RS60606B1 - Reagensi sirp-alfa visokog affiniteta - Google Patents

Description

Opis

POZADINA PRONALASKA

[0001] Promet ćelija započinje indukcijom apoptotičkog programa ili drugim ćelijskim promenama koje ih obeležavaju uklanjanjem i naknadnim prepoznavanjem markera pomoću fagocita, uključujući makrofage, dendritične ćelije i slično. Ovaj postupak zahteva specifično i selektivno uklanjanje neželjenih ćelija. Sposobnost prepoznavanja zdravih iz neželjenih/ostarelih/umirućih ćelija prikazuje markere ili ligande nazvane „pojedi me“ signalom, tj. „izmenjenim ja“, što zauzvrat mogu prepoznati receptori na fagocitima. Zdrave ćelije mogu prikazati „ne jedi me“ signale koji aktivno inhibiraju fagocitozu; ovi signali su ili regulisani u umirućim ćelijama ili su prisutni u izmenjenoj konformaciji. Ćelijski površinski protein CD47 na zdravim ćelijama i njegovo angažovanje receptora za fagocite, SIRPα, predstavljaju ključni signal „ne jedi me“ koji može isključiti zahvatanje posredovano više modaliteta, uključujući apoptotski ćelijski klirens i fagocitozu posredovanu FcR. Blokiranje CD47 posredovanog angažmana SIRPα na fagocitu ili gubitak CD47 ekspresije kod nokaut miševa može prouzrokovati uklanjanje živih ćelija i eritrocita koji nisu stari. Alternativno, blokiranje prepoznavanja SIRPα takođe omogućava obnavljanje ciljeva koji obično nisu fagocitovani.

[0002] CD47 je široko eksprimirani transmembranski glikoprotein sa jednim Ig-sličnim domenom i pet membranskih regiona koji deluju kao ćelijski ligand za SIRPα sa vezivanjem posredovanim kroz NH2-terminalni V-sličan domen SIRPα. SIRPα se eksprimira prvenstveno na mijeloidnim ćelijama, uključujući makrofage, granulocite, mijeloidne dendritičke ćelije (DC), mastocite i njihove prekursore, uključujući hematopoetske matične ćelije. O strukturnim odrednicama na SIRPα koji posreduju u vezivanju CD47 razmatra Lee i dr. (2007) J. Immunol.

179:7741-7750; Hatherley i dr. (2007) J.B.C. 282:14567-75; i uloga SIRPα cis dimerizacije u vezivanju CD47 razmatrana je Lee i dr. (2010) J.B.C.285:37953-63.

[0003] U skladu sa ulogom CD47 da inhibira fagocitozu normalnih ćelija, postoje dokazi da se on prelazno reguliše na matičnim ćelijama hematopoeze (HSCs) i potomcima neposredno pre i tokom njihove migracione faze, i da nivo CD47 na tim ćelijama određuje verovatnoća da ih zahvati in vivo. CD47 je takođe konstitutivno regulisan za veliki broj karcinoma. Prekomerna ekspresija CD47 od strane tumorskih ćelija može povećati patogenost omogućavajući ćeliji da izbegne fagocitozu.

[0004] WO 2010/130053 A1 i WO 2009/046541 A1 opisuju postupke modulisanja interakcije SIRPα-CD47 davanjem terapeutski efikasne količine SIRPα polipeptida kojem nedostaje transmembranski domen SIRPα koji se može vezati za vanćelijski domen humanog CD47 u lečenju hematološkog karcinoma i u cilju povećanja ugradnje matičnih ćelija hematopoeze.

REZIME PRONALASKA

[0005] Pronalazak je kao što je definisan u patentnim zahtevima.

[0006] Obezbeđeni su polipeptidi visokog afiniteta i njihovi analozi, koji se ovde nazivaju SIRPα reagensi visokog afiniteta. Reagensi su varijante sekvenci urođenog humanog proteina SIRPα i koriste se za in vivo i in vitro postupke koji blokiraju interakciju između prirodnog SIRPα proteina i njegovog receptora, CD47. Promene aminokiselina koje pružaju povećani afinitet su lokalizovane u d1 domenu, pa SIRPα reagensi visokog afiniteta iz obelodanjivanja sadrže d1 domen humanog SIRPα, sa najmanje jednom promenom aminokiseline u odnosu na sekvencu divljeg tipa d1 domen. Takav reagens visokog afiniteta SIRPα po izboru sadrži dodatne aminokiselinske sekvence, na primer Fc sekvence antitela; delove humanog proteina SIRPα divljih vrsta, osim d1 domena, uključujući ostatke 150 do 374 izvornog proteina ili njegove fragmente, obično fragmente koji su povezani sa d1 domenom; i slično. SIRPα reagensi visokog afiniteta mogu biti monomerni ili multimerni, tj. dimerni, trimerni, tetramerni itd.

[0007] Obelodanjivanje obezbeđuje rastvorljive reagense visokog afiniteta SIRPα, kojima nedostaje transmembranski domen SIRPα, i sadrže najmanje jednu aminokiselinu i ne više od 15 promena d1 domena u odnosu na divlji tip humanog SIRPα, pri čemu se modifikuju ostaci u odnosu na ostatke izabrano iz grupe koja se sastoji iz: L4, V6, A21, V27, 131, E47, K53, E54, H56, V63, S66, K68, V92, F94 i F103 SEQ ID NO:1, gde navedena promena aminokiselina povećava afinitet vezivanja SIRPα polipeptida prema CD47 u odnosu na afinitet humanog SIRPα polipeptida divljeg tipa. SIRPα polipeptid visokog afiniteta može biti naknadno translaciono modifikovan, na primer glikozilacijom, pegilovanjem, itd. Reagens SIRPα visokog afiniteta može biti fuzioni protein koji sadrži Fc domen.

[0008] Obelodanjivanje takođe uključuje farmaceutske formulacije SIRPα reagensa visokog afiniteta u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Takve formulacije mogu biti obezbeđene kao jedinična doza, npr. doza efikasna za povećanje ciljane fagocitoze kod pojedinca. Farmaceutske formulacije takođe uključuju liofilizovane ili druge preparate SIRPα reagensa visokog afiniteta, koji se mogu rekonstituisati za upotrebu.

[0009] Omogućeni su postupci za manipulaciju ciljane fagocitoze ćelija, npr. putem makrofaga ili drugih fagocitnih ćelija sisara. U takvim postupcima, ćelija koja eksprimira CD47 je u kontaktu sa reagensom SIRPα visokog afiniteta iz obelodanjivanja u dozi koja je efikasna da blokira interakciju između endogenog SIRPα i CD47. Blokiranje ove interakcije omogućava obnavljanje ciljeva koji se obično ne fagocitoziraju. Kontaktiranje se može izvesti in vivo, npr. u terapeutske svrhe i in vitro, npr. za testove skrininga i slično. SIRPα reagens visokog afiniteta za ove svrhe može biti multimeran; ili monomeran. Monomerni reagensi nalaze posebnu upotrebu za davanje u kombinaciji sa antitelom koje se selektivno vezuje za ćeliju ciljanu za fagocitozu.

[0010] Tumorske ćelije, npr. čvrsti tumori kao što su karcinomi, sarkomi, melanomi, itd.; leukemije; limfomi itd. mogu biti ciljani na fagocitozu kontaktom ćelije tumora sa dozom visokog afiniteta SIRPα polipeptida koji je efikasan za blokiranje ili maskiranje CD47 na ćelijskoj površini, omogućavajući zahvatanje ciljeva koji se obično ne fagocitoziraju. Davanje efektivne doze polipeptida visokog afiniteta SIRPα pacijentu sprečava interakciju između CD47 i SIRPα, što povećava klirens tumorskih ćelija fagocitozom. U ove svrhe može biti korisno davati varijantu SIRPα visokog afiniteta u prisustvu imunoglobulina Fc vezanog za ćeliju ciljanu za fagocitozu, koja obezbeđuje profagocitni signal. U ovim aspektima, visoki afinitet SIRPα polipeptid može da se kombinuje sa monoklonskim antitelom usmerenim protiv jednog ili više dodatnih markera tumorskih ćelija, koji sastavi mogu biti sinergistički za pojačavanje fagocitoze i eliminaciju tumorskih ćelija u poređenju sa upotrebom pojedinačnih sredstava. Monomerni SIRPα reagensi visokog afiniteta su povoljni za ovu svrhu, jer imaju nisku toksičnost u eritrocitima. Alternativno SIRPα fuzioni konstrukt koji sadrži imunoglobulin Fc region, npr. onaj koji daje profagocitni signal, može se davati.

[0011] SIRPα reagens visokog afiniteta može sadržavati etiketu koja se može otkriti. Takav obeleženi reagens može se upotrebiti za potrebe slikanja in vitro ili in vivo, npr. u snimanju tumora.

KRATAK OPIS SLIKA

[0012] Slike 1A-1E. Usmerena evolucija varijanti SIRPα visokog afiniteta. A. Šema blokade CD47 rastvorljivim visokim afinitetom SIRPα. (Levo) U bazalnom stanju, ekspresija CD47 na ćelijama kancera aktivira SIRPα na makrofazima, pokreću inhibitornu kaskadu kroz SHP 1 i 2 tirozin fosfataze i sprečava fagocitozu ćelija kancera. (Desno) Rastvorljivi, visoki afinitet SIRPα protein konkurentno antagonizuje CD47 i sprečava interakciju sa SIRPα na makrofazima, čime dezinfikuje fagocitozu. B. Šematski prikaz površinskog prikaza kvasca domena SIRPα V-skupa Ig (domen 1, d1). Klonovi kvasca (sive ćelije) predstavljaju različite varijante SIRPα (obojene izbočine). Umetanje označava vezu SIRPα na površini ćelije kvasca fuzijom sa Aga2 i selekcijom sa biotiniliranim CD47. C. Rezime merenja sekvenci i SPR afiniteta konstruisanih varijanti SIRPα. Položaj mutiranih ostataka i njihov odgovarajući niz u alelu 1 divljeg tipa označen je na vrhu tabele. Crvena boja teksta označava konsenzusne mutacije, a plava senka označava ostatke kontakta u konsenzusu. Reprezentativni SPR senzorski programi divljeg tipa SIRPα i varijante visokog afiniteta, imobilizovanog CD47 koji vezuje CDD, prikazani su s desne strane. RU = jedinice za odgovor. D. Kristalna struktura kompleksa FD6:CD47 prikazana je kao prozirne površine koje sadrže prikaz vrpce FD6 (narandžasta) i CD47 (plava). E. Superpozicija divljih vrsta (magenta) i visoko afinitetnih (zelenih) SIRPα:CD47 kompleksa. Umeci prikazuju mutirane kontaktne ostatke u SIRPα C'D petlji (štapovima) i vezujućem interfejsu CD47 (vrh, prostili koji ispunjava; dno, štapići).

[0013] Slike 2A-2H. Varijante SIRPα visokog afiniteta blokiraju CD47 i podstiču fagocitozu in vitro. A. Krive doza-reakcija na antagonizam CD47 na ćelije Raji limfoma sa divljim tipom SIRPα alela 1 (WTa1, ružičasta), fragmenti Fab anti-CD47 klona B6H12 (narandžasti) ili dve varijante SIRPα visokog afiniteta (FD6, CV1, zelena). Ćelije obojene titracijskim koncentracijama sredstava za blokiranje CD47 u konkurenciji sa 100 nM Alexa Fluili 647-konjugovanim WT SIRPα tetramerom. B. Reprezentativne slike testova fagocitoze izvedene sa Raji limfomskim ćelijama obeleženim CFSE i RFP+ makrofazima sa kontrolom veziva (PBS) ili mutantom visokog afiniteta SIRPα spojenim sa humanim IgG4 (CV1-hlgG4). Prilozi pokazuju makrofag koji je gutao više ćelija kancera. Skala = 50 µm. C. Reprezentativne parcele koje prikazuju testove fagocitoze analizirane protočnom citometrijom. Ljudski makrofagi su zajedno kultivisani sa GFP+ DLD-1 ćelijama i navedenim tretmanima. Izlazi su korišćeni za procenu GFP+ makrofaga (crveni) kao procenat ukupne populacije makrofaga (plavi). D. Fagocitoza tumorskih ćelija GFP+ od strane humanih doktorskih makrofaga kako je procenjeno protočnom citometrijom. Svi tretmani proteina koji se koriste pri 100 nM. Procenat GFP+ makrofaga je normalizovan na maksimalan odgovor svakog davaoca protiv svake ćelijske linije. E. Fagocitoza ćelija GFP+ DLD-1 sa različitim koncentracijama varijanti SIRPα-Fc ili izotipsko podudarnim anti-CD47 antitelom (klon B6H12). F. Fagocitoza GFP+ DLD-1 ćelija sa nespecifičnom izotipskom kontrolom (mlgG1), ne blokirajućim anti-CD47 (2D3) ili anti-EpCam antitelama. Sva antitela su upotrebljena u 20 µg/mL. WT SIRPα ili FD6 varijanti sa visokim afinitetom varijante korišćeni su na 1 µM i kombinovani kako je naznačeno. G. Fagocitoza ćelija GFP+ DLD-1 sa različitim koncentracijama cetuksimaba (anti-EGFR) sama (crvena) ili u kombinaciji sa WT SIRPα monomerima (ružičasta) ili monomerima SIRPα visokog afiniteta (zelena). Sve varijante SIRPα koje se koriste pri 100 nM. H. Fagocitoza GFP+ Raji ćelija sa različitim koncentracijama rituksimaba (anti-CD20) sama (crvena) ili u prisustvu WT SIRPα monomera (roza) ili visokoafinitetnih SIRPα monomera (zelena). Sve varijante SIRPα korištene su pri 100 nM. D-H Svi testovi fagocitoze ljudske makrofage izvedeni su sa makrofazima dobijenim od najmanje tri nezavisna davalaca krvi. Trake grešaka označavaju standardnu devijaciju. ns = nije značajno, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 prema WT SIRPα varijanti (d,g,h), u odnosu na B6H12-hlgG4 (e), ili kako je drugačije naznačeno.

[0014] Slike 3A-3H. SIRPα-Fc fuzioni proteini visokog afiniteta su efikasni kao pojedinačna sredstva protiv kancera. A. Reprezentativna slika GFP-luciferaze DLD-1 ćelija ugrađena u peritonealnu šupljinu, formirajući diseminirane tumorske čvorove među okolnim petljama creva. B. Preživljavanje miševa koji su prebačeni sa GFP-luciferazom DLD-1 ćelijama nakon tretmana sa kontrolnim sredstvom (PBS, crveno) ili fuzionim proteinom visokog afiniteta SIRPα-hIgG4 (CV1-hIgG4, plavi). C. Reprezentativna analiza humanog Fc vezanog za površinu celih krvnih ćelija kod životinja koje su lečene u b. D. Analiza krvi lečenih životinja u b koja pokazuje prosečno i standardno odstupanje od četiri životinje u grupi tokom vremena. Tačkasta linija pokazuje donju granicu normalnih vrednosti. E. Rast GFP-luciferaze 639-V ćelija kancera mokraćnog mehura u dorzalnom potkožnom tkivu NSG miševa nakon tretmana navedenim terapijama kako je procenjeno bioluminescencijskim slikanjem. Trake prikazuju srednje vrednosti, tačke pokazuju vrednosti od pojedinačnih miševa. F. Reprezentativne slike bioluminiscencije 639-V nakalamljenih miševa iz svake grupe za tretiranje na dan 37 nakon ugradnje. G. Obim tumora 639-V nakalamljenih miševa na dan 38 nakon gravitacije. Trake prikazuju srednje vrednosti, tačke pokazuju vrednosti od pojedinačnih miševa. H. Preživljavanje miševa koji su privedeni GFP-luciferazom+ 639-V ćelijama. AH. Crne strelice označavaju početak i prestanak svakodnevnog tretmana. ns = nije značajno, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 za kontrolni tretman sredstva za prenošenje u odnosu na CV1-hlgG4.

[0015] Slike 4A-4F. Monomeri visokog afiniteta SIRPα povećavaju efikasnost monoklonskih antitela in vivo. A. Rast tumora GFP-luciferaze Raji limfoma svakodnevnim tretmanom PBS (crveni), CV1 monomerom (narandžasti), rituksimabom (zeleni) ili rituksimabom plus CV1 monomerom (plavi), kako je procenjeno bioluminescencijskim slikanjem. Trake označavaju srednje vrednosti, tačke pokazuju vrednosti kod pojedinačnih miševa. B. Reprezentativne slike bioluminiscencije miševa 29. dana nakon ugradnje. Crveni krugovi označavaju mesta primarnih tumora, crvena strelica označava mesto metastaza u aksilarne limfne čvorove. C. Srednja merenja zapremine tumora kod miševa iz A. Trake grešaka prikazuju standardnu devijaciju. D. Preživljavanje miševa koji nose limfome iz AE Rast tumora GFP-luciferaze Raji limfomi nakon dvonedeljnog tretmana PBS (crveni), CV1 monomera (narandžasti), alemtuzumab (zeleni), alemtuzumab i CV1 monomera (plavi), kao procenjena merenjima zapremine tumora. Trake označavaju srednje vrednosti, tačke pokazuju vrednosti kod pojedinačnih miševa. F. Preživljavanje miševa koji nose limfome sa E. A-F Crne strelice ukazuju na početak i prestanak lečenja. ns = nije značajno, *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001 za sve grupe nasuprot ritukimab+CV1 monomeru ili sam alemtuzumab nasuprot alemtuzumab+CV1 monomeru.

[0016] Slike 5A-5B. Dizajn biblioteke i nizovi iz prve generacije. A. Levo: Tabela nasumičnih pozicija biblioteke „kontaktnih ostataka“ sa mogućim varijantama aminokiselina i lokacijom nasumičnih pozicija unutar SIRPα. Desno: Lokacija i opis nasumičnih pozicija za bezkontaktnu biblioteku 'jezgra ostatka'. SIRPα je prikazan zeleno, CD47 je prikazan magenta, a nasumični položaji su predstavljeni kao bočni lanci koji ispunjavaju prostor. B. Pregled sekvenci SIRPα varijanti dobijenih nakon prve generacije selekcija. Položaj mutiranih ostataka i njihov odgovarajući niz u alelu 1 divljeg tipa označen je na vrhu tabele. Plavo senčenje označava „kontaktne“ mutacije koje se javljaju na interfejsu SIRPα:CD47. Italik font označava mutacije na pozicijama koje nisu bile nasumične u sabranoj biblioteci (Glu47 i His56).

[0017] Slika 6. Dizajn biblioteke izbora druge generacije. Tabela nasumičnih položaja i mogućih aminokiselina za biblioteku druge generacije i položaj promenljivih ostataka unutar strukture SIRPα. SIRPα je prikazan zeleno, CD47 je prikazan magenta, a nasumični položaji su predstavljeni kao bočni lanci koji ispunjavaju prostor.

[0018] Slika 7. Reprezentativna mapa gustine elektrona FD6:CD47 kompleksa. 2mFo-DFckarta gustine elektrona kontinuirana je na 2.0σ. Modelirani aminokiselinski ostaci prikazani su kao štapići, a ostaci FD6 u žutoj boji, a CD47 ostaci zelene boje. Ostatak 1 piroglutaminske kiseline CD47 označen je kao PCA1 iznad odgovarajućeg ostatka i gustine.

