RS60602B1 - Lipozomi za lečenje virusnih infekcija - Google Patents

Description

MAKROPOROZNI KOPOLIMER METILMETAKRILATA I

AKRILAMIDA, POSTUPAK SINTEZE I KORIŠĆENJE KAO

NOSAČA ZA MIKROORGANIZME I ENZIME

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak odnosi se na novi proizvod - makroporozni, umreženi, kopolimermetilmetakrilataformule I

iakrilamidaformule II

sa slobodnom zapreminom otvorenih pora od 50 do 90%, postupak za njegovo dobijanje i njegovu primenu za preparate na bazi kopolimera sa ekonomskim i tehnoločki prihvatljivim kriterijumima.

Prema Međunarodnoj klasifikaciji patenata pronalazak pripada klasama C08 J 9/04, 9/28, C08 F 2/24, 2/26, 2/32 , BOI J 32/00, 35/10, 37/36; B29 C 35/02, 45/02.

TEHNIČKI PROBLEM

Ovim pronalaskom rešava se problem dobijanja polimernog materijala, koji se može iskoristiti kao nosač za imobilizaciju enzima i mikroorganizama.

Enzimi su vrlo specifični biokatalizatori, visokomolekularne supstance biološkog porekla, najčešće proteinske prirode. Proteinski deo enzima je apoenzim, a neki enzimi poseduju i neku prostetičku grupu neproteinskog karaktera. Sinteza enzima se odvija u biološkim ćelijama, a supstance na koje enzimi deluju su supstrati. Jedan molekul enzima može, po pravilu, da konvertuje veliki broj molekula supstrata. Izolacija enzima iz biološkog materijala i prečišćavanje su spori i skupi poslovi, a ako se zna da je koncentracija enzima u ćelijama relativno mala, onda je problem dobijanja enzima i njihovog korišcenja u čistom stanju veoma prisutan. Ako se izolovani i prečišćeni enzim upotrebi u smeši sa supstratom u jednom šaržnom ili kontinualnom postupku u industrijske svrhe, enzim je onečišćen, praktično izgubljen nepovratno. Velika ušteda se može ostvariti ako se izolovani i prečišćeni enzim imobiliše na krupnijim česticama polimera ili nekog drugog materijala, tako da se prostim filtriranjem, centrifugiranjem, taloženjem, lako odvoji od reakcione smeše u kojoj je katalizovao neki proces. Na taj način se enzim može više puta koristiti do njegove potpune fizičke istrošenosti.

U nekim procesima radi dobijanja jedinjenja važnih za farmaceutsku, prehrambenu i hemijsku industriju koriste se žive ćelije različitih mikroorganizama. Problem kontinualnih fermentacija je mogućnost ispiranja ćelija iz bioreaktora većim protokom hranljivog medijuma. To se može sprečiti unošenjem živih ćelija mikroorganizama u porozne polimerne strukture koje će se fiksirati ili mešati unutar bioreaktora. Još jedna povoljna okolnost je daje uticaj smicajnih sila na ćelije pri mešanju mnogo manji kada su ćelije zaklonjene u nekom poroznom nosaču.

Zahtevi u pogledu kvaliteta koje materijal mora da ispuni su:

- polimerne čestice moraju imati tvrdoću da izdrže mešanje u bioreaktoru,

pore unutar kopolimera moraju biti otvorene,

- treba da budu zastupljene i pore sa ekvivalentnim prečnikom većim od veličine ćelija mikroorganizama, ako se porozni kopolimer koristi kao nosač za žive ćelije mikroorganizama, a to je veličina pora veća od 1 u.m,

- potrebna poroznost je između 50 i 90% od ukupne zapremine.

STANJE TEHNIKE

Sinteza makroporoznih polimera je uvek predmet velikog interesovanja, jer se pri tom dobijaju materijali različite namene. Ako imaju otvorene pore mogu se koristiti kao polazne supstance za dobijanje različitih tipova jonoizmenjivačkih smola, kao adsorbenti, inertni nosači čestica katalizatora, enzima ili celih ćelija mikroorganizama. Ako se u postupku dobijanja proces vodi tako da pore ostanu zatvorene dobiče se penasti polimerni materijal, koji se može iskoristiti kao laki konstrukcioni materijal ili kao dobar izolator.

Imobilizacija mikroorganizama kao producenata farmaceutskih, industrijskih i prehrambenih sirovina na inertnim nosačima je veoma aktuclna. U tu svrhu se koriste različiti komercijalni sunđeri (C. Sommariva i sar.Chem. Biochem. Eng. Q.5, str. 135 - 140, 1991), alginatni gel (S. Zerajič, Magistarski rad, Skopje, 1989; D. Pejin i sar.Hem. Ind.46, str. 133 - 137, 1992; J. C. Ogbonna i sar.Process Biochemistry26 str. 109 - 121, 1991), karaginan (J. N. Nigam,Journal of Biotechnology80, str 189 - 193, 2000), sinterovano staklo (B. Bisping i sar.Appl. Microbiol. Biotechnol,23, str. 174 - 179,

(1986). B. Bisping i sar.Appl. Microbiol. Biotechnol,32, str. 119 - 123, 1989; B. H. Rotmann i sar.Appl. Microbiol. Biotechnol,34, str. 502 - 508, 1991), šećerna trska (D. K. Jain i sar.Process Biochemistry26, str. 217 - 223, 1991; R. D. Tyagi i sar.Process Biochemistry27, str, 23 - 32, 1992), pamučno vlakno (S. F. D'Souza i sar,Appl. Microbiol. Biotechnol.29, str. 136 - 140, 1988), kosti životinja, drveni materijal, porozne alumine itd. Imobilizacijom mikroorganizama se postiže visoka koncentracija ćelija u bioreaktoru, umanjen uticaj smicajnih sila na ćelije koje su u poroznom nosaču pri mešanju fermentacionog medijuma i nemogućnost ispiranja ćelija iz bioreaktora.

U patentnoj literaturi su opisani brojni postupci sinteze umreženog polimernog materijala niske gustine, pri čemu je početni proces predpolimerizacija u emulziji sa visokim sadržajem vodene faze (US Patenti 4,522,953; 4,536,521; 4,788,225; 5,147,345; 5,200,433; 5,210,104; 5,260,345; 5,268,224; 5,318,554; 5,331,015; 5,500,451 EP-A-0299762; WO 9324535; WO 9745456; WO 9909070). Patenti ove vrste u osnovi imaju isti pristup: - priprema emulzije različitim vrstama površinski aktivnih sredstava kao stabilizatora emulzije, sa velikim sadržajem vode, i monomerima u organskoj fazi; - korišćenje, uglavnom, vodorastvornih jedinjenja koja lako raspadanjem grade radikale, koji su inicijatori polimerizacije; - korišcenje vinilnih monomera sa jednom dvostrukom vezom, kao polaznih jedinjenja za polimerizaciju; - upotreba jedinjenja u obliku monomera sa dve ili više dvostrukih veza, koja će se u postupku polimerizacije ugraditi u polimerne lance jednom svojom dvostrukom vezom, a drugom (ili drugim) dvostrukom vezom (dvostrukim vezama) grade poprečne veze među polimernim lancima, čime se dobija umreženi nerastvorni polimer; od gustine poprečnih veza i primenjenih monomera zavisi u kojoj meri će dobijeni polimer moći

da bubri, biti elastičan ili imati potpuno čvrstu strukturu;

- postupak ispiranja polimernog materijala, otvaranja pora i sušenja.

