[go: up one dir, main page]

RS60305B1 - Agensi koji vezuju cd123 i njihove upotrebe - Google Patents

Agensi koji vezuju cd123 i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS60305B1
RS60305B1 RS20200573A RSP20200573A RS60305B1 RS 60305 B1 RS60305 B1 RS 60305B1 RS 20200573 A RS20200573 A RS 20200573A RS P20200573 A RSP20200573 A RS P20200573A RS 60305 B1 RS60305 B1 RS 60305B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antigen
antibody
heavy chain
antibodies
Prior art date
Application number
RS20200573A
Other languages
English (en)
Inventor
Francois Gaudet
Ricardo Attar
Benjamin C Harman
Yingzhe Li
Jinquan Luo
Ronan Mcdaid
Steven C Pomerantz
Susan H Tam
Alexey Teplyakov
John Wheeler
Sheng-Jiun Wu
Jennifer F Nemeth
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Pharmaceutica Nv filed Critical Janssen Pharmaceutica Nv
Publication of RS60305B1 publication Critical patent/RS60305B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

Opis a
OBLAST TEHNIKE
[0001] Opis koji je ovde obezbeđen se odnosi na monoklonska antitela koja imunospecifično vezuju klastersku determinantu 123 (CD123; poznatu takođe kao IL-3Rα), multispecifična antitela koja imunospecifično vezuju CD123 i klastersku determinantu 3 (CD3), kao i na postupke proizvodnje i upotrebe opisanih antitela.
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0002] Približno na svaka tri minuta, postavi se nova dijagnoza kancera krvi. Najčešći kanceri krvi su leukemija, limfom i mijelom, koji će predstavljati 156.420 novih slučajeva postavljanih dijagnoza kod ljudi u Sjedinjenim Državama 2014. godine. Približno na svakih 10 minuta, neko u Sjedinjenim Državama umre od kancera krvi. Kanceri krvi su oboljenja koja mogu pogoditi kosnu srž, ćelije krvi, limfne čvorove i druge delove limfnog sistema. Ovi kanceri nesrazmerno pogađaju mlade lјude, sa leukemijom kao najčešćim tipom kancera kod dece i adolescenata mlađih od 20 godina.
[0003] Jedna vrsta ćelija kancera krvi eksprimira ćelijski marker poznat kao CD123 (IL-3Rα). Primeri ćelija kancera krvi koje eksprimiraju CD123 su blastne i leukemijske matične ćelije. Oboljenja povezana sa ekspresijom CD123 obuhvataju akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS; niskog i visokog rizika), akutnu limfocitnu leukemiju (ALL, sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hroničnu mijeloidnu leukemiju (CML) i neoplaziju blastnih plazmacitoidnih denditričnih ćelija (DPDCN).
[0004] EP2426148 (A1) opisuje antitelo na humani IL-3R± lanac, koje ne inhibira IL-3 signalizaciju i vezuje se za B domen humanog IL-3R± lanca, ali se ne vezuje za C domen humanog IL-3R± lanca.
[0005] Trenutno, lečenje ovih oboljenja uključuje preko 50 pojedinačnih lekova, sa drugima koji se istražuju i u kliničkim su ispitivanjima. Terapija zračenjem (RT) takođe se uobičajeno koristi za lečenje kancera krvi, a ponekad se primenjuje zajedno sa terapijom lekovima. Koriste se i imunoterapija, genska terapija i personalizovana medicina. Ipak, ove terapije mogu karakterisati značajni sporedni efekti i neželјene reakcije. Postoji stoga potreba za novim i poboljšanim tretmanima kancera krvi koji eksprimiraju CD123 (IL-3Rα).
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji obuhvataju teški i laki lanac koji sadrže:
a. CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 012, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 013, CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 014, CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 015, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 016 i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 017; ili
b. CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 051, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 052, CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 053, CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 024, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 025 i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 054.
[0007] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovano CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži prvi teški lanac (HC1), drugi teški lanac (HC2), prvi laki lanac (LC1) i drugi laki lanac (LC2), tako da HC1 i LC1 par obrazuje prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD123 (IL3-Rα), dok HC2 i LC2 par obrazuje drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3, ili se pronalazak odnosi na njegov CD123 (IL3-Rα) x CD3-bispecifičan vezujući fragment, gde:
i) HC1 i LC1 čine bilo koji od sledećih parova:
a. SEQ ID NO: 203 i SEQ ID NO: 204 ili
b. SEQ ID NO: 205 i SEQ ID NO: 206, tim redom; i
ii) HC2 i LC2 čine bilo koji od sledećih parova:
a. SEQ ID NO: 193 i SEQ ID NO: 194,
b. SEQ ID NO: 195 i SEQ ID NO: 196,
c. SEQ ID NO: 197 i SEQ ID NO: 198,
d. SEQ ID NO: 199 i SEQ ID NO: 200 ili
e. SEQ ID NO: 201 i SEQ ID NO: 202, tim redom.
[0008] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovano CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo ili CD123 (IL3-Rα) x CD3-bispecifičan vezujući fragment koji sadrži: a) prvi teški lanac (HC1); b) drugi teški lanac (HC2); c) prvi laki lanac (LC1); i d) drugi laki lanac (LC2), pri čemu HC1 i LC1 par obrazuje prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD123 (IL3-Rα), a HC2 i LC2 par obrazuje drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3, pri čemu
a. u paru teškog i lakog lanca koji imunospecifično vezuju CD3, navedeni teški lanac (HC2) sadrži SEQ ID NO: 184, a navedeni laki lanac (LC2) sadrži SEQ ID NO: 190 i
b. u paru teškog i lakog lanca koji imunospecifično vezuju CD123,
i. navedeni teški lanac (HC1) sadrži SEQ ID NO: 120, a navedeni laki lanac (LC1) sadrži SEQ ID NO: 165 ili
ii. navedeni teški lanac (HC1) sadrži SEQ ID NO: 136, a navedeni laki lanac LC1) sadrži SEQ ID NO: 168.
[0009] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovanu ćeliju koja eksprimira antitelo ili fragment antitela.
[0010] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo predmetnog pronalaska, ili na njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u postupku lečenja kancera.
[0011] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo ili na njegov bispecifičan vezujući fragment, za upotrebu u postupku inhibicije rasta ili proliferacije ćelija kancera, pri čemu postupak obuhvata: primenu terapijski efektivne količine CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili njegovog bispecifičnog vezujućeg fragmenta da bi se inhibirali rast ili proliferacija ćelija kancera.
[0012] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo ili na njegov bispecifičan vezujući fragment, za upotrebu u postupku preusmeravanja T-ćelije na ćeliju kancera koja eksprimira CD123, pri čemu postupak obuhvata: primenu terapijski efektivne količina CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili njegovog bispecifičnog vezujućeg fragmenta da bi se T-ćelija preusmerila na kancer.
[0013] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koji sadrži CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo, ili njegov bispecifičan vezujući fragment, i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
[0014] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovan sintetski polinukleotid koji kodira antitelo ili fragment antitela.
[0015] Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na komplet koji sadrži antitelo predmetnog pronalaska, ili njegov fragment koji vezuje antigen, i pakovanje za iste.
[0016] Ovde su obezbeđena antitela koja se imunospecifično vezuju za CD123, kao i njihovi fragmenti koji vezuju antigen. Takođe su opisani srodni polinukleotidi sposobni da kodiraju obezbeđena antitela koja su specifična za CD123 i njihove fragmente koji vezuju antigen, ćelije koje eksprimiraju obezbeđena antitela i fragmente koji vezuju antigen, kao i odgovarajući vektori i antitela i fragmenti antitela obeleženi molekulima koji se mogu detektovati. Dodatno, opisani su postupci upotrebe obezbeđenih antitela i fragmenata koji vezuju antigen. Na primer, antitela i fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD123, mogu biti upotrebljeni da bi se postavila dijagnoza ili pratila progresija, regresija ili stabilnost kancera koji eksprimira CD 123; da bi se utvrdilo da li je potrebno da se pacijent leči od kancera ili ne; ili da bi se uvrdilo da li subjekat boluje od kancera koji eksprimira CD123 ili ne, a time i da li može biti prijemčiv za tretman sa anti-kancerskim terapeutikom specifičnim za CD123, kao što su multispecifična antitela na CD 123 i CD3 koja su ovde opisana.
[0017] Ovde su dalјe obezbeđena multispecifična antitela koja se imunospecifično vezuju za CD 123 i CD3 i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen. Takođe su opisani srodni polinukleotidi sposobni da kodiraju obezbeđena CD123 x CD3 multispecifična antitela, ćelije koje eksprimiraju obezbeđena antitela, kao i odgovarajući vektori i multispecifična antitela obeležena molekulima koji se mogu detektovati. Dodatno, opisani su postupci upotrebe obezbeđenih multispecifičnih antitela. Na primer, CD123 x CD3-multispecifična antitela mogu biti upotrebljena da bi se postavila dijagnoza ili pratila progresija, regresija ili stabilnost kancera koji eksprimira CD 123; da bi se utvrdilo da li je potrebno da se pacijent leči od kancera ili ne; ili da bi se uvrdilo da li subjekat boluje od kancera koji eksprimira CD123 ili ne, a time i da li može biti prijemčiv za tretman sa anti-kancerskim terapeutikom specifičnim za CD123, kao što su CD 123 i CD3-multispecifična antitela koja su ovde opisana.
Antitela specifična za CD123
[0018] Ovde su opisana izolovana antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen. U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju humani CD123 SP1 (SEQ ID NO: 1). U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju humani CD123 SP2 (SEQ ID NO: 2). U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju humane CD123 SP1 i SP2. U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju humani CD123 SP1 i CD123 cinomolgus majmuna (SEQ ID NO: 3). U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju se za epitop koji obuhvata jedan ili više od ostataka iz (i) segmenta vanćelijskog domena (ECD) CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 195 - 202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 173 - 178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)) ili (ii) segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)). i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može vezivati za CD123 sa afinitetom od 5x0<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<- 9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje.
[0019] U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili fragment koji vezuje antigen specifični za CD123, u kompeticiji su vezivanja za CD123 sa antitelom specifičnim za CD123, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koje se vezuje za epitop koji obuhvata jedan ili više od ostataka iz (i) segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 195-202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)) ili (ii) segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)). Antitela ili fragmenti koji se vezuju za najmanje jedan ostatak u ovim epitopima mogu se takođe vezivati za dodatne ostatke u ECD-u CD123 uklјučujući jedan ili više ostataka iz (i) segmenta ECD-a u CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)) i/ili segmenta ECD-a u CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 173 - 178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)) ili ii) jedan ili više ostataka iz segmenta ECD-a u CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje.
[0020] U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, poput onih razmatranih u prethodna dva paragrafa, su neutrališuća antitela. Neutrališuće antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, obuhvataju one koji su sposobni da inhibiraju vezivanje IL-3 za CD123, što se uvrđuje merenjem smanjenja u fosforilaciji STAT5 nakon stimulacije TF-1 ćelija sa rhIL-3.
[0021] U pojedinim primerima izvođenja, antitela i fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD3123, mogu sprečiti vezivanje IL-3 za CD123(IL3Rα)/CD131(IL3Rb) receptor. U drugim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu sprečiti udruživanje α i β lanaca IL3R receptora, (CD123(IL3Rα)/CD131(IL3Rb)). Antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvataju one koji su sposobni da inhibiraju vezivanje IL3 i/ili su sposobni da inhibiraju heteromerizaciju CD123/CD133, što se utvrđuje merenjem smanjenja u udruživanju između CD123 i CD131 i merenjem gubitka heteromerizacije sa povećanjem koncentracije antitela. Tabela 1 obezbeđuje sažet prikaz primera pojedinih antitela specifičnih za CD123 koja su ovde opisana:
Tabela 1. CDR sekvence mAt generisanih iz fagnog panela za humani CD123 (SEQ ID NO:)
[0022] U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeni su antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže teški lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeni su antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže teški lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1 i laki lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1. U pojedinim primerima izvođenja koji su ovde opisani, antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, u kompeticiji je vezivanja za CD123 sa antitelom ili vezivanjem antigena koji sadrži teški lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1 i laki lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1.
[0023] Kod lјudi, IgG klasa je podelјena u četiri izotipa: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Oni dele više od 95% homologije u aminokiselinskim sekvencama Fc regiona, ali ih karakterišu velike razlike u aminokiselinskom sastavu i strukturi zglobnog regiona. Fc region posreduje efektorske funkcije, kao što su ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisna od sistema komplemenata (CDC). U ADCC, Fc region antitela se vezuje za Fc receptore (FcgR) na površini imunskih efektorskih ćelija, poput ćelija prirodnih ubica i makrofaga, što vodi fagocitozi ili lizi cilјnih ćelija. U CDC, antitela ubijaju cilјne ćelije aktiviranjem kaskade komplementa na površini ćelija. Antitela koja su ovde opisana obuhvataju antitela sa opisanim karakteristikama varijabilnih domena, u kombinaciji sa bilo kojim od IgG izotipova, uklјučujući modifikovane verzije u kojima je Fc sekvenca modifikovana tako da utiče na različite efektorske funkcije.
[0024] U mnogim primenama terapijskih antitela, efektorske funkcije posredovane sa Fc nisu deo mehanizma delovanja. Ove efektorske funkcije posredovane sa Fc mogu biti štetne i potencijalno predstavlјati rizik za bezbednost upotrebe, prouzrokovanjem sporedne toksičnosti u odnosu na mehanizam dejstva. Modifikovanje efektorskih funkcija može biti postignuto izmenom Fc regiona tehnikama genetičkog inženjeringa, da bi se smanjilo njihovo vezivanje za FcgR ili faktore sistema komplemenata. Vezanje IgG za aktivirajuće (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa i FcgRIIIb) i inhibitorne (FcgRIIb) FcgR ili za prvu komponentu sistema komplementa (C1q) zavisi od ostataka koji se nalaze u zglobnom regionu i CH2 domenu. Tako, u IgG1, IgG2 i IgG4 su uvođene mutacije da bi se smanjile ili utišale funkcionalnosti Fc. Antitela koja su ovde opisana mogu sadržavati ovakve modifikacije.
[0025] Prema jednom aspektu, antitelo sadrži Fc region koga karakteriše jedna ili više od sledećih osobina: (a) smanjena efektorska funkcija u poređenju sa matičnim Fc; (b) smanjen afinitet za Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb i/ili Fcg RIIIa, (c) smanjen afinitet za FcgRI (d) smanjen afinitet za FcgRIIa (e) smanjen afinitet za FcgRIIb, (f) smanjen afinitet za Fcg RIIIb ili (g) smanjen afinitet za cgRIIIa.
[0026] U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su IgG ili njegovi derivati, npr. izotipa su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U pojedinim primerima izvođenja gde je antitelo IgG1 izotipa, antitelo u svom Fc regionu sadrži supstituciju(e) tipa L234A, L235A i/ili K409R. U pojedinim primerima izvođenja gde je antitelo IgG4 izotipa, antitelo u svom Fc regionu sadrži supstitucije S228P, L234A i L235A. Antitela koja su ovde opisana mogu sadržavati ovakve modifikacije.
[0027] U pojedinim primerima izvođenja, opisana antitela su sposobna da se vezuju za CD123 sa konstantom disocijacije od 5 nM ili manje, što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (SPR od engl. surface plasmon resonance). U pojedinim primerima izvođenja, antitela sadrže CDR sekvence I3RB2 i I3RB18 antitela koja su predstavlјena iznad, u Tabeli 1. Testovi za merenje afiniteta upotrebom SPR, obuhvataju testove urađene upotrebom BIAcore 3000 ili Biacore T200 instrumenta, pri čemu je test rađen na sobnoj temperaturi (npr. na ili blizu 25°C) i pri čemu je antitelo koje je sposobno da se vezuje za CD123, “hvatano” na BIAcore senzorski čip sa anti-Fc antitelom (npr. kozjim anti-humanim IgG antitelom specifičnim za Fc, Jackson ImmunoResearch laboratories, kat. br. 109-005-098) do nivoa od oko 75RU, nakon čega je sledilo prikupljanje podataka o asocijaciji i disocijaciji pri brzini protoka od 40µl/min.
[0028] Pored opisanih antitela i fragmenata koji vezuju antigen specifičnih za CD123, obezbeđene su i polinukleotidne sekvence sposobne da kodiraju opisana antitela i fragmente koji vezuju antigen. Obezbeđeni su takođe vektori koji sadrže opisane polinukleotide, kao i ćelije koje eksprimiraju antitela specifična za CD123 ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji su ovde obezbeđeni. Opisane su i ćelije sposobne da eksprimiraju opisane vektore. Ove ćelije mogu biti sisarske ćelije (poput 293F ćelija, CHO ćelija), ćelije insekata (poput Sf7 ćelija), ćelije kvasca, bilјne ćelije ili ćelije bakterija (poput E. coli). Opisana antitela mogu takođe biti proizvedena od strane ćelija hibridoma.
Postupci upotrebe antitela specifičnih za CD123
[0029] Opisani su takođe postupci upotrebe obezbeđenih antitela specifičnih za CD123 ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen. Određena antitela za upotrebu u postupcima koji se razmatraju u ovom odelјku, obuhvataju ona sa setom CDR sekvenci koji je prethodno opisan za I3RB2 i I3RB18 antitela u Tabeli 1, ili antitela koja su u kompeticiji vezivanja za CD123 sa jednim od I3RB2 i I3RB18 antitela iz Tabele 1. Na primer, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen pronalaska mogu biti korisni u postupku lečenja kancera, inhibiranjem biološkog efekta IL-3, i to sprečavanjem vezivanja IL-3 za IL-3R ili, kada je antitelo konjugovano sa toksinom, usmeravanjen toksina ka kanceru koji eksprimira CD123. Pored toga, ova antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti korisni za detektovanje prisustva CD123 u biološkom uzorku, kao što je krv ili serum; za kvantifikaciju količine CD123 u biološkom uzorku, kao što je krv ili serum; za upotrebu u postupku postavljanja dijagnoze kancera koji eksprimira CD123; za određivanje postupka lečenja subjekta obolelog od kancera; ili za praćenje progresije kancera koji eksprimira CD123 kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 može biti hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN). Opisani postupci mogu biti sprovedeni pre nego što subjekat primi terapiju za kancer koji eksprimira CD123, kao što je lečenje multispecifičnim antitelom na CD123 i CD3. Dodatno, opisani postupci mogu biti sprovedeni nakon što subjekat primi terapiju za kancer koji eksprimira CD123, kao što je tretman multispecifičnim antitelom za CD123 i CD3 koje je ovde opisano.
[0030] Opisani postupci detekcije CD123 u biološkom uzorku obuhvataju izlaganje biološkog uzorka jednom ili više od antitela ili fragmenata koji vezuju antigen specifičnih za CD123 koji su ovde opisani.
[0031] Opisani postupci postavljanja dijagnoze za kancer koji eksprimira CD123 kod subjekta obuhvataju i izlaganje biološkog uzorka jednom ili više od antitela specifičnih za CD123 koji su ovde opisani, ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen; ipak, postupci podrazumevaju i kvantifikaciju količine CD123 koja je prisutna u uzorku; poređenje količine CD123 koja je prisutna u uzorku sa poznatim standardnim ili referentnim uzorkom; i utvrđivanje da li CD123 nivoi kod subjekta potpadaju unutar nivoa CD123 koji su povezani sa kancerom.
[0032] Ovde su opisani i postupci praćenja kancera koji eksprimira 123 kod subjekta. Opisani postupci obuhvataju izlaganje biološkog uzorka jednom ili više od CD123 antitela specifičnih za CD123, ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen; kvantifikaciju količine CD123 prisutne u uzorku koja je vezana za antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen; poređenje količine CD123 koja je prisutna u uzorku sa bilo kojim poznatim standardnim ili referentnim uzorkom ili sa količinom CD123 u istom uzorku koji je prethodno dobijen iz subjekta; i utvrđivanje da li nivoi CD123 kod subjekta ukazuju na progresiju, regresiju kancera ili stabilno oboljenje, na osnovu razlika u količini CD123 u uzorcima koji se porede.
[0033] Uzorci dobijeni, ili izvedeni iz, subjekata su biološki uzorci kao što su urin, krv, serum, plazma, plјuvačka, asciti, cirkulišuće ćelije, cirkulišuće tumorske ćelije, ćelija koje nisu povezane sa tkivima, tkiva, hirurški disekovano tumorsko tkivo, biopsije, uzorci aspiracije sa iglom ili histološki preparati.
[0034] Opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD123, mogu biti obeleženi za upotrebu u opisanim postupcima ili u drugim postupcima koji su poznati stručnjacima u oblasti tehnike. Na primer, antitela koja su ovde opisana, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu biti obeleženi sa radioaktivnim obeleživačem, fluorescentnim obeleživačem, epitopskim tagom, biotinom, hromoforom, ECL obeleživačem, enzimom, rutenijumom,<111>In-DOTA,<111>In-dietilen-triaminpentasirćetnom kiselinom (DTPA), peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom i beta-galaktozidazom ili poli-histidinom ili sa tome sličnim oznakama koje su poznate u tehnici.
1
Kompleti antitela specifičnih za CD123
[0035] Ovde su opisani kompleti koji uključuju opisana antitela specifična za CD123 ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Opisani kompleti mogu biti upotrebljeni za izvođenje postupaka upotrebe antitela specifičnih za CD123 ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen koji su ovde obezbeđeni, ili drugih postupaka poznatih stručnjaciam iz oblasti tehike. U pojedinim primerima izvođenja, opisani kompleti mogu sadržavati antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji su ovde opisani i reagense za upotrebu u detekciji prisustva CD123 u biološkom uzorku. Shodno tome, opisani kompleti mogu sadržavati jedno ili više od ovde opisanih antitela ili njegov/njihov fragment(e) koji vezuju antigen, kao i posudu koja sadrži antitelo ili fragment kada nisu u upotrebi, uputstva za upotrebu antitela ili fragmenta, a dalje i antitelo ili fragment koji je pričvršćen na čvrsti nosač i/ili oblike antitela ili fragmenta koji su obeleženi molekulima koji se mogu detektovati, kao što je ovde opisano.
CD123 x CD3-multispecifična antitela
[0036] Ovde su opisana izolovana multispecifična antitela koja vezuju CD123 i CD3 ("CD123 x CD3 multispecifična antitela") i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeno je izolovano antitelo koji se imunospecifično vezuje za CD123 SP2 (IL3-Rα) i CD123 SP1 (IL3-Rα) ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0037] U pojedinim primerima izvođenja, krak multispecifičnog antitela koji je specifičan za CD123 vezuje humani CD123 i/ili CD123 cinomolgus majmuna. U pojedinim primerima izvođenja, krak specifičan za CD123 iz CD123 x CD3 multispecifičnog antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, vezuje SP1 i/ili SP2 fragment humanog CD123. U poželјnim primerima izvođenja, CD123 x CD3 multispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen je bispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, izolovano CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo sadrži: a) prvi teški lanac (HC1); b) drugi teški lanac (HC2); c) prvi laki lanac (LC1); i d) drugi laki lanac (LC2), pri čemu HC1 i LC1 par obrazuje prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD123 (IL3-Rα), dok HC2 i LC2 par obrazuje drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3, ili je obezbeđen njegov CD123 (IL3-Rα) x CD3-bispecifičan vezujući fragment. U drugom primeru izvođenja, obezbeđena je izolovana ćelija koja eksprimira antitelo ili bispecifičan vezujući fragment. U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD123 (ili "krak specifičan za CD123") iz CD123 x CD3 multispecifičnog antitela je izveden iz ovde opisanog CD123 antitela (na primer, iz antitela I3RB2 ili I3RB18 sa CDR sekvencama navedenim u listi Tabele 1).
[0038] U pojedinim primerima izvođenja, krak specifičan za CD123 iz CD123 x CD3 multispecifičnog antitela ili fragmenata koji vezuju antigen, su IgG ili njegovi derivati. U pojedinim primerima izvođenja, opisana CD123 x CD3 multispecifična antitela su sposobna da vezuju CD123 sa konstantom disocijacije od 5 nM ili manje, što se meri površinskom plazmonskom rezonancom ili sa MSD-CAT.
[0039] U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 (ili "krak specifičan za CD3") iz CD123 x CD3 multispecifičnog antitela je izveden iz mišjeg monoklonskog antitela SP34, mišjeg IgG3/lambda izotipa. (Pessano S. i saradnici, 1995. EMBO J.4, 337-344). U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 iz CD123 x CD3 multispecifičnog antitela sadrži jedan VH domen i jedan VL domen izabrane iz Tabele 2. Tabela 2 obezbeđuje sažet prikaz primera pojedinih teških lanaca i lakih lanaca antitela specifičnih za CD3 ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen.
Tabela 2. Teški lanci i laki lanci antitela specifičnih za CD3 ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen.
[0040] U pojedinim primerima izvođenja, antitela i fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD3 sadrže teški lanac iz Tabele 3 i laki lanac iz Tabele 3. Tabela 3 obezbeđuje sažet prikaz matrice teških lanaca i lakih lanaca za antitela specifična za CD3 i njihove fragmente koji vezuju antigen.
Tabela 3. Antitela nastala kombinovanjem teških i lakih lanaca.
[0041] Kod lјudi, IgG klasa je podelјena u četiri izotipa: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Oni dele više od 95% homologije u aminokiselinskim sekvencama Fc regiona, ali ih karakterišu velike razlike u aminokiselinskom sastavu i strukturi zglobnog regiona. Fc region posreduje u efektorskim funkcijama, kao što su ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisna od sistema komplemenata (CDC). U ADCC, Fc region antitela se vezuje za Fc receptore (FcgR) na površini imunskih efektornih ćelija, poput ćelija prirodnih ubica i makrofaga, što dovodi do fagocitoze ili lize cilјnih ćelija. U CDC, antitela uništavaju cilјne ćelije aktiviranjem kaskade komplementa na ćelijskoj površini.
[0042] Za mnoge primene terapijskih antitela, efektorske funkcije posredovane sa Fc nisu deo mehanizma delovanja. Ove efektorske funkcije posredovane sa Fc mogu biti štetne i potencijalno predstavlјati rizik za bezbednost primene, prouzrokovanjem sporedne toksičnosti u odnosu na mehanizm dejstva. Modifikacije efektorskih funkcija mogu biti postignute izmenama Fc regiona, postupcima genetičkog inženjeringa, da bi se smanjilo njihovo vezivanje za FcgR ili faktore sistema komplemenata. Vezanje IgG za aktivirajuće (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa i FcgRIIIb) i inhibitorne (FcgRIIb) FcgR ili prvu komponentu sistema komplementa (C1q) zavisi od ostataka koji se nalaze u zglobnom regionu i CH2 domenu. Da bi se smanjile ili utišale Fc funkcionalnosti, uvođene su tako mutacije u IgG1, IgG2 i IgG4. Utišavajuće mutacije mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na IgG1 AA (F234A, L235A) ili IgG4 PAA (S228P, F234A, L235A) ili IgG2 AA (V234A, G237A) ili IgG1 FEA (L234F, L235E, D265A) ili IgG1 FES (L234F/L235E/P331S).
[0043] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži Fc region koga karakteriše jedna ili više od sledećih osobina: (a) smanjena efektorska funkcija u poređenju sa matičnim Fc; (b) smanjen afinitet za Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb i/ili Fcg RIIIa, (c) smanjen afinitet za FcgRI (d) smanjen afinitet za FcgRIIa (e) smanjen afinitet za FcgRIIb, (f) smanjen afinitet za Fcg RIIIb ili (g) smanjen afinitet za FcgRIIIa.
[0044] U pojedinim primerima izvođenja, antitelo specifično za CD3, ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz koga je izveden krak specifičan za CD3 multispecifičnog antitela, je IgG ili njegov derivat. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo specifično za CD3, ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz koga je izveden krak specifičan za CD3 multispecifičnog antitela, je IgG1 ili njegov derivat. U pojedinim primerima izvođenja, na primer, Fc region IgG1 antitela specifičnog za CD3 iz koga je izveden krak koji vezuje CD3, sadrži supstitucije L234A, L235A i F405L u svom Fc regionu. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo specifično za CD3, ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz koga je izveden krak specifičan za CD3 multispecifičnog antitela je IgG4 ili njegov derivat. U pojedinim primerima izvođenja, na primer, Fc region IgG4 antitela specifičan za CD3 iz koga je izveden krak koji vezuje CD3 sadrži supstitucije S228P, L234A, L235A, F405L i R409K u svom Fc regionu. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo specifično za CD3, ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz koga je izveden krak specifičan za
1
CD3 multispecifičnog antitela je IgG-AA Fc. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo specifično za CD3, ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz koga je izveden krak specifičan za CD3 multispecifičnog antitela je IgG-AA Fc-L234A, L235A i F405L (gde su L234A, L235A i F405L mutacije). U pojedinim primerima izvođenja, antitelo specifično za CD3, ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz koga je izveden krak specifičan za CD3 multispecifičnog antitela, vezuje CD3ε na primarnim humanim T-ćelijama i/ili na primarnim T-ćelijama cinomolgus majmuna. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo specifično za CD3, ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz koga je izveden krak multispecifičnog antitela specifičnog za CD3 aktivira primarne humane CD4+ T-ćelije i/ili primarne CD4+ T-ćelije cinomolgus majmuna. U pojedinim primerima izvođenja, opisana CD123 x CD3 multispecifična antitela su sposobna da vezuju CD3 na humanim ili T-ćelijama cinomolgus majmuna sa konstantom disocijacije manjom od 500 ili manjom od 100 ili manjom od 20 nM, što je određeno kompetitivnim vezivanjem sa obeleženim anti-CD3 antitelom poznatog afiniteta
[0045] Pored opisanih CD123 x CD3-multispecifičnih antitela, takođe su obezbeđene polinukleotidne sekvence sposobne da kodiraju opisana CD123 x CD3-multispecifična antitela. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđen je izolovan sintetski polinukleotid koji kodira HC1, HC2, LC1 ili LC2 CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta. Obezbeđeni su i vektori koji sadrže opisane polinukleotide, kao i ćelije koje eksprimiraju CD123 x CD3 multispecifična antitela koja su ovde obezbeđena. Takođe su opisane ćelije sposobne da eksprimiraju prijavljene vektore. Ove ćelije mogu biti sisarske ćelije (poput 293F ćelija, CHO ćelije), ćelije insekata (poput Sf7 ćelija), ćelije kvasca, bilјne ćelije ili ćelije bakterija (poput E. coli). Opisana antitela mogu takođe biti proizvedena od strane ćelija hibridoma. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za generisanje CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta, kultivisanjem ćelija.
[0046] Ovde su dalјe obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže CD123 (IL3-Rα) x CD3 multispecifična antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
Postupci upotrebe CD123 x CD3-multispecifičnih antitela
[0047] Opisani su i postupci upotrebe opisanih CD123 x CD3-multispecifičnih antitela i njihovih multispecifičnih fragmenata koji vezuju antigen. Na primer, CD123 x CD3 multispecifična antitela i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen mogu biti korisni u lečenju kancera koji eksprimira CD123 kod subjekta kome je to potrebno. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 je hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzan krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN).
[0048] Opisani postupci lečenja kancera koji eksprimira CD123 kod subjekta kome je to potrebno, obuhvataju primenu terapijski efektivne količine opisanog CD123 x CD3-multispecifičnog antitela ili njegovog multispecifičnog fragmenta koji vezuje antigen subjektu. U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je sisar, poželјno čovek. U poželјnim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za lečenje subjekta koji boluje od kancera, primenom terapijski efektivne količine CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog fragmenta koji vezuje antigen, pacijentu kome je to potrebno i tokom vremena dovoljnog za lečenje kancera.
[0049] Ovde su dalјe obezbeđeni postupci za inhibiranje rasta ili proliferacije ćelija kancera, primenom terapijski efektivne količine CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta da bi se inhibirali rast ili proliferacija ćelija kancera.
[0050] Obezbeđeni su i postupci preusmeravanja T-ćelije na ćeliju kancera koja eksprimira CD123, primenom terapijski efektivne količine CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta da bi se T-ćelija preusmerila na kancer.
Kompleti antitela specifičnih za CD123 i CD3
[0051] Ovde su opisani kompleti koji sadrže opisana CD123 x CD3-multispecifična antitela. Opisani kompleti mogu biti upotrebljeni za izvođenje postupaka upotrebe CD123 x CD3-multispecifičnih antitela koja su ovde obezbeđena ili drugih postupaka poznatih stručnjacima u oblasti tehnike. U pojedinim primerima izvođenja, opisani kompleti mogu sadržavati antitela koja su ovde opisana i reagense za upotrebu u lečenju kancera koji eksprimira CD123. Shodno tome, opisani kompleti mogu sadržavati jedno ili više od ovde opisanih multispecifičnih antitela, ili njihovih multispecifičnih fragmenata koji vezuju antigen, i posudu koja sadrži antitelo ili fragment kada nisu u upotrebi i/ili uputstva za upotrebu antitela ili fragmenta, kao i antitelo ili fragment pričvršćene na čvrsti nosač i/ili oblike antitela ili fragmenta obeležene molekulom koji se može detektovati, kao što je ovde opisano.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0052]
Slika 1. Slika 1 prikazuje vektor pDisplay koji je upotrebljen za kloniranje vanćelijskih domena CD123.
Slika 2. Slika 2 (Slika 2A, Slika 2B i Slika 2C) prikazuje test ćelijskog vezivanja koji je ukazao na potencijal vezivanja antitela iz pozitivnih klonova fagnog panela za ćelije koje eksprimiraju CD123.
Slika 3. Slika 3 prikazuje kompetitivni ELISA test između panela antitela i anti-CD 123 antitela 7G3.
Slika 4. Slika 4 (Slika 4A i Slika 4B) prikazuje funkcionalnu analizu STAT5 zasnovanu na CD123 ćelijama. Slika 4C prikazuje funkcionalnu analizu STAT5 zasnovanu na CD123 ćelijama u zavisnosti od doze, za I3RB18 i 7G3 antitela.
Slika 5. Slika 5 (Slika 5A, Slika 5B i Slika 5C) prikazuje vezivanje monoklonskih antitela I3RB2, I3RB18 i 7G3 za endogeni CD123 koji je eksprimiran na AML ćelijskoj liniji, OCI-AML5.
Slika 6. Slika 6 (Slika 6A i Slika 6B) prikazuje analizu kompetitivnog vezivanja između obeleženih I3RB2 i I3RB18 mAt i drugih anti-CD 123 At koja su identifikovana skriningom.
Slika 7. Slika 7 (Slika 7A (SEQ ID NO: 232) i Slika 7B (SEQ ID NO: 232)) prikazuju rezultate studija mapiranja epitopa upotrebom vodonik/deuterijumske izmene sa masenom spektrometrijom (HDX-MS), koji pokazuju razlike u nivoima deuterijuma za CD123 SP2 u prisustvu ili odsustvu Fab.
Slika 8. Slika 8 prikazuje ostatke antitela koji su uklјučeni u vezivanje CD123 sp2, što je utvrđeno analizom strukture kokristala scFv izvedenog iz I3RB18 i ECD-a iz CD123 SP2. Numeracija: CD123 sp2, uokvireno elipsama; CDR iz I3RB18, uokvireno kvadratima.
1
Slika 9. Slika 9A prikazuje strukturu kokristala CD123 sp2:I3RB18 (označenu kao B18), a Slika 9B prikazuje strukturu kokristala CD123 spl:CSL362 Fab, humanizovanog oblika mAt 7G3 iz PDB unosa 4JZJ.
Slika 10. Slika 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu SP34 sa sekvencijalnom numeracijom. CDR sekvence po AbM definiciji (K.R. Abhinandan i A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol.45, 3832-3839) su podvučene. Ser230 je poslednji HC ostatak koji je prisutan u Fab region dobijenom cepanjem sa papainom. Ostaci 231-455 su iz IGHG3_MOUSE (mišjeg IgG3, izoforma 2).
Slika 11. Slika 11 prikazuje varijabilni domen SP34 sa klјučnim ostacima regiona VL/VH kontakta. Ostaci 38, 48 i 51 u VL (obeleženi) su u kontaktu sa CDR-H3.
Slika 12. Slika 12 prikazuje varijante ataptacija dobijene postupkom adaptacije humanim uokvirujućim regionoma („HFA“) za VH(SEQ ID NOS 5 i 184-187, tim redom, po redosledu pojavljivanja) i VL(SEQ ID NOS 4 i 188-190, tim redom, po redosledu pojavljivanja). Numeracija je redna; CDR sekvence po AbM definiciji su podvučene; ostaci koji se razlikuju od SP34 su naznačeni podeblјanim slovima; povratne mutacije u HFA varijantama su podeblјane i podvučene.
Slika 13. Slika 13 prikazuje vezivanje varijanti SP34 HFA za primarne humane T-ćelije.
Slika 14. Slika 14 prikazuje vezivanje varijanti SP34 HFA na primarne T-ćelije cinomolgus majmuna.
Slika 15. Slika 15 pokazuje da SP34 HFA varijante aktiviraju primarne humane T-ćelije in vitro. Vrednosti za negativne kontrole su prikazane belim stubićima, a za pozitivne kontrole crnim stubićima.
Slika 16. Slika 16 pokazuje da SP34 HFA varijante aktiviraju primarne T-ćelije cinomolgus majmuna in vitro. Vrednosti za negativne kontrole su prikazane belim stubićima, a za pozitivne kontrole crnim stubićima.
Slika 17. Slika 17 prikazuje korelaciju vezivanja i aktivacije sa SP34 HFA varijantama. Prosečne vrednosti vezivanja i srednje vrednosti intenziteta fluorescencije („MFI“) CD69 od čoveka (Slika 17A) i cinomolgus (Slika 17B) untete su jedna u odnosu na druge.
Slika 18. Slika 18 prikazuje test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama za donora M6587 (Slika 18A) i donora M7020 (Slika 18B) sa MV4-11 ćelijskom linijom.
Slika 19. Slika 19 prikazuje test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama za donora M6587 (Slika 19A) i donora M7020 (Slika 19B) sa ćelijskom linijom OCI-M2.
Slika 20. Slika 20 prikazuje test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama za donora M6587 (Slika 20A) i donora M7020 (Slika 20B) sa OCI-AML ćelijskom linijom.
