RS60274B1

RS60274B1 - Proteini antiportera tonoplast protona/šećer i njihova upotreba za povećanje koncentracije saharoze saharoznog skladišnog organa biljke

Info

Publication number: RS60274B1
Application number: RS20200358A
Authority: RS
Inventors: Wolfgang Koch; Norbert Sauer; Petra Wirsching; Benjamin Pommerrenig; Ekkehard Neuhaus; Benjamin Jung; ULF-INGO FLüGGE; Frank Ludewig; Nicole Wöstefeld; Irene Marten; Rainer Hedrich; Alexander Schulz
Original assignee: Kws Saat Se & Co Kgaa; Suedzucker Ag
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2020-06-30
Also published as: MX368206B; AR100122A1; JP2017513519A; US20210238620A1; CA2945416C; HRP20200471T1; LT3129394T; CN106471124B; BR112016023624A2; US12173298B2; MX2019011224A; MX2016013211A; HUE049853T2; EA201691953A1; AU2015245634A1; PT3129394T; ZA201607612B; CA2945416A1; JP6789922B2; US10961543B2

Description

[0001] Tonoplastni protonski/šećerni antiporter proteini i njihova upotreba radi pove ćanja koncentracije saharoze kod organa za skladištenje saharoze kod biljaka.

[0002] Predmetni pronalazak je iz polja industrijske proizvodnje šećera iz useva i odnosi se na povećanje prinosa saharoze kod poljoprivrednog uzgoja useva. Konkretno, pronalazak se odnosi na tonoplastne protonske/šećerne antiporter proteine, konkretnije tonoplastne protonske/saharozne antiporter proteine i nukleinske kiseline koje ih kodiraju i njihovu upotrebu za povećanje koncentracije saharoze kod organa za skladištenje saharoze kod biljnih useva.

[0003] Sa jedne strane, šećer je kolektivni naziv za sve mono i disaharide sa slatkim ukusom, a sa druge strane, komercijalno je uobičajen naziv za disahard saharozu. Saharoza je obični kućni ili granulisani šećer i takođe je poznat kao sukroza. Saharoza je dimer jednog molekula α-D-glukoze i β-D-fruktoze, koji su međusobno povezani putem α,β-1,2-glikozidne veze.

[0004] Saharoza se formira u biljkama putem fotosinteze. Biosinteza saharoze se odvija u citoplazmi biljnih ćelija. U tu svrhu, dva triozna fosfata, gliceraldehid-3-fosfat i dihidroksiaceton fosfat, koji je pojavljuju kao neto rezultat asimilacije ugljenika fotosinteze (Kalvinov ciklus), su izvezeni iz hloroplasta u citosol. U citosolu biljne ćelije iz trioznih fosfata nastaju monosaharidi UDP-glukoza i fruktoza 6-fosfat. U tu svrhu, prvi fruktoza-1,6-bisfosfat je formiran kondenzacionom reakcijom gliceraldehid-3-fosfata i dihidroksiaceton fosfata. Fruktoza-1,6-bisfosfat zatim reaguje da se formira fruktoza-6-fosfat putem defosorilacije. Fruktoza-6-fosfat može takođe formirati glukozu-6-fosfat izomerizacijom, koja, nakon prethodne izomerizacije koja formira glukozu-1-fosfat, reaguje sa uridin trifosfatom (UTP) i formira uridin difosfatnu glukozu (UDP-glukoza). Naknadna kondenzacija UDP-glukoze i fruktoza-6-fosfata koja formira saharoza-6-fosfat je katalisana enzimom saharozno-fosfatne sintaze. Neophodna energija je obezbe đena eliminacijom uridin difosfata (UDP). Konačno, fosfatni ostatak saharoza-6-fosfata se cepa u nepovratnoj reakciji enzimom saharoza-fosfat-fosfataza tako da nastaje saharoza.

[0005] Saharoza je disaharid koji se ne redukuje i zbog toga je najvažniji transportni šećer kod biljaka. Saharoza je sintetisana kao nova u lišću biljaka i transportovana putem floema u njihove organe skladištenja, gde se akumulira u vakuolama biljnih ćelija kao hranljivi sastojak i izvor energije.

[0006] Od značaja za industrijsku proizvodnju saharoze su posebno šećerna repa (Beta vulgaris subsp. vulgaris), šećerna trska (Saccharum officinarum) i šećerna palma (Arenga pinnata, syn.: Arenga saccharifera Labil., uglavnom u Indoneziji). U manjim količinama, saharoza se takođe dobija iz soka javorovog šećera (Acer saccharum). Ove biljke su korišćene za proizvodnju saharoze zbog njihovog izuzetno visokog sadržaja saharoze.

[0007] U šećernoj trsci postoje šećeri - uglavnom saharoza - u proporciji od obično 10 do 20% u srži biljke (njen organ za skladištenje saharoze). Šećer iz trske se dobija kristalizacijom i rafiniranjem biljnog soka dobijenog ceđenjem.

[0008] Šećerna repa je dvogodišnja biljka, koja stvara zalihu šećera u telu repe u prvoj godini, koja se koristi kao hrana cvetajuće biljke u drugoj godini. Šećer se obično proizvodi od čipova šećerne repe u ekstrakcionom procesu sa vodom. Ekstrakt može zatim biti tretiran sa kalcijum oksidom kako bi precipitirao kiseline biljke kao što je oksalna ili vinska kiselina i proteine. Višak limeta se odvaja uvođenjem ugljen dioksida. Naknadnom evaporacijom vode iz šećernog rastvora u vakumu se dobija sirupasti rastvor. Kristališući šećer je odvojen od preostalog braon sirupa centrifugacijom. Ostatak, melase, se koristi kao hrana za stoku ili se koristi za alkoholnu fermentaciju. Prečišćavanje šećera (rafiniranje) se vrši rekristalizacijom, filtracijom i evaporacijom u vakumu.

[0009] Tokom decenija napora na kultivisanju biljaka koje skladište saharozu, mogla bi se postići suštinska povećanja prinosa organa za skladištenje saharoze i koncentracije saharoze. Na primer, kod sorti šećerne repe koje se trenutno uzgajaju radi proizvodnje šećera, koncentracija saharoze tela repe je oko 15 do 20% mase, na osnovu sveže mase tela korena. Ipak, dostignute koncentracije saharoze jo š uvek nisu zadovoljavajuće.

[0010] Stoga je cilj predmetnog pronalaska da se biljkama obezbede veće koncentracije saharoze i da se pronađu metodi pomoću kojih koncentracija saharoze kod biljaka, naročito kod šećerne trske i šećerne repe, može biti povećana.

[0011] Internacionalna aplikacija objavljena kao WO 2010/072210 A1 otkriva metod za povećanje saharoznog prinosa kod poljoprivrednog uzgoja šećerne repe. U pomenutom postupku, koriste se biljke šećerne repe ili šećerne trske čiji genetski sklop je usmeren na smanjenje enzimske aktivnosti invertaze. Za ovu svrhu, nukleinska kiselina koja je u biljnoj ćeliji pogodna za smanjenje enzimske aktivnosti invertaze, je korišćena za formiranje skladišnog organa saharoze kod biljke, pri čemu koncentracija saharoze je povećana u poređenju sa koncentracijom saharoze nemodifikovanog kontrolnog organa za skladištenje saharoze istog genotipa u uporedivoj fazi razvoja.

[0012] Vakuole biljaka imaju centralnu ulogu kod dugoročnog ili kratkoročnog skladištenja šećera, jer vakuola kao organela zauzima zapreminu od oko 90% u fotosintetski aktivnoj biljnoj ćeliji (Martinola, E. et al. (2007) "Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism", J. Exp. Bot. 58: 83-102). Usled njihovih dimenzija vakuole su iz tog razloga od neizmernog značaja za skladištenje šećera (Neuhaus, H.E. (2007) "Transport of primary metabolites across the plant vacuolar membrane", FEBS Lett 581: 2223-2226). Skladišna tkiva kao što je glavni koren šećerne repe (Beta vulgaris) i srž šećerne trske (Saccharum officinarum) akumuliraju velike količine saharoze u vakuolama ćelija njihovih skladišnih organa kako bi ih koristila kao izvor energije za metabolizam biljke.

[0013] Kod različitih monokotiledonih i dikotiledonih biljaka kao što je Nedicago (identifikacioni broj AC131026), Vitis vinifera (identifikacioni broj AAX47312) i riža (Oryza sativa; identifikacioni broj Os02g13560.) otkriveni su proteini koji su odgovorni za transport šećera iz citoplazme biljne ćelije u njene vakuole. U biljci Arabidopsis, identifikovan je gen, čiji proteinski proizvod je transporter šećera, koji se nalazi u vakuolarnoj membrani fotosintetski aktivnih ćelija i može uvesti glukozu iz citosola u vakuolu (Wormit, A. et al. (2006) "Molecular identification and physiological characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolar sugar transport", Plant Cell 18: 3476-3490). Ovaj transportni protein poznat kao tonoplastni monosaharidni transporter (TMT) se nalazi u membrani vakuole, tonoplastu. Tonoplastni monosaharidni transportni (TMT) protein obuhvata tri izoforme u Arabidopsis thaliana, koje se nazivaju AtTMT1, AtTMT2 i AtTMT3. Geni za AtTMT1 i AtTMT2 imaju ekspresione obrasce specifične za tkivo i ćeliju, dok je AtTMT3 gen eksprimiran samo veoma slabo. Putem TMT genskih nokauta bi moglo biti prikazano da su tako modifikovane biljke akumulirale značajno manje glukoze i fruktoze u njihovim vakuolama u poređenju sa biljkama divlje vrste. Međutim, što se tiče akumulacije saharoze, nisu uočene razlike između biljaka divlje vrste i TMT genskih nokauta.

[0014] Tonoplastni monosaharidni transporter TMT1 iz Arabidopsis thaliana je elektrofiziološki okarakterisan kao protonski vođen glukozni i saharozni antiporter, koji transportuje glukozu i saharozu pri približno istoj specifičnosti kroz vakuolarnu membranu (Schulz, A. et al. (2011) "Proton-driven sucrose symport and antiport are provided by the vacuolar transporters SUC4 and TMT1/2", The Plant Journal 68: 129-136). U istom članku saharozni transportni protein SUC4 Arabidopsis thaliana je okarakterisan kao simporter proton/saharoze, koji bi se takođe trebao nalaziti u vakuolarnoj membrani.

[0015] Internacionalna aplikacija objavljena kao WO 2011/120549 A1 otkriva to da prinos semena može biti povećan, sadržaj proteina i ulja semena se može povećati ili rani rast monokotiledonih iili dikotiledonih biljaka se može pospešiti prekomernom ekspresijom tonoplastnog monosaharidnog transportera AtTMT1 u biljkama. Akumulacija saharoze u organu za skladištenje nije otkrivena.

