[go: up one dir, main page]

RS58810B1 - Metodi konjugacije - Google Patents

Metodi konjugacije

Info

Publication number
RS58810B1
RS58810B1 RS20190602A RSP20190602A RS58810B1 RS 58810 B1 RS58810 B1 RS 58810B1 RS 20190602 A RS20190602 A RS 20190602A RS P20190602 A RSP20190602 A RS P20190602A RS 58810 B1 RS58810 B1 RS 58810B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
conjugate
succinimidyl
linker
reaction
Prior art date
Application number
RS20190602A
Other languages
English (en)
Inventor
Brenda A Kellogg
Rajeeva Singh
Ravi V J Chari
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43298108&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58810(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of RS58810B1 publication Critical patent/RS58810B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/38—Antigens from snakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/14—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Description

Opis
[0001] Ova patentna prijava zahteva prioritet Privremene patentne prijave Sjedinjenih Država br. 61/183,774, podnete 3. juna 2009.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Ovaj pronalazak odnosi se na novi metod konjugacije efektorske grupe (tj., majtanzinoida) sa sred stvom koje se vezuje za ćeliju (t j., antitelo ili n jegov fragment) preko bifunkcionalnog povezivača, t ako da proces i sključi korake koji za rezultat imaju formiranje neželjenih hidrolizovanih vrsta ili neželjenih unakrsno povezanih vrsta formiranih usled unutarmolekulskih ili međumolekulskih reakcija.
OSNOV PRONALASKA
[0003] Konjugati sredstava koja se vezuju za ćeliju, kao što su antitela, sa efektorskim grupama, kao što su m ala c itotoksična sredstva ili citotoksični proteini, od neprocenjivog su značaja za razvijanje ant ikancerskih t erapeutika ( Richart, A . D., an d To lcher, A. W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-25). Ovi konjuga ti su tumor-specifični z bog visoke specifičnosti odabranih antitela prema antigenima koji se eksprimiraju na provršini tumorskih ćelija. Posle specifičnog vezivanja za t umorsku ćeliju, konjugat antitelo-citotoksično sredstvo se internalizuje i razgra ÿuje unutar ciljne kancerske ćelije, oslobađajući time aktivno citotoksično sredstvo koje inhibira važne ćelijske funkcije kao što su dinamika mikrotubula ili replikacija DNK, što rezultuje ubijanjem kancerske ćelije. Za povezivanje antitela sa citotoksičnim sredstvi ma koriste se r azličiti povezivači, sa c iljem pobo ljšanja do premanja sredstva ćeliji, posle internalizacije i obrade konjugata, uz zadržavanje željene stabilnosti konjugata u plazmi. Ovi povezivači uključuju d isulfidne povezivače dizajnirane sa raz ličitim stepenima sternog ometanja, kako bi se uticalo na njihovu redukcionu kinetiku sa unutarćelijskim tiolom, pept idne po vezivače ko ji mogu da se seku, ka o što j e veza valincitrulin, i povezivače koji ne mogu da se seku, kao što je tioetarska veza (Widdison, W., et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408; Erickson, H., et al., Cancer Res., 2006, 66, 4426-4433).
[0004] Konjugati sredstava ko ja se vezuju za ćeliju, kao što su antitela, sa obeleživačima ili reporterskim grupama korisni su za primenu u stvaranju slike tumora kod pacijenata obolelih od k ancera, za primenu u imunotestovima kojima se dijagnostikuju različita oboljenja, za lečenje kancera ko rišćenjem konjugata r adioaktivni nuklid-ligand, i za pr imenu u a finitetnoj hromatografiji za prečišćavanje bioaktivnih sredstava kao što su proteini, peptidi i oligonukleidi. Obeleživači ili reporterske grupe k onjugovani sa sredstvima koja s e vezuju za ćeliju uključuju fluorofore i afinitetne obeleživače kao što je biotin.