Slika 21. Slika 21 prikazuje efikasnost I3RB186 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu.
Slika 22. Slika 22 prikazuje efikasnost I3RB186 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, utvrđenu analizom periferne krvi na CD45+ (Slika 22A) i CD8+/CD4+ (Slika 22B), 30. dana, postupkom ćelijskog sortiranja aktivniranog fluorescencijom (FACS).
1
Slika 23. Slika 23 prikazuje efikasnost I3RB186 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu upotrebom FACS analize periferne krvi na CD45+ (Slika 23A) i CD8+/CD4+ (Slika 23B), 53. dana nakon implantacije tumora.
Slika 24. Slika 24 prikazuje efikasnost I3RB186 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, koja ukazuje na promene telesne težine sa tretmanom.
Slika 25. Slika 25 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 bispecifičnog At I3RB186 sa kontrolnim nultim krakom bispecifičnih antitela I3RB191 i I3RB192 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu.
Slika 26. Slika 26 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 bispecifičnog At I3RB186 sa kontrolnim nultim krakom bispecifičnih antitela I3RB191 i I3RB192 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, dobijenu FACS analizom na CD45+ (Slika 26A) i CD8+/CD4+ (Slika 26B), 36. dana nakon implantacije tumora.
Slika 27. Slika 27 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 bispecifičnog At I3RB186 sa kontrolnim nultim krakom bispecifičnih antitela I3RB191 i I3RB192 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, dobijenu FACS analizom na CD45+ (Slika 27A) i CD8+/CD4+ (Slika 27B), 63. dana nakon implantacije tumora.
Slika 28. Slika 28 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 bispecifičnog At I3RB186 sa kontrolnim nultim krakom bispecifičnih antitela I3RB191 i I3RB192 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, koja ukazuje na promene telesne težine tokom lečenja.
Slika 29. Slika 29 prikazuje krive vezivanja u zasićenju, koje su upotrebljene za određivanje afiniteta ćelijskog vezivanja (Kd) za SP34-2 na primarnim T-ćelijama čoveka (Slika 29A) i T-ćelijama cinomolgus majmuna (Slika 29B).
Slika 30. Slika 30 prikazuje eksperimente kompetitivnog vezivanja za primarne humane T-ćelije (Slika 30A) i T-ćelije cinomolgus majmuna (Slika 30B) upotrebom obeleženih antitela. Alexa Fluor<R>488B146 i rastućih koncentracije neobeleženih CD123 x CD3 antitela.
Slika 31. Slika 31 prikazuje test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama za donora M6948 (Slika 31A) i donora M6521 (Slika 31B) sa OCI-AML ćelijskom linijom.
Slika 32. Slika 32 prikazuje test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama za donora M6948 (Slika 32A) i donora M6521 (Slika 32B) sa KG-1 ćelijskom linijom.
Slika 33. Slika 33 prikazuje test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama za donora M6948 (Slika 33A) i donora M6521 (Slika 33B) sa JIM3 ćelijskom linijom.
Slika 34. Slika 34A, B, C i D prikazuje efekat CD123 x CD3 antitela na heteromerizaciju indukovanu sa IL-3, za CD123 i CD131 iz I3RB218 (Slika 34A), 8747 (Slika 34B), I3RB217 (Slika 34C) i 7959 (Slika 34D)
Slika 35. Slika 35 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 7959 i At 9958 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem srednjih vrednosti zapremina tumora.
Slika 36. Slika 36 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 3978 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem srednjih vrednosti zapremina tumora.
1
Slika 37. Slika 37 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 8747 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem srednjih vrednosti zapremina tumora.
Slika 38. Slika 38 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 8876 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem srednjih vrednosti zapremina tumora.
Slika 39. Slika 39 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 7959 i At 9958 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem promena u telesnoj težini sa tretmanom.
Slika 40. Slika 40 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 3978 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem promena u telesnoj težini sa tretmanom.
Slika 41. Slika 41 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 8747 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem promena u telesnoj težini sa tretmanom.
Slika 42. Slika 42 prikazuje efikasnost CD123 x CD3 At 8876 u KG-1 tumorskom ksenograftnom modelu, poređenjem promena u telesnoj težini sa tretmanom.
Slika 43. Slika 43 prikazuje in vivo mišji PK za CD123 x CD3 bispecfična antitela 3978, 7955, 7959, 9958
DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA
Definicije
[0053] U celoj specifikaciji i patentnim zahtevima su upotrebljeni razni termini koji se odnose na različite aspekte opisa. Predviđeno je da takvi termini imaju svoja uobičajena značenja iz oblasti tehnike, ukoliko nije drugačije naznačeno. Ostale posebno definisane pojmove treba tumačiti na način koji je u skladu sa definicijama koje su ovde obezbeđene.
[0054] Kao što je upotrebljeno u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, jednina pojmova podrazumeva i množinu istih, ukoliko sadržaj jasno ne uslovljava drugačije. Tako, na primer, nevođenje temina "ćeliju" obuhvata kombinaciju dve ili više ćelija i slično.
[0055] Podrazumeva se da termin "oko/približno", kako se ovde upotrebljava kada se odnosi na merlјivu vrednost kao što je količina, vremensko trajanje i slično, obuhvata varijacije do ± 10% od navedene vrednosti, pošto su takve varijacije pogodne za sprovođenje opisanih postupaka. Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi brojevi koji ukazuju na količine sastojaka, osobine kao što su molekulska težina, reakcioni uslovi i tako dalјe, koji su upotrebljavani u specifikaciji i patentnim zahtevima, treba smatrati kao modifikovanima u svim slučajevima upotrebe termina "oko/približno". Prema tome, ukoliko nije naznačeno suprotno, numerički parametri navedeni u specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima koji slede, prestavljaju približne vrednosti koje mogu varirati u zavisnosti od želјenih osobina koje je potrebno dobiti predmetnim pronalaskom. Svaki numerički parameter stoga treba tumačiti barem uzimanjem značajnih cifara i primenom uobičajenih tehnika zaokruživanja, a ne kao pokušaj da se ograniči primena doktrine ekvivalentna području patentnih zahteva,.
[0056] Bez obzira da li numerički opsezi i parametri koji se navode za šire definisanje područja pronalaska približne vrednosti, numeričke vrednosti koje su navedene u konkretnim primerima su prijavljene što je moguće preciznije. Bilo koja numerička vrednost, međutim, inherentno sadrži
1
određene greške koje nužno proističu iz standardne devijacije koja se javlja prilikom njihovih odgovarajućih merenja u ispitivanjima.
[0057] „Izolovano“ označava da je biološka komponenta (kao što je nukleinska kiselina, peptid ili protein) značajno razdvojena, proizvedena odvojeno od ili prečišćena od drugih bioloških komponenti organizma u kojima se komponenta prirodno nalazi, tj. od drugih hromozomskih i ekstrahromozomskih DNK i RNK i proteina. Nukleinske kiseline, peptidi i proteini koji su "izolovani" stoga obuhvataju nukleinske kiseline i proteine koji su prečišćeni standardnim postupcima prečišćavanja. "Izolovane" nukleinske kiseline, peptidi i proteini mogu biti deo kompozicije i još uvek biti izolovani, ukoliko takva kompozicija nije deo prirodnog okruženja nukleinske kiseline, peptida ili proteina. Termin takođe obuhvata nukleinske kiseline, peptide i proteine koji su pripremlјeni rekombinantnom ekspresijom u ćeliji domaćinu, kao i hemijski sintetisane nukleinske kiseline. Predviđeno je i da se "izolovano" antitelo ili fragment koji vezuje antigen, kako se ovde upotrebljavaju, odnose na antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je suštinski oslobođen od drugih antitela ili fragmenata koji vezuju antigen i sa različitom su specifičnošču za antigen (na primer, izolovano antitelo koja se specifično vezuje za CD123 je u suštini bez antitela koja se specifično vezuju za antigene različite od CD123). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu CD123 može, međutim, biti unakrsno reaktivno sa drugim srodnim antigenima, na primer, iz drugih vrsta (kao što su homolozi CD123 iz drugih vrsta).
[0058] "Polinukleotid", sa sinonimima koji podrazumevaju "molekul nukleinske kiseline", "nukleotidi" ili "nukleinske kiseline", odnosi se na bilo koji poliribonukleotid ili polidezoksiribonukleotid, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. "Polinukleotidi" obuhvataju, bez ograničavanja na, jednolančanu i dvolančanu DNK, DNK koja predstavlјa smešu jednolančanih i dvolančanih regiona, jednolančanu i dvolančanu RNK i RNK koja je smeša jednolančanih i dvolančanih regiona, hibridne molekule koji sadrže DNK i RNK koji mogu biti jednolančani ili, češće, dvolančani ili smešu jednolančanih i dvolančanih regiona. Dodatno, „polinukleotid“ se odnosi na trolančane regione koji sadrže RNK ili DNK ili i RNK i DNK. Termin polinukleotid takođe obuhvata DNK ili RNK koje sadrže jednu ili više modifikovanih baza i DNK ili RNK sa okosnicama koje su modifikovane u cilju stabilnosti ili iz drugih razloga. "Modifikovane" baze obuhvataju, na primer, baze obeležene tricijmom i neuobičajene baze poput inozina. DNK i RNK mogu biti modifikovane na razne načine; stoga, „polinukleotid“ obuhvata hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike polinukleotida koji se obično javljaju u prirodi, kao i hemijske oblike DNK i RNK koji su karakteristični za viruse i ćelije. "Polinukleotid" takođe obuhvata relativno kratke lance nukleinskih kiselina koji se često označavaju kao oligonukleotidi.
[0059] Značenje izraza "suštinski isti", može se razlikovati u zavisnosti od konteksta u kome se izraz upotrebljava. Zbog varijacije prirodnih sekvenci za koju je verovanto da postoji među teškim i lakim lancima i genima koji ih kodiraju, moglo bi se očekivati da će se uek pronaći neki nivo varijacije unutar aminokiselinskih sekvenci ili gena koji kodiraju antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji su ovde opisani, sa malim ili bez uticaja na njihove jedinstvene karakteristike vezivanja (npr. specifičnost i afinitet). Takvo očekivanje je delimično posledica degeneracije genetičkog koda, kao i evolutivnog uspeha konzervativnih varijacija u aminokiselinskim sekvencama, tako da "suštinski isto" označava identičnost od najmanje 65% između dve ili više sekvenci. Poželјno je da se termin odnosi na identičnost između dve ili više sekvenci od najmanje 70%, poželјnije identičnost od najmanje 75%, poželјnije identičnost od najmanje 80%, poželјnije identičnost od najmanje 85%, poželјnije identičnost od najmanje 90%, poželјnije identičnost od najmanje 91%, poželјnije identičnost od najmanje 92%,
1
poželјnije identičnost od najmanje 93%, poželјnije identičnost od najmanje 94%, poželјnije identičnost od najmanje 95%, još poželјnije identičnost od najmanje 96%, još poželјnije identičnost od najmanje 97%, još poželјnije identičnost od najmanje 98% i još poželјnije identičnost od najmanje 99% ili više. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koji je zajednički za sekvence (tj.% homologije = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija x 100), uzimajući u obzir broj razmaka (praznina, engl. gap) i dužinu svakog razmaka, pri čemu razmaci moraju biti uvedeni radi optimalnog poravnanja dve sekvence. Procenat identičnosti između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence može biti određen npr.upotrebom algoritma koji su definisali E. Meyers i W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988), a koji je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), upotrebom PAM120 tabele za težine ostataka, kao i ograničavajem dužine razmaka od 12 i ograničavanjem broja razmaka na 4. Dodatno, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može biti određen upotrebom Needleman-Wunsch-ovog algoritma, J. Mol. Biol.48, 444-453 (1970).
[0060] Stepen varijacije koji se može javiti unutar aminokiselinske sekvence proteina bez značajnog uticaja na funkciju proteina je mnogo niži nego kod skevence nukleinske kiseline, pošto se isti principi degeneracije koda ne mogu primeniti na aminokiselinske sekvence. Prema tome, u kontekstu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, "suštinski isto" označava antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji su 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan opisanim antitelima i fragmentima koji vezuju antigen. Ostali primeri izvođenja obuhvataju antitela specifična za CD123, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže uokvirujuće, skafoldne ili druge nevezujuće regione koji nisu sa zanačajnim identitetom u sekvenci sa ovde opisanim antitelima i fragmentima koji vezuju antigen, ali u koje su ugrađeni jedna ili više od CDR ili drugih sekvenci koje su neophodne da bi se obezbedilo svojstvo vezivanje koje je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identično svojstvu sekvenci koje su ovde opisane. "Vektor" je replikon, poput plazmida, faga, kozmida ili virusa, u koji može operativno biti ugrađen drugi segment nukleinske kiseline da bi se postigla replikacija ili ekspresija segmenta.
[0061] "Klon" je populacija ćelija koja je mitozom izvedena iz jedne ćelije ili zajedničkog pretka. "Ćelijska linija" je klon primarne ćelije koja je sposobna za stabilan rast in vitro, tokom mnogih generacija. U pojedinim primerima koji su ovde obezbeđeni, ćelije su transformisane upotrebom transfekcije ćelija sa DNK.
[0062] Termini "eksprimira" i "proizvodi" su ovde upotrebljavani kao sinonimi i odnose se na biosintezu genskog proizvoda. Ovi termini obuhvataju transkripciju gena u RNK. Ovi termini takođe obuhvataju prevođenje/translaciju RNK u jedan ili više polipeptida, a dalјe obuhvataju sve prirodne posttranskripcione i post-translacione modifikacije. Ekspresija ili proizvodnja antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen može biti unutar citoplazme ćelije ili u vanćelijskom okruženju, kao što je medijum za rast ćelijske kulture.
[0063] Termini „lečenje“ ili „tretman“ se odnose na svaki uspeh ili na pokazatelјe uspeha u ublažavanju ili pobolјšanju povrede, patologije ili stanja, uklјučujući bilo koji objektivan ili subjektivan parametar poput snižavanja, remisije, umanjenja simptoma ili činjenja stanja podnošlјivim za pacijenta, kao i usporavanja stope degeneracije ili njenog pada, činjenje konačne tačke degeneracije manje oštećujućom, pobolјšanja fizičkog i mentalnog zdravlja subjekta ili produženja dužine preživlјavanja.
2
Tretman može biti ispitan na osnovu objektivnih ili subjektivnih parametara; uklјučujući rezultate fizičkog pregleda, neurološkog pregleda ili psihijatrijskih procena.
[0064] "Efektivna količina" ili "terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u određenim dozama i tokom potrebnog vremenskog perioda, za postizanje želјenog terapijskog rezultata. Terapijski efektivna količina CD123 x CD3 antitela može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stadijum oboljenja, starost, pol i težina pojedinca, kao i od sposobnost antitela da izazove želјeni odgovor kod pojedinca. Terapijski efektivna količina je takođe ona u kojoj terapijski korisna dejtva prevazilaze bilo kakav toksičan ili štetan efekti antitela ili dela antitela.
[0065] "Antitelo" se odnosi na sve izotipove imunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD i IgY), uklјučujući razne monomerne, polimerne i himerne oblike, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Termin "antitelo" specifično obuhvata poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAt) i polipeptide slične antitelima, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela.
[0066] Fragmenti koji vezuju antigen su svaka proteinska struktura koja može ispoljiti afinitet vezivanja za određeni antigen. Fragmenti koji vezuju antigen obuhvataju one koji su obezbeđeni bilo kojom poznatom tehnikom, poput enzimskog cepanja, sinteze peptida i rekombinantnih tehnika. Pojedini fragmenti koji vezuju antigen se sastoje od delova intaktnih antitela koji zadržavaju specifičnost vezivanja antigena iz matičnog molekula antitela. Na primer, fragmenti koji vezuju antigen mogu sadržavati najmanje jedan varijabilan region (bilo varijabilni region teškog ili lakog lanca) ili jednu ili više CDR sekvenci antitela za koju je poznato da vezuju određeni antigen. Primeri pogodnih fragmenata koji vezuju antigen obuhvataju, bez ograničenja, dimerna antitela i jednolančane molekule, kao i Fab, F(ab’)2, Fc, Fabc i Fv molekule, jednolančana (Sc) antitela, pojedinačne lake lance antitela, pojedinačne teške lance antitela, himerne fuzije između lanca antitela ili CDR sekvenci i drugih proteina, proteina matriksa, monomere ili dimere teških lanaca, monomere ili dimere lakih lanaca, dimere koji se sastoje od jednog teškog i jednog lakog lanca, monovalentan fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena ili monovalentno antitelo koje je opisano u WO2007059782, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu, Fd fragment koji se suštinski sastoji od V.pod.H i C.pod.H1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, dAb fragmenta (Ward i saradnici, Nature 341, 544-546 (1989)), koji se suštinski sastoji od VH domena i označava se i kao domensko antitelo (Holt i saradnici; Trends Biotechnol. novembar 2003; 21(11):484-90); kamelidna ili nanotela (Revets i saradnici; Expert Opin Biol Ther.2005 Jan.; 5(1):111-24); izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR) i slično. Svi izotipovi antitela mogu biti upotrebljeni za proizvodnju fragmenata koji vezuju antigen. Dodatno, fragmenti koji vezuju antigen mogu obuhvatati proteinske uokvirujuće regione koji nisu antitela i u koje su uspešno ugrađeni polipeptidni segmenti u orijentaciji koja obezbeđuje afinitet za dati antigen od interesa, kao što su proteini matriksa. Fragmenti koji vezuju antigen mogu biti i rekombinantno proizvedeni ili proizvedeni enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. Fraza "antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen" može biti upotrebljena da se označi da dati fragment koji vezuje antigen obuhvata jedan ili više aminokiselinskih segmenata antitela navedenog u frazi. Kada se ovde upotrebljava u kontekstu dva ili više antitela ili fragmenata koji vezuju antigen, termin "u kompeticiji sa" ili "u unakrsnoj kompeticiji sa" ukazuje da su dva ili više antitela ili fragmenta koji vezuju antigen u kompeticiji vezivanja za CD123, npr. u kompeticiji vezivanja za CD123 u testu koji je opisan u Primeru 9. Za pojedine parove antitela ili fragmenata koji vezuju antigen, kompeticija ili blokirajuće dejstvo u testu iz primera se uočava samo kada je ploča obložena jednim antitelom i drugo se upotrebljava za kompeticiju, a ne obrnuto. Ukoliko nije drugačije definisano ili je u suptrotnosti sa kontekstom, predviđeno je da termini „u kompeticiji sa“ ili „u unakrsnoj kompeticiji sa“, kada se ovde upotrebljavaju, obuhvataju takve parove antitela ili fragmenata koji vezuju antigen.
[0067] Termin "epitop" označava proteinsku determinant koja je sposobna da se specifično vezuje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, koji su sa specifičnim trodimenzionalnim strukturnim karakteristikama, kao i sa specifičnim karakteristikama naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvonavedene, ali ne i za drugonavedene, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može sadržavati aminokiselinske ostatke koji su direktno uklјučeni u vezivanje i ostale aminokiselinske ostatke koji nisu direktno uklјučeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani ili prekriveni specifičnim peptidom koji vezuje antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar “otisaka” peptida koji je specifično vezan za antigen).
[0068] "Specifično vezivanje" ili "imunospecifično vezivanje" ili termini koji su iz njih izvedeni, kada se koriste u kontekstu antitela ili fragmenata antitela, podrazumevaju vezivanje za jedan ili za više epitopa proteina od interesa, preko domena koji su kodirani imunoglobulinskim genima ili fragmentima imunoglobulinskih gena, bez preferencijalnog vezivanja drugih molekula u uzorku koji sadrži mešovitu populaciju molekula. Antitelo se obično vezuje za srodan antigen sa Kdkoja je manja od oko 1x10<-8>M, što se meri testom površinske plazmonske resonance ili testom ćelijskog vezivanja. Predviđeno je da fraze poput antitelo "specifično za [antigen]" (npr. antitelo specifično za CD123) podrazumevaju da navedeno antitelo specifično vezuje navedeni antigen.
[0069] Termin "kd" (sek<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na konstantu brzine disocijacije za određenu interakciju antitela i antigena. Navedena vrednost se takođe označava kao koffvrednost.
[0070] Termin "ka" (M<-1>sec<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na konstantu brzine asocijacije za određenu interakciju antitela i antigena.
[0071] Termin "KD" (M), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije za određenu interakciju antitela i antigena.
[0072] Termin "KA" (M<1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu asocijacije za određenu interakciju antitela i antigena i dobija se delјenjem kasa kd.
[0073] Termin "subjekt" se odnosi na čoveka i životinje drugačije od čoveka, uključujući sve kičmenjake, npr. sisare i kičmenjake koji nisu sisari, kao što su primati drugačiji od čoveka, miševi, zečevi, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci i gmizavci. U mnogim primerima izvođenja opisanih postupaka, subjekat je čovek.
[0074] Termin "uzorak", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na kolekciju sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva (npr. hirurški disekovano tumorsko tkivo, biopsije, uklјučujući aspirate dobijene iglom), koje su izolovani iz subjekta, kao i tečnosti, ćelije ili tkiva koji su prisutni unutar subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak je biološka tečnost. Biološke tečnosti su obično tečnosti na fiziološkim temperaturama i mogu uklјučivati tečnosti koje se javlјaju u prirodi i koje su prisutne u, uzorkovane iz, eksprimirane ili na drugi način ekstrahovane iz subjekta ili biološkog izvora. Određene biološke tečnosti su poreklom iz određenih tkiva, organa ili lokalizovanih regiona, dok određene druge biološke tečnosti mogu biti više globalno ili sistemski lokalizovane u subjektu ili biološkom izvoru. Primeri bioloških tečnosti obuhvataju krv, serum i serozne tečnosti, plazmu, limfu, urin, pljuvačku, tečnost cista, suze, izmet, isplјuvak, sketret sluzokože iz sekretornih tkiva i organa, vaginalni sekret, ascitne tečnosti kao što su one povezane sa tumorima koji nisu solidni, tečnosti pleuralne, perikardijalne, peritonealne, trbušne i drugih telesnih šupljina, tečnosti prikuplјene bronhijalnom lavažom i slično. Biološke tečnosti mogu takođe uključivati tečne rastvore koji su bili dovedeni u kontakt sa subjektom ili biološkim uzorkom, na primer, medijum ćelijskih i kultura organa koji obuhvata kondicionirane medijume, tečnosti nakon lavaže i slično. Termin "uzorak", kako se ovde upotrebljava, podrazumeva materijale uklonjene iz subjekta ili materijale prisutne u subjektu.
[0075] "Poznati standard" može biti rastvor sa poznatom količinom ili koncentracijom CD123, pri čemu rastvor može biti rastvor koji se javlja u prirodi, poput uzorka iz pacijenta za koga je poznato da boluje od kancera u ranoj, umereno kasnoj, kasnoj, progresivnoj ili statičnoj fazi, ili rastvor može biti sintetisan rastvor kao što je puferisana voda sa poznatom količinom CD123 koja je u njoj razblažena. Poznati standardi, koji su ovde opisani, mogu podrazumevati CD123 koji je izolovan iz subjekta, rekombinantan ili prečišćen CD123 protein ili vrednost koncentracije CD123 koja je povezana sa bolesnim stanjem.
[0076] Termin "CD3" se odnosi na humani CD3 proteinski kompleks sa više subjedinica. CD3 proteinski kompleks sa više subjedinica se sastoji od 6 jasno različitih polipeptidnih lanaca. Oni obuhvataju CD3γ lanac (SwissProt P09693), CD3δ lanac (SwissProt P04234), dva CD3ε lanca (SwissProt P07766) i jedan homodimer CD3 ζ lanaca (SwissProt 20963), koji su povezani sa α i β lancem T-ćelijskih receptora. Termin "CD3" obuhvata bilo koju varijantu, izoformu i CD3 homolog iz druge vrste koji se prirodno eksprimira od strane ćelija (uklјučujući T-ćelije) ili koji može biti eksprimiran na ćelijama koje su trasnfektovane sa genima ili cDNK koji kodiraju ove polipeptide, osim ukoliko nije nazanačeno drugačije.
[0077] Kako se ovde upotrebljava, termini "alfa subjedinica IL-3 receptora", "IL3Rα", "CD123", "IL3Rα lanac" i "IL3Rα podjedinica" se naizmenično odnose na antigenu determinantu koja se može detektovati na leukemijskim prekusorskim ćelijama i koja se imunološki vezuje za interleukin- 3 (IL3). U specifičnom primeru izvođenja, CD123 je humani CD123. U specifičnom primeru izvođenja, CD123 je CD123 cinolmolgus majmuna. U specifičnom primeru izvođenja, CD123 je CD123 SP1. U specifičnom primeru izvođenja, CD123 je CD123 SP2. Termin "CD123" obuhvata bilo koju varijantu, izoformu i homologa CD123 iz drugih vrsta, osim ukoliko nije naznačeno drugačije.
[0078] "CD123 x CD3 antitelo" je multispecifično antitelo, opciono bispecifično antitelo, koje sadrži dva različita regiona koja vezuju antigen, od kojih se jedan specifično vezuje za antigen CD123, a drugi se specifično vezuje za CD3. Multispecifično antitelo može biti bispecifično antitelo, dimerno antitelo ili sličan molekul (pogledati, na primer, PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) za opis dimernih antitela). Bispecifična antitela, dimerna antitela i slično, koja su ovde obezbeđena, mogu dodanto vezivati bilo koji pogodan ciljni molekul proed dela koji vezuje CD123. Termin "bispecifično antitelo" treba razumeti kao antitelo koje sadrži dva različita regiona koja vezuju antigen, a koji su definisani različitim sekvencama antitela. Navedeno podrazumeva različito ciljano vezivanje, ali obuhvata i vezivanje za različite epitope u oviru jednog ciljnog molekula.
[0079] "Referentni uzorak" je uzorak koji se može uporediti sa drugim uzorkom, kao što je ispitivani uzorak, da bi se omogućil karakterizacija uzorka koji se sa njim upoređuje. Referentni uzorak će karakteristi svojstva koja služe kao polazna osnova za poređenje sa uzorkom koji se ispituje. Na primer, referentni uzorak može biti upotrebljen kao referentni nivo za nivoe CD123 koji ukazuju na subjekta sa
2
kancerom. Referentni uzorak ne mora nužno biti analiziran paralelno sa uzorkom koji se ispituje, tako da u pojedinim slučajevima, referentni uzorak može biti brojčana vrednost ili opseg za koje je prethodno utvrđeno da su karakteristični za dato stanje, kao što su nivoi CD123 koji su pokazatelj kancera kod subjekta. Termin takođe obuhvata uzorke koji se upotrebljavaju u svrhu poređenja i za koje je poznato da su povezani sa fiziološkim stanjem ili oboljenjem, kao što je kancer koji eksprimira CD123, ali koji je sa nepoznatom količinom CD123.
[0080] Termin "progresija", kako se upotrebljava u kontekstu progresije kancera koji eksprimira CD123, podrazumeva promenu kancera iz manje ozbiljnog u stanje koje je više ozbiljno. Navedeno može obuhvatati porast broja ili stepena ozbiljnosti tumora, stepena metastaza, brzine rasta ili širenja kancera i slično. Na primer, "progresija kancera debelog creva" obuhvata progresiju takvog kancera od manje ozbiljnog do onog koji je teže kliničke slike, kao što je progresija iz stadijuma I u stadijum II, iz stadijuma II u stadijum III itd.
[0081] Termin "regresija", kako se upotrebljava u kontekstu regresije kancera koji eksprimira CD123, obuhvata promenu kancera iz ozbiljnijeg u manje ozbiljno stanje. Navedeno može obuhvatati smanjenje broja ili stepena ozbiljnosti tumora, stepena metastaza, brzine rasta ili širenja kancera i slično. Na primer, "regresija kancera debelog creva" obuhvata regresiju takvog kancera iz ozbiljnijeg u manje ozbiljno stanje, kao što je progresija iz stadijuma III u stadijum II, iz stadijuma II u stadijum III itd.
[0082] Termin "stabilan", kako se upotrebljava u kontekstu stabilnog kancera koji eksprimira CD123, ima za cilј da opiše stanje oboljenja koje nije, ili nije bilo, značajno promenjeno tokom klinički relevantnog vremenskog perioda da bi se moglo smatrati progresivnim kancerom ili kancerom u regresiji.
[0083] Primeri izvođenja koji su ovde opisani nisu ograničeni na određene postupke, reagense, jedinjenja, kompozicije ili biološke sisteme, koji mogu, naravno, varirati.
Antitela i fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD123,
[0084] Ovde su opisana izolovana monoklonska antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za CD123. Opšta struktura molekula antitela obuhvata domen koji vezuje antigen, koga čine teški i laki lanci, kao i Fc domen, čija je uloga u raznim funkcijama, uklјučujući fiksaciju komplemenata i vezivanje receptora za antitela.
[0085] Opisana antitela specifična za CD123, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, obuhvataju sve izotipove, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM i sintetske multimere imunoglobulinske strukture sa četiri lanca. Opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen takođe obuhvataju IgY izotip koji se obično nalazi u serumu kokoške ili ćurke ili žumancetu jajeta kokoške ili ćurke.
[0086] Antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu biti izvedeni iz bilo koje vrste na rekombinantan način. Na primer, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti verzije iz miša, pacova, koze, konja, svinje, govečeta, pileta, zeca, kamile, magarca ili himerne verzije. Za upotrebu u primeni kod ljudi, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen izvedeni iz vrste koja je različita od čoveka mogu biti genetički ili strukturno izmenjeni da bi bili manje antigeni nakon primene humanom pacijentu.
[0087] U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su himerni. Kako se ovde upotrebljava, termin "himerni" se odnosi na antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži najmanje neki deo najmanje jednog varijabilnog domena koji je izveden iz aminokiselinske sekvence antitela sisara različitog od čoveka, glodara ili gmizavca, dok je preostali deo antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, izveden iz humanog antitela.
[0088] U pojedinim primerima izvođenja, antitela su humanizovana antitela. Humanizovana antitela mogu biti himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab')2 ili druge sekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz imunoglobulina koji je različit od humanog. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoc/recipijentno antitelo) u kojima se ostaci recipijentnog regiona koji određuje komplementarnost (CDR) zamenjuju ostacima iz CDR sekvenci vrste koja nije čovek (donorsko antitelo), poput mišjih, pacovskih ili zečjih sa željenom specifičnošću, afinitetom i kapacitetom. U principu, humanizovano antitelo će uglavnom sadržavati sve od najmanje jednog, a obično dva varijabilna domena u kojima svi ili suštinski svi od CDR regiona odgovaraju onima iz imunoglobulina koji je različit od humanog, dok svi ili suštinski svi od uokvirujućih regiona predstavljaju one iz humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo može sadržavati najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično onaj iz humanog imunoglobulina.
[0089] Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani mogu biti prisutni u raznima od oblika, ali će uklјučivati jednu ili više CDR sekvenci iz I3RB2 ili I3RB18 antitela prikazanih u Tabeli 1.
[0090] Ovde su opisana izolovana antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji se imunospecifično vezuju za CD123. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su specifični za CD123 i predstavljaju humani IgG ili njegove derivate. Iako su antitela koja su specifična za CD123, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, ovde prikazani kao humani, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji su prikazani mogu biti himerizovani.
[0091] U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđena su antitela specifična za CD123, ili njihov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže teški lanac sa CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđena su antitela specifična za CD123, ili njihov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže teški lanac sa CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1 i laki lanac koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od I3RB2 i I3RB18 antitela opisanih u Tabeli 1.
[0092] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 006, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 007 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 008. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 006, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 007, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 008, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 009, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 010 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 011. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji
2
je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 119. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 119 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 164. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koje je razmatrano u ovom paragrafu su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0093] U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 012, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 013 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 014. U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 012, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 013, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 014, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 015, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 016 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 017. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 120. U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 120 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 165. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0094] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 018, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 019 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 020. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 018, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 019, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 020, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 009, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 010 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 011. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 121. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 121 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 164. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0095] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 021, CDR2 teškog lanca koji
2
obuhvata SEQ ID NO: 022 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 023. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 021, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 022, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 023, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 024, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 025 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 026. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 122. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 122 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 166. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0096] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 027, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 028 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 029. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 027, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 028, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 029, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 123. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 123 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0097] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 035. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 035, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili
2
manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 124. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 124 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0098] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 036. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 036, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 125. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 125 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0099] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 037. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 037, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 126. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 126 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
2
[0100] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 038. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 038, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 127. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 127 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0101] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 040 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 041. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 040, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 041, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 128. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 128 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0102] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 042. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 042, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće
2
sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 129. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 129 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0103] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 043. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 043, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<- 8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 130. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 fragmenti koji vezuju antigen sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 130 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0104] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 044 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 045. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 044, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 045, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 015, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 016 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 017. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 131. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 131 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 165. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0105] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 046 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 047. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 046, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 047, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 132. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 132 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0106] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 048. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 048, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 133. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 133 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0107] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 049. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog
1
lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 049, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 134. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 134 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0108] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 050. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 050, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 135. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 135 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0109] U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 051, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 052 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 053. u pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 051, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 052, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 053, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 024, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 025 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 054. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 136. U pojedinim primerima izvođenja, antitela specifična za CD123 i njihovi
2
fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 136 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 168. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koja su razmatrana u ovom odelјku su pogodna za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0110] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 055, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 056 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 057. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 055, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 056, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 057, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 058, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 059 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 137. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 137 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 169. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0111] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 060. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 060, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 138. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 138 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan gSEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0112] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 061. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 061, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 062, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 063 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 064. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 139. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 139 i varijabilni domen lakog lanca koji je u osnovi isti kao ili identičan SEQ ID NO: 170. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0113] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 065. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 065, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 066, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 067 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 068. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 140. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 140 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 171. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0114] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 069. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 069, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 070. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<- 8>M ili manje, 1x10<-8>M ili
4
manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 141 U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 141 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 172. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima je jedan krak anti-CD123 kraka.
[0115] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 071. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 071, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 142. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 142 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0116] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 072 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 073. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 072, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 073, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 143. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 143 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0117] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 074. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 074, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 075, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 076 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 077. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 144. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 144 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 173. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0118] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 078. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 078, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 079, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 063 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 080. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 145. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 145 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 174. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0119] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 081. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 081, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 146. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 146 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0120] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 082. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 082, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 083, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 084. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 147. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 147 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 175. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0121] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 085 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 086. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 085, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 086, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 087, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 067 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 088. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 148. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 148 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 176. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0122] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 089 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 090. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 089, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 090, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 091, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 076 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 092. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 149. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 149 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 177. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0123] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 093. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 093, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 150. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 fragmenti koji vezuju antigen sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 150 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0124] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 094. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 094, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 095, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 076 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 096. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 151. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 151 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 178. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0125] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 097. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 097, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 098, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 067 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 099. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<- 8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 152. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 152 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 179. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0126] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 100. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 100, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 101. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 153. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 153 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 180. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0127] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 102. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 102, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 154. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 154 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0128] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 103. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 103, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 104, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 105. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 155. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 155 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 181. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0129] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji
4
obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 106. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 039, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 106, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 156. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 156 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0130] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 107. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 107, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 108, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 109 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 110. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 157. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 157 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 182. Teški lanac varijabilni domen i varijabilni domen antitela lakog lanca koji su razmatrani u ovom odelјku su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0131] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 111. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 111, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 112, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 076 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 113. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 158. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 158 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 183. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0132] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 114, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 022 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 115. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 114, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 022, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 115, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 024, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 025 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 026. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 159. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 159 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 166. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0133] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 114, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 022 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 116. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 114, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 022, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 116, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 015, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 016 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 017. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 160. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 160 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti kao ili identičan SEQ ID NO: 165. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0134] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 117, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 013 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 118. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 117, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 013, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 118, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 015, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 016 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 017. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 161. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 161 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 165. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0135] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 051, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 052 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 053. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 051, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 052, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 053, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<- 7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 162. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 162 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0136] U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034 i CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 042. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže CDR1 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 033, CDR2 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 034, CDR3 teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 042, CDR1 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 030, CDR2 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 031 i CDR3 lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 032. Ovakvo antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu sadržavati humane uokvirujuće
4
sekvence. Navedeno antitelo specifčno za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu vezivati CD123 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<- 8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 163. U pojedinim primerima izvođenja opisa, antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 163 i varijabilni domen lakog lanca koji je suštinski isti ili je identičan SEQ ID NO: 167. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela razmatrani u ovom paragrafu su pogodni za uklјučivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan krak predstavlja anti-CD 123 krak.
[0137] Anti-CD123 antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji su obezbeđeni pronalaskom takođe obuhvataju antitela koja su u kompeticija sa antitelima koja su prethodno opisana. Kompeticija u vezivanju može biti utvrđena upotrebom ELISA testa kompetitivnog vezivanja, u skladu sa tehnikom opisanom ispod, u Primeru 5. Kompetitivno vezivanje može biti utvrđeno detektovanjem inhibicije vezivanja prvog antitela sa drugim antitelom od najmanje 20%, bez obzira na redosled po kome se antitela vezuju za CD123 (tj. ukoliko se, kada se antitelo A vezuje za CD123 pre antitela B, uočava inhibicija od samo 10%, dok kada se antitelo B vezuje za CD123 pre antitela A, uočava se inhibicija od 30%, a pošto se uočava inhibicija veća od 20% u jednom od eksperimenata, može se zaključiti da je prisutno kompetitvno vezivanje).
[0138] U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su IgG ili njegovi derivati, npr. IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 su izotipa. U pojedinim primerima izvođenja gde je antitelo IgG1 izotipa, antitelo u svom Fc regionu sadrži L234A, L235A i K409R supstituciju(supstitucije). U pojedinim primerima izvođenja gde je antitelo IgG4 izotipa, antitelo sadrži supstitucije S228P, L234A i L235A u svom Fc regionu. Specifična antitela definisana sa CDR i/ili sekvencom varijabilnih domena koje su razmatrane u prethodnim paragrafima mogu sadržavati ove modifikacije.
[0139] Takođe su opisani izolovani polinukleotidi koji kodiraju antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji se imunospecifično vezuju za CD123. Izolovani polinukleotidi sposobni da kodiraju segmente varijabilnih domena koji su ovde obezbeđeni mogu biti uklјučeni na istim ili različitim vektorima da bi se proizvela antitela ili fragmenti koji vezuju antigen.
[0140] Polinukleotidi koji kodiraju rekombinantne proteine koji vezuju antigen takođe pripadaju područja opisa. U pojedinim primerima izvođenja, opisani polinukleotidi (i peptidi koje kodiraju) sadrže vodeću sekvencu. Može biti upotrebljena bilo koja vodeća sekvenca koja je poznata u oblasti tehnike. Vodeća sekvenca može obuhvatati, ali nije ograničena na, restrikciona mesta ili mesta početka translacije.
[0141] Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD123 koji su ovde opisani, obuhvataju varijante koje sadrže jednu ili višestruke aminokiselinske supstitucije, delecije ili adicije kojima se zadržavaju biološka svojstva (npr. afinitet vezivanja ili imunsku efektorsku aktivnost) opisanih antitela specifičnih za CD123 ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen. U kontekstu predmetnog pronalaska, za opisivanje mutacije su upotrebljavane sledeće oznake, ukoliko nije drugačije naznačeno; i) supstitucija aminokiseline na datoj poziciji je navedena kao npr. K409R što označava substituciju lizina na poziciji 409 sa argininom; i ii) za specifične varijante se upotrebljavaju specifični kodovi sa tri ili jednim slovom, uključujući kodove Xaa i X da bi se naznačio bilo koji aminokiselinski ostatak. Tako, supstitucija arginina lizinom na poziciji 409 je označena kao: K409R ili je supstitucija bilo kog aminokiselinskog ostatka lizinom na poziciji 409 označena kao K409X. U slučaju delecije lizina na poziciji 409, supstitucija se označava sa K409*. Iskusan stučnjak može proizvesti varijatne sa jednom ili sa višestrukim aminokiselinskim supstitucijama, delecijama ili adicijama.
[0142] Navedene varijante mogu obuhvatati: (a) varijante u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstituisani konzervativnim ili nekonzervativnim aminokiselinama, (b) varijante u kojima se jedna ili više aminokiselina adirane u ili deletirane iz polipeptida, (c) varijante u kojima jedna ili više aminokiselina uklјučuju supstituentnu grupu i (d) varijante u kojima je polipeptid fuzionisan sa drugim peptidom ili polipeptidom, kao što je fuzioni partner, proteinski tag ili druga hemijska grupa, koji mogu obezbediti polipeptidu korisne osobine, kao što su, na primer, epitop za antitelo, polihistidinska sekvenca, ostatak biotina i slično. Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu sadržavati varijante u kojima su aminokiselinski ostaci iz jedne vrste supstituisani sa odgovarajućim ostatakom kod druge vrste, bilo na konzervativnim ili nekonzervativnim pozicijama. U drugim primerima izvođenja, aminokiselinski ostaci na nekonzervativnim pozicijama su supstituisani konzervativnim ili nekonzervativnim ostacima. Tehnike dobijanja ovih varijanti, uklјučujući genetičke (delecije, mutacije itd.), hemijske i enzimske tehnike koje su dobro poznate prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike.
[0143] Antitela specifična za CD123 ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu sadržavati nekoliko izotipova antitela, kao što su IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. U pojedinim primerima izvođenja, izotip antitela je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotip, a poželјno je IgG1 ili IgG4 izotip. Specifičnost antitela ili njegovog fragmenta za antigen je u velikoj meri određena aminokiselinskom sekvencom i rasporedom CDR regiona. Zbog toga se CDR sekvence jednog izotipa mogu prebacivati u drugi izotip bez promene specifičnosti za antigen. Alternativno, uspostavlјene su tehnike da bi se prouzrokovao prelazak hibridoma iz onih koji poizvode jedan izotip antitela u drugi (izotipsko prebacivanje), bez promene specifičnosti antigena. Shodno navedenom, takvi izotipovi antitela su unutar područja opisanih antitela ili fragmenata koji vezuju antigen.
[0144] Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD123, sa afinitetom su vezivanja za CD123 SP1 koji podrazumeva konstantu disocijacije (KD) manju od oko 5x10<-7>M, poželјno manju od oko 5x10<-8>M. U pojedinim primerima izvođenja, ovde opisana antitela specifična za CD123 ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, sa afinitetom su vezivanja za CD123 SP2 koji podrazumeva konstantu disocijacije (KD) manju od oko 5x10<-7>M, poželјno manju od oko 5x10<-8>M. Afinitet opisanih antitela ili fragmenata koji vezuju antigen specifičnih za CD123, može biti određen raznim postupcima poznatim u oblasti tehnike, kao što su površinska plazmonska rezonanca ili postupci zasnovani na ELISA testu. Testovi za merenje afiniteta upotrebom SPR obuhvataju analize izvedene upotrebom BIAcore 3000 mašine, gde se test izvodi na sobnoj temperaturi (npr. na ili blizu 25°C), pri čemu se antitelo sposobno da se vezuje za CD123 “zarobljava” na BIAcore senzorskom čipu sa anti-Fc antitelom (npr. kozjim anti-humanim IgG atnitelom specifičnim za Fc, kompanije Jackson ImmunoResearch laboratories, kat. br. 109-005-098) do nivoa od oko 75RU, nakon čega sledi prikupljanje podataka o asocijaciji i disocijaciji pri brzini protoka od 40 µl/min.
[0145] Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže polinukleotide koji su ovde opisani. Vektori mogu biti ekspresioni vektori. Smatra se stoga da su rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže sekvence koje kodiraju polipeptide od interesa, unutar područja ovog opisa. Ekspresioni vektor može sadržavati jednu
4
ili više dodatnih sekvenci, kao što su, ali bez ograničavanja na, regulatorne sekvence (npr. promotor, pojačivač), selektivni marker i signal za poliadenilaciju. Vektori za transformaciju širokog spektra ćelija domaćina su dobro poznati i obuhvataju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fagemide, kozmide, bakulovirususe, bakmide, bakterijske veštačke hromozome (BAC), veštačke hromozome kvasca (IAC), kao i druge bakterijske, vektore kvasaca i virusne vektore.
[0146] Rekombinantni ekspresioni vektori unutar područja opisa obuhvataju sintetske, genomske ili fragmente nukleinskih kiselina izvedene iz cDNK, koji kodiraju najmanje jedan rekombinantan protein koji može biti operativno povezan sa odgovarajućim regulatornim elementima. Takvi regulatorni elementi mogu uključivati transkripcioni promotor, sekvence koje kodiraju odgovarajuća mesta vezivanja iRNK za ribozom i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Ekspresioni vektori, posebno sisarski ekspresioni vektori, mogu takođe sadržavati jedan ili više netranskribujućih elemenata, kao što su mesto početka replikacije, pogodan promotor i pojačivač povezani sa genom koji će se eksprimirati, kao i ostale 5’ ili 3' bočne netranskribujuće sekvence, 5’ ili 3’ netranslatirajuće sekvence (poput mesta neophodnih za vezivanje za ribozom), poliadenilaciono mesto, donorsko i akceptorsko mesto obrade ili sekvence za terminaciju transkripcije. Može biti ugrađeno i mesto početka replikacije koje obezbeđuje sposobnost replikacije u domaćinu.
[0147] U ekspresionim vektorima, transkripcione i translacione kontrolne sekvence koji se upotrebljavaju za transformaciju ćelija kičmenjaka mogu biti obezbeđene iz virusnih izvora. Vektori za primer mogu biti konstruisani kao što je opisano u Okayama i Berg, 3 Mol.Cell. Biol.280 (1983).
[0148] U pojedinim primerima izvođenja, kodirajuće sekvence za antitelo ili fragment koji vezuje antigen stavljaju se pod kontrolu snažnog konstitutivnog promotora, poput promotora za sledeće gene: hipoksantin fosforibozil transferazu (HPRT), adenozin deaminazu, piruvat kinazu, beta-aktin, humani miozin, humani hemoglobin, humani kreatin mišića i druge. Dodatno, mnogi virusni promotori deluju konstitutivno u eukariotskim ćelijama i pogodni su za upotrebu u opisanim primerima izvođenja. Takvi virusni promotori obuhvataju, bez ograničavanja samo na njih, citomegalovirusni (CMV) neposredni rani promotor, rane i kasne SV40 promotore, promotor virusa mišjeg mamilarnog tumora (MMTV), duge terminalne ponovke (LTR) Malonijevog virusa leukemije, promotore humanog imunodeficijentnog virusa (HIV), Epstein-Barr-ovog virusa (EBV), Roušovog sarkoma virusa (RSV) i drugih retrovirusa, kao i promotore timidin kinaze Herpes Simplex virusa. U jednom primeru izvođenja, kodirajuće sekvence antitela specifičnog za CD123, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, stavljaju se pod kontrolu inducibilnog promotora, kao što su metalotioneinski promotor, promotor koji se indukuje tetraciklinom, pormotor koji se indukuje doksiciklinom, promotori koji sadrže jedan ili više elemenata odgovora stimulisanih interferonom (ISRE) poput protein kinazne R2',5'-oligoadenilat sintetaze, Mx geni, ADAR1 i sličnih.
[0149] Vektori koji su ovde opisani mogu sadržavati jedno ili više internih mesta ulaska u rizobozom (IRES). Uklјučivanje IRES sekvence u fuzione vektore može biti korisno za pojačavanje ekspresije nekih proteina. U pojedinim primerima izvođenja, vektorski sistem će uklјučivati jedno ili više mesta poliadenilacije (npr. SV40), koja mogu biti postavljena uzvodno ili nizvodno od bilo koje od prethodno navedenih sekvenci nukleinskih kiselina. Vektorske komponente mogu biti međusobno povezane ili raspoređene na način koji obezbeđuje optimalan razmak za ekspresiju genskih produkata (tj. uvođenjem "spejserskih" nukleotida između ORF) ili mogu biti pozicionirane na neki drugi način.
4
Regulatorni elementi, poput IRES motiva, mogu takođe biti raspoređeni tako da se obezbedi optimalan razmak za ekspresiju.
[0150] Vektori mogu sadržavati selektivne markere koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Selektivni markeri obuhvataju pozitivne i negativne selektivne markere, na primer, gene rezistencije na antibiotike (npr. gen za neomicinsku rezistenciju, gen za rezistenciju na higromicin, gen za rezistenciju na kanamicin, gen za rezistenciju na tetraciklin, gen za rezistenciju na penicilin), gene za glutamat sintazu, HSV-TK, HSV-TK derivate za selekciju na ganciklovir ili gen bakterijske purinske nukleozdine fosforilaze za selekciju sa 6-metilpurinom (Gadi i saradnici, 7 Gene Ther.1738-1743 (2000)). Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira selektivni marker ili mesto kloniranja može biti uzvodno ili nizvodno od nukleinske kiseline koja kodira polipeptid od interesa ili mesto kloniranja.
[0151] Vektori koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni za transformisanje raznih ćelija sa genima koji kodiraju opisana antitela ili fragmente koji vezuju antigen. Na primer, vektori mogu biti upotrebljeni za generisanje ćelija koje proizvode antitela specifična za CD123 ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Prema tome, još jedan aspekt podrazumeva ćelije domaćina koje su transformisane sa vektorima koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo koji specifično vezuje CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što su antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani i prikazani u primerima.
[0152] U oblasti tehnike su poznate brojne tehnike uvođenja stranih gena u ćelije, a koji mogu biti upotrebljeni za konstruisanje rekombinantnih ćelija u svrhe sprovođenja opisanih postupaka, u skladu sa raznim primerima izvođenja koji su ovde opisani i prikazani u vidu primera. Upotrebljena tehnika bi trebala da obezbedi stabilan prenos heterologne genske sekvence u ćeliju domaćina, tako da se heterologna genska sekvenca može naslediti i eksprimirati od strane potomstva ćelije i tako da se ne poremeti neophodan razvoj i fiziološke funkcije recipijentne ćelije. Tehnike koje se mogu upotrebiti obuhvataju, ali nisu ograničene na, transfer hromozoma (npr. ćelijsku fuziju, transfer gena posredovan hromozomima, genski transfer posredovan mikroćelijskim elementima), fizičke postupke (npr. transfekciju, sferoplastnu fuziju, mikroinjeciranje, elektroporaciju, upotrebu lipozomskih nosača), transfer virusnim vektorima (npr. rekombinantnim DNK virusima, rekombinantnim RNK virusima) i slično (opisano u Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). Precipitacija kalcijum fosfatom i fuzija bakterijskih protoplasta sa sisarskim ćelijama indukovana polietilen glikolom (PEG), mogu takođe biti upotrebljene za transformaciju ćelija.
[0153] Ćelije pogodne za upotrebu u ekspresiji ovde opisanih antitela specifičnih za CD123 ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, poželjno su eukariotske ćelije, poželјnije ćelije poreklom iz biljaka, glodara ili čoveka, kao što su na primer, ali bez ograničavanja samo na, NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tkts13, BHK, HEK293 ćelije, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L ćelije, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 ćelije mijeloma i BHK ćelijske linije, između ostalih. Dodatno, ekspresija antitela može biti ostvarena upotrebom ćelija hibridoma. Postupci za proizvodnju hibridoma su dobro uspostavljeni u oblasti tehnike.
[0154] Ćelije transformisane sa ekspresionim vektorima koji su ovde opisani mogu biti selektovane ili povrgnute skriningu za rekombinantnu ekspresije antitela ili fragmenata koji vezuju antigen koji su ovde opisani. Pozitivne rekombinantne ćelije se umnožavaju i pretražuju se subklonovi koji ispoljavaju željeni fenotip, kao što je visok nivo ekspresije, poboljšano svojstvo rasta ili sposobnost proizvodnje proteina sa željenim biohemijskim karakteristikama, na primer, zbog proteinskih modifikacija ili izmenjenih post-translacionih modifikacija. Ovi fenotipovi mogu biti posledica inheretnih osobina
4
datog subklona ili posledica mutacije. Mutacije mogu biti dobijene upotrebom hemikalija, svetlosti talasne dužine iz UV dela spektra, upotrebom zračenja, virusa, insercionih mutagena, inhibicijom popravke pogrešno sparenih baza u DNK ili kombinacijom ovih postupaka.
Postupci upotrebe antitela specifičnih za CD123 za lečenje
[0155] Ovde su obezbeđena antitela specifična za CD123, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, za upotrebu u terapiji. Preciznije, ova antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti korisni u lečenju kancera, kao što je kancer koji eksprimira CD123. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje CD123 antitela ili fragmente koji vezuju antigen za upotrebu u postupku lečenja kancera, pri čemu postupak obuhvata primenu antitela koja su opisana pronalaskom, kao što su antitela ili fragmenti koji vezuju antigen specifični za CD123. Na primer, upotreba može biti inhibiranjem biološkog efekta IL-3, bilo sprečavanjem vezivanja IL-3 za IL-3R ili, kada je antitelo konjugovano sa toksinom, takvo usmeravanje toksina ka kanceru koji eksprimira CD 123. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 obuhvata hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN). Antitela za upotrebu u ovim postupcima obuhvataju ona koja su ovde prethodno opisana, na primer, antitelo specifično za CD123 ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji se vezuju za epitop koga čine jedan ili više ostataka segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 195 - 202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 173 - 178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)). U ovim postupcima, za upotrebu su takođe korisna I3RB2 i I3RB18 antitela sa karakteristikama koje su navedene u Tabeli 1 kao što su, na primer, CDR ili sekvence varijabilnih domena, i u daljim razmatranjima ovih antitela.
[0156] U pojedinim primerima izvođenja koji su ovde opisani, imunske efektorske osobine antitela specifičnih za CD123 mogu biti pojačane ili utišane modifikacijama Fc regiona, tehnikama koje su poznate iskusnim stručnjacima. Na primer, Fc efektorske funkcije poput vezivanje Clq, citotoksičnosti zavisne od sistema komplemenata (CDC), citotoksičnosti posredovane ćelijama koja je zavisna od antitela (ADCC), fagocitoze posredovane ćelijama koja je zavisna od antitela (ADCP), negativne regulacije receptora na ćelijskoj površini (npr. B ćelijskih receptora; BCR) itd., mogu biti obezbeđene i/ili kontrolisane modifikovanjem ostataka u Fc regionu odgovornih za ove aktivnosti.
[0157] "Citotoksičnost posredovana ćelijama koja je zavisna od antitela" ili "ADCC" se odnosi na reakciju posredovanu ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezana antitela na cilјnoj ćeliji i zatim prouzrokuju lizu ciljne ćelije.
[0158] Sposobnost monoklonskih antitela da indukuju ADCC može biti pojačana izmenom njihove oligosaharidne komponente, tehnikama genetičkog inženjeringa. Humani IgG1 ili IgG3 su N-glikozilovani na Asn297, sa većinom glikana u dobro poznatim biantenarnim oblicima G0, G0F, G1, G1F, G2 ili G2F. Antitela proizvedena u netransformisanim CHO ćelijama su obično sa sadržajem glikanske fukoze od oko najmanje 85%. Uklanjanje jezgra fukoze iz biantenarnog kompleksnog tipa oligosaharida pričvršćenog za Fc region pojačava ADCC antitela pobolјšanim vezivanjem Fc.gama.RIIIa, bez izmene vezivanja antigena ili CDC aktivnosti. Takva mAt mogu biti dobijena upotrebom različitih postupaka za
4
koje je prijavljeno da vode uspešnoj ekspresiji relativno visoko defukozilovanih antitela koja nose biantenarni kompleksni tip Fc oligosaharida, kao što su kontrola osmolalnosti u kulturi (Konno i saradnici, Cytotechnology 64:249-65, 2012), primena varijante CHO linije Lecl3 kao linije ćelija domaćina (Shields i saradnici, J Biol Chem 277:26733-26740, 2002), primena varijante CHO linije EB66 kao linije ćelija domaćina (Olivier i saradnici, MAt; 2(4), 2010; elektronski publikovano pre štampanja; PMID:20562582), primena pacovske hibridoma ćelijske linije YB2/0 kao linije ćelija domaćina (Shinkawa i saradnici, J Biol Chem 278:3466-3473, 2003), uvođenje male interferirajuće RNK specifične za.alfa.1,6-fukoziltrasferazni (FUT8) gen (Mori i saradnici, Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004) ili koekspresiju.beta.-1,4-N-acetilglukozaminiltransferaze III i Goldži.alfa.-manozidaze II ili potentnog inhibirora alfa-manozidaze I, kifunenzina (Ferrara i saradnici, J Biol Chem 281:5032-5036, 2006, Ferrara i saradnici, Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou i saradnici, Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008).
[0159] U pojedinim primerima izvođenja koji su ovde opisani, ADCC izazvana CD123 antitelima može takođe biti pojačana određenim supstitucijama u Fc regionu antitela. Supstitucije za primer su, na primer, supstitucije na aminokiselinskim pozicijama 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 ili 430 (numeracija ostataka je prema EU indeksu) kao što je opisano u U.S. Pat. No.6,737,056.
Postupci detekcije CD123
[0160] Ovde su obezbeđeni i postupci detekcije CD123 u biološkom uzorku, kontaktom uzorka sa ovde opisanim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen. Kao što je ovde opisano, uzorak može biti dobijen iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivima (tj. iz slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški disekovanog tumorskog tkiva, iz biopsija, uključujući aspirate tankom iglom), histoloških kompozicija i sličnog. U pojedinim primerima izvođenja, opisani postupci obuhvataju detekciju CD123 u biološkom uzorku kontaktom uzorka sa bilo kojim od antitela ili fragmenata koji vezuju antigen specifičnih za CD123 koji su ovde opisani.
[0161] U pojedinim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa više od jednim od ovde opisanih antitela specifičnih za CD123 ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen. Na primer, uzorak može biti doveden u kontakt sa prvim antitelom specifičnim za CD123, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, a zatim može biti doveden u kontakt sa drugim antitelom specifičnim za CD123, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, pri čemu prvo antitelo ili fragment koji vezuje antigen i drugo antitelo ili fragment koji vezuje antigen nisu isto antitelo ili fragment koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, prvo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu biti pričvršćeni za povšinu kao što je mikrotitar ploča, čip ili sličan supstrat, pre kontakta sa uzorkom. U drugim primerima izvođenja, prvo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ne moraju biti pričvršćeni ili vezani za bilo što pre kontakta sa uzorkom.
[0162] Opisana antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu biti obeleženi molekulima koji se mogu detektovati. U pojedinim primerima izvođenja, obeležena antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu olakšati detekciju CD123 upotrebom postupaka koji su ovde opisani. Mnogi takvi obeleživači su dobro poznati stučnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, pogodni obeleživači obuhvataju, mada ne bi trebalo smatrati da je obraničeno samo na njih, radioaktivne obeleživače, fluorescentne obeleživače, epitopske tagove, biotin, hromoforske obeleživače, ECL obeleživače ili enzime. Preciznije, opisani obeleživači obuhvataju rutenijum,<111>In-DOTA,<111>In-
4
dietilentriaminpentasirćetnu kiselinu (DTPA), peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i beta-galaktozidazu, poli-histidin (HIS tag), akridinske boje, cijaninske boje, fluoronske boje, oksazinske boje, fenatridinske boje, rodaminske boje, Alexa Fluor® boje i slično.
[0163] Opisana antitela specifična za CD123 i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu biti upotrebljeni u raznim testovima za detekciju CD123 u biološkom uzorku. Neki pogodni testovi obuhvataju, mada ne treba smatrati da je ograničeno samo na njih, imunoblot analizu, radioimunoanalizu, površinsku plazmonsku rezonancu, imunofluorimetriju, imunoprecipitaciju, ravnotežnu dijalizu, imunodifuziju, elektrohemiluminescentnu (ECL) imunoanalizu, imunohistohemiju, ćelijsko sortiranje aktivirano fluorescencijom (FACS) ili ELISA test.
[0164] U pojedinim primerima izvođenja koji su ovde opisani, CD123 antitela pronalaska ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu biti upotrebljeni u postupku detekcije ćelija kancera koje eksprimiraju CD123 kod subjekta, da bi se utvrdilo da li subjekat može biti lečen terapijskim agensom usmerenim na CD123.
[0165] CD123 je prisutan u uzorcima krvi i seruma u nivoima koji se mogu detektovati. Stoga, ovde su obezbeđeni postupci za detektovanje CD123 u uzorku izvedenom iz krvi, kao što je uzorak seruma, kontaktom uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, a koji specifično vezuju CD123. Uzorak krvi, ili njegov derivate, mogu biti razblaženi, frakcionisani ili na drugi način obrađeni da bi se dobio uzorak na kome može biti sproveden opisani postupak. U pojedinim primerima izvođenja, CD123 može biti detekovan u uzorku krvi, ili njegovom derivatu, bilo kojom od brojnih analiza koje su poznate u oblasti tehnike, kao što su, ali ne ograničavajući se samo na njih, imunoblot analiza, radioimunoanaliza, površinska plazmonska rezonanca, imunofluorimetrija, imunoprecipitacija, ravnotežna dijaliza, imunodifuzija, elektrohemiluminescentna (ECL) imunoanaliza, imunohistohemija, ćelijsko sortiranje aktivirano fluorescencijom (FACS) ili ELISA test.
Postupci dijagnostifikovanja kancera
[0166] Ovde su obezbeđena CD123 antitela pronalaska, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, za upotrebu u postupcima postavljanja dijagnoze kancera koji eksprimira CD123 kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 podrazumeva hematološke kancere, kao što su akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN). U pojedinim primerima izvođenja, kao što je prethodno opisano, detektovanje CD123 u biološkom uzorku, poput uzorka krvi ili uzorka seruma, omogućava postavljanje dijagnoze kancera kod subjekta iz koga je uzorak dobijen. Alternativno, u pojedinim primerima izvođenja, drugi uzorci poput histološkog uzorka, uzorka aspirata finom iglom, disekovanog tumorskog tkiva, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija i sličnih, mogu takođe biti upotrebljeni za utvrđivanje da li subjekat iz koga je uzorak dobijen boluje od kancera. U pojedinim primerima izvođenja, može biti već poznato da subjekat iz koga je uzorak dobijen boluje od kancera, ali tip kancera od koga je subjekat oboleo može još uvek biti nedijagnostifikovan ili preliminarna dijagnoza može biti nejasna, tako da detekcija CD123 u biološkom uzorku koji je dobijen iz subjekta može omogućiti, ili pojasniti, dijagnozu kancera. Na primer, može biti poznato da subjekat boluje od kancera, ali ne mora biti poznato, ili može biti nejasno, da li je kancer kod subjekta kancer koji eksprimira CD123.
[0167] U pojedinim primerima izvođenja, opisani postupci obuhvataju procenu da li je subjekat oboleo od kancera koji eksprimira CD123, određivanjem količine CD123 koja je prisutna u biološkom uzorku dobijenom iz subjekta; i upoređivanjem utvrđene količine CD 123 sa količinom CD 123 u kontrolnom, odnosno referentnom uzorku, pri čemu je razlika između količine CD123 u uzorku dobijenom iz subjekta i količine CD123 u kontrolnom ili referentnom uzorku, pokazatelj da je subjekat oboleo od kancera koji eksprimira CD123. U drugom primeru izvođenja, količina CD123 koja je utvrđena u biološkom uzorku dobijenom iz subjekta može biti upoređena sa nivoima CD123 za koje je poznato da su povezani sa određenim oblicima ili stadijumima kancera, da bi se odredio oblik ili stadijum kancera subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, količina CD123 u uzorku dobijenom iz subjekta se ispituje dovođenjem uzorka u kontakt sa antitelom, ili sa njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji imunospecifično vezuju CD123, kao što su antitela specifična za CD123 koja su ovde opisana. Uzorak u kome se ispituje prisustvo CD123 može biti izveden iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. iz slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški disekovanog tumorskog tkiva, iz biopsije, usključujući aspirat dobijen finom iglom), histoloških kompozicija i sličnog. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 podrazumeva hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN). U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je čovek.
[0168] U pojedinim primerima izvođenja, postupak postavljanja dijagnoze kancera koji eksprimira CD123 će obuhvatati: kontakt biološkog uzorka subjekta sa antitelom specifičnim za CD123 ili sa njegovim fragmentom koji vezuje antigen (kao što su ona koji se mogu izvesti iz I3RB2 i I3RB18 antitela i fragmenata, obezbeđena u Tabeli 1), kvantifikaciju količine CD123 prisutne u uzorku za koji je vezano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, upoređivanje količine CD123 prisutne u uzorku sa poznatim standardnim ili referentnim uzorkom; i određivanje da li nivoi CD123 kod subjekta potpadaju unutar nivoa CD123 koji su povezani sa kancerom. U dodatnom primeru izvođenja, dijagnostički postupak može biti praćen dodatnim korakom primene ili propisivanja tretmana koji je specifičan za kancer. U drugom primeru izvođenja, dijagnostički postupak može biti praćen dodatnim korakom prosleđivanja rezultata analize, da bi se olakšalo lečenje kancera. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje specifično za kancer može biti usmereno na kancer koji eksprimira CD123, kao što je lečenje sa CD123 x CD3 multispecifičnim antitelima koja su ovde opisana.
[0169] U pojedinim primerima izvođenja, opisani postupci obuhataju procenu da li je subjekat oboleo od kancera koji eksprimira CD123, određivanjem količine CD123 koja je prisutna u uzorku krvi ili seruma dobijenom iz subjekta; i upoređivanjem utvrđene količine CD123 sa količinom CD123 u kontrolnom, odnosno referentnom uzorku, pri čemu je razlika između količine CD 123 u uzorku dobijenom iz subjekta i količine CD123 u kontrolnom, odnosno referentnom uzorku, pokazatelј da je subjekat oboleo od kancera koji eksprimira CD123.
[0170] U pojedinim primerima izvođenja, kontrolni, odnosno referentni uzorak može biti dobijen iz subjekta koji ne boluje od kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja, kontrolni, odnosno referentni uzorak može biti dobijen iz subjekta koji ne boluje od kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja gde je kontrolni, odnosno referentni uzorak izveden iz subjekta koji ne boluje od kancera koji eksprimira CD 123, utvrđeno povećanje količine CD 123 prisutne
1
u ispitivanom uzorku, u odnosu na onu koja se uočava u kontrolnom ili referentnom uzorku, predstavlja pokazatelj da subjekat boluje od kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja gde je kontrolni uzorak izveden iz subjekta koji ne boluje od kancera koji eksprimira CD123, utvrđen pad ili sličnost količine CD123 prisutne u ispitivanom uzorku, u odnosu na onu koja se uočava kod kontrolnog ili referentnog uzorka, predstavlja pokazatelj da ispitivani subjekat ne boluje od kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja gde je kontrolni ili referentni uzorak izveden iz subjekta koji boluje od kancera koji eksprimira CD123, utvrđena sličnost u količini CD123 prisutne u ispitivanom uzorku, u odnosu na onu koja je utvrđena za kontrolni ili referentni uzorak, predstavlja pokazatelj da subjekat koji se ispituje boluje od kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja gde je kontrolni, odnosno referentni uzorak izveden iz subjekta koji ne boluje od kancera koji eksprimira CD123, utvrđivanje smanjenja količine CD123 prisutne u ispitivanom uzorku, u odnosu na onu koja je utvrđena za kontrolni ili referentni uzorak, predstavlja pokazatelj da ispitivani subjekat ne boluje od kancera koji eksprimira CD 123.
[0171] U pojedinim primerima izvođenja, količina CD123 u uzorku dobijenom iz subjekta se ispituje kontaktom uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, a koji specifično vezuje CD123, kao što su to antitela koja su ovde opisana. Uzorak koji se ispituje na prisustvo CD123 može biti izveden iz uzorka krvi, uzorka seruma, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški disekovanog tumorskog tkiva, biopsija, uključujući aspirat dobijen finom iglom), histoloških kompozicija i sličnog.
[0172] Prema raznim aspektima, količina CD123 se određuje kontaktom uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji se specifično vezuju za CD123. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa više od jedne vrste antitela koja specifično vezuje CD123 ili sa njihovim fragmentima koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt prvim antitelom koje specifično vezuje CD123 ili sa njegovim fragmentom koji vezuje antigen, a zatim može biti doveden u kontakt sa drugim antitelom koje specifično vezuje CD123 ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen. U ovom svojstvu mogu biti upotrebljena antitela specifična za CD123, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, poput onih koja su ovde opisana.
[0173] Razne kombinacije antitela specifičnih za CD123 i njihovih fragmenata koji vezuju antigen mogu biti upotrebljene za obezbeđivanje „prvog“ i „drugog“ antitela ili fragmenta koji vezuje antigen da bi se sproveli opisani dijagnostički postupci. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 obuhvata hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN).
[0174] U određenim primerima izvođenja, količina CD123 je određena imunoblot analizom, radioimunoanalizom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminescentnom (ECL) imunoanalizom, imunohistohemijom, ćelijskim sortiranjem aktiviranim fluorescencijom (FACS) ili ELISA testom.
[0175] U raznim primerima izvođenja opisanih dijagnostičkih postupaka, upotrebljava se kontrolni ili referentni uzorak. Ovaj uzorak može biti pozitivna ili negativna kontrola analize koja osigurava da se analiza obavlja pravilno; na primer, kontrola analize ove prirode može biti uobičajeno upotrebljena za imunohistohemijske analize. Alternativno, uzorak može biti standardizovana referenca za količinu
2
CD123 u biološkom uzorku iz zdravog subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, utvrđeni nivoi CD123 kod subjekta koji se ispituje mogu biti upoređeni sa nivoima CD123 koji se uočavajaju u uzorcima iz subjekata za koje je poznato da boluju od kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja, kontrolni subjekat može bolovati od određenog kancera od interesa. U pojedinim primerima izvođenja, za kontrolnog subjekta je poznato da je sa kancerom u ranom stadijumu, koji može, ali ne mora, biti kancer koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja, za kontrolnog subjekta je poznato da je sa kancerom u intermedijernom stadijumu, koji može, ali ne mora, biti kancer koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja, za kontrolnog subjekta je poznato da je sa kancerom u kasnom stadijumu, koji može, ali ne mora, biti kancer koji eksprimira CD 123.
Postupci za praćenje kancera
[0176] Ovde su obezbeđeni postupci za praćenje kancera koji eksprimira CD123 kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 obuhvata hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN). U pojedinim primerima izvođenja, opisani postupci obuhvataju procenu da li je kancer koji eksprimira CD123 u progresiji, regresiji ili ostaje stabilan, određivanjem količine CD 123 koja je prisutna u ispitivanom uzorku dobijenom iz subjekta; i upoređivanje uvrđene količine CD123 sa količinom CD123 u biološkom uzorku koji je dobijen na sličan način iz subjekta u ranijoj vremenskoj tački, pri čemu razlika između količine CD123 u uzorku koji se ispituje i uzorku iz ranije vremenske tačke ukazuje da li je kancer u progresiji, regresiji ili ostaje stabilan. U tom pogledu, kada uzorak koji se ispituje sadrži povećanu količinu CD123 u odnosu na količinu koja je utvrđena u uzorku koji je uzorkovan u ranijoj vremenskoj tački, to može ukazivati na progresiju kancera koji eksprimira CD123. Nasuprot tome, kada je uzorak koji se ispituje sa smanjenom količinom CD123 u odnosu na količinu koja je utvrđena u uzorku koji je ranije uzorkovan, to može ukazivati na regresiju kancera koji eksprimira CD123.
[0177] Shodno navedenom, uzorak koji se ispituje koga karakteriše razlika u količini CD123 koja nije značajna u odnosu na količinu koja je utvrđena u uzorku koji je ranije uzorkovan, može ukazati na stanje stabilnog oboljenja kod kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja, količina CD123 u biološkom uzorku koji je izveden iz subjekta se ispituje kontaktnom uzorka sa antitelom ili njegovim fragmentom antitela koji se specifično vezuju za CD123, poput antitela koja su ovde opisana. Uzorak koji se ispituje na prisustvo CD123 može biti izveden iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj. iz slobodnih ćelija), tkiva (npr. hirurški disekovanog tumorskog tkiva, biopsija, uklјučujući aspirate finom iglom), histoloških kompozicija i sličnog. U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je čovek.
[0178] U pojedinim primerima izvođenja, postupci praćenja kancera koji eksprimira CD123 će obuhvatati: dovođenje biološkog uzorka subjekta u kontakt sa antitelom specifičnim za CD123 ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen (poput onih koji se mogu dobiti iz antitela i fragmenata prikazanih u Tabeli 1), kvantifikaciju količine CD123 koja je prisutna u uzorku, upodređivanje količine CD123 prisutne u uzorku sa količinom CD123 za koju je utvrđeno da je prisutna u biološkom uzorku koji je dobijen na sličan način iz istog subjekta u ranijoj vremenskoj tački; i utvrđivanje da li se nivo CD123 kod subjekta menjao tokom vremena. Ispitivani uzorak sa povećanom količinom CD123 u odnosu na količinu koja je utvrđena u uzorku koji je uzorkovan u ranijoj vremenskoj tački, može ukazivati na progresiju kancera. Nasuprot tome, ispitivani uzorka sa smanjenom količinom CD123 u odnosu na količinu koja je utvrđena kod uzorka koji je uzorkovan u ranijoj vremenskoj tački, može ukazati na regresiju kancera koji eksprimira CD123. U skladu sa navedenim, kada ispitivani uzorak ne karakteriše značajna razlika u količini CD123 u odnosu na količinu koja je utvrđena kod uzorka koji je uzorkovan u ranijoj vremenskoj tački, to može ukazivati na stanje stabilne bolesti kod kancera koji eksprimira CD123. U pojedinim primerima izvođenja, nivoi CD123 u uzorku mogu biti upotređeni sa poznatim standardnim ili referentnim uzorkom, samostalno ili dodatno u odnosu na nivoe CD123 koji su određeni za uzorak koji je ispitivan u ranijoj vremenskoj tački. U dodatnom primeru izvođenja, dijagnostički postupak može biti praćen dodatnim korakom primene tretmana koji je specifičan za kancer. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje specifično za kancer može biti usmereno na kancer koji eksprimira CD123, poput lečenja sa CD123 x CD3 multispecifičnim antitelima koja su ovde opisana.
[0179] Prema raznim apsektima, količina CD123 se određuje kontaktom uzorka sa antitelom koje specifično vezuje CD123 ili sa njegovim fragmentom koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa više od jednog tipa antitela ili sa njihovim fragmentom koji vezuju antigen, a koji specifično vezuje CD123. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak može biti doveden u kontakt sa prvim antitelom koje se specifično vezuje za CD123 ili sa njegovim fragmentom koji vezuje antigen, a zatim može biti doveden u kontakt sa drugim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen koji specifično vezuju CD123. U ovom svojstvu mogu biti upotrebljena antitela kao što su ona koja su ovde opisana.
[0180] Razne kombinacije antitela i fragmenata koji vezuju antigen koji su opisani u Tabeli 1, mogu biti upotrebljene za obezbeđivanje „prvog“ i „drugog“ antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, da bi se sproveli opisani postupci praćenja. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 predstavlja hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN).
[0181] U određenim primerima izvođenja, količina CD123 je određivana imunoblot analizom, radioimunoanalizom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminescentnom (ECL) imunoanalizom, imunohistohemijom, ćelijskim sortiranjem aktiviranim fluorescencijom (FACS) ili ELISA testom.
Kompleti za detektovanje CD123
[0182] Ovde su obezbeđeni kompleti za detektovanje CD123 u biološkom uzorku. Ovi kompleti sadrže jedno ili više od ovde opisanih antitela koja su specifična za CD123 ili njihov fragment koji vezuje antigen, kao i uputstva za upotrebu kompleta.
[0183] Obezbeđeno antitelo specifično za CD123, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može biti u rastvoru; liofilizovan; pričvršćen za podlogu, nosač ili ploču; ili obeležen molekulima koji se mogu detektovati.
[0184] Opisani kompleti mogu takođe sadržavati dodatne komponente koje su korisne za izvođenje postupaka koji su ovde opisani. Na primer, kompleti mogu sadržavati sredstva za dobijanje uzorka iz subjekta, kontrolni ili referentni uzorak, npr. uzorak iz subjekta koji boluje od kancera koji sporo
4
napreduje i/ili subjekta koji nema kancer, kao i jedno ili više pregrađenih mesta za uzorke i/ili materijal sa uputstvom u kome je opisano izvođenje postupka pronalaska, a dalje i kontrole i standarde koji su specifični za određena tkiva.
[0185] Sredstva za određivanje nivoa CD123 mogu dalјe uklјučivati, na primer, pufere ili druge reagense za upotrebu u testu za određivanje nivoa CD 23. Uputstva mogu biti, na primer, štampana uputstva za izvođenje analize i/ili uputstva za procenu nivoa ekspresije CD123.
[0186] Opisani kompleti mogu takođe sadržavati sredstva za izolovanje uzorka iz subjekta. Ova sredstva mogu sadržavati jedno ili više od opreme ili reagenasa koji mogu biti upotrebljeni za dobijenje tečnosti ili tkiva iz subjekta. Sredstva za dobijanje uzorka iz subjekta mogu takođe podrazumevati sredstvo za izolovanje komponenti krvi, kao što je serum, iz uzorka krvi. Poželјno je da komplet bude dizajniran za upotrebu kod humanog subjekta.
Multispecifična antitela
[0187] Vezujući domeni ovde opisanih anti-CD 123 antitela prepoznaju ćelije koje eksprimiraju CD123 na svojoj površini. Kao što je prethodno naznačeno, ekspresija CD123 može ukazivati na kancersku ćeliju. Specifičnije ciljano dejstvo na određene podgrupe ćelija može biti postignuto pravlјenjem bispecifičnih molekula, kao što su antitela ili fragmenti antitela, koji se vezuju za CD123 i za drugi ciljni molekul. Primeri takvih dodatnih ciljnih molekula uključuju CD3 i CD33. Navedeno se postiže pripremom molekula koji sadrže prvi region koji se vezuje za CD 123 i drugi vezujući region koji se vezuje za dodanti antigen. Regioni vezivanja antigena mogu biti bilo kog oblika koji omogućava specifično prepoznavanje ciljnog molekula, na primer, vezujući region može biti ili može obuhvatati varijablini domen teškog lanca ili Fv (kombinaciju varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca). Shodno tome, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji sadrže dva različita regiona za vezivanje antigena koji vezuju CD123 i drugi antigen, tim redom.
[0188] Pojedina od multispecifičnih antitela koja su ovde opisana, sadrže dva različita regiona za vezivanje antigena koji vezuju CD123 i CD3, tim redom. U poželјnim primerima izvođenja, obezbeđena su multispecifična antitela koja vezuju CD123 i CD3 (CD123 x CD3-multispecifična antitela), kao i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen. U pojedinim primerima izvođenja, CD123 x CD3-multispecifično antitelo sadrži prvi teški lanac (HCl) i prvi laki lanac (LC1) koji se uparuju da bi se obrazovalo prvo mesto koje vezuje antigen, a koje imunospecifično vezuje CD123, i drugi teški lanac (HC2) i drugi laki lanac (LC2) koji se uparuju da bi se obrazovalo drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3. U poželјnim primerima izvođenja, CD123 x CD3-multispecifično antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži krak specifičan za CD123, koji sadrži prvi teški lanac (HC1) i prvi laki lanac (LC1) koji se uparuju da bi obrazovali prvo mesto vezivanja antigena koje imunospecifično vezuje CD123, i krak specifičan za CD3, koji sadrži drugi teški lanac (HC2) i drugi laki lanac (LC2) se uparuju da bi obrazovali drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3. U pojedinim primerima izvođenja, bispecifična antitela pronalaska obuhvataju antitela koja karakteriše struktura antitela pune dužine. "Antitelo pune dužine", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo koje sadrži dva teška lanca antitela pune dužine i dva laka lanca antitela pune dužine. Teški lanac antitela pune dužine (HC) obuhvata varijabilne i konstantne domene teškog lanca, VH, CHI, CH2 i CH3. Laki lanac antitela pune dužine (LC) obuhvata varijabilne i konstantne domene lakog lanca, VL i CL. Antitelu pune dužine može nedostajati lizin (K) na C-kraju bilo jednog ili oba teška lanca. Termin "Fab-krak" ili "pola molekula" se odnosi na jedan par teškod lanca i lakog lanca koji specifično vezuje antigen.
[0189] Krak koji vezuje CD123 iz multispecifičnih antitela koja su ovde obezbeđena može biti izveden iz bilo kog od prethodno opisanih antitela specifičnih za CD123. U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD123 se vezuje za epitop koji obuhvata jedan ili više ostataka iz (i) segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 195 - 202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 173 - 178 (TEQVRDR (SEQ ID NO: 233) ili (ii) segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 164 - 175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD123 je u kompeticiji vezivanja za CD123 sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen specifičnim za CD123 koji se vezuje za epitop koji obuhvata jedan ili više ostataka iz (i) segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 195 - 202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232 i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 173 - 178 (TEQVRDR(SEQ ID NO: 233)) ili (ii) segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 164 - 175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)) i/ili segmenta ECD-a iz CD123 SP2 koji obuhvata ostatke 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). Krakovi koji vezuju CD 123, a koji se vezuju za najmanje jedan ostatak u ovim epitopima, mogu se takođe vezivati za dodatne ostatke u CD123 ECD. U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD123 je neutrališući. Neutrališući krak koji vezuje CD123 obuhvata one koji su spotozni da inhibiraju vezivanje IL-3 za CD123. Što se određuje merenjem smanjenja u fosforilaciji STAT5 nakon stimulacije TF-1 ćelija sa rhIL-3. U pojedinim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, krak koji vezuje CD123 se vezuje za humani CD123 SP1, poželјno njegov vanćelijski domen.
[0190] U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji vezuju SP1 u CD123, prvi region vezivanja atnigena koji se vezuje za CD123 sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca izvedene iz klona I3RB2 ili I3RB18 antitela, kao što je opisano u Tabeli 1. U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji se vezuju za CD123 SP1, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadržei CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca izvedene iz klona antitela I3RB2 ili I3RB18, kao što je opisano u Tabeli 1. U pojedinim oglednim primerima opisa za takve krake koji vezuju CD123 SP1, prvi region za vezivanje za antigen koji se vezuje za CD123 sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teških lanaca klona I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 ili I3RB47. U pojedinim oglednim primerima izvođenja opisa za takve krake koji vezuju CD123 SP1, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog klona I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, 13RB16, 13RB17, 13RB18, 13RB19, 13RB20, 13RB21, 13RB22, 13RB24, 13RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 ili I3RB47. U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji vezuju SP1 u CD123, prvi region vezivanja atnigena koji se vezuje za CD123 sadrži varijabilni region teškog lanca izveden iz klona antitela I3RB2 ili I3RB18, kao što je opisano u Tabeli 1. U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji se vezuju za CD123 SP1, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži varijabilni domen lakog lanca izveden iz klona antitela I3RB2 ili I3RB18, kao što je opisano u Tabeli 1. U pojedinim oglednim primerima izvođenja opisa za takve krake koji vezuju CD123 SP1, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži varijabilni domen teškog lanca klona I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 ili I3RB47. U pojedinim oglednim primerima izvođenja opisa za takve krake koji vezuju CD123 SP1, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca klona I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 ili I3RB47.
[0191] U pojedinim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, krak koji vezuje CD123 se vezuje za humani CD123 SP2, poželјno njegov vanćelijski domen. U poželјnim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, krak vezivanja za CD123 se vezuje za humani CD123 SP1 i humani CD123 SP2 i još poželјnije za njihove vanćelijske domene. U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji vezuju CD123 SP2, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca klona I3RB2 ili I3RB18. U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji vezuju CD123 SP2, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca klona I3RB2 ili I3RB18. U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji vezuju CD123 SP2, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži varijabilni domen teškog lanca klona I3RB2 ili I3RB18. U pojedinim oglednim primerima izvođenja za takve krake koji vezuju CD123 SP2, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za CD123 sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca klona I3RB2 ili I3RB18.
[0192] U pojedinim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, krak koji vezuje CD123 takođe vezuje CD123 cinomolgus majmuna, poželјno njegov vanćelijski domen.
[0193] U pojedinim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, krak koji vezuje CD123 je izveden iz antitela specifičnog za CD123 koje je u kompeticiji vezivaja za CD123 sa klonom antitela I3RB2, I3RB60, I3RB70, I3RB79 ili I3RB118. U pojedinim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, krak koji vezuje CD123 je izveden iz antitela specifičnog za CD123 koje je u kompeticiji vezivanja sa klonom antitela I3RB18, I3RB49 ili I3RB55. Kompeticija vezivanja može biti određena upotrebom kompetitivnog ELISA testa vezivanja, u skladu sa tehnikom koja je opisana ispod, u Primeru 5. Kompetitivno vezivanje može biti određeno detektovanjem inhibicije vezivanja prvog antitela sa drugim antitelom od najmanje 20%, bez obzira na redosledom po kome se antitela vezuju za CD123 (tj. ukoliko, kada se antitelo A vezuje za CD123 pre antitela B, uočava se inhibicija od samo 10% i kada se antitelo B vezuje za CD123 pre antitela A, uočava se inhibicija od 30%, tada se može zaključiti da je kompetitivno vezivanje prisutno pošto je inhibicija veća od 20% uočena u jednom od eksperimenata).
[0194] U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD123 iz multispecifičnog antitela je IgG ili njegov derivat, na primer, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 je izotipa. U pojedinim primerima izvođenja gde je krak koji vezuje CD123 IgG1 izotipa, on sadrži supstituciju(supstitucije) L234A, L235A i K409R u svom Fc regionu. U pojedinim primerima izvođenja gde krak gde je krak koji vezuje CD123 IgG4 izotipa, on sadrži supstituciju(supstitucije) S228P, L234A i L235A u svom Fc regionu.
[0195] U pojedinim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, drugi krak koji vezuje antigen se vezuje za humani CD3. U pojedinim poželјnim primerima izvođenja, krak specifičan za CD3 iz CD123 x CD3 bispecifičnog antitela je izveden iz antitela specifičnog za CD3 koje vezuje i aktivira humane primarne T-ćelije i/ili primarne T-ćelije cinomolgus majmuna. U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 se vezuje za epitop na N-kraju CD3ε. U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 stupa u kontakt sa epitopom koji obuhvata šest N-terminalnih aminokiselina CD3ε. U pojedinim primerima izvođenja, krak vezivanja specifičan za CD3 iz bispecifičnog antitela je izveden iz mišjeg monoklonskog antitela SP34, mišjeg IgG3/lambda izotipa. U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 sadrži CDR sekvence antitela SP34. Takvi kraci koji vezuju CD3 se mogu vezivati za CD3 sa afinitetom od 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje ili 1x10<-9>M ili manje. Krak vezivanja specifičan za CD3 može biti humanizovana verzija kraka mišjeg monoklonskog antitela SP34. Adaptacija humanim uokvirujućim regionom (HFA) može biti upotrebljena za humanizaciju anti-CD3 antitela iz kog je izveden krak specifičan za CD3. U pojedinim primerima izvođenja bispecifičnih antitela, krak koji vezuje CD3 sadrži par teškog i lakog lanca izabran iz Tabele 2. U pojedinim primerima izvođenja, krak za vezivanje CD3 iz CD123 x CD3 bispecifičnog antitela je izveden iz Tabele 3.
[0196] U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 je IgG ili njegov derivat. U pojedinim aspektima, krak koji vezuje CD3 je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U pojedinim primerima izvođenja gde je krak koji vezuje CD3 IgG1 izotipa, on sadrži supstituciju(supstitucije) L234A, L235A i F405L u svom Fc regionu. U pojedinim primerima izvođenja gde je krak koji vezuje CD3 IgG4 izotipa, on sadrži S228P, L234A, L235A, F405L i R409K supstituciju(supstitucije) u svom Fc regionu. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su IgG-AA Fc. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su IgG-AA Fc-L234A, L235A i F405L. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen se vezuju za CD3ε na primarnim humanim T-ćelijama. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen se vezuju za CD3ε na primarnim T-ćelijama cinomolgus majmuna. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen se vezuju za CD3ε na primarnim T-ćelijama čoveka i cinomolgus majmuna. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen aktiviraju primarne humane CD4+ T-ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen aktiviraju primarne CD4+ T-ćelije cinomolgus majmuna.
[0197] U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeno je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje sadrži krak koji vezuje CD123 sa teškim lancem klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, At 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeno je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje sadrži krak koji vezuje CD3 sa teškim lancem i lakim lancem klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, At 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeno je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje sadrži krak koji vezuje CD123 sa teškim lancem klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, At 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeno je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje sadrži krak koji vezuje CD3 sa teškim lancem i lakim lancem klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, At 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeno je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje sadrži krak koji vezuje CD123 sa teškim lancem klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, mAB 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466 i krak koji vezuje CD3 koji sadrži teški lanac klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, AbB 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeno je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje sadrži krak koji vezuje CD123 sa teškim lancem i lakim lancem klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, At 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466 i krak koji vezuje CD3 koji sadrži teški i laki lanac klona antitela I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, At 7959, Ab3978, At 7955, At 9958, At 8747, At 8876, At 4435 ili At 5466.
[0198] Poželјna CD123 x CD3 bispecifična antitela su obezbeđena u Tabelama 13 i 17.
[0199] Opisani su različiti formati bispecifičnih antitela koji su nedavno sumirani u revijskom pregledu, Chames i Bati (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276.
[0200] U pojedinim primerima izvođenja, bispecifično antitelo predmetnog pronalaska je dimerno antitelo, ukršteno antitelo ili bispecifično antitelo dobijeno kontrolisanom izmenom Fab kraka poput one opisane u predmentom pronalasku.
[0201] U pojedinim primerima izvođenja, bispecifična antitela obuhataju molekule slične IgG, sa komplementarnim CH3 domenima za prinudnu heterodimerizaciju; rekombinantni dvojno ciljajuće molekule slične IgG, u kojima svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta iz najmanje dva različita antitela; IgG fuzione molekule, gde su IgG antitela pune dužine spojena sa dodatnim Fab fragmentom ili delovima Fab fragmenta; Fc fuzione molekule, gde su jednolančani Fv molekuli ili stabilizovana dimerna antitela fuzionisana sa konstantnim domenima teških lanaca, Fcregionima ili njihovim delovima; Fab fuzione molekule, gde su različiti Fab-fragmenti fuzionisani zajedno; antitela zasnovana na scFv- i dimernim antitelima i antitelima samo sa teškim lancima (npr. domenska antitela, nano antitela) gde su raličiti jednolančani Fv molekuli ili različita dimerna antitela ili različita antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, nano antitela) fuzionisana jedna sa drugima ili sa drugim proteinom ili molekulom nosačem.
[0202] U pojedinim primerima izvođenja, molekuli slični IgG sa komplementarnim CH3 domenima obuhvataju Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), molekule tipa “dugme u rupicu” (engl. Knobs-in-Hole, Genentech), CrossMAt (Roche) i elektrostatički podudarne molekule (Amgen), LUZ-Y (Genentech), antitelo konstruisanih domena dobijeno izmenom lanaca (SEEDbody od engl. Strand Exchange Engineered Domain body, EMD Serono), biklonska (Merus) i DuoBody (Genmab A/S).
[0203] U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantni dualno ciljajući molekuli slični IgG obuhvataju dvojno ciljajući (DT od engl. Dual Rargeting)-Ig (GSK/Domantis), antitelo dva u jedan (engl. Two-in-one Antibody, Genentech), umrežena monoklonska antitela (Karmanos Cancer Center), mAt2 (F-Star) i CovX-antitelo (CovX/Pfizer).
[0204] U pojedinim primerima izvođenja, IgG fuzioni molekuli obuhvataju dvostruko varijabilni domen (DVD)-Ig (Abbott), Bispecifičan molekul sličan IgG (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) i BsAb (Zyimogenetics), HERCULES (Biogen Idec) i TvAb (Roche).
[0205] U pojedinim primerima izvođenja, Fc fuzioni molekuli obuhvataju ScFv/Fc fuzije (Academic Institution), SCORPION ((Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), antitela dobijena tehnologijom dualnog afiniteta i preusmeravanja specifičnosti (Fc-DART) (MacroGenics) i dualni(scFv).2-Fab ((National Research Center for Antibody Medicine--China).
[0206] U pojedinim primerima izvođenja, Fab fuziona bispecifična antitela obuhvataju F(ab)2 (Medarey/AMGEN), dvostruko delujuća ili Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics), bivalentna bispecifična (Biotecnol) i Fab-Fv antitela (UCB-Celltech). Antitela zasnovana na scFv, dimernim antitelam i domenskim antitelima obuhvataju, ali nisu ograničena na, Bispecifičan angažer T-ćelija (BITE od engl. bispecifičnih T Cell Engager) (Micromet), tandemska dimerna antitela (Tandab) (Affimed), antitela dobijena tehnologijom dualnog afiniteta i preusmeravanja specifičnosti (DART) (MacroGenics), jednolančana dimerna antitela (Academic), antitela slična TCR (AIT, ReceptorLogics), ScFv fuzije sa humanim serumskim albuminom (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), dvosturko ciljajuća nano antitela (Ablynx), dvostruko cilјajuća antitela sa samo teškim domenom.
[0207] Bispecifična antitela pune dužine pronalaska mogu biti generisana, na primer, upotrebom izmene Fab kraka (ili izmenom polovina molekula) između dva monospecifična bivalentna antitela, uvođenjem supstitucija u region kontakta teškog lanca sa CH3 u svakoj polovini molekula da bi se favorizovalo obrazovanje heterodimera dve polovine molekula antitela sa jasno različitim specifičnostima bilo in vitro u okruženju oslobođenom od ćelija ili upotrebom koekspresije. Reakcija izmene Fab kraka je rezultat reakcije izomerizacije disulfidne veze i disocijacije-asocijacije CH3 domena. Disulfidne veze teškog lanca u zglobnim regionima matičnih monospecifičnih antitela se najpre redukuju. Rezultujući slobodni cisteini jednog od matičnih monospecifičnih antitela obrazuju disulfidnu vezu između teških lanaca sa ostacima cisteina drugog matičnog monospecifičnog molekula antitela, uz istovremeno oslobađanje CH3 domena matičnih antitela i ponovno obrazovanje molekula, disocijacijama i asocijacijama. CH3 domeni Fab kraka mogu biti konstruisani tako da se favorizuje heterodimerizacije u odnosu na homoderizaciju. Dobijeni proizvod je bispecifično antitelo sa dva Fab kraka ili sa polovinama molekula od kojih se svaki vezuje za jasno različit epitop, tj. eptiop na CD123 (IL3-Rα) i epitop na CD3.
[0208] "Homodimerizacija", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na interakciju dva teška lanca sa identičnim CH3 aminokiselinskim sekvencama. "Homodimer", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo sa dva teška lanca sa identičnim CH3 aminokiselinskim sekvencama.
[0209] "Heterodimerizacija", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na interakciju dva teška lanca sa CH3 aminokiselinskim sekvencama koje nisu identične. "Heterodimer", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo sa dva teška lanca u kojima CH3 aminokiselinske sekvence nisu identične.
[0210] Strategija „dugme u rupu“ (pogledati npr. PCT Inti. Publ. No. WO 2006/028936) može biti upotrebljena za generisanje bispecifičnih antitela pune dužine. Ukratko, izabrane aminokiseline koje obrazuju površinu kontakta CH3 domena u humanom IgG mogu biti mutirane na pozicijama koje utiču na interakcije CH3 domena da bi se pospešilo obrazovanje heterodimera. Aminokiselina sa malim bočnim lancem (“rupom”) se uvodi u teški lanac antitela koje specifično vezuje prvi antigen, a aminokiselina sa velikim bočnim lancem (“dugme”) se uvodi u teški lanac antitela koje specifično vezuje sekundu antigen. Nakon istovremene ekspresije (koekspresije) dva antitela, nastaje heterodimer kao rezultat preferencijalne interakcije teškog lanca sa „rupicom“ sa teškim lancem sa „dugmetom“. Primeri CH3 supstitucionih parova koji obrazuju dugme i rupicu (predstavljenih u vidu modifikovane pozicije u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca/modifikovana pozicija u drugom CH3 domenu drugog teškog lanca) su: T366Y/F405A, T366W/ F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S i T366W/T366S_L368A_Y407V.
[0211] Mogu biti upotrebljene i druge strategije kao što su pospešivanje heterodimerizacije teških lanaca upotrebom elektrostatičkih interakcija, supstitucijom pozitivno naelektrisanih ostataka na jednoj CH3 površini i negativno naelektrisanih ostataka na drugoj CH3 površini, kao što je opisano u US Pat. Publ. No. US2010/0015133; US Pat. Publ. No. US2009/0182127; US Pat. Publ. No. US2010/028637 ili US Pat. Publ. No. US2011/0123532. U drugim strategijama, heterodimerizacija može biti pospešena sledećim supstitucijama (predstavljenim u vidu modifikovane pozicije u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca/modifikovana pozicija u drugom CH3 domenu drugog teškog lanca): L351Y _F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/ F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, or T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, kao što je opisano u U.S. Pat. Publ. No. US2012/0149876 ili U.S. Pat. Publ. No. US2013/0195849.
[0212] Pored prethodno opisanih postupaka, bispecifična antitela predmetnog pronalaska mogu biti generisana in vitro, u okruženju oslobođenom od ćelija, uvođenjem asimetričnih mutacija u CH3 regione dva monospecifična homodimerna antitela i obrazovanjem bispecifičnih heterodimernih antitela iz dva matična monospecifična homodimerna antitela u redukujućim uslovima da bi se omogućila izomerizacija disulfidne veze prema postupcima opisanim u Inti. Pat. Publ. No. WO2011/131746. U postupcima, prvo monospecifično bivalentno antitelo (npr. anti-CD123 (IL3-Rα) antitelo) i drugo monospecifično bivalentno antitelo (npr. anti-CD3 antitelo) su kontruisani tako da sadrže određene supstitucije u CH3 domenu koje pospešuju stabilnost heterodimera; antitela se inkubiraju zajedno pod redukujućim uslovima koji su dovoljni da se omogući cisteinima u zglobnom regionu da se podvrgnu izomerizaciji disulfidne veze; na taj način se stvara bispecifično antitelo, izmenom Fab kraka. Uslovi inkubacije mogu biti optimalno vraćeni u neredukujuće uslove. Primer redukcionih agenasa koji mobu biti upotrebljeni su 2-merkaptoetilamin (2-MEA), ditiotritol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutation, tris (2-karboksietil)fosfin (TCEP), L-cistein i beta-merkaptoetanol, a poželјno je da je redukujući agens izabran iz grupe koja se sastoji od: 2-merkaptoetilamina, ditiotreitola i tris (2-karboksietil)fosfina. Na primer, može biti upotrebljena inkubacija tokom najmanje 90 min na temperaturi od najmanje 20°C, u prisustvu najmanje 25 mM 2-MEA ili u prisustvu najmanje 0,5 mM ditiotreitola, pri pH od 5-8, na primer, na pH 7,0 ili pH 7,4.
[0213] Pored opisanih CD123 x CD3-multispecifičnih antitela, obezbeđene su takođe polinukleotidne sekvence sposobne da kodiraju opisana CD123 x CD3-multispecifična antitela. Obezbeđeni su i vektori koji sadrže opisane polinukleotide, kao i ćelije koje eksprimiraju CD123 x CD3 multispecifična antitela koja su ovde navedena. Opisane su dalje ćelije sposobne da eksprimiraju prijavljene vektore. Ove ćelije mogu biti sisarske ćelije (poput 293F ćelija, CHO ćelije), ćelije insekata (poput Sf7 ćelija), ćelije kvasaca, ćelije bilјaka ili ćelije bakterija (poput E. coli). Opisana antitela takođe mogu biti proizvedena hibridoma ćelijama.
Terapijske kompozicije i postupci lečenja upotrebom multispecifičnih antitela i njihovih multispecifičnih fragmenata koji vezuju antigen
[0214] CD123 bispecifična antitela koja su prethodno razmatrana, na primer CD123 x CD3 bispecifična antitela koja su prethodno razmatrana, korisna su u terapiji. Preciznije, CD123 bispecifična antitela su korisna u lečenju kancera. Ovde su takođe obezbeđene terapijske kompozicije za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara, koje sadrže terapijski efektivnu količinu ovde opisanog multispecifičnog antitela ili multispecifičnog fragmenta koji vezuje antigen i farmaceutski prihvatlјiv
1
nosač. U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD123 x CD3-multispecifično antitelo kao što je ovde opisano ili njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželјnije je CD123 x CD3-bispecifično antitelo kao što je ovde opisano ili njegov CD123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen U jednom primeru izvođenja, navedena farmaceutska kompozicija je za lečenje kancera koji eksprimira CD123, uklјučujući (ali ne ograničavajući se na njih) sledeće: hematološke kancere koji eksprimiraju CD123, kao što su akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN); i druge vrste kancera za koje je tek potrebno utvrditi u kojima se eksprimira CD123. Posebna bispecifična antitela koja mogu biti upotrebljena za lečenje kancera, kao što je hematološki kancer, obuhvataju specifične kancere koji su prethodno razmatrani, podrazumevaju antitela 7959, 3978, 7955, 9958, 8747, 4435 i 5466. Jedan primer korisnog bispecifičnog antitela za lečenje kancera, kao što je hematološki kancer, uključujući ove specifične vrste kancera, je antitelo 9958. Drugi primer korisnog bispecifičnog antitela za lečenje kancera, kao što je hematološki kancer, uklјučujući ove specifične vrste kancera, je antitelo 3978. Drugi primer korisnog bispecifičnog antitela za lečenje kancera, kao što je kao hematološki kancer, uklјučujući ove specifične vrste kancera, je antitelo 8747. Drugi primer korisnog bispecifičnog antitela za lečenje kancera, kao što je hematološki kancer, uklјučujući i ove specifične vrste kancera, je antitelo 7959.
[0215] Farmaceutske kompozicije koje su ovde obezbeđene, sadrže: a) efektivnu količinu multispecifičnog antitela ili fragmenta antitela predmetnog pronalaska i b) farmaceutski prihvatlјiv nosač, koji može biti inertan ili fiziološki aktivan. U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD123 x CD3-multispecifično antitelo kao što je ovde opisano, ili njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželjnije je CD 123 x CD3-bispecifično antitelo kao što je ovde opisano, ili njegov CD123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen. Kako se ovde upotrebljava, termin "farmaceutski prihvatlјivi nosači" obuhvataju bilo koji i sve od rastvarača, dispergujućih medijuma, obloga, antibakterijskih i antifungalnih agenasa i sličnog, koji su fiziološki kompatibilni. Primeri pogodnih nosača, razblaživača i/ili eksipijenasa obuhvataju jedno ili više od vode, fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora puferisanog fosfatima, dekstroze, glicerola, etanola i sličnog, kao i bilo koju njihovu kombinaciju. U mnogim slučajevima, poželјno je da se u kompoziciju uklјuče izotonični agensi poptu šećera, polialkohola ili natrijum hlorida. Preciznije, relevantni primeri pogodnog nosača obuhvataju: (1) Dulbecco-ov fiziološki rastvor puferisan fosfatima, pH oko 7,4, koji sadrži ili ne sadrži od oko 1 mg/ml do 25 mg/mL humanog serumskog albumina, (2) 0,9% fiziološki rastvor (0,9% w/v natrijum hlorida (NaCl)) i (3) 5% (w/v) dekstroze; a može takođe sadržavati antioksidans kao što je triptamin i agens za stabilizaciju kao što je Tween20®.
[0216] Kompozicije ovde mogu takođe sadržavati dodatni terapijski agens, ukoliko je to potrebno za određeni poremećaj koji se leči. Poželјno je da multispecifično antitelo ili fragment antitela i dopunsko aktivno jedinjenje imaju komplementarne aktivnosti koje ne utiču štetno jedna na drugu. U poželјnom primeru izvođenja, dodatni terapijski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid ili interleukin 2. U poželјnom primeru izvođenja, dodatni terapijski agens je hemoterapijski agens.
[0217] Kompozicije pronalaska mogu biti u raznovrsnim oblicima. Oni obuhvataju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, ali poželjan oblik zavisi od planiranog načina primene i terapijske namene. Uobičajene poželjene kompozicije su olika rastvora za injekcije ili infuzije. Poželјan način primene je parenteralni (npr. intravenski, intramuskularni, intraperinonealni, supkutani). U poželјnom
2
primeru izvođenja, kompozicije pronalaska se primenjuje intravenski u vidu bolus-injekcije ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda. U još jednom poželјnom primeru izvođenja, kompozicije se injeciraju intramuskularno, supkutano, intraartikularno, intrasinovijalno, intratumorski, unutar ili u okolinuu lezije, da bi se ispoljili lokalni, kao i sistemski terapijski efekti.
[0218] Sterilne kompozicije za parenteralnu primenu mogu biti pripremljene uklјučivanjem antitela, fragmenta antitela ili konjugata antitela predmetnog pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Kao rastvarač ili nosač, mogu biti upotrebljeni voda, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatima, dekstroza, glicerol, etanol i slično, kao i njihova kombinacija. U mnogim slučajevima, poželјno je da se u kompoziciju budu uključeni izotonični agensi poput šećera, polialkohola ili natrijum hlorida. Ove kompozicije mogu takođe sadržavati adjuvanse, naročito agense za vlaženje, izotoničnost, emulgovanje, dispergovanje i stilizaciju. Sterilne kompozcije za parenteralnu primenu mogu biti pripremljene i u obliku čvrstih sterilnih kompozicija koje mogu biti rastvorene u vreme upotrebe, u sterilnoj vodi ili u bilo kom drugom sterilnom medijumu koji se može injecirati.
[0219] Multispecifično antitelo ili fragment antitela može takođe biti primenjen oralno. Kao čvrste kompozicije za oralnu primenu mogu biti upotrebljeni tablete, pilule, praškovi (želatinske kapsule, kesice) ili granule. U ovim kompozicijama, aktivni sastojak prema pronalasku se meša sa jednim ili sa više inertnih rastvarača, kao što su skrob, celuloza, saharoza, laktoza ili silika, pod strujom argona. Ovakve kompozicije takođe mogu sadržavati supstance drugačije od razblaživača, na primer, jedno ili više od lubrikanata poput magnezijum stearata ili talka, agenasa za boju, oblakje (kod tableta obloženih šećerom) ili glazura.
[0220] U slučaju tečnih kompozicija za oralnu primenu, mogu biti upotrebljeni farmaceutski prihvatlјivi rastvori, suspenzije, emulzije, sirupi i eliksiri koji sadrže inertne razblaživače kao što su voda, etanol, glicerol, bilјna ulјa ili parafinsko ulјe. Ovakve kompozicije mogu sadržavati supstance drugačije od razblaživača, na primer, agense za vlaženje, zaslađivače, arome, agense za zgušnjavanje ili stabilizovanje proizvoda.
[0221] Doze zavise od želјenog efekta, trajanja tretmana i načina primene koji se upotrebljava; obično su između 5 mg i 1000 mg dnevno prilikom oralne primene kod odrasle osobe, sa dozama opsega od 1 mg do 250 mg aktivne supstance. U principu, lekar će odrediti odgovarajuću dozu u zavisnosti od starosti, težine i bilo kojih drugih faktora specifičnih za subjekat koji će se lečiti.
[0222] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za ubijanje CD123+ ćelije, primenom, multispecifičnog antitela koje vezuje navedeni CD123 pacijentu kome je to potrebno, a koje je sposobno da regrutuje T-ćelije u cilju ubijanja navedenih CD123+ ćelije (tj. da preusmeri T-ćelije). Bilo koje od multispecifičnih antitela ili fragmenata antitela pronalaska može biti terapijski upotrebljeno. U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD123 x CD3-multispecifično antitelo kao što je ovde opisano, ili njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželјnije je CD123 x CD3-bispecifično antitelo koje je ovde opisano ili njegov CD123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen
[0223] U poželјnom primeru izvođenja, multispecifična antitela ili fragmenti antitela pronalaska se upotrebljavaju za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara. U jednom poželјnijem primeru izvođenja, jedna od prethodno opisanih farmaceutskih kompozicija, a koja sadrži multispecifično antitelo ili fragment antitela pronalaska, upotrebljava se za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara. U jednom primeru izvođenja, poremećaj je kancer. Preciznije, kancer je kancer koji eksprimira CD123, uklјučujući (ali ne ograničavajući se na) sledeće: hematološke kancere koji eksprimiraju CD123, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN); i druge vrste kancera za koje je tek potrebno utvrditi da eksprimiraju CD123. U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD123 x CD3-multispecifično antitelo koje je ovde opisano ili njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželјnije je CD123 x CD3-bispecifično antitelo kao što je ovde opisano ili njegov CD123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen.
[0224] Shodno navedenom, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska su korisne u lečenju ili prevenciji raznih vrsta kancera, uklјučujući (ali ne ograničavajući se na) sledeće: kancer koji eksprimira CD123, uklјučujući (ali nije ograničavajuće se na) sledeće: hematološke kancere koji eksprimiraju CD123, kao što su akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzni krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN); i druge vrste kancera za koje je tek potrebno utvrditi da eksprimiraju CD123.
[0225] Slično navedenom, dodatno je ovde obezbeđen postupak inhibicije rasta izabrane polulacije ćelija, postupak koji obuhvata kontakta ciljnih ćelija koje eksprimiraju CD123, ili tkiva koje sadrže takve cilјne ćelije, sa efektivnom količinom multispecifičnog antitela ili fragmenta antitela pronalaska, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim citotoksičnim ili terapijskim agensima, u prisustvu mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD123 x CD3-multispecifično antitelo kao što je ovde opisano, ili njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželјnije je CD123 x CD3-bispecifično antitelo kao što je ovde opisano ili njegov CD123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen. U poželјnom primeru izvođenja, dodatni terapijski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid ili interleukin 2. U poželјnom primeru izvođenja, dodatni terapijski agens je hemoterapijski agens. Postupak inhibicije rasta izabranih ćelijskih populacija se može primeniti u praksi in vitro, in vivo ili ex vivo.
[0226] Primeri in vitro upotrebe obuhvataju tretman autologne kosne srži pre njene transplantacije istom pacijentu da bi se uništile obolele ili maligne ćelije; tretman kosne srži pre njene transplantacije da bi se uništile kompetentne T-ćelije i sprečila bolest “kalem-protiv-domaćina” (GVHD); tretman ćelijskih kultura da bi se uništile sve ćelije, osim želјenih varijanti koje ne eksprimiraju cilјni antigen; ili da bi se uništile varijate koje eksprimiraju neželјeni antigen. Uslovi nekliničkih in vitro upotreba se lako mogu odrediti od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike.
[0227] Primeri kliničkih ex vivo upotreba je za uklanjanje tumorskih ćelija iz kosne srži pre autologne transplantacije tokom lečenja kancera. Lečenje može biti sprovedeno na sledeći način. Kosna srže se izdvaja iz pacijenta ili drugih osova i potom inkuvira u medijumu koji sadrži serum u koji je bio dodat citotoksičan agens pronalaska. Koncentracije su bile opsega od oko 10 um do 1 um, a inkubarano je tokom oko 30 min do oko 48 sati, na oko 37°C. Tačni uslovi, koncentracije i vreme inkubacije, tj. doza, lako može odrediti stručnjak iz obasti tehnike. Nakon inkubacije, ćelije kosne srži se ispiraju medijumom koji sadrži serum, pa se i.v. infuzijom vraćaju u pacijenta, u skladu sa poznatim
4
postupcima. U okolnostima kada pacijent prima drugi tretman, kao što je ciklus ablativne hemoterapije ili zračejne celog tela između vremena izolacije kosne srži i ponovnog vraćanja tretiranih ćelija infuzijom, tretirane ćelije kosne srži se čuvaju zamrznute u tečnom azotu upotrebom standardne medicinske opreme.
[0228] Za kliničku in vivo upotrebu, terapijski efektivna količina multispecifičnog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen se primenjuje subjektu kome je to potrebno. Na primer, CD123 x CD3-multispecifična antitela i njihovi multispecifični fragmenti koji vezuju antigen mogu biti korisni u lečenju kancera koji eksprimira CD123 kod subjekta je to potrebno. U pojedinim primerima izvođenja, kancer koji eksprimira CD123 je hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS, niskog ili visokog rizika), akutna limfocitna leukemija (ALL, uklјučujući sve podtipove), difuzan krupnoćelijski B-limfom (DLBCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) ili neoplazija blastnih plazmacitoidnih dendritičnih ćelija (DPDCN). U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD123 x CD3-multispecifično antitelo kao što je ovde opisano ili je njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželјnije je CD123 x CD3-bispecifično antitelo koje je ovde opisano ili njegov CD123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je sisar, poželјno čovek. U pojedinim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen će biti primenjeni u vidu rastvora čija je sterilnost bila analizirana.
[0229] Režimi doziranja u prethodno navedenim postupcima lečenja i upotrebe se prilagođavaju tako se obezbedi optimalan želјeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može biti primenjena bolusna injekcija, može biti primenjeno nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može biti proprocionalno smanjena ili povećana shodno potrebama terapijske situacije. Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u jediničnim doznim oblicima za laku primenu i ujednačenost doze.
[0230] Efikasne doze i režimi doziranja za multispecifična antitela i fragmente zavise od oboljenja ili stanja koje će biti lečeno i može biti određeno od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Na primer, neograničavajući opseg za terapijski efektivnu količinu jedinjenja predmetnog pronalaska je oko 0,001-10 mg/kg, kao što je oko 0,001-5 mg/kg, na primer oko 0,001-2 mg/kg, kao što je oko 0,001-1 mg/kg, na primer oko 0,001, oko 0,01, oko 0,1, oko 1 ili oko 10 mg/kg.