[0016] U skladu sa ovim, osnovni cilj predmetnog pronalaska je postignut identifikovanjem proteina odgovornih za uvoz šećera u vakuole ćelija korena šećerne repe, konkretno proteina odgovornog za uvoz saharoze u vakuole ćelija korena šećerne repe, što je specifično za saharozu. Sa identifikacijom ovih proteina, konkretno sa identifikacijom prvog saharozno-određenog tonoplastnog proton/šećer antiporter proteina i nukleotidnih sekvenci koje kodiraju za ove proteine, kultivisanje i/ili molekularni genetski metodi za povećanje saharozne koncentracije kod biljaka a samim tim takođe biljaka sa većom koncentracijom saharoze su dati.

[0017] Prema prvom aspektu, opisan je molekul nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein. Poželjno, molekul nukleinske kiseline kodira tonoplastni proton/šećer antiporter protein koji je specifičan za saharozu. U nastavku, takav protonski/šećerni antiporter protein koji je specifičan za saharozu, takođe se naziva i protonski/saharozni antiporter protein.

[0018] Prema drugom aspektu, otkriven je rekombinantni gen koji sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom ili molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein, poželjno tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein. Molekul nukleinske kiseline može biti operativno povezan sa barem jednim regulatornim elementom.

[0019] Prema trećem aspektu, pronalazak se odnosi na vektor ili mobilni genetski element, koji sadr ži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom.Takođe je otkriven i vektor koji sadrži rekombinantni gen u skladu sa drugim aspektom.

[0020] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na eukariotsku ćeliju domaćina ili prokariotsku ćeliju domaćina koja sadrži vektor ili mobilni genetski element u skladu sa trećim aspektom.

[0021] Eukartioska ili prokariotska ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom, poželjno transgen, rekombinantni gen u skladu sa drugim aspektom su takođe opisane.

[0022] Prema sledećem aspektu, opisan je protein koji deluje kao protonski/ šećerni antiporter, koji je poželjno specifičan za saharozu ili poželjno deluje kao tonoplastni protonski/saharozni antiporter.

[0023] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na transgeničnu biljnu ćeliju koja sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom kao transgen, ili vektor ili mobilni genetski element u skladu sa trećim aspektom, i transgeničnu biljku ili njene delove koji sadrže barem jednu takvu transgeničnu biljnu ćeliju.

[0024] Transgenična biljna ćelija koja sadrži rekombinantni gen u skladu sa drugim aspektom kao transgen je takođe opisana.

[0025] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na seme transgenične biljke u skladu sa prethodnim aspektom, pri čemu seme sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom kao transgen, ili vektor ili mobilni genetski element u skladu sa trećim aspektom.

[0026] Seme transgenične biljke koje sadrži rekombinantni gen u skladu sa drugim aspektom kao transgen je takođe otkriveno.

[0027] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metode za proizvodnju transgeničnih biljaka.

[0028] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metode za povećanje koncentracije saharoze u organu za skladištenje saharoze kod biljke.

[0029] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metode za identifikovanje biljke koja je pogodna za generisanje povećane koncentracije saharoze u organu za skladištenje saharoze kod biljke.

[0030] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na oligonukleotide koji su pogodni za kori šćenje kao molekularni markeri za dijagnostičku detekciju molekula nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom.

[0031] Isto tako su otkrivena i antitela koja su dijagnostička za protein koji funkcioniše kao tonoplastni protonski/šećerni antiporter, koji je poželjno specifičan za saharozu, poželjno kao tonoplastni protonski/saharozni antiporter.

[0032] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na korišćenje tonoplastnih protonskih/šećernih antiporter proteina za povećanje koncentracije saharoze u organu za skladištenje saharoze kod biljke.

Slika 1 prikazuje tabelu koja ukazuje na identitete i sličnosti aminokiselinskih sekvenci tri paralognih tonoplastnih monosaharidskih transporterskih (TMT) proteina iz Arabidopsis thaliana sa četiri paralogna tonoplastna šećerna transporterska (TST) proteina iz Beta vulgaris.

Slika 2 prikazuje kladogram koji ilustruje filogenetske odnose tri paralogna tonoplastna monosaharidska transporterska (TMT) proteina iz Arabidopsis thaliana i četiri paralogna tonoplastna šećerna transporterska (TST) proteina iz Beta vulgaris.

Slika 3 prikazuje grafikon koji ilustruje saharoznu koncentraciju glavnog korena dve sorte šećerne repe različite starosti.

Slika 4 prikazuje grafikon koji ukazuje na relativne količine mRNK od četiri paralogna TST gena Beta vulgaris kod dve različite sorte šećerne repe u različitim periodima razvoja.

Slika 5 prikazuje grafikon koji ilustruje koncentraciju različitih šećera u listovima šećerne repe sorte "Belladonna KWS" u različitim periodima razvoja.

Slika 6 prikazuje grafikon koji ukazuje na relativne količine mRNK za četiri paralogna BvTST gena u listovima šećerne repe sorte "Belladonna KWS" u različitim periodima razvoja.

Slika 7 predstavlja grafikon koji ilustruje promenu current gustine indukovanu ra zličitim šećerima (saharidima) u vakuolama prelazno transformisanih ćelija mezofila.

[0033] Izumitelji su identifikovali protein ovde nazvan BvTST2.1 kao jedan od kvantitativno najzastupljenijih proteina vakuolarne membrane ćelija glavnog korena šećerne repe i iznenađujuće otkrili da protein BvTST2.1 može specifično uvesti saharozu iz citosola u vakuole biljnih ćelija kao tonoplastni šećerni transporter. Stoga, ovaj protein i proteini sa istom funkcijom ne predstavljaju samo tonoplastne šećerne transportere (TST), već se takođe nazivaju i tonoplastni saharozni transporteri ili tonoplastni protonski/saharozni antiporter ili tonoplastni protonski/saharozni antiporter proteini, pri čemu "Bv" u skraćenici koja je ovde korišćena označava Beta vulgaris, organizam u kom je ovaj protein prvobitno identifkovan. Izumitelji su identifikovali protein BvTST2.1 kao protonski/šećerni antiporter protein koji je visoko specifičan za saharozu i koji je prvi poznati predstavnik ove biljne familije proteina koji prenose šećer. Dodatno, tri druge paralogne izoforme, BvTST1, BvTST2.2 i BvTST3, koje su verovatno funkcionalno povezane sa poznatim TMT proteinima iz Arabidopsis, su uspešno identifikovane.

[0034] Na osnovu identifikacije ovog novog antiportera specifičnog za saharozu, izumitelji su takođe identifikovali nukleotidne sekvence koje kodiraju tonoplastni protonski/ šećerni antiporter protein i druge izoforme.

[0035] Stoga, otkriveni molekuli nukleinske kiseline kodiraju tonoplastni protonski/ šećerni antiporter protein, poželjno tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein.

[0036] Prema trećem aspektu molekul nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein sadrži molekul nukleinske kiseline izabran iz grupe:

a) molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 2 ili molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima identičnost od najmanje 80% sa nukleotidnom sekvencom u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 2;

b) molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa jednom od nukleotidnih sekvenci u skladu sa a); i

c) molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 1, ili molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid čija aminokiselinska sekvenca ima identičnost od najmanje 80% sa aminokiselinskom sekvencom u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 1.

[0037] Dalje, otkriven je molekul nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein koji sadrži molekul nukleinske kiseline izabran iz grupe:

d) molekul nukleinske kiseline koji se hibridizuje sa molekulom nukleinske kiseline u skladu sa a) ili b); i

e) molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira homolog, analog ili ortolog polipeptida u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 1.

[0038] Slično tome, otkriven je molekul nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein koji sadrži molekul nukleinske kiseline izabran iz grupe:

a) molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 2, ili molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima identičnost od najmanje 80% sa nukleotidnom sekvencom u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 2.

b) molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna jednoj od nukleotidnih sekvenci u skladu sa a);

c) molekul nukleinske kiseline koji se hibridizuje sa molekulom nukleinske kiseline u skladu sa a) ili b);

d) molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 1, ili molekul nukleinske kiseline sa nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija aminokiselinska sekvenca ima identičnost od najmanje 80% sa aminokiselinskom sekvencom u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 1; i

e) molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira homolog, analog ili ortolog polipeptida u skladu sa sekvencionim identifkacionim brojem 1.

[0039] Pojam “molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu” obuhvata ne samo molekule nukleinske kiseline čija se nukleotidna sekvenca sastoji od tada opisane nukleotidne sekvence, ve ć takođe molekule nukleinske kiseline koji dodatno imaju barem jedan nukleotid ili nukleotidnu sekvencu pored tada opisane nukleotidne sekvence.

[0040] Prema alternativnoj i/ili dodatnoj izvedbi molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 1, 3, 5 ili 7. Ipak, molekul nukleinske kiseline može takođe kodirati aminokiselinsku sekvencu u kojoj je barem jedan aminokiselinski ostatak aminokiselinske sekvence supstituisan sa aminokiselinom koja ima slična hemijska svojstva (konzervativna ili polukonzervativna aminokiselinska supstitucija). Kod konzervativne aminokiselinske supstitucije aminokiselina je zamenjena sa drugom aminokiselinom sa sličnim hemijskim svojstvima. Kod polukonzervativne aminokiselinske supstitucije, aminokiselina je zamenjena sa drugom aminokiselinom koja ima sličnu sternu konfirmaciju. Supstitucija poželjno nema dejstva na proteinsku funkciju. Primeri aminokiselinskih supstitucija su Asp i Glu, Leu i Ile, Ala i Val, Arg i Lys, i Phe i Trp.

[0041] Prema alternativnoj i/ili dodatnoj izvedbi, nukleotidne sekvence nukleinskih kiselina i/ili aminokiselinske sekvence kodirane sa nukleotidnim sekvencama imaju identičnost od barem 80%, barem 85%, poželjno barem 90%, naročito poželjno barem 95%, barem 96%, barem 97% ili barem 98%, a najpoželjnije barem 99% sa nukleotidnom sekvencom u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 2, 4, 6 ili 8 ili aminokiselinska sekvenca u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 1, 3, 5 ili 7.

[0042] Pojam “hibridizovanje” kao što je korišćeno ovde znači hibridizovanje pod konvencionalnim uslovima, kao što je opisano u Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), poželjno pod strogim uslovima. Strogi uslovi hibridizacije su, na primer: hibridizovanje u 4 × SSC pri 65 °C a zatim praćeno sa višestrukim ispiranjem 0,1 x SSC pri 65 °C tokom ukupno 1 sata. Manje strogi uslovi hibridizacije su, na primer: hibridizovanje u 4 × SSC pri 37 °C a zatim praćeno sa višestrukim ispiranjem u 1 x SSC pri sobnoj temperaturi. “Strogi uslovi hibridizacije” može takođe značiti: hibridizovanje pri 68 °C u 0,25 M natrijum fosfat, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA i 1% BSA tokom 16 sati a zatim praćeno sa dva ispiranja sa 2 x SSC i 0,1% SDS pri 68 °C.

[0043] Pojmovi “specifično za saharozu” ili “visoko specifično za saharozu” ili “saharozno-specifični transport” ili “saharozno visoko specifični transport” ili “specifičnost za saharozu” ili “saharozna specifičnost” znači da je specifičnost tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina za saharozu nad drugim šećerom je barem 5 puta, 10 puta ili 15 puta, poželjno barem 18 puta, 20 puta, 22 puta, 24 puta, 26 puta ili 28 puta, naročito poželjno barem 30 puta, barem 31 put, barem 32 puta, barem 33 puta, barem 34 puta, barem 35 puta, barem 36 puta, barem 37 puta, barem 38 puta ili barem 39 puta, a najpoželjnije barem 40 puta veća. Dalje, ovo takođe može značiti da je specifičnost tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina za saharozu nad monosaharidom kao što je glukoza ili fruktoza barem 5 puta, 10 puta ili 15 puta, poželjno barem 18 puta, 20 puta, 22 puta, 24 puta, 26 puta ili 28 puta, naročito poželjno barem 30 puta, barem 31 put, barem 32 puta, barem 33 puta, barem 34 puta, barem 35 puta, barem 36 puta, barem 37 puta, barem 38 puta ili barem 39 puta, a najpo željnije barem 40 puta veća. Radi svrhe pronalaska, pojam “”specifično za saharozu” treba shvatiti na način da je specifičnost tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina za saharozu u odnosu na drugačiji šećer barem 5 puta povećana.

[0044] Radi svrhe pronalaska, “homolog” znači protein istog filogenetskog porekla, “analog” znači protein koji vrši istu funkciju, ali ima različito filogenetsko poreklo, i “ortolog” znači protein od drugih vrsta, koji vrši istu funkciju.

[0045] Takođe je otkriven rekombinantni gen koji sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom ili molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja poželjno kodira tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein. Molekul nukleinske kiseline može biti operativno povezan sa barem jednim regulatornim elementom.

[0046] “Regulatorni element” znači nukleotidne sekvence koje nisu deo nukleotidne sekvence koja kodira protein, ali posreduje u ekspresiji nukleotidne sekvence koja kodira protein. Regulatorni elementi uključuju, na primer, promotore, cis-regulatorne elemente, pojačivače, introne ili terminatore. U zavisnosti od tipa regulatornog elementa nalazi se u molekulu nukleinske kiseline pre (tj., 5' od) ili posle (tj., 3' od) nukleotidne sekvence koja kodira protein. Regulatorni elementi su funkcionalni u ćeliji žive biljke.

[0047] Pojam „operativno povezan“ znači da je regulatorni element povezan na takav način sa nukleotidnom sekvencom koja kodira protein, tj. pozicioniran je na takav na čin u odnosu na nukleotidnu sekvencu koja kodira protein na, na primer, molekulu nukleinske kiseline tako da se ekspresija nukleotidne sekvence koja kodira protein pod kontrolom regulatornog elementa može desiti u živoj ćeliji.

[0048] Za svrhu predmetnog pronalaska, „promotor“ je nukleotidna sekvenca koja reguli še ekspresiju gena, i obično se nalazi na 5’ kraju gena i posreduje početak transkripcije RNK polimerazom interakcijom sa određenim proteinima koji vezuju DNK. Primeri promotora koji su funkcionalni u biljnim ćelijama uključuju konstitutivne promotore kao što su virusni promotori, na primer, CaM35S promotor, dvostruki CaM35S promotor, ili biljni promotori kao što su ubikvitin promotori kao što je opisano u EP 0305668 i US 6,528,701. Štaviše, mogu biti korišćeni promotori koji imaju, na primer, specifičnu aktivnost u određenim fazama razvoja ili su inducibilni faktorima životne sredine kao što su biotički ili abiotički stres, ili koji su specifični za tkivo. Posebno se mogu koristiti oni promotori koji pokazuju povećanu specifičnost za organ za skladištenje saharoze ili njegove delove, tj., koji su aktivni naročito u ovom organu za skladištenje saharoze ili njegovim delovima. Kod šećerne repe, promotor može biti, na primer, specifičan za koren ili specifičan za glavni koren. Iskusni stručnjak ih poznaje iz prethodne prakse: WO 02/40687, Oltmanns, H. et al. (2006) "Taproot promoters cause tissue specific gene expression within the storage root of sugar beet", Planta 224: 485-495, Noh, Seol Ah, et al. (2012) "A sweetpotato SRD1 promoter confers strong root, taproot-, and tuber-specific expression in Arabidopsis, carrot, and potato" Transgenic research 21: 265-278. Kod šećerne trske poželjno se mogu koristiti culm-specifični promotori, kao što su oni koji su poznati iz Goshu Abraha, Tsion. "Isolation and characterization of a culm-specific promoter element from sugarcane", diss. Stellenbosch: University of Stellenbosch, 2005. Govender, C. "Stem specific promoters from sorghum and maize for use in sugarcane", diss. Stellenbosch: Stellenbosch University, 2008; and Mudge, S.R. et al. (2013) "Mature-stem expression of a silencing-resistant sucrose isomerase gene drives isomaltulose accumulation to high levels in sugarcane," Plant Biotechnology Journal 1: 502-509).

[0049] Nadalje, pogodni promotori uključuju sintetičke promotore. To su promotori koji su napravljeni tehnikama molekularne biologije i koji se u takvoj konfiguraciji ne mogu prona ći u prirodi. Sintetički promotor je minimalistički promotor koji sadrži samo jedan ili više odabranih, definisanih cis-elemenata pored minimalnog promotora. Ovi cis-elementi predstavljaju vezujuća mesta za proteine koji vezuju DNK kao što su transkripcioni faktori i izolovani su iz prirodnih promotora, dobijeni od prethodno izolovanih ciselemenata, ili proizvedeni tehnički nasumičnim rekombinacionim tehnikama i odabrani odgovarajućim metodama; u poređenju sa prirodnim promotorom, usled svoje manje kompleksne konstrukcije, sinteti čki promotor se aktivira samo putem nekoliko egzogenih i endogenih faktora i iz tog razloga je preciznije regulisan.

[0050] „Minimalni promotor“ ili „jezgro“- promotor je nukleotidna sekvenca koja sadrži vezujuća mesta za kompleks baznog faktora transkripcije i omogućava preciznu inicijaciju transkripcije RNK polimerazom II. Karakteristični motivi sekvence minimalnog promotora su TATA paket, inicijatorni element (lnr), "TFBII element prepoznavanja" (BRE) i "downstream core promoter element" (OPE). Kod minimalnog promotora ovi elementi se mogu pojaviti individualno ili u kombinaciji. Minimalni promotor ili njegovi motivi sekvence su dostupni, na primer, iz bilo kog biljnog, bakterijskog, gljivičnog ili virusnog gena.

[0051] „Cis elementi“ su nukleotidne sekvence koje se nalaze na istom molekulu nukleinske kiseline kao nukleotidna sekvenca koja kodira protein koja se eksprimira. Cis elementi ne moraju kodirati RNK ili protein i u smeru transkripcije mogu biti locirani pre ili posle nukleotidne sekvence koja kodira protein kako bi bili eksprimirani. Cis elementi uzvodno pre nukleotidne sekvence koja kodira protein koja se eksprimira često pružaju neophodne vezujuće motive naročito za transkripcione faktore koji se angažuju kao trans-delujući elementi (od lat. trans, „izvan“), na molekularnom nivou, sa druge strane u regulaciji transkripcije ovog gena. Ukoliko, dodatno, cis elementi vode do inhibicije transkripcije, nazivaju se prigušivači. Cis elementi koji vode do poboljšanja transkripcije se nazivaju pojačivači. Ukupnost cis/trans aktivnosti u promotoru određuje intenzitet sa kojim RNK polimeraza vrši transkripciju.

[0052] Dalje, promotor može biti himerni promotor i/ili promotor koji je modifikovan cis elementima. Modifikacija promotora može takođe značiti dodatnu inkorporaciju cis elementa u promotor koji, na primer, prirodno već ima cis element. Dalje, modifikacija takođe uključuje multimerizaciju cis elementa, naročito multimerizaciju cis elementa koji prirodno postoji. U poređenju sa nativnom verzijom tako modifikovan promotor može imati izmenjena svojstva u odnosu na specifičnost, ekspresioni nivo ili pozadinsku aktivnost, na primer.

[0053] Terminatori su nukleotidne sekvence na DNK, koje obično označavaju završetak gena i vode do prekida transkripcije.

[0054] Prema alternativnoj i/ili dodatnoj izvedbi, nukleotidna sekvenca koja kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein, naročito nukleotidna sekvenca koja kodira tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein, i nukleotidna sekvenca barem jednog regulatornog elementa su heterologne. To znači da su dobijene iz različitih vrsta ili se ne pojavljuju prirodnim putem u vrstama u namenjenoj kombinaciji.

[0055] Prema trećem aspektu, pronalazak se odnosi na vektor ili mobilni genetski element, koji sadr ži molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu u skladu sa prvim aspektom.

[0056] Ovde, vektor predstavlja transportno sredstvo za molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom ili rekombinantni gen u skladu sa drugim aspektom, naročito za transfer strane nukleinske kiseline u živu ćeliju primaoca. Živa ćelija primaoca može biti eukariotska ćelija ili prokariotska ćelija. Vektori uključuju, na primer, plazmide, kozmide, veštačke hromozome kvasca (YAC), bakterijske veštačke hromozome (BAC) ili P1 veštačke hromozome (PAC) kao i modifikovane viruse kao što su adenovirusi, retrovirusi i fagovi.

[0057] Mobilni genetski elementi su nukleotidne sekvence, čija je pozicija u genomu organizma promenljiva. Mobilni genetski elementi uključuju, na primer, samoposlužujuće nukleotidne sekvence kao što su transpozoni, retro elementi, insercione sekvence i inteini, ali tako đe i introne grupe II, insertujuće plazmide i određene bakteriofage kao što je Mu fag.

[0058] U skladu sa sledećim aspektom, pronalazak se odnosi na eukariotsku ćeliju domaćina ili prokariotsku ćeliju domaćina koja sadrži vektor ili mobilni genetski element u skladu sa trećim aspektom kao transgen. To znači da je vektor ili mobilni genetski element inkorporiran u ćeliju domaćina, na primer posredstvom transformacije ili transfekcije. Primeri prokariotskih ćelija domaćina su bakterija roda A. tumefaciens, E. coli i B. subtilis. Primeri eukariotskih ćelija domaćina su ćelije kvasca kao što su Saccharomyces ili Schizosaccharomyces, ali takođe i ćelije životinjskog ili biljnog porekla.

[0059] Dalje su otkriveni proteini koji deluju kao tonoplastni protonski/saharozni antiporter. Ovaj antiporter je specifičan za saharozu. Poželjno, protein je kodiran molekulom nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom.