[0005] U konvencionalnom metodu konjugacije sredstva ko je se vezu je za ćeliju, kao što je antitelo (antibody, Ab), sa efektorskom grupom (npr., citotoksično sredstvo) ili reporterskom grupom (npr., radioobeleživač), povezanih nereducibilnom vezom (kao što je tioetarska veza), koriste se dva zasebna reakciona k oraka sa anti telom i n eophodno je k orišćenje ko raka prečišćavanja. U prvom reakcionom koraku, antitelo reaguje sa bifunkcionalnim povezivačem koji nosi dve raz ličite reakt ivne grupe ( npr., X i Y). Na primer, u jednom pristupu, reakcija reaktivnih rezidua an titela (kao što su l izinske amino rezidue) sa reakt ivnom grupom X (kao što je N-hidroksisukcinimid estar) heterobifunkcionalnog reagensa za rezultat ima ugraÿivanje povezivača sa reaktivnom grupom Y na jednu ili više reaktivnih rezidua u ant itelu (kao što su lizinske amino rezidue). Ovako početno modifikovano antitelo mora da se pre čisti i z viška reagensa sa povezivačem i li hidrolizovanim p ovezivačem, pre nego što bude moguće pristupiti sledećem koraku. U drugom reakcionom koraku, antitelo modifikovano povezivačem koji sadrži reaktivnu grupu Y (kao što je maleimid ili haloacetamid) reaguje sa efektorom, kao što je efektorska grupa (C) (npr., citotoksično sredstvo), koji sadrži reaktivnu grupu kao što j e t iol, da bi se s tvorio konjugat antitelo-efektor koji se po novo prečišćava u dodatnom koraku prečišćavanja (vidi, npr., U.S. patente 5,208,020, 5,416,064, ili 5,024,834). Prema tome, u gornjem procesu, potrebna su najmanje dva koraka prečišćavanja.
[0006] U drugom pr istupu, koji uk ljučuje dva koraka reakcije i pre čišćavanja kako bi se antitelo konjugovalo sa efektorskom ili reporterskom grupom, koristi se reakcija tiol-rezidua u antitelu (stvorenih modifikacijom a ntitela t iol-generišućim r eagensima, na p rimer 2-iminotiolanom, ili mutagenezom za ugraÿivanje nenativnih cisteinskih rezidua, ili redukcijom nativnih disulfidnih veza) sa homobifunkcionalnim povezivačem Y-L-Y koji sadrži reakt ivne grupe Y (kao što su maleimid ili haloacetamid).
[0007] Glavni nedostaci ugraÿivanja reaktivne grupe Y k ao to je maleimid (ili haloacetamid) u antitelo ili p eptid su sk lonost reaktivnih maleimidnih ( ili haloacetamidnih) grupa da podlegnu unutar- ili međumolekulskoj reakciji sa nativnim reziduama histidina, lizina, tirozina ili cisteina u an titelu ili peptidu (Papini, A. et al ., Int. J. Pep t. Protein Res., 1992, 39, 348-355; Ueda, T. et al., Biochemistry, 1985,24, 6316-6322), kao i inaktivacija Y maleimidne grupe vodom. Neželjena unutarmolekulska ili međumolekulska reakcija maleimidnih (ili haloacetamidnih) gr upa Y, ugrađenih u antitelo, sa nativnim reziduama his tidina, lizina, ili cisteina u antitelu, i in aktivacija Y maleimidne gr upe vodom pre druge reakcije sa efektorskom ili reporterskom grupom C dovode do stvaranja unakrsno povezanih proteina ili heterogenih kon jugata i snižavaju e fikasnost druge reakc ije sa e fektorskom i li repo rterskom grupom C . Heterogeni konjugatski pro izvod-unakrsno povezani prot ein ili pept id, nastao neželjenom reakcijom na početku ugra đene grupe Y (kao što je maleimidna gr upa) sa nativnim grupama u antitelu ili peptidima (kao što su h istidin, lizin, tirozin, ili cistein), ili s a neaktivnim maleimidnim reziduama stvorenim inaktivacijom vodom, može imati nižu aktivnost i stabilnost nego željeni homogeni proizvod konjugacije.