Makroporozni kopolimer na bazi metilmetakrilata sintetisan suspenzionom kopolimerizacijom sa glicidil metakrilatom (S. Jovanović i sar.Makromol. Chem.219, str. 161 - 168, 1994; S. Jovanović i sar.Hem. Ind.53, str. 372 - 376, 1999; S. Jovanović i sar.Hem. Ind.54, str. 471 - 479, 2000) može se iskoristiti za selektivnu sorpciju jona metala, a poznata je i sinteza u nadkritičnim uslovima u ugljen dioksidu sol - gel polimerizacijom pri čemu je jedan od komonomera, koji treba da daju tvrdoću gotovom polimernom proizvodu, metilmetakiilat (A. Cooper i sar.Ind. Eng. Chem. Res.39, str. 4741 - 4744, 2000; A. Cooper,J. Mater. Chem.,10, str. 207 - 234, 2000). U patentnoj literaturi Sjedinjenih Američkih Država postoje patenti o poroznom polimetilmetakrilatu kao implatantnom materijalu u humane svrhe (US Patenti 4,101,984; 4,627,836), i o poroznom polimetilmetakrilatu sa proteinskim sadržajem (US Patent 5,482,996).

Imobilizacija enzima kovalentnim vezivanjem je izvedena u poliakrilamidnom gelu ili polimetilmetakrilatnom polimeru (K. Mosbach, Methods in Enzymology, Academic Press, London, vol. 137, str. 24-26, 1988; J. Woodward, Immobilised Cells and enzvmes, Prevod na ruski jezik, MIR Moskva, str. 89-90, 1988).

U patentnoj i nepatentnoj literaturi nije pronađen kopolimer od metilmetakrilata i akrilamida.

OPIS PRONALASKA SA PRIMERIMA IZVOĐENJA

Makroporozni umreženi kopolimeri imaju poroznu strukturu i u čvrstom stanju za razliku od običnih umreženih kopolimera koji postaju porozni tek posle bubrenja u nekom rastvaraču.

Novi proizvod - makroporozni, umreženi, kopolimermetilmetakrilataformule 1 iakrilamidaformule II, sa slobodnom zapreminom otvorenih pora od 50 do 90%, se ne rastvara i ne bubri ni u kom organskom rastvaraču. Na njemu se mogu izvoditi hemijske transformacije na grupama koje se nalaze na zidovima pora, orijentisane od slobodne površine kopolimera ka tečnoj fazi u koju je uronjeno polimerno telo.

Struktura kopolimera

Struktura kopolimera sa slobodnom zapreminom otvorenih pora od 50 do 90% se može odrediti pomoću više metoda. Prvi pokazatelj da se radi o umreženom polimernom materijalu je ispitivanje na rastvaranje. Uzorci sintetisanog umreženog kopolimera su potapani uvodui nepolarne organske rastvarače( ksilen, toluol, hloroform, ugljentetrahlorid),alkohole{ metanol, etanol, n- propanol),upiridinitetrahidrofuran,i nakon dužeg mešanja (i do 24 h) konstatovano da se kopolimer ne rastvara i ne bubri u primenjenim rastvaračima.

Apsorbcija vode tela od poroznog kopolimera je data na slici 1 u prilogu i dešava se kapilarnom absorpcijom u stabilne šupljine kopolimera. Spoljna dimenzija se ne menja. Ograničavajući faktor za bržu apsorbciju su zadržani mehurići vazduha u polimernom telu, koji sporo, zbog malog potiska, izlaze van i ustupaju mesto vodi. Desorpcija vode (odnosno njeno isparavanje) je več znatno brže, što se vidi iz slike 2 u prilogu, jer sada ima manje ograničavajućih faktora prolazu vode kroz otvore pora, a to je samo veličina pora; dodatno, apsorbcija vode je morala da se odvija samo u tečnom stanju, a desorpcija je mogla da se odvija migracijom vode u tečnom stanju kroz kapilare do vrha polimernog tela i otparavanjem, ili delimičnim otparavanjem i unutar pora i zatim difuzija u parnom stanju iz pora. Dimenzije polimernog tela u obliku spljoštenog cilindra su: prečnik 12,7 mm i visina 1,5 mm.

Infracrvena spektroskopija ( FT- IC)

Produkti sinteze su praćeni snimanjem FT-IC spektara na IC spektroskopu Bomem Hartmann & Braun MB-series u obliku presovane pastile uzorka 1,2 mg u 160 mg KBr spektrofotometrijske čistoc'e.

Valenciona traka sekundarnogcikličnog amiduvNH na oko 3200 cm"<1>(slika 3 u prilogu)glikoluriluse pomera ka većim frekvencijama zbog uvedene C-OH grupe, v0Hkoja apsorbuje na oko 3300 do 3470cm~' (slika 4), što potvrđuje nastajanjemetilol derivata glikohirila.Pojavljuje se traka od deformacione OH vibracije na 1319 cm ', i valenciona vc_0na 1183 cm"' (slika 4 u prilogu). C-H veza u glikolurilu apsorbuje na 2842 cm"<1>jer je C-atom na kome se nalazi H vezan za heteroatom (N), pa je došlo do pomeranja ka višim frekvencijama. Nove tri trake od C-H apsorpcija iz CH i CH2grupa u metilol derivatu glikolurila (slika 4 u prilogu) se pojavljuju na 2908, 2957 i 2988 cm"<1>. Valenciona vibracija C=0 grupe ureidne strukture (glikoluril je acetilen-urea) u adicionom proizvodu je na 1718 cm"<1>, dok je u glikolurilu pokazivala dve trake na 1685 i 1764 cm"<1>; to su amidna traka I i II, pri čemu amidna traka I potiče od C=0 grupe, a amidna traka II potiče delom od N-H deformacionih vibracija u ravni koje se kupluju sa valencionim C-N vibracijama. Nakon adicije formaldchida i uvođenja metilolne grupe, na N-atomu nema više slobodnog H-atoma, nema kuplovanja sa C-N grupom i u potpunosti se gubi amidna traka II (vidi prilog, slika 4).

Na slikama 5, 6 i 7 u prilogu je pomoću IC spektara ilustrovana sinteza poroznog kopolimera sa umreživačem. S obzirom da je dominantan sadržaj metilmetakrilata u kopolimeru (slika 7 - prilog), do 90% mase polimera, evidentna je sličnost u pojedinim trakama sa IC spektrom čistog homopolimera, polimetilmetakrilata (slika 6 - prilogu). Valenciona vibracija C=0 grupe polimetilmetakrilata (slika 6 - prilog) koja pokazuje apsorpciju na 1728 cm"<1>, prisutna je i kod poroznog kopolimera na 1733 cm"<1>. AmidnaIraka I iz poliakrilamida sa prevojem zbog blizine amidne trake II kuplovane deformacione N-H sa valentnom C-N na 1614 cm"<1>, takođe je prisutna u kopolimeru sa slabije izraženim prevojem zbog delimičnog utroška N-H veza na umrežavanje, a inače i cela traka je slabijeg intenziteta u poroznom kopolimeru zbog manjeg procentualnog učešća akrilamida i umreživača u strukturi kopolimera. Međutim, traka na oko 3440 cm"<1>(slika 7 - prilog) pokazuje i apsorpciju valencionih N-H iz akrilamida (slika 5 - prilog) i valencionih O-H iz umreživača (slika 4 - prilog) koje nisu utrošene na stvaranja poprečnih veza.