[0231] Lekar ili veterinar sa uobičajenim iskustvom iz oblasti tehnike može lako odrediti i propisati efektivnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar ili veterinar može započeti sa dozom multispecifičnog antitela ili fragmenta upotreblјenog u farmaceutskoj kompoziciji u nivoima nižim od potrebnih za postizanje želјenog terapijskog efekta i postepeno povećavati dozu sve dok se ne postigne želјeni efekat. U principu, pogodna dnevna doza bispecifičnog antitela predmetnog pronalaska će biti ona količina jedinjenja koja je najmanja efektivna doza za postizanje terapijskog efekta. Primena može npr. biti parenteralna, poput intravenske, intramuskularne ili supkutane. U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo ili fragment može biti primenjeno infuzijom u nedelјnoj dozi izračunatoj u mg/m2. Takve doze mogu, na primer, biti zasnovane na dozama u mg/kg koje su prethodno navedene, u skladu sa sledećim: doza (mg/kg)x70: 1,8. Takva primena može biti ponovljena, npr.1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena se može izvesti kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati. U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo ili fragment može biti primenjen sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, da bi se smanjili toksični neželjeni efekti.
[0232] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo ili fragment može biti primenjeni u nedelјnoj dozi, izračunatoj u vidu fiksne doze, do osam puta, kao što je od četiri do šest puta, kada se primenjuje jednom nedelјno. Takav režim se može ponoviti jedan ili više puta po potrebi, na primer, nakon šest meseci ili dvanaest meseci. Ovakve fiksne doze mogu, na primer, biti zasnovane na dozi u mg/kg koja je obezbeđena iznad, uz procenu telesne težine od 70 kg. Doza može biti određena ili prilagođena merenjem količine bispecifičnog antitela pronalaska u krvi nakon primene, na primer, vađenjem biološkog uzorka i upotrebom anti-idiotipskih antitela koja cilјano deluju na region koji vezuje antigen iz CD123 u multispecifičnim antitelima predmetnog pronalaska.
[0233] U jednom primeru izvođenja, multispecifično antitelo ili fragment može biti primenjeni u vidu terapije održavanja, kao što je, npr. jednom nedeljno tokom perioda od šest meseci ili više.
[0234] Multispecifično antitelo ili fragment takođe mogu biti primenjeni profilaktički da bi se smanjio rizik od razvoja kancera, odložio početak pojave događaja u progresiji kancera i/ili smanjio rizik od ponovne pojave kada je kancer u remisiji.
[0235] Multispecifična antitela i njihovi fragmenti koji su ovde opisani, tkođe mogu biti primenjeni u kombinovanoj terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima relevantnim za oboljenje ili stanje koje se leči. Shotno tome, u jednom primeru izvodđenja, medikament koji sadrži antitelo je za kombinaciju sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa, kao što su hemoterapijski agensi. U pojedinim primerima izvođenja, drugi terapijski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid ili interleukin 2. Takva kombinovana primena može biti istovremena, odvojena ili sekvencalna, po bilo kakvom rasporedu. Za istovremenu primenu, agensi moguu biti primenjeni kao jedna kompozicija ili kao posebne kompozicije, prema potrebi.
[0236] U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD123 kod subjekta, pri čemu postupak podrazumeva primenu terapijski efektivne količine multispecifičnog antitela ili fragmenta, kao što je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje je ovde opisano, i radioterapije subjekta kome je to potrebno. U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za lečenje ili prevenciju kancera, postupak koji obuhvata primenu terapijski efektivne količine multispecifičnog antitela ili fragmenta, kao što je CD123 x CD3 bispecifično antitelo koje je ovde opisano, i radioterapiju subjektu kome je to potrebno. Obezbeđena je i radioterapija koja može obuhvatati zračenje ili povezano primenu radiofarmaceutika pacijentu. Izvor zračenja može biti bilo spolјni ili unutrašnji u odnosu na pacijenta koji se leči (radiaciono lečenje može, na primer, biti u obliku terapije spolјnim zracima zračenja (EBRT) ili brahiterapije (BT)). Radioaktivni elementi koji se mogu biti upotrebljeni u praksi takvih postupak uklјučuju, na primer, radijum, cezijum-137, iridijum-192, americijum-241, zlato-198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jod-123, jod-131 i indijum-Ill.
Kompleti pronalaska
[0237] Ovde su takođe obezbeđeni kompleti, npr. oni koji sadrže opisano multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i uputstva za upotrebu antitela ili fragemtn za uništavanje određenih tipova ćelija. U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD 123 x CD3-multispecifično antitelo kao što je ovde opisano, ili njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželјnije je to CD123 x CD3-bispecifično antitelo koje je ovde opisano ili njegov CD 123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen. Uputstva mogu sadržavati uputstva za upotrebu multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen in vitro, in vivo ili ex vivo.
[0238] Komplet će obično sadržavati odeljke u kojima su smešteni multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu biti u liofilizovanom obliku, tečnom obliku ili drugom obliku koji se može uklјučiti u komplet. Komplet takođe može sadržavati dodatne elemente potrebne za izvođenje postupka koji je opisan u uputstvima kompleta, kao što su sterilisan rastvor za rekonstituciju liofilizovanog praha, dodatni agens za kombinovanje sa multispecifičnim antitelom ili njegovim fragment koji vezuje antigen, pre primene pacijenti, kao i pomoćni pribor za primenu multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen pacijentu.
Dijagnostičke upotrebe
[0239] Multispecifična antitela i fragmenti koji su vode opisani, takođe mobu biti upotrebljeni u dijagnostičke svrhe. Obezbeđene su stoga i dijagnostičke kompozicije koje sadrže multispecifično antitelo ili fragmente koji su ove definisani, kao i njihova upotreba. U poželјnim primerima izvođenja, multispecifično antitelo je CD123 x CD3-multispecifično antitelo kao što je ovde opisano ili njegov multispecifičan fragment koji vezuje antigen, a poželјnije je da je to CD123 x CD3-bispecifično antitelo koje je ovde opisano ili njegov CD123 x CD3-bispecifičan fragment koji vezuje antigen. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za dijagnozu kancera koji sadrži spremnik koji sadrži bispecifično CD123 x CD3 antitelo i jedan ili više reagensa za detekciju vezivanja antitela na CD123. Reagensi mogu uključivati, na primer, fluorescentne oznake, enzimske oznake ili druge oznake koje se mogu detektovati. Reagensi mogu takođe obuhvatati sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimske reakcije, pri čemu enzimske reakcije proizvode proizvod koji se može vizuelizovati. Na primer, ovde opisana multispecifična antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu biti obeleženi radioaktivnim obeleživačem, fluorescentnim obeleživačem, epitopskim tagom, biotinom, hromoforskim obeleživačem, ECL obeleživačem, enzimom, rutenijumom, sa<111>In-DOTA,<111>In-dietilentriaminpentasirćetnom kiselinom (DTPA), peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom i beta-galaktozidazom ili poli-histidinom ili sličnim obeleživačima poznatim u oblasti tehnike.
[0240] Primeri koji slede su obezbeđeni kao dopune prethodnog opisa pronalaska i da bi se obezbedilo bolje razumevanje predmeta pronalaksa koji je ovde opisan. Ove primere ne treba smatrati ograničavajućim za opisan predmet pronalaska. Podrazumeva se da su primeri, kao i primeri izvođenja koji su ovde opisani navedeni samo u ilustrativne svrhe i da će razne modifikacije ili promene u tom kontekstu biti jasne iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike.
Primer 1: Materijali
Generisanje CD123 ćelijskih linija
[0241] Set pDisplay™ vektora sa prezentovanim humanim CD123 SP1 ECD (aminokiseline 20 - 305) (SEQ ID NO: 1), humanim CD123 SP2 ECD (aminokiseline 19 - 227 iz SEQ ID NO: 2) i CD123 ECD cinomolgus majmuna (amino kiselina 19 - 305 iz SEQ ID NO: 3), generisan je za upotrebu u vidu alata za skrinig i procenu anti-CD123 vodećih sekvenci. Upotrebljen je sisarski ekspresioni vektor pDisplay™ (Invitrogen) koji omogućava prikaz proteina na ćelijskoj površini (Slika 1). Proteini eksprimirani sa pDisplay™ su fuzionisani sa N-krajem vodeće sekvence mišjeg Ig κ-lanca, što je usmerilo protein prema sekretornom putu, dok je na C-kraj fuzionisan transmembranski domen receptora za faktor rasta poreklom iz trombocita (PDGFR), koji usidrava protein na plazma membranu tako da bude prikazan na njenoj vanćelijskoj strani. Rekombinantni proteini eksprimirani sa pDisplay™ sadrže hemaglutinin A i myc epitope za detekciju imunoblot postupkom ili imunofluorescencijom. CMV promotor pokreće ekspresiju.
[0242] Vektori su prolazno transfektovani u HEK293T ćelije, upotrebom standardnih postupaka. Transfektovane 293F adherentne ćelije sa stabilno integrisanim plazmidom su selektovane, pa su sortirane pojedinačne ćelije i kvantifikovana je ekpresija površinskog receptora CD123, FACS postupkom, upotrebom BangsLabs Quantum FITC-5 kompleta (kat.br. 855, Bangs Laboratories, Inc). Za skrining je odabran skup od 10 jednoćelijskih klonova za svaku ćelijsku liniju, pa je kvantifikovana ekspresija CD123 ECD. Ćelijske linije upotrebljene za sledeći korak nasumičnog skrininga je karakterisala ekspresija CD123 ECD na površini od približno 500000 kopija po ćeliji.
Generisanje solubilnog CD123 ECD proteina
[0243] Rekombinantan humani CD123 SP1 ECD-His tag protein (ser.br. LV081110A), koji odgovara aminokiselinama od 20 do 305 u CD123 SP1 (SEQ ID NO: 1), nabavljen je od kompanije R&D Systems (kat.br.301-R3/CF) u cilju upotrebe u selekciji faga i nasumičnom skriningu. Pre upotrebe je ispitan i sadržaj endotoksina u proteinu, pa je protein biotinizovan za studije selekcije faga. Ovaj materijal je takođe upotrebljavan za merenja vezivanja i afiniteta.
[0244] Rekombinantan humani CD123 SP2 ECD protein koji odgovara aminokiselinama 18-225 u humanom CD123 SP2 (SEQ ID NO: 2), prečišćen je za upotrebu u merenjima vezivanja i afiniteta. Upotrebom tehnika genske sinteze, pripremljan je i cDNK (U.S. Pat. No. 6,670,127; U.S. Pat. No.
6,521,427). Plazmidi za ekspresiju sintetisanog solubilnog CD123 ECD SP2 su pripremlјeni upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije. Fragment gena CD123 ECD SP2 sa gp67 signalnom sekvencom na N-kraju i sa 6-His tagom na C-kraju, kloniran je između Eco RI i Not I mesta u pFastbac1 (Invitrogen), pa je eksprimiran sistemom Bac-to-Bac (Invitrogen) u High Five ćelijama (Invitrogen). Izlučeni protein (SEQ ID NO: 226) je prečišćen kroz HisTrap (GE) i Superdex 75 (GE) kolone. Dobijeni materijal je upotrebljen za merenja vezivanja i afiniteta, kao i za mapiranje epitopa.
[0245] Solubilni CD123 ECD proteini su biotinizirnai upotrebom SureLink kompleta za biotinizaciju (KPL, kat.br.86-00-01) prema uputstvima proizvođača. Proteini su razdvojeni SDS/PAGE postupkom da bi se potvrdilo monomerno stanje.
Anti-CD3 antitelo za rendgensku kristalografiju
[0246] SP34 mAt, mišji IgG3/lambda izotip, nabavljen je od kompanije BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA), kat.br.556611 i sadržavao je lake i teške lance prikazane u SEQ ID NO: 4 i 5, tim redom.
Primer 2: Identifikacija anti-humanih CD123 monoklonskih antitela (mAt)
[0247] Selekcija u rastvoru za de novo humane Fab-pIX biblioteke [Shi L. i saradnici, J Mol Biol, 2010, 397(2): str.385-396. WO 2009/085462], koja su se sastojale od biblioteka VH1-69, 3-23 i 5-51 teških lanaca uparenih sa bibliotekama Vkl-39, 3-11, 3-20 i 4-1 lakih lanaca, urađena je upotrebom postupka “hvatanja” sa magnetnim zrnima za vezivanje biotiniziranog antigen-streptavidina, kao što je prethodno opisano (Rothe i saradnici, J. Mol. Biol. 376:1182-1200, 2008; Steidl i saradnici, Mol. Immunol.46: 135-144, 2008) u četiri uzastopna ciklusa.
[0248] Gen pIX je isecanjem uklonjen iz fagemidne DNK nakon četvrtog ciklusa selekcije, da bi se generisali regioni koji kodiraju Fab obeleženi histidinom. Fab su zatim eksprimirani u E. coli, pa je urađen skrining vezivanja za rekombinantan humani CD123 SP1 ECD protein obeleženi histidinom, ELISA testom. Ukratko, Maxisorp mikrotitar ploče sa 96 mesta kompanije Nunc (Nunc, kat.br.437111) su obložene ovčjim anti-humanim Fd (The Binding Site, kat.br. PC075), koncentracije 1 µg/mL u PBS-u, preko noći na 4°C. Kolonije bakterija koje su sadržavale Fab ekspresioni vektor su gajene u 450 µL 2xYT medijuma (sa karbenecilinom), u pločama za kulturu sa dubokim bunarićima do zamućenosti (OD600 ≈ 0,6). Ekspresija Fab je indukovana dodavanjem IPTG-a do koncentracije od 1 mM. Kulture su inkubirane preko noći na 30°C i potom su izbistrene centrifugiranjem. Maxisorp ploče obložene anti-Fd antitelima su zatim isprane jednom TBS-om sa 0,5% Tween-20 (Sigma, kat.br.79039-10PAK), pa su blokirane sa po 200 µL PBS-Tween (0,5%) nemasnog mleka u prahu (3%) po bunariću, tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon ovog i svih narednih koraka, ploča je ispirana tri puta TBS-om sa 0,5% Tween-20 (Sigma, kat.br. 79039-10PAK). U svaki bunarić je dalje dodato po 50 µL Fab supernatanta i ploča je inkubirna 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon pranja, dodato je i po 50 µL biotiniziranog CD123 i ploča je ponovo inkubirana na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Nakon još jednog pranja, dodato je 50 µL Streptavidina obeleženog sa HRP (Pierce, kat.br. 21130) u razblaženju od 1:5000, pa je ploča inkubirana još jednom na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Ploče su ponovo isprane i dodato je po 50 µL hemiluminiscentnog supstrat, PoD (Roche, kat.br.121-5829500001) prema uputstvima proizvođača. Konačno je očitana luminescencija ploča na čitaču ploča tipa EnVision (Perkin Elmer). Bunarići u kojima je signal iznosio >5 puta u odnosu na signal pozadine. smatrani su pozitivnima.
[0249] Klonovima koji su ispoljili vezivanje za rekombinantan humani ECD iz CD123 SP1 obeležem histidinom, sekvencirani su varijabilni regioni teškog (HC) i lakog lanca (LC). Fagnom selekcijom su identifikovane ukupno 52 jedinstvene Fab sekvence, a 45 je na kraju prevedeno u IgG1 izotip fuzionim kloniranjem uz očuvanje okvira čitanja (Tabela 1). Fuziono kloniranje uz očuvanje okvira čitanja je urađeno umožavanjem HC i LC varijabilnih regiona PCR postupkom, upotrebom PCR SuperMix High Fidelity kompleta (Life Technologies, kat.br.10790-020), i kloniranjem u Esp3I mesta u vDR149 za HC i vDR157 za LC, upotrebom In-Fusion® HD Cloning Plus kompleta (Clontech, kat.br.638909). VH i VL iz pozitivnih bunarića su prikazani ispod, u Tabeli 4.
Tabela 1. CDR sekvence mAt generisanih fagnom selekcijom sa rekombinantnim humanim ECD iz CD123 SP1 proteinom obeleženim histidinskim tagom (odgovarajuće SEQ ID NOs su navedene u zagradama)
� Tabela 4: VHi VLsekvence mAt generisanih fagnim skriningom na CD123
2
4
Primer 3: MSD ćelijsko vezivanje za hCD123 SP1, hCD123 SP2 i CD123 SP1 cinomolgus majmuna
[0250] Vezivanje CD123 antitela za ćelije transformisane sa pDisplay je ispitivano upotrebom MSD (Mesoscale) ćelijskog testa vezivanja. Cilј skrininga je bio da se identifikuju antitela koja se vezuju za ćelije koje eksprimiraju hCD123 SP1 i SP2, kao i unakrsna reaktivnost sa ćelijama koje eksprimiraju CD123 SP1 cinomolgus majmuna.
[0251] Ćelije su imobilisane i fagi su analizirani u triplikatu. Ukratko, supernatanti ćelija koje ekprimiraju vektore ili prečišćena CD 123 antitela su normalizovani na 10 µg/mL. Zatim je u bunariće ploče sa 384 mesta (MA6000, kat. L21XB, MSD) zasejano po 5000 ćelija po bunariću i ćelije su ostavljene da se zalepe tokom 2 sata. Ćelije su potom blokirane sa 20% FBS u PBS-u (Gibco) tokom 15 minuta. Dalje su dodati supernatanti antitela i ploča je ostavljena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ćelije su isprane 3 puta sa PBS-om, pa je dodato sekundarno antitelo obeleženo rutenijumom (Jackson Immuno Research) u koncentraciji od 1 µg/mL i inkubacija na sobnoj temperaturi je nastavljena tokom još 1 sata. Izveden je zatim sledeći korak pranja, pa je u svaki bunarić dodato po 35 µL MSD pufera T za očitavanje (bez surfaktanta), nakon čega je proča inkubirana tokom 30 minuta u cilju detekcije. Ploče su konačno očitane upotrebom Sector Imager 2400 (MSD). Podaci su normalizovani u odnosu na kontrole i grafički su prestavljeni upotrebom GraphPad Prism programa, verzije 5. Pozitivno vezivo je određeno kao pogodak kada je signal bio 3x veći u odnosu na signal pozadine (Slika 2A, B i C). Ispitivanje je ponovlјeno zbog konzistentnosti podataka iza dalji razboj su izabrana antitela sa najboljim karakteristikama vezivanja. U sve tri ćelijske linije, dobijeni su pozitivni rezultati vezivanja za sledeća antitela: I3RB2, 13RB5, 13RB8, 13RB18, 13RB20, 13RB21 i I3RB35.
Primer 4: Merenja afiniteta upotrebom SPR.
Merenja afiniteta na ProteOn sistemu
[0252] Afiniteti 29 kandidata za anti-CD 123 antitelo u odnosu na rekombinantni humani ECD iz CD123 SP1 i ECD iz CD123 SP2 su mereni površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), upotrebom ProteOn XPR36 sistema za interakciju proteina (BioRad).
[0253] Stope asocijacije i disocijacije sa CD123 SP1 ECD ili CD123 SP2 ECD su merene za svaku varijantu. Površina biosenzora je pripremana kovalentnim kuplovanjem kozjeg anti-humanog IgG (Fc) za površinu GLC čipa (BioRad), prema uputstvima proizvođača za hemiju amiskog kuplovanja. Imobilisano je približno 8800 RU (jedinica odgovora) kozjeg anti-humanog IgG (Fc) antitela (Jackson ImmunoResearch laboratorija, kat.br.109-005-098). Za imobilisana antitela, RU je takođe obuhvatao kozje anti-mišje Fc antitelo koje je dodavano da bi uhvatila drgua anttela koja nisu obuhvaćena onim koja su ovde prijavljena. Kako je smeša bila odnosa 1:1, očekivalo sa je oko 50% RU za ova imobilisana antitela bio poreklom od kojeg anti-humanog Fc. Kinetički eksperimenti su rađeni na 25°C u puferu za protok (PBS pH 7,4, 0,005% P20, 3 mM EDTA). Serijska razblaženja humanih CD123 SP1 ECD i CD123 SP2 ECD od 4 puta (1:3), polazeći od 400 nM, pripremana su u puferu za protok. Na svakom kanalu senzorskog čipa je bilo “uhvaćeno” (vezano) u proseku 300 RU za mAt (174-600). Kao referentne površine su korišćene referentne tačke (površina modifikovana sa kozjim anti-humanim IgG (Fc)) koje nisu sadržavale vezana antitela kandidate. Nakon vezivanja mAt je sledilo injeciranje antigena u koncentraciji do 40 µL/min tokom 3 min (faza asocijacije), a zatim i propuštanje pufera u trajanju od 10 min (faza disocijacije). Površina čipa je obnovljena injeciranjem 0,85% fosforne kiseline pri brzini protoka od 100 µL/min. Podaci su obrađeni u kompjuterskom program instrumenta. Dvostruko oduzimanje referentnih podataka je rađeno oduzimanjem krivih koje su dobijene injeciranjem pufera od krvih dobijenih oduzumanjem referentnih podataka za injeciranje analita. Kinteička analiza podataka je urađena upotrebom 1:1 Langmuirovog modela vezivanja sa uklapanjem grupa. Rezultat za svaki mAt je prikazan u formatu Ka(kon ili stopa asocijacije), Kd (koff ili stopa disocijacije), KD(ravnotežna konstanta disocijacije) (Tabela 5).
[0254] Rezultati su ukaali da se svih 29 monoklonskih antitela vezivalo za CD123 SP1 ECD, ali i da je samo šest njih ispoljilo vezivanje za CD 123 SP2 ECD. Da bi se analizirala ponovlјivosti podataka, četiri antitela su analizirana najmanje u duplikatu. U principu, rezultati su ukazali na dobru reproducibilnost između ponavljanja, osim u slučaju I3RB1 za koga je pokazana niska stopa asocijacije.
Tabela 5. Analiza afiniteta pozitivnih klonova fagnog panela 1 sa SPR
<1>NBO = Nije utvrđeno vezivanje
Merenja afiniteta na Biacore sistemu.
[0255] Afinitet nekoliko antitela za CD123 SP1 ECD i CD123 SP2 ECD je takođe izmeren površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), kako u mAt, tako i Fab format, upotrebom Biacore instrumenta. Kinetičke studije su rađene na 25°C upotrebom Biacore 3000 sistema (BIAcore, Inc., sada deo GE Healthcare). Kozje antitelo specifično za humani IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch laboratories, kat.br. 109-005-098) kovalentno je vezano na dve protočne ćelije (obično 1 i 2) sa površinama od karboksimetil dekstrana prevučenim zlatom (CM-5 čip, Biacore). Ovčje antitelo specifično za humani Fd (The binding site, kat.br. PC075) kovalentno je vezano za dve protočne ćelije (obično 3 i 4) sa površinama od karboksimetil dekstrana prevučenim zlatom (CM-5 čip, Biacore). Karboksimetil grupe dekstrana su aktivirane sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimidom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS). Antitela su kuplovana na pH 4,5 u 10 mM natrijum acetata. Sva preostala reaktivna mesta na površini su blokirana reakcijom sa etanolaminom. Za merenja kinetike vezivanja, anti-CD 123 antitela su vezana za antitelo specifično za humani Fcγ, dok su Fab vezivani za antitela specifična na Fd injeciranjem anti-CD 123 molekula pri brzini protoka od 5 ili 6 µL/min. Utvrđeno je da je bilo vezano oko 75 RU antitela i oko 50 RU Fab, tim redom. Nakon “hvatanja” At i Fab je sledilo injeciranje humanog CD123 SP1 ili humanog CD123 SP2 u koncentracijama između 1.6 nM i 400 nM pri 40 µL/min. Podaci o asocijaciji su prikuplјani tokom 2 min, nakon čega je sledilo 10 minuta disocijacije. Površina je obnovljena sa 30 µL 100 mM H3PO4 pri 100 µL/min. Svi uzorci su pripremani u D-PBS-u koji je sadržavao 3 mM EDTA i 0,005% surfaktanta P20. Podaci koji su prijavlјeni predstavljaju razlike u SPR signalu između protočne ćelije koja je sadržavala vezano antitelo ili Fab i referentne ćelije koja nije sadržavala vezano antitelo ili Fab. Dodatni instrumentalni doprinosi signalu su uklonjeni oduzimanjem podataka od injeciranja koje je predstavljalo slepu probu od signala od koga je oduzeta referentna vrednost. Podaci su dobijani u triplikatu i analizirani su uklapanjem faza asocijacije i disocijacije u svim koncentracijama (globalno uklapanje) sa modelom vezivanja 1:1, upotrebom kompjuterskog programa BIAevaluation (BIAcore, Inc.). Urađeni su duplikati eksperimenta i dobijeni podaci su se preklapali u zadovoljavajućem stepenu. Podaci su predstavljeni kao prosečne vrednosti.
[0256] Rezultati su pokazali da su afinitet vezivanja CD123 SP1 ECD i CD123 SP2 ECD za mAt (I3RB2, I3RB18, I3RB35, I3RB37) u saglasnosti sa njihovim odgovarajućim Fabs (I3RB120, I3RB119, I3RB121, I3RB122) (Tabela 6.). Rezultati za sva analizirana anti-CD123 antitela su takođe pokazali da je opseg afiniteta vezivanja Fab za CD123 SP1 ECD i CD123 SP2 ECD iznosio 1,8-46,9 nM, odnosno 0,4-12,5 nM, tim redom; dok je opseg afiniteta vezivanja mAt iznosio 1,2-52 nM i 0,3-11,7 nM, tim redom.
Tabela 6. Afinitet i vrednosti stope asocijacije(on)/disocijacije(off) za anti-CD123 pozitivne klonove fagnog panela 1 dobijeni sa SPR (Biacore).
**Odgovor testa je niži od očekivanog
ND: očigledno vezivanje, ali je signal izvan kriterijuma za prihvatanje (<5 RU i podaci lošeg kvaliteta ili nepravilan senzogram)
Primer 5: Kometicija sa 7G3
Analiza kompetitivnosti za CD123 upotrebom ELISA testa
[0257] Urađen je skrining kompetitvnog vezivanja panela CD123 antitela za 7G3 ELISA testom.7G3 je neutrališuće monoklonsko antitelo, čiji je epitop lokalizovan unutar prvih 50 aminokiselina CD123 SP1 antigena (US6177078B1).7G3 mAt je nabavlјeno od kompanije BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA, kat.br. 554526) i obeleženo je sa MSD Sulfo-Tag™ NHS-estrom prema uputstvima proizvođača (Meso Scale Discovery).
[0258] Za CD123 kompetitivni ELISA test, providne Maxisorb ploče sa 96 mesta su tretirane sa po 100 µL/bunariću 2 µg/mL anti-6x histidinskog antitela (R&D Systems, kat.br. MAB050), pripremljenog u bikarbonatnom puferu, pH 9,4 (Pierce, kat.br. 28382), pa su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane tri puta sa ELISA puferom za ispiranje (PBS, 0,01% Tween-20), a zatim su blokirane sa po 300 µL/bunariću StartingBlock pufera koji je sadržavao Tween-20, PBST, (Thermo Scientific, kat.br.
37539). Svi bunarići su potom tretirani sa 1 ng rekombinantnog huCD123 ECD SP1, nakon čega su ploče inkubirane na sobnoj temperaturi 1 sat. Nevezan huCD123 ECD SP1 je ispran sa ELISA puferom za pranje.7G3 ili mišji IgG2A (mIgG2A) su pripremljeni u medijumu za ekspresiju (FreeStyile™ medijum za ekspresiju, Gibco, kat.br.12338-018) u koncentraciji od 20 µg/mL, pa je po 50 µl/bunariću dodato u duplikatu na ploču, u njihove odgovarajuće bunariće, dok je po 50 µl/bunariću ispitivanih anti-CD 123 mAt dodato u koncentraciji od 2 µg/mL ili kao čisto antitelo u preostale bunariće, pa su ploče inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi uz umereno treskanje. Zatim je u sve bunariće dodato biotinizirano 7G3 antitelo do finalne koncentracije od 100 ng/mL i ploče su dodatno inkubirane 1 sat. Ploče su končno isprane tri puta ELISA puferom za pranje i vezani biotinizovan 7G3 je detektovan upotrebom SA-HRP konjugata u vidu optiček gustine na 450 nm.
[0259] Anti-CD 123 mAt koji su inhibirala 7G3:CD123 vezivanje su definisana kao ona koja su dovela do inhibicije aktivnosti od 20%. Preciznije, antitelo je smatrano inhibitorom ukoliko je bilo u stanju da inhibira vezivanje biotiniziranog 7G3 za humani CD123 ECD za najmanje 20%. Na osnovu ovog kriterijuma selekcije, identifikovana su tri inhibitora: 13RB18, 13RB34 i 13RB44 (Slika 3).
Primer 6: Funkcionalni pSTAT5 test
[0260] Da bi se procenila agonistička ili antagonistička aktivnost antitela, urađen je i skrining panela u testu fosforilacije STAT5 indukovane sa IL-3 zasnovanom na ćelijama, upotrebom TF-1 ćelija (gde su nabavljene). Prisustvo inhibitora anti-CD 123 mAt prouzrokuje pad u fosforilaciji STAT5 nakon stimulacije sa rhIL-3. I u STAT5 funkcionalnom testu je korišćen kriterijum inhibicije od 20% (20% inhibicije aktivnosti rhIL-3).
[0261] Približno 50,000 TF-1 ćelija (humane eritroleukemije) je zasejano u svaki bunarić ploče sa 96 mesta u 60 µL RPMI medijuma koji je sadržavao 10% FBS, pa je ploča inkubirana na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2 preko noći. Svi uzorci su pripremani u medijumu za ekspresiju (FreeStyleTM medijum za ekspresiju, Gibco, kat.br.12338-018). Kontrolnim uzorcima je dodato po 70 µL/bunariću bilo 20 µg/mL 7G3 ili mIgG2A izotipske kontrole. U preostale bunarići je dodato po 70 µL/bunariću uzorka antihumanih CD123 mAt u koncentraciji od 2 µg/mL ili čistih antitela. Svi uzorci su inkubirani 1 sat na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2. Ćelije su zatim tretirane rekombinantnim humanim IL-3, rhIL-3 (PeproTech, kat.br. 200-03) u finalnoj koncentraciji od 10 ng/ml u RPMI medijumu koji je sadržavao 10% FBS, sa izuzetkom ćelija koje nisu ili su bile tretirane samo sa 7G3 ili izotipskom kontrolom. Uzorci su zatim inkubirani dodatnih 15 min na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2. Ćelije su lizirane sa 46,7 µl po bunariću ledenog kompletnog pufera za lizu, nakon čega su uzorci inkubirani na ledu tokom 30 minuta. Lizati su mešani pipetiranjem gore-dole 10 puta. Fosforilisan STAT5 (pSTAT5a, b) je zatim određen upotrebom fosfo(Tyr694)/ukupni STAT5a,b kompleta kompanije Meso Scale Discovery (MSD, kat.br. K15163D-2) i prateći uputstva proizvođača.
1
[0262] Anti-CD 123 mAt koji su inhibirala fosforilaciju STAT5 sa rhIL-3 su definisana kao ona koja su dovela do inhibicije aktivnosti od 20%. Preciznije, antitelo je smatrano inhibitorom ukoliko je bilo u stanju da inhibira fosforilaciju STAT5 sa rhIL-3 za najmanje 20%.
[0263] Pet mAt je ispoljilo sposobnost da blikira stimulaciju STAT5 sa IL-3 (Slika 4A). Ovih pet je uklјučivalo 13RB18, kao i 13RB19, 13RB30, 13RB34 i 13RB44. Ipak, kada su ispitivana u koncentraciji od 1 µg/mL, samo jedno antitelo, 13RB18, je blokiralo stimulaciju STAT5 fosforilacije sa IL-3 u TF-1 ćelijama (Slika 4B). Dodatno, 13RB18 (B18) je karakterisala zavisnost od doze u ovom testu (Slika 4C). Iz ovih podataka je zaklјučeno da je I3RB18 jedino antagonističko antitelo.
Primer 7: Potvrda monovalentnog afiniteta za hCD123
[0264] Vezivanje Fab iz dva anti-CD123 pozitivna klona (I3RB120 (I3RB2 Fab), I3RB119 (I3RB18 Fab) za humani ili CD123 SP1 cinomolgus majmuna eksprimirane na površini ćelija, analiziran je u duplikatu upotrebom MSD-ćelijske afinitetne tehnologije da bi se dobila mera monovalentnog vezivanja za CD123 na površini ćelije.
[0265] Monovalentni afiniteti izabranih anti-CD123 antitela koja su bila vodeći kandidati vezivanja za hCD123 ili cynoCD123 na ćelijskoj površini, urađeni su upotrebom postupka MSD-tehnike ćelijskog afiniteta (MSD-CAT). MSD-CAT je razvijen interno kao postupak za određivanje afiniteta bez obeležavanja, upotrebom intaktnih ćelija i u formatu velikog obima pretraživanja. Ovi eksperimenti su urađeni da bi se ispitali afinitet i specifičnost vezivanja kandidata anti-CD123 antitela za humani ili CD123 SP1 cinomolgus majmuna (cino) na površini ćelija. Analiza je omogućila poređenje afiniteta kandidata za anti-CD123 antitela u odnosu na humani i cino antigen u odsustvu rekombinantnog solubilnog cinoCD123. Ćelijske linije koje su bile upotrebljene su bile ćelije sa humanim pDisplay CD123SP1 i pDisplay CD123SP1 cinomolgus majmuna. Da bi se izmerio afinitet ovih interakcija upotrebom MSD-CAT postupka, serija smeša sa utvrđenim koncentracijama anti-CD123 (1000, 200, 40 i/ili 8 pM) i varirajućim koncentracijama ćelija (1,5 x10<7>-0 762 x10<7>ćelija/mL) su pripremlјene i ostavlјene da dostignu ravnotežu, rotiranjem ploča tokom 24 sata na 4°C. Ovakvi uzorci su pripremani u DMEM Glutamax medijumu koji je sadržavao 0,05% azida, 1% BSA, 3 mM EDTA. Broj receptora (3,15-4,18) X10<6>hCD123/ćelija i (4,78-9,24) 10<6>cyCD123/ćeliji je preveden u M koncentraciju receptora u smeši na osnovu zapremine reakcije, gustine ćelija (ćelije/L) i Avogadrovog broja. Rezultat je bio opseg koncentracija od 104 nM do 5,3 pM za humani CD123 i 12 nM do 0,6 pM za CD123 cinomolgus majmuna. Nakon postizanja ravnoteže, ploča je centrifugirana 5 min na ∼1000 o/min i detektovan je slobodan anti-CD3 u supernatantu. Slobodan anti-CD123 u smeši je detektovan elektrohemiluminescencijom (ECL) upotrebom instumenta za očitavanje kompanije Mesoscale Discovery (MSD). Za detekciju slobodnog anti-CD123 u uravnoteženoj smeši, pripremlјene su ploče za elektrohemiluminescentnu imunoanalizu (ECL). Da bi se pripremile ploče za detekciju (antigeni vezani na SA-MSD pločama), standardne MSD streptavidinske ploče su blokirane sa po 50 µL/bunariću pufera za analizu (PBS, (Life Sciences GIBCO 14190-136), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA) tokom 5 min. Pufer za analizu je zatim uklonjen bez ispiranja, pa je u MSD ploču dodato po 50 µL/bunariću 0,7 µg/mL biotiniziranog antigena u puferu za analizu i ploča je inkubirana preko noći (∼16 h na 4°C). Nakon inkubacije preko noći, ploče su blokirane dodavanjem 150 µL pufera za analizu po bunariću, bez uklanjanja antigena za oblaganje, pa je ploča inkubirana tokom ∼1 sata na sobnoj temperaturi i dalje isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (pufer za analizu bez BSA). Po 50 µL/bunariću supernatanta sa ploče sa uzorcima je prebačeno na ploče obložene antigenom, koje su dalje inkubirane 60 minuta i
2
zatim tri puta isprane sa puferom za ispiranje. Nakon toga, u svaki bunariće je dodato po 50 µL antitela za detekciju koje je bilo obeleženo rutenijumom (anti-humani H L), pa je ploča inkubirana tokom 1 sata. Nakon 1 sata, ploče su isprane i u svaki bunarić je dodato po 150 µL MSD pufera za očitavanje (pripremlјenog razblaživanjem koncentrovanog rastvora u d. H2O, odnos 1:4). Nivo luminescencije ploča je odmah očitan na MSD Sector Imager 6000 čitaču. ECL signal koji je MSD detektovao je izražen u vidu % slobodnog antitela u smeši i podaci su dalje analizirani da bi se odredio afinitet upotrebom jednačine koju je definisao korisnik (izvedene iz zakona o dejstvu mase) koja je bila uvedena u Prism kompjuterski program. Podaci pokazuju da su se I3RB18 i njegov Fab (13RB119) najčvršće vezali za CD123 SP1 na površini ćelija sa pM afinitetom (ili prividnim afinitetom za mAt), ali i da je njihovo vezivanje bilo za >10 puta slabije za cino CD123 SP1. Za I3RB18 i njegov Fab (13RB119) nije bilo moguće dobiti vrednost afiniteta ni za mAt ni za Fab kod ćelija koje su eksprimirale cinoSP1. Sve što se može reći je da je afinitet bio >12 nM. Ipak, dok se I3RB120 vezuje s nM afinitetom za oba antigena, on se vezuje s jednakim ili <5 puta afinitetom za humani i cino CD123 SP1. Afiniteti dobijeni putem SPR za hCD123 SP1 su bili slabiji nego što je utvrđeno analizom na ćelijama. Ova razlika je najverovatnija posledica prezentacije antigena na ćelijskoj površini i lokalizacije epitopa antitela. Rezultati su prikazani u Tabeli 7.
Tabela 7. Vrednosti afiniteta Fab prema ćelijama CD123 dobijene MSD-CAT
[0266] Afinitet izmeren za I3RB2 Fab je u skladu sa mAt podacima dobijenim upotrebom Proteon sistema. Dodatno, utvrđeno je dobro veivanje cynoCD123 za ćelije sa ovim Fab-om, što je jasno ukazalo da je I3RB2 unakrsno reaktivno antitelo. Ispitivanje I3RB18 mAt i njegovog odgovarajućeg Fab (I3RB119) ukazuju da su afiniteti dobijeni za rekombinantni CD123 SP1 upotrebom Proteon sistema slabiji od onih utvrđenih na ćelijama; 1 nM za rekombinantni protein prema 55-300 pM za ćelije. Ova razlika je najverovatnije posedica prezentacije antigena na površini čelije i lokalizacije epitopa antitela. Nije bilo moguće dobiti vrednost afiniteta ni za mAt ni za Fab (afinitet >12 nM). Navedeno ukazuje da antitelo nije unakrsno reaktivno u monovalentnom formatu. Prethodni podaci vezivanja za ćelija su ukazali na unakrsnu reaktivnost, što je najverovatnije olakšano dvovalentnim vezivanjem za površinu ćelija.