[0008] Procesi konjugacije antitela sa tiol-sadržavajućim citotoksičnim sredstvima preko disulfidnih veza opisani su ranije (vidi, npr., U.S. patente 5,208,020, 5,416,064, 6,441,163, U.S. patentnu publikaciju br. 2007/0048314 A1). Ovi procesi obuhvataju početnu reakciju antitela sa heterobifunkcionalnim r eagensom, praćenu drugom reakcijom sa t iol-sadržavajućim c itotoksičnim sredstvo m. U U.S. patentu 6,441,163 B1 opisan je a lternativni proces u ko jem se d isulfidno povezani reaktivni estar citotoksičnog sredstva prvo prečisti i zatim reaguje sa an titelom, ali koji uključuje dodatni korak reakcije i prečišćavanja počevši od citotoksičnog sredstva koje sadrži tiol grupu, pre koraka reakcije sa antitelom.
[0009] Još jedan nedostatak sadašnjeg procesa spravljanja konjugata sredstava koja se vez uju za ćeliju je potreba za izvođenjem dva koraka prečišćavanja, što snižava ukupan prinos, a čini i da pro ces bude glomazan i neekonomičan za odvijanje u velikim razmerama. U.S. patentna publikacija br. 2004/192900 objavljuje metod pripremanja konjugata kaliheamicinskog derivata i anti-CD22 antitela. WO 2007/024536 i U.S. patentna publikacija br.
2004/235840 objavljuju metode pripremanja konjugata majtanzinoid-antitelo.
[0010] U svetlu napred iznetog, u struci po stoji po treba za razvojem po boljšanih metoda pripremanja konjugatskih smeša sredstvo koje se vezuje za ćeliju-lek, koje su suštinski visoke čistoće i mogu se pripremiti uz izbegavanje glomaznih koraka i smanjenje vremena i troškova za kor isnika. Pronalazak o bezbeđuje takav m etod. Ove i druge prednosti, kao i dodatne inventivne osobine, biće jasne iz opisa pronalaska, datog u ovom tekstu.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0011] Predmetni pronalazak opisuje metod konjugacije za pripremanje nereducibilnih, tioetarski po vezanih ko njugata formule C-L-CBA, gde redom C predstavlja citotoksično sredstvo, L je povezivač i CBA je sredstvo koje se vezuje za ćeliju (tj., antitelo ili njegov fragment), uz korišćenje direktne reakcije tiol-sadržavajućeg citotoksičnog sredstva (tj., majtanzinoid) sa he tero- ili homobifunkcionalnim reagensom, (npr., povezivač ko ji može da se iseče ili po vezivač ko ji ne može da s e iseče), praćene mešanjem neprečišćene reakc ione mešavine sa sred stvom koje se vezuje za ćeliju ( tj., antitelo ili nj egov f ragment), čime s e stvara nereducibil ni, tioetarski povezani konjugat, pro cesom koji j e efikasniji, daje visoki prinos i odgovara proizvodnji u velikim razmerama. Još jedna važna prednost je ta što metod konjugacije da je t ioetarski povezane nereducibilne konjugate, bez međulančanog u nakrsnog povezivanja proteina ili inaktiviranja rezidua (npr., maleimidnih ili haloacetamidnih rezidua). Novi metodi objavljeni u ovoj patentnoj prijavi mogu s e primeniti za pripremanje bilo kojeg konjugata predstavljenog gornjom formulom.
Na osnovu objave sadržane u ovom t ekstu, predmetni pr onalazak obezbeđuje proces pripremanja prečišćenog konjugata u ras tvoru, pri čemu konjugat uključuje majtanzinoid koji sadrži tiol grupu, vezan za ant itelo, proces uk ljučuje ko rake: (a) dovođenje majtanzinoida u kontakt sa bifunkcionalnim povezjućim reagensom da bi se po vezivač ko valentno spojio sa majtanzinoidom i time pr ipremila neprečišćena prva mešavina ko ja sadrž i m ajtanzinoid s a povezivačima vezanim za njega, (b) konjugovanje antitela sa majtanzinoidom koji za sebe ima vezane povezivače, reakcijom neprečišćene prve mešavine sa antitelom, da se pr ipremi druga mešavina, i (c ) izlaganje druge mešavine filtraciji s a tangencijalnim p rotokom, dijalizi, gel filtraciji, adsorptivnoj hro matografiji, selektivnoj pr ecipitaciji i li n jihovoj ko mbinaciji, da bi se time pripremio prečišćeni konjugat.