Skenirajuca elektronska mikroskopija ( SEM)

Uzorak polimera je pripremljen za SEM mikroskopiju tehnikom katodnog raspršivanja pomoću JEOL JFC - 1100E ion sputter-a. Time je na površinu uzorka polimera nanesen tanak sloj zlata od nekoliko nm. SEM mikroskopija je urađena na JEOL JSM - 5300 Scanning electron microscope-u.

U prilogu su date SEM fotografije umreženog, poroznog kopolimera (slika 8 - 11). Sa fotografija se vidi oblik i veličina pora sintetisanog kopolimera. Uglavnom su ovalnog oblika, veličine između 0,2 i lOum, iako se mogu primetiti i veće usamljene pore veličine do lOOum. Za imobilizaciju enzima odgovara manja veličina pora, ali za imobilizaciju većih ćelija mikroorganizma potrebne su pore veće veličine. Na slici 10 (prilog) vidi se pora elipsastog poprečnog preseka veličine 20x40|im.

živina porometrija

Na živinom porometru Carlo Erba 2000 određena je kumulativna raspodela zapremine pora po veličini pora za uzorak umreženog makroporoznog kopolimera.

Iz kumulativne krive raspodele veličine pora (slika 12 - prilog) može se videti vrednost ukupne poroznosti, ukupne poroznosti od 0,2 do 5,0 cm<3>/g kopolimera, ali i odrediti procentualno učešće zapremine pora većih od 10u.m, koje iznosi 1-20 %. Iz krive raspodele veličine pora može se izračunativrednost slobodne površineSSHsu m<2>/g prema jednačini (S. Jovanović i sar.Makromol. Chem.219, str. 161 - 168, 1994; S. Jovanović i sar.Hem. Ind.54, str. 471 - 479, 2000):

pri čemu je V;(u cm<3>/g) zapremina pora sa prečnikom d;(u nm). Za uzorak kopolimera (primer 1) dobijena vrednost slobodne površine je od 5 do 30m<2>. Cooper (A. Cooper i sar.Ind. Eng. Chem. Res.39, str. 4741 - 4744, 2000; A. Cooper,/. Mater. Chem.,10, str. 207 - 234, 2000) raspodelu veličina pora poroznih polimera prikazuje kao diferencijalnu raspodelu dV/(dlogP) u funkciji od D. Sa takvog grafika se vidi srednji prečnik najzastupljenijih pora (slika 13 - prilog), koji se kreće u opsegu 0,2 do 2 um.

Analiza

Najbrža metoda analize je merenje gustine sintetisanog i osušenog poroznog polimernog materijala. Gustina kopolimera bez šupljina je oko 1 g/cm<3.>Za brzu proveru to se može iskoristiti preko približnih jednačina:

Gustina = 1 - Poroznost

gde je poroznost definisana kao udeo slobodne zapremine pora u odnosu na ukupnu zapreminu polimernog tela. Gustina posle sinteze se odredi merenjem mase i zapremine polimernog tela, a približna projektovana poroznost pre sinteze se odredi prema:

Dalja karakterizacija može da se izvede snimanjem FT-IC spektara sintetisanog poroznog materijala, pri čemu karakteristične trake za prepoznavanje su: - valenciona vibracija C=0 grupe iz metilmetakrilata na 1733 cm"<1>; - amidna traka I iz akrilamida na 1670 cm 'sa prevojem zbog blizine amidne trake II kuplovane deformacione N-H sa valentnom C-N na oko 1620 cm"<1>; - široka traka sa prevojem i sa maksimumom na oko 3440 cm ', koja potiče od valencionih O-H i valencionih N-H vibracija; - uobičajene trake na 2847 i 2950 cm"', koje potiču od simetrične i asimetrične valencione vibracije CH2grupa u polimetilmetakrilatnim segmentima i 2995 cm ', koja potiče od CH, grupa na polimernim lancima.

Pomoću živine porometrije može da se odredi raspodela veličine pora, ukupna poroznost i udeo pora određenih prečnika, dok se struktura jednog dela površine (to može biti i prelomljena površina), oblik i veličina pora, može videti skenirajućom elektronskom mikroskopijom.

Ako se porozni kopolimer uroni u rastvor hidrazina i ostavi dovoljno dugo da se reakcija završi, određivanjem koncentracije hidrazina pre i posle reakcije sa polimerom, odredice se količina grupa koje su dostupne tečnoj fazi i reakciji sa hidrazinom. Slika 14 - prilog pokazuje pH-metrijsku titraciju hidrazina hlorovodoničnom kiselinom dva uzorka hidrazina: pre i posle reakcije sa poroznim kopolimerom. Dobija se tipična kriva titracije slabe baze jakom kiselinom. Tačke neutralizacije su prevojne tačke na krivoj pH - V.

Iz razlike količine HC1 poznate koncentracije utrošene na titraciju hidrazina pre i posle reakcije sa sintetisanim kopolimerom, može se odrediti količina utrošenog hidrazina po gramu kopolimera i to je ekvivalentno količini dostupnih grupa od akrilamida ili metilmetakrilata u kopolimeru. Znajući ukupnu količinu grupa u kopolimeru može se doći do podatka koliki udeo tih grupa je dostupan reakciji, tj. koliki udeo grupa je raspoređen po slobodnoj površini polimera na dodiru faza prema tečnosti. Taj podatak je za uzorke sintetisanog kopolimera 20 do 40%. Preostalih 80 do 60% grupa se nalazi unutar zidova kopolimera "zazidano" ili umreženo s obzirom da je prisutan i umreživač i da je reakcija sinteze kopolimera vođena tako daje došlo i do termičkog umrežavanja kopolimera, čime je stabilizovana njegova struktura.

Određen molski sadržaj grupa koje mogu reagovati sahidruzinom(računat po gramu suvog poroznog kopolimera) i poznata slobodna površina poroznog koolimera su podaci koji mogu dati broj acilazidnih grupa po jediničnoj slobodnoj površini polimernog nosača i time odrediti njegove potencijalne mogućnosti za kovalentno vezivanje. Taj broj se kreće od 50 do 100 miliona grupa po kvadratnom mikrometru slobodne površine.

Mogućnost primene

Makroporozni kopolimer na bazi metilmetakrilata i akrilamidaje interesantan materijal za imobilizaciju mikroorganizama ili enzima unutar pora. Posebno je pogodan za imobilizaciju enzima jer poseduje grupe na polimernim segmentima koje se lako mogu transformisati u acil-azidne grupe i na taj način omogućiti kovalentno vezivanje poroznog kopolimera sa slobodnim NH2grupama iz neke bazne aminokiseline bilo kog proteina. Esencijalna aminokiselina lizin, poseduje a-amino grupu koja učestvuje u stvaranju peptidnih veza pri ugrađivanju u strukturu proteina. Takođe, ima još jednu slobodnu amino-grupu koja može da se iskoristi za povezivanje sa acil-azidnom grupom na polimernom nosaču, ako je slobodna amino-grupa proteina povoljno orijentisana ka spoljnoj površini proteina u koji je ugrađena ta aminokiselina.