[0060] Prema izvedbi, tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein je odabran iz grupe proteina koji:

a) imaju sekvencu aminokiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 1;

b) imaju sekvencu aminokiseline koja ima identičnost od barem 80% sa sekvencom aminokiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 1;

c) su homolog, analog ili ortolog proteina u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 1.

[0061] Tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 1, koji se takođe naziva BvTST2.1, ima sekvencu aminokiseline koja ima dužinu od 735 aminokiselina. Analiza hidrofobnosti ukazuje na to da BvTST2.1 očigledno ima 12 hidrofobnih transmembranskih domena i veliku, centralno lociranu hidrofilnu petlju koja povezuje šesti i sedmi transmembranski domen. BvTST2.1 ima najveću sekventnu identičnost tonoplastnom monosaharidnom transporter proteinu 2 iz Arabidopsis thaliana (AtTMT2). Identičnost ove dve aminokiselinske sekvence je 68% i imajući u vidu konzervativne i polukonzervativne aminokiselinske supstitucije, imaju sekventnu sličnost od 84% (slika 1).

[0062] Takođe su otkriveni proteini koji deluju kao tonoplastni protonski/ šećerni antiporter. Poželjno, protein je kodiran molekulom nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom.

[0063] Prema izvedbi, tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein je odabran iz grupe proteina koji

a) imaju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 3, 5 ili 7; b) imaju aminokiselinsku sekvencu koja ima identičnost od barem 80% sa aminokiselinskom sekvencom sekvencionih identifikacionih brojeva: 3, 5 ili 7;

c) su homolog, analog ili ortolog proteina u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 3, 5 ili 7.

[0064] Tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 3, se takođe naziva i BvTST1, u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 5, se takođe naziva i BvTST2.2 i u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 7, se takođe naziva i BvTST3.

[0065] Obzirom da tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein BvTST2.1 identifikovan u Beta vulgaris kao i drugi tonoplastni protonski/šećerni antiporter proteini BvTST1, BvTST2.2 i BvTST3 takođe ima/imaju sekventne identičnosti sa transportnim proteinima iz drugih biljaka, tonoplastni protonski/šećerni antiporter proteini, naročito tonoplastni protonski/saharozni antiporter proteini takođe sadrže proteine čija aminokiselinska sekvenca ima identičnost od barem 80% sa aminokiselinskom sekvencom sekvencionih identifikacionih brojeva: 1, 3, 5 ili 7, poželjno od barem 85%, barem 90%, barem 95%, barem 96%, barem 97%, barem 98% ili barem 99%, kao i njihovi homologi, analogi ili ortologi. U ovom kontekstu je irelevantno kod kojih se vrsta ovi proteini pojavljuju prirodnim putem ili nisu proteini koji se pojavljuju prirodnim putem već koji su proizvedeni, na primer, putem molekularnih genetskih metoda.

[0066] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na transgeničnu biljnu ćeliju koja sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom kao transgen ili vektor ili mobilni genetski element u skladu sa trećim aspektom kao transgen, kao i transgeničnu biljku ili njene delove koja sadrži barem jednu takvu biljnu ćeliju. U ovom kontekstu, transgenična biljka ili njeni delovi takođe sadrži(e) molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom kao transgen ili vektor ili mobilni genetski element u skladu sa trećim aspektom kao transgen.

[0067] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na seme transgenične biljke u skladu sa prethodnim aspektom, pri čemu seme a konkretno barem embrionalna ćelija semena sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom kao transgen ili vektor ili mobilni genetski element u skladu sa tre ćim aspektom.

[0068] U izvedbi, biljna ćelija je ćelija monokotiledone biljke. U drugoj izvedbi, biljna ćelija je ćelija dikotiledone biljke. Prema drugoj i/ili dodatnoj izvedbi, biljna ćelija su ćelije biljke, koja je odabrana iz grupe vrsta ili matičnih rodova koja sadrži Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum i Sorghum sp. Shodno tome, prema sledećoj izvedbi, transgenična biljka je odabrana iz grupe koja sadrži Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum i Sorghum sp. Prema sledećoj izvedbi, delovi transgenične biljke ili seme transgenične biljke su dobijeni od grupe biljaka koja sadrži Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum i Sorghum sp.

[0069] U dodatnoj i/ili alternativnoj izvedbi, transgenična biljna ćelija, transgenična biljka ili delovi transgenične biljke, koji su poželjno organ za skladištenje saharoze kod biljke, imaju veću koncentraciju saharoze u odnosu na izogeničnu biljnu ćeliju ili biljku kultivisanu pod identičnim uslovima. Dalje, delovi biljke se mogu povezati za celu netaknutu biljku ili biti odvojeni od nje. Takvi delovi uklju čuju, na primer, organe, tkiva, ćelije i seme biljke.

[0070] Poželjno, viša koncentracija saharoze se zasniva na višoj koncentraciji saharoze u vakuoli biljke, naročito u vakuoli barem jedne ćelije organa za skladištenje saharoze biljke. Naročito poželjno, biljka sa višom koncentracijom saharoze takođe ima povećan prinos saharoze. U tom kontekstu, prinos znači prinos saharoze iz organa za skladištenje saharoze u odnosu na definisano područje koje se obrađuje (na primer, hektar) ili u odnosu na masu organa za skladištenje saharoze uzimajući u obzir vodeni sadržaj u organu za skladištenje saharoze (pogodno je da se normalizacija izvrši u odnosu na svežu ili suvu masu).

[0071] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metod za proizvodnju transgeničnih biljaka, pri čemu pomenuti metod obuhvata barem sledeće korake:

(a) inkorporiranje molekula nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom ili vektora ili mobilnog genetskog elementa u skladu sa trećim aspektom u barem jednu ćeliju biljke, i

(b) regeneriranje pomenute transgenične biljke od biljne ćelije dobijene u koraku a).

[0072] Prema izvedbi, transgenična biljka, koja je rezultat ovog postupka, je sposobna za koncentrisanje saharoze u vakuolama svojih ćelija, poželjno u vakuolama ćelija svog organa za skladištenje saharoze na višem nivou u odnosu na izogeničnu kontrolnu biljku uzgajanu pod identičnim uslovima.

[0073] Za svrhe predmetnog pronalaska “izogenične biljke ili kontrolne biljke” ili “izogenične biljne ćelije” znači one biljke ili biljne ćelije, koje su korišćene kao polazni materijali za generisanje transgeničnih biljaka ili transgeničnih biljnih ćelija.

[0074] Stoga, genom transgeničnih biljaka i/ili biljnih ćelija, u meri u kojoj su to genetski modifikovane biljke ili biljne ćelije, je/nije različit, izuzev kod gena prenesenih genskom tehnologijom i/ili inkorporiranih nukleotidnih sekvenci.

[0075] U skladu sa dodatnom i/ili alternativnom izvedbom, transgenična biljka eksprimira ili prekomerno eksprimira nukleotidnu sekvencu koja kodira barem jedan protonski/ šećerni antiporter protein u barem jednoj ćeliji.

[0076] Inkorporiranje molekula nukleinske kiseline, na primer putem transformacije, mo že biti postignuto

1

sa tehnikama koje su u osnovi poznate stručnjacima iz oblasti. Na primer, molekul nukleinske kiseline može biti inkorporiran u biljnu ćeliju inficiranjem biljnog tkiva ili biljne ćelije sa Agrobacterium tumefaciens koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja se prenosi u svom plazmidu koja se može integrisati u biljni genom. Druga opcija je inkorporiranje putem biolisti čkog transfera, pri čemu nukleinska kiselina koja se inkorporira u biljnu ćeliju je primenjena na česticama zlata ili volframa, koje se zatim velikom brzinom upucavaju u ćelije. Druga opcija, koja je poznata stručnoj osobi iz oblasti, za inkorporiranje nukleinske kiseline u biljnu ćeliju je protoplast transformacija, pri čemu ili se polietilen glikol dodaje protoplastima u prisustvu molekula nukleinske kiseline koji se inkorporiraju, ili su protoplasti izloženi kratkom strujnom impulsu, tako da membrana protoplasta prolazno postaje propusna za molekule nukleinske kiseline. Metodi za regenerisanje kompletnih biljaka od transformisanih tkiva ili ćelija su takođe poznati stručnjaku iz oblasti iz prethodne prakse.

[0077] Poželjno, molekul nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom, rekombinantni gen u skladu sa drugim aspektom i/ili vektor ili mobilni genetski element u skladu sa tre ćim aspektom, su stabilno inkorporirani u genom ćelije biljke. To znači da nakon regeneracije biljke prenesena sekvenca nukleinske kiseline može biti stabilno prenesena iz ove biljke u biljku potomstva.

[0078] Poželjno, transformacija i regeneracija šećerne repe se sprovodi metodom opisanim od strane Lindsey (Lindsey K. (1991) "Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens" Plant Tissue Culture Manual B7: 1-13, Kluwer Academic Publishers).

[0079] Transgeneza biljaka može biti verifikovana polimeraznom lančanom reakcijom korišćenjem odgovarajućih oligonukleotidnih prajmera. Nakon regeneracije, transformanti se mogu uzgajati i samooploditi radi dobijanja semena u staklenoj bašti.

[0080] U izvedbi, biljne ćelije koje se transformišu su ćelije monokotiledonih biljaka. U sledećoj izvedbi, biljne ćelije koje se transformišu su ćelije dikotiledonih biljaka. Prema drugoj i/ili dodatnoj izvedbi, biljne ćelije koje se transformišu su ćelije biljke koja je odabrana iz grupe vrsta ili matičnog roda koji obuhvata Beta vulgaris, Saccharum officinarum, Arenga saccharifera, Acer saccharum and Sorghum sp.

[0081] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metode za povećanje koncentracije saharoze organa za skladištenje saharoze biljke ekspresijom ili prekomernom ekspresijom tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina, naročito tonoplastnog protonskog/saharoznog antiporter proteina, u barem jednoj ćeliji biljke. Ekspresija ili prekomerna ekspresija može biti dobijena genetskom modifikacijom barem jedne ćelije biljke, i obuhvata

(1) inkorporiranje molekula nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom, rekombinantnog gena u skladu sa drugim aspektom i/ili vektora ili mobilnog genetskog elementa u skladu sa trećim aspektom, u barem jednoj ćeliji biljke, time izazivajući dodatnu ekspresiju ili prekomernu ekspresiju tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina, ili

(2) genetsko modifikovanje endogenog regulatornog elementa, kao što je promotor, koji reguliše ekspresiju endogenog gena koji kodira tonoplastni protonski/ šećerni antiporter protein, na primer ubacivanjem dodatnih cis elemenata ili pojačivača, time izazivajući povećanu ekspresiju regulisanog tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina.

