] Još jedan metod koji može da se koristi je usmeravanje mutageneze u CDR regione VH ili VL gena. Takve tehnike su opisane kod Barbas et al. [Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813] i Schier et al. [Schier et al., 1996, J. Mol. Biol.263:551-567].

[0150] Sve gore opisane tehnike su poznate kao takve u datoj oblasti i stručnjak će moći da koristi takve tehnike da bi obezbedio vezujuće elemente predmetnog otkrića upotrebom rutinske metodologije u stanju tehnike.

[0151] Sledeći aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje postupak za dobijanje antigen-vezujućeg mesta antitela za humani Aβ1-42, pri čemu postupak sadrži obezbeđivanje putem supstitucije, delecije, ili insercije jedne ili više aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci VH domena prikazanog u ovom dokumentu, gde VH domen predstavlja varijantu aminokiselinske sekvence VH domena, opciono kombinujući VH domen koji je obezbeđen na taj način sa jednim ili više VL domena, i ispitivanje VH domena ili kombinacije ili kombinacija VH/VL u cilju identifikovanja vezujućeg elementa ili antigen-vezujućeg mesta antitela za Aβ1-42, i opciono, sa jednim ili više željenih svojstava. Navedeni VL domen može da ima aminokiselinsku sekvencu koja je suštinski kao što je ovde prikazano. Može da bude upotrebljen analogni postupak u kome se jedna ili više varijanti sekvence VL domena koji je ovde opisan kombinuju sa jednim ili više VH domena.

[0152] Kao što je gore navedeno, aminokiselinska sekvenca CDR suštinski kao što je ovde navedeno može da bude ugrađena kao CDR u varijabilni domen humanog antitela ili njegov suštinski deo. HCDR3 sekvence suštinski kao što je ovde prikazano predstavljaju primere izvođenja predmetnog otkrića i svaka od njih može da bude ugrađena kao HCDR3 u varijabilni domen humanog teškog lanca ili njegov suštinski deo.

[0153] Varijabilni domeni uključeni u predmetno otkriće mogu da budu dobijeni ili izvedeni iz bilo kog humanog varijabilnog domena klicine linije ili rearanžiranog humanog varijabilnog domena, ili mogu da predstavljaju sintetski varijabilni domen zasnovan na konsenzusnoj ili aktuelnoj sekvenci poznatih humanih varijabilnih domena. Varijabilni domen može da potiče iz nehumanog antitela. CDR sekvenca predmetnog otkrića (npr. CDR3) može da bude introdukovana u repertoar varijabilnih domena kojima nedostaje CDR (npr. CDR3), upotrebom rekombinantne DNK tehnologije. Na primer, Marks et al. [Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779-783] opisuju postupke za proizvodnju repertoara varijabilnih domena antitela u kojima se konsenzusni prajmeri usmereni na, ili susedni 5' kraju oblasti varijabilnog domena koriste zajedno sa konsenzusnim prajmerima za treći okvirni region humanih VH gena da bi se dobio repertoar VH varijabilnih domena kojima nedostaje CDR3. Marks et al. Dalje opisuju kako ovaj repertoar može da se kombinuje sa CDR3 određenog antitela. Upotrebom analognih tehnika, sekvence poreklom od CDR3 predmetnog otkrića mogu da budu pomešane sa repertoarima VH ili VL domena kojima nedostaje CDR3, i pomešani komplet VH ili VL domena kombinovan sa srodnim VL ili VH domenom da bi se dobili vezujući elementi predmetnog otkrića. Repertoar zatim može da bude prikazan na pogodnom sistemu domaćina, kao što je sistem prikaza na fagu prema WO92/01047, ili prema bilo kojoj od sledeće brojne literature, uključujući Kay, Winter & McCafferty [Kay, B.K., Winter, J., i McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press], tako da pogodni vezujući elementi mogu da budu selektovani. Repertoar može da se sastoji od bilo koliko od 10<4>individualnih elemenata naviše, na primer najmanje 10<5>, najmanje 10<6>, najmanje 10<7>, najmanje 10<8>, najmanje 10<9>ili najmanje 10<10>elemenata ili više. Drugi pogodni sistemi domaćina uključuju, ali nisu ograničeni na prikaz na kvascu, bakterijski prikaz, T7 prikaz, virusni prikaz, ćelijski prikaz, ribozomalni prikaz i kovalentni prikaz.

[0154] Obezbeđen je postupak za pripremu vezujućeg elementa za humani Aβ1-42, pri čemu postupak sadrži:

(a) obezbeđivanje polaznog repertoara nukleinskih kiselina koje kodiraju VH domen, koje ili uključuju CDR3 koji treba da bude zamenjen, ili nemaju region koji kodira CDR3; (b) kombinovanje navedenog repertoara sa donorskom nukleinskom kiselinom koja kodira aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je ovde prikazano za VH CDR3, na primer VH CDR3 prikazan u tabeli 11, tako da se navedena donorska nukleinska kiselina insertuje u CDR3 region u repertoaru, tako da obezbedi nastali repertoar nukleinskih kiselina koje kodiraju VH domen;

(c) eksprimiranje nukleinskih kiselina navedenog nastalog repertoara;

(d) selekciju vezujućeg elementa za humani Aβ1-42; i

(e) izdvajanje navedenog vezujućeg elementa ili nukleinske kiseline koja ga kodira.

4

[0155] Ponovo, može da se koristi analogni postupak u kome se VL CDR3 predmetnog otkrića kombinuje sa repertoarom nukleinskih kiselina koje kodiraju VL domen koje ili uključuju CDR3 koji treba da bude zamenjen, ili nemaju region koji kodira CDR3.

[0156] Slično, jedan ili više, ili sva tri CDR regiona mogu da budu nakalemljena u repertoar VH ili VL domena koji se zatim podvrgava skriningu za vezujući element ili vezujuće elemente za humani Aβ1-42.

[0157] Na primer, mogu da budu upotrebljeni HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3, npr., set HCDR regiona, iz jednog ili više antitela navedenih u tabeli 5 ili tabeli 6, i/ili mogu da budu upotrebljeni LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3, npr., set LCDR regiona, iz jednog ili više antitela navedenih u ovom dokumentu.

[0158] Slično, mogu da budu upotrebljeni drugi VH i VL domeni, setovi CDR regiona i setovi HCDR regiona i/ili setovi LCDR regiona opisanih u ovom dokumentu.

[0159] Suštinski deo varijabilnog domena imunoglobulina može da sadrži najmanje tri CDR regiona, zajedno sa njihovim umetnutim okvirnim regionima. Deo može takođe da uključuje najmanje oko 50% bilo kog ili oba od prvog i četvrtog okvirnog regiona, pri čemu je 50% C-terminalnih 50% prvog okvirnog regiona i N-terminalnih 50% četvrtog okvirnog regiona. Dodatne rezidue na N-terminalnom ili C-terminalnom kraju suštinskog dela varijabilnog domena mogu da budu one koje nisu normalno povezane sa prirodnim regionima varijabilnog domena. Na primer, konstrukcija vezujućih elemenata predmetnog otkrića napravljena tehnikama rekombinantne DNK može da rezultuje uvođenjem N- ili C-terminalnih rezidua kodiranih linkerima uvedenim da olakšaju kloniranje ili druge manipulativne korake. Drugi manipulativni koraci uključuju uvođenje linkera za spajanje varijabilnih domena predmetnog otkrića za sledeće proteinske sekvence uključujući konstantne regione antitela, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji di-antitela) ili detektabilne/funkcionalne oznake kao što je detaljnije razmatrano na drugom mestu u ovom dokumentu.

[0160] Iako u nekim aspektima predmetnog otkrića vezujući elementi sadrže par VH i VL domena, pojedinačni vezujući domeni koji se zasnivaju na sekvencama VH ili VL domena čine sledeće aspekte predmetnog otkrića. Poznato je da pojedinačni imunoglobulinski domeni, posebno VH domeni, imaju sposobnost vezivanja ciljnih antigena na specifičan način. Na primer, videti razmatranje o dAb antitelima u tekstu iznad.

[0161] U slučaju bilo kog od pojedinačnih vezujućih domena, ti domeni mogu da budu upotrebljeni za skrining komplementarnih domena sposobnih da formiraju dvodomenski vezujući element koji može da veže Aβ1-42. Ovo može da se postigne metodama skrininga prikaza na fagu upotrebom takozvanog hijerarhijskog dualnog kombinatornog pristupa kao što je opisano u WO92/01047, u kome se pojedinačna kolonija koja sadrži klon ili H ili L lanca

4

upotrebljava za infekciju kompletne biblioteke klonova koja kodira drugi lanac (L ili H) i rezultujući dvolančani vezujući element se selektuje u skladu sa tehnikama prikaza na fagu, kao što su one prikazane u tim referencama. Ove tehnike su opisane i kod Marks et al., Bio/Technology, 1992, 10:779-783.

[0162] Vezujući elementi predmetnog otkrića mogu dodatno da sadrže konstantne regione antitela ili njihove delove, npr., konstantne regione humanog antitela ili njihove delove. Na primer, VL domen može da bude spojen na svom C-terminalnom kraju sa konstantnim domenima lakog lanca antitela uključujući humane Cκ ili Cλ lance. Slično, vezujući element zasnovan na VH domenu može da bude spojen na svom C-terminalnom kraju sa celim ili delom (npr., CH1 domenom) teškog lanca imunoglobulina koji potiče od bilo kog izotipa antitela, npr. IgG, IgA, IgE i IgM i bilo koje izotipske potklase, naročito IgG2, IgG1 i IgG4. IgG2 može da predstavlja prednost u nekim primerima izvođenja zbog nedostatka efektorskih funkcija. U drugim primerima izvođenja, IgG1 može da predstavlja prednost zbog svoje efektorske funkcije i jednostavne proizvodnje. Bilo koja sintetska ili druga varijanta konstantnog regiona koja ima ova svojstva i stabilizuje varijabilne regione može takođe da bude korisna u predmetnom otkriću.

[0163] Vezujući elementi mogu da budu obeleženi detektabilnom ili funkcionalnom oznakom. Prema tome, vezujući element ili molekul antitela može da bude prisutan u obliku imunokonjugata tako da se dobije detektabilan signal i/ili signal koji može da se kvantifikuje. Imunokonjugat može da sadrži molekul antitela predmetnog otkrića konjugovan sa detektabilnom ili funkcionalnom oznakom. Detektabilna oznaka, kako je ovde navedeno, može da bude bilo koja oznaka koja proizvodi ili može da bude indukovana da proizvodi signal, uključujući, ali bez ograničenja fluorescentne, hemiluminescentne (npr., peroksidaza rena), obojene oznake (npr. lateks [plavo] ili koloidno zlato [crveno]), radioaktivne oznake, enzime, fotosenzitizere i magnetne oznake. Količina oznake vezane za površinu, npr., površinu kapilarnog otvora, može prema tome da se detektuje i/ili meri detektovanjem fluorescencije ili luminescencije, boje, radioaktivnosti, enzimske aktivnosti, apsorbancije svetlosti ili promene magnetnog polja. Detektabilne oznake mogu da budu vezane za vezujući elementi upotrebom konvencionalne hemije. Poželjno, detektabilna oznaka je oznaka koja može da se detektuje optičkim ispitivanjem, npr., digitalnom kamerom ili ravnim skenerom. Oznake koje mogu da se detektuju optičkim ispitivanjem uključuju fluorescentne, hemiluminescentne i obojene oznake. Mehanizam kojim signal može da bude generisan za optičku detekciju uključuje (ali nije nužno ograničen na): apsorpciju svetlosti, rasipanje svetlosti, difrakciju svetlosti, refleksiju svetlosti, fluorescenciju ili luminescenciju.

[0164] Pogodne oznake uključuju, u smislu ilustracije, a ne ograničenja,

4

− enzime, kao što je alkalna fosfataza, glukozo-6-fosfat dehidrogenaza ("G6PDH"), alfa-D-galaktozidaza, glukozo-oksidaza, glukozo-amilaza, ugljena anhidraza, acetilholinesteraza, lizozim, malat dehidrogenaza i peroksidaza, npr., peroksidaza rena;

− boje;

− fluorescentne oznake ili fluorescentne agense, kao što je fluorescein i njegovi derivati, fluorohrom, jedinjenja i derivati rodamina, GFP (GFP za "zeleni fluorescentni protein"), dansil, umbeliferon, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid i fluoreskamin; fluorofore kao što su lantanid kriptati i helati, npr., Europijum itd (Perkin Elmer i Cis Biointernational),

− hemiluminescentne oznake ili hemiluminescentne agense, kao izoluminol, luminol i dioksetani;

− bio-luminescentne oznake, kao luciferaza i luciferin;

− senzitizere;

− koenzime;

− enzimske supstrate;

− radioaktivne oznake, uključujući ali bez ograničenja, brom<77>, ugljenik<14>, kobalt<57>, fluor<8>, galijum<67>, galijum<68>, vodonik<3>(tricijum), indijum<111>, indijum<113m>, jod<123m>, jod<125>, jod<126>, jod<131>, jod<133>, živa<107>, živu<203>, fosfor<32>, renijum<99m>, renijum<101>, renijum<105>, rutenijum<95>, rutenijum<97>, rutenijum<103>, rutenijum<105>, skandijum<47>, selen<75>, sumpor<35>, tehnecijum<99>, tehnecijum<99m>, telur<121m>, telur<122m>, telur<125m>, tulijum<165>, tulijum<167>, tulijum<168>, itrijum<199>i druge radioaktivne oznake koje se ovde pominju;

− čestice, kao lateks ili čestice ugljenika; metalni sol; kristalit; lipozome; ćelije, itd., koje mogu da budu dodatno obeležene bojom, katalizatorom ili drugom detektabilnom grupom;

− molekule kao biotin, digoksigenin ili 5-bromodeoksiuridin;

− fragmente toksina, kao na primer fragment toksina odabran iz grupe Pseudomonas egzotoksina (PE ili njegovog citotoksičnog fragmenta ili mutanta), Diptheria toksina ili njegovog citotoksičnog fragmenta ili mutanta, Botulinum toksina A, B, C, D, E ili F, ricina ili njegovog citotoksičnog fragmenta npr. ricin A, abrina ili njegovog citotoksičnog fragmenta, saporina ili njegovog citotoksičnog fragmenta, antivirusnog toksina biljke vinobojka ili njegovog citotoksičnog fragmenta i briodina 1 ili njegovog citotoksičnog fragmenta.

[0165] Primeri pogodnih enzima i koenzima opisani su u US4275149 i US4318980. Pogodni fluorescentni i hemiluminescentni agensi takođe su opisani u US4275149. Oznake dalje

4

uključuju hemijske fragmente, kao biotin koji mogu da budu detektovani putem vezivanja za specifični srodni detektabilni fragment, npr., obeleženi avidin ili streptavidin. Detektabilne oznake mogu da budu vezane za antitela predmetnog otkrića upotrebom konvencionalne hemije poznate u stanju tehnike.

[0166] Imunokonjugati ili njihovi funkcionalni fragmenti mogu da se pripreme postupcima poznatim stručnjaku u datoj oblasti. Oni mogu da budu kuplovani sa enzimima ili sa fluorescentnim oznakama direktno ili posredstvom spejserske grupe ili povezujuće grupe, kao što je polialdehid, kao glutaraldehid, etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DPTA), ili u prisustvu agensa za kuplovanje, kao što su oni pomenuti gore u tekstu za terapijske konjugate. Konjugati koji sadrže oznake fluoresceinskog tipa mogu da se pripreme reakcijom sa izotiocijanatom.

[0167] Postupci poznati u stanju tehnike za kuplovanje terapijskih radioizotopa sa antitelima bilo direktno ili preko agensa za heliranje, kao gore pomenute EDTA, DTPA mogu takođe da se upotrebe za radioaktivne elemente koji mogu da se koriste u dijagnostici. Na sličan način je moguće obaviti obeležavanje sa natrijumom<125>postupkom sa hloraminom T [Hunter W. M. and Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495] ili drugačije sa tehnecijumom<99m>tehnikom iz US4424200 ili vezivanjem preko DTPA kao što je opisano u US4479930.

[0168] Postoje brojni postupci pomoću kojih oznaka može da proizvede signal detektabilan pomoću eksternih sredstava, na primer, vizualnim ispitivanjem, elektromagnetnim zračenjem, toplotom, i hemijskim reagensima. Oznaka može takođe da bude vezana za drugi vezujući element koji vezuje antitelo predmetnog otkrića, ili za podlogu.

[0169] Oznaka može direktno da proizvede signal, i stoga, dodatne komponente nisu potrebne za proizvodnju signala. Brojni organski molekuli, na primer fluorescentni agensi mogu da apsorbuju ultraljubičastu i vidljivu svetlost, pri čemu apsorpcija svetosti prenosi energiju na ove molekule i podiže ih u pobuđeno energetsko stanje. Ova apsorbovana energija se zatim rasipa emisijom svetlosti na drugoj talasnoj dužini. Ova emisija druge talasne dužine može takođe da prenese energiju na obeleženi akceptorski molekul, i rezultujuća energija se rasipa iz akceptorskog molekula emisijom svetlosti na primer rezonantnim prenosom energije fluorescencije (FRET). Druge oznake koje direktno proizvode signal uključuju radioaktivne izotope i boje.

[0170] Alternativno, oznaka može da zahteva druge komponente za proizvodnju signala, i sistem za proizvodnju signala bi tada uključivao sve komponente potrebne za proizvodnju merljivog signala, koje mogu da uključuju supstrate, koenzime, pojačivače, dodatne enzime, supstance koje reaguju sa enzimskim proizvodima, katalizatore, aktivatore, kofaktore, inhibitore, molekulske hvatače, metalne jone, i specifičnu vezujuću supstancu potrebnu za vezivanje supstanci koje

4

generišu signal. Detaljno razmatranje pogodnih sistema koji proizvode signal može da se nađe u US5185243.

[0171] Aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje postupak koji sadrži izazivanje ili omogućavanje vezivanja ovde obezbeđenog vezujućeg elementa sa humanim Aβ1-42. Kao što je navedeno, takvo vezivanje može da se odvija in vivo, npr. nakon primene vezujućeg elementa, ili nukleinske kiseline koja kodira vezujući element, ili može da se odvija in vitro, na primer pomoću ELISA testa, Western blottinga, imunocitohemije, imunoprecipitacije, afinitetne hromatografije i biohemijskih testova ili testova na bazi ćelija.

[0172] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje merenje nivoa antigena direktno, npr., u plazmi ili CSF, korišćenjem vezujućeg elementa prema predmetnom otkriću na primer u biosenzorskom sistemu. Na primer, postupak detekcije i/ili merenja vezivanja sa humanim Aβ1-42 može da sadrži, (i) izlaganje navedenog vezujućeg elementa Aβ1-42 i (ii) detektovanje vezivanja navedenog vezujućeg elementa sa Aβ1-42, pri čemu se vezivanje detektuje upotrebom bilo kog postupka ili detektabilne oznake opisanih u ovom dokumentu. Aβ1-42 može da bude monomerni ili oligomerni Aβ1-42, poželjno monomerni Aβ1-42. Ovaj, i bilo koji drugi postupak za detekciju vezivanja opisan u ovom dokumentu, može da interpretira direktno osoba koja sprovodi postupak, na primer, vizualnim zapažanjem detektabilne oznake. Alternativno, ovaj postupak, ili bilo koji drugi postupak za detekciju vezivanja opisan u ovom dokumentu, može da proizvede izveštaj u obliku autoradiografije, fotografije, kompjuterskog ispisa, izveštaja protočne citometrije, grafikona, dijagrama, epruvete ili kontejnera ili bunarčića koji sadrži rezultat, ili bilo koju drugu vizuelnu ili fizičku predstavu rezultata postupka.

[0173] Količina vezivanja vezujućeg elementa sa Aβ1-42 može da bude određena. Kvantifikacija može da bude vezana za količinu antigena u ispitivanom uzorku, koja može da bude od dijagnostičkog interesa. Skrining vezivanja Aβ1-42 i/ili njegova kvantifikacija može da bude korisna, na primer, u skriningu pacijenata na ovde pomenute bolesti ili poremećaje i/ili bilo koju drugu bolest ili poremećaj koji uključuje aberantne nivoe i/ili aktivnost Aβ1-42.

[0174] Dijagnostički postupak može da sadrži (i) dobijanje uzorka tkiva ili fluida od subjekta, npr., pacijenta za koga se sumnja ili veruje da ima ovde pomenuto stanje ili bolest, (ii) izlaganje navedenog uzorka tkiva ili fluida jednom ili više vezujućih elemenata predmetnog otkrića; i (iii) detektovanje vezanog Aβ1-42 u poređenju sa kontrolnim uzorkom, pri čemu povećanje količine vezivanja Aβ1-42 u poređenju sa kontrolom može da ukaže na aberantni nivo Aβ1-42. Uzorci tkiva ili fluida za ispitivanje uključuju krv, serum, plazmu, CSF, urin, materijal biopsije, tumora, ili bilo kog tkiva za koje se sumnja da sadrži aberantne nivoe Aβ1-42. Subjekti čiji je rezultat testa pozitivan na aberantne nivoe ili aktivnost Aβ1-42 mogu takođe da imaju koristi od postupaka lečenja opisanih kasnije u ovom dokumentu.

[0175] Stručnjaci u datoj oblasti mogu da izaberu pogodan način određivanja vezivanja vezujućeg elementa za antigen prema svojim sklonostima i opštem znanju, u svetlu ovde opisanih postupaka.

[0176] Reaktivnosti vezujućih elemenata u uzorku mogu da se odrede na bilo koji pogodan način. Radioimunoesej (RIA) je jedna mogućnost. Radioaktivno obeleženi antigen se meša sa neobeleženim antigenom (ispitivani uzorak) i ostavlja da se veže za vezujući element. Vezani antigen se fizički odvaja od nevezanog antigena i određuje se količina radioaktivnog antigena vezanog za vezujući element. Što je više antigena u ispitivanom uzorku, to će se manje radioaktivnog antigena vezati za vezujući element. Test kompetitivnog vezivanja može takođe da se koristi sa ne-radioaktivnim antigenom, upotrebom antigena ili analoga vezanog za reporterski molekul. Reporterski molekul može da bude fluorohrom, fosfor ili laserska boja sa spektralno izolovanim karakteristikama apsorpcije ili emisije. Pogodni fluorohromi uključuju fluorescein, rodamin, fikoeritrin i Teksas crveno, i lantanid helate ili kriptate. Pogodne hromogene boje uključuju diaminobenzidin.

[0177] Drugi reporteri uključuju makromolekulske koloidne čestice ili čestični materijal, kao perle lateksa koje su obojene, magnetski ili paramagnetski, i biološki ili hemijski aktivne agense koji mogu, direktno ili indirektno, da izazovu da detektabilni signali budu vizualno zapaženi, elektronski detektovani ili drugačije zabeleženi. Ovi molekuli mogu da budu enzimi, koji katalizuju reakcije koje razvijaju, ili menjaju boje ili izazivaju promene električnih svojstava, na primer. Oni mogu da budu molekularno ekscitabilni, tako da elektronski prelazi između energetskih stanja rezultuju karakterističnim spektralnim apsorpcijama ili emisijama. Oni mogu da uključuju hemijske entitete upotrebljene zajedno sa biosenzorima. Mogu da se upotrebe biotin/avidin ili biotin/streptavidin i sistemi za detekciju na bazi alkalne fosfataze.

[0178] Signali generisani pojedinačnim konjugatima vezujući element-reporter mogu da se upotrebe da bi se dobili merljivi apsolutni ili relativni podaci o vezivanju relevantnog vezujućeg elementa u uzorcima (normalnim i ispitivanim).