Dobijeni porozni umreženi polimerni materijal se može upotrebiti kao nosač pri imobilizaciji enzima ili živih ćelija mikroorganizama, ako je potrebno da se enzim ili ćelije mikroorganizama koriste kao biokatalizatori za proizvodnju neke prehrambene, farmaceutske ili neke druge biohemijske supstance. Imobilizacija enzima se izvodi kovalentnim povezivanjem acil-azidne grupe sa amino-grupom iz aminokiseline koja se nalazi u proteinskom delu enzima. Enzimi koji se mogu imobilisati su:/ 3- glukoziduzu

( celohiaza), / 3- fruktofuranozidaza ( invertaza), alkoholdehidrogenaza, a- amilaza, fi-

amilaza, dekstransaharaza, penicilinamidaza, laktaza, izoamUaza, amUoglukozidaza,

ciklodekstringlukanotransferaza, ureaza, tripsin, glukozoizomeraza, acetilholinestaraza,

karbamUaza, taktamaza, papirin, himotripsin, holesteroloksidaza, nitratreduktaza,enzimi iz grupelipaza, peroksidaza, hidrolaza, liaza, izotneraza,. oksidoreduktaza, trun sferaza, ligaza.Na ovakav način mogu se imobilisati i druge vrste proteina, a ne samo enzimi.

Dobija se novi proizvod,kopolimer-enzimski biokatalizatorna bazimakroporoznog kopolimera metilmetakrilata i akrilamida ienzima.

Imobilizacija živih ćelija mikroorganizama može da se izvede najjednostavnije uvlačenjem suspenzije ćelija mikroorganizama u porozni polimerni nosač pomoću vakuuma. Prilikom izvođenja fermentacije, uvučene ćelije formiraju svoje kolonije i mogućnost ispiranja ćelija zbog dubine pora je relativno mala. Pojedine ćelije se mogu pojaviti slobodno suspendovane u fermentacionom medijumu, koje potiču iz takvog poroznog nosača. Bakterije koje se mogu imobilisati su vrste roda:Bacillus, Acetobacter, Escherichia, Streptococcus, Leuconostoc, Lactohacillus, Clostridium, Zymomonas.Gljive koje se mogu imobilisati su vrste roda:Saccharomyces, Schizosaccharomyces,

Saccharomvcodes, Candida, Aspergillus, Mucor, Citromyces, Penicillium.

Može se pokušati i kovalentno povezivanje proteina na površini ćelije mikroorganizma sa acil-azidnom grupom na kopolimeru, radi prisnijeg povezivanja u porozni nosač. Naravno, posle izvesnog vremena izvođenja fermentacije sa imobilisanim ćelijama na porozni polimerni nosač, ćelije se ipak pojavljuju u fermentacionom medijumu kao slobodno suspendovane. Razlog je taj što se razmnožavanje ćelija mikroorganizma, u uslovima povoljnog okolnog medijuma, izvodi uglavnom deobom ćelija, pa ako je protein jedne ćelije i bio kovalento povezan sa polimerom, njena kći ćelija to ne mora biti. Pupljenjem kod kvasaca takođe se stvara mogućnost da se kći ćelija odvoji od polimera.

Dobija se novi proizvod,kopolimer-mikrobni biokatalizatorna bazimakroporoznog kopolimera metilmetakrilata i akrilamidai živih ćelija mikroorganizama.

Polimer-analogne reakcije na slobodnoj površini kopolimera se izvode sahidrazinombez obzira da li je na površini pristupačna grupa odmetilmetakrilatailiakrilamida,jer je proizvod reakcije isti i u krajnjem slučaju vodi doacilazida ( K. Mosbach,Methods in Enzymology,Academic Press, London, vol. 137, str. 24-26, 1988,

J.Woodward, Immobilised Cells and enzymes,Prevod na ruski jezik, MIR Moskva, str. 89-90, 1988):

Ispiranje bidestilovanom vodom na 0°C.

Ispiranje fosfatnim puferom, pH 7,5, 50 mM, a zatim kuplovanje sa enzimom:

U literaturi nije opisan pokušaj kovalentnog povezivanja acilazidne grupe na polimernom materijalu sa proteinom žive ćelije mikroorganizma radi imobilizacije:

Sinteza kopolimera

Makroporozni umreženi kopolimerise mogu dobiti samo u slučaju kada kopolimerizuju dva ili više monomera, od kojih bar jedan ima više od jedne dvostruke veze, u nekom inertnom medijumu. Za razliku od takvog tradicionalnog pristupa, sinteza makroporoznog umreženog kopolimera se ovde izvodi monomerima sa po jednom dvostrukom vezom. Umrežavanje se izvodi niskomolekularnim jedinjenjima koja imaju funkcionalne grupe koje se mogu kondenzovati međusobno, ali i sa funkcionalnom grupom iz jednog monomera{ akrilamida)u kopolimeru. Na taj način se stvaraju poprečne veze među makromolekularnim lancima, što na kraju procesa rezultuju stvaranjem trodimenzionalne mreže i potpuno čvrstom, fiksiranom strukturom polimernog materijala, koji se ne rastvara i ne bubri.

Takav kopolimer može se sintetisati odmetilmetakrilataformule I

iakrilamidaformule II sa slobodnom zapreminom otvorenih pora od 50 do 90%, saumreživačimana bazimelamina ([ l, 3, 5] triazin- 2, 4, 6- triamin)formuleIII iglikolurilu ( tetrahidro- imidazo[ 4, 5- dJ' imidazol- 2, 5- dion)formule IV

uz površinski aktivnu supstancu za stabilizovanje emulzije. Emulzija se priprema sa velikim sadržajem vode u kojoj se rastvara i jedan monomer( akrilamid),vodorastvorni umrcživač i inicijator. Drugi monomer{ mctilmetakrilat)se nalazi u organskoj fazi, u kojoj se dodatno nalazi ietilacetatkao sredstvo koje će otvoriti pore u završnim fazama izrade ovog polimernog materijala. U principu kao drugi monomer u organskoj fazi mogu da se iskoriste i drugialkil estri akrilne i metakrilne kiselineza dobijanje kopolimera druge namene.

Ako se pripremaporozni umreženi kopolimerkoji ce prvenstvenu namenu imati kao nosač za imobilizaciju enzima i mikroorganizama, potrebni monomeri za kopolimerizaciju su isključivo jedinjenjametilmetakrilatiakrilamid,zato što se u polimernom lancu mogu da izvode polimeranalogne reakcijehidrazinomna grupama - CONH2i COOCH3izakrilamidaimetilmetakrilata,respektivno.

Odnos primenjenih količinametilmetakrilataiakrilamidaje od 3:1 do 20:1, a poželjan odnos je 6:1 do 12:1.

Kaoinicijatorimogu da se koriste vodorastvorni persulfati kao što su:natrijumpersulfat, kalijumper sulfat i amonijumper sulfat,njihova kombinacija međusobno i redoks sistemi pomenutih persulfata sakalijum-ilinatrijum- metabisulfitom.Potrebna količina inicijatora je 0,1 do 20 % masenih u odnosu na količinu monomera u reakcionoj smeši. Inicijatori se rastvaraju u vodenoj fazi u toku pripreme emulzije. Ako se kao inicijator koristi samo persulfatno jedinjenje temperatura izvođenja predpolimerizacije i polimerizacije je do 60°C, a ako se kao inicijator koristi redoks sistem persulafata i metabisulfita temperatura izvođenja ovih procesa je do 30°C.

Kaostabilizator emulzijekoriste sealkilsulfosukcinatiu količini 0,03 do 5% maseni u odnosu na primenjenu količinu vodene faze u emulziji, u oblasti koncentracija iznad kritične micelarne koncentracije, i rastvaraju se u vodenoj fazi pre dodavanja organske faze.