[0082] Pod ekspresijom ili prekomernom ekspresijom tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina, naročito tonoplastnog protonskog/saharoznog antiporter proteina, u barem jednoj ćeliji biljke, uvoženje saharoze u vakuole genetski modifikovane ćelije je poboljšano. To takođe povećava koncentraciju saharoze u vakuolama ove ćelije u poređenju sa izogenom biljnom ćelijom.

[0083] “Povećanje u koncentraciji saharoze” ili “povećana koncentracija saharoze” ili “viša koncentracija saharoze organa za skladištenje saharoze kod biljke” znači povećanje prosečne koncentracije saharoze, na osnovu sveže mase organa za skladištenje saharoze, u poređenju sa netransgeničnom (izogenom) kontrolnom biljkom uzgajanom pod identičnim uslovima od barem 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% ili 1%, poželjno od barem 1,2%, 1,4%, 1,6%, 1,8% ili 2%, naročito poželjno od barem 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 6%, 7%, 8% ili 10%, a najpoželjnije od barem 15%.

[0084] Radi svrha pronalaska pojam “prekomerno eksprimirano” znači da je količina tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina u biljci, biljnoj ćeliji ili njenim tonoplastima viša nego u izogenoj biljci, izogenoj biljnoj ćeliji ili njenim tonoplastima.

[0085] Prema izvedbi, metod za povećanje koncentracije saharoze organa za skladištenje saharoze biljke obuhvata ekspresiju i/ili prekomernu ekspresiju nukeotidne sekvence molekula nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein u skladu sa prvim aspektom pronalaska.

[0086] Radi ove svrhe, transgenična biljka je napravljena u skladu sa gore opisanim metodom, pri čemu ekspresija i/ili prekomerna ekspresija protonskog/šećernog antiporter protein(a) u transgeničnoj biljci, kao što je opisano u prethodnom tekstu, može biti olakšana različitim genetskim modifikacijama.

[0087] Na primer, konstrukt koji se sastoji od snažnog promotora i nukleotidne sekvence u skladu sa prvim aspektom pronalaska može biti inkorporiran u biljnu ćeliju koja se transformiše. Alternativno, endogeni promotor gena koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein, naročito gen koji kodira tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein, može biti modifikovan na takav način da bude aktivniji u transgeničnoj biljci nego u izogenoj kontrolnoj biljci. Sredstva za modifikovanje endogenog promotora mogu biti, na primer, TALEN ili cinkov prst nukleaze. Prema drugoj alternativi, dodatni gen kopira endogeni gen koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein, naročito endogeni gen koji kodira tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein, uključujući svoj prirodni promotor, može biti inkorporiran u biljnu ćeliju.

[0088] U alternativnoj i/ili dodatnoj izvedbi, tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein je odabran iz grupe koja sadrži BvTST2.1 proteine, homologe, analoge i ortologe njihove.

[0089] U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metode za identifikovanje biljke koja je pogodna za generisanje povećane koncentracije saharoze u svom organu za skladištenje saharoze.

[0090] Prema izvedbi, biljke koje se identifikuju mogu biti podvrgnute identifikaciji uz pomo ć markera. U ovu svrhu, izolovan je DNK svake biljke koja se ispituje i ili je podvrgnut polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) korišćenjem odgovarajućih oligonukleotidnih prajmera, tako da se ove biljke mogu identifikovati koje su, usled svog genetskog sastava, pogodne za generisanje povećane koncentracije saharoze u svom skladištu saharoze analizom reakcionih proizvoda PCR, ili gel hromatografijom ili posredstvom fluorescentne detekcije kao u RT-PCR. Prema dodatnoj i/ili alternativnoj izvedbi genetski sastav biljke koja se identifikuje se može odrediti polimorfizmom restriktivne dužine, pri čemu izolovana DNK je hidrolizovana različitim restrikcionim endonukleazama, restrikcioni fragmenti su razdvojeni gel hromatografijom, blotted i hibridizovani sa odgovarajućom sondom. Pogodni primerni oligonukleotidi za identifikaciju transgeničnih biljaka koje su pogodne za generisanje povećane koncentracije saharoze u svom organu za skladištenje saharoze, zato što eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju nukleotidnu sekvencu sekvencionog identifikacionog broja: 2 mogu biti odabrani iz grupe oligonukleotida koji obuhvataju sekvencione identifikacione brojeve: 15-26. Stručnjak iz oblasti zna kako da obezbedi pogodne oligonukleotide takođe za homologe, analoge ili orgologe sekvencionog identifikacionog broja: 2.

[0091] Prema dodatnoj i/ili alternativnoj izvedbi, identifikacija biljaka koje su pogodne za generisanje povećane koncentracije saharoze u svom organu za skladištenje saharoze nije izvršena na osnovu njihovog genetskog sastava, već na osnovu ekspresije njihovih tonoplastnih protonskih/saharoznih antiporter proteina. To se može desiti, na primer, na nivou mRNK utvrđivanjem količine mRNK deoksiribonukleotidnih sekvenci koje kodiraju za tonoplastne protonske/šećerne antiporter proteine, naročito deoksiribonukleotidne sekvence koje kodiraju za tonoplastne protonske/saharozne antiporter proteine, na primer, “kvantitativnom PCR u stvarnom vremenu”. Određivanje veće količine mRNK koja kodira barem jedan tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein, opisan u prethodnom tekstu, u biljci, tkivu biljke ili biljnoj ćeliji, naročito u tkivu ili ćeliji organa za skladištenje saharoze kod biljke, u odnosu na uporednu biljku iste vrste ili njenog dela, ili u odnosu na drugo biljno tkivo ili biljnu ćeliju iste biljke, koja nije deo organa za skladištenje saharoze kod biljke, se smatra dokazom pogodnosti biljke da generi še povećanu koncentraciju saharoze u njenom organu za skladištenje saharoze.

[0092] Identifikacija biljaka koje su pogodne da genenrišu povećanu koncentraciju saharoze u svom organu za skladištenje saharoze, se takođe može izvršiti kvantitativnom detekcijom količine tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina, naročito tonoplastnog protonskog/saharoznog antiporter proteina u delu biljke. U tu svrhu se koristi takozvani Vestern blot, gde su elektroforetski razdvojeni proteini dela biljke, poželjno vakuola, naročito poželjno vakuolarne membrane ovog dela inkubirani sa antitelom specifičnim za jedan ili više tonoplastnih protonskih/šećernih antiporter proteina opisanih u prethodnom tekstu. Pomoću sekundarnog antitela koje vezuje antitelo specifično za jedan ili više tonoplastnih protonskih/šećernih antiporter proteina opisanih u prethodnom tekstu, i koje ima uo čljivu oznaku, količina tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina, naročito tonoplastnog protonskog/saharoznog antiporter proteina, može biti utvrđena u delu biljke i te biljke se mogu identifikovati koje su pogodne za generisanje povećane koncentracije saharoze u svom organu za skladištenje saharoze. Utvrđivanje veće količine barem jednog tonoplastnog protonskog/saharoznog antiporter proteina u biljci, delu biljke ili biljnoj ćeliji, naročito u tkivu ili ćeliji organa za skladištenje saharoze kod biljke, u odnosu na uporednu biljku istih vrsta ili njenog dela ili u odnosu na drugo biljno tkivo ili biljnu ćeliju iste biljke, koja nije deo organa za skladištenje saharoze biljke, se smatra dokazom pogodnosti biljke za generisanje povećane koncentracije saharoze u svom organu za skladištenje saharoze.

[0093] Takođe su otkrivene biljke identifikovane gore pomenutom metodom koje su pogodne za generisanje povećane koncentracije saharoze u svom organu za skladištenje saharoze.

[0094] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na oligonukleotide koji su pogodni za upotrebu kao molekularni markeri za dijagnostičku detekciju molekula nukleinske kiseline u skladu sa prvim aspektom.

[0095] Prema izvedbi, barem jedan od pogodnih oligonukleotida je odabran iz grupe koja sadr ži oligonukleotide u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 15, sekvencionim identifikacionim brojem: 16, sekvencionim identifikacionim brojem: 17, sekvencionim identifikacionim brojem: 18, sekvencionim identifikacionim brojem: 19, sekvencionim identifikacionim brojem: 20, sekvencionim identifikacionim brojem: 21, sekvencionim identifikacionim brojem: 22, sekvencionim identifikacionim brojem: 23, sekvencionim identifikacionim brojem: 24, sekvencionim identifikacionim brojem: 25 i sekvencionim identifikacionim brojem: 26. Oni mogu biti kori šćeni kao molekularni markeri za dijagnostičku detekciju molekula nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu sekvencionog identifikacionog broja: 2.

[0096] Nadalje su otkrivena antitela koja su dijagnostika proteina koji deluje kao tonoplastni protonski/šećerni antiporter, poželjno kao tonoplastni protonski/saharozni antiporter.

[0097] U izvedbi, dijagnostičko antitelo je monoklonalno antitelo. U alternativnoj izvedbi, dijagnosti čko antitelo je deo poliklonalnog antiseruma.

[0098] U dodatnoj i/ili alternativnoj izvedbi, dijagnostičko antitelo ili poliklonalni antiserum specifičan za određeni tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein kao što je tonoplastni protonski/saharozni antiporter protein. Poželjno dijagnostičko antitelo prepoznaje i vezuje epitop na petlji između šestog i sedmog transmembarnskog domena protonskog/saharoznog antiporter proteina.

[0099] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu tonoplastnog protonskog/ šećernog antiporter proteina za povećanje koncentracije saharoze organa za skladištenje saharoze biljke.

[0100] Prema izvedbi upotreba tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina za povećanje koncentracije saharoze organa za skladištenje saharoze biljke obuhvata povećanje kocentracije saharoze ekspresijom ili prekomernom ekspresijom molekula nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein. Poželjno, molekul nukleinske kiseline sadrži

i. molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ili 14, ili koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima identičnost od barem 80% jednoj od nukleotidnih sekvenci u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ili 14;

ii. molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna jednoj od nukleotidnih sekvenci u skladu sa i.;

iii. molekul nukleinske kiseline koji se hibridizuje sa jednim od molekula nukleinske kisline u skladu sa i. ili ii.; ili

iv. molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa

1

sekvencionim identifikacionim brojevima: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ili 13, ili koji kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima identičnost od barem 80% sa jednom od aminokiselinskih sekvenci u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojevima: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ili 13.

[0101] Molekul nukleinske kiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 2 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter TST2.1 od Beta vulgaris koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 1.

[0102] Molekul nukleinske kiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 4 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter TST1 od Beta vulgaris koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 3.

[0103] Molekul nukleinske kiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 6 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter TST2.2 od Beta vulgaris koji ima aminokliselinsku sekvencu sekvencionog identifikacionog broja: 5.

[0104] Molekul nukleinske kiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 8 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter TST3 od Beta vulgaris koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 7.

[0105] Molekul nukleinske kiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 10 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter TMT1 od Arabidopsis thaliana koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 9.