[0019] Slike 8A-8C. Varijante SIRPα visokog afiniteta potencijalno vežu i blokiraju CD47 na ćelijama kancera. A. Titracione krive divljeg tipa SIRPα alela 1 monomera (WTa1 mono, roza), divljeg tipa SIRPα alel 1 tetramer (WTa1 tetramer, bordo) ili varijante SIRPα visokog afiniteta (FD6, FA4, zelena) koje se vezuju na ćelije Jurkat leukemije. Trake grešaka označavaju standardnu devijaciju. B. Test blokade CD47 na Jurkat ćelijama. CD47 antagonisti su dodani u konkurenciji sa Alexa Fluili 647-konjugiranim tetramerom divljih vrsta SIRPα. Blokiranje je testirano na mutaciji SIRPα prve generacije kao monomera (1A5 mono, tirkizni), mutaciji SIRPα druge generacije kao monomeru (FD6 mono, zeleni), mutaciji SIRPα druge generacije kao Fc fuziji sa ljudskim IgG4 (FD6-hlgG4, plavi) i anti-CD47 klon B6H12 (narandžasti). Trake grešaka označavaju standardnu devijaciju. C. Vezivanje divljih vrsta SIRPα-Fc proteina (WTa1-hlgG4, ružičasto; WTa2-hlgG4, ljubičasta), visoko-afinitetni SIRPα-Fc proteini (FD-hlgG4, CV1-hlgG4, zeleni) i klon antitela protiv CD47 B6H12 (B6H12-hlgG4, narandžasti) prema ćelijama kancera DLD-1 debelog creva.

[0020] Slika 9. Varijante SIRPα-Fc visokog afiniteta ograničavaju rast DLD-1 ćelija kancera debelog creva in vivo. Krivulje rasta tumora nakon tretiranja vehikulumom (PBS, crveno) ili fuzionim proteinom visokog afiniteta SIRPαhIgG4 (CV1-hlgG4, plavi), mereno bioluminiscentnim slikanjem peritonealnih šupljina tretiranih miševa. Tačke označavaju vrednosti od pojedinačnih miševa, a linije prikazuju srednje vrednosti. **p<0.01 dvosmernom ANOVA sa Bonferonijevim post-testom.

[0021] Slike 10A-10D. Lečenje varijantama SIRPα-Fc visokog afiniteta izaziva infiltraciju makrofaga i utiče na indeks crvenih ćelija. A. Secirana masa potkožnog palpabilnog tkiva od miša tretiranog CV1-hlgG4. Levo = bela svetlost, desno = GFP fluorescencija. Isprekidani ovali okružuju dva površinska tumorska kvržica, zvezdice označavaju stromalni infiltrat bogat makrofagom. Linija skale = 5 mm. B. Bojenje hematoksilinom i eozinom palpabilne mase potkožnog tkiva od miša tretiranog CV1-hlgG4, demonstrirajući prisustvo infiltracionih makrofaga. Tumorski čvor je vidljiv u gornjem levom delu slike sa inflamatornim infiltratom koji ga okružuje. Umeci prikazuju reprezentativne makrofage u području označenom isprekidanom kutijom. C. Imunohistohemijsko bojenje za F4/80, mišji marker makrofaga, u masi potkožnog tkiva koji se može opipati od miša tretiranog sa CV1-hlgG4. Tumorski čvor je vidljiv u desnom delu slike, a na levoj strani su infiltrirani makrofazi. Prilog pokazuje reprezentativne makrofage u području naznačenom isprekidanom kutijom, sa dokazima makrofaga u procesu fagocitoze (crne strelice) i uspešnog zahvatanja ćelija tumora (crvene strelice). D. Analiza krvi na miševima koji nose GFP-luciferazu+ 639-V tumore mokraćne bešike, na dan 34. posle ugradnje. Tretman CV1-hlgG4 doveo je do umerenog smanjenja indeksa crvenih krvnih zrnaca (žuto). Nije primećena toksičnost za druge krvne loze.

[0022] Slike 11A-11C. Tretman monomerima SIRPα visokog afiniteta ne izaziva toksičnost crvenih krvnih zrnaca. A. Merenja hematokrita kod miševa tokom lečenja određenim terapijama. B. Nivo hemoglobina kod miševa tokom lečenja navedenim terapijama. C. Apsolutna brojka crvenih krvnih zrnaca kod miševa tokom lečenja navedenim terapijama. A-C. ns = nije značajno. Crne strelice označavaju početak i prestanak svakodnevnog tretmana.

[0023] Slika 12. Varijante SIRPα visokog afiniteta pokazuju sigurnost kod primata koji nisu ljudi. Majmuni cinomolgus su tretirani jednom intravenskom injekcijom visoko-afinitetnog SIRPα-Fc (FD6-hlgG4, crveni) ili serijom eskalacije doze visoko-afinitetnog SIRPα monomera (FD6 mono, plavi). Isprekidane crte prikazuju dane lečenja dozama navedenim u mg/kg. Primećena je umerena toksičnost za crvena krvna zrnca kao pad hematokrita tokom lečenja FD6-hlgG4, a nije primećen gubitak crvenih krvnih ćelija kod terapije monomerom FD6. Nije primećena toksičnost za druge organe.

[0024] Slike 13A-13C. Radioaktivno obeležene varijante SIRPα sa visokim afinitetom su efikasne kao neinvazivna sredstva za snimanje kancera. A. NSG miševi su subkutano uzgajani sa DLD-1 ćelijama kancera humanog creva u gornjem desnom boku. Miševima koji nose tumore ubrizgan je Cu-64 obeležen FD6 monomerom i snimljen PET skeniranjem. Crvene strelice označavaju unos tumora, a crne strelice označavaju unos bubrega. Gornji paneli prikazuju dorzalne slike, a donji paneli pokazuju poprečne preseke kroz tumore. M2, M3 predstavljaju slike dveju nezavisnih životinja. B. Kvantifikacija signala životinja sa vremenom. FD6 zadržava tumor najmanje 24 sata. C. Tabela koja pokazuje prisustvo radioaktivno obeleženog FD6 u tumoru i normalnom tkivu. T:N = odnos unosa tumora u naznačeno tkivo. ID/g = ubrizgana doza po gramu tkiva.

[0025] Slike 14A-14F. Sortiranje ćelija makrofaga aktivirano fluorescencijom pokazuje da su varijante SIRPα visokog afiniteta indukovale fagocitozu ćelija kancera. Primarni humani makrofagi i ćelije karcinoma debelog creva GFP+ DLD-1 ko-kultivisane su u prisustvu 100 nM CV1-hlgG4. Fagocitoza je kvantifikovana kao procenat CD45+ makrofaga koji su postali GFP+. Populacije makrofaga sortirane su protočnom citometrijom za one koje su bile negativne na GFP (plava), niska GFP (crvena) ili visoka GFP (zelena). B Sortirani GFP-visoki makrofagi sadrže zahvaćene ćelije tumora kao što su vizuelno prikazane mikroskopijom pod svetlosnim svetlom (gornja slika) i fluorescentnom svetlošću (donja slika; crvena = CD45, zelena = GFP). C Wright-Giemsa bojenje DLD-1 ćelijama kancera debelog creva. D Wright-Giemsa bojenje sortirane populacije makrofaga negativnih na GFP kojima nedostaje prožet materijal. E Wright-Giemsa bojenje sortirane populacije makrofaga sa niskim GFP obogaćeno zaokupljenim materijalom. F Wright-Giemsa bojenje sortirane populacije makrofaga visokih GFP koje sadrže zahvaćene ćelije tumora. B-F skala predstavlja 100 µm.

[0026] Slika 15. Varijante SIRPα visokog afiniteta sinergišu sa trastuzumabom za Her2+ karcinom dojke. Primarni ljudski makrofagi su zajedno kultivisani sa GFP+ SK-BR-3 ćelijama kancera dojke i naznačenim terapijama. Fagocitoza je procenjena protočnom citometrijom. Dodavanje monomer FD6 ili CV1 visokog afiniteta SDP trastuzumaba u fagocitozu pojačanu trastuzumabom. ns = nije značajno, ***p<0.001, ****p<0.0001 prema kontrolnim tretmanima ili divljim tipom SIRPα tretmana u kombinaciji sa trastuzumabom.

[0027] Slike 16A-D: Varijante SIRPα visokog afiniteta indukuju maksimalnu efikasnost u prisustvu Fc lanaca povezanih sa tumorom. Šema koja prikazuje varijante SIRPα visokog afiniteta. B Analitička filtracija gela koja pokazuje fuzione proteine visokog afiniteta SIRPα-Fc se prečišćava kao jedna vrsta (zapremina elucije = 13.44) sa ograničenom agregacijom. Analiza fagocitoze pomoću RFP+ mišjih makrofaga i GFP+ humanih limfoma Raji ćelija. Blokada CD47 sa visoko-afinitetnim SIRPα monomerom CV1 ili fragmenti anti-CD47 Fab doveli su do neznatnog povećanja fagocitoze, dok je lečenje visoko-afinitetnim SIRPα-Fc ili netaknutim antitela protiv CD47 izazvalo povišenu fagocitozu. D Oligomerizacija CD47 ne indukuje fagocitozu. Analiza fagocitoze izvedena sa primarnim ljudskim makrofagama i GFP+ DLD-1 ćelijama kancera humanog creva. Lečenje dimerima sa visokim afinitetom SIRPα kojima nedostaje profagocitni stimulus ne indukuje znatne nivoe fagocitoze.

[0028] Slike 17A-17D: Varijante SIRPα visokog afiniteta vezuju i blokiraju druge ortologe CD47 sisara. A. Vezivanje visoko-afinitetne SIRPα varijante FD6, ali ne i divljih vrsta alela 1 humanog SIRPα, na mišje ćelije CT26 kancera debelog creva. B. Varijanta SIRPα visokog afiniteta FD6-Fc blokira vezanje mišjih divljih tipa SIRPα tetramera na mišu CD47 prikazanu na površini kvasca. C. Varijanta SIRPα visokog afiniteta CV1 veže miša CD47 prikazana na površini kvasca. D. Vezivanje 100nM alela divljih vrsta 2 SIRPα-Fc, visoko-afinitetna SIRPα-Fc ili antitela protiv CD47 (klonovi B6H12 i 5F9) na pseće MDCK ćelije, kao što je otkriveno protočnom citometrijom sa anti-humanim IgG sekundarnim antitelom.

DEFIINICIJE

[0029] U opisu koji sledi korišćeni su brojni pojmovi koji se konvencionalno koriste u polju ćelijske kulture. Da bi se obezbedilo jasno i dosledno razumevanje specifikacije i zahteva i obima koji se takvim terminima treba dati, date su sledeće definicije.

[0030] Termini "inhibitori", "blokirajuća sredstva" i "sredstva za maskiranje" interakcije između SIRPα i njegovog liganda CD47 odnose se na molekule koji sprečavaju vezivanje SIRPα i CD47. Za razvojne svrhe vezivanje se može obaviti u eksperimentalnim uslovima, npr. korišćenje izolovanih proteina kao vezujućih partnera, korišćenje delova proteina kao vezujućih partnera, korišćenje prikaza kvasca proteina ili delova proteina kao partnera koji se vezuju i slično.

[0031] U fiziološki relevantne svrhe vezivanje SIRPα i CD47 obično je događaj između dve ćelije, pri čemu svaka ćelija ispoljava jednog od partnera koji se vezuje. Posebno je zanimljivo ispoljava SIRPα na fagocitnim ćelijama, poput makrofaga; i ekspresija CD47 na ćelijama koje mogu biti meta fagocitoze, npr. tumorske ćelije, cirkulišuće hematopoetske ćelije i slično. Inhibitori se mogu identifikovati upotrebom ispitivanja in vitro i in vivo za vezivanje receptora ili liganda ili signalizaciju.

[0032] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" ovde su korišćeni naizmenično za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka. Termini se takođe odnose na aminokiselinske polimere u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na polimere aminokiselina koji se prirodno javljaju i aminokiselinski polimer koji se prirodno ne pojavljuje.

[0033] Termin "aminokiselina" odnosi se na prirodne i sintetičke aminokiseline, kao i na analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama. Prirodno prisutne aminokiseline su one kodirane genetskim kodom, kao i one aminokiseline koje su kasnije modifikovane, npr., hidroksiprolin, gama-karboksi glutamat i O-fosfo serin. Analozi aminokiselina odnose se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao i amino kiselina koja se javlja u prirodi, tj. .alfa. ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, npr., homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (npr., norleucin) ili modifikovane peptidne okosnice, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao i aminokiselina koja se javlja u prirodi. Mimetici aminokiselina odnose se na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu različitu od opšte hemijske strukture aminokiseline, ali koja funkcionišu na način sličan aminokiselini koja se prirodno nalazi.

[0034] Termini "ispitanik", "pojedinac" i "pacijent" ovde su korišćeni naizmenično za označavanje sisara koji se procenjuje na lečenje i/ili lečenje. Sisar je možda čovek. Termini "ispitanik", "pojedinac" i "pacijent" obuhvataju, bez ograničenja, osobe koje imaju kancer. Ispitanici mogu biti ljudi, ali mogu uključivati i druge sisare, naročito one sisare koji su korisni kao laboratorijski modeli za ljudsku bolest, npr. miš, pacov itd.

[0035] Termini "karcinom", "neoplazma" i "tumor" ovde se koriste naizmenično kako bi se odnosili na ćelije koje imaju autonomni, neregulisani rast, tako da pokazuju aberantni fenotip rasta koji karakteriše značajan gubitak kontrole nad ćelijskom proliferacijom. Ćelije od interesa za otkrivanje, analizu ili lečenje u ovoj prijavi uključuju prekancerozne (npr., benigne), maligne, pre-metastatske, metastatske i ne metastatske ćelije. Kancer gotovo svakog tkiva je poznat. Termin "teret kancera" odnosi se na kvantitet ćelija kancera ili količinu kancera kod ispitanika.

Smanjivanje opterećenja od kancera prema tome odnosi se na smanjenje broja ćelija kancera ili obima kancera kod ispitanika. Termin "ćelija kancera" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koju ćeliju koja je ćelija kancera ili je izvedena iz ćelije kancera, npr. klon ćelije kancera. Mnogi tipovi karcinoma su poznati onima koji poznaju ovo područje, uključujući solidne tumore kao što su karcinomi, sarkomi, glioblastomi, melanomi, limfomi, mijelomi itd., i cirkulirajući kanceri, poput leukemije. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer jajnika, kancer dojke, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, karcinom želuca, karcinom pankreasa, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer mokraćne kiseline. kancer urinarnog trakta, kancer tiroidne žlezde, kancer bubrega, karcinom, melanom, kancer glave i vrata i kancer mozga.

[0036] "Patologija" kancera uključuje sve pojave koje ugrožavaju dobrobit pacijenta. Ovo uključuje, bez ograničenja, nenormalan ili nekontroliran rast ćelija, metastaze, ometanje normalnog funkcionisanja susednih ćelija, oslobađanje citokina ili drugih sekretornih proizvoda na nenormalnim nivoima, suzbijanje ili pogoršanje inflamatornog ili imunološkog odgovora, neoplazija, premalignaliznost, malignost, invazija okolnih ili udaljenih tkiva ili organa, poput limfnih čvorova itd.

[0037] Kao što je ovde korišćeno, termini "recidiv kancera" i "recidiv tumora", kao i njegove gramatičke varijante, odnose se na dalji rast neoplastičnih ili kanceroznih ćelija posle dijagnoze karcinoma. Posebno se može javiti recidiv kada se u kancerogenom tkivu dogodi dalji rast ćelija. "Širenje tumora", slično se dešava kada ćelije tumora šire u lokalna ili udaljena tkiva i organe; stoga širenje tumora obuhvata metastaze tumora. "Invazija tumora" nastaje kada se rast tumora lokalno raširio da bi se komplikovala, uništila ili sprečila normalna funkcija organa kompromitovala funkcija zahvaćenih tkiva.

[0038] Kako se ovde koristi, pojam "metastaze" odnosi se na rast kanceroznog tumora u organu ili delu tela, koji nije direktno povezan sa organom originalnog karcinoma tumora. Pod metastazama se podrazumeva mikrometastaza, što predstavlja prisustvo nedodirljive količine kancerogenih ćelija u organu ili delu tela koje nije direktno povezano sa organom originalnog karcinoma tumora. Metastaza se takođe može definisati kao nekoliko koraka procesa, poput odlaska ćelija kancera sa originalnog mesta tumora i migracije i/ili invazije ćelija kancera u druge delove tela.

[0039] Termin "uzorak" za pacijenta obuhvata uzorke krvi i drugih tečnih uzoraka biološkog porekla, uzorke čvrstog tkiva poput uzorka biopsije ili kultura tkiva ili ćelija izvedenih iz njih i potomstvo istog. Definicija takođe uključuje uzorke kojima je na bilo koji način manipulirano nakon nabavke, kao što je tretman reagensima; ispran; ili obogaćivanje određene ćelijske populacije, kao što su ćelije kancera. Definicija takođe uključuje uzorak koji je obogaćen za određene vrste molekula, npr. nukleinske kiseline, polipeptide itd. Termin "biološki uzorak" obuhvata klinički uzorak, a takođe uključuje tkivo dobijeno hirurškom resekcijom, tkivo dobijeno biopsijom, ćelije u kulturi, ćelijski supernatanti, lizati ćelija, uzorci tkiva, organa, koštane srži, krvi, plazme, seruma i sličnog. "Biološki uzorak" uključuje uzorak dobijen iz pacijentove ćelije kancera, npr., uzorak koji sadrži polinukleotide i/ili polipeptide koji su dobijeni iz ćelije kancera pacijenta (npr., ćelijski lizat ili drugi ćelijski ekstrakt koji sadrži polinukleotide i/ili polipeptide); i uzorak koji sadrži ćelije kancera pacijenta. Biološki uzorak koji sadrži ćeliju kancera pacijenta takođe može da uključuje ćelije koje nisu kancerogene.

[0040] Termin "dijagnoza" se ovde koristi za označavanje molekularnog ili patološkog stanja, bolesti ili stanja, kao što je identifikacija molekularne podvrste karcinoma dojke, kancera prostate ili drugog tipa karcinoma.

[0041] Termin "prognoza" se ovde koristi za predviđanje verovatnoće smrti ili progresije koji se može pripisati kanceru, uključujući recidiv, metastatsko širenje i otpornost na lekove neoplastične bolesti, poput kancera jajnika. Termin "predviđanje" ovde se koristi za označavanje akta predviđanja ili procene, zasnovan na posmatranju, iskustvu ili naučnom zaključku. U jednom primeru, lekar može predvideti verovatnoću da će pacijent preživeti, nakon hirurškog uklanjanja primarnog tumora i/ili hemoterapije tokom određenog vremenskog perioda bez recidiva kancera.

[0042] Kako se ovde koristi, termini „lečenje“, „lečiti“ i slično odnose se na primenu sredstva ili sprovođenje postupka u svrhu postizanja efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu da se delimično ili delimično spreči bolest ili njen simptom i/ili može biti terapeutski u smislu postizanja delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili simptoma bolesti. "Lečenje", kako se ovde koristi, može da uključuje lečenje tumora kod sisara, naročito kod čoveka, i uključuje: (a) sprečavanje pojave bolesti ili simptoma bolesti kod ispitanika koji može biti predisponiran za bolest, ali još uvek nije dijagnostikovano kao da ga ima (npr., uključujući bolesti koje mogu biti povezane ili uzrokovane primarnom bolešću; (b) inhibiranje bolesti, tj., zaustavljanje njenog razvoja; i (c) ublažavanje bolesti, tj., izazivanja regresije bolesti.