Primer 8: Endogeno vezivanje u ćelijama
[0267] Izmerena je i potvrda vezivanja I3RB2 i I3RB18 za endogeni CD123 na AML ćelijama. OCI-AML5 ćelije (DSMZ), koje eksprimiraju približno 75000 kopija CD123 na ćelijskoj površini, upotrebljavane su u MSD testu vezivanja zavisnom od doze. Vezivanje CD123 antitela za AML ćelije je ispitivano upotrebom MSD (Mesoscale) testa ćelijskog vezivanja. Ukratko, ekspresioni supernatanti ili prečišćena CD123 antitela su upotrebljena u rasponu doza od 40 µg/mL do 0,039 µg/mL. Po 50,000 ćelija je zasejano u svaki bunarić ploče sa 96 mesta (Mesoscale ploča visokog kapaciteta vezivanja) i omogućeno je ćelijama da se zalepe tokom 2 sata. Zatim su ćelije blokirane sa 20% FBS u PBS-u da Fc blokatorima (Fc blokator je prečišćeni Fc deo antitela nakon digestije papinom (SEQ ID NO 209) tokom 15 minuta. Potom su dodati supernatanti antitela i ploča je inkubirana na ST tokom 1 sata. Ćelije su zatim isprane 3 puta sa PBS-om, pa je dodato sekundarno antitelo obeleženo rutenijumom (Jackson Immuno Research) u koncentraciji od 1 µg/mL i inkubirano je tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Urađen je sledeći korak ispiranja, pa je u svaki bunarić dodato po 150 µLul MSD pufera T za očitavanje (bez surfaktanta) i ploča je inkubirana tokom 30 minuta u svrhu detekcije. Ploče su konačno očitane upotrebom Sector Imager 2400 čitača (MSD). Podaci su normalizovani u odnosu na kontrole i grafički su predstavljeni upotrebom porgrama GraphPad Prism, verzije 5.
[0268] Rezultati su pokazali da se I3RB2 i I3RB18 vezuju za endogeni CD123 eksprimiran na OCI-AML5 ćelijama na način koji zavisi od doze (Slike 5A i B). Pozitivna kontrola, mAt 7G3, takođe je bila uklјučena u ovaj test zarad poređenja (Slika 5C).
Primer 9: Analiza kompetitivnog vezivanja CD123mAB sa 13RB2 i 13RB18
[0269] Urađena je potom kompetitivna sutidja za 13RB2 i 13RB18 u odnosu na druge unakrsno reaktivne CD123 SP1/SP2 pozitivne klonove, kao i za 7G3 kontrolu da bi se odredile grupe anti-CD 123 antitela koje su kompetitivne ili tzv. „epitopske grupe“.
[0270] Za kompetitivni ELISA test, po 5 µL (20 µg/mL) prečišćenog humanog CD123 ECD proteina generisanog kao što je opisano u Primeru 1, upotrebljeno je za oblakje svakog bunarića MSD HighBind ploče (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD), tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. U svaki bunarić je zatim dodat alikvot od po 150 µL 5% MSD blokirajućeg pufera A (Meso Scale Discovery) i ploča je inkubirana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su dalje isprane tri puta sa 0,1 M HEPES puferom, pH 7,4, nakon čega je sledilo dodavanje smeše obeleženih anti-CD123 mAt sa različitim kompetitivnim anti-CD123 mAt. Obeležena antitela (20 nM) su inkubirana sa 2 µM neobeleženih kompetitivnih anti-CD123 antitela, pa su dodati u označene bunariće u zapremini smeše od 25 µL. Nakon inkubacije od 2 sata uz lako mućkanje na sobnoj temperaturi, ploče su isprane 3 puta sa 0,1 M HEPES puferom (pH 7,4). MSD pufer T za očitavanje je razblažen destilovanom vodom (4 puta), pa je raspodeljen u zapremini od 150 µL/bunariću i analiziran sa SECTOR Imager 6000. Antitela su dalje bila obeležavana sa MSD Sulfo-Tag™ NHS-estrom prema uputstvima proizvođača (Meso Scale Discovery).
[0271] Rezultati kompetitivnog ELISA testa su ukazali da je I3RB2 u kompeticiji sa 13RB60, 13RB70, 13RB79 i 13RB118, ali i da nije u kompeticiji sa drugim antitelama, uklјučujući I3RB18 (Slika 6A). Potreno je ipak napomenuti da se, kada je I3RB2 bio obeležen, kompeticija sa I3RB60 mogla detektovati; međutim, kada je I3RB60 bio obeležen, kompeticija nije bila detektovana. Jedan mogući razlog za navedeno su pojedine nespecifične interakcije vezanja. Kada je ispitivan I3RB18, utvrđeno je da je on u kompeticiji sa 13RB49 i 13RB55, ali ne i sa 13RB2 (Slika 6B).
4
[0272] Analiza kompetitivnog grupisanja je definisala dve kompetitivne grupe za unakrsno reaktivna CD123 SP1/SP2 antitela (Tabela 8). Monoklonsko antitelo I3RB2 nije bilo u kompeticiji sa I3RB18 i pripadali su različitim grupama epitopa. Grupa 1 (tamno sivo) obuhvata mAt 13RB2, 13RB60, I3RB70, I3RB79 i I3R118. Grupu 2 (svetlo siva) čine mAt I3RB18, I3RB49 i I3RB55. Komercijalni mAt 7G3 nije bio u kompetidiji ni sa jednim od internih anti-CD123 antitela.
Tabela 8. Rezultati kompetitivnog vezivanja I3RB2 i I3RB18 obeleženih sa rutenijumom za anti-CD123 antitela
Primer 10: Mapiranje epitopa za I3RB2 i I3RB18
Studije H/D izmene.
[0273] Da bi se identifikovali epitopi za I3RB2 i I3RB18 na humanom CD123, urađena je vodonik/deuterijumska izmena u rastvoru sa masenom spektrometrijom (HDX-MS), upotrebom odgovarajućih Fab. Za H/D izmenu, procedure upotrebljene za analizu izmene na Fab su bile slične onima koje su prethnodo opisane (Hamuro i saradnici, J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003; Horn i saradnici, Biochemistry 45:8488-8498, 2006) sa pojedinim izmenama. Za ove studije je upotrebljen CD123 SP2 ECD antigen, pošto je antigen manje složen od SP1 molekula zbog smanjenog broja mesta glikozilacije. Rekombinantan CD123 SP2 ECD (SEQ ID NO: 226) je inkubiran u deuterizovanom vodenom rastvoru tokom unapred određenog vreme, što je rezultovalo ugradnjom deuterijuma u atome vodonika koji se mogu izmenjivati. Deuterizovan CD123 SP2 ECD je bio u kompleksu bilo sa I3RB119 (Fab od I3RB18) ili sa I3RB120 (Fab od I3RB2) u 43 µL deuterijum oksida (D2O) na 4°C tokom 30 sekundi, 2 min, 10 min i 60 min. Reakcija izmene je zaustavljena niskim pH, pa su proteini podvrgnuti digestiji pepsinom. Nivoi deuterijuma na identifikovanim peptidima su praćeni na osnovu pomeraja u masi tokom LC-MS postupka. Kao referentna kontrola je upotrebljen uzorak CD123 SP2 ECD koji je obrađen na sličan način, osim što nije bio u kompleksu sa Fab molekulima. Za regione vezane za Fab je zaklјučeno da su ona mesta koja su relativno zaštićena od izmene i das toga sadrže više udele deuterijuma u odnosu na referentan CD123 SP2 ECD uzorak. Oko 94% proteina je moglo biti mapirano na specifične peptide.
[0274] Mape izmena dobijene HDX-MS postupkom u rastvoru za CD123 ECD SP2 sa I3RB119 i I3RB120 su prikazane na Slikama 7A i 7B, tim redom. Jedan segment, sa ostacima 176-184 (RARERVYEF (SEQ ID NO: 227)), koji odgovara aminokiselinskim ostacima 195 - 202 u CD123 sp2, bio je izrazito zaštićen sa I3RB119. Dva različita regiona, ostaci 145-156 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)) i ostaci 165-170 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)), koji odgovaraju ostacima 164 - 175 i ostacima 184 - 189 u CD123 sp2, tim redom, bili su prepozati od strane I3RB120. Ovi HDX-MS rezultati ukazuju na peptidni nivo epitopa za I3RB119 i I3RB120. Za ova dva antitela nisu utvrđena preklapanja epitopskih regiona. Navedeni rezultati su u skladu sa prethodnim podacima kompetitivnog vezivanja koji su ukazali da I3RB2 i I3RB18 nisu u kompeticiji jedan sa drugim.
Primer 11: Mapiranje epitopa anti-CD123 antitela I3RB18 analizom kristalne strukture
[0275] Epitop vezivanja antitela I3RB18 je određen rendgenskom kristalografijom.
[0276] Jednolančani Fv fragment anti-CD123 mAt I3RB18 je proizveden u obliku: VL-(Gly4Ser)4-VH-Gly-His6 (SEQ ID NO: 230). Eksprimiran je u HEK293 Expi ćelijama i prečišćen afinitetnom (HisTrap), pa jonoizmenjivačkom (Source 15S i Mono S) hromatografijom.
[0277] Sp2 izoforma humanog CD123 ECD (SEQ ID NO: 231) sa 8xHis oznakom na C-kraju, eksprimirana je u ćelijama insekata inficiranim bakulovirusom, pa je prečišćena afinitetnom (HisTrap) i hromatografijom sa isklјučivanjem po veličini (Superdex 75).
[0278] Kompleks CD123 i scFv iz I3RB18 je pripremlјen mešanjem 1,8 mg CD123 (1,1 mg/mL) sa 2,4 mg scFv (1,6 mg/mL) u molarnom odnosu od približno 1:1,2 (scFv u višku) i inkubiranjem preko noći na 4°C. SEC niskog obima (150 µg) je ukazao na obrazovanje kompleksa. Protein je zatim koncentrovan do 18 mg/mL u 20 mM HEPES-u, pH 7,5, i 100 mM NaCl.
[0279] Kristalizacija je urađena upotrebom postupka difuzije pare, na 20°C, upotrebom formata sedeće kapi, u MRC pločama za kristalizaciju sa 2 ležišta (Swissci). Kristali kompleksa pogodni za eksperiment sa X-zracima su dobijeni pod uslovima: 2,0 M (NH4)2SO4, 0,1 M MES pufer, pH 6,5. Podaci o kristalima su navedeni u Tabeli 9. Jedan kristal je prebačen u matičnu tečnost u koju je bilo dodato 24% glicerola, pa je smrznut u tečnom azotu i upotrebljen za prikuplјanje podataka difrakcije X-zraka. Strutkura je određivana uz rezoluciju od 3,5 Å.
[0280] I3RB18 se vezuje za CD123 sp2 preko C-terminalog (proksimalnog u odnosu na površinu ćelije) domena ECD. Epitop je konformacioni i obuhvata tri segmenta lanca CD 123 sp2, ostatke 156 - 161 (RKFRYE, (SEQ ID NO: 232)), 173 - 178 (TEQVRD, (SEQ ID NO: 233)) i 195 - 202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)) koji odgovaraju ostacima 234 - 239, 251-256 i 273 - 280 u CD123 spl. Interakcije antitela i antigena su prevashodno elektrostatičke. Epitop na CD123 sp2 sadrži veliki broj baznih ostataka, dok su u CDR sekvecama I3RB18 zastupljeni kiseli ostaci. Ostaci antitela koji su uklјučeni u vezivanje CD123 obuhvataju 7 ostataka iz lakog lanca i 9 ostataka iz teškog lanca (Sl.8). Sve CDR sekvence osim LCDR2 su uklјučene u vezivanje.
[0281] Vezivanje I3RB18 za CD123 sp2 (Slika 9A) ga razlikuje od drugog anti-CD 123 antitela, 7G3, koje vezuje N-terminalni domen 1 ECD-a iz CD312 sp1, kao što je prikazano u kristalnoj strukturi Fab iz humanizovanog 7G3, CSL362, u kompleksu sa CD123 sp1 (Slika 9B) (pdb: 4JZJBroughton i saradnici, Cell Rep.2014; 8:410-419).
Primer 11: Kristalna struktura Fab iz anti-CD3 antitela
[0282] Kristalna struktura SP34 Fab određena sa rezolucijom od 2,1 A. Utvrđena je kompletna aminokiselinska sekvenca i identifikovane su moguće mišje germinativne linije iz kojih je izvedeno SP34 mAt.
Materijali
[0283] SP34 mAt, mišjeg IgG3/lambda izotipa, nabavljeno je od kompanije BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA), kat.br. 556611. Prema tehničkom listu, prečišćen je iz supernatanta kulture tkiva, afinitetnom hromatografijom i skladišten na 4°C. Fab fragment je proizveden papainskom digestijom mAt (Pierce, kat.br. 44985, Thermofisher), pa je razdvojen od Fc upotrebom Nab Protein A Plus Spin kolone (Pierce, kat.br.44985, Thermofisher) prema protokolu proizvođača. Fab je dalјe prečišćen na MonoS koloni (GE Healthcare), ekvilibrisanoj sa 20 mM MES, pH 6.5 (pufer A). Elucija je rađena sa puferom A i gradijentom 1 M NaCl od 13-28% u 50 zapremina kolone. Sakupljene su frakcije koje odgovaraju glavnom piku, pa su koncentrovane do 9,2 mg/mL i upotrebljene za kristalizaciju.
Kristalizacija
[0284] Kristalizacija je rađena postupkom difuzije para, na 20°C i sa formatom sedeće kapi, upotrebom Corning 3550 ploče sa 96 mesta. Fab kristal koji je upotrebljavan za rendgensku analizu je dobijen upotrebom 12% PEG 3350, 0,2 M K/Na tartarata (pH 7,4), 3% izopropanola i 3% dioksana. Podaci za kristale su dati u Tabeli 10,
Prikuplјanje podataka dobijenih rendgenskom kristalografijom i određivanje strukture
[0285] Za prikuplјanje podataka rendgenskom kristalografijom, jedan kristal je natoplјen nekoliko sekundi u matičnu tečnost u koju je bilo dodato 20% glicerola, pa je trenutno zamrznut u tečnom azotu. Difrakcioni podaci su prikupljeni upotrebom Advanced Photon Source (Argonne, IL) IMCA snopa upotrebom CCD detektora tipa Pilatus. Statistika dobijenih rendgenskih podata je data u Tabeli 10,
[0286] Struktura je razrešena molekulskom zamenom upotrebom Fab modela konstruisanog na osnovu mišjeg anti-Thomsen-Friedenreich antigenskog antitela Jaa-F11 (PDB 3gnm), koje je IgG3/kapa izotipa. Sva kristalografska izračunavanja su urađena u CCP4 programskom paketu [CCP4.1994, Acta Crystallogr. D50:760-763.]. Podešavanja modela su urađena upotrebom programa COOT [Emsley P i Cowtan K.2004. Acta Crystallogr. D60:2126-2132.]. Statistički podaci utačnjavanja su dati u Tabeli 10.
[0287] Sekvenca SP34 je prikazana na Slici 10, sa ostacima 1 - 215 lakog lanca i ostacima 1-230 teškog lanca izvedenim direktno iz mape elektronskih gustina, i sa ostacima 231 - 455 izvedenim iz IGHG3_MOUSE (mišji IgG3, izoforma 2).
Primer 12: Prilagođavanje anti-CD3 antitela SP34 humanim uokvirujućim sekvencama
[0288] Anti-CD3 mišje antitelo SP34 je humanizovano postupkom Prilagođavanja humanim uokvirujućim sekvencama (Fransson i saradnici, JMB, 2010, 398(2):214-31). Četiri različita teška lanca su kombinovana sa tri različita laka lanca da bi se proizvelo 12 humanizovanih varijanti.
Humanizacija i afinitetno sazrevanje SP34
Selekcija humanih germinativnih linija
[0289] Za testiranje je izabrana matrica koja je podrazumevala sekvence četiri humana teška i tri laka v regiona. Selekcija humanih germinativnih linija (GL) se zasnivala isključivo na sličnostima ukupnih sekvenci sa SP34 u uokvirujućem regionu (FR). Ni CDR sekvence, ni njihova dužina ili kanonske strukture nisu bile uzete u obzir prilikom ove selekcije.
[0290] Najbliža podudaranja za teški lanac su bila sa humanim GL IGHV3-72 i IGHV3-73. Druga GL, IGHV3-23, izabrana je zbog visoke učestalostinjenog pojavlјivanja u repertoaru humanih B ćelija.
[0291] Najbliža podudaranja za laki lanac su bila sa humanim lambda GL IGLV7-43 (aka 7a), IGLV7-46 (aka 7b) i IGLV1-51 (aka lb). IGLV7-46 je praktično bila identična IGLV7-43, ali je njena prednost prisustvo Ala na poziciji 2, odnosno ono što je slučaj i u SP34.
[0292] Izabrani J-regioni su bili sledeći: IGHJ1 za teški lanac; IGLJ3 za lambda laki lanac
Povratne mutacije
[0293] Da bi se očuvala konformacija CDR-H3, ostaci na nekoliko pozicija uokvirujućeg regiona u VL, pre svega na pozicijama Val38, Gly48 i Gly51 (Slika 11), moraju biti zadržani. Ovakve „povratne mutacije“ su dodate u plan humanizacije.
[0294] Asn na poziciji 57 teškog lanca nije sa dobrom gustinom bočnih lanaca u strukturi. Takođe pozicioniran je u sredini CDR-H2 i usmeren je od uobičajenog mesta vezivanja. Na osnovu ove analize, moguće je da neće doprineti značajnom vezivanju. Pored toga, geometrija okosnice je pozicionirana u regionu koji je najpovolјniji za Gly ostatak u Ramachadran-ovom regionu. Stoga je u plan maturacije proteina uvedeno skraćivanje do Gly da bi se omogućila potrebna fleksibilnost i potencijalno pobolјšala stabilnost (smanjenjem lokalnog strukturnog uvijanja koje je povezano sa odsustvom glicina) uz izbegavanje uticaja na vezivanje.
[0295] U dizajn humanizacije je uvedeno još nekoliko drugih parametara. Najpre, humanim GL IGLV7-46 i IGLV7-43 je uveden Trp na poziciji 59 sa neželјenim potencijalom oksidacije. Dve druge GL su sa Gly na ovoj poziciji, što odgovara mišjoj sekvenci. Zbog toga je Gly59 sačuvan i u IGLV7-46 i IGLV7-43 varijantama. Konačno, Ala na poziciji 49 u VH može biti od suštinske važnosti. Takođe, ostatak na poziciji 99 (Val u SP34) može uticati na vezivanje antigena. U cilju ispitivanja ovih pozicija, u pojedine varijante su uvođene povratne mutacije (Slika 12)
HFA matrica
[0296] HFA matrica (Tabela 11) se sastojala od četiri varijante VH i tri varijante VL (Slika 12). U svrhu HFA, upotrebljena je CDR definicija AbM (K.R. Abhinandan i A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839).
[0297] Varijante za VH:
CD3H141 (SEQ ID NO: 184): IGHV3-72*01 sa mišjim CDR sekvencama+ Gly49Ala
CD3H142 (SEQ ID NO: 185): IGHV3-23*01 sa mišjim CDR sekvencama+ Ser49Ala
CD3H143 (SEQ ID NO: 186): IGHV3-23*01 sa mišjim CDR sekvencama+ Ser49Ala, Ala99Val
CD3H144 (SEQ ID NO: 187): IGHV3-73*01 sa mišjim CDR sekvencama Asn57Gly
[0298] Varijante za VL:
CD3L63 (SEQ ID NO: 188): IGLV7-46*01 sa mišjim CDR sekvencama F38V, A48G, Y51G, W59G
CD3L64 (SEQ ID NO: 189): IGLV1-51*01 sa mišjim CDR sekvencama Y38V, L48G, Y51G
CD3L66 (SEQ ID NO: 190): IGLV7-43*01 sa mišjim CDR sekvencama F38V, A48G, Y51G, W59G
Tabela 11. Matrica teških i lakih lanaca CD3
[0299] Aminokiselinske sekvence su povratno translatirane u DNK i pripremljena je cDNK, upotrebom tehnika genske sinteze (U.S. Pat. No.6,670,127; U.S. Pat. No.6,521,427). V regioni teških lanaca (HC) su subklonirani u humani IgG1-AA Fc koji je sadržavao L234A, L235A i F405L mutacije, upotrebom internog ekspresionog vektora sa CMV promotorom, standardnim tehnikama molekularne biologije. Varijabilni regioni lakih lanaca (LC) su subklonirani u humane konstantne regione lambda (λ) lanca, upotrebom internog ekspresionog vektora sa CMV promotorom, standardnim tehnikama molekularne
1
biologije. Dobijenim plazmidima su transfektovane Expi293F ćelije (Invitrogen) i tako su eksprimirana mAt. Pročišćavanje je urađeno standardnim postupcima, upotrebom Protein A kolone (hiTrap MAbSelect SuRe kolona). Nakon elucije, serije antitela su podvrgnute dijalizi u D-PBS, pH 7,2. VH i VL sekvence antitela su prikazane u Tabeli 12.
Tabela 12. VH i VL sekvence anti-CD antitela
2
[0300] Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B143 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 184 i VL iz SEQ ID NO: 188, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A, F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B144 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 184 i VL iz SEQ ID NO: 189, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B146 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 184 i VL iz SEQ ID NO: 190), kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B147 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 185 i VL iz SEQ ID NO: 188), kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B148 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 185 i VL iz SEQ ID NO: 189, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B150 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 185 i VL iz SEQ ID NO: 190, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B151 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 186 i VL iz SEQ ID NO: 188, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B152 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 186 i VL iz SEQ ID NO: 189, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B154 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 186 i VL iz SEQ ID NO: 190, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B155 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 187 i VL iz SEQ ID NO: 188, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B156 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 187 i VL iz SEQ ID NO: 189, kao i IgG1 konstantni region sa L234A,
4
L235A i F405L supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B158 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 187 i VL iz SEQ ID NO: 190, kao i IgG1 konstantni region sa L234A, L235A i F405L supstitucijom.
Primer 13: Endogeno ćelijsko vezivanje humanizovanih anti-CD3 antitela iz pozitivnih klonova za primarne T-ćelije
[0301] Ispitivano je dalje vezivanje dobijenog panela anti-CD3 antitela za CD3ε na ćelijskoj površini primarnih humanih T-ćelija. Da bi se to postiglo, vezivanje antitela iz ekspresionih supernanata je vizuelizovano upotrebom poliklonskog anti-humanog sekundarnog antitela, pa je urađena analiza protočnom citometrijom. Ukratko, vezivanje anti-CD3 antitela za CD3ε na površini ćelija je ispitivano protočnom citometrijom, upotrebom primarnih humanih T limfocita koji su bili prečišćeni negativnom selekcijom (Biological Specialty, Colmar, USA). Ekspresioni supernatanti ili prečišćena antitela su normalizovani na 10µg/ml u medijumu ili FACS puferu (BD BioSciences), tim redom. Po 2x10<5>ćelija je alikvotirano u bunariće sa okrugljim dnom ploče sa 96 mesta (CoStar) radi obeležavanja. Zatim su ćelijama dodata antitela u ekspresionom supernatantu i ploča je inkubirana tokom 45 minuta na 4°C. Nakon centrifugiranja na 1300 o/min tokom 3 min i uklanjanja supernatanta, sa ćelijama je inkubirano po 50 µL anti-humanog IgG (H L) sekundarnog antitela obeleženog sa Alexa Fluor 647 (Life technologies Inc.) u finalnoj koncentraciji od 10µg/ml, tokom 30 minuta na 4°C, uz zaštitu od direktne svetlosti. Nakon ispiranja i resuspendovanja u 30 µL FACs pufera (BD BioSciences). Prikuplјanje uzoraka je rađeno na Intellicyt HTFC sistemu upotrebom kompjuterskog programa ForeCyt. Pre analize vezivanja, vijabilne pojedinačne ćelije su pripremljene za prolazak kroz sistem upotrebom zelenih ili crvenih boja koje se mogu fiksirati za žive/mrtve ćelije (Life Technologies Inc.), pa su propuštene i određeni su površina rastipanja napred i u stranu, kao i paramteri intenziteta, tim redom. Grafici su generisani u GraphPad Prism program, verzija 5, upotrebom srednje vrednosti intenziteta fluorescencije.
[0302] Iako je rađeno sa titracionim serijama, srednje koncentracije su prikazane na Slici 13 radi jasnoće. Dva interna antitela izvedena iz fagne biblioteke sa istim Fc regionom kao terapijska antitela, upotrebljena su kao kontrole: iz G11 (HC SEQ ID NO: 222, LC SEQ ID NO: 223), unakrsno reaktivno, agonističko antitelo koje nije bilo iz cinomolgus majmuna je bilo upotrebljeno kao pozitivna kontrola, dok je CD3B94 (HC-SEQ ID NO: 224, LC - SEQ ID NO: 225) kao nevezujuće i antitelo koji nije antagonističko, upotrebljeno za određivanje nespecifičnog vezivanja. Komercijalno SP34 antitelo nije bilo upotrebljeno u obom testu za poređenja, popto je ono mišje antitelo, a upotreba drugog sekundarnog reagensa za detekciju bi onemogućila direktno poređenje sa ispitivanim varijantama.
[0303] Podaci pokazuju niz potencijala vezivanja unutar panela humanizovanih anti-CD3 antitela iz pozitivnih klonova, sa dva antitela (CD3B144, CD3B152) koje karakteriše potpuni gubitak vezivanja za humane T-ćelije. Preostala antitela je karakterisao raspon potencijala vezivanja koji bi ugrubo mogao biti podeljen na ona koja se jako i slabo vezuju, upotrebom vezivanja G11 kao porizvoljnog praga za vezivanje. Upotrebom navedenih parametara, identifikovano je nekoliko snažno vezujućih i slabo vezujućih antitela iz panela varijanti (Slika 13).
[0304] Zatim je urađena analiza vezivanja anti-CD3 antitela iz pozitivnih klonova za primarne cinomolgusCD4<+>T-ćelije da bi se procenilo zadržavanje unakrsne reaktivnosti. Upotrebljene su pečišćene CD4<+>T-ćelije periferne krvi cinomolgus majmuna (Zen Bio, Triangle Research Park, USA). Protokoli ispitivanja su bili slični onima koji su prethodno opisani. Pošto G11 ne reaguje unakrsno sa cinomolgusCD3ε, CD3B124, kao pozitivna kontrola u ovom testu, upotrebljeno je interno himerno antitelo izvedeno iz SP34, sa SP34 VH i VL koji su sadržavali mišje uokvirujuće sekvence i sa humanim IgG1 Fc (Slika 14). Interesantno je da nekoliko varijanti ispoljilo smanjen potencijal vezivanja u poređenju sa onim koji je uočan sa humanim ćelijama. Navedeno je podrazumevalo snažno vezujuće CD3B150, CD3B151 i CD3B154, u kojima je vezivanje bilo smanjeno, dok se vezivanje nekoliko slabo vezujućih antitela više nije moglo detektovati u odnosu na signal pozadine. Ovaj gubitak vezivanja nije bio povezan sa specifičnim imunoglobulinskim lancem, što je ukazalo da kominacija teških i lakih lanaca ima ulogu u gubitku unakrsne reaktivnosti. Upotrebljeni zajedno, ovi testovi su omogućili identifikaciju varijanti koje su zadržale unakrsnu reaktivnost između vrsta, za humani i CD3ε cinomolgus majmuna.
Primer 14: Funkcionalna analiza humanizovanih anti-CD3 pozitivnih klonova u primarnim T-ćelijama
[0305] Analiza vezivanja je pokazala da je panel humanizovanih anti-CD3 antitela iz pozitivnih klonova karakterisao širok opsef potencijala vezivanja za humane i T-ćelije cinomolgus majmuna. Da bi se ispitao kapacitet svake varijante da indukuje aktivaciju putem umrežavanja CD3ε, primarne T-ćelije su kultivisane preko noći u prisustvu antitela konjugovanog sa magnetnim zrncima. Sledećeg dana, ćelije su sakuplјene i obeležene sa anti-CD69 antitelom da bi se izmerila aktivacija (Slika 15). Humanizovana anti-CD3 antitela su bila vezana za magnetna zrna obložena proteinom A (SpheroTech, Lake Forest, USA), inkubacijom preko noći sa antitelom u koncentraciji od 10 µg/mL. Sledećeg dana, 2x10<5>primarnih humanih T-ćelija je zasejano u ploće za kulturu sa bunarićima okruglog dna, u triplikatima, pa je dodato po 2x10<5>obloženih zrnaca. Nkon inkubacije preko noći na 37°C, ćelije su sakuplјene i obeležene anti-CD69 antitelom sa Alexa Fluor® 488 bojom (klon FN50; Biolegend) da bi se procenila pozitivna regulacija ovog markera aktivacije. Prikuplјanje i analiza uzoraka su urađeni kao što je opisano prethnodno za vezivanje. U istom eksperimentu, upotrebljeno je nekoliko negativnih kontrola, uklјučujući T-ćelije samostalno, T-ćelije sa zrnima koja nisu bila obložena i T-ćelije sa zrnima koja su bila obložena izotipskim kontrolnim antitelom (CD3B94). Sve grupe su karakterisale slične srednje vrednosti intenziteta fluorescencije koje su bile uporedive sa neobojenim T-ćelijama, što je ukazalo da je signal pozadine bio nizak u ovoj analizi. Radi poređenja, u eksperimentu je korišćeno i nekoliko pozitivnih kontrola, uklјučujući OKT3 (US5929212) i komercijalno dostupno SP34-2 antitelo.
[0306] Ispitan je i kapacitet humanizovanih anti-CD3 antitela iz pozitivnih klonova da aktiviraju CD4+ T-ćelije cinomolgus majmuna (Zen Bio, Triangle Research Park, USA) u istom testu (Slika 16). FN50 anti-CD69 antitelo je opisano kao unakrsno reaktivno sa proteinom koji nije humani i koje stoga može biti upotrebljeno za ispitivanje aktivacije ovih ćelija.
[0307] Podaci o aktivaciji humanih i ćelija cinomolgus majmuna su korelisani sa podacima vezivanja i pokazano je da je zajedničko da panel pozitivnih klonova ispoljava opseg potencijala aktivacije. Brojna snažno vezujuća antitela su ispoljila kapacitet aktiviranja humanih T-ćelija sa opsegom koji je bio ekvivalentan ili veći u poređenju sa komercijalno dostupnim SP34-2. Nekoliko varijanti je ispoljilo potencijal aktivacije niži u poređenju sa SP34-2, dok za pojedina od vezujućih antitela nije tvrđen dokaz CD69 stimulacije. Nemogućnost da aktiviraju je utvršena samo kod varijanti koje su ispoljile odsustvoa ili slabo vezivanje, dok su sva snažno vezujuća antitela ispoljila neki nivo aktivacije, što je ukazalo na korelaciju između vezivanja i potencijala aktivacije, kako humanih (Slika 17A), tako i za ćelija cinomolgus majmuna (Slika 17B).
Primer 15: Priprema antitela bispecifičnog formata u IgG1 L234A, L235A
[0308] Nekoliko monospecifičnih CD123 antitela je eksprimirano kao IgG1, sa Fc supstitucijama L234A, L235A i K409R (na anti-CD123) (numeracija prema EU indeksu) u njihovim Fc regionima. Monospecifična antitela su eksprimirana u HEK ćelijskim linijama. Monospecifična CD3 antitela su bila IgG1 sa Fc supstitucijama L234A, L235A i F405L.
[0309] Generisano je monospecifično anti-CD123 antitelo I3RB135-K409R, koje je sadržavalo VH i VL regione anti-CD123 antitela I3RB2, sa VH tipa SEQ ID NO: 120 i VL tipa SEQ ID NO: 165, kao i sa IgG1 konstantim regionom sa L234A, L235A i K409R supstitucijama.
[0310] Generisano je monospecifično anti-CD123 antitelo I3RB125-K409R koje je sadržavalo VH i VL regione anti-CD 123 antitela I3RB18 sa VH tipa SEQ ID NO: 136 i VL tipa SEQ ID NO: 168, kao i sa IgG1 konstantim regionom sa L234A, L235A i K409R supstitucijama.
[0311] Kao kontrola, generisano je monospecifično anti-RSV antitelo, B21M, koje je sadržavalo VH i VL regione sa VH iz SEQ ID NO: 191 i VL iz SEQ ID NO: 192, kao i sa IgG1 konstantim regionom koji je sadržavao L234A, L235A i bilo K409R ili F405L supstitucije, a da bi moglo da se upari kao nulti krak bilo sa CD3 ili CD123 krakom bispecifičnog antitela.
[0312] Monospecifična antitela su prečišćena standardnim postupcima, uptorebom Protein A kolone (HiTrap MabSelect SuRe kolone). Nakon elucije, serije su podvrgnute dijalizi u D-PBS, pH 7,2.
[0313] Monospecifična anti-CD123 antitela su kombinovana upotrebom matrice za in vitro Fab izmenu kraka da bi se generisala bispecifična antitela koja su potom naknado okarakterisana (Tabela 13).
[0314] Bispecifična CD123 x CD3 antitela su generisana kombinovanjem monospecifičnog CD3 mAt i monospecifičnog CD123 mAt u in vitro postupku izmene Fab kraka (kao što je opisano u WO2011/131746). Ukratko, pomešano je oko 1-20 mg/mL anti-CD123/anti-CD3 antitela u molarnom odnosu 1,08:1 u PBS-u, pH 7-7,4 i sa 75 mM 2-merkaptoetanolamina (2-MEA), pa je smeša inkubirana na 25-37°C. tokom 2-6 h, nakon čega je uklonjen 2-MEA dijalizom, dijafiltracijom, tangencijalnog protočnom filtracijom i/ili filtracijom kroz jedinice za centrifugiranje, upotrebom standardnih postupaka. Na sličan način su generisana kontrolna bispecifična antitela sa anti-RSV-(B21M) krakom.
[0315] Generisana monospecifična anti-CD3 i CD123 antitela su pomešana za in vitro postupak izmene Fab kraka po matrici i dalje su okarakterisana raznim analizama. Bispecifično antitelo I3RB179-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B146-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB135-K409R. Bispecifično antitelo I3RB186-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B146-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB125-K409R. Bispecifično antitelo I3RB180-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B147-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB135-K409R. Bispecifično antitelo I3RB187-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B147-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB125-K409R. Bispecifično antitelo I3RB181-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B151-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB135-K409R. Bispecifično antitelo I3RB188-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B155-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB125-K409R. Bispecifično antitelo I3RB182-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B154-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB135-K409R. Bispecifično antitelo I3RB189-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B154-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB125-K409R. Bispecifično antitelo I3RB183-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B155-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB135-K409R. Bispecifično antitelo CD3B191-Ab je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B155-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB125-K409R.
[0316] Za kontrolna bispecifična antitela, anti-RSV antitelo, B21M (HC SEQ ID NO: 207 - prikazano sa mutacijom F405L, LC SEQ ID NO: 208), kombinovano je bilo sa CD3 krakom ili CD123 kracima, na način koji sledi. Bispecifično antitelo I3RB185-Ab je sadržavalo anti-RSV krak za vezivanje iz mAt B21M-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB135-K409R. Bispecifično antitelo I3RB191-Ab je sadržavalo anti-RSV krak za vezivanje iz mAt B21M-F405L i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB125-K409R. Bispecifično antitelo I3RB192-Ab je sadržavalo anti-RSV krak za vezivanje iz mAt B21M-K409R i krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B146-F405L. Bispecifično antitelo I3RB193-Ab je sadržavalo RSV krak za vezivanje iz mAt B2M-F409R i krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B147-F405L. Bispecifično antitelo I3RB194-Ab je sadržavalo anti-RSV krak za vezivanje iz mAt B2M-F409R i krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B151-F405L. Bispecifično antitelo I3RB195-Ab je sadržavalo anti-RSV krak za vezivanje iz mAt B21M-K409R i krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B154-F405L. Bispecifično antitelo I3RB196-Ab je sadržavalo anti-RSV krak za vezivanje iz mAt B21M-K409R i krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B155-F405L.
[0317] Teški i laki lanci za CD123 x CD3 bispecifična antitela su prikazani ispod, u Tabeli 14.
Tabela 14. Sekvence teških i lakih lanca za bispecifična IgG1 antitela
1
11
12
1
14
1
1
1
1
Primer 16: Ispitivanje bispecifičnih antitela u funkcionalnom testu ubijanja ćelija
[0318] Test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama je funkcionalan test za procenu sposobnosti CD123 x CD3 bispecifičnih antitela da liziraju ćelije, upotrebom T-ćelija iz zdravih davalaca.
[0319] Praćen je protokol objavljen od strane Laszlo-a i saradnika (Laszlo G. i saradnici, 2014, BLOOD 123:4, 554-561). Ukratko, efektorske ćelije su sakuplјene, prebrojene, isprane i resuspendovane do 1X10^6 ćelija/ml u RPMI (10% FBS) ćelijskom medijumu. Cilјne ćelije su obeležene sa CFSE (Invitrogen, kat.br. C34554) i ponovo su resuspendovane do 2X10<5>ćelija/mL u RPMI (Invitrogen, kat.br.61870-036) sa 10% FBS-om (Invitrogen, kat.br. 10082-147). Efektorske i cilјne ćelije obeležene sa CFSE su pomešane u odnosu E:T = 5:1 u sterilnim pločama sa 96 bunarića okruglog dna. U svaki bunarić koji je sadržavao razne koncentracije, dodati su zatim alikvoti svakog od bispecifičnih antitela od po 5 µL. Kulture ćelija su inkubirane tokom 48 sati na 37°C, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon 48 sati, u uzorke je dodat LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead pufer za bojenje ćelija ((life technologies, kat.br. L10119), pa su ćelije inkubirane 20 minuta u mraku na ST, isprane i resuspendovane u 170 µL FAC pufera. Citotoksičnost indukovana lekovima je određena upotrebom CANTO II protočnog citometra (BD Biosciences) i analizirana kompjuterskim programima FlowJo ili Dive (BD Biosciences). Populacija od interesa je bila dvostruko pozitivna u vidu CFSE+/živih/mrtvih+ ćelija.