[0106] Molekul nukleinske kiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 12 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter TMT2 od Arabidopsis thaliana koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 11.

[0107] Molekul nukleinske kiseline u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 14 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter TMT3 od Arabidopsis thaliana koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 13.

[0108] Pod ekspresijom i/ili prekomernom ekspresijom barem jedne od nukleotidnih sekvenci pomenutih pod i. do iv. u biljci nakon njihovog inkorporiranja u barem jednu ćeliju biljke, količina protonskog/šećernog antiporter proteina u vakuoli ove biljke može biti povećana, naročito u membranama vakuola organa za skladištenje saharoze ove biljke, tako da više saharoze može biti transportovano u vakuole biljke, a koncentracija saharoze u organu za skladištenje saharoze biljke u poređenju sa izogeničnom kontrolnom biljkom uzgajanom pod identičnim uslovima je povećana. Ovo omogućava povećanje prinosa saharoze po biljci, po organu za skladištenje saharoze i/ili po površini.

[0109] Predmetni pronalazak će sada biti ilustrovan primernim izvedbama, pri čemu primerne izvedbe su isključivo za ilustrativne svrhe, ali ne ograničavaju predmetni pronalazak. Predmetni pronalazak je definisan isključivo patentnim zahtevima. Pojam “a” ili “an” ne treba tumačiti kao određivanje broja.

[0110] Primerne izvedbe jasno pokazuju da je TST2.1 od Beta vulgaris tonoplastni membranski protein koji može uvesti visoko specifičnu saharozu u vakuolu biljne ćelije kao protonski/šećerni antiporter.

Primer 1: Biljni materijal i uslovi rasta

[0111] Za sledeće eksperimente korišćene su sorte šećerne repe "Belladonna KWS" i "Brigadier". Seme sorte "Belladonna KWS" je obezbeđeno od strane KWS Saat AG, Einbeck, DE, a seme za repu sorte "Brigadier" je kupljeno u lokalnim preduzećima za prodaju semena.

[0112] Dalje, korišćene su biljke i biljne ćelije od Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana. Biljke su rasle u komorama rasta na standardnom supstratu ED 73 kompanije Einheitserde- i Humuswerke Gebr. Patzer GmbH & Co. KG u svetlo-tamnom ciklusu od 10 sati svetla i 14 sati tame, 22 °C i 125 µmol quanta m<-2>s<-1>.

[0113] Arabidopsis Attst1-2 T-DNK dvostruki genski nokaut mutant je opisan u prethodnoj praksi (Wormit, A. et al. (2006) "Molecular identification and physiological characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolar sugar transport" Plant Cell 18, 3476-3490). Kod eksperimenata rasta sa 2-deoksiglukoznom površinom sterilisano Arabidopsis seme je zasađeno na polukoncentrovanim Murashige i Skoog (1⁄2MS) agar pločama kao što je opisano u (Reiser, J. et al. (2004) "Molecular physiological analysis of the two plastidic ATP/ADP transporters from Arabidopsis ", Plant Physiol. 136: 3524-3536). Selekcija pUBQ:BvTST2.1-GFP i 35S:BvTST1 biljaka sa prekomernom ekspresijom je sprovedena na 1⁄2MS agar pločama koje sadrže ili 50 µg/ml higromicina ili 40 µg/ml kanamicina.

Primer 2: Kvantitativna determinacija šećera u tkivima šećerne repe

[0114] Tkivo glavnog korena šećerne repe je prikupljeno sa sekačem povrća, odmah zamrznuto u tečnom azotu i čuvano do kvantitativnog ispitivanja glukoze na -80 °C. Radi utvrđivanja sadržaja šećera, biljno tkivo je položeno u tečni azot i 50 µg položenog tkiva je ekstraktovano dva puta tokom 20 minuta na 80 °C sa 80% etanola. Supernatanti su spojeni i upareni sa SpeedVac (Eppendorf, Hamburg, Germany). Isu šeni šećeri su rastvoreni u vodi i kvantifikovani putem enzimskog testa kuplovanog sa NADP u čitaču mikroploča kao što je opisano (Bergmeyer, H. U. and Bernt, E. (1974) "Methods of Enzymatic Analysis", vol. 3, Bergmeyer, H. U. ed., Verlag Chemie New York, S. 1176-117; Lee, Y. C. (1972) "α-Mannosidase, βglucosidase, and β-galactosidase from sweet almond emulsion" Methods Enzymol. 28: 699-702).

Primer 3: Analiza ekspresije gena

[0115] Relativna akumulacija mRNK je sprovedena putem Northern blot analiza kao što je opisano u (Young, B. et al. (2011) "Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines" Plant J. 65: 703-711). Kvantitativna RT-PCR je sprovedena kao što je prethodno opisano u (Leroch M. et al (2005) "Identification and characterization of a novel plastidic adenine nucleotide uniporter from Solanum tuberosum" J. Biol. Chem. 280: 17992-18000). Genski-specifični prajmeri koji su korišćeni su navedeni u tabeli 1:

Tabela 1: Genski-specifični prajmeri za amplifikaciju nukleotidnih sekvenci koje kodiraju BvTST1 i BvTST2.1, i za kvantitativnu PCR za ekspresionu analizu četiri paralogna TST gena od Beta vulgaris.

_

Primer 4: Izolacija vakuola i tonoplastne membrane iz tkiva glavnog korena

[0116] Vakuole su izolovane metodom Leigh i Branton (Leigh, R. A. and Branton, D. (1976) "Isolation of Vacuoles from Root Storage Tissue of Beta vulgaris" L. Plant Physiol 58: 656-662) sa sledećim promenama: tkivo glavnog korena je isečeno na parčiće od 0,1 do 0,2 mm debljine sa sekačem za povrće, i odmah inkubirano u kolekcionom medijumu (1 M sorbitol, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6) na

1

sobnoj temperaturi. Naknadno, tanki komadići tkiva glavnog korena su usitnjeni sa žiletom u kolekcionom medijumu (1 M sorbitol, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6), filtrirani kroz sito od nerđajućeg čelika (100 mm dimenzija mrežice) i sedimentirani centrifugiranjem (2,000 x g, 20 min, 4 °C). Sediment je ponovo suspendovan u kolekcionom medijumu sa 30% Nycodenz (Axis-Shield GmbH, Heidelberg, Germany) i prebačen u epruvete za centrifugu od 17 ml (Beckman UltraClear). U sledećem centrifugiranju okrećuće kašike (1,500 x g, 15 min, 8 °C) Nycodenz formira gradijent gustine, a vakuole plutaju na gornjoj fazi gradijenta gustine.

[0117] Membrane vakuola su izolovane kao što je opisano u prethodnoj praksi (Schulze W. X. et al. (2012) "Cold acclimation induce changes in Arabidopsis tonoplast protein abundance and activity and alters phosphorylation of tonoplast monosaccharide transporters", Plant J. 69: 529-541). Aktivnost αmannosidaze u sonikovanim vakuolama je sprovedeno kao što je opisano drugde (Boller, T. and Kende, H. (1979) "Hydrolytic enzymes in the central vacuole of plant cells" Plant Physiol 63: 1123-1132; Lee, Y. C. (1972) "α-Mannosidase, β-glucosidase, and β-galactosidase from sweet almond emulsion" Methods Enzymol.

28: 699-702).

Primer 5: Tečna hromatografija i tandem masena spektometrija

[0118] Sedimenti izolovanih tonoplastnih membrana od biljaka koje su stare 2 ili 5 meseci su uzeti u puferu (4% SDS, 50 mM NH4HCO3) pri koncentraciji od 1 µg/ml. Preuzeti proteini su precipitirani tokom noći na -20 °C in 80% acetona i dalje obrađeni kao što je opisano od strane Mühlhaus (Mühlhaus, T. et al. (2011) "Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii," Mol. Cell. Proteomics 10: M110004739). Ekstraktovani peptidi su ponovo suspendovani u 200 µl pufera (2% acetonitril, 0,4% sirćetna kiselina).

[0119] Uzorci 3 µl ekstraktovanih peptida su svaki podvrgnuti tečnoj hromatografiji-tandem masenoj spektrometriji (LC-MS/MS analiza). Hromatografsko razdvajanje je izvršeno na nanoAquity UPLC (Waters, Eschborn, Germany) posredstvom "simetrijska C18 trap kolona (5 mm dimenzija čestice, 180 µm x 20 mm dimenzije kolone) i BEH 130 C18 kolona (1,7 µm veličina čestice, 75 mm x 150 mm dimenzije kolone). Eluent je bio dvostruko gradijentovan, prvo od 100% pufera A (0,4% sirćetna kiselina, 1% 2-propanol, 2% acetonitril) do 40% pufera B (0,4% sirćetna kiselina, 1% 2-propanol, 90% acetonitril) tokom 2 ili 3 sata, a zatim do 90% pufera B tokom 5 minuta, i konačno 15 minuta sa 90% pufera B. Kolona je uravnoteživana na kraju tokom 15 minuta sa 100% pufera A. Hibridni LTQ XL-Orbitrap maseni spektrometar (ThermoScientific, Hamburg, Germany) je korišćen u režimu zavisnom od podataka sa ciklusom kompletnog skeniranja masenog spektra 300 - 1500 m/z (Orbitrap), sa postavljenom rezolucijom od 60.000 pri 400 m/z, praćeno sa sedam zavisnih od podataka sukcesivnih MS<2>skeniranja (LTQ) najintenzivnijih jona. Pojedinačno naelektrisani joni su isključeni iz MS<2>analize a matični joni za MS<2>analizu su postavljeni tokom 20 sekundi na ekskluzionu listu. Svaki uzorak je analiziran u tri primerka.

[0120] Proteini su identifikovani korišćenjem MaxQuant softvera i Andromeda Search Engine (Cox, J. and Mann, M. (2008) "MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification". Nat. Biotechnol. 26: 1367-72) u bazi podataka proteina šećerne repe napravljenoj u kući jednog od izumitelja.

Primer 6: Konstruktori nukleinske kiseline

[0121] Komplementarna DNK (cDNK) od Beta vulgaris je pripremljena reverznom transkripcijom RNK koja je izolovana iz glavnog korena ili lišća. Sve lančane reakcije polimeraze (PCR) su sprovedene sa Phusion HF DNA Polymerase (Thermo Scientific).

[0122] pUBQ:BvTST1-GFP fuzioni konstrukt je pripremljen korišćenjem vektora pUBC-GFP-Dest (Grefen et al (2010) "A ubiquitin-10 promoter-based vector set for fluorescent protein tagging facilitates temporal stability and native protein distribution in transient and stable expression studies", Plant J. 64: 355-365). U ovu svrhu, cDNK od BvTST1 je amplifikovan i stop kodon je uklonjen putem PCR korišćenjem BvTST1 prajmera koji sadrže attB1 i attB2 lokacije. Amplifikacioni proizvod je kloniran preko BP reakcije u pDONRZEO (Invitrogen, Heidelberg, Germany), a zatim LR reakcije u pUBC-GFP-Dest.