[0179] Komplet koji sadrži vezujući element kao što je ovde opisano takođe je obezbeđen kao aspekt predmetnog otkrića. U kompletu, vezujući element može da bude obeležen da omogući određivanje njegove reaktivnosti u uzorku, npr., kao što je dodatno opisano u tekstu ispod. Dalje, vezujući element može, ali ne mora da bude vezan za čvrstu podlogu. Komponente kompleta su uglavnom sterilne i u zapečaćenim fiolama ili drugim kontejnerima. Kompleti mogu da se koriste u dijagnostičkoj analizi ili drugim postupcima za koje su vezujući elementi korisni. Komplet može da bude za upotrebu u gore opisanom postupku. Komplet može da sadrži uputstvo za upotrebu komponenata u postupku, npr., postupku u skladu sa predmetnim otkrićem. Pomoćni materijali koji pomažu ili omogućavaju izvođenje takvog postupka mogu da budu

1

uključeni u komplet predmetnog otkrića. Pomoćni materijali uključuju drugi, drugačiji vezujući element koji se vezuje za prvi vezujući element i konjugovan je sa detektabilnom oznakom (npr., fluorescentnom oznakom, radioaktivnim izotopom ili enzimom). Kompleti na bazi antitela mogu da sadrže i perle za sprovođenje imunoprecipitacije. Svaka komponenta kompleta je uopšteno u svom sopstvenom odgovarajućem kontejneru. Prema tome, ovi kompleti uopšteno sadrže posebne kontejnere pogodne za svaki vezujući element. Dalje, kompleti mogu da sadrže uputstvo za izvođenje testa i postupke za tumačenje i analizu podataka dobijenih izvođenjem testa.

[0180] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje upotrebu vezujućeg elementa kao što je gore navedeno za merenje nivoa antigena u testu kompeticije, odnosno postupak za merenje nivoa antigena u uzorku upotrebom vezujućeg elementa kao što je dato predmetnim otkrićem u testu kompeticije. Ovaj postupak može da se sprovodi kada fizičko razdvajanje vezanog i nevezanog antigena nije potrebno. Jedna od mogućnosti je vezivanje reporterskog molekula za vezujući element, takvo da, nakon vezivanja, dolazi do fizičke ili optičke promene. Reporterski molekul može direktno ili indirektno da stvori detektabilne signale, koji mogu da budu kvantitabilni. Vezivanje reporterskih molekula može da bude direktno ili indirektno, kovalentno, npr., putem peptidne veze ili nekovalentno. Vezivanje putem peptidne veze može da bude rezultat rekombinantne ekspresije genske fuzije koja kodira antitelo i reporterski molekul.

[0181] Kompeticija između vezujućih elemenata može lako da se ispita in vitro, na primer upotrebom ELISA testa i/ili biohemijskog testa kompeticije, kao što je označavanje specifičnim reporterskim molekulom jednog vezujućeg elementa koji može da bude detektovan u prisustvu jednog ili više drugih neoznačenih vezujućih elemenata, da bi se omogućila identifikacija vezujućih elemenata koji vezuju isti epitop ili epitop koji se preklapa. Takvi postupci su dobro poznati stručnjaku u datoj oblasti, i detaljnije su opisani u ovom dokumentu.

[0182] Predmetno otkriće obuhvata vezujući element koji kompetira za vezivanje za humani Aβ1-42 sa bilo kojim ovde definisanim vezujućim elementom, npr., bilo kojim od antitela navedenih u tabelama 5 i 6, npr., u formatu IgG2, IgG1 ili trostruke mutacije IgG1 ("TM"; Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64(Pt 6):700-4). Kompeticija između vezujućih elemenata može lako da se ispita in vitro, na primer označavanjem specifičnim reporterskim molekulom jednog vezujućeg elementa koji može da bude detektovan u prisustvu drugog/drugih neoznačenih vezujućih elemenata, da bi se omogućila identifikacija vezujućih elemenata koji vezuju isti epitop ili epitop koji se preklapa. Kompeticija može da bude određena na primer upotrebom ELISA testa u kome je Aβ1-42 imobilisan na ploči i prvi označeni ili obeleženi vezujući element zajedno sa jednim ili više drugih neoznačenih ili neobeleženih vezujućih elemenata se dodaje na ploču. Prisustvo neoznačenog vezujućeg elementa koji

2

kompetira sa označenim vezujućim elementom zapaža se preko smanjenja signala koji emituje označeni vezujući element.

[0183] Testovi kompeticije mogu da se koriste i za mapiranje epitopa. U jednom slučaju, mapiranje epitopa može da se koristi za identifikovanje epitopa vezanog vezujućim elementom koji opciono može da ima optimizovane neutrališuće i/ili modulatorne karakteristike. Takav epitop može da bude linearni ili konformacioni. Konformacioni epitop može da sadrži najmanje dva različita fragmenta Aβ, pri čemu su navedeni fragmenti smešteni međusobno blizu kada je peptid Aβ savijen u svoju tercijarnu ili kvaternarnu strukturu da bi se formirao konformacioni epitop koga prepoznaje inhibitor Aβ, kao što je Aβ - vezujući element. Pri ispitivanju kompeticije može da se koristi peptidni fragment antigena, posebno peptid koji uključuje ili se suštinski sastoji od epitopa od interesa. Može da se upotrebi peptid koji ima sekvencu epitopa uz dodatak jedne ili više aminokiselina sa bilo kog kraja. Vezujući elementi prema predmetnom otkriću mogu da budu takvi da je njihovo vezivanje za antigen inhibirano peptidom koji ima, ili koji uključuje datu sekvencu.

[0184] U sledećim aspektima, predmetno otkriće obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira vezujući element, VH domen i/ili VL domen prema predmetnom otkriću, i postupke za pripremu vezujućeg elementa, VH domena i/ili VL domena predmetnog otkrića, koji obuhvataju ekspresiju navedene nukleinske kiseline pod uslovima za ostvarivanje proizvodnje navedenog vezujućeg elementa, VH domena i/ili VL domena, i njegovo izdvajanje. Primeri kodirajućih sekvenci nukleinske kiseline prikazani su u tabelama i priloženom listingu sekvenci. Sekvence nukleinske kiseline prema predmetnom otkriću mogu da sadrže DNK ili RNK i mogu da budu potpuno ili delimično sintetske. Pozivanje na nukleotidnu sekvencu kao što je ovde prikazano obuhvata DNK molekul sa naznačenom sekvencom, i obuhvata RNK molekul sa naznačenom sekvencom u kome je T supstituisan sa U, osim ako kontekst ne zahteva drugačije.

[0185] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje konstrukte u formi plazmida, vektora, kao što je plazmidni ili fagni vektor, transkripcione ili ekspresione kasete koje sadrže najmanje jedan polinukleotid kao gore, na primer operativno vezan za regulatorni element.

[0186] Sledeći aspekt obezbeđuje ćeliju-domaćina koja sadrži ili je transformisana nukleinskim kiselinama i/ili vektorima predmetnog otkrića. Predmetno otkriće takođe obezbeđuje rekombinantnu liniju ćelije-domaćina koja sadrži jedan ili više konstrukata kao gore. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira bilo koji CDR ili set CDR regiona ili VH domen ili VL domen ili antigen-vezujuće mesto antitela ili molekul antitela, npr. scFv ili IgG (npr. IgG2, IgG1 ili IgG1TM) kao što je dato, formira aspekt predmetnog otkrića, zajedno sa postupkom proizvodnje kodiranog proizvoda, pri čemu postupak obuhvata ekspresiju sa njegove kodirajuće sekvence nukleinske kiseline. Ekspresija može pogodno da se ostvari kultivisanjem rekombinantnih ćelijadomaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu pod odgovarajućim uslovima. Nakon proizvodnje ekspresijom, VH ili VL domen, ili vezujući element mogu da budu izolovani i/ili prečišćeni upotrebom bilo koje pogodne tehnike, a zatim korišćeni prema potrebi.

[0187] Prema tome, još jedan aspekt predmetnog otkrića je postupak za proizvodnju VH varijabilnog domena antitela, gde postupak uključuje izazivanje ekspresije sa kodirajućih sekvenci nukleinske kiseline. Takav postupak može da sadrži kultivaciju ćelija-domaćina pod uslovima za proizvodnju navedenog VH varijabilnog domena antitela.

[0188] Analogni postupci za proizvodnju VL varijabilnih domena i vezujućih elemenata koji sadrže VH i/ili VL domen obezbeđeni su kao sledeći aspekti predmetnog otkrića.

[0189] Postupak za proizvodnju može da sadrži korak izolovanja i/ili prečišćavanja proizvoda. Postupak za proizvodnju može da sadrži formulaciju proizvoda u kompoziciju koja uključuje najmanje jednu dodatnu komponentu, kao što je farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0190] Sistemi za kloniranje i ekspresiju polipeptida u brojnim različitim ćelijama-domaćinima su dobro poznati. Pogodne ćelije-domaćini uključuju bakterije, sisarske ćelije, biljne ćelije, filamentozne gljive, kvasce i bakulovirusne sisteme i transgene biljke i životinje. Ekspresija antitela i fragmenata antitela u prokariotskim ćelijama je dobro uspostavljena u stanju tehnike. Za pregled, videti na primer Plückthun [Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]. Uobičajeni bakterijski domaćin je E. coli.

[0191] Ekspresija u eukariotskim ćelijama u kulturi je takođe dostupna stručnjacima u datoj oblasti kao opcija za proizvodnju vezujućeg elementa [Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194; Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418].

[0192] Sisarske ćelijske linije dostupne u stanju tehnike za ekspresiju heterologog polipeptida uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka, NS0 ćelije mišjeg melanoma, YB2/0 ćelije mijeloma pacova, humane embrionske ćelije bubrega, humane embrionske ćelije retine i mnoge druge.

[0193] Pogodni vektori, koji sadrže odgovarajuće regulatorne sekvence, uključujući promotorske sekvence, terminatorske sekvence, poliadenilacione sekvence, sekvence pojačivača, marker-gene i druge sekvence po potrebi, mogu da se odaberu ili konstruišu. Vektori mogu da budu plazmidi npr. fagmid, ili virusni, npr. 'fag, po potrebi [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Mnoge poznate tehnike i protokoli za manipulaciju nukleinskom kiselinom, na primer u pripremi konstrukata nukleinske kiseline, mutagenezi, sekvenciranju, introdukciji DNK u ćelije i genskoj ekspresiji, i

4

analizi proteina, detaljno su opisane kod Ausubel et al. [Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th edition 1999].

[0194] Sledeći aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje ćeliju-domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisano. Takva ćelija-domaćin može da postoji in vitro i može da postoji u kulturi. Takva ćelija-domaćin može da postoji in vivo. Prisustvo ćelije-domaćina in vivo može da omogući intracelularnu ekspresiju vezujućih elemenata predmetnog otkrića kao "intra-tela" ili intracelularnih antitela. Intra-tela mogu da se koriste za gensku terapiju.

[0195] Još jedan aspekt obezbeđuje postupak koji sadrži introdukciju nukleinske kiseline predmetnog otkrića u ćeliju-domaćina. Za introdukciju može da se koristi bilo koja dostupna tehnika. Za eukariotske ćelije, pogodne tehnike mogu da uključuju transfekciju kalcijum fosfatom, DEAE-dekstranom, elektroporaciju, transfekciju posredovanu lipozomom i transdukciju upotrebom retrovirusa ili drugog virusa, npr., virusom vakcinije, ili za insekatske ćelije, bakulovirusom. Za introdukciju nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina, posebno u eukariotsku ćeliju, može da se koristi virusni ili plazmidni sistem. Plazmidni sistem može da se održava epizomalno ili može da bude ugrađen u ćeliju-domaćina ili u veštački hromozom. Ugradnja može da bude ili nasumična ili ciljna integracija jedne ili više kopija na jednom ili više lokusa. Za bakterijske ćelije, pogodne tehnike mogu da uključuju transformaciju kalcijum hloridom, elektroporaciju i transfekciju upotrebom bakteriofaga.

[0196] Introdukcija može da bude praćena izazivanjem ili omogućavanjem ekspresije sa nukleinske kiseline, npr., kultivacijom ćelija-domaćina pod uslovima za ekspresiju gena. Prečišćavanje eksprimiranog proizvoda može da se ostvari postupcima poznatim stručnjaku u datoj oblasti.

[0197] Nukleinska kiselina predmetnog otkrića može da bude integrisana u genom (npr., hromozom) ćelije-domaćina. Integracija može da se podstakne uključivanjem sekvenci koje podstiču rekombinaciju sa genomom, u skladu sa standardnim tehnikama.

[0198] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupak koji sadrži upotrebu konstrukta kao što je gore navedeno u ekspresionom sistemu kako bi se eksprimirao vezujući element ili polipeptid kao iznad u tekstu.

[0199] Vezujući elementi prema predmetnom otkriću mogu da budu upotrebljeni u lečenju (koje može da uključuje profilaktični tretman) bolesti ili poremećaja u telu čoveka ili životinje (npr., kod humanog pacijenta), koje obuhvata davanje vezujućeg elementa pacijentu. Stanja koja mogu da se leče prema predmetnom otkriću opisna su na drugom mestu u ovom dokumentu, uključujući preventivno lečenje i smanjenje ozbiljnosti stanja ili jednog ili više njegovih simptoma, ili odlaganje ili smanjenje rizika od pojave.

[0200] Prema tome, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za lečenje ili smanjenje ozbiljnosti najmanje jednog simptoma bilo kog od ovde pomenutih stanja, koji obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine jednog ili više vezujućih elemenata predmetnog otkrića samog, ili u kombinovanom terapijskom režimu sa drugim pogodnim lekom poznatim u stanju tehnike ili ovde opisanim, tako da se ozbiljnost najmanje jednog simptoma bilo kog od gore navedenih poremećaja smanjuje.

[0201] Pojam "efikasna doza" definisan je kao količina dovoljna da leči ili najmanje delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji već pati od bolesti.

[0202] Predmetno otkriće usmereno je, između ostalog, na lečenje Alchajmerove bolesti i drugih amiloidogenih bolesti primenom terapijskog antitela predmetnog otkrića kod pacijenta pod uslovima koji stvaraju koristan terapijski odgovor kod pacijenta (npr., redukciju Aβ1-42 u CSF, redukciju opterećenja plakovima, inhibiciju formiranja plakova, redukciju neuritske distrofije, poboljšanje kognitivne funkcije, i/ili reverziju, redukciju ili prevenciju kognitivnog pada) kod pacijenta, na primer, za prevenciju ili lečenje amiloidogene bolesti.

[0203] Kako se ovde koristi, "lečenje" je definisano kao upotreba ili primena terapijskog agensa kod pacijenta, koji ima bolest ili stanje povezano sa amiloidozom; ili simptom, ili predispoziciju za takvu bolest ili stanje povezano sa amiloidozom, kako bi došlo do izlečenja, isceljenja, ublažavanja, slabljenja, modifikovanja, lečenja, smanjenja, poboljšanja ili delovanja na bolest, stanje, njene simptome ili predispoziciju za nju.

[0204] Predmetno otkriće obezbeđuje postupke za prevenciju ili lečenje bolesti povezane sa amiloidnim depozitima Aβ u mozgu pacijenta. Takve bolesti uključuju Alchajmerovu bolest, Daunov sindrom i kognitivno oštećenje. Kognitivno oštećenje može da se javi sa, ili bez drugih karakteristika amiloidogene bolesti. Predmetno otkriće obezbeđuje postupke za lečenje makularne degeneracije, stanja koje je povezano sa Aβ. Postupci predmetnog otkrića mogu da uključuju davanje efikasne doze pacijentu antitela koje se specifično vezuje za 1 - 42 Aβ i njegove N-terminalno skraćene oblike. Takvi postupci su posebno korisni za prevenciju ili lečenje Alchajmerove bolesti kod humanih pacijenata.

[0205] Antitela predmetnog otkrića mogu da se koriste u terapijskim režimima za prevenciju ili ublažavanje neuropatologije i, kod nekih pacijenata, kognitivnog oštećenja povezanog sa Alchajmerovom bolešću.

[0206] Pacijenti podložni lečenju uključuju pacijente koji pokazuju simptome, a takođe i osobe u riziku od bolesti koje ne pokazuju simptome. Kod Alchajmerove bolesti, potencijalno svako je u riziku, ako živi dovoljno dugo. Antitela predmetnog otkrića mogu da se primene profilaktički kod subjekta bez bilo kakve procene rizika kod predmetnog pacijenta. Pacijenti podložni lečenju uključuju osobe koje imaju poznati genetski rizik za Alchajmerovu bolest, na primer osobe koje imaju krvne srodnike sa ovom bolešću i one kod kojih je rizik određen analizom genetskih ili biohemijskih markera. Genetski markeri predispozicije za Alchajmerovu bolest uključuju mutacije u genu APP, posebno mutacije na poziciji 717 i pozicijama 670 i 671 označene kao Hardy, odnosno švedske mutacije. Drugi markeri rizika su mutacije u presenilinskim genima, PS1 i PS2, i ApoE4, porodična istorija AD, hiperholesterolemija ili ateroskleroza. Kod osoba koje pate od Alchajmerove bolesti dijagnoza može da se uspostavi putem karakteristične demencije povezane sa bolešću, kao i prisustva gore opisanih faktora rizika. Dostupni su brojni dijagnostički testovi za pomoć pri identifikaciji Alchajmerove bolesti kod pojedinca. Oni uključuju merenje nivoa tau i Aβ1-42 u CSF. Povišeni nivoi tau i sniženi nivoi Aβ1-42 mogu da znače prisustvo AD. Kod osoba koje pate od Alchajmerove bolesti dijagnoza može da se uspostavi i pomoću kriterijuma NINCDS-ADRDA ili DSM-IV-TR.

[0207] Kod asimptomatskih pacijenata, lečenje može da počne u bilo kom uzrastu (npr., 10, 20, 30). Uopšteno, lečenje počinje u kasnijem dobu, na primer kada pacijent dostigne svoje 40, 50, 60. ili 70. godine. Lečenje može da uključuje višestruke doze tokom vremenskog perioda, koje mogu da traju tokom preostalog života pacijenta. Potreba za primenom ponovljenih doza može da se prati merenjem nivoa antitela tokom vremena.

[0208] Kod profilakse, farmaceutske kompozicije ili lekovi se daju pacijentu koji je podložan, ili na drugi način u riziku od Alchajmerove bolesti u količini dovoljnoj da eliminiše ili smanji rizik, smanji ozbiljnost, ili odloži početak bolesti, uključujući biohemijsko, histološko, kognitivno oštećenje i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i intermedijarne patološke fenotipe prisutne tokom razvoja bolesti. Kod terapijskih primena, kompozicije ili lekovi se daju pacijentu koji je podložan, ili već pati od takve bolesti u količini dovoljnoj da izleči, ili bar delimično zaustavi, simptome bolesti (biohemijske, histološke, kognitivno oštećenje i/ili bihejvioralne), uključujući njene komplikacije i intermedijarne patološke fenotipe tokom razvoja bolesti.

[0209] Predmetno otkriće obezbeđuje postupak za lečenje osobe koji obuhvata davanje osobi kojoj je to potrebno efikasne količine jednog ili više vezujućih elemenata predmetnog otkrića pojedinačno, ili u kombinovanom terapijskom režimu sa drugim odgovarajućim lekom poznatim u stanju tehnike ili opisanim u ovom dokumentu. Postupak za lečenje može da sadrži davanje efikasne količine ovde opisanog vezujućeg elementa pacijentu kome je to potrebno, pri čemu se nivoi Aβ1-42 u krvnoj plazmi i/ili CSF snižavaju.

[0210] Postupak za lečenje može da sadrži (i) identifikovanje pacijenta koji ima stanje povezano sa amiloidozom kao što je ovde pomenuto, i (ii) davanje efikasne količine ovde opisanog vezujućeg elementa pacijentu, pri čemu se nivoi Aβ1-42 u krvnoj plazmi i/ili CSF snižavaju, i amiloidoza se redukuje. Efikasna količina je količina koja snižava nivo Aβ1-42 tako da snižava ili smanjuje ozbiljnost najmanje jednog simptoma konkretne bolesti ili poremećaja koji se leči, ali ne leči nužno bolest ili poremećaj.

[0211] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupak za antagonizovanje najmanje jednog dejstva Aβ1-42 koji obuhvata dovođenje u kontakt ili primenu efikasne količine jednog ili više vezujućih elemenata predmetnog otkrića tako da je navedeno najmanje jedno dejstvo Aβ1-42 antagonizovano.

[0212] Prema tome, sledeći aspekti predmetnog otkrića obezbeđuju postupke za lečenje koji obuhvataju primenu vezujućeg elementa kao što je obezbeđeno, farmaceutske kompozicije koje sadrže takav vezujući element, i upotrebu takvog vezujućeg elementa u proizvodnji leka za primenu, na primer u postupku za pravljenje leka ili farmaceutske kompozicije koja sadrži formulaciju vezujućeg elementa sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens može da bude jedinjenje ili kombinacija jedinjenja koja ulazi u farmaceutsku kompoziciju, koja ne izaziva sekundarne reakcije i koja omogućava, na primer, olakšavanje primene vezujućeg elementa, produženje njegovog životnog veka i/ili njegove efikasnosti u telu, povećanje njegove rastvorljivosti u rastvoru ili drugo poboljšanje u njegovom čuvanju. Ovi farmaceutski prihvatljivi vehikulumi su dobro poznati i stručnjak u datoj oblasti će ih prilagoditi prirodi i načinu primene jednog ili više odabranih aktivnih jedinjenja.

[0213] Vezujući elementi kao što je ovde opisano obično će biti primenjeni u obliku farmaceutske kompozicije, koja može da sadrži najmanje jednu komponentu pored vezujućeg elementa. Prema tome, farmaceutske kompozicije prema predmetnom otkriću, i za upotrebu u skladu sa predmetnim otkrićem, mogu da sadrže, pored vezujućeg elementa, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale dobro poznate stručnjacima u datoj oblasti. Takvi materijali treba da budu netoksični i ne treba da interferiraju sa efikasnošću aktivnog sastojka. Precizna priroda nosača ili drugog materijala zavisiće od puta primene.

[0214] Kod injektabilnih formulacija, npr., kod intravenske ili subkutane injekcije, aktivni sastojak će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji je bez pirogena i ima pogodan pH, izotoničnost i stabilnost. Vezujući elementi kao što je ovde opisano mogu da budu formulisani u tečnom, polu-čvrstom ili čvrstom obliku u zavisnosti od fizikohemijskih svojstava molekula i puta isporuke. Formulacije mogu da uključuju ekscipijense, ili kombinacije ekscipijenasa, na primer: šećere, aminokiseline i surfaktante. Tečne formulacije mogu da uključuju širok opseg koncentracija antitela i pH. Čvrste formulacije mogu da budu proizvedene liofilizacijom, sušenjem raspršivanjem, ili sušenjem tehnologijom superkritičnog fluida, na primer. Tretman može da bude dat injekcijom (na primer, subkutano, ili intravenski). Tretman može da bude primenjen pulsnom infuzijom, posebno sa opadajućim dozama vezujućeg elementa. Put primene može da se odredi prema fizikohemijskim karakteristikama tretmana, posebnim razmatranjem bolesti ili prema potrebi da se optimizuje efikasnost ili da se sporedna dejstva svedu na najmanju meru. Jedan konkretan put primene je intravenski. Drugi put primene farmaceutskih kompozicija predmetnog otkrića je subkutani. Subkutana injekcija upotrebom uređaja bez igle takođe predstavlja prednost.

[0215] Kompozicija može da se primeni pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, istovremeno ili uzastopno, u zavisnosti od stanja koje treba da se leči.