[0320] Prikazani su rezultati lize ćelija posredovane T-ćelijama za AML ćelijske linije MV4-11 (Slika 18A i B), OCI-AML5 (Slika 19A i B) i OCI-M2 (Slika 20A i B) nakon 48 h inkubacije na 37°C, sa 5% CO2. MV4-11 i OCI-AML5 su ćelijske linije koje eksprimiraju CD123, dok liniju OCI-M2 karakteriše značajno niska ekspresija CD123 ekspresiju. Odnos efektornih i ciljnih ćelija u ovoj studiji je iznosio 5:1. Dodaani su i alikvoti od 2 mg/ml blokatora Fc da bi se blokirala funkcija Fc.
1
[0321] U specifičnom ubijanju ćelija CD123+ ćelija, kada su bila kombinovana sa anti-CD3 antitelom u bispecifičan format, bila su efikasna i I3RB2 i I3RB18 antitela. Doddatno, podaci su omogućili da se razjasne razlike između I3RB135 (zasnovanog na I3RB2) i I3RB125 (zasnovanog na I3RB18) bispecifičnih antitela, sa I3RB125 x CD3 bispecifičnim antitelima kao potentnijim u odnosu na I3RB135 x CD3 bispecifična antitela. Unutar svake familije, bispecifična antitela zasnovana na CD3B146 i CD3B155 (mAt višeg afiniteta) su bila potentnija od bispecifičnih antitela zasnovanih na CD3B151 i CD3B154. Niski nivoi bazalne citotoksičnosti koji su zavisili od doze, uočeni su kod ćelijske linije OCI-M2 sa niskom ekspresijom CD123.
Primer 17: Ispitivanje bispecifičnog antitela, I3RB186, u tumorskom modelu oboljenja – Materijali i metode
[0322] Ćelijska linija. Da bi se utvrdila efikasnost bispecifičnog antitela I3RB186 in vivo, za studije efikasnosti su izabrane komercijalno dostupne tumorske ćelijske linije sa visokom ekspresijom CD123. Linija KG-1 (DSMZ, kataloški broj ACC 14), humane tumorske ćelije akutne mijelogene leukemije (AML), gajene su in vitro, u RPMI medijumu u koji je bio dodat toplotom inaktiviran fetalni serum govečeta (10% v/v), na 37°C u atmosferi sa 5% CO2u vazduhu. Ćelije su rutinski subkultivisane dva do tri puta nedelјno. Ćelije koje su bile u eksponencijalnoj fazi rasta su prikuplјene i prebrojane zarad inokulacije tumorskih ćelija.
[0323] Priprema humanih PBMC za transplantaciju. Humane ćelije krvi, obogaćene mononuklearnim ćelijama (kat.br.213-15-04), nabavljene su od kompanije Biological Specialty Corporation (Colmar, PA), i upotrebljene su za ispitivanje hIgG1-AA molekula. PBMC su izolovane razdvajanjem na Ficoll gradijentu gustine (Ficoll-Paque™ Plus, GE Healthcare Bio-Sciences AB, kat.br. 17-1440-03), pa je alikvotirano po 50x10<6>ćelija u vajlice, u medijum za zamrzavanje (Recovery Cell Culture Freezing Medium, Gibco, kat.br. 12648-010). Valice su čuvane na -80°C tokom približno 24 sata, a zatim su prebačene u tečni azot za dugoročno čuvanje. Za ispitivanje IgG4 molekula su upotrebljavane vajle zamrznutih izolovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (100x10<6>ćelije po vajli, kat.br. PB009-3) nabavljene od kompanije HemaCare (Van Nuys, CA). Da bi se odrzle PBMC, zamrznute valice su stavljen u vodeno kupatilo na 37°C. Ćelije su zatim prebacivane u konusne epruvete koje su sadržavale hladan medijum za odmrzavanja. Konusne epruvete su centrifugiranje, pa su ćelije resuspendovane u sterilnom PBS-u. Vijabilnost ćelija je ispitana upotrebom postupka isključivanja mrtvih ćelija sa tripan plavim. Ćelije su konačno resuspendovane do koncentracije ćelija od 50x10<6>ćelija po mL u sterilnom PBS-u za injekcije.
[0324] Prikupljanje periferne krvi za FACS analizu. Za ovu analizu, prikuplјano je po 50 µL krvi iz svake životinje, iz retro-orbitalnog sinusa, a krv je odlagana u epruvete obložene heparinom sa litijumom. Alikvoti krvi svakog uzorka od 25 µL su prebacivani u svaku od dve ploče sa 96 mesta, u 175 µl medijuma (RPMI sa 10% FBS). Ploče su centrifugirane, pa su crvena krvna zrnca lizirana upotrebom tri tretmana sa ACK puferom za lizu. Preostale ćelije svakog uzorka su spojene i obojene za CD45, CD3, CD8 i CD4 radi kvantifikacije cirkulišućih humanih T limfocita (pogledati poglavlje Prikupljanje periferne krvi iz miševa i bojenje – protocol za izolaciju leukocia i FACS analizu).
[0325] Protokol za FACS analizu leukoca. Protokol za FACS analizu leukoca. Periferna krv je prikupljana do dva puta tokom studije za analizu sortiranjem ćelija aktiviranog fluorescencom (FACS) cirkulišućih humanih PBMC. Puna krv (25 µL) je razblažena u 175 µL RPMI medijuma u pločama sa 96
11
mesta. Ploče su centrifugirane na 1400 o/min tokom 4 min, pa je odliven supernatant. Ćelije su respendovane u 200 µL ACK pufera za lizu i inkubirane na ledu tokom 5 minuta. Nakon centrifugiranja na 1300 o/min tokom 5 minuta, supernatant je uklonjen aspiriranjem. Ćelije su još dva puta tretirane sa ACK puferom za lizu, pa su isprane jednom u 200 µL PBS i ponovo centrifugirane na 1500 o/min tokom 5 minuta. Talozi ćelija su resuspendovani u 50 µL/bunariću koktela antitela u PBS-u koji je sadržavao boju za boljenje živih i mrtvih ćelija (Invitrogen, kat.br. L10119, 0,25 µL/bunariću koncentrovanog rastvora. Osnovni rastvor e razblaživan u 150 µL DMSO-a), nakon čega su inkubirani na sobnoj temperaturi u mraku tokom 30 min. Za obeležavanje ćelija su upotrebljena sledeća antitela: CD4 (Becton Dickinson, kat.br.557922, 0,5 µL/bunariću), CD8 (Invitrogen, Q010055, 0,5 µL razblaženja od 1:10 u PBS-u/bunariću), CD3 (Becton Dickinson, kat.br.558117, 0,5 µL/bunariću), CD45 (BioLegend, kat.br. 304006, 0,5 µL/bunariću). Ćelija je isprana 3X sa FACS puferom (200 µL/bunariću) i dalje su resuspendovane u 170 µL FACS pufera. Prikuplјanje uzoraka je urađeno na BD LSR Fortessa protočnom citometru. Vijabilne pojedinačne ćelije su pre analize pripremane, upotrebom Near-IR live/dead boje (Life Technologies Inc.), pa su određivani parametri rasipanja napred/sa strane i intenziteta, tim redom. Podaci su analizirani upotrebom BD FACS Diva kompjuterskog programa, verzije 7.
[0326] In vivo dizajn. Ženke NSG (NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ) miševa su supkutano inokulirane sa KG-1 ćelijama (5x10<6>ćelija u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatima, u zapremini od 200 µL), sa dorzalne bočne strane svake životinje. Dan inokulacije tumorskih je ćelija označen kao Dan 0. Mere tumora su praćene dva puta nedelјno, počevši od sedmog ana nakon implantacije, sve dok se zapremina tumora nije bila opsega između 100-150 mm<3>(četrnaest dana nakon implantacije), u kojem su trenutku miševi nasumično raspoređeni po zapremini tumora u grupe tretmana. Miševia su zatim intravenski (bočna repna vena) transplantirane humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) (10x10<6>ćelija u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatima, u zapremini od 200 µL). Odmah nakon transplantacije PBMC, miševi su primili intravensku terapiju bispecifičnim At I3RB186 (bispecifično, razblaženo u PBS-u i dozirano u zapremini od 100 µL). Tretman se odvijao približno svakog drugog dana, sa ukupno pet doza (pogledati Tabelu 15 za tačne dane primene doza). Merenja tumora i telesne težine su beležena dva puta nedelјno.
[0327] Krajnja svrha studije je bila određivanje inhibicije rasta tumora, maksimalnog opterećenja tumorom (srednja vrednost po grupi veća od 1500 mm<3>) i gubitka telesne težine većeg od 20% telesne težine do početka lečenja. Veličina tumora merena je dva puta nedelјno u dve dimenzije, upotrebom nonijusa, a zapremina je izražena u mm<3>upotrebom formule: V = 0,5axb<2>gde su i b dugi i kratki prečnici tumora, tim redom. Kompletna regresija tumora (CR) je definisana kao tumor koji se smanjio ispod granice opipljivosti (50 mm<3>). Delimična regresija tumora (PR) je definisana kao tumor koji se smanjio u odnosu na početnu zapreminu tumora. Minimalno trajanje i koji su smanjeni od početnog volumena tumora. Da bi se CR ili PR smatrao trajnim, neophodno je da je minimalno trajanje CR ili PR bio uočen u tri ili više od uzastopnih merenja tumora.
[0328] Transplantacija humanih PBMC dovodi do moguće bolesti “kalem-protiv-domaćina” (GVHD) kod miševa, pri čemu transplantirane donorske T-ćelije postaju aktivirane i infiltriraju se u tkiva domaćina, vodeći ka otkazivanju organa, ekstremnom gubitku telesne težine i neizbežno ka smrti. Da bi se ispratili početak i ozbiljnost GVHD u ovom modelu, telesna težina je beležena dva puta nedelјno i izražavana je u gramima (g). Procenat promene telesne težine je izračunat formulom: promena telesne težine = [(C-I)/I]<∗>100 gde je C trenutna telesna težina, a I telesna težina na početku lečenja.
[0329] Sažeti statistički podaci za zapremine tumora, uklјučujući srednju vrednosg i i standardnu grešku srednje vrednosti (SEM), su navedeni da bi se izračunala razlika u zapremini tumora između svake grupe, za svaku od vremenkih tačaka, i prikazani su u odgovarajućim tabelama studija. Statistička analiza razlika u zapremini tumora među grupama je analizirana upotrebom dvofaktorskog ANOVA testa sa ponovljenim merenjima, nakon čega je seldio Bonferroni post-test, upotrebom GraphPad Prism programa, verzije 5.01. p<0,05 je smatrano kao statistički značajno.
Efikasnost CD123xCD3 IgG1, F234A, L235A bispecifičnih antitela
[0330] NSG miševima su supkutano inokulirane KG-1 ćelije, pa su intravenski ubrizgane humena PBMC, kao što je prethodno opisano, a kada su se tumori oformili (srednja zapremina tumora = 102 /- 5,9 mm<3>), primenjene su doze CD123 x CD3 bispecifičnih At - za I3RB186, doze su iznosile 0,01; 0,1; 1 i 10 µg po životinji, kao što je prethodno opisano. Podgrupi miševa sa tumorima nisu injecirane PBMC, ali su primenjene doze antitela, tako da je ova grupa predstavljala kontrole za mehanizam bispecifičnosti u odsustvu kontrolnih bispecifičnih At. Takođe, podgrupi miševa bez tumora su injecirane PBMC, a potom su primenjivane doze antitela, tako da je ova grupa predstavljala kontrole za FACS analizu periferne krvi (pogledati Tabela 15 za dizajn studije).
Tabela 15. Raspored primene doza za in vivo efikasnost I3RB186
Rezultati studije in vivo efikasnosti
[0331] Slika 21 prikazuje efikasnost CD123xCD3 IgG1-AA bispecifičnog antitela, I3RB186 - IgG1, F234A, L235A, u KG-1 humanom AML ksenograftima kada su prisutne humane PBMC, u dve doze, 0,1 i 1 µg po životinji (p<0,001). Ovo bispecifično antitelo u dozi od 1 µg po životinji (sivi zatvoreni kvadratići) je ispoljilo neposredniju anti-tumorsku efikasnost od 0,1 µg, sa potpunim regresijama kod 3/8 životinja i delimičnim regresijam kod 3/8 životinja. Međutim, ponovan rast tumora je uočen kod 6/8 miševa, počevši od Dana 55 nakon implantacije tumora. Bispecifično antitelo u dozi od 0,1 µg po životinji (sivi zatvoreni dijamant) je ispoljilo odloženu, ali bolјu efikasnost sa potpunim i delimičnim regresijama koje su se javile kod svih životinja. Podaci pokazuju da je prisustvo efektorskih T limfocita neophodno za ubijanje cilјnih ćelija sa bispecifičnim antitelima.
[0332] Slika 22 prikazuje FACS analizu periferne krvi prikuplјene iz miševa 30. dana nakon implantacije tumora. Porast u CD45+ ćelijama, uslovljen povećanje u CD8+ T limfocitima, bio je očigledan kod životinja sa tumorima koje su bile tretirani sa 0,1 i 1 µg bispecifičnih antitela. Ovakva ekspanzija CD8+ T limfocita se javljala samo kada su bile prisutne cilјne ćelije (KG-1), u grupama u kojima je uočena antitumorska efikasnost. Alternativno, delovalo je da je 10 µg bispecifičnog antitela očistilo CD45+ PBMC iz periferne krvi. Ovakav klirens efektorskih ćelija može objasniti nedostatak efikasnosti koji se uočava pri primeni ove doze.
[0333] Slika 23 prikazuje FACS analizu periferne krvi prikuplјene iz miševa 53. dana nakon implantacije tumora. CD45+, CD8+ i CD4+ ćelije su bile sličnih nivou kod miševa sa tumorima koji su bili tretirani sa 0,1 i 1 µg bispecifičnih antitela, kao kod miševa bez tumora koji su tretirani sa PBS-om i sa 0,01 i 0,1 µg bispecifičnih antitela. Miševe bez tumora tretirane sa 1 i 10 µg bispecifičnih antitela su karakterisali vrlo niski nivoi CD45+, CD8+ i CD4+ ćelija; uzrok tome trenutno nije poznat.
[0334] Slika 24 prikazuje promenu srednje vrednosti telesne težine tretiranih grupa tokom vremena. Kao što je prethodno opisano, gubitak telesne težine je u korelaciji sa pojavom i težinom GVHD, što je prouzrokovano aktiviranim T-ćelijama. I kod miševa koji nose tumor i koji su bez tumora, gubitak telesne težine bio je najozbiljniji prilikom tretmana sa 0,1 µg bispecifičnog antitela. Kod miševa sa tumorima lečenih bispecifičnim antitelom u dozi od 1 µg, nije došlo do ozbiljnog gubitka telesne težine. T limfociti su bili prisutni 53. dana nakon implantacije tumora (prema FACS analizi, Slika 23), međutim nedostatak gubitka telesne težine i početak GVHD su ukazali i na gubitak aktiviranih T-ćelija, što može objasniti ponovan rast tumora koji je uočen u ovoj grupi nakon 55.dana od implantacije tumora (Slika 21).
Primer 18. Ispitivanje I3RB186 i kontrolnih bispecifičnih antitela (I3RB191 i I3RB192) in vivo
[0335] U drugom in-vivo eksperimentu, dodavane su bispecifične At kontrole, I3RB191, antitela sa CD3 nultim krakom i I3RB192, CD123 nulti krak At. Protokol je bio isti kao u primeru 16. KG-1 humani AML tumorski ksenografti su supkutano implantirani u ženke NSG miševe. Četrnaest dana nakon implantacije, miševi su nasumično raspoređeni po zapremi tumora u grupe tremana. Humani PBMC su intravenski implantirani, nakon čega je sledio intravenski tretman sa I3RB186, kao i I3RB191 i I3RB192 kontrolnim bispecifičnim At u dozi od 1 µg po životinji (pogledati raspored primene doza u Tabeli 16). Lečenje se odvijalo 14., 16., 18., 21. i 23. dana nakon implantacije tumora. Strelice na slici prikazuju dane primene bispecifičnog At.
11
Tabela 16 Raspored primene doza u 2. in vivo eksperimentu
[0336] Antitumorska aktivnost bispecifičnih At je prikazana u vidu promena u veličini tumora (mm3) tokom vremena (Slika 25). Tretman sa 13RB186 u dozi od 1 µg je značajno inhibirao rast tumora (p<0,001) u poređenju sa onim kod životinja tretiranih sa PBS-om i kontrolnim bispecifičnim At.
[0337] Na dan 36 nakon implantacije tumora, prikuplјena je periferna krv za FACS analizu cirkulišućih humanih PBMC. Za razliku od prve stuidje, nije bilo razlike u učestalosti humanih CD45+ PBMC (a) ili CD8+ i CD4+ T limfocita (b) kod životinja koje su tretirane sa I3RB186 u poređenju sa PBS i I3RB191 (Slika 26). CD45+, CD8+ i CD4+ ćelije bile su sa nižim učestalostima kod životinja sa tumorom i kod životinja bez tumora tretiranih sa I3RB192, kontrolnim bispecifičnom At sa CD123 nultim krakom.
[0338] Na dan 63 nakon implantacije tumora, takođe je prikuplјena periferna krv za FACS analizu cirkulišućih humanih PBMC. Od životinja sa tumorima, ostale su samo životinje tretirane sa I3RB186 u dozi od 1 µg (Slika 27). Došlo je i do povećanja učestalosti CD45+ humanih PBMC-a (a) i CD8+ T-limfocita (b) kod životinja sa tumorima koje su bile tretirane sa 1 µg I3RB186, u poređenju sa životinjama koje nisu bile sa tumorom i tretirane su sa PBS-om ili sa 1 µg I3RB186 (Slika 25). CD4+ T limfociti su bili sa sličnim učestalostia u svim preostalim grupama. Miševi bez tumora, tretirani sa PBS-om i 1 µg I3RB186 su bili sa vrlo niskom učestalošću CD45+, CD8+ i CD4+ ćelija.
[0339] Slika 28 prikazuje promenu srednje vrednosti telesne težine kod tretiranih grupa tokom vremena. Kao što je prethodno opisano, gubitak telesne težine je bio u korelaciji sa pojavom i težinom GVHD, što je bilo prouzrokovano aktiviranim T-ćelijama. Kod miševa sa tumorima, došlo je do većeg gubitka telesne težine tokom tretmana sa 1 µg bispecifičnog antitela u poređenju sa svim ostalim grupama. Navedeno je u suprotnosti sa prvom studijom, gde kod miševa sa tumorima tretiranih sa 1 µg bispecifičnog antitela nije došlo do ozbiljnog gubitka telesne težine. T-limfociti su bili prisutni 63. dana nakon implantacije tumora (Slika 27), međutim, efikasnost sa dozom od 1 µg nije bila tako izražena kao u prvoj studiji (Slike 21,25).
Primer 19. Priprema antitela u bispecifičnom formatu sa IgG4 S228P, F234A, L235A
[0340] Nekoliko monospecifičnih CD3 i CD123 antitela je eksprimirano u vidu IgG4, sa Fc supstitucijama S228P, F234A i L235Ax (CD123 krak) ili S228P, F234A, L235A, F405L i R409K (CD3 krak) (numeracije prema EU indeksu) u njihovim Fc regionima. Monospecifična antitela su eksprimirana u CHO ćelijskim linijama pod kontrolom CMV promotora.
[0341] Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B219 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 184 i VL iz SEQ ID NO: 190, kao i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A, L235A, F405L i R409K supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B217 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 186 i VL iz SEQ ID NO: 188, kao i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A, L235A, F405L i R409K supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B218 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 186 i VL iz SEQ ID NO: 190, kao i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A, L235A, F405L i R409K supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B220 koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 187 i VL iz SEQ ID NO: 188, kao i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A, L235A, F405L i R409K supstitucijama.
[0342] Generisano je monospecifično anti-CD 123 antitelo I3RB218 koje je sadržavalo VH i VL regione anti-CD123 antitela I3RB2 sa VH iz SEQ ID NO: 120 i VL iz SEQ ID NO: 165, kao i sa konstantnim regionom IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama. Generisano je monospecifično anti-CD123 antitelo I3RB217 koje je sadržavalo VH i VL regione iz anti-CD123 antitela I3RB18 sa VH iz SEQ ID NO: 136 i VL iz SEQ ID NO: 168 i sa konstantnim regionom IgG4 sa S228P, F234A i L235A supstitucijama.
[0343] Kao kontrola, generisano je monospecifično anti-RSV antitelo, izvedeno iz B21M, koje je sadržavalo VH i VL regione tipa VH iz SEQ ID NO: 191 i VL iz SEQ ID NO: 192 i konstantni region IgG4 sa S228P, F234A, L235A ili F234A, L235A, R409K, F405L da bi se se uparili kao nulti krak sa bilo CD3 ili CD 123 krakom bispecifičnog antitela.
[0344] Monospecifična antitela su prečišćena, pa su generisana monospecifična anti-CD3 i CD123 antitela pomešana za postupak in vitro izmene Fab prema matrici (Tabela 12), kao što je prethodno opisano u Primeru 15, i dalje su okarakterisana u raznim testovima. Bispecifično antitelo -Ab 7959 je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B219 -F405L, R409K i krak sza vezivanje CD123 iz mAt I3RB217 -R409. Bispecifično antitelo At 3978 je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B217 -F405L, R409K, kao i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB217 -R409. Bispecifično antitelo At 7955 je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B218 -F405L, R409K i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB217 -R409. Bispecifično antitelo 9958 At je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B220 -F405L, R409K i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB217 -R409. Bispecifično antitelo At 8747 je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B219 -F405L, R409K i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB218 -R409. Bispecifično antitelo At 8876 je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B217 -F405L, R409K i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB218 -R409. Bispecifično antitelo At 4435 je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B218 -F405L, R409K i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB218 -R409. Bispecifično antitelo At 5466 je sadržavalo krak za vezivanje CD3 iz mAt CD3B220 -F405L, R409K i krak za vezivanje CD123 iz mAt I3RB218 -R409.
[0345] Za kontrolna bispecifična antitela, generisan je B2M1 u IgG4 PAA formatu, koji je dalje prečišćen i kombinovan bilo sa CD3 krakom ili CD123 kracima shodno matirici navedenoj ispod, u Tabeli 17.
11
Tabela 17 Matrica IgG4 bispecifičnih antitela
[0346] Teški i laki lanci za CD123 x CD3 bispecifična antitela su prikazani u Tabeli 18.
11
Tabela 18. Sekvence teških i lakih lanaca za bispecifična At IgG4-PAA
11
11
11
12
Primer 20. Monovalentni afinitet CD123 bispecifičnih antitela u IgG4-PAA formatu upotrebom rekombinantnog antigena
[0347] Eksperimenti merenja površinske plazmonske rezonance (SPR) su urađeni da bi se odredile kinetike i afinitet vezivanja CD3XCD123 bispecifičnih antitela za humane CD123 SP1 ECD i CD123 SP2 ECD.
[0348] Afiniteti anti-CD123 xCD3 bispecifičnih At 3978, 7955, 7959, 9958 8876, 8747, 5466 za rekombinantni humani CD123 SP1 i rekombinantni humani CD123 SP2 ECD su mereni površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom Biacore instrumenta. Kinetičke studije su rađene na 25°C upotrebom Biacore T200 sistema (Biacore, Inc., sada deo GE Healthcare). Kozje anti-humano antitelo specifično oza IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch laboratories, kat.br. 109-005-098) kovalentno je vezano za površine CM-5 senzorskog čipa od karboksimetil dekstrana prevučene zlatom (GE Healthcare). Karboksimetilne grupe dekstrana su aktivirane sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimidom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS). Anti-Fc antitela su kuplovana na pH 4,5 u 10 mM natrijum acetata. Sva preostala reaktivna mesta na površini su blokirana reakcijom sa etanolaminom. Za merenja kinetike vezivanja, anti-CD 123 antitela su vezana za antitelo specifično za humani Fcγ, i “uhvaćeno” je 40-70 RU antitela. Nakon “hvatanja” At je sledilo injeciranje humanog CD123 SP1 ili humanog CD123 SP2 u koncentracijama između 0,4 nM i 400 nM pri 40 µL/min. Podaci o asocijaciji su prikuplјani tokom 2 min, nakon čega je sledilo 10 minuta disocijacije. Površina je obnovljena sa 30 µL 100 mM H3PO4 pri 100 µL/min, nakon čega je nanet 50mM NaOH. Uzorci za kinetičke anlize su pripremani u puferu zasnovanom na PBS-u (D-PBS, koji je sadržavao 3 mM EDTA i 0,005% surfaktanta P20. Podaci koji su prijavlјeni predstavljaju razlike u SPR signalu između protočne ćelije koja je sadržavala vezano antitelo i referentne ćelije koja nije sadržavala vezano antitelo. Dodatni instrumentalni doprinosi signalu su uklonjeni oduzimanjem podataka dobijenih pri injeciranju koje je predstavljalo slepu probu, od signala od koga je oduzeta referentna vrednost. Podaci su analizirani su uklapanjem faza asocijacije i disocijacije u svim koncentracijama (globalno uklapanje) prema modelu vezivanja od 1:1, upotrebom kompjuterskog programa BIAevaluation (BIAcore, Inc.). U Tabeli 20 i 21 su sažeti kinetički i rezultati afiniteta dobijeni upotrebom Biacore instrumenta. Obe tabele prikazuju podatke dobijene tokom tri ili više nezavisnih eksperimenata.
[0349] Biacore podaci pokazuju da se unutar iste familije bispecifičnih At izvedenih iz I3RB18 i bispecifičnih At izvedenih iz I3RB2, ona vezuju za CD123 SP1 sa sličnim afinitetima (Tabela 19), kao i da su slični afiniteti za CD123 SP2 (Tabela 20). Bispecifična At izvedena iz I3RB18 se vezuju za rekombinantni CD123 SP1 >10 puta jače od bispecifičnih At izvedenih iz I3RB2, sa afinitetima od ∼1 nM, odnosno 14 nM, tim redom. Kada se vezuje za rekombinantan CD123 SP2, bispecifična At izvedena iz I3RB18 se vezuju >5 puta čvršće od bispecifičnih At izvedenih iz I3RB2, sa afinitetima od ∼0,3 nM, odnosno 1,7 nM, tim redom. Standardna odstupanja u Tabelama 19 i 20 ukazuju da su podaci bili vrlo reproducibilni.
Tabela 19 Kinetički i podaci za afinitet vezivanja bispecifičnih antitela za rekombinantan humani CD123 SP1 dobijeni upotrebom Biacore instrumenta.
12
Tabela 20. Kinetički i podaci za afinitet vezivanja anti-CD123 bispecifičnih antitela za rekombinantan humani CD123 SP2 dobijeni upotrebom Biacore instrumenta.
Primer 21. Monovalentni afinitet CD123 bispecifičnih antitela u IgG4-PAA formatu za antigen eksprimiran na površini ćelije upotrebom MSD-CAT
[0350] Monovalentni afiniteti izabranih anti-CD 123 bispecifc antitela za hCD123 SP1 i SP2 eksprimirane na površini ćelija, određeni su upotrebom postupka MSD tehnike ćelijskog afiniteta (MSD-CAT). MSD-CAT je razvijen interno kao postupak za određivanje afiniteta bez obeležavanja, upotrebom intaktnih ćelija i u formatu viskokog obima pretraživanja. Ovi eksperimenti su urađeni da bi se ispitali afinitet i specifičnost vezivanja kandidata anti-CD123 antitela za humani CD123 SP1 ili CD123 SP2 na površini ćelija. Ćelijske linije koje su bile upotrebljene su bile ćelije sa humanim pDisplay CD123SP1 i pDisplay CD123SP2. Negativno kontrolno antitelo je upotrebljeno da bi se ispitalo da li se mreža bispecifičnih antitela nespecifično vezuje za ćelije i razlikuje nespecifično u odnosu na specifično vezivanje za CD123. Da bi se izmerio afinitet ovih interakcija upotrebom MSD-CAT postupka, serija smeša sa utvrđenim koncentracijama anti-CD123 (800, 160, 32 i/ili 6 pM) i varirajuće koncentracije ćelija (20 miliona do 1016 ćelija/mL) su pripremlјene i ostavlјene da dostignu ravnotežu, rotiranjem ploča tokom 24 sata na 4°C. Ovakvi uzorci su pripremani u DMEM Glutamax medijumu koji je sadržavao 0,05% azida, 1% BSA, 3 mM EDTA. Broj receptora (0,29-1,08) X10<6>hCD123/ćeliji i (0,57-1,5) x 10<6>hCD123 SP2/ je preveden u M koncentraciju receptora u smeši, na osnovu zapremine reakcije, gustine ćelija (ćelije/L) i Avogadrovog broja. Rezultat je bio opseg koncentracija od 35 nM do 0,5 M za humani CD123 SP1 ; i 49nM do 0,97 pM for human CD123 SP2. Nakon postizanja ravnoteže, ploča je centrifugirana 5 min na ∼1000 o/min i detektovan je slobodan anti-CD3 u supernatantu. Slobodan anti-CD123 u smeši je detektovan elektrohemiluminescencijom (ECL), upotrebom instumenta za očitavanje kompanije Mesoscale Discovery (MSD). Za detekciju slobodnog anti-CD 123 u uravnoteženoj smeši, pripremlјene su ploče za elektrohemiluminescentnu imunoanalizu (ECL). Da bi se pripremile ploče za detekciju (antigeni vezani na SA-MSD pločama), standardne MSD streptavidinske ploče su blokirane sa po 50 µL/bunariću pufera za analizu (PBS, (Life Sciences GIBCO 14190-136), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA) tokom 5 min. Pufer za analizu je zaitm uklonjen bez ispiranja, pa je u MSD ploču dodato po 50 µL/bunariću 0,7 µg/mL biotinizovanog antigena u puferu za analizu i ploča je inkubirana preko noći (∼16 h na 4°C). Nakon inkubacije preko noći, ploče su blokirane dodavanjem 150 µL pufera za analizu po bunariću, bez uklanjanja antigena za oblaganje, pa je ploča inkubirana tokom ∼1 sata na sobnoj temperaturi i dalje isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (pufer za analizu bez BSA). Po 50 µL/bunariću supernatanta sa ploče sa uzorcima je prebačeno na ploče obložene antigenom, nakon čega su ploče inkubirane 60 minuta i zatim tri puta isprane sa puferom za ispiranje. Nakon toga, u svaki bunariće je dodato po 50 µL antitela za detekciju koje je bilo obeleženo rutenijumom (anti-humani H L), pa je ploča inkubirana tokom 1 sata. Nakon 1 sata, ploče su isprane i u svaki bunarić je dodato po 150 µL MSD pufera za očitavanje (Read Buffer T 4X, R92RD-2, MSD). Nivo luminescencije ploča je odmah očitan na MSD Sector Imager 6000 čitaču. ECL signal koji je detektovan sa MSD je izražen u vidu % slobodnog antitela u smeši i podaci su dalje analizirani da bi se odredio afinitet upotrebom jednačine koju je definisao korisnik (izvedene iz zakona o dejstvu mase) koja je bila uvedena u Prism kompjuterski program. Rezultati MSD-CAT ekpserimenata su prikazani u Tabeli 21.
Tabela 21. MSD-CAT podaci afiniteta pokazuju vezivanje anti-CD123 molekula za humani CD123 SP1 i humani CD123 SP2 na ćelijskoj površini. Podaci su obrađeni upotrebom nelinearne analize i postupka najmanjih kvadrata sa modelom vezivanja tipa 1:1.
[0351] MSD-CAT afiniteti bispecifičnih At za CD123 SP1 na površini ćelije bili su >6 puta jači od SPR podataka za rekombinantan CD123 SP1; Ipak, afiniteti za CD123 SP2 na površini ćelije su bili slični afinitetima rekombinantnog CD123 SP2 (razlika od <2 puta). Razlika u SPR afinitetima u odnosu na MSD-CAT afinitete za CD123 SP1 najverovatnije je posledica prezentacije antigena na ćelijskoj površini u poređenju sa rekombinantnim antigenom. MSD-CAT je pokazao da su bispecifična At izvedena iz I3RB18 (3978, 7955, 7959, 9958) najčvršće vezana za humani CD123 SP1 i humani CD123 SP2 na površini ćelija, sa pM afinitetima. Afiniteti antitela izvedenih iz I3RB18 su bili oko 10 puta i oko 5 puta jači od afiniteta bispecifičnih At izvedenih iz I3RB2 za CD123 SP1 i CD123 SP2 na povrišini ćelije, tim redom. Afiniteti su bili slični za bispecifična At unutar iste familije.
12
[0352] Sveukupno, analize molekulskih interakcija upotrebom Biacore i MSD-CAT sistema su bili u saglasnosti i pokazali su da se bispecifična At izvedena iz I3RB18 čvršće vezuje za rekombinantni i humani CD123 (SP1 i SP2) na površini ćelija u odnosu na bispecifična At izvedena iz I3RB2.
Primer 22. CD123 monovalentni afinitet bispecifičnih antitela u IgG4-PAA formatu za antigen eksprimiran na ćelijskoj površini upotrebom protočne citometrije
[0353] Protočna citometrija je upotrebljena za merenje vrednosti afiniteta nekoliko CD123xCD3 bispecfičnih At za CD3 na humanim T-ćelijama (Biological Specialty, Colmar, SAD) i T-ćelijama cinomolgus majmuna (Zen Bio, Triangle Research Park, USA). Format je uklјučivao kompetitivno vezivanje upotrebom fiksne koncentracije obeleženih anti-CD3 mAt poznatog afiniteta i rastućih koncentracija neobeleženih ispitivanih At (Ashkenazi A i saradnici, PNAS: 88:10535, 1991.). Upotreblјeno anti-CD3 mAt je bilo CD3B146 hu IgG1-AlaAla F405L antitelo čija je vrednost afiniteta slična SP34-2. Kd za SP34-2 je određen upotreom vezivanja u zasićenju, a primeri krivih vezivanja za humane i T-ćelije cinomolgus majmuna su prikazani na Slici 29. Slika 30 prikazuje kompetitivno vezivanje sa obeleženim B146 i sa raznim koncentracijama neobeleženih CD123 x CD3 bispecifičnih antitela dobijenih za humane (Slika 30 A) i T-ćelija ciomolgus majmuna (Slika 30 B). Za humane i T-ćelija ciomolgus majmuna su dobijene uporedive vrednosti. Deluje da je bilo prisutno tri CD3 afinitetne grupe unutar analiziranih uzoraka: visokog afiniteta (9-15 nM), srednjeg afiniteta (25-50 nM) i niskog afiniteta (110-270 nM) što je zbirno prikazano u Tabeli 22.
TABELA 22. Vrednosti afiniteta (Kd) CD123 x CD3 bispecifičnih antitela za humane ili T-ćelije cinomolgus majmuna - kompetitivno vezivanje upotrebom obeleženog B146 i rastućih koncentracija neobeleženih antitela
12
Primer 23 Ispitivanje IgG4-PAA CD123 x CD3 bispecifičnih antitela u funkcionalnom testu ubijanja ćelija
[0354] Test citotoksičnosti posredovane T-ćelijama, kao što je opisano u Primeru 16, upotrebljen je za procenu sposobnosti CD123 x CD3 bispecifičnih At da liziraju ćelije, upotrebom T-ćelija iz dva zdrava donora. Za ove eksperimente su korišćene OCI-AML5, KG-1 i JIM3 ćelije. JIM3 je mijelomska tumorska linije koja ne eksprimira CD123, tako da je upotrebljavana kao kontrola. Ćelije su tretirane tokom 48 sati bispecifičnim At. Odnos E:T za ovu studiju je iznosio 5:1, a dodavano je i 2mg/mL Fc blokatora da bi se blokirala funkcija Fc.
[0355] Prikazani su rezultati lize ćelije posredovane sa T-ćelijama u AML ćelijskim linijama OCI-AML (Slika 31), KG-1 (Slika 32) i JIM3 (Slika 33), nakon 48 h inkubacije na 37°C, u 5% CO2. MV4-11 i OCI-AML5 su ćelijske linije koje eksprimiraju CD123, dok JIM3 karakteriše vrlo niska ili odsustvo CD123 ekspresije. Odnos efektora i ciljnog molekula za ovu studiju je iznosio 5:1. Dodavano je i 2mg/mL Fc blokatora da bi se blokirala funkcija Fc.
[0356] Rezultati su slični prethodnim eksperimentima ubijanja ćelija sa CD123 x CD3 bispecifičnim At u IgG1-AA formatu. I I3RB217 (I3RB18) i I3RB218 (I3RB2) antitela, kada su kombinovana sa anti-CD3 antitelom u bispecifičnom formatu, efikasna su u specifičnom ubijanju CD123+ ćelija. Ubijanje ćelija je specifično za ćelije koje sadrže CD123, što je pokazano odsustvom efekta kod JIM3 ćelija. Dodatno, podaci omogućavaju jasno razlikovanje između I3RB218 (zasnovanih na I3RB2) i I3RB217 (zasnovanih na I3RB18) bispecifičnih antitela, pri čemuu su I3RB217 x CD3 bispecifična antitela potentnija u odnosu na I3RB218 x CD3 bispecifična antitela, što je u saglasnosti sa prethodnim podacima o ubijanju ćelija.
Primer 24. Ispitivanje bispecifičnih antitela u testu heterodimerizacije receptora
[0357] Test dimerizacije receptora DiscoveRx za IL3RA/CD131 (DiscoveRx 93-0969-C1), upotrebljen je za procenu sposobnosti CD123 antitela da spreče heteromerizaciju II,3Rα (CD123)/IL3Rβ (CD131) indukovanu sa IL3. CD123 i CD131 su označeni sa ProLink™ (PK) ili enzimskim akceptorom (EA). Nakon aktivacije indukovane sa IL3, proteini su dimerizovani da bi obrazovali IL3 receptor, primoravanjem dve β-gal komponente da se nadopunjuju i stvore aktivan enzim. Aktivan β-gal generiše hemiluminescentni signal u prisustvu supstrata. Anti-CD123 antitela ili bispecifična antitela koja pokazuju opadajući signal sa povećanjem koncentracije antitela su zapravo pozitivna u sprečavanju heterodimerizacije.