[0043] Lečenje se može odnositi na bilo kakve pokazatelje uspeha u lečenju ili poboljšanje ili sprečavanje kancera , uključujući bilo koji objektivni ili subjektivni parametar, poput ublažavanja; remisija; umanjivanje simptoma ili čineći stanje bolesti podnošljivijim za pacijenta; usporavanje stope degeneracije ili opadanja; ili što krajnju tačku degeneracije čini manje oslabiti. Lečenje ili poboljšanje simptoma može se zasnivati na objektivnim ili subjektivnim parametrima; uključujući rezultate pregleda od strane lekara. Shodno tome, termin "lečenje" uključuje davanje jedinjenja ili sredstva predmetnog obelodanjivanja radi sprečavanja ili odlaganja, ublažavanja ili zaustavljanja ili inhibicije razvoja simptoma ili stanja povezanih sa karcinomom ili drugim bolestima. Termin "terapeutski efekat" odnosi se na smanjenje, uklanjanje ili sprečavanje bolesti, simptome bolesti ili neželjene efekte bolesti kod ispitanika.

[0044] "U kombinaciji sa", "kombinovana terapija" i "kombinovani proizvodi" se odnose na istodobnu primenu pacijentu prvog terapeuta i jedinjenja koja su ovde korišćena. Kada se primenjuju u kombinaciji, svaka komponenta može se davati istovremeno ili sekvencijalno bilo kojim redosledom u različitim vremenskim tačkama. Stoga se svaka komponenta može primeniti odvojeno, ali dovoljno blisko u vremenu da se obezbedi željeni terapeutski efekat.

[0045] Lečenje se može izvršiti davanjem kombinacije SIRPα reagensa visokog afiniteta obelodanjivanja sa citotoksičnim sredstvom. Jedna primerena klasa citotoksičnih lekova su hemoterapijska sredstva. Primeri hemoterapeutski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, aldesleukin, altretamin, amifostin, asparaginaza, bleomicin, kapecitabin, karboplatin, karmustin, kladribin, cisaprid, cisplatin, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin (DTIC), daktinomicin, docetaksel, doksorubicin, dronabinol, duokarmicin, etopozid, filgrastim, fludarabin, fluorouracil, gemcitabin, granisetron, hidroksiurea, idarubicin, ifosfamid, interferon alfa, irinotekan, lanzoprazol, levamizol, leukovorin, megestrol, mesna, metoksa, mitoteks, mitoksid, mitotreksid, metotreksan, mitotoksid, mitotreksid (Taxol™), pilokarpin, prohlorperazin, rituksimab, saproin, tamoksifen, taksol, topotekan hidrohlorid, trastuzumab, vinblastin, vinkristin i vinorelbin tartrat.

[0046] Davanje SIRPα reagensa visokog afiniteta ovog otkrića može se kombinovati sa efikasnom dozom sredstva koja povećava hematokrit pacijenta, na primer sredstva za stimulaciju eritropoetina (ESA). Takva sredstva su poznata i upotrebljena u struci, uključujući, na primer, Aranesp® (darbepoetin alfa), Epogen®NF/Procrit®NF (epoetin alfa), Omontys® (peginesatid), Procrit®, itd.

[0047] Ostale kombinovane terapije uključuju davanje antitela specifičnih za ćeliju, na primer antitela koja su selektivna za markere tumorskih ćelija, zračenje, operativni zahvat i/ili oduzimanje hormona (Kwon i dr., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 96: 15074-9, 1999). Inhibitori angiogeneze se takođe mogu kombinovati sa postupcima obelodanjivanja.

[0048] Jedan broj antitela se trenutno nalazi u kliničkoj upotrebi za lečenje raka, a druga su u različitim fazama kliničkog razvoja. Na primer, postoji veliki broj antigena i odgovarajuća monoklonska antitela za lečenje maligniteta B ćelija. Jedan ciljni antigen je CD20. Rituksimab je himerno nekonjugovano monoklonsko antitelo usmereno na antigen CD20. CD20 ima važnu funkcionalnu ulogu u aktivaciji, proliferaciji i diferencijaciji B ćelija. CD52 antigen je ciljan monoklonskim antitelom alemtuzumab, koji je indiciran za lečenje hronične limfocitne leukemije. CD22 cilja mnoštvo antitela i nedavno je pokazao efikasnost u kombinaciji sa toksinom u dlakavim ćelijama otpornim na hemoterapiju. Dva nova monoklonska antitela koja ciljaju CD20, tositumomab i Ibritumomab, predata su Upravi za hranu i lekove (FDA). Ova antitela se konjuguju sa radioizotopovima. Alemtuzumab (Campath) se koristi u lečenju hronične limfocitne leukemije; Gemtuzumab (Mylotarg) nalazi upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije; Ibritumomab (Zevalin) nalazi upotrebu u lečenju ne-Hodžkinovi limfomi; Panitumumab (Vectibix) nalazi upotrebu u lečenju kancera debelog creva.

[0049] Monoklonska antitela korisna u postupcima obelodanjivanja koja su korišćena u čvrstim tumorima uključuju, bez ograničenja, edrekolomab i trastuzumab (herceptin). Edrekolomab cilja antigen 17-1A koji se vidi u raku debelog creva i rektuma, a odobren je za upotrebu u Evropi za ove indikacije. Trastuzumab cilja HER-2/neu antigen. Ovaj antigen je primećen kod 25% do 35% karcinoma dojke. Cetuksimab (Erbitux) je takođe od interesa za upotrebu u postupcima obelodanjivanja. Antitelo se vezuje za EGF receptor (EGFR) i primenjeno je u lečenju čvrstih tumora, uključujući karcinom debelog creva i pločasti ćelijski karcinom glave i vrata (SCCHN).

[0050] Pored terapije raka, SIRPα reagensi predmetnog obelodanjivanja su korisni i u drugim terapijama u kojima se daju monoklonska antitela u svrhu iscrpljivanja ćelija, npr. u lečenju inflamatornih bolesti iscrpljivanjem imunih ćelija. U takve svrhe, SIRPα reagens predmetnog obelodanjivanja se daje u kombinaciji sa terapeutskim antitelom, npr. sa rituksimabom za iscrpljivanje B ćelija kod inflamatornih bolesti i autoimunih stanja; alemtuzumab za multiple sklerozu; OKT3 za imunosupresiju; drugi za kondicioniranje transplantacije koštane srži; i slično.

[0051] "Istovremeno davanje" terapijskog leka protiv kancera, ESA ili antitela usmerenog na tumor sa farmaceutskom kompozicijom ovog otkrića znači davanje sa SIRPα reagensom visokog afiniteta u to vreme da i lek, ESA ili antitelo i sastav predmetnog obelodanjivanja imaće terapeutski efekat. Takvo istovremeno davanje može da uključi istodobnu (tj. istovremeno), pre ili naknadnu primenu leka, ESA ili antitela u vezi sa primenom jedinjenja iz obelodanjivanja. Osoba sa običnim veštinama iz ove oblasti neće imati poteškoća u određivanju odgovarajućeg vremena, sekvence i doze primene za određene lekove i sastave predmetnog obelodanjivanja.

[0052] Kao što je ovde korišćeno, fraza "preživljavanje bez bolesti" odnosi se na nedostatak takvog recidiva i/ili širenja tumora i sudbinu pacijenta posle dijagnoze, u pogledu efekata raka na životni vek pacijenta. Fraza "opšti opstanak" odnosi se na sudbinu pacijenta posle dijagnoze, uprkos mogućnosti da uzrok smrti kod pacijenta nije direktno posledica dejstva raka. Fraze, "verovatnoća preživljavanja bez bolesti", "rizik od recidiva" i njegove varijante, odnose se na verovatnoću da se tumor pojavi ili se proširi kod pacijenta posle dijagnoze karcinoma, pri čemu se verovatnoća određuje prema procesu obelodanjivanje.

[0053] Kako se ovde koristi, termin "u vezi sa", ili "veza sa", i slični pojmovi, odnosi se na statističku povezanost između slučajeva dva događaja, gde događaji uključuju brojeve, skupove podataka i slično. Na primer, kada događaji uključuju brojeve, pozitivna korelacija (koja se ovde naziva i "direktna korelacija") znači da kako se jedan povećava, tako i drugi raste. Negativna korelacija (koja se ovde takođe naziva "obrnuta korelacija") znači da kako se jedna povećava, druga opada.

[0054] "Jedinica za doziranje" odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao unitarne doze za pojedinca koji se leči. Svaka jedinica može da sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja (a) izračunatog da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa traženim farmaceutskim nosačem. Specifikacija oblika dozne jedinice može biti diktirana (a) jedinstvenim karakteristikama aktivnog (ih) jedinjenja (a) i određenim terapeutskim efektima (a) koji se postižu, i (b) ograničenjima svojstvenim u umetnosti jedinjenja tako aktivnog jedinjenja jedinjenje.

[0055] "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens" označava pomoćnu supstancu koja je korisna u pripremi farmaceutski sastav koji je generalno siguran, netoksična i poželjna i uključuje ekscipijense koji su prihvatljivi za veterinarsku upotrebu kao i za farmaceutsku upotrebu kod ljudi. Takvi pomoćni sastojci mogu biti čvrsti, tečni, polu-čvrsti ili, u slučaju aerosolne sastave, gasoviti.

[0056] "Farmaceutski prihvatljive soli i estri" su soli i estri koji su farmaceutski prihvatljivi i imaju željena farmakološka svojstva. Takve soli uključuju soli koje mogu da se formiraju tamo gde su kiseli protoni prisutni u jedinjenjima sposobni da reaguju sa neorganskim ili organskim bazama. Pogodne neorganske soli uključuju one koje se formiraju uz alkalne metale, npr. natrijuma i kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i aluminijuma. Pogodne organske soli uključuju one formirane sa organskim bazama, kao što su aminske baze, npr., etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N metilglukamin i slično. Takve soli uključuju i adicione soli koje se formiraju sa anorganskim kiselinama (npr., hlorovodoničnom i bromovodoničnom kiselinom) i organskim kiselinama (npr., sirćetnom kiselinom, limunskom kiselinom, maleinskom kiselinom, i alkanskim i arenosulfonskim kiselinama kao što je metansulfonska kiselina i benzensulfonska kiselina). Farmaceutski prihvatljivi estri uključuju estre koji se formiraju iz karboksi, sulfoniloksi i fosfonoksi grupa prisutnih u jedinjenjima, npr., C1-6alkil estra. Kada su prisutne dve kisele grupe, farmaceutski prihvatljiva so ili ester mogu biti mono-kiselina-monoso ili ester ili di-so ili ester; i slično tamo gde su prisutne više od dve kisele grupe, neke ili sve takve grupe mogu se salifikovati ili esterifikovati. Jedinjenja koja su imenovana u ovom otkriću mogu biti prisutna u ne-salifikovanom ili ne-sterilizovanom obliku, ili u salifikovanom i/ili esterifikovanom obliku, a namena takvih jedinjenja je da obuhvati i originalno (ne-salifikovano i ne-sterilizovano) jedinjenje i njegove farmaceutski prihvatljive soli i estre. Takođe, određena jedinjenja koja su imenovana u ovom otkriću mogu biti prisutna u više od jednog stereoizomernog oblika, a imenovanje takvih jedinjenja ima za cilj da obuhvati sve pojedinačne stereoizomere i sve smeše (bilo racemične ili druge) takvih stereoizomera.

[0057] Termini "farmaceutski prihvatljiva", "fiziološki podnošljiva" i njihove gramatičke varijacije, jer se odnose na sastave, nosače, razblaživače i reagense, koriste se naizmenično i predstavljaju da su materijali sposobni da se daju čoveku ili na njega bez proizvodnje nepoželjnih. fiziološke efekte do mere koja bi zabranila davanje sastava.

[0058] "Terapeutski efikasna količina" označava količinu koja je, kada se daje ispitaniku za lečenje bolesti, dovoljna da se sprovede lečenje te bolesti.

DETALJNI OPIS

[0059] Obezbeđeni su polipeptidi visokog afiniteta i njihovi analozi, koji se općenito mogu nazvati SIRPα reagensi visokog afiniteta. Reagensi su varijante prirodnog humanog proteina SIRPα. Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje rastvorljivi polipeptid varijante SIRPα, pri čemu polipeptidu nedostaje transmembranski domen SIRPα i sadrži najmanje jednu i ne više od 15 promena aminokiselina u odnosu na divlji tip SIRPα sekvence, i gde promena aminokiseline povećava afinitet vezivanje polipeptida SIRPα na CD47, na primer smanjenjem odstupanja za najmanje 10 puta, najmanje 20 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta, najmanje 500 puta ili više.

[0060] Prema predmetnom obelodanjivanju, promene aminokiselina uključuju sve modifikacije aminokiselina koje su nastale u prirodi ili koje je stvorio čovek poznate ili kasnije otkrivene na terenu. Promene aminokiseline mogu obuhvatati, npr., supstituciju, brisanje, dodavanje, ubacivanje, itd. jedne ili više aminokiselina. Promene aminokiseline mogu uključivati zamenu postojeće aminokiseline drugom aminokiselinom. Promene aminokiselina mogu uključivati zamenu jedne ili više postojećih aminokiselina ne-prirodnim aminokiselinama ili umetanje jedne ili više ne-prirodnih aminokiselina. Promene aminokiselina mogu se izvršiti u najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili više aminokiselinskih ostataka u odnosu na izvornu sekvencu. Jedna ili više aminokiselina menja promenjena svojstva SIRPα, npr., utičući na stabilnost, aktivnost vezivanja i/ili specifičnost, itd.

[0061] SIRPα reagens visokog afiniteta predmetnog obelodanjivanja sadrži najmanje jednu modifikaciju aminokiselina unutar d1 domena SIRPα, koja domena je data u SEQ ID NO:1 i odgovara ostacima 31 do 149 izvornog ljudskog proteina celog čoveka celog dužine. SIRPα reagens visokog afiniteta može da se sastoji od celog ili dela d1 domena; i mogu dalje sadržavati jednu ili više aminokiselina iz SIRPα izvan d1 domena; ili mogu da sadrže sekvence aminokiselina koje nisu SIRPα, a koje uključuju bez ograničenja sekvence imunoglobulina Fc regiona.

[0062] SIRPα polipeptidi visokog afiniteta mogu biti dužine najmanje oko 100 aminokiselina, najmanje oko 110, najmanje oko 120, najmanje oko 150, najmanje oko 200 aminokiselina, sve do pune dužine divljeg tipa protein na transmembranskom domenu, tj. dužine oko 343 aminokiseline, i opciono je stopljen sa heterolognim polipeptidom, npr. imunoglobulin Fc.

[0063] Kraći peptidi unutar d1 domena i koji sadrže najmanje jednu promenu aminokiselina koja je ovde data, nalaze se u upotrebi, pri čemu takvi peptidi obično sadrže neprekidni deo aminokiselina iz redosleda ovde navedenog u dužini ne većoj od 10 aminokiselina, ne većoj od 15 aminokiselina u dužini, ne više od 20, ne više od 25, ne više od 30 aminokiselina, ne više od 35 aminokiselina, ne više od 40 aminokiselina, ne više od 45 aminokiselina, ne više od 50 aminokiselina , ne više od 55 aminokiselina, ne više od 60 aminokiselina, ne više od 65 aminokiselina, ne više od 70 aminokiselina, ne više od 75 aminokiselina, ne više od 80 aminokiselina, ne više od 85 aminokiselina, ne više od 90 aminokiselina, ne više od 95 aminokiselina, ne više od 100 aminokiselina.

[0064] Promene aminokiselina u polipeptidu visokog afiniteta SIRPα izvedene su na jednoj ili više aminokiselina unutar skupa hidrofobnih jezgra SIRPα, koji uključuju, bez ograničenja, ostatke (numerisanje definisano sekvencijom divljeg tipa d1 domene, postavljenom dalje kao SEQ ID NO:1) L4, V6, V27, I36, F39, L48, I49, Y50, F57, V60, M72, F74, I76, V92, F94 i F103. Promene aminokiselina mogu se izvršiti na sekvenci alela 2 divljeg tipa, npr. kao što je prikazano za CV1.

[0065] Promene aminokiselina mogu se izvršiti na jednoj ili više aminokiselina unutar skupa kontaktnih ostataka koji stupaju u interakciju sa CD47, koji uključuju, bez ograničenja, A29, L30, 131, P32, V33, G34, P35, Q52, K53, E54 , S66, T67, K68, R69, F74, K93, K96, G97, S98 i D100 (SEQ ID NO:1).

[0066] Promene aminokiseline mogu se izvršiti na dve ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, a ne više od 14 aminokiselina unutar kombinovanog skupa kontaktnih ostataka i skupa hidrofobnih ostataka jezgra definisanih iznad.

[0067] Promene aminokiseline se rade na jednoj ili više aminokiselina unutar skupa koji uključuje, bez ograničenja, ostatke L4, V6, A21, V27, 131, E47, K53, E54, H56, S66, V63, K68, V92, F94 i F103, ili njihova kombinacija, na primer na dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, sedam ili više, a ne više od 15 ostataka.

[0068] SIRPα reagens visokog afiniteta može da sadrži najmanje jednu promenu aminokiselina odabranu između (1) L4V; L4I; (2) V6I; V6L; (3) A21V; (4) V27I; V27L; (5) 131T; I31S; I31F; (6) E47V; E47L; (7) K53R; (8) E54Q; (9) H56P; H56R; (10) S66T; S66G; (11) K68R; (12) V92I; (13) F94L; F94V; (14) V63I; i (15) F103V. SIRPα polipeptid visokog afiniteta može da sadrži modifikacije odabrane od (1) do (15), na dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, 10, 11, 12, 13, 14 ili svih 15 ostaci; i njihove kombinacije i konzervativni ekvivalenti.

[0069] Skupovi promena aminokiselina mogu da uključuju kombinacije iznad navedenog, na primer:

• V27I ili V27L; K53R; S66T ili S66G; K68R; i F103V.

• L4V ili L4I; V27I ili V27L; E47V ili E47L; K53R; E54Q; S66T ili S66G; K68R; V92I; i F103V.

• L4V ili L4I; V6I ili V6L; A21V; V27I ili V27L; I31T, I31S ili I31F; E47V ili E47L; K53R; H56P ili H56R;

S66T ili S66G; K68R; i F94L ili F94V.

• V6I ili V6L; V27I ili V27L; I31T, I31S, ili I31F; E47V ili E47L; K53R; E54Q; H56P ili H56R; S66T ili S66G; V92I; i F94L ili F94V.

• L4V ili L4I; A21V; V27I ili V27L; I31T, I31S, ili I31F; E47V ili E47L; K53R; E54Q; H56P ili H56R;

S66T ili S66G; F94L ili F94V; i F103V.

• L4V ili L4I; V6I ili V6L; V27I ili V27L; I31T, I31S, ili I31F; E47V ili E47L; K53R; H56P ili H56R; S66T

1

ili S66G; K68R; V92I; i F94L ili F94V.

• L4V ili L4I; V6I ili V6L; I31T, I31S, ili I31F; E47V, ili E47L; K53R; H56P ili H56R; S66T, ili S66G;

V92I; i F103V.

