RS58285B1

RS58285B1 - Uti-fuzioni proteini

Info

Publication number: RS58285B1
Application number: RS20181514A
Authority: RS
Inventors: Aaron Chamberlain; Qiang Liu; Mathias Schmidt
Original assignee: Takeda Gmbh; Takeda Pharmaceuticals Co
Priority date: 2014-02-24
Filing date: 2015-02-23
Publication date: 2019-03-29
Also published as: SG11201606691QA; JP2023123763A; JP2022002513A; MA39347B2; ECSP16076535A; JP6938565B2; CA3178241A1; SG10201708400QA; LT3110434T; JP6574431B2; MA39347A1; SMT201800674T1; MX2024000004A; EP3443978A1; KR102461210B1; CN110092837B; EP3110434B1; SI3110434T1; KR102722304B1; AU2019204448A1

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na molekularnu biologiju, farmakologiju i medicinu.

STANJE TEHNIKE

[0002] Urinarni tripsin inhibitor (UTI), poznat i kao ulinastatin, uristatin, urinastatin, ulistin, humani inhibitor 30 (HI-30), mingin i bikunin, je inhibitor proteaze sa molekulskom masom od oko 40kD. UTI je prisutan u humanom urinu i krvi (hUTI) i ima razne fiziološke aktivnosti, kao što je inhibitorni efekat na familiju serinskih proteaza, kao što su tripsin, Į-himotripsin, plazmin, katepsin-G i leukocitna elastaza. UTI takođe ima imunomodulatorni efekat i može regulisati oslobađanje proinflamatornih citokina, kao što je faktor tumorske nekroze-Į (TNF-a), interleukin-1 (IL-1) i interleukin (IL-6). Pored toga, UTI takođe ometa PDGF-D (PDGF-DD)/PDGF-BBR aktivni dimer-posredovani signalizacijski put putem neutralizacije dimera.

[0003] hUTI je odobren za promet i jedan proizvod se prodaje u Japanu pod trgovačkim imenom Miraclid a izolovan je iz humanog urina. Zapravo, hUTI izolovan iz humanog urina trenutno na tržištu prodaje nekoliko proizvođDča za lečenje pankreatitisa i akutnog nedostatka cirkulacije usled šoka.

[0004] UTI je najpre proizveden u ljudima kao presursorski protein nazvan AMBP (Į1-mikroglobulin/bikunin prekursor) koji je kodiran na humanom hromozomu 9. Proteolizom AMBP dobija se slobodan UTI sa 143 aminokiseline. UTI obuhvata dva Kunitz domena za koje je poznato da inhibiraju serinske proteaze, koje su okružene nestruktuiranim amino kiselinama na UTI-ovim N- i C-terminalnim grupama. Od ova dva domena se očekuje da daju različite specifičnosti inhibicije proteaze, usled različitih amino kiselina uključenih u vezivanje proteaze. Po analogiji sa drugim inhibitorima serinske proteaze (npr. BPTI, inhibitor tripsina goveđeg pankreasa), možemo proceniti da dve ključne aminokiseline za inhibiciju proteaze uključuju Met26 (Kunitz domen 1) i Arg88 (Kunitz domen 2). Malo se zna o učešću različitih UTI delova tokom inhibicije različitih proteaza, ali je pokazano da uklanjanje Kunitz domena 1 menja specifičnost proteaza, otkrivajući novu inhibitornu aktivnost protiv faktora Xa i serumskog kalikriena. UTI pune dužine ne pokazuje inhibiciju ove dve proteaze (Morishita i sar., Thrombosis Research 1994, vol.73 (3/4) p193-204). UTI takođe sadrži dva vezana šećera, jedan O-povezan na Ser10 i jedan N-povezan na Asn45.

Poluvreme života UTI kod glodara i ljudi iznosi 4-30 minuta (Fries i sar., International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2000, vol 32, p 125-137).

[0005] UTI fuzioni protein treba da sadrži optimizovanu sekvencu aminokiselina, uključujući najbolju start i stop tačku bilo kojeg UTI domena, i može se spojiti sa drugim proteinom kako bi se poboljšale osobine kao što su ekspresija, prečišćavanje, poluvreme života i stabilnost. Tačan redosled fuzionog partnera treba odrediti i može uključivati varijacije u linkerima, start/stop tačkama i/ili mutacijama koje mogu promeniti funkcionalne osobine fuzionog partnera. Varijante ulinastatina dobijene iz urina su poznate WO199856916, US5792629, US5407915, US5409895, US7019123 i US6583108.Koncept fuzionih proteina ulinastatina (i njegove varijacije) otkriveni su u US20080181892, US5541288 i US20080255025. Određeni UTI fuzioni proteini opisani su u CN 103044554A. Fuzioni proteini CN 103044554A odnose se na specifične varijante u domenu Fc, verovatno da bi se izbegli farmakološki efekti posredovani sa Fc (ADCC, CDC). Iznenađujuće smo otkrili da se UTI-Fc sa divljim tipom IgG1 dobro toleriše i pruža značajno povećanje poluvremena života. Takođe, u poređenju sa UTI fuzionim proteinima iz CN 103044554A, predmetni UTI fuzioni proteini, posebno SEK ID BR:1, pokazuju veću termičku stabilnost.

[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje UTI fuzione proteine, farmaceutske kompozicije koje sadrže iste, metode preparacije i njihovu upotrebu.

SUŠTINA PRONALASKA

[0007] Predmetni pronalazak obezbeđuje UTI fuzione proteine, koji sadrže UTI domen i fuzionog partnera u kojem je domen UTI operativno povezan sa fuzionim partnerom.

Predmetni pronalazak obezbeđuje UTI fuzione proteine, koji sadrže UTI domen i Fc domen gde je UTI domen operativno povezan sa Fc domenom. Predmetni pronalazak takođe pruža izolovane UTI fuzione proteine kao što je ovde opisano.

[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje UTI fuzioni protein koji sadrži SEK ID BR:1.

[0009] Prema drugom izvođenju predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira UTI fuzione proteine koji sadrže UTI fuzione proteine opisane ovde. Nadalje, pronalazak obezbeđuje sekvence DNK koje su navedene kao SEK ID BR:2. U jednom izvođenju, nukleinska kiselina koja kodira UTI fuzioni protein dalje sadrži vektor koji sadrži kontrolne sekvence na koje je nukleinska kiselina operabilno povezana. U još jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira UTI fuzioni protein, kao što je sisar, insekt, E. coli ili ćelija kvasca, i održavanje ćelije domaćina pod uslovima u kojima se eksprimira molekul fuzionog proteina.

[0010] U još jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži UTI fuzione proteine opisane ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.

[0011] Prema daljem izvođenju ovog pronalaska, obezbeđen je postupak lečenja poremećaja povezanih sa UTI, koji obuhvata davanje pacijentu kojem je to potrebno efektivne količine UTI fuzionog proteina koji je ovde opisan.

[0012] Odnosno, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu UTI fuzionog proteina kao leka, uključujući i proizvodnju leka, i upotrebu UTI fuzionog proteina opisanog ovde za lečenje poremećaja povezanih sa UTI, koji su ovde opisani.

KRATAK OPIS SLIKA

[0013]

SL. 1 Struktura UTI domena i mesta glikozilacije

SL. 2 Dva UTI-Fc konstrukta demonstriraju izmenjene linkere.

SL. 3 Različiti UTI-Fc konstrukti iz predmetnog pronalaska.

SL. 4 Strategija sklapanja DNK (SLIC) koja je korišćena u UTI fuzionoj konstrukciji.

SL. 5 Supresija aktivnosti proteaze (tripsina) pomoću UTI i UTI-Fc1, SEKV ID BR:1

SL. 6 Supresija aktivnosti proteaze (himotripsina) pomoću UTI-Fc1, UFC1, SEKV ID BR:1.

SL. 7 Supresija aktivnosti proteaze (multiple proteaze) pomoću UTI-Fc1, UFC1, SEKV ID BR:1.

SL. 8 Supresija sekrecije citokina (IL-6) pomoću UTI i UTI-Fc1, UTI-Fc, SEKV ID BR:1.

SL. 9 Prinosi prečišćavanja UTI fuzionih proteina.

SL. 10 Efekat SEKV ID BR:1 na LPS indukovani C5a u C3H miševima.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0014] Predmetni pronalazak obezbeđuje UTI fuzioni protein prema SEKV ID BR. 1 u UTI domenu i fuzionog partnera gde je UTI domen operativno povezan sa fuzionim partnerom.

UTI fuzioni proteini predmetnog pronalaska imaju inhibitorni efekat na proteaze, uključujući tripsin.

[0015] U nekim izvođenjima, fuzioni partner je humani Fc polipeptid. Dalje, opisani fuzioni partner je analog(i) humanog Fc polipeptida kao što je fragment(i) humanog Fc polipeptida. Opisano je da je fuzioni partner Fc polipeptid miša. Opisano je da je fuzioni partner Fc polipeptid pacova.

[0016] U nekim izvođenjima UTI domen je humani UTI (hUTI). U nekim izvođenjima UTI domen je analog od hUTI. U nekim izvođenjima UTI domen je fragment hUTI. U nekim izvođenjima, UTI fuzioni protein sadrži hUTI domen divljeg tipa.

[0017] U nekim izvođenjima, UTI fuzioni protein sadrži humani UTI domen divljeg tipa i human Fc domen. U nekim izvođenjima, UTI fuzioni protein sadrži hUTI domen divljeg tipa i linker domen i humani Fc domen.

[0018] U nekim izvođenjima, Fc domen se vezuje za Fc receptor na humanoj ćeliji. U nekim izvođenjima, poluvreme života molekula u serumu je znatno duži od poluvremena života samog UTI domena u serumu. U nekim izvođenjima, aktivnost inhibicije proteaze UTI domena iz molekula je ista ili veća od samog UTI domena. U nekim izvođenjima, primena molekula na mišu smanjuje inflamatorne reakcije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, smanjenje aktivacije imunih ćelija ili smanjenje proizvodnje, sekrecije ili aktivnosti citokina ili hemokina.

[0019] Podrazumeva se da UTI domen može biti operativno povezan sa fuzionim partnerom pomoću linker domena.

[0020] Predmetni pronalazak obezbeđuje UTI fuzioni protein, koji sadrži UTI domen spojen sa FC domenom.

[0021] Predmetni fuzioni proteini obuhvataju proteine koji imaju monomerne i multimerne oblike bez obzira da li su pripremljeni digestijom intaktnih antitela ili su proizvedeni drugim načinima.

[0022] Izrazi "multimer" i "multimerni" odnose se na proteine u kojima Fc domeni ili molekuli koji sadrže Fc domene imaju dva ili više polipeptidnih lanaca povezanih kovalentno, nekovalentno ili imaju i kovalentne i nekovalentne interakcije. Izraz multimer uključuje izraz dimer.

[0023] Izraz "dimer" odnosi se na proteine u kojima Fc domeni ili molekuli koji sadrže Fc domene imaju dva polipeptidna lanca povezana kovalentno, nekovalentno ili imaju i kovalentne i nekovalentne interakcije. To znači da se termin "dimer" odnosi na UTI fuzione proteine u kojima su dva Fc domena povezana kovalentno, nekovalentno ili imaju i kovalentne i nekovalentne interakcije. Preciznije, izraz "dimer" se odnosi na UTI fuzione proteine u kojima su dva Fc domena povezana kovalentno.

ZNAýENJE IZRAZA

[0024] Pojmovi korišćeni u ovoj specifikaciji i zahtevima su definisani kako je navedeno dole osim ako nije drugačije naznačeno.

[0025] Kao što se ovde koristi, izrazi "povezani", "spojeni" ili "fuzija" se koriste naizmenično.

[0026] Ovi izrazi se odnose na povezivanje još dva elementa ili komponenti ili domena, bilo kojim sredstvima, uključujući hemijsku konjugaciju ili rekombinantna sredstva. Metode hemijske konjugacije su poznate u oblasti.

[0027] "Fuzioni protein" se odnosi na polipeptid koji ima dva ili više delova kovalentno povezanih zajedno, pri čemu jedan ili više delova su dobijeni iz različitih proteina. Dva dela mogu biti povezana direktno jednom peptidnom vezom (npr. delovi povezani direktno jedni sa drugima) ili putem peptidnog linkera koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka (npr. sa intervenišućom aminokiselinom ili aminokiselinskom sekvencom između delova). Uopšteno govoreći, DNK koja kodira dva dela i linker će biti u čitajućem okviru povezana i proizvedena pomoću rekombinantnih tehnika.

[0028] "UTI domen" je protein ili peptid koji imitira aktivnost UTI-ja. Podrazumeva se da se UTI domen predmetnog pronalaska može izmeniti tako da variraju sekvence iz prirodno javljajućih ili nativnih sekvenci iz kojih su izvedene, a zadržavaju željenu aktivnost nativne sekvence. Poželjno je da je UTI domen nativni humani UTI (hUTI), analozi i njihove varijante. Varijante hUTI uključuju zamenu ili modifikaciju jedne ili više aminokiselina nativnog hUTI-ja koje nisu potrebne za strukturne osobine ili za pružanje funkcionalne aktivnosti, uključujući i konzervativne supstitucije. Varijante hUTI uključuju uklanjanje ili ubacivanje jedne ili više aminokiselina u nativni hUTI koje nisu potrebne za strukturne osobine ili za pružanje funkcionalne aktivnosti. Varijante hUTI uključuju zamenu ili modifikaciju jedne ili više aminokiselina nativnog hUTI-ja radi modifikacije jedne ili više osobina ili aktivnosti. Varijante hUTI-ja uključuju uklanjanje ili ubacivanje jedne ili više aminokiselina u nativni hUTI radi modifikacije jedne ili više UTI osobina ili aktivnosti. Varijante hUTI uključuju uklanjanje ili promenu mesta glikolizacije u nativom humanom UTI-ju. Varijante hUTI uključuju uklanjanje ili promenu jednog ili više Kunitz domena. Varijante hUTI mogu se uvesti standardnim tehnikama, kao što je mutageneza usmerena na lokaciju i mutageneza posredovana PCR-om.

[0029] Sekvenca aminokiselinskog ostataka rekombinantnog hUTI domena je prikazana kao SEKV ID BR: 31. Generalno, UTI domen koji sadrži sekvencu najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu rekombinantnom hUTI domenu prikazan je kao SEKV ID BR:31.

[0030] "Fc domen" je polipeptid koji sadrži konstantni region antitela isključujući prvi konstantni region imunoglobulinskog domena, a u nekim slučajevima, deo ili sve spojeve. Dakle, Fc domen se odnosi na antigen nevezujući deo antitela, bilo u monomernom ili multimernom obliku. Antitelo iz koga se izdvaja Fc domen je poželjno humanog porekla i može biti bilo koji od imunogobulina, iako su IgG1 i IgG2 preferirajući.

[0031] Fc domen obuhvata spojni region teškog lanca. Ovde "spoj" ili "spojni region" ili "spojni region antitela" ili "spojni region imunoglobulina" označava fleksibilni polipeptid koji obuhvata aminokiseline između prvog i drugog konstantnog domena antitela, neposredno iznad papainskog cepanja. Shodno tome, za IgG, Fc domen obuhvata domene imunoglobulina CH2 i CH3 i spojni region između CH1 i CH2. Iako granice Fc regiona mogu varirati, Fc region za težak lanac IgG obično se definiše tako da uključuje ostatke C226 ili P230 u svom karboksilnom terminusu, pri čemu je numerisanje prema EU indeksu i u Kabatu. U nekim izvođenjima, kako je detaljnije opisano u nastavku, modifikacije aminokiselina se vrše u Fc domenu, na primer, da se izmeni vezivanje za jedan ili više FcȖR receptora ili FcRn receptora.

[0032] Shodno tome, termin Fc domen obuhvata spojni region koji se može skraćivati, modifikovati zamenom, brisanjem i/ili umetanjem i dalje modifikovani ili nemodifikovani spojni region može biti mesto dodira na povezujućem domenu.

[0033] "Analog Fc domena" odnosi se na molekul ili sekvencu koja je modifikovana iz nativnog Fc, ali i dalje sadrži vezujuće mesto za salvažni receptor. Termin analog Fc domena uključuje molekul ili sekvencu koja je humanizovana od ne-humanogn ativnog Fc. Termin analog Fc domena takođe uključuje molekul ili sekvencu koja nema ili ima modifikacije jednog ili više nativnih Fc ostataka koji utiču ili su uključeni u nastanak disulfida, nekompatibilnost sa ćelijom domaćina, N-terminalnom heterogenošću nakon ekspresije, stabilnošću, glikolilaciju, interakciju sa komplementom, vezivanje za neki Fc salvažni receptor i/ili interakciju sa nekim FcȖ receptorom.

[0034] Izrazi "fragmenti Fc domena" ili "fragment Fc domena" odnose se na nativni Fc iz kojeg je uklonjena jedna ili više lokacija, gde uklonjena lokacija(e) ne obuhvataju strukturne osobine ili funkcionalnu aktivnost koja je potrebna od strane fuzionog proteina predmetnog pronalaska. Fragmenti Fc domena uključuju brisanje ostataka iz nativnog Fc ili skraćivanje nativnog Fc i mogu uključivati supstitucije preostalih ostataka. Umetnuti ili izmenjeni ostaci (npr., supstituisani ostaci) mogu biti prirodne aminokiseline ili izmenjene aminokiseline, peptidomimetici, neprirodne aminokiseline ili D-aminokiseline.

[0035] Generalno, Fc domen uključuje sekvencu sa najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM, posebno sa humanim IgG1 ili IgG2.

[0036] Izraz Fc domen obuhvata nativni Fc i analoge Fc i uključuje monomerne i multimerne oblike bez obzira da li su pripremljeni digestijom intaktnih antitela ili su proizvedeni drugim sredstvima.

[0037] Jedan Fc domen obuhvata najmanje jedan spojni domen (gornji, srednji i/ili donji spojni region), CH2 domen (ili varijante ili njegove fragmente) i CH3 domen (ili varijante ili njegove fragmente). Fc domen se sastoji od spojnog domena (gornjeg, srednjeg i/ili donjeg spojnog regiona), CH2 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta) i CH3 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta). U nekim drugim izvođenjima, Fc domen se sastoji od spojnog domena (gornjeg, srednjeg i/ili donjeg spojnog regiona), CH2 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta), CH3 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta)i CH4 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta). U još jednom izvođenju, Fc domen se sastoji od spojnog domena (gornjeg, srednjeg i/ili donjeg spojnog regiona) i CH2 domena. U još jednom izvođenju, domen Fc se sastoji od spojnog domena (gornjeg, srednjeg i/ili donjeg spojnog regiona) i CH3 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta). U drugom izvođenju, Fc domen se sastoji od CH2 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta) i CH3 domena (ili varijante ili njegovog fragmenta). U još jednom izovđenju, Fc domen se sastoji od kompletnog CH2 domena i kompletnog CH3 domena. U još jednom izvođenju, domen Fc se sastoji od kompletnog CH2 domena i kompletnog CH3 domena. Fc domen iz ovog pronalaska obuhvata bar deo Fc molekula poznatog u struci koji je potreban za FcRn vezivanje. U drugom izvođenju, Fc domen iz ovog pronalaska sadrži najmanje deo Fc molekula koji je poznat u struci a koji je potreban za vezivanje proteina A.

[0038] Prema predmetnom pronalasku, Fc domen se uglavnom odnosi na polipeptid koji sadrži sve ili deo Fc domena imunoglobulinskog teškog lanca. Kao što je već rečeno, ovo uključuje, ali nije ograničeno na polipeptide koji sadrže čitavu spojnu oblast, CH1, CH2 i/ili CH3 domene, kao i fragmente takvih peptida koji sadrže, na primer, spojnu oblast, CH2 i CH3 domene. Fc domen može biti izveden iz bilo kojeg imunoglobulina bilo koje vrste i/ili podtipa, uključujući, ali bez ograničenja, humana IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitela. Fc domen obuhvata poslednja dva konstantna regiona imunoglobulinskog domena IgA, IgD i IgG, poslednja tri konstantna regiona imunoglobulinskog domena IgE i IgM, kao i fleksibilnu N-terminalnu spojnu oblast na ove domene. Za IgA i IgM, Fc može uključiti i J lanac.

[0039] Fc domen kako se ovde koristi obuhvata nativne Fc i Fc varijante molekula. Kao i kod Fc varijanti i nativnih Fc proteina, izraz Fc domen uključuje molekule u monomernom i multimernom obliku, bilo da se dobijaju digestijom antitela ili da su proizvedeni drugim sredstvima.

[0040] Kao što je ovde navedeno, podrazumeva se da se bilo koji Fc domen može modifikovati tako da se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od nativnog Fc domena prirodno javljajućeg imunoglobulinog molekula. U određenim primerima izvođenja, Fc domen zadržava funkciju efektora, na primer, u vezivanju FcȖR. U određenim primerima izvođenja, Fc domen nema efektorsku funkciju, na primer, u vezivanju FcȖR.

[0041] UTI fuzioni proteini uključuju Fc domen. Fc domen koristan za proizvodnju UTI fuzionih proteina mogu se dobiti iz više različitih izvora. U poželjnim izvođenjima Fc domen UTI fuzionih proteina izveden je iz humanog imunoglobulina.

[0042] Izrazi "divlji tip" ili "dt" ili "nativni", kako se ovde koriste, podrazumevaju aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja se nalazi u prirodi, uključujući alelne varijacije. Protein, polipeptid, antitelo, imunoglobulin, IgG, polinukleotid, DNK, RNK divljeg tipa i slično imaju aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja nije bila namerno modifikovana.

[0043] Opisano je da UTI fuzioni proteini iz predmetnog pronalaska mogu koristiti linker domen. Linker domen se koristi za operativno povezivanje UTI domena sa fuzionim partnerom.

[0044] Izraz "linker domen" se odnosi na polipeptidne linkere, ne-peptidne linkere i njihove kombinacije. Posebno, linker domen može biti polipeptid. Kako se ovde koristi, termin "linker domen" odnosi se na sekvencu koja povezuje dva domena u linearnoj sekvenci. Kako se ovde koristi, termin "polipeptidni linker" odnosi se na peptidnu ili polipeptidnu sekvencu (npr., sintetičku peptidnu ili polipeptidnu sekvencu) koja povezuje dva domena u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci polipeptidnog lanca. Na primer, polipeptidni linkeri mogu se koristiti za povezivanje UTI domena sa Fc domenom. Poželjno, takvi polipeptidni linkeri mogu obezbediti fleksibilnost molekula polipeptida. UTI fuzioni protein iz pronalaska može sadržati linker domen, uključujući peptidni linker.

[0045] Na primer, linker domen može se koristiti za povezivanje dva domena u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci polipeptidnog linkera, kao što je povezivanje UTI domena sa Fc domenom. U određenim izvođenjima linker domen se može koristiti za povezivanje UTI domena sa Fc domenom. Linker domen se može koristiti za povezivanje domena u bilo kom redosledu. Na primer, linker će povezati UTI domen i Fc domen sa redosledom UTI-linker-Fc, dok u drugim izvođenjima linker će povezati UTI domen i Fc domen s redosledom Fclinker-UTI, gde se polipeptidni regioni označavaju od N-terminusa do C-terminusa. Primeri za polipeptidne linkere uključuju one koji se sastoje od ostataka glicina i serina, tzv. Gly-Ser polipeptidni linkeri. Kako se ovde koristi, termin "Gly-Ser polipeptidni linker" odnosi se na peptid koji se sastoji od ostataka glicina i serina. Primer za Gly-Ser polipeptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu Ser(Gly4Ser)n, gde je n celi broj od 1 do 10, SEKV ID BR: 33-42, respektivno. Opisano je da UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=1. U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein uključuje jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=2. U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=3. Opisano je da UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=4. U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=5. U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=6. U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=7. Opisano je da UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=8. U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=9. U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein sadrži jedan ili dva Gly-Ser polipeptidna linkera u kojima je n=10.

[0046] Još jedan primer za linker dat je u SEKV ID BR: 43.

[0047] Izraz "obuhvata" znači da jedinjenje, tj., fuzioni protein, može uključivati dodatne aminokiseline na bilo kojem ili na oba N- ili C-terminusa. Naravno, ove dodatne aminokiseline ne bi trebalo značajno ometati aktivnost jedinjenja, tj. fuzionog proteina.

[0048] Izraz "aminokiselina" odnosi se na prirodne i sintetičke aminokiseline, kao i na aminokiselinske analoge i aminokiselinske mimetike koji funkcionišu na način sličan prirodno nastalim aminokiselinama. Prirodno nastale aminokiseline su one koje su kodirane genetskim kodom, kao i one koje su kodirane aminokiseline a koje su kasnije modifikovane, na primer, hidroksiprolin i fosfoserin. Analozi aminokiseline se odnose na jedinjenje, tj. na fuzioni protein(e), koji imaju istu bazičnu hemijsku strukturu kao i prirodno nastale aminokiseline, odnosno imaju atom ugljenika vezan za atom vodonika, karboksil grupu, amino grupu i R grupu. Aminokiselinski analozi imaju modifikovane R grupe ili dovode do modifikovanih peptidnih lanaca, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao i prirodno nastale aminokiseline.

[0049] Izraz "supstitucija aminokiselina" odnosi se na zamenu najmanje jednog postojećeg aminokiselinskog ostatka u prethodno određenoj ili nativnoj aminokiselinskoj sekvenci sa različitim "zamenskim" aminokiselinama.

[0050] Izraz "insercija aminokiselina" odnosi se na ubacivanje jedne ili više dodatnih aminokiselina u prethodno određenu ili nativnu aminokiselinsku sekvencu. Umetanje može biti sa jednim, dva, tri, četiri, pet ili do dvadesetak aminokiselinskih ostataka.

[0051] Izraz "delecija aminokiselina" odnosi se na uklanjanje najmanje jedne amino kiseline iz unapred određene ili nativne aminokiselinske sekvence. Uklonjeni mogu biti jedan, dva, tri, četiri, pet ili do dvadesetak aminokiselinskih ostataka.

[0052] Izrazi "polipeptid", "peptid" i "protein" se ovde naizmenično koriste i odnose se na polimer aminokiselinskih ostataka. Izrazi se primenjuju i na aminokiselinske polimere u kojima jedna ili više aminokiselina nisu prirodno nastale aminokiseline, koje su sintetička aminokiselina ili mimetička aminokiselina.

[0053] Izraz "nukleinska kiselina" odnosi se na dezoksiribonukleotid ili ribonukleotid i njihove polimere u bilo kom obliku pojedinačnog lanca ili dvostrukog lanca. Izraz "nukleinska kiselina" se koristi naizmenično sa genom, nukleotidom, polinukleotidom, cDNK, DNK i iRNK. Osim ako se posebno ne ograničava taj izraz obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slična vezujuća svojstva kao prirodna nukleinska kiselina. Osim ako nije izričito ograničeno, određena nukleotidna sekvenca takođe obuhvata i konzervativno modifikovane varijante (na primer, one koje sadrže degenerisane supstitucije kodona) i komplementarne sekvence, kao i sekvence specifično opisane.

[0054] Polinukleotidi iz predmetnog pronalaska mogu se sastojati od bilo kog poliribonukleotida ili polidezoksiribonukleotida, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. Na primer, polinukleotidi mogu biti sastavljeni od jednolančanog ili dvolančanog regiona, mešanih jednolančanih ili dvolančanih regiona. Osim toga, polinukleotidi mogu biti trolančani regioni koji sadrže RNK ili DNK ili obe RNK i DNK. Modifikovani polinukleotidi uključuju modifikovane baze, kao što su tritilatovane baze ili neobične baze kao što je inozin. Na RNK i DNK mogu se napraviti različite modifikacije, tako da polinukleotid uključuje hemijski, enzimatski ili metabolički modifikovane oblike.

[0055] Izraz "derivatizovani" ili "derivat "odnosi se na jedinjenje, tj. fuzioni protein(e), koji ima ciklični deo, na primer, unakrsno vezivanje između cisteinilnih ostataka, jedinjenje, tj. fuzioni protein, je unakrsno povezano, jedna ili više peptidilnih veza se zamenjuje nepeptidnom vezom, ili je N-terminus zamenjen sa NRR1, NRC(O)R1, NRC(O)OR1, NHC(O)NHR1, NRS(O)2R2, sukcinamidom ili drugom grupom gde su R i R1definisani ovde i/ili je C-terminus zamenjen sa C(O)R3or NR4R5, i jedinjenje, tj. fuzioni protein(e), u kojme se aminokiselinski ostaci modifikuju tretmanima sa agensima sposobnim da reaguju sa izabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima. R je izabran iz grupe koju čine vodonik i C1-6alkil, R1je izabran iz grupe koju čine vodonik i C1-6alkil, R2je izabran iz grupe koju čine C1-6alkil, C3-8cikloalkil i opciono supstituisani fenil; R3je izabran iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-8cikloalkil; R4je izabran iz grupe koju čine vodonik i C1-6alkil; R5je izabran iz grupe koju čine vodonik, C1-6alkil i C3-8cikloalkil; ili R4i R5su uzeti zajedno sa azotom na koji su oni vezani formirajući 4 do 7-člani, zasićeni, prsten koji opciono ima jedan dodatni prstenasti heteroatom izabran iz grupe N, O i S.

[0056] Izraz "C1-6alkil" odnosi se na ravan ili razgranat alkilni lanac od jednog do šest atoma ugljenika.

[0057] Izraz "C3-8cikloalkil" se odnosi na monociklični ili biciklični, zasićeni ili delimično (ali ne u potpunosti) nezasićeni alkilni prsten od tri do osam atoma ugljenika, i obuhvata ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i slično. Podrazumeva se da izraz uključuje benzofuzionisani ciklopentil i cikloheksil.

[0058] Izraz "opciono supstituisani fenil" odnosi se na fenil grupu koja je opciono supstituisana sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabrana iz grupe koju čine halo, C1-6alkil, C1-

6alkoksi, cijano i trifluorometil.

PRIPREMANJE

[0059] Jedinjenja, tj. fuzioni proteini ovog pronalaska mogu se pripremiti standardnim sintetičkim metodama, rekombinantnim DNK tehnikama ili drugim postupcima za pripremu peptida i fuzionih proteina. U primeru postupka, hUTI domen je kovalentno povezan sa Fc domenom ekspresijom DNK konstrukta koji kodira UTI domen i Fc domen i bilo koji linker domen.

[0060] Predviđeni su alternativni načini konstrukcije UTI fuzionog proteina. U nekim izvođenjima, orijentacija domena može se izmeniti kako bi se konstruisao Fc-UTI molekul ili UTI-Fc molekul ili UTI-Fc-UTI molekul koji zadržava FcR vezivanje i ima aktivni UTI domen.

[0061] U nekim izvođenjima, UTI fuzioni proteini uključuju Fc domen divljeg tipa koji može dozvoliti da fuzioni protein prolazi kroz endocitozu nakon FcRn vezivanja (Fc neonatalni receptor). Prema tome, predmetni pronalazak dalje obezbeđuje metode za proizvodnju opisanih UTI fuzionih proteina. Ovi postupci obuhvataju kultivaciju ćelije domaćina sa izolovanom nukleinskom kiselinom koja kodira UTI fuzione proteine iz pronalaska. Kao što će se proceniti u struci, to se može uraditi na različite načine, u zavisnosti od prirode UTI fuzionog proteina. U nekim izvođenjima, UTI fuzioni protein iz pronalaska se proizvodi i može se izolovati.

[0062] Generalno, obezbeđene su nukleinske kiseline koje kodiraju UTI fuzioni protein iz pronalaska. Ovakvi polinukleidi kodiraju za UTI domen, za fuzionog partnera i bilo koji linker domen. Predmetni pronalazak takođe obuhvata oligonukleotidne fragmente izvedene iz opisanih polinukleotida i sekvenci nukleinske kiseline koji su komplementarni ovim polinukleotidima.

[0063] Polinukleotidi mogu biti u obliku RNK ili DNK. Polinukleotidi u obliku DNK, cDNK, genomske DNK, analoga nukleinske kiseline i sintetičke DNK su u okviru ovog pronalaska. DNK može biti dvolančana ili jednolančana, a ako je jednolančana, može biti kodirajući (sens) ili nekodirajući (antisens) lanac. Kodirajuća sekvenca koja kodira polipeptid može biti identična kodirajućoj sekvenci koja je ovde navedena ili može biti drugačije kodirajuća sekvenca, gde sekvenca, kao rezultat redundance ili degeneracije genetičkog koda, kodira iste polipeptide kao DNK koja je ovde data.

[0064] U nekim izvođenjima, nukleinska(e) kiselina(e) koja(e) kodiraju UTI fuzione proteine iz pronalaska ugrađena je u ekspresione vektore, koji mogu biti ekstrahromozomski ili dizajnirani da se integrišu u genom ćelije domaćina u koju su uvedeni. Ekspresioni vektori mogu sadržati bilo koji broj odgovarajućih regulatornih sekvenci (uključujući, ali ne ograničavajući se na, transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence, promotere, ribozomalna vezujuća mesta, pojačivače, poreklo replikacije itd.) ili druge komponente (selekcioni geni itd.), koje su sve funkcionalno povezane, kako je dobro poznato u ovoj oblasti. U nekim slučajevima se koriste dve nukleinske kiseline i svaka se stavlja u drugi ekspresioni vektor (npr. teški lanac u prvom ekspresionom vektoru, laki lanac u drugom ekspresionom vektoru), ili alternativno se mogu staviti u isti ekspresioni vektor. Stručnjaci iz oblasti će prepoznati da dizajn ekspresionog(ih) vektora, uključujući i izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što je izbor ćelije domaćina, nivo ekspresije željenog proteina itd.

[0065] Generalno, nukleinske kiseline i/ili ekspresije se mogu uneti u pogodnu ćeliju domaćina kako bi se stvorila rekombinantna ćelija domaćina koristeći bilo koji metod koji odgovara odabranoj ćeliji domaćina (npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, infekcija), tako da molekul(i) nukleinske kiseline su operativno povezani sa jednim ili više kontrolnih elemenata ekspresije (npr. u vektoru, u konstruktu stvorenom procesima u ćeliji, integrisanjem u genom ćelija domaćina). Dobijena rekombinantna ćelija domaćina može se održavati pod uslovima pogodnim za ekspresiju (npr. u prisustvu induktora, u pogodnoj nehumanoj životinji, u odgovarajućem kultivacionom medijumu koji je snabdeven sa odgovarajućim solima, faktorima rasta, antibioticima, nutritivnim dodatcima itd.), pri čemu su proizvedeni kodirani polipeptidi. U nekim slučajevima, teški lanci se proizvode u jednoj ćeliji a laki lanac u drugoj.

[0066] ûelijske linije sisara koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su poznate u struci i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije koje su dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA uključujući, ali ne ograničavajući se na ćelije Chinese hamster ovary (CHO), HEK 293 ćelije, NSO ćelije, HeLa ćelije, Baby hamster kidney (BHK) ćelije, monkey kidney (COS) ćelije, ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2) i niz drugih ćelijskih linija. ûelije ne-sisara, uključujući ali ne ograničavajući se na bakterije, kvasce, insekte i biljke, takođe se mogu koristiti za ekspresiju rekombinantnih antitela. U nekim izvođenjima, antitela mogu biti proizvedena u transgenim životinjama kao što su krave ili pilići.

[0067] U jednom izvođenju, fuzioni proteini iz pronalaska su kodirani nukleotidnom sekvencom. Nukleotidne sekvence iz pronalaska mogu biti korisne za niz primena, uključujući: kloniranje, genetsku terapiju, ekspresiju proteina i prečišćavanje, uvođenje mutacija, DNK vakcinaciju domaćina u potrebi za tim, generisanje antitela za, npr., pasivnu imunizaciju, PCR, prajmere i generisanje sonde, siRNK dizajn i generisanje i slično. U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca prema pronalasku sadrži, sastoji se od ili se suštinski sastoji od nukleotidne sekvence izabrane iz SEKV ID NO 2.

[0068] U jednom izvođenju nukleotidna sekvenca uključuje nukleotidnu sekvencu koja je identična nukleotidnoj sekvenci koja je navedena u SEKV ID NO 2. U jednom izvođenju nukleotidna sekvenca uključuje susednu nukleotidnu sekvencu sa najmanje 80%, 81%, 82%, 83% 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa susednom nukleotidnom sekvencom navedenom u SEKV ID BR: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32.

[0069] Opisani su UTI fuzioni proteini koji sadrže sekvence (npr., najmanje jedan Fc domen) izvedene iz humane imunoglobulinske sekvence. Međutim, sekvence mogu sadržati jednu ili više sekvenci iz drugih vrsta sisara. Na primer, primarni Fc domen ili nukleazni domen može biti uključen u predmetnu sekvencu. Alternativno, jedna ili više murinskih aminokiselina mogu biti prisutne u polipeptidu. U nekim izvođenjima polipeptidne sekvence iz ovog pronalaska nisu imunogene i/ili imaju smanjenu imunogenost. UTI fuzioni proteini prema pronalasku mogu da sadrže konzervativne supstitucije aminokiselina u jednom ili više aminokiselinskih ostataka, npr., u esencijalnim ili neesencijalnim aminokiselinskim ostacima.

"Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj se aminokiselinski ostatak zamenjuje aminokiselinskim ostacima koji imaju sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u stanju tehnike, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, neesencijalni aminokiselinski ostatak u vezujućem polipeptidu je poželjno zamenjen drugim aminokiselinskim ostacima iz iste porodice bočnih lanaca. U još jednom izvođenju, niz aminokiselina može se zameniti strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova familije bočnog lanca. Alternativno, kao što je ovde opisano, mutacije mogu biti nasumično uvedene duž celokupne ili u delu kodirajuće sekvence, na primer putem mutageneze zasićenjem, a rezultujući mutanti mogu biti inkorporisani u vezujuće polipeptide iz pronalaska i ispitani da li poseduju sposobnost da se vezuju za željeni cilj.

PRIMENA

[0070] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje metode dijagnostikovanja i lečenja stanja povezanih sa UTI. Kako se ovde koriste termini "stanje", "poremećaj" i "bolest" odnose se na bilo koje nezdravo ili abnormalno stanje. Izraz "stanja povezana sa UTI" uključuju stanja, poremećaje i bolesti u kojima UTI pruža terapeutsku korist. Izraz "stanja povezana sa UTI" obuhvataju stanja koje karakteriše imunomodulatorni ili inflamatorni efekat. Posebno, izraz stanja povezana sa UTI uključuje pankreatitis, uključujući akutni pankreatitis i hronični pankreatitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora, akutno cirkulatorno otkazivanje (npr. izazvano šokom), diseminiranu intravaskularnu koagulaciju i sindrom multiple disfunkcije organa. Izraz stanja povezana sa UTI takođe uključuje i primenu kod visoko rizičnih hirurških pacijenata. Izraz stanja povezana sa UTI takođe uključuje infekcije pluća, jetre, srca ili bubrega. Izraz stanja povezana sa UTI takođe uključuje i tešku sepsu. Izraz stanja povezana sa UTI takođe uključuje akutnu povredu pluća (ALI) uzrokovanu virusom SARS-a ili akutni respiratorni stresni sindrom (ARDS).

[0071] U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje stanja povezanog sa UTI, što uključuje davanje pacijentu kojem je to potrebno efektivne količine, na primer, farmaceutski efektivne količine opisanog UTI fuzionog proteina. U određenim izvođenjima, stanje je specifično pomenuto ovde.

[0072] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska su pripremljene na način dobro poznat u farmaceutskoj oblasti i uključuju bar jedan od UTI fuzionih proteina iz pronalaska kao aktivni sastojak. Farmaceutski sastav UTI fuzionih proteina koji se koriste u skladu sa ovim pronalaskom pripremaju se mešanjem UTI fuzionog proteina koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima. Termin "farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" se odnosi na one koji se tipično koriste za pripremu farmaceutskih kompozicija i treba da budu farmaceutski čisti i netoksični u korišćenim količinama. Oni su obično čvrsti, polučvrsti ili tečni materijali koji u agregatu mogu poslužiti kao nosioc ili medijum za aktivni sastojak. Neki primeri farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata nalaze se u Remington’s Pharmaceutical Sciences i Handbook of Pharmaceutical Excipients i uključuju diluente, nosioce, nosače, matrice sa produženim oslobađanjem, sredstva za stabilizaciju, konzervanse, rastvarače, sredstva za suspendovanje, pufere, emulgatore, sredstva za premazivanje i druge. Generalno za injekcije ili intravenoznu primenu, UTI fuzioni proteini iz ovog pronalaska su u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora.

[0073] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti su netoksični prema subjektima u korišćenim količinama i uključuju pufere kao što su fosfatni, citratni, i drugih organskih kiselina; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol; polipeptida male molekulske mase (sa manje od 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumini, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuće agense kao što su EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; katjone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., Zn-protein kompleksi); i/ili nejonske površinski aktivne materije kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0074] Ovde navedeni farmaceutski preparati mogu takođe sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja, tj. fuzionog proteina, po potrebi za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno ona koja imaju komplementarne aktivnosti i koja ne utiču negativno jedni na druge. Takvi molekuli su odgovarajuće prisutni u kombinaciji u količinama koje su efektivne u svrhu predviđene namene.

[0075] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu treba da budu sterilne, ili skoro sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

[0076] UTI fuzioni proteini prema pronalasku se primenjuju na subjektu, u skladu sa poznatim metodama, kao što je intravenozna primena kao što je bolus ili kontinualna infuzija tokom određenog perioda vremena, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, subkutano, intraartikularno, intrasinovijalno ili intratekalnao injektiranje ili infuzija ili putem topikalnih ili inhalacionih puteva. Poželjna je intravenozna ili subkutana administracija UTI fuzionog proteina.

[0077] Izrazi "lečenje", "tretman" i "tretiranje" uključuju poboljšanje stanja koja su ovde opisana. Izrazi "lečenje", "tretman" i "tretiranje" uključuju sve postupke koji omogućavaju usporavanje, prekidanje, umirenje, kontrolu ili zaustavljanje stanja ili napredovanje stanja opisanih ovde, ali ne ukazuju obavezno na potpunu eliminaciju svih simptoma ili izlečenje stanja. Izrazi "lečenje", "tretman" i "tretiranje" imaju nameru da uključe terapeutski tretman takvih poremećaja. Izrazi "lečenje", "tretman" i "tretiranje" imaju nameru da obuhvate profilaktički tretman takvih poremećaja.

[0078] Kao što se ovde koristi, pojmovi "pacijent" i "subjekt" uključuju ljude i ne-humane životinje, na primer, sisare, kao što su miševi, pacovi, morske prasiće, pse, mačke, zečeve, krave, konje, ovce, koze i svinje. Termin takođe uključuje i ptice, ribe, reptile, vodozemce i slično. Podrazumeva se da je određeniji pacijent čovek. Takođe, određeniji pacijenti i subjekti su ne-humani sisari, kao što su miševi, pacovi i psi.

[0079] Kako se ovde koristi, pojam "efektivna količina" odnosi se na količinu jedinjenja, tj. fuzionog proteina, prema pronalasku kojom se tretira, nakon pojedinačne ili višestruke doze, pacijent koji pati od pomenutog stanja. Efektivna količina se može lako odrediti od strane odgovarajućeg dijagnostičara kao medicinskog stručnjaka, kao što je lekar ili veterinar kao stručni u oblasti, korištenjem poznatih tehnika i posmatranjem rezultata dobijenih pod analognim okolnostima. Na primer, medicinski stručnjak može započeti doziranje medikamenta koji se koristi u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima nižim od onog koji je potreban za postizanje željenog terapeutskog efekta i postepeno povećavati doze dok se ne postigne željeni efekat.

[0080] Pri određivanju efektivne količine doze, brojni faktori se mogu razmatrati od strane prisutnog dijagnostičara, uključujući, ali ne ograničavajući se na: vrstu pacijenta; njegovu veličinu, starost i opšte zdravlje; specifično stanje, poremećaj ili bolest; stepen ili napredovanje ili ozbiljnost stanja, poremećaja ili bolesti, odgovor individualnog pacijenta; samo jedinjenje, tj. fuzioni protein koji se primenjuje; način primene; karakteristike bioraspoloživosti primenjenog preparata; izabrani režim doziranja; istovremena upotreba drugih lekova; i druge relevantne okolnosti. Specifična količina se može odrediti od strane stručne osobe. Iako se ova doziranja zasnivaju na prosečnom humanom subjektu koji ima masu od oko 60 kg do oko 70 kg, lekar će moći da odredi odgovarajuću dozu za konkretnog pacijenta (npr. dete) kod koga je masa izvan ovog opsega težine.

[0081] Režim doziranja se prilagođava kako bi se dobio željeni odgovor. Na primer, jedan bolus može biti administriran, nekoliko odvojenih doza se može administrirati tokom vremena ili doza se može proporcionalno smanjiti ili povećati, kao što je indikovano potrebama terapeutske situacije.

[0082] Parenteralne kompozicije se mogu formulisati u jedinične dozne oblike za lakšu primenu i uniformnost doziranja. Jedinični dozni oblici kao što se ovde koristi odnose se na fizički ograničene jedinice koje su pogodne za jedinične doze za subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja, tj., fuzionog proteina, koja je proračunata da bi se dobio željeni terapeutski efekat u sprezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem.

[0083] Predmetne farmaceutske kompozicije se poželjno formulišu u obliku jedinične doze, a svaka doza tipično sadrži od oko 0,5 mg do oko 100 mg UTI fuzionog proteina iz ovog pronalaska. Izraz "jedinični dozni oblik" odnosi se na fizički ograničenu jedinicu koja sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka, u sprezi sa odgovarajućim farmaceutskim ekscipijentom, od koga se jedan ili više koriste tokom režima doziranja kako bi se dobio željeni terapeutski efekat. Jedan ili više "jediničnih doznih oblika" mogu se uzeti kako bi se uskladili sa doziranjem tokom lečenja.

[0084] Jedan primer, bez ograničavanja, za opseg efektivne količine UTI fuzionog proteina koji se koristi u ovom pronalasku je oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, na primer oko 0,1-20 mg/kg, kao što je oko 0,1-10 mg/kg, na primer oko 0,5 mg/kg, oko 0,3 mg/kg, oko 1 mg/kg ili oko 3 mg/kg. U drugom izvođenju, UTI fuzioni protein se primenjuje u dozi od 1 mg/kg ili više, kao što je doza od 1 do 20 mg/kg, npr. doza od 5 do 20 mg/kg, npr.

doza od 8 mg/kg. Jedan primer, bez ograničavanja za opseg efektivne količine UTI fuzionog proteina koji se koristi u predmetnom pronalasku je oko 1-500 mg/doziranju, kao što je oko 1-100 mg/doziranju, na primer oko 1-50 mg/doziranju, kao što je oko 1-10 mg/doziranju, na primer oko 1 mg/doziranju ili oko 3 mg/ doziranju, ili oko 5 mg/ doziranju.

U jednom izvođenju, UTI fuzioni protein se daje infuzijom na svaka 3 dana ili nedeljno u dozi od 10 do 500 mg/doziranju. Ovakva administracija se može ponoviti, ako je potrebno, da bi se održao željeni terapeutski efekat.

[0085] Kao neograničavajući primeri, tretman prema predmetnom pronalasku može biti obezbeđen doziranjem UTI fuzionog proteina u količini od oko 0,1-100 mg/kg, kao što je 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg dnevno, najmanje jedan dan; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 mg/kg, ili alternativno najmanje jednom nedeljno 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 mg/kg nakon početka terapije ili bilo koje njihove kombinacije. Kao neograničavajući primeri, tretman prema predmetnom pronalasku može biti obezbeđen doziranjem UTI fuzionog proteina u količini od oko 1-100 mg/dozu, kao što su 1, 5, 10, 20, 30, 40, 45, 50 , 60, 70, 80, 90, 100150, 200, 250, 300, 350 ili 400 mg/doziranju. Najmanje jednom dnevno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 mg/ doziranju nakon početka terapije ili bilo koje njihove kombinacije. Barem jednom nedeljno, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/doziranju, nakon početka terapije ili bilo koje njihove kombinacije.

[0086] UTI fuzioni proteini pronalaska imaju upotrebu u različitim primenama, uključujući i tretman bolesti povezanih sa UTI. UTI fuzioni proteini prema pronalasku mogu da se koriste u lečenju bolesti kod kojih je uključen imuni sistem, autoimunskih bolesti, inflamatornih bolesti, post-operativnog inflamatornog odgovora, bolesti povezanih sa lizozomom, koagulacijskih bolesti povezanih sa proteazama i kao adjuvantne terapije tokom operacije. UTI fuzioni proteini prema pronalasku mogu da se koriste za lečenje pankreatitisa (uključujući endoskopijom indukovani pankreatitis i akutni pankreatitis), artritisa, SARS-a, sindroma sistemskog inflamatornog odgovora, akutnog cirkulatornog otkazivanja, sepse, hepatitisa, apendicitisa, kolitias, otkazivanja organa, oštećenja organa (uključujući i pankreas, bubreg, pluća), povreda reperfuzije, Stevens-Johnsonov-og sindroma, toksične epidermalne nekrolize, šoka, ishemijske povrede, akutne povrede pluća (uključujući i akutnu disekciju aorte), astme, upale pluća, pneumonije, diseminirane intravaskularne koagulacije (DIC), akutnog respiratornog stresnog sindroma (ARDS) i sindroma sistemskog inflamatornog odgovora.

[0087] UTI fuzioni proteini prema ovom pronalasku mogu da se koriste u inhibiciji proteaza, uključujući serinske proteaze, uključujući tripsin, himotripsin, trombin, kalikrein, plazmin, elastazu, katepsin, lipazu, hijaluronidazu, faktore IXa, Xa, XIa i XlIa i polimorfonuklearnu leukocitnu elastazu.

[0088] UTI fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu naći upotrebu u supresiji proinflamatornih medijatora, kao što su citokini, tumorski nekrozni faktor-alfa, interleukin-1, -1 ȕ, -4, -6 i -8, -10 i hemokini.

[0089] UTI fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu da se koriste u lečenju kancera, uključujući sprečavanje invazije tumora i metastaza, izmenjene brzine apoptoze i smanjenje gubitka bubrežne funkcije kod lečenja cisplatinom.

[0090] UTI fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu naći upotrebu za lečenje AIDS-a, uključujući i kao dodatni tretman.

PRIMERI

[0091] Dalje su opisani primeri specifičnih rešenja za izvođenje predmetnog pronalaska. Primeri su dati samo za ilustrativne svrhe i nije im namena da na bilo koji način ograniče obim ovog pronalaska. Uloženi su napori kako bi se osigurala tačnost u odnosu na brojeve koji se koriste (npr. količine, temperature, itd.), ali treba, naravno, uzeti u obzir moguću eksperimentalnu grešku i odstupanje. Praktikovanje iz ovog pronalaska će koristiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode proteinske hemije, biohemije, tehnike rekombinantne DNK i farmakologije, u okviru veštine u oblasti. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc.); Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory J\1anual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowlck and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B (1992).

PRIMER 1: Konstrukcija DNK vektora koji kodiraju UTI fuzione proteine

[0092] Metode za izvođenje molekularne biologije poznate su u stanju tehnike i mogu se naći, na primer, u Molecular Cloning: A laboratory Manual 4th edition (Micheal Green and Joseph Sambrook, Cold Spring Harbor Press, 2012).

[0093] Gen koji kodira UTI-Fc1 je uređen korišćenjem usluge GeneArt kodon-optimizovane sinteze gena iz Life Technologies (Carlsbad, CA). Proteinska sekvenca je navedena u SEKV ID BR: 1 sa signalnim peptidom, MGWSCIIL-FLVATATGVHS, dodatim za sekreciju. Na Slici 1 prikazani su opšti regioni UTI koji se koriste u fuziji. Gen koji kodira UTI-Fc1 je ligiran u ekspresioni vektor sisara. Ekspresioni vektori sisara su poznati u struci uključujući pSecTag2/Hygro A, pcDNA4 i pcDNA6 vektore (Life Technologies, Carlsbad CA). Vektor je digestiran restrikcionim enzimima, HindIII-HF i EcoRI iz ew England Biolabs (NEB). Ovaj fragment je ligiran u ekspresioni vektor koji obezbeđuje rezistenciju na karbenicilin i bio je digestiran istim restrikcionim enzimima. Korišćen je molarni odnos od 1: 3 za vektor: umetak u ligaciji. Ligirana DNK je transformisana u 10-beta hemijski kompetentne ćelije E.coli iz NEB, koje su stavljene na ploče sa LB-karbenicilinom za rast preko noći. Kolonije su rasle tokom noći u LB sa karbenicilinom i miniprep DNK je pripremljena sa Qiagen’s QIAprep Spin Miniprep Kit-om (Qiagen, Hilden, Germany).

DNK je zatim sekvencionisana korišćenjem usluga DNK sekvencioniranja iz Bio Applied Technologies Joint (BATJ, San Diego). Kolonija verifikovana sekvencioniranjem je kasnije uzgajana u LB medijumu sa karbenicilinom za prečišćavanje DNK pomoću BenchPro 2100 instrumenta i MaxiCard iz Life Technologies.

PRIMER 2: Konstrukcija DNK vektora koji kodiraju varijante UTI-Fc fuzionih proteina

[0094] SEKV ID BR: 1-28 lista DNK i proteinskih sekvenci nekih UTI-Fc fuzionih proteina. Ovi UTI fuzioni proteini sadrže modifikacije koje menjaju Ig izotope, linkere, UTI domen, redosled UTI i Fc domena (N- ili C-terminuse), UTI vrste, Fc vrste, UTI start/stop rezidue, vezivanje šećera, proteaza senzitivnih mesta i funkciju Fc efektora. Neki UTI-Fc proteini su prikazani na Slikama 2 i 3. UTI-Fc fuzioni proteini koji sadrže tri modifikacije aminokiselina Ser (IgG1 Fc3Ser, C154S/P172S/P265S) sadrže mutacije za promenu formiranja disulfidnih veza i FcȖR funkcija.

Kreiranje UTI-Fc ekspresionih konstrukta

[0095] Nukleotidne sekvence UTI (npr. varijante divljeg tipa, S10A i K21S K22S varijante) i humani Fc3Ser domeni su bili kodon optimizovani za ekspresiju CHO ćelija i sintetizovani od strane Life Technologies (Carlsbad, CA). Sledeći konstrukti su kreirani u CHO ekspresionom vektoru kombinovanjem UTI i Fc3Ser domena putem metode sekvencioniranja i od ligacije nezavisnog kloniranja (SLIC) (Li and Elledge 2007 Nature Methods 4(3):251-256): UTI-Fc3Ser, UTI S10A-Fc3Ser, UTI K21S K22S-Fc3Ser, UTI m2-Fc3Ser, UTI Ll-Fc3Ser, UTI L2-Fc3Ser (Slika 4A). DNK sklop zasnovan na SLIC-u je urađen mešanjem linearizovanog vektora (30 ng), UTI (100 ng) i Fc3Ser (100 ng) PCR proizvoda sa odgovarajućim nadvišenim sekvenama za homolognu rekombinaciju i T4 DNK polimeraze (0.5 U) u 5 mL zapremine koja sadrži NEBuffer 2 i BSA (New England Biolabs). Nakon 30 min inkubacije na sobnoj temperaturi, egzonukleazna aktivnost T4 DNK polimeraze je kvenčovana dodavanjem 2 mM dCTP. Tada je homologna rekombinacija in vitro obavljena sa temperaturnim gradijentom od 75°C do 37°C tokom 30 min. Reakciona smeša koja sadrži sklopljenu DNK je hemijski transformisana u TOP10 E. coli (Invitrogen) I naneta na ploču LB agara sa karbenicilinom. Otvoreni okviri čitanja za preostale konstrukte (UTI mL-Fc3Ser, UTI dl-Fc3Ser, UTI d2-Fc3Ser, UTI L3-Fc3Ser, UTI-Fc IgG2, Fc3Ser-UTI i mišji UTI miša IgGI) su kodon optimizovani i sintetisani kao fuzioni konstrukti. Ovi konstrukti su klonirani u ekspresioni vektor koristeći SLIC metod kao što je gore opisano (Slika 4B). DNK sekvence svih 13 konstrukta u vektoru potvrđena je Sanger DNK sekvencioniranjem.

PRIMER 3: Ekspresija UTI-Fc fuzije u CHO ćelijama.

[0096] DNK vektor koji kodira UTI-Fc1 je stabilno transfektovan u CHO-S ćelije koristeći Invitrogen Freestile MAX Reagent. Serije kulture su zasejane u T-posude i odabrane pomoću CD CHO dopunjene različitim koncentracijama metionin sulfoksimina (MSKS) u rasponu od 50-100 mM. Jednom kada je kultura izdvojena nakon selekcije, ona je umnožena za proizvodnju i krioprezervaciju. Višestruke proizvodne serije su uradjene kako bi se podržalo in vitro i in vivo testiranje. Proces proizvodnje je 10-14 dnevna serija kulture korišćenjem CD FortiCHO, CD Efficient Feed B i CD Efficient Feed C iz Invitrogen-a. Proizvodne zapremine su se kretale od 1L-3L, a kulture su sakupljane centrifugiranjem na 3500 rpm tokom 1-2 sata, nakon čega sledi sterilna filtracija supernatanta a dobijeni supernatant je korišćen u prečišćavanju.

PRIMER 4: Prečišćavanje UTI-Fc fuzionih proteina.

[0097] Prečišćavanje 2 serije UTI-Fc1 obavljeno je primenom 2,3 litre CHO ćelijskog kondicioniranog medijuma sa eksprimiranim UTI-Fc1 u 30 mL proteina A mAb select 1x (GE healthcare) ekvilibriranog u 25mM trinatrijum citrata sa pH 8.1, 125mM NaCl. Kolona je isprana sa 2 kolonske zapremine (60 mL) 25mM trinatrijum citrata pH 8.1, 125mM NaCl, a zatim sa 2 kolonske zapremine (60 mL) 25mM trinatrijum citrata pH 8.1, 2000mM NaCl. Kolona je zatim ekvilibrirana sa 2 kolonske zapremine (60 mL) 25mM trinatrijum citrata pH 8.1, 125mM NaCl. UTI-Fc1 je eluiran sa 7 kolonskih zapremina (210 mL) gradijentom do 100% 25 mM limunske kiseline pH 2.9, 125 mM NaCl. UTI-Fc1 je eluiran kao dva pika, širok, bočni vrh sa približnim pH od 5,5 i oštriji vrh na približno pH od 3.5. Zatim je koncentrovani UTI-Fc zamenjen puferom u finalni pufer TBS pH 7.4 (25mM tris, 130mM NaCl, 2.7mM KCl pH 7.4) korišćenjem Amicon Ultra centrifugalnih koncentratora sa 30K M.W.C.O. Prinos prečišćenih proteina prikazan je u TABELI 1 a protein je čuvan na - 80°C za dalju upotrebu.

TABELA 1

PRIMER 5: Ekspresija i prečišćavanje dodatnih UTI-Fc fuzionih proteina

[0098] Na dan transfekcije, CHO ćelije su prebrojane i zasejane u gustini od 2,2x10^6 živih ćelija/ mL u 90% ukupne zapremine - 900 mL i uzgajane u orbitalnom šejkeru na 33°C do postizanja transfekcije. Smrznuta DNK je odmrznuta i dodata u PEI (polietilenimin-kationski polimer) i AKT. DNK je dodata u koncentraciji od 0,625 Pg/1 milion ćelija.1L ćelija zahteva 1,25 mg.90% ukupne dodate DNK je DNK od interesa = 1,125 mg. Preostalih 10% je AKT (kodirani anti-apoptotički protein) = 0,125 mg. PEI je dodan u koncentraciji od 2,5 Pg/l milion ćelija. Za 1 L izvođenja transfekcije to je 5 mg. PEI rastvor je dodat u razblaženu DNK i inkubiran na sobnoj temperaturi 15 minuta pre dodavanja kompleksa DNK u ćelije.

[0099] Kulture su gajene na 33°C, 5% CO2 i 125 rpm.1 do 4 sata posle transfekcije, 0.6 mM valprojske kiseline je dodato. Za 1L transfekciju, ovo je bilo 2 ml 300 mM stoka. Na dan 1, dodato je 1:250 anti-klamping agensa, tj.4 mL/1L i 15% v/v CD Efficient Feed C, to jest 150 mL/lL. Na dan 5. i dan 9. je dodato 15% CD Efficient Feed C.

[0100] Supernatanti ćelija su sakupljani na dan 14., ćelije su izbrojane i određeni su titri proteina. ûelije su izdvojene centrifugiranjem na 3000 rpm tokom 30 minuta na 4°C.

Supernatanti su filtrirani kroz filter od 0,2 mikrona i skladišteni na 4°C ili zamrznuti na -20°C.

[0101] Prečišćavanje UTI-Fc fuzija obavljeno je pomoću proteinske A hromatografije.200 mL supernatanta ćelijske kulture je pomešano sa 2 mL MabSelect Sure Protein A Sepharoza perlica i šejkirano preko noći na 4°C. Mešavina perlica je zatim centrifugirana u 50 ml tubama pri 1200 rpm tokom 5 minuta i supernatant je odbačen. Perlice su dodate u kolonu i isprane tri puta sa vezivnim puferom (Biorad, Hercules, CA). UTI-fuzije su eluirane sa 8 ml MAPS II Elution pufera (Biorad, Hercules, CA). Dodato je 2 mL rastvora za neutralizaciju (1M Tris-HCl pH 8). Uzorci su tada puferski razmenjivani u 25 mM citrata, 125 mM NaCl, pH 5.5 sa ponovljenim koncentrisanjem i razblaživanjem puferom pomoću Amicon centrifugalnih jedinica (30 MWCO, 15 mL, Millipore). Na slici 9 prikazani su rezultati prečišćavanja različitih UTI fuzionih proteina.

PRIMER 6: Inhibicija proteaza putem UTI fuzionih proteina

[0102] In vitro enzimski test za inhibiciju tripsina putem UTI-Fc fuzionog proteina

[0103] Rastvori UTI-Fc1 u različitim koncentracijama (<200 nM konačne koncentracije) su pripremljeni u 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM CaCl2 i 0.01% Brij L23, pH 7.4. Analize aktivnosti su obavljene u Greiner 384 pločama sa bunarčLćima malih zapremina. Svi koraci su sprovedeni na ambijetalnoj temperaturi.

[0104] Humani pankreasni tripsin (1,5 nM konačna koncentracija) (Athens Research & Technology, Inc) dodat je u rastvor koji je preinkubiran sa test UTI-Fc u toku 15 minuta. Zatim, reakcija je inicirana sa 100 PM (konačnih) supstrata N-benzoil-L-arginin-7-amido-4-metilkumarin hidrohlorida SIGMA B7260-25MG. Ukupna zapremina reakcione smeše bila je 20 l. Aktivnost tripsina određena je putem fluorescencije. Za prajmer, intenzitet fluorescencije je određen u kinetičkom režimu kroz okvir od 30 do 60 minuta na BMG PHERAstar FS ili PHERAstar plus koristeći talasnu dužinu ekscitacije od 370 nm i emisionu talasnu dužinu od 470 nm. Aktivnost tripsina bila je linearno proporcionalna promenama u posmatranoj fluorescenciji (finalni - početni). Procenat inhibicije tripsina u datoj koncentraciji UTI-Fc definisan je kao:

Procent inhibicije = 100 * (l-((Fi - Fp)/(Fn - Fp)))

[0105] Gde: Fi je bila uočena fluorescencija pri datoj koncentraciji testiranog UTI-Fc.

[0106] Fp je bila posmatrana fluorescencija pozitivne kontrole, tj. prosečna vrednost od 2 do 6 ispitivanja u odsustvu tripsina.

[0107] Fn je bila posmatrana fluorescencija negativne kontrole, tj. prosečna vrednost od 2 do 6 ispitivanja tripsina u prisustvu samog rastvora.

[0108] IC50 (molarna koncentracija jedinjenja, tj. fuzionog proteina, koja daje 50% inhibicije) testiranog jedinjenja, tj. fuzionog proteina, izračunava se pomoću fitovanja nelinearne krive najmanjih kvadrata jednačine Procenat inhibicije = Dno ((Vrh-Dno) / (1 ((IC50 / [UTI-Fc])^Hill))). Uključen unutar panela UTI-Fc je bio jedna pozitivna kontrola. Kao što je prikazano na Slici 5, humani UTI ima IC50 od ~3 nM.

[0109] Merenje inhibicije drugih proteaza sa UTI-Fc1 takođe je mereno u Reaction Biology Corporation (Malvern, PA). Slika 6 prikazuje UTI-Fc1 inhibiciju himotripsina. Na Slici 7 prikazane su inhibitorne konstante UTI-Fc1 za razne proteaze. UTI-Fc1 umereno inhibira himotripsin i plazmin i pokazuje slabu inhibiciju kaspaze-1, katepsina C i papaina.

PRIMER 7: ûelijski efekti tretmana sa UTI fuzionim proteinima

[0110] UTI-Fc1 inhibicija ispuštanja citokina bila je mera u ćelijskom testu. BEAS2B ćelije su zasejane u gustini od 20.000 ćelija/bunarčLću na ploči sa 96 bunarčLća i kultivisane, korišćenjem kompleta BEGM Bullet Kit (Lonza) u CO2 inkubatoru. Posle 24 časa, medijum za kultivaciju je zamenjen čistim DMEM za gladovanje, a ćelije su kultivisane preko noći. Tada su ćelije inkubirane sa svežim čistim DMEM koji sadrži 100 nM tripsina sa različitim koncentracijama humanih urinskih UTI ili rekombinantnih UTI-Fc1 proteina. Nakon 8 sati, supernatanti kulture su sakupljeni i procenjeni su nivoi proteina IL-6 koristeći humani IL-6 DuoSet (R&D Systems).

[0111] Rezultati pokazuju da su i UTI i UTI-Fc smanjili produkciju IL-6 indukovanu tripsinom u BEAS2B ćelijama. Kao što je prikazano na slici 8, inhibicija je zavisna od doze sa vrednostima IC50 od 0,40 i 0,41 mg/mL, respektivno.

PRIMER 8

[0112] Merenja stabilnosti molekula UTI-Fc - Termička denaturacija

[0113] Ispitivanja su izvedena kako bi se merila termička i stabilnost u stvarnom vremenu. Svi molekuli demonstrirali su aktivnost inhibicije tripsina. Termička stabilnost merena je diferencijalnom skenirajućom kalorometrijom na Microcal VP-DSC kalorimetru. Uzorci su pripremljeni u koncentraciji od 1 mg/mL i puferisani u 0.25 mM Tris pH 7.4, 0.13 M NaCl i 0.0027M KCl. Uzorci su zagrevani od 25°C do 110°C brzinom od 200°C na sat. UTI-Fc1 je upoređivan sa Application Publication Number CN 103044554 A, SEK ID 2 i 6, koje sadrže IgG2 ili IgG1 Fc domen, respektivno. Rezultati su prikazani u Tabeli 8.

TABELA 8

PRIMER 9

Merenja stabilnosti u realnom vremenu

[0114] Merenja stabilnosti u realnom vremenu izvršena su inkubiranjem SEKV ID BR: 1 (UTI-Fcl) ili CN 103044554 A, SEK ID 2 ili 6 na 2-8°C i 40°C 0,2 i 4 nedelje u TBS, pH 7.4 puferu. Formiranje vrsta viših i nižih molekulskih masa određeno je hromatografijom za isključivanje veličine (SEC) i vizualizovano sa poliakrilamidnom gel elekroforezom (PAGE). Koncentracija svakog UTI-Fc takođe je praćena određivanjem apsorbance rastvora na 280 nm (A280), koristeći koeficijente ekstinkcije određene sa proteinskim sastavom. Molekuli UTI-Fc su proizveli dva delimično preklopljena pika, kada su analizirani sa SEC. Procenat površine pika za svaki uzorak UTI-Fc meren sa SEC je prikazan u Tabeli 9 za period vremena = 0 nedelja, 2 nedelje i 4 nedelje. Takođe je prikazana procentualna promena koncentracije izmerena na A280 (% ǻ (mg/mL)) u vremenu = 2 nedelje i 4 nedelje. Inicijalna T0 koncentracija u svakom uzorku bila je UTI-Fc1 = 33.5 mg/mL, CN 103044554 A SEKV ID 2 = 8.5 mg/mL i CN 103044554 A SEKV ID 6 = 5.6 mg/mL. Varijabilnost od 3% je tipična za SEC i 15% za pojedinačna UV merenja. Analiza sa PAGE pokazala je da svaki UTI-Fc molekul pokazuje očekivane obrasce za UTI-Fc u punoj dužini.

TABELA 9.

PRIMER 10

In vivo testovi inhibicije komplementa.

[0115] Uticaj UTI-Fc1 (SEKV ID BR: 1) na sistem komplementa meren je in vivo. Ženke, C3h/HeJ miševa su kupljeni od Jackson Laboratories. Životinje se doziraju prema eksperimentalnom dizajnu iz Tabele 10. Životinje su injektirane i.p. (100 Pl/mišu) 15 minuta posle doze sa LPS u nultom vremenu. Životinje su eutanizovane u 2 i 4 satu posle ubrizgavanja LPS-a predoziranjem sa CO2, a krv je sakupljena kardijačnom punkturom. Krv je prebačena u mikrotrubce separatora seruma i ostavljena je da se zagreva na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon toga, mikrotube su centrifugirane na 12.000 rpm tokom 5 minuta, a serum je uklonjen i alikvotiran na ploči sa 96 bunarčLća. Rosmarinska kiselina je korišćena kao pozitivna kontrola i korišćena je kao 3 mg/mL u fiziološkom rastvoru. Ploča sa 96 bunarčLća je zamrznuta na -20°C. Uzorci seruma analizirani su na sadržaj C5a pomoću duoseta. Statistička značajnost određena je korišćenjem Prism grafičkog softvera, a efekti se smatraju statistički značajni ako je p <0.05. Kao što je prikazano na Slici 10, SEKV ID BR:1 (UTI-Fcl) značajno je smanjio C5a pri koncentraciji od 20, 50 i 100 mg/kg u toku 4 sata nakon LPS doziranja.

TABELA 10: Eksperimentalni dizajn (UTI-Fc1 je SEQ ID:1)

LISTA SEKVENCI

[0116]

Claims

Patentni zahtevi

1. UTI fuzioni protein koji obuhvata SEKV ID BR:1.

2. Izolovani UTI fuzioni protein koji obuhvata SEKV ID BR:1.

3. UTI fuzioni protein kao što je definisan u bilo kojem od zahteva 1 i 2, pri čemu je fuzioni protein dimer i sadrži Fc domene koji su povezani kovalentno.

4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži UTI fuzioni protein kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1, 2 i 3 i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.

5. UTI fuzioni protein kao što je definisan u bilo kojem od zahteva 1, 2 i 3 za upotrebu kao lek.

6. UTI fuzioni protein kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1, 2 i 3 za upotrebu u lečenju pankreatitisa, uključujući endoskopijom indukovani pankreatitis i akutni pankreatitis; artritis, SARS, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora, akutne cirkulatorna insuficijencije, sepse, hepatitisa, apendicitisa, kolitisa, insuficijencije organa, oštećenja organa, uključujući oštećenje pankreasa, bubrega ili pluća; reperfuzione povrede, Stevens-Johnsonov-og sindroma, toksične epidermalne nekrolize, šoka, ishemijske povrede, akutne povrede pluća, uključujući povrede pluća uzrokovane akutnom disekcijom aorte; astme, inflamacije pluća, pneumonije, uključujući ventilator-povezane pneumonije; diseminirane intravaskularne koagulacije ili akutnog respiratornog stres sindroma.

7. Nukleinska kiselina koja sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira SEKV ID BR:1.

8. Vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu kako je definisana u zahtevu 7

9. Rekombinantna ćelija domaćina koja sadrži ekspresioni vektor kao što je definisan u zahtevu 8.

10. Postupak za proizvodnju UTI fuzionog proteina, koji obuhvata: postavljanje rekombinantne ćelije domaćina kako je definisana u zahtevu 9 u medijumu za rast, tako da se eksprimira rekombinantni fuzioni protein i izolovanje rekombinantnog fuzionog proteina iz ćelije ili medijuma za rast.