1

[0123] pUBQ:BvTST2.1-GFP konstrukt je pripremljen kao što sledi: kompletan otvoren okvir za čitanje BvTST2.1 gena je amplifikovan sa prajmerima BvTST2.1fw_XhoI/BvTST2.1rev_XbaI. Dobijen PCR proizvod je digestiran sa XhoI i XbaI i ligatiran u vektor pUBC-cGFP-Dest otvoren sa XhoI i SpeI (Grefen et al. (2010)). Tako proizveden konstrukt sadrži bar gen, koji kod transformisanih biljaka ima za rezultat Basta rezistenciju. Nakon toga, kompletna nukleotidna sekvenca koja kodira BvTST2.1-GFP je isečena iz ovog konstrukta korišćenjem XhoI/PstI, i ubačena u vektor pUBN-nYFP-Dest koji je u skladu sa tim otvoren sa XhoI i PstI, koji posreduje higromicin rezistenciju kod transformisanih biljaka. Digestija pUBN-nYFP Dest sa XhoI/PstI je dovela do potpunog uklanjanja nYFP sekvence i “Gateway” svojstava ciljanog vektora tako da je pogodan za transformaciju Attst1-2 dvostrukih genskih nokaut mutanata posredstvom agrobakterije (Clough S. J., Bent, A. F. (1998) "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana" Plant J. 16: 735-743). Nukleotidne sekvence svih genskih konstrukta koji su proizvedeni su verifikovane sekventnom analizom.

Primer 7: „Patch-clamp“ studije vakuola transformisanih Nicotiana benthamina biljaka

[0124] Za prolaznu prekomernu ekspresiju transportnih proteina šećera (BvTST1-GFP i BvTST2.1-GFP) označenih na njihovim krajevima C-terminala sa zelenim fluoroscentnim proteinom (GFP) ili samo sa GFP pod kontrolom ubikvitin promotora (pUBQ10) u mezofilnim ćelijama N. benthamiana N. metod opisan od strane Latz et al. (2007) o agro-infiltraciji od 5 do 7 nedelja starih biljaka (Latz et al. (2007) "In planta AKT2 subunits constitute a pH and Ca2+-sensitive inward rectifying K+ channel" Planta, 225: 1179-1191). Nasuprot postupka opisanog u prethodnoj praksi, Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 je korišćen kao nosilac za nukleotidnu sekvencu koja kodira gen 19K i za odgovarajuće transportne proteine šećera/GFP konstrukte. Bakterije su kultivisane tokom noći u YEB medijumu od 5 ml, centrifugirane na 8,000 x g tokom 1 minuta na sobnoj temperaturi i isprane 2 puta sa Agromix (Latz et al. (2007)). Bakterijske ćelije su ponovo suspendovane u 3 ml Agromix i držane tokom 2 do 3 sata na 28 °C u tami. Za infiltraciju, 1 ml suspenzije sa 19K koje sadrži agrobakteriju je pomešan sa 1 ml suspenzije agrobakterije koja sadrži pUBQ:BvTST1-GFP, pUBQ:BvTST2.1 GFP ili pUBQ:GFP, i 2 ml Agromix je dodato.

[0125] Dva dana nakon agroinfiltracije, protoplasti mezofilnih ćelija su izolovani esencijalno kao što je opisano od strane Beyhl et al. (Beyhl, D. et al (2009) "The fou2 mutation in the major vacuolar cation channel TPC1 confers tolerance to inhibitory luminal calcium", Plant J. 58: 715-723). Nakon enzimske inkubacije komadića lista tokom 1 sata, oslobođeni protoplasti su isprani sa 500 mM sorbitola i 1 mM CaCl2. Vakuole su oslobođene direktno u “patch clamp” komore iz protoplasta njihovim izlaganjem liznom puferu koji ima osmolarnost od 280 mOsmol x kg<-1>(10 mM EGTA, 10 mM Hepes/Tris, pH 7,4; osmolarnost postavljena sa D-sorbitolom). Makroskopske struje su merene u “celo-vakularnoj” konfiguraciji (Beyhl, D. et al. (2009) "The fou2 mutation in the major vacuolar cation channel TPC1 confers tolerance to inhibitory luminal calcium" Plant J. 58: 715-723 ); i niskopropusno filtrirane na 100 Hz. Kada i rastvor pipete su bili identični u odnosu na njihovu kompoziciju (100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 450-500 Osmol x kg<-1>, postavljeno sa D-sorbitolom), izuzev za pH. pH kade je bila postavljena na 7,4 (Hepes/Tris) a pH rastvora pipete je bila postavljena na 5,5 (Mes/Tris). Kako bi se izmerio šećerom indukovan protonski fluks, glukoza ili saharoza su dodate citoplazmičnoj strani vakuolarne membrane, svaka u konačnoj koncentraciji od 50 mM.

Primer 8: Analiza membranskog proteoma vakuola ćelija glavnog korena šećerne repe

[0126] Kako bi se analizirao proteom vakuolarne membrane ćelija glavnog korena šećerne repe, vakuole ćelija glavnog korena šećerne repe sorte "Belladonna KWS" stare pet meseci (Beta vulgaris) su izolovane i vakuolarna membrana je obogaćena centrifugacijom velike brzine. Hidrofobni membranski proteini su precipitirani sa acetonom iz tonoplastne frakcije isprane nekoliko puta, naknadno ponovo suspendovani u ratvoru uree (8 M urea) i podvrgnuti triptičnoj digestiji pre LC-MS/MS analize.

[0127] Ukupno oko 400 različitih proteina je identifikovano u svakom od obogaćenih tonoplastnih preparata. Jedan od tih proteina, pod nazivom BvTST2.1 u tekstu (sekvencioni identifikacioni broj: 1), je bio prisutan u velikim količinama u svim nezavisno sprovedenim pripremama, je imao oznaku šećernog transportera ([LIVMSTAG] - [LIVMFSAG] - (SH) - (RDE ) - [LIVMSA] - [DE] - (TD) - [LIVMFYWA] - G - R - [RK] -x (4.6) - [GSTA]; prozitni obrazac PS00216, http://prosite.expasy.org/) i imao je najveću sličnost sa vakuolarnim monosaharidnim transporterom TMT2 iz Arabidopsis thaliana (slika 1).

1

Primer 9: Gen za tonoplastne šećerne transportne proteine u genomu šećerne repe

[0128] Pretragom genoma B. vulgaris identifikovana su 4 paralogna gena koji kodiraju tonoplastne šećerne transportne proteine. Filogenetička analiza (slika 2) je pokazala da su šećerni transporteri BvTST1 i BvTST3 najsrodniji sa ortolognim genima AtTMT1 ili AtTMT3 od Arabidopsis, dok BvTST2.1 i BvTST2.2, vrlo sličan par gena, imaju najveću sekventnu sličnost Arabidopsis ortologa AtTMT2 (slika 1). Aminokiselinska sekvenca BvTST2.1 odgovara do približno 68% onoj od AtTMT2 i sličnost je 84% (slika 1).

Primer 10: Subcelularna lokalizacija BvTST2.1

[0129] Subcelularna lokalizacija BvTST2.1 je proučavana kod Attst1-2 dvostrukih genskih nokaut mutanata stabilno transformisanih sa pUBQ:BvTST2.1-GFP.

[0130] Izolacija protoplasta iz mezofilnih ćelija lišća i oslobađanje vakuola je sprovedeno poznatim postupkom (Yoo, S. D. et al. (2007) "Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis", Nat. Protocol 1565-1572).

[0131] Konfokalni mikroskop za lasersko skeniranje (Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) je korišćen za fluoroscentne mikroskopijske snimke. Svi snimci su zabeleženi sa Leica HCX PL APO 63x/1.20w motCORR CS objektivom. Obrada snimka je urađena korišćenjem Leica Application Suite Advanced Fluorescence Lite softvera.

[0132] Nakon kloniranja kompletne BvTST2.1 mRNK, subcelularna lokalizacija proteina je utvrđena stabilnim eksprimiranjem BvTST2.1-GFP fuzionog proteina u Arabidopsis. Zelena fluoroscencija koja je bila uočena u mezofilnim ćelijama listova Arabidopsis mutanata koji stabilno eksprimiraju BvTS2.1-GFP je ukazala da je fuzioni protein lokalizovan u membrani vakuola, koja je usko okružila hloroplaste.

[0133] Enzimatski digest mezofilnog tkiva biljaka koje eksprimiraju BvTST2.1-GFP ima za rezultat pojedinačne netaknute protoplaste. Kasniji hipoosmotski tretman ovih protoplasta je doveo do oslobađanja stabilnih, zelenih fluorescentnih vakuola, čime je potvrđena lokalizacija BvTST2.1 GFP u tonoplastu.

Primer 11: Korelacija ekspresije BvTST2.1 i koncentracije saharoze u glavnim korenima šećerne repe

[0134] Kako bi se saznalo o mogućnoj korelaciji između ekspresije BvTST2.1 u glavnim korenima šećerne repe i koncentracije saharoze šećerne repe, ekspresija BvTST2.1 gena je određena kod sojeva šećerne repe "Belladonna KWS" i "Brigadier".

[0135] Sorta "Belladonna KWS" je poznat kao soj šećerne repe, koji ima visoku koncentraciju saharoze i već nakon dva meseca nakon sadnje ima koncentraciju saharoze od oko 160 µmol x g<-1>sveže mase u glavnom korenu (slika 3). Ova visoka koncentracija saharoze se povećala tokom sledeća tri meseca razvoja, dostižući oko 450 µmol x g<-1>sveže mase. To odgovara trostrukom povećanju, na osnovu glavnih korena starih dva meseca.

[0136] Suprotno tome, glavni koreni soja "Brigadier" su sadržali manje od 70 µmol saharoze po g sveže mase nakon dva meseca rasta, i akumulirali su svega približno 195 µmol saharoze po g sveže mase u sledeća tri meseca (slika 3).

[0137] Kada se poredi koncentracija saharoze listova i glavnih korena otprilike 30 puta ve ći sadržaj saharoze je pronađen u glavnim korenima u poređenju sa listovima, dok je koncentracija glukoze u listovima bila oko 80 puta viša u odnosu na glavne korene.

[0138] Razlike u akumulaciji saharoze između različitih sojeva šećerne repe su takođe odražene u količini mRNK koja kodira BvTST2.1 (slika 4). Kod glavnih korena sorte "Belladonna KWS" kao i kod sorte "Brigadier" količine mRNK za sva četiri paralogna šećerna transportera su bile niske nakon dva meseca rasta.

[0139] Nakon još jednog meseca rasta i razvoja, količina mRNK BvTST2.1 kod oba soja je bila značajno veća u odnosu na količine mRNK koje kodiraju BvTMT1, BvTMT2.2 i BvTMT3. Dodatno, količina BvTST2.1

1

mRNK u glavnim korenima sorte "Belladonna KWS" je bila približno 2,6 puta veća u odnosu na glavne korene sorte "Brigadier" (slika 4).