• V6I; V27I; I31F; E47L; K53R; E54Q; H56P; i S66T.

• L4V; V6I; V27I; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56P; V63I; S66T; K68R; i V92I.

• V6I; V27I; I31T; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66G; K68R; V92I; i F103V.

• V6I; V27I; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66T; i V92I.

[0070] SIRPα polipeptid visokog afiniteta može da sadrži skup promena aminokiselina:

• {V27I; K53R; S66T; S66G; K68R; F103V} na primer kao što je prikazano u (SEQ ID NO:3);

• {L4V; V27L; E47V; K53R; E54Q; S66G; K68R; V92I} na primer kao što je prikazano u (SEQ ID NO:4);

• {L4V; V6I; A21V; V27I; I31T; E47L; K53R; H56P; S66T; K68R; F94L} na primer kao što je prikazano u (SEQ ID NO:5);

• {V6I; V27I; I31S; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66G; V92I; F94L} na primer kao što je prikazano u (SEQ ID NO:6);

• {L4I; A21V; V27I; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56R; S66G; F94V; F103V} na primer kao što je prikazano u (SEQ ID NO:7);

• {L4V; V6I; V27I; I31F; E47V; K53R; H56R; S66G; K68R; V92I; F94L} na primer kao što je prikazano u (SEQ ID NO:8); ili

• {L4V; V6L; I31F; E47V; K53R; H56P; S66G; V92I; F103V} na primer kao što je prikazano u (SEQ ID NO:9)

• {V6I; V27I; I31F; E47L; K53R; E54Q; H56P; S66T} na primer kao što je prikazano u SEQ ID NO:9; 37.

• {L4V; V6I; V27I; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56P; V63I; S66T; K68R; V92I} na primer kao što je prikazano u SEQ ID NO:38;

• {V6I; V27I; I31T; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66G; K68R; V92I; F103V} na primer kao što je prikazano u SEQ ID NO:39;

• {V6I; V27I; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66T; V92I} na primer kao što je prikazano u SEQ ID NO:10;

[0071] Za potrebe obelodanjivanja, reagens ovog obelodanjivanja sadrži deo SIRPα koji je dovoljan da veže CD47 na prepoznatljiv afinitet, npr., visoki afinitet, koji obično leži između signalne sekvence i transmembranskog domena, ili njegov fragment zadržava aktivnost vezivanja. SIRPα reagens visokog afiniteta obično sadrži najmanje d1 domen SIRPα (SEQ ID NO:1) sa modifikovanim aminokiselinskim ostacima kao što je iznad opisano. SIRPα polipeptid visokog afiniteta može da sadrži najmanje aminokiseline 1-3, 7-20, 32-46, 69-91, 95-102 divljeg tipa polipeptida SIRPα d1 (SEQ ID NO:1) ili njegovu alelnu varijantu, tj. alel divljeg tipa 2. SIRPα polipeptid visokog afiniteta može dalje da sadrži delove prirodnog humanog proteina SIRPα, osim d1 domena, uključujući ostatke 150 do 374 izvornog proteina (kao što je navedeno u SEQ ID NO:2), uključujući, bez ograničenja, na najmanje 10 susednih aminokiselina iz sekvence navedene u SEQ ID NO:2, najmanje 20 susednih aminokiselina, najmanje 50 susednih aminokiselina, najmanje 100 susednih aminokiselina, najmanje 125 susednih aminokiselina, najmanje 250 susednih aminokiselina kiseline ili više.

[0072] SIRPα reagensi visokog afiniteta prema predmetnom obelodanjivanju mogu se dalje modifikovati, npr., pridruživanjem širokom spektru drugih oligopeptida ili proteina za različite svrhe. Na primer, post-translaciono modifikovane, na primer prenilacijom, acetilacijom, amidacijom, karboksilacijom, glikozilacijom, pegilovanjem itd. Takve modifikacije mogu takođe da uključuju modifikacije glikozilacije, npr. one nastale modifikovanjem obrazaca glikozilacije polipeptida tokom njegove sinteze i prerade ili u daljim koracima prerade; npr. izlaganjem polipeptida enzimima koji utiču na glikozilaciju, kao što su glikozilirajući ili deglikozilirajući enzimi sisara. SIRPα varijante predmetnog obelodanjivanja uključuju SIRPα varijante sa fosforilisanim aminokiselinskim ostacima, npr. fosfotirozin, fosfoserin ili fosfotreonin.

[0073] SIRPα reagens visokog afiniteta može imati kinetiku KDod najmanje oko 1 x 10<-8>M za CD47. SIRPα reagens visokog afiniteta može imati kinetiku KDod najmanje oko 1 x 10<-9>M za CD47. SIRPα reagens visokog afiniteta može imati kinetiku KDod najmanje oko 1 x 10<-10>M za CD47. SIRPα reagens visokog afiniteta može da pokazuje kinetički KDdo CD47 koji je bar oko 5 puta veći od kinetičkog KDurođenog humanog SIRPα polipeptida, kao što je prikazano u SEQ ID NO:1 i 2. SIRPα reagens visokog afiniteta ima kinetički KDdo CD47 koji je najmanje oko 10-puta, 50-puta, 100-puta, 500-puta, 1000 puta veći od kinetičkog KDprirodnog SIRPα polipeptida.

[0074] Vezanje na CD47 može se odrediti, na primer, sposobnošću SIRPα reagensa da se vezuje za CD47 obložen na ploči za ispitivanje; prikazan na površini mikrobne ćelije; u rastvoru; itd. aktivnost vezivanja SIRPα varijanti ovog otkrića na CD47 može se testirati imobilizacijom liganda, npr. CD47 ili SIRPα varijante, na kuglu, supstrat, ćeliju itd. Agensi se mogu dodati u odgovarajući pufer i partneri za vezivanje inkubiraju se tokom određenog vremena, na datoj temperaturi. Posle ispiranja radi uklanjanja nevezanog materijala, vezani protein se može osloboditi, na primer, SDS, puferima sa visokim pH i slično i analizirati.

[0075] SIRPα varijanta predmetnog obelodanjivanja može biti fuzioni protein, npr., stopljen u okviru sa drugim polipeptidom. Drugi polipeptid može biti sposoban da poveća veličinu fuzionisanog proteina, npr., tako da se fuzioni protein ne bi brzo očistio iz cirkulacije. Drugi polipeptid može biti deo ili celina Fc regiona imunoglobulina. Alternativno, drugi polipeptid može biti bilo koji pogodan polipeptid koji je suštinski sličan Fc, npr., obezbeđuje povećanu veličinu, multimerizacione domene i/ili dodatno vezivanje ili interakciju sa Ig molekulima. Ovi fuzioni proteini mogu olakšati pročišćavanje, multimerizaciju i pokazuju produženi polu-raspad in vivo. Fuzioni proteini koji imaju disulfidno povezane multimerne strukture mogu takođe biti efikasnije u vezivanju i neutraliziranju drugih molekula nego monomerni SIRPα.

[0076] Domen vezivanja SIRPα visokog afiniteta, tj. SIRPα d1 domen modifikovan kao što je ovde navedeno da obezbedi visoko afinitetno vezivanje za CD47, može se dobiti kao multimerni protein, tj. dva, tri, četiri ili više SIRPα vezanih domena su kovalentno ili ne-kovalentno povezani, npr kao fuzioni protein; disulfidno vezan; preko vezivanja biotina na avidin, streptavidin, itd. Takvi multimerni proteini koji vezuju SIRPα visokog afiniteta su korisni kao pojedinačni agensi za povećanje fagocitoze ćelija koje eksprimiraju CD47; ili u kombinaciji sa drugim vezujućim sredstvima, npr. ćelijski specifična monoklonska antitela.

[0077] Domen visokog afiniteta koji se vezuje za SIRPα može biti spojen ili na drugi način povezan sa imunoglobulinskom sekvencom da bi se formirao himerni protein. Imunoglobulinska sekvenca, poželjno, ali ne nužno, je imunoglobulinski konstantni domen(i). Imunoglobulinski deo u takvim himerama može se dobiti od bilo koje vrste, obično ljudske, i uključuje podvrste lgG1, lgG2, lgG3 ili IgG4, IgA, IgE, IgD ili IgM. Imunoglobulinski deo može da sadrži jednu ili više domena, npr. CH1, CH2, CH3, itd.

[0078] Himere konstruisane iz sekvence vezane za odgovarajuću sekvencu imunoglobulinskog konstantnog domena poznate su u stanju tehnike. U takvim fuzijama, kodirani himerni polipeptid može zadržati najmanje funkcionalno aktivne zglobove, CH2 i CH3 domene konstantnog područja teškog lanca imunoglobulina. Fuzije se takođe prave na C-završecima Fc dela konstantnog domena, ili odmah N-terminala na CH1 teškog lanca ili odgovarajuću oblast lakog lanca. Precizno mesto na kome je fuzija napravljena nije kritično; određena mesta su dobro poznata i mogu se odabrati da bi se optimizirale biološke aktivnosti, sekrecije ili karakteristike vezivanja SIRPα polipeptidimunoglobulinskih himera. SIRPα polipeptidno-imunoglobulinski himeri mogu biti sastavljeni kao monomeri ili hetero- ili homo-multimeri, a naročito kao dimeri ili tetrameri.

[0079] Iako nije neophodno prisustvo lakog lanca imunoglobulina, laki lanac imunoglobulina može biti uključen, ili kovalentno povezan sa fuzionim polipeptidom teškog lanca polipeptida-imunoglobulina SIRPα, ili direktno spojen sa SIRPα polipeptidom. Konstrukcija sa jednim lancem može se koristiti za obezbeđivanje konstantnih područja teških i lakih lanaca.

[0080] U drugim konstrukcijama fuzionog proteina, drugi polipeptid je sekvenca markera, poput peptida koji olakšava prečišćavanje fuzionisanog polipeptida. Na primer, marker aminokiselinske sekvence može biti heksahistidin peptid, kao što je oznaka data u pQE vektoru (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), između kojih su mnogi komercijalno dostupnog. Kao što je opisano u Gentz i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989, na primer, heksa-histidin omogućava pogodno pročišćavanje fuzionog proteina. Druga peptidna oznaka korisna za prečišćavanje, oznaka "HA", odgovara epitopu koji je dobijen iz proteina gripa hemaglutinin. Wilson i dr., Cell 37: 767, 1984. Dodavanje peptidnih delova radi lakšeg rukovanja polipeptidima su poznate i rutinske tehnike u struci.

[0081] SIRPα vezni domen visokog afiniteta može se dobiti kao monomerni protein, koji može biti izolovan d1 domen, ili d1 domen spojen sa SIRPα ili himernim sekvencama. Monomerni domeni za vezivanje SIRPα su korisni, na primer, kao pomoćno sredstvo za povećanje fagocitoze ćelija koje eksprimiraju CD47, u kombinaciji sa ćelijskim vezujućim sredstvom, npr. antitelo, posebno antitelo specifično za tumorske ćelije kako je ovde definisano. Monomerni domeni koji se vezuju za SIRPα takođe su korisni kao adjuvansi za povećanje fagocitoze, kao i druge imune funkcije, npr. ADCC, unos antigena za prezentaciju antigena i slično od strane mnogih imunih ćelija, kao što su makrofagi, dendritične ćelije, neutrofili, granulociti i slično, koji eksprimiraju SIRPα i reaguju na blokadu SIRPα reagensima iz obelodanjivanja, Monomerni SIRPα vezujući domeni visokog afiniteta takođe su korisni kao sredstva za obradu slike, npr. kada se konjuguje na etiketu koja se može otkriti.

[0082] SIRPα reagensi visokog afiniteta iz obelodanjivanja uključuju reagense dalje modifikovane da poboljšaju svoju otpornost na proteolitičku razgradnju ili da poboljšaju svojstva rastvorljivosti ili da ih učine pogodnijim kao terapeutsko sredstvo. Na primer, varijante predmetnog obelodanjivanja nadalje uključuju analoge koji sadrže ostatke koji nisu prirodno prisutne L-aminokiseline, npr. D-aminokiseline ili sintetičke aminokiseline koje nisu u prirodi. D-aminokiseline mogu biti supstituisane za neke ili sve aminokiselinske ostatke.

[0083] SIRPα reagens visokog afiniteta može biti povezan ili konjugovan sa jednom ili više slikovnih jedinica, tj. etikete koju je moguće detektovati. Kao što se ovde koristi, "citotoksična grupa" se odnosi na deo koji inhibira rast ćelije ili podstiče smrt ćelije kada je ćelija blizu ili apsorbuje. Pogodni citotoksični delovi u ovom pogledu uključuju radioaktivne izotope (radionuklide), hemotoksične agense kao što su induktori diferencijacije i mali hemotoksični lekovi, toksinski proteini i njihovi derivati.

[0084] Kao što je ovde korišćeno, "slikovni deo" ili detektujuća oznaka odnosi se na deo koji se može koristiti za povećanje kontrasta između tumora i okolnog zdravog tkiva u tehnici vizuelizacije, npr., radiografija, pozitronskoemisijska tomografija, magnetna rezonanca, direktan ili indirektni vizuelni pregled. Prema tome, pogodne grupe za snimanje uključuju radiografske delove, npr. teški metali i ostaci koji emituju zračenje, ostaci koji emituju pozitrone, kontrastni delovi magnetne rezonance i optički vidljive grupe (npr., fluorescentna ili vidljivog spektra, vidljive čestice itd. Onaj sa uobičajenom veštinom će oceniti da postoji malo preklapanja između onoga što postoji je terapeutska celina i šta je slikovni deo.

[0085] Generalno, terapijska sredstva ili sredstva za snimanje mogu biti konjugovana na reagens deo SIRPα visokog afiniteta bilo kojom pogodnom tehnikom, uz odgovarajuće razmatranje potrebe za farmakokinetičkom stabilnošću i smanjenom ukupnom toksičnošću za pacijenta. Direktna reakcija između agensa i SIRPα moguća je kada svaki poseduje funkcionalnu grupu koja je sposobna da reaguje sa drugom. Na primer, nukleofilna grupa, kao što je amino ili sulfhidrilna grupa, može biti sposobna da reaguje sa grupom koja sadrži karbonil, kao što je anhidrid ili kiselinski halogenid, ili sa alkil grupom koja sadrži dobru odlazeću grupu (npr., halogenid). Alternativno, može se upotrebiti odgovarajuća hemijska grupa veze. Grupa veznika može funkcionisati kao razdelnik da bi se izbegle smetnje u vezivanju mogućnosti.

[0086] Stručnjacima će biti očigledno da se mogu koristiti različiti bifunkcionalni ili polifunkcionalni reagensi, homo- i heterofunkcionalni (poput onih opisanih u katalogu Pierce Chemical Co., Rockford, III.). kao veznička grupa. Spajanje se može izvršiti, na primer, putem amino grupa, karboksilnih grupa, sulfhidrilnih grupa ili oksidovanih ostataka ugljenih hidrata. Postoje brojne reference koje opisuju takvu metodologiju. Alternativno, SIRPα je povezan sa citotoksičnom ili slikovnom jedinicom upotrebom nekovalentnog veznog para, kao što je streptavidin/biotin, ili avidin/biotin. U ovim slučajevima, jedan član para je kovalentno spojen sa SIRPα, a drugi član vezujućeg para kovalentno povezan s citotoksičnim ili slikovnim delom. Možda je poželjno da spojite više od jednog citotoksičnog i/ili slikovnog dela. Poli-derivatizacijom SIRPα reagensa visokog afiniteta, istovremeno se može primeniti nekoliko strategija, antitelo može biti korisno kao kontrastno sredstvo za nekoliko tehnika vizuelizacije, ili se terapeutsko antitelo može obeležiti za praćenje tehnikom vizuelizacije.

[0087] Nosač može nositi sredstva na različite načine, uključujući kovalentno vezivanje direktno ili preko vezničke grupe i nekovalentne asocijacije. Pogodni nosači kovalentne veze uključuju proteine kao što su albumini, peptidi i polisaharidi poput aminodekstrana, od kojih svaki ima više mesta za vezivanje ostataka. Nosač može takođe nositi sredstvo nekovalentnim asocijacijama, kao što je nekovalentna veza ili enkapsulacijom

[0088] Nosači i veznici specifični za radionuklidna sredstva uključuju male radiohalogenizovane molekule i helirajuća jedinjenja. Radionuklidni helat može se formirati iz helatnih jedinjenja koja uključuju ona koja sadrže atome azota i sumpora kao atome donora za vezivanje metala, ili metalnog oksida, radionuklida.

[0089] Radiografske jedinice za upotrebu kao slikovne grupe u ovom obelodanjivanju uključuju jedinjenja i helate sa relativno velikim atomima, kao što su zlato, iridijum, tehnijum, barijum, talijum, jod i njihovi izotopi. Poželjno je da se u sastavima i postupcima obelodanjivanja koriste manje otrovni ostaci radiografskog snimanja, poput joda ili jodnih izotopa. Takve grupe mogu biti konjugovane sa delom antitela visokog afiniteta SIRPα kroz prihvatljiv hemijski veznik ili nosač helacije. Delovi koji emituju pozron i koji se koriste u ovom obelodanjivanju uključuju<18>F, koji se lako mogu konjugovati reakcijom fluoracije sa reagensom visokog afiniteta SIRPα.

[0090] Kontrastne grupe magnetne rezonance uključuju helate hroma (III), mangana (II), gvožđe (II), nikla (II), bakar (II), prazeodimijum (III), neodijum (III), samarijum (III) i iterbijum (III) jona. Zbog vrlo jakog magnetnog momenta, posebno su poželjni joni gadolinijuma (III), terbijuma (III), disprozijuma (III), holmijuma (III), erbijuma (III) i gvožđa (III).

1

[0091] Optički vidljive grupe za upotrebu kao slikovne jedinice uključuju fluorescentne boje ili boje vidljivog spektra, vidljive čestice i ostale vidljive delove obeležavanja. Fluorescentne boje kao što su fluorescein, kumarin, rodamin, bodipijska teksaška crvena i cijaninska boja, korisne su kada se mestu može obezbediti dovoljno energije za pobuđivanje za vizuelni pregled. Postupci endoskopske vizuelizacije mogu biti kompatibilniji sa upotrebom takvih oznaka. Prihvatljiva bojila uključuju hranljive boje i boje koje je odobrila FDA, a nisu netoksične, mada su poželjna farmaceutski prihvatljiva bojila odobrena za unutrašnje davanje.

[0092] Efektivna količina sastava za konjugaciju za slike koji će se dati određenom pacijentu zavisiće od različitih faktora, od kojih će se nekoliko razlikovati od pacijenta do pacijenta. Nadležni kliničar će moći da odredi efikasnu količinu za olakšavanje vizuelizacije tumora. Doziranje će zavisiti od lečenja tumora, načina primene, prirode terapeuta, osetljivosti tumora na terapeutske lekove i dr. Koristeći uobičajenu veštinu, kompetentni kliničar će moći da optimizira doziranje određenog terapijskog ili predstavljanje sastava tokom rutinskih kliničkih ispitivanja.

[0093] Tipična doza može biti od 0.001 do 100 miligrama konjugata po kilogramu telesne težine. Relativno velike doze, u rasponu od 0.1 do 10 mg po kilogramu telesne mase pacijenta, mogu se koristiti za snimanje konjugata sa relativno netoksičnim imidžingom. Korišćena količina zavisiće od osetljivosti postupka snimanja i relativne toksičnosti slikovnog dela.