[0216] Vezujući element može da se upotrebi kao deo kombinovane terapije zajedno sa dodatnom medicinskom komponentom. Kombinovani tretmani mogu da se koriste da obezbede značajna sinergistička dejstva, posebno kombinacija vezujućeg elementa sa jednim ili više drugih lekova. Vezujući element može da se primeni istovremeno ili uzastopno ili kao kombinovani preparat sa drugim terapijskim agensom ili agensima, za lečenje jednog ili više ovde navedenih stanja.

[0217] Vezujući element i jedna ili više od gore navedenih dodatnih medicinskih komponenata mogu da se koriste u proizvodnji leka. Lek može da bude za odvojenu ili kombinovanu primenu kod osobe, i prema tome može da sadrži vezujući element i dodatnu komponentu kao kombinovani preparat ili kao posebni preparati. Posebni preparati mogu da se koriste da olakšaju odvojenu i sekvencijalnu ili istovremenu primenu, i da omoguće primenu komponenata različitim putevima npr. oralnu i parenteralnu primenu.

[0218] Date kompozicije mogu da se primene kod sisara. Primena je normalno u "terapijski efikasnoj količini", koja je dovoljna da pokaže korist za pacijenta. Takva korist može da bude bar ublažavanje najmanje jednog simptoma. Stvarna primenjena količina, i brzina i vremenski tok primene, zavisiće od prirode i ozbiljnosti onoga što se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničkog stanja pojedinačnog pacijenta, uzroka poremećaja, mesta isporuke kompozicije, tipa vezujućeg elementa, metode primene, rasporeda primene i drugih faktora poznatih lekarima. Propisivanje lečenja, npr. odluke o doziranju, itd, u nadležnosti je lekara opšte prakse i drugih lekara, i može da zavisi od ozbiljnosti simptoma i/ili progresije bolesti koja se leči. Terapijski efikasna količina ili pogodna doza vezujućeg elementa predmetnog otkrića može da se odredi poređenjem njegove in vitro aktivnosti i in vivo aktivnosti u životinjskom modelu. Postupci za ekstrapolaciju efikasnih doza sa životinja u testu na ljude su poznati. Precizna doza će zavisiti od brojnih faktora, uključujući to da li je antitelo za dijagnozu, prevenciju ili za lečenje, veličine i lokacije oblasti koja se leči, precizne prirode antitela (npr., celo antitelo, fragment ili di-antitelo) i prirode bilo kakve detektabilne oznake ili drugog molekula vezanog za antitelo. Tipična doza antitela biće u opsegu 100 µg do 1 g za sistemske primene. Može da se primeni polazna viša udarna doza, praćena jednom ili više nižih doza. Tipično, antitelo će biti celo antitelo, npr., IgG1 ili IgG1-TM izotip. Tretmani mogu da se ponavljaju u dnevnim, dvaput nedeljno, nedeljnim ili mesečnim intervalima, prema nahođenju lekara. Tretmani mogu da budu svake dve do četiri nedelje kod subkutane primene i svakih četiri do osam nedelja kod intravenske primene. Tretman može da bude periodičan, i period između primena je oko dve nedelje ili više, npr., oko tri nedelje ili više, oko četiri nedelje ili više, ili oko jednom mesečno.

[0219] Razni dodatni aspekti i primeri izvođenja predmetnog otkrića biće očigledni stručnjacima u datoj oblasti u svetlu predmetnog otkrića.

[0220] Svi dokumenti, uključujući reference na baze podataka i pristupne brojeve, patente, patentne prijave i objave, pomenuti u ovoj specifikaciji uključeni su u celini u ovaj dokument po referenci za sve svrhe.

[0221] Kada se u ovom dokumentu koristi "i/ili", to treba razumeti kao specifično opisivanje svake od dve navedene osobine ili komponente, sa ili bez one druge. Na primer "A i/ili B" treba razumeti kao specifično opisivanje svakog od (i) A, (ii) B i (iii) A i B, kao da je svaki od njih ovde naveden pojedinačno.

[0222] Određeni aspekti i primeri izvođenja predmetnog otkrića biće sada ilustrovani primerom i uz pozivanje na prateće slike i tabele.

Primeri

[0223] Sledeće sekvence su deponovane kod NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB219YA. Škotska, Velika Britanija:

E. coli TOP10 ćelije Abet0007 = NCIMB 41889

E. coli TOP10 ćelije Abet0380-GL = NCIMB 41890

E. coli TOP10 ćelije Abet0144-GL = NCIMB 41891

E. coli TOP10 ćelije Abet0377-GL = NCIMB 41892

Datum deponovanja = 02. novembar 2011.

Primer 1. Generisanje antitela specifičnih za beta-amiloid 1-42 i selekcija vodećeg antitela

1.1 Formulacija beta-amiloidnih peptida

[0224] Biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117 ili Bachem AG, Švajcarska; kat: H-5642) je resuspendovan do 1 mg/ml u 1% rastvoru amonijum hidroksida (zapr./zapr.) i skladišten u alikvotima na -80°C do upotrebe. Identična procedura je praćena za neobeleženi humani beta-amiloidni peptid 1-42 (Anaspec, SAD; kat: 64129), neobeleženi humani beta-amiloidni peptid 1-40 (rPeptide, SAD; kat: A1155), biotinilisani humani betaamiloidni peptid 1-40 (rPeptide, SAD; kat: A111 ili Bachem AG, Švajcarska; kat: H-5914), biotinilisani mišji beta-amiloidni peptid 1-42 (Anaspec, SAD; kat: 61718-01) i biotinilisani mišji beta-amiloidni peptid 1-40 (Anaspec, SAD; kat: 61717).

1.2 Selekcije

[0225] Za selekcije je upotrebljena biblioteka prikaza na lambda fagu Fab310 (Dyax, SAD) klonirana u fagmidni vektor na bazi filamentoznog faga M13 (Hoet et al., 2005). Fab-antitela specifična za beta-amiloid 1-42 izolovana su iz biblioteka prikaza na fagu upotrebom serije ciklusa selekcije na sintetskom humanom biotinilisanom beta-amiloidu 1-42 (rPeptide, SAD) suštinski kao što je prethodno opisano (Hawkins et al., 1992; Vaughan et al., 1996). Ukratko, za prvi ciklus selekcije u fazi rastvora, biotinilisani beta-amiloid 1-42 u Dulbecco-vom fosfatno puferisanom slanom rastvoru (DPBS, pH 7.4) dodat je prečišćenim česticama faga koje su preinkubirane 1 čas u Marvel-PBS (3% tež./zapr.) koji sadrži 100-struki višak neobeleženog humanog beta-amiloidnog peptida 1-40 (Anaspec, SAD). Čestice faga vezane za biotinilisani beta-amiloidni peptid 1-42 uhvaćene su upotrebom paramagnetnih perli kuplovanih sa streptavidinom (Invitrogen Life Technologies, VB) i slabo vezane čestice faga su uklonjene serijom ciklusa pranja upotrebom PBS-Tween (0.1% zapr./zapr.). Vezane čestice faga su eluirane sa perli, njima su inficirane bakterije E. coli TG1 i izdvojene za sledeći ciklus selekcije (Vaughan et al., 1996). Dva uzastopna ciklusa selekcije sprovedena su kao što je prethodno opisano, ali sa redukovanom koncentracijom biotinilisanog beta-amiloidnog 1-42 antigena.

1.3 Identifikacija klonova specifičnih za beta-amiloid 1-42 upotrebom testa direktnog vezivanja na neprečišćenim Fab fragmentima

[0226] Da bi se proizveli rastvorljivi jednolančani Fab fragmenti (sFab) genelll tether je uklonjen iz kasete za prikaz na bazi Fab310-Lambda upotrebom standardnih tehnika cepanja i ligacije. Ukratko, fagmidni vektori su izolovani kao proizvod 3. ciklusa upotrebom standardnih kompleta za prečišćavanje DNK (QIAgen, VB) i sekvenca genelll tether je uklonjena iz vektora upotrebom restrikcione digestije sa MluI (Hoet et al., 2005). Ponovo ligirani vektori su transformisani natrag u TG1 ćelije i pojedinačne kolonije su uzete za analizu.

[0227] Neprečišćeni sFab iz periplazmatskih preparata su podvrgnuti skriningu u testu vezivanja pomoću homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF™, CisBio International, Francuska) upotrebom čitača ploča EnVision (PerkinElmer, SAD). U ovom testu, vezivanje neprečišćenog sFab za humani beta-amiloidni peptid 1-42 procenjeno je merenjem rezonantnog prenosa energije fluorescencije (FRET) između histidinom označenog sFab i biotinilisanog peptida upotrebom reagensa za detekciju streptavidin kriptata i anti-6his-XL665 (CisBio

1

International, Francuska; kat: 610SAKLB i 61HISXLB redom). Proizvodi selekcije su podvrgnuti skriningu kao neprečišćeni bakterijski periplazmatski ekstrakti koji sadrže sFab, pripremljeni u 50 mM MOPS puferu pH 7.4, 0.5 mM EDTA i 0.5 M saharozi. Deset mikrolitara uzoraka neprečišćenog sFab dodato je na ploču za test sa 384 bunarčića Costar® (Corning, SAD; kat: 3676). Zatim je dodato 5 µl 20 nM sintetskog humanog beta-amiloida 1-42 i 5 µl kombinovanog rastvora 6 nM streptavidin kriptata i 20 nM anti-his-XL665. Bunarčići sa nespecifičnim vezivanjem (negativne kontrole) definisani su za svaku ploču upotrebom negativne kontrole neprečišćenog sFab umesto ispitivanog uzorka sFab. Unakrsno reaktivni klonovi sFab identifikovani su upotrebom istovremene analize sa humanim beta-amiloidnim peptidom 1-40. Sva razblaženja su urađena u 50 mM MOPS pH 7.4 (Sigma, VB; kat: M9381) koji sadrži 0.4 M KF (BDH Chemicals, SAD; kat: 103444T), 0.1% goveđi serumski albumin bez masnih kiselina (Sigma, VB; kat: A6003) i 0.1% Tween 20 (zapr./zapr.) (Sigma, VB; kat: P2287) (pufer za test). Ploče za test su inkubirane 4 časa na sobnoj temperaturi pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na čitaču ploča EnVision (PerkinElmer, SAD) upotrebom talasne dužine ekscitacije od 320 nm i merenjem emisije na 620 nm i 665 nm (100 fleševa).

[0228] Podaci su analizirani izračunavanjem % Delta F vrednosti za svaki uzorak. % Delta F je određen prema jednačini 1.

Jednačina 1:

% Delta F = (odnos 665 nm/620 nm uzorka) – (odnos 665 nm/620 nm negativne x 100 kontrole)

(odnos 665 nm/620 nm negativne kontrole)

1.4 Test direktnog vezivanja prečišćenih sFab fragmenata

[0229] Neprečišćeni periplazmatski ekstrakti sFab koji su pokazali specifično vezivanje za humani beta-amiloidni peptid 1-42 u testu HTRF™ podvrgnuti su DNK sekvenciranju (Osbourn et al., 1996; Vaughan et al., 1996). sFab sa jedinstvenim proteinskim sekvencama eksprimirani su u E. coli i prečišćeni afinitetnom hromatografijom (suštinski kao što je opisano (Bannister et al., 2006)). Profil vezivanja beta-amiloida za svaki prečišćeni sFab određen je ispitivanjem serija razblaženja prečišćenog sFab u testu HTRF™ opisanom u odeljku 1.3, zamenom neprečišćenog periplazmatskog preparata sFab prečišćenim sFab. Istovremeno je ispitano vezivanje prečišćenih sFab za biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42, biotinilisani mišji beta-amiloidni peptid 1-42 i biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-40. Pored toga, ispitano je vezivanje sFab za humani beta-amiloidni peptid 1-42 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (Anaspec,

2

prilagođena sinteza) u odvojenom eksperimentu HTRF™ u cilju kontrole bilo kakvog nespecifičnog vezivanja peptida. Podaci su analizirani izračunavanjem % Delta F vrednosti kao što je opisano u odeljku 1.3.

[0230] Primer rezultata za prečišćeni Abet0007 sFab prikazan je na slici 1. Ovi rezultati pokazuju da se Abet0007 specifično vezuje za humani beta-amiloidni peptid 1-42 u odnosu na humani beta-amiloidni peptid 1-40 i humani beta-amiloidni peptid 1-42 sa nasumičnim redosledom aminokiselina. Pored toga, Abet0007 sFab je unakrsno reaktivan sa mišjim betaamiloidnim peptidom 1-42.

1.5 Preoblikovanje Fabs antitela specifičnih za beta-amiloid 1-42 u IgG2 format

[0231] Trinaest klonova specifičnih za beta-amiloid 1-42 pretvoreno je iz Fab u IgG2 subkloniranjem domena varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) u vektore koji eksprimiraju cele teške i lake lance humanog antitela redom. VHdomeni su bili kodonoptimizovani u laboratoriji pre subkloniranja budući da su VHdomeni Dyax FAB310 biblioteke polu-sintetski i ne eksprimiraju se u dovoljnim količinama u sisarskim ćelijama koje su ovde opisane. Laboratorijski VHmodifikovan prema sekvenci klicine linije, za koga je poznato da se dobro eksprimira kao humani IgG cele dužine u sisarskim ćelijama, upotrebljen je kao matrica za izmenu upotrebe kodona DNK Dyax VH domena uz zadržavanje originalne aminokiselinske sekvence. Kodon-optimizovani varijabilni teški lanci su klonirani u sisarski ekspresioni vektor (pEU 9.2) koji sadrži konstantne domene humanog teškog lanca i regulatorne elemente za ekspresiju celog teškog lanca IgG2 u sisarskim ćelijama. Slično, varijabilni domen lakog lanca kloniran je u sisarski ekspresioni vektor (pEU4.4) za ekspresiju konstantnih domena humanog lambda lakog lanca, kao i regulatornih elemenata za ekspresiju lakog lanca IgG u sisarskim ćelijama. Vektori za ekspresiju teških lanaca i lakih lanaca originalno su opisani kod Persic et al. (Persic et al., 1997). Da bi se dobili klonovi kao IgG2, ekspresioni vektori teškog i lakog lanca IgG su tranzijentno transficirani u HEK293-EBNA (Invitrogen, VB; kat: R620-07) ili CEP6-CHO (proizveden u laboratoriji) sisarske ćelije u kojima je antitelo eksprimirano i izlučeno u medijum. Sakupljeni medijum je filtriran pre prečišćavanja. IgG antitela su prečišćena upotrebom hromatografije na proteinu A (Biosepra™, Pall, SAD ili MabSelect SuRe, GE Healthcare, VB). Supernatanti kultura su naneti na odgovarajuću kolonu proteina A prethodno ekvilibrisanu u 50 mM Tris pH 8.0, 250 mM NaCl. Vezani IgG je eluiran sa kolone upotrebom 0.1 M natrijum citrata pH 3.0 i eluat je neutralisan dodavanjem 1 M Tris pufera (pH 10.0). IgG antitelima je izmenjen pufer u Dulbecco-ov PBS upotrebom kolona za izmenu pufera NAP-10 (GE Healthcare, VB; kat: 17-0854-02). Prečišćena IgG su propuštena kroz filter od 0.2 mikrometra i koncentracija IgG je određena pomoću apsorbancije na 280 nm upotrebom koeficijenta ekstinkcije zasnovanog na aminokiselinskoj sekvenci IgG. Analizirana je agregacija ili razgradnja prečišćenih IgG antitela upotrebom tehnika SEC-HPLC i SDS-PAGE.

1.6 Određivanje specifičnosti vodećih antitela u kompetitivnom testu HTRF™ pomoću betaamiloidnog peptida

[0232] Kao što je gore opisano, prečišćeni sFab fragmenti koji se specifično vezuju za betaamiloidni peptid 1-42 pretvoreni su u rekombinantni IgG. Da bi se ispitala specifičnost ovih IgG antitela za vezivanje za druge humane beta-amiloidne peptide, razvijen je test kompeticije. U ovom testu neobeleženi humani beta-amiloidni peptidi 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1165), 1-40 (rPeptide, SAD; kat: A1155), 11-42 (rPeptide, SAD; kat: A1063), 17-42 (rPeptide, SAD; kat: A1058) i 1-43 (Anaspec, SAD; kat: 25356) inkubirani su sa vodećim IgG i biotinilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117). Ukratko, serije razblaženja svakog ispitivanog peptida kombinovane su sa 0.3 nM ispitivanog IgG i 5 nM biotinilisanog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42. Kompeticija svakog peptida procenjena je detekcijom gubitka vezivanja vodećeg IgG za biotinilisani peptid 1-42 merenjem rezonantnog prenosa energije fluorescencije (FRET) između IgG i biotinilisanog beta-amiloida 1-42 upotrebom reagenasa za detekciju streptavidin kriptata (CisBio International, Francuska; kat: 610SAKLB) i antitela protiv humanog Fc IgG XL665 (CisBio International, Francuska; kat: 61HFCXLB).

[0233] Streptavidin kriptat i antitelo protiv humanog Fc IgG XL665 su kombinovani pri koncentraciji od 7 nM i 5 nM redom u puferu za test koji sadrži 50 mM MOPS pH 7.4 (Sigma, VB; kat: M9381), 0.4 M KF (BDH Chemicals, SAD; kat: 103444T), 0.1% goveđeg serumskog albumina bez masnih kiselina (Sigma, VB; kat: A6003) i 0.1% Tween 20 (zapr./zapr.) (Sigma, VB; kat: P2287). 5 µl ovog rastvora dodato je na ploču za analizu (Costar® crna, sa 384 plitka bunarčića, Corning Life Sciences; kat: 3676). Beta-amiloidni peptidi su serijski razblaženi u puferu za test upotrebom ploče sa U dnom sa 96 bunarčića Greiner (Greiner BioOne, Nemačka; kat: 650201). 5 µl svakog razblaženja peptida preneto je u duplikatu na ploču za analizu upotrebom robota za rukovanje tečnošću MiniTrak™ (PerkinElmer, SAD). Ispitivani IgG razblažen je do 1.2 nM u puferu za test i 5 µl je dodato na ploču za analizu. 20 nM rastvora biotinilisanog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 pripremljeno je u puferu za test i 5 µl ovog rastvora dodato je na ploče za analizu. Bunarčići sa nespecifičnim vezivanjem (negativne kontrole) definisani su za svaku ploču zamenom ispitivanog IgG sa 5 µl pufera za test. Ploče za analizu inkubirane su 4 časa na sobnoj temperaturi pre očitavanja vremenski razložene

4

fluorescencije na talasnim dužinama emisije od 620 nm i 665 nm upotrebom čitača ploča EnVision (PerkinElmer, SAD).

[0234] Podaci su analizirani izračunavanjem % Delta F vrednosti za svaki uzorak. % Delta F određen je prema jednačini 1. % Vrednosti Delta F su zatim upotrebljene za izračunavanje % specifičnog vezivanja kao što je opisano jednačinom 2.

Jednačina 2:

% specifičnog vezivanja % Delta F uzorka x 100

=

% Delta F kontrole ukupnog vezivanja

[0235] Primer rezultata za Abet0007 IgG prikazan je na slici 2. Ovi rezultati pokazuju da se Abet0007 IgG vezuje za humani beta-amiloidni peptid 1-42, ali ne i za humani beta-amiloidni peptid 1-40. Ovo antitelo se takođe vezuje za skraćene peptide 11-42 i 17-42 i za humani betaamiloidni peptid 1-43.

1.7 Određivanje afiniteta vezivanja vodećih antitela za humani beta-amiloid 1-42 upotrebom rezonancije površinskog plazmona

[0236] Za procenu kinetičkih parametara interakcije između svakog vodećeg antitela i sintetski proizvedenog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 upotrebljen je biosenzorski instrument BIAcore T-100 (GE Healthcare, VB). Ovi eksperimenti su u suštini sprovedeni kao što je opisano kod Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991).

[0237] Biosenzor upotrebljava optičke efekte rezonancije površinskog plazmona (SPR) za ispitivanje promena površinske koncentracije koje rezultuju iz interakcije molekula analita koji se preliva preko molekula liganda koji je imobilisan na sloju dekstrana biosenzorskog čipa. Tipično, definisana koncentracija vrste analita propušta se preko kuplovanog liganda i svako vezivanje se detektuje kao povećanje lokalnog SPR signala (faza asocijacije). Ovo je praćeno periodom protoka pufera, tokom koga disocijacija vrste analita sa površine imobilisanog liganda može da se zapazi kao opadanje signala (faza disocijacije). Preostali analit zatim može da bude skinut sa liganda vezanog za čip i procedura ponovljena pri nekoliko različitih koncentracija analita. Eksperiment je dizajniran tako da se ni apsolutni kapacitet vezivanja ni kinetički profil kuplovanog liganda ne menjaju značajno tokom celog eksperimenta i mogu da se prate upotrebom serije kontrola uključenih u eksperiment. Vlasnički fiziološki rastvor puferisan HEPES-om koji sadrži EDTA (HBS-EP+, GE Healthcare, VB) tipično se koristi kao pufer za razblaživanje za uzorke analita i kao protočni pufer tokom faze disocijacije. Eksperimentalni podaci se tokom vremena beleže kao 'rezonanatne jedinice' (RUs), koje predstavljaju proizvoljne jedinice koje direktno odgovaraju SPR signalu. RU jedinice su direktno proporcionalne promenama refraktornog indeksa na površini čipa, što zauzvrat predstavlja približnu meru mase vezanog analita. Vlasnički programski paket BIAevaluation može da se upotrebi za obradu podataka i prilagođavanje modela vezivanja skupovima podataka. Konstante brzine povratne asocijacije (ka, M<-1>s<-1>) i disocijacije (kd, s<-1>) omogućavaju izračunavanje afinitetnih konstanti disocijacije (KD, M).

[0238] Afinitet vezivanja između svakog ispitivanog IgG i humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 procenjen je upotrebom testova u kojima je antitelo kovalentno kuplovano aminskom vezom sa površinom vlasničkog čipa CM5 do finalne površinske gustine od približno 2 000 RU. Površina čipa je regenerisana između ciklusa jednom injekcijom tokom 40 sekundi 10 mM glicina pH 2.0 za uklanjanje liganda vezanog za antitelo. Regeneracija nije rezultovala značajnim gubitkom aktivnosti vezivanja peptida.

[0239] Serije razblaženja sintetskog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (1.6 - 100 nM) su uzastopno propuštane preko površine sa antitelom tokom dovoljno vremena da se zapaze senzorgrami koji su mogli pouzdano da se prilagode odgovarajućem modelu vezivanja. Podaci za blank referentnu protočnu ćeliju oduzeti su od svakog skupa podataka za IgG i obavljeno je dvostruko kontrolno oduzimanje podataka za blank uzorak sa puferom sa nultom koncentracijom od glavnog skupa podataka da bi se umanjilo dejstvo bilo kakvih artefakata pufera ili efekti nespecifičnog vezivanja. Odgovarajući model vezivanja je zatim istovremeno prilagođen podacima iz svake titracije analita upotrebom programa BIAevaluation.

[0240] Validnost podataka procenjena je upotrebom izračunate vrednosti hi<2>, sa prihvatljivom vrednošću ispod 2 RU<2>. Ukupan uspeh prilagođavanja procenjen je upotrebom reziduala, pri čemu je devijacija ispod 2 RU smatrana prihvatljivom.

[0241] Primer rezultata za Abet0007 IgG2 prikazan je na slici 3. Srednja konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd) i konstanta disocijacije (KD) iznose 1.6 x 105 M<-1>s<-1>, 7.4 x 10<-2>s<-1>i 473 nM redom. Ovi parametri su dobijeni prilagođavanjem modela Langmuira 1:1 podacima.

