RS59264B1 - Novi 2’ i/ili 5’ derivati 3’-deoksi adenozina supstituisani aminokiselinskim estrom fosforamidata, kao antikancerska jedinjenja - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na hemijska jedinjenja, jedinjenja za upotrebu u postupku lečenja, naročito u postupku prevencije ili lečenja kancera, na postupak za pripremu ovih jedinjenja i farmaceutskih kompozicija koje sadrže ova jedinjenja.

[0002] Naročito, mada ne isključivo, predmetni pronalazak se odnosi na hemijska jedinjenja za upotrebu u lečenju leukemije, limfoma, i/ili čvrstih tumora kod homo sapiens-a.

[0003] Kordicepin je 3’-deoksiadenozin (3’dA). Predstavlja nukleozidni analog adenozina kome nedostaje 3’-hidroksilna grupa na riboznom ostatku.

[0004] Kordicepin je jedna od glavnih bioaktivnih supstanci koje proizvodi Cordyceps militaris, parazitska gljiva koja se koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini zbog svojih dejstava pri aktivaciji imunog sistema, protiv starenja i protiv tumora. Kao referencu pogledati Tuli, H. S. et al 3 Biotech (2014) 4:1-12.

[0005] Kordicepin može da se proizvede sintezom od adenozina. Referenca za takve postupke sinteze je publikacija Robins, J. R. et al J. Org. Chem. 1995, 60, 7902-7908 i Aman, S. et al Organic Process Research & Development 2000, 4, 601-605.

[0006] Kordicepin je najintenzivnije proučavan kao antikancersko sredstvo.

[0007] Zbog svoje strukture, 3’dA i njegov trifosfatni oblik potencijalno bi mogli da interferiraju sa svakim procesom u kome su neophodni adenozin, odnosno adenozin trifosfat (ATP), redom.

[0008] Nakon primene, 3’dA se, međutim, in vivo brzo deaminuje pomoću adenozin deaminaze (ADA) i rapidno metaboliše do neaktivnog metabolita, 3’-deoksiinozina. Kao referencu pogledati Tsai, Y-J et al J. Agri. Food Chem.58 4638-43 (2010).

[0009] Kao što je opisano u Glazer, R. et al Cancer Research 38, 2233-2238 (1978), pokazano je da kordicepin prikazuje antikancerski potencijal kada se koristi u kombinaciji sa inhibitorom adenozin deaminaze, kao što je pentostatin (2-deoksikoformicin, dCF). Drugi ADA inhibitori takođe su predlagani kao alternativni ko-lekovi za istovremenu primenu sa kordicepinom, ali je u kliničkim ispitivanjim korišćena kombinacija 3’dA-dCF. Kao što je objavljeno u Wehbe-Janek, H. et al Anticancer Research 27: 3143-3146 (2007), za 2-deoksikoformicin se, međutim, zna da je relativno toksičan lek.

[0010] Za 2-fluorokordicepin (3’deoksi-2-fluoroadenozin) je takođe poznato da je citotoksičan (videti npr. Montgomery et al., J. Med. Chem., 1969, 12(3), 498-504 i Dickinson et al, J. Med. Chem., 1967, 10(6), 1165-1166).

[0011] Antivirusna aktivnost 2-hlorokordicepina (3’deoksi-2-fluoroadenozin) je procenjena (Rosowsky et al. J. Med. Chem., 1989, 32, 1135-40).

[0012] WO 2006/063149 opisuje nukleozide i farmaceutske kompozicije koje sadrže ovakva jedinjenja, sa antivirusnom i antikancerskom aktivnošću.

[0013] WO 2012/040126 opisuje nukleotidne analoge fosforamidata, postupke za sintezu nukleotidnih analoga fosforamidata i postupke za lečenje bolesti i/ili stanja kao što su virusne infekcije, kancer i/ili parazitske bolesti, nukleotidnim analozima fosforamidata.

[0014] Predmetni pronalazak za svoj cilj ima da reši problem povećanja efikasnosti delovanja purinskog 3’-deoksinukleozida, na primer kordicepina (3’-deoksiadenozin), u postupku profilakse ili lečenja, naročito, mada ne i isključivo, u antikancerskoj hemioterapiji, uključujuči hemioterapiju za lečenje leukemije, limfoma i/ili čvrstih tumora.

[0015] Dodatni cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi rešenje za problem purinskih 3’-deoksinukleozida, na primer, kordicepina (3’-deoksiadenozin), koji se prilikom primene deaminuju pomoću ADA i zatim rapidno metabolišu do neaktivnog metabolita.

[0016] Dodatni cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi rešenje za problem purinskih 3’-deoksinukleozida, na primer, kordicepina (3’-deoksiadenozin), koji se prilikom primene deaminuju pomoću ADA i zatim rapidno metabolišu do neaktivnog metabolita, tako da se sasvim spreči, ili da se bar u nekoj meri smanji, potreba da se, kada se purinski 3’-deoksinukleozid koristi u postupku za profilaksu ili lečenje, naročito, mada ne i isključivo, u antikancerskoj hemioterapiji, uključujuči hemoterapiju za lečenje leukemije, limfoma i/ili čvrstih tumora, istovremeno primenjuje neki inhibitor ADA.

[0017] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je 3’-deoksiadenozin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)] fosfat

ili farmaceutski prihvatljiva so, estar, so estra ili solvat njegovog jedinjenja.

[0018] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku su purinski 3’-deoksinukleozidi kod kojih je svaka 3’ pozicija supstituenta na šećernom ostatku nukleozida zauzeta sa H.

[0019] Prema drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je 3’-deoksiadenozin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)] fosfat

[0020] Sledeće izjave se odnose na jedinjenja prema prvom i/ili prema drugom aspektu. Ove izjave su nezavisne i međusobno zamenjive. Drugim rečima, bilo koja karakteristika opisana u bilo kojoj od sledećih izjava može (gde je to hemijski dopušteno) da se kombinuje sa karakteristikama opisanim u jednoj ili više izjava u tekstu koji sledi. Konkretno, tamo gde je u ovoj specifikaciji dat primer ili ilustracija nekog jedinjenja, bilo koje dve tvrdnje ili više njih, od tvrdnji koje slede, a koje opisuju neku karakteristiku tog jedinjenja, na bilo kom nivou uopštenosti, mogu da se kombinuju tako da predstavljaju predmet pronalaska koji se razmatra tako da sačinjava deo opisa ovog pronalaska u ovoj specifikaciji.

[0021] U predmetnoj specifikaciji, izraz „alfa aminokiselina koja se javlja u prirodi" podrazumeva aminokiselinu koja može da ima L ili D stereohemiju, odabranu iz grupe koja se sastoji od glicina, alanina, valina, leucina, izoleucina, fenilalanina, tirozina, triptofana, serina, treonina, lizina, arginina, histidina, asparaginske kiseline, glutaminske kiseline, asparagina, glutamina, cisteina i metionina. U predmetnoj specifikaciji, bočni lanac alfa aminokiselina koje se javljaju u prirodi je, dakle, član izabran iz grupe koja se sastoji od H, CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, - CH(CH3)(CH2CH3), -CH2Ph, -CH2Ph-OH, -CH2SH, -CH2CH2SCH3, -CH2OH, - (CH3)(OH), -CH2CH2CH2CH2NH

3, -CH2CH2CH2NHC(=NH

2)NH2, -CH2C(O)O-, -CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)NH2, -CH2CH2C(O)NH2,

[0022] Jedinjenje prema pronalasku je:

3’-deoksiadenozin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)] fosfat;

i njegove farmaceutski prihvatljive soli, estri, soli estra ili solvati.

[0023] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje prema pronalasku nije: (2S)-izopropil-2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi) fosforil)amino)propanoat.

[0024] Prema trećem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje prema predmetnom pronalasku za upotrebu u vidu medikamenta. Ovo jedinjenje može da se koristi u profilaksi ili lečenju kancera.

[0025] Prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje prema predmetnom pronalasku za upotrebu u profilaksi ili lečenju kancera.

[0026] Prema petom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje prema predmetnom pronalasku za upotrebu u ciljanom dejstvu na matične ćelije kancera prilikom lečenja kancera.

[0027] U vezi sa trećim, četvrtim i petim aspektom predmetnog pronalaska, pojedinačno, primeri izvođenja prema pronalasku uključuju neki kancer izabran od hematoloških i čvrstih tumora. Konkretno, kancer može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od leukemije, multiplog mijeloma, kancera jetre, kancera dojke, kancera glave i vrata, neuroblastoma, tiroidnog karcinoma, kancera kože (uključujući melanom), oralnog karcinoma skvamoznih ćelija, kancera mokraćne bešike, tumora Lejdigovih ćelija, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, kancera pluća (nesitnoćelijski i sitnoćelijski), kancera žučnih puteva, kancera pankreasa, sarkoma, kancera prostate, kancera centralnog nervnog sistema, Juingov sarkoma, holangiokarcinoma i ginekoloških kancera, uključujući kancer jajnika, kancer materice i kancer grlića materice, uključujući epitelni karcinom grlića materice. U poželjnim primerima izvođenja, kancer je leukemija ili limfom, npr. kancer izabran iz grupe koja se sastoji od akutne limfoblastne leukemije, akutne mijelogene leukemije, akutne promijelocitne leukemije, akutne limfocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije, hronične limfocitne leukemije, monoblastne leukemije, leukemije vlasastih ćelija, Hočkinovog limfoma i ne-Hočkinovog limfoma. U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, kancer je akutna limfoblastna leukemija.

[0028] Treći, četvrti i peti aspekt prema pronalasku, svaki pojedinačno, mogu da obuhvataju primere izvođenja za lečenje kancera koji se koriste u kombinaciji sa drugom terapijom kancera. Primeri druge terapije kancera uključuju radioterapiju i/ili drugu hemoterapiju. Bez ograničenja teorijom ili mehanizmima, objavljeno je (npr. Robertson, J. B. et al Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med.1978 34(5): 417-29, Hiraoka, W. et al Radiat. Res. (1988) 114(2):231-9 i Hiraoka, W. et al J. Radiat. Res. (Tokyo) (1990) 31(2): 156-61) da 3’-deoksiadenozin inhibira popravku DNK oštećenja koje je izazvano rendgenskim zracima. U nekim poželjnim primerima izvođenja trećeg, četvrtog i petog aspekta prema predmetnom pronalasku, pojedinačno, jedinjenja prema pronalasku su namenjena upotrebi u, ili se upotrebljavaju u, postupku za lečenje kancera koji uključuje primenu jedinjenja prema predmetnom pronalasku, u kombinaciji sa radioterapijom, kod pacijenta kome je takvo lečenje potrebno.

[0029] U vezi sa trećim, četvrtim i petim aspektom predmetnog pronalaska, pojedinačno, dodatni primeri izvođenja prema pronalasku obuhvataju jedinjenja prema pronalasku koja su namenjena upotrebi u, ili se upotrebljavaju u, postupku za profilaksu ili lečenje mijelodisplastičnog sindroma.

[0030] Bez ograničenja teorijom ili mehanizmom: Tuli et al (supra) objavili su da kordicepin, osim toga što ima anti-tumorsku i apoptotsku aktivnost, takođe pokazuje antioksidativnu, antiinflamatornu, antimalaričnu, antifungalnu, imunomodulatornu, antidijabetičku/hipoglikemijsku aktivnost, aktivnost u obrazovanju steroida i sprečavanju starenja; Vodnala, S. K. et al J. Med. Chem. 2013, 56, 9861-9873 objavili su da i kordicepin i 2-fluorokordicepin pokazuju antiparazitsku aktivnost; Ahn, Y. J. et al J. Agric. Food Chem. 2000 48 (7) 2744-8 objavili su da kordicepin pokazuje antibakterijsku aktivnost i de Julian-Ortiz J. V. et al J. Med. Chem. 1999 42(17) 3308-14 objavili su da kordicepin pokazuje antivirusnu aktivnost; Sugar et al, Antimicrob. Agents. Chemother. 1998 42(6) 1424-7, pokazali su da kordicepin ima antifungalnu aktivnost. U vezi sa trećim, četvrtim i petim aspektom predmetnog pronalaska, pojedinačno, primeri izvođenja prema pronalasku obuhvataju jedinjenja prema pronalasku koja su namenjena upotrebi u, ili se upotrebljavaju u, postupku za profilaksu ili lečenje kod pacijenta sa bolešću ili stanjem za koje je neophodan najmanje jedan tretman izabran iz grupe koja se sastoji od antioksidativne, anti-inflamatorne, antimalarične, antifungalne, imunomodulatorne, antidijabetičke/hipoglikemijske aktivnosti, aktivnosti u obrazovanju steroida, sprečavanju starenja, antiparazitske, antibakterijske i antivirusne aktivnosti.

[0031] U vezi sa trećim, četvrtim i petim aspektom predmetnog pronalaska, pojedinačno, primeri izvođenja prema pronalasku obuhvataju jedinjenja prema predmetnom pronalasku koja su namenjena upotrebi u, ili se upotrebljavaju u, postupku za profilaksu ili lečenje, pri čemu se u postupku ne koristi primena ko-leka koji predstavlja inhibitor adenozin deaminaze. Za razliku od matičnog jedinjenja, kordicepina, koje uobičajeno mora da se ko-primenjuje sa inhibitorom ADA, da bi bilo efikasno, moguće da jedinjenja prema pronalasku ne zahtevaju takvu koprimenu.

[0032] Inhibitor ADA može, međutim, da se koristi, kao ko-lek, ukoliko je to poželjno u vezi sa trećim, četvrtim i petim aspektom predmetnog pronalaska pojedinačno. Pogodan inhibitor ADA za ko-primenu sa jedinjenjem koje predstavlja primer izvođenja prema predmetnom pronalasku je hidroksiurea ili pentastatin.

[0033] Prema šestom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema predmetnom pronalasku u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.

[0034] Ovde je opisan postupak za pripremu farmaceutske kompozicije koji uključuje korak u kome se kombinuje jedinjenje prema predmetnom pronlasku sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.

[0035] Iznenađujuće je nađeno da jedinjenja iz primera izvođenja prema predmetnom pronalasku imaju poboljšanu farmaceutsku aktivnost, naročito poboljšanu antikancersku aktivnost, u poređenju sa purinskim 3’-deoksinukleozidom iz koga su izvedena, naročito kada se koriste u lečenju leukemije, limfoma i/ili čvrstih tumora.

[0036] Poboljšanje aktivnosti je nađeno u odsustvu primene ko-leka koji treba da inhibira adenozin deaminazu, u poređenju sa matičnim purinskim nukleozidom kada se primenjuje u odsustvu ko-leka koji treba da inhibira ADA.

[0037] Predmetni pronalazak, dakle, neočekivano obezbeđuje sredstva da se derivat 3’-deoksiadenozina, ili derivat analoga 3’-deoksiadenozina, upotrebljava kao farmaceutsko sredstvo, naročito kao antikancersko sredstvo, koje ublažava problem deaminacije adenozin deaminazom, pri čemu se potpuno izbegava, ukoliko je to poželjno, upotreba ko-leka koji je inhibitor adenozin deaminaze, uključujući relativno toksični 2-deoksikoformicin.

[0038] Bez ograničenja bilo kojom teorijom, efikasnost, naročito antikancerska efikasnost koju ispoljavaju jedinjenja prema predmetnom pronalasku, pokazuje da se 3’-deoksinukleozidna jedinjenja prema predmetnom pronalasku fosforilišu unutar ćelije do 3’-deoksiadenozin trifosfata, ili do trifosfata 3’-deoksiadenozinskog analoga.

[0039] Nijedna od prethodno navedenih unutarćelijskih aktivnosti jedinjenja prema predmetnom pronalasku nije se mogla unapred predvideti.

[0040] Prethodno navedene prednosti su dodatak poboljšanoj pearmeabilnosti ćelijske membrane za fosforamidatne nukleozide prema predmetnom pronalasku, u poređenju sa matičnim jedinjenjem 3’-deoksiadenozina ili 3’-deoksiadenozinskog analoga, gde se poboljšana pearmeabilnost ćelijske membrane može pripisati fosforamidatnoj strukturi predmetnih jedinjenja. Dalje, ne može se a priori pretpostaviti da je prednost usled povećane propustljivosti ćelijske membrane prisutna za fosforamidat bilo kog nukleozida. Veruje se da su jedinjenja prema predmetnom pronalasku prvi primer fosforamidata 3’-deoksinukleozida koji iskazuje poboljšan antikancerski potencijal u odnosu na svoj matični 3’-deoksinukleozid. Prednost usled povećane propustljivosti ćelijske membrane jedinjenja prema predmetnom pronalasku je, dakle, iznenađujuća.

[0041] Poželjni primeri izvođenja jedinjenja prema predmetnom pronalasku imaju, u kombinaciji, karakteristike koje su prethodno izložene, imajući u vidu primere izvođenja jedinjenja prema pronalasku.

[0042] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalaku za upotrebu u ciljanom delovanju na matične ćelije kancera.

[0043] Prikaz obezbeđuje upotrebu jedinjenja prema pronalasku u proizvodnji medikamenta za ciljano delovanje na matične ćelije kancera.

[0044] Ovaj prikaz obezbeđuje postupak za ciljano delovanje na matične ćelije kancera, pri čemu postupak obuhvata obezbeđivanje populacije matičnih ćelija kancera količinom jedinjenja prema pronalasku, dovoljnom da se takve ćelije kancera targetuju.

[0045] Ciljano delovanje na matične ćelije kancera koje se pominje u predmetnom pronalasku može da se koristi u prevenciji ili lečenju kancera. U takvim primerima izvođenja populacije matičnih ćelija kancera mogu da budu u kanceroznom ili prekanceroznom stanju kod pacijenta kojima je takvo ciljano delovanje potrebno, i postupak može da uključuje primenu terapeutski efikasne količine jedinjenja prema pronalasku kod pacijenta.

[0046] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u vidu antikancerskog medikamenta za matične ćelije kancera. Ova upotreba jedinjenja prema pronalasku može takođe da se koristi u prevenciji ili lečenju kancera.

[0047] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u prevenciji ili lečenju kancera kod pacijenta odabranog za takvo lečenje postupkom koji obuhvata:

testiranje biološkog uzorka reprezentativnog za kancer ili prekancerozno stanje kod pacijenta na prisustvo matičnih ćelija kancera; pri čemu prisustvo matičnih ćelija kancera u biološkom uzorku ukazuje na to da je pacijent pogodan za lečenje jedinjenjem prema pronalasku.

[0048] Prethodno izloženi postupci mogu dodatno da obuhvate korak prevencije ili lečenja kancera ili prekanceroznog stanja upotrebom jedinjenja prema pronalasku.

[0049] U pogodnim primerima izvođenja postupaka prema pronalasku kancer je rekurentni ili nesenzitivni kancer. Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi za lečenje ovakvog rekurentnog ili nesenzitivnog kancera.

[0050] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju nesenzitivnog kancera kod subjekta. Subjekt može da bude čovek. Subjekt može da bude domaća životinja, npr. sisar.

[0051] Pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja prema pronalasku u proizvodnji medikamenta za lečenje rekurentnog ili nesenzitivnog kancera kod subjekta. Subjekt može da bude domaća životinja, npr. sisar.

[0052] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u dozi od između približno 25 mg/m<2>i 4000 mg/m2 nedeljno u najmanje jednom inicijalnom ciklusu lečenja, a zatim za upotrebu u nižoj nedeljnoj dozi u najmanje jednom dodatnom ciklusu lečenja. Kancer može da bude rekurentni ili nesenzitivni kancer.

[0053] Različiti aspekti pronalaska zasnivaju se na saznanju da je jedinjenje prema pronalasku u stanju da smanji broj matičnih ćelija kancera, i može preferencijalno da smanji njihov broj u odnosu na druge tipove ćelija. Ovo saznanje je iznenađujuće u tom smislu što se zna da su matične ćelije kancera otporne na mnoga hemioterapijska sredstva i da prethodno nije bilo indikacija da je bilo jedinjenje prema pronalasku, bilo kordicepin ili 2-fluorokordicepin, matično jedinjenje pro-leka od koga je jedinjenje prema pronalasku izvedeno, u stanju da ciljano deluje na matične ćelija kancera. Dakle, saznanje da jedinjenje prema pronalasku može ciljano da deluje na matične ćelija kancera i tako smanji njihov broj, za koje su pronalazači potvrdili da može da se primenjuje na širok spektar kancera, predstavlja iznenađujući prodor koji omogućava čitav opseg novih terapeutskih primena jedinjenja prema pronalasku.

[0054] Biološke aktivnosti jedinjenja prema pronalasku, koje nisu bile prethodno objavljene, ukazuju na to da su ova jedinjenja u stanju da obezbede tretman za koji je verovatno da će biti efikasan kod pacijenata sa rekurentnim ili nesenzitivnim kancerima. Ova vrsta tretmana, upotrebom jedinjenja prema pronalasku, može da izazove smanjenje veličine tumora i/ili smanjenje klinički relevantnih biomarkera, pri čemu i jedno i drugo može da bude povezano sa povoljnijom prognozom. Osim toga, tretman jedinjenjem prema pronalasku može da pomogne da se smanjenje veličine tumora kod pacijenata sa rekurentnim ili nesenzitivnim kancerom održi. Shodno tome, lečenje jedinjenjem prema pronalasku može da postigne visoku trajnu stopu kontrole bolesti (DCR) kod pacijenata sa rekurentnim ili nesenzitivnim kancerima.

[0055] Bez želje da budu vezani bilo kojom hipotezom, pronalazači veruju da sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluju na matične ćelije kancera doprinosi terapeutskoj koristi od ovih jedinjenja prilikom lečenja rekurentnog ili nesenzitivnog kancera.

[0056] Osim tamo gde kontekst zahteva drugačije, kada se u ovom opisu pominje "upotreba" jedinjenja prema pronalasku u skladu sa pronalaskom, može se smatrati da se to odnosi na bilo koju od medicinskih upotreba jedinjenja prema pronalasku koje su ovde opisane. Slično tome, podrazumeva se da se pominjanje "postupka" prema pronalasku u kome se koristi jedinjenje prema pronalasku odnosi na bilo koji od postupaka prema pronalasku koji su ovde opisani.

[0057] Sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluje na matične ćelije kancera obezbeđuje nove terapije usmerene protiv onih ćelija kancera koje se smatraju najtežim za lečenje, i za koje se smatra da igraju ključnu ulogu u rezistenciji koja ograničava efikasnost mnogih postojećih terapija za kancer. Ova sposobnost takođe obezbeđuje način za ciljano delovanje na ćelije za koje se veruje da su povezane sa razvojem, progresijom, ponovnom pojavom i propagacijom kancera. U skladu sa tim, biće prepoznato da antikancerska aktivnost jedinjenja prema pronalasku u odnosu na matične ćelije kancera donosi prednosi u kontekstu u kome se nove i efikasne terapije već dugo traže.

Kratak opis slika

[0058] Primeri izvođenja prema pronalasku su ovde dodatno opisani u tekstu koji sledi, uz pozivanje na prateće slike, na kojima:

Slika 1. Poređenje LD50vrednosti za Kordicepin, jedinjenje A, 2-F-kordicepin, i uporedna jedinjenja O, P, Q i R. Svi testovi su izvedeni upotrebom KG1a ćelija i podaci su predstavljeni kao srednja vrednost mean (±SD) pet nezavisnih eksperimenata.

Slika 2. Analiza kapaciteta Kordicepina i jedinjenja A da targetuju matične ćelije leukemije (LSC). Prethodno dobijeni podaci (ii) su prikazani u cilju poređenja. Svi podaci su srednje vrednosti (±SD) tri nezavisna eksperimenta.

Slika 3. Analiza kapaciteta 2-F-kordicepina i uporednih jedinjenja O, P, Q i R da targetuju LSC. Svi podaci su srednje vrednosti (±SD) tri nezavisna eksperimenta.

Slika 4. Poređenje kapaciteta 2-F-kordicepina i pojedinačno svakog proTide jedinjenja da ciljano deluju na LSC. Svi podaci su srednje vrednosti (±SD) tri nezavisna eksperimenta.

Detaljan opis

[0059] Kako se ovde koristi, izraz "alkil" odnosi se na negranati ili granati zasićeni monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) ciklični ili aciklični ugljovodonični radikal, koji ima naznačen broj atoma ugljenika (ili gde nije naznačeno, aciklična alkil grupa može da ima 1-20, 1-18, 1-10, 1-6 ili 1-4 atoma ugljenika a ciklična alkil grupa može da ima 3-20, 3-10 ili 3-7 atoma ugljenika), opciono je supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su nezavisno odabrani iz prethodno opisane grupe, što se tiče supstituenata koji mogu da budu prisutni na R1, R2, R3i R4. Kako pokazuju neograničavajući primeri, alkil grupe mogu da uključuju metil, etil, propil, butil, pentil, heksil, oktil, nonil i dodecil.

[0060] Kako se ovde koristi, izraz "alkenil" odnosi se na negranati ili granati nezasićeni monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) aciklični ili ciklični ugljovodonični radikal

1

koji ima jednu ili više C=C dvostrukih veza i naznačen broj atoma ugljenika (ili gde nije naznačeno, aciklična alkenil grupa može da ima 2-20, 2-10, 2-6 ili 2-4 atoma ugljenika a ciklična alkenil grupa može da ima 3-20 ili 5-7 atoma ugljenika), i opciono je supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su nezavisno odabrani iz prethodno opisane grupe, što se tiče supstituenata koji mogu da budu prisutni na R1, R2, R3i R4. Kako pokazuju neograničavajući primeri, alkenil grupe mogu da uključuju vinil, propenil, butenil, pentenil i heksenil.

[0061] Kako se ovde koristi, izraz "alkinil" odnosi se na negranati ili granati nezasićeni monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) aciklični ili ciklični ugljovodonični radikal koji ima jednu ili više C≡C trostrukih veza i naznačen broj atoma ugljenika (ili gde nije naznačeno, aciklična alkinil grupa može da ima 2-20, 2-10, 2-6 ili 2-4 atoma ugljenika a ciklična alkinil grupa može da ima 8-20 atoma ugljenika), i opciono je supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su nezavisno odabrani iz prethodno opisane grupe, što se tiče supstituenata koji mogu da budu prisutni na R1, R2, R3i R4.

[0062] Kako se ovde koristi, izraz "alkoksi" odnosi se grupu alkil-O-, pri čemu je alkil definisan u prethodnom tekstu alkil ostatak može opciono da bude supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta kao što je prethodno opisano za alkil. Vezivanje je preko -O-. Kako pokazuju neograničavajući primeri, alkoksi grupe mogu da uključuju metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, n-butoksi, terc-butoksi, sek-butoksi, n-pentoksi, n-heksoksi i 1,2-dimetilbutoksi.

[0063] Kako se ovde koristi, izraz "ariloksi" odnosi se na grupu aril-O-, gde je aril definisan kao u tekstu koji sledi i gde aril ostatak može da bude opciono supstituisan sa sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su prethodno opisani imajući u vidu grupu Ar. Vezivanje je preko -O-.

[0064] Kako se ovde koristi, izraz "alkoksialkil" odnosi se na alkil grupu koja ima alkoksi supstituent. Vezivanje je preko alkil grupe. Alkil ostatak i alkoksi ostatak su ovde opisani imajući u vidu definicije za alkil i alkoksi, redom. Alkoksi i alkil ostaci mogu da budu supstituisani svaki sa po jednim, dva ili tri supstituenta koji su prethodno opisani imajući u vidu definiciju za alkil.

[0065] Kako se ovde koristi, izraz "arilalkil" odnosi se na alkil grupu koja ima aril supstituent. Vezivanje je preko alkil grupe. Aril ostatak i alkil grupa su ovde definisani uzimajući u obzir definicije za aril i alkil, redom. Aril i alkil ostaci mogu da budu supstituisani svaki sa po jednim, dva ili tri supstituenta koji su prethodno opisani imajući u vidu definicije za supstituente koji mogu da budu prisutni u odnosu na aril i alkil, redom. U poželjnom primeru izvođenja, arilalkil je benzil, što je Ph-CH2-.

[0066] Kako se ovde koristi, izraz "alkoksiaril" odnosi se na aril grupu koja ima alkoksi supstituent. Vezivanje je preko aril grupe. Alkoksi ostatak i aril ostatak su definisani ovde imajući u vidu definicije za alkoksi i aril, redom. Alkoksi i aril ostaci mogu da budu supstituisani svaki sa po jednim, dva ili tri supstituenta pri čemu su supstituenti definisani ovde uzimajući u obzir definicije za one supstituente koji mogu da budu prisutni na alkoksi i aril ostacima, redom.

[0067] Kako se ovde koristi, izraz "cikloalkilaril" odnosi se na aril grupu koja ima ciklični alkil supstitutent. Vezivanje je preko aril grupe. Cikloalkil ostatak i aril ostatak su ovde definisani, uzimajući u obzir definicije za cikloalkil i aril, redom. Cikloalkilni ostatak i arilni ostatak mogu da budu supstituisani svaki sa po jednim, dva ili tri supstituenta kao što je ovde izloženo, uzimajući u obzir definicije za alkil i aril, redom.