Predmetni pro nalazak i njegovi pr imeri izvođenja izloženi su u priloženim patentnim zahtevima.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0012]
Slika 1 pri kazuje konjugaciju antitela sa reakci onom mešavinom majtanzinoida DM1 (ili DM4) i maleimid-PEGn-NHS povezivača
Slika 2 pri kazuje reduku juću SDS- PAGE Ab -(PEG4-Mal)-DM4 konjugata pripremljenih korišćenjem metoda o pisanog u o vom pro nalasku, u poređenju sa konjugatima pripremljenim kor išćenjem tr adicionalnog metoda u 2 koraka. Svaka uzoračka linija sadržala je 10 µg proteina; gel je obojen Coomassie plavim. Linije 1 i 2 sadržale su markere molekulske t ežine. Linija 3 sadržala je konjugat pripremljen tradicionalnim meto dom u dva koraka, sa 6.1 DM4 po Ab. Linija 4 sadržala je konjugat pripremljen metodom opisanim u ovom pronalasku, koji je sadržao 6.2 DM4 po Ab.
Slika 3 pri kazuje Prot ein LabChip el ektroforezu A b-(PEG4-Mal)-DM4 konjugata pripremljenih korišćenjem metoda o pisanog u o vom pro nalasku, u poređenju sa konjugatima pripremljenim korišćenjem tradicionalnog metoda u 2 k oraka. A. Protein LabChip e lektroforeza pod redukuj ućim uslovima (Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 kit) Ab-(PEG4-Mal)-DM4 konjugata. Linija 1: markeri molekulske težine; linija 2: Ab-PEG4-Mal-DM4, 6.2 D/Ab, sintetisan korišćenjem meto da opisanog u ovom pronalasku; lin ija 3 : Ab-PEG4-Mal-DM4, 6.1 D/Ab, sintetisan korišćenjem metoda konj ugacije u 2 koraka; linija 4: nekonjugovano Ab ( 0.24 mikrograma ukupnog proteina u svakoj liniji). Gornji marker, sistemski pik i donje markerske trake predstavljaju spo ljašnje markere do date iz k ita. B. K vantifikacija prot einskih traka iz Protein LabChip elektroforeze.
Slika 4 pr ikazuje MS Ab-(PE G4-Mal)-DM4 konjugata pripremljenih korišćenjem metoda o pisanog u o vom pro nalasku, u poređenju sa konjugatima pripremljenim korišćenjem t radicionalnog metoda u dva koraka. A. MS konjugata pripremljenog tradicionalnim metodom u dva koraka sa 6.1 DM4 po Ab. Zbog značajne heterogenosti konjugata MS pikovi nisu mogli dobro da se razdvoje. B. MS konjugata pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku, koji je sadržao 6.2 DM4 po Ab. Zbog homogenosti konjugata, MS pikovi su dobro razdvojeni.
Slika 5 pr ikazuje vezivan je ant i-CanAg a ntitelo-PEG4-Mal-DM1 konjugata sa 6.7 DM1 po antitelu (pripremljen ko rišćenjem m etoda opisan og u o vom pronalasku), u poređenju sa vez ivanjem nemodifikovanog antitela, za CanAg anti gen-eksprimirajuće COLO205 ćelije. Vezivanje je mereno u jedinicama fluorescencije.