[0140] Tokom još dva meseca rasta, količina BvTST2.1 mRNK kod dve sorte se nije značajno promenila, u poređenju sa količinom nakon 3 meseca rasta, tako da čak nakon pet meseci rasta i razvojne faze količina mRNK za BvTST2.1 u glavnim korenima sorte "Belladonna KWS" je još uvek bila oko 2,6 puta veća u odnosu na glavne korene sorte "Brigadier".

[0141] Kako bi se prikupilo više informacija koje se tiču važnosti BvTST2.1 proteina za skladištenje saharoze, koncentracije glukoze, fruktoze i saharoze su utvrđene u listovima šećerne repe stare tri i pet meseci sorte "Belladonna KWS" (slika 5) i poređena sa količinama mRNK četiri TST paraloga (slika 6). Suprotno glavnim korenima, gde je sadržaj glukoze i fruktoze bio veoma nizak, ova dva monosaharida su se akumulirala u listovima. U listovima šećerne repe stare tri meseca, koncentracija glukoze i fruktoze je bila između 33 i 35 µmol/g sveže mase, dok je koncentracija saharoze bila manja od 15 µmol/g sveže mase. Nakon pet meseci rasta, koncentracija svakog od tri šećera je bila između 6 i 9 µmol/g sveže mase (slika 5).

[0142] Bilo je primetno da je količina mRNK za BvTST2.1 u listovima bila konzistentno niža u odnosu na količinu mRNK za BvTMT1, BvTMT2.2 i BvTMT3 dok je količina mRNK za BvTST2.1 u glavnom korenu uvek bila viša u odnosu na količinu mRNK za druge izoforme (slika 6).

Primer 12: Tonoplastni transport saharoze posredovan sa BvTST2.1

[0143] Kako bi se prikazala transportna funkcija BvTST2.1, “patch clamp” tehnologija je primenjena na izolovanim vakuolama. U ovu svrhu, BvTST2.1-GFP fuzioni protein je prolazno eksprimiran u mezofilnim ćelijama Nicotiana benthaminana. Netaknute vakuole transformisanih protoplasta su identifikovane po njihovoj zelenoj boji nakon blage hipoosmotske lize.

[0144] Kako bi se ponovio fiziološki protonski gradijent preko tonoplasta izolovanih vakuola, medijum u pipeti, koji predstavlja luminalne sadržaje vakuole, je puferovan do pH 5,5, dok je medijum u komori (= loš), koji predstavlja citosol, bio prilagođen na pH 7,5. Kada je saharoza dodata “citosolnom” medijumu, vakuole su reagovale sa snažnom silaznom deflekcijom protoka struje. Dodavanje saharoze u medijumu koji okružuje izolovane vakuole je imalo za rezultat unutrašnju struju, što ukazuje na protonski antiport transporta saharoze.

[0145] U odsustvu BvTST2.1, izolovane vakuole N. benthaminana nisu pokazale značajnu saharoznu/protonsku transportnu aktivnost. Nasuprot tome, u slučaju BvTST2.1 koji sadrži vakuole, dodavanje saharoze medijumu komore je imalo za rezultat unutra šnji tok struje u magnitudi od skoro -1 pA/pF (slika 7). Ove struje predstavljaju biološki otisak protonski vođenog uvoza saharoze preko vakuolarne membrane koja sadrži BvTST2.1-GFP i jasan su znak da BvTST2.1 povezuje izvoz protona duž protonskog gradijenta preko membrane sa uvozom saharoze naspram psotojećeg saharoznog gradijenta. Kasnija funkcija je biohemijski preduslov da šećerna repa bude u mogućnosti da akumulira visoke količine saharoze u vakuolama njihovih glavnih korena.

[0146] Treba napomenuti da BvTST2.1 ne olakšava bilo kakav izvoz protona posredovan glukozom.

Za razliku od BvTST2.1, izoforma BvTST1 posreduje protokom struje povezanim i sa saharozom i sa glukozom u redosledu od približno -03, pA/pF (slika 7; tabela 2).

Tabela 2: ećerom indukovane promene gustine struje pojedinačnih vakuola. Ovi podaci pokazuju specifičnost BvTST2.1 za saharozu.

1

[0147] Promjene u gustoć i struje pojedinih vakuola izazvane su še ć erom.

[0148] Ovi podaci ilustruju specifičnost BvTST2.1 za saharozu.

Primer 13: saharozna specifičnost BvTST2.1 in vivo

[0149] Kako bi se analizirala visoka supstratna specifičnost BvTST2.1 u živim biljnim ćelijama, AtTMT dvostruki genski nokaut mutanti koji nemaju nijedan od dva važna tonoplastna monosaharidna transporterska proteina, su transformisani ili sa PUBQ:BvTST2.1-GFP konstruktom ili sa pUBQ:BvTST1 konstruktom. Transformanti su odgajani u prisustvu toksičnog analoga glukoze 2-deoksiglukoze. U kontrolnim eksperimentima bez 2-deoksiglukoze sve biljne linije su prikazale sličan rast. U prisustvu 2-deoksiglukoze tst1-2 dvostruki genski nokaut mutanti se nisu razvijali pravilno, dok su biljke divlje vrste i linija koje eksprimiraju BvTST1 prikazale mnogo bolji rast. Biljke divlje vrste i BvTST1 koji eksprimira dvostrukog genskog nokaut mutanta su rasle bolje u prisustvu 2-deoksiglukoze verovatno iz razloga što je 2-deoksiglukoza mogla biti transportovana u vakuolama radi detoksikacije. Dvostruki genski nokaut mutant nije u mogućnosti da uradi to. Ove dvostruke genske nokaut biljke koje eksprimiraju BvTST2.1 nisu mogle da nadoknade zaustavljanje rasta Attst1-2 dvostrukog genskog nokaut mutanta u prisustvu 2-deoksiglukoze, iako je BvTST2.1-GFP fuzioni protein bio prisutan u vakuolarnim membranama.

[0150] Izuzetna osetljivost Attst1-2::BvTST2.1-GFP biljaka na 2-deoksiglukozu in vivo je konzistentna sa elektrofiziološkim podacima i saharoznom specifičnošću BvTST2.1, koja je dobijena izolovanim vakuolama.

2

�

4

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Vektor ili mobilni genetski element, koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein, naznačeno time da je tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein specifičan za saharozu, pri čemu specifičnost tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina za saharozu je najmanje pet puta veća nego za monosaharid i pri čemu molekul nukleinske kiseline sadrži molekul nukleinske kiseline odabran iz grupe koja se sastoji od:

a) molekula nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu prema sekvencionom identifikacionom broju: 2 ili molekula nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80 % identičnosti sa nukleotidnom sekvencom prema sekvencionom identifikacionom broju: 2;

b) molekula nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna jednoj od nukleotidnih sekvenci prema a);

c) molekula nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema sekvencionom identifikacionom broju: 1, ili molekula nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80 % identičnosti sa sekvencionim identifikacionim brojem: 1.

2. Eukariotska ili prokariotska ćelija domaćina koja sadrži vektor ili mobilni genetski element kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

3. Transgenična biljna ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein kao što je definisano prema patentnom zahtevu 1, kao transgen, ili vektor ili mobilni genetski element kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

4. Transgenična biljka ili njen deo, koja sadrži najmanje jednu transgeničnu biljnu ćeliju kao što je definisano u patentnom zahtevu 3.

5. Seme od transgenične biljke kako je naznačeno u patentnom zahtevu 4, pri čemu seme sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein kako je definisano u patentnom zahtevu 1, kao transgen, ili vektor ili mobilni genetski element kako je nazna čeno u patentnom zahtevu 1.

6. Metod za proizvodnju transgenične biljke, pri čemu metod obuhvata sledeće korake:

(a) inkorporisanje molekula nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/ šećerni antiporter protein kako je definisano u patentnom zahtevu 1, kao transgen, ili vektor ili mobilni genetski element kako je naznačeno u patentnom zahtevu 1, u najmanje jednu ćeliju biljke, i (b) regenerisanje transgenične biljke iz biljne ćelije dobijene u koraku a).

7. Metod za povećanje saharozne koncentracije saharoznog skladišnog organa biljke prekomernom ekspresijom molekula nukleinske kiseline kako je definisano upatentnom zahtevu 1 koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein u najmanje jednoj ćeliji biljke.

8. Metod naznačen u patentnom zahtevu 7, pri čemu je prekomerna ekspresija dobijena genetskom modifikacijom endogenog regulatornog elementa, pri čemu je endogeni operativni element operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira protein.

9. Metod za identifikovanje biljke koja je poželjna za proizvodnju povećane saharozne koncentracije u svom saharoznom skladišnom organu, koji obuhvatajući detektovanje molekula nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein kako je definisano u patentnom zahtevu 1.

10. Oligonukleotid pogodan za upotrebu kao molekularni marker, koji je dijagnostički za detekciju molekula nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein kako što je definisano u patentnom zahtevu 1, pri čemu je oligonukleotid odabran iz sledeće grupe: sekvencioni identifikacioni broj: 15, sekvencioni identifikacioni broj: 16, sekvencioni identifikacioni broj: 17, sekvencioni identifikacioni broj: 18, sekvencioni identifikacioni broj: 19, sekvencioni identifikacioni broj: 20, sekvencioni identifikacioni broj: 21, sekvencioni identifikacioni broj: 22, sekvencioni identifikacioni

2

broj: 23, sekvencioni identifikacioni broj: 24, sekvencioni identifikacioni broj: 25 i sekvencioni identifikacioni broj: 26.

11. Upotreba tonoplastnog protonskog/šećernog antiporter proteina za povećanje saharozne koncentracije saharoznog skladišnog organa biljke prekomernom ekspresijom molekula nukleinske kiseline koji kodira tonoplastni protonski/šećerni antiporter protein, i pri čemu molekul nukleinske kiseline sadrži sledeće:

i. molekul nukleinske kiseline koji imajući nukleotidnu sekvencu prema sekvencionim identifikacionim brojevima: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ili 14, ili koji imajući nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80 % identičnosti sa jednom od nukleotidnih sekvenci prema sekvencionim identifikacionim brojevima: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ili 14;

ii. molekul nukleinske kiseline koji imajući nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna jednoj od nukleotidnih sekvenci prema i.; ili

iii. molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji imajući aminokiselinsku sekvencu prema sekvencionim identifikacionim brojevima: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ilil 13, ili koji kodira polipeptid koji imajući aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80 % identičnosti sa jednom od aminokiselinskih sekvenci prema sekvencionim identifikacionim brojevima: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ili 13.

12. Upotreba kako je naznačeno u patentnom zahtevu 11, pri čemu je prekomerna ekspresija dobijena genetskom modifikacijom endogenog regulatornog elementa.