[0068] Kako se ovde koristi, izraz "aril" odnosi se na monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) aromatični karbociklični radikal koji ima jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest prstenova i naznačeni broj atoma ugljenika (ili gde nije naznačeno 6 do 30, 6 do 12 ili 6 do 11 atoma ugljenika). Poželjni primer izvođenja ima jedan, dva ili tri prstena. Aril grupa može opciono da bude supstituisana sa jednim, dva, tri, četiri ili pet supstituenata, kao što je prethodno opisano imajući u vidu izborne supstituente koji mogu da budu prisutni na grupi Ar. U poželjnim primerima izvođenja, aril grupa sadrži: aromatični monociklični prsten koji sadrži 6 atoma ugljenika; aromatični spojeni biciklični sistem prstenova koji sadrži 7, 8, 9 ili 10 atoma ugljenika; ili aromatični spojeni triciklični sistem prstenova koji sadrži 10, 11, 12, 13 ili 14 atoma ugljenika. Neograničavajući primeri za aril uključuju fenil i naftil. U poželjnom primeru izvođenja, opcione supstituentske grupe na aril grupi mogu nezavisno da se odaberu od hidroksi, C1-6acil, C1-6aciloksi, nitro, amino, karboksil, cijano, C1-6alkilamino, diC1-6alkilamino, tiol, hloro, bromo, fluoro, jodo, SO3H, SH i SR’, pri čemu se R’ nezavisno bira od istih grupa kao i R1uzimajući u obzir formulu Ia.

[0069] Kako se ovde koristi, izraz "5-30heteroaril" odnosi se na monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) nezasićeni aromatični heterociklični radikal koji ima 5 do 30 članova prstena u obliku jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest spojenih prstenova i, sadržan u bar jednom prstenu, najmanje jedan heteroatom odabran iz grupe koja se sastoji od N, O i S. Poželjni primer izvođenja ima jedan, dva ili tri spojena prstena. Dostupni atomi ugljenika i/ili heteroatomi u sistemu prstenova mogu na prstenu da budu supstituisani sa jednim, dva, tri, četiri ili pet supstituenata, kao što je u prethodnom tekstu izloženo uzimajući u obzir supstituente koji mogu da budu prisutni na grupi Ar. Heteroaril grupe mogu da uključuju aromatični monociklični sistem prstenova koji sadrži šest članova prstena od kojih je najmanje jedan član prstena N, O ili S atom i koji izborno sadrži, dva ili tri dodatna N atoma u prstenu; aromatični monociklični prsten koji ima šest članova od kojih su jedan, dva ili tri člana prstena N atomi; aromatični biciklični sistem spojenih prstenova koji imaju devet članova od kojih je najmanje jedan član prstena N, O ili S atom i koji izborno sadrži jedan, dva ili tri dodatna N atoma u prstenu; ili aromatični biciklični sistem spojenih prstenova koji imaju devet članova, od kojih su jedan, dva ili tri člana prstena N atomi. Primeri uključuju, i nisu ograničeni na, piridil i kinolil.

[0070] Kako se ovde koristi, izraz "5-20heterociklil" odnosi se na monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) zasićeni ili delimično nezasićeni heterociklični radikal koji ima 5 do 20 članova prstena, pri čemu je najmanje jedan član prstena odabran iz grupe koja se sastoji od N, O i S, i koji je u obliku jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest spojenih prstenova. U poželjnom primeru izvođenja, radikal ima jedan, dva ili tri prstena. U poželjnom primeru izvođenja, radikal ima 5 do 10 članova prstena. Heterociklil radikali mogu da uključuju: monociklični sistem prstenova koji imaju pet članova prstena od kojih je najmanje jedan član prstena N, O ili S atom i koji izborno sadrži jedan dodatni O atom u prstenu ili jedan, dva ili tri dodatna N atoma u prstenu; monociklični sistem prstena koji ima šest članova prstena od kojih su jedan, dva ili tri člana prstena N atomi i koji izborno uključuje jedan O atom; biciklični sistem spojenih prstenova koji ima devet članova prstena od kojih je najmanje jedan član prstena N, O ili S atom i koji izborno sadrži jedan, dva ili tri dodatna N atoma u prstenu; ili biciklični sistem spojenih prstenova koji ima deset članova prstena od kojih je najmanje jedan član prstena N atom. Primeri uključuju, i nisu ograničeni na, pirolinil, pirolidinil, 1,3-dioksolanil, imidazolinil, imidazolidinil, pirazolinil, pirazolidinil, piperidinil, morfolinil ili piperazinil.

[0071] Dostupni atomi ugljenika u prstenu i/ili heteroatomi u prstenu "heterociklil" sistema prstenova koji su prethodno opisani, mogu da budu supstituisani sa jednim, dva, tri, četiri ili pet supstituenata. Kada je prsten(prstenovi) supstituisan sa jednim ili više heteroatoma, supstituenti heteroatoma se biraju od halogena (F, Cl, Br i I) i od kiseonika, azota i sumpora, pri čemu kiseonik, azot i sumpor obrazuju ostatka supstituenta. Kada je prsten(prstenovi) supstituisan sa jednim ili više heteroatoma, poželjno postoji 1, 2, 3 ili 4 heteroatomska supstituenta koji su odabrani od grupe koja se sastoji od kiseonika, azota, sumpora i halogena. Primeri supstituentnih grupa koje mogu da budu prisutne na sistemu heterocikličnog prstena, mogu da budu nezavisno odabrane od hidroksi, C1-6acil, C1-6aciloksi, nitro, amino, karboksil, cijano, C1-6alkilamino, diC1-

6alkilamino, tiol, hloro, bromo, fluoro, jodo, SO3H, SH i SR’, pri čemu je R’ nezavisno odabran od istih grupa kao i R1, imajući u vidu formulu Ia.

[0072] Kako se ovde koristi, izraz "acil" odnosi se na negranati ili granati, zasićeni ili nezasićeni, supstituisani ili nesupstituisani, monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) radikal koji uključuje ostatak -C(=O)-, gde je vezivanje ostvareno preko -C- atoma -C(=O)- ostatka, i koji ima naznačen broj atoma ugljenika (ili gde nije naznačeno, acil grupa ima 1-6, ili 1-4 ili 1-2 atoma ugljenika, uključujući C atom -C(=O)- ostatka), izborno supstituisan jednim, dva ili tri supstituenta nezavisno odabrana od grupe izložene u prethodnom tekstu, imajući u vidu supstituente koji mogu da budu prisutni na R1, R2, R3i R4. Kako pokazuju neograničavajući

1

primeri, acil grupe uključuju HC(=O)-, CH3C(=O)-, C2H5C(=O)-, C3H7C(=O)-, C4H9C(=O)- i C5H11C(=O)-.

[0073] Kako se ovde koristi, izraz "aciloksi" odnosi se na negranati ili granati, zasićeni ili nezasićeni, supstituisani ili nesupstituisani, monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) radikal koji uključuje ostatak -C(=O)-O-, gde je vezivanje ostvareno preko -O- atoma, i ima naznačen broj atoma ugljenika, uključujući C atom -C(=O)-O- ostatka (ili gde nije naznačeno, aciloksi grupa ima 1-6, 1-4 ili 1-2 atoma ugljenika, uključujući atom ugljenika -C(=O)-O)-ostatka), izborno supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta koji mogu da budu prisutni na R1, R2, R3i R4. Kako pokazuju neograničavajući primeri, aciloksi grupe uključuju HC(=O)-O-, CH3C(=O)-O-, C2H5C(=O)-O-, C3H7C(=O)-O-, C4H9C(=O)-O- i C5H11C(=O)=O-.

[0074] Kako se ovde koristi, izraz "C2-6estar" odnosi se na supstituisani ili nesupstituisani monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) radikal koji sadrži R18C(=O)-O-R19, gde se R18se bira iz grupe koja se sastoji od H i C1-4alkil i R19se bira iz grupe koja se sastoji od C1-

5alkil, gde je maksimalni ukupni broj C atoma, uključujući C atom -C(=O)-O- ostatka u R18C(=O)-O-R19,šest. Vezivanje je preko R18ili R19, gde jedan H odgovarajuće grupe nedostaje tako da je alkil grupa preko koje se vezivanje odvija, dvovalentna, ili, kada je R18H, preko C iz -C(=O)-O- ostatka. U poželjnom primeru izvođenja, C2-6estar, uključujući C -C(=O)-O ostatka, ima 2-5 atoma ugljenika. C2-6estar izborno može da bude supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su nezavisno odabrani iz prethodno izložene grupe imajući u vidu supstituente koji mogu da budu prisutni na R1, R2, R3i R4. Kao što pokazuje neograničavajući primer, C2-

6estar može da bude -C2H4-C(=O)-O-C2H5, gde je -C2H4- ostatak -CH2-CH2- i vezivanje je preko -C2H4- ostatka.

[0075] Kako se ovde koristi, izraz "aldehid" odnosi se na negranati ili granati, zasićeni ili nezasićeni, supstituisani ili nesupstituisani monovalentni (osim gde kontekst zahteva drugačije) radikal koji sadrži HC(=O)-R20-, gde se vezivanje ostvaruje preko -R20-, ima naznačeni broj antoma ugljenika, uključujući C atom -C(=O)- ostatka (ili ako nije naznačeno, aldehidna grupa ima 1-6, 1-4 ili 1-2 atoma ugljenika, uključujući C atom -C(=O)- ostatka), izborno supstituisan sa jednim, dva ili više supstituenata koji mogu da se nalaze na R1, R2, R3i R4. Kako pokazuju neograničavajući primeri, aldehidne grupe uključuju HC(=O)-CH2-, HC(=O)-C2H4-, HC(=O)-C3H6-, HC(=O)-C4H8- i HC(=O)-C5H10-.

[0076] Kako se ovde koristi, izraz "fluoroalkil" odnosi se na alkil grupu, gde je alkil grupa negranati ili granati, zasićeni monovalnetni (osim gde kontekst zahteva drugačije) aciklični ili ciklični ugljovodonični radikal, koji ima naznačeni broj atoma ugljenika (ili gde nije naznačeno, aciklična alkil grupa ima 1-6 ili 1-4 atoma ugljenika i ciklična alkil grupa ima 3-6 atoma ugljenika) supstituisanih sa 1 do 6 F atoma.

[0077] Kako se ovde koristi, izraz "fluoroalkenil" odnosi se na alkenil grupu, gde je alkenil grupa negranati ili granati nezasićeni monovalnetni (osim gde kontekst zahteva drugačije) aciklični ili ciklični ugljovodonični radikal koji ima jednu ili više C=C dvostrukih veza i ima naznačeni broj atoma ugljenika (ili gde nije naznačeno, aciklična alkenil grupa ima 2-6 ili 2-4 atoma ugljenika i ciklična alkenil grupa ima 4-6 atoma ugljenika) supstituisanih sa 1 do 6 F atoma.

[0078] Postupak za pripremu jedinjenje formule Ia ili Ib poželjno se izvodi u prisustvu pogodnog rastvarača.

[0079] Pogodni rastvarači uključuju ugljovodonične rastvarače kao što su benzen i toluen; rastvarače etarskog tipa kao što su dietil etar, tetrahidrofuran, difenil etar, anizol i dimetoksibenzen; halogenovane ugljovodonične rastvarače kao što su metilen hlorid, hloroform i hlorobenzen; rastvarače ketonskog tipa kao što su aceton, metil etil keton i metil izobutil keton; rastvarače alkoholnog tipa kao što su metanol, etanol, propanol, izopropanol, n-butil alkohol i tercbutil alkohol; rastvarače nitrilnog tipa kao što su acetonitril, propionitril i benzonitril; rastvarače estarskog tipa kao što su etil acetat i butil acetat; rastvarače karbonatnog tipa kao što su etilen karbonat i propilen karbonat; i slično. Ova jedinjenja mogu da se koriste pojedinačno ili se dva ili više njih mogu koristiti u smeši.

[0080] U postupku prema predmetnom pronalasku, poželjno se koristi inertni rastvarač. Izraz "inertni rastvarač" znači rastvarač koji je inertan pod uslovima reakcije koja je u vezi sa njim opisana, uključujući, na primer, benzen, toluen, acetonitril, tetrahidrofuran, dimetilformamid, hloroform, metilen hlorid (ili dihlorometan), dietiletar, etil acetat, aceton, metiletil keton, metanol, etanol, propanol, izopropanol, terc-butanol, dioksan, piridine, i slično. Tetrahidrofuran je naročito poželjan.

[0081] Postupak prema predmetnom pronalasku se poželjno izvodi pod suštinski suvim uslovima.

[0082] Fosforohloridat može da se pripremi od ariloksi fosforohloridata i pogodno zaštićenog derivata aminokiseline. Alternativno, fosfatna hemija može da se koristi sa pogodnim sredstvima za kondenzovanje.

[0083] Poželjno, postupak za pripremu jedinjenja formule Ib može da uključuje korak zaštite slobodne OH grupe, na nukleozidu koji je različit u odnosu na nukleozid za koji treba da se veže fosforamidat. Na primer, izvođenje reakcije 3’-deoksinukleozida sa željenim fosforohloridatom u prisustvu t-BuMgCl omogućava pripremanje 2’-fosforamidata.

[0084] Kako se ovde koristi, izraz "stereoizomer" definiše sva moguća jedinjenja sačinjena od istih atoma, vezanih istim redosledom veza, ali koja imaju različite trodimenzionalne strukturekoje jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da poseduju.

1

[0085] U slučaju kada jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom imaju bar jedan hiralni centar, shodno tome, ona mogu da postoje kao enantiomeri. U slučaju kada jedinjenja poseduju dva ili više hiralnih centara, ona dodatno mogu da postoje i kao dijastereoizomeri. U slučaju kada prilikom postupaka za pripremu jedinjenja prema pronalasku nastaju smeše stereoizomera, ovi izomeri mogu da se razdvoje konvencionalnim tehnikama kao što je preparativna hromatografija. Jedinjenja mogu da se pripreme u stereohemijski mešanom obliku ili individualni enantiomeri mogu da se pripreme standardnim tehnikama koje su poznate stručnjacima u oblasti, na primer, enantiospecifičnom sintezom ili rezolucijom, obrazovanjem dijastereoizomernih parova putem formiranja soli sa optički aktivnom kiselinom, praćenom frakcionom kristalizacijom i regeneracijom slobodne baze. Jedinjenja mogu da se razdvoje i obrazovanjem dijastereoizomernih estara ili amida, nakon koga sledi hromatografsko razdvajanje i uklanjanje hiralnog pomoćnog sredstva. Alternativno, jedinjenja mogu da se razdvoje upotrebom hiralne HPLC kolone. Potrebno je razumeti da su svi ovakvi izomeri i njihove smeše obuhvaćeni obimom predmetnog pronalaska.

[0086] Osim toga, potrebno je uvideti da je fosfatni centar u jedinjenjima prema predmetnom pronalasku hiralan, i da jedinjenja mogu da postoje kao RPi SPdijastereoizomeri. Kompozicija jedinjenja može da bude mešani RPi SPili jedan čist dijastereoizomer. U poželjnom primeru izvođenja, jedinjenje je suštinski čist jedinstven dijastereoizomer, ili RPili SP. Pod "suštinski čist jedinstven dijastereoizomer" misli se na do da se jedinjenje sastoji od 98% ili više bio RPili SPdijastereoizomera. U drugom primeru izvođenja, može da se radi o smeši 1:1 RPprema SPdijastereoizomera. Alternativno, jedinjenje može da sadrži smešu RPi SPdijastereoizomera sa odnosom RPprema SPdijastereoizomera od 1:90 do 90:1, 1:50 do 50:1, 1:20 do 20:1, 1:15 do 15:1, 1:10 do 10:1, 1:9 do 9:1, 1:8 do 8:1, 1:7 do 7:1, 1:6 do 6:1, 1:5 do 5:1, 1:4 do 4:1, 1:3 do 3:1 ili 1:2 do 2:1. U poželjnim primerima izvođenja, jedinjenje prema pronalasku može da sadrži odnos RPprema SPdijastereoizomera od više od 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:50, 1:90, 1:95 ili 1:99 ili obrnuto.

[0087] Izraz "solvat" znači jedinjenje prema pronalasku kako je ovde definisano, pri čemu se molekuli pogodnog rastvarača ugrađuju u kristalnu rešetku. Primenjene doze pogodnog rastvarača se mogu fiziološki tolerisati. Primeri pogodnih rastvarača su etanol, voda i slično. Kada je voda rastvarač, molekul se označava kao hidrat.

[0088] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu takođe da budu prisutna u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Za upotrebu u medicini, soli jedinjenja prema ovom pronalasku odnose se na "farmaceutski prihvatljive soli". Oblici farmaceutski prihvatljivih soli koje je odobrio FDA (Ref. International J. Pharm. 1986, 33, 201-217; J. Pharm. Sci., 1977, Jan, 66 (1)) uključuju farmaceutski prihvatljive kisele/anjonske ili bazne/katjonske soli.

1

[0089] Farmaceutski prihvatljive kisele/anjonske soli uključuju, i nisu ograničene na acetat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bitartarat, bromid, kalcijum edetat, kamsilat, karbonat, hlorid, citrat, dihidrohlorid, edetat, edisilat, estolat, esilat, fumarat, gliceptat, glukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksilrezorcinat, hidrabamin, hidrobromid, hidrohlorid, hidroksinaftoat, jodid, izetionat, laktat, maleat, mandelat, mezilat, metilbromid, metilnitrat, metilsulfat, galaktarat, napsilat, nitrat, pamoat, pantotenat, fosfat, difosfat, poligalakturonat, salicilat, stearat, subacetat, sukcinat, sulfat, tanat, tartrat, teoklat, tozilat i trietjodid.

[0090] Farmaceutski prihvatljive bazne/katjonske soli uključuju, i nisu ograničene na, aluminijum, benzatin, kalcijum, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilenediamin, litijum, magnezijum, kalijum, prokain, natrijum i cink.

[0091] Farmaceutski prihvatljivi derivati estara kod kojih su jedna ili više slobodnih hidroksi grupa esterifikovane u oblik farmaceutski prihvatljivih estara su konkretni primeri estara koji mogu da se prevedu solvolizom pod fiziološkim uslovima u jedinjenja prema predmetnom pronalasku koja imaju slobodne hidroksi grupe.

[0092] Farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da se formulišu na uobičajeni način upotrebom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača koji obuhvataju ekscipijense i pomoćne supstance koje olakšavaju obradu aktivnih jedinjenja u preparacije koje mogu da se upotrebljavaju farmaceutski. Ove farmaceutske kompozicije mogu da se proizvode na mačin koji je sam po sebi poznat, npr., putem uobičajenih postupaka mešanja, rastvaranja, granulisanja, pravljenja dražeja, levigating, emulzifikacije, inkapsuliranja, hvatanje ili liofilizacije. Pravilna formulacija zavisi od odabranog puta primene.

[0093] Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku kože da se primeni kod pacijenta, koji može da bude homo sapiens ili životinja, bilo kojim pogodnim sredstvima.

[0094] Medikamenti primenjeni u predmetnom pronalasku mogu da se primenjuju oralnim ili parenteralnim putevima, uključujući intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu, potkožnu, transdermalnu primenu, primenu preko disajnih puteva (aerosolom), rektalnu, vaginalnu i topikalnu (bukalnu i sublingvalnu) primenu.

[0095] Za oralnu primenu, jedinjenja prema pronalasku će u principu biti obezbeđena u obliku tableta ili kapsula, kao prah ili granule, ili kao vodeni rastvor ili suspenzija.

[0096] Tablete za oralnu upotrebu mogu da uključuju aktivne sastojke pomešane sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su inertni razblaživači, sredstva za raspadanje, sredstva za vezivanje, sredstva za davanje vlažnosti, zaslađivači, sredstva za davanje ukusa, sredstva za bojenje i konzervansi. Pogodni inertni diluensi uključuju natrijum i kalcijum karbonat, natrijum i kalcijum fosfat, i laktozu, dok su kukuruzni skrob i alginična kiselina pogodna sredstva za

1

raspadanje. Sredstva za vezivanje mogu da uključuju skrob i želatin, dok će sredstvo za davanje vlažnosti, ukoliko je prisutno u principu biti magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Po želji, tablete mogu da budu obložene materijalom kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat, kako bi se odložila apsorpcija u gastrointestinalnom traktu.

[0097] Kapsule za oralnu upotrebu uključuju tvrde želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa čvrstim razblaživačem, i želatinske kapsule kod kojih je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljem kao što je ulje kikirikija, tečni parafin ili maslinovo ulje.

[0098] Formulacije za rektalnu primenu mogu da budu predstavljene supozitorijama sa pogodnom osnovom koja sadrži, na primer, kakao puter ili salicilat.

[0099] Formulacije pogodne za vaginalnu primenu mogu da budu predstavljene vaginaletama, tamponima, kremama, gelovima, pastama, penama ili formulacijama u vidu spreja, koje uz aktivni sastojak, kao dodatak sadrže nosače za koje se u tehnici zna da su odgovarajući.

[0100] Za intramuskularnu, intraperitonealnu, potkožnu i intravensku upotrebu, jedinjenja prema pronalasku će u principu biti obezbeđena u sterilnim vodenim rastvorima ili suspenzijama, puferovanim na odgovarajući pH i izotoničnost. Pogodna vodeni rastvarači uključuju Ringerov rastvor i izotonični natrijum hlorid. Vodene suspenzije prema pronalasku mogu da uključuju sredstva za suspendovanje kao što su derivati celuloze, natrijum alginat, polivinil-pirolidon i tragakant guma, i sredstvo za davanje vlažnosti kao što je lecitin. Pogodni konzervansi za vodene suspenzije uključuju etil i n-propil p-hidroksibenzoat.

[0101] Jedinjenja prema pronalasku mogu takođe da budu predstavljena u vidu formulacija sa lipozomima.

[0102] U principu, pogodna doza će biti u opsegu od 0.1 do 300 mg po kilogramu telesne težine recipijenta, na dan. Pogodnija doza može da bude u opsegu od 0,5 mg do 150 mg po kilogramu telesne težine recipijenta, na dan, u opsegu od 0,5 do 100 mg po kilogramu telesne težine recipijenta, na dan, u opsegu od 1 do 50 mg po kilogramu telesne težine recipijenta, na dan, ili u opsegu od 1 do 10 mg po kilogramu telesne težine recipijenta, na dan. Pogodna niža doza može da bude 0,5 mg po kilogramu telesne težine recipijenta, na dan, ili 1 mg po kilogramu telesne težine recipijenta, na dan. Alternativno, pogodna doza može da bude u opsegu od 1 do 100 mg po m2 površine tela recipijenta, na dan, ili 5 do 50 mg po m<2>površine tela recipijenta, na dan. Pogodne doze mogu da budu 6, 12, 24 ili 48 mg po m2 površine tela recipijenta, na dan. Poželjna doza može da bude predstavljena i primenjena kao pojedinačna dnevna doza ili kao dve, tri, četiri, pet ili šest ili više pod-doza primenjenih u odgovarajućim intervalima tokom dana. Doze mogu da se primenjuju u obliku jediničnih doza koje, na primer, sadrže 10 do 1500 mg, proželjno 20 do 1000 mg, i najpoželjnije 50 do 700 mg aktivnog sastojka po obliku jedinične

1

doze. Ukupna dnevna doza je pogodno 1000 do 3000 mg, bilo da se uzima kao pojedinačna doza ili u vidu pod-doza u intervalima tokom dana.

"Matične ćelije kancera"

[0103] Matične ćelije kancera, koje se ponekad inače nazivaju i "inicirajuće ćelije tumora", dobro su poznate stručnjacima u oblasti. Kako se ovde koristi, izraz "matične ćelije kancera" potrebno je tumačiti u skladu sa njegovim široko prihvaćenim značenjem, koje predstavlja ćeliju koja ima kapacitet za samoobnavljanje putem asimetrične deobe, tako da inicira stvaranje tumora, i da diferencijacijom obrazuje potomstvo zrelijih ne-matičnih ćelija kancera.

[0104] Matične ćelije kancera igraju značajnu ulogu u razvoju, napredovanju ponovnoj pojavi i propagaciji kancera. U skladu sa tim, nalaz da su jedinjenja prema pronalasku u stanju da ciljano deluju na matične ćelije kancera, i time smanje njihov broj, nudi terapeutske mogućnosti za pevenciju ili lečenje ovih aktivnosti.

[0105] Kao što se na drugim mestima u ovoj specifikaciji detaljnije razmatra, matične ćelije kancera su nađene u prekanceroznim stanjima, gde, kako se veruje, njihovo prisustvo doprinosi razvoju takvih stanja u kancer. U skladu s tim, postupci za lečenje i medicinske upotrebe prema pronalasku, u kojima se jedinjenje prema pronalasku koristi za ciljano delovanje na matične ćelije kancera, mogu da se koriste kako bi se smanjio broj matičnih ćelija kancera u prekanceroznim stanjima (kao što je mijelodiplastični sindrom ili druga stanja koja se razmatraju na drugim mestima u ovoj specifikaciji), i time, da spreče progresiju ovakvih prekanceroznih stanja u kancer.

[0106] Kao što se prethodno pominje, asimetrična ćelijska deoba matičnih ćelija kancera daje diferencirane ne-matične ćelije kancera. Dakle, matične ćelije kancera su odgovorne za obrazovanje i održavanje glavne mase tumora.

[0107] Nagomilavanje ovakvih ne-matičnih ćelija kancera igra glavnu ulogu u progresiji kancera. Ciljano delovanje na matične ćelije kancera jedinjenjem prema pronalasku u mogućnosti je da smanji broj matičnih ćelija kancera, što sa svoje strane smanjuje broj potomačkih ne-matičnih ćelija kancera. Dakle, postupci za lečenje i medicinske upotrebe jedinjenja prema pronalasku u skladu sa predmetnim pronalaskom predstavljaju prednost u lečenju kancera tako što sprečavaju progresiju kancera. Ovakvi primeri izvođenja su podrobnije opisani na drugim mestima u ovoj specifikaciji.

[0108] Matične ćelije kancera su takođe u mogućnosti da deluju kao rezervoar ćelija kancera koje mogu da izazovu recidiv kancera nakon remisije. Čak i u slučaju da je većina ćelija kancera kod pacijenta uklonjena (na primer hirurški, radioterapijom, ili hemoterapijom, pojedinačno ili u kombinaciji), tako da nisu preostali nikakvi vidljivi znaci kancera, nastavak prisustva matičnih ćelija kancera može da da nukleus za recidiv kancera tokom vremena. Ciljano delovanje na

1

matične ćelije kancera jedinjenjem prema pronalasku obezbeđuje novi način na koji broj matičnih ćelija kancera može da se smanji i da se matične ćelije kancera ubiju. Shodno tome, i kao što je podrobnije razmatrano na drugim mestima u ovoj specifikaciji, u pogodnim primerima izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje postupak i medicinske upotrebe pri kojima jedinjenje prema pronalasku sprečava i odlaže recidiv kancera.

[0109] Osim toga, premeštanje matičnih ćelija kancera od mesta gde se kancer nalazi, do druge lokacije u telu može da doprinese propagaciji kancera, na primer, izazivajući metastaze. Usled toga, sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluje na matične ćelije kancera obezbeđuje, dakle, nove postupke za lečenje i medicinske upotrebe u preenciji ili lečenju propagacije kancera.

[0110] Osim po svojim biološkim aktivnostima, matične ćelije kancera mogu da se identifikuju i po eksprimiranju određenih karakterističnih markera na površini ćelije. Matične ćelije kancera koje se obično identifikuju kod hematoloških malignih bolesti su obično CD34<+>, dok su kod čvrstih tumora kao markeri matičnih ćelija kancera identifikovani CD44<+>, CD133<+>i CD90<+>. Sledeća tabela daje pregled primera za poznate fenotipove površine ćelija. Očekivano je da na svaki od ovih oblika matičnih ćelija kancera može ciljano da se deluje upotrebom jedinjenja prema pronalasku u skladu sa pronalaskom, tako da postupci ili upotrebe u kojima se koristi jedinjenje prema pronalasku mogu da se koriste u prevenciji ili lečenju vrsta kancera koje su povezane sa ekspresijom bilo kog od ovih setova markera na matičnim ćelijam kancera.

2

[0111] Podaci predstavljeni u primerima pokazuju da je jedinjenje prema pronalasku u stanju da ciljano deluje na matične ćelije kancera kod ćelijskih linija matičnih ćelija leukemije, specifično na matične ćelije kancera prisutne u ćelijskoj liniji mijeloidne leukemije KG1a. Ova ćelijska linija ispoljava manji odeljak nalik na matične ćelije, sa posebnim imunofenotipom (Lin-/CD34+/CD38- /CD123+), na koji ciljano deluje jedinjenje prema pronalasku. U skladu sa tim, postupci za lečenje ili medicinske upotrebe jedinjenja prema pronalasku u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da se koriste za prevenciju ili lečenje leukemije ili drugih kancera povezanih sa matičnim ćelijama kancera koje eksprimiraju ove karakteristične markere.