[0358] U ćelijama je ispitivano povećanje enzimske antivnosti u prisustvu IL-3 liganda, upotrebom PathHunter® detektujućih reagenasa (DiscoveRx), prema protokolu proizvođača. HEK293 IL3RA-PK/CSF2RB-EA ćelijske linije su zasejavane u 20 µL medijuma za analizu, u četvoroplikatima, na pločama 384 bunarića u kojima je bilo po 5000 ćelija po bunariću. Koncentrovani rastvori antitela su serijski razblaživani u 0,1% BSA/PBS-u tako da je visoka koncentracija jedinjenja bila 10 ug/mL. Visoka doza je serijski razblaživana u odnosu 1:3 tako da se dobije ukupno 11 doza za ispitivanje. U bunariće je zatim
12
dodavnao po 5 ul razblaženog antitela. Ćelije su inkubirane tokom 1 sata na 37°C. Osnovni rastvor rekombinantnog humanog IL-3 koncentracije 100 µg/mL je razblažen tako da je 5 ul razblaženja IL-3 od 60 ng/mL moglo biti dodato u svaki bunarić. Finalna koncentracija IL-3 koja je bila upotrebljena je iznosila 10 ng/mL. Ćelije su inkubirane dodatnih 6 sati na 37°C. PathHunter Flash Detection reagens koji je sadržavao pufer za lizu i supstrat enzima, dodat je ćelijama, ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi, pa je očitana na Envision luminometru. Podaci su analizirani upotrebom GraphPad Prism programa 6. Krive su dobijene upotrebom sigmoidnog doznog odgovora sa promenlјivim nagibom (četiri parametra) bez ograničenja; postupak uklapanja = najmanji kvadrati (normalno uklapanje).
[0359] IgG4 PAA bispecifična antitela 8747 i 7959, kao i matična antitela I3RB218 i I3RB217 su ispitivana u istom testu. Ispitivanje je rađenu u dva nezavisna vremena, u prisustvu 10 ng/ml IL-3, a CD123 antitelo 7G3 je upotreboljavano kao pozitivna kontrola i za poređenja u testu. Antitela koja su sadržavala anti-CD123 krak I3RB18 sekvence, I3RB217 i 7959, (Slika 34C i D) bila su u stanju da spreče obrazovanje funkcionalnog IL-3 receptora u prisustvu IL-3 liganda. Antitela koja su sadržavala anti-CD 123 krak iz I3RB2, I3RB218 i 8747 (Slika 34A i B) nisu sprečila obrazovanje funkcionalnog receptora IL-3 u ovom testu. Ovo je u korelaciji sa prethodnim podacima koji su pokazali da I3RB18 može inhibirati nishodnu signalizaciju povezanu sa funkcionalnim IL-3 receptom
Primer 24. Analiza nekoliko bispecifičnih antitela u KG-1 tumorskom modelu
[0360] Efikasnost nekoliko CD123 x CD3 bispecifičnih At je ispitivana KG-1 AML mišjem modelu, kao što je prethodno opisano. Protokol je bio isti za ovu studiju kao u Primerima 16 i 17, osim što su ispitivanje IgG4 bispecifičnih antitela bile upotrebljene vajlice zamrznutih izolovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (100x10<6>ćelije po vajli, kat.br. PB009-3) nabavljene od kompanije HemaCare (Van Nuys, CA). NSG miševima su supkutano inokulirane KG-1 ćelije, a zatim su intravenski injecirane humane PBMC kada su se tumori razvili (srednja zapremina tumora = 135,7 /- 4,7 mm3). Miševima su zatim primenjivane doze IgG4 PAA CD123 x CD3 bispecifični At sa različitim afinitetima i odgovarajućim kontrolnim bispecifičnim At u rasponu doza, kao što je opisano u Tabeli 23.
Tabela 23. Raspored primene doza u 3. in vivo studiji
12
[0361] Rezultati ispitivanja in vivo efikasnosti za višestruko CD123 x CD3 bispecifična At su prikazani na Slikama 35 - 42. Slike 35 - 38 prikazuju efikasnost CD123 x CD3 IgG4-PAA bispecifičnih At sa različitim afinitetima i dozama u KG-1 modelu humanog AML ksenografta, Na Slici 35, bispecifična At sa visokim afinitetom CD123 i CD3 kraka su ispoljila značajnu efikasnost u poređenju s PBS-om i kontrolnim bispecifičnim At od Dana 25 do 36 nakon implantacije tumora (p<0,001). Bispecifično At 9958 u dozi od 1 µg je karakterisala značajna efikasnost u poređenju sa 0,1 µg, kao i obe doze bispecifičnog At 7959 do 36. dana nakon implantacije tumora (p<0,01). Ovo ukazuje da su visoki afinitet CD123 i CD3 kraka neophodni za izraženu efikasnost u ovom modelu.
12
[0362] Na Slici 36 je prikazano da je bispecifično At 3978 u dozi od 10 µg ispoljilo značajnu efikasnost u poređenju sa PBS-om i kontrolnim bispecifičnim At od 28. dana (p<0,05) do 36. dana (p<0,001) nakon implantacije tumora, kao i doza od 1 µg od 32. dana (p<0,05) do 36. dana (p<0,01) nakon implantacije tumora, a isto je važilo i za dozu od 0,1 µg od 32. dana (p<0,01) do 36. dana (p<0,001) nakon implantacije tumora. Utvrđeno je prisustvo zavisnosti odgovora od doze sa ovim bispecifičnim Ab, što ukazuje da CD3 krak visokog afiniteta u visokoj dozi može rezultovati efikasnošću u ovom modelu.
[0363] Na Slici 37 je prikazano da je bispecifično At 8747 u dozi od 0,1 µg ispoljilo značajnu efikasnost u poređenju sa PBS-om i kontrolnim bispecifičnim At od 32. do 36. dana nakon implantacije tumora (p<0,001), a u poređenju sa dozama od 1 i 10 µg na 36. dana nakon implantacija tumora (p<0,001). Navedeno ukazuje da CD3 krak visokog afiniteta u niskoj dozi može rezultovati efikasnošću u ovom modelu.
[0364] Na Slici 38 je prikazano da bispecifično At 8876 nije ispoljilo značajnu efikasnost u poređenju sa PBS-om i kontrolnim bispecifičnim Atom u bilo kojoj dozi.
[0365] Slike 39 - 42 prikazuju promenu srednje vrednosti telesne težine u tretiranim grupama tokom vremena. Kao što je prethodno opisano, gubitak telesne težine je u korelaciji sa pojavom i ozbiljnošću GVHD, što je prouzrokovano aktiviranim T-ćelijama.
[0366] Životinje tretirane bispecifičnim At 7959 u dozi od 0,1 µg i bispecifičnim At 9958 u dozi od 1 µg ije karakterisao ozbiljniji gubitak telesne težine koji je i ranije počinjao u osnodu na životinje tretirane PBS-om, kontrolnim bispecifičnim At i ostalim dozama bispecifičnog At 7959 i bispecifičnog At 9958 (Slika 39). Navedeno je u korelaciji sa značajnom anti-tumorskom efikasnošću koja je uočna za 1 µg bispecifičnog At 9958 (Slika 35).
[0367] Životinje tretirane bispecifičnim At 3978 u dozi od 10 µg je karakterisaon ozbiljniji i raniji gubitak telesne težine u poređenju sa onima koje su tretirane PBS-om i kontrolnim bispecifičnim At (Slika 40). Miševi koji su bili tretirani dozama od 1 µg i 0,1 µg ispoljili su gubitak telesne težine na način koji je zavisio od doze. Gubitak težine zavisan od doze je bio u korelaciji sa anti-tumorskom efikasnošću zavisnom od doze prikazanom na Slici 36).
[0368] Životinje tretirane bispecifičnim At 8747 u dozi od 0,1 µg ispoljile su sličan gubitak telesne težine kao one u grupi koja je bila tretirana PBS-om, međutim, miševi su povratili telesnu težinu posle 39. dana nakon implantacije tumora (Slika 41). Gubitka telesne težine nije utvrđen nakon primene doza od 1 ili 10 µg. Gubitak težine koji je uočen za dozu od 0,1 µg je bio u korelaciji sa anti-tumorskom efikasnošću koja je zabeležena za ovu dozu (Slika 37).
[0369] Životinje tretirane bispecifičnim At 8876 nisu ispoljile gubitak težine drugačiji od miševa tretiranih sa PBS-om ili kontrolnim bispecifičnim At (Slika 42), što odgovara nedostatku anti-tumorske efikasnosti koji se uočava pri primeni ovog bispecifičnog antitela (Slika 38).
[0370] Ukratko, CD123 x CD3 bispecifična At pokazuje konzistentnu efikasnost u humanoj AML ćelijskoj liniji koja eksprimira CD123, KG-1, samo u prisustvu efektorskih ćelija (T limfocita). Umnožavanje T-ćelija je uočeno ubrzo nakon primene doza, samo u prisustvu bolesti (KG-1 ksenografti). Pored toga, bispecifična efikasnost je bila u korelaciji sa početkom GVHD, što je mereno gubitkom telesne težine, ukazujući da su prisutni aktivirani T limfociti. Ovi podaci zajedno ukazuju da CD123 x CD3 bispecifična
1
antitela karakteriše anti-tumorska efikasnost posredovana predloženim mehanizmom angažovanja ciljnih i efektorskih ćelija i ubijenjem T-ćelija.
Primer 24. In vivo PK studije na mišu
[0371] Ispitivan At su formulisana u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatima, u koncentraciji od 0,2 mg/mL. Koncentracije su potvrđene upotrebom Nanodrop spektrofotometra, a zatim su sterilisane kroz filtere za šric sa veličinom pora od 0,2 mikrona.
[0372] Transgene životinje upotrebljene u ovim istraživanjima su izvedene iz C57BL/6 miševa. Tg32 licenciran od strane Jackson Laboratory (Bar Harbor), dobijen je izbacivanjem (engl. knocked out) njegovog endogenog mišjeg FcRn α gena i uvođenjem humanog FcRn α gena kao transgena, a koji je pod kontrolom nativnog humanog genskog promotora. Tg32 hemi se odnosi na miševe koji su hemizigotni za FcRn transgene, pri čemu se drugonavedeni dobijaju parenjem homozigotnih transgenih miševa sa FcRn α knockout miševima. Primećena je značajna korelacija između PK humanih antitela i PK kod primata sa Tg32 hemi modelom miša, tako da je stoga on upotrebljen u sledećim PK studijama za procenu poluživota At. Celokupan uzgoj miša je urađen u vivarijumuu SAGE Research Labs Boyertown, PA.
[0373] Za istraživanje su upotrebljeni miševi stari nedelje, sa 48 ženki Tg32 hemi miševa kojima su IV injecirana hIgG4-PAA bispecifična At, upotrebom 5 miševa po grupi. Retro-orbitalno uzorkovanje krvi je uvek uzimano u sitim vremenskim tačkama.
[0374] Nakon uzimanja uzoraka, urađena je analiza seruma. Koncentracije humanog IgG u uzorcima seruma određivane su elektrohemiluminescentnom imunoanalizom upotrebom MESO Scale Discovery (MSD) sistema. Streptavidinske MSD ploče obložene su sa 50 µL/bunariću biotiniziranog F(ab’)2 kozjeg anti hu IgG (H L, Jackson lot 109-066-08) koncentracije 2 µg/ml, pa su inkubirane stavljanjem u Starting Block T20 (Thermo) preko noći, na 4°C. Ploče su zatim isprane sa PBS puferom i uzorci su razblaživani u 10% mišjem serumu (Bioreclamations, NY) u Starting Block-u T20. Na svakoj ploči je postavljeno i za standardnu krivu svakog ispitivanog jedinjenje, sa serijskim dvostrukim razblaženjima, a polažeći od koncentracije 0,1 mg/ml. Ploče su inkubirane 2-3 h, na ST i na šejkeru, a zatim su isprane i inkubirane sa 2 µg/mL MSD-TAG (anti-humani IgG mAt, obeležen rutenijumom, R10Z8E9, MSD) u toku 1 h, na ST, uz treskanje. Ploče su isprane i konačno je dodato 200 µL MSD pufera za očitavanje (MSD), pa su ploče očitane uptorebom MSD Sector Imager 6000.
[0375] Da bi se utvrdilo da li PK uzorci seruma imaju uočlјive imunološke titre koji mogu uticati na PK ispitivanih uzoraka, urađen je ELISA test na Maxisorb pločama (Nunc) obloženim sa odgovarajućim ispitivanim antitelim u koncentraciji od 10 µg/mL, nakon inkubacije preko noći na 4°C. Uzorci seruma su razblaženi u 1% BSA-PBS-u, pa su inkubirani na pločama tokom 2-3 h uz mućkanje na ST. Za detekotvanje vezanih antitela je upotrebljen magareći anti-mišji IgG konjugovan sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch), nakon čega je sledio razvijanje dodavanjem 3,3’,5,5'-tetrametilbenzidina (Fitzgerald) kao supstrata. Ploče su očitane i spektorofotometrijska očitavanja koja su bila tri puta veća od vrednosti za pufer ili kontrolni serum, smatrana su pozitivnima. Imunski titri su izraženi kao 1/razblaženje seruma. Uočeno je i odsustvo imunskihi titara (podaci nisu prikazani).
[0376] Konačno, određena je farmakokinetika molekula. Proračuni terminalnog poluživota (t1/2) faze eliminacije za PK studije su određeni upotrebom jednofaznog eksponencijalnog modela raspadanja
1 1
praćenog linearnom regresijom sa prirodnim logaritmom koncentracije u odnosu na vreme, upotrebom kompjuterskog programa Prism, vezije 5.01 (GraphPad Softvare, Inc.). Izbačeni su dvofazni modeli pošto je za svaki ispitivani model najbolјe odgovarao jednofazni model eksponencijalnog raspada, što je utvrđeno odsustvom značajnosti u F testu dodatne sume kvadrata (p>0,05) kod većine životinja. Model nelinearnog raspadanja najmanjih kvadrata je ponderisan faktorom 1/podešena koncentracija. Izračunavanja poluživota faze eliminacije su rađena potrebom formule t1/2 = ln2/β, gde je β nagib linije dobijene regresionom analizom sa postupkom najmanjih kvadrata počevši od prve doze.
[0377] U PK studiji koja je ovde opisana, vrednost terminalnog poluživota za antitelo je određena uzimanjem proseka t1/2 vrednosti izračunatih za svaku životinju u ispitivanoj grupi. Vrednosti iz studije koje su iskakale su identifikovane kao životinje kod kojih je titar mišjeg anti-humanog IgG bio ili veći od 1 do 1000 oko 7d nakon prime doze ili kod kojih je početna vrednost seruma bila više nego dvostruko manja od vrednosti za ostale miševe u grupi, moguće usled primene nepotpune doze.
[0378] Pretpostavke za humani PK na osnovu podataka dobijenih za miševe zasnivao se na utvrđenim razlikama u poluživotu kod huFcRn-transgenih miševa u odnosu na ljude za panel od osam humanih IgG antitela za koje se veruje da na njih neće značajno uticati ciljano vezivanja bilo u mišu ili kod ljudi. Na osnovu ovih analiza, procenjeno je da bi terminalni poluživot CD123 x CD3 bispecifičnih At bio 2-4 puta duži od onoga koji je detektovan kod huFcRn-transgenih miševa, uz ekstrapolaciju koja pretpostavlјa da je uticaj cilјnog vezivanja na klirens uporediv kod miševa i lјudi. Tabela 24 sažeto prikazuje uočene vrednosti poluživota kod miševa za razne varijante bispecifičnih antitela, kao i odgovarajuće pretpostavljenje vrednosti kod ljudi koje su odraz navedene ekstrapolacije. Pošto je dobro poznato da postupak predviđanja PK kod ljudi, zasnovan na alometijskoj skali između vrsta, još uvek nije validiran upotrebom mišjih PK podataka, alometrijska skala nije upotrebljena za ekstrapolacije. Rezultati PK studije su prikazani na Slici 43, kao zavisnost koncentracije u serumu u odnosu na vreme. PK profili pokazuju linearan pad koncentracije u serumu tokom vremenskog perioda od 28 dana. Procenjene vrednosti poluživota kod miša za sva CD123 x CD3 bispecifična antitela At bila su bile slične između Dana 5,2-6,6. Zabeleženi su minimalni imunski titri (<1:40) u svim grupama. PK podaci za miša (sa srednjim vrednostima /- standardnim odstupanjima), zajedno sa pretpostavkom kliensa i vrednosti poluživota kod ljudi sumarno su prikazani u Tabele 24. Predviđene vrednosti poluživota kod ljudi pretpostavlјaju da ciljano vezivanje kod lјudi nije veće nego kod miševa.
[0379] IgG4-PAA bispecifično antitelo At pokazalo je slične vrednosti između I3RB2 i I3RB18 grupa kod miševa. Izračunavanja poluživota faze eliminacije kod miša je određivano upotrebom jednofaznog eksponencijalnog modela uz linearnu regresiju, upotrebom prirodnogh logaritma koncentracija u odnosu na vreme, kao što je opisano. Izračunate vrednosti poluživota za osam bispecifičnih antitela kod Tg32 hemi miševa su bile: 3978, 6,6 /- 0,7 dana; 7955, 5,2 /- 0,4 dana; 7959, 6,6 /- 0,6 dana; 9958, 6,4 /- 0,7 dana; 8876, 4,1 /- 0,7 dana; 4435, 5,4 /- 1,0 dana; 8747, 6,4 /- 0,4 dana; 5466, 5,6 /- 0,1 dana. Predviđene PK vrednosti kod ljudi na osnovu podataka iz miža, zasnivale su na zapažanju razlika u poluživotu kod huFcRn-transgenih miševa i lјudi. Na osnovu ovih analiza, procenjeni terminalni poluživot kod lјudi za CD123xCD3 bispecifična antitela je bio 2 do 4 puta duži od onog koji je uočen u huFcRn-transgenim miševima, uz pretpostavku da je uticaj ciljanog vezivanja na klirens uporediv kod miševa i lјudi. Tabela 24 sumarno primazuje uočene vrednosti poluživota kod miševa varijante Bispecifičnih antitela, kao i odgovarajuće pretpostavljene vrednosti za ljude koji odražavaju ovu pretpostavku.
1 2
Tabela 24. Sažet prikaz PK za CD123 x CD3 IgG4-PAA bispecifična At
1
[0380] Rezultati PK studija sa CD123XCD3 bispecifičnim antitelima kod miša, pokazuju da se uočene vrednosti t1/2 u T32 hemi miševima mogu povoljno uporediti sa 8 kliničkih antitela čiji je profil dobijen na isti način. (Tam i saradnici, MAbs (2013) 5(3):3987-405).
1 4
1
1
�
1
�
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
�
2
24
24
24
24
��
24
24
�
21
22
2
��
2
2
�
2
2
2
21
22
2
24
�
2
2
�
2
2
21
22
2
��
2
2
�
�
2
2
21
22
2
��
2
2
2
2
2
2
21

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji obuhvataju teški i laki lanac koji sadrže:
a. CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 012, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 013, CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 014, CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 015, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 016 i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 017; ili
b. CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 051, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 052, CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 053, CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 024, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 025 i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 054.
2. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, gde teški lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120, i laki lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165.
3. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, gde teški lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i laki lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168.
4. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, gde je navedeno antitelo ili fragment koji vezuje antigen IgG1 ili IgG4 izotipa.
5. Izolovano CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo, ili fragment koji vezuje antigen, koji sadrže prvi teški lanac (HC1), drugi teški lanac (HC2), prvi laki lanac (LC1) i drugi laki lanac (LC2), tako da HC1 i LC1 par obrazuje prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD123 (IL3-Rα), dok HC2 i LC2 par obrazuje drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3 ili njegov CD123 (IL3 -Rα) x CD3-bispecifičan vezujući fragment, pri čemu:
i) HC1 i LC1 sadrže bilo koji od sledećih parova:
a. SEQ ID NO: 203 i SEQ ID NO: 204 ili
b. SEQ ID NO: 205 i SEQ ID NO: 206, tim redom; i
ii) HC2 i LC2 sadrže bilo koji od sledećih parova:
a. SEQ ID NO: 193 i SEQ ID NO: 194,
b. SEQ ID NO: 195 i SEQ ID NO: 196,
c. SEQ ID NO: 197 i SEQ ID NO: 198,
2 2
d. SEQ ID NO: 199 i SEQ ID NO: 200 ili
e. SEQ ID NO: 201 i SEQ ID NO: 202, tim redom.
6. Bispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 5, gde HC1 sadrži SEQ ID NO: 203, i LC1 sadrži SEQ ID NO: 204, i HC2 sadrži SEQ ID NO: 193 i LC2 sadrži SEQ ID NO: 194.
7. Bispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 5, gde HC1 sadrži SEQ ID NO: 205, i LC1 sadrži SEQ ID NO: 206, i HC2 sadrži SEQ ID NO: 193 i LC2 sadrži SEQ ID NO: 194.
8. Izolovano CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo ili CD123 (IL3-Rα) x CD3-bispecifičan vezujući fragment koji sadrži:
a) prvi teški lanac (HC1);
b) drugi teški lanac (HC2);
c) prvi laki lanac (LC1); i
d) drugi laki lanac (LC2),
pri čemu HC1 i LC1 par obrazuje prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD123 (IL3-Rα), dok HC2 i LC2 par obrazuje drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3, pri čemu
a. u uparenom teškom i lakom lancu koji imunospecifično vezuje CD3, navedeni teški lanac (HC2) sadrži SEQ ID NO: 184, i navedeni laki lanac (LC2) sadrži SEQ ID NO: 190 i
b. u uparenom teškom i lakom lancu koji imunospecifično vezuje CD123,
i. navedeni teški lanac (HC1) sadrži SEQ ID NO: 120, i navedeni laki lanac (LC1) sadrži SEQ ID NO: 165 ili
ii. navedeni teški lanac (HC1) sadrži SEQ ID NO: 136, i navedeni laki lanac (LC1) sadrži SEQ ID NO: 168.
9. Izolovana ćelija koja eksprimira antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8.
10. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8, za upotrebu u postupku lečenja kancera.
11. CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifičan vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 5 do 8, za upotrebu u postupku inhibicije rasta ili proliferacije ćelija kancera, pri čemu postupak obuhvata:
primenu terapijski efektivne količine CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta da bi se inhibirali rast ili proliferacija ćelija kancera.
12. CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifičan vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 5 do 8, za upotrebu u postupku preusmeravanja T ćelije na ćeliju kancera koja eksprimira CD123, pri čemu postupak obuhvata:
primenu terapijski efektivne količine CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta za preusmeravanje T ćelije na kancer.
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži CD123 (IL3-Rα) x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifičan vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 5 do 8 i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
14. Izolovan sintetski polinukleotid koji kodira antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 5 do 8.
15. Komplet koji sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 i pakovanje za iste.
16. Bispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva od 5 do 8, pri čemu se navedeno bispecifično antitelo ili fragment koji vezuje antigen imunospecifično vezuju za CD123 SP2 (IL-3Ra) i CD123 SP1 (IL3Ra).
2 4
RS20200573A 2014-09-05 2015-09-03 Agensi koji vezuju cd123 i njihove upotrebe RS60305B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462046682P 2014-09-05 2014-09-05
EP15766973.0A EP3189081B1 (en) 2014-09-05 2015-09-03 Cd123 binding agents and uses thereof
PCT/US2015/048316 WO2016036937A1 (en) 2014-09-05 2015-09-03 Cd123 binding agents and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60305B1 true RS60305B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=54150667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200573A RS60305B1 (sr) 2014-09-05 2015-09-03 Agensi koji vezuju cd123 i njihove upotrebe

Country Status (39)

Country Link
US (1) US9850310B2 (sr)
EP (2) EP3722315A1 (sr)
JP (2) JP6805130B2 (sr)
KR (1) KR102540192B1 (sr)
CN (1) CN107074956B (sr)
AR (1) AR101765A1 (sr)
AU (1) AU2015311931B2 (sr)
CA (1) CA2959171C (sr)
CL (1) CL2017000515A1 (sr)
CO (1) CO2017002196A2 (sr)
CR (1) CR20170079A (sr)
CY (1) CY1122858T1 (sr)
DK (1) DK3189081T3 (sr)
EA (1) EA037647B1 (sr)
EC (1) ECSP17020812A (sr)
ES (1) ES2791249T3 (sr)
HR (1) HRP20200745T1 (sr)
HU (1) HUE048791T2 (sr)
IL (1) IL250770B (sr)
JO (1) JO3568B1 (sr)
LT (1) LT3189081T (sr)
MA (2) MA40609B1 (sr)
ME (1) ME03724B (sr)
MX (1) MX384424B (sr)
MY (1) MY186337A (sr)
NI (1) NI201700025A (sr)
PE (1) PE20171556A1 (sr)
PH (1) PH12017500472A1 (sr)
PL (1) PL3189081T3 (sr)
PT (1) PT3189081T (sr)
RS (1) RS60305B1 (sr)
SG (1) SG11201701599UA (sr)
SI (1) SI3189081T1 (sr)
SM (1) SMT202000253T1 (sr)
TW (1) TWI693233B (sr)
UA (1) UA120060C2 (sr)
UY (1) UY36289A (sr)
WO (1) WO2016036937A1 (sr)
ZA (1) ZA201702369B (sr)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110066339A (zh) * 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
KR102680151B1 (ko) 2015-01-23 2024-07-03 사노피 항-ｃｄ3 항체, 항-ｃｄ123 항체, 및 ｃｄ3 및/또는 ｃｄ123에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
US10100118B2 (en) 2015-04-08 2018-10-16 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind CD123
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
PT3313884T (pt) * 2015-06-29 2021-02-25 Immunogen Inc Anticorpos anti-cd123 e conjugados e derivados dos mesmos
IL319047A (en) 2015-08-28 2025-04-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
BR112018011781A2 (en) 2015-12-14 2018-12-04 Macrogenics, Inc. bispecific molecule having one or more epitope binding sites capable of immunospecific binding to (one) pd-1 epitope (s) and one or more epitope binding sites capable of immunospecific binding to (one) epitope (s) -4, and pharmaceutical composition
CN119060177A (zh) 2016-05-20 2024-12-03 哈普恩治疗公司 单结构域血清白蛋白结合蛋白质
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
CN116987189A (zh) * 2016-05-20 2023-11-03 哈普恩治疗公司 单链可变片段cd3结合蛋白质
CA3025995C (en) 2016-06-06 2023-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Fusion proteins for ophthalmology with increased eye retention
KR20190015520A (ko) 2016-06-07 2019-02-13 마크로제닉스, 인크. 조합 치료법
TWI790206B (zh) * 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
TWI781108B (zh) * 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
CN107840889A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 上海吉倍生物技术有限公司 高亲和力的抗cd123抗体及其应用
MX2019003225A (es) * 2016-09-21 2019-06-10 Aptevo Res & Development Llc Proteínas de unión a cd123 y composiciones y métodos relacionados.
AU2017363302A1 (en) 2016-11-23 2019-06-27 Harpoon Therapeutics, Inc. PSMA targeting trispecific proteins and methods of use
MX2019006043A (es) 2016-11-23 2019-09-26 Harpoon Therapeutics Inc Proteína de unión de antígeno prostático específico de membrana.
JP7685735B2 (ja) 2016-12-02 2025-05-30 アンヘレス セラピューティクス インコーポレイテッド 合成免疫受容体およびその使用方法
CA3049689A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for augmenting antibody mediated receptor signaling
CN110325209A (zh) 2017-02-24 2019-10-11 宏观基因有限公司 能够结合cd137和肿瘤抗原的双特异性结合分子及其用途
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGEN BINDING PROTEIN
WO2018166461A1 (en) * 2017-03-14 2018-09-20 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Dual-target fusion proteins comprising the fc portion of an immunoglobulin
SG10202107880XA (en) 2017-05-12 2021-09-29 Harpoon Therapeutics Inc Mesothelin binding proteins
BR112019023856A2 (pt) 2017-05-12 2020-06-09 Harpoon Therapeutics Inc proteínas triespecíficas que visam msln e métodos de utilização
WO2019034580A1 (en) 2017-08-14 2019-02-21 Morphosys Ag HUMANIZED ANTIBODIES FOR CD3
US20210061911A1 (en) * 2017-09-07 2021-03-04 Macrogenics, Inc. Dosing Regiments of Bi-Specific CD123 x CD3 Diabodies in the Treatment of Hematologic Malignancies
BR112020007196A2 (pt) 2017-10-13 2020-12-01 Harpoon Therapeutics, Inc. proteínas triespecíficas e métodos de uso
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
AU2018357221B2 (en) * 2017-10-27 2025-08-28 Pfizer Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates specific for CD123 and uses thereof
AU2018385409A1 (en) 2017-12-12 2020-07-02 Macrogenics Inc. Bispecific CD 16-binding molecules and their use in the treatment of disease
SG11202007572VA (en) 2018-02-15 2020-09-29 Macrogenics Inc Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
CN120399075A (zh) * 2018-03-14 2025-08-01 诺维莫尼公司 抗-CD3ε抗体及其应用方法
JP2021523192A (ja) 2018-05-14 2021-09-02 ハープーン セラピューティクス，インク． 免疫グロブリン分子の条件的活性化のための結合部分
KR20220080044A (ko) * 2018-05-16 2022-06-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 암 요법에 사용하기 위한 bcma/cd3 및 gprdc5d/cd3 이중특이성 항체
JOP20190116A1 (ar) * 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
AU2019274657A1 (en) 2018-05-24 2020-12-10 Janssen Biotech, Inc. PSMA binding agents and uses thereof
JOP20200295A1 (ar) 2018-05-24 2020-11-22 Janssen Biotech Inc أجسام أحادية النوعية ومتعددة النوعية مضادة لـ tmeff2 المضاد واستخداماتها
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
EP3882266A4 (en) * 2018-10-17 2022-07-27 Good T Cells, Inc. LRIG-1 PROTEIN SPECIFIC BINDING MOLECULE AND USE THEREOF
TWI874341B (zh) 2018-12-18 2025-03-01 美商健生生物科技公司 產生異二聚體抗體之方法
JP7566766B2 (ja) * 2019-03-11 2024-10-15 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗Ｖβ１７／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体
AR118720A1 (es) 2019-04-19 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar el cáncer de próstata con un anticuerpo anti-psma / cd3
BR112021022089A2 (pt) * 2019-05-08 2022-02-08 Janssen Biotech Inc Materiais e métodos para modulação da imunidade mediada por células t
US12516128B2 (en) 2019-05-14 2026-01-06 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use
CN113874398B (zh) 2019-05-21 2025-08-01 诺华股份有限公司 Cd19结合分子及其用途
CN113912697B (zh) * 2019-07-24 2023-05-30 暨南大学 靶向cd133的结合蛋白与应用
GB201912681D0 (en) 2019-09-04 2019-10-16 Eth Zuerich Bispecific binding agent that binds to cd117/c-kit and cd3
BR112022016550A2 (pt) 2020-02-21 2022-11-16 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de ligação a flt3 e métodos de uso
MX2022010228A (es) 2020-02-21 2022-09-19 Macrogenics Inc Moleculas de union a cd137 y usos de las mismas.
CA3171113A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Patrick John DOONAN Materials and methods for binding siglec-3/cd33
WO2021236841A2 (en) 2020-05-19 2021-11-25 The Regents Of The University Of California Conjugate polypeptides and vaccines for inducing immune responses
WO2021234560A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising a t cell redirection therapeutic and a vla-4 adhesion pathway inhibitor
WO2022056192A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for modulating beta chain mediated immunity
WO2022087458A1 (en) * 2020-10-23 2022-04-28 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions with cd8 antigen binding molecules for modulating immune cell function
MX2023007901A (es) 2020-12-31 2023-07-11 Sanofi Sa Acopladores de celulas asesinas naturales (nk) multifuncionales que se unen a nkp46 y a cd123.
FI4284512T3 (fi) 2021-01-28 2025-05-22 Regeneron Pharma Koostumuksia ja menetelmiä sytokiinien vapautumisoireyhtymän hoitamiseksi
MX2023013791A (es) 2021-05-18 2024-02-13 Janssen Biotech Inc Composiciones que comprenden una terapéutica de redirección de células t y una terapéutica anti-cd44.
IL308609A (en) 2021-05-19 2024-01-01 Asher Biotherapeutics Inc IL-21 polypeptides and target constructs
AU2022326544A1 (en) * 2021-08-09 2024-02-29 Merck Patent Gmbh Proteins that decouple t cell-mediated tumor cytotoxicity from release of pro-inflammatory cytokines
WO2023138666A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Utc Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Circular rna and use thereof
CA3247475A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DESTRUCTION OF UNIVERSAL TUMOR CELLS
WO2023227790A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Sanofi Natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and bcma variants with fc-engineering
AU2024223918A1 (en) 2023-02-17 2025-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Induced nk cells responsive to cd3/taa bispecific antibodies

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6177078B1 (en) 1995-12-29 2001-01-23 Medvet Science Pty Limited Monoclonal antibody antagonists to IL-3
EP1538206B1 (en) 1997-09-16 2010-03-24 Centocor, Inc. Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2008511337A (ja) 2004-09-02 2008-04-17 ジェネンテック・インコーポレーテッド ヘテロ多量体分子
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2012-06-29 Генмаб А/С Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
JP2011507519A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ｐＩＸ又はｐＶＩＩへの融合を介したヒトデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリの設計及び作製、ベクター、抗体、及び方法
EP2949673A1 (en) * 2009-04-27 2015-12-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-il-3ra antibody for use in treatment of blood tumor
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CN102597775A (zh) * 2009-09-25 2012-07-18 佐马技术有限公司 筛选方法
CN110066339A (zh) 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
NZ604510A (en) 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use
HUE047228T2 (hu) 2010-11-05 2020-04-28 Zymeworks Inc Stabil heterodimer antitest-kialakítás az FC doménben mutációval
JP6326371B2 (ja) 2011-11-04 2018-05-16 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメインにおける変異を有する安定なヘテロ二量体抗体デザイン
EP4053162A1 (en) * 2012-05-18 2022-09-07 Aptevo Research and Development LLC Bispecific scfv immunofusion (bif) binding to cd123 and cd3

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016036937A1 (en) 2016-03-10
UY36289A (es) 2016-04-01
CO2017002196A2 (es) 2017-07-28
MA53145A (fr) 2021-05-19
SG11201701599UA (en) 2017-03-30
JP6805130B2 (ja) 2020-12-23
CA2959171C (en) 2023-11-14
JO3568B1 (ar) 2020-07-05
JP2021050216A (ja) 2021-04-01
CR20170079A (es) 2017-04-27
TWI693233B (zh) 2020-05-11
MX384424B (es) 2025-03-14
CY1122858T1 (el) 2021-05-05
TW201625687A (zh) 2016-07-16
ZA201702369B (en) 2018-12-19
EA037647B1 (ru) 2021-04-27
KR20170049554A (ko) 2017-05-10
US20160068605A1 (en) 2016-03-10
EA201790530A1 (ru) 2018-03-30
US9850310B2 (en) 2017-12-26
DK3189081T3 (da) 2020-05-04
ECSP17020812A (es) 2018-07-31
PT3189081T (pt) 2020-05-25
CN107074956A (zh) 2017-08-18
IL250770A0 (en) 2017-04-30
HRP20200745T1 (hr) 2020-08-07
ES2791249T3 (es) 2020-11-03
JP2017529838A (ja) 2017-10-12
AU2015311931B2 (en) 2020-09-03
ME03724B (me) 2021-01-20
CN107074956B (zh) 2021-11-26
EP3189081B1 (en) 2020-02-19
PL3189081T3 (pl) 2020-10-05
SMT202000253T1 (it) 2020-07-08
BR112017004322A2 (pt) 2017-12-05
HUE048791T2 (hu) 2020-09-28
MX2017002891A (es) 2017-10-11
AR101765A1 (es) 2017-01-11
LT3189081T (lt) 2020-05-11
UA120060C2 (uk) 2019-09-25
PH12017500472A1 (en) 2017-07-31
MY186337A (en) 2021-07-13
MA40609B1 (fr) 2020-05-29
AU2015311931A1 (en) 2017-03-16
PE20171556A1 (es) 2017-10-27
IL250770B (en) 2020-10-29
EP3189081A1 (en) 2017-07-12
NI201700025A (es) 2017-06-22
CA2959171A1 (en) 2016-03-10
CL2017000515A1 (es) 2018-03-16
SI3189081T1 (sl) 2020-07-31
KR102540192B1 (ko) 2023-06-02
EP3722315A1 (en) 2020-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7469432B2 (ja) 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体、ｇｐｒｃ５ｄとｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、及びその使用
KR102540192B1 (ko) Cd123 결합제 및 그의 용도
KR102890745B1 (ko) Bcma와 cd3에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자인 항-bcma 항체, 및 이들의 용도
WO2017079121A2 (en) Anti-il1rap antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind il1rap and cd3, and uses thereof
HK40039447A (en) Cd123 binding agents and uses thereof
HK1240948B (zh) Cd123结合剂及其用途
BR112017004322B1 (pt) ANTICORPO BIESPECÍFICO CD123 (IL3-RA) x CD3 ISOLADO, OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, USOS DOS MESMOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E KIT
HK1240948A1 (en) Cd123 binding agents and uses thereof
BR122024008695A2 (pt) Anticorpos anti-gprc5d, anticorpo isolado biespecífico para gprc5d x cd3, usos dos mesmos, composição farmacêutica, métodos para gerar os ditos anticorpos, célula e polinucleotídeos sintéticos isolados, e kit
BR122024008676A2 (pt) Anticorpos anti-gprc5d, anticorpo isolado biespecífico para gprc5d x cd3, usos dos mesmos, composição farmacêutica, métodos para gerar os ditos anticorpos, célula e polinucleotídeos sintéticos isolados, e kit
BR122024008681A2 (pt) Anticorpos anti-gprc5d, anticorpo isolado biespecífico para gprc5d x cd3, usos dos mesmos, composição farmacêutica, métodos para gerar os ditos anticorpos, célula e polinucleotídeos sintéticos isolados, e kit