[0094] SIRPα varijante ovog otkrića mogu se proizvesti bilo kojim pogodnim sredstvom koje je poznato ili kasnije otkriveno na terenu, npr., proizvedeno iz eukariotskih ili prokariotskih ćelija, sintetizovanih in vitro, itd. Tamo gde se protein proizvodi prokariotskim ćelijama, može se dalje obrađivati odvijanjem, npr. denaturacija toplote, redukcija DTT itd. i mogu se dalje ponovo koristiti, koristeći postupke poznate u tehnici.

[0095] Polipeptidi se mogu pripremiti putem ćelija bez sistemskih translacionih sistema ili sintetičkom in vitro sintezom, koristeći konvencionalne postupke kao što je poznato u tehnici. Na raspolaganju su različiti komercijalni sintetički aparati, na primer, automatizovani sintetizatori kompanije Applied Biosistems, Inc., Foster City, CA, Beckman, itd. Upotrebom sintetizatora, prirodne aminokiseline mogu biti zamenjene neprirodnim aminokiselinama. Određeni redosled i način pripreme biće određeni pogodnošću, ekonomičnošću, potrebnom čistoćom i slično.

[0096] Polipeptidi se takođe mogu izolovati i pročistiti u skladu sa uobičajenim postupcima rekombinantne sinteze. Lizat se može pripremiti iz ekspresionog domaćina i lizat se prečisti pomoću HPLC, isključujuće hromatografije, gel elektroforeze, afinitetne hromatografije ili druge tehnike prečišćavanja. Najveći deo, sastavi koji se koriste sadrže najmanje 20 mas.% željenog proizvoda, obično najmanje oko 75 mas.%, poželjno najmanje oko 95 mas.%, a u terapeutske svrhe obično najmanje oko 99.5 mas.% u odnosu na kontaminante koji se odnose na način pripreme proizvoda i njegovo prečišćavanje. Obično se procenti zasnivaju na ukupnom proteinu.

[0097] Postupci koji su dobro poznati stručnjacima mogu se koristiti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuće sekvence i odgovarajuće transkripcijske/translacione kontrolne signale. Ovi postupci uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Alternativno, RNK koja može kodirati željene polipeptide može se hemijski sintetizovati. Osoba koja poznaje ovo područje može lako da koristi dobro poznate tablice upotrebe kodona i sintetske metode da obezbedi pogodnu sekvencu za kodiranje bilo kog od polipeptida predmetnog obelodanjivanja, nukleinske kiseline se mogu izolovati i dobiti u značajnoj čistoći. Obično će nukleinske kiseline, bilo kao DNK ili RNK, biti dobivene u suštini bez drugih sekvence nukleinske kiseline koje se javljaju u prirodi, a obično su najmanje oko 50%, obično najmanje oko 90% i obično su "rekombinantne", npr. obložena jednim ili više nukleotida sa kojima nije normalno povezano na prirodnom hromozomu. Nukleinske kiseline iz obelodanjivanja mogu se obezbediti kao linearni molekul ili unutar kružnog molekula, i mogu se obezbediti unutar autonomno umnožavajućih molekula (vektora) ili unutar molekula bez replikacionih sekvenci. Ekspresija nukleinskih kiselina može se regulisati sopstvenim ili drugim regulatornim sekvencama poznatim u stanju tehnike. Nukleinske kiseline predmetnog obelodanjivanja mogu se uvesti u pogodne ćelije domaćina korišćenjem različitih tehnika dostupnih u tehnici.

[0098] Prema predmetnom obelodanjivanju, varijante SIRPα mogu se dobiti u farmaceutskim sastavima pogodnim za terapijsku upotrebu, npr. za lečenje ljudi. Farmaceutski sastavi predmetnog obelodanjivanja uključuju jedan ili više terapeutskih entiteta predmetnog obelodanjivanja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, estri ili solvati. Farmaceutski sastavi predmetnog obelodanjivanja uključuju jedan ili više terapeutskih entiteta predmetnog obelodanjivanja u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvom, npr., drugim antitumorskim sredstvom.

[0099] Terapeutski subjekti predmetnog obelodanjivanja se često daju kao farmaceutski sastavi koji sadrže aktivno terapeutsko sredstvo i drugi farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Poželjni oblik zavisi od načina davanja i terapijske primene. Sastavi mogu takođe da sadrže, u zavisnosti od željene formulacije, farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače ili razblaživače, koji su definisani kao nosači koji se obično koriste za formulisanje farmaceutskih sastava za životinjsko ili ljudsko davanje. Razblaživač je izabran tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri takvih razblaživača su destilovana voda, fiziološka otopina puferisana fiziološkim fosfatima, Ringerove rastvore, rastvor dekstroze i Hankov rastvor. Pored toga, farmaceutski sastav ili formulacija mogu takođe da sadrže druge nosače, adjuvanse ili netoksične, ne terapeutske, neimunogene stabilizatore i slično.

[0100] Farmaceutski sastavi predmetnog obelodanjivanja mogu takođe da uključuju velike, sporo metabolizovane makromolekule kao što su proteini, polisaharidi kao hitozan, polaktične kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimeri (kao što je funkcionalizovan lateks Sepharose™, agaroza, celuloza i slično), polimerne aminokiseline kopolimeri aminokiselina i lipidni agregati (poput kapljica ulja ili lipozoma).

POSTUPCI UPOTREBE

[0101] Omogućeni su postupci za lečenje, smanjenje ili sprečavanje raka, uključujući bez ograničenja limfome, leukemije, karcinomi, melanomi, glioblastomi, sarkomi, mijelomi itd. kao primarni ili metastatski karcinom, inhibiranjem interakcije između SIRPα i CD47, povećavajući in vivo fagocitozu ćelija tumora. Takvi postupci uključuju davanje ispitaniku kome je potreban tretman terapeutski efikasne količine ili efektivne doze SIRPα reagensa visokog afiniteta iz otkrića, uključujući bez ograničenja kombinacije reagensa sa hemoterapeutskim lekom, antitelom specifičnim za tumor ili ESA.

[0102] Efektivne doze terapeutskog entiteta predmetnog obelodanjivanja, npr. za lečenje raka variraju u zavisnosti od mnogih različitih faktora, uključujući sredstva za primenu, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju i da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. Obično je pacijent čovek, ali sisari, takođe, mogu se lečiti, npr. životinje u pratnji kao što su psi, mačke, konji itd., laboratorijski sisari, poput zečeva, miševa, pacova, itd., i slično. Doze tretmana mogu se titrirati da se optimiziraju sigurnost i efikasnost.

[0103] Terapeutska doza može biti u opsegu od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i uobičajenije od 0.01 do 5 mg/kg telesne težine domaćina. Na primer, doziranje može biti 1 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili u opsegu od 1-10 mg/kg. Primeran režim lečenja podrazumeva davanje jednom u dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom u 3 do 6 meseci. Terapeutski subjekti predmetnog obelodanjivanja se obično primenjuju u više navrata. Intervali između pojedinih doza mogu biti sedmični, mesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu biti neredovni što se pokazuje merenjem nivoa terapijskog entiteta u krvi kod pacijenta. Alternativno, terapeutski subjekti predmetnog obelodanjivanja mogu se primeniti kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebno ređe davanje. Doziranje i učestalost variraju u zavisnosti od polu-raspada polipeptida kod pacijenta.

[0104] U profilaktičke primene, relativno mala doza može se primenjivati u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da se leče do kraja života. U drugim terapijskim primenjivanjima, ponekad je potrebna relativno velika doza u relativno kratkim intervalima dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine, a poželjno dok pacijent ne pokaže delimičnu ili potpunu amelioraciju simptoma bolesti. Nakon toga, patent može uvesti profilaktički režim.

[0105] Postupci predmetnog obelodanjivanja uključuju lečenje, smanjenje ili sprečavanje rasta tumora, metastaze tumora ili invazije tumora na karcinom, uključujući limfome, leukemije, karcinomi, melanom, glioblastom, sarkom, mijelom itd. Za profilaktičku upotrebu, farmaceutske kompozicije ili lekovi se primenjuju pacijent podložan ili na drugi način rizikovan od bolesti u količini dovoljnoj da eliminiše ili smanji rizik, umanji težinu ili odloži početak bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili simptome ponašanja, njene komplikacije i intermedijarne patološki fenotipovi koji su prisutni tokom razvoja bolesti.

[0106] SIRPα polipeptidi visokog afiniteta predmetnog obelodanjivanja mogu se koristiti in vitro i in vivo za praćenje toka terapije bolesti, na primer, merenjem povećanja ili smanjenja broja ćelija koje eksprimiraju CD47, posebno ćelije raka koje eksprimiraju CD47, to može biti utvrdili da li je određeni terapijski režim usmeren na ublažavanje bolesti efikasan. U takve svrhe, SIRPα polipeptid može biti detektovan.

[0107] SIRPα polipeptidi visokog afiniteta iz obelodanjivanja mogu se koristiti in vitro u testovima vezivanja u kojima se mogu koristiti u tečnoj fazi ili vezati za nosač u čvrstoj fazi. Pored toga, polipeptidi u tim imuno-testovima mogu se detektovano obeležiti na različite načine. Primeri tipova testova koji mogu da koriste SIRPα polipeptide visokog afiniteta iz otkrića su protočna citometrija, npr. FACS, MACS, histohemijska, takmičarska i nekonkurentna imunoanaliza u bilo direktnom ili indirektnom formatu; i slično. Detekcija CD47 upotrebom polipeptida visokog afiniteta SIRPα može se izvršiti ispitivanjima koja se vrše bilo unapred, obrnuto ili istovremeno, uključujući histohemijske testove na fiziološkim uzorcima. Stručnjaci u ovoj oblasti će znati ili mogu lako uočiti druge oblike ispitivanja bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0108] Polipeptidi visokog afiniteta mogu se vezati za mnogo različitih nosača i koristiti za otkrivanje prisustva ćelija koje eksprimiraju CD47. Primeri dobro poznatih nosača uključuju staklo, polistiren, polipropilen, polietilen, dekstran, najlon, amilaze, prirodne i modifikovane celuloze, poliakrilamide, agaroze i magnetit. Priroda nosača može biti rastvorljiva ili nerastvorljiva za potrebe obelodanjivanja, Stručnjaci u ovoj oblasti će znati druge pogodne

1

nosače za vezivanje proteina ili će ih moći utvrditi koristeći rutinske eksperimente.

[0109] Poznato je mnogo različitih oznaka i metoda obeležavanja onima koji imaju uobičajene veštine. Primeri tipova obeležavanja koji se mogu koristiti u ovom obelodanjivanju uključuju enzime, radioizotope, fluorescentna jedinjenja, koloidne metale, hemiluminiscentna jedinjenja i bioluminiscentna jedinjenja. Stručnjaci u ovoj oblasti će znati druge pogodne oznake za vezivanje na polipeptide predmetnog obelodanjivanju, ili će ih moći utvrditi, koristeći rutinske eksperimente. Pored toga, vezivanje ovih obeležavanja na polipeptide predmetnog obelodanjivanja može se izvršiti standardnim tehnikama, zajedničkim onima koji imaju uobičajene struke.

[0110] CD47 može se detektovati po SIPPα polipeptidima visokog afiniteta iz obelodanjivanja kada su prisutni u biološkim tečnostima i tkivima. Može se koristiti bilo koji uzorak koji sadrži otkrivenu količinu CD47. Uzorak može biti tečnost kao što su urin, slina, cerebrospinalna tečnost, krv, serum i slično ili čvrsta ili polu-čvrsta supstanca kao što su tkiva, izmet i slično, ili, alternativno, čvrsto tkivo kao što je obično koristi se u histološkoj dijagnozi.

[0111] Druga tehnika obeležavanja koja može rezultirati većom osetljivošću sastoji se od spajanja polipeptida u haptene male molekulske težine. Ovi hapteni mogu se zatim posebno otkriti pomoću druge reakcije. Na primer, uobičajena je upotreba haptena kao što je biotin, koji reaguje sa avidinom, ili dinitrofenolom, piridoksalom ili fluoresceinom, koji mogu reagovati sa specifičnim antitipovima protiv haptena.

[0112] Konjugati za obradu konzervata SIRPα reagensa visokog afiniteta mogu se davati ispitaniku u seriji od više primena. Sastavi konjugata za slike mogu se primeniti u odgovarajuće vreme pre tehnike vizuelizacije. Na primer, davanje u roku od sat vremena pre direktnog vizuelnog pregleda može biti odgovarajuća, ili davanje u roku od dvanaest sati pre nego što MRI skeniranje može biti prikladno. Međutim, treba voditi računa da se ne dozvoli previše vremena između davanja i vizuelizacije, jer se jedinjenje za obradu može na kraju očistiti iz pacijentovog sistema.

[0113] Sastavi za lečenje raka mogu se davati parenteralnim, topikalnim, intravenskim, intratumoralnim, oralnim, potkožnim, intraarterijalnim, intrakranijalnim, intraperitonealnim, intranazalnim ili intramuskularnim sredstvima. Tipičan način davanja je intravenski ili intratumorski, mada i drugi putevi mogu biti jednako efikasni.

[0114] Obično se sastavi pripremaju kao injekcije, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije; mogu se pripremiti i čvrsti oblici pogodni za rastvor u tečnim nosačima pre injekcije. Preparat se takođe može emulgirati ili inkapsulirati u lipozome ili mikro čestice kao što su polilaktid, poliglikolid ili kopolimer za pojačani adjuvantni efekat, kao što je iznad diskutovano. Langer, Science 249: 1527, 1990 i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Sredstva predmetnog obelodanjivanja mogu se primeniti u obliku depo injekcije ili preparata za implantate koji mogu biti formulisani na način koji omogućava kontinuirano ili pulsirajuće oslobađanje aktivnog sastojka. Farmaceutski sastavi su uglavnom formulisani kao sterilne, u suštini izotonične i u potpunosti u skladu sa svim propisima dobre proizvodne prakse (GMP) američke administracije za hranu i lekove.

[0115] Toksičnost SIRPα reagensa visokog afiniteta koji su ovde opisani može se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., određivanjem LD50(doza smrtonosna za 50% populacije) ili LD100(doza smrtonosna do 100% stanovništva). Odnos doze između toksičnog i terapeutskog efekta je terapijski indeks. Podaci dobijeni iz ovih ispitivanja ćelijske kulture i ispitivanja na životinjama mogu se koristiti u formulisanju raspona doza koji nije toksičan za upotrebu kod ljudi. Doziranje ovde opisanih proteina leži poželjno u rasponu koncentracija u krugu koje uključuju efektivnu dozu sa malo ili bez toksičnosti. Doziranje može da varira u ovom opsegu u zavisnosti od korišćenog oblika doziranja i načina davanja. Tačan oblik, način davanja i doziranje može izabrati svaki lekar s obzirom na pacijentovo stanje.

[0116] Takođe su u okviru opsega obelodanjivanja kompleti koji sadrže sastave (npr., reagense visokog afiniteta SIRPα i njihove formulacije) otkrića i uputstva za upotrebu. Komplet može dalje da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, npr. hemoterapijski lek, antitumorsko antitelo, ESA, itd. Kompleti obično sadrže etiketu koja označava namensku upotrebu sadržaja kompleta. Termin nalepnica uključuje bilo koji pisani ili snimljeni materijal koji se isporučuje u kompletu ili uz njega, ili koji na drugi način prati komplet.

EKSPERIMENTALNO

[0117] Sledeći primeri su dati tako da onima koji imaju obične veštine daju potpuno obelodanjivanje i opis načina kako da naprave i koriste ovaj pronalazak, i nisu namenjeni ograničavanju dometa onoga što izumitelji smatraju svojim izumom niti da li treba da predstave da su eksperimenti u nastavku svi ili jedini eksperimenti koji se izvode. Uloženi su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperature itd.), ali treba uzeti u obzir i neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ako nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekularna težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepeni Celzijusa, a pritisak je atmosferski ili blizu.

[0118] Ekspresija i prečišćavanje proteina: IgSF domen humanog CD47 (ostaci 19-135) i varijante prvog lgSF domena humanog SIRPα (ostaci 31-148) klonirani su u pAcGP67 sa C-terminalnim 8xHistidinskim obeležjima i

1

eksprimirani u Hi5 ćelijama koristeći rekombinantni bakulovirus. Slobodni cistein na CD47 IgSF domenu mutiran je na glicin. Proteini su prečišćeni Ni-NTA hromatografijom i gel filtracijom preko Superdex-75 kolone u HBS (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl). Da bi se proizveli biotinilirani proteini, dodata je oznaka akceptornog peptida za biotin C-terminal (BAP)-LNDIFEAQKIEWHE i proteini su ekspresionirani sa BirA ligazom sa viškom biotina (100 µM). Za kristalizaciju, varijanta FD6 SIRPα izražena je u periplazmi E. coli sa N-terminalnom proteinom koji vezuje maltozu (MBP), koji je uklonjen tretmanom 3C proteazom. CD47 IgSF domen zajednički eksprimiran je sa EndoF u Hi5 ćelijama u prisustvu kifunensina radi uklanjanja glikozilacije.

[0119] Za ekspresiju proteina varijante SIRPα kao fuzije na humani IgG4 i lgG2 Fc lanci, varijante SIRPα klonirane su u pFUSE-hlgG4-Fc2 i pFUSE-hlgG2-Fc2 vektore (Invivogen) u okviru sa IL2 signalnom sekvencom. Fuzioni proteini varijante SIRPα su eksprimirani u ćelijama Freestyle 293-F (Invitrogen) nakon transfekcije 293fektin (Invitrogen). Supernatanti su sakupljeni nakon 96 sati ekspresije proteina i prečišćeni na HiTrap protein A kolonama (GE Healthcare).

[0120] Kristalizacija i strukturno određivanje kompleksa FD6:CD47: FD6 dobijen E. coli i deglikozilovani CD47 dobijeni od insekata pomešani su u razmeri 1:1 i tretirani karboksipeptidazom A i B, nakon čega je usledila filtracija gela preko Superdex-75 kolone u HBS. Kompleks je koncentrovan do 22 mg/mL i kristalizovan difuzijom pare u sedećim kapi dodavanjem 0.1 µL proteina u jednaku zapreminu od 2.0M amonijum sulfata, 0.1 M Tris pH 7.3. Studije difrakcije izvedene su u naprednom izvoru svetlosti. Kristalne strukture su rešene molekularnom zamenom sa PHASER i rafinirane korišćenjem PHENIX i COOT.

[0121] Rezonancija površinskog plazmona: SPR eksperimenti su vršeni na instrumentu Biacore T100 na 25°C. Eksperimenti su koristili Biacore SA senzorski čip (GE Healthcare) za snimanje biotiniliranog CD47 na površinskoj gustini od oko 150 RU. Nepovezani biotinilirani protein imobilizovan je kao referentna površina za SA senzorski čip sa podudaranjem RU sa eksperimentalnom površinom. Serijska razblaženja nebiotiniliranih varijanti SIRPα u puferu za tekuće tekućine [1xHBS-P (GE Healthcare)] tekla su preko čipa brzinom od 50 µL/min. CD47 je regeneriran korišćenjem tri 30 sekundne injekcije 2M MgCl2. Podaci su analizirani korišćenjem softvera za procenu Biacore T100 verzije 2.0 sa modelom vezivanja Langmuir 1:1.