Kaoumreživačmože da se koristimelamini sva šest njegova derivata:mono-, di-, tri-, tetra-, penta- i heksametilolmelamin, glikoliirili sva njegova četiri derivata:mono-, di-, tri- i tetrametilolglikoluril.Umreživač je prisutan u reakcionoj smeši u toku kopolimerizacije, za to vreme ne reaguje i vrši umrežavanje tek naknadnim povećanjem temperature kondenzacijom grupa -NH2, -NH- i -OH. Potrebna količina umreživača je 1 do 30 % masenih u odnosu na primenjenu količinu monomera.

S obzirom na odnos vodene i organske faze 2:1 do 4:1, početna struktura emulzije je voda u ulju, jer se emulzija ulje u vodi gradi tek pri odnosu vodene i organske faze većem od 4:1 (WO 9324535). Organsku fazu čini smešametilmetakrilata(ili nekog drugogalki! akrilata ili metakrilata,ili njihove smeše) ietilacetata.U vodenoj fazi se nalazi inicijator, akrilamid i umreživač. Na površini dodira faza se nalazi emulgator. Ovakva struktura emulzije do formiranja gela u predpolimerizaciji vodi stvaranju blok kopolimera.

Postupaksinteze poroznog, umreženog kopolimerase sastoji iz sledećih faza:

1. Sinteza poroznog kopolimera počinje sintezom umreživača. Pošto se može koristiti više različitih metilol derivatamelaminailiglikolurilu,sintetiše se svaki ponaosob. U rastvorudinutrijum hidrogen fosfatakoncentracije 0,001 do 0,06 mol/dm<3>(pH 9,1-9,7) izvodi se sintezametilol derivatu glikoluriluilimelaminana temperaturi 40 do 70°C u toku 0,5 do 3 h. Potreban molski odnosmelaminlformaldehidiglikolurillformuidehidzavisi od toga koji derivat se želi da dobije: na primer molski odnosmelaminlformaldehid je1:3 za dobijanjetrimetilol- meluminu ([ 4, 6- Bis-( hidroksimetil-amino)- [ 1, 3, 5] triuzin- 2- il aminoj- metanol)formule V a molski odnosglikolurillformuidehid je1:4 za dobijanjetetrametilol- glikolurila ( 1, 3, 4, 6-Tetrukis- hidroksimetil- tetrahidro- imidazo[ 4, 5- d] imidazol - 2, 5- dion)formule VI.

2.Priprema emulzijeza sintezu kopolimera: potrebna količina stabilizatora emulzije (čija je koncentracija u rastvoru veća od kritične micelarne koncentracije), inicijatora, akrilamida, umreživača, vode i smeše etilacetata i metilmetakrilata se sipa u sud i intenzivno promeša. Zbog prisutnogakrilamidau vodenoj fazi, a naročito pri zagrevanju zbog uticaja povišene temperature u fazi predpolimerizacije, emulzija i pored dodatog stabilizatora nije u potpunosti stabilna i sporo se raslojava. U fazi sinteze kopolimera može se koristiti i smeša različitih metilol derivata melamina i

glikolurila.

3. Sud sa mešalicom u kome je reakciona smeša se priključi na refluks, temperatura se povec'a najviše do 60°C uz mešanje i reakcija predpolimerizacije vodi 10 do 60 min. U ovom periodu se dostiže stanje mekog tečljivog gela, prestaje raslojavanje, a reakciona smeša može da se razlije u kalupe koji ce obezbediti dobijanje čestica

željenih oblika.

4. U sudu željenog oblika i veličine (na primer: sfere određenog prečnika, cilindri, kocke,...) nastavlja se polimerizacija reakcione smeše sol-gel procesom bez mešanja uz termostatiranje na temperaturi najviše do 60°C, do potpunog očvršcavanja reakcione

smeše. Ukupno vreme predpolimerizacije i polimerizacije je 1 do 5 h.

5. Dodatno oblikovanje čestica očvrslog polimera vrši se na primer seckanjem cilindra na tanke pločice da se dobije oblik spljoštenog cilindra, ili usitnjavanjem čestica do veličina ispod 1 mm, npr. miksovanjem očvrslog polimera u vodi pomoću

homogenizera ili blendera.

6. Obrada čestica polimera gotovog oblika zagrevanjem u destilovanoj vodi na temperaturi do 80°C. Vreme zagrevanja na ovoj temperaturi je najmanje 15 min. Pri tomeetilacelat,koji je inkorporiran uglavnom između segmenata koje čine monomerne jedinice metilmetakrilata, unutar polimera otparava i svojim naponom pare otvara pore i izlazi van polimera. U isto vreme, zaostale količine inicijatora završavaju reakciju polimerizacije i počinje reakcija kondenzacije hemijskih grupa radi stvaranja poprečnih veza u polimernom materijalu, čime ce se uspostaviti i fiksirati trodimenzionalna mreža polimernih lanaca. Pri tom se vrši i ispiranje polimernog materijala od primenjenog emulgatora i zaostalih količina nepolimerizovanih monomera. Dalja obrada polimernog materijala zagrevanjem u destilovanoj vodi uz mešanje. Ako se ovaj stadijum vodi diskontinualno potrebna je zamena vode u kojoj se zagreva polimerni materijal. Zapremina vode prema zapremini polimera koji se obrađuje je najmanje 2:1 u svakoj šarži. Proces ispiranja, zagrevanja, završetka reakcije i umrežavanja može da se obavi i u nekom protočnom reaktoru sa mešanjem uz konstantno proticanje tople vode, pri čemu je zapremina vode u kojoj se kuva polimer bar dva puta veća od zapremine polimera, a protok iznosi bar tri takve zapremine na sat. U ovom stadijumu se primenjuje linearni program uvećanja temperature sa 0,2 do 1 stepen/min do ključanja, a zatim se na temperaturi ključanja zadrži bar 10 min. Ukupno trajanje ovog stadijuma

je najmanje 40 min.

7.Umrežavanje i otvaranje pora.Zagrevanje polimernih čestica suvim zagrejanim vazduhom temperature od 100 do 150°C, čime se u potpunosti završava reakcija umrežavanja, izvrši se potpuno fiksiranje nagrađene polimerne mreže, pore se definitivno otvore, i izvrši se potpuno sušenje polimernog materijala. Vreme trajanja ovog stadijuma je 10 do 100 min. Gustina osušenih polimernih čestica je 0,1 do 0,4g/cm<3>.

Nakon završene faze polimerizacije, umrežavanja i stvaranja poprečnih veza među lancima polimera, odvija se nekom od sledećih reakcija na temperaturi iznad 90°C:

Prednostovogpronalaska ješto se njime može sintetisati porozni polimerni nosač za imobilizaciju molekula proteinskog karaktera, ili preko proteina, večih čestica koje su već vezane na neki drugi način za protein ili aminokiselinu koja poseduje slobodnu amino-grupu. Nosač je vrlo stabilne strukture, teško lomljiv, nerastvoran, ne bubri i inertan je u pogledu aktivnosti biokatalizatora. Polimerni porozni nosač se može sintetisati u bilo kojoj veličini i obliku koji može da se kalupi. Strukturno je dovoljno stabilan da može izdržati intenzivno mešanje u bioreaktoru, ako se iskoristi kao polimerni inertni nosač za imobilizaciju biokatalizatora (enzima ili celih ćelija radnog mikroorganizma).