Slika 6 prikazuje in vitro citotoksičnost anti-CanAg antitelo-PEG4-Mal-DM1 konjugata sa 6.7 DM1 po antitelu (pr ipremljen korišćenjem metoda opisanog u ovom pronalasku), prema CanAg an tigen-eksprimirajućim COLO205 ćelijama. Konjugat je dodat COLO205 ćelijama, i posle 5 dana kontinuirane inkubacije sa konjugatom, merena je vijabilnost ćelija korišćenjem WST-8 testa. Kontrolni eksper iment za prikazivanje s pecifičnosti konjugata i zveden j e kor išćenjem n ekonjugovanog an ti-CanAg antitela u vi šku, da bi se blokirali vezivanje i citotoksičnost konjugata prema ciljnim kancerskim ćelijama.
Slika 7 prikazuje ko njugaciju an titela sa r eakcionom m ešavinom DM1 ( ili DM4) i Maleimid-Sulfo-NHS povezivačem.
Slika 8 prikazuje redukujuću SDS-PAGE Ab-(Sulfo-Mal)-DMl konjugata pripremljenih korišćenjem metoda opisani h u ovom pro nalasku, u poređenju sa konjugatima pripremljenim kor išćenjem tr adicionalnog metoda u 2 koraka. Svaka uzoračka linija sadržala je 10 µg proteina; g el je bojen C oomassie plavim. Linija 1 sadržala je markere molekulske težine. Linije 3 i 5 sadržale su konjugate pripremljene korišćenjem meto da opi sanih u o vom pronalasku, koji su sa držali 3.6, odnosno 5.6 DM1 po Ab. Linije 2 i 4 sadržale su konjugate pripremljene tradicionalnim metodom u dva koraka, koji su sadržali 4.0, odnosno 5.7 DM1 po Ab.
Slika 9 prikazuje Protein LabChip elektroforezu Ab-(Sulfo-Mal)-DM1 konjugata pripremljenog korišćenjem metoda o pisanog u o vom pro nalasku, u poređenju sa konjugatom pripremljenim t radicionalnim meto dom u 2 ko raka. A. Protein LabChip elektroforeza pod redukujućim us lovima (Agilent 2100 Bi oanalyzer/Agilent Protein 230 kit) Ab-(Sulfo-Mal)-DM1 konjugata. Linija 1: markeri molekulske težine; linija 2: nekonjugovano antitelo; linija 3: Ab-Sulfo-Mal-DM1, 5.7 D/Ab, sintetisan korišćenjem metoda konj ugacije u 2 koraka; l inija 4: Ab -Sulfo-Mal-DM1, 5.6 D/Ab, sintetisan korišćenjem metoda o pisanog u ovom pr onalasku; 0.22 mikrograma ukupnog proteina dodatog po bunarčiću. Gornji ma rker, sistemski p ik i do nje markerske trake predstavljaju spoljašnje markere dodate i z kita (0.24 mikrograma ukupnog proteina po bunarčiću). B. Kvantifikacija proteinskih traka iz Protein LabChip elektroforeze.
Slika 10 prikazuje LC-MS poređenje konjugata antitelo-(Sulfo-Mal)-DMl pripremljenog metodom opisanim u o vom pronalasku, u poređenju sa t radicionalnim metodom konjugacije u dva ko raka. A. MS k onjugata sa 3.6 DM1/Ab pr ipremljenog korišćenjem metoda o pisanog u o vom pronalasku pokazuje homogeni konjugat, sa razdvojenim pikovima ko njugata sa 1- 6 DM1. B. MS konjugata sa 4.0 DM1/Ab pripremljenog t radicionalnim me todom konjugacije u dva koraka. MS za k onjugat pripremljen tr adicionalnim metodom u dva ko raka po kazuje p ikove ko ji o dgovaraju konjugatima, i konj ugate sa hidrolizovanim ili unakrsno povezanim poveziva čima (kao što j e konjugat sa 2 DM 1, plus jedan L , 2L, i 3 L), što ukazuje na heterogenost proizvoda.