[0122] Ćelijske linije kancera i uslovi kulture: Jurkat ćelije (ATCC) i DLD-1 ćelije (ATCC) su održavane u RPMI (Invitrogen)+10% fetalnog goveđeg seruma (Omega Scientific)+1% GlutaMax (Invitrogen)+1% rastvora penicilina/streptomicina (Invitrogen). Jurkat ćelije su održavane u suspenziji, dok su DLD-1 ćelije održavane kao adhezioni pojedinačni slojevi. Obe ćelijske linije su prolazile u pravilnim razmacima od 3-4 dana pre nego što su stigle do ujedinjenja. Da bi se napravila GFP-luciferaza+ ćelijske linije, Jurkat i DLD-1 ćelije su transdukovane luciferazom 2 (Promega)-eGFP eksprimirajućim lentivirusom dobijenim iz lentivirusnog vektora na bazi pCDH-CMV-MCS-EF1-puro (System Bioscience). Ćelije su sortirane za GFP+ ćelije korišćenjem BD FACSAria II protočnog citometra i održavane u kulturi na isti način kao roditeljske linije.

[0123] Procena vezivanja varijante SIRPα na ćelije kancera čoveka: GFP+ Jurkat ćelije su isprane u PBS i zatim inkubirane 30 minuta na ledu sa titrisanim koncetracijama biotiniliranih varijanti SIRPα. Divljeg tipa SIRPα tetramer je prethodno formiran inkubacijom 4:1 molarnog odnosa biotiniliranog divljeg tipa SIRPα sa streptavidinom tokom 15 minuta na ledu. Ćelije su isprane u FACS puferu (PBS+2% FBS), zatim inkubirane sa 50 nM streptavidinom konjugovanim na Alexa Fluor 647 tokom 20 minuta na ledu. Ćelije su isprane dva puta, zatim analizirane na vezivanje varijante SIRPα protočnom citometrijom korišćenjem protočnog citometra Accuri C6. Da bi se procenilo blokiranje divljeg tipa SIRPα do cD47, 50 nM divljeg tipa SIRPα tetramera inkubirano je 30 minuta titrisanjem koncentracije agensa za blokiranje CD47 tokom leda. Anti-CD47 klon B6H12 (eBioscience) korišćen je kao pozitivna kontrola za blokiranje. Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 5. Maksimalno vezivanje varijante SIRPα predstavlja procenat maksimalnog srednjeg intenziteta fluorescencije merenog za svaku varijantu.

[0124] Derivacija i kultura makrofaga: Za derivaciju ljudskih makrofaga, odabrane su komore sistema za smanjenje leukocita iz Centra za krv u Stanfordu od anonimnih davalaca. Periferne mononuklearne ćelije krvi su dobijene centrifugiranjem preko gradijenta gustine Ficoll Paque Premium (GE Healthcare). CD14+ monociti su prečišćeni korišćenjem CD14 mikro-perli (Miltenyi) i AutoMACS Pro separatorom (Miltenyi). Monociti su diferencirani u makrofage kultivacijom u IMDM+ GlutaMax (Invitrogen)+10% AB humanog seruma (Invitrogen)+1% penicilina/streptomicina tokom 7 dana, u koje vreme su korišćeni za analizu fagocitoze.

[0125] Miševi makrofagi su izvedeni izdvajanjem koštane srži iz C57BI/Ka Rosa26-mRFP1 transgenskih miševa i kultivisanjem u RPMI (Invitrogen)+10% FBS+1% GlutaMax+1% penicilina/streptomicina sa dodatkom 10 µg/mL mišjeg M-CSF (Peprotech). Posle 7 dana diferencijacije, sakupljeni su makrofagi i korišćeni za testiranje na fagocitozu.

[0126] Analiza fagocitoze in vitro: Ispitivanja in vitro fagocitoze izvedena su koristeći makrofage miša i čoveka. Za procenu protočnom citometrijom, u ploče za kulturu sa 96 udubljenja dodato je oko 50,000 makrofaga po pločici.

1

200,000 ćelija tumora GFP+ prethodno je inkubirano tokom 30 minuta terapijom antitela ili varijante SIRPα u podlozi bez seruma i zatim dodato makrofagovima. Anti-CD47 klon 2D3 (eBioscience) i cetukimab (Bristol-Myers Squibb) korišćeni su kako je opisano za opsonizaciju. Makrofagi i ciljne ćelije se inkubiraju tokom 2 sata u vlažnom 37° inkubatoru koji sadrži 5% ugljen dioksida. Posle inkubacije, ćelije su isprane, uklonjene sa ploče i pripremljene za protočnu citometriju. Mrtve ćelije su isključene iz analize bojenjem DAPI (Invitrogen). Humani makrofagi su identifikovani obojenjem sa Alexa Fluor 647 konjugovanim anti-humanim CD14 (BioLegend). Uzorci su analizirani korišćenjem BD Biosciences LSRFortessa sa uzorkom sa velikom propusnom snagom. Procenat ćelija makrofaga koji fagocitoziraju tumore, predstavljen GFP+ makrofazima, određen je korišćenjem FlowJo 7.6.4 (Treestar).

[0127] Za vizualizaciju fagocitoze in vitro, 50,000 makrofaga je posijano u ploče sa 24 udubljenja. Tumorske ćelije su obeležene sa 5µM CFSE (Invitrogen) prema protokolu proizvođača.200,000 CFSE+ tumorskih ćelija tretirano je tretmanima antitela ili varijante SIRPα tokom 30 minuta u podlozi bez seruma, dodato je makrofagovima i zatim inkubirano 2 sata na 37°. Posle inkubacije, udubljenja su oprana opsežno da bi se uklonile preostale ciljane ćelije. Nakon toga, udubljenja su vizualizovane korišćenjem invertovanog fluorescentnog mikroskopa (Leica DMI6000 B). Indeks fagocitoze je ocenjen kao broj ciljnih ćelija po makrofagu pomnožen sa 100.

[0128] Rezultati. In vivo eksperimenti u lečenju ksenografisanih imunodeficijentnih miševa pokazuju da je tretman reagensima visokog afiniteta SIRPα-Fc blokirao rast tumora. Miševi transplantirani luciferazom koji eksprimira HL60 ćelije leukemije tretirani su rastvorljivim SIRP reagensima. Opterećenje tumora mereno sjajem koji je emitovao ćelije luciferaze-HL60 smanjio se na nivo pozadine što ukazuje na klirens ćelija tumora, dok se kod miševa koji su kontrolisani IgG, zračenje povećavalo, što odražava povećani rast tumora. Ovaj rezultat je bio uporediv sa rezultatima opaženim sa hu5F9 anti-CD47ab. Ovi podaci pokazuju da su visoko rastvorljivi reagensi SIRPα visokog afiniteta uporedivi sa anti-CD47 antitelom u efikasnom blokiranju "ne jedi me" signala vezivanjem na CD47 u ćeliji HL60 i omogućavanjem fagocitoze i čišćenja ćelija.

Primer 2

SIRPα visokog afiniteta snižava prag za fagocitozu makrofaga ćelija kancera

[0129] Sposobnost tumora da izbegnu imuni sistem je prva karakteristika raka, a nove terapijske strategije koje usmeravaju imuni odgovor na ćelije kancera pokazuju obećavajuće u eksperimentalnim i kliničkim okruženjima. Makrofagi obično infiltriraju tumore, a nedavne studije su CD47 identifikovale kao antifagocitni signal „ne jedi me“ koji je izrazito izražen na mnogim vrstama kancera da bi se izbeglo uništavanje posredovano makrofagama. Antitela koja blokiraju vezivanje CD47 na SIRPα, inhibitorni receptor na makrofagovima, uvelike povećavaju fagocitozu ćelija kancera - identifikujući uzbudljivu novu osovinu za manipulaciju sa antitumorskim imunoterapijama. Usmerena evolucija i inženjering proteina korišćeni su za modifikovanje domena vezivanja SIRPα, čiji je afinitet divljeg tipa suviše slab da bi bio terapeutski koristan, kao konkurentski antagonist visokog afiniteta CD47.

[0130] Napravili smo SIRPα varijante koje se vežu za CD47 sa afinitetom od oko 50,000 puta u odnosu na divlji tip SIRPα. Kada se proizvode kao multimerni fuzioni proteini visokog afiniteta SIRPα-Fc, varijante deluju kao pojedinačni agensi za indukciju fagocitoze in vitro i smanjenje rasta humanih tumora in vivo. Iako jednodomni monomeri visokog afiniteta SIRPα nisu dovoljni da sami pozovu maksimalnu fagocitozu, oni značajno povećavaju efikasnost utvrđenih terapijskih monoklonalnih antitela kada se daju u kombinovanoj terapiji. Pošto je CD47 rašireni mehanizam koji tumorske ćelije koriste da izbegnu imuni sistem, molekuli generisani u ovoj studiji imaju koristi od velikog broja obolelih od kancera, i kao monoterapije i kao adjuvansi drugih ciljanih bioloških lekova.

[0131] Da bi se stvorio idealan antagonist CD47, korišćen je inženjerski protein da bi se poboljšao afinitet rastvorljivog SIRPα za CD47 (slika 1A). Napravili smo mutirane biblioteke N-terminala V domena Ig-a SIRPα konjugirane na Aga2p za površinski prikaz kvasca (Slika 1B). Koristeći domen CD47 IgSF kao selektivni reagens, izveli smo dve „generacije“ in vitro evolucije. Prva generacija podrazumevala je pet krugova selekcije iz združene mutantske biblioteke koja sadrži randomizacije na dve klase ostataka SIRPα - one koji kontaktiraju CD47 ili one koji se nalaze u hidrofobnom jezgru (Slika 5A). Dobijene varijante SIRPα prve generacije su vezale CD47 sa 20-100 puta većim afinitetom od divljeg tipa SIRPα, mereno površinskom plazmonskom rezonancom. Da bismo dobili još više varijante afiniteta, izveli smo drugu generaciju usmerene evolucije konstruišući biblioteku koja je postigla potpunu pokrivenost trinaest ostataka mutiranih u selektantima prve generacije. Nakon pet dodatnih krugova odabira, dobili smo varijante koje su vezivale CD47 sa konstantama disocijacije (KD) čak 34.0 pM i polu-vekovima propadanja (t1/2) čak 44 minuta u poređenju sa 0.3-0.5 µM KDi 1.8 sekundi t1/2za divlji tip SIRPα (Slika 1C). Zanimljivo je da su sekvence varijanti SIRPα visokog afiniteta konvergirale na konsenzusni skup mutacija. Kada smo ovih devet konzervativnih supstitucija cepkali na prevladavajući divlji tip SIRPα alela (alel 2), rezultirajuća varijanta (nazvana CV1, konsenzusna varijanta 1) je povezala CD47 sa afinitetom od 11.1 pM (Slika 1C).

1

[0132] CV1 sekvenca ima sledeće promene aminokiselina u odnosu na alele divljeg tipa: V6I; V27I; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66T; V92I. CV1 može da sadrži, na primer, sekvencu d1 domena aminokiselina kao što sledi:

[0133] Da bismo razumeli da li su varijante SIRPα visokog afiniteta zadržale geometriju vezivanja CD47 sličnu proteinu divljeg tipa, odredili smo kristalnu strukturu kompleksa između varijante FD6 visokog afiniteta i domena CD47 IgSF (Slika 1D). FD6:CD47 kompleks prekriven divljim tipom SIRPα:CD47 kompleks sa korenom srednjeg kvadratnog odstupanja od samo 0.613 A, što ukazuje na visok stepen strukturne sličnosti i potvrđuje naša nastojanja da sačuvamo geometriju interakcije divljih vrsta (Slika 1E). Preklapajući načini vezivanja FD6 i divlji tip SIRPα za CD47 ukazuju da će se nadmetati za isti CD47 epitop, pružajući na taj način maksimalni potencijalni antagonizam. Kao vidljiva razlika, C'D petlja FD6 sadrži tri od četiri kontaktne mutacije prisutne u konsenzusnom nizu (Slika 1E). Nagađamo da ove mutacije stabilizuju C'D petlju, koja postavlja pozitivan naboj Arg53 u klaster glutaminske kiseline na CD47 (Slika 1E). Ostatak vezujućeg interfejsa između FD6 i CD47 vrlo podseća na divlji tip SIRPα:CD47 interfejsa, s tim što je najistaknutiji izuzetak bila mutacija Ile31 na Phe. Ova strukturna ispitivanja pokazuju da varijante SIRPα visokog afiniteta mogu poslužiti kao efikasni antagonisti CD47.

[0134] Da bismo testirali funkcionalna svojstva varijanti SIRPα visokog afiniteta, prvo smo ispitali njihovu sposobnost vezanja i antagonizacije CD47 na površini ćelija kancera. Otkrili smo da varijante SIRPα sa povećanim afinitetom CD47 pokazuju veću potenciju u vezivanju (Sl. 8a, c) i blokiranje CD47 ćelijske površine (Sl. 2a i Sl.

8b). Kao monomeri sa jednim domenom, i FD6 i CV1 varijante su pokazali snažan antagonizam u odnosu na divlji tip SIRPα. Važno je da su obe varijante visokog afiniteta bile snažnije CD47 antagoniste nego fragmenti Fab proizvedeni iz klona anti-CD47 antitela B6H12, dobro okarakterisan antagonist CD47 koji pokazuje terapijsku efikasnost in vitro i in vivo (Slika 8a).

[0135] Sledeće smo procenili sposobnost varijanti SIRPα visokog afiniteta da povećaju fagocitozu in vitro zajedničkom kultivacijom makrofaga i ćelija tumora u prisustvu sredstava koja blokiraju CD47. Kako su fuzioni proteini sa Fc fragmentom humanog IgG4 (hlgG4), varijante SIRPα visokog afiniteta dovele su do dramatičnog povećanja fagocitoze ćelija raka vizuelno prikazanog mikroskopijom (Slika 2b). Da bi se dobila kvantitativna merenja fagocitoze, primarni humani makrofagi i tumorske ćelije GFP<+>su zajedno kultivisani sa sredstvima koja blokiraju CD47 i zatim analizirani protočnom citometrijom (Sl. 2c). Koristeći više ćelijskih linija karcinoma koje predstavljaju i čvrste i hematološke malignitete, otkrili smo da tretman zasićenim koncentracijama varijanti SIRPαhlgG4 visokog afiniteta dovodi do dramatičnih porasta fagocitoze u odnosu na kontrole divljih vrsta SIRPα-hlgG4 (Sl. 2d). Iako su varijante SIRPα-hlgG4 visokog afiniteta i antitelo podudarno izotipom anti-CD47 proizvele uporedive nivoe fagocitoze kod zasićenih koncentracija (Slika 2d), varijante SIRPα visokog afiniteta pokazale su jasnu prednost kada se titriraju da bi se generisale krive doza-odgovor. (Sl.2e). Visoki afiniteti FD6-hlgG4 i CV1-hlgG4 odgovarali su smanjenim EC50, što ukazuje na jaču indukciju fagocitoze.

[0136] Interesantno je da nisu primećena značajna povećanja fagocitoze nakon lečenja zasićenim koncentracijama visoko-afinitetnih SIRPα monomera (Sl. 2d), što sugeriše da samo blokiranje CD47 nije dovoljno da indukuje maksimalnu fagocitozu. Shodno tome, pretpostavili smo da će lečenje monomerima SIRPα visokog afiniteta sniziti prag za fagocitozu u prisustvu monoklonskih antitela specifičnih za tumor. Da bismo istražili ovu hipotezu, izvršili smo analize fagocitoze koristeći antitela koja ciljaju ćelije DLD-1, ćelijsku liniju raka ljudskog raka debelog creva. Kada su monomeri SIRPα visokog afiniteta dodani sami ili u kombinaciji sa nespecifičnim antitelom za izotipizaciju, primećeni su bazni nivoi fagocitoze (Slika 2f).

[0137] Tretman ili anti-CD47 klonom 2D3, koji veže CD47, ali ne blokira interakciju sa SIRPα, ili anti-EpCam antitelom proizvodi umerene nivoe fagocitoze. Međutim, dodatkom visoko-afinitetnog SIRPα monomera FD6 na oba tretmana antitelom, makrofagi su pokazali značajno povećanje fagocitoze (Slika 2f). Stoga, blokiranje CD47 snižava prag za fagocitozu makrofaga u prisustvu drugih aktivirajućih podražaja, poput antitela Fc.

[0138] Da bismo pokazali kliničke implikacije ovog principa, istraživali smo sposobnost visoko-afinitetnih SIRPα monomera za povećanje efikasnosti utvrđenih monoklonskih antitela koja se trenutno koriste kao terapija protiv raka. Prvo, ispitivanja fagocitoze izvedena su koristeći DLD-1 ćelije raka debelog creva lečene cetuksimabom anti-EGFR antitela. Fagocitoza je procenjena kao odgovor na titracijske koncentracije samog cetuksimaba, u kombinaciji sa monomerom SIRPα divljih vrsta ili u kombinaciji sa monomerima SIRPα visokog afiniteta. U odnosu na sam cetuksimab ili u kombinaciji sa monomerom divljeg tipa SIRPα, kombinacija cetuksimaba plus visoko-afinitetnog SIRPα monomera proizvela je značajno povećanje i maksimalne efikasnosti i potencijala cetuksimaba (Sl. 2g). Slični efekti su primećeni kada je fagocitoza procenjena sa ćelijama Raji limfoma tretiranim titracijskim koncentracijama rituksimaba, antitela protiv CD20 (Sl.2h). Opet, monomeri SIRPα visokog afiniteta povećavali su

1

i maksimalnu efikasnost i moć rituksimaba. U kliničkim uslovima monoklonska antitela često postižu samo ograničene odgovore, a recidivi su uobičajeni nakon lečenja. Monomeri SIRPα visokog afiniteta nude rešenje za ove probleme tako što služe kao univerzalni adjuvansi antitela specifičnih za tumor.

[0139] Sledeće smo procenili efikasnost varijanti SIRPα visokog afiniteta in vivo koristeći modele tumora miša. Kao agresivni model karcinoma debelog creva u naprednom stadijumu, GFP-luciferaza<+>DLD-1 ćelije su ugrađene u peritonealne šupljine NSG miševa (Sl.3a). Nakon potvrđivanja ugradnje bioluminiscencijskim slikama, započeo je svakodnevni tretman kontrolisanjem nosača ili varijantom CV1-hlgG4 visokog afiniteta SIRPα kao monoterapijom. Nadgledanje ukupnog fluksa bioluminiscencijom otkrilo je umereno smanjenje stope rasta tumora tokom prvih nedelja lečenja sa CV1-hlgG4 (Slika 9), što je dovelo do značajne koristi za preživljavanje tokom vremena (Slika 3b). Pošto je gubitak crvenih krvnih zrnaca glavni neželjeni efekat primećen prilikom lečenja antimizoničnim antitelima CD47, ispitivali smo u krvi miševa tretiranih CV1-hlgG4 da li postoji sličan pad. Protok citometrije pokazao je da CV1-hlgG4 veže sve ćelije u krvi (Sl.3c) i rezultira u umerenim smanjenjem hematokrita (Sl.3d). Međutim, kao što je ranije primećeno, produženo lečenje nije uzrokovalo dalje toksičnost.