Razlika u odnosu na nepatentno i patentno opisane načine sinteze umreženih poroznih polimera niske gustine je u načinu stvaranja poprečnih veza među polimernim lancima. U ovom pronalasku povezivanje lanaca polimera se vrši hemijskom kondenzacijom amido, amino i hidroksi grupa na povišenoj temperaturi. U patentnoj literaturi o sintezi umreženih polimera niske gustine polazeći od emulzione polimerizacije sa visokim sadržajem vodene faze (US Patenti 4,522,953; 4,536,521; 4,788,225; 5,147,345; 5,200,433; 5,210,104; 5,260,345; 5,268,224; 5,318,554; 5,331,015; 5,500,451 EP-A-0299762; WO 9324535; WO 9745456; W0 9909070) uglavnom se govori o korišćenju višefunkcionalnih nezasićenih monomera za umrežavanje. U nepatentnoj naučnoj literaturi (S. Jovanović i sar.Makromol. Chem.219, str. 161 - 168, 1994; S. Jovanović i sar.Hem. Ind.53, str. 372 - 376, 1999; S. Jovanović i sar.Hem. Ind.54, str. 471 - 479, 2000) pominju se glicidil derivati različitih nezasićenih jedinjenja za umrežavanje polimernih lanaca.

Da bi se olakšalo razumevanje postupka koji je predmet ovog pronalaska, dati su sledeći primeri, koje ne treba smatrati za ograničavajuće.

PRIMER 1. SINTEZA

U rastvorudinatrijum- hidrogen- fosfatakoncentracije 0,0141 mol/đnr' (pH 9,57) izvodi se sintezatrimetilol- melaminana temperaturi 60°C u toku lh. Potreban molski odnosmelaminlformaldehidza dobijanjetrimetilol- melamina je1:3.

Sastav reakcione smeše za sintezutrimetilol- melamina:30 mgdinatrijum-hidrogen- fosfata,1,262 gmelamina,2,85gformaldehida(35%-tnog) i 12 cm<3>destilovane vodese pomeša u balonu, postavi kondenzator za refluks i magnetna mešalica na 300 o/min, a zatim se temperatura poveća na 60°C, i reakcija vodi 1 sat. Nakon završene reakcije, reakciona smeša se prebaci u odmerni sud od 25 cm<3>i dopuni destilovanom vodom. Na taj način je dobijen rastvortrimetilolmelamina86,57 mg/cm<3>, koji će se koristiti u pripremi emulzije za dobijanje kopolimera.

Sastav reakcione smeše za sintezu poroznog polimera u vodi: 0,7gnatrijum-dioktilsulfosukcinat, 2gkalijum- persulfata,7,8 gakrilamida,220 cm<3>destilovana voda,12 cm<3>pripremljenog rastvoratrimetilol- melamina,35cm<3>etilacetatai 70cm<3>metilmetakrilata.Reakciona smeša se intenzivno izmeša u balonu, postavi kondenzator za refluks i magnetna mešalica na 450 o/min, temperatura na 60°C, i reakcija vodi 20 min. Zatim se dobijeni mekani gel prenese u staklene epruvete, i nastavi termostatiranje na 60°C još 1,5 h. Očvrsli polimer u obliku dugačkog valjka se izvadi iz epruvete i iseče popreko na kolutove debljine 1,5 mm, koji se zatim zagrevaju u destilovanoj vodi na 80°C 50 min. Zameni se destilovana voda i ponovo zagreje na 80°C a nakon toga se temperatura uveća linearnim temperaturnim programom po 0,5 stepena/min do ključanja, gde se i zadrži još 20 min. Polimerne čestice se prenesu u sušnicu na 130°C i zagrevaju 50 min.

PRIMER 2. SINTEZA

U rastvorudinatrijum- hidrogen- fosfatakoncentracije 0,0557 mol/dm<3>(pH = 9,71) izvodi se sintezatetrametilol- glikolurila(formule VI) na temperaturi 60°C u toku 2 h. Potreban molski odnosglikolurillformaldehidza dobijanjetetrametilol- glikolurilaje 1:4.

Sastav reakcione smeše za sintezutetrametilol- glikolurila:174mg dinatrijum-hidrogen- fosfata,5,2 gglikolurila,12,55g formaldehida(35%-tnog) i 7 cm<3>destilovane vodese pomeša u balonu, postavi kondenzator za refluks i magnetna mešalica na 300 o/min, a zatim se temperatura poveća na 60°C, i reakcija vodi 2 sata. Nakon završene reakcije, reakciona smeša se prebaci u odmerni sud od 25 cm<3>i dopuni destilovanom vodom. Na taj način je dobijen rastvortetrametilol- glikolurila383,8 mg/cm<3>, koji će se koristiti u pripremi emulzije za dobijanje kopolimera.

Sastav reakcione smeše za sintezu poroznog polimera u vodi: 0,66 gnatrijum-diokfilsulfosukcinat,1,9 gamonijum- persulfafa,8,2 gakrilamida,240 cm<3>destilovana voda,4 cm<3>pripremljenog rastvoratetrametilol- glikolurila,35 cm<3>etilacetatai 70 cm<3>metilmetakrilata.Reakciona smeša se intenzivno izmeša u balonu, postavi kondenzator za refluks i magnetna mešalica na 450 o/min, temperatura na 60°C, i reakcija vodi 20 min. Zatim se dobijeni mekani gel prenese u staklene epruvete, i nastavi termostatiranje na 60°C još 1,5 h. Očvrsli polimer u obliku dugačkog valjka se izvadi iz epruvete i iseče popreko na kolutove debljine 1,5 mm, koji se zatim zagrevaju u destilovanoj vodi na 80°C 50 min. Zameni se destilovana voda i ponovo zagreje na 80°C a nakon toga se temperatura uveća linearnim temperaturnim programom po 0,5 stepena/min do ključanja, gde se i zadrži još 20 min. Polimerne čestice se prenesu u sušnicu na 130°C i zagrevaju 50 min.

PRIMER 3. UPOTREBA

Odmerena količina oko 20 gsuvog poroznog polimerase prelije sa 650 cm<3>vodei 50 cm<3>rastvora (15%, v/v)hidrazina.Reakciona smeša stoji na sobnoj temperaturi 24 h, a zatim se izvrši ispiranjebidestilovanom vodom 2h termostatirajući u ledenom kupatilu. Zatim se polimer tretiraazotastom kiselinomkoja se direktno dobija delovanjem 20,6 cm<3>koncentrovane hlorovodonočne kiseline(36%) na 800 cm<3>rastvora 0,5 mol/dm<3>natrijumnitritau ledenom kupatilu, za 3 h.Azotasta kiselinaće acil-hidrazinske grupe prevesti u acil-azidne grupe.Fosfatni pufer,pripremljen od 9 gkalijum- dihidrogen- fosfatai 11,87 gdinatrijum- hidrogen- fosfatau dm<3>, koristi se za ispiranje poroznog polimera od rastvoraazotaste kiseline.Zatim se vrši kuplovanje polimera i enzima potapanjem polimera u 300 cm<3>rastvora enzima oc-amilaze koncentracije 4 mg/ml na temperaturi oko 4°C za 24 h. Naknadnim ispiranjembidestilovanom vodomviše puta u polimeru ostaje samo imobilisani enzim.

Imobilisanom enzimu( a- amilazi)na polimeru se sipa rastvor škroba i meri količina izdvojene glukoze u rastvoru spektrofotometrijskom metodom pomoćupikrinske kiselineu rastvorunatrijum karbonata.Iz količine izdvojeneglukozeu toku vremena (slika 15 - prilog) određuje se brzina hidrolizeškroba,koja iznosi 3,936 mgskrobalh- g suvog polimera.Posle 28 dana brzina hidrolize škroba je opala na 3,215 mg škroba /h-g suvog polimera.