1.8 Određivanje funkcionalnih karakteristika vodećih antitela deplecijom beta-amiloidnih peptida u humanoj plazmi

[0242] Vodeća antitela ispitana su u testu deplecije u plazmi da bi se istražila njihova sposobnost da imunoprecipitiraju humani beta-amiloidni peptid 1-42 iz humane krvne plazme. Ovaj test je upotrebljen za obezbeđivanje dokaza o funkcionalnoj efikasnosti za svako antitelo. Ukratko, uzorci humane plazme inkubirani su sa svakim ispitivanim IgG tokom 3 časa posle čega su antitela i svi vezani ligandi uklonjeni. Sadržaj beta-amiloidnog peptida 1-42 u uzorcima humane plazme ispitan je upotrebom standardnih tehnika pre i posle imunoprecipitacije, i ove vrednosti su upotrebljene za određivanje efikasnosti antitela. U uzorcima plazme ispitana je i bilo kakva deplecija beta-amiloidnog peptida 1-40 za procenu specifičnosti vodećih antitela.

[0243] Svako ispitivano antitelo je odvojeno kovalentno vezano za magnetne perle sa karboksilnom kiselinom Dynabeads® M-270 (Invitrogen Life Technologies, VB; kat: 143-05D) prema uputstvima proizvođača. Za svaki ispitivani IgG 100 µl Dynabeads oprano je dva puta sa 100 µl 25 mM MES, pH 5 (Sigma, VB; kat: M5287) upotrebom magneta za odvajanje perli od suspenzije. Neposredno pre upotrebe, EDC (Pierce, Thermo Scientific, SAD; kat: 22981) je rastvoren u hladnom 25 mM MES, pH 5 do finalne koncentracije od 50 mg/ml. Rastvor od 50 mg/ml NHS (Pierce, Thermo Scientific; kat: 24500) je na sličan način pripremljen u 25 mM MES, pH 5. 50 µl rastvora NHS i 50 µl rastvora EDC dodato je opranim Dynabeads, koje su dobro promešane i inkubirane uz sporu rotaciju na sobnoj temperaturi 30 minuta. Magnet je upotrebljen za taloženje perli i supernatant je uklonjen. Perle su oprane dva puta sa 100 µl 25 mM MES, pH 5. Svaki ispitivani IgG razblažen je do 0.6 mg/ml u ukupnoj zapremini od 100 µl 25 mM MES, pH 5. Oprane perle su resuspendovane u rastvoru liganda i inkubirane najmanje 30 minuta na sobnoj temperaturi sa sporom rotacijom. Perle su zatim staložene upotrebom magneta i oprane jednom sa 100 µl 50 mM Tris pufera, pH 7.4 (Sigma, VB). Perle su zatim resuspendovane u 100 µl Marvel-PBS (3% tež./zapr.) i inkubirane preko noći na 4°C. Zatim su perle oprane dva puta sa Dulbecco-vim PBS (100 µl) i resuspendovane u PBS (100 µl).

[0244] Uzorci EDTA-plazma su uzeti od anonimnih davalaca u zdravstvenoj klinici AstraZeneca u Södertälje, Švedska. Približno 100 ml krvi je uzeto od svakog davaoca, i sakupljeno u dve epruvete od 50 ml. EDTA je dodat do finalne koncentracije od 5 mM da bi se sprečilo zgrušavanje, i epruvete su centrifugirane na 4 000 x g tokom 10 minuta na 4°C. Supernatant (plazma) je sakupljen, alikvotiran u epruvete od 1 ml, i skladišten na -80 °C do upotrebe. U uzorcima je ispitan sadržaj beta-amiloidnog peptida 1-42 i beta-amiloidnog peptida 1-40 kao što je dole opisano.

[0245] Svaki set perli obloženih antitelom odvojeno je inkubiran sa alikvotom od 1 ml EDTA-plazma 3 časa na 4 °C sa sporom rotacijom, i perle su zatim staložene upotrebom magneta. Supernatant je pažljivo uklonjen iz perli i ispitan na beta-amiloidni peptid 1-42 i beta-amiloidni peptid 1-40 kao što je dole opisano.

[0246] Analiza sadržaja beta-amiloidnog peptida 1-40 u uzorcima plazme sprovedena je upotrebom kompleta Aβ 40 Human ELISA Kit proizvođača Invitrogen (VB; kat: KHB3482) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, humani beta-amiloidni 1-40 standard upotrebljen je za dobijanje serije razblaženja od 1 ng/ml naniže do 7.81 pg/ml. Razblaženja su napravljena upotrebom standardnog pufera za razblaživanje koji sadrži 1 tabletu inhibitora proteaze (Roche, VB; kat: 11697498001) na 50 ml razblaživača. 50 µl svakog razblaženja je zatim dodato u različite mikrotitarske bunarčiće prethodno obložene vlasničkim monoklonskim antitelom specifičnim za N-terminalni kraj beta-amiloidnog peptida. Uzorci EDTA-plazma su centrifugirani 10 minuta na 4 °C i 2 000 x g i 50 µl supernatanta svakog uzorka dodato je u posebni bunarčić na istoj mikrotitarskoj ploči kao standardi. Zatim je u svaki mikrotitarski bunarčić dodato 50 µl vlasničkog Hu Aβ antitela za detekciju, koje specifično prepoznaje C-terminalni kraj beta-amiloidnog peptida 1-40. Ploča je pokrivena filmom za ploče i inkubirana 3 časa na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploča je oprana četiri puta sa 400 µl pufera za pranje, uz ostavljanje ploče da se natapa 15-30 sekundi tokom svakog pranja. Ploča je zatim okrenuta i osušena lupkanjem. 100 µl vlasničkog anti-zečjeg IgG HRP konjugata dodato je u svaki bunarčić, ploča je pokrivena filmom za ploče, i uzorci su inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ponovo, ploča je oprana četiri puta sa 400 µl pufera za pranje, uz ostavljanje ploče da se natapa 15-30 sekundi tokom svakog pranja. Ploča je zatim okrenuta i osušena lupkanjem. U svaki bunarčić dodato je 100 µl vlasničkog stabilizovanog hromogena, i ploča je inkubirana u mraku 20 minuta na sobnoj temperaturi. Ovo je praćeno dodavanjem 100 µl vlasničkog rastvora za zaustavljanje reakcije u svaki bunarčić. Apsorbancija svakog bunarčića očitana je na 450 nm unutar 2 časa od dodavanja rastvora za zaustavljanje reakcije. Standardna kriva je dobijena iz serija razblaženja humanog beta-amiloidnog 1-40, i ovo je upotrebljeno za određivanje koncentracije humanog beta-amiloidnog 1-40 u ispitivanim uzorcima EDTA-plazma.

[0247] Analiza sadržaja beta-amiloidnog peptida 1-42 u uzorcima plazme sprovedena je upotrebom kompleta INNOTEST® β-Amiloid(1-42)proizvođača Innogenetics (Belgija; kat: 80177) suštinski prema uputstvima proizvođača. Ukratko, standard humanog beta-amiloida 1-42 upotrebljen jeza pravljenje serije razblaženja od 1 ng/ml naniže do 7.81 pg/ml. 100 µl svakog razblaženja je zatim dodato u različite mikrotitarske bunarčiće prethodno obložene vlasničkim monoklonskim antitelom specifičnim za C-terminalni kraj humanog beta-amiloidnog peptida 1-42. Uzorci EDTA-plazma su centrifugirani 10 minuta na 4 °C i 2000 x g i 100 µl supernatanta svakog uzorka dodato je u posebni bunarčić na istoj mikrotitarskoj ploči kao standardi. Ploča je pokrivena filmom za ploču i inkubirana 3 časa na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploča je oprana pet puta sa 400 µl pufera za pranje i zatim okrenuta i osušena lupkanjem. 100 µl vlasničkog konjugata 1 (C1HS), koji prepoznaje N-terminalni kraj beta-amiloidnog peptida, dodato je u svaki bunarčić. Ploča je prekrivena filmom za ploču, i uzorci su inkubirani 1 čas na sobnoj temperaturi. Ponovo, ploča je oprana pet puta sa 400 µl pufera za pranje, i zatim okrenuta i osušena lupkanjem. Zatim je u svaki bunarčić dodato 100 µl konjugata 2 (C2), streptavidinHRP konjugata koji se vezuje za biotinilisano C1HS antitelo. Ploča je pokrivena filmom za ploču i inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploča je oprana pet puta sa 400 µl pufera za pranje, i zatim okrenuta i osušena lupkanjem. 100 µl rastvora vlasničkog supstrata dodato je u svaki bunarčić, ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim je u svaki bunarčić dodato 100 µl rastvora za zaustavljanje reakcije. Apsorbancija svakog bunarčića očitana je na 450 nm unutar 15 minuta od dodavanja rastvora za zaustavljanje reakcije. Standardna kriva je napravljena iz serije razblaženja humanog beta-amiloida 1-42, i ovo je zatim upotrebljeno za određivanje koncentracije humanog beta-amiloida 1-42 u ispitivanim uzorcima EDTA-plazma.

[0248] U jednom eksperimentu, antitelo Abet0007 IgG2 je redukovalo nivoe humanog betaamiloidnog peptida 1-42 u plazmi sa 80.47 pg ml-1 na 60.56 pg ml-1 (redukcija od 25%). U drugom eksperimentu, nivoi su redukovani sa 197.43 pg ml-1 na 154.45 pg ml-1 (redukcija od 22%).

1.9 Identifikacija vodećih klonova sa niskim afinitetom za nativni beta-amiloid upotrebom in vitro imunohistohemije

[0249] Ispitivana je sposobnost vodećih antitela da se vežu za beta-amiloid, u cilju identifikacije vodećih klonova sa niskim afinitetom za nativne oblike beta-amiloidnog peptida. Ukratko, vodeća antitela su podvrgnuta skriningu na isečcima humanog mozga obolelog od Alchajmerove bolesti i isečcima mozga miševa Tg2576 da bi se identifikovala anti beta-amiloidna 1-42 antitela koja se vezuju za nativni amiloid in vitro.

[0250] Tg2576 miševi su transgeni miševi koji prekomerno eksprimiraju gen za humani amiloidni prekursorski protein (APP). Ovaj gen nosi dve tačkaste mutacije na mestu cepanja gama-sekretazom (Lys670Asn i Met671Leu) koje vode formiranju beta-amiloidnih plakova u korteksu i hipokampusu miševa, koje počinje u uzrastu od približno 9 meseci.

[0251] Tkivo humanog mozga je izolovano iz frontalnog korteksa (inferiorni frontalni girus) dve osobe sa ozbiljnom Alchajmerovom bolešću (ApoE genotip 3/3, Brakov stadijum 6 i ApoE genotip 4/3, Brakov stadijum 5, redom). Kao kontrola, ekvivalentno tkivo je izolovano od jedne osobe koja nije dementna (ApoE genotip 3/3, Brakov stadijum 1). Sva tri tkiva su nabavljena iz holandske banke mozgova (NBB). Kvalitet isečaka potvrđen je bojenjem hematoksilinom/eozinom pre upotrebe. Tkivo mišjeg mozga izolovano je iz miševa Tg2576 u uzrastu od 15 meseci (2 miša), 18 meseci (6 miševa), i 22 meseca (2 miša).

[0252] Isečci mozga obloženi parafinom, debljine 4-6 µm, pripremljeni su za imunohistohemiju prvo uklanjanjem parafinske potporne matrice. Isečci su oprani ksilenom (5 minuta x2), apsolutnim etanolom (3 minuta x2), 95% etanolom (3 minuta x2), 70% etanolom (3 minuta x2), 90% mravljom kiselinom (Sigma Aldrich, VB; kat: 06440; 10 minuta), česmenskom vodom (20 minuta x3) i PBS-om (5 minuta x2). Isečci su zatim prokuvani u rastvoru Diva Decloaker (Biocare Medical, SAD; kat: DV2004 G1) u mikrotalasnoj peći 20 minuta na 100°C. Uzorci su zatim ohlađeni do 40°C u vodenom kupatilu, a zatim oprani destilovanom vodom (5 minuta) i PBS-om (5 minuta x3).

[0253] Vodeća IgG2 antitela su ispitana u koncentracijama od 2, 5 i 20 µg ml<1>. Vezivanje ovih IgG antitela detektovano je upotrebom zečjeg anti-humanog sekundarnog antitela (Dako, Danska; kat: A0482) u razblaženju 1 prema 400, praćenim OmniMap anti-zečjim antitelom konjugovanim sa HRP (Ventana Medical Systems, SAD; kat: 760-4311). Signal je detektovan upotrebom kompleta ChromoMap DAB (Ventana Medical Systems, SAD; kat: 760-159). Ovi koraci bojenja sprovedeni su upotrebom automatizovanog sistema za pripremu slajdova BenchMark (Ventana Medical Systems, SAD) prema standardnim protokolima.

[0254] Ocenjivanje bojenja sprovodila su najmanje dva nezavisna istraživača slepom metodom pod optičkim uveličanjem 20-40x. In vitro vezivanje plakova označeno je upotrebom skale od 0 (nema bojenja plakova) do 4 (intenzivno bojenje plakova).

[0255] Abet0007 IgG2 je pokazao odsustvo bojenja plakova bilo u humanim mozgovima obolelim od Alchajmerove bolesti ili mozgovima miševa Tg2576 (skor = 0). Nasuprot tome, pozitivna kontrola antitela proizvela je skor od 4 na srodnim isečcima pod istim uslovima. Reprezentativni snimci prikazani su na slici 4.

Primer 2. Optimizacija antitela Abet0007 putem usmerene mutacije regiona za određivanje komplementarnosti 3 (CDR3)

2.1 Konverzija parentalnog klona Abet0007 u format scFv

[0256] Parentalni klon je pretvoren iz formata IgG2 u format jednolančanog varijabilnog fragmenta (scFv) tokom pripreme za optimizaciju afiniteta. Kodon-optimizovani varijabilni domeni teškog lanca (VH) i varijabilni domeni lakog lanca (VL) umnoženi su odvojeno sa svojih odgovarajućih IgG vektora uz dodavanje specifičnih mesta za kloniranje i fleksibilnog linkerskog regiona. Zatim je sproveden rekombinatorni PCR za generisanje kompletnog konstrukta scFv, koji je kloniran u fagmidni vektor pCantab10.5, suštinski kao što je opisano kod Vaughan et al. (Vaughan et al., 1996). Vektor pCantab10.5 je modifikovana verzija vektora pCantab6 koja sadrži dodatna restrikciona mesta za olakšavanje dodavanja oznaka drugačijih od standardnih His i myc oznaka.

2.2 Optimizacija Abet0007 usmerenom mutagenezom

[0257] Vodeće antitelo (Abet0007) je optimizovano za poboljšani afinitet prema humanom betaamiloidnom peptidu 1-42 upotrebom pristupa usmerene mutageneze sa selekcijama prikaza na fagu na osnovu afiniteta. Velike biblioteke scFv-fag poreklom od Abet0007 stvorene su oligonukleotidnom usmerenom mutagenezom regiona za određivanje komplementarnosti 3 (CDR3) varijabilnog teškog (VH) i varijabilnog lakog (VL) lanca upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije kao što je opisano kod Clackson and Lowman ((2004) A Practical Approach, Oxford University Press).

[0258] Biblioteke su podvrgnute postupcima selekcije prikaza na fagu na osnovu afiniteta kako bi se obogatile varijantama sa većim afinitetom prema humanom beta-amiloidnom peptidu 1-42. Selekcije su suštinski sprovedene kao što je prethodno opisano (Hawkins et al., 1992; Schier et al., 1996; Thompson et al., 1996). Ukratko, čestice faga sa scFv inkubirane su sa biotinilisanim humanim beta-amiloidnim peptidom 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117) u rastvoru. Čestice ScFvfag koje su se vezale za antigen su zatim uhvaćene na streptavidinom obloženim paramagnetnim perlama (Dynabeads® M280, Invitrogen Life Sciences, VB) prema uputstvima proizvođača. Selektovane čestice scFv-fag su zatim izdvojene kao što je prethodno opisano (Osbourn et al., 1996), i postupak selekcije je ponavljan u prisustvu opadajućih koncentracija biotinilisanog humanog beta-amiloidnog 1-42 antigena (200 nM do 2 nM tokom 3 ciklusa).

2.3 Identifikacija poboljšanih klonova upotrebom testa direktnog vezivanja

[0259] Hiljadu sedamsto šezdeset scFv je nasumično selektovano iz selekcionih ciklusa 2 i 3 u okviru pristupa usmerene mutageneze opisanog u odeljku 2.2. Ovi klonovi su podvrgnuti skriningu upotrebom testa direktnog vezivanja suštinski kao što je opisano u odeljku 1.3. Ukratko, kod neprečišćenih scFv iz periplazmatskih preparata ispitivano je povećano vezivanje za biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42 i detektovano upotrebom HTRF™ tehnologije sa detekcionim reagensima streptavidin kriptatom i anti-6his-XL665.

[0260] Neprečišćeni scFv iz periplazmatskih preparata pripremljen je u 50 mM MOPS puferu pH 7.4 koji uključuje 0.5 mM EDTA i 0.5 M saharoze i zatim razblažen do 1% u puferu za test koji sadrži 50 mM MOPS pH 7.4 (Sigma, VB; kat: M9381), 0.4 M kalijum fluorida (BDH Chemicals, SAD; kat: 103444T), 0.1% goveđeg serumskog albumina bez masnih kiselina (Sigma, VB; kat: A6003) i 0.1% Tween 20 (zapr./zapr.) (Sigma, VB; kat: P2287) upotrebom ploče sa V dnom sa 384 bunarčića Greiner (Greiner BioOne, Nemačka; kat: 781280). 5 µl razblaženog uzorka scFv preneto je na ploču za analizu (Costar® 384 bunarčića, crni plitki bunarčići, Corning Life Sciences; kat: 3676) upotrebom robota za rukovanje tečnošću MiniTrak™ (PerkinElmer, SAD). Zatim je u svaki bunarčić dodato 5 µl pufera za test.20 nM rastvor biotinilisanog humanog beta-

1

amiloidnog peptida 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117) pripremljen je u puferu za test i 5 µl ovog rastvora dodato je na ploču za analizu. Detekcioni reagensi streptavidin kriptat (Cisbio International, Francuska; kat: 610SAKLB) i anti-His6-XL665 (Cisbio International, Francuska; kat: 61HISXLB) kombinovani su u puferu za test da bi se dobile koncentracije 7 nM streptavidin kriptata i 60 nM anti-His6-XL665, a zatim je 5 µl ovog koktela za detekciju dodato u svaki bunarčić ploča za analizu. Bunarčići sa nespecifičnim vezivanjem (negativne kontrole) definisani su za svaku ploču zamenom uzorka scFv sa 5 µl pufera za test. Ploče za analizu su zatvorene filmom za ploče i inkubirane 2.5 časa na sobnoj temperaturi pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na talasnim dužinama emisije od 620 nm i 665 nm upotrebom čitača ploča EnVision (PerkinElmer, SAD). Analiza podataka sprovedena je kao što je prethodno opisano (odeljak 1.3) i vrednosti % Delta F su upotrebljene za poređenje signala u testu u susednim bunarčićima. "Pogodak" je definisan kao uzorak scFv koji je generisao % Delta F veći od signala zapaženog kod Abet0007 scFv.

2.4 Potvrđivanje poboljšanih klonova upotrebom testa kompeticije za epitop

[0261] Klonovi koji su ispoljili veće vezivanje za humani beta-amiloidni peptid 1-42 od parentalnog klona Abet0007 podvrgnuti su sekvenciranju DNK (Osbourn et al., 1996; Vaughan et al., 1996). scFv sa jedinstvenim proteinskim sekvencama eksprimirani su u E. coli i prečišćeni afinitetnom hromatografijom praćenom izmenom pufera. Afiniteti vezivanja ovih scFv su zatim ispitani u testu kompeticije za epitop nasuprot referentnog antitela označenog kao Abet0042, koje ima sličan afinitet prema humanom beta-amiloidnom peptidu 1-42 kao Abet0007. U ovom testu kompeticije, vezivanje Abet0042 IgG za biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42 kompetira sa ispitivanim uzorcima scFv. Vezivanje Abet0042 IgG za biotinilisani humani betaamiloidni peptid 1-42 detektuje se upotrebom HTRF™ tehnologije kao što je prethodno opisano (odeljak 1.6). Ukratko, serije razblaženja prečišćenog scFv dodaju se smeši Abet0042 IgG, biotinilisanog beta-amiloidnog peptida 1-42, streptavidin kriptata i antitela protiv humanog Fc IgG XL665. Vremenski razložena fluorescencija očitava se posle dva časa inkubacije na sobnoj temperaturi.

[0262] Prečišćeni scFv je serijski razblažen u puferu za test koji sadrži 50 mM MOPS pufera pH 7.4 (Sigma, VB; kat: M9381), 0.4 M kalijum fluorida (BDH Chemicals, SAD; kat: 103444T), 0.1% goveđeg serumskog albumina bez masnih kiselina (Sigma, VB; kat: A6003) i 0.1% Tween 20 (Sigma, VB; kat: P2287) upotrebom ploče sa U dnom sa 96 bunarčića Greiner (Greiner BioOne, Nemačka; kat: 650201).5 µl svakog razblaženja scFv preneto je u duplikatu na ploču za analizu (Costar® 384 bunarčića, crni plitki bunarčići, Corning Life Sciences; kat: 3676)

2

upotrebom robota za rukovanje tečnošću MiniTrak™ (PerkinElmer, SAD). 20 nM rastvor biotinilisanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117) pripremljen je u puferu za test i 5 µl rastvora biotinilisanog peptida dodato je na ploče za analizu, da bi se dobila finalna koncentracija od 5 nM peptida u finalnoj zapremini testa od 20 µl. Ploče za analizu su zatvorene filmom za ploče i inkubirane na sobnoj temperaturi 1 čas. Streptavidin kriptat i antitelo protiv humanog Fc IgG XL665 su kombinovani u koncentraciji od 7 nM i 20 nM, redom u puferu za test i 5 µl ovog rastvora dodato je na ploču za analizu. Abet0042 IgG je razblažen do 2.4 nM u puferu za test i 5 µl je dodato na ploču za analizu da bi se dobila finalna koncentracija IgG od 0.6 nM. Bunarčići sa nespecifičnim vezivanjem (negativne kontrole) definisani su za svaku ploču zamenom Abet0042 IgG sa 5 µl pufera za test. Ploče za analizu su zatvorene filmom za ploče i inkubirane 2 časa na sobnoj temperaturi pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na talasnim dužinama od 620 nm i 665 nm upotrebom čitača ploča EnVision (PerkinElmer, SAD).

[0263] Podaci su analizirani izračunavanjem vrednosti % Delta F i % specifičnog vezivanja za svaki uzorak. % Delta F određen je prema jednačini 1 i % specifičnog vezivanja izračunat je upotrebom jednačine 2. IC50vrednosti su određene upotrebom programa Prism (Graphpad Software, SAD) prilagođavanjem krive upotrebom četvoroparametarske logističke jednačine, kao što je opisano u jednačini 3.

Jednačina 3:

Y = Bazalni odgovor Maksimalni odgovor – Bazalni odgovor

+

1 10^((LogEC50– X)* Hilov nagib)

[0264] Gde je Y specifično vezivanje i X je logaritam koncentracije.

[0265] Primer rezultata prikazan je na slici 5. Originalno vodeće antitelo, Abet0007, ima IC50od 159 nM dok klon koji je najviše poboljšan, Abet0144, ima IC50vrednost od 5.5 nM.

2.5 Određivanje kinetičkog profila klonova sa poboljšanim afinitetom u formatu prečišćenog scFv pomoću rezonancije površinskog plazmona

[0266] Rezonancija površinskog plazmona upotrebljena je za analizu prečišćenih klonova scFv koji su pokazali značajno poboljšanje afiniteta vezivanja za humani beta-amiloidni peptid 1-42 u odnosu na parentalnu sekvencu, Abet0007, u HTRF™ testu kompeticije za epitop (odeljak 2.4). Ukratko, biosenzorski instrument BIAcore T-100 (GE Healthcare, VB) upotrebljen je za procenu kinetičkih parametara interakcije između svakog prečišćenog scFv i sintetski proizvedenog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42. Ovi eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano kod Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Za dodatne detalje videti odeljak 1.7.

[0267] Afinitet vezivanja između svakog ispitivanog scFv i humanog beta-amiloida 1-42 procenjen je upotrebom testova u kojima je biotinilisani sintetski humani beta-amiloidni peptid 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117) bio nekovalentno vezan preko biotin/streptavidin interakcije za vlasnički SA senzorski čip do finalne površinske gustine od približno 700 RU. Površina čipa je regenerisana između ciklusa jednom injekcijom u trajanju od 20 sekundi 10 mM glicina pH 2.0 za uklanjanje scFv vezanog za peptid. Regeneracija nije rezultovala značajnim gubitkom kapaciteta vezivanja peptida.

[0268] Serije razblaženja svakog prečišćenog scFv (12.5 - 400 nM) su uzastopno propuštane preko površine sa peptidom tokom vremena dovoljnog za posmatranje senzorgrama koji su mogli pouzdano da se prilagode odgovarajućem modelu vezivanja. Podaci o blanku sa puferom sa nultom koncentracijom oduzeti su od glavnog skupa podataka da bi se umanjilo dejstvo bilo kakvih artefakata pufera ili efekti nespecifičnog vezivanja. Odgovarajući model vezivanja je zatim istovremeno prilagođen podacima iz svake titracije analita upotrebom programa BIAevaluation.

[0269] Validnost podataka procenjena je upotrebom izračunate vrednosti hi<2>, sa prihvatljivom vrednošću ispod 4 RU<2>. Ukupan uspeh prilagođavanja procenjen je upotrebom reziduala, pri čemu je devijacija ispod 20 RU smatrana prihvatljivom.

[0270] Primer rezultata za Abet0144 scFv prikazan je na slici 6. Konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd) i konstanta disocijacije (KD) iznose 2.01 x 10<5>M<-1>s<-1>, 6.66 x 10<-3>s<-1>i 33.2 nM redom. Ovi parametri su dobijeni prilagođavanjem modela Langmuira 1:1 podacima.

2.6 Preoblikovanje scFv sa poboljšanim afinitetom u humani IgG1-TM

[0271] Format IgG1-TM antitela je humani IgG1 izotip koji sadrži tri pojedinačne aminokiselinske supstitucije (trostruki mutant: TM) unutar donjeg regiona zgloba i konstantnog domena CH2 (Oganesyan et al., 2008). Kada se uvede u donji region zgloba i CH2 domen humanih IgG1 molekula, trostruka mutacija L234F/L235E/P331S ('TM') izaziva znatno smanjenje njihovog vezivanja za humani CD64, CD32A, CD16 i C1q. Ove TM mutacije koriste se za stvaranje humanog izotipa sa veoma niskom efektorskom funkcijom. ScFv su preoblikovani u IgG1-TM subkloniranjem domena varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) u vektore koji eksprimiraju cele teške i lake lance humanog antitela redom. Varijabilni teški lanac je kloniran u sisarski ekspresioni vektor (pEU 1.4) koji sadrži konstantne

4

domene humanog teškog lanca i regulatorne elemente za ekspresiju celog teškog lanca IgG1-TM u sisarskim ćelijama. Slično, varijabilni domen lakog lanca kloniran je u sisarski ekspresioni vektor (pEU 4.4) za ekspresiju konstantnih domena humanog lambda lakog lanca i regulatornih elemenata za ekspresiju celog lakog lanca IgG u sisarskim ćelijama. IgG antitela su eksprimirana i prečišćena suštinski kao što je opisano u odeljku 1.5.

2.7 Modifikovanje prema sekvenci klicine linije

[0272] Aminokiselinske sekvence VHi VLdomena antitela optimizovanog afiniteta specifičnih za beta-amiloidni peptid 1-42 poravnate su sa poznatim sekvencama humane klicine linije u bazi podataka VBASE (Tomlinson et al., 1992), i najbliža klicina linija je identifikovana pomoću sličnosti sekvence. Za VHdomene optimizovane linije antitela to je bila Vh3-23 (DP-47), a za VLdomene, Vλ3-3r (DPL-23).

[0273] Postupak modifikovanja prema sekvenci klicine linije sastojao se od reverzije rezidua okvirnog regiona u VHi VLdomenima na sekvencu najbliže klicine linije u cilju postizanja identične podudarnosti sa humanim antitelima. Kod Abet0144, nijedna rezidua nije zahtevala promenu u VHdomenu (tabela 1), ali je ukupno 5 promena napravljeno u okvirnom regionu VLdomena. Ove promene su se dogodile na Kabatovim pozicijama 1, 2, 3, 40 i 81 (tabela 2). Vernier rezidue (Foote et al., 1992), nisu modifikovane prema sekvenci klicine linije, osim rezidue 2 u sekvenci lakog lanca koja je modifikovana prema sekvenci klicine linije u isto vreme kad i bočne rezidue 1 i 3. Modifikovanje prema sekvenci klicine linije ovih aminokiselinskih rezidua sprovedeno je upotrebom standardnih tehnika mesto-specifične mutageneze sa odgovarajućim mutagenim prajmerima kao što je opisano kod Clackson i Lowman (Clackson et al., 2004).

Tabela 1: Poravnanje sekvenci klonova Abet0144 i Abet0144-GL sa klicinom linijom VH3-23 (DP47). Rezidue različite od onih u klicinoj liniji su istaknute. Vernier rezidue su označene krugovima (•). Promene u VHdomenu za modifikovanje klona Abet0144 prema sekvenci klicine linije nisu napravljene.

Tabela 2: Poravnanje sekvenci klonova Abet0144 i Abet0144-GL sa klicinom linijom Vλ3-3R (DPL-23). Rezidue različite od onih u klicinoj liniji su istaknute. Vernier rezidue su označene krugovima (•). Pet promena je napravljeno u VL domenu za modifikovanje klona Abet0144 prema sekvenci klicine linije. Vernier rezidua 2 je modifikovana prema sekvenci klicine linije u isto vreme kao i rezidue 1 i 3. Reverzija ove rezidue nije uticalo na aktivnost antitela.

2.8 Određivanje kinetike vezivanja antitela IgG optimizovanog afiniteta upotrebom rezonancija površinskog plazmona

[0274] Rezonancija površinskog plazmona upotrebljena je za analizu kinetike vezivanja IgG antitela optimizovanog afiniteta (odeljak 2.6) i njihovih ekvivalenata modifikovanih prema sekvenci klicine linije (odeljak 2.7). Ukratko, biosenzorski instrument BIAcore T-100 (GE Healthcare, VB) upotrebljen je za procenu kinetičkih parametara interakcije između svakog ispitivanog IgG i sintetski proizvedenog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42. Ovi eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano kod Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Za dodatne detalje videti odeljak 1.7.

[0275] Afinitet vezivanja između svakog ispitivanog IgG i humanog beta-amiloida 1-42 procenjen je upotrebom testova u kojima je antitelo kovalentno kuplovano aminskom vezom sa površinom vlasničkog čipa CM3 do finalne površinske gustine od približno 2000 RU. Površina čipa je regenerisana između ciklusa jednom injekcijom u trajanju od 40 sekundi 10 mM glicina pH 2.0 za uklanjanje liganda vezanog za antitelo. Regeneracija nije rezultovala značajnim gubitkom kapaciteta vezivanja peptida.

[0276] Serije razblaženja sintetskog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (1.6 - 50 nM) su uzastopno propuštane preko površine sa antitelom tokom vremena dovoljnog za posmatranje senzorgrama koji su mogli pouzdano da se prilagode odgovarajućem modelu vezivanja. Podaci za blank referentnu protočnu ćeliju oduzeti su od svakog skupa podataka za IgG i obavljeno je dvostruko kontrolno oduzimanje podataka za blank uzorak sa puferom sa nultom koncentracijom od glavnog skupa podataka da bi se umanjilo dejstvo bilo kakvih artefakata pufera ili efekti nespecifičnog vezivanja. Odgovarajući model vezivanja je zatim istovremeno prilagođen podacima iz svake titracije analita upotrebom programa BIAevaluation.

[0277] Validnost podataka procenjena je upotrebom izračunate vrednosti hi2, sa prihvatljivom vrednošću ispod 2 RU2. Ukupan uspeh prilagođavanja procenjen je upotrebom reziduala, pri čemu je devijacija ispod 2 RU smatrana prihvatljivom.

[0278] Primer rezultata za Abet0144-GL (modifikovan prema sekvenci klicine linije) IgG1-TM prikazan je na slici 7. Konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd) i konstanta disocijacije (KD) iznose 2.08 x 10<5>M<-1>s<-1>, 1.97 x 10<-3>s<-1>i 9.50 nM redom. Ovi parametri su dobijeni prilagođavanjem modela Langmuira 1:1 podacima.

2.9 Određivanje profila specifičnosti IgG antitela optimizovanog afiniteta upotrebom rezonancije površinskog plazmona

[0279] Rezonancija površinskog plazmona upotrebljena je za potvrđivanje specifičnosti IgG antitela optimizovanog afiniteta za humani beta-amiloidni peptid 1-42. Ukratko, biosenzorski instrument BIAcore T-100 (GE Healthcare, VB) upotrebljen je za procenu kinetičkih parametara interakcije između svakog ispitivanog IgG i niza malih peptida uključujući sintetski proizvedeni humani beta-amiloidni peptid 1-42 i humani beta-amiloidni peptid 1-40. Ovi eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano kod Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Za dodatne detalje videti odeljak 1.7.

[0280] Afinitet vezivanja između svakog ispitivanog IgG i svakog peptida procenjen je upotrebom testova u kojima je antitelo kovalentno kuplovano aminskom vezom sa površinom vlasničkog čipa CM3 do finalne površinske gustine od približno 2 000 RU. Površina čipa je regenerisana između ciklusa jednom injekcijom u trajanju od 40 sekundi 10 mM glicina pH 2.0 za uklanjanje liganda vezanog za antitelo. Regeneracija nije rezultovala značajnim gubitkom kapaciteta vezivanja peptida.

[0281] Svaki ispitivani peptid u koncentraciji od 400 nM je uzastopno propuštan preko površine sa antitelom tokom vremena dovoljnog za posmatranje senzorgrama koji ili nisu pokazali vezivanje ili su mogli pouzdano da se prilagode odgovarajućem modelu vezivanja. Podaci za blank referentnu protočnu ćeliju oduzeti su od svakog skupa podataka za IgG i obavljeno je dvostruko kontrolno oduzimanje podataka za blank uzorak sa puferom sa nultom koncentracijom od glavnog skupa podataka da bi se umanjilo dejstvo bilo kakvih artefakata pufera ili efekti nespecifičnog vezivanja.

[0282] Primer rezultata za Abet0144-GL (modifikovan prema sekvenci klicine linije) IgG1-TM prikazan je na slici 8. Dva peptida (biotinilisani humani beta-amiloid 1-42, (rPeptide, SAD; kat: A1117) i neobeleženi humani beta-amiloid 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1165)) pokazala su snažno vezivanje za antitelo, dok tri peptida (biotinilisani humani beta-amiloid 1-42 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (Anaspec, SAD; prilagođena sinteza), biotinilisani humani beta-amiloid 1-40 (rPeptide, SAD; kat: A1111) i neobeleženi humani beta-amiloid 1-40 (Anaspec, SAD; kat: 24236)) nisu pokazala vezivanje za antitelo.

2.10 Određivanje profila specifičnosti Abet0144-GL IgG1-TM u formatu testa kompeticije za epitop

[0283] Za ispitivanje specifičnosti Abet0144-GL IgG1-TM za vezivanje sa drugim humanim beta-amiloidnim peptidima, razvijen je test kompeticije. U ovom testu fiksna koncentracija (1.5nM) biotinilisanog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117) inkubirana je sa opsegom različitih koncentracija neobeleženih humanih beta-amiloidnih peptida uključujući 1-42, 1-40, 1-16, 12-28, pyro 3-42, pyro 11-42 i 1-42 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (Anaspec kat: 20276, 24236, 24226, 24230, 29907, 29903 i 25383, redom) u prisustvu fiksnih koncentracija (0.28nM) Abet0144-GL IgG1-TM. Peptidna kompeticija procenjena je detektovanjem inhibicije vezivanja Abet0144-GL IgG1-TM za biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42 upotrebom vremenski razloženog rezonantnog prenosa energije fluorescencije (TR-FRET). Ovo uključuje upotrebu reagenasa za detekciju za TR-FRET, antitela protiv humanog Fc IgG obeleženog europijum kriptatom (CisBio International, Francuska; kat: 61HFCKLB) i streptavidina obeleženog sa XL665 (CisBio International, Francuska; kat: 611SAXLB).

Eksperimenti su postavljeni u mikrotitarskim pločama sa 384 bunarčića plitkog dna Costar.

5ul/bunarčiću biotinilisanog humanog beta-amiloida 1-42 (6nM) dodato je u sve bunarčiće ploče za analizu (osim bunarčića za negativnu kontrolu testa vezivanja) kako bi se dobila finalna koncentracija u testu od 1.5nM. 5ul pufera za test dodato je samo u bunarčiće za negativnu kontrolu testa vezivanja. Pripremljena je 1:3 serijska titracija sa 11 tačaka u duplikatu svakog ispitivanog peptida počevši od najveće koncentracije od 40uM u cilju dobijanja najveće finalne koncentracije peptida u testu od 10uM. Zatim je 5ul po bunarčiću serijskog razblaženja svakog ispitivanog peptida preneto na ploču za analizu sa 384 bunarčića. 5ul pufera za test dodato je samo u bunarčiće za ukupnu i negativnu kontrolu testa vezivanja. Abet0144-GL IgG1-TM je razblažen da bi se dobio radni rastvor od 1.12nM.5ul po bunarčiću ovog rastvora dodato je u sve bunarčiće ploče za analizu sa 384 bunarčića kako bi se dobila finalna koncentracija Abet0144-GL-IgG1-TM u testu od 0.28nM. Najzad, pripremljen je kombinovani rastvor koji sadrži antitela protiv humanog Fc obeležena europijum kriptatom (2.4nM) i streptavidin obeležen sa XL665 (60nM). 5ul po bunarčiću ovog rastvora dodato je u sve bunarčiće ploče za analizu sa 384 bunarčića kako bi se dobila finalna koncentracija antitela protiv humanog Fc obeleženog europijum kriptatom i streptavidina obeleženog sa koje su XL6650.6nM i 15nM, redom. Treba zapaziti da je finalna zapremina testa bila 20ul i da je svaka pojedinačna komponenta testa dodata u zapremini od 5ul u četvorostrukoj potrebnoj finalnoj koncentraciji za test. Svi reagensi su razblaženi u puferu za test koji sadrži 50 mM MOPS pH 7.4 (Sigma, VB; kat: M9381), 0.4 M KF (BDH Chemicals, SAD; kat: 103444T), 0.1% goveđeg serumskog albumina bez masnih kiselina (Sigma, VB; kat: A6003) i 0.1% Tween 20 (zapr./zapr.) (Sigma, VB; kat: P2287).

[0284] Ploče za analizu su inkubirane 2 časa na sobnoj temperaturi pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na talasnim dužinama emisije od 620 nm i 665 nm upotrebom čitača ploča EnVision (PerkinElmer, SAD). Podaci su analizirani izračunavanjem vrednosti % Delta F za svaki uzorak. % Delta F je određen prema jednačini 1.

Jednačina 1:

% Delta F = (odnos 665 nm/620 nm uzorka) – (odnos 665 nm/620 nm negativne x 100 kontrole)

(odnos 665 nm/620 nm negativne kontrole)

Vrednosti % Delta F su upotrebljene za izračunavanje % specifičnog vezivanja kao što je opisano u jednačini 2.

Jednačina 2:

% specifičnog vezivanja % Delta F uzorka x 100

=

% Delta F kontrole ukupnog vezivanja

[0285] Primer rezultata za Abet0144-GL IgG1-TM prikazan je na slici 9. Ovi rezultati pokazuju da se Abet0144-GL IgG1-TM vezuje za humani beta-amiloid 1-42, pyro 3-42 i pyro 11-42 peptid, ali se ne vezuje za humani beta-amiloidni peptid 1-40 ili skraćene peptide 1-16 i 12-28.

2.11 Određivanje funkcionalnih karakteristika vodećih antitela deplecijom beta-amiloidnih peptida u humanoj plazmi

[0286] Vodeća antitela su ispitivana u testu deplecije u plazmi da bi se ispitala njihova sposobnost da imunoprecipitiraju humani beta-amiloidni peptid 1-42 iz humane krvne plazme. Ovaj test je upotrebljen za obezbeđivanje dokaza za funkcionalnu efikasnost svakog antitela. Testovi su sprovedeni tačno kao što je opisano u odeljku 1.8.

[0287] U jednom eksperimentu, Abet0144-GL IgG1-TM antitelo redukovalo je nivoe humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 u plazmi sa 13.54 pg ml-1 na 9.86 pg ml-1 (redukcija od 27%). U drugom eksperimentu, nivoi su redukovani sa 40.06 pg ml-1 na 34.65 pg ml-1 (redukcija od 14%).

2.12 Identifikacija poboljšanih klonova sa nativnim vezivanjem za beta-amiloid upotrebom in vitro imunohistohemije

[0288] Ispitivana je sposobnost antitela IgG optimizovanog afiniteta da se vežu za beta-amiloid, u cilju identifikovanja vodećih klonova koji prepoznaju nativni beta-amiloidni peptid. Ukratko, vodeća antitela su podvrgnuta skriningu na isečcima humanog mozga obolelog od Alchajmerove bolesti i isečcima mozga miševa Tg2576 za identifikovanje antitela protiv beta-amiloida 1-42 koje se vezuje za nativni amiloid in vitro. Eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano u odeljku 1.9.

[0289] U ovim eksperimentima, humano tkivo mozga izolovano je iz frontalnog korteksa i hipokampusa dve osobe sa ozbiljnom Alchajmerovom bolešću (ženska osoba, ApoE 4/3, 86 godina; ženska osoba, ApoE 3/3, 67 godina). Tkivo mozga miša izolovano je iz miševa Tg2576 u uzrastu od 18 meseci (6 miševa). Antitela su ispitivana u koncentracijama od 2,5 i 20 ug ml<1>.

[0290] U jednom eksperimentu, antitelo Abet0144-GL IgG1-TM nije bojilo difuzne plakove (DP) ili plakove kod cerebralne amiloidne angiopatije (CAA) (skor = 0). Ono je, međutim, bojilo guste plakove (CP) sa skorom od 1 na isečcima mozga miševa Tg2576, i sa skorom od 1.5 na humanim isečcima mozga obolelog od AD. Nasuprot tome, pozitivna kontrola antitela proizvela je skor od 3-4 na svim plakovima (CP, DP, CAA) na srodnim isečcima pod istim uslovima. Reprezentativni snimci prikazani su na slici 10.

Primer 3. Optimizacija antitela Abet0144-GL putem mutacije svih šest CDR regiona uključujući bočne Vernier rezidue

3.1 Pretvaranje parentalnog klona Abet0144-GL u format scFv kompatibilan sa ribozomalnim prikazom

[0291] Parentalni klon pretvoren je iz formata IgG1-TM u format jednolančanog varijabilnog fragmenta (scFv) tokom pripreme za optimizaciju afiniteta. Varijabilni domeni teškog lanca (VH) i varijabilni domeni lakog lanca (VL) sa optimizovanim kodonima umnoženi su odvojeno sa svojih odgovarajućih IgG vektora uz dodatak specifičnih mesta za kloniranje i fleksibilnog linkerskog regiona. Zatim je sproveden rekombinatorni PCR za generisanje kompletnog scFv konstrukta, koji je kloniran u modifikovani pUC vektor (pUC-RD) koji sadrži strukturne karakteristike neophodne za ribozomalni prikaz. Ove karakteristike uključuju 5' i 3' strukturu drška-petlja za sprečavanje degradacije transkripta iRNK egzonukleazama, sekvencu Shine-Dalgarno za podsticanje vezivanja ribozoma za transkript iRNK, i spejser genelll koji omogućava translatiranom molekulu scFv da se uvije dok i dalje ostaje vezan za ribozom (Groves et al., 2005).

3.2 Optimizacija Abet0144-GL usmerenom mutagenezom

[0292] Vodeće antitelo (Abet0144-GL) je dodatno optimizovano za poboljšani afinitet prema humanom beta-amiloidnom peptidu 1-42 upotrebom pristupa usmerene mutageneze sa selekcijama na osnovu afiniteta pomoću ribozomalnog prikaza. Velike scFv-ribozomalne biblioteke poreklom od Abet0144-GL stvorene su pomoću oligonukleotidne usmerene

1

mutageneze svih šest regiona za određivanje komplementarnosti (CDR regiona) varijabilnog teškog (VH) i varijabilnog lakog (VL) lanca upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije kao što je opisano kod Clackson i Lowman (Clackson et al., 2004). Mutirane sekvence iz svakog CDR optimizovane su u odnosu na afinitet kao posebna biblioteka. Pet Vernier rezidua koje prethode VHCDR1 (Kabatove rezidue 26-30) takođe su randomizovane upotrebom usmerene mutageneze i ove sekvence su kombinovane i podvrgnute sazrevanju sa ostatkom biblioteke VHCDR1. Sve biblioteke su podvrgnute selekcijama na osnovu afiniteta pomoću ribozomalnog prikaza kako bi se obogatile varijantama sa većim afinitetom prema humanom beta-amiloidnom peptidu 1-42. Selekcije su sprovedene suštinski kao što je prethodno opisano (Hanes et al., 2000).

[0293] Ukratko, šest biblioteka usmerene mutageneze vodećeg klona Abet0144-GL, po jedna za svaki CDR, odvojeno su transkribovane u iRNK. Upotrebom postupka prekinute translacije, formirani su tercijarni kompleksi iRNK-ribozom-scFv (Hanes et al., 1997). Ovi kompleksi su zatim podvrgnuti selekciji u četiri ciklusa inkubiranjem u prisustvu opadajućih koncentracija sintetskog biotinilisanog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (Bachem, Nemačka; kat: H-5642) (100 nM do 10 nM) za selekciju varijanti sa višim afinitetom prema humanom betaamiloidnom peptidu 1-42. Oni kompleksi koji se vezuju za antigen su zatim zarobljeni na paramagnetnim perlama obloženim streptavidinom (Dynabeads™, Invitrogen, VB; kat: 112-05D) i nespecifični ribozomalni kompleksi su uklonjeni pranjem. Zatim je izolovana iRNK iz vezanih ribozomalnih kompleksa, prevedena reverznom transkripcijom u cDNK, a zatim amplifikovana pomoću PCR. Ova DNK je upotrebljena za sledeći ciklus selekcije.

[0294] Posle četiri ciklusa afinitetnog sazrevanja, svaki proizvod selekcije je kloniran u svrhu skrininga. ScFv izolovani pomoću ribozomalnog prikaza klonirani su u fagmidni vektor pCANTAB6 pomoću digestije restrikcionom endonukleazom NotI/NcoI konstrukta ribozomalnog prikaza (New England BioLabs, SAD; kat: R0189L, R0193L) praćene ligacijom u pCANTAB6 digestiran pomoću NotI/NcoI upotrebom ligaze T4 DNK (New England BioLabs, SAD; kat: M0202L) suštinski kao što je opisano kod McCafferty et al. (McCafferty et al., 1994).

3.3 Identifikacija poboljšanih klonova upotrebom testa kompeticije za epitop

[0295] Dve hiljade dvadeset četiri scFv koji su nasumično odabrani iz selekcionih ciklusa 3 i 4 u okviru pristupa usmerene mutageneze opisanog u odeljku 3.2 eksprimirani su u bakterijama da bi se proizveo neprečišćeni periplazmatski scFv. Oni scFv koji su bili sposobni da vežu sintetski humani beta-amiloidni peptid 1-42 preko istog epitopa kao Abet0144-GL IgG1-TM identifikovani su u testu u formatu kompeticije, upotrebom platforme HTRF™. Specifično, rezonantni prenos energije fluorescencije (FRET) izmeren je između streptavidin kriptata

2

(povezanog sa biotinilisanim beta-amiloidnim peptidom 1-42) i antitela protiv humanog Fc XL665 (povezanog sa Abet0144-GL IgG1-TM) u prisustvu jedne koncentracije svakog neprečišćenog periplazmatskog ispitivanog scFv. Uspešno zauzimanje epitopa Abet0144-GL IgG1-TM na peptidu pomoću scFv rezultovala je redukcijom FRET, mereno na fluorescentnom čitaču ploča.

[0296] Signal 'ukupnog' vezivanja određen je analizom vezivanja Abet0144-GL IgG1-TM za sintetski humani beta-amiloidni peptid 1-42 u odsustvu kompetitorskog peptida. Signali 'uzorka' dobijeni su analizom vezivanja Abet0144-GL IgG1-TM za sintetski humani beta-amiloidni peptid 1-42 u prisustvu ispitivanog uzorka scFv. Najzad, uzorak 'blanka kriptata' određen je analizom fluorescencije posredovane isključivo koktelom reagensa za detekciju.

[0297] Neprečišćeni periplazmatski scFv isporučeni su u puferu za uzorak koji se sastoji od 50 mM MOPS, pH 7.4, 0.5 mM EDTA, i 0.5 M saharoze. Za određivanje profila, uzorci scFv su razblaženi na ploči sa V dnom sa 384 bunarčića do 50% originalne koncentracije štok rastvora u puferu za test, koji se sastoji od 50 mM MOPS, pH 7.4, 0.4 M kalijum fluorida, 0.1% goveđeg serumskog albumina bez masnih kiselina i 0.1% Tween 20 (zapr./zapr.). 5 µl svakog novorastvorenog scFv preneto je u bunarčiće 'uzorak' crne, plitke, nevezujuće ploče sa 384-bunarčića sa čvrstim dnom za analizu upotrebom robota za rukovanje tečnošću. Preostali reagensi (pripremljeni u puferu za test) dodati su na ploču za analizu multikanalnom pipetom sledećim redom: 5 µl pufera za uzorak (u bunarčiće 'ukupno' i 'blank kriptata'), 10 µl pufer za test (u bunarčiće 'blank kriptata'), 5 µl 2 nM Abet0144-GL IgG1-TM (u bunarčiće 'uzorak' i 'ukupno'), 5 µl 5 nM biotinilisanog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (u bunarčiće 'uzorak' i 'ukupno'), i 5 µl koktela za detekciju, koji se sastoji od 6 nM streptavidin kriptata i 60 nM anti-His6-XL665 (u sve bunarčiće). Ploče za analizu su zatvorene filmom za ploču, a zatim inkubirane 3 časa na sobnoj temperaturi u mraku, pre merenja vremenski razdvojene fluorescencije na talasnim dužinama emisije od 620 i 665 nm na fluorescentnom čitaču ploča.

[0298] Podaci su analizirani izračunavanjem vrednosti % Delta F za svaki uzorak. % Delta F određen je prema jednačini 4.

Jednačina 4:

% Delta F = (odnos 665 nm/620 nm uzorka) – (odnos 665 nm/620 nm blanka x 100 kriptata)

(odnos 665 nm/620 nm blanka kriptata)

[0299] Vrednosti Delta F upotrebljene za izračunavanje normalizovanih vrednosti vezivanja kao što je opisano u jednačini 5.

Jednačina 5:

Normalizovani podaci (% od ukupno) = % Delta F uzorka x 100

% Delta F kontrole ukupnog

vezivanja

[0300] Neprečišćeni periplazmatski scFv koji pokazuje značajnu inhibiciju vezivanja Abet0144-GL IgG1-TM za beta-amiloidni peptid 1-42 podvrgnuti su sekvenciranju DNK (Osbourn et al., 1996; Vaughan et al., 1996). scFv za koje je nađeno da imaju jedinstvene proteinske sekvence eksprimirani su u E. coli i prečišćeni afinitetnom hromatografijom praćenom izmenom pufera.

[0301] Aktivnost svakog prečišćenog scFv određena je ispitivanjem serije razblaženja scFv (tipično 4 pM - 1200 nM) u testu kompeticije za epitop koji je gore opisan. Podaci su ponovo analizirani izračunavanjem vrednosti % Delta F i % ukupnog vezivanja za svaki uzorak. Pored toga, vrednost % inhibicije za svaku koncentraciju prečišćenog scFv takođe je izračunata kao što je opisano u jednačini 6:

Jednačina 6:

% Inhibicije = 100 - % ukupnog vezivanja

[0302] Koncentracija uzorka ScFv prikazana je grafički u odnosu na % inhibicije upotrebom naučnog kompjuterskog programa za grafički prikaz, i bilo kakvi odgovori zavisni od koncentracije prilagođeni su nelinearnim krivama regresije. Vrednosti IC50dobijene su iz ovih analiza sa Hilovim nagibima ograničenim na vrednost -1. Najaktivniji klon iz ovog ciklusa selekcija, Abet0286, imao je IC50od 1.8 nM i potekao je iz biblioteke usmerene mutageneze VLCDR1.

[0303] Izvori reagenasa/opreme: MOPS (Sigma, VB; kat: M9381), kalijum fluorid (BDH chemicals, SAD; kat: A6003), goveđi serumski albumin bez masnih kiselina (Sigma, VB; kat: A6003), Tween 20 (Sigma, VB; kat: P2287), Abet0144-GL IgG1-TM (proizveden u laboratoriji), biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42 (rpeptide, SAD; kat: A1117), streptavidin kriptat (Cisbio, Francuska; kat: 610SAKLB), anti-His6-XL665 (Cisbio, Francuska; kat: 61HISXLB), ploče za analizu sa 384 bunarčića (Corning, Costar Life Sciences; kat: 3676), ploče za razblaživanje sa 384 bunarčića (Greiner BioOne, Nemačka; kat: 781280), robot za rukovanje tečnošću (MiniTrak™, Perkin Elmer, SAD), fluorescentni čitač ploča (Envision™, Perkin Elmer, SAD), HTRF tehnologija (Cisbio International, Francuska), kompjuterski program za grafičko prikazivanje/statističku obradu (Prism, Graphpad SAD).

4

3.4 Rekombinacija proizvoda uspešne selekcije za proizvodnju "dvokomponentnih" biblioteka, i naknadna optimizacija njihovih afiniteta

[0304] Test kompeticije za epitop opisan u odeljku 3.3 korišćen je da se proceni da li je određena scFv-ribozomalna biblioteka bila podvrgnuta sazrevanju afiniteta tokom prva četiri ciklusa selekcije. Dve biblioteke, biblioteke usmerene mutageneze VHCDR3 i VLCDR2, nisu pokazale poboljšanje u odnosu na parentalni klon Abet0144-GL i nisu dalje obrađivane.

[0305] Preostale četiri biblioteke usmerene mutageneze, (koje obuhvataju VHCDR1, VHCDR2, VLCDR1 i VLCDR3), pokazale su poboljšanja afiniteta i one su rekombinovane u parovima da bi se dobilo šest "dvokomponentnih" rekombinacionih biblioteka u kojima su dva od šest CDR regiona mutirana. Na primer, biblioteka sazrelog afiniteta koja obuhvata VHCDR1 nasumično je rekombinovana sa biblioteka VHCDR2 sazrelog afiniteta da bi se dobila biblioteka VH1:VH2. Preostale biblioteke proizvedene su kao: VH1 :VL1, VH1 :VL3, VH2:VL1, VH2:VL3 i VL1 :VL3. Podset svake rekombinacione biblioteke kloniran je kao što je prethodno opisano (odeljak 3.2) i podvrgnut sekvenciranju da bi se potvrdio integritet svake biblioteke.

[0306] Selekcije su zatim nastavljene kao što je prethodno opisano (odeljak 3.2) u prisustvu opadajućih koncentracija biotinilisanog sintetskog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (5 nM i 2 nM za cikluse 5 i 6, redom). Kao i pre, svaki proizvod selekcije je kloniran u svrhu skrininga (odeljak 3.2).

[0307] Hiljadu devet stotina trideset šest scFv, nasumično odabranih iz selekcionih ciklusa 5 i 6, podvrgnuti su skriningu u testu kompeticije za epitop kao što je opisano u odeljku 3.3. Zbog povećanja aktivnosti ovih klonova, neprečišćeni scFv su prvo razblaženi do 25% pre dodavanja na ploče za analizu. Kao i prethodno, klonovi koji su pokazali značajna inhibitorna svojstva podvrgnuti su sekvenciranju DNK, i jedinstveni klonovi su proizvedeni i analizirani kao prečišćeni scFv (odeljak 3.3). Najaktivniji klon iz ovih selekcija, Abet0303, imao je aktivnost od 0.84 nM i potekao je iz rekombinacione biblioteke VH1:VH2.

3.5 Rekombinacija proizvoda binarne selekcije za proizvodnju "trokomponentnih" biblioteka, i naknadna optimizacija njihovih afiniteta

[0308] Test kompeticije za epitop opisan u odeljku 3.3 upotrebljen je za procenu da li je svaka dvokomponentna biblioteka bila podvrgnuta sazrevanju afiniteta tokom prethodna dva ciklusa selekcije (5 i 6). Sve biblioteke su pokazale poboljšanja afiniteta, i stoga su razmatrane za dodatno sazrevanje afiniteta.

[0309] Šest dvokomponentnih biblioteka (odeljak 3.4) je rekombinovano sa uspešnim proizvodima ciklusa 4 (odeljak 3.2) u paru da bi se formirale četiri "trokomponentne" rekombinacione biblioteke u kojima je tri od šest CDR regiona mutirano. Na primer, dvokomponentna biblioteka VH2:VL3 (proizvod ciklusa 6) rekombinovano sa bibliotekom usmerene mutageneze VHCDR1 (proizvod ciklusa 4) za stvaranje biblioteke VH1:VH2:VL3. Slični konstrukti su takođe napravljeni kombinovanjem dvokomponentne biblioteke VH1:VH2 (proizvod ciklusa 6) sa bibliotekom usmerene mutageneze VLCDR3 (proizvod ciklusa 4). Ove dve individualne biblioteke su spojene za stvaranje trokomponentne biblioteke VH1:VH2:VL3.

[0310] Vođeno je računa da se ne naruši sinergija između CDR regiona koji su ko-optimizovani. Na primer, dvokomponentna biblioteka VH1:VL3 nije rekombinovana sa bibliotekom usmerene mutageneze VHCDR2 budući da bi ova manipulacija uništila sinergiju između ko-optimizovanih sekvenci VHCDR1 i VLCDR3. Kompletna lista svih trokomponentnih biblioteka i njihovih derivata data je u tabeli 3. Podset svake rekombinacione biblioteke kloniran je kao što je prethodno opisano (odeljak 3.2) i podvrgnut sekvenciranju za potvrđivanje integriteta svake biblioteke.

Tabela 3: Opis četiri trokomponentne biblioteke koje su sazrevale tokom ciklusa 7 i 8 druge kampanje optimizacije vodećeg klona. Svaka biblioteka sadržala je dve sastavne biblioteke, stvorene nasumičnom rekombinacijom u paru dvokomponentne biblioteke, proizvoda ciklusa 6 i biblioteke usmerene mutageneze, proizvoda ciklusa 4.

[0311] Selekcije su zatim nastavljene kao što je prethodno opisano (odeljak 3.2) u prisustvu opadajućih koncentracija biotinilisanog sintetskog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (500 pM i 200 pM za cikluse 7 i 8, redom). Kao i prethodno, svaki proizvod selekcije je kloniran u svrhu skrininga (odeljak 3.2).

[0312] Hiljadu četiristo osam scFv, nasumično odabranih iz ciklusa selekcije 7 i 8, podvrgnuti su skriningu u testu kompeticije za epitop kao što je opisano u odeljku 3.3. Kao kod "dvokomponentnog" skrininga, neprečišćeni scFv su prvo razblaženi do 25% pre dodavanja na ploče za analizu. Kao prethodno, klonovi koji su pokazali značajna inhibitorna svojstva podvrgnuti su sekvenciranju DNK, i jedinstveni klonovi su proizvedeni i analizirani kao prečišćen scFv (odeljak 3.3). Najaktivniji klon iz ovih selekcija, Abet0343, imao je aktivnost od 0.48 nM i poticao je iz rekombinacione biblioteke VH1:VH2:VL3.

3.6 Rekombinacija proizvoda trokomponentne selekcije za proizvodnju "četvorokomponentnih" biblioteka, i naknadna optimizacija njihovih afiniteta

[0313] Test kompeticije za epitop opisan u odeljku 3.3 upotrebljen je za procenu da li je svaka trokomponentna biblioteka bila podvrgnuta sazrevanju afiniteta tokom prethodna dva ciklusa selekcije (7 i 8). Sve biblioteke su pokazale poboljšanja afiniteta, i bile stoga razmatrane za dalje sazrevanje afiniteta.

[0314] Trokomponentna biblioteka VH1:VH2:VL1 (proizvod ciklusa 8) je rekombinovana sa bibliotekom usmerene mutageneze VLCDR3 (proizvod ciklusa 4) i trokomponentna biblioteka VH2:VL1:VL3 (proizvod ciklusa 8) je rekombinovana sa bibliotekom usmerene mutageneze VHCDR1 (proizvod ciklusa 4). Odvojeno, dvokomponentna biblioteka VH1:VH2 (proizvod ciklusa 6) je rekombinovana sa dvokomponentnom bibliotekom VL1:VL3 (proizvod ciklusa 6). Ove tri pojedinačne biblioteke su zatim spojene da bi se dobila jedna "četvorokomponentna" biblioteka, VH1:VH2:VL1:VL3, u kojoj je četiri od šest CDR regiona mutirano.

[0315] Vođeno je računa da se ne naruši sinergija između CDR regiona koji su ko-optimizovani. Na primer, trokomponentna biblioteka VH1:VL2:VL3 nije rekombinovana sa bibliotekom usmerene mutageneze VLCDR1 budući da bi ova manipulacija uništila sinergiju između kooptimizovanih sekvenci VHCDR1/VHCDR2 i VLCDR3. Podset svake rekombinacione biblioteke kloniran je kao što je prethodno opisano (odeljak 3.2) i podvrgnut sekvenciranju za potvrđivanje integriteta svake biblioteke.

[0316] Selekcije su zatim nastavljene kao što je prethodno opisano (odeljak 3.2) u prisustvu opadajućih koncentracija biotinilisanog sintetskog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (50 pM do 10 pM za cikluse 9 do 11). Kao i prethodno, svaki proizvod selekcije je kloniran u svrhu skrininga (odeljak 3.2).

[0317] Hiljadu šesto sedamdeset dva scFv, nasumično odabrana iz ciklusa selekcije 9 do 11, podvrgnuta su skriningu u testu kompeticije za epitop kao što je opisano u odeljku 3.3. Zbog povećanja aktivnosti ovih klonova, neprečišćeni scFv su prvo razblaženi do 3.13% pre dodavanja na ploče za analizu. Kao i prethodno, klonovi koji su pokazali značajna inhibitorna svojstva podvrgnuti su sekvenciranju DNK, i jedinstveni klonovi su proizvedeni i analizirani kao prečišćen scFv (odeljak 3.3). Najaktivniji klon iz ovih selekcija, Abet0377, imao je aktivnost od 0.32 nM (n=2 podatka). Krive inhibicije uzorka prikazane su na slici 11, a podaci za 24 klona sa najvišom aktivnošću prikazani su u tabeli 4. Odgovarajuće proteinske sekvence su navedene u tabelama 5 i 6.

Tabela 4: Primer podataka o aktivnosti za optimizovane klonove scFv kada su procenjivani u testu kompeticije za epitop Abet0144-GL HTRF™. Tamo gde je test obavljen više nego jednom, dat je apsolutni opseg vrednosti IC50.

[0318] Tabela 5 (videti ispod): Poravnanje sekvence VH domena ovde opisanih optimizovanih klonova koji nisu modifikovani prema sekvenci klicine linije. Promene u odnosu na parentalnu sekvencu (Abet0144-GL) su istaknute. Rezidue su označene u skladu sa sistemom numeracije Kabata.

[0319] Tabela 6 (videti ispod): Poravnanje sekvence VL domena ovde opisanih optimizovanih klonova koji nisu modifikovani prema sekvenci klicine linije. Promene u odnosu na parentalnu sekvencu (Abet0144-GL) su istaknute. Rezidue su označene u skladu sa sistemom numeracije Kabata. Treba napomenuti da Abet0378 ima amber stop kodon "B" prisutan u VL sekvenci na poziciji 91, koji je uveden kao promena iz glutamina tokom optimizacije. Antitelo je proizvedeno kao scFv fragment u E. coli soju TG1 upotrebljenom za ekspresiju u kome se amber stop kodon čita kao glutamin.

�

3.7 Određivanje kinetičkog profila klonova sa poboljšanim afinitetom u formatu prečišćenog scFv rezonancijom površinskog plazmona

[0320] Rezonancija površinskog plazmona upotrebljena je za analizu prečišćenih klonova scFv koji su pokazali značajno poboljšanje afiniteta vezivanja za humani beta-amiloidni peptid 1-42 u odnosu na parentalnu sekvencu, Abet0144-GL, u HTRF™ testu kompeticije za epitop (odeljci 3.3-3.6). Ukratko, matrični sistem za proteinske interakcije ProteOn (BioRad, SAD) upotrebljen je za procenu kinetičkih parametara interakcije između svakog prečišćenog scFv i sintetski proizvedenog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42. Ovi eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano kod Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Za dodatne detalje videti odeljak 1.7.

[0321] Afinitet vezivanja između svakog ispitivanog scFv i humanog beta-amiloida 1-42 procenjen je upotrebom testova u kojima je biotinilisani sintetski humani beta-amiloidni peptid 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1117) bio nekovalentno vezan preko biotin/streptavidin interakcije za vlasnički streptavidinski čip (NTA 176-5021) pri pet različitih površinskih gustina. Površina čipa je regenerisana između ciklusa jednom injekcijom u trajanju od 60 sekundi 10 mM glicina pH 2.0 za uklanjanje scFv vezanog za peptid. Regeneracija nije rezultovala značajnim gubitkom kapaciteta vezivanja scFv.

[0322] Svaki scFv u koncentraciji od 100 - 200 nM uzastopno je propuštan preko površine sa peptidom tokom vremena dovoljnog za posmatranje senzorgrama koji su mogli pouzdano da se prilagode odgovarajućem modelu vezivanja. Podaci o blanku irelevantnom za scFv oduzeti su od glavnog skupa podataka da bi se umanjilo dejstvo bilo kakvih artefakata pufera ili efekti nespecifičnog vezivanja. Odgovarajući model vezivanja je zatim prilagođen podacima.

[0323] Za Abet0380 scFv, konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd) i konstanta disocijacije (KD) iznose 1.93 x 10<5>M<-1>s<-1>, 2.85 x 10<-5>s<-1>i 148 pM redom. Ovi parametri su dobijeni prilagođavanjem modela Langmuira 1:1 podacima.

Tabela 7: Primer kinetičkih podataka za vezivanje optimizovanih klonova scFv za sintetski biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42, određeno rezonancijom površinskog plazmona.

2

3.8 Preoblikovanje scFv sa poboljšanim afinitetom u humani IgG1-TM

[0324] Format antitela IgG1-TM razmatran je u odeljku 2.6. ScFv su preoblikovani u IgG1-TM subkloniranjem varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL) u vektore koji eksprimiraju ceo teški i laki lanac humanog antitela, redom. Varijabilni domen teškog lanca kloniran je u sisarski ekspresioni vektor (pEU 1.4) koji sadrži konstantne domene humanog teškog lanca i regulatorne elemente za ekspresiju celog teškog lanca IgG1-TM u sisarskim ćelijama. Slično, varijabilni domen lakog lanca kloniran je u sisarski ekspresioni vektor (pEU 4.4) za ekspresiju konstantnih domena humanog lambda lakog lanca i regulatornih elemenata za ekspresiju celog lakog lanca IgG u sisarskim ćelijama.

[0325] Da bi se dobila antitela kao IgG, ekspresioni vektori teškog i lakog lanca IgG su tranzijentno transficirani u sisarske ćelije HEK293-EBNA (Invitrogen, VB; kat: R620-07) u kojima su IgG antitela eksprimirana i izlučena u medijum. Žetve su spojene i filtrirane pre prečišćavanja. IgG je prečišćen upotrebom hromatografije na proteinu A. Supernatanti kultura su naneti na odgovarajuće keramičke kolone sa proteinom A (BioSepra - Pall, SAD) i oprani sa 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 250 mM NaCl. Vezani IgG je eluiran sa kolone upotrebom 0.1 M natrijum citrata (pH 3.0) i neutralizovan dodavanjem Tris-HCI (pH 9.0). U eluiranom materijalu izmenjen je pufer u PBS upotrebom NAP-10 kolona za izmenu pufera (GE Healthcare, VB; kat: 17-0854-02) i prečišćena IgG antitela su propuštena kroz filter promera 0.2 µm. Koncentracija IgG određena je spektrofotometrijski upotrebom koeficijenta ekstinkcije zasnovanog na aminokiselinskoj sekvenci IgG. Agregacija ili razgradnja prečišćenih IgG antitela analizirana je upotrebom SEC-HPLC i metodom SDS-PAGE.

3.9 Modifikovanje prema sekvenci klicine linije

[0326] Pet najaktivnijih IgG antitela odabrano je za modifikovanje prema sekvenci klicine linije, na osnovu eksperimentalnog određivanja karakteristika njima odgovarajućih scFv. Svi prečišćeni scFv klonova Abet0343, Abet0369, Abet0377, Abet0380 i Abet0382 ispoljili su IC50vrednosti manje od 750 pM, određeno testom kompeticije za epitop (tabela 4), i svi su imali eksperimentalnu konstantu disocijacije manju od 250 pM, određeno rezonancijom površinskog plazmona, tabela 7.

[0327] Postupak modifikovanja prema sekvenci klicine linije sastojao se od reverzije rezidua okvirnog regiona u VHi VLdomenima na sekvencu najbliže klicine linije, tako da ona identično odgovara humanim antitelima. Za VHdomene optimizovane linije antitela to je bilo Vh3-23 (DP-47), a za VLdomene, Vλ3-3r (DPL-23). Kod Abet0380, 1 rezidua je zahtevala promenu u VHdomenu na poziciji Kabata 43 (tabela 8) i 1 rezidua je zahtevala promenu u VLdomenu na poziciji Kabata 81 (tabela 9). Preostale četiri sekvence zahtevale su između dve i pet promena (tabele 8 i 9). Vernier rezidue (Foote et al., 1992), nisu modifikovane prema sekvenci klicine linije, osim rezidue 2 u sekvenci lakog lanca Abet0343, koja je modifikovana prema sekvenci klicine linije u isto vreme kao bočne rezidue 1 i 3. Modifikovanje prema sekvenci klicine linije ovih aminokiselinskih rezidua sprovedeno je upotrebom standardnih tehnika mesto-specifične

4

mutageneze sa odgovarajućim mutagenim prajmerima kao što je opisano kod Clackson i Lowman (Clackson et al., 2004).

Tabela 8: Poravnanje sekvence VHdomena pet klonova odabranih za modifikovanje prema sekvenci klicine linije. Dve rezidue koje su vraćene na sekvencu klicine linije označene su osenčenim kućicama. Pozicije Vernier rezidua označene su kružićima (•).

3.10 Određivanje kinetike vezivanja antitela IgG optimizovanog afiniteta upotrebom rezonancije površinskog plazmona

[0328] Rezonancija površinskog plazmona upotrebljena je za analizu kinetike vezivanja antitela IgG optimizovanog afiniteta (odeljak 3.8) i njihovih ekvivalenata modifikovanih prema sekvenci klicine linije (odeljak 3.9). Ukratko, biosenzorski instrument BIAcore T-100 (GE Healthcare, VB) upotrebljen je za procenu kinetičkih parametara interakcije između svakog ispitivanog IgG i sintetski proizvedenog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42. Ovi eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano kod Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Za dodatne detalje videti odeljak 1.7.

[0329] Afinitet vezivanja između svakog ispitivanog IgG i humanog beta-amiloida 1-42 procenjen je upotrebom testova u kojima je svako antitelo nekovalentno zarobljeno korišćenjem površine sa proteinom G koja je sama vezana aminskim mostom za vlasnički CM5 čip. Površina čipa je regenerisana između ciklusa parom injekcija u trajanju od 40 sekundi 10 mM glicina pH 2.0 za uklanjanje liganda i vezanog antitela. Ispitivano antitelo je zatim ponovo nanošeno za svaku injekciju peptida.

[0330] Serije razblaženja sintetskog humanog beta-amiloidnog peptida 1-42 (0.063 - 1024 nM) su uzastopno propuštane preko površine sa antitelom tokom vremena dovoljnog za posmatranje senzorgrama koji su mogli pouzdano da se prilagode odgovarajućem modelu vezivanja. Podaci za blank referentnu protočnu ćeliju oduzeti su od svakog skupa podataka za IgG i obavljeno je dvostruko kontrolno oduzimanje podataka za blank uzorak sa puferom sa nultom koncentracijom od glavnog skupa podataka. Odgovarajući model vezivanja je zatim istovremeno prilagođeni podacima iz svake titracije analita upotrebom programa BIAevaluation.

[0331] Validnost podataka procenjena je upotrebom izračunate vrednosti hi<2>, sa prihvatljivom vrednošću ispod 2 RU<2>. Ukupan uspeh prilagođavanja procenjen je upotrebom reziduala, pri čemu je devijacija ispod 2 RU smatrana prihvatljivom.

[0332] Primer rezultata za Abet0380-GL (modifikovano prema sekvenci klicine linije) IgG1-TM prikazan je na slici 12. Konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd) i konstanta disocijacije (KD) iznose 9.52 x 10<5>M<-1>s<-1>, 3.07 x 10<-4>s<-1>i 322 pM redom. Ovi parametri su dobijeni prilagođavanjem modela Langmuira 1:1 podacima.

3.11 Određivanje profila specifičnosti antitela IgG optimizovanog afiniteta upotrebom rezonancije površinskog plazmona

[0333] Rezonancija površinskog plazmona upotrebljena je za potvrđivanje specifičnosti antitela IgG optimizovanog afiniteta za humani beta-amiloidni peptid 1-42. Ukratko, biosenzorski instrument BIAcore T-100 (GE Healthcare, VB) upotrebljen je za procenu kinetičkih parametara interakcije između svakog ispitivanog IgG i niza malih peptida uključujući sintetski proizvedeni humani beta-amiloidni peptid 1-42 i humani beta-amiloidni peptid 1-40. Ovi eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano kod Karlsson et al. (Karlsson et al., 1991). Za dodatne detalje videti odeljak 1.7.

[0334] Interakcija između svakog ispitivanog IgG i svakog peptida procenjena je upotrebom testova u kojima je antitelo nekovalentno zarobljeno korišćenjem površine sa proteinom G koja je sama vezana aminskim mostom za vlasnički CM5 čip. Interakcija između antitela i peptida posmatrana je upotrebom pristupa sa 5 primena u jednom ciklusu. Površina čipa je regenerisana između ciklusa parom injekcija u trajanju od 40 sekundi 10 mM glicina pH 2.0 za uklanjanje liganda i vezanog antitela. Ispitivano antitelo je zatim ponovo nanošeno za svaki ciklus ubrizgavanja peptida.

[0335] Svaki ispitivani peptid (između 64 i 1024 nM) je uzastopno propuštan preko površine sa antitelom tokom vremena dovoljnog za posmatranje senzorgrama koji ili nisu pokazali vezivanje, ili su mogli pouzdano da se prilagode odgovarajućem modelu vezivanja. Podaci za blank referentnu protočnu ćeliju oduzeti su od svakog skupa podataka za IgG i obavljeno je dvostruko kontrolno oduzimanje podataka za blank uzorak sa puferom sa nultom koncentracijom od glavnog skupa podataka.

[0336] Primer rezultata za Abet0380-GL (modifikovano prema sekvenci klicine linije) IgG1-TM prikazan je na slici 13. Dva peptida (biotinilisani humani beta-amiloid 1-42, (rPeptide, SAD; kat: A1117) i neobeleženi mišji beta-amiloid 1-42 (rPeptide, SAD; kat: A1008) pokazala su snažno vezivanje za antitelo, dok dva peptida, biotinilisani humani beta-amiloid 1-40 (rPeptide, SAD; kat: A1111) i neobeleženi mišji beta-amiloid 1-40 (rPeptide, SAD; kat: A1007) nisu pokazala vezivanje za antitelo.

3.12 Afinitet najaktivnijih IgG antitela prema nativnom beta-amiloidu upotrebom in vitro imunohistohemije

[0337] Ispitana je sposobnost najaktivnijih IgG antitela da se vežu za beta-amiloid, u cilju procene afiniteta ovih klonova za nativne forme beta-amiloidnog peptida. Ukratko, vodeća antitela su podvrgnuta skriningu na isečcima humanog mozga sa Alchajmerovom bolešću i isečcima mozga miševa Tg2576 za identifikovanje antitela protiv beta-amiloida 1-42 koja se vezuju za amiloidne plakove in vitro. Eksperimenti su sprovedeni suštinski kao što je opisano u odeljku 1.9.

[0338] U ovim eksperimentima, tkivo humanog mozga izolovano je iz frontalnog korteksa dve osobe sa ozbiljnom Alchajmerovom bolešću (ApoE genotip 3/3, Brakov stadijum 6 i ApoE genotip 4/3, Brakov stadijum 5). Kao kontrola, ekvivalentno tkivo izolovano je iz jedne osobe koja nema demenciju (ApoE genotip 3/3, Brakov stadijum 1). Tkivo mozga miša izolovano je iz miševa Tg2576 uzrasta 15 meseci (2 miša) i 22 meseca (2 miša). Antitela su ispitana u koncentracijama od 2, 5, 10 i 20 ug ml<-1>.

[0339] U jednom eksperimentu, Abet0380-GL IgG1-TM antitelo je bojilo guste plakove (CP) sa skorom od 4 na isečcima mozga Tg2576, i skorom od 3 na isečcima humanog mozga sa AD. Takođe je bojilo difuzne plakove (DP) i plakove kod cerebralne amiloidne angiopatije (CAA), ali u manjem stepenu. Nasuprot tome, pozitivna kontrola antitela proizvela je skor od 3-4 na svim plakovima (CP, DP, CAA) na srodnim isečcima pod istim uslovima. Reprezentativni snimci prikazani su na slici 14.

3.13 Demonstracija profila prepoznavanja Abeta42 antitelom Abet0380-GL IgG1-TM metodom western blot

[0340] Za umrežavanje Aβ42 oligomera pre SDS-PAGE, postupak PICUP (foto-indukovano umrežavanje peptida) sproveden je kao što sledi. 1 mM rastvor Ru(Bpy) napravljen je dodavanjem 2 µl štoka (od 10 mM) u 18 µl 1xPBS. Pored toga, 20 mM rastvor amonijum persulfata (APS) napravljen je dodavanjem 2 µl štoka (od 200 mM) u 18 µl 1xPBS. Neiskorišćeni štok je odmah zamrznut na suvom ledu i vraćen u zamrzivač na -80°C. U mračnoj sobi, 5 µl Ru(Bpy) je dodato u 80ul agregata (čist 10uM uzorak), praćeno sa 5 µl APS. Uzorci su ozračeni lampom u mračnoj sobi 10 sekundi. Odmah je dodato 30uls (4x) LDS pufera za uzorak.

[0341] SDS-PAGE je zatim sprovedena na umreženim (PICUP) i neumreženim Aβ1-42 agregatima. Rastvori su inkubirani u vodenom kupatilu sa toplim blokom na 70°C tokom 10 minuta. U međuvremenu, napravljen je marker kombinovanjem 5 µl proteinskog standarda za western blot Magic Mark XP, 5 µl prethodno obojenog proteinskog standarda Novex Sharp. Posle desetominutne inkubacije, uzorci i marker su naneti na gelove NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris (1.0 mm, 15 bunarčića, 15 µl po bunarčiću) sa MES puferom kao mobilnom fazom. Hromatografija gelova izvedena je na 200 V tokom 35 minuta.

[0342] Zatim je gel prenet na PVDF membranu upotrebom uređaja iBlot proizvođača Invitrogen, tokom 7 minuta na 20V (program P3).

[0343] Kada je prenošenje završeno, uklonjen je sloj gela i PVDF membrana je blokirana u 50 ml 4% MPBST (4% Marvel u PBST) jedan čas na sobnoj temperaturi uz blago rotiranje. Blotovi su zatim isečeni skalpelom za ispitivanje sa pojedinačnim antitelima. To je bila inkubacija tokom 1 časa sa rastvorom primarnog antitela (2ug/ml u 10 ml 3% MPBST).

[0344] Zatim, membrana je oprana 5x sa PBST, svaki put po 5 minuta, a zatim inkubirana u rastvoru sekundarnog antitela (1 µl konjugata HRP antitela specifičnog za humani Fc u 10 ml PBST) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Membrana je oprana 3x PBST-om i 2x PBS-om, svaki put po 5 minuta.

[0345] Tokom završnih pranja, hemiluminescentni supstrat SuperSignal West Dura (Thermo Scientific; 34075) ostavljen je da se zagreje do sobne temperature. Kombinovano je po 600ul svakog od 2 rastvora. PBS je odliven sa PVDF membrane, a zatim je membrana prekrivena pomešanim reagensima Dura pomoću pipete. Reakcija je ostavljena da se odvija ∼5 minuta (za to vreme je sistem za snimanje VerscDoc postavljen), a zatim je urađen snimak sa ekspozicijom od 30 sekundi (uz poboljšanje upotrebom filtera za transformaciju). Reprezentativni snimak prikazan je na slici 15.

Primer 4. Studije koje pokazuju specifični funkcionalni odgovor antitela Abet0380-GL IgG1-TM in vivo

4.1 Određivanje funkcionalnih karakteristika Abet0380-GL IgG1-TM redukcijom slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 in vivo

[0346] Osam nedelja stari mužjaci albino pacova Harlan Sprague-Dawley (n = 8-12) primili su jednu dozu antitela Abet0380-GL IgG1-TM intravenskom injekcijom sa vehikulumom za primenu doze od 25 mM histidina, 7% saharoze, 0.02% surfaktanta p80, pH 6.0 pri 5 ml/kg. Rastvori za doziranje su pravljeni neposredno pre davanja doze. Životinje su anestezirane u naznačeno vreme i cerebrospinalna tečnost (CSF) je aspirirana iz oblasti cisterna magna. Uzorci CSF su centrifugirani 10 minuta na približno 3000 x g na 4°C unutar 20 minuta od uzorkovanja, da bi se uklonile ćelije ili debris. Uzorci su zatim zamrznuti na suvom ledu i skladišteni na -70°C za naknadnu analizu.

[0347] Životinje su žrtvovane dekapitovanjem, tkivo mozga je disekovano i beta-amiloidni peptidi su ekstrahovani iz tkiva mozga u dietilaminu (DEA; Fluka, Sigma, VB; kat: 31729). Ukratko, zamrznuto tkivo mozga je homogenizovano u 0.2% DEA i 50 mM NaCl (Merck, SAD; kat: 1.06404.1000). Homogenati mozga su ultracentrifugirani na 133000 x g, 1 čas. Izdvojeni supernatanti su neutralisani do pH 8.0 sa 2 M Tris-HCI (TRIZMA<®>-hidrohlorid; Sigma, VB; kat: 93363) i skladišteni na -70°C do analize. Eksperimenti na životinjama su sprovedeni u skladu sa odgovarajućim smernicama i propisima koje pruža Švedski odbor za poljoprivredu. Etičku

1

dozvolu je dao etički odbor specijalizovan za eksperimente na životinjama: Etički odbor za istraživanja na životinjama u Južnom Stokholmu.

[0348] Merenje slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 u CSF pacova sprovedeno je upotrebom imunoprecipitacije za uklanjanje beta-amiloidnog peptida 1-42 vezanog za Abet0380-GL, praćenog analizom komercijalnim kompletom za ELISA test proizvođača Invitrogen. Ukratko, rastvor perli sa proteinom A (Dynabeads<®>Protein A; Invitrogen, VB; kat: 100-02D) dodat je na neoivičenu ploču sa 96 bunarčića (polipropilen 0.2 ml; VWR International, VB; kat: 10732-4828) i opran dva puta sa TBST (50 mM TBS; Sigma, VB; kat: T6664 i 0.1% Tween20) upotrebom magneta (DynaMag™ 96 odeljaka; Invitrogen, VB; kat: 123.31D) da bi se perle razdvojile od rastvora. Odmrznuti uzorci CSF pacova (40 µl) dodati su u svaki bunarčić i inkubirani na 40°C sa rotiranjem pod nagibom 1 čas. Perle su zatim staložene upotrebom magneta i 30 µl imunoprecipitiranih uzoraka CSF preneto je na ploču sa 96 bunarčića iz kompleta za ELISA test (komplet za kolorimetrijski ELISA test mišjeg beta-amiloida (1-42); Invitrogen, VB; kat: KMB3441) sa već dodatih 70 µl standardnog pufera za razblaživanje (obogaćenog inhibitorom proteaze; Roche, VB; kat: 11836153001). Kalibracioni standardni uzorci su dodati na ploču u duplikatu i ploča je inkubirana 2 časa na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploča je oprana 4 puta sa 400 µl pufera za pranje, 100 µl rastvora antitela za detekciju dodato je u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ponovo, ploča je oprana 4 puta sa 400 µl pufera za pranje, 100 µl radnog rastvora sekundarnog antitela je dodato u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Najzad, ploča je oprana 4 puta sa 400 µl pufera za pranje, 100 µl stabilizovanog hromogena dodato je u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Za zaustavljanje reakcije, 100 µl rastvora za zaustavljanje reakcije dodato je u svaki bunarčić i ploča je očitana unutar 2 časa pri apsorbanciji od 450 nm. Pojedinačni uzorci CSF su analizirani i analiza podataka je sprovedena upotrebom Prism 4 (GraphPad, SAD) pomoću jednosmerne ANOVA na log-transformisanim podacima bez podešavanja za višestruka poređenja.

[0349] Merenje ukupnog (slobodnog i vezanog za Abet0380-GL) beta-amiloidnog peptida 1-42 u homogenatima mozga pacova sprovedeno je upotrebom modifikacija kompleta za kolorimetrijski ELISA test mišjeg beta-amiloida (1-42) (Invitrogen, VB; kat: KMB3441). Antitelo za detekciju iz kompleta zamenjeno je antitelom Abet0380-GL IgG1-TM u višku, a sekundarno antitelo konjugatom antitela protiv humanog IgG sa HRP (Jackson ImmunoResearch, VB; kat: 109-035-098). Ukratko, odmrznuti homogenati mozga od 50 µl razblaženi 1:2 u razblaživaču za uzorke (obogaćenom inhibitorom proteaze; Roche, VB; kat: 11836153001) i standardni uzorci su dodati u duplikatu na ploču sa 96 bunarčića za ELISA test. Antitelo

1 1

Abet0380-GL IgG1-TM u višku (50 µl, 4 µg/ml) je dodato u svaki bunarčić i ploča je zatim inkubirana 3 časa na sobnoj temperaturi. Ploča je oprana 4 puta sa 400 µl pufera za pranje, 100 µl radnog rastvora sekundarnog antitela je dodato u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Najzad, ploča je oprana 4 puta sa 400 µl pufera za pranje, 100 µl stabilizovanog hromogena je dodato u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Za zaustavljanje reakcije, 100 µl rastvora za zaustavljanje reakcije dodato je u svaki bunarčić i ploča je očitana unutar 2 časa pri apsorbanciji od 450 nm. Analiza podataka je sprovedena upotrebom Prism 4 (GraphPad, SAD) pomoću jednosmerne ANOVA na logtransformisanim podacima bez podešavanja za višestruka poređenja.

[0350] Merenje ukupnog beta-amiloidnog peptida 1-40 u homogenatima mozga pacova sprovedeno je upotrebom kompleta za kolorimetrijski ELISA test mišjeg beta-amiloida (1-40) (Invitrogen, VB; kat: KMB3481). Ukratko, odmrznuti homogenati mozga od 50 µl i standardni uzorci, razblaženi u razblaživaču za uzorke (obogaćenom inhibitorom proteaze; Roche, VB; kat: 11836153001), dodati su u duplikatu na ploču sa 96 bunarčića za ELISA test. 50 µl rastvora antitela za detekciju dodato je u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 3 časa na sobnoj temperaturi. Ploča je oprana 4 puta sa 400 µl pufera za pranje, 100 µl radnog rastvora sekundarnog antitela dodato je u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Najzad, ploča je oprana 4 puta sa 400 µl pufera za pranje, 100 µl stabilizovanog hromogena je dodato u svaki bunarčić i ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Za zaustavljanje reakcije, 100 µl rastvora za zaustavljanje reakcije dodato je u svaki bunarčić i ploča je očitana unutar 2 časa pri apsorbanciji od 450 nm. Analiza podataka je sprovedena upotrebom Prism 4 (GraphPad, SAD) pomoću jednosmerne ANOVA na log-transformisanim podacima bez podešavanja za višestruka poređenja.

4.2 Određivanje funkcionalnih karakteristika Abet0380-GL IgG1-TM redukcijom slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 in vivo

[0351] Jedna doza Abet0380-GL IgG1-TM antitela pri 20 mg/kg redukovala je nivo slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 u CSF pacova do granice kvantifikacije na 72 ili 168 časova posle davanja doze u testu opisanom u odeljku 4.1 (podaci nisu prikazani). Da bi se dodatno ispitalo dejstvo Abet0380-GL IgG1-TM antitela in vivo, pacovi su primali nedeljne doze od 0.25, 0.5, 1, 5 ili 10 mg/kg tokom 14 dana. Životinje su eutanazirane 168 časova posle druge doze da bi se izmerili nivoi slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 u CSF, kao i ukupni beta-amiloidni peptidi 1-42 ili 1-40 u tkivu mozga.

1 2

[0352] Dozno-zavisni pad slobodnog beta-amiloida 1-42 pokazan je u CSF (slika 16A). Dve najviše doze od 5 i 10 mg/kg redukovale su beta-amiloidni peptid 1-42 do granice kvantifikacije u korišćenom testu, dok su doze od 0.5 i 1 mg/kg značajno redukovale beta-amiloidni peptid 1-42 za 47% i 61% redom, u poređenju sa kontrolom vehikuluma. Najniža doza, 0.25 mg/kg, dala je redukciju od 14% slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 u CSF, ali nije dostigla statističku značajnost. Zahvaljujući sekvestraciji beta-amiloidnog peptida 1-42 pomoću antitela Abet0380-GL IgG1-TM, dozno-zavisno povećanje ukupnog beta-amiloidnog peptida 1-42 pokazano je u tkivu mozga (slika 16B). Međutim, na nivo ukupnog beta-amiloidnog peptida 1-40 u tkivu mozga nije bilo uticaja (slika 16C), čime je pokazana specifičnost Abet0380-GL IgG1-TM za beta-amiloidni peptid 1-42. ukupno uzevši, gore prikazani rezultati studija na pacovima pokazali su da Abet0380-GL IgG1-TM antitelo redukuje nivo slobodnog beta-amiloidnog peptida 1-42 u CSF sa ED50između 0.5 i 1 mg/kg.

4.3 Određivanje funkcionalnih karakteristika Abet0380-GL IgG1TM – demonstracija izostanka vezivanja za plakove in vivo - bez vezivanja Abet0380-GL IgG1-TM za betaamiloidne plakove in vivo 168 časova posle davanja doze putem perifernog suda kod starijih miševa Tg2576

[0353] Ispitana je sposobnost antitela Abet0380-GL IgG1-TM da se veže za beta-amiloidne plakove kod ostarelih miševa Tg2576 posle jedne periferno date doze. Eksperimenti na životinjama su sprovedeni u skladu sa odgovarajućim smernicama i propisima koje pruža Švedski odbor za poljoprivredu. Etičku dozvolu je dao etički odbor specijalizovan za eksperimente na životinjama: Etički odbor za istraživanja na životinjama u Južnom Stokholmu.

[0354] Sedamnaest meseci stare ženke miševa Tg2576 (n=5) primile su jednu dozu vehikuluma, pozitivna kontrola antitela u koncentraciji od 30 mg/kg ili Abet0380-GL IgG1-TM antitelo u koncentraciji od 10 ili 30 mg/kg intravenskom injekcijom sa vehikulumom za doziranje od 25 mM histidina, 7% saharoze, 0.02% surfaktanta p80, pH 6.0 pri 5 mL/kg. Na 168 časova posle davanja doze, životinje su duboko anestezirane i urađena im je perfuzija PBS-om sobne temperature praćenim hladnim (4°C) fosfatno puferisanim 4% paraformaldehidom (PFA). Životinje su zatim žrtvovane dekapitovanjem i mozgovi su disekovani i fiksirani potapanjem u PFA na 4 °C 72 časa. Fiksativ je zamenjen PBS-om koji sadrži 0.1% natrijum azida i tkiva su skladištena na 4ºC do dalje obrade.

[0355] Imunohistohemija je sprovedena na isečcima mozga da bi se procenio stepen vezivanja Abet0380-GL IgG1-TM za beta-amiloidne plakove in vivo. Ukratko, parafinom obloženi isečci mozga pripremljeni su za imunohistohemiju kao što je opisano u odeljku 1.9. Detekcija

1

Abet0380-GL IgG1-TM ili pozitivne kontrole antitela nataloženih unutar parenhima mozga urađena je upotrebom zečjeg-anti-mišjeg IgG1 i IgG2-specifičnog sekundarnog antitela kompanije Epitomics. Bojenje je sprovedeno pomoću robota Ventana, upotrebom sistema za detekciju OmniMap (Ventana Medical Systems, SAD). Za uvođenje ex vivo, uzastopni isečci tkiva obojeni su in vitro ubrizganim Abet0380-GL IgG1-TM ili pozitivnom kontrolom antitela u višku. Sekundarna antitela i hromogeni su bili isti kao gore.