[0140] Pošto je CV1-hlgG4 pokazao efikasnost protiv tumora kao jedinstveno sredstvo, sledeći put smo procenili njegovu efikasnost na modelu karcinoma mokraćne bešike, vrste raka za koji trenutno ne postoji ciljana biologija. GFP-luciferaza 639-V ćelije raka mokraćnog mehura ubrizgane su u dorzalno potkožno tkivo NSG miševa. Ugrađivanje je potvrđeno snimkom bioluminiscencije, a miševi su nasumično podeljeni u grupe za svakodnevno lečenje kontrolom nosača ili CV1-hlgG4. Tretman sa CV1-hlgG4 značajno je smanjio stope rasta tumora, što je procenjeno bioluminiscentnim snimanjem (Sl.3e, f). Zapremina tumora procenjena je neposredno pre smrti prvog kontrolnog miša, u kome su se veliki tumori merili kod svih kontrolnih miševa i nije bilo vidljivih tumora koji su se mogli osetiti kod miševa tretiranih sa CV1-hlgG4 (Sl. 3 g). Shodno tome, primećena je izuzetna korist u preživljavanju, čak i nakon prekida lečenja nakon što su svi kontrolni miševi umrli (Sl.3h).

[0141] Kao što je ranije primećeno, lečenje sa CV1-hlgG4 dovelo je do smanjenja indeksa crvenih krvnih zrnaca (Sl.10a). Miševi tretirani sa CV1-hlgG4 takođe su razvili opipljivo stromalno tkivo koje okružuje mesta ugradnje tumora. Histopatološkim pregledom ovog tkiva otkriveni su mali tumorski čvorovi ugrađeni u obiman inflamatorni infiltrat koji sadrži makrofage (Sl.10b, c).

[0142] Sledeće smo istražili adjuvantni efekat visoko afinitetnih SIRPα monomera in vivo. U lokalizovanom modelu humanog limfoma, GFP-luciferaza<+>Raji ćelije subkutano su ugrađene u bok NSG miševa. Nakon potvrđivanja ugradnje bioluminescencijskim slikanjem, miševi su nasumično podeljeni u grupe tokom tronedeljnog dnevnog tretmana bilo vehikulumom, samo CV1 monomerom, samim rituksimabom, ili kombinacijom rituksimaba i CV1 monomera. Sam tretman CV1 monomerom ili rituksimabom samo je smanjio rast tumora, dok je lečenje kombinovanom terapijom dramatično iskorenilo tumore kod većine miševa (Sl. 4a, b, c). Tokom perioda lečenja nije primećeno značajnije smanjenje broja eritrocita (Sl. 11a, b, c). Efekti svake terapije prevedeni su na odgovarajuće trendove krivulja preživljavanja (Sl.4d). Izuzetno je da je sinergistički efekat kombinovanja SIRPα monomera visokog afiniteta i monoklonskog antitela specifičnog za tumor doveo do dugotrajnih izlečenja kod većine životinja - čak i nakon prekida lečenja (Slika 4d).

[0143] Razvoj varijanti SIRPα visokog afiniteta predstavlja multidisciplinarni, racionalni napili na dizajniranju lekova, polazeći od molekularnog inženjeringa na nivou proteina, do in vitro validacije korišćenjem pročišćenih imunih efektorskih ćelija, i na kraju do terapijskog ispitivanja na životinjskim modelima. Iako su prethodne studije pokazale vrednost ciljanja interakcije CD47-SIRPα kao imune intervencije za rak, ovde smo dodatno manipulisali ovim sistemom da bi se stvorili visoko efikasni i moćni CD47 antagonisti koji pokazuju optimalna svojstva kao terapeutici.

[0144] Naši in vitro i in vivo nalazi pružaju novi uvid u aktivnost makrofaga protiv raka i njihov odgovor na imunomodulacione terapije. Kao što je posmatrano sa monomerima SIRPα visokog afiniteta, sama blokada CD47 nije dovoljna da indukuje maksimalnu fagocitozu. Slično tome, kada je CD47 slobodan da prenosi inhibitorne signale kroz SIRPα na makrofagovima, monoklonska antitela ne postižu svoju maksimalnu efikasnost. Međutim, makrofagi su snažno stimulisani kada je CD47 blokiran visoko-afinitetnim SIRPα monomerima u prisustvu površinski vezanog antitela Fc. Visoko-afinitetni fuzioni proteini SIRPα-Fc i antitela protiv CD47 kombinuju komponentu koja blokira CD47 i profagocitno antitelo Fc u jednu molekulu; stoga pokazuju efikasnost kao pojedinačna sredstva, ali imaju veći potencijal za van-toksičnu toksičnost. S druge strane, kombinacija SIRPα monomera visokog afiniteta sa zasebnim antitumorskim monoklonskim antitelom, poput rituksimaba, posebno pojačava antitumorske odgovore. Iako ova strategija nudi jasne koristi, posebno nedostatak vidljive toksičnosti, za postizanje maksimalnih odgovora zavisi od raspoloživosti i efikasnosti klinički odobrenih monoklonskih antitela.

[0145] Nedavni izveštaj sugerisao je da se fuzioni proteini divljeg tipa SIRPα-Fc mogu koristiti za lečenje leukemije kod ljudi. Međutim, naše istraživanje pokazuje da slab afinitet između divljeg tipa SIRPα i CD47 ograničava potencijal takve terapije. Efekti koje su primetili drugi verovatno su posredovani pre-fagocitnim efektima Fc, za

2

razliku od antagonizma CD47, jer je fagocitoza bila očigledna samo kada su makrofagi bili prethodno aktivirani endotoksinom i interferonom. In vivo, nedostatak unakrsne reaktivnosti između divljih vrsta SIRPα i mišjeg CD47 nedovoljno modelira lečenje i toksičnost kod ljudi gde postoji veliki ponili antigena 'usled ekspresije CD47 na svim ćelijama u telu.

[0146] Visoko-afinitetni SIRPα reagensi predstavljaju novu klasu antitumorskih bioloških lekova koji su podložni daljem inženjeringu. Modifikacije mogu da se dizajniraju tako da izmene efikasnost, specifičnost, penetraciju tkiva, klirens i toksičnost. Dalje, pošto mnogi tumori prekomerno izražavaju CD47 i nivo ekspresije koreliraju sa lošim ishodom pacijenta, varijante SIRPα visokog afiniteta mogu se prilagoditi kao neinvazivna sredstva za snimanje raka. CD47 se obično koristi od tumorskih ćelija da bi izbegli imuni sistem, pa bi varijante SIRPα visokog afiniteta mogle da budu dragoceni terapeutici za različite vrste raka čoveka. Visoko-afinitetni fuzijski proteini SIRPα-Fc pokazuju efikasnost kao pojedinačna sredstva i stoga mogu biti posebno korisni kao tretmani za kancere za koje trenutno ne postoji ciljana terapija. Štaviše, monomeri SIRPα visokog afiniteta mogu se koristiti kao univerzalni adjuvansi za uobičajene terapije monoklonskim antitelom. Sveukupno, ova studija produbljuje naše znanje o odgovorima makrofaga na maligne ćelije i podržava upotrebu reagensa visokog afiniteta SIRPα kao terapije raka zasnovane na imunosti.

POSTUPCI

[0147] Ekspresija i prečišćavanje proteina. CD47 IgSF domen (ostaci 1-117), sa C15G mutacijom i C-terminalnim 8. histidinskim markom, je izlučen iz ćelija Trichoplusia ni (Hi-5) korišćenjem bakulovirusa i prečišćen pomoću Ni-NTA i hromatografija za isključivanje veličine Superdex-75 kolona. Da bi se stvorio CD47 minimiziran glikanom za kristalografiju, CD47 je zajedno eksprimiran sa endoglikozidazom-H (endoH) u prisustvu kifunensina. Varijante monomerne SIRPα (ostaci 1-118) su eksprimirane kao MBP-fuzije u periplazmi BL-21 (DE3) E. coli korišćenjem modifikovanog vektora ekspresije pMal-p2X (New England Biolabs) koji sadrži mesto deljenja rinovirusa 3C proteaze posle MBP oznaka i C-terminal 8. histidinska oznaka. Ćelije su indukovane na OD600od 0.8 sa 1 mM IPTG i inkubirane uz mućkanje na 22 °C tokom 24 sata. Periplazmatski protein je dobijen osmotskim šokom i MBP-fuzijski proteini su prečišćeni korišćenjem hromatografije nikl-nitrilotrisirćetne kiseline (Ni-NTA). Eluirani proteini su digestirani sa 3C proteazom na 4 °C tokom 12 sati radi uklanjanja MBP i dalje prečišćeni dodatnim Ni-NTA hromatografijom, nakon čega je usledila hromatografija za isključivanje veličine sa kolonom Superdex-S75. Za ispitivanja in vitro fagocitoze i in vivo eksperimente, endotoksin je uklonjen korišćenjem Triton X-114 kao što je prethodno opisano, a uklanjanje endotoksina potvrđeno je korišćenjem ToxinSensor Chromogenic LAL endotoksin testa (Genscript). SIRPα-Fc fuzije proizvedene su kloniranjem SIRPα varijanti u modifikovani pFUSE-hlgG4-Fc vektor (Invivogen) sa IL-2 sekvencom signala i inženjerskom mutacijom Ser228 Pro. Proteini su eksprimirani prolaznom transfekcijom u ćelijama Freestyle 293-F (Invitrogen) i prečišćenim na HiTrap proteinima A kolonama (GE Healthcare). Himerni anti-CD47 klon B6H12-hlgG4 je rekombinantno proizveden stabilnom ekspresijom u CHO ćelijama (Lonza).

[0148] Da bi se dobili biotinilirani CD47 i SIRPα, proteini su eksprimirani karboksi terminalnim peptidnim receptorima biotina (GLNDIFEAQKIEWHE) i prečišćeni kao što je iznad opisano. Prečišćeni proteini su biotinilirani in vitro BirA ligazom, a zatim uklonjeni iz reakcione smeše pomoću hromatografije za isključivanje veličine.

[0149] Priprema Fab fragmenata B6H12. Antitelo na B6H12 je razdvojeno u 20 mM natrijum-citratnog pH 6.0, 25 mM cisteina, 5 mM EDTA i razblaženo do koncentracije od 4 mg/mL. Antitelo je zatim pomešano sa 250 µL imobilizovane ficin smole (Thermo Scientific) po mL antitela i inkubirano rotacijom na 37 °C tokom pet sati. Digestirani fragmenti su prečišćeni prenošenjem reakcione smeše preko monoQ kolone (B6H12 Fab je ostao u toku), a potom je gel filtracijom u koloni Superdex-200.

[0150] Prikaz kvasca i stvaranje biblioteke varijanti SIRPα. N-terminalni V-set domena SIRPα (ostaci 1-118) prikazan je na površini soja S. cerevisiae EBY100 kao C terminalna fuzija sa Aga2 koristeći vektor pCT302 kao što je prethodno opisano. Objedinjena biblioteka prve generacije je generisana dvema PCR reakcijama odvojene montaže koje su nasumično postavile ostatke kontakta CD47 i hidrofobne „jezgrene“ ostatke SIRPα, korišćenjem sledećih setova prajmera sa degenerisanim kodonima: Kontaktni ostatak PCR seta, nasumično postavljanje Ser29=RST, Leu30=NTT, Ile31=NTT, Pro32=CNT, Val33=NTT, Gly34=RST, Pro35=CNT, Gln52=SAW, Lys53=ARG, Glu54=SAW, Ser66=RST, Thr67=RST, Lys68=ARG, Arg69=ARG, Phe74=NTT, Lys93=ANG, Lys96=ANG, Gly97=RST, Ser98=RST, i Asp100=RAS:

(SEQ ID NO:11) 5'GAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTATCAGTTGCAGCT3'; (SEQ ID NO:12) 5'GGTCACAGTGCAGTGCAGAATGGCCGACTCTCCAGCTGCAACTGATACGGA3'; (SEQ ID NO:13) 5'CTGCACTGCACTGTGACCRSTNTTNTTCNTNTTRSTCNTATCCAGTGGTTCAGAGGA3'; (SEQ ID NO:14) 5'ATTGTAGATTAATTCCCGGGCTGGTCCAGCTCCTCTGAACCACTGGAT3'; (SEQ ID NO:15) 5'CGGGAATTAATCTACAATSAWARGSAWGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGAG3'; (SEQ ID NO:16) 5'GTTACTGATGCTGATGGAAANGTCCATGTTTTCCYTCYTASYASYCTCTGAAACAGTTGTTAC3'; (SEQ ID NO:17) 5'TCCATCAGCATCAGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTGTG3'; (SEQ ID NO:18) 5'TCCAGACTTAAACTCCGTWTYAGGASYASYCNTCCGGAACNTCACACAGTAGTA GGTGCC3'; (SEQ ID NO:19) 5'ACGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGTGCCA AACCCTCT3'

[0151] 'Jezgreni' ostaci PCR prajmera, nasumično postavljanje Leu4, Val6, Val27, Ile36, Phe38, Leu47, Ile49, Tyr50, Phe57, Val60, Met72, Phe74, Ile76, V92, Phe94, i Phe103 to NTT:

(SEQ ID NO:20) 5'GGATCCGAGGAGGAGNTTCAGNTTATTCAGCCTGACAAGTCCGTATCAGTTGCAGCT GGAGAG3'; (SEQ ID NO:21) 5'GGGCCCCACAGGGATCAGGGAGGTAANAGTGCAGTGCAGAATGGCCGA CTCTCCAGCTGCAAC3'; (SEQ ID NO:22) 5'CTGATCCCTGTGGGGCCCNTTCAGTGG NTTAGAGGAGCTGGACCAGCCCGGGAA3'; (SEQ ID NO:23) 5'GTGGCCTTCTTTTTGATTAANAANAA NTTCCCGGGCTGGTCCAGC3'; (SEQ ID NO:24) 5'AATCAAAAAGAAGGCCACNTTCCCC GGNTTACAACTGTTTCAGAGTCCACAAAGAGAGAAAAC3'; (SEQ ID NO:25) 5'GCCGGCATCTG CTGGGGTGATGTTACTGATGCTAANGGAAANGTCAANGTTTTCTCTCTTTGTGGA3'; (SEQ ID NO:26) 5'ACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTNTTAAGNTTCGGAAAGGGAGCCCTGACACGGAG3', (SEQ ID NO:27) 5'AGAGGGTTTGGCACGCACAGACAGCTCAGTGCCTGCTCCAGACTTAANCTCCGTGTCAGGGCTCCC 3'. PCR proizvodi su dalje amplifikovani sa prajmerima koji sadrže homologiju na pCT302 vektoru, kombinovani sa linearizovanom pCT302 vektorskom DNK i zajedno elektroporirani u kvascu EBI100. Rezultujuća biblioteka sadržavala je 4.0·10<8>transformatora.

[0152] Biblioteka druge generacije je generisana i transformisana identično kao biblioteka prve generacije, ali je sastavljena sa sledećim prajmerima, nasumično Leu4=NTT, Val6=NTT, Val27=NTT, Ile31=WYT, Glu47=SWA, Lys53=ARG, Glu54=SAK, His56=CNT, Ser66=RST, Lys68=ARG, Val92=NTT, Phe94=NTT, Phe103=NTT:

(SEQ ID NO:28) 5'GGATCCGAGGAGGAGNTTCAGNTTATTCAGCCTGACAAGTCCGTATC3'; (SEQ ID NO:29) 5'GTGCAGTGCAGAATGGCCGACTCTCCAGCTGCAACTGATACGGACTTGTCAGGCTGAA3'; (SEQ ID NO:30) 5'CATTCTGCACTGCACTNTTACCTCCCTGWYTCCTGTGGGGCCCATCCAG3'; (SEQ ID NO:31) 5'CGGGCTGGTCCAGCTCCTCTGAACCACTGGATGGGCCCCACAGG3'; (SEQ ID NO:32) 5'GAGCTGGACCAGCCCGGSWATTAATCTACAATCAAARGSAKGGCCNTTTCCCCCGGGTAACAACT GTTTCAGAG3; (SEQ ID NO:33) 5'GAAAAGTCCATGTTTTCTCTCYTTGTASYCTCTGAAACAGTTGTTAC3'; (SEQ ID NO:34) 5'AGAGAAAACATGGACTTTTCCATCAGCATCAGTAACATCACCCCAGCAGATGCC GGCAC3'; (SEQ ID NO:35) 5'CTCCGTGTCAGGGCTCCCTTTCCGAANCTTAANACAGTAGTAGGTGCCGGCATC TGCTG3', (SEQ ID NO:36) 5'GAGCCCTGACACGGAGNTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGTGCCAA ACCCTCT3'. Rezultujuća biblioteka sadržavala je 2 x 10<8>transformatora.

[0153] Izbili biblioteke prve generacije. Transformisani kvas proširio se u tečni medijum SDCAA na 30 °C i indukovao u SGCAA tečnom medijumu na 20 °C. Svi koraci selekcije su izvedeni na 4 °C. Za prvi krug selekcije, kvas izazvan 4 x 10<9>, koji predstavlja desetostruko pokrivanje broja bibliotečkih transformatora, resuspendovan je u 5 ml PBE (fiziološki rastvor punjen fosfatom sa dodatkom 0.5% goveđeg serumskog albumina i 0,5 mM EDTA). Kvasac je pomešan sa 500 µL paramagnetičkih mikroperlica streptavidina (Miltenyi) koje su prethodno premazane biotiniliranim CD47 i smeša je inkubirana rotacijom tokom jednog sata. Kvasac je granuliran centrifugiranjem na 5,000 g tokom pet minuta i dva puta ispran sa 10 ml PBE. Kvas s magnetno obeleženim resuspendiranjem u 5 mL PBE i razdvojen LS MACS kolonom prema uputstvima proizvođača (Miltenyi). Eluirani kvasac je granuliran, resuspendovan u SDCAA medijumu i proširen za sledeći krug selekcije. Četiri dodatna kruga selekcije izvedena su slično kao u prvom krugu sa sledećim modifikacijama: 1 x· 10° kvas resuspendovan je u 500 µL PBE koji sadrži FITC obeleženo anti-c-Myc antitelo (Miltenyi) ili sukcesivno smanjuje koncentracije biotiniliranog CD47 proteina, sa 1 µL na 100 nM. Posle inkubacije tokom jednog sata, kvas se ispere sa PBE i za selekcije sa CD47, obeležen streptavidin-PE (Invitrogen) ili streptavidin-Alexa Flour 647 (proizveden u kući) tokom 15 minuta. Kvasac je ispran još dva puta sa PBE i magnetno obeležen sa 50 µL odgovarajuće anti-fluoroforne mikro-perlice (anti-FITC, anti-PE ili anti-Alexa Flour 647; Miltenyi) tokom 15 minuta. Kvasac je ispran jednom, ponovo suspendovan u 3 mL PBE i razdvojen sa LS kolonom kao u prvom krugu.

[0154] Izbili biblioteke druge generacije. Za prva dva kruga selekcije biblioteke druge generacije, kvasci su odabrani monomernim, biotiniliranim proteinima CD47, kao u drugim krugovima selekcije prve generacije. Prvi krug je izabran sa 20 nM biotiniliranog CD47, a drugi krug sa 1 nM biotinilovanog CD47, korišćenjem veće zapremine bojenja (10 mL PBE) da bi se izbeglo iscrpljivanje liganda. Za sve naredne runde selekcije izvedena je kinetička selekcija. Ukratko, kvas je obojen sa 20 nM biotiniliranog CD47 tokom jednog sata, ispran sa PBE, a zatim resuspendovan u 500 µL PBE koji sadrži 1 µM ne-biotiniliranog CD47. Ćelije su inkubirane 90 minuta na 25 °C (tri kruga) ili 300 minuta (četvrti i pet krugova), nakon čega su isprane ledenim PBE i obojene fluorescentno obeleženim streptavidinom. U krugovima od jedne do četiri, kvasci su razdvojeni pomoću MACS, kako je opisano u biblioteci prve generacije. U petom krugu selekcije, kvasci su obeleženi sa FITC-om anti-c-Mic i streptavidin-Aleka Flour 647 i izabrani pomoću FACSAria ćelijskog sortera (BD Biosciences).