PRIMER 4. UPOTREBA

Ako se pretpostavi da u membrani ćelija mikroorganizama su uronjeni proteini koji mogu biti samo u jednom delu membrane ili prolaze kroz celu membranu (slika 16 - prilog), da su proteini globalno sastavljeni od aminokiselina među kojima se mogu naći i bazne aminokiseline sa slobodnim amino-grupama, onda se može pretpostaviti i reakcija acilazidne grupe sa amino-grupom aminokiseline iz proteina u membrani ćelije mikroorganizma.

Odmerena količina oko 20 gsuvog poroznog polimerase prelije sa 650 cm<3>vodei 50 cm<3>rastvora (15%, v/v) hidrazina. Reakciona smeša stoji na sobnoj temperaturi 24 h, a zatim se izvrši ispiranje bidestilovanom vodom 2 h termostatirajući u ledenom kupatilu. Zatim se polimer tretiraazotastom kiselinomkoja se direktno dobija delovanjem 20,6 cm<3>koncentrovane hlorovodonočne kiseline(36%) na 800 cm<3>rastvora 0,5 mol/dm<3>natrijumnitritau ledenom kupatilu, za 3 h.Azotasta kiselinaće acil-hidrazinske grupe prevesti u acil-azidne grupe. Fosfatni pufer, pripremljen od 9 gkalijum- dihidrogen- fosfatai 11,87 gdinatrijum- hidrogen- fosfatau dm<3>, koristi se za ispiranje poroznog polimera od rastvora azotaste kiseline. Količina od 10 g svežeg pekarskog kvascaSacchuromyces cerevisiaese ispira destilovanom vodom tri puta i ćelije odvajaju centrifugiranjem na 3500 o/min za 5 min. Poslednje resuspendovanje ćelija kvasca, čija se viabilnost kreče oko 97%, izvrši se u fiziološkom rastvoru (0,9% rastvornatrijum- hloridau destilovanoj vodi), i ta suspenzija se koristi za kuplovanje ćelija sa pripremljenim polimerom. Kuplovanje traje dva dana uz blago mešanje na temperaturi oko 4°C. Nakon povezivanja vrši se ispiranje polimera bidestilovanom vodom više puta uz intenzivno mućkanje, čuvanje polimera u kome su ćelije kvascaSaccharomyces cerevisiaese izvodi u rastvoru fermentacione podloge (za 1 dm<3>:glukoza40g;magnezijum- sulfat0.5 g;kalcijum hlorici0,1 g;natrijum klorid1 g;kalijum hlorid1 g;kalijum- dihidrogen- fosfat3,5 g;amonijum- sulfat5 g;destilovana vodado 1 dm<3>; pH 4,67; sterilisana u autoklavu na 120°C za 20 min) na 4°C. SEM fotografije (slike 17 do 19 - prilog) potvrda su da su ćelije kvasca prisutne na slobodnoj površini poroznog polimera. Da ćelije nisu izgubile funkcionalnost potvrđuje izvođenje anaerobne alkoholne fermentacije u pomenutoj fermentacionoj podlozi sa česticama polimera na kojima su kuplovane ćelije kvasca. Utrošak glukoze u hranljivoj podlozi pri fermentaciji na 30°C je dat na slici 20 - prilog.

Claims (20)

1. Makroporozni umreženi kopolimerni matrijalna bazimetilmetakrilataformule T iakrilamidaformule II u odnosu od 3:1 do 20:1, prvenstveno 6:1 do 12:1.

2. Makroporozni kopolimer metilmetakrilata i akrilamidanaznačen time,što sadrži pore uglavnom ovalnog i elipsastog oblika, veličine između 0,2 i 100p.m, pri čemu je prosečna veličina pora 1-10 pxn, a za imobilizaciju većih ćelija mikroorganizama su pore veličina 10 do 100 um.

3. Makroporozni kopolimer metilmetakrilata i akrilamida,naznačen time,što je slobodna zapremina otvorenih pora od 50 do 90%.

4. Makroporozni kopolimer metilmetakrilata i akrilamida,naznačen time,što je vrednost ukupne poroznosti od 0,2 do 5,0 cm<3>/g kopolimera, sa procentualnim učešćem zapremine pora večih od lOum, koje iznosi od 1% do 20 %, a srednji prečnik najzastupljenijih pora se kreće u opsegu 0,2 do 2 \ xm.

5. Makroporozni kopolimer metilmetakrilata i akrilamida,naznačen time,što je gustina osušenih polimernih čestica 0,1 do 0,4 g/cm\

6. Makroporozni kopolimer metilmetakrilata i akrilamida,naznačen time,što je vrednost slobodne površine je od 5 do 30 m<2>.

7. Makroporozni kopolimer metilmetakrilata i akrilamida,naznačen time,što se ne rastvara i ne bubri ni u vodi, ni u nepolarnim organskim rastvaračima( ksilen, toluol, hloroform, ugljentetrahlorid),ni ualkoholima ( metanol, etanol, n- propanol),niti upiridinuitetrahidrofuranu,čak i nakon dužeg mešanja u organskom rastvaraču; na njemu se mogu izvoditi hemijske transformacije na grupama koje se nalaze na zidovima pora, orijentisane od slobodne površine kopolimera ka tečnoj fazi u koju je uronjeno polimerno telo.

8. Postupak za dobijanjemakroporoznog kopolimera metilmetakrilata i akrilamida,naznačen time,što obuhvata sledece faze: (a)sinteza umreživačavrši se za svaki umreživač ponaosob, pošto se može koristiti više različitihmetilolderivatamelaminaiglikolurila,tako što se u rastvorudi natrij um hidrogen fosfatakoncentracije 0,001 do 0,06 mol/dm<3>(pH 9,1-9,7) izvodi sintezametilol derivata glikolurilaimelaminana temperaturi 40 do 70°C u toku 0,5 do 3h, pri određenom odnosumelaminlformaldehid i glikolurillformaldehid(b)priprema emulzijeza sintezu kopolimera tako što se potrebna količina stabilizatora emulzije, inicijatora,akrilamida,umreživača,vodei smešeetilacetataimetilmetakrilatasipa u sud i intenzivno promeša; (c) sud sa mešalicom u kome je reakciona smeša se priključi na refluks, temperatura se poveća najviše do 60°C uz mešanje ireakcija predpolimerizacijevodi 10 do 60 minuta, kada se dostiže stanje mekog tečljivog gela, prestaje raslojavanje, a reakciona smeša može da se razlije u kalupe koji će obezbediti dobijanje čestica željenih oblika; (d) u sudu željenog oblika nastavlja sepolimerizacija reakcionesmešesol-gel procesombez mešanja uz termostatiranje do potpunog očvršćavanja reakcione smeše; (e) oblikovanje čestica očvrslog polimera u željeni oblik i veličinu, izlivanjem u kalupe, sečenjem ili usitnjavanje homogenizovanjem. (0 obrada čestica polimera gotovog oblika zagrevanjem u destilovanoj vodi na temperaturi do 80°C, najmanje 15 minuta, pri čemuetilacetat,koji je inkorporiran uglavnom između segmenata koje čine monomerne jedinicemetilmetakrilata,unutar polimera otparava i svojim naponom pare otvara pore i izlazi van polimera, a u isto vreme zaostale količine inicijatora završavaju reakciju polimerizacije i počinje reakcija kondenzacije hemijskih grupa radi stvaranja poprečnih veza u polimernom materijalu, čime će se uspostaviti i fiksirati trodimenzionalna mreža polimernih lanaca; pri tom se vrši i ispiranje polimernog materijala od primenjcnog emulgatora i zaostalih količina nepolimerizovanih monomera, dalja obrada polimernog materijala zagrevanjem u destilovanoj vodi uz mešanje; ako se ovaj stadijum vodi diskontinualno potrebna je zamena vode u kojoj se zagreva polimerni materijal; zapremina vode prema zapremini polimera koji se obrađuje je 2:1 u svakoj šarži; proces ispiranja, zagrevanja, završetka reakcije i umrežavanja može da se obavi i u nekom protočnom reaktoru sa mešanjem uz konstantno proticanje tople vode, pri čemu je zapremina vode u kojoj se kuva polimer bar dva puta veća od zapremine polimera, a protok iznosi bar tri takve zapremine na sat, sa linearnim programom uvećanja temperature sa 0,2 do 1 stepen/min do ključanja, a zatim se na temperaturi ključanja zadrži bar 10 minuuta; (g) umrežavanje i otvaranje pora zagrevanje polimernih čestica suvim zagrejanim vazduhom temperature od 100 do 150°C, čime se u potpunosti završava reakcija umrežavanja, izvrši se potpuno fiksiranje nagrađene polimerne mreže, pore se definitivno otvore i izvrši se potpuno sušenje polimernog materijala; (h) nakon završene faze polimerizacije i umrežavanja, stvaranje poprečnih veza među lancima polimera, odvija se nekom od sledećih reakcija na temperaturi iznad 90°C:

9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što ukupno vreme faze (c) predpolimerizacije i (d) polimerizacije iznosi 1 do 5 h, a vreme trajanja faze (f) obrade polimernog materijala zagrevanjem u destilovanoj vodi je od 10 do 100 min.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačentime,što se koriste umreživači na bazimelamina ([ 1, 3, 5Jtriazin- 2, 4, 6- triamin)formule III iglikolurila ( tetrahidro- imidazo[ 4, 5- d']' imidazol- 2, 5- dion)formule IV uz površinski aktivnu supstancu za stabilizovanje emulzije.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 8,naznačen time,što se kaoinicijatorikoriste vodorastvorninatrijumpersulfat, kalijumpeisulfat / amonijumper sulfat,njihova kombinacija međusobno iredoks sistemipomenutih persulfata sa kalijum- ili natrijum-metabisulfitom u količini od 0,1 do 20 % masenih u odnosu na količinu monomera u reakcionoj smeši.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 8,naznačen time,što se kaostabilizator emulzijekoriste sealkilsulfosukcinatiu količini 0,03 do 5% maseni u odnosu na primenjenu količinu vodene faze u emulziji, u oblasti koncentracija iznad kritične micelarne koncentracije, i rastvaraju se u vodenoj fazi pre dodavanja organske faze.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 8,naznačen time,što se kaoumreživaču toku kopolimerizacije koristimelamini sva šest njegova derivata:mono-, di-, tri-, tetra-, penta- i heksametilolmelamin, glikolurili sva njegova četiri derivata:mono-, di-, tri- itetrumetilolglikoluril,koji vrši umrežavanje tek naknadnim povec'anjem temperature kondenzacijom grupa -NH2, -NH- i -OH, a potrebna količina umreživača je 1 do 30 % masenih u odnosu na primenjenu količinu monomera.

14. Primena makroporoznog kopolimera metilmetakrilata i akrilamida, prema patentnim zahtevima 1 do 14 za primenu kao nosača za imobilizaciju: enzima kao što su( 3-glukoziduzu ( celobiaza), [ 3- fruktofurunoziduza ( invertaza), alkoholdehidrogenaza, a-umilazu, / 3- amilaza, dekstrunsaharaza, penicilinamidaza, laktaza, izoamilaza, ciklodekstringlukanotrunsferaza, iireaza, amiloglukozidazu, ghtkozoizomeraza, acetdhoUnestaruza, kurbumiluzu, laktamaza, papain, tripsin, himotripsin, holesteroloksidaza, nitratreduktuza,enzimi iz grupelipaza, peroksidaza, hidrolaza, liaza, izomeraza, oksidoreduktaza, transferaza, li gaza,drugih vrsta proteina, i/ili živih ćelija mikroorganizama kao što su vrste bakterija roda:BaciIIus, Acetobacter, Escherichia, Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Clostridium, Zymomonas,vrste gljiva roda:Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sacchavomycodes, Candidu, Aspergillus, Mucov, Citromyces, Penicillium,posebno za korišcnje kao biokatalizatora za proizvodnju prehrambene, farmaceutske ili neke druge biohemijske supstance.

15.Kopolimer-enzimski biokatalizatorna bazimakroporoznog kopolimera metilmetakrilata i akrilamidai enzima, što sadrži bar jedan enzim kao što je:J3-glukozidaza ( celobiaza), j3- frnktofuranozidaza ( invertaza), alkoholdehidrogenaza, a-amilaza, / 3- amilaza, dekstrunsaharaza, ureaza, penicilinamidaza, laktaza, papain, izoamilaza, ciklodekstringlukanotransferaza, amiloglukozidazu, acetilholinestaruzu, tripsin, glukozoizomeraza, karbamilaza, laktamaza, himotripsin, holesteroloksidaza, nitratreduktuza,ili enzim iz grupe:lipaza, peroksidaza, hidrolaza, liaza, izomeraza, oksidoreduktaza, transferazailigaza.

16.Kopolimer-mikrobni biokatalizatorna bazimakroporoznog kopolimera metilmetakrilata i akrilamidai živih ćelija mikroorganizama, što sadrži bar jednu vrstu bakterija roda:Bacillus, Acetobacter, Escherichia, Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Clostridium, Zymomonas,i/ili bar jednu vrstu gljiva roda:Mucor,Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes, Candidu, Aspergillus, CitromycesiPenicillium.

17.Postupak za dobijanje imobilisanih živih c'elija mikroorganizama na makroporoznom kopolimeru metilmetakrilata i akrilamida,naznačena time,što se izvodi uvlačenjem suspenzije ćelija mikroorganizama u porozni polimerni nosač pomoću vakuuma, uvučene ćelije formiraju svoje kolonije.

18. Postupak za dobijanje makroporoznog kopolimera sa acil-azidnim grupama na polimernim segmentima,naznačen time,što se vrši obrada sa hidrazinom, bez obzira da li je na površini pristupačna grupa od metilmetakrilata ili akrilamida, a zatim obrada azotastom kiselinom, dobijenom iz njene soli i jake kiseline.

79. Postupak prema zahtevu 18, za dobijanje imobilisanog enzima na makroporoznom kopolimeru metilmetakrilata i akrilamida,naznačena time,što se izvodi kovalentnim povezivanjem acil-azidne grupe sa amino-grupom iz aminokiseline koja se nalazi u proteinskom delu enzima.

20. Postupak prema zahtevu 18, za dobijanje imobilisanih mikroorganizma na makroporoznom kopolimeru metilmetakrilata i akrilamida,naznačen time,što se vrši kovalentno povezivanje proteina na površini ćelije mikroorganizma sa acil-azidnom grupom na kopolimeru. IZJAVA o zajedničkom predstavniku Saglasni smo da za patentnu prijavu pod nazivom:MAKROPOROZNI KOPOLIMER METILMETAKRILATA I AKRILAMIDA, POSTUPAK SINTEZE I KORIŠCENJE KAO NOSAČA ZA MIKROORGANIZME I ENZIME,zajednički predstavnik bude pronalazačLjubiša Nikolić.