Slika 11 prikazuje vezivanje ko njugata anti-CanAg antitelo-Sulfo-Mal-DMl sa 5.6 DM4 po antitelu (pripremljen ko rišćenjem m etoda opisan og u o vom pronalasku), u poređenju sa vez ivanjem nemodifikovanog antitela, za CanAg anti gen-eksprimirajuće COLO205 ćelije. Vezivanje je mereno u jedinicama fluorescencije.
Slika 12 prikazuje in vitro citotoksičnost konjugata anti-CanAg antitelo-Sulfo-Mal-DMl sa 5. 6 DM4 po antitelu (pripremljen ko rišćenjem me toda opisanog u ovom pronalasku) pr ema Ca nAg antigen-eksprimirajućim COLO205 ćelijama. Konjugat je dodat COLO205 ćelijama i po sle 5 dana kontinuirane inkubacije sa konjugatom, vijabilnost ćelija merena je korišćenjem WST-8 testa. Kontrolni eks periment za prikazivanje s pecifičnosti konjugata i zveden j e kor išćenjem n ekonjugovanog an ti-CanAg antitela u višku, kako bi se blokirali vezivanje i citotoksičnost konjugata prema ciljnim kancerskim ćelijama.
Slika 13 pr ikazuje ko njugaciju an titela sa reakcio nom mešavinom DM1 (ili DM4) i Sulfo-NHS SMCC povezivačem.
Slika 14 prikazuje redukujuću SDS-PAGE Ab-(SMCC)-DM1 konjugata pripremljenog korišenjem metoda o pisanog u o vom pro nalasku, u poređenju sa konjugatom pri premljenim ko rišćenjem t radicionalnog metoda u 2 koraka. Svaka uzoračka linija sadržala je 10 mikrograma ukupnog proteina; gel je bo jen Coomassie plavim. Linija 1 sadrži markere molekulske težine, linija 2 sadrži nekonjugovano Ab, linija 3 sadrži konjugat pripremljen tradicionalnim metodom u dva koraka sa 3.1 DM1 po Ab i linija 4 sadrž i konjugat pripremljen metodom opisanim u ovom pronalasku sa 3.1 DM1 po Ab.
Slika 15 prikazuje Protein LabChip elektroforezu Ab-(SMCC)-DM1 konjugata pripremljenog korišćenjem metoda o pisanog u o vom pro nalasku, u poređenju sa konjugatom pripremljenim korišćenjem tradicionalnog metoda u 2 k oraka. A. Protein LabChip elektroforeza u redukujućim usl ovima (Agilent 2100 B ioanalyzer/Agilent Protein 230 kit) Ab-SMCC-DM1 konjugata. Linija 1: markeri m olekulske težine; linija 2: Ab-SMCC-DM1, 3.1 D/Ab, sintetisan kor išćenjem metoda opisanog u ovom patentu; linija 3: nekonjugovano Ab; linija 4: Ab-SMCC-DM1, 3.1 D/Ab, sintetisan korišćenjem metoda konjugacije u 2 kor aka; (0.24 mi krograma ukupnog proteina u svakoj l iniji). Gornji m arker, sistemski pik i donje markerske trake predstavljaju spoljašnje markere dodate iz k ita (0.24 mikrograma ukupnog prot eina po bunarčLću). B. Kvantifikacija proteinskih traka iz Protein LabChip elektroforeze.
Slika 16 prikazuje LC-MS poređenje antitelo-(SMCC)-DMl konjugata pr ipremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku, sa ko njugatom pripremljenim tradicionalnim metodom konjugacije u d va ko raka. A. MS ko njugata pr ipremljenog sekvencijalnim metodom u dva koraka, sa 3.1 DM1 po Ab. Svaki glavni pik konjugata ima pridružene bočne pikove zbog prisustva hidrolizovanih i unakrsno povezanih fragmenata povezivača. B. MS konjugata pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku sa 3.1 DM1 po Ab. Zbog homogenosti konjugata, MS pikovi su dobro razdvojeni.
Slika 17 prikazuje predložene mehanizme međulančanog unakrsnog povezivanja i inaktivacije maleimida tokom konjugacije tradicionalnim metodom u 2 koraka.
Slika 18 prikazuje neredukujuću SDS PAGE Ab-(Sulfo-Mal)-DM4 konjugata pripremljenog korišćenjem metoda opisanog u ovom pronalasku i gašenjem slobodnog DM4-tiola (posle inicijalne kuplujuće reakcije DM4 NHS-Sulfo-Mal heterobifunkcionalni reage ns) korišćenjem 4- maleimidobuterne kiseline, pre reakcije konjugacije sa antitelom. Svaki uzorak sadržao j e 10 µg protein a; ge l j e obojen Coomassie plavim. Linije 1 i 5 sadržale su markere molekulske težine. Linija 2 sadržala je s amo Ab. Linija 3 sadržala je k onjugat pripremljen metodom opisanim u ovom pro nalasku bez dodavanja 4-maleimidobuterne ki seline. Linija 4 sadržala je konjugat pripremljen m etodom opisanim u ov om pronalasku uz dodavanje 4-maleimidobuterne kiseline posle početne reakcije DM4 NHS-Sulfo-Mal heterobifunkcionalni reagens (pre koraka konjugacije antitela).
Slika 19 prikazuje pr ipremanje d isulfidnom vezom po vezanog konjugata a ntitela u z korišćenje reakcione mešavine DM1 (ili DM4) i SPDB povezivača.
Slika 20 prikazuje pripremanje konjugata antitelo-majtanzinoid sa disulfidnim i nesecivim PEG4-Mal povezivačima, konjugacijom antitela sa neprečišćenom reakcionom mešavinom DM1 (ili DM4) i SPDB i NHS-PEG4-Mal povezivačima. Slika 21 prikazuje MS konjugata antitelo-majtanzinoid sa d isulfidnim i nesecivi m PEG4-Mal povezivačima (pripremljen konjugacijom antitela sa neprečišćenom reakcionom mešavinom sa DM1, ili DM4, i SPDB i NHS-PEG4-Mal povezivačima). Slika 22 pr ikazuje ko njugaciju an titela sa reakcio nom mešavinom DM1 (ili DM4) i SMCC povezivačem.
Slika 23 prikazuje MS konjugata antitelo-SMCC-DMl pr ipremljenog uz korišćenje SMCC, metodom opisanim u o vom pronalasku, koji sadž i prosečno 3.1 DM1 po antitelu.
Slika 24 prikazuje p ripremanje d isulfidno povezanog konjugata ant itela k orišćenjem reakcione mešavine DM1 (ili DM4) i SSNPB povezivača.
Slika 25 pr ikazuje ko njugaciju an titela sa reakcio nom mešavinom DM1 (ili DM4) i heterobifunkcionalnim povezivačem sa alifatičnim linearnim ugljenikovim lancem.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0013] U nastavku sledi detaljno upućivanje na određene primere izvođenja pronalaska, čiji su primeri ilustrovani u pr idruženim strukturama i formulama. Iako će pronalazak biti opisan u vezi s a navedenim p rimerima izvođenja, podrazumeva se da nema namere da se pronalazak ograniči na t e p rimere izvođenja. Naprotiv, pronalazak treba da obuhvati sve a lternative, modifikacije, i ekvivalente koji mogu biti uključeni u o kvir pr edmetnog pronalaska, kako je definisano patentnim zahtevima. Stručnjak u oblasti će prepoznati mnoge metode i materijale koji su slični ili ekvivalentni opisanima u ovom tekstu, koji se mogu upotrebiti u izvođenju predmetnog pronalaska.
[0014] Ova objava opisuje novi metod konjugovanja tiol-sadržavajućeg efektora (npr., citotoksično sredstvo) ili reporterske grupe (npr., radioobeleživač) sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju ( npr., an titelo), u k ojem efektor i li reporter koji s adrže t iol grupu prvo reaguju s a bifunkcionalnim povezujućim reagensom u organskom, vodenom ili mešovitom organskom/vodenom rastvaraču, posle čega sledi reakcija neprečišćene reakcione mešavine sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju, u organskom, vodenom ili mešovitom organskom/vodenom rastvaraču.
skraćenice u legendi
[0015] Skraćenice upotrebljene u opisima Šema i Primera koji slede su:
C = Efektorska ili reporterska grupa (npr., citotoksično sredstvo ili radioobeleživač) L = Povezivač (npr., povezivač koji može da se i seče ili povezivač koji ne može da se iseče)
X = amin-reaktivna grupa (npr., N-hidroksisukcinimid estar (NHS estar), sulfo-NHS estar, p-nitrofenol estar, t etrafluorosulfonat fenil estar, 1-hidroksi-2-nitrobenzen-4-sulfonska kiselina estar)
Y = Maleimid, ili haloacetamid (jodoacetamid, bromoacetamid)
Ybje raktivna mešovita disulfidna grupa (npr., 2-p iridilditio, 4-piridilditio, 2-nitropiridilditio, 5-nitro-piridilditio, 2-karboksi-5-nitro-piridilditio)
1
X' = amidna veza
Y' = tioetarska (R-S-R') ili selenoetarska (R-Se-R') veza
Yb'= disulfidna (R-S-S-R') veza
[0016] U jednom primeru izvoÿenja ovog pronalaska, opisan je pro ces pripremanja t ioetarski povezanog konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju sa efektorskim ili reporterskim molekulom, proces uključuje sledeće korake: a) dovoÿenje u kontakt bifunkcionalnog povezivača formule X-L-Y sa tiol-sadržavajućim efektorskim ili reporterskim molekulom C (tj., majtanzinoid) u reakcionim mešavinama u vodenom rastvaraču, organskom rastvaraču, ili mešovitom organskom/vodenom rastvaraču, koje da je intermedijarni pro izvod formule X-L-Y'-C; b) mešanje reakcione mešavine, bez prečišćavanja, sa antitelom (Ab) da se proizvede konjugat formule Ab-(X'-L-Y'-C)m, gde je L supstituisana ili nesupstituisana linearna, granata ili ciklična alkil, alkenil, ili alkinil grupa koja nosi 1-10 ugljenikovih atoma, prosta ili supstituisana aril jedinica (supstituenti izabrani izmeÿu alkil, alkoksi, halogen, nitro, fluoro, karboksi, sulfonat, fosfat, amino, karbonil, piperidin) ili polietilen g likol-sadržavajuća jedinica (poželjno spejser od 1-500 PEG, ili poželjnije spejser od 1-24 PEG, ili još poželjnije spejser od 2-8 PEG); X i Y su amin ili t iol-reaktivna grupa kao N-hidroksisukcinimid estar i maleimid ili haloacetamid; Ab je antitelo; m je ceo broj o d 1 do 20; X' je modifikovano X mesto (npr., amidna veza) posle reakcije sa antitelom; Y' je modifikovano Y mesto (npr., tioetarska veza) posle r eakcije sa, na pr imer, citotoksičnim sredst vom i li radioobeleživačem kao efektorskom ili repo rterskom grupo m; i c) prečišćavanje konjugata filtracijom sa tangencijalnim protokom, dijalizom, ili hromatografijom (npr., gel filtracija, jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija hidrofobnih interakcija) ili njihovom kombinacijom. Poželjno, Y j e t iol-reaktivna gr upa koj a se bira izmeÿu maleimida ili ha loacetamida. Poželjno, L j e linearna ili granata alkil grupa sa 1-6 ugljenika ili spejser od 2-8 PEG. C je majtanzinoid.
[0017] Ova reakciona sekvenca prikazana formulama 1 i 2:
X-L-Y C ĺ X-L-Y'-C (1)
Ab X-L-Y'-C (neprečišćeno iz reakcije 1) ĺ Ab-(X'-L-Y'-C)m(2)
ne uključuje prečišćavanje intermedijarnog proizvoda X-L-Y'-C, i tako obezbeÿuje prednost njegovog direktnog mešanja sa ant itelom (n eprečišