RS58916B1 - Ciljani terapeutski lizozomalni fuzioni proteini i njihova primena - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na terapeutske fuzione proteine koji su korisni u tretmanu bolesti lizozomalnog skladištenja i postupke za tretman takvih bolesti. Primeri terapeutskih fuzionih proteina obuhvataju lizozomalni enzim, lizozomalni ciljani deo, npr., IGF-II peptid, i spejser peptid. Smatra se da je lizozomalni enzim alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) i da je bolest mukopolisaharidoza tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom).

STANJE TEHNIKE

[0002] Normalno, lizozomalni enzimi kod sisara se sintetišu u citosolu i prelaze ER gde su glikozilovani sa N-vezanim, visoko manoznim ugljenim hidratom. U goldžiju, visoko manozni ugljeni hidrat je modifikovan na lizozomalnim enzimima dodavanjem manoza-6-fosfata (M6P) koji cilja ove proteine na lizozom. M6P-modifikovani proteini se dostavljaju u lizozom preko interakcije sa bilo kojim od dva M6P receptora. Najpovoljniji oblik modifikacije je kada se dva M6P dodaju visoko manoznom ugljenom hidratu.

[0003] Više od četrdeset bolesti lizozomalnog skladištenja (LSD) je prouzrokovano, direktno ili indirektno, odsustvom jednog ili više lizozomalnih enzima u lizozomu. Aktivno se traga za terapijom zamene enzima za LSD. Terapija generalno zahteva da se LSD proteini uzmu i dostave lizozomima različitih tipova ćelija na način zavisan od M6P. Jedan mogući pristup uključuje prečišćavanje LSD proteina i modifikovanje kako bi se uključio ugljenohidratni deo sa M6P. Ovaj modifikovani materijal može biti prihvaćen od strane ćelija efikasnije od nemodifikovanih LSD proteina zbog interakcije sa M6P receptorima na površini ćelije.

[0004] Pronalazači predmetne prijave su prethodno razvili tehnologiju ciljanja zasnovanu na peptidima koja omogućava efikasniju dostavu terapeutskih enzima lizozomima. Ova patentirana tehnologija nazvana je lizozomalno ciljanje nezavisno od glikozilacije (GILT) jer peptidna oznaka zamenjuje M6P kao deo koji cilja lizozome. Detalji GILT tehnologije su opisani u U.S. publikacijama prijava br.2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400, i međunarodnim publikacijama WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077.

SAŽETAK PRONALASKA

[0005] predmetni pronalazak pruža dalje poboljšane sastave i postupke za efikasno lizozomalno ciljanje zasnovano na GILT tehnologiji. Između ostalog, predmetni pronalazak pruža sastave za ciljanje lizozomalnih enzima na lizozome upotrebom lizozomalno ciljanih peptida. predmetni pronalazak takođe pruža sastave za ciljanje lizozomalnih enzima na lizozome upotrebom lizozomalnog ciljanog peptida koji ima smanjen ili umanjen afinitet vezivanja za IGF-I receptor i/ili smanjen ili umanjen afinitet vezivanja za insulin receptor, i/ili je otporan na razdvajanje furina. predmetni pronalazak takođe pruža lizozomalne enzimske fuzione proteine koji sadrže lizozomalni enzim i IGF-II i spejser peptide koji pružaju poboljšanu proizvodnju i unos u lizozome lizozomalnog enzima fuzionog proteina. U nekim otelotvorenjima, lizozomalni enzim je alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu).

[0006] U jednom aspektu, pronalazak pruža ciljani terapeutski fuzioni protein koji sadrži lizozomalni enzim, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid između lizozomalnog enzima i IGF-II peptidnu oznaku. Spejser peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), i opciono dalje sadrži jedan ili više od (i) GAP (SEQ ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO: 12), (iii) GGGS (SEQ ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO: 17), (v) AAAS (SEQ ID NO: 18), (vi) PAPA (SEQ ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO: 21) ili (ix) GGGGA (SEQ ID NO: 60).

[0007] Primeri lizozomalnih enzima koji su ovde obuhvaćeni uključuju one koji su prikazani u Tabeli 1.

[0008] U različitim otelotvorenjima, ciljani terapeutski fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu (Slika 1, SEQ ID NO: 1), peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake. Spejser sadrži aminokiselinsku sekvencu GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51) između aminokiselina zrelog ljudskog IGF-II i aminokiselina ljudskog Naglu.

[0009] U različitim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža IGF-II peptid za upotrebu kao peptidna oznaku za ciljanje peptida, ili fuzionog proteina koji sadrži peptid, na lizozom sisara. U različitim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža IGF-II mutein. U različitim otelotvorenjima, pronalazak pruža IGF-II mutein otporan na furin koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II (A YRPSETLCGGEL VDTLQFVCGDRGFYFSRP ASR VSRRSRGIVEECCFRSCDLALLET YCATPAXE) (SEQ ID NO: 5) i mutaciju koja ukida najmanje jedno mesto razdvajanja furin proteaze.

[0010] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža IGF-II mutein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein peptidna oznaka sadrži aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein sadrži mutaciju koja smanjuje ili umanjuje afinitet vezivanja za insulinski receptor u poređenju sa ljudskim IGF-II divljeg tipa.

[0011] U nekim otelotvorenjima, IGF-II mutein ima smanjeni afinitet vezivanja za IGF-I receptor u odnosu na afinitet prirodnog ljudskog IGF-II za IGF-I receptor.

[0012] U različitim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža ciljani terapeutski fuzioni protein koji sadrži lizozomalni enzim; i IGF-II mutein koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II, gde je IGF-II mutein rezistentan na furinsko razdvajanje i vezuje se za ljudski manoza-6-fosfat receptor nezavisan od katjona na način nezavisan od manoza-6-fosfata.

[0013] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak pruža ciljani terapeutski fuzioni protein koji sadrži lizozomalni enzim; i IGF-II mutein koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II, i ima smanjen afinitet vezivanja za insulinski receptor u odnosu na afinitet prirodnog ljudskog IGF-II za insulinski receptor. U povezanom otelotvorenju, IGF-II mutein je rezistentan na razlaganje furina i vezuje se za ljudski manoza-6-fosfat receptor nezavisan od katjona na način nezavisan od manoza-6-fosfata.

[0014] U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein odgovarajuć za pronalazak uključuje mutaciju u regionu koji odgovara aminokiselinama 30-40 zrelog ljudskog IGF-II. U nekim otelotvorenjima, IGF-II mutein odgovarajuć za pronalazak uključuje mutaciju u regionu koji odgovara aminokiselinama 34-40 zrelog ljudskog IGF-II tako da mutacija ukida najmanje jedno mesto razdvajanja furin proteaze. U nekim otelotvorenjima, odgovarajuća mutacija je aminokiselinska supstitucija, brisanje i/ili umetanje. U nekim otelotvorenjima, mutacija je aminokiselinska supstitucija na mestu koje odgovara Arg37 ili Arg40 zrelog ljudskog IGF-II. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska supstitucija je Lys ili Ala supstitucija.

[0015] U nekim otelotvorenjima, pogodna mutacija je brisanje ili zamena aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju položajima izabranim iz grupe koja se sastoji od 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40 zrelog ljudskog IGF-II i njihove kombinacije.

[0016] U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein prema pronalasku dalje sadrži brisanje ili zamenu aminokiselina koje odgovaraju položajima 2-7 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein prema pronalasku dalje uključuje brisanje ili zamenu aminokiselina koje odgovaraju položajima 1-7 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein prema pronalasku dalje sadrži brisanje ili zamenu aminokiselina koje odgovaraju položajima 62-67 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein prema pronalasku dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na položaju koji odgovara Tyr27, Leu43, ili Ser26 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein prema pronalasku sadrži barem aminokiselinsku supstituciju izabranu iz grupe koju čine Tyr27Leu, Leu43Val, Ser26Phe i njihove kombinacije. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein prema pronalasku sadrži aminokiseline koje odgovaraju položajima 48-55 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein prema pronalasku sadrži barem tri aminokiseline izabrane iz grupe koja se sastoji od aminokiselina koje odgovaraju položajima 8, 48, 49, 50, 54, i 55 zrelog ljudskog IGF-II. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein pronalaska sadrži, na položajima koji odgovaraju položajima 54 i 55 zrelog ljudskog IGF-II, aminokiseline od kojih je svaka nenaelektrisana ili negativno naelektrisana na pH 7,4. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein ima smanjen afinitet vezivanja za IGF-I receptor u odnosu na afinitet prirodnog ljudskog IGF-II za IGF-I receptor. U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein je IGF2 Δ8-67 R37A (tj., aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II sa Arg na položaju 37 zrelog ljudskog IGF-II supstituisanog sa Ala).

[0017] U različitim otelotvorenjima, peptidna oznaka je vezana za N-terminus ili C-terminus lizozomalnog enzima, stoga je N-terminalna oznaka ili C-terminalna oznaka, respektivno. U različitim otelotvorenjima, peptidna oznaka je C-terminalna oznaka.

[0018] U nekim otelotvorenjima, lizozomalni enzim pogodan za pronalazak je ljudska alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) (Slika 1), ili njen funkcionalni fragment ili varijanta. U nekim otelotvorenjima, lizozomalni enzim pogodan za pronalazak uključuje aminokiseline 1-743 ljudske alfa-N-acetilglukozaminidaze ili aminokiseline 24-743 ljudske alfa-N-acetilglukozaminidaze, kojoj nedostaje signalna sekvenca.

[0019] U različitim otelotvorenjima, ciljani terapeutski fuzioni protein iz pronalaska dalje obuhvata spejser između lizozomalnog enzima i IGF-II muteina. Spejser sadrži aminokiselinsku sekvencu GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

[0020] U različitim otelotvorenjima, spejser sadrži alfa-spiralnu strukturu ili rigidnu strukturu.

[0021] U različitim otelotvorenjima, spejser sadrži jednu ili više Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO: 9), Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10), ili Gly-Gly-Ser (GGS) (SEQ ID NO: 11) aminokiselinskih sekvenci.

[0022] U različitim otelotvorenjima, fuzioni protein dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

[0023] Predmetni pronalazak takođe pruža nukleinske kiseline koje kodiraju ciljani terapeutski fuzioni protein kao što je opisano u različitim otelotvorenjima iznad. Predmetni pronalazak dalje pruža različite ćelije koje sadrže nukleinsku kiselinu pronalaska.

[0024] Predmetni pronalazak pruža farmaceutske sastave pogodne za tretmana bolesti lizozomalnog skladištenja koje sadrže terapeutski efikasnu količinu ciljanog terapeutskog fuzionog proteina pronalaska. Ovde su opisani postupci za tretman bolesti lizozomalnog skladištenja koji obuhvataju davanje ciljanog terapeutskog fuzionog proteina prema pronalasku pacijentu kom je potreban tretman. U nekim otelotvorenjima, lizozomalna bolest skladištenja je mukopolisaharidoza tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom).

[0025] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak za proizvodnju ciljanog terapeutskog fuzionog proteina uključujući korak kultivisanja ćelija sisara u medijumu ćelijske kulture, gde ćelije sisara nose nukleinsku kiselinu pronalaska, naročito, kao što je opisano u različitim otelotvorenjima ovde; i kultivacija se izvodi pod uslovima koji dozvoljavaju eksprimiranje ciljanog terapeutskog fuzionog proteina.

[0026] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak za proizvodnju ciljanog terapeutskog fuzionog proteina uključujući korak kultivisanja ćelija sisara sa nedostatkom furina u medijumu ćelijske kulture, gde ćelije sa nedostatkom furina nose nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni protein koji sadrži lizozomalni enzim i IGF-II mutein koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II, gde se IGF-II mutein vezuje za ljudski manoza-6-fosfat receptor nezavisan od katjona na način nezavisan od manoza-6-fosfata; i gde se kultivacija izvodi pod uslovima koji dozvoljavaju eksprimiranje ciljanog terapeutskog fuzionog proteina.

[0027] U različitim otelotvorenjima, smatra se da određeni ciljani terapeutski proteini koji sadrže spejser, kao što je ovde opisano, pokazuju povećano eksprimiranje aktivnog proteina kada se eksprimiraju rekombinantno u poređenju sa ciljanim terapeutskim proteinima koji sadrže različit spejser peptid. U različitim otelotvorenjima, takođe se smatra da ciljani terapeutski proteini koji su ovde opisani mogu imati povećanu aktivnost u odnosu na druge ciljane terapeutske proteine ovde opisane. Zamišljeno je da se za dalje eksperimentisanje koriste ciljani terapeutski proteini koji pokazuju povećano eksprimiranje aktivnog proteina i/ili imaju povećanu aktivnost u poređenju sa drugim ciljanim terapeutskim proteinima koji sadrže različiti spejser peptid.

[0028] U drugom aspektu, pronalazak pruža sastav za upotrebu u tretmanu bolesti lizozomalnog skladištenja kod pacijenta koji sadrži fuzioni protein koji sadrži lizozomalni enzim, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između aminokiselinske sekvence lizozomalnog enzima i IGF-II peptidne oznake. Spejser peptid sadrži GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

[0029] Primeri bolesti lizozomalnog skladištenja koje su razmatrane ovde obuhvataju one koje su navedene u Tabeli 1. Smatra se da se bolest lizozomalnog skladištenja tretira korišćenjem ciljanog terapeutskog fuzionog proteina koji sadrži enzim sa nedostatkom bolesti lizozomalnog skladištenja, takođe opisan u Tabeli 1.

[0030] U različitim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastav za upotrebu u tretmanu mukopolisaharidoze tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom) kod pacijenta koji sadrži fuzioni protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu (SEQ ID NO: 1), peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake. Spejser sadrži aminokiselinsku sekvencu GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

[0031] U različitim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastav za upotrebu u redukciji nivoa glikozaminoglikana (GAG) kod pacijenta koji pati od mukopolisaharidoze tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom) koji sadrži fuzioni protein koji sadrži i) aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu (SEQ ID NO: 1), ii) peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II, i iii) spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake.

[0032] Spejser sekvenca sadrži aminokiseline GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

[0033] U različitim otelotvorenjima, lizozomalni ciljani domen ili IGF-II peptidna oznaka obuhvataju aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II (SEQ ID NO: 2, 4). U različitim otelotvorenjima, IGF-II peptidna oznaka sadrži mutaciju na ostatku Arg37. U različitim otelotvorenjima, mutacija je supstitucija alanina za arginin. U različitim otelotvorenjima, lizozomalni ciljani domen ili IGF-II peptidna oznaka sadrži IGF2 Δ8-67 R37A.

[0034] U različitim otelotvorenjima, fuzioni protein sadrži aminokiseline 1-743 ljudskog Naglu (SEQ ID NO: 1, 3). U različitim otelotvorenjima, fuzioni protein sadrži aminokiseline 24-743 ljudskog Naglu.

[0035] U različitim otelotvorenjima, efikasna količina fuzionog proteina je u opsegu od oko 0,1-1 mg/kg, oko 1-5 mg/kg, oko 2,5-20 mg/kg, oko 5-20 mg/kg, oko 10- 50 mg/kg, ili 20-100 mg/kg telesne težine pacijenta. U različitim otelotvorenjima, efikasna količina fuzionog proteina je oko 2,5-20 mg po kilogramu telesne težine pacijenta.

[0036] U različitim otelotvorenjima, fuzioni protein se primenjuje intratekalno, intravenozno, intramuskularno, parenteralno, transdermalno ili transmukozno. U različitim otelotvorenjima, fuzioni protein se primenjuje intratekalno. U različitim otelotvorenjima, intratekalna primena opciono dalje obuhvata primenu fuzionog proteina intravenozno.

[0037] U različitim otelotvorenjima, intratekalna primena obuhvata uvođenje fuzionog proteina u cerebralni ventrikul, lumbalno područje ili cisterna magna.

[0038] U različitim otelotvorenjima, fuzioni protein se primenjuje dvomesečno, mesečno, tronedeljno, dvonedeljno, nedeljno, dnevno ili u promenljivim intervalima.

[0039] U različitim otelotvorenjima, tretman dovodi do smanjenja nivoa glikozaminoglikana (GAG) u tkivu mozga. Dalje se razmatra da tretman rezultuje u smanjenju lizozomalnih granulata za skladištenje u tkivu mozga.

[0040] Takođe su razmatrani sastavi koje sadrže ciljane terapeutske fuzione proteine kao što je ovde opisano za upotrebu u tretmanu lizozomalnih bolesti skladištenja. Primeri lizozomalnih bolesti skladištenja obuhvataju one navedene u Tabeli 1.

[0041] Ostale karakteristike, predmeti i prednosti predmetnog pronalaska su očigledni u detaljnom opisu koji sledi. Treba, međutim, razumeti da je detaljan opis, iako ukazuje na otelotvorenja predmetnog pronalaska, dat samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje.

Različite promene i modifikacije unutar obima predmetnog pronalaska biće jasne stručnjacima iz detaljnog opisa.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0042] Crteži su dati samo za ilustraciju, a ne za ograničenje.

Slika 1 prikazuje aminokiselinske sekvence dela primernog terapeutskog fuzionog proteina koji sadrži (A) Naglu i (B) IGF-II peptid koji sadrži 8-67 ostatke od IGF-II i koji imaju aminokiselinsku supstituciju na ostatku 37, R37A (Arg37Ala).

Slika 2 prikazuje nukleotidne sekvence dela primernog terapeutskog fuzionog proteina koji sadrži (A) Naglu i (B) IGF-II peptid koji sadrži ostatke 8-67 od IGF-II i koji imaju aminokiselinsku supstituciju kod ostatka 37, R37A (Arg37Ala).

Slika 3 opisuje primerne spejser sekvence predviđene za upotrebu u terapeutskom fuzionom proteinu.

DEFINICIJE

[0043] Amelioracija: Kako se ovde koristi, izraz „amelioracija“ označava prevenciju, smanjenje ili ublažavanje stanja, ili poboljšanje stanja pacijenta. Poboljšanje uključuje, ali ne zahteva potpuni oporavak ili potpunu prevenciju bolesti. U nekim otelotvorenjima, poboljšanje uključuje redukciju akumuliranih materijala unutar lizozoma relevantnih tkiva bolesti.

[0044] IGF-II mutein otporan na furin : Kako se ovde koristi, izraz „IGF-II mutein otporan na furin“ odnosi se na peptid zasnovan na IGF-II koji sadrži izmenjenu aminokiselinsku sekvencu koja ukida najmanje jedno mesto razdvajanja prirodne furin proteaze ili menja sekvencu blisku ili susednu mestu razdvajanja prirodne furin proteaze, tako da je razdvajanje furina sprečeno, inhibirano, smanjeno ili usporeno u poređenju sa divljim tipom ljudskog IGF-II peptida. Kako se ovde koristi, IGF-II mutein otporan na furin se takođe naziva i IGF-II mutein rezistentan na furin.

[0045] Mesto razdvajanja furin proteaze: Kako se ovde koristi, izraz „mesto razdvajanja furin proteaze“ (koji se takođe naziva „mesto razdvajanja furina“ ili „sekvenca razdvajanja furina“) odnosi se na aminokiselinsku sekvencu peptida ili proteina koja služi kao sekvenca prepoznavanja za razdvajanje enzimske proteaze sa furinom ili furin-sličnim proteazama. Tipično, mesto razdvajanja furin proteaze ima konsenzus sekvencu Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO: 6), X je bilo koja aminokiselina. Mesto razdvajanja je pozicionirano posle ostatka

1

arginina (Arg) na kraju karboksi-terminala u sekvenci. U nekim otelotvorenjima, mesto razdvajanja furina može imati konsenzus sekvencu Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 7), X je bilo koja aminokiselina. Mesto razdvajanja je pozicionirano posle ostatka arginina (Arg) na kraju karboksi-terminala u sekvenci.

[0046] Furin: Kako se ovde koristi, izraz „furin“ se odnosi na bilo koju proteazu koja može da prepozna i razdvoji mesto razdvajanja furin proteaze, kao što je ovde definisano, uključujući furin ili furin-sličnu proteazu. Furin je takođe poznat kao upareni bazni enzim za razdvajanje aminokiselina (paired basic amino acid cleaving enzyme - PACE). Furin pripada familiji proproteina konvertaze nalik subtilizinu. Gen koji kodira furin bio je poznat kao FUR (FES Upstream Region – FES uzvodni region).

[0047] Ćelije sa nedostatkom furina: Kako se ovde koristi, izraz „ćelije sa nedostatkom furina“ se odnosi na bilo koje ćelije čija je aktivnost proteina furina inhibirana, smanjena ili eliminisana. Ćelije sa nedostatkom furina obuhvataju i ćelije sisara i ćelije koje nisu od sisara, koje ne proizvode furin ili proizvode smanjenu količinu furina ili defektnu furin proteazu.

[0048] Lizozomalno ciljanje nezavisno od glikozilacije: Kako se ovde koristi, izraz „lizozomalno ciljanje nezavisno od glikozilacije“ (takođe se naziva „GILT“) odnosi se na lizozomalno ciljanje koje je nezavisno od manoza-6-fosfata.

[0049] Ljudska alfa-N-acetilglukozaminidaza: Kako se ovde koristi, izraz „ljudska alfa-N-acetilglukozaminidaza“ (takođe se naziva „Naglu“) odnosi se na prekursor (tj., koji sadrži prirodnu Naglu signalnu sekvencu peptida) ili obrađen (tj. nema prirodnu Naglu sekvencu signalnog peptida) divlji tip ljudske alfa-N-acetilglukozaminidaze, ili njen funkcionalni fragment ili varijantu, koji je sposoban da redukuje nivoe glikozaminoglikana (GAG) u lizozomima sisara, ili može spasiti ili poboljšati jedan ili više MPS IIIB (Sanfilipov B sindrom) simptom. Kako se ovde koristi, izraz „funkcionalni“ kad se odnosi na Naglu, odnosi se na Naglu enzim koji je sposoban da se uzme od strana lizozoma sisara, i koji ima dovoljno enzimske aktivnosti da smanji materijal za skladištenje, tj. glikozaminoglikan (GAG), u lizozomu sisara.

[0050] Mutein IGF-II: Kako se ovde koristi, izraz „IGF-II mutein“ se odnosi na peptid zasnovan na IGF-II koji sadrži izmenjenu aminokiselinsku sekvencu. Kako se ovde koristi, izraz „IGF-II mutein otporan na furin“ odnosi se na peptid zasnovan na IGF-II koji sadrži izmenjenu aminokiselinsku sekvencu koja ukida najmanje jedno mesto razdvajanja prirodne furin proteaze ili menja sekvencu blisku ili srodnu prirodnom mesto razdvajanja furin proteaze, tako da je razdvajanje furina sprečeno, inhibirano, redukovano ili usporeno u odnosu na divlji tip ljudskog IGF-II peptida. Kako se ovde koristi, IGF-II mutein otporan na furin se takođe naziva i IGF-II mutein otporan na furin.

[0051] Poboljšanje, povećanje ili smanjivanje: Kako se ovde koriste, izrazi „poboljšanje“, „povećanje“ ili „smanjivanje“, ili gramatički ekvivalenti, ukazuju na vrednosti koje su u odnosu na osnovno merenje, kao što je merenje u istoj jedinki pre započinjanja tretmana koji je ovde opisan, ili merenje u kontrolnoj jedinki (ili više kontrolnih jedinki) u odsustvu ovde opisanog tretmana. „Kontrolna jedinka“ je jedinka obolela od istog oblika bolesti lizozomalnog skladištenja (npr. MPS IIIB (Sanfilipov B Sindrom)) kao jedinka koji se tretira, koja je približno iste starosti kao i jedinka koji se tretira (kako bi se osiguralo da su faze bolesti kod tretirane jedinke i kontrolne jedinke uporedive).

[0052] Jedinka, pacijent, pacijent: Kako se ovde koristi, izrazi „pacijent“, „jedinka“ ili „bolesnik“ se odnose na čoveka ili pacijenta sisara koji nije čovek. Jedinka (koja se takođe naziva „pacijent“ ili „bolesnik“) koja se leči je jedinka (fetus, dete, dete, adolescent ili odrasli čovek) boluje od bolesti lizozomalnog skladištenja, na primer, MPS IIIB (Sanfilipov B sindrom) (tj. bilo infantilni-, juvenilni- ili odrasli- ili teški/klasični tip ili atenuirani tip MPS IIIB (Sanfilipov B sindrom)), ili koja imaju potencijal da razvije bolest lizozomalnog skladištenja (npr. MPS IIIB (Sanfilipov B sindrom)).

[0053] Bolesti lizozomalnog skladištenja: Kako se ovde koristi, „bolesti lizozomalnog skladištenja“ se odnose na grupu genetskih poremećaja koji su rezultat nedostatka najmanje jednog od enzima (npr. kiselih hidroliza) koji su potrebni za razbijanje makromolekula do peptida, aminokiselina, monosaharida, nukleinskih kiseline i masne kiseline u lizozomima. Kao rezultat, pojedinci koji pate od lizozomalnih bolesti skladištenja imaju nakupljene materijale u lizozomima. Primeri lizozomalnih bolesti skladištenja su navedeni u Tabeli 1.

[0054] Lizozomalni enzim: Kako se ovde koristi, izraz „lizozomalni enzim“ se odnosi na bilo koji enzim koji je sposoban da redukuje akumulirane materijale u lizozomima sisara ili da može spasiti ili poboljšati jedan ili više simptoma bolesti skladištenja lizozoma. Lizozomalni enzimi pogodni za pronalazak obuhvataju i divlje tipove ili modifikovane lizozomalne enzime, i mogu biti proizvedeni korišćenjem rekombinantnih i sintetskih postupaka ili prečišćeni iz prirodnih izvora. Primeri lizozomalnih enzima su navedeni u Tabeli 1.

[0055] Spejser. Kako se ovde koristi, izraz „spejser“ (koji se takođe naziva „veznik“) odnosi se na peptidnu sekvencu između dve proteinske grupe u fuzionom proteinu. Spejser je generalno dizajnirana da bude fleksibilan ili da umetne strukturu, kao što je alfa-spirala, između dva proteinska ostatka. Primerne spejser sekvence su detaljnije opisane u Detaljnom opisu.

[0056] Terapeutski efikasna količina: Kako se ovde koristi, izraz „terapeutski efikasna količina“ ili „efektivna količina“ se odnosi na količinu ciljanog terapeutskog fuzionog proteina koja daje terapeutski efekat tretiranom pacijentu, u razumnom odnosu koristi/rizika koji je primenjiv na bilo koji medicinski tretman. Terapijski efekat može biti objektivan (tj. merljiv nekim testom ili markerom) ili subjektivan (tj. pacijent daje indikaciju ili oseća efekat). Posebno, „terapeutski efektivna količina“ se odnosi na količinu terapeutskog fuzionog proteina ili sastava koji je efikasan u tretmanu, ublažavanju ili sprečavanju željene bolesti ili stanja, ili ispoljava detektabilni terapeutski ili preventivni efekat, kao što je poboljšanje simptoma bolesti, sprečavanje ili odlaganje početka bolesti, i/ili takođe smanjuje težinu ili učestalost simptoma bolesti. Terapeutski efikasna količina se obično daje u režimu doziranja koji može da sadrži višestruke jedinične doze. Za bilo koji određeni terapeutski fuzioni protein, terapeutski efikasna količina (i/ili odgovarajuća jedinična doza u okviru efikasnog režima doziranja) može varirati, na primer, u zavisnosti od puta primene, u kombinaciji sa drugim farmaceutskim agensima. Takođe, specifična terapeutski efikasna količina (i/ili jedinična doza) za bilo kog određenog pacijenta može zavisiti od niza faktora, uključujući poremećaj koji se tretira i ozbiljnost poremećaja; aktivnost upotrebljenog specifičnog farmaceutskog agensa; specifičnog sastava koji se koristi; starosti, telesne težine, opšteg zdravlja, pola i ishrane pacijenta; vremena primene, puta primene i/ili brzina izlučivanja ili metabolizma specifičnog fuzionog proteina koji se koristi; trajanja tretmana; i sličnih faktore koji su dobro poznati u medicini.

[0057] Tretman: Kako se ovde koristi, izraz „tretman“ (takođe „tretiranje“ ili „tretirati“) odnosi se na bilo koju primenu terapeutskog fuzionog proteina ili farmaceutskog sastava koji sadrži navedeni terapeutski fuzioni protein koji delimično ili potpuno ublažava, smanjuje,

1

olakšava, inhibira, odlaže početak, smanjuje ozbiljnost i/ili smanjuje učestalost jednog ili više simptoma ili karakteristika određene bolesti, poremećaja i/ili stanja. Takav tretman može biti kod pacijenta koji ne pokazuje znake relevantne bolesti, poremećaja i/ili stanja i/ili pacijenta koji pokazuje samo rane znake bolesti, poremećaja i/ili stanja. Alternativno ili dodatno, takav tretman može biti tretman pacijenta koji pokazuje jedan ili više utvrđenih znakova relevantne bolesti, poremećaja i/ili stanja. Na primer, tretman se može odnositi na poboljšanje srčanog statusa (npr. povećanje krajnje dijastolne i/ili krajnje sistolne zapremine, ili smanjenje, poboljšanje ili prevenciju progresivne kardiomiopatije koja se obično nalazi u, na primer, Pompe-ovoj bolesti) ili funkcije pluća (npr. povećanje vitalnog kapaciteta plača u odnosu na kapacitet bazne linije i/ili normalizacija desaturacije kiseonika tokom plača); poboljšanje neurorazvojnosti i/ili motoričkih sposobnosti (npr. povećanje AIMS rezultata); smanjenje skladištenja (npr. glikozaminoglikan (GAG), nivoi u tkivu jedinke koja je zahvaćen bolešću, ili bilo koja kombinacija ovih efekata. U nekim otelotvorenjima, tretman uključuje poboljšanje klirensa glikozaminoglikana (GAG), naročito u redukciji ili prevenciji MPS IIIB (Sanfilipov B sindrom) - pridruženi neuronski simptomi..

[0058] Kako se koristi u ovoj prijavi, izrazi „oko“ i „približno“ se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji brojevi koji se koriste u ovoj prijavi sa ili bez oko/približno su namenjeni da pokriju sve normalne fluktuacije koje ocenjuje stručnjak iz odgovarajuće oblasti.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0059] Predmetni pronalazak pruža poboljšane sastave za ciljanje lizozomalnih enzima na bazi tehnologije lizozomalnog ciljanja nezavisnog od glikozilacije (GILT). Između ostalog, predmetni pronalazak pruža IGF-II muteine koji su otporni na furin i/ili imaju smanjen ili umanjen afinitet vezivanja za insulinski receptor, i/ili imaju smanjen ili umanjen afinitet vezivanja za IGF-I receptor i ciljane terapeutske fuzione proteine koji sadrže IGF-II mutein pronalaska. Predmetni pronalazak takođe pruža postupke za njihovu izradu i upotrebu.

[0060] Različiti aspekti pronalaska su detaljno opisani u narednim odeljcima. Upotreba odeljaka ne treba da ograničava pronalazak. Svaki odeljak se može primeniti na bilo koji aspekt pronalaska. U ovoj prijavi, upotreba „ili“ znači „i/ili“ ukoliko nije drugačije navedeno.

Lizozomalni enzimi

[0061] Lizozomalni enzim pogodan za pronalazak uključuje bilo koji enzim koji je sposoban da redukuje nagomilane materijale u lizozomima sisara, ili može spasiti ili poboljšati jedan ili više simptoma bolesti skladištenja lizozoma. Pogodni lizozomalni enzimi uključuju i divlje tipove ili modifikovane lizozomalne enzime i mogu biti proizvedeni korišćenjem rekombinantnih ili sintetičkih postupaka, ili prečišćeni iz prirodnih izvora. Primeri lizozomalnih enzima su navedeni u Tabeli 1.

Tabela 1. Bolesti lizozomalnog skladištenja i povezani defekti enzima

1

1

1

[0062] U nekim otelotvorenjima, lizozomalni enzim koji se ovde razmatra uključuje polipeptidnu sekvencu koja ima 50-100%, uključujući 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i 100%, identičnosti sekvence sa prirodno nastalom polinukleotidnom sekvencom ljudskog enzima prikazanom u Tabeli 1, dok i dalje kodira protein koji je funkcionalan, tj. sposoban da redukuju akumulirane materijale, npr. glikozaminoglikan (GAG), u lizozomima sisara, ili koji može spasiti ili ublažiti jedan ili više simptoma bolesti lizozomalnog skladištenja.

[0063] „Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvence lizozomalnih enzima je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u prirodnoj sekvenci ljudskog enzima, nakon poravnanja sekvenci i uvođenjem praznina, ako je potrebno, da se postigne maksimalni procenat identičnosti sekvence, i da se ne uzmu u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Usklađivanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u struci, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što su BLAST, ALIGN ili Megalign (DNKSTAR) softveri. Stručnjaci u oblasti mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme koji su potrebni za postizanje maksimalnog poravnanja preko pune dužine sekvenci koje se porede. Poželjno, WU-BLAST-2 softver se koristi za određivanje identiteta aminokiselinske sekvence (Altschul i dr., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996). WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretrage, od kojih je većina podešena na podrazumevane vrednosti. Podesivi parametri se podešavaju sa sledećim vrednostima: overlap span=1, overlap fraction=0.125, world threshold (T)=11. HSP score (S) i HSP S2 parametri su dinamičke vrednosti i utvrđeni su samim programom, u zavisnosti od sastava određene sekvence, međutim, minimalne vrednosti se mogu podesiti i postaviti kao što je gore navedeno.

Alfa-N-acetilglukozaminidaza

[0064] Alfa-N-acetilglukozaminidaza, Naglu, se proizvodi kao prekursorski molekul koji se

1

obrađuje do zrelog oblika. Ovaj proces se obično dešava uklanjanjem signalnog peptida od 23 aminokiseline, jer protein ulazi u endoplazmatični retikulum. Tipično, prekursorski oblik se takođe označava kao prekursor pune dužine ili Naglu protein pune dužine, koji sadrži 743 aminokiseline (SEQ ID NO: 1). N-terminalne 23 aminokiseline se razdvajaju kako prekursorski protein ulazi u endoplazmatični retikulum, rezultujući u obrađenom ili zrelom obliku. Prema tome, smatra se da N-terminalne 23 aminokiseline generalno nisu potrebne za aktivnost Naglu proteina. Aminokiselinske sekvence zrelog oblika i prekursorskog oblika pune dužine tipičnog divljeg tipa ili prirodnog ljudskog Naglu proteina prikazane su na Slici 1 i date su u SEQ ID NO: 1. Nukleotidna sekvenca kodirajućeg regiona ljudski Naglu je data u SEQ ID NO: 3. mRNK sekvenca ljudskog Naglu opisan je u Genbank Accession number NM_000263. U različitim otelotvorenjima, Naglu je ljudski Naglu, sa (aminokiseline 1-743) ili bez (aminokiseline 24-743) signalnim sekvencama.

[0065] US Patent No.6,255,096 opisuje da su molekulske težine prečišćene ljudske alfa-N-acetilglukozaminidaze (tj. 82 kDa i 77 kDa) i rekombinantne sisarske alfa-N-acetilglukozaminidaze proizvedene u CHO ćelijama (tj.89 kDa i 79 kDa) veće od izvedene molekulske težine Naglu polipeptida (tj.70 kDa), što ukazuje da su prečišćeni i rekombinantni polipeptidi modifikovani post-translaciono. Takođe pogledati Weber i dr., Hum Mol Genet 5:771-777, 1996.

Mukopolisaharidoza III B (Sanfilipov B sindrom)

[0066] Jedan primer za bolest lizozomalnog skladištenja je mukopolisaharidoza III B (MPS IIIB), takođe poznata kao Sanfilipov tip B sindrom. MPS IIIB, Sanfilipov B sindrom, je retki autozomnio recesivni genetski poremećaj koji se karakteriše nedostatkom enzima alfa-N-acetil-glukozaminidaze (Naglu). U odsustvu ovog enzima, glikozaminoglikani (GAG), na primer GAG heparan sulfat, i delimično degradirani GAG molekuli ne mogu se ukloniti iz tela i akumulirati u lizozomima različitih tkiva, što dovodi do progresivne rasprostranjene somatske disfunkcije (Kakkis i dr., N Engl J Med.344(3):182-8, 2001). Pokazano je da se GAG akumuliraju u lizozomima neurona i glijalnih ćelija, uz manje nakupljanje izvan mozga.

[0067] Identifikovana su četiri različita oblika MPS III, označena kao MPS IIIA, B, C i D. Svaki predstavlja nedostatak jednog od četiri enzima uključenih u degradaciju GAG heparan sulfata (Tabela 1). Svi oblici uključuju različite stupnjeve istih kliničkih simptoma, uključujući grube karakteristike lica, hepatosplenomegaliju, zamućenje rožnjače i deformitete skeleta. Najznačajniji je, međutim, ozbiljan i progresivan gubitak kognitivnih sposobnosti,

1

koji je vezan ne samo za akumulaciju heparan sulfata u neuronima, već i za naknadno podizanje gangliozida GM2, GM3 i GD2 uzrokovanih primarnom GAG akumulacijom (Walkley i dr., Ann N Y Acad Sci.845:188-99,1998).

[0068] Karakteristično kliničko svojstvo Sanfilipovog B sindroma je degeneracija centralnog nervnog sistema (CNS), koja rezultuje gubitkom ili nemogućnošću u dostizanju glavnih razvojnih tačaka. Progresivni kognitivni pad kulminira demencijom i preranom smrti. Bolest se obično manifestuje kod male dece, i životni vek pogođene osobe generalno se ne proteže dalje od kasnog tinejdžerskog perioda do ranih dvadesetih godina.

[0069] Sve bolesti MPS III imaju slične simptome koji se obično manifestuju kod male dece. Oštećena beba je na izgled normalna, mada se mogu primetiti blagi deformiteti lica. Ukočeni zglobovi, maljavost i gruba kosa tipična za druge mukopolisaharidoze obično nisu prisutni do kasne bolesti. Nakon početnog perioda bez simptoma, pacijenti se obično pojavljuju sa usporavanjem razvoja i/ili problema u ponašanju, nakon čega sledi progresivni intelektualni pad koji rezultuje teškom demencijom i progresivnom motoričkom bolešću. Sticanje govora je često sporo i nepotpuno. Bolest napreduje do povećanja poremećaja u ponašanju, uključujući izlive temperamenta, hiperaktivnost, destruktivnost, agresivno ponašanje, pika i poremećaj spavanja. Pošto obolela deca imaju normalnu mišićnu snagu i pokretljivost, poremećajima u ponašanju je veoma teško upravljati. U završnoj fazi bolesti deca postaju sve nepokretnija i nereaktivnija, često zahtevaju invalidska kolica i razvijaju napade i poteškoće pri gutanju. Životni vek obolelog deteta obično se ne proteže dalje od kasnog tinejdžerskog perioda do ranih dvadesetih godina.

[0070] Enzim alfa-N-acetilglukozaminidaza pogodan za tretmana MPS IIIB (Sanfilipov B sindrom) uključuje ljudsku alfa-N-acetilglukozaminidazu divljeg tipa (SEQ ID NO: 1 ili 3), ili njen funkcionalni fragment ili varijantu sekvence koja zadržava sposobnost da se unese u lizozome sisara i da se hidrolizuju alfa, 1,4 veze na terminalnom N-acetil-D-glukozaminskom ostatku u linearnim oligosaharidima.

[0071] Efikasnost tretmana MPS IIIB (Sanfilipov B sindrom) korišćenjem rekombinantnih ciljanih terapeutskih fuzionih proteina, kao što je ovde opisano, može se meriti primenom tehnika koje su poznate u struci, kao i analizom lizozomalnih i neuronskih biomarkera.

Početni eksperimenti se izvode na Naglu knock-out životinjama (pogledati Li i dr., Proc Natl

2

Acad Sci USA 96:14505-510, 1999). Naglu knock-out-i su prisutni sa velikim količinama heparan sulfata u jetri i bubrezima i povećanju gangliozida u mozgu.

[0072] Analize uključuju analizu aktivnosti i biodistribuciju egzogenog enzima, redukciju skladištenja GAG u lizozomima, posebno u moždanim ćelijama, i aktivaciju astrocita i mikroglija. Nivoi različitih lizozomalnih ili neuronskih biomarkera obuhvataju, ali nisu ograničeni na, membranski protein 1 (LAMP1), glipikan, gangliozide, holesterol, podjedinicu c mitohondrijalne ATP sintaze (SCMAS), ubikvitin, P-GSK3b, beta amiloid i P-tau. Analiza preživljavanja i ponašanja se takođe izvodi korišćenjem tehnika koje su poznate u ovoj oblasti.

[0073] Eksperimenti su pokazali da se podjedinica c proteina mitohondrijalne ATP sinteze (SCMAS) akumulira u lizozomima MPS IIIB životinja (Ryazantsev i dr., Mol Genet Metab.

90(4): 393-401, 2007). Pokazalo se da su LAMP-1 i GM130 povišeni kod MPS IIIB životinja (Vitry i dr., Am J Pathol.177(6):2984-99, 2010).

[0074] U različitim otelotvorenjima, tretman bolesti lizozomalnog skladištenja se odnosi na smanjeno lizozomalno skladištenje (npr., GAG) u različitim tkivima. U različitim otelotvorenjima, tretman se odnosi na smanjeno lizozomalno skladištenje u ciljanim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljanim tkivima. U nekim otelotvorenjima, lizozomalno skladištenje je smanjeno za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U različitim otelotvorenjima, lizozomalno skladištenje je smanjeno najmanje 1-puta, 2-puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više u poređenju sa kontrolom.

[0075] U različitim otelotvorenjima, tretman se odnosi na povećanu aktivnost enzima u različitim tkivima. U različitim otelotvorenjima, tretman se odnosi na povećanu aktivnost enzima u ciljanim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljanim tkivima. U različitim otelotvorenjima, enzimska aktivnost je povećana za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 1000% ili više u poređenju sa kontrolom. U različitim otelotvorenjima, aktivnost enzima je povećana najmanje 1-put, 2-puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više u poređenju sa kontrolom. U različitim otelotvorenjima, povećana enzimska aktivnost je najmanje približno 10 nmol/sat/mg, 20 nmol/sat/mg, 40 nmol/sat/mg, 50 nmol/sat/mg, 60 nmol/sat/mg, 70 nmol/sat/mg, 80 nmol/sat/mg, 90 nmol/sat/mg, 100 nmol/sat/mg, 150 nmol/sat/mg, 200 nmol/sat/mg, 250 nmol/sat/mg, 300 nmol/sat/mg, 350 nmol/sat/mg, 400 nmol/sat/mg, 450 nmol/sat/mg, 500 nmol/sat/mg, 550 nmol/sat/mg, 600 nmol/sat/mg ili više. U različitim otelotvorenjima, lizozomalni enzim je Naglu.

Terapija zamene enzima

[0076] Terapija zamene enzima (ERT) je terapijska strategija za ispravljanje nedostatka enzima infuzijom enzima koji nedostaje u krvotok. Kako krv prožima tkiva pacijenta, enzim preuzimaju ćelije i transportuju se do lizozoma, gde enzim deluje tako da eliminiše materijal koji se nakupio u lizozomima zbog nedostatka enzima. Kako bi terapija za zamenu lizozomalnog enzima bila efikasna, terapeutski enzim mora biti dostavljen lizozomima u odgovarajućim ćelijama u tkivima gde je nedostatak skladištenja primećena. Konvencionalni terapeutici za zamenu lizozomalnih enzima se isporučuju koristeći ugljene hidrate koji su prirodno vezani za protein kako bi se uključili specifični receptori na površini ciljanih ćelija. Jedan receptor, M6P receptor nezavisan od katjona (CI-MPR), je posebno koristan za ciljanje zamene lizozomalnih enzima zato što je CI-MPR prisutan na površini većine tipova ćelija.

[0077] Izrazi „receptor manoza-6-fosfata nezavisan od katjona (CI-MPR),“ „M6P/IGF-II receptor,“ CI-MPR/IGF-II receptor,“ „IGF-II receptor“ ili „IGF2 receptor,“ ili njihove skraćenice, ovde se koriste međusobno zamenjivo, i odnose se na ćelijski receptor koji vezuje i M6P i IGF-II.

Kombinovana terapija koja toleriše terapiju zamene enzima

[0078] Otkriveno je da tokom primene agenasa kao što su rekombinantni proteini i drugi terapeutski agensi, pacijent može da uspostavi imuni odgovor protiv ovih agenasa, što dovodi do proizvodnje antitela koja vezuju i ometaju terapeutsku aktivnost, uz šta izazivaju i akutneili hronične imunološke reakcije. Ovaj problem je najznačajniji za proteinsku terapiju jer su proteini kompleksni antigeni i u mnogim slučajevima pacijent je imunološki naivan na antigene. Prema tome, u određenim aspektima predmetnog pronalaska, može biti korisno da pacijent dobije terapeutske enzime tolerantne na terapiju zamene enzima. U ovom kontekstu, terapija zamene enzima može se dati pacijentu kao kombinovana terapija sa režimom tolerisanja.

[0079] US Patent 7,485,314 opisuje tretman lizozomalnih poremećaja skladištenja korišćenjem indukcije imunološke tolerancije. Ukratko, upotreba takvog režima tolerancije može biti korisna za sprečavanje pacijenta da uspostavi imuni odgovor na terapiju zamene enzima i na taj način smanji ili na drugi način učini neefikasnim potencijalne korisne efekte terapije zamene enzima.

[0080] U jednom postupku, pronalazak razmatra smanjenje ili prevenciju klinički značajnog antigen-specifičnog imunog odgovora na rekombinantni terapeutski fuzioni protein, na primer, koji sadrži Naglu, koji se koristi za tretman poremećaja lizozomalnog skladištenja, na primer mukopopolisaharidozu IIIB (MPS IIIB ili Sanfilipov B sindrom) gde se fuzioni protein daje intratekalno. Postupak koristi početni 30-60-dnevni režim imunosupresivnog agensa T-ćelija kao što je ciklosporin A (CsA) i antiproliferativni agens, kao što je azatioprin (Aza), kombinovan sa nedeljnim intratekalnim infuzijama niskih doza enzima, npr., Naglu. Tipični jaki IgG odgovor na nedeljne infuzije enzima se uveliko smanjuje ili sprečava korišćenjem 60-dnevnog režima imunosupresivnih lekova, ciklosporina A (CsA) i azatioprina (Aza), u kombinaciji sa nedeljnim intratekalnim ili intravenskim infuzijama malih doza fuzionog proteina koji sadrže enzim. Koristeći takve režime tolerancije, biće moguće da pacijent bude tolerantan na više terapeutske doze terapeutskog fuzionog proteina do 6 meseci bez povećanja titra antitela u odnosu na Naglu, ili bilo koji drugi enzim koji bi se mogao koristiti za zamenu enzima bolesti lizozomalnog skladištenja. Takvi režimi tolerancije su opisani u U.S. Patent No 7,485,314.

Lizozomalno ciljanje nezavisno od glikozilacije

[0081] Tehnologija za lizozomalno ciljanje nezavisno od glikozilacije (Glycosylation Independent Lysosomal Targeting - GILT) je razvijena kako bi se ciljali terapeutski enzimi na lizozome. Specifično, GILT tehnologija koristi peptidnu oznaku umesto M6P kako bi uključila CI-MPR za lizozomalno ciljanje. Tipično, GILT oznaka je protein, peptid ili drugi deo koji vezuje CI-MPR na način nezavisan od manoza-6-fosfata. Pogodno, ova tehnologija oponaša normalan biološki mehanizam za unos lizozomalnih enzima, ali to čini na način nezavisan od manoza-6-fosfata.

[0082] Poželjna GILT oznaka je izvedena iz ljudskog insulinu sličnog faktora rasta II (IGF-II). Ljudski IGF-II je ligand visokog afiniteta za CI-MPR, koji se takođe naziva i IGF-II receptor. Vezivanje GILT-označenih terapijskih enzima za M6P/IGF-II receptor cilja protein na lizozom preko endocitnog puta. Ovaj postupak ima brojne prednosti u odnosu na postupke

2

koji uključuju glikozilaciju, uključujući jednostavnost i ekonomičnost, jer kada se protein izoluje, ne moraju se vršiti dalje modifikacije.

[0083] Detaljan opis GILT tehnologije i GILT oznake mogu se pronaći u U.S. publikacije br.

20030082176, 20040006008, 20040005309, i 20050281805.

GILT oznaka otporna na furin

[0084] Tokom razvoja GILT-označenih lizozomalnih enzima za tretmana bolesti lizozomalnog skladištenja, postalo je očigledno da IGF-II izvedena GILT oznaka može biti podvrgnuta proteolitičkom cepanju furinom tokom proizvodnje u ćelijama sisara (pogledati odeljak za primere). Furin proteaza tipično prepoznaje i razdvaja mesto razdvajanja koje ima konsenzus sekvencu Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO: 6), X je bilo koja aminokiselina. Mesto razdvajanja je pozicionirano posle ostatka arginina (Arg) na kraju karboksi-terminala u sekvenci. U nekim otelotvorenjima, mesto razdvajanja furina ima konsenzus sekvencu Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 7), X je bilo koja aminokiselina. Mesto razdvajanja je pozicionirano posle ostatka arginina (Arg) na kraju karboksi-terminala u sekvenci. Kako se ovde koristi, izraz „furin“ se odnosi na bilo koju proteazu koja može da prepozna i razdvoji mesto razdvajanja furin proteaze kako je ovde definisano, uključujući furin ili furin-sličnu proteazu. Furin je takođe poznat kao upareni bazni enzim za razdvajanje aminokiselina (paired basic amino acid cleaving enzyme - PACE). Furin pripada porodici proproteina konvertaze slične subtilizinu koja uključuje PC3, proteazu odgovornu za sazrevanje proinzulina u ćelijama ostrvaca pankreasa. Gen koji kodira furin bio je poznat kao FUR (FES upstream Region).

[0085] Zrela ljudska IGF-II peptidna sekvenca je prikazana u nastavku.

[0086] Kao što se može videti, zreli ljudski IGF-II sadrži dva potencijalna mesta preklapanja furinskog razdvajanja između ostataka 34-40 (podebljano i podvučeno). Strelice su umetnute u dva potencijalna položaja furinskog razdvajanja.

[0087] Modifikovane GILT oznake koji su otporne na razdvajanje furinom, a i dalje zadržavaju sposobnost da se vežu za CI-MPR na način nezavisan od manoza-6-fosfata, obelodanjene su u US 20110223147. Konkretno, GILT oznake otporne na furin mogu biti dizajnirane mutacijom aminokiselinske sekvence na jednom ili više mesta razdvajanja furina, tako da mutacija ukida najmanje jedno mesto razdvajanja furina. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, GILT oznaka otporna na furin je IGF-II mutein otporan na furin koji sadrži mutaciju koja ukida najmanje jedno mesto razdvajanja furin proteaze ili menja sekvencu koja je susedna mestu odvajanja furin proteaze tako da se tako sprečava, inhibira, smanjuje ili usporava razdvajanje furin proteza u poređenju sa divljim tipom IGF-II peptida (npr. ljudski zreli IGF-II divljeg tipa). Tipično, pogodna mutacija ne utiče na sposobnost GILT oznake otporne na furin da se veže za ljudski manoza-6-fosfat receptor nezavisan od katjona.

Naročito, IGF-II mutein otporan na furin pogodan za pronalazak vezuje se za ljudski manoza-6-fosfat receptor nezavisan od katjona na način nezavisan od manoza-6-fosfata sa konstantom disocijacije od 10<-7>M ili manje (npr.10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>ili manje) pri pH 7,4. U nekim otelotvorenjima, IGF-II mutein otporan na furin sadrži mutaciju u regionu koji odgovara aminokiselinama 30-40 (npr., 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33- 39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) zrelog ljudskog IGF-II. U nekim otelotvorenjima, pogodna mutacija ukida najmanje jedno mesto razdvajanja furin proteaze. Mutacija može biti aminokiselinska supstitucija, umetanje i brisanje. Na primer, bilo koja aminokiselina u regionu koji odgovara ostacima 30-40 (npr.30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) od SEQ ID NO: 5 može biti supstituisana sa bilo kojom drugom aminokiselinom ili izbrisana. Na primer, supstitucije na položaju 34 mogu uticati na prepoznavanje furina prvog mesta razdvajanja. Ubacivanje jedne ili više dodatnih aminokiselina unutar svakog mesta za prepoznavanje može ukinuti jedno ili oba mesta razdvajanja furina. Brisanje jednog ili više ostataka u degenerisanim položajima može takođe da ukine oba mesta razdvajanja furina.

[0088] U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein otporan na furin sadrži supstitucije aminokiselina na položajima koji odgovaraju Arg37 ili Arg40 zrelog ljudskog IGF-II. U nekim otelotvorenjima, IGF-II mutein otporan na furin sadrži Lys ili Ala supstituciju na položajima Arg37 ili Arg40. Moguće su i druge supstitucije, uključujući kombinacije Lys i/ili Ala mutacija na oba položaja 37 i 40, ili supstitucije aminokiselina koje nisu Lys ili Ala.

[0089] U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein pogodan za upotrebu ovde može da sadrži dodatne mutacije. Na primer, do 30% ili više ostataka SEQ ID NO: 1 može da se promeni (npr. do 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% ili više

2

ostataka može biti promenjeno). Prema tome, IGF-II mutein pogodan za upotrebu ovde može imati aminokiselinsku sekvencu najmanje 70%, uključujući najmanje 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnu aminokiselinama 8-67 zrelog ljudskog IGF-II.

[0090] U različitim otelotvorenjima, IGF-II mutein pogodan za upotrebu ovde je specifično ciljan na CI-MPR. Posebno korisne su mutacije u polipeptidu IGF-II koje rezultuju proteinom koji sa visokim afinitetom vezuje CI-MPR (npr., sa konstantom disocijacije od 10<-7>M ili manje na pH 7,4) dok se vezuju drugi receptori za koje je poznato da su vezani IGF-II sa smanjenim afinitetom u odnosu na prirodni IGF-II. Na primer, IGF-II mutein otporan na furin pogodan za pronalazak može biti modifikovan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za IGF-I receptor u odnosu na afinitet prirodnog ljudskog IGF-II za IGF-I receptor. Na primer, supstitucija IGF-II ostataka Tyr 27 sa Leu, Leu 43 sa Val ili Ser 26 sa Phe smanjuje afinitet IGF-II za IGF-I receptor za 94-, 56- i 4-puta, respektivno (Torres i dr. (1995) J. Mol. Biol. 248(2):385-401). Brisanje ostataka 1-7 ljudskog IGF-II rezultovalo je 30-strukim smanjenjem afiniteta za ljudski IGF-I receptor, i pratećim 12-strukim povećanjem afiniteta za pacovski IGF-II receptor (Hashimoto i dr. (1995) J. Biol. Chem. 270(30):18013-8). NMR struktura IGF-II pokazuje da se Thr-7 nalazi u blizini ostataka Phe-48 Phe i Ser-50, kao i blizu Cys-9-Cys-47 disulfidnog mosta. Smatra se da interakcija Thr-7 sa ovim ostacima može stabilizovati fleksibilni N-terminalni heksapeptid potreban za vezivanje receptora IGF-I (Terasawa i dr. (1994) EMBO J.13(23)5590-7). U isto vreme ova interakcija može modulisati vezivanje za IGF-II receptor. Skraćivanje C-terminusa IGF-II (ostaci 62-67) takođe izgleda da snižava afinitet IGF-II za IGF-I receptor za 5 puta (Roth i dr. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181(2):907-14).

[0091] Vezujuće površine za IGF-I i M6P receptore nezavisne od katjona su na odvojenim licima IGF-II. Na osnovu strukturalnih i mutacijskih podataka, funkcionalni domeni za vezivanje M6P nezavisnog od katjona mogu biti konstruisani tako da su znatno manji od ljudskog IGF-II. Na primer, amino terminalne aminokiseline (npr., 1-7 ili 2-7) i/ili karboksi terminalni ostaci 62-67 mogu biti izbrisani ili zamenjeni. Pored toga, aminokiseline 29-40 mogu biti eliminisane ili zamenjene bez promene preklapanja ostatka polipeptida ili vezivanja za M6P receptor nezavisan od katjona. Prema tome, može se konstruisati ciljana grupa koja uključuje aminokiseline 8-28 i 41-61. Ovi proteini aminokiselina mogu biti

2

direktno spojeni ili odvojeni od strane veznika. Alternativno, aminokiseline 8-28 i 41-61 mogu biti date na odvojenim polipeptidnim lancima. Uporedivi domeni insulina, koji su homologni sa IGF-II i imaju tercijarnu strukturu blisko vezanu sa strukturom IGF-11, imaju dovoljno strukturalnih informacija da omoguće pravilno savijanje u odgovarajuću tercijarnu strukturu, čak i kada su prisutni u odvojenim polipeptidnim lancima (Wang i dr. (1991) Trends Biochem. Sci.279-281). Tako, na primer, aminokiseline 8-28, ili njihova konzervativna supstituciona varijanta, mogu biti fuzionisane sa lizozomalnim enzimom; rezultujući fuzioni protein može da se pomeša sa aminokiselinama 41-61, ili njegovom konzervativnom supstitucionom varijantom, i da se daje pacijentu.

[0092] IGF-II se takođe može modifikovati kako bi se minimalizovalo vezivanje za serumske IGF-vezujuće proteine (Baxter (2000) Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 278(6):967-76) kako bi se izbegla sekvestracija IGF-II/GILT konstrukata. Brojne studije imaju lokalizovane ostatke u IGF-II neophodne za vezivanje za IGF-vezujuće proteine. Konstrukti sa mutacijama na ovim ostacima mogu biti testirani na zadržavanje visokog afiniteta vezivanja za M6P/IGF-II receptor i za smanjeni afinitet za IGF-vezujuće proteine. Na primer, za zamenu Phe-26 od IGF-II sa Ser je navedeno da smanjuje afinitet IGF-II za IGFBP-1 i -6 bez uticaja na vezivanje za M6P/IGF-II receptor (Bach i dr. (1993) J. Biol. Chem.268(13):9246-54). Druge supstitucije, kao što je Lys za Glu-9, takođe mogu biti korisne. Analogne mutacije, odvojeno ili u kombinaciji, u regionu IGF-I koje je visoko konzerviran sa IGF-II rezultuju velikim smanjenjem vezivanja IGF-BP (Magee i dr. (1999) Biochemistry 38(48):15863-70).

[0093] Alternativni pristup je da se identifikuju minimalni regioni IGF-II koji se mogu vezati sa visokim afinitetom za M6P/IGF-II receptor. Ostaci koji su uključeni u IGF-II vezivanje za M6P/IGF-II receptor su uglavnom klasteri na jednoj strani IGF-II (Terasawa i dr. (1994) EMBO J.13(23):5590-7). Iako je tercijarna struktura IGF-II normalno održavana sa tri intramolekularne disulfidne veze, peptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu na površini vezivanja receptora M6P/IGF-II receptora IGF-II može biti dizajniran da se pravilno savija i ima aktivnost vezivanja. Takav minimalni vezujući peptid je veoma poželjan lizozomalni ciljani domen. Na primer, poželjni lizozomalni ciljani domen su aminokiseline 8-67 ljudskog IGF-II. Dizajnirani peptidi, zasnovani na regionu oko aminokiselina 48-55, koji se vezuju za M6P/IGF-II receptor, takođe su poželjni lizozomalni ciljani domeni. Alternativno, nasumična biblioteka peptida može biti testirana za sposobnost vezivanja M6P/IGF-II receptora ili preko dva hibridna testa kvasca, ili putem testa tipa prikaza fag.

2

Afinitet vezivanja za insulinski receptor

[0094] Mnogi IGF-II muteini, uključujući furin-otporne IGF-II muteine, koji su ovde opisani, imaju smanjen ili umanjen afinitet vezivanja za insulinski receptor. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, peptidna oznaka pogodna za pronalazak ima smanjen ili umanjen afinitet vezivanja za insulinski receptor u odnosu na afinitet prirodnog ljudskog IGF-II za insulinski receptor. U nekim otelotvorenjima, peptidne oznake sa smanjenim ili umanjenim afinitetom vezivanja za receptor insulina pogodne za pronalazak uključuju peptidne oznake koje imaju afinitet vezivanja za insulinski receptor koji je više od 1,5 puta, 2-puta, 3-puta, 4-puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 12 puta, 14 puta, 16 puta, 18 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta. 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta manji nego kod zrelog ljudskog IGF-II divljeg tipa. Afinitet vezivanja za insulinski receptor može se meriti korišćenjem različitih in vitro i in vivo testova poznatih u struci. Primeri testova vezivanja opisani su u odeljku Primeri.

Mutageneza

[0095] IGF-II muteini se mogu pripremiti uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u IGF-II DNK, ili sintezom željenog IGF-II polipeptida. Varijacije u sekvenci IGF-II mogu biti napravljene, na primer, korišćenjem bilo koje od tehnika i smernica za konzervativne i nekonzervativne mutacije navedene, na primer, u U.S. Pat. No.5,364,934. Varijacije mogu biti supstitucija, brisanje ili umetanje jednog ili više kodona koji kodiraju IGF-II, što rezultuje promenom u sekvenci aminokiselina IGF-II u poređenju sa sekvencom koja se javlja u prirodi zrelog ljudskog IGF-II. Aminokiselinske supstitucije mogu biti rezultat zamene jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima slična strukturna i/ili hemijska svojstva, kao što je zamena leucina sa serinom, tj., konzervativne aminokiselinske zamene.

Aminokiselinske supstitucije mogu takođe biti rezultat zamene jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva, tj. nekonzervativne aminokiselinske zamene. Umetanja ili brisanja mogu opciono biti u opsegu od 1 do 5 aminokiselina. Dozvoljene varijacije mogu se odrediti sistematskim unosima, brisanjima ili supstitucijama aminokiselina u sekvenci i testiranjem dobijenih varijanti za aktivnost u in vivo ili in vitro testovima koji su poznati u struci (kao što su testovi vezivanja za CI-MPR ili testove razdvajanja furina).

[0096] Analiza aminokiselina za skeniranje takođe se može koristiti za identifikaciju jedne ili više aminokiselina duž kontinualne sekvence. Među poželjnim aminokiselinama su relativno male, neutralne aminokiseline. Takve aminokiseline uključuju alanin, glicin, serin i cistein.

2

Alanin je tipično poželjna aminokiselina za skeniranje u ovoj grupi jer eliminiše bočni lanac iznad beta-ugljenika i manje je verovatno da će promeniti konformaciju glavnog lanca varijante. Alanin je takođe obično poželjan jer je najčešća aminokiselina. Dalje, često se nalazi i u zakopanim i izloženim položajima [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Ako supstitucija alanina ne daje adekvatne količine varijante, može se koristiti izoterična aminokiselina.

[0097] Varijacije se mogu izvesti upotrebom postupaka koji su poznati u struci, kao što su oligonukleotid-posredovana (usmerena na mesto) mutageneza, alaninsko skeniranje i PCR mutageneza. Mutageneza usmerena na mesto [Carter i dr., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller i dr., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], kasetna mutageneza kasete [Wells i dr., Gene, 34:315 (1985)], mutageneza restrikcione selekcije [Wells i dr., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] ili druge poznate tehnike mogu biti izvedene na kloniranoj DNK kako bi se proizveli IGF-II muteini.

Spejser

[0098] GILT oznaka može biti fuzionisana na N-terminus ili C-terminus lizozomalnog enzima. GILT oznaka može biti fuzionisana direktno sa lizozomalnim enzimom ili može biti odvojena od lizozomalnog enzima pomoću veznika ili spejsera. Aminokiselinski veznik ili spejser je generalno dizajniran da bude rigidan, fleksibilan ili da se umeće strukturu, kao što je alfa-spirala, između dve proteinske grupe. Veznik ili spejser može biti duži, kao što je dužina 25-50 aminokiselina ili 35-55 aminokiselina. Mesto fuzionog spoja treba izabrati pažljivo kako bi se promovisalo pravilno savijanje i aktivnost oba fuziona partnera i kako bi se sprečilo prevremeno odvajanje peptidne oznake od lizozomalnog enzima, npr., Alfa-N-acetilglukozaminidaza.

[0099] Dodatni konstrukti GILT-označenih alfa-N-acetilglukozaminidaznih proteina koji se mogu koristiti u postupcima i sastavima predmetnog pronalaska su detaljno opisani u U.S. publikacije br.20050244400 i 20050281805.

Ćelije

[0100] Svaka ćelija sisara, ili tip ćelije, koja je osetljiva na ćelijsku kulturu, i na eksprimiranje polipeptida, može se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, kao što je, na primer, ljudski embrionalni bubreg (HEK) 293, jajnik kineskog hrčka (CHO), bubreg majmuna (COS), HT1080, C10, HeLa, bubreg bebe hrčka (BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/0 i L-929.

Neograničavajući primeri ćelija sisara koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom

2

uključuju, ali nisu ograničeni na, BALB/c mišju liniju mijeloma (NS0/1, ECACC No:

85110503); ljudske retinoblaste (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega ljudskog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham i dr., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka /- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1 587); ćelije ljudskog raka grlića materice (HeLa, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (V138, ATCC CCL 75); ljudske ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i dr., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija ljudskog hepatoma (Hep G2). U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein iz predmetnog pronalaska se proizvodi iz CHO ćelijskih linija.

[0101] Fuzioni protein iz pronalaska može takođe biti eksprimiran u različitim ćelijama domaćina koji nisu sisari, kao što je, na primer, insekt (npr., Sf-9, Sf-21, Hi5), biljka (npr. Leguminosa, žitarice, ili duvan), kvasac (npr. S. cerivisae, P. pastoris), prokariot (npr. E. Coli, B. subtilis i drugi Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomices spp), ili gljiva.

[0102] U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein sa ili bez GILT oznake otporne na furin može biti proizveden u ćelijama sa nedostatkom furin. Kako se ovde koristi, izraz „ćelije sa nedostatkom furina“ se odnosi na bilo koje ćelije čija je aktivnost proteina furina inhibirana, smanjena ili eliminisana. Ćelije sa nedostatkom furina uključuju i sisarske i ćelije koje nisu sisarske koje ne proizvode furin ili proizvode smanjenu količinu ili defektnu furin proteazu. Primeri ćelija sa nedostatkom furina koje su poznate i dostupne stručnjacima, uključuju ali nisu ograničene se na FD11 ćelije (Gordon i dr (1997) Infection and Immunity 65(8):3370 3375), i one mutantne ćelije opisane u Moebring and Moehring (1983) Infection and Immunity 41(3):998 1009. Alternativno, ćelija sa nedostatkom furina može se dobiti izlaganjem gore opisanih ćelija sisara i ćelija koje nisu od sisara tretmanu mutageneze, npr. zračenju, etidijum bromidu, bromidovanom uridinu (BrdU) i drugim, poželjno hemijske mutageneze, i još poželjnije etil metan sulfonat mutageneze, uz uzimanje ćelija koje su preživele tretman, i selekciju za one ćelije za koje je utvrđeno da su otporne na toksičnost Pseudomonas egzotoksina A (pogledati Moehring and Moehrin (1983) Infection and Immunity 41(3):998 1009).

[0103] U različitim otelotvorenjima, smatra se da određeni ciljani terapeutski proteini koji sadrže spejser, kao što je ovde opisano, mogu pokazivati povećano eksprimiranje aktivnog proteina kada se eksprimiraju rekombinantno u poređenju sa ciljanim terapeutskim proteinima koji sadrže različit spejser peptid. U različitim otelotvorenjima, takođe se smatra da ciljani terapeutski proteini koji su ovde opisani mogu imati povećanu aktivnost u odnosu na druge ciljane terapeutske proteine ovde pomenute. Zamišljeno je da se za dalje eksperimentisanje koriste ciljani terapeutski proteini koji pokazuju povećano eksprimiranje aktivnog proteina i/ili imaju povećanu aktivnost u poređenju sa drugim ciljanim terapeutskim proteinima koji sadrže različiti spejser peptid.

Primena terapeutskih proteina

[0104] Prema pronalasku, terapeutski protein iz predmetnog pronalaska se tipično daje pojedincu, ili u sastavima ili lekovima koji sadrže terapeutski protein (npr., u proizvodnji leka za tretmana bolesti), kao što je ovde opisano. Sastavi mogu biti formulisani sa fiziološki prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom za pripremu farmaceutskog sastava. Nosač i sastav mogu biti sterilni. Formulacija treba da odgovara načinu primene.

[0105] Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, rastvore soli (npr. NaCl), fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, alkohole, glicerol, etanol, gumu arabiku, biljna ulja, benzil alkohole, polietilen glikole, želatin, ugljene hidrate kao što su laktoza, amiloza ili skrob, šećere kao što su manitol, saharoza ili drugi, dekstrozu, magnezijum stearat, talk, silicijumsku kiselinu, viskozni parafin, parfemsko ulje, estre masnih kiselina, hidroksimetilcelulozu, polivinil pirolidon, itd., kao i njihove kombinacije.

Farmaceutski preparati se, po želji, mogu mešati sa pomoćnim agensima (npr. lubrikanti, konzervansi, stabilizatori, agensi za vlaženje, emulgatori, soli za uticanje na osmotski pritisak, puferi, boje, arome i/ili aromatične supstance i slično) koje ne reaguju štetno sa aktivnim jedinjenjima, i ne ometaju njihovu aktivnost. U poželjnom otelotvorenju, koristi se vodorastvorni nosač pogodan za intravenoznu primenu.

[0106] Sastav ili lek, po želji, mogu takođe da sadrže manje količine agenasa za vlaženje ili emulgiranje, ili agense za puferisanje pH. Sastav može biti tečni rastvor, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa odloženim oslobađanjem ili prah. Sastav se takođe

1

može formulisati kao supozitorijum, sa tradicionalnim vezivima i nosačima kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može uključivati standardne nosače kao što su farmaceutski tipovi manitola, laktoze, skroba, magnezijum stearata, polivinil pirolidona, natrijum-saharina, celuloze, magnezijum-karbonata, itd.

[0107] Sastav ili lek može biti formulisan u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutski sastav prilagođena za davanje ljudima. Na primer, u poželjnom otelotvorenju, sastav za intravenoznu primenu je tipično rastvor u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je neophodno, sastav može takođe da sadrži agens za solubilizaciju i lokalni anestetik za ublažavanje bola na mestu injekcije. Generalno, sastojci se isporučuju ili odvojeno ili pomešani zajedno u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili kesica koja ukazuje na količinu aktivnog agensa. Tamo gde sastav treba primenjivati infuzijom, ona se može izdati sa infuzionom bocom koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu, fiziološki rastvor ili dekstrozu/vodu. Kada se preparat primenjuje injekcijom, može se pružiti ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu mešati pre primene.

[0108] Terapeutski protein može biti formulisan kao neutralni ili slani oblik. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one formirane sa slobodnim amino grupama kao što su one izvedene iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one formirane sa slobodnim karboksilnim grupama kao što su one izvedene iz natrijuma, kalijuma, amonijaka, kalcijuma, feri hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd.

[0109] Terapeutski protein (ili sastav ili lek koji sadrži terapeutski protein) se primenjuje na bilo koji odgovarajući način. U različitim otelotvorenjima, terapeutski protein se primenjuje intravenozno. U drugim otelotvorenjima, terapeutski protein se primenjuje direktnom primenom u ciljano tkivo, kao što je srce ili mišić (npr., intramuskularno), ili nervni sistem (npr. direktno injektiranje u mozak; intraventrikularno; intratekalno). U različitim otelotvorenjima, terapeutski protein se primenjuje intratekalno. Alternativno, terapeutski protein (ili sastav ili lek koji sadrži terapeutski protein) može biti primenjen parenteralno, transdermalno ili transmukozno (npr. oralno ili nazalno). Više od jednog puta se može koristiti istovremeno, ako se želi, npr. terapeutski protein se primenjuje intravenozno i

2

intratekalno. Istovremena intravenska i intratekalna primena ne mora biti istovremena, ali može biti sekvencijalna.

[0110] Terapeutski protein (ili sastav ili lek koji sadrži terapeutski protein) može biti primenjen sam ili u kombinaciji sa drugim agensima, kao što su antihistaminici (npr. difenhidramin) ili imunosupresivi ili drugi imunoterapijski agensi koji suzbijaju anti-GILT-označena lizozomalna enzimska antitela. Izraz „u vezi sa“ označava da se agens primenjuje pre, približno u isto vreme ili posle terapeutskog proteina (ili sastava ili leka koji sadrži terapeutski protein). Na primer, agens se može mešati u sastav koja sadrži terapeutski protein, i na taj način se primenjuje istovremeno sa terapeutskim proteinom; alternativno, agens se može primenjivati istovremeno, bez mešanja (npr., „piggybacking“ isporukom agensa na intravenoznoj liniji kojom se takođe daje terapeutski protein, ili obrnuto). U drugom primeru, agens se može primenjivati odvojeno (npr., ne meša se), ali u kratkom vremenskom okviru (npr., unutar 24 sata) od primene terapeutskog proteina.

[0111] Terapeutski protein (ili sastav ili lek koji sadrži terapeutski protein) se daje u terapeutski efikasnoj količini (tj. količina doze koja je, kada se daje u pravilnim intervalima, dovoljna za tretman bolesti, kao što je poboljšanje simptoma povezanih sa bolešću, sprečavanje ili odlaganje početka bolesti, i/ili takođe smanjenje ozbiljnosti ili učestalosti simptoma bolesti, kao što je gore opisano). Doza koja će biti terapeutski efikasna za tretmana bolesti će zavisiti od prirode i obima efekata bolesti i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Dodatno, in vitro ili in vivo testovi se opciono mogu koristiti da pomognu u identifikaciji optimalnih opsega doziranja koristeći postupke koji su poznati u struci. Precizna doza koja će se koristiti će takođe zavisiti od puta primene i ozbiljnosti bolesti, i trebalo bi da bude određena prema proceni stručnjaka i okolnostima svakog pacijenta. Efektivne doze se mogu ekstrapolirati iz doza-odgovor krivih izvedenih in vitro ili iz test sistema za životinjske modele. Terapeutski efikasna količina doze može biti, na primer, oko 0,1-1 mg/kg, oko 1-5 mg/kg, oko 2,5-20 mg/kg, oko 5-20 mg/kg, oko 20-50 mg/kg ili oko 20-100 mg/kg ili oko 50-200 mg/kg, ili oko 2,5 do 20 mg/kg telesne težine. Efikasna doza za određenu jedinku može varirati (npr., povećati se ili smanjiti) tokom vremena, u zavisnosti od potreba jedinke. Na primer, u vreme fizičkog oboljenja ili stresa, ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, količina doze se može povećati.

[0112] Terapeutski efikasna količina terapeutskog proteina (ili sastava ili leka koji sadrži terapeutski protein) se primenjuje u redovnim intervalima, u zavisnosti od prirode i obima efekata bolesti, i na stalnoj osnovi. Primena u „intervalu“, kako se ovde koristi, ukazuje da se terapeutski efikasna količina primenjuje periodično (kako se razlikuje od jednokratne doze). Interval se može odrediti standardnim kliničkim tehnikama. U nekim otelotvorenjima, terapeutski protein se primenjuje dvomesečno, mesečno, dva puta mesečno, tronedeljno, dvonedeljno, nedeljno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno ili dnevno. Interval primene za jednu jedinku ne mora biti fiksni interval, ali se može menjati tokom vremena, u zavisnosti od potreba jedinke. Na primer, u vreme fizičkog oboljenja ili stresa, ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, interval između doza se može smanjiti.

[0113] Kako se ovde koristi, izraz „dvomesečno“ podrazumeva primenu jednom u dva meseca (tj. jednom svaka dva meseca); izraz „mesečno“ znači primenu jednom mesečno; izraz „tronedeljno“ znači primenu jednom u tri nedelje (tj. jednom svake tri nedelje); izraz „dvonedeljno“ označava primenu jednom u dve nedelje (tj. jednom svake dve nedelje); izraz „nedeljno“ označava primenu jednom nedeljno; i izraz „dnevno“ označava primenu jednom dnevno.

[0114] Obelodanjenje se dodatno odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski protein, kao što je ovde opisano, u kontejneru (npr. boci, bočici, kesici za intravenoznu primenu, špricu, itd.) sa oznakom koja sadrži uputstva za davanje sastave za tretmana mukopolisaharidoze tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom), kao što su ovde opisani postupci. Intratekalnu primenu farmaceutski prihvatljivih formulacija

[0115] U različitim otelotvorenjima, enzimski fuzioni protein se primenjuje uvođenjem u centralni nervni sistem pacijenta, npr., u cerebrospinalnu tečnost pacijenta. U određenim aspektima predmetnog pronalaska, enzim se uvodi intratekalno, npr. u lumbalno područje, ili u cistema magna ili intraventrikularno (ili intracerebroventrikularno) u prostor moždane komore. Postupci primene lizozomalnog enzima intratekalno su opisani u US Patent 7,442,372.

[0116] Stručnjaci u oblasti su svesni uređaja koji se mogu koristiti za obavljanje intratekalne primene terapeutskog sastava. Na primer, terapija se može primeniti korišćenjem Ommaya rezervoara koji se obično koristi za intratekalnu primenu lekova za meningealnu karcinomatozu (Ommaya AK, Lancet 2: 983-84, 1963). Konkretnije, u ovom postupku, ventrikularna cev je ubačena kroz rupu formiranu u prednjem rogu i povezana je sa Ommaya

4

rezervoarom instaliranim ispod skalpa, i rezervoar je potkožno probušen da intratekalno isporuči određeni enzim koji se zamenjuje, koji se injektira u rezervoar. Drugi uređaji za intratekalnu primenu terapeutskih sastava pojedincu su opisani u U.S. Pat. No.6,217,552. Alternativno, sastav može biti intratekalno primenjen, na primer, jednom injekcijom, ili kontinuiranom infuzijom. Treba shvatiti da tretman doziranjem može biti u obliku pojedinačne doze ili više doza.

[0117] Kako se ovde koristi, izraz „intratekalna primena“ ima za cilj da uključi isporuku farmaceutskog sastava direktno u cerebrospinalnu tečnost pacijenta, tehnikama koje uključuju lateralnu cerebroventrikularnu injekciju (tj. Intracerebroventrikularno) kroz rupu u lobanji ili cistemalnu ili lumbalnu punkciju ili slično (opisano kod Lazorthes i dr. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 and Omaya i dr., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179. Izraz „lumbalni region“ treba da obuhvati područje između trećeg i četvrtog lumbalnog (donji deo leđa) pršljena i, još više, L2-S1 regiona kičme. Izraz „cisterna magna“ je namenjen da obuhvati pristup prostoru oko i ispod cerebeluma preko otvora između lobanje i vrha kičme. Izraz „moždana komora“ ima za cilj da obuhvati šupljine u mozgu koje su kontinuirane sa centralnim kanalom kičmene moždine. Primena farmaceutskog sastava u skladu sa ovim pronalaskom na bilo koje od gore pomenutih mesta može se postići direktnim ubrizgavanjem sastave ili upotrebom infuzionih pumpi. Za injekcije, sastav pronalaska može biti formulisana u tečnim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što je Hank-ov rastvor, Ringer-ov rastvor ili fosfatni pufer. Dodatno, enzim može biti formulisan u čvrstom obliku i ponovo rastvoren ili suspendovan neposredno pre upotrebe. Liofilizovani oblici su takođe uključeni. Injekcija može biti, na primer, u obliku bolus injekcije ili kontinuirane infuzije (npr. upotrebom infuzionih pumpi) enzima.

[0118] U različitim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, enzim se primenjuje lateralnom cerebro-ventrikularnom injekcijom u mozak pacijenta. Injekcija se može napraviti, na primer, kroz rupu koja je napravljena u lobanji pacijenta. U još jednom otelotvorenju, enzim i/ili druga farmaceutska formulacija se primenjuju kroz hirurški umetnut šant u cerebralnu komoru pacijenta. Na primer, ubrizgavanje se može izvršiti u lateralne komore, koje su veće, iako se može napraviti i injekcija u treću i četvrtu manju komoru.

[0119] U različitim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi koje se koriste u ovom pronalasku se primenjuje injekcijom u cisternu magnu, ili lumbalnu oblast pacijenta. U sledećem otelotvorenju postupka prema pronalasku, farmaceutski prihvatljiva formulacija pruža neprekidno oslobađanje, npr., „sporo oslobađanje“ enzima ili drugog farmaceutskog sastava koji se koristi u ovom pronalasku, pacijentu tokom najmanje jedne, dve, tri, četiri nedelje, ili u dužim vremenskim periodima nakon što se pacijentu primeni farmaceutski prihvatljiva formulacija.

[0120] U različitim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja na jedno ili više površinskih ili plitkih tkiva mozga ili kičmene moždine. Na primer, u različitim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja na jedno ili više površinskih ili plitkih tkiva cerebruma ili kičmene moždine. U nekim otelotvorenjima, ciljane površine ili plitka tkiva cerebruma ili kičmene moždine nalaze se unutar 4 mm od površine cerebruma. U nekim otelotvorenjima, ciljane površine ili plitka tkiva cerebruma su izabrana iz tkiva pia materije, tkiva cerebralne kortikalne trake, hipokampusa, Virchow Robin prostora, krvnih sudova unutar VR prostora, hipokampusa, delova hipotalamusa na donjoj površini. mozak, optički nervi i trakti, olfaktorna sijalica i projekcije, i njihove kombinacije.

[0121] U nekim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja u jedno ili više dubokih tkiva cerebruma ili kičmene moždine. U nekim otelotvorenjima, ciljane površine ili plitka tkiva cerebruma ili kičmene moždine nalaze se 4 mm (npr., 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm ili 10 mm) ispod (ili unutar) površine mozga. U nekim otelotvorenjima, ciljana duboka tkiva mozga uključuju cerebralnu kortikalnu traku. U nekim otelotvorenjima, ciljana duboka tkiva cerebruma uključuju jedan ili više od diencefalona (npr. hipotalamus, talamus, prethalamus, subtalamus, itd.), metencefalona, lentiformnih jezgara, bazalne ganglije, kaudata, putamena, amigdale, globus pallidus i njihovih kombinacija.

[0122] U različitim otelotvorenjima, ciljana površina ili plitko tkivo kičmene moždine sadrži pia materiju i/ili trake bele materije. U različitim otelotvorenjima, ciljano duboko tkivo kičmene moždine sadrži sivu materiju kičmene moždine i/ili ependimalne ćelije. U nekim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja neuronima kičmene moždine.

[0123] U različitim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja u jedno ili više tkiva malog mozga. U određenim otelotvorenjima, ciljano jedno ili više tkiva malog mozga je izabrano iz grupe koja se sastoji od tkiva molekularnog sloja, tkiva Purkinje ćelijskog sloja, tkiva granularnog ćelijskog sloja, cerebelarnih pedunklova i njihovih kombinacije. U nekim otelotvorenjima, terapeutski agensi (npr. enzimi) se dostavljaju u jedno ili više dubokih tkiva malog mozga uključujući, ali ne ograničavajući se na, tkiva Purkinje ćelijskog sloja, tkiva granularnog ćelijskog sloja, dubokog tkiva male cerebelarne mase (npr. duboko u odnosu na granularni ćelijski sloj), i duboko tkivo jezgra malog mozga.

[0124] U različitim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja u jedno ili više tkiva moždanog stabla. U nekim otelotvorenjima, ciljano jedno ili više tkiva moždanog stabla uključuje belu materiju tkiva moždanog stabla i/ili tkivo jezgra moždanog stabla.

[0125] U različitim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja različitim tkivima mozga uključujući, ali bez ograničenja, sivu materiju, belu materiju, periventrikularne oblasti, pia-arahnoid, meninge, neokorteks, cerebelum, duboka tkiva u moždanom korteksu, molekularni sloj, kaudat/putamen region, srednji mozak, duboki regioni pons ili medula, i njihove kombinacije.

[0126] U različitim otelotvorenjima, terapeutski fuzioni protein se dostavlja različitim ćelijama u mozgu uključujući, ali bez ograničavanja, neurone, glijalne ćelije, perivaskularne ćelije i/ili meningealne ćelije. U nekim otelotvorenjima, terapeutski protein se dostavlja oligodendrocitima duboke bele materije.

Kompleti za upotrebu u postupcima pronalaska

[0127] Agensi koja se koriste u postupcima iz predmetnog pronalaska mogu biti pruženi u kompletu, gde komplet može dalje da sadrži uputstva za upotrebu. Takav komplet će sadržati fuzioni protein, kako je ovde opisan, koji obuhvata enzim za upotrebu u tretmanu bolesti lizozomalnog skladištenja i lizozomalnu ciljanu grupu, obično u dozi i obliku pogodnom za primenu domaćinu. Komplet će obično sadržati uređaj za isporuku enzima intratekalno.

[0128] Komplet takođe može da se pruži za konjugaciju antigena, posebno polipeptidnog antigena, sa visokom koncentracijom, kako bi se dobio terapeutski sastav. Na primer, može se pružiti ostatak kao što je IGF-II mutein, bilo konjugovan na veznik pogodan za povezivanje polipeptida, kao što je gore opisano. Grupa sa visokim unosom može takođe biti pružena u nekonjugovanom obliku, u kombinaciji sa pogodnim veznikom, i uputstvima za upotrebu.

[0129] Drugi komplet može sadržati instrukcije za intratekalnu primenu terapeutskih sastava predmetnog pronalaska, pored terapeutskih sastava. Kompleti mogu sadržati katetere ili druge uređaje za intratekalnu primenu terapije zamene enzima, koji su prethodno napunjeni sa terapeutskim preparatima predmetnog pronalaska. Na primer, posebno su razmatrani kateteri koji su prethodno napunjeni sa 0,001-0,01 mg, 0,01-0,1 mg, 0,1-1,0 mg, 1,0-10 mg, 10-100 mg, ili više terapeutskog fuzionog proteina koji sadrži lizozomalni enzim i lizozomalni ciljani ostatak, kao što je Naglu i IGF-II mutein, u farmaceutski prihvatljivoj formulaciji. Primeri katetera mogu biti kateteri za jednokratnu upotrebu koji se mogu odbaciti nakon upotrebe. Alternativno, prethodno napunjeni kateteri mogu biti takvi da se mogu ponovo puniti, i dati u kompletima koji imaju odgovarajuće količine enzima za ponovno punjenje takvih katetera.

[0130] Pronalazak će dalje biti detaljnije opisan sledećim primerima. Primeri su, međutim, uključeni radi ilustracije, a ne radi ograničenja.

PRIMER 1 – GENERISANJE SPEJSER SEKVENCI

[0131] Lizozomalni enzimi koji sadrže GILT oznake i spejsere su obelodanjeni u US publikacije patenata br.20030082176, 20040006008, 20040005309, i 20050281805. Fuzioni proteini alfa-N-acetilglukozaminidaze (Naglu) koji sadrže spejser peptide su obelodanjeni u US publikacije patenata br.201120232021. Dodatni spejser peptidi za upotrebu u ciljanim terapeutskim fuzionim proteinima koji sadrže lizozomalni enzim i GILT oznaku razvijeni su kao što je opisano ispod.

[0132] Spejseri se mogu razviti kako bi povezale i IGF-II muteini i IGF-II muteine otporni na furin. Primerni spejseri uključuju naredne aminokiselinske sekvence: EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22) GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), i GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62).

[0133] Konstrukti koji sadrže spejser, Naglu pune dužine (uključujući signalnu sekvencu) i IGF-II peptid su generisani, kod kojih je spejser sekvenca (EFGGGGSTR spejser (SEQ ID NO: 22), GAP spejser (SEQ ID NO: 9), GGGGS spejser (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG spejser (SEQ ID NO: 23), ili GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS spejser (SEQ ID NO: 36)) umetnuta između Naglu pune dužine i IGF28-67 R37A (SEQ ID NOs: 560-564).

[0134] Dodatni veznici su napravljeni na osnovu XTEN postupka kao što je opisano u Schellenberger i dr. (Nat Biotech 27: 1186-1190, 2009). XTEN-slični veznici mogu da pruže duži polu-život za generisani fuzioni protein u poređenju sa drugim veznicima. Primerni spejseri imaju aminokiselinske sekvence GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), i GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO: 47). Spejser se može umetnuti između Naglu i IGF-2 muteina, opciono preko AscI mesta na konstruktima.

[0135] Eksprimiranje proteina je povezano sa DNK kodonom koji se koristi za kodiranje određene aminokiseline, npr., promena kodona za aminokiselinu može povećati eksprimiranje proteina bez promene aminokiselinske sekvence proteina (Trinh i dr, Mol. Immunol 40:717-722, 2004). Promena kodona koji kodira peptid rezultuje povećanim nivoima proizvodnje rekombinantnog fuzionog proteina. Koristeći ovu tehniku razvijene su dodatne sekvence za upotrebu u terapeutskom fuzionom proteinu sa lizozomalnim enzimom, kao što je GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58) i GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59). Dodatne spejser sekvence su GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81) i GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82). Bilo koji od ovih spejsera umetnut je između Naglu i IGF-II muteina, opciono preko AscI mesta na konstruktima.

[0136] Primerni rigidni veznik koji sadrži višestruke proline koji doprinose rigidnosti, ima sledeću sekvencu GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), ili

GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), gde primerni spiralni veznik ima narednu sekvencu GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), ili GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55). Bilo koji od ovih spejsera umetnut je između Naglu i IGF-II muteina, opciono preko AscI mesta na konstruktima.

[0137] Dodatni odstojnici se mogu generisati korišćenjem optimizacije kodona koristeći tehnologiju razvijenu od strane DNK 2.0 (Menlo Park, CA). Razmatrani spejseri uključuju GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30),

GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGA

P (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40),

GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGA

P (SEQ ID NO: 43), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID

4

NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS GAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS

GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSG AP (SEQ ID NO: 78), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), i GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90). Bilo koji od ovih spejsera umetnut je između Naglu i IGF-II muteina, opciono preko AscI mesta na konstruktima.

[0138] U nekim otelotvorenjima, BM-40 sekvenca signalnog peptida proteina ekstracelularnog matriksa (Nischt i dr., Eur J. Biochem 200:529-536, 1991) se upotrebljava, Naglu u konstruktu koji ne sadrži sopstvenu sekvencu signalnog peptida. Spejser je umetnut između Naglu sekvence i IGF-II mutein sekvence (npr., IGF28-67 R37A). Primerna BM-40 sekvenca signalnog peptida je MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 8). GAP peptid se može dodati u spejser kako bi se olakšalo kloniranje i dodavanje mesta za kloniranje AscI. U određenim otelotvorenjima, ako se koristi prirodna Naglu sekvenca signalnog peptida (Weber i dr., Hum Mol Genet.5:771-777, 1996), Naglu, i spejser se umeću između Naglu pune dužine i IGF-II mutein sekvence (npr. IGF28-67 R37A). GAP peptid se može dodati u spejser kako bi se olakšalo kloniranje i dodavanje mesta za kloniranje AscI.

[0139] U primernim konstruktima, ljudski Naglu je „kodon optimizovan“ koristeći DNK 2.0 tehnologiju. Smatra se da Naglu sadrži aminokiseline 1-743 ili aminokiseline 24-743 ljudskog Naglu. U primeru konstrukt, spejser opciono sadrži GAP spejser (AscI mesto restrikcionog enzima koji se koristi za kloniranje) ili bilo koju od sledećih sekvenci:

EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGA

P (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGA

P (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40),

GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGA

P (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

(SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS GAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS GAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS

4

(SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS GAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSG AP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82),

GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH

[ili (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), i GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90). Gore navedeni spejseri su opciono „kodon optimizovani“ koristeći DNK 2.0 tehnologiju.

[0140] Bilo koji od ovde opisanih IGF-II muteina, koji su opciono „kodon optimizovani“ koristeći DNK 2.0 tehnologiju, korisni su u ovim konstruktima. U primernim konstruktima, IGF-II mutein je IGF-II mutein otporan na furin, IGF2 Δ8-67 R37A.

PRIMER 2 - EKSRPIMIRANJE I ČIŠĆENJE KONSTRUKATA

[0141] Konstrukti koji sadrže gore navedene spejsere, Naglu enzim i IGF-II ciljani peptid su napravljeni i rekombinantno eksprimirani. U određenim otelotvorenjima, konstrukti sadrže signalni peptid. Primeri signalnih peptida uključuju, na primer, i bez ograničenja, Naglu signalni peptid koji sadrži aminokiseline 1-23 od Naglu pune dužine (Weber i dr., Hum Mol Genet 5:771-777, 1996) ili signalni peptid izveden iz BM-40 proteina ekstracelularnog matriksa (Nischt i dr., Eur J Biochem 200:529-536, 1991).

[0142] DNK koja kodira Naglu sekvencu, IGF-II mutein i spejser peptid su ubačeni u odgovarajući vektor eksprimiranja, kao što su pEE i pXC GS vektori eksprimiranja (Lonza Biologics, Berkshire, UK) i pC3B (BioMarin, in-house) vektor eksprimiranja. AscI restrikciono mesto (ggcgcgcc (SEQ ID N0: 570)) može biti ubačeno u vektor da pomogne u kloniranju terapeutskih fuzionih proteina koji su ovde opisani.

[0143] Primerni konstrukt obuhvata Naglu sekvencu pune dužine (Slika 1 i Slika 2), uključujući signalni peptid, spejser peptid (Slika 3) i IGF-II peptid koji sadrži ostatke 8-67 i koji imaju supstituciju Ala aminokiseline kod ostatka Arg -37, R37A (Slike 1 i 2), koji IGF-II peptidu daju otpornost na furina.

[0144] Različite sekvence veznika ili spejsera opisane u Primeru 1, koje povezuju Naglu i IGF-II peptid, se inicijalno procenjuju korišćenjem sistema prelaznog eksprimiranja. GILT-označeni Naglu plazmidi (pXC17,4, Lonza) su transfektovani u suspenzione CHOK1SV GS KO ćelije (Lonza).15 µg DNK plazmida se transfektuje u 10<6>ćelija korišćenjem elektroporacije. Medijumi se potpuno zamenjuju 24 sata posle transfekcije. Transfektovane ćelije se zaseju u posude za mućkanje pri 1,5 x x10<6>ćelija/ml bez selekcije. Rast ćelija, vitalnost, titar i specifična produktivnost su određeni kako se ćelije uzgajaju na 30°C do 14 dana.

[0145] GILT-označeni Naglu plazmidi su transfektovani u suspenziju CHOK1SV ćelija (Lonza). Ćelije se uzgajaju u CDCHO medijumu (Invitrogen) sa 6 mM glutamina u posudama za mućkanje na 37°C i 8% CO2.30 µg linearizovane plazmidne DNK u 1 x 10<7>ćelija se transfektuju u ćelije korišćenjem elektroporacije. Ćelije su stavljene na 5000 ćelija/komorica u CDCHO medijumu 40 µM MSX 48 sati nakon transfekcije. Ploče su inkubirane na 37°C i 8% CO2tokom približno 4-6 nedelja kako bi se identifikovao klonski rast. Kolonije su zatim testirane 4MU testom aktivnosti za Naglu (pogledati Primer 3) i kolonije koje su najviše eksprimirale prebačene su na ploče sa 24 komorice u CDCHO medijumu 40 µM MSX, i zatim je nastavljeno da se prolazi kroz klonove sa najvećim eksprimiranjem do ploča sa 6 komorica, zatim da se tresu bočice kako bi se identifikovali klonovi sa najvećim eksprimiranjem da se proizvedu GILT-označeni Naglu fuzioni proteini.

[0146] Prečišćavanje se vrši korišćenjem standardnih tehnika za prečišćavanje proteina. Na

4

primer, u primernom postupku prečišćavanja, početni materijal supernatanta ćelijske kulture sisara, kao što je gore opisano, se odmrzava od čuvanja na -80°C. Materijal je prilagođen sa NaCl kako bi se postigla konačna koncentracija od 1 M, praćeno sa 0,2 µM sterilnom filtracijom.

[0147] Filtrirani materijal je nanesen na kolonu butil hidrofobne interakcije, prethodno ekvilibriranu sa butil puferom za punjenje (20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7,5). Vezani materijali se eluiraju sa linearnim gradijentom preko 10 zapremina kolone, koristeći butil pufer za eluiranje (20 mM Tris, pH 7,5). Uzorci iz eluiranih vrhova su sakupljeni, pufer je zamenjen u 20 mM Tris, pH 7,5, i napunjen u kolonu Q anjona. Vezani proteini se zatim eluiraju sa linearnim gradijentom (10 zapremina kolone) upotrebom pufera za eluiranje x (20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7,5). Pročišćeni uzorci se zatim razmenjuju korišćenjem centrifugalnih obrtnih koncentratora i sterilno filtriraju za čuvanje.

[0148] Konstrukcija, eksprimiranje, proizvodnja, prečišćavanje i formulacija primernog Naglu fuzionog proteina: Nasdu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEP ID NO: 568).. Konstrukcija DNK koja kodira Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) je generisan standardnim postupcima rekombinantne DNK. Naglu odgovara aminokiselinama 1-743 ljudskog Naglu pune dužine i IGF-II odgovara IGF-II muteinu koji sadrži aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II sa supstitucijom R37A aminokiseline koja daje otpornost na furin. CHOK1SV ćelije su transfektovane sa DNK konstruktom, i stabilan GILT-označeni Naglu-IGF-II fuzioni protein koji eksprimira klon izolovan je kao što je gore opisano.

[0149] Ćelije koje eksprimiraju Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) su uzgajane u bioreaktoru, i Naglu fuzioni protein je prečišćen iz medijuma za kulturu kao što sledi. Žetva je prilagođena za so do 1 M NaCl, zatim je napunjena na Butil Sepharose 4 FF kolonu. Naglu fuzioni protein je eluiran sa soli iz Butil Sepharose 4 FF kolone, sakupljen i dijaliziran, i zatim napunjen na Heparin Sepharose 6 FF kolonu. Naglu fuzioni protein je sakupljen u protočnom fragmentu i nanet na Q Sepharose HP kolonu. Naglu fuzioni protein je eluiran sa soli iz Q Sepharose HP kolone, koncentrovan i zatim poliran preparativnom Sephacryl S300 hromatografijom za isključivanje veličine.

[0150] Koristeći ovu proceduru prečišćavanja, visoko prečišćeni, enzimski aktivni Naglu fuzioni protein, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) . Prečišćeni Naglu

4

fuzioni protein je formulisan sa 20 mg/mL u veštačkom CSF (1 mM natrijum fosfat, 148 mM natrijum hlorid, 3 mM kalijum hlorid, 0,8 mM magnezijum hlorid, 1,4 mM kalcijum hlorid, pH 7,2).

[0151] Konstrukcija, eksprimiranje, proizvodnja, prečišćavanje i formulacija primernih Naglu fuzionih proteina. DNK konstrukti koji kodiraju Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO: 567), i Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565) su generisani standardnim postupcima rekombinantne DNK. Naglu odgovara aminokiselinama 1-743 ljudskog Naglu pune dužine i IGF-II odgovara IGF-II muteinu koji sadrži aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II sa supstitucijom R37A aminokiseline koja daje otpornost na furin. Primeri rigidnih, spiralnih i XTEN veznika su opisani u Primeru 1. CHOK1SV ćelije su transfektovane sa DNK konstruktima, i stabilni klonovi koji eksprimiraju GILT-označeni Naglu-IGF-II fuzioni protein izolovani su kao što je opisano gore.

[0152] Ćelije koje eksprimiraju Naglu-IGF-II fuzione proteine su uzgajane u bioreaktoru. U tipičnom serijskom proizvodnom ciklusu (10-16 dana), konstrukti Naglu-IGF-II sa različitim veznicima su dostigli titre iznad 30 mg/L sa visokom vijabilnošću preko 80%.

[0153] Naglu fuzioni proteini su prečišćeni iz medijuma za kulturu kao što je gore opisano. Koristeći ovu proceduru prečišćavanja, enzimski aktivni neoznačeni fuzioni proteini Naglu i Naglu-IGF-II, kao što je Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO: 567), Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565) i Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), su prečišćeni do ~ 99% čistoće, što je određeno reverzno-faznom HPLC. Prečišćeni netaknuti Naglu i Naglu fuzioni proteini su formulisani sa 20 mg/mL u veštačkom CSF (1 mM natrijum fosfat, 148 mM natrijum hlorid, 3 mM kalijum hlorid, 0,8 mM magnezijum hlorid, 1,4 mM kalcijum hlorid, pH 7,2).

[0154] Razmatrano je da se fuzioni proteini, kao što je ovde opisano, koji pokazuju više nivoe rekombinantnog eksprimiranja aktivnog proteina i/ili povećane enzimske aktivnosti u poređenju sa fuzionim proteinima koji sadrže različit spejser peptid, mogu koristiti u daljem eksperimentu, kao što su testovi aktivnosti, testovi vezivanja, testovi unosa i in vivo testovi aktivnosti kao što je dalje opisano.

4

PRIMER 3 - TESTOVI AKTIVNOSTI

[0155] Kako bi se odredila enzimska aktivnost Naglu fuzionih proteina, in vitro Test aktivnosti Naglu je izveden upotrebom fluorescentno obeleženog sintetičkog supstrata.

[0156] Materijali korišćeni u testu uključuju: 4-Metilumbelliferil-N-acetil-a-D-glukozaminid (4MU-NaGlu supstrat) (Calbiochem, Cat # 474500) pripremljen do konačne koncentracije 20 mM u 10% DMSO u puferu za analizu (0,2 M Natrijum acetat, sa ili bez 1 mg/ml BSA, i 0,005% Tween 20, pH 4,3-4,8) i čuva se na -80°C. Osnovni rastvor 4-Metilumbeliferona (4-MU Standard) (Sigma, Cat # M1381) je pripremljen na 10 mM u DMSO i čuvan na -20°C u malim alikvotima. Kontrola rhNaglu-His6 (0,5 mg/ml, R&D Systems, Cat # 7096-GH) se razblaži do 10 µg/ml u 25 mM Tris, 125 mM NaCl, 0,001% Tween 20, pH 7,5 i čuva na -80°C u malim alikvotima.

[0157] Na čistoj ploči za razblaživanje sa 96 komorica (Granger), 2x serijska razblaženja standarda u puferu za razblaživanje (1 x PBS, sa ili bez 1 mg/ml BSA, 0,005% Tween 20, pH 7,4, od 200 µM do 1,563 µM plus jedan prazan. Na čistoj ploči za razblaživanje uzorci se pripremaju u nekoliko razblaženja (u puferu za razblaživanje) kako bi se osiguralo da su unutar standardne krive.

[0158] 10 µl standarda (200 µM do 1,563 µM), kontrolni i radni uzorci se prenose u crnu netretiranu ploču sa 96 komorica (Costar, Cat # 3915).75 µl supstrata (2 mM) se dodaje u svaku komoricu, nakon čega sledi inkubacija tokom 30 minuta na 37°C. Reakcija se zatim gasi dodavanjem 200 µl pufera za zaustavljanje (0,5 M glicin/NaOH, pH 10,7). Ploče se očitavaju na Ex355 Em460 sa 455 odsečenim na fluorescentnom čitaču ploča sa 96 komorica.

[0159] Koristeći ovaj test, primeri Naglu fuzionih proteina, uključujući Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO: 567), i Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565), pokazali su da imaju enzimsku aktivnost in vitro, sa specifičnim aktivnostima prema sintetičkom 4MU-Naglu supstratu u rasponu od -175,000 do ~ 220,000 nmol/sat/mg. Enzimatska aktivnost Naglu fuzionih proteina je bila uporediva sa onom neoznačenog Naglu proteina (-190,000 nmol/sat/mg). Podaci o enzimskoj aktivnosti za primere Naglu fuzionih proteina dati su u Tabeli 1.

Tabela 2. Aktivnost Naglu fuzionih proteina

4

PRIMER 4 - ISPITIVANJE VEZIVANJA

[0160] Testovi vezivanja za određivanje vezivanja Naglu fuzionih proteina za IGF-I, IGF-II i receptore za insulin se izvode generalno kako je opisano u US 20120213762. Ukratko, konstrukti fuzionog proteina se testiraju na afinitet vezivanja za insulinski receptor u testu koji meri nadmetanje biotinilovanog vezivanja insulina za insulin vezan za ploču. Ispitivanje vezivanja insulinskih receptora sprovedeno je pomoću insulina koji se nadmeće, IGF-II i fuzionog proteina sa vezanjem biotinilovanog insulina za insulinski receptor (Insulin-R).

[0161] Konkretno, bele Reacti-Bind ploče su obložene sa Insulinom-R u koncentraciji od 1 pg/komorica/100 µl (38,4 nM). Obložene ploče su inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi, zatim isprane 3x puferom za ispiranje (300 µl/komorica). Ploče se zatim blokiraju puferom za blokiranje (300 µl/komorica) tokom 1 sata. Koraci pranja se ponavljaju i svaki trag rastvora u pločama se izvlači. Biotinilovani insulin se meša na 20 nM sa različitim koncentracijama insulina, IGF-II ili fuzionog proteina, serijskim razblaženjima. 100 µl razblaženog insulina, IGF-II ili Naglu fuzionog proteina u 20 nM insulin-biotina se

4

dodaje u obložene ploče, i ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ploče se zatim isperu 3 puta sa puferom za ispiranje. U ploče se doda 100 µl radnog rastvora strepavidina-HRP (50 µl strepavidin-HRP u 10 ml pufera za blokiranje) i ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Doda se 100 µl Elisa-Pico radnog rastvora koji sadrži Elisa-Pico hemiluminiscentni supstrat i hemiluminescencija se meri na 425 nm.

Test kompetetivnog vezivanja IGF2R

[0162] Kako bi se izmerila sposobnost konstrukata Naglu fuzionog proteina da se vezuju za IGF-II receptor, vrši se test kompetitivnog vezivanja. Fragment IGFIIR koji je uključen u vezivanje IGF-II (domeni 10-13, nazvan protein 1288) je obložen na ploče sa 96 komorica. Biotinilovani IGF-II se inkubira sa receptorom u prisustvu rastućih količina konkurenata: bilo kontrolni IGF-II (ne-biotinilovan), ili uzorak fuzionog proteina (koji sadrži GILT epitop od IGF-II). Biotinilovani IGF-II vezan za receptore detektovan je sa streptavidinom konjugovanim sa peroksidazom hrena (HRP) i hemiluminiscentnim HRP supstratom.

Sposobnost fuzionog proteina da inhibira vezivanje biotinilovanog IGF-II na IGFIIR izračunava se iz krive inhibicije i izveštava kao IC50(koncentracija potrebna za postizanje 50% inhibicije vezivanja).

[0163] Za test, IGFIIR je obložen u beloj Reacti-bind ploči (Pierce, Cat # 437111) na 0,5 µg/komorica u zapremini od 100 µl (69,6 nM/po bunarčiću) u puferu za oblaganje. Ploča je zatvorena i inkubirana preko noći na sobnoj temperaturi. Ploča je zatim isprana 3X puferom za ispiranje, blokirana puferom za blokiranje i zatim ponovo isprana 3X puferom za ispiranje (300 µl/komorica).

[0164] Zatim, 8 nM IGF-II-biotin je pomešan sa različitim koncentracijama konkurenata (IGF-II (ne-biotinilovani), referentni protein, ili uzorci Naglu fuzionog proteina, i dodat je u IGFIIR-obloženu ploču u 2X serijskim razblaženjima.

[0165] Ploča se inkubira na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, nakon čega se ploča 3X opere puferom za ispiranje. Streptavidin-HRP je pripremljen u blokirajućem puferu (1: 200 razblaženje), i 100 µl/komorica je dodat na ploču. Aktivnost vezivanja IGF-II-biotina detektuje se pomoću streptavidin-HRP koristeći Pico-Elisa reagense. Ukratko, pripremljeni Pico-Elisa radni rastvor se dodaje po komorici (100 µl/komorica), i inkubira na sobnoj temperaturi 5 minuta uz lagano ljuljanje, zatim se meri hemiluminescencija na 425 nm.

[0166] IC50uzoraka se izračunava korišćenjem procenta IGF-II-Biotin vezanog za svaku koncentraciju inhibitora.

[0167] Upotrebom ovog kompetitivnog IGFIIR testa vezivanja, za primere Naglu fuzionih proteina, uključujući Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO: 567), i Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565), pokazalo se da imaju IC50vrednost 0,23-0,36 nM. Neoznačeni Naglu protein nije imao detektabilno vezivanje u ovom testu. Podaci o kompetitivnom vezivanju IGF2R za primerne Naglu fuzione proteine dati su u Tabeli 1.

PRIMER 5 – TESTOVI UNOSA

[0168] Kako bi se izmerila sposobnost enzima za lizozomalnu bolest za skladištenje da ulazi u ćelije preko endocitoze posredovane receptorom, vrši se test unosa koji meri unos enzima korišćenjem CI-MPR receptora u L6 ćelijama mikoblasta pacova ili kod ljudskih MPS IIIB fibrobalsta. Manozo-6-fosfat (M6P) i IGF-II se koriste kao inhibitori za određivanje mesta vezivanja za CI-MPR receptor. Podaci se prikupljaju kako bi se dobila kriva zasićenja za unos enzima i odredio kinetički parametar, Kuptake, procesa.

[0169] Pre testa unosa (24 sata), L6 ćelije (L6 Rat Myoblasts, ATCC # CRL-1458) ili ljudski MPS IIIB fibroblasti su nanesene pri gustini od 1x10<5>ćelije po komorici u pločama sa 24 komorice (VWR #62406-183) i posejane su 0,5 ml po komorici. Na jutro testa, enzim se pomeša sa medijumom za unos (1 L DMEM, 1,5 g natrijum bikarbonata.0,5 g telećeg+ serumskog albumina, 20 ml L-glutamina (200 mM (Gibco # 25030-081)), 20 ml 1M HEPES (Gibco # 1563080)) (20 mM konačno), pH 7,2) u poklopcu kulture tkiva. Količine enzima mogu biti u rasponu od 2-500 nM. Konačna zapremina medija za unos enzim je 0,5 ml po komorici. M6P (5 mM konačne koncentracije) i/ili IGF-II (2,4 µM ili 18 µg/ml konačne koncentracije) se dodaju u odgovarajuće uzorke. Za inhibiciju unosa, 18 µl IGF-II zaliha (1 mg/ml, 133,9 µM) je dodato po mL medijuma za unos.

[0170] Medijum za rast je izvučen iz ćelija i 0,450 ml enzima u puferu za unos je dodato u svaku komoricu. Zabeleženo je vreme i ćelije su vraćene u inkubator tokom 18 sati. Ploča je uklonjena iz inkubatora i pufer za prihvatanje je usisan iz ćelija. Ploče su isprane 4x dodavanjem 0,5 ml Dulbecco-ovog PBS i aspirirane su.200 µl CelLytic M pufera za lizu

1

(Sigma) se doda na ploče i mućka na sobnoj temperaturi tokom 20-30 minuta. Lizat se uklanja iz ćelija i skladišti u prozirnoj ploči sa 96 komorica pokrivenoj trakom (VWR) na -80°C dok nije spreman za testiranje.

[0171] Za enzimski test, 5 µl svakog lizata se dodaje u duplikatu dodavanjem 15 µl mešavine enzimske reakcije (npr. Naglu 4MU testovi) u crnoj ploči sa 96 komorica (VWR) (pogledati gore) i enzim/jedinici/ml/sat je određeno u svakom lizatu.

[0172] Za test lizat proteina, 10 µl svakog lizata u duplikatu se analizira korišćenjem Pierce BCA kompleta za ispitivanje proteina prema uputstvima proizvođača. Kako bi se izmerila apsorpcija, apsorpcija se očitava na 562 nm sa čitačem ploča (čitač ploča BMG FluoStar Optima) i određuje se koncentracija µg/ml.

[0173] Za svako opterećenje enzima, unos je jedinica enzimske aktivnosti/mg lizata. Kako bi se odredio unos, enzimske jedinice/ml su podeljene sa proteinom µg/ml i pomnožene sa 1000 (uzimanje iz praznih komorica je oduzeto). Rezultati testova sa ili bez inhibitora su upoređeni kako bi se odredila specifičnost preuzimanja receptora.

[0174] Za krive zasićenja, koristi se 10 koncentracija enzima u rasponu od 0,2-100 nM kako bi se dobila kriva zasićenja koristeći gore opisane analize.

[0175] Koristeći ovu analizu, primer Naglu fuzionog proteina, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) ima Kuptakeod 7-9 nM u MPS-IIIB fibroblastima.

[0176] Alternativno, pre testa preuzimanja (24 sata), L6 ćelije ili ljudski MPS IIIB fibroblasti su naneseni pri gustini od 1x10<5>ćelije po 0,5 ml po komorici u pločama sa 24 komorice. Uzorci enzima na 1,6~50 nM su pripremljeni u medijumu za unos: 1 L DMEM, 1,5 g natrijum bikarbonata. 0,5 g telećeg serumskog albumina, 20 ml 200 mM L-glutamina i 20 ml 1M HEPES, pH7,2. Za inhibiciju unosa, u odgovarajuće uzorke se dodaju M6P (do 5,0 mM konačno) i/ili IGF-II (do 1,0 µM konačno).

[0177] Medijum za rast je aspiriran iz ćelija i zamenjen sa 0,5 ml enzimskog preparata u puferu za unos po komorici. Posle 4-časovne inkubacije, ploče su isprane 2 puta sa 0,5 ml

2

Dulbecco-ovog PBS.100 µl M-PER lizirajućeg pufera (Pierce) se doda na ploče i mućka na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Lizat se čuva na -80°C dok nije spreman za testiranje.

[0178] Za enzimski test, 10 µl svakog lizata se dodaje u duplikatu na crnoj ploči sa 96 komorica (pogledati iznad).

[0179] Za analizu lizat proteina, 10 µl svakog lizata u duplikatu se testira korišćenjem Pierce BCA Protein Assay Kit prema uputstvima proizvođača. Apsorbanca se očitava na 562 nm sa čitačem ploča (čitač BMG FluoStar Optima Plate) i koncentracija µg/ml određena je korišćenjem BSA kao standarda.

[0180] Za svako enzimsko opterećenje, apsorpcija je izražena kao nmolovi od 4-MU oslobođeni tokom 30 minuta. Za krive zasićenja, koncentracije enzima u rasponu od 1,6-50 nM se koriste za generisanje krive zasićenja koristeći gore opisane analize.

[0181] Ćelijska stabilnost Naglu fuzionih proteina je određena praćenjem intracelularne aktivnosti Naglu tokom perioda od ~8 dana. Ljudski MPS IIIB fibroblasti stavljeni na ploče pri gustini od 1x10<5>ćelija po komorici u pločama sa 24 komorice (VWR # 62406-183) su tretirani Naglu fuzionim proteinom pri 20 nM konačnoj koncentraciji tokom 4 sata. Posle 4-časovne inkubacije, ćelije su prebačene u medijum za rast bez Naglu fuzionog proteina. Za svaku vremensku tačku (4 sata, 28 sati, 4 dana, 6 dana i 8 dana), ćelije su lizirane u 100 µl M-PER lizirajućeg pufera (Pierce) na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, i testirane na enzimsku aktivnost koristeći 4-MU obeleženi supstrat. Smanjenje aktivnosti Naglu tokom perioda uzorka od 8 dana može biti prilagođeno kinetici prvog reda kako bi se procenio ćelijski polu-život proteina.

[0182] Koristeći ovaj test, za primere Naglu fuzionih proteina, uključujući Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO: 567), i Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565), pokazalo se da su internalizovani u MPS IIIB fibroblaste sa Kuptakevrednostima od -2,3-6,3 nM. Nasuprot tome, neoznačeni Naglu protein nije prihvaćen od strane ćelija pod ovim eksperimentalnim uslovima. Osim toga, opaženi unos Naglu fuzionog proteina inhibiran je od strane IGF-II, ali ne i M6P. Nakon unosa, za primerne Naglu fuzione proteine utvrđeno je da su stabilni sa procenjenim polu-životom od 9,5 dana, na osnovu enzimske aktivnosti (4-MU supstrat) merene u ćelijskim lizatima. Podaci o uzimanju i polu-životu za primerne Naglu fuzione proteine dati su u Tabeli 1.

PRIMER 6 - IN VIVO AKTIVNOST NAGLU FUZIONOG PROTEINA

[0183] Kako bi se odredila aktivnost Naglu fuzionih proteina in vivo, fuzioni proteini su davani Naglu knock-out životinjama (pogledati Li i dr., Proc Natl Acad Sci USA 96:14505-510, 1999). Naglu knock-out-i su prisutni sa velikom količinom heparan sulfata u mozgu, jetri i bubrezima, povećanjem aktivnosti beta-heksosaminidaze i bojenjem lizozomalnog membranskog proteina 2 (LAMP-2) u mozgu i povećanjem gangliozida u mozgu.

[0184] Aktivnost i biodistribucija egzogenog enzima se određuju nakon 4 ICV (intracerebroventrikularne) injekcije tokom perioda od dve nedelje (100 µg/injekcija) rekombinantnog ljudskog (rh) Naglu-IGF2. Stalna kanula je implantirana u miša (n=12/gp, 8-12 nedelja star na početku) i prilagođena da pokriva one miševe čije kanule nisu u ventrikuli. Merenja krajnjih tačaka uključuju Naglu biodistribuciju, redukciju GAG, npr. Heparan sulfat, skladištenje u lizozomima moždanih ćelija i aktivaciju astrocita i mikroglija. Nivoi različitih lizozomalnih ili neuronskih biomarkera (Ohmi i dr., PLoS One 6:e27461, 2011) merene u tretiranim i kontrolnim grupama, nivoi uključuju, ali nisu ograničeni na, membranski protein 1 (LAMP-1), LAMP-2, LAMP-2, glipikan 5, Naglu-specifični nereducirajući krajevi (NRE) heparan sulfata, gangliozidi, holesterol, podjedinica c mitohondrijalne ATP sinteze (SCMAS), ubikvitin, P-GSK3beta, beta amiloid, P-tau (fosforilirani Tau), GFAP (aktivacija astrocita) i CD68 (mikroglijalna aktivacija).

[0185] Dodatni eksperimenti za određivanje preživljavanja i analize ponašanja se izvode pomoću miševa koji primaju 4 ICV injekcije tokom perioda od dve nedelje od rhNaglu-IGF2 (n=12/gp, 5 meseci star na početku, 100 µg/injekcija). Krajnje tačke koje treba meriti uključuju vreme preživljavanja, aktivnost na otvorenom polju, biodistribuciju Naglu, redukciju GAG, npr. Heparan sulfat, skladištenje u lizozomima, nivoe lizozomalnih ili neuronskih biomarkera, kao što su LAMP-1, LAMP-2, glipikan 5, gangliozidi, holesterol, SCMAS, ubikvitin, P-GSK3beta, beta amiloid, P-tau, GFAP i CD68.

[0186] Naglu knockout miševi (Naglu -/-) koji imaju mutaciju u eksonu 6 naglu gena su razvijeni (Li i dr., Proc Natl Acad Sci USA. 96:14505-10, 1999). Lokacija eksona 6 je izabrana zato što je to mesto mnogih mutacija kod ljudi. Nikakva aktivnost Naglu nije detektovana u homozigotnim miševima, i smanjena je Naglu aktivnost u heterozigotima.

4

Naglu -/miševi imaju smanjeno vreme preživljavanja (6 - 12 meseci), i mogu imati druge funkcionalne fenotipove kao što su smanjeni nivoi aktivnosti. Efekti Naglu fuzionih proteina na Naglu -/- miševe su analizirani.

[0187] Naglu -/- miševima (n=8) i 8 kontrola nosača Naglu -/- miševima (n=8 heterozigota) su primenjene 4 doze ICV (100 µg Naglu-IGF2/doza) tokom 2 nedelje. Na dan -2, miševi su anestezirani, i leva bočna komora je kanulisana. Miševima je dozvoljeno da se oporave. U danima 1,5, 10 i 14, miševi su anestezirani (Benedril, 5 mg/kg IP) 15 minuta pre ICV doze. ICV doza se daje infuzijom preko kanule, zapremine 5 µl tokom 15 minuta, i miševima je dozvoljeno da se oporave. Petnaestog dana, miševi su žrtvovani, uzeta im je krv i zamrznut je serum. Mozgovi se sakupljaju i IR boja se ubrizgava u kanulu i prikazana je kanula.

[0188] Sledeći testovi su sprovedeni kako bi se odredili efekti Naglu fuzionih proteina: procena telesne težine, NIR snimanje za postavljanje kanule, procena nivoa Naglu-IGF2, GFAP, LAMP-1 i LAMP-2 u mozgu korišćenjem imunohistohemije, biohemijskog testa za Naglu aktivnost, nivoi i aktivnost β-heksosaminadaze, SensiPro test za detekciju neredukujućih krajeva akumuliranih glikozaminoglikana (GAG) specifičnih za mukopolisaharidozu IIIb (MPS-IIIb) (WO 2010/078511A2), Nivoi gangliozida GM3 mereni biohemijskim testom, kao i imunostain za SCMAS, A-beta, glipikan 5, CD68, GFAP i Naglu u medijalnom entorrinalnom korteksu (Li i dr., supra).

[0189] Očekuje se da efektivan tretman sa Naglu-IGF2 rezultuje smanjenjem nivoa LAMP-1, LAMP-2, GFAP, CD68, SCMAS, A-beta, glipikana 5, β-heksosaminadaze, GM3 gangliozida i MPS-IIIb-specifičnih GAG.

[0190] In vivo efikasnost primera Naglu fuzionih proteina u mišjem modelu MPS IIIb. Četiri doze ICV (100 µg/doza) Naglu-IGF-II fuzionog proteina, bilo Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) ili Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO: 566), su primenjeni tokom perioda od dve nedelje na Naglu -/- miševe (n=8). Naglu -/- miševi (n=8) i osam heterozigotnih ili miševa divljeg tipa uz istog legla (n=8) dobili su samo nosač kao kontrolu. Na dan -5, miševi su anestezirani; leva bočna komora mozga je kanulisana. Miševima je dozvoljeno da se oporave. U danima 1, 5, 10 i 14, miševi su anestezirani inhalacionim izofluranom. Benadril (5 mg/kg IP) je primenjen svakom mišu 15 minuta pre ICV doze kako bi se smanjilo potencijalno oslobađanje histamina kao odgovor na tretman Naglu-IGF-II.

Doza ICV je data infuzijom preko implantirane kanule, zapremine 5 µl u toku 15-20 minuta, i miševima je dozvoljeno da se oporave. U danima 1, 7, 14 i 28 nakon konačne doze, miševi su žrtvovani. Mozgovi su sakupljeni i podeljeni sagitalno u 5 sekcija za distribuciju u različite testove.

[0191] Sledeći testovi su sprovedeni kako bi se odredili efekti Naglu-IGF-II fuzionog proteina: imunohisohemijska procena nivoa Naglu, LAMP-2, GFAP i CD68 u mozgu, biohemijski testovi za aktivnost Naglu i beta-heksosaminadaze, SensiPro test (Deakin i dr., Glycobiology 18:483, 2008; Lawrence i dr., Nat Chem Biol.8:197, 2012; Lawrence i dr., J Biol Chem.283:33674, 2008) za detekciju ukupnog heparan sulfata i NRE heparan sulfata specifičnog za mukopolisaharidozu IIIB (MPS-IIIB) (WO 2010/078511A2), i imunoflourescentno bojenje za SCMAS, beta-amiloid (A-beta), p-Tau, P-GSK3beta, glipikan 5, GFAP i CD68 u medijalnom entorisalnom korteksu (Li i dr., supra).

[0192] Kada se proceni 24 sata posle konačne doze, tretman bilo sa Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) ili Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO: 566) rezultovao je značajnim povećanjem aktivnosti enzima Naglu, uz istovremeni pad aktivnosti beta-heksosaminadaze i nivoa ukupnog heparan sulfata, Naglu-specifičnih NRE heparan sulfata i LAMP-2. Naglu enzim se lako detektuje u moždanom tkivu, ne samo u korteksu, hipokampusu, dentatnom girusu i talamusu, već i u udaljenim distalnim geografskim lokacijama, uključujući amigdilu, peririnalni korteks i hipotalamus. Značajna smanjenja nivoa CD68, SCMAS, beta-amiloida (A-beta), p-Tau, P-GSK3beta i glipikana 5 takođe su primećena u Naglu -/- mozgovima nakon tretmana Naglu-IGF-II. GFAP bojenje se nije promenilo 24 sata posle poslednje doze. Imunohistohemija je pokazala prisustvo Naglu enzima u mnogim oblastima mozga, unutar neurona i glijalnih ćelija, ko-lokalizovanje sa LAMP-2.

[0193] Nivoi heparan sulfata, Naglu-specifične NRE i aktivnosti beta-heksosaminidaze nastavili su da opadaju tokom vremenskih tačaka 7, 14 i 28 dana posle poslednje doze. Nakon 28 dana, svi analiti su bili na ili blizu normalnih kontrolnih vrednosti miša.

EKVIVALENTI

[0194] Stručnjaci u oblasti će prepoznati, ili biti u stanju da utvrde korišćenjem samo rutinskog eksperimentisanja, mnoge ekvivalente specifičnim otelotvorenjima ovde opisanog pronalaska. Cilj predmetnog pronalaska nije ograničen na gore opisani opis, već je onako kako je izložen u priloženim patentnim zahtevima. Oblici jednine, kako su korišćeni u specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako nije jasno naznačeno suprotno, treba da se shvate da uključuju i oblike množine. Tvrdnje ili opisi koji uključuju „ili“ između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovoljenim ako su jedan, više od jednog, ili svi članovi grupe prisutni u, upotrebljeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces, ukoliko nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Pronalazak obuhvata otelotvorenja u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, upotrebljen u ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili proces. Pronalazak takođe obuhvata otelotvorenja u kojima je više od jednog ili svih članova grupe prisutno u, upotrebljeno u ili na neki drugi način relevantno za dati proizvod ili proces. Dalje, treba razumeti da pronalazak obuhvata varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd., iz jednog ili više patentnih zahteva unose u drugi patentni zahtev koji zavisi od istog osnovnog patentnog zahteva (ili, ako je relevantno, bilo kog drugog patentnog zahteva) osim ako nije drugačije naznačeno ili osim ako bi bilo očigledno stručnjaku u oblasti kad bi se pojavila kontradikcija ili nedoslednost. Tamo gde su elementi predstavljeni kao liste, npr. u Markush grupi ili sličnom formatu, podrazumeva se da je svaka podgrupa elemenata takođe obelodanjena, i da svaki element može biti uklonjen iz grupe. Treba imati na umu da, uopšteno, gde se pronalazak ili aspekti pronalaska pozivaju tako da obuhvataju određene elemente, svojstva, itd., određena otelotvorenja pronalaska ili aspekata pronalaska se sastoje, ili se sastoje suštinski zarad jednostavnosti, od takvih elemenata, svojstava, itd. Za svrhe jednostavnosti, ova otelotvorenja nisu u svakom slučaju izričito navedena ovde. Takođe treba razumeti da bilo koje otelotvorenje pronalaska, npr., bilo koje otelotvorenje koja se nalazi u prethodnom stanju tehnike, može biti eksplicitno isključeno iz patentnih zahteva, bez obzira da li je specifično isključenje navedeno u specifikaciji.

[0195] Takođe treba razumeti da, osim ako nije jasno naznačeno suprotno, u bilo kom postupku za koji se ovde tvrdi da uključuje više od jednog koraka, redosled postupaka postupke nije nužno ograničen na redosled kojim se navode koraci postupka, ali pronalazak obuhvata otelotvorenja u kojima je redosled tako ograničen. Dalje, gde patentni zahtevi navode sastav, pronalazak obuhvata postupke korišćenja sastava i postupke za pripremu sastava. Tamo gde patentni zahtevi navode sastav, treba razumeti da pronalazak obuhvata postupke upotrebe sastava i postupke za pripremu sastava.

[0196] Sve publikacije i patentni dokumenti koji su navedeni u ovoj prijavi uključeni su referencom u celini u istoj meri kao da je sadržaj svake pojedinačne publikacije ili patentnog dokumenta uključen ovde.

Predmetno obelodanjenje otkriće će sada biti detaljnije opisano u sledećim paragrafima sa brojevima:

1. Terapeutski ciljani fuzioni protein koji obuhvata (a) lizozomalni enzim, (b) peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i (c) spejser peptid između lizozomalnog enzima i IGF-II peptidne oznake, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više GGGPS (SEQ ID NO: 14) ili GGGSP (SEQ ID NO: 15) aminokiselinsku sekvencu, i opciono dalje obuhvata jednu ili više od (i) GAP (SEQ ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO: 12), (iii) GGGS (SEQ ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO: 17), (v) AAAS (SEQ ID NO: 18), (vi) PAPA (SEQ ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO: 21) ili (ix) GGGGA (SEQ ID NO: 60).

2. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 1, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (GGGGS)n(SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170-218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n(SEQ ID NOs: 60,79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); gde n je 1 do 7.

3. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 2, gde n je 1 do 4.

4. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 1, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS

(SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGP SGA P (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS

(SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS GA P (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SG AP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS GA P (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

(SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPS GAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS

(SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGG PS GAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGG GPS GAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 77),

GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SG AP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ili (GGGGA)8GGGPS] (SEQ ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [ili (GGGGA)8GGGPSH] (SEQ ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

[ili (GGGGA)9GGGPS] (SEQ ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

H [ili (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), i GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90).

5. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 4, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), i GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

1

6. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 5, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), i GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

7. Terapeutski ciljani fuzioni protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake, gde spejser obuhvata aminokiselinsku sekvencu GAP (SEQ ID NO: 9), GPS (SEQ ID NO: 10), ili GGS (SEQ ID NO: 11).

8. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 7, gde spejser sekvenca obuhvata aminokiseline Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10) između aminokiseline zrelog ljudskog IGF-II i aminokiseline ljudskog Naglu.

9. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog paragrafa od 7 do 8, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više GGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGGA (SEQ ID NO: 60) ili GGGS (SEQ ID NO: 16) aminokiselinsku sekvencu.

10. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog paragrafa od 7 do 9, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više GGGPS (SEQ ID NO: 14) ili GGGSP (SEQ ID NO: 15) aminokiselinsku sekvencu.

11. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog paragrafa od 7 do 10, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više AAAAS (SEQ ID NO: 17) ili AAAS (SEQ ID NO: 18) aminokiselinsku sekvencu.

12. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog paragrafa od 7 do 11, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više PAPA (SEQ ID NO: 19) ili TPAPA (SEQ ID NO: 20) aminokiselinsku sekvencu.

13. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog paragrafa od 7 do 12, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više AAAKE (SEQ ID NO: 21) aminokiselinsku sekvencu.

14. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog paragrafa od 7 do 8, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (GGGGS)n(SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEQ ID

2

NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170-218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n(SEQ ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); gde n je 1 do 7.

15. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 14, gde n je 1 do 4.

16. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 7, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS

(SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGP SGA P (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS

(SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS GA P (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SG AP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS GA P (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

(SEQ ID NO: 65),

4

GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPS GAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS

(SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGG PS GAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 75),

GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SG AP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82),

GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

H [ili (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), i GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90).

17. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 16, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), i GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

18. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 17, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), i GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

19. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa, gde je peptidna oznaka N-terminalna oznaka ili C-terminalna oznaka.

20. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 19, gde je peptidna oznaka C-terminalna oznaka.

21. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa, gde spejser obuhvata Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO: 9) ili Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10) aminokiselinsku sekvencu.

22. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa, gde domen za ciljanje lizozoma obuhvata aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II.

23. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa, gde spejser obuhvata alfa-spiralnu strukturu ili rigidnu strukturu.

24. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa, gde IGF-II peptidna oznaka obuhvata mutaciju na ostatku Arg37.

25. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz paragrafa 23, gde gde je mutacija supstitucija alanina za arginin.

26. Terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa, koji dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač ili ekscipijent.

27. Farmaceutski sastav pogodan za tretman bolesti lizozomalnog skladištenja koji obuhvata terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa.

1. 28. Nukleinska kiselina koja kodira terapeutski ciljani fuzioni protein iz bilo kog prethodnog paragrafa.

29. Ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu iz paragrafa 27.

30. Postupak proizvodnje ciljanog terapeutskog fuzionog proteina koji obuhvata korak: kultivisanja ćelija sisara u medijumu ćelijske kulture, gde ćelije sisara nose nukleinsku kiselinu iz paragrafa 28; i kultivacija se izvodi pod uslovima koji dozvoljavaju eksprimiranje ciljanog terapeutskog fuzionog proteina.

31. Postupak za tretman bolesti lizozomalnog skladištenja kod pacijenta, koji obuhvata primenu pacijentu terapeutski efikasne količine farmaceutskog sastava koji obuhvata fuzioni protein koji obuhvata lizozomalni enzim, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između aminokiselinske sekvence lizozomalnog enzima i IGF-II peptidne oznake, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više GGGPS (SEQ ID NO: 14) ili GGGSP (SEQ ID NO: 15) aminokiselinsku sekvencu, i opciono dalje obuhvata jednu ili više od (i) GAP (SEQ ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO: 12), (iii) GGGS (SEQ ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO: 17), (v) AAAS (SEQ ID NO: 18), (vi) PAPA (SEQ ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO: 21) ili (ix) GGGGA (SEQ ID NO: 60).

32. Postupak iz paragrafa 31, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (GGGGS)n(SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 37, 108-113), GAP(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170-218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n(SEQ ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); gde n je 1 do 7.

33. Postupak iz paragrafa 32, gde n je 1 do 4.

34. Postupak tretmana mukopolisaharidoze tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom) kod pacijenta koji se sastoji od primene pacijentu terapeutski efikasne količine farmaceutskog sastava koji sadrži fuzioni protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake, gde spejser obuhvata aminokiselinsku sekvencu GAP (SEQ ID NO: 9), GPS (SEQ ID NO: 10), ili GGS (SEQ ID NO: 11).

35. Postupak iz paragrafa 34, gde spejser sekvenca obuhvata aminokiseline Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10) između aminokiseline zrelog ljudskog IGF-II i aminokiseline ljudskog Naglu.

36. Postupak iz bilo kog paragrafa od 34 do 35, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više GGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGGA (SEQ ID NO: 60) ili GGGS (SEQ ID NO: 16) aminokiselinsku sekvencu.

37. Postupak iz bilo kog paragrafa od 34 do 36, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više GGGPS (SEQ ID NO: 14) ili GGGSP (SEQ ID NO: 15) aminokiselinsku sekvencu. 38. Postupak iz bilo kog paragrafa od 34 do 37, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više AAAAS (SEQ ID NO: 17) ili AAAS (SEQ ID NO: 18) aminokiselinsku sekvencu.

39. Postupak iz bilo kog paragrafa od 34 do 38, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više PAPA (SEQ ID NO: 19) ili TPAPA (SEQ ID NO: 20) aminokiselinsku sekvencu.

40. Postupak iz bilo kog paragrafa od 34 do 39, gde spejser peptid obuhvata jednu ili više AAAKE (SEQ ID NO: 21) aminokiselinsku sekvencu.

41. Postupak iz bilo kog paragrafa od 31 ili 34, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (GGGGS)n(SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170-218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n(SEQ ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); gde n je 1 do 7.

42. Postupak iz paragrafa 41 gde n je 1 do 4.

43. Postupak za smanjenje nivoa glikozaminoglikana in vivo koji se sastoji od primene pacijentu koji boluje od mukopolisaharidoze tipa IIIB (Sanfillippo B sindrom) efikasne količine fuzionog proteina koji sadrži i) aminokiselinsku sekvencu barem 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu, ii) peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II, i iii) spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake.

44. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31, 34 ili 43, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS

(SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGP SGA P (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS

(SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS GA P (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SG AP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS GA P (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50),

GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

(SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPS GAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS

(SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGG PS GAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGG GPS GAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS

(SEQ ID NO: 77),

GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP

1

SG AP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ili (GGGGA)gGGGPS] (SEQ ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [ili (GGGGA)8GGGPSH] (SEQ ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

[ili (GGGGA)9GGGPS] (SEQ ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS

H [ili (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), i GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90).

45. Postupak iz paragrafa 44, gde spejser obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), i GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

46. Postupak iz paragrafa 45, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID

2

NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP

(SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), i GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

47. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 46, gde spejser sekvenca obuhvata aminokiseline Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO: 9) sekvence.

48. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 47, gde je peptidna oznaka N-terminalna oznaka ili C-terminalna oznaka.

49. Postupak iz paragrafa 48, gde je peptidna oznaka C-terminalna oznaka.

50. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 49, gde spejser obuhvata alfa-spiralnu strukturu ili rigidnu strukturu.

51. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 50, gde domen za ciljanje lizozoma obuhvata aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II.

52. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 51, gde IGF-II peptidna oznaka obuhvata mutaciju na ostatku Arg37.

53. Postupak iz paragrafa 52, gde gde je mutacija supstitucija alanina za arginin.

54. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 53, gde fuzioni protein obuhvata aminokiseline 1-743 ili aminokiseline 24-743 ljudskog Naglu (Slika 1).

55. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 54, gde je efikasna količina u rasponu 2,5-20 mg po kilogramu telesne težine pacijenta.

56. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 55, gde se fuzioni protein primenjuje intratekalno, opciono dalje obuhvata primenu fuzionog proteina intravenozno.

57. Postupak iz paragrafa 56, gde primena obuhvata uvođenje fuzionog proteina u cerebralni ventrikul, lumbalno područje ili cisterna magnu.

58. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 55, gde se fuzioni protein primenjuje intravenozno.

59. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 58, gde se fuzioni protein primenjuje dvomesečno, mesečno, tronedeljno, dvonedeljno, nedeljno, dnevno ili u promenljivim intervalim.

60. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 59, gde tretman rezultuje smanjenjem nivoa glikozaminoglikana (GAG) u moždanom tkivu.

61. Postupak iz bilo kog od paragrafa 31 do 60, gde tretman rezultuje u smanjenju lizozomalnih granulata za skladištenje u tkivu mozga.

Claims (27)

Patentni zahtevi

1. Terapeutski ciljani fuzioni protein koji obuhvata (a) lizozomalni enzim, (b) peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i (c) spejser peptid između lizozomalni enzim i IGF-II peptidne oznake, gde spejser peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51).

2. Terapeutski ciljani fuzioni protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake, gde spejser obuhvata aminokiselinsku sekvencu GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51) između aminokiseline zrelog ljudskog IGF-II i aminokiseline ljudskog Naglu.

3. Terapeutski ciljani fuzioni protein patentnog zahteva 1 ili 2, gde peptidna oznaka obuhvata aminokiseline 8-67 od SEQ ID NO: 5.

4. Terapeutski ciljani fuzioni protein patentnog zahteva 1 ili 2, gde peptidna oznaka obuhvata SEQ ID NO: 2.

5. Terapeutski ciljani fuzioni protein bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, gde se spejser sastoji od od SEQ ID NO: 51.

6. Terapeutski ciljani fuzioni protein bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, gde je peptidna oznaka N-terminalna oznaka ili C-terminalna oznaka.

7. Terapeutski ciljani fuzioni protein bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, gde IGF-II peptidna oznaka obuhvata mutaciju na ostatku Arg37, opciono gde gde je mutacija supstitucija alanina za arginin.

8. Terapeutski ciljani fuzioni protein bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač ili ekscipijent.

4

9. Farmaceutski sastav pogodan za tretman bolesti lizozomalnog skladištenja koji obuhvata terapeutski ciljani fuzioni protein bilo kog od prethodnih patentnih zahteva.

10. Nukleinska kiselina koja kodira terapeutski ciljani fuzioni protein bilo kog od prethodnih patentnih zahteva.

11. Ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu patentnog zahteva 10.

12. Postupak za proizvodnju ciljanog terapeutskog fuzionog proteina koji obuhvata korak: kultivisanja ćelija sisara u medijumu ćelijske kulture, gde ćelije sisara nose nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 10; i kultivacija se izvodi pod uslovima koji dozvoljavaju eksprimiranje ciljanog terapeutskog fuzionog proteina.

13. Sastav za upotrebu u tretmanu bolesti lizozomalnog skladištenja kod pacijenta, koji obuhvata fuzioni protein koji obuhvata lizozomalni enzim, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između aminokiselinske sekvence lizozomalnog enzima i IGF-II peptidne oznake, gde spejser peptid obuhvata GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51) aminokiselinsku sekvencu.

14. Sastav za upotrebu u tretmanu mukopolisaharidoze tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom) kod pacijenta, koji obuhvata fuzioni protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu, peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II i spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake, gde spejser obuhvata aminokiselinsku sekvencu GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

15. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 13 ili 14, gde peptidna oznaka obuhvata aminokiseline 8-67 od SEQ ID NO: 5.

16. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 13 ili 14, gde peptidna oznaka obuhvata aminokiseline date u SEQ ID NO: 2.

17. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 13 ili 14, gde se spejser peptid sastoji od od SEQ ID NO: 51.

18. Sastav za upotrebu u smanjenju nivoa glikozaminoglikana kod pacijenta koji pati od mukopolisaharidoze tipa IIIB (Sanfilipov B sindrom), koji obuhvata fuzioni protein koji obuhvata i) aminokiselinsku sekvencu barem 85% identičnu ljudskom α-N-acetilglukozaminidaza (Naglu) proteinu, ii) peptidnu oznaku koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselini 8-67 zrelog ljudskog IGF-II, i iii) spejser peptid koji se nalazi između Naglu aminokiselinske sekvence i IGF-II peptidne oznake, gde spejser obuhvata jednu ili više aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od (GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

19. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, gde se spejser sastoji od od aminokiseline date u SEQ ID NO: 51.

20. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 18 do 19, gde peptidna oznaka obuhvata aminokiseline 8-67 od SEQ ID NO: 5.

21. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 13 do 20, gde je peptidna oznaka N-terminalna oznaka ili C-terminalna oznaka.

22. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 13 do 21, gde domen za ciljanje lizozoma obuhvata aminokiseline 8-67 zrelog ljudskog IGF-II.

23. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 13 do 22, gde IGF-II peptidna oznaka obuhvata mutaciju na ostatku Arg37, opciono gde gde je mutacija supstitucija alanina za arginin.

24. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 13 do 23, gde fuzioni protein obuhvata aminokiseline 1-743 ili aminokiseline 24-743 ljudskog Naglu (Slika 1).

25. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 13 do 24, gde je efikasna količina u rasponu 2,5-20 mg po kilogramu telesne težine pacijenta.

26. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 13 do 25, gde se fuzioni protein primenjuje intratekalno, opciono dalje obuhvata primenu fuzionog proteina intravenozno, opciono gde primena obuhvata uvođenje fuzionog proteina u cerebralni ventrikul, lumbalno područje ili cisterna magnu.

27. Sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 13 do 25, gde se fuzioni protein primenjuje intravenozno.