[0155] Površinska plazmonska rezonanca (SPR). Eksperimenti su sprovedeni sa Biacore T100 na 25 °C. Koncentracije proteina kvantifikovane su apsorbancom od 280 nm sa Nanodrop2000 spektrometrom (Thermo Scientific). Za snimanje biotiniliranog CD47 korišćen je Biacore SA senzorski čip (GE Healthcare) (Rmax ∼150 RU). Nepovezani biotinilirani protein imobilizovan je sa vrednosti RU koja se podudara sa referentnom površinom radi kontrole nespecifičnog vezivanja. Merenja su izvršena serijskim razblaživanjem varijanti SIRPα u HBS-P<+>puferu (GE Healthcare). Površina CD47 je regenerirana pomoću tri 60 sekundarne injekcije 2 M MgCl2. Svi podaci analizirani su pomoću Biacore T100 softvera za procenu verzije 2.0 sa modelom vezivanja 1:1.

[0156] Kristalizacija i strukturno određivanje kompleksa FD6:CD47. FD6 koji je minimiziran glikanom CD47 i E. coli mešani su u razmeri 1:1 i digestirani sa karboksipeptidazama A i B kako bi se uklonili njihovi C-terminalni 8x histidin oznake. Digestirani FD6:CD47 kompleks je prečišćen gel filtracijom u fiziološkom rastvoru HEPES puferisanu (HBS; 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) sa kolonom Superdex-75 i koncentrovano do 22 mg/mL. Kristali su dobijeni dodavanjem 0.1 µL proteina u jednakoj zapremini od 2.0 M amonijum sulfata i 0.1 M Tris pH 7.3 i podvrgnuti su krioprotekciji u parafinskom ulju. Ispitivanja difrakcije izvedene su na liniji snopa 8-2 kod naprednog izvora svetlosti (Berkeley, CA, SAD). Dobijen je anizotropski skup podataka 1.9 A i obrađen sa HKL-3000. Kompleks FD6:CD47 je rešen molekularnom zamenom pojedinačnih modela CD47 i SIRPα iz pristupnog koda 2JJS banke podataka o proteinima. Prečišćavanje je izvršeno korišćenjem PHENIX i prilagođavanje modela izvršeno sa COOT. Za korekciju rastvarača korišćeno je glomaznost rasutih rastvora. U početnom usavršavanju korišćeno je kruto telo, koordinatno i realno-prostorno usavršavanje, zajedno sa preciziranjem pojedinačnog parametra atomskog pomeranja. U kasnijim iteracijama preciziranja dodato je TLS usavršavanje.

[0157] Ćelijske linije i GFP-luciferaza+transdukcija. DLD-1 ćelije (ATCC), HT-29 ćelije (ATCC), Raji ćelije (ATCC), Jurkatove ćelije (ATCC) i 639-V ćelije (DSMZ) kultivisane su u RPMI+GlutaMax (Invitrogen) sa dodatkom 10% ploda goveđi serum (Omega Scientific), 100 U/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina (Invitrogen). GFP-luciferaza<+>linije su generisane transdukcijom korišćenjem pCDH-CMV-MCS-EF1 puro lentivirusnog vektora zasnovanog na HIV-u (Systems Biosciences) dizajniranog da izražava fuzioni protein eGFP-luciferaraze2 (pgl4). Stabilne linije su stvorene sortiranjem GFP ekspresije na FACSAria II sorterima ćelija (BD Biosciences).

[0158] Analize vezivanja CD47 na ćeliji. Različite koncentracije biotiniliranih SIRPα monomera, SIRPα-hlgG4 fuzionisanih proteina ili antitela protiv CD47 inkubirane su sa ćelijama raka kako je naznačeno. Vezanje biotiniliranih monomera detektirano je upotrebom streptavidina povezanog 100 nM Alexa Flour 647 kao sekundarnog sredstva za bojenje i analizirano na protočnom citometru Accuri C6 (BD Biosciences). Vezivanje SIRPα-hlgG4 fuzionisanih proteina ili anti-CD47 antitela detektirano je sa kozjim anti-humanim IgG antitelom (Invitrogen) i analizirano na LSRFortessa sa uzorkom visokog protoka (BD Biosciences). Podaci predstavljaju srednji intenzitet fluorescencije normalizovan na maksimalno vezivanje za svaku klasu reagensa, a tačke su bile uklopljene na sigmoidne krive doza-odgovor pomoću Prism 5 (Graphpad).

[0159] Testovi za blokiranje CD47 na ćeliji. Biotinilirani WTa1d1 SIRPα inkubiran je sa streptavidinom konjugovanim sa Alexa Flour 647 da formira WTa1d1 SIRPα tetramere. 100 nM WTa1d1 SIRPα tetrameri su kombinovani sa titrirajućim koncentracijama CD47 antagonista i istovremeno dodavani u 50,000 GFP-luciferaze+Raji ćelije. Ćelije su se inkubirale 30 minuta na 4 °C i zatim isprale da bi se uklonio nevezani tetramer. Uzorci su obojeni sa DAPI (Sigma) da bi se isključile mrtve ćelije, a fluorescencija je testirana korišćenjem LSRFortessa sa uzorkom visokog protoka (BD Biosciences). Podaci predstavljaju geometrijski srednji intenzitet fluorescencije analiziran korišćenjem FlowJo v9.4.10 (Tree Star), normalizovanog na maksimalno vezanje tetramera, i bili su prilagođeni krivuljama sigmoidne reakcije doze pomoću Prism 5 (Graphpad).

[0160] Analiza derivacije makrofaga i fagocitoze. Komore sistema za smanjenje leukocita (LRS) dobijene su iz Stanfordskog centra krvi od anonimnih davalaca, a mononuklearne ćelije periferne krvi obogaćene su centrifugiranjem gradijenta gustoće preko Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare). Monociti su prečišćeni na AutoMACS (Miltenyi) korišćenjem anti-CD14 mikroperlica (Miltenyi) i diferencirani u makrofage kulturom tokom 7-10 dana u IMDM+GlutaMax (Invitrogen) sa dodatkom 10% AB-humanog seruma (Invitrogen) i 100 U/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina (Invitrogen). Testovi na fagocitozu izvedeni su ko-kulturom 50,000 makrofaga

2

sa 100,000 GFP+tumorskih ćelija tokom 2 sata, a zatim analizirani pomoću LSRFortessa ćelijskog analizatora sa uzorkom visokog protoka (BD Biosciences). Antitela koja se koriste za lečenje uključuju: miša IgG1 izotipska kontrola (eBioscience), anti-CD47 klon 2D3 (eBioscience), anti-EpCam (BioLegend), cetuksimab (Bristoll-Myers Squibb) i rituksimab (Genentech). Makrofagi su identifikovani protočnom citometrijom primenom antitela anti-CD14, anti-CD45 ili anti-CD206 (BioLegend). Mrtve ćelije su isključene iz analize bojenjem DAPI (Sigma). Fagocitoza je procenjena kao procenat GFP<+>makrofaga korišćenjem FlowJo v9.4.10 (Tree Star) i normalizovan je na maksimalan odgovor svakog nezavisnog davaoca protiv svake ćelijske linije. Statistički značaj je određen dvosmernom ANOVA s Bonferonijevim post-testovima, i, kada je naznačeno, podaci su bili prilagođeni sigmoidnim krivama doza-odgovor pomoću Prism 5 (Graphpad).

[0161] Slika fagocitoze u živim ćelijama. RFP<+>miši makrofagi su generisani i procenjeni u testu slikanja živih ćelija kao što je prethodno opisano. Ukratko, ćelije koštane srži su izolovane iz transgenskih miševa C57BL/KaRosa26 mRFP1 i diferencirane u 10 ng/mL mišjeg M-CSF (Peprotech). 500.000 Raji ćelija je obeleženo sa 0.5 M CFSE (Invitrogen) i ko-kultiviran sa 50,000 RFP makrofaga i snimljen je korišćenjem BioStation IMQ (Nikon) koji je uravnotežen na 37°C i 5% ugljen-dioksida.

[0162] Miševi. Nod.Cg-Prkdc<scid>IL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) miševi su korišćeni za sve in vivo eksperimente. Miševi su uzgajani tumorima od otprilike 6-10 nedelja starosti, a eksperimenti su izvedeni sa kohortama od 8-15 miševa razvrstanih po polu. Miševi su održavani u objektu sa zaprekama pod nadzorom Centra za veterinarske usluge u Stanfordu i njima se postupalo u skladu s protokolima koji su odobrili Upravni odbili Univerziteta Stanford o laboratorijskoj nezi životinja.

[0163] Tumorski modeli. Da bi se modelirao karcinom humanog creva, u peritonealnu šupljinu NSG miševa ubrizgano je 1.105 GFP-luciferaze+DLD-1 ćelije. Tumorski čvorovi vizualizovani su na M205 FA fluorescentnom disekcijskom mikroskopu (Leica) opremljenom DFC 500 kamerom (Leica). Rak mokraćne bešike modeliran je ugrađivanjem 1.25·10<5>GFP-luciferaze<+>639-V ćelija u dorzalno potkožno tkivo NSG miševa u 25% Matrigelu (BD Biosciences).1·10<6>GFP-luciferaze Raji ćelije su subkutano ubačene na donji bok za lokalizovani model humanog limfoma. U svim modelima, lečenje je započeto nakon potvrđivanja ugradnje i nastavljeno kako je naznačeno. Za sve tretmane, 200 µg varijante SIRPα ili antitela primenjeno je intraperitonealnom injekcijom svakodnevno. Rast tumora je praćen snimkom bioluminiscencije, a mere tumora su merene da bi se izračunale količine prema elipsoidnoj formuli (π/6·dužina·širina<2>). Statističku važnost utvrdili su Mann-Whitney test ili Kruskal-Wallis sa Dunnovim post-testovima, prema potrebi. Preživljavanje je analizirano Mantel-Cox testom.

[0164] Hematološka analiza. Krv je uzeta iz retro-orbitalnog pleksusa i prikupljena je u epruvetama dipokalijum-EDTA mikrotaksi (BD Biosciences). Hematološki parametri su procenjeni korišćenjem HemaTrue analizatora (Heska). Statistički značaj je određen dvosmernom ANOVA sa Bonferonijev post-testom. Vezanje SIRPα-Fc varijanti za mišu punu krv određeno je protočnom citometrijom korišćenjem Alexa Fluor 647 kozjeg anti-humanog IgG antitela (Invitrogen).

[0165] Bioluminescence predstavljanje. Anesteziranim miševima ubrizgano je 200 µL D-luciferin (svitac) kalijumova so (Biosynth) rekonstituisana u 16.67 mg/mL u sterilnom PBS. Bioluminiscencija je izvedena korišćenjem IVIS spektra (Caliper Life Sciences) tokom 20 minuta da bi se zabeležio maksimalni sjaj. Najveće vrednosti ukupnog fluksa procenjene su iz anatomske oblasti od interesa pomoću Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences) i korišćene za analizu.

[0166] Proteinske sekvence. Među proteinima korišćenim u ovde opisanim primerima, uključuju se:

FD6-hlgG4 (podvučen FD6, humani IgG4 S228P podebljan), koji uključuje CH2, CH3 i zglobne oblasti humanog IgG4, i d1 domen visokog afiniteta SIRPα FD6:

CV1-hlgG4 (podvučen FDCV-1, humani IgG4 S228P podebljan), koji uključuje CH2, CH3 i zglobne oblasti humanog IgG4, i d1 domen visokog afiniteta SIRPα CV1: Imajte na umu da su supstitucije aminokiselina CV1 „izgrađene“ na ljudskom alelu divljeg tipa 2:

FD6-hlgG2 (podvučen FD6, humani IgG2 podebljan), koji uključuje CH2, CH3 i zglobne oblasti humanog IgG2, i d1 domen visokog afiniteta SIRPα FD6:

CV1-hlgG2 (podvučen CV-1, humani IgG2 podebljan), koji uključuje CH2, CH3 i zglobne oblasti humanog IgG2, i d1 domen visokog afiniteta SIRPα CV-1:

GCN4 leucinski fuzioni patent zatvarač:

FD6-patentni zatvarač (podvučen FD6, podebljani patentni zatvarač GCN4), koji uključuje d1 domen FD6 spojenog sa GCN4 i koji koristi leucin zatvarač da umanji dimenzije:

Konkatamer konstrukcije:

2

Tabela izabranih sekvenci

2

2

2

2

1

2

4

4

Claims (25)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid visokog afiniteta SIRPα koji sadrži najmanje jednu a ne više od 15 modifikacija aminokiselina unutar d1 domena ljudske SIRPα sekvence divljeg tipa, pri čemu su modifikacije izvedene na ostatke koji odgovaraju ostacima izabranima iz grupe koja se sastoji iz : L4, V6, A21, V27, 131, E47, K53, E54, H56, V63, S66, K68, V92, F94, i F103 SEQ ID NO:1, pri čemu modifikacija aminokiselina povećava afinitet vezivanja polipeptida SIRPα na CD47 u odnosu na afinitet humanog SIRPα polipeptida divljih vrsta i gde SIRPα polipeptidu visokog afiniteta nedostaje transmembranski domen SIRPα.

2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid visokog afiniteta ima KD od najmanje 1 x 10-9 M za CD47.

3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid visokog afiniteta ima KDod najmanje 1 x 10<-8>M za CD47.

4. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde;

(i) se polipeptid sastoji iz celog ili dela SIRPα d1 domena ili

(ii) polipeptid sadrži aminokiselinske sekvence iz SIRPα izvan d1 domena.

5. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži najmanje jednu modifikaciju aminokiselina odabranu iz (1) L4V; L4I (2) V6I; V6L; (3) A21V; (4) V27I; V27L; (5) I31T; I31S; I31F; (6) E47V; E47L; (7) K53R; (8) E54Q; (9) H56P; H56R; (10) S66T; S66G; (11) K68R; (12) V92I; (13) F94L; F94V; (14) V63I; i (15) F103V.

6. Polipeptid prema patentnom zahtevu 5, koji sadrži modifikacije aminokiselina odabranih iz:

i. V6I; V27I; I31 F; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66T; i V92I;

ii. V27I ili V27L; K53R; S66T ili S66G; K68R; i F103V;

iii. L4V ili L4I; V27I ili V27L; E47V ili E47L; K53R; E54Q; S66T ili S66G; K68R; V92I; i F103V iv. L4V ili L4I; V6I ili V6L; A21V; V27I ili V27L; I31T, I31S ili 131 F; E47V ili E47L; K53R; H56P ili H56R; S66T ili S66G; K68R; i F94L ili F94V;

v. V6I ili V6L; V27I ili V27L; I31T, I31S, ili I31F; E47V ili E47L; K53R; E54Q; H56P ili H56R; S66T ili S66G; V92I; i F94L ili F94V;

vi. L4V ili L4I; A21V; V27I ili V27L; 131T, 131S, ili I31 F; E47V ili E47L; K53R;E54Q; H56P ili H56R; S66T ili S66G; F94L ili F94V; i F103V;

vii. L4V ili L4I; V6I ili V6L; V27I ili V27L; I31T, I31S, ili I31F; E47V ili E47L; K53R; H56P ili H56R; S66T ili S66G; K68R; V92I; i F94L ili F94V;

viii. L4V ili L4I; V6I ili V6L; I31T, I31S, ili 131 F; E47V, ili E47L; K53R; H56P ili H56R; S66T, ili S66G; V92I; i F103V;

ix. V6I; V27I; 131 F; E47L; K53R; E54Q; H56P; i S66T;

x. L4V; V6I; V27I; 131 F; E47V; K53R; E54Q; H56P; V63I; S66T; K68R; i V92I; xi. V6I; V27I; 131T; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66G; K68R; V92I; i F103V;

xii. V27I; K53R; S66T; S66G; K68R; F103V;

xiii. L4V; V27L; E47V; K53R; E54Q; S66G; K68R; V92I;

xiv. L4V; V6I; A21V; V27I; I31T; E47L; K53R; H56P; S66T; K68R; F94L;

xv. V6I; V27I; I31S; I31F; E47V; K53R; E54Q; H56P; S66G; V92I; F94L;

xvi. L4I; A21V; V27I; 131 F; E47V; K53R; E54Q; H56R; S66G; F94V; F103V;

xvii. L4V; V6I; V27I; I31F; E47V; K53R; H56R; S66G; K68R; V92I; F94L; ili

xviii. L4V; V6L; I31F; E47V; K53R; H56P; S66G; V92I; F103V.

7. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde SIRPα polipeptid visokog afiniteta sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 3-6, 8-10, i 37-39.

8. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 10.

9. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, spojen u imunoglobulinsku Fc sekvencu.

10. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, gde je polipeptid visokog afiniteta multimerni.

11. Terapeutska formulacija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10.

12. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, pri čemu polipeptid dalje sadrži etiketu koja se može otkriti.

4

13. Formulacija prema patentnom zahtevu 11, koja koristi u postupku lečenja raka, pri čemu postupak sadrži kontakt ćelije koja eksprimira CD47 sa formulacijom in vivo.

14. Formulacija za upotrebu u patentnom zahtevu 13, koja dalje sadrži kontakt navedene ćelije sa antitelom specifičnim za tumor.

15. Formulacija za upotrebu u patentnom zahtevu 13, gde ćelija koja eksprimira CD47 je ćelija raka.

16. Formulacija prema patentnom zahtevu 11, koja se koristi u postupku lečenja inflamatorne bolesti ili autoimune bolesti, pri čemu postupak sadrži primenu formulacije u kombinaciji sa terapeutskim antitelom.

17. In vitro postupak modulacije fagocitoze ćelije koja eksprimira CD47, koji obuhvata kontaktiranje navedene ćelije sa formulacijom iz patentnog zahteva 11 in vitro.

18. Polipeptid prema patentnom zahtevu 12, koji se koristi u postupku slikanja tumora, pri čemu postupak uključuje kontaktiranje ćelija raka sa polipeptidom.

19. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, gde je polipeptid visokog afiniteta monomerni.

20. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde modifikacija aminokiselina povećava afinitet vezanja polipeptida SIRPα na CD47 smanjujući odstupanje za najmanje 10 puta.

21. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde modifikacija aminokiselina povećava afinitet vezanja polipeptida SIRPα na CD47 smanjujući odstupanje za najmanje 20 puta.

22. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde modifikacija aminokiselina povećava afinitet vezivanja polipeptida SIRPα na CD47 smanjujući odstupanje za najmanje 50 puta.

23. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde modifikacija aminokiselina povećava afinitet vezivanja polipeptida SIRPα na CD47 smanjujući odstupanje za najmanje 100 puta.

24. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde modifikacija aminokiselina povećava afinitet vezivanja polipeptida SIRPα na CD47 smanjujući odstupanje za najmanje 500 puta.

25. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, pri čemu je CD47 humani CD47.