[0356] Ocenjivanje bojenja sprovedeno je slepom metodom pod optičkim uveličanjem od 10x. Zabeležen je raspored obojenih plakova. Intenzitet bojenja plakova bodovan je prema skali relativnog intenziteta od 0 (bez bojenja plakova) do 4 (intenzivno bojenje plakova).

[0357] Abet0380-GL IgG1-TM nije bojio beta-amiloidne plakove ili plakove kod cerebralne amiloidne angiopatije (CAA) in vivo na 168 časova posle periferno date doze od 10 ili 30 mg/kg. Pozitivna kontrola antitela pokazala je intenzivno do nisko in vivo bojenje plakova. Uočljiv je parcijalni i fokalni obrazac raspodele, sa gustim plakovima, difuznim plakovima i CAA kod svih životinja. Reprezentativni snimci prikazani su na slici 17. Ex vivo uvođenje Abet0380-GL IgG1-TM i pozitivne kontrole antitela u tkivo mozga istih životinja potvrdilo je prethodno demonstriran kapacitet za ex vivo vezivanje plakova ubrizganih antitela (nije prikazano).

Primer 5. Sekvence antitela protiv Aβ1-42

[0358] Primeri sekvenci molekula antitela navedeni su u priloženom listingu sekvenci, uključujući primere VH domena, VL domena, pojedinačnih CDR sekvenci, setova HCDR regiona, setova LCDR regiona, i okvirnih regiona antitela.

[0359] Sekvence 24 optimizovana klona navedene u tabeli 7 su upoređene. Tabele 10 i 11 prikazuju % identičnosti sekvence između VH i VL domena redom.

1 4

�

�

�

�

�

11 Tabela 16: Korelacija između sekvenci antitela koja su ovde pominjana i sekvenci u listingu sekvenci na kraju ovog dokumenta

11

11

11

11

11

11

��

Primer 6: Specifičnost Abet0380-GL IgG1-TM u eksperimentima kompetitivnog vezivanja

[0360] Specifičnost Abet0380-GL IgG1-TM ispitivana je u eksperimentima kompetitivnog vezivanja. Ukratko, Abet0380-GL IgG1-TM (0.5nM) je inkubiran (1 čas na sobnoj temperaturi) sa panelom humanih Abeta peptida cele dužine, skraćenih i pyro humanih Abeta peptida (Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 1-16, Abeta 12-28, Abeta 17-42, Abeta pyro-3-42, ili Abeta pyro-11-42) u opsegu različitih koncentracija (10uM naniže do 0.17nM).

[0361] Nakon inkubacije Abet0380-GL IgG1-TM sa Abeta peptidima, dodat je Abeta 1-42 sa N-terminalnim biotinom (1.5nM), a zatim antitelo protiv humanog Fc obeleženo europijum kriptatom (0.8nM) (CisBio kat. br. 61HFCKLB) i streptavidin-XL<ent!>(5nM) (CisBio kat. br.

611SAXLB). Test je zatim inkubiran dodatna 2 časa na sobnoj temperaturi pre očitavanja na čitaču ploča Envision (PerkinElmer) upotrebom standardnog protokola očitavanja homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF). U odsustvu kompeticije, interakcija Abeta 1-42 sa N-terminalnim biotinom sa Abet0380-GL IgG1-TM (u kompleksu sa streptavidin-XL<ent!>i antitelom protiv humanog Fc obeleženog europijum kriptatom, redom) može zatim da se meri putem vremenski razloženog rezonantnog prenosa energije fluorescencije (TR-FRET) zbog blizine donorskog fluorofora europijum kriptata i akceptorskog fluorofora XL<665>. Kompeticija Abet0380-GL IgG1-TM: interakcija Abeta 1-42 sa N-terminalnim biotinom sa ispitivanim peptidima, prema tome, rezultovala je redukcijom signala u testu. Rezultati su izraženi kao % specifičnog vezivanja, gde 100% specifično vezivanje potiče od bunarčića koji sadrže

12

streptavidin-XL<ent!>(5nM), Abeta 1-42 sa N-terminalnim biotinom (1.5nM), Abet0380-GL IgG1-TM (0.5nM) i antitelo protiv humanog Fc obeleženo europijum krptatom (0.8nM). 0% specifičnog vezivanja potiče od bunarčića u kojima je Abet0380-GL IgG1-TM izostavljen.

[0362] Finalna zapremina testa bila je 20µl i svi reagensi su bili pripremljeni u puferu za test koji sadrži MOPS pH7.4 (50mM), kalijum fluorid (0.4M), tween 20 (0.1%) i BSA bez masnih kiselina (0.1%). Test je izveden na crnim pločama za analizu sa 384 bunarčića male zapremine (Costar 3676).

[0363] Najzad, inhibicija Abet0380-GL IgG1-TM: vezivanje Abeta 1-42 sa N-terminalnim biotinom zapaženo je u slučaju Abeta 1-42, Abeta 1-43, Abeta 17-42, Abeta Pyro-3-42 i Abeta Pyro-11-42 sa vrednostima IC50u opsegu od 10<-8>do 10<-9>mola za ovu grupu. Nedostatak inhibicije Abet0380-GL IgG1-TM: vezivanje Abeta 1-42 sa N-terminalnim biotinom zapaženo je u slučaju Abeta 1-16 ili Abeta 12-28 (slika 18).

Primer 7: Sposobnost antitela Abet0144-GL da sekvestrira beta-amiloid 1-42 u PK-PD studiji na normalnim pacovima

[0364] Sposobnost antitela Abet0144-GL da sekvestrira beta-amiloid 1-42 istraživana je u PK-PD studiji na normalnim pacovima. Pacovima je intravenski davan Abet0144-GL (10 ili 40 mg/kg) ili vehikulum nedeljno tokom 2 nedelje (0. i 7. dana), i oni su žrtvovani nedelju dana posle 2. doze. CSF je uzorkovan za slobodni i ukupni beta-amiloid 1-42, i mozak je uzorkovan za merenje ukupnog beta-amiloida 1-42. Nivoi ukupnog i slobodnog beta-amiloida 1-42 mereni su upotrebom gore opisanih testova.

[0365] Kao što je prikazano na slici 19, slobodni beta-amiloid 1-42 u CSF nije bio značajno izmenjen ni sa 10, ni sa 40 mg/kg Abet0144-GL (povećanje od 5 i 18%, redom u poređenju sa vehikulumom; slika 19). Ukupni beta-amiloid 1-42 u CSF bio je značajno povećan za 38% pri 10 mg/kg, i za 139% pri 40 mg/kg. Ukupni beta-amiloid 1-42 u tkivu mozga bio je takođe značajno povećan, za 16% i 50% pri 10 i 40 mg/kg, redom. Ukupno uzevši, podaci iz ove studije na normalnim pacovima pokazali su da Abet0144-GL nema značajno dejstvo na nivoe slobodnog beta-amiloida 1-42 u CSF, dok povećava nivoe ukupnog beta-amiloida 1-42 i u CSF i u mozgu. Ovo je bio očekivani profil za antitelo sa afinitetom za ciljni molekul u rasponu od nekoliko desetina nM.

Reference

[0366]

Bannister, D., Wilson, A., Prowse, L., Walsh, M., Holgate, R., Jermutus, L. and Wilkinson, T. (2006). Parallel, high-throughput purification of recombinant antibodies for in vivo cell assays. Biotechnol. Bioeng. 94, 931-937.

Bard, F., Cannon, C., Barbour, R., Burke, R. L., Games, D., Grajeda, H., Guido, T., Hu, K., Huang, J., Johnson-Wood, K., Khan, K., Kholodenko, D., Lee, M., Lieberburg, I., Motter, R., Nguyen, M., Soriano, F., Vasquez, N., Weiss, K., Welch, B., Seubert, P., Schenk, D. and Yednock, T. (2000). Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nat. Med.6, 916-919.

Borchelt, D. R., Thinakaran, G., Eckman, C. B., Lee, M. K., Davenport, F., Ratovitsky, T., Prada, C. M., Kim, G., Seekins, S., Yager, D., Slunt, H. H., Wang, R., Seeger, M., Levey, A. I., Gandy, S. E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Price, D. L., Younkin, S. G. and Sisodia, S. S. (1996). Familial Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abeta1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo. Neuron 17, 1005-1013.

Citron, M., Eckman, C. B., Diehl, T. S., Corcoran, C., Ostaszewski, B. L., Xia, W., Levesque, G., St George Hyslop, P., Younkin, S. G. and Selkoe, D. J. (1998). Additive effects of PS1 and APP mutations on secretion of the 42-residue amyloid beta-protein. Neurobiol. Dis.5, 107-116.

Clackson, T. and Lowman, H. B. (2004). Phage display: a practical approach, Oxford University Press.

De Strooper, B. (2007). Loss-of-function presenilin mutations in Alzheimer disease. Talking Point on the role of presenilin mutations in Alzheimer disease. EMBO Rep. 8, 141-146.

DeMattos, R. B., Bales, K. R., Cummins, D. J., Dodart, J. C., Paul, S. M. and Holtzman, D. M. (2001). Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8850-8855.

Duff, K., Eckman, C., Zehr, C., Yu, X., Prada, C. M., Perez-tur, J., Hutton, M., Buee, L., Harigaya, Y., Yager, D., Morgan, D., Gordon, M. N., Holcomb, L., Refolo, L., Zenk, B., Hardy, J. and Younkin, S. (1996). Increased amyloid-beta42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature 383, 710-713.

Foote, J. and Winter, G. (1992). Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J. Mol. Biol.224, 487-499.

Gilman, S., Koller, M., Black, R. S., Jenkins, L., Griffith, S. G., Fox, N. C., Eisner, L., Kirby, L., Rovira, M. B., Forette, F. and Orgogozo, J. M. (2005). Clinical effects of

12

Abeta immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology 64, 1553-1562.

Glabe, C. (2000). Does Alzheimer disease tilt the scales of amyloid degradation versus accumulation? Nat. Med.6, 133-134.

Golde, T. E., Das, P. and Levites, Y. (2009). Quantitative and Mechanistic Studies of Ab Immunotherapy. CNS & Neuro. Dis. - Drug Targets 8, 31-49

Greeve, I., Kretzschmar, D., Tschape, J. A., Beyn, A., Brellinger, C., Schweizer, M., Nitsch, R. M. and Reifegerste, R. (2004). Age-dependent neurodegeneration and Alzheimer-amyloid plaque formation in transgenic Drosophila. J. Neurosci. 24, 3899-3906.

Groves, M. A. and Osbourn, J. K. (2005). Applications of ribosome display to antibody drug discovery. Expert Opin. Biol. Ther.5, 125-135.

Hanes, J., Jermutus, L. and Pluckthun, A. (2000). Selecting and evolving functional proteins in vitro by ribosome display. Methods Enzymol.328, 404-430.

Hanes, J. and Pluckthun, A. (1997). In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4937-4942.

Hawkins, R. E., Russell, S. J. and Winter, G. (1992). Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol.226, 889-896.

Hoet, R. M., Cohen, E. H., Kent, R. B., Rookey, K., Schoonbroodt, S., Hogan, S., Rem, L., Frans, N., Daukandt, M., Pieters, H., van Hegelsom, R., Neer, N. C., Nastri, H. G., Rondon, I. J., Leeds, J. A., Hufton, S. E., Huang, L., Kashin, I., Devlin, M., Kuang, G., Steukers, M., Viswanathan, M., Nixon, A. E., Sexton, D. J., Hoogenboom, H. R. and Ladner, R. C. (2005). Generation of high-affinity human antibodies by combining donorderived and synthetic complementarity-determining-region diversity. Nat. Biotechnol.23, 344-348.

lijima, K., Liu, H. P., Chiang, A. S., Hearn, S. A., Konsolaki, M. and Zhong, Y. (2004). Dissecting the pathological effects of human Abeta40 and Abeta42 in Drosophila: a potential model for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 6623-6628. Karlsson, R., Michaelsson, A. and Mattsson, L. (1991). Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. J. Immunol Methods 145, 229-240.

Kuperstein, I., Broersen, K., Benilova, I., Rozenski, J., Jonckheere, W., Debulpaep, M., Vandersteen, A., Segers-Nolten, I., Van Der Werf, K., Subramaniam, V., Braeken, D., Callewaert, G., Bartic, C., D'Hooge, R., Martins, I. C., Rousseau, F., Schymkowitz, J.

12

and De Strooper, B. (2010). Neurotoxicity of Alzheimer's disease Abeta peptides is induced by small changes in the Abeta42 to Abeta40 ratio. EMBO J.29, 3408-3420.

Lambert, M. P., Barlow, A. K., Chromy, B. A., Edwards, C., Freed, R., Liosatos, M., Morgan, T. E., Rozovsky, I., Trommer, B., Viola, K. L., Wals, P., Zhang, C., Finch, C. E., Krafft, G. A. and Klein, W. L. (1998). Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6448-6453.

Levites, Y., Das, P., Price, R. W., Rochette, M. J., Kostura, L. A., McGowan, E. M., Murphy, M. P. and Golde, T. E. (2006). Anti-Abeta42- and anti-Abeta40-specific mAbs attenuate amyloid deposition in an Alzheimer disease mouse model. J. Clin. Invest. 116, 193-201.

Matsuoka, Y., Saito, M., LaFrancois, J., Saito, M., Gaynor, K., Olm, V., Wang, L., Casey, E., Lu, Y., Shiratori, C., Lemere, C. and Duff, K. (2003). Novel therapeutic approach for the treatment of Alzheimer's disease by peripheral administration of agents with an affinity to beta-amyloid. J. Neurosci.23, 29-33.

McCafferty, J., Fitzgerald, K. J., Earnshaw, J., Chiswell, D. J., Link, J., Smith, R. and Kenten, J. (1994). Selection and rapid purification of murine antibody fragments that bind a transition-state analog by phage display. Appl. Biochem. Biotechnol. 47, 157-171; discussion 171-153.

McGowan, E., Pickford, F., Kim, J., Onstead, L., Eriksen, J., Yu, C., Skipper, L., Murphy, M. P., Beard, J., Das, P., Jansen, K., Delucia, M., Lin, W. L., Dolios, G., Wang, R., Eckman, C. B., Dickson, D. W., Hutton, M., Hardy, J. and Golde, T. (2005). Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron 47, 191-199. Mucke, L., Masliah, E., Yu, G. Q., Mallory, M., Rockenstein, E. M., Tatsuno, G., Hu, K., Kholodenko, D., Johnson-Wood, K. and McConlogue, L. (2000). High-level neuronal expression of abeta 1-42 in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: synaptotoxicity without plaque formation. J. Neurosci. 20, 4050-4058.

Oganesyan, V., Gao, C., Shirinian, L., Wu, H. and Dall'Acqua, W. F. (2008). Structural characterization of a human Fc fragment engineered for lack of effector functions. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 64, 700-704.

Orgogozo, J. M., Gilman, S., Dartigues, J. F., Laurent, B., Puel, M., Kirby, L. C., Jouanny, P., Dubois, B., Eisner, L., Flitman, S., Michel, B. F., Boada, M., Frank, A. and Hock, C. (2003). Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abeta42 immunization. Neurology 61, 46-54.

12

Osbourn, J. K., Field, A., Wilton, J., Derbyshire, E., Earnshaw, J. C., Jones, P. T., Allen, D. and McCafferty, J. (1996). Generation of a panel of related human scFv antibodies with high affinities for human CEA. Immunotechnology 2, 181-196.

Persic, L., Roberts, A., Wilton, J., Cattaneo, A., Bradbury, A. and Hoogenboom, H. R. (1997). An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. Gene 187, 9-18.

Portelius, E., Bogdanovic, N., Gustavsson, M. K., Volkmann, I., Brinkmalm, G., Zetterberg, H., Winblad, B. and Blennow, K. (2010). Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathol.120, 185-193.

Pride, M., Seubert, P., Grundman, M., Hagen, M., Eldridge, J. and Black, R. S. (2008). Progress in the active immunotherapeutic approach to Alzheimer's disease: clinical investigations into AN1792-associated meningoencephalitis. Neurodegener. Dis. 5, 194-196.

Schenk, D., Barbour, R., Dunn, W., Gordon, G., Grajeda, H., Guido, T., Hu, K., Huang, J., Johnson-Wood, K., Khan, K., Kholodenko, D., Lee, M., Liao, Z., Lieberburg, I., Motter, R., Mutter, L., Soriano, F., Shopp, G., Vasquez, N., Vandevert, C., Walker, S., Wogulis, M., Yednock, T., Games, D. and Seubert, P. (1999). Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature 400, 173-177.

Schenk, D. B., Seubert, P., Lieberburg, I. and Wallace, J. (2000). beta-peptide immunization: a possible new treatment for Alzheimer disease. Arch. Neurol. 57, 934-936.

Scheuner, D., Eckman, C., Jensen, M., Song, X., Citron, M., Suzuki, N., Bird, T. D., Hardy, J., Hutton, M., Kukull, W., Larson, E., Levy-Lahad, E., Viitanen, M., Peskind, E., Poorkaj, P., Schellenberg, G., Tanzi, R., Wasco, W., Lannfelt, L., Selkoe, D. and Younkin, S. (1996). Secreted amyloid beta-protein similar to that in the senile plaques of Alzheimer's disease is increased in vivo by the presenilin 1 and 2 and APP mutations linked to familial Alzheimer's disease. Nat. Med.2, 864-870.

Schier, R., Bye, J., Apell, G., McCall, A., Adams, G. P., Malmqvist, M., Weiner, L. M. and Marks, J. D. (1996). Isolation of high-affinity monomeric human anti-c-erbB-2 single chain Fv using affinity-driven selection. J. Mol. Biol.255, 28-43.

Selkoe, D. J. (1999). Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer's disease. Nature 399, A23-31.

12

Thompson, J., Pope, T., Tung, J. S., Chan, C., Hollis, G., Mark, G. and Johnson, K. S. (1996). Affinity maturation of a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop of human immunodeficiency virus: use of phage display to improve affinity and broaden strain reactivity. J. Mol. Biol.256, 77-88.

Tomlinson, I. M., Walter, G., Marks, J. D., Llewelyn, M. B. and Winter, G. (1992). The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops. J. Mol. Biol.227, 776-798.

Vassar, R., Bennett, B. D., Babu-Khan, S., Kahn, S., Mendiaz, E. A., Denis, P., Teplow, D. B., Ross, S., Amarante, P., Loeloff, R., Luo, Y., Fisher, S., Fuller, J., Edenson, S., Lile, J., Jarosinski, M. A., Biere, A. L., Curran, E., Burgess, T., Louis, J. C., Collins, F., Treanor, J., Rogers, G. and Citron, M. (1999). Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science 286, 735-741.

Vaughan, T. J., Williams, A. J., Pritchard, K., Osbourn, J. K., Pope, A. R., Earnshaw, J. C., McCafferty, J., Hodits, R. A., Wilton, J. and Johnson, K. S. (1996). Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat. Biotechnol.14, 309-314.

Walsh, D. M., Klyubin, I., Fadeeva, J. V., Cullen, W. K., Anwyl, R., Wolfe, M. S., Rowan, M. J. and Selkoe, D. J. (2002). Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539. Walsh, D. M., Klyubin, I., Shankar, G. M., Townsend, M., Fadeeva, J. V., Betts, V., Podlisny, M. B., Cleary, J. P., Ashe, K. H., Rowan, M. J. and Selkoe, D. J. (2005a). The role of cell-derived oligomers of Abeta in Alzheimer's disease and avenues for therapeutic intervention. Biochem. Soc. Trans.33, 1087-1090.

Walsh, D. M., Townsend, M., Podlisny, M. B., Shankar, G. M., Fadeeva, J. V., EI Agnaf, O., Hartley, D. M. and Selkoe, D. J. (2005b). Certain inhibitors of synthetic amyloid beta-peptide (Abeta) fibrillogenesis block oligomerization of natural Abeta and thereby rescue long-term potentiation. J. Neurosci.25, 2455-2462.

Wang, H. W., Pasternak, J. F., Kuo, H., Ristic, H., Lambert, M. P., Chromy, B., Viola, K. L., Klein, W. L., Stine, W. B., Krafft, G. A. and Trommer, B. L. (2002). Soluble oligomers of beta amyloid (1-42) inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res. 924, 133-140.

Weller, R. O. and Nicoll, J. A. (2003). Cerebral amyloid angiopathy: pathogenesis and effects on the ageing and Alzheimer brain. Neurol. Res.25, 611-616.

12

Wilcock, D. M., Alamed, J., Gottschall, P. E., Grimm, J., Rosenthal, A., Pons, J., Ronan, V., Symmonds, K., Gordon, M. N. and Morgan, D. (2006). Deglycosylated anti-amyloidbeta antibodies eliminate cognitive deficits and reduce parenchymal amyloid with minimal vascular consequences in aged amyloid precursor protein transgenic mice. J. Neurosci. 26, 5340-5346.

Wilcock, D. M. and Colton, C. A. (2009). Immunotherapy, vascular pathology, and microhemorrhages in transgenic mice. CNS Neurol. Disord. Drug. Targets. 8, 50-64.

Younkin, S. G. (1995). Evidence that A beta 42 is the real culprit in Alzheimer's disease. Ann. Neurol.37, 287-288.

Younkin, S. G. (1998). The role of A beta 42 in Alzheimer's disease. J. Physiol. Paris 92, 289-292.

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

14

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

24

24

24

24

24

24

24

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

Sekvence za humani Aβ1-42, humani Aβ1-40, humani Aβ17-42, humani Aβ1-43, mišji Aβ1-42 i njihove skraćene oblike

[0368]

Biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-42: Biotin-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 559)

Humani beta-amiloidni peptid 1-42:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 560)

Biotinilisani humani beta-amiloidni peptid 1-40: Biotin-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 561)

Humani beta-amiloidni peptid 1-40:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 562)

Mišji beta-amiloidni peptid 1-42:

DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 563)

21

Biotinilisani mišji beta-amiloidni peptid 1-42: Biotin-DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 564)

Biotinilisani-LC-mišji beta-amiloidni peptid 1-42: Biotin-(Lanac linkera)-DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 565)

Mišji beta-amiloidni peptid 1-40:

DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 566)

Biotinilisani-LC-mišji beta-amiloidni peptid 1-40: Biotin-(Lanac linkera)-DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 567)

Biotinilisani beta-amiloidni peptid 1-42 sa nasumičnim redosledom aminokiselina:

Biotin-AIAEGDSHVLKEGAYMEIFDVQGHVFGGLIFRVVDLGSHNVA (SEQ ID NO: 568)

Humani beta-amiloidni peptid 1-43:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT (SEQ ID NO: 569)

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 29-42: KKKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 570)

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 29-40: KKKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 571)

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 1-16: DAEFRHDSGYEVHHQK (SEQ ID NO: 572)

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 11-22: EVRHQKLVFFAE (SEQ ID NO: 573)

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 12-28: VRHQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 574)

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 17-42: LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 575)

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 11-42:

EVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 576)

22

Humani beta-amiloidni skraćeni peptid 3-42:

EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 577)

2

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Molekul antitela usmeren na humani Aβ1-42, naznačen time što molekul antitela sadrži VH domen i VL domen, gde VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 524 i gde VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 533.

2. Molekul antitela prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je molekul antitela kodiran sekvencom nukleinske kiseline deponovanom pod pristupnim brojem NCIMB 41890.

3. Molekul antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je molekul antitela scFv.

4. Kompozicija koja sadrži molekul antitela prema jednom od patentnih zahteva 1-3 za upotrebu u terapiji.

5. Kompozicija prema patentnom zahtevu 4 za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti.

6. Kompozicija prema patentnom zahtevu 4 za upotrebu u poboljšanju kognicije ili smanjenju kognitivnog pada kod pacijenta sa Alchajmerovom bolešću ili Daunovim sindromom.

24