[0112] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke i medicinske upotrebe gde se pacijenti odabiraju za prevenciju ili lečenje kancera, upotrebom jedinjenja prema pronalasku, na osnovu identifikacije prisustva matičnih ćelija kancera u biološkom uzorku koji je reprezentativan za kancer ili prekancerozno stanje kod pacijenta. Prethodno izloženi markeri obezbeđuju pogodne primere koji mogu da se koriste za identifikaciju prisustva matičnih ćelija kancera u skladu sa tim primerima izvođenja prema pronalasku. Pogodne tehnike pomoću kojih ekspresija ovih markera može da se ispituje u biološkom uzorku razmatraju se dodatno na drugim mestima u ovoj specifikaciji.

"Ciljano delovanje na matične ćelije kancera"

[0113] Predmetni pronalazak obezbeđuje prvi pokazatelj da jedinjenja prema pronalasku mogu da se koriste za ciljano delovanje na matične ćelije kancera. Sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluju na matične ćelije kancera ilustrovano je u primerima opisanim u ovoj specifikaciji.

[0114] Može se uočiti da, kada se jedinjenje prema pronalasku obezbedi populacijama ćelija kancera koje sadrže matične ćelije kancera, ono ciljano deluje na prisutne matične ćelije kancera, što dovodi do smanjenja ukupnog broja ćelija kancera. Kao što se na drugim mestima u predmetnoj specifikaciji razmatra, izvesna jedinjenja prema pronalasku preferencijalno targetuju matične ćelije kancera u odnosu na ćelije tumorske mase, i aktivnost takvih jedinjenja može ne samo da smanji ukupan broj prisutnih ćelija kancera, nego takođe da smanji i udeo ukupnog broja ćelija kancera koje ispoljavaju fenotipske markere matičnih ćelija kancera.

[0115] Veruje se da jedinjenja prema predmetnom pronalasku ulaze u ćelije kancera i ugrađuju se u nukleinske kiseline (RNK i/ili DNK) u ćelijama. Bez ograničenja bilo kojom teorijom, veruje se da efikasnost, naročito antikancerska efikasnost, koju ispoljavaju jedinjenja prema predmetnom pronalasku, pokazuje da se jedinjenja prema predmetnom pronalasku fosforilišu do trifosfata kordicepina ili derivata kordicepina (npr. 2-fluorokordicepin ili 2-Cl-kordicepin) i veruje se da se enzimska razgradnja u ćeliji prevodi jedinjenje prema pronalasku direktno u 8-hloroadenozin monofosfat pre fosforilacije do trifosfata.

[0116] Takođe se veruje da jedinjenja prema pronalasku poseduju povećanu sposobnost prolaska kroz ćelijsku membranu (u poređenju sa kordicepinom), i da ovo doprinosi poboljšanoj antikancerskom potencijalu jedinjenja prema pronalasku u poređenju sa matičnim jedinjenjem od koga su izvedena.

[0117] Bez želje da budu ograničeni bilo kojom hipotezom, pronalazači veruju da smanjenje broja matičnih ćelija kancera nastaje kao rezultat ciljanog ubijanja matičnih ćelija kancera u populaciji ćelija kancera. Dakle, jedinjenja prema pronalasku u stanju su da izazovu smrt matičnih ćelija kancera. Osim toga, rezultati izloženi na drugim mestima u ovoj specifikaciji ilustruju da izvesna jedinjenja prema pronalasku izgleda da ubijaju matične ćelije kancera preferencijalno u poređenju sa ubijanjem ne-matičnih ćelija kancera, čime dovode ne samo do smrti matičnih ćelija kancera, ali takođe i smanjenje udela matičnih ćelija kancera uukupnoj populaciji ćelija kancera.

[0118] Premda pronalazači veruju da jedinjenja prema pronalasku koja preferencijalno deluju ciljano na matične ćelije kancera preferencijalno ubijaju matične ćelije kancera u poređenju sa ne-matičnim ćelijama kancera, moguće je i da su drugi mehanizmi doprineli smanjenju udela matičnih ćelija kancera do koga dolazi kada se jedinjenjem prema pronalasku ciljano deluje na ove ćelije.

[0119] Samo kao primer, tretman jedinjenjem prema pronalasku može da dovede do povećanja diferencijacije matičnih ćelija kancera, smanjujući time broj matičnih ćelija kancera a takođe i udeo ukupnog broja ćelija kancera koji je predstavljen matičnim ćelijama kancera. Alternativno, jedinjenje prema pronalasku može da dovede do gubitka fenotipa matične ćelije kod matičnih ćelija kancera, na primer, do gubitka njihove sposobnosti da se samoobnavljaju, smanjujući time broj matičnih ćelija kancera.

[0120] Reference na ciljano delovanje na matične ćelije kancera u predmetnom prikazu trebalo bi tumačiti na odgovarajući način. Za potrebe predmetnog prikaza, "ciljano delovanje" na matične ćelije kancera može da se razume tako da obuhvata bilo koji mehanizam putem koga jedinjenje prema pronalasku smanjuje broj matičnih ćelija kancera prisutnih u populaciji ćelija, bilo in vitro ili in vivo. Naročito, ciljano delovanje na matične ćelije kancera može da se razume tako da obuhvata preferencijalno smanjenje broja matičnih ćelija kancera u poređenju sa drugim tipovima ćelija, naročito u poređenju sa ne-matičnim ćelijama kancera. Reference na ciljano delovanje u ovoj specifikaciji mogu da se razumeju tako da uključuju ubijanje, i, po potrebi, preferencijalno ubijanje matičnih ćelija kancera u poređenju sa ne-matičnim ćelijama kancera. "Prevencija ili lečenje kancera"

[0121] Pronalazak obezbeđuje medicinske upotrebe i postupke za lečenje u kojima se jedinjenje prema pronalasku koristi za prevenciju ili lečenje kancera. U kontekstu predmetnog pronalaska, "prevencija" kancera treba da se posmatra tako da se odnosi na profilaktičke primene jedinjenja prema pronalasku kada se koristi pre razvoja kancera, i sa ciljem da se razvoj kancera spreči. Sa druge strane, pod "lečenje" kancera se podrazumeva da se radi o upotrebi jedinjenja prema pronalasku nakon što se kancer pojavio, sa ciljem da se kancer ublaži usporavanjem ili zaustavljanjem proliferacije ćelija kancera i rasta tumora. U povoljnom slučaju, lečenje kancera može da dovede do delimičnog ili potpunog smanjenja broja ćelija kancera i veličine tumora. Efikasno lečenje kancera može da dovede do bolesti koja je ili "stabilizovana" ili "responsivna" u skladu sa RECIST (Kriterijumi za evaluaciju odgovora kod čvrstih tumora) smernicama.

[0122] Kao što je u daljem tekstu sa više pojedinosti opisano, prevencija kancera u skladu sa predmetnim pronalaskom može da bude naročito od koristi kod pacijenata koji imaju prekancerozno stanje koje kod njih povećava verovatnoću da razviju kancer.

"Prevencija kancera"

[0123] Prevencija kancera u skladu sa predmetnim pronalaskom može da se sprovede lečenjem prekanceroznog stanja koristeći jedinjenje prema pronalasku u skladu sa različitim aspektima ili primerima izvođenja prema pronalasku koji su ovde opisani.

[0124] Konkretno, prevencija kancera, u kontekstu predmetnog pronalaska, može da se postigne postupcima ili medicinskim upotrebama pronalaska, u kojima se jedinjenje prema pronalasku obezbeđuje pacijentu sa prekanceroznim stanjem. Postupci lečenja ili medicinske upotrebe u skladu sa ovim primerom izvođenja mogu da spreče razvoj lečenog prekanceroznog stanja u kancer, obezbeđujući time efikasnu prevencija kancera.

[0125] Reference na prevenciju kancera u kontekstu predmetnog pronalaska mogu takođe da obuhvataju druge profilaktičke primene jedinjenja prema pronalasku. Na primer, sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluje na matične ćelije kancera i time sprečava razvoj kancera, i/ili sprečava napredovanje kancera, i/ili sprečava recidiv kancera, i/ili sprečava propagaciju kancera.

"Prekancerozna stanja "

[0126] Kanceru često prethodi razvoj prekanceroznog stanja, koje samo po sebi nije kancerozno, ali je povezano sa povećanim rizikom od dobijanja kancera. Nagomilavanje genetskih ili epigenetskih promena može da dovede do toga da prethodno normalne ćelije razviju fenotip

2

matičnih ćelija kancera. Shodno tome, matične ćelije kancera mogu takođe da budu prisutne u takvim prekanceroznim stanjima, kao i u kanceroznim stanjima.

[0127] Veruje se da prisustvo matičnih ćelije kancera u prekanceroznim stanjima doprinosi razvoju ovih stanja u kancer. Postupci i medicinske upotrebe pronalaska mogu da se upotrebe za ciljano delovanje na matične ćelije kancera prisutne u prekanceroznim stanjima, i time za lečenje tih stanja. Biće uzeto u obzir da novo i neočekivano saznanje da jedinjenja prema pronalasku ciljano deluju na matične ćelije kancera znači da lečenje prekanceroznih stanja ovim jedinjenjima može da se koristi da se spreči da se lečena stanja razviju u kancer. Ovo predstavlja način na koji jedinjenje prema pronalasku može da se koristi medicinski u prevenciji kancera, što je razmatrano na drugim mestima u ovoj specifikaciji.

[0128] Primeri prekanceroznih stanja koja mogu da se leče u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, stanja izabrana iz grupe koja se sastoji od: aktinske keratoze, Baretovog jednjaka, atrofičnog gastritisa, kongenitalne diskeratoze, sideropenične disfagije, Lihenovog planusa, oralne submukozne fibroze, solarne elastoze, cervikalne displazije, leukoplakije, eritroplakije, monoklonalne gamopatije nepoznatog značaja (MGUS), monoklonalne B-ćelijske limfocitoze (MBL), mijelodisplastičnog sindroma, kao i prekanceroznih stanja želuca kao što su atrofični gastritis, želudačni čir, perniciozna anemija, želudačni patrljci, želudačni polipi, i Menetrijerova bolest. Među nabrojanim prekanceroznim stanjima želuca, atrofični gastritis, perniciozna anemija, želudačni patrljci, i izvesne vrste želudačnih polipa mogu da imaju naročito povišen rizik da se razviju u kancer.

[0129] Prekancerozna stanja često imaju oblik lezija koje sadrže displastične i hiperplastične ćelije. Shodno tome, prisustvo displazije ili hiperplazije, kao alternativa ili dodatak prisustvu ćelija sa eksprimiranim markerima ili fenotipivima karakterističnim za matične ćelije kancera, mogu da se koriste u identifikaciji prekanceroznih stanja.

[0130] Ozbiljnost displazije može da varira kod različitih prekanceroznih stanja ili sa razvojem jednog prekanceroznog stanja tokom vremena. U principu, što je displazija povezana sa kanceroznim stanjem više uznapredovala, to je verovatnije da će se prekancerozno stanje razviti u kancer. Displazija se uobičajeno klasifikuje kao blaga, umerena ili ozbiljna. Ozbiljna displazija obično se razvija u kancer ukoliko se ne leči. Prikladno, postupci lečenja ili medicinske upotrebe u kojima se koristi jedinjenje prema pronalasku, mogu, dakle, da se koriste za lečenje pacijenta sa prekanceroznim stanjem koje je povezano sa ozbiljnom displazijom.

[0131] U pogodnom primeru izvođenja prema pronalasku, jedinjenje prema pronalasku koristi se za lečenje pacijentkinje sa ozbiljnom cervikalnom displazijom. Ozbiljna cervikalna displazija može da se dijagnostifikuje pomoću razmaza. U drugom primeru izvođenja prema pronalasku, jedinjenje prema pronalasku se koristi za lečenje displazije jednjaka ("Baretov jednjak"). Ozbiljna displazija jednjaka može da se dijagnostifikuje nakon biopsije tkiva.

[0132] Nedavno je objavljeno da stanja koja prethode malignim bolestima mogu takođe da se identifikuju putem detekcije somatskih mutacija u ćelijama kod pojedinaca za koje se ne zna da imaju kancer. Konkretno, bilo je objavljeno da je klonalna hematopojeza u vezi sa starenjem uobičajeno premaligno stanje koje je povezano sa povećanim ukupnim mortalitetom i povećanim rizikom od kardiometaboličkih bolesti. Većina mutacija koje su detektovane u krvnim ćelijama, javljaju se u tri gena: DNMT3A, TET2 i ASXL1. U skladu sa tim, pacijenti koji bi imali koristi od upotrebe jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluje na matične ćelije kancera, i time leči prekancerozno stanje, mogu da se identifikuju testiranjem uzorka koji sadrži krvne ćelije na prisustvo genetskih mutacija koje ukazuju na prekancerozno stanje, u najmanje jednom od gena: DNMT3A i/ili TET2 i/ili ASXL1.

[0133] Prekancerozna stanja za koja može biti korisno lečenje jedinjenjem prema pronalasku, u skladu sa pronalaskom, putem ciljanog delovanja na matične ćelije kancera, može da se identifikuje određivanjem prisustva matičnih ćelija kancera imajući u vidu tehnike koje se zasnivaju na ekspresiji markera karakterističnih za matične ćelije kancera, ili fenotipova matičnih ćelija kancera, što se razmatra na drugim mestima u ovoj specifikaciji.

"Lečenje kancera"

[0134] Stručnjak u oblasti uzeće u obzir da postoje mnoga merenja kojima se "lečenje" kancera može oceniti. Samo kao primer, može se smatrati da bilo koje smanjenje ili prevencija razvoja kancera, progresije kancera, recidiva kancera, ili propagacije kancera ukazuje na efikasno lečenje kancera.

[0135] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi: da bi se smanjio udeo matičnih ćelija kancera u populaciji ćelija kancera; i/ili da se inhibira rast tumora; i/ili da se smanji tumorigenost; i/ili da se spreči ili leči primarni kancer; i/ili da se spreči ili leči rekurentni kancer; i/ili da se spreči ili leči metastatski ili sekundarni kancer; i/ili da se leče, spreče ili inhibiraju metastaze ili recidiv; i/ili da se leči ili spreči nesenzitivni kancer.

[0136] Sposobnost lečenja kancera uporebom jedinjenja prema pronalasku da izazove smanjenje veličine tumora, i takođe da održi smanjenje veličine tumora tokom/nakon perioda u kome se lečenje sprovodi, prestavlja naročito značajnu indikaciju efikasnog lečenja kancera. Kao što je u primerima izloženo, lečenja ili medicinske upotrebe prema pronalasku pokazale su se iznenađujuće efikasnim u ovom smislu, čak i kod modela gde se koriste ćelije koje su reprezentativne za recidive ili nesenzitivni kancer, koji je prethodno bio rezistentan na lečenje drugim terapijama.

2

[0137] Podaci predstavljeni u primerima ilustruju da lečenje jedinjenjem prema pronalasku smanjuje udeo matičnih ćelija kancera u populaciji ćelija kancera. Karakteristične biološke aktivnosti ili markeri ćelijske površine pomoću kojih matične ćelije kancera mogu da se identifikuju, opisani su na drugim mestima u ovoj specifikaciji. U pogodnom primeru izvođenja, lečenje kancera u skladu sa predmetnim pronalaskom može da dovede do smanjenja udela matičnih ćelija kancera koje su prisutne kod kancera pacijenta od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, ili najmanje 40%. U pogodnim primerima izvođenja, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja udela matičnih ćelija kancera koje su prisutne kod kancera pacijenta od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, ili najmanje 80%. Lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja udela matičnih ćelija kancera koje su prisutne kod kancera pacijenta od najmanje 85%, najmanje 90%, ili najmanje 95%. Zapravo, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja udela matičnih ćelija kancera koje su prisutne kod kancera pacijenta od najmanje najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100% (tako da matične ćelije kancera praktično uopšte ne preostaju).

[0138] Asimetrična deoba matičnih ćelija kancera doprinosi rastu tumora. Lečenje kancera jedinjenjem prema pronalasku u skladu sa predmetnim pronalaskom može da dovede do inhibicije rasta tumora od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, ili najmanje 40%. Pogodno, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do inhibicije rasta tumora od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, ili najmanje 80%. Lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do inhibicije rasta tumora od najmanje 85%, najmanje 90%, ili najmanje 95% kod pacijenta koji se tako leči. Zapravo, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do inhibicije rasta tumora od najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili od čak 100% kod lečenog kancera.

[0139] Rast tumora može da se procenjuje bilo kojim pogodnim postupkom pri kome se promena veličine tumora procenjuje tokom vremena. Pogodno, veličina tumora pre lečenja kancera može da se poredi sa veličinom istog tumora tokom ili nakon lečenja kancera. Poznat je izvestan broj načina na koji se veličina tumora može proceniti. Na primer, veličina tumora može da se proceni vizualizacijom in situ u pacijentu. Pogodne tehnike, kao što su tehnike vizualizacije, mogu da omoguće da se odredi zapremina tumora i da se procene promene zapremine tumora.

[0140] Kao što je prikazano u rezultatima izloženim u primerima u ovoj specifikaciji, postupci za lečenje i medicinske upotrebe jedinjenja prema pronalasku ne samo da mogu da zaustave rast tumora, već zapravo mogu i da izazovu smanjenje zapremine tumora kod pacijenata sa kancerom, uključujući pacijente sa recidivima ili nesenzitivnim kancerom. Pogodno, lečenje

2

kancera u skladu sa predmetnim pronalaskom može da dovede do smanjenja zapremine tumora od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, ili najmanje 40%. U pogodnim primerima izvođenja, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja zapremine tumora od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, ili najmanje 80%. Lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja zapremine tumora od najmanje 85%, najmanje 90%, ili najmanje 95%. Zapravo, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja zapremine tumora od najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100%.

[0141] Prethodno opisana vrsta smanjenja zapremine tumora može da se izračuna u odnosu na pogodnu kontrolu. Na primer, u studijama koje su sprovedene in vitro, ili in vivo u pogodnim životinjskim modelima, smanjenje zapremine tumora može da se odredi direktnim poređenjem između zapremine tumora koji je tretiran jedinjenjem prema pronalasku i zapremine kontrolnog tumora (koji može da bude nelečen ili lečen na neki drugi način, a ne jedinjenjem prema pronalasku). Potrebno je imati u vidu da ovakvi modeli, gde se zahteva odsustvo lečenja tumora, mogu da budu etički neprihvatljivi u kontekstu kliničkih ispitivanja ili odlučivanja o toku lečenja kod pacijenata, i u tom slučaju, smanjenje zapremine tumora može da se procenjuje poređenjem zapremine lečenog tumora i istog tog tumora pre lečenja, ili sa predviđenom zapreminom koju bi tumor dostigao da nikakav tretman nije bio primenjen.

[0142] Postupci lečenja i medicinske upotrebe jedinjenja prema pronalasku mogu da dovedu do smanjenja biomarkera koji ukazuju na kancer. Smanjenje ovih biomarkera obezbeđuje dodatnu procenu kojom se može pokazati efikasno lečenje kancera. Pogodni primeri ovih biomarkera mogu da se odaberu na osnovu toga koju je vrstu kancera potrebno lečiti: u slučaju ginekoloških kancera CA125 predstavlja pogodan primer biomarkera,dok u slučaju kancera pankreasa ili žučnih puteva CA19.9 predstavlja pogodan primer biomarkera, a u slučaju kolorektalnih kancera CEA može da bude pogodan biomarker.

[0143] Pogodno, lečenje kancera u skladu sa predmetnim pronalaskom može da dovede do smanjenja biomarkera kancera od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, ili najmanje 40%. U pogodnim primerima izvođenja, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja biomarkera kancera od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, ili najmanje 80%. Lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja biomarkera kancera od najmanje 85%, najmanje 90%, ili najmanje 95%. Zapravo, lečenje kancera u skladu sa pronalaskom može da dovede do smanjenja biomarkera kancera od najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100%.

[0144] Korisna dejstva, kao što je smanjenje udela matičnih ćelija kancera koje su prisutne, smanjenje rasta tumora, ili smanjenje zapremine tumora ili biomarkera za kancer, uočeno

2

prilikom lečenja kancera u skladu sa predmetnim pronalaskom, mogu da se održavaju tokom najmanje jednog meseca. Pogodno, ova korisna dejstva mogu da se održavaju tokom najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, ili najmanje šest meseci. Zapravo, ova korisna dejstva mogu da se održavaju tokom najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, ili najmanje 24 meseca. Pogodno, korisna dejstva mogu da se održavaju tokom najmanje tri godine, najmanje četiri godine, najmanje pet godina, najmanje šest godina, najmanje sedam godina, najmanje osam godina, najmanje devet godina, ili tokom deset ili više godina.

[0145] U pogodnom primeru izvođenja pronalaska, jedinjenje prema pronalasku se koristi u postupku za prevenciju ili lečenje kancera ili premalignog stanja, ciljanim delovanjem na matične ćelije kancera. U pogodnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja prema pronalasku u postupku za prevenciju ili lečenje kancera ili premalignog stanja, pri čemu postupak smanjuje tumorigenost jedne ili više matičnih ćelije kancera. Pogodno, ovi postupci mogu da spreče progresiju kancera ili da inhibiraju rast tumora.

[0146] Kada se jedinjenje prema pronalasku koristi u postupcima lečenja i medicinske upotrebe jedinjenja prema pronalasku za prevenciju ili lečenje progresije kancera, ova prevencija ili lečenje mogu da izazovu usporavanje, odlaganje ili potpuno zaustavljanje progresije kancera.

[0147] Progresija kancera se uobičajeno određuje tako što se kanceru dodeljuje stadijum. Dodeljivanje stadijuma se obično sprovodi tako što se kanceru dodeli broj od I do IV, gde je I izolovani kancer i IV kancer koji se raširio do granice veličine koja se meri. Specifičnosti dodeljivanja stadijuma variraju kod različitih kancera, ali stadijum u principu uzima u obzir veličinu tumora, da li je tumor napao susedne organe, na koliko se regionalnih (obližnjih) limfnih čvorova raširio (ako je uopšte na neki), i da li se pojavio na udaljenijim lokacijama (metastazirao).

[0148] U principu, stadijum I je lokalizovan u jednom delu tela i može da se leči hirurškom resekcijom (kod čvrstih tumora koji su dovoljno mali). Stadijum II je lokalno uznapredovao, i moguće je lečiti ga hemioterapijom, terapijom zračenjem, operacijom ili kombinacijom navedenog. Stadijum III je takođe lokalno uznapredovao i dodeljivanje oznake Stadijum II ili Stadijum III zavisi od specifične vrste kancera, iako je generalno prihvaćeno da je stadijum III "kasno" lokalno uznapredovao. Kanceri stadijuma IV su često metastazirali na drugi organ. Lečenje kancera upotrebom jedinjenja prema pronalasku u postupcima ili medicinskim upotrebama prema predmetnom pronalasku može da se koristi za lečenje kancera stadijuma I, II, III ili IV tako što se ciljano deluje na matične ćelije kancera. Lečenje jedinjenjem prema pronalasku može da se koristi za prevenciju progresije iz jednog stadijuma u sledeći. U jednom primeru izvođenja, lečenje jedinjenjem prema pronalasku se koristi za prevenciju progresije iz stadijuma I u stadijum II. U drugom primeru izvođenja, lečenje jedinjenjem prema pronalasku se

2

koristi za prevenciju progresije iz stadijuma II u stadijum III. U još jednom dodatnom primeru izvođenja, lečenje jedinjenjem prema pronalasku se koristi da se spreči progresija iz stadijuma III u stadijum IV.

[0149] Sprečavanje ili inhibicija progresije kancera, naročito je važna za prevenciju širenja kancera, na primer, progresija iz stadijuma I u stadijum II gde se kancer širi lokalno, ili progresija iz stadijuma III u stadijum IV gde kancer metastazira na druge organe. Matične ćelije kancera su tumorigene i zbog toga se veruje da igraju kritičnu ulogu prilikom širenja kancera, kako lokalnog tako i metastatskog. Postupci za lečenje ili medicinske upotrebe pronalaska u kojima se koristi jedinjenje prema pronalasku mogu se, dakle, koristiti da se spreči širenje kancera, tako što će se ciljano delovati na tumorigene matične ćelije kancera i tako smanjiti njihov broj.

"Kanceri"

[0150] Jedinjenja prema pronalasku pokazuju povećanu antikancersku aktivnost u poređenju sa matičnim nukleozidima od kojih su izvedeni. Čini se da je ovo povećanje antikancerske aktivnosti obezbeđeno kao rezultat povećane aktivnosti kako protiv matičnih ćelija kancera, tako i ne-matičnih ćelija kancera.

[0151] Matične ćelije kancera igraju ulogu u biološkoj aktivnosti širokog spektra kancera. U skladu sa tim, postoji široki spektar kancera koje je moguće sprečiti ili lečiti u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0152] Kao što je na drugim mestima u ovom tekstu razmatrano, za matične ćelije kancera se zna da su prisutne u mnogim vrstama tumora, uključujući tečne tumore (uključujući hematološke tumore kao što su leukemije i limfomi) i čvrste tumore (kao što su tumori dojke, pluća, debelog creva, prostate, jajnika, kože, mokraćne bešike, žučnih puteva i pankreasa). Stoga se očekuje da postupci za lečenje i medicinske upotrebe jedinjenja prema pronalasku za ciljano delovanje na matične ćelije kancera budu korisni u prevenciji i lečenju ovih kancera.

[0153] Pogodno, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u perevenciji ili lečenju kancera izabranih iz grupe koja se sastoji od: leukemije, limfoma, multiplog mijeloma, kancera pluća, kancera jetre, kancera dojke, kancera glave i vrata, neuroblastoma, tiroidnog karcinoma, kancera kože (uključujući melanom), oralnog karcinoma skvamoznih ćelija, kancera mokraćne bešike, tumora Lejdigovih ćelija, kancera žučnih puteva, kao što su holangiokarcinom ili kancer žučnog kanala, kancera pankreasa, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera i ginekoloških kancera, uključujući kancer jajnika, kancer endometrijuma, kancer jajovoda, kancer materice i kancer grlića materice, uključujući epitelni kancer grlića materice. U pogodnim primerima izvođenja, kancer je leukemija i može da se izabere iz grupe koja se sastoji od akutne limfoblastne leukemije, akutne mijelogene leukemije (koja je takođe poznata kao akutna mijeloidna leukemija

2

ili akutna nelimfocitna leukemija), akutne promijelocitne leukemije, akutne limfocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije (koja je takođe poznata kao hronična mijeloidna leukemija, hronična mijelocitna leukemija ili hronična granulocitna leukemija), hronične limfocitne leukemije, monoblastne leukemije i leukemije vlasastih ćelija. U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, kancer je akutna limfoblastna leukemija. U naročitom primeru izvođenja, leukemija je neosetljiva TdT-pozitivna leukemija. U pogodnom primeru izvođenja kancer je limfom koji može da se izabere iz grupe koja se sastoji od: Hočkinovog limfoma; ne-Hočkinovog limfoma; Burkitovog limfoma; i limfoma malih ćelija.

[0154] Pogodnim ciljanim delovanjem na matične ćelije kancera kod ovih kancera može se postići efikasno lečenje kancera time što će se sprečiti ili lečiti razvoj kancera, time što će se sprečiti ili lečiti progresija kancera, time što će se sprečiti ili lečiti recidiv kancera ili time što će se sprečiti ili lečiti propagacija kancera.

[0155] U pogodnom primeru izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u ciljanom delovanju na matične ćelije kancera pri prevenciji ili lečenju metastatskog kancera.

[0156] U pogodnom primeru izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u ciljanom delovanju na matične ćelije kancera pri lečenju rekurentnog ili nesenzitivnog kancera.

[0157] U pogodnom primeru izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u ciljanom delovanju na matične ćelije kancera pri lečenju primarnog kancera. Pogodno, lečeni primarni kancer može da bude drugi primarni kancer.

[0158] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u ciljanom delovanju na matične ćelije kancera pri lečenju sekundarnog kancera. U pogodnom primeru izvođenja sekundarni kancer je metastatski kancer.

[0159] U pogodnom primeru izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje a jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u ciljanom delovanju na matične ćelije kancera, pri čemu ciljano delovanje na matične ćelije kancera sprečaav ili inhibira: (i) recidiv kancera; (ii) pojavu drugog primarnog kancera; ili (iii) metastazu kancera.

[0160] Postupci lečenja ili medicinske upotrebe u kojima se jedinjenje prema pronalasku koristi na osnovu svoje sposobnosti da ciljano deluje na matične ćelije kancera ogu da se koriste u lečenju rekurentnog ili nesenzitivnog kancera. Razmatranja koja se tiču rekurentnog ili nesenzitivnog kancera u ovim primerima izvođenja, osim gde kontekst zahteva drugačije, ista su kao i za lečenje rekurentnog ili nesenzitivnog kancera u vezi sa aspektima pronalaska.

"Rekurentni ili nesenzitivni kancer"

[0161] Kao što je prethodno napomenuto, izvesni aspekti i primeri izvođenja prema pronalasku naročito se odnose na upotrebu jedinjenja prema pronalasku u lečenju rekurentnih ili nesenzitivnih kancera.

[0162] Za potrebe predmetnog pronalaska, nesenzitivnim kancerima se mogu smatrati kanceri koji pokazuju otpornost prema lečenju antikancerskim terapijama koje su različite od terapija gde se koristi jedinjenje prema pronalasku. Na primer, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u lečenju nesenzitivnih kancera koji su otporni na lečenje radioterapijom. Alternativno, ili dodatno, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u lečenju nesenzitivnih kancera koji su otporni na biološka sredstva koja se koriste u lečenju kancera. U pogodnom primeru izvođenja, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u lečenju nesenzitivnih kancera koji su otporni na lečenje hemioterapijskim sredstvima, različitim od jedinjenja prema pronalasku.

[0163] Konkretno, nesenzitivni kanceri koji mogu da imaju koristi od postupaka za lečenje u medicinskim upotrebama prema pronalasku u kojima se koristi jedinjenje prema pronalasku, uključuju kancere koji su otporni na kordicepin ili 2-fluorokordicepin.

[0164] Rekurentni kanceri (ili povratni kanceri) su oni koji se vraćaju nakon perioda remisije tokom kog kancer ne može da se detektuje. Ponovna pojava kancera može da se dogodi na mestu originalnog kancera (lokalna ponovna pojava kancera), na mestu koje je blizu mesta originalnog kancera (regionalna ponovna pojava kancera), ili na mestu koje je udaljeno od mesta originalnog kancera (distalna ponovna pojava kancera). Veruje se da matične ćelije kancera igraju ulogu u ponovnoj pojavi kancera, na taj način što obezbeđuju izvor iz koga se obrazuju ćelije rekurentnog kancera. Shodno tome, postupci lečenja i medicinske upotrebe jedinjenja prema pronalasku, u skladu sa pronalaskom, koji omogućavaju ciljano delovanje na matične ćelije kancera, mogu da budu od velike koristi u kontekstu rekurentnih kancera. Sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluje na matične ćelije kancera može da se koristi za uklanjanje populacija onih ćelija koje su ustanju da dovedu do ponovne pojave, čime se sprečavaju slučajevi rekurentnog kancera. Antikancerska aktivnost jedinjenja prema pronalasku u odnosu na matične ćelije kancera može takođe da se iskoristi za ciljano delovanje na matične ćelije kancera kod kancera koji su se ponovo pojavili, kao i da potencijalno ispoljava citotoksična dejstva na nematične ćelije kancera, obezbeđujući time lečenje rekurentnih kancera.

[0165] Imajući u vidu prethodno navedeno, smatraće se da jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u postupcima ili upotrebama pronalaska za prevenciju ili lečenje rekurentnog kancera. Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u postupcima ili upotrebama pronalaska, za prevenciju ili lečenje lokalnih, regionalnih ili udaljenih rekurentnih kancera.

[0166] Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u postupcima ili uporebama prema pronalasku, kako bi se sprečio recidiv kancera, obezbeđujući najmanje 2 meseca, najmanje 6

1

meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, najmanje 24 meseca, ili najmanje 30 meseci remisije. Zapravo, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi kako bi se sprečio recidiv kancera, obezbeđujući najmanje 4 godine, najmanje 5 godina, najmanje 6 godina, najmanje 7 godina, najmanje 8 godina, najmanje 9 godina, ili najmanje 10 godina remisije.

[0167] Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u postupcima ili uporebama prema pronalasku za lečenje recidiva kancera, koji se pojavio nakon najmanje 2 meseca, najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, najmanje 24 meseca, ili najmanje 30 meseci remisije. Zapravo, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi za lečenje recidiva kancera, koji se pojavio nakon najmanje 4 godine, najmanje 5 godina, najmanje 6 godina, najmanje 7 godina, najmanje 8 godina, najmanje 9 godina, ili najmanje 10 godina remisije.

[0168] Sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluju na matične ćelije kancera daje ovim jedinjenjim sposobnost da spreče ili leče kancere u skladu sa medicinskim upotrebama ili postupcima lečenja prema pronalasku. Međutim, trebalo bi napomenuti da jedinjenja prema pronalasku takođe ispoljavaju direktno citotoksično dejstvo na ne-matične ćelije kancera koje sačinjavaju najveći deo mase tumora. Iako aktivnost matičnih ćelija kancera verovatno leži u osnovi velikog dela otpornosti koja toliko otežava lečenje rekurentnih ili nesenzitivnih kancera, ne-matične ćelije kancera su takođe glavni sastavni deo ovih rekurentnih ili nesenzitivnih kancera.

[0169] Jedinjenja prema pronalasku ispoljavaju veća citotoksična dejstva na ne-matične ćelije kancera nego što to čine kordicepin ili 2-fluorokordicepin, hemioterapeutski molekul od koga su izvedena jedinjenja prema pronalasku. Shodno tome, mehanizam kojim jedinjenje prema pronalasku deluje tokom lečenja rekurentnog ili nesenzitivnog kancera ne mora da bude ograničeno isključivo na antikancersku aktivnost ovog jedinjenja u odnosu na matične ćelije kancera, več može da koristi i dejstvo jedinjenja prema pronalasku na ne-matične ćelije kancera. Pri ovim upotrebama, lečenje jedinjenjem prema pronalasku će smanjiti ukupan broj kako matičnih ćelija kancera, tako i ne-matičnih ćelije kancera. Kada se koriste određena jedinjenja prema pronalasku, ova lečenja će preferencijalno smanjiti udeo matičnih ćelija kancera koje preostaju nakon lečenja.

Terapeutski efikasne doze jedinjenja prema pronalasku

[0170] Terapeutski efikasna količina jedinjenja prema pronalasku može da bude količina koja je dovoljna da indukuje smrt ćelija kancera. Terapeutski efikasna količina jedinjenja prema pronalasku može da bude količina koja je dovoljna da indukuje smrt matičnih ćelija kancera. U nekim primerima izvođenja, naročito primerima koji se odnose na lečenje rekurentnog ili nesenzitivnog kancera, terapeutski efikasna količina jedinjenja prema pronalasku može da bude

2

količina koja je dovoljna da indukuje smrt matičnih ćelija kancera i takođe da indukuje smrt nematičnih ćelija kancera.

[0171] Postoje različiti načini na koje količina terapeutski efikasnog jedinjenja, kao što je jedinjenje prema pronalasku, koje je potrebno primeniti kod pacijenta, može da se izračuna i izrazi. Jedan takav način za koji se smatra da je naročito značajan za doze sredstava za prevenciju ili lečenje kancera, je količina sredstva koja se primenjuje po jedinici površine tela pacijenta. Ove doze se uobičajeno izražavaju u smislu količine sredstva (koja može da bude određena masom) po kvadratnom metru (m<2>) površine.

[0172] Za upotrebe jedinjenja prema pronalasku u prevenciji ili lečenju kancera može da se koristi nedeljna doza od između 10 mg/m<2>i 1000 mg/m<2>. Za ovakva lečenja, može, na primer, da se koristi nedeljna doza od između 375 mg/m<2>i 900 mg/m<2>. Na primer, efikasno lečenje rekurentnih ili nesenzitivnih kancera može da se obezbedi kada su pacijentima obezbeđene nedeljne doze jedinjenja prema pronalasku koje se kreću između približno 500 mg/m<2>i 825 mg/m2.

[0173] Bez želje da budu ograničeni bilo kojom hipotezom, pronalazači veruju da sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluje na matične ćelije kancera omogućava da se efikasnost postigne upotrebom nižih doza ovog jedinjenja nego što bi se to inače očekivalo. Samo kao primer, nedeljne doze jedinjenja prema pronalasku koje su tako niske da iznose i 825 mg/m2 , 750 mg/m2 , 600 mg/m2 , ili 500 mg/m<2>, mogu da se pokažu kao terapeutski efikasne pri upotrebama i postupcima prema pronalasku.

[0174] Odabrana nedeljna doza jedinjenja prema pronalasku može da se obezbedi u vidu jedne primene, ili više primena u toku nedelje. Na primer, nedeljna doza jedinjenja prema pronalasku može da bude obezbeđena putem dve primene, tri primene, ili više. Tako, u slučaju nedeljne doze od 750 mg/m2 , ona se može postići putem tri primene od po 250 mg/m<2>u toku nedelje, ili dve primene od po 375 mg/m2 tokom nedelje. Slično tome, u slučaju nedeljne doze od 600 mg/m2 , ona se može postići putem tri primene od po 200 mg/m<2>u toku nedelje, ili dve primene od po 300 mg/m2 tokom nedelje.

[0175] Pogodna količina jedinjenja prema pronalasku koja se primenjuje kao jedinstvena doza za lečenje kako bi se obezbedila potrebna doza ovog jedinjenja za celu nedelju, može da bude između približno 100 mg/m<2>i 300 mg/m<2>.

[0176] Obezbeđena nedeljna doza jedinjenja prema pronalasku može da se smanjuje tokom lečenja. Na primer, lečenje može da otpočne sa nedeljnom dozom od oko 1000 mg/m<2>, 900 mg/m2 , 825 mg/m2 , 750 mg/m2 ili 725 mg/m2 , i tokom lečenja, potrebna doza može da se smanji na oko 750 mg/m2 (u slučajevima kada je početna doza iznad ove količine), oko 650 mg/m<2>, oko 625 mg/m2 , ili čak oko 500 mg/m<2>ili oko 375 mg/m<2>.

[0177] Doze jedinjenja prema pronalasku, mogu, naravno, da se predstave i na druge načine. Najuobičajeniji od ovih načina je količina aktivnog sredstva koja se obezbeđuje po jedinici telesne mase. Izračunato je da je za prosečnog pacijenta, kada je u pitanju čovek, doza od 1 mg/m2 ekvivalentna približno 0,025 mg/kg telesne mase. U skladu sa tim, podaci pokazuju, da je jedinjenje prema pronalasku efikasno za lečenje rekurentnog ili nesenzitivnog kancera u dozama koje se kreću od približno 6,25 mg/kg do približno 25 mg/kg. Pogodna doza može, na primer, da bude između oko 9,5 mg/kg i 22,5 mg/kg. U pogodnom primeru izvođenja, jedinjenje prema pronalasku postiže efikasno lečenje rekurentnog ili nesenzitivnog kancera kada se pacijentima obezbede nedeljne doze koje se kreću između približno 12,5 mg/kg i 20,5 mg/kg.

[0178] Razmatranja u vezi sa formulacijama jedinjenja prema pronalasku koje su pogodne za upotrebu u postupcima za prevenciju ili lečenje i za medicinske upotrebe predmetnog pronalaska opisane su na drugim mestima u ovom prikazu. U slučaju formulacija jedinjenja prema pronalasku za injeciranje, one se mogu primenjivati intravenski. Intravenska primena može da se ostvari tokom bilo kog pogodnog vremenskog okvira, na primer, tokom injeciranja u trajanju od 10 minuta, ili slično.

Vrste lečenja

[0179] U pogodnom primeru izvođenja, jedinjenje prema pronalasku može da se koristi za ciljano delovanje na matične ćelije kancera, kao prva linija lečenja kancera.

[0180] Međutim, otkriće da jedinjenja prema pronalasku mogu ciljano da deluju na matične ćelije kancera i time leče rekurentni ili nesenzitivni kancer, ilustruje činjenicu da jedinjenje prema pronalasku može da obezbedi efikasno lečenje kancera u kontekstima u kojima su se druge vrste lečenja pokazale kao neefikasne. Shodno tome, u pogodnom primeru izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za ciljano delovanje na matične ćelije kancera kao drugu liniju lečenja kancera. Zapravo, u pogodnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za ciljano delovanje na matične ćelije kancera kao treću, ili dodatnu, liniju lečenja kancera.

[0181] U pogodnom primeru izvođenja obezbeđeno je jedinjenje prema pronalasku za upotrebu kao neoadjuvans u lečenju kancera. Neoadjuvans je sredstvo koje se obezbeđuje pacijentu kako bi se veličina tumora smanjila pre "glavne" anti-kancerske terapije, kao što je hirurško uklanjanje kancera. Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi kao neoadjuvansna terapija za pacijenta koji će nakon toga biti podvrgnut hirurškom lečenju kancera i/ili lečenju kancera radioterapijom.

[0182] Alternativno, ili dodatno, pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u vidu adjuvansa pri lečenju kancera. Adjuvans je sredstvo koje se obezbeđuje pacijentu nakon "glavne" antikancerske terapije, kao što je hirurško uklanjanje kancera, kako bi se sprečio

4

povratak kancera nakon glavne terapije. Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi kao adjuvans za pacijenta koji je prošao hirurško lečenje kancera i/ili lečenje kancera radioterapijom.

[0183] Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u postupcima ili upotrebama prema pronalasku u monoterapiji, što znači u prevencijama ili lečenjima u kojima jedinjenje prema pronalasku obezbeđuje suštinski sve aktivnosti koje se upotrebljavaju u prevenciji ili lečenju.

[0184] Alternativno, postupci ili upotrebe prema pronalasku mogu da koriste jedinjenje prema pronalasku u kombinovanoj terapiji. U ovakvim primerima izvođenja jedinjenje prema pronalasku se koristi u vezi sa najmanje jednom dodatnom terapijom kancera. Dodatna terapija kancera može da obuhvata operaciju i/ili radioterapiju. Dodatno, ili alternativno, dodatna terapija kancera može da obuhvata upotrebu najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva koje doprinosi prevenciji ili lečenju kancera koje je potrebno postići. Pogodno, ovakvo jedno sredstvo može da bude hemioterapijsko sredstvo ili biološko sredstvo koje se koristi u prevenciji ili lečenju kancera.

[0185] U pogodnom primeru izvođenja kombinovane terapije, jedinjenje prema pronalasku i dodatno terapeutsko sredstvo mogu da budu istovremeno obezbeđeni pacijentu. U pogodnom primeru, jedinjenje prema pronalasku i dodatno terapeutsko sredstvo mogu da budu formulisani kao deo iste farmaceutske kompozicije. Alternativno, jedinjenje prema pronalasku i dodatno terapeutsko sredstvo mogu da budu formulisani odvojeno za davanje pacijentu u suštinski isto vreme.

[0186] U drugom pogodnom primeru izvođenja kombinovane terapije, jedinjenje prema pronalasku i dodatno terapeutsko sredstvo mogu da budu obezbeđeni pacijentu u različitim trenucima. Jedinjenje prema pronalasku i dodatno terapeutsko sredstvo mogu da budu obezbeđeni pacijentu jedno za drugim. Na primer, jedinjenje prema pronalasku može da bude obezbeđeno pacijentu pre obezbeđivanja dodatnog terapeutskog sredstva. Alternativno, jedinjenje prema pronalasku može da bude obezbeđeno pacijentu nakon obezbeđivanja dodatnog terapeutskog sredstva.

"Dodatna terapeutska sredstva"

[0187] Jedinjenje prema pronalasku može da se koristi u kombinaciji sa širokim spektrom dodatnih terapeutskih sredstava za prevenciju ili lečenje kancera. Ova sredstva uključuju biološka sredstva, imunoterapeutska sredstva i hemioterapeutska sredstva koja mogu da se koriste za prevenciju ili lečenje kancera.

[0188] Iako se specifični primeri pogodnih dodatnih sredstava razmatraju u odeljcima koji slede, ne bi trebalo smatrati da oni ograničavaju opseg dodatnih terapeutskih sredstava koja su pogodna za upotrebu sa jedinjenjem prema pronalasku. Zapravo, sposobnost jedinjenja prema pronalasku da ciljano deluje na matične ćelije kancera ukazuje na to da bi njegova upotreba u kombinaciji sa bilo kojim dodatnim terapeutskim sredstvom koje se koristi u prevenciji i lečenju kancera bila od koristi, bez obzira na to da li takvo dodatno sredstvo ciljano deluje na matične ćelije kancera, nematične ćelije kancera, ili druge ćelije ili konstituente uključene u razvoj, održavanje, recidiv ili propagaciju kancera.

[0189] Primeri dodatnih terapeutskih sredstava koja mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjem prema pronalasku uključuju:

(a) antiangiogeno sredstvo, gde je, opciono, antiangiogeno sredstvo: (i) inhibitor VEGF puta, opciono bevacizumab; (ii) inhibitor tirozin kinaze, opciono sorafenib, sunitinib ili pazopanib; ili (iii) mTOR inhibitor, opciono everolimus;

(b) alkilujuće sredstvo;

(c) antimetabolit;

(d) antitumorski antibiotik;

(e) topoizomerazu;

(f) inhibitor mitoze;

(g) monoklonsko antitelo;

(h) metalno sredstvo; ili

(i) aktivnu ili pasivnu imunoterapiju.

[0190] Osim tamo gde kontekst zahteva drugačije, dodatna terapeutska sredstva izložena na prethodnoj listi, trebalo bi sva smatrati pogodnim za upotrebu u bilo kom od primera izvođenja kombinovanih terapija sa jedinjenjem prema pronalasku koje je razmatrano u prethodnom tekstu.

Odabir pacijenata

[0191] Otkriće pronalazača da jedinjenje prema pronalasku može ciljano da deluje na matične ćelije kancera omgućava niz postupaka kojima se može utvrditi da li je verovatno da će konkretni pacijent imati koristi od primanja jedinjenja prema pronalasku tokom prevencije ili lečenja kancera, kao što je rekurentni ili nesenzitivni kancer.

[0192] U skladu sa tim, prikaz obezbeđuje postupak za utvrđivanje da li će pacijent sa kancerom ili prekanceroznim stanjem imati koristi od prevencije ili lečenja kancera jedinjenjem prema pronalasku, pri čemu postupak obuhvata: testiranje biološkog uzorka reprezentativnog za kancer ili prekancerozno stanje kod pacijenta, na prisustvo matičnih ćelija kancera; pri čemu prisustvo matičnih ćelija kancera u biološkom uzorku ukazuje na to da će pacijent imati koristi od lečenja jedinjenjem prema pronalasku.

[0193] Ovaj prikaz dodatno obezbeđuje postupak za određivanje pogodnog režima lečenja za pacijenta sa kancerom ili prekanceroznim stanjem, gde postupak obuhvata: testiranje biološkog uzorka reprezentativnog za kancer ili prekancerozno stanje kod pacijenta, na prisustvo matičnih ćelija kancera; pri čemu prisustvo matičnih ćelija kancera u biološkom uzorku ukazuje na to da će pogodan režim lečenja obuhvatati lečenje pacijenta jedinjenjem prema pronalasku.

[0194] Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u prevenciji ili lečenju kancera kod pacijenta koji je odabran za takvo lečenje postupkom koji obuhvata: testiranje biološkog uzorka reprezentativnog za kancer ili prekancerozno stanje kod pacijenta, na prisustvo matičnih ćelija kancera; pri čemu prisustvo matičnih ćelija kancera u biološkom uzorku ukazuje na to da je pacijent pogodan za lečenje jedinjenjem prema pronalasku.

[0195] U pogodnim primerima izvođenja matične ćelije kancera u biološkom uzorku mogu da se identifikuju po svojoj ekspresiji karakterističnih obrazaca za markere koji su prethodno razmatrani u ovoj patentnoj prijavi.

[0196] Stručnjak će uvideti da postoje brojni pogodni primeri bioloških uzoraka koji se mogu koristiti u primerima izvođenja prema pronalasku kao što su prethodno izloženi primeri. Pogodno, takav uzorak može da uključuje ćelije kancera ili prekanceroznog stanja. Pogodan biološki uzorak može da bude uzorak tkiva, kao što je uzorak za upotrebu u histologiji. Ekspresija markera za matične ćelije kancera u ćelijama ovih uzoraka, kao što su markeri izloženi u prethodnom tekstu, može direktno da se procenjuje.

[0197] Alternativno ili dodatno, pogodan biološki uzorak može da sadrži ciljne molekule reprezentativne za ekspresiju gena u ćelijama kancera ili prekanceroznih stanja. Primeri ovih ciljnih molekula uključuju proteine koje kodiraju eksprimirani geni ili nukleinske kiseline, kao što je iRNK, koje su reprezentativne za ekspresiju gena.

[0198] Pogodni primeri tehnika kojima markeri matičnih ćelija kancera mogu da se procenjuju mogu da se biraju imajući u vidu vrstu uzorka. Tehnike za ispitivanje eksprimiranih markera često se koriste u kontekstu kliničkih procena (kao na primer za dijagnostičke ili prognostičke svrhe) i njihova upotreba biće poznata osobama koje moraju da ih sprovode u kontekstu predmetnog pronalaska. Samo kao primer, u uzorcima koji sadrže proteine, prisustvo markera za matične ćelije kancera može da se procenjuje pogodnim tehnikama, korišteći antitela koja reaguju sa markerima za matične ćelije kancera o kojima se radi. Primeri ovakvih uzoraka, koji sadrže proteinske markere matičnih ćelija kancera, uključuju histološke uzorke (gde se prisustvo markera može vizualizovati pogodnim imunocitohemijskim tehnikama), ili uzorke dobijene iz cirkulacije. Ovde se prisustvo cirkulišćih matičnih ćelija kancera (za koje se veruje da doprinose propagaciji kancera preko metastaza) može proceniti upotrebom tehnika kao što je protočna citometrija.

[0199] U uzorcima koji sadrže nukleinske kiseline reprezentativne za ekspresiju markera matičnih ćelija kancera, ova ekspresija može da se proceni pogodnim molekularno-biološkim tehnikama, kao što je amplifikacija lančanom reakcijom polimeraze (PCR), uz upotrebu pogodnih prajmera.

Primer 1 – postupci sinteze

[0200] Jedinjenja prema pronalasku mogu da se naprave shodno ili analogno sledećim Opštim procedurama i Primerima za postupke sinteze.

Opšta procedura 1 (za jedinjenja A-F i L-U)

[0201] N-metilimidazol (1,0 mmol) i rastvor pogodnog fosfohloridata (0,6 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavani su u kapima suspenziji 3’-deoksiadenozina (0,20 mmol), ili supstituisanog 3’-deoksiadenozina, u anhidrovanom THF (10 mL), i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni i preparativna TLC dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance. Količine korišćenih komponenti mogu da variraju a stvarne količine su date u primerima koji slede.

Opšta procedura 2 (za jedinjenje J)

[0202] 3’-deoksiadenozin (0.80 mmol) je suspendovan u (CH3O)3PO (5 mL) i POCl3(0.80 mmol) je dodavan u kapima na -5 °C. Reakciona smeša je dovedena na sobnu temperaturu i ostavljena da se meša tokom 4 sata. Dodat je rastvor soli estra odgovarajuće aminokiseline (4.0 mmol) rastvorene u anhidrovanom CH2Cl2(5 mL) a nakon toga i diizopropil etil amin (8.0 mmol) na -78 °C. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 20 sati dodata je voda i slojevi su razdvojeni. Vodena faza je ekstrahovana dihlorometanom a organska faza je oprana fiziološkim rastvorom. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (elucija gradijentom CH2Cl2/MeOH=100/0 do 93/7) da bi dao željeni proizvod u vidu bele pene. Količine upotrebljenih komponenti mogu da variraju i stvarne količine su date u primerima koji slede.

Opšta procedura 3 (za jedinjenja G-I)

[0203] 3’-deoksiadenozin (0.20 mmol) je suspendovan u anhidrovanom THF (5 mL) i<t>BuMgCl (1.0 M rastvor u THF, 0.22 mmol) je dodavan u kapima na sobnoj temperaturi. Rastvor odgovarajućeg fosfohloridata (0.6 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavan je u kapima i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni i preparativna TLC dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance. Količine korišćenih komponenti mogu da variraju a stvarne količine su date u primerima koji slede.

Opšta procedura 4 (za jedinjenje V)

[0204] Terc-butildimetilsilil hlorid (3.3 mol/ekv.) i imidazol 6.6 (mol/ekv) dodati su rastvoru odgovarajućeg derivata 3’-deoksiadenozina (1 mol/ekv) u anhidrovanom DMF i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći (16-20 h). Zatim je NH4Cl dodat smeši i dvaput opran etilacetatom. Organski slojevi su kombinovani, osušeni na Na2SO4i rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Prečišćavanje smeše hromatografijom na koloni dalo je intermedijer C1. Intermedijer C1 je zatim rastvoren u vodenom rastvoru THF/H2O/TFA 4/1/1 (6 ml/ekv) i mešan je na 0 °C tokom 4 h. Rastvor je zatim pažljivo neutralisan vodenim zasićenim rastvorom NaHCO3i smeša je dvaput oprana etilacetatom. Organski slojevi su kombinovani, osušeni na Na2SO4i rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Prečišćavanje smeše hromatografijom na koloni dalo je intermedijer C2. Zatim je primenjena opšti postupak B i dobijen je intermedijer C3. Intermedijer C3 je zatim rastvoren u vodenom rastvoru THF/H2O/TFA 1/1/1 (6 ml/ekv) na 0 °C i mešan je na RT tokom 24 h. Prečišćavanje hromatografijom dalo je željena jedinjenja u vidu belih čvrstih supstanci.

Opšta procedura 5 (za pripremanje 3’-deoksiadenozina i 3’-deoksi-2-hloroadenozina koji se koriste u primerima):

[0205] Rastvor H2O/CH3CN 1:9 a zatim α-AIBBr (4.0 mol/ekv) dodati su jedan za drugim suspenziji osušenog adenozina ili 2-hloroadenozina u anhidrovanom CH3CN i mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi (20 °C). Nakon 1 h, zasićeni rastvor NaHCO3je pažljivo dodat i rastvor je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovana organska faza je oprana fiziološkim rastvorom. Vodena faza je ekstrahovana pomoću EtOAc, a kombinovana organska faza je osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparavana tako da da belu gumu. Sirova smeša je rastvorena u anhidrovanom MeOH i mešana tokom 1 h sa Amberlite (2 x OH-) smolom koja je prethodno dobro oprana anhidrovanim MeOH. Rastvor je zatim filtriran a smola pažljivo oprana anhidrovanim metanolom. Isparavanje kombinovanog filtrata dalo je 2’,3’- dehidroadenozin ili 2’,3’-dehidro-2-hloroadenozin u vidu bele čvrste supstance.

[0206] Rastvor LiEt3BH (1M rastvor u THF 4-4.3 mol/ekv) dodavan je u kapima hladnom (4 °C) rastvoru 2’,3’- dehidroadenozina ili 2’,3’-dehidro-2-hloroadenozina (1 mol/ekv) u anhidrovanom DMSO/THF (1/10), u atmosferi argona. Mešanje je nastavljeno na 4°C tokom 1 h i na sobnoj temperaturi preko noći (16 h). Reakciona smeša je pažljivo zakišeljena (5% AcOH/H2O), pročišćena pomoću N2tokom 1 h (u digestoru) kako bi se uklonio piroforni trietilboran, i ispravana. Ostatak je hromatografski razdvojen kako bi dao 3’-deoksiadenozin ili 3’-deoksi-2-hloroadenozin u vidu belog praha.

[0207] Koristeći opštu proceduru 5: 2’,3’-dehidroadenozin je pripremljen od 10.0 g (37.4 mmol) adenozina, 7.5 mL H2O/CH3CN (1/9), 22 mL (149.7 mmol) α-AIBBr u 500 mL anhidrovanog CH3CN, i 300 mL Amberlite (2 x OH-) smole u 400 mL suvog metanola. 2’,3’-dehidroadenozin je dobijen u vidu bele čvrste supstance (9.12 g, 98%).3’-deoksiadenozin je pripremljen od 9.12 g (36.6 mmol) 2’,3’-dehidroadenozina i 159 mL (159 mmol) LiEt3BH/THF 1M, u anhidrovanom DMSO/THF (1/10, 50 mL). Prečišćavanje hromatografijom na koloni na gelu silicijum dioksida (sistem eluensa 3-18% MeOH u DCM) dao je 3’-deoksiadenozin u vidu belog praha (7.12 g, 77%).

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.37 (s, 1H, H8), 8.17 (s, 1H, H2), 7.29 (br s, 2H, NH2), 5.89 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H1’), 5.68 (d, J = 4.5 Hz, 1H, OH-2’), 5.19 (t, J = 6.0 Hz, 1H, OH-5’), 4.63 -4.58 (m, 1H, H2’), 4.40 - 4.34 (m, 1H, H4’), 3.71 (ddd, J = 12.0, 6.0, 3.0 Hz, 1H, H5’), 3.53-3.49 (ddd, J= 12.0, 6.0, 4.0 Hz, 1H, H5’), 2.30-2.23 (m, 1H, H3’), 1.98-1.90 (m, 1H, H3’).<13>C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 156.00 (C6), 152.41 (C2), 148.82 (C4), 139.09 (C8), 119.06 (C5), 90.79 (C1’), 80.66 (C4’), 74.56 (C2’), 62.61 (C5’), 34.02 (C3’).

[0208] Koristeći opštu proceduru 5: 2’,3’-dehidro-2-hloroadenozin je pripremljen od 5.0 g (16.6 mmol) 2-hloroadenozina, 3.0 mL H2O/ CH3CN (1/9), 9.7 mL (66.2 mmol) α-AIBBr u 38 mL anhidrovanog CH3CN, i 150 mL Amberlite (2 x OH-) smole u 200 mL anhidrovanog metanola.

2’,3’-dehidro-2 hloroadenozin je dobijen u vidu bele čvrste supstance (3.03 g, 60%).3’-deoksi-2-hloroadenozin je pripremljen od 2.18 g (7.68 mmol) 2’,3’-dehidro-2-hloroadenozina i 30.7 mL (30.7 mmol) LiEt3BH/THF 1M u anhidrovanom DMSO/THF (1/10 mL, 30 mL). Prečišćavanje hromatografijom na koloni na gelu od silicijum dioksida (sistem eluensa 2-20% MeOH u DCM) dalo je 3’-deoksi-2-hloroadenozin u vidu belog praha (1.20 g, 55%).

1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.41 (s, 1H, H8), 5.93 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H1’), 4.68-4.66 (m, 1H, H2’), 4.56-4.52 (m, 1H, H4’), 3.95 (dd, J = 3, 12.5 Hz, 1H, H5’), 3.70 (dd, J = 3, 12.5 Hz, 1H, H5’), 2.39-2.33 (m, 1H, H3’), 2.08-2.03 (m, 1H, H3’)<13>C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 158.14 (C6), 155.19 (C2), 151.15 (C4), 141.30 (C8), 119.56 (C5), 93.58 (C1’), 82.80 (C4’), 76.81 (C2’), 64.01 (C5’), 34.33 (C3’).

Priprema 3’-deoksi-2-fluoroadenozina:

[0209] Rastvor H2O/ CH3CN (1:9; 1.4 mL) a zatim α-AIBBr (4.10 mL, 28.05 mmol) dodati su jedan za drugim, suspenziji osušenog 2-fluoroadenozina (2.0 g, 7.01 mmol) u anhidrovanom CH3CN (50 mL) i mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi (20 °C). Nakon 1 h, zasićeni rastvor NaHCO3je pažljivo dodat i rastvor je ekstrahovan pomoću EtOAc (2 x 100 mL). Kombinovana organska faza je oprana fiziološkim rastvorom (1 x 50 mL). Vodena faza je ekstrahovana pomoću EtOAc (2 x 50 mL) i kombinovana organska faza je osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparavana tako da da belu gumu. Sirova smeša je rastvorena u smeši THF/H2O(4/1, 50 mL) i mešana tokom 1 h sa 60 mL Amberlite (2 x OH-) smole (koja je prethodno dobro oprana sa THF). Rastvor je zatim filtriran i smola je pažljivo oprana sa THF. Isparavanje kombinovanog filtrata i kristalizacija ostatka EtOH dala je 2’,3’-dehidro- 2-fluoroadenozin u vidu bele čvrste supstance (1.13 g, 60%).

[0210] Rastvor LiEt3BH/THF (1M; 18.01 mL, 18.01 mmol) dodavan je u kapima (4 °C, ledeno kupatilo) rastvoru 2’,3’-dehidro-2-fluoroadenozina (1.13 g, 4.18 mmol) u anhidrovanom

4

DMSO/THF (1/10, 15 mL) u atmosferi argona. Mešanje je nastavljeno na 4 °C tokom 1 h i na sobnoj temperaturi preko noći (16 h). Reakciona smeša je pažljivo zakišeljena (5% AcOH/H2O), pročišćena sa N2tokom 1 h (u digestoru) kako bi se uklonio piroforni trietilboran, i isparavana. Ostatak je hromatografski razdvojen na gelu od silicijum dioksida (3-18% MeOH in DCM) kako bi dao 3’-deoksi-2-fluoroadenozin u vidu belog praha (7.12 g, 77%).

19F NMR (470 MHz, DMSO-d6): δF -52.19.<1>HNMR (500 MHz, DMSO-d6) δH 8.34 (s, 1H, H8), 7.80 (br s, 2H, NH2), 5.78 (d, J = 2.25 Hz, 1H, H1’), 5.68 (br s, 1H, OH-2’), 5.01 (br s, 1H, OH-5’), 4.55-4.51 (m, 1H, H2’), 4.39-4.32 (m, 1H, H4’), 3.73-3.76 (m, 1H, H5’), 3.56-3.50 (m, 1H, H5’), 2.26-2.18 (m, 1H, H3’), 1.94-1.85 (m, 1H, H3’).<13>C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC 158.51 (d, 1JC-F= 202.7 Hz, C2), 157.55 (d, 3JC-F= 21.2 Hz, C6), 150.11 (d, 3JC-F= 20.3 Hz, C4), 139.22 (d, 6JC-F= 2.2 Hz, C8), 117.37 (d, 4JC-F= 4.1 Hz, C5), 90.67 (C1’), 80.90 (C4’), 74.73 (C2’), 62.35 (C5’), 33.89 (C3’).

Priprema 3 ’-deoksi-2-metoksiadenozina:

[0211] Rastvor H2O/ CH3CN (1:9; 1.4 mL) i zatim α-AIBBr (4.10 mL, 28.05 mmol) dodati su jedan po jedan, suspenziji osušenog 2-fluoroadenozina (2.0 g, 7.01 mmol) u anhidrovanom CH3CN (50 mL) i mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi (20 °C). Nakon 1 h, zasićeni rastvor NaHCO3dodat je pažljivo i rastvor je ekstrahovan pomoću EtOAc (2 x 100 mL). Kombinovana organska faza je oprana fiziološkim rastvorom (1 x 50 mL). Vodena faza je ekstrahovana pomoću EtOAc (2 x 50 mL) i kombinovana organska faza je osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparavana tako da da belu gumu. Sirova smeša je rastvorena anhidrovanim MeOH (50 mL) i mešana tokom 1 h sa 60 mL Amberlite (2 x OH-) smole (koja je prethodno dobro oprana MeOH). Rastvor je zatim filtriran i smola je pažljivo oprana sa THF. Isparavanje kombinovanog filtrata i kristalizacija ostatka od EtOH dale su 2’,3’- dehidro-2-metoksiadenozin u vidu bele čvrste supstance (1.57 g, 84%).

[0212] Rastvor LiEt3BH (1M rastvor u THF; 8.53 mL, 8.53 mmol) dodavan u kapima hladnom (4 °C) rastvoru 2’,3’-dehidro-2-metoksiadenozina (762 mg, 2.84 mmol) u anhidrovanom DMSO/THF (1/10, 15 mL) u atmosferi argona. Mešanje je nastavljeno na 4 °C tokom1 h i na sobnoj temperaturi preko noći (16 h). Reakciona smeša je pažljivo zakišeljena (5% AcOH/H2O), pročišćena sa N2tokom 1 h (u digestoru) kako bi se uklonio pirohorni trietilboran, i isparavana. Ostatak je hromatografski razdvojen na gelu od silicijum dioksida (3-17% MeOH u DCM) kako bi dao 3’-deoksi-2-metoksiadenozin u vidu belog praha (650 mg, 81%).

1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH 8.20 (s, 1H, H8), 5.90 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H1’), 4.75-4.71 (m, 1H, H2’), 4.54-4.48 (m, 1H, H4’), 3.91 (dd, J = 12.3, 2.5 Hz, 1H, H5’), 3.69 (dd, J = 12.30, 4.0 Hz, 1H, H5’), 3.37 (s, 3H, OCH3), 2.43-2.35 (m, 1H, H3’), 2.08-2.02 (m, 1H, H3’). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δC 163.68 (C2), 158.12 (C6), 151.94 (C4), 139.71 (C8), 116.64 (C5), 93.36 (C1’), 82.53 (C4’), 76.59 (C2’), 64.24 (C5’), 55.29 (OCH3), 34.81 (C3’).

[0213] Fosfohloridati su pripremani objavljenim postupcima od aril fosforodihloridata i hidrohlorida estara aminokiselina.

3’-deoksiadenozin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)] fosfat A

[0214]

[0215] Jedinjenje A je pripremljeno prema opštoj proceduri 1 koristeći 3’-deoksiadenozin (50 mg, 0.20 mmol), N-metilimidazol (80 µL, 1.0 mmol) i fenil(benziloksi-L-alaninil) fosforohloridat (212 mg, 0.6 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 7/93) sa gradijentom CH2Cl2/MeOH (100% do 95:5%) i preparativna TLC (1000 µm, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste supstance (31 mg, 28 %).

1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.26 (s, 0.5H, H8), 8.24 (s, 0.5H, H8), 8.22 (s, 0.5H, H2), 8.21 (s, 0.5H, H2), 7.34-7.25 (m, 7H, Ar), 7.21-7.13 (m, 3H, Ar), 6.01 (d, J = 2.9 Hz, 1H, H1’), 6.00 (d, J = 2.9 Hz, 1H, H1’), 5.15-5.04 (m, 2H, OCH2Ph), 4.73-4.63 (m, 2H, H2’, H4’), 4.43-4.35 (m, 1H, H5’), 4.27-4.20 (m, 1H, H5’), 4.03-3.91 (m, 1H, CHCH3), 2.35-2.28 (m, 1H, H3’), 2.09-2.02 (m, 1H, H3’), 1.32 (d, J = 7.4 Hz, 1.5 H, CHCH3), 1.28 (d, J = 7.4 Hz, 1.5 H, CHCH3).

13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 174.84 (d, 3JC-P= 4.5 Hz, C=O), 174.63 (d, 3JC-P= 4.5 Hz, C=O), 157.32 (C6), 157.31 (C6), 153.86 (C2), 153.84 (C2), 152.13 (C4), 152.07 (C4), 150.20 (C-Ar), 150.18 (C-Ar), 140.47 (C8), 137.26 (C-Ar), 137.19 (C-Ar), 130.76 (CH-Ar), 130.74 (CH-Ar), 129.57 (CH-Ar), 129.32 (CH-Ar), 129.31 (CH-Ar), 129.29 (CH-Ar), 129.26 (CH-Ar), 126.16 (CH-Ar), 126.14 (CH-Ar), 121.46 (d, 3JC-P= 4.7 Hz, CH-Ar), 121.38 (d, 3JC-P= 4.7 Hz, CH-Ar) 120.54 (C5), 120.53 (C5), 93.24 (C1’), 3.18 (C1’), 80.43 (d,<3>JC-P= 3.6 Hz, C4’), 80.36 (d, 3JC-P= 3.6 Hz, C4’), 76.62 (C2’), 68.62 (d, 2JC-P= 5.3 Hz, C5’), 68.30 (d, 2JC-P= 5.3 Hz, C5’), 67.95 (OCH2Ph), 67.92 (OCH2Ph), 51.74 (CHCH3), 51.60 (CHCH3), 34.91 (C3’), 34.70 (C3’), 20.45 (d, 3JC-P= 7.0 Hz, CHCH3), 20.28 (d, 3JC-P= 7.0 Hz, CHCH3).

31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 3.9, 3.7.

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 569.2 (M H<+>), 591.2 (M Na<+>), 1159.4 (2M Na<+>) C26H29N6O7P traženo: (M) 568.2.

[0216] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, 1 = 254 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 14.02 min. i tR 14.26 min.

Uporedni primer: (2S)-benzil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2- il)metoksi)(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)propanoat B [0217]

[0218] Koristeći opštu proceduru 1 iz prethodnog teksta, N-metilimidazol (240 µL, 3.0 mmol) i rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)propanoata (727 mg, 1.8 mmol) u anhidrovanom THF (10 mL), dodavani su u kapima suspenziji 3’-deoksiadenozina (150 mg, 0.6 mmol) u anhidrovanom THF i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (2000 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (45 mg, 12%).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 619.2 (M H<+>), 641.2 (M Na<+>), 1259.4 (2M Na<+>) C30H31N6O7P traženo: (M) 618.58.

31P NMR (202 MHz,): δP 4.3 (s), 4.1 (s).

1H NMR (500 MHz, CH3OD): δH 8.24 (s, 0.5H, H8), 8.22 (s, 0.5H, H8), 8.20 (s, 0.5H, H2), 8.19 (s, 0.5H, H2), 8.14-8.09 (m, 1H, Ar), 7.89-7.85 (m, 1H, Ar), 7.70-7.67 (m, 1H, Ar), 7.53 7.42 (m, 3H, Ar), 7.39-7.34 (m, 1H, Ar), 7.31-7.25 (m, 5H, Ar), 5.99 (d, J= 2.0 Hz, 0.5H, H1’), 5.98 (d, J = 2.0 Hz, 0.5H, H1’), 5.10-5.01 (m, 2H, CH2Ph), 4.72-4.61 (m, 2H, H2’, H4’), 4.47-4.40 (m, 1H, H5’), 4.33-4.24 (m, 1H, H5’), 4.09-3.98 (m, 1H, CH ala) 2.35-2.26 (m, 1H, H3’), 2.07-1.98 (m, 1H, H3’), 1.30-1.24 (m, 3H, CH3).

13C NMR (125 MHz, CH3OD): δC 174.85 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 174.56 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 157.33 (C6), 157.31 (C6), 153.87 (C2), 153.85 (C2), 150.24 (C4), 150.23 (C4), 147.91 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, ’ipso’ Nap), 147.95, (d, 3JC-P= 7.5 Hz, ’ipso’ Nap), 140.56 (C8), 140.50 (C8), 137.22 (C-Ar), 137.17 (C-Ar), 136.28 (C-Ar), 129.55 (CH-Ar), 129.53 (CH-Ar), 129.30 (CH-Ar), 129.25 (CH-Ar), 128.88 (CH-Ar), 128.82 (CH-Ar), 127.91 (d, 2JC-P= 6.25 Hz, C-Ar),

4

127.83 (d, 2JC-P= 6.25 Hz, C-Ar), 127.77 (CH-Ar), 127.75 (CH-Ar), 127.49 (CH-Ar), 127.45 (CH-Ar), 126.48 (CH-Ar), 126.47 (CH-Ar), 126.02 (CH-Ar), 125.97 (CH-Ar), 122.77 (CH-Ar), 122.63 (CH-Ar), 120.58 (C5), 120.53 (C5), 116.35 (d, 3JC-P= 3.75 Hz, CH-Ar), 116.15 (d, 3JC-P= 3.75 Hz, CH-Ar), 93.22 (C1’), 93.20 (C1’), 80.30 (d,<3>JC-P= 2.75 Hz, C4’), 80.24 (d, 3JC-P= 2.75 Hz, C4’), 76.51 (C2’), 76.44 (C2’), 68.87 (d,<2>JC-P= 5.2 Hz, C5’), 68.64 (d, 2JC-P= 5.2 Hz, C5’), 67.93 (OCH2Ph), 51.82 (CH ala), 51.73 (CH ala), 35.01 (C-3’), 34.76 (C3’), 20.41 (d, 3JC-P= 6.7 Hz, CH3ala), 20.22 (d, 3JC-P= 6.7, CH3ala).

[0219] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, 1 = 200 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 16.36 min. i tR 16.60 min.

Uporedni primer: Benzil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)acetat C

[0220]

[0221] Koristeći opštu proceduru iz prethodnog teksta, N-metilimidazol (80 µL, 1.0 mmol) i rastvor benzil 2-((hloro(fenoksi)fosforil)amino)acetata (204 mg, 0.6 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavani su u kapima suspenziji 3’-deoksiadenozina (50 mg, 0.20 mmol) u anhidrovanom THF, i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (500 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (21 mg, 19 %).

(ES+) m/z, zabeleženo: 555.2 (M H<+>), 577.2 (M Na<+>), 1131.4 (2M Na<+>). C25H27N6O7P traženo: (M) 554.2.

31P NMR (202 MHz, CH3OD) δ 5.1, 4.9.

1H NMR (500 MHz, CH3OD) δ 8.27 (s, 0.5H, H8), 8.24 (s, 0.5H, H8), 8.22 (s, 0.5H, H2), 8.21 (s, 0.5H, H2), 7.37-7.26 (m, 7H, Ph), 7.22-7.13 (m, 3H, Ph), 6.02 (d, J = 1.8 Hz, 0.5H, H1’), 6.00 (d, J= 1.8 Hz, 0.5H, H1’), 5.14-5.11 (m, 2H, OCH2Ph), 4.73-4.64 (m, 2H, H2’, H4’), 4.50-4.39 (m, 1H, H5’), 4.36-4.24 (m, 1H, H5’), 3.53-3.71 (m, 2H, CH2gly), 2.39-2.25 (m, 1H, H3’), 2.13-2.02 (m, 1H, H3’).

13C NMR (125 MHz, CH 3

3OD) δ 172.30 (d, JC-P= 5.0 Hz, C=O), 172.27 (d, 3JC-P= 5.0 Hz, C=O), 157.34 (C6), 157.32 (C6), 153.88 (C2), 153.87 (C2), 152.08 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, C-Ar), 152.05 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, C-Ar), 150.20 (C4), 150.19 (C4), 140.52 (C8), 140.42 (C8), 137.15 (CAr), 130.79 (CH-Ar), 129.57 (CH-Ar), 129.55 (CH-Ar), 129.35 (CH-Ar), 129.34 (CH-Ar), 129.33 (CH-Ar), 126.22 (CH-Ar), 121.44 (d, JC-P= 3.7 Hz, CH-Ar), 121.40 (d, JC-P= 3.7 Hz, CH-Ar), 120.51 (C5), 120.49 (C5), 93.19, 93.14 (C1’), 80.46 (d,<3>JC-P= 4.60 Hz, C4’), 80.39 (d, 3JC-P= 4.60, C4’), 76.66 (C2’), 68.68 (d, 2JC-P= 5.42 Hz, C5’), 68.24 (d, 2JC-P= 5.42 Hz, C5’), 67.95 (OCH2Ph), 67.93 (OCH2Ph), 43.90 (CH2gly), 43.83 (CH2gly), 34.83 (C3’), 34.54 (C3’).

[0222] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, 1 = 200 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 13.63 min. i tR 13.41 min.

Uporedni primer: (2S)-pentil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)-4-metilpentanoat D [0223]

[0224] Koristeći opštu proceduru 1 iz prethodnog teksta, N-metilimidazol (76 µL, 0.95 mmol) i rastvor (2S)-pentil 2-((hloro(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)-4-metilpentanoata (250 mg, 0.6 mmol) u anhidrovanom THF (1 mL) dodavani su u kapima suspenziji 3’-deoksiadenozina (48 mg, 19 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 5/95) i preparativna TLC (1000 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl24/96) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (27 mg, 22 %).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 641.3 (M H<+>), 663.3 (M Na<+>), 1303.6 (2M Na<+>) C31H41N6O7P traženo: (M) 640.3.

31P NMR (202 MHz, CH3OD) δ 4.64, 4.37.

1H NMR (500 MHz, CH3OD) δ 8.28 (s, 0.5H, H-8), 8.25 (s, 0.5H, H-8), 8.21 (s, 0.5H, H-2), 8.20 (s, 0.5H, H-2), 8.17-8.12 (m, 1H, Nap), 7,88-7,83 (m, 1H, Nap), 7.69-7.66 (m, 1H, Nap), 7.54-7.42 (m, 3H, Nap), 7.40-7.35 (m, 1H, Nap), 7.31-7.26 (m, 5H, Ar), 6.01 (d, J = 2.1 Hz, 0.5H, H1’), 6.00 (d, J = 2.1 Hz, 0.5H, H1’), 4.47-4.67 (m, 2H, H2’, H4’), 4.55-4.44 (m,1H, H5’), 4.43-4.31 (m, 1H, H5’), 4.00-3.87 (m, 3H, CH leu, CH2Pen), 2.44-2.30 (m, 1H, H3’), 2.14-2.04

4

(m, 1H, H3’), 1.66-1.39 (m, 5H, CH2CH leu, CH2Pen), 1.1.28-1.21 (m, 4H, CH2CH2Pen), 0.86-0.81 (m, 3H, CH3Pen), 0.81-0.68 (m, 6H, (CH3)2leu).

13C NMR (125 MHz, CH3OD) δ 175.42 (d, 3JC-P= 2.5 Hz, C=O), 175.04 (d, 3JC-P= 2.5 Hz, C=O), 157.32 (C6), 153.87 (C2), 153.86 (C2), 150.23 (C4), 147.97 (d, 3JC-P= 6.2 Hz, ’ipso’ Nap), 140.55 (C8), 136.30 (C-Ar), 136.29 (C-Ar), 128.89 (CH-Ar), 128.84 (CH-Ar), 127.95 (CAr), 127.91 (C-Ar), 127.84 (C-Ar), 127.78 (CH-Ar), 127.76 (CH-Ar), 127.46 (CH-Ar), 126.50 (C-Ar), 126.48 (C-Ar), 126.46 (C-Ar), 126.01 (CH-Ar), 125.91 (CH-Ar), 122.80 (CH-Ar), 122.70 (CH-Ar), 120.58 (C5), 120.56 (C5), 116.40 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, CH-Ar), 116.01 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, CH-Ar), 93.31 (C1’), 93.27 (C1’), 80.35 (d,<3>JC-P= 3.5 Hz, 80.29 (d, 3JC-P= 3.5 Hz, C4’), 76.54 (C2’), 76.50 (C2’), 69.07 (d,<2>JC-P= 5.5 Hz, C5’), 68.85 (d, 2JC-P= 5.5 Hz, C5’), 66.33 (CH2Pent), 66.32 (CH2Pent), 54.81 (CH leu), 54.71 (CH leu), 44.22 (d, 3JC-P= 7.6 Hz, CH2leu), 43.93 (d, 3JC-P= 7.6 Hz, CH2leu), 35.15 (C3’), 34.86 (C3’), 29.32 (CH2pent), 29.30 (CH2Pent), 29.11 (CH2pent), 25.67 (CH leu), 25.45 (CH leu), 23.30 (CH2pent), 23.12 (CH3leu), 23.02 (CH3leu), 22.04 (CH3leu), 21.78 (CH3leu), 14.28 (CH3pent).

[0225] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, 1 = 200 nm, pokazala je jedan pik dva preklapajuća dijastereoizomera sa tR 20.84 min.

Uporedni primer: Metil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)-metoksi)(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)-2-metilpropanoat E

[0226]

[0227] Koristeći opštu proceduru 1 iz prethodnog teksta, N-metilimidazol (24 µL, 3.0 mmol) i rastvor metil 2-((hloro(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)-2-metilpropanoata (612 mg, 1.8 mmol) u anhidrovanom THF (1 mL) dodavani su u kapima suspenziji 3’-deoksiadenozina (150 mg, 0.6 mmol) u anhidrovanom THF (15 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl2

4

0/100 do 7/93) i preparativna TLC (1000 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl24/96) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (20 mg, 6%).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 557.2 (M H<+>), 579.2 (M Na<+>), 1135.4 (2M Na<+>) C25H29N6O7P traženo: (M) 556.51.

31P NMR (202 MHz, CH3OD) δ 2.73.

1H NMR (500 MHz, CH3OD) δ 8.28 (s, 0.5H, H8), 8.25 (s, 0.5H, H8), 8.21 (s, 0.5H, H2), 8.19 (s, 0.5H, H2), 8.18-8.14 (m, 1H, Nap), 7.90-7.84 (m, 1H, Nap), 7.71-7.66 (m, 1H, Nap), 7.53 7.47 (m, 3H, Nap), 7.41-7.35 (m, 1H, Nap), 6.03 (d, J= 2.1 Hz, 0.5H, H1’), 5.99 (d, J= 2.1 Hz, 0.5H, H1’), 4.76-4.67 (m, 2H, H2’, H4’), 4.52-4.44 (m, 1H, H5’), 4.42-4.33 (m, 1H, H5’), 3.65 (s, 1.5H, OCH3), 3.64 (s, 1.5H, OCH3), 2.48-2.41 (m, 0.5H, H3’), 2.37-2.30 (m, 0.5H, H3’), 2.15-2.09 (m, 0.5H, H3’), 2.08-2.02 (m, 0.5H, H3’), 1.47-1.44 (m, 6H, CH3).

13C NMR (125 MHz, CH3OD) δ 177.25 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 157.53 (C6), 157.51 (C6), 153.86 (C2), 150.28 (C4), 150.25 (C4), 148.06 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, ’ipso’ Nap), 148.04 (d, 3JC-P= 7.5, ’ipso’ Nap), 140.67 (C8), 140.60 (C8), 136.28 (C-Ar), 136.27 (C-Ar), 128.82 (CH-Ar), 128.80 (CH-Ar), 127.93 (d, 2JC-P= 6.25 Hz, C-Ar), 127.92 (d, 2JC-P= 6.25 Hz, C-Ar), 127.71 (CH-Ar), 127.69 (CH-Ar), 127.32 (CH-Ar), 126.44 (CH-Ar), 125.84 (CH-Ar), 122.93 (CH-Ar), 120.56 (C5),120.50 (C5), 116.38 (d, 3JC-P= 3.75 Hz, CH-Ar), 116.36 (d, 3JC-P= 3.75 Hz, CH-Ar), 93.25 (C1’), 80.40 (d,<3>JC-P= 8.0 Hz, C4’), 80.33 (d, 3JC-P= 8.0 Hz, C4’), 76.57 (C2’), 76.43 (C2’), 68.99 (d,<2>JC-P= 5.5 Hz, C5’), 68.84 (d, 2JC-P= 5.5 Hz, C5’), 53.01 (OCH3), 35.22 (C-3’), 34.90 (C3’), 27.85 (d,<3>JC-P= 6.0 Hz, CH3), 27.80 (d, 3JC-P= 6.0, CH3), 27.60 (d, 3JC-P= 6.0, CH3), 27.56 (d, 3JC-P= 6.0, CH3).

[0228] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, 1 = 254 nm, pokazala je dva pika sa tR 16.51 min, tR 16.75 min.

Uporedni primer: (2S)-benzil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(2-(3-etoksi-3-oksopropil)fenoksi)fosforil)amino)propanoat F

[0229]

4

[0230] Koristeći opštu proceduru 1 iz prethodnog teksta, N-metilimidazol (32 µL, 4.2 mmol) i rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(2-(3-etoksi-3-oksopropil)fenoksi)fosforil)amino)propanoata (1.14 g, 2.5 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavani su u kapima suspenziji 3’-deoksiadenozina (210 mg, 0.84 mmol) u anhidrovanom THF (10 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CHCl30/100 do 8/92) i preparativna TLC (1000 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (123 mg, prinos = 22%).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 669.3 (M H<+>), 691.3 (M Na<+>), C31H37N6O9P traženo: (M) 668.63. 31P NMR (202 MHz, CH3OD): δP 3.95, 3.65.

1H NMR (500 MHz, CH3OD): δH 8.25 (s, 0.5H, H8), 8.21 (s, 1H, H8, H2), 8.20 (s, 0.5H, H2), 7.35-7.29 (m, 6H, Ph), 7.25-7.21 (m, 1H, Ph), 7.16-7.07 (m, 2H, Ar), 6.00 (d, J = 1.9 Hz, 0.5H, H1’), 5.98 (d, J = 1.9 Hz, 0.5H, H1’), 5.17-5.05 (m, 2H, OCH2Ph), 4.76-4.73 (m, 0.5H, H2’), 4.70-4.59 (m, 1.5H, H2’, H4’), 4.45-4.34 (m, 1H, H5’), 4.30-4.22 (m, 1H, H5’), 4.08-3.96 (m, 3H, CH2CH3, CH ala), 2.98-2.92 (m, 2H, CH2CH2), 2.62-2.56 (m, 2H, CH2CH2), 2.40-2.29 (m, 1H, H3’), 2.11-2.03 (m, 1H, H3’), 1.36 (d, J = 6.9 Hz, 1.5 H, CH3ala), 1.33 (d, J = 6.9 Hz, 1.5 H, CH3ala), 1.17 (t, J = 7.0 Hz, 1.5 H, CH2CH3), 1.16 (t, J = 7.0 Hz, 1.5 H, CH2CH3).

13C NMR (125 MHz, CH3OD): δC 174.82 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 174.62 (C=O), 174.58 (C=O), 174.55 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 157.34 (C6), 157.32 (C6), 153.86 (C2), 153.84 (C2), 150.48 (d, JC-P= 2.5 Hz, C-Ar), 150.44 (C4), 150.22 (d, JC-P= 2.5 Hz, C-Ar), 140.49 (C8), 137.29 (C-Ar), 137.21 (C-Ar), 133.09 (d, J = 7.5 Hz, C-Ar), 132.94 (d, J = 7.5 Hz, CAr), 131.62 (CH-Ar), 131.59 (CH-Ar), 129.58 (CH-Ar), 129.34 (CH-Ar), 129.31 (CH-Ar), 129.28 (CH-Ar), 128.70 (d, J = 5.0 Hz, CH-Ar), 128.69 (d, J = 5.0 Hz, CH-Ar), 126.18 (CH-Ar), 121.02 (d, J = 2.5 Hz, CH-Ar), 120.49 (d, J = 2.5 Hz, CH-Ar), 120.58 (C5), 93.28 (C1’), 93.24 (C1’), 80.32 (d, 3JC-P= 8.7 Hz, C4’), 76.57 (C2’), 68.86 (d, 2JC-P= 5.0 Hz, C5’), 68.53 (d, 2JC-P= 5.0 Hz, C5’), 67.98 (OCH2Ph), 67.95 (OCH2Ph), 61.57 (CH2CH3), 51.76 (CH ala), 51.65 (CH ala), 35.37

4

(CH2CH2), 35.30 (CH2CH2), 35.08 (C3’), 34.85 (C3’), 26.77 (CH2CH2), 26.72 (CH2CH2), 20.55 (d, 3JC-P= 6.2 Hz, CH3ala), 20.33 (d, 3JC-P= 6.2 Hz, CH3ala), 14.53 (CH2CH3).

[0231] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, l = 245 nm, pokazala je jedan pik sa tR 15.99 min.

Uporedni primer: (2S)-benzil 2-(((((2R,3R,5S)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-il)oksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat G

[0232]

[0233] Koristeći opštu proceduru 3 iz prethodnog teksta, 3’-deoksiadenozin (50 mg, 0.20 mmol) je suspendovan u anhidrovanom THF (5 mL) i tBuMgCl (1.0 M rastvor u THF, 0.22 mL, 0.22 mmol) je dodavan u kapima na sobnoj temperaturi. Rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(fenoksi)fosforil)amino)propanoata (212 mg, 0.6 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavan je u kapima i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 8/92) i preparativna TLC (500 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl2= 5/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (6 mg, 5%).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 569.2 (M H<+>), 591.2 (M Na<+>), 1159.4 (2M Na<+>) C26H29N6O7P traženo: (M) 568.2.

31P NMR (202 MHz, CH3OD): δP 2.44 (s), 2.92 (s).

1H NMR (500 MHz, CH3OD): δH 8.41 (s, 0.5 H, H8), 8.28 (s, 0.5 H, H8), 8.19 (s, 0.5H, H2), 8.18 (s, 0.5H, H2), 7.39-7.30 (m, 4H, Ar), 7.28-7.18 (m, 4H, Ar), 7.17-7.11 (m, 1H, Ar), 7.08 7.03 (m, 1H, Ar), 6.23 (d, J = 2.0 Hz, 0.5H, H1’), 6.08 (d, J = 3.4 Hz, 0.5H, H1’), 5.52-5.43 (m, 1H, C2’), 5.19-5.12 (m, 1H, CH2Ph), 5.07-4.95 (m, 1H, CH2Ph), 4.48-4.42 (m, 1H, H4’), 4.05-3.97 (m, 1H, CH ala), 3.95-3.87 (m, 1H, H5’), 3.69-3.61 (m, 1H, H5’), 2.59-2.45 (m, 1H, H3’), 2.31-2.23 (m, 1H, H3’), 1.36-1.27 (m, 3H, CH3ala).

13C NMR (125 MHz, CH3OH): δC 174.76 (d, 3JC-P= 5.0 Hz, C=O), 174.52 (d, 3JC-P= 5.0 Hz, C=O), 157.44 (C6), 153.76 (C2), 151.93 (C4), 150.06 (C-Ar), 149.93 (C-Ar), 141.38 (C8),

4

141.18 (C8), 137.33 (C-Ar), 137.10 (C-Ar), 130.69 (CH-Ar), 130.79 (CH-Ar), 129.61 (CH-Ar), 129.51 (CH-Ar), 129.40 (CH-Ar), 129.30 (CH-Ar), 129.23 (CH-Ar), 126.33 (CHAr), 126.16 (CH-Ar), 121.53 (d, 3JC-P= 4.5 Hz, CH-Ar), 121.20 (d, 3JC-P= 4.5 H, CH-Ar), 120.76 (C5), 91.56 (d, 3JC-P= 7.7 Hz, C1’), 91.45 (d, 3JC-P= 7.7 Hz, C1’), 82.78 (C4’), 82.28 (C4’), 81.83 (d, 2JC-P= 4.7 Hz, C2’), 80.96 (2 x d,<2>JC-P= 4.7 Hz, C2’), 67.95 (OCH2Ph), 67.92 (OCH2Ph), 64.13 (C5’), 63.59 (C5’), 51.88 (CH ala), 51.75 (CH ala), 33.75 (d<3>JC-P= 3.0 Hz, C3’), 33.59 (d, 3JC-P= 3.0 Hz, C3’), 20.33 (d,<3>JC-P= 7.1 CH3ala), 20.18 (d, 3JC-P= 7.1 CH3ala).

[0234] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3OH od 90/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, l = 254 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 22.16 min. i tR 22.43 min.

Uporedni primer: Benzil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-((((1-(benziloksi)-1-oksopropan-2-il)amino)(fenoksi)fosforil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)-amino)propanoat H

[0235]

[0236] Koristeći opštu proceduru 3 iz prethodnog teksta, 3’-deoksiadenozin (50 mg, 0.20 mmol) je suspendovan u anhidrovanom THF (5 mL) i tBuMgCl (1.0 M rastvor u THF, 0.22 mL, 0.22 mmol) je dodavan u kapima na sobnoj temperaturi. Rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(fenoksi)fosforil)amino)propanoata (212 mg, 0.6 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavan je u kapima i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 8/92) i preparativna TLC (500 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (19 mg, prinos = 11%).

MS (ES+) m/z, zabeleženo: 886.3 (M H<+>), 1771.6 (2M H<+>), 751.2 (molekul bez nukleobaze M). C42H45N7O11P2traženo: (M+) 885.3.

31P NMR (202 MHz, CH3OD): δP 3.98, 3.88, 3.59, 3.12, 3.05, 2.45, 2.32.

1H NMR (500 MHz, CH3OD): δH 8.24-8.13 (m, 2H, H8, H2), 7.39-7.08 (m, 20H, Ph), 6.27-6.23 (m, 0.5H, H1’), 6.16-6.13 (m, 0.5H, H1’), 5.61-5.48 (m, 1H, H2’), 5.17-4.91 (m, 4H, CH2Ph), 4.57-4.49 (m, 1H, H4’), 4.41-4.29 (m, 1H, H5’), 4.25-4.15 (m, 1H, H5’), 4.10-4.01 (m, 1H, CH ala), 3.99-3.89 (m, 1H, CH ala), 2.57-2.41 (m, 1H, H3’), 2.28-2.17 (m, 1H, H3’), 1.38-1.23 (m, 6H, CH3ala).

13C NMR (125 MHz, CH3OD): δC 174.88 (C=O), 174.83 (C=O), 174.79 (C=O), 174.73 (C=O), 174.61 (C=O), 174.57 (C=O), 174.53 (C=O), 157.36 (C6), 157.34 (C6), 157.32(C6), 157.29 (C6), 154.04 (C2), 154.01 (C2), 153.97 (C2), 153.94 (C2), 152.09 (C4), 152.04 (C4), 152.02 (C4), 151.97 (C4), 150.31 (C-Ar), 150.29 (C-Ar), 150.16 (C-Ar), 140.98 (C8), 140.91 (C8), 140.81 (C8), 137.31 (C-Ar), 137.28 (C-Ar), 137.22 (C-Ar), 137.09 (C-Ar), 130.86 (CH-Ar), 130.78 (CH-Ar), 130.77 (CH-Ar), 129.65 (CH-Ar), 129.61 (CH-Ar), 129.58 (CH-Ar), 129.55 (CH-Ar), 129.44 (CH-Ar), 129.42 (CH-Ar), 129.38 (CH-Ar), 129.34 (CH-Ar), 129.32 (CH-Ar), 129.30 (CH-Ar), 129.28 (CH-Ar), 129.23 (CH-Ar), 129.21 (CH-Ar), 12.42 (CH-Ar), 126.23 (CH-Ar), 126.20 (CH-Ar), 126.17 (CH-Ar), 121.65 (CH-Ar), 121.63 (CH-Ar), 121.61 (CH-Ar), 121.59 (CH-Ar), 121.52 (CH-Ar), 121.50 (CH-Ar), 121.47 (CH-Ar), 121.46 (CH-Ar), 121.40 (CH-Ar), 121.39 (CH-Ar), 121.36 (CH-Ar), 121.35 (CH-Ar), 121.30 (CH-Ar), 121.28 (CH-Ar), 121.26 (CH-Ar), 121.24 (CH-Ar), 120.61 (C5), 120.57 (C5), 120.56 (C5), 120.54 (C5), 91.56 (C1’), 91.51 (C1’), 91.45 (C1’), 91.25 (C1’), 91.20 (C1’), 81.84 (C2’), 81.82 (C2’), 81.79 (C2’), 81.27 (C2’), 81.22 (C2’), 81.18 (C2’), 80.49 (C4’), 80.43 (C4’), 80.06 (C4’), 79.99 (C4’), 68.29 (C5’, OCH2Ph), 68.25 (C5’, OCH2Ph), 68.00 (C5’, OCH2Ph), 67.96 (C5’, OCH2Ph), 67.94 (C5’, OCH2Ph), 67.90 (C5’, OCH2Ph), 67.71 (C5’, OCH2Ph), 67.67 (C5’, OCH2Ph), 51.91 (CH ala), 51.74 (CH ala), 51.70 (CH ala), 51.59 (CH ala), 34.22 (C3’), 34.20 (C3’), 34.16 (C3’), 33.97 (C3’), 33.94 (C3’), 33.91 (C3’), 20.44 (CH3ala), 20.43 (CH3ala), 20.39 (CH3ala), 20.29 (CH3ala), 20.27 (CH3ala), 20.24 (CH3ala), 20.21 (CH3ala), 20.19 (CH3ala).

[0237] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, l = 254 nm, pokazala je jedan širok pik sa tR 15.97 min.

Uporedni primer: (2S)-benzil 2-(((((2R,3R,5S)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-il)oksi)(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)propanoat I

[0238]

1

[0239] Koristeći opštu proceduru 3 koja je prethodno izložena u tekstu, 3’-deoksiadenozin (50 mg, 0.20 mmol) je suspendovan u anhidrovanom THF (5 mL) i tBuMgCl (1.0 M rastvor u THF, 0.3 mL, 0.3 mmol) je dodavan u kapima na sobnoj temperaturi. Rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)propanoata (323 mg, 0.8 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavan je u kapima i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (500 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (14 mg, 11 %).

(ES+) m/z, zabeleženo: 619.2 (M H<+>), 641.2 (M Na<+>), 1259.4 (2M Na<+>). C30H31N6O7P traženo: (M) 618.20.

31P NMR (202 MHz, CH3OD): δP 3.27 (s), 2.75 (s).

1H NMR (500 MHz, CH3OD): δH 8.37 (s, 1H, H8), 8.18 (s, 1H, H8), 8.14 (s, 1H, H2), 8.13 8.11 (m, 0.5 H, Nap) 8.11 (s, 1H, H2), 7.94-7.90 (m, 0.5 H, Ar), 7.90-7.87 (m, 0.5 H, Ar), 7.86 7.82 (m, 0.5 H, Ar), 7.74-7.70 (m, 0.5 H, Ar), 7.66-7.61 (m, 0.5 H, Ar), 7.57-7.47 (m, 1.5 H, Ar), 7.46-7.37 (m, 2.5 H, Ar), 7.34-7.27 (m, 4 H, Ar), 7.25-7.17 (m, 1 H, Ar), 6.19 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H, H1’), 6.04 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H, H1’), 5.60-5.54 (m, 0.5H, H2’), 5.50-5.42 (m, 0.5H, H2’), 5.16-4.99 (m, 2H, OCH2Ph), 4.46-4.40 (m, 0.5H, H4’), 4.36-4.30 (m, 0.5H, H4’), 4.13-4.04 (m, 1H, CH ala), 3.90-3.83 (m, 1H, H5’), 3.64-3.56 (m, 1H, H5’), 2.61-2.54 (m, 0.5H, H3’), 2.49 2.41 (m, 0.5H, H3’), 2.35-2.27 (m, 0.5H, H3’), 2.22-2.16 (m, 0.5H, H3’), 1.35-1.24 (m, 3H, CH3ala).

13C NMR (125 MHz, CH3OH): δC 174.52 (C=O), 174.49 (C=O), 157.27 (C6), 153.58 (C2), 149.97 (C4), 149.93 (C-4), 147.70 (d, 3JC-P= 7.5, ’ipso’ Nap), 147.48 (d, 3JC-P= 7.5, ’ipso’ Nap), 141.36 (C8), 141.19 (C8), 137.25 (C-Ar), 137.05 (C-Ar), 136.31 (C-Ar), 136.20 (C-Ar), 129.58 (CH-Ar), 129.48 (CH-Ar), 129.37 (CH-Ar), 129.26 (CH-Ar), 129.22 (CHAr), 128.88 (CH-Ar), 127.84 (CH-Ar), 127.75 (CH-Ar), 127.49 (CH-Ar), 127.44 (CH-Ar), 126.48 (CH-Ar), 126.39

2

(CHAr), 126.26 (CH-Ar), 126.05 (CH-Ar), 122.76 (CH-Ar), 122.38 (CH-Ar), 120.68 (C5), 120.61 (C5), 116.64 (d, 3JC-P= 3.75 Hz, CH-Ar), 116.13 (d, 3JC-P= 3.75, CH-Ar), 91.60 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, C1’), 91.43 (d,<3>JC-P= 7.5 Hz, C1’), 82.74 (C4’), 82.27 (C4’), 81.99 (d, 2JC-P= 5.5 Hz, C2’), 81.12 (d,<2>JC-P= 5.5 Hz, C2’), 67.97 (OCH2Ph), 67.94 (OCH2Ph), 64.16 (C5’), 63.51 (C5’), 51.96 (CH ala), 51.89 (CH ala), 33.89 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, CH3ala), 33.63 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, CH3ala).

[0240] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, l = 200 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 24.84 min. i tR 25.43 min.

Uporedni primer: Benzil 2-[({[5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksioksolan-2-il]metoksi}({[1-(benziloksi)-1-oksopropan-2-il]amino})fosforil)amino]propanoat J [0241]

[0242] Koristeći opštu proceduru 2 koja je prethodno izložena u tekstu, 3’-deoksiadenozin (200 mg, 0.80 mmol) je suspendovan u (CH3)3PO3(5 mL) i POCl3(75µL, 0.80 mmol) je dodavan u kapima na -5 °C. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu i da se meša 4 sata. Rastvor (S)-1-(benziloksi)-1-oksopropan-2-aminijum 4-metilbenzenesulfonata (1.4 g, 4.0 mmol) rastvoren u anhidrovanom CH2Cl2(5 mL) je dodat a nakon njega diizopropil etil amin (1.4 mL, 8.0 mmol) na -78 °C. Nakon mešanja na sobnoj temperaturi u toku 20 sati, dodata je voda i slojevi su razdvojeni. Vodena faza je ekstrahovana dihlorometanom a organska faza je oprana fiziološkim rastvorom. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je prečiščen hromatografijom na koloni (elucija gradijentom CH2Cl2/MeOH=100/0 do 93/7) kako bi dala belu penu (256 mg, 49%).

[0243] MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 654.2 (M H<+>), 676.2 (M Na<+>), 1329.5 (2M Na<+>) C30H36N7O8P traženo: (M) 653.62.

31P NMR (202 MHz, CH3OD) δ 13.9.

1H NMR (500 MHz, CH3OD) δ 8.28 (s, 1H, H8), 8.22 (s, 1H, H2), 7.37-7.26 (m, 10H, Ph), 6.00 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H1’), 5.15-5.05 (m, 4H, OCH2Ph), 4.74-4.70 (m, 1H, H2’), 4.63-4.56 (m, 1H, H4’), 4.24-4.18 (m, 1H, H5’), 4.11-4.05 (m, 1H, H5’), 3.97-3.87 (m, 1H, CH ala), 2.35-2.27 (m, 1H, H3’), 2.07-2.01 (m, 1H, H3’), 1.34-1.27 (m, 3H, CH3ala).

13C NMR (125 MHz, CH3OD) δ 175.40 (d, 3JC-P= 5.0 Hz, C=O), 175.36 (d, 3JC-P= 5.0 Hz, C=O), 157.36 (C6), 153.91 (C2), 150.25 (C4), 140.64 (C8), 137.33 (C-Ar), 137.29 (C-Ar), 129.58 (CH-Ar), 129.57 (CH-Ar), 129.33 (CH-Ar), 129.31 (CH-Ar), 129.29 (CH-Ar), 120.55 (C5), 93.18 (C1’), 80.67 (d,<3>JC-P= 8.4 Hz, C4’), 76.59 (C2’), 67.90 (OCH2Ph), 67.47 (d, 2JC-P= 5.2 Hz, C5’), 51.14 (d,<2>JC-P= 1.7 Hz, CH ala), 51.11 (d, 2JC-P= 1.7 Hz, CH ala), 35.08 (C3’), 20.77 (d, 3JC-P= 6.5 Hz, CH3ala), 20.59 (d, 3JC-P= 6.5 Hz, CH3ala).

[0244] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 90/10 do 0/100 za 30 minuta, 1ml/min, l = 254 nm, pokazala je jedan pik sa tR 13.87 min.

Uporedni primer: (2S)-benzil 2-((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-2-metoksi-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(naftalen-1-iloksi)fosforilamino)propanoat K [0245]

[0246] Koristeći opštu proceduru 1 koja je prethodno izložena u tekstu, N-metilimidazol (99 µL, 1.24 mmol) i rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(naftalen-1-iloksi)fosforil)amino)propanoata (303 mg, 0.75 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL) dodavani su u kapima suspenziji 2-O-metil-3’-deoksiadenozina (70 mg, 0.25 mmol) u anhidrovanom THF (10 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (96 mg, 60%).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 649.2 (M H<+>) C31H33N6O8P traženo: 648.21(M). 31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 4.38 (s), 4.08 (s). 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.14-8.11 (d, J = 8.0Hz, 0.5H, Ar), 8.07 (d, J = 8.0Hz, 0.5H, Ar), 8.05 (s, 0.5H, H8), 8.02 (s, 0.5H, H8), 7.82-7.80 (m, 1H, Ar), 7.61 (d, J = 7.0Hz, Ar), 7.47-7.44 (m, 4H, Ar), 7.35-7.29 (m, 2H, Ar), 7.24-7.22 (m, 3H, Ar), 5.88 (s, 1H, H1’), 4.71-4.68 (m, 1H, H4’), 4.65-6.60 (m, 1H, H2’), 4.42-4.40 (m, 1H, H5’), 4.30-4.27 (m, 1H, H5’), 4.08-3.98 (m, 1H, CH ala) 3.88 (s, 1.5H, OCH3), 3.86 (s, 1.5H, OCH3), 2.37-2.33 (m, 1H, H3’), 2.04-2.01 (m, 1H, H3’), 1.27 (d J = 7.0 Hz, 1.5H, CH3), 1.24 (d

4

J = 7.0 Hz, 1.5H, CH3). 13C NMR (125 MHz, CH3OD): δC 174.83 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 174.60 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 163.70 (C-2), 158.10 (C6), 151.95 (C4), 147.95 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, ’ipso’ Nap), 147.91, (d,<3>JC-P= 7.5 Hz, ’ipso’ Nap), 139.39 (C8), 139.37 (C8), 137.12, 137.17 (C-ipso CH2Ph), 136.22 (C-Ar), 129.57, 129.54, 129.48, 129.32, 129.27, 129.12, 129.24 128.89, 128.83, (CH-Ar), 127.85 (d, 2JC-P= 6.25 Hz, C-Ar), 127.86, 127.76, 127.51, 127.48, 126.49, 126.00, 125.97, 122.73, 122.63 (CH-Ar), 116.86 (C5), 116.72 (C5), 116.29 (d, 3JC-P= 3.75 Hz, CH-Ar), 116.22 (d, 3JC-P= 3.75 Hz, CH-Ar), 93.33 (C1’), 93.31(C1’), 80.24 (d, 3JC-P= 2.75 Hz, C4’), 76.29 (C2’), 76.26 (C2’), 69.09 (d,<2>JC-P= 5.0 Hz, C5’), 68.16 (d, 2JC-P= 8.2 Hz, 67.95 (OCH2Ph), 55.28, 55.32 (OCH3), 51.79 (CH ala), 51.71 (CH ala), 35.40 (C-3’), 35.12 (C3’), 20.49 (d,<3>JC-P= 6.7 Hz, CH3ala), 20.35 (d 3JC-P= 6.7, CH3ala). HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, F =1ml/min, λ = 280 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 16.22 min. i tR 16.48 min.

Uporedni primer: (2S)-benzil 2-((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-2-metoksi-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(naftalen-1-iloksi)fosforilamino)propanoat L [0247]

[0248] Koristeći opštu proceduru 1 koja je prethodno izložena u tekstu, N-metilimidazol (99 µL, 1.24 mmol) i rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(fenoksi)fosforil)amino)propanoata (264 mg, 0.75 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavani su u kapima suspenziji 2-O-metil-3’-deoksiadenozina (70 mg, 0.25 mmol) u anhidrovanom THF i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (13 mg, 10%).

(ES+) m/z, zabeleženo: 599.2 (M H<+>), C27H31N6O8P traženo: 598.19 (M).

31P NMR (202 MHz, CD3OD) δ 3.97, 3.64.1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.06 (s, 0.5H, H8), 8.04 (s, 0.5H, H8), 7.33-7.28 (m, 7H, Ph), 7.20-7.14 (m, 3H, Ph), 5.92 (d, J = 1.5 Hz, 0.5H, H1’), 5.90 (d, J = 1.5 Hz, 0.5H, H1’), 5.14-5.04 (m, 2H, OCH2Ph), 4.78-4.76 (m, 0.5H, H4’), 4.74 4.72 (m, 0.5H, H4’), 4.63-4.59 (m, 1H, H2’), 4.10-4.34 (m, 1H, H5’a), 4.25-4.20 (m, 1H, H5’b), 3.94, 3.95 (OCH3), 3.99-3.90 (m, 1H, CH ala), 2.40-2.37 (m, 1H, H3’), 2.07-2.04 (m, 1H, H3’), 1.31 (d J = 7.0 Hz, CH3), 1.26 (d, J = 7.0 Hz, CH3).13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 174.82 (d, 3J 3

C-P= 3.7 Hz, C=O), 174.62 (d, JC-P= 3.7 Hz, C=O), 163.80 (C-2), 158.16, 158.13 (C6), 152.15 (C4), 152.05 (d, 3JC-P= 4.8 Hz, C-ipso Ph), 152.00 (d, 3JC-P= 4.8 Hz, C-ipso Ph), 139.39 (C8), 137.30, 137.21 (C-ipso CH2Ph), 130.72, 129.57, 129.31,129.27, 126.122 (CHAr), 121.42 (d, JC-P = 4.5 Hz, CH-Ar), 121.37 (d, JC-P = 4.5 Hz, CH-Ar), 116.72 (C5), 116.69 (C5), 93.33, 93.24 (C1’), 80.26 (d,<3>JC-P= 8.87, C4’), 80.19 (d, 3JC-P= 8.87, C4’), 76.35 (C2’), 68.78 (d, 2JC-P= 5.0 Hz, C5’), 68.35 (d,<2>JC-P= 5.0 Hz, C5’), 67.94 (OCH2Ph), 67.92 (OCH2Ph), 55.25, 55.28 (OCH3), 51.69, 51.57 (CH ala), 35.23 (C3’), 34.96 (C3’), 20.38 (d, 3JC-P= 6.7, CH3ala), 20.26 (d, 3JC-P= 6.7, CH3ala). HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, F =1ml/min, λ = 280 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 14.22 min. i tR 14.51 min.

Uporedni primer: 2-O-metil-3’-deoksiadenozin-5’-O-[1-naftil(1-pentiloksi-L-leucinil)] fosfat M

[0249]

[0250] Jedinjenje M je pripremljeno u skladu sa opštom procedurom 1 koristeći 2-O-metil-3’-deoksiadenozin (70 mg, 0.25 mmol), N-metilimidazol (99 µL, 1.24 mmol) i naftil(pentiloksi-L-leucinil) fosfohloridat (330 mg, 0,75 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (2000 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl27/93) dali su jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste supstance (50 mg, 30%).

31P NMR (202 MHz, CD3OD) δP 4.53, 4.28.

1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH 8.04-7.96 (m, 1H, H8), 7.77-7.71 (m, 1H, Nap), 7.58-7.53 (m, 1H, Nap), 7.45-7.17 (m, 5H, Nap), 5.83-5.75 (m, 1H, H1’), 4.64-4.51 (m, 2H, H2’, H4’), 4.40-4.16 (m, 2H, H5’), 3.88-3.75 (m, 6H, OCH3, O(CH2)4CH3, CHCH2CH(CH3)2), 2.38-2.24 (m, 1H, H3’), 2.00-1.91 (m, 1H, H3’), 1.53-1.05 (m, 11H, O(CH2)4CH3, CHCH2CH(CH3)2), 0.77-0.55 (m, 9H, O(CH2)4CH3, CHCH2CH(CH3)2).

13C NMR (125 MHz, CD3OD) δC 175.02 (d, 3JC-P= 2.5 Hz, C=O), 174.78 (d, 3JC-P= 2.5 Hz, C=O), 163.76 (C2), 158.14 (C6), 151.03 (C4), 147.96 (d, 3JC-P= 7.2, ’ipso’ Nap), 138.96 (C8), 136.30 (C-Ar), 136.28 (C-Ar), 136.22 (C-Ar), 128.93 (CH-Ar), 128.88 (CH-Ar), 128.81 (CHAr), 128.48 (CH-Ar), 127.77 (CH-Ar), 127.73 (CH-Ar), 127.44 (CH-Ar), 127.42 (CH-Ar), 127.06 (CH-Ar), 126.86 (CH-Ar), 126.45 (CH-Ar), 126.44 (CH-Ar), 126.31 (CH-Ar), 125.98 (CH-Ar), 125.88 (CH-Ar), 123.83 (CH-Ar), 123.43 (CH-Ar), 123.24 (CH-Ar), 122.81 (CH-Ar), 122.77 (CH-Ar), 122.69 (CH-Ar), 116.34 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, CH-Ar), 116.02 (d, 3JC-P= 3.7 Hz,

(CHCH2CH(CH3)2), 54.68 (CHCH2CH(CH3)2), 44.20 (d, 3JC-P= 7.25 Hz, CHCH2CH(CH3)2), 43.93 (d, 3JC-P= 7.25 Hz, CHCH2CH(CH3)2), 35.49 (C3’), 35.17 (C3’), 29.31 (O(CH2)4CH3), 29.11 (O(CH2)4CH3), 25.67 (CHCH2CH(CH3)2), 25.44 (CHCH2CH(CH3)2), 23.30 (O(CH2)4CH3), 23.10 (CHCH2CH(CH3)2), 23.00 (CHCH2CH(CH3)2), 22.94 (CHCH2CH(CH3)2), 22.81 (CHCH2CH(CH3)2), 14.27 (O(CH2)4CH3).

(ES+) m/z, zabeleženo: 671.3 (M H<+>), C32H43N6O8P traženo: 670.69 (M).

[0251] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1 ml/min, l = 254 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 20.83 min. i tR 20.93 min.

Uporedni primer: 2-O-metil-3’-deoksiadenozin-5’-O-[fenil(1-heksiloksi-L-alaninil)] fosfat N

[0252]

[0253] Jedinjenje N je pripremljeno u skladu sa opštom procedurom 1 koristeći 2-O-metil-3’-deoksiadenozin (70 mg, 0.25 mmol), N-metilimidazol (99 µL, 1.24 mmol) i fenil(heksiloksi-L-alaninil) fosfohloridat (261 mg, 0.75 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (gradijent sistema eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (1000 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl27/93) dali su jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste supstance (26 mg, 18%).

31P NMR (202 MHz, CD3OD) δP 3.87, 3.65.

1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH 8.08 (s, 0.5H, H8), 8.07 (s, 0.5H, H8), 7.36-7.29 (m, 2H, Ph), 7.24-7.14 (m, 3H, Ph), 5.94 (d, J = 2.0 Hz, 0.5H, H1’), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 0.5H, H1’), 4.81-4.76 (m, 1H, H2’), 4.71-4.62 (m, 1H, H4’), 4.48-4.43 (m, 0.5H, H5’), 4.42-4.36 (m, 0.5H, H5’), 4.33 4.25 (m, 1H, H5’), 4.10-3.83 (m, 6H, OCH3, O(CH2)5CH3, CHCH3), 2.48-2.40 (m, 1H, H3’), 2.13-2.07 (m, 1H, H3’), 1.61-1.51 (m, 2H, O(CH2)5CH3), 1.33-1.24 (m, 9H, O(CH2)5CH3, CHCH3), 0.89 (m, 3H, O(CH2)5CH3).

13C NMR (125 MHz, CD3OD) δC 175.13 (d, 3JC-P= 4.3 Hz, C=O), 174.94 (d, 3JC-P= 4.3 Hz, C=O), 163.80 (C2), 163.78 (C2), 158.17 (C6), 158.15 (C6), 152.17 (d, 2JC-P= 6.3 Hz, C-Ar), 152.15 (d, 2JC-P= 6.3 Hz, C-Ar), 152.03 (C4), 151.99 (C4), 139.42 (C8), 139.39 (C8), 130.75 (CH-Ar), 130.74 (CH-Ar), 126.13 (CH-Ar), 121.43 (CH-Ar), 121.41 (CH-Ar), 121.39 (CH-Ar), 121.37 (CH-Ar), 116.74 (C5), 116.69 (C5), 93.40 (C1’), 93.27 (C1’), 80.30 (C4’), 80.23 (C4’), 76.40 (C2’), 68.85 (d,<2>JC-P= 5.2 Hz, C5’), 68.42 (d, 2JC-P= 5.2 Hz, C5’), 66.43 (O(CH2)5CH3), 55.30 (OCH3), 55.26 (OCH3), 51.64 (CHCH3), 51.54 (CHCH3), 35.30 (C3’), 35.04 (C3’), 32.58 (O(CH2)5CH3), 29.67 (O(CH2)5CH3), 29.64 (O(CH2)5CH3), 26.61 (O(CH2)5CH3), 23.59 (O(CH2)5CH3), 20.56 (d, 3JC-P= 6.4 Hz, CHCH3), 20.41 (d, 3JC-P= 6.4 Hz, CHCH3), 14.36 (O(CH2)5CH3).

(ES+) m/z, zabeleženo: 593.3 (M H<+>), C32H43N6O8P traženo: 592.58 (M).

[0254] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1 ml/min, l = 254 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 17.02 min. i tR 17.23 min.

Uporedni primer: 2-fluoro-3’-deoksiadenozin-5’-O-[1-naftil(benziloksi-L-alaninil)] fosfat O [0255]

[0256] Jedinjenje O je pripremljeno u skladu sa opštom procedurom 1 koristeći 2-fluoro-3’-deoksiadenozin (50 mg, 0.18 mmol), N-metilimidazol (74 µL, 0.93 mmol) i fenil(benziloksi-L-alaninil) fosfohloridat (196 mg, 0.56 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (gradijent sistema eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (500 µM, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste supstance (5 mg, 4%).

31P NMR (202 MHz, CD3OD) δP 4.33, 4.08.

1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH 8.17 (s, 0.5H, H8), 8.14 (s, 0.5H, H8), 8.14-8.09 (m, 1H, Ar), 7.89-7.85 (m, 1H, Ar), 7.70-7.66 (m, 1H, Ar), 7.54-7.42 (m, 4H, Ar), 7.40-7.24 (m, 5H, Ar), 5.89 (d, J = 2.3 Hz, 0.5H, H1’), 5.88 (d, J = 2.3 Hz, 0.5H, H1’), 5.08-5.01 (m, 2H, OCH2Ph), 4.70-4.60 (m, 2H, H2’, C4’), 4.46-4.39 (m, 1H, C5’), 4.32-4.24 (m, 1H, C5’), 4.09-3.97 (m, 1H, CHCH3), 2.36-2.25 (m, 1H, H3’), 2.06-1.98 (m, 1H, H3’), 1.32-1.25 (m, 3H, CHCH3).

13C NMR (125 MHz, CD3OD) δC 175.54 (CO), 175.22 (CO), 161.02 (d, 1JC-F= 207.3 Hz, C2), 160.89 (d, 1JC-F= 207.3 Hz, C2), 158.45 (d, 3JC-F= 18.2 Hz, C6), 158.23 (d, 3JC-F= 18.2 Hz, C6), 150.63 (d, 3JC-F= 18.4 Hz, C4), 140.67 (C8), 136.26 (C-Ar), 131.62, 131.54, 129.56 (CH-Ar), 129.52 (CH-Ar), 129.37 (CH-Ar), 129.31 (CH-Ar), 129.26 (CH-Ar), 128.87 (CH-Ar), 128.81 (CH-Ar), 128.29 (CH-Ar), 128.02 (CH-Ar), 127.79 (CH-Ar), 127.76 (CH-Ar), 127.51 (CH-Ar), 127.49 (CH-Ar), 127.47 (CH-Ar), 126.47 (CH-Ar), 126.33 (C-Ar), 126.27 (C-Ar), 125.97 (CH-Ar), 122.78 (CH-Ar), 122.74 (CH-Ar), 122.64 (CH-Ar), 122.62 (CH-Ar), 116.35 (d, 4JC-F= 3.0 Hz, C5), 116.15 (d, 4JC-F= 3.0 Hz, C5), 93.25 (C1’), 93.20 (C1’), 80.41 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, C4’), 80.33 (d,<3>JC-P= 7.5 Hz, C4’), 76.43 (C2’), 76.35 (C2’), 68.84 (d, 2JC-P= 5.5 Hz, C5’), 68.45 (d, 2JC-P= 5.5 Hz, C5’), 67.92 (OCH2Ph), 67.92 (OCH2Ph), 51.75 (CHCH3), 51.52 (CHCH3), 34.97 (C3’), 34.74 (C3’), 20.42 (d, 3JC-P= 6.7 Hz, CHCH3), 20.20 (d, 3JC-P= 6.7 Hz, CHCH3).

19F NMR (470 MHz, CD3OD) δF -53.14, -53.22.

(ES+) m/z, zabeleženo: 637.2 (M H<+>), C30H30FN6O7P traženo: 636.57 (M).

[0257] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1 ml/min, l = 254 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 17.09 min. i tR 17.34 min.

Uporedni primer: (2S)-benzil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-2-fluoro-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat P

[0258]

[0259] Koristeći opštu proceduru 1 koja je prethodno izložena u tekstu, N-metilimidazol (74 µL, 0.93 mmol) i rastvor (2S)-benzil 2-((hloro(fenoksi)fosforil)amino)propanoata (196 mg, 0.56 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavani su u kapima suspenziji 2-fluoro-3’-deoksiadenozina (50 mg, 0.18 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (5 mg, 7%).

(ES+) m/z, zabeleženo: 587.1 (M H<+>), C26H28FN6O7P traženo: 586.17 (M). 19F NMR (470 MHz, CD3OD): δF -53.17, -53.23. 31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 3.95 (s), 3.67 (s). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 8.19 (s, 0.5H, H8), 8.16 (s, 0.5H, H8), 7.36-7.27 (m, 7H, Ar), 7.22-7.13 (m, 3H, Ar), 5.91 (d, J = 1.5 Hz, 0.5H, H1’), 5.89 (d, J = 1.7 Hz, 0.5H, H1’), 5.15-5.06 (m, 2H, OCH2Ph), 4.73-4.58 (m, 2H, H2’, H4’), 4.42-4.34 (m, 1H, H5’), 4.02-3.90 (m, 1H, H5’), 3.27-3.24 (m, 1H, H3’), 2.08-2.00 (m, 1H, H3’), 1.33 (d, J = 7.1 Hz, 1.5H, CH3ala), 1.29 (d, J = 7.1 Hz, 1.5H, CH 13

3ala). C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 175.85 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 174.63 (d, 3JC-P= 5.0 Hz, C=O), 160.58 (d, 1JC-F= 207.5 Hz, C2), 160.53 (d, 1JC-F= 207.5 Hz, C2), 159.06 (d, 3JC-F= 18.7 Hz, C6), 159.05 (d, 3JC-F= 17.5 Hz, C6), 152.11 (d, 2JC-P= 8.75 Hz, CAr), 152.08 (d, 2JC-P= 8.7 Hz, C-Ar), 151.58 (d, 3J 3

C-F= 19.7 Hz, C4), 151.56 (d, JC-F= 19.5 Hz, C4), 140.63 (C8), 137.28 (C-Ar), 137.21 (C-Ar), 130.78 (CH-Ar), 130.75 (CH-Ar), 129.58 (CH-Ar), 129.38 (CH-Ar), 129.34 (CH-Ar), 129.32 (CH-Ar), 129.28 (CH-Ar), 128.3 (CH-Ar), 128.02 (CH-Ar), 121.16 (CH-Ar), 121.18 (CH-Ar), 121.47 (CH-Ar), 121.51 (CH-Ar), 121.42 (CH-Ar), 121.39 (CH-Ar), 121.36 (CH-Ar), 118.75 (d, 4JC-F= 3.7 Hz, C5), 118.72 (d, 4JC-F= 3.7 Hz, C5), 93.25 (C1’), 93.18 (C1’), 80.48 (d,<3>JC-P= 8.3 Hz, C4’), 80.46 (d, 3JC-P= 8.1 Hz, C4’), 76.51 (C2’), 76.49 (C2’), 68.54 (d,<2>JC-P= 5.2 Hz, C5’), 68.18 (d, 2JC-P= 5.6 Hz, C5’), 67.94 (CH2Bn), 67.91 (CH2Bn), 51.71 (CH ala), 51.56 (CH ala), 34.85 (C3’), 34.64 (C3’), 20.42 (d, 3JC-P= 7.1 Hz, CH3ala), 20.25 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, CH3ala). HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1 ml/min, l = 280 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 14.98 min. i tR 15.12 min.

Uporedni primer: 2-fluoro-3’-deoksiadenozin-5’-O-[1-naftil(1-pentiloksi-L-leucinil)] fosfat Q

[0260]

[0261] Jedinjenje Q je pripremljeno u skladu sa opštom procedurom 1, koristeći 2-fluoro-3’-deoksiadenozin (50 mg, 0.18 mmol), N-metilimidazol (74 µL, 0.93 mmol) i naftil(pentiloksi-L leucinil) fosfohloridat (246 mg, 0.56 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (1000 µm, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su title jedinjenje u vidu bele čvrste supstance(65 mg, 53%).

31P NMR (202 MHz, CD3OD): 4.60, 4.35.

1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.23 (s, 0.5H, H8), 8.20 (s, 0.5H, H8), 8.18-8.12 (m, 1H, Ar), 7.92-7.86 (m, 1H, Ar), 7.73-7.68 (m, 1H, Ar), 7.57-7.46 (m, 3H, Ar), 7.42-7.36 (m, 1H, Ar), 5.93-5.91 (m, 1H, H1’), 4.74-4.62 (m, 2H, H2’, H4’), 4.55-4.50 (m, 0.5H, H5’), 4.49-4.44 (m, 0.5H, H5’), 4.43-4.37 (m, 0.5H, H5’), 4.36-4.31 (m, 0.5H, H5’), 4.02-3.86 (m, 3H, CHCH2CH(CH3)2, O(CH2)4CH3), 2.43-2.29 (m, 1H, H3’), 2.12-2.04 (m, 1H, H3’), 1.67-1.20 (m, 11H, O(CH2)4CH3, CHCH2CH(CH3)2), 0.89-0.67 (m, 9H, O(CH2)4CH3, CHCH2CH(CH3)2) 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 175.03 (d, 3JC-P= 2.5 Hz, C=O), 174.93 (d, 3JC-P= 2.5 Hz, C=O), 161.45 (d, 1JC-F= 205.5 Hz, C2), 160.39 (d, 1JC-F= 205.5 Hz, C2), 158.33 (C6), 151.60 (C4), 147.92 (C-Ar), 140.69 (C8), 136.30 (C-Ar), 128.88 (CH-Ar), 128.83 (CH-Ar), 127.80 (CH-Ar), 127.76 (CH-Ar), 127.49 (CH-Ar), 127.46 (CH-Ar), 126.48 (CH-Ar), 126.45 (CH-Ar), 126.02 (CH-Ar), 125.91 (CH-Ar), 123.03 (C-Ar), 122.81 (CH-Ar), 122.69 (CH-Ar), 116.39 (d, 3JC-P= 2.9 Hz, CH-Ar), 116.28 (C5), 116.26 (C5), 115.97 (d, 3JC-P= 2.9 Hz, CH-Ar), 93.29 (C1’), 93.23 (C1’), 80.45 (d,<3>JC-P= 6.0 Hz, 80.38 (d, 3JC-P= 6.0 Hz, C4’), 76.45 (C2’), 76.41 (C2’), 68.99 (d,<2>JC-P= 5.4 Hz, C5’), 68.78 (d, 2JC-P= 5.4 Hz, C5’), 66.31 (O(CH2)4CH3), 66.29 (O(CH2)4CH3), 54.78 (CHCH2CH(CH3)2), 54.66 (CHCH2CH(CH3)2), 44.16 (d, 3JC-P= 7.25 Hz, CHCH 3

2CH(CH3)2), 43.84 (d, JC-P= 7.3 Hz, CHCH2CH(CH3)2), 35.09 (C3’), 34.79 (C3’), 29.31 (O(CH2)4CH3), 29.12 (O(CH2)4CH3), 25.65 (CHCH2CH(CH3)2), 25.41 (CHCH2CH(CH3)2), 23.33 (O(CH2)4CH3), 23.11 (CHCH2CH(CH3)2), 23.00 (CHCH2CH(CH3)2), 21.95 (CHCH2CH(CH3)2), 21.68 (CHCH2CH(CH3)2), 14.29 (O(CH2)4CH3).

19F NMR (470 MHz, CD3OD): δF -53.15, -53.20.

(ES+) m/z, zabeleženo: 659.3 (M H<+>), C31H40FN6O7P traženo: 658.66 (M).

[0262] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1 ml/min, 1 = 254 nm, pokazala je jedan pik preklapajućih dijastereoizomera sa tR 21.95 min.

Uporedni primer: (2S)-heksil 2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-2-fluoro-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat R

[0263]

1

[0264] Koristeći opštu proceduru 1 koja je prethodno izložena u tekstu, N-metilimidazol (74 µL, 0.93 mmol) i rastvor (2S)-heksil 2-((hloro(fenoksi)fosforil)amino)propanoata (196 mg, 0.56 mmol) u anhidrovanom THF (2 mL) dodavani su u kapima suspenziji 2-fluoro-3’-deoksiadenozina (50 mg, 0.18 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (5 mg, 7%).

(ES+) m/z, zabeleženo: 587.1 (M H<+>), C26H28FN6O7P traženo: 586.17 (M). 19F NMR (470 MHz, CD3OD): δF -53.15, -53.20.31P NMR (202 MHz, CD3OD): 3.91 (s), 3.73 (s). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 8.21 (s, 0.5H, H8), 8.20 (s, 0.5H, H8), 7.37-7.29 (m, 7H, Ar), 7.26-7.13 (m, 3H, Ar), 5.94-5.91 (m, 1H, H1’), 4.76-4.64 (m, 2H, H2’, H4’), 4.49-4.44 (m, 0.5H, H5’), 4.43 4.37 (m, 0.5H, H5’), 4.33-4.26 (m, 1H, H5’), 4.11-3.99 (m, 2H, CH2Hex), 3.97-3.83 (m, 1H, CH ala), 2.41-2.32 (m, 1H, H3’), 2.13-2.06 (m, 1H, H3’), 1.62-1.52 (m, 2H, CH2Hex), 1.37 1.23 (m, 9H, CH3ala, CH2Hex), 0.92-0.85 (m, 3H, CH3Hex).

13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 175.15 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C=O), 174.96 (d, 3JC-P= 5.0 Hz, C=O), 160.59 (d, 1JC-F= 207.5 Hz, C2), 160.56 (d, 1JC-F= 207.5 Hz, C2), 159.09 (d, 3JC-F= 21.2 Hz, C6), 159.08 (d, 3JC-F= 20.0 Hz, C6), 152.16 (d, 2JC-P= 7.5 Hz, C-Ar), 152.14 (d, 2JC-P= 6.3 Hz, C-Ar), 151.71 (d, 3JC-F= 20.0 Hz, C4), 151.67 (d, 3JC-F= 20.0 Hz, C4), 140.70 (d, 5JC-F= 2.5 Hz, C8), 140.68 (d, 5JC-F= 2.5 Hz, C8), 130.77 (CH-Ar), 130.74 (CH-Ar), 126.16 (CH-Ar), 126.24 (CH-Ar), 121.48 (CH-Ar), 121.44 (CH-Ar), 121.41 (CH-Ar), 121.37 (CH-Ar), 118.80 (d, 4JC-F= 3.7 Hz, C5), 118.77 (d, 4JC-F= 3.7 Hz, C5), 93.37 (C1’), 93.25 (C1’), 80.52 (d, 3JC-P= 3.7 Hz, C4’), 80.45 (d,<3>JC-P= 4.1 Hz, C4’), 76.52 (C2’), 76.49 (C2’), 68.69 (d, 2JC-P= 5.4 Hz, C5’), 68.30 (d, 2JC-P= 4.9 Hz, 66.46 (CH2Hex), 51.68 (CH ala), 51.57 (CH ala), 35.02 (C3’), 34.80 (C3’), 32.58 (CH2Hex), 29.65 (CH2Hex), 26.61 (CH2Hex), 23.59 (CH2Hex), 20.60 (d, 3JC-P= 7.1 Hz, CH3ala), 20.43 (d, 3JC-P= 7.5 Hz, CH3ala), 14.35 (CH3Hex). HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, 1 ml/min, 1 = 280 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 17.83 min. i tR 18.02 min.

Uporedni primer: (2R)-benzil 2-((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-2-hloro-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(naftalen-1-iloksi)fosforilamino) propanoat S

2

[0266] U rastvor 2-hloro-3’-deoksiadenozina (100 mg, 1.0 mol/ekv.) u 10 mL anhidrovanog THF, koji se mešao, dodavano je u kapima 424 mg (2S)-benzil 2-(hloro(naftalen-1-iloksi)fosforilamino)propanoata (3.0 ekv/mol) rastvorenog u 10 mL anhidrovanog THF. Ovoj reakcionoj smeši je dodato 0.14 mL NMI (5 mol/ekv.) u kapima, na sobnoj temperaturi u atmosferi argona. Reakciona smeša je mešana tokom 88 h. Rastvarač je uklonjen pri sniženom pritisku ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa gradijentom eluensa (CH3OH/CH2Cl20/100 do 5/95) kako bi se dobio željeni proizvod u vidu žute čvrste supstance. (7 mg, prinos = 3%). MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 653 (M H<+>), 675 (M Na<+>) C30H30ClN6O7P traženo: 652.16 (M); 31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 4.39 (s), 4.12 (s); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.10 (s, 0.5 H, H8), 8.07 (s, 0.5 H, H8), 8.02-7.97 (m, 3H, CH2Ph i Naph), 7.43-7.14 (m, 9H, CH2Ph i Naph), 5.80-5.81 (m, 1H, H1’), 4.89-4.97 (m, 2H, CH2Ph) 4.49-4.53 (m, 2H, H4’i H2’), 4.30-4.35 (m, 1H, H5’), 4.15-4.21 (m, 1H, H5’), 3.87-3.95 (m, 1H, CHCH3), 2.12-2.23 (m, 1H, H3’), 1.86-1.93 (m, 1H H3’), 1.14-1.17 (m, 3H, CHCH3); 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 174.85 (d JCP= 4.0 Hz, C=O), 174.55 (d JCP= 4.3 Hz, C=O), 158.07, 158.04 (C6), 155.31, 155.28 (C2), 151.34, 151.31 (C4), 149.69 (C-Ar), 147.96 (d 3JCP= 7.25 Hz, C-ipso Naph), 147.90 (d 3JCP= 7.0 Hz, C-ipso Naph), 140.70 (C8), 137.21, 137.16 (C-ipso CH2Ph), 136.26 (C-Ar), 130.92, 130.80, 129.56, 129.53, 129.31, 129.27, 129.25, 128.88, 128.81 (CH-Ar), 127.78 (d JCP= 4.7 Hz, CH-Ar), 127.50 (d JCP= 6.2 Hz, CH-Ar), 126.48, 126.02, 125.97 (CHAr), 119.46, 119.42 (C5), 116.33 (d, JCP= 3.0, CH-Ar), 116.16 (d, JCP= 3.4, CH-Ar), 93.30, 93.27 (C1’), 80.56 (d J = 8.3 Hz, C4’), 80.51 (d J = 8.4 Hz, C4’), 76.61, 76.54 (C2’), 68.74 (d JCP= 5.3 Hz, C5’), 68.54 (d JCP= 5.1 Hz, C5’), 67.93, 67.90 (CH2Ph), 51.81, 51.70 (CHCH3), 34.79, 34.53 (C3’), 20.42 (d JCP= 6.5 Hz, CHCH3), 20.23 (d JCP= 7.7 Hz, CHCH3); HPLC Elucija reversnofazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 90/10 do 0/100 za 30 minuta, F = 1ml/min, 1 = 254 nm, tR 18.03 min.

Uporedni primer: 2-hloro-3’deoksiadenozin 5’-O-[1-fenil (2,2-dimetilpropoksi-L-alanin)] fosfat T

[0267]

[0268] Jedinjenje T je pripremljeno u skladu sa opštom procedurom 1 koristeći 2-hloro-3’-deoksiadenozin (350 mg, 1.25 mmol), N-metilimidazol (490 µL, 6.15 mmol) i fenil(2,2-dimetilpropoksi-L-alaninil) fosfohloridat (1231 mg, 3.69 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 5/95) i preparativna TLC (1000 µL, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl24/96) dali su jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste supstance (181 mg, 25 %).

31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 3.93, 3.72.

1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.12 (s, 0.5 H, H8), 8.10 (s, 0.5 H, H8), 7.19-7.23 (m, 2 H, Ph), 7.03-7.12 (m, 3 H, Ph), 5.84 (d J =2, 0.5 H, H1’), 5.83 (d J =2, 0.5 H, H1’), 4.54-4.60 (m, 2 H, H4’i H2’), 4.34-4.38 (m, 0.5 H, H5’), 4.27-4.31 (m, 0.5 H, H5’), 4.16-4.23 (m, 1 H, H5’), 3.80-3.90 (m, 1 H, CHCH3), 3.57-3.73 (m, 2 H OCH2C(CH3)3), 2.18-2.28 (m, 1 H, H3’), 1.94-1.99 (m, 1 H, H3’), 1.20-1.24 (m, 3 H, CHCH3), 0.81 (s, 4.5 H OCH2(CH3)3), 0.79 (s, 4.5 H OCH2C(CH3)3).

13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 175.09 (d 3JCP = 4.75 Hz, C=O), 174.90 (d 3JCP = 5.37 Hz, C=O), 158.10, (C6), 155.31, 155.28 (C2), 152.14 (d 2JCP= 6.37 Hz, C-ipso Ph), 152.13 (d 2JCP= 6.25 Hz, C-ipso Ph), 151.33, 151.30 (C4), 140.87, 140.76 (C8), 130.78, 130.77 (CH-Ar), 126.17, 126.42 (CH-Ar), 121.45 (d 3JCP= 11.75 Hz, CH-Ar), 121.41 (d 3JCP= 11.75 Hz, CH-Ar), 119.52, 119.48 (C5), 93.49, 93.35 (C1’), 80.67 (d<3>J = 8.62 Hz, C4’), 80.65 (d<3>J = 8.25 Hz, C4’), 76.70, 76.67 (C2’), 75.43, (OCH2C(CH3)3), 68.68 (d 2JCP= 5.12 Hz, C5’), 68.42 (d 2JCP= 5.12 Hz, C5’), 51.77, 51.60 (CHCH3), 34.94, 34.67 (C3’), 32.36, 32.32 (OCH2C(CH3)3), 26.78, 26.76 (OCH2C(CH3)3), 20.83 (d JCP= 6.25 Hz, CHCH3), 20.61 (d JCP= 7.12 Hz, CHCH3).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 583 (M H<+>), 605 (M Na<+>) C24H32ClN6O7P traženo: 582.18 (M).

HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 90/10 do 0/100 za 30 minuta, F = 1ml/min, 1 = 254 nm, tR 16.37, 16.55 min.

Uporedni primer: 2-hloro-3’deoksiadenozin 5’-O-[1-naftill (2,2-dimetilpropoksi-L-alanin)] fosfat U

[0269]

4

[0270] Jedinjenje U je pripremljeno u skladu sa opštom procedurom 1 koristeći 2-hloro-3’-deoksiadenozin (350 mg, 1.25 mmol), N-metilimidazol (490 µL, 6.15 mmol) i naftil(2,2-dimetilpropoksi-L-alaninil) fosfohloridat (1416 mg, 3.69 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 5/95) i preparativna TLC (1000 µm, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl24/96) dali su jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste supstance (264 mg, 34 %).

31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 4.35, 4.20.

1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.23 (s, 0.5 H, H8), 8.21 (s, 0.5 H, H8), 8.11-8.16 (m, 1 H, Naph), 7.86-7.89 (m, 1 H, Naph), 7.69-7.70 (m, 1 H, Naph), 7.54-7.46 (m, 3 H, Naph), 7.37-7.41 (m, 1 H, Naph), 5.95 (d J = 2, 0.5 H, H1’), 5.94 (d J = 1.5, 0.5 H, H1’), 4.67-4.73 (m, 2 H, H4’i H2’), 4.34-4.55 (m, 2 H, H5’), 4.00-4.08 (m, 1 H, CHCH3), 3.66-3.81 (m, 2 H OCH2C(CH3)3), 2.28-2.41 (m, 1 H, H3’), 2.03-2.10 (m, 1 H, H3’), 1.31-1.34 (m, 3 H, CHCH3), 0.90 (s, 4.5 H OCH2C(CH3)3), 0.89 (s, 4.5 H CH2(CH3)3).

13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 175.11 (d JCP= 4.1 Hz, C=O), 174.85 (d JCP= 5.0 Hz, C=O), 158.10, 158.04 (C6), 155.32, 155.30 (C2), 151.33 (C4), 147.96 (d 2JCP= 7.25 Hz, C-ipso Naph), 147.93 (d 2JCP= 7.25 Hz, C-ipso Naph), 140.84, 140.76 (C8), 136.29 (C-Ar), 128.87, 128.82 (CH-Ar), 127.85 (C-Ar), 127.77, 127.74, 127.48, 127.45, 126.47, 125.99, 125.96, 122.74, 122.66 (CH-Ar), 119.47 (C5), 116.29 (d 3J 3

CP= 3.4 Hz, CH-Ar), 116.17 (d JCP= 2.9 Hz, CHAr), 93.42, 93.34 (C1’), 80.57 (d<3>JCP= 8.1 Hz, C4’), 80.53 (d 3JCP= 5.1 Hz, C4’), 76.61, 76.53 (C2’), 75.41, 75.38 (OCH2C(CH3)3), 68.95 (d 2JCP= 5.3 Hz, C5’), 68.82 (d 2JCP= 5.2 Hz, C5’), 51.84, 51.73 (CHCH3), 35.04, 34.75 (C3’), 32.29 (OCH2C(CH3)3), 26.70 (OCH2C(CH3)3), 20.76 (d 3JCP= 6.4 Hz, CHCH3), 20.55 (d 3JCP= 7.2 Hz, CHCH3).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 633 (M H<+>), 655 (M Na<+>) C28H34ClN6O7P traženo: 652.16 (M).

HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 90/10 do 0/100 za 30 minuta, F = 1ml/min, 1 = 254 nm, tR 19.16 min.

Uporedni primer: 2-hloro-3’deoksiadenozin 5’-O-[1-fenil (etoksi-L-alanin)] fosfat V

[0271]

[0272] Jedinjenje V je pripremljeno u skladu sa opštom procedurom 4 koristeći 2-hloro-3’-deoksiadenozin (343 mg, 0.66 mmol), tercbutildimetilsilil hlorid (328 mg 2.18 mmol) imidazol (297 mg, 4.36 mmol). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 12/88) dalo je intermedijer 1 u kvantitativnom prinosu. Sledeće, intermedijer 1 (970 mg, 1.89 mmol) je izložen reakciji sa 12 mL rastvora THF/H2O/TFA 4/1/1. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 12/88) dalo je intermedijer 2 (544 mg, 72 %). Zatim je intermedijer 2 (204 mg, 0.51 mmol) izložen reakciji sa tercbutilmagnezujum hloridom i rastvorom fenil(etiloksi-L-alaninil) fosfohloridata (348.56 mg, 1.02 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL). Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 8/92) dalo je intermedijer 3 (93 mg, 28 %). Konačno, intermedijer 3 (93 mg, 0.14 mmol) je izložen reakciji sa rastvorom THF/TFA/H2O 1/1/1 (3 mL). Prečišćavanje preparativnom TLC (2000 µm, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl24/96) dali su jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste supstance (50 mg, 66 %). (Ukupan prinos 13 %)

31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 3.93, 3.72.

1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.12 (s, 0.5 H, H8), 8.11 (s, 0.5 H, H8), 7.18-7.23 (m, 2 H, Ph), 7.03-7.12 (m, 3 H, Ph), 5.85 (d J=1.5, 0.5 H, H1’), 5.84 (d J =2, 0.5 H, H1’), 4.55-4.62 (m, 2 H, H4’i H2’), 4.34-4.38 (m, 0.5 H, H5’), 4.28-4.32 (m, 0.5 H, H5’), 4.16-4.22 (m, 1 H, H5’), 3.93-4.03 (m, 2 H, OCH2CH3), 3.70-3.84 (m, 1 H, CHCH3), 2.20-2.28 (m, 1 H, H3’), 1.95-1.99 (m, 1 H, H3’), 1.15-1.21 (m, 3 H, CHCH3), 1.06-1.11 (m, 3 H, OCH2CH3).

13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 173.66 (d 3JCP= 4.5 Hz, C=O), 173.65 (d 3JCP= 5.3 Hz, C=O), 156.68, 156.70 (C6), 153.93, 153.88 (C2), 150.72 (d 2JCP= 6.7 Hz, C-ipso Ph), 150.71 (d 2JCP= 6.5 Hz, C-ipso Ph), 149.89, 149.94 (C4), 139.41, 139.35 (C8), 129.33 (CH-Ar), 124.74, 124.73 (CH-Ar), 120.03 (d 3JCP= 4.75 Hz, CH-Ar), 119.97 (d 3JCP= 4.87 Hz, CH-Ar), 118.07, 118.03 (C5), 92.02, 91.88 (C1’), 79.26, 79.19 (C4’), 75.26, 75.24 (C2’), 67.18 (d<2>JCP= 5.25 Hz, C5’), 66.81 (d<2>JCP= 5.12 Hz, C5’), 60.96 (OCH2CH3), 50.23, 50.12 (CHCH3), 33.46, 33.21 (C3’), 19.16 (d<3>JCP= 6.3 Hz, CHCH3), 18.97 (d 3JCP= 7.2 Hz, CHCH3), 13.10, 13.07 (OCH2CH3).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 541 (M H<+>), 563 (M Na<+>) C21H26ClN6O7P traženo: 540 (M). HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 90/10 do 0/100 za 30 minuta, F = 1ml/min, 1 = 254 nm, tR 12.41, 12.83 min.

Uporedni primer: (2S)-izopropil-2-(((((2S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino) propanoat W

[0273]

[0274] N-metilimidazol (240 µL, 5 mmol) i rastvor (2S)-izopropil 2-((hloro(fenoksi)fosforil)amino)propanoata (546 mg, 3 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL) dodavani su u kapima suspenziji (2R,3R,5S)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (150 mg, 0.6 mmol) u anhidrovanom THF (3 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 16 sati. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (sistem eluensa CH3OH/CH2Cl20/100 do 6/94) i preparativna TLC (2000 µm, sistem eluensa CH3OH/CH2Cl25/95) dali su željeno jedinjenje u vidu bele čvrste supstance (40 mg, 13%).

MS (ES+) m/z: Zabeleženo: 521.2 (M H<+>), 543.3 (M Na<+>), 1063.4 (2M Na<+>) C31H33N6O8P traženo: 520.18(M).

31P NMR (202 MHz, CD3OD): δP 3.99 (s), 3.82 (s).

1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.16 (s, 0.5H, H8), 8.15 (s, 0.5H, H8), 8.11 (s, 1H, H-2) 7.23-7.20 (m, 2H, Ph), 7.11-7.03 (m, 3H, Ph), 5.91 (d J = 2.0Hz, 0.5H, H1’), 5.90 (d J = 2.0Hz, 0.5H, H1’), 4.85-4.79 (m, 1H, CH(CH3)2, 4.64-4.63 (m, 1H, H4’), 4.60-6.57 (m, 1H, H2’), 4.37 4.33 (m, 1H, H5’), 4.31-4.28 (m, 1H, H5’), 3.74-4.22-4.17 (m, 1H, H5’), 3.70 (m, 1H, CH ala), 2.02-1.97 (m, 1H, H3’), 2.04-2.01 (m, 1H, H3’), 1.18-1.14 (m, 3H, CH3), 1.24 (m,6H, CH(CH3)2)

[0275] HPLC Elucija reversno-fazne HPLC pomoću H2O/CH3CN od 100/10 do 0/100 za 30 minuta, F =1ml/min, λ = 200 nm, pokazala je dva pika dijastereoizomera sa tR 11.58 min. i tR 11.92 min.

[0276] Rastvarači i reagensi. Sledeći anhidrovani rastvarači kupljeni su od proizvođača Sigma-Aldrich: dihlorometan (CH2Cl2), trimetilfosfat ((CH3O)3PO). Komercijalno dostupni estri aminokiselina kupljeni su od Sigma-Aldrich kompanije. Svi komercijalno dostupni reagensi korišćeni su bez daljeg prečišćavanja.

Tankoslojna hromatografija (TLC).

Prethodno obložene ploče sa aluminijumskom osnovom (60 F254, debljine 0.2 mm, Merck) vizualizovane su pomoću ultraljubičastog svetla kratke i duge talasne dužine (254 i 366 nm) ili gorenjem, koristeći sledeće TLC indikatore: (i) molibdat amonijum cerijum sulfat; (ii) rastvor kalijum permanganata. Preparativne TLC ploče (20 cm x 20 cm, 500-2000 µm) kupljene su od proizvođača Merck. Fleš hromatografija na koloni je izvedena upotrebom silika gela koji je isporučila firma Fisher (60A, 35-70 µm). Staklene kolone su napakovane suspenzijom koristeći odgovarajući eluens pri čemu je uzorak nanet u vidu koncentrovanog rastvora u istom eluensu ili je bio prethodno adsorbovan na silika gelu. Frakcije koje su sadržale proizvod identifikovane su pomoću TLC i spojene, a rastvarač je uklonjen in vacuo.

Tečna hromatografija visoke performanse (HPLC). HPLC analizom je potvrđena čistoća finalnih jedinjenja od >95% , koristeći ili I) ThermoSCIENTIFIC, SPECTRA SYSTEM P4000, detektor SPECTRA SYSTEM UV2000, Varian Pursuit XRs 5 C18, 150 x 4.6 mm (kao analitičku kolonu) ili II) Varian Prostar (LC Workstation-Varian Prostar 335 LC detektor), Thermo SCIENTIFIC Hypersil Gold C18, 5µm, 150 x 4.6 mm (kao analitičku kolonu). Postupak elucije potražiti u eksperimentalnom delu.

Nuklearna magnetna rezonanca (NMR). 1H NMR (500 MHz), 13C NMR (125 MHz), 31P NMR (202 MHz) i 19F NMR (470 MHz) je zabeležena na spektrometru Bruker Avance 500 MHz, na 25 °C. Hemijski pomaci (δ) su navedeni u delovima na milion (ppm) u odnosu na interni MeOH-d4(δ 3.341H-NMR, δ 49.86<13>C-NMR) i CHCl3-d4(δ 7.26<1>H NMR, δ 77.36<13>C NMR) ili eksterni 85 % H3PO4(δ 0.00 31P NMR). Konstante kuplovanja (J) su merene u hercima. Sledeće skraćenice su korišćene pri dodeljivanju NMR signala: s (singlet), d (dublet), t (triplet), q (kvartet), m (multiplet), bs (široki singlet), dd (dvostruki dublet), dt (dvostruki triplet), app (aparentno). Dodeljivanje signala u 1H NMR i 13C NMR obavljeno je na osnovu analize konstanti kuplovanja i dodatnih dvodimanzionanih eksperimenata (COSY, HSQC, HMBC, PENDANT).

Masena spektrometrija (MS). Maseni spektri niske rezolucije dobijeni su na instrumentu Bruker Daltonics microTof-LC, (jonizacija atmosferskim pritiskom, masena spektroskopija elektronskog spreja) ili u pozitivnom ili u negativnom modu.

Čistoća finalnih jedinjenja. Čistoća od ≥95% svih finalnih jedinjenja potvrđena je pomoću HPLC analize.

Primer 2 - Citotoksičnost

[0277] Antikancerski potencijal jedinjenja čiji su primeri dati u primerima izvođenja predmetnog pronalaska, procenjen je u sledećim postupcima.

[0278] In vitro testovi vijabilnosti izvedeni su kako bi se procenilo dejstvo jedinjenja na vijabilnost ćelija u 7 odabranih ćelijskih linija tokom 72 sata koristeći esej CellTiterGlo (CTG, Promega-G7573). Testovi su izvođeni u duplikatima sa tretmanom jedinjenjima u 9 tačaka, titracijom od 3.16 puta u pločama sa 96 bunarčića tokom ~72 sata. Početne koncentracije jedinjenja su bile 198 mM. Test ćelijske vijabilnosti je izveden upotrebom CellTiterGlo u pločama sa 96 bunarčića. Tretman jedinjenjem trajao je 72 sata, pod standardnim uslovima rasta, i u duplikatu. Jedinjenja su rastvarana do koncentracije od 40mM otopljenim 100%. Jedinjenja su serijski razblažena 3.16 puta u otopljenom DMSO, i zagrejana na 37°C pre nego što su rastvorena u medijumu (2µl+200µl). Posle su jedinjenja rastvorena u medijumima (medijumi su takođe zagrevani na 37°C). Medijumi koji su sadržali jedinjenja zagrevani su do 37°C u inkubatoru a zatim su jedinjenja u medijumu dodavana u ploče za ćelije (50µl 50µl), u duplikatu. Finalne koncentracije jedinjenja su bile od 198M do 19.9nM. Rastvorljivosti svih jedinjenja su proverene i ponovo zabeležene, zatim su ploče odmah prebačene u inkubator sa CO2za ćelijsku kulturu i inkubirane 3 dana. Finalna koncentracija DMSO je 0.5%.

[0279] Rezultati inicijalnog skrininga su predstavljeni u tabeli II. A predstavlja relativnu IC50od 0.1 do 5 µM, B predstavlja relativnu IC50veću od 5 µM i do najviše 15 µM, C predstavlja relativnu IC50od više od 15 µM i najviše do 100 µM; i D predstavlja relativnu IC50od više od 100 µM.

[0280] Zatim je, upotrebom sledećeg eseja, testirana citotoksična aktivnost podgrupe jedinjenja prema pronalsku u širem spektru čvrstih tumora i hematoloških maligniteta.

Esej za čvrste tumore i hematološke malignitete

[0281] In vitro testovi vijabilnosti izvedeni su kako bi se procenilo dejstvo jedinjenja na vijabilnost ćelija u odabranim ćelijskim linijama tokom 72 sata koristeći esej CellTiterGlo (CTG, Promega-G7573). Testovi su izvođeni u duplikatima sa tretmanom jedinjenjima u 9 tačaka, titracijom od 3.16 puta u pločama sa 96 bunarčića tokom ~72 sata. Početne koncentracije jedinjenja su bile 198 mM. Test ćelijske vijabilnosti je izveden upotrebom CellTiterGlo u pločama sa 96 bunarčića. Tretman jedinjenjem trajao je 72 sata, pod standardnim uslovima rasta, i u duplikatu. Jedinjenja su rastvarana do koncentracije od 40mM sa otopljenim 100%. Jedinjenja su serijski razblažena 3.16 puta u otopljenom DMSO, i zagrejana na 37°C pre nego što su rastvorena u medijumu (2µl+200µl). Posle rastvaranja jedinjenja u medijumu, medijumi koji su sadržali jedinjenja zagrevani su do 37°C u inkubatoru, a zatim su jedinjenja u medijumu dodavana u ploče za ćelije (50µl 50µl), u duplikatu. Finalne koncentracije jedinjenja su bile od 198M do 19.9nM. Rastvorljivosti svih jedinjenja su proverene i ponovo zabeležene, zatim su ploče odmah prebačene u inkubator sa CO2za ćelijsku kulturu i inkubirane 3 dana. Finalna koncentracija DMSO je 0.5%.

[0282] Sledeće ćelijske linije su testirane i nalaze se u tabeli IV u tekstu koji sledi:

[0283] Rezultati daljih skrininga predstavljeni su u tabelama IV-VII. Za tabele IV do VI: A predstavlja apsolutnu IC50vrednosti od 0.1 µM do 5 µM, B predstavlja apsolutnu IC50veću od 5 µM i najviše do 15 µM, C predstavlja apsolutnu IC50od više od 15 µM i najviše do 100 µM; i D predstavlja apsolutnu IC50veću od 100 µM. Za tabelu VII: A predstavlja apsolutnu EC50vrednosti od 0.1 µM do 5 µM, B predstavlja apsolutnu EC50veću od 5 µM i najviše do 15 µM, C predstavlja apsolutnu EC50od više od 15 µM i najviše do 100 µM; i D predstavlja apsolutnu EC50veću od 100 µM.

Tabela IV

1

Tabela V

2

Tabela VI

Tabela VII

[0284] Sva testirana jedinjenja pokazala su citotoksičnu aktivnost protiv testiranih ćelijskih linija. U većini slučajeva, jedinjenja prema pronalasku bila su potentnija protiv ćelijskih linija od matičnog nukleozida.

Primer 3 – Procena citotoksičnosti i aktivnost matičnih ćelija kancera

[0285] Za prošireni opseg doza je sprovedena dodatna komparativna analiza toksičnosti jedinjenja prema ćelijskoj liniji akutne mijeloidne leukemije (AML) KG1a i za ceo opseg doza je procenjen relativni efekat jedinjenja na odeljak sa matičnim ćelijama leukemije (LSC) u okviru ćelijske linije KG1a.

Materijal i metode

Uslovi ćelijske kulture KG1a

[0286] Ćelijska kultura KG1a je održavana u RPMI medijumu (Invitrogen, Paisley, VELIKA BRITANIJA) kome je dodato 100 jedinica/ml penicilina, 100µg/ml streptomicina i 20% fetalnog telećeg seruma. Ćelije su zatim alikvotirane (10<5>ćelija/100µl) u ploče sa 96 bunarčića i inkubirane na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% ugljen dioksidatokom 72h u prisustvu nukleozidnih analoga i njihovih odgovarajućih proTide na koncentracijama koje su eksperimentalno određene za svaku seriju jedinjenja. Pored toga, obrađene su kontrolne kulture kojima nisu dodavani lekovi. Ćelije su zatim sakupljene centrifugiranjem i analizirane protočnom citometrijom koristeći Aneksin V esej.

Merenje apoptoze in vitro

4

[0287] Gajene ćelije su sakupljene centrifugiranjem a zatim resuspendovane u 195µl pufera bogatog kalcijumom. Zatim, 5 µl Aneksina V (Caltag Medsystems, Botolph Claydon, Velika Britanija) dodato je u ćelijsku suspenziju i ćelije su 10 min inkubirane u mraku pre ispiranja. Finalno su ćelije resuspendovane u 190µl pufera bogatog kalcijumom zajedno sa 10µl propidijum jodida. Apoptoza je procenjivana dvobojnom imunofluorescentnom protočnom citometrijom, kao što je prethodno opisano. Zatim su LD50vrednosti (doza potrebna da se ubije 50% ćelija u kulturi) izračunate za svaki analog nukleozida i ProTide.

Imunofenotipska identifikacija odeljaka sa matičnim ćelijama leukemije

[0288] KG1a ćelije su gajene 72h u prisustvu širokog spektra koncentracija svakog od testiranih jedinjenja. Ćelije su zatim sakupljene i obojene koktelom antitela za diferencijalnu detekciju ćelijske linije (PE-cy7), anti-CD34 (FITC), anti-CD38 (PE) i anti-CD123 (PERCP cy5). Podgrupe koje eksprimiraju LSC fenotip su nakon toga identifikovane i izražene kao procenat vijabilnih ćelija koje su preostale u kulturi. Procenti preostalih matičnih ćelija predstavljeni su na grafiku zavisnosti odgovora od doze i dejstva različitih jedinjenja su poređena međusobno, kao i sa matičnim nukleozidom.

Statistička analiza

[0289] Podaci dobijeni u ovim eksprimentima ocenjeni su korišćenjem jednosmerne ANOVA. Upotrebom omnibus K2 testa potvrđeno je da se svi podaci uklašaju u Gausovu raspodelu ili njenu aproksimaciju. LD50vrednosti su izračunate na osnovu nelinearne regresije i analize najboljeg uklapanja sigmoidnih krivih zavisnosti efekta od doze. Sve statističke analize obavljane su upotrebom Graphpad Prism 6.0 softvera (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

Rezultati

[0290] In vitro osetljivost na lekove je merena upotrebom eseja Aneksin V/propidijum jodid. Jedinjenje A pokazalo je povećanu efikasnost delovanja in vitro u poređenju sa kordicepinom (P<0.0001). 2-F-kordicepin je bio značajno efikasnijji od kordicepina (P<0.0001) i svi testirani ProTides prikazali su povećanu efikasnost delovanja u poređenju sa matičnim nukleozidom (slika 1).

[0291] Ovi eksperimenti potvrdili su da je jedinjenje A prikazalo povećanu efikasnost delovanja u odeljku matičnih ćelija pri koncentracijama iznad 1mM. Kao što može da se vidi iz slike 2, jedinjenje A prikazalo je sposobnost ne samo da smanji ukupan broj matičnih ćelija kancera, nego i da smanji brojeve tih ćelija kao udeo u ukupnom broju ćelija kancera prisutnih u kulturi. Ovo ukazuje na sposobnost jedinjenja A da u većoj meri deluje ciljano na matične ćelije kancera. Pri višim testiranim koncentracijama (1mM i više), sposobnost jedinjenja A da u većoj meri deluje ciljano na LSC bila je značajno veća nego kod matičnog jedinjenja.

[0292] 2-F-kordicepin proTides jedinjenja P, Q i R takođe su pokazala pretežno ciljano delovanje na LSC koje je bilo značajno poboljšano u poređenju sa matičnim nukleozidom. Nasuprot tome, premda je jedinjenje O moglo da dovede do smanjenja udela LSC prisutnih u tretiranim ćelijskim populacijama (uključujući mogućnost ciljanog delovanja na LSC), njegova aktivnost nije bila značajno drugačija od aktivnosti 2-F-kordicepina pri bilo kojoj od testiranih koncentracija. Slika 3 prikazuje poređenje između 2-F-kordicepina i svih testiranih proTides jedinjenja, dok su individualna poređenja prikazana na panelima slike 4.

Primer 4 – Dodatne procene citotoksičnosti i studije inhibicije

[0293] Određena jedinjenja prema pronalasku podvrgnuta su daljem proučavanju kako bi se testirala citotoksična aktivnost određenih jedinjenja prema pronalasku a takođe i da bi se izmerila njihova aktivnost protiv 4 ćelijske linije hematoloških kancera

• TdT pozitivna CEM (humani ALL)

• TdT negativna K562 (humani CML)

• TdT negativna Hl-60 (humani ANLL)

• RL (CRL-2261) ne-HD limfom

Takođe su merene i koncentracije aktivnog metabolita dATP-a (kordicepin trifosfat) u ovim ćelijskim linijama.

Citotoksična aktivnost i unutarćelijske koncentracije 3’-dATP takođe su proučavane u prisustvu hENT1, farmakoloških inhibitora adenozin kinaze (AK) i adenozin deaminaze u ćelijskim linijama kancera CEM i RL. Pomenuti inhibitori podražavaju poznate mehanizme rezistencije na kancer.

Postupci

Ćelijska kultura

[0294] Ćelijske linije leukemije HL-60 (ATCC<®>CCL-240™), K562 (ATCC® CCL-243™), CCRF-CEM (ATCC® CRM-CCL-119™) i RL (ATCC® CRL-2261™), dobijene od Američke kolekcije tipova ćelijskih kultura (ATCC), Middlesex. HL-60 i K562 ćelijske linije su negativne na deoksinukleotidil transferazu (TdT-vna), dok je ćelijska linija CCRF-CEM TdT+vna.

[0295] HL-60 ćelijska linija je linija akutne promijelocitne leukemije; K562 je CML ćelijska linija, CCRF-CEM ćelijska linija je linija akutne limfoblastne leukemije (ALL); i RL je ćelijska ne-Hočkinovog limfoma.

Održavanje ćelijskih linija

[0296] Ćelijske linije HL-60, K562, CCRF-CEM i RL gajene su u RPMI-1640 medijumu (Sigma Aldrich, VELIKA BRITANIJA) suplementiranom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (PAA Laboratories), 1% amfotericina B (5.5 ml) i 1% penicilin/streptomicina (5.5 ml) (PAA Laboratories) i gajene u flaskovima na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2.

Test za adenozin 5’-trifosfat (ATP)

[0297] Količina ATP-a korišćena je za merenje broja ćelija i ćelijske vijabilnosti. Za detekciju ATP-a pomoću ATP ViaLightTM plus kita (Lonza, SAD: br. proizvoda LT07-121) ćelije su, u pločama sa 96 bunarčića kompatibilnim sa fluorescencijom (početna koncentracija ćelija je bila 1x104 ćelija/bunarčiću), tretirane kordicepinom i ProTides u koncentracijama od: 0, 0.1, 0.5, 1, 5 i 10 µM, nakon čega je sledila inkubacija od 72 sata na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2. Za studije inhibicije, 10 µM NBTI ili 1 µM EHNA ili A-134974 je dodato i ostavljeno 5 minuta pre nego što su dodati lekovi (pojedinosti o inhibitorima videti u odeljku 5).

[0298] Nakon inkubacije, po 50µl reagensa za lizu ćelija dodato je pločama sa 96 bunarčića kako bi se oslobodio unutarćelijski ATP, a nakon toga po 100µl reagensa za praćenje ATP-a (AMR). Vrednosti luminescencije u svakom bunarčiću određene su čitačem mikrotitar ploča FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech) koji konvertuje ATP u svetlost upotrebom enzima luciferaze. Dakle, količina proizvedene luminescencije je direktno srazmerna količini ATP-a.

Tretman ćelija i ekstrahovanje uzoraka u cilju analize unutarćelijskog trifosfata

[0299] Korišćene su ćelijske linije sa 5x10<6>ćelija/ml. Ćelije su tretirane sa 1 µl 50 µM kordicepina i jedinjenja A, B, D, E i F i inkubirane 2 sata na 37°C sa 5% CO2. Nakon inkubacije, ćelije su centrifugirane (temperatura okoline, 1200 rpm, 5 minuta), supernatanti medijuma iz kulture su uklonjeni i ćelijski talozi su oprani sa 1ml PBS-a i centrifugirani (temperatura okoline, 1200 rpm, 5 minuta). Supernatanti su uklonjeni; talozi su rekonstituisani u 100µl PBS-a i 100µl 0.8M perhlorne kiseline i promešani na vorteksu i stavljeni na led na 30 minuta. Zatim su centrifugirani (temperatura okoline, 1200 rpm, 5 minuta) i 180µl supernatanta je prebačeno u nove tubice i čuvano na -80°C do trenutka analize.

[0300] Tokom analize, 90µl ekstrakta je prebačeno u nove tubice. Ekstraktu je dodato 25µl 1M amonijum acetata a zatim je neutralisan dodavanjem 10µl 10% amonijaka i 5µl dejonizovane vode i potom prebačen u LC-MS bočice i 10µl je injecirano u UPLC-MS/MS sistem.

Proučavanje inhibitora

[0301] Ćelijske linije su tretirane na isti onaj način koji je prethodno opisan u tekstu, ali je pre tretmana lekovima, dodat izvestan broj inhibitora:

1) Nitrobenziltioinozin (NBTI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, proizvod # N2255) blokira transportne molekule za nukleozide

2) EHNA hidrohlorid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, proizvod # E114) blokira adenozin deaminazu

3) inhibitor adenozin kinaze A-134974 dihidrohlorid hidrat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, proizvod # A2846): blokira adenozin kinazu

[0302] Ćelije su tretirane sa 10 µM NBTI ili 1 µM EHNA ili A-134974 i ostavljane 5 minuta pre nego što je dodavan lek. Ćelije su zatim inkubirane tokom 2 sata na 37°C sa 5% CO2.

LC-MS/MS analiza

[0303] Analiti su razdvojeni koristeći sistem za tečnu hromatografiju ultra-performanse (Accela UPLC, Thermo Scientific, Velika Britanija) opremljen Biobasic colonom Ax5µm, 50x2.1mm (Thermo Electron Corporation, Murrieta, CA, SAD) i mobilnu fazu koja se sastoji od smeše 10mM NH4Ac u ACN/H2O (30:70zapr./zapr.), pH6.0 (A) i 1mM NH4Ac u ACN/H2O (30:70zapr./zapr.), pH 10.5 (B). Koristiće se gradijent mobilne faze koji sadrži: pufer A=95% tokom 0-0.5 min, od 95 do 0% za 1.25 minuta, na 0% tokom 1.75 minuta, od 0-95% za 0.1 min, završavajući sa 95% tokom 2.9 minuta, sve to pri stopi protoka od 500µl/min.

[0304] Jedinjenja od interesa koja se eluiraju detektovana su korišćenjem trostrukog kvadrupol sistema za masenu spektrometriju Vantage (kompanijaThermo Scientific, Velika Britanija) koji je opremljen elektrosprej jonizacionim izvorom. Uzorci su analizirani praćenjem višestruke fragmentacije, u negativnim jonskim modovima pri naponu spreja od 3000V. Azot je korišćen kao gas za raspršivanje mobilne faze i desolvataciju, pri stopi protoka od 50 i 20 arbitrarnih jedinica, redom. Argon je korišćen kao gas za koliziju sa pritiskom od 1.5 mTorr. Optimalna tranziciona masa produkt jona i koliziona energija za svaki od analita bile su sledeće: 3’ATP 490.1 → 392.1 (koliziona energija 19V) i unutrašnji standard HloroATP 539.9 → 442.2 (koliziona energija 24V).

Statistička analiza

[0305] Krive zavisnosti odgovora od doze koje opisuju citotoksičnost leka određene su analizom procentualne ćelijske vijabilnosti u odnosu na koncentraciju pomoću nelinearne regresije i dobijene su EC50vrednosti. Unutarćelijski esej je sproveden u pet replikata za svaki od uslova. Unutarćelijski esej je određen analizom 3’ATP/ATP koncentracije pomoću t testa uparenih uzoraka (dvostranog) i dobijene su p-vrednosti. Za sve analize je korišćen Prism Software program (GraphPad Software) a Microsoft Powerpoint® 2013 je korišćen za grafički prikaz rezultata.

Rezultati

[0306]

Tabela sa kratkim pregledom IC50(µM)

Kratak pregled srednje vrednosti nivoa unutarćelijskog 3’-dATP (µg/ml)

[0307] Jedinjenja A i B su dala najbolje rezultate, sa 3 do 150 puta boljom IC50nego kordicepin. Jedinjenja A i B proizvela su 3 do 56 puta bolje unutarćelijske koncentracije 3’-dATP-a nego kordicepin.

Tabela sa kratkim pregledom IC50(sve u µM)

Kratak pregled srednje vrednosti nivoa unutarćelijskog 3’-dATP (µg/ml)

[0308] NBTI, AK i EHNA nisu uticali na unutarćelijski 3’-dATP koji su obrazovala tri testirana jedinjenja prema pronalasku, što ukazuje na to da ovi inhibitori ne interferiraju sa metabolizmom putem koga jedinjenja prema pronalasku obrazuju aktivni agens 3’-dATP u ćelijskim linijama hematoloških kancera koje su korišćene u ovoj studiji. Pošto ovi inhibitori podražavaju poznate mehanizme rezistencije na kancer, ovi rezultati ukazuju na to da će jedinjenja prema pronalasku biti manje osetljiva na mehanizme rezistencije na kancer nego kordicepin.

Claims (14)

1. Patentni zahtevi 1. 3’-Deoksiadenozin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)] fosfat
2. ili farmaceutski prihvatljiva so, estar, so estra ili solvat njegovog jedinjenja. 2. 3’-Deoksiadenozin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)] fosfat prema patentnom zahtevu 1
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 za upotrebu u vidu medikamenta.
4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 za upotrebu u profilaksi ili lečenju kancera.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 za upotrebu u ciljanom delovanju na matične ćelije kancera prilikom lečenja kancera.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je kancer odabran od leukemije, limfoma, kancera dojke, kancera pluća, kancera debelog creva, kancera prostate, kancera jajnika, kancera kože, kancera bešike, kancera žučnih puteva i kancera pankreasa.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je kancer odabran od kancera dojke, kancera CNS-a, kancera debelog creva, Juingovog sarkoma, melanoma, kancera jetre, holangiokarcinoma, kancera jajnika, kancera pankreasa, nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera bešike, akutne mijeloidne leukemije, B-akutne limfoblastne leukemije, B-akutne limfoblastne leukemije, multiplog mijeloma i T-akutne limfoblastne leukemije.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 naznačeno time što je kancer odabran iz grupe koja se sastoji od: leukemije, limfoma, multiplog mijeloma, kancera pluća (uključujući nesitnoćelijski kancer pluća i sitnoćelijski kancer pluća), kancera jetre, kancera dojke, kancera bešike, kancera prostate, kancera glave i vrata, neuroblastoma, sarkoma (uključujući Juingov sarkom), tiroidnog karcinoma, kancera kože (uključujući melanom), oralnog karcinoma skvamoznih ćelija, kancera mokraćne bešike, tumora Lejdigovih ćelija, kancera žučnih puteva, kao što su holangiokarcinom ili kancer žučnog kanala, kancera pankreasa, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera i ginekoloških kancera, uključujući kancer jajnika, kancer endometrijuma.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 naznačeno time što je kancer leukemija ili limfom.
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 naznačeno time što je leukemija odabrana iz grupe koja sadrži akutnu limfoblastnu leukemiju, akutnu mijelogenu leukemiju, akutnu promijelocitnu leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, monoblastnu leukemiju, leukemiju vlasastih ćelija, Hočkinov limfom i ne-Hočkinov limfom.
11. 11. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 naznačeno time što je leukemija akutna limfoblastna leukemija.
12. 12. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 11, naznačeno time što je kancer rekurentni ili nesenzitivni kancer.
13. 13. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 11, naznačeno time što je kancer metastatski kancer.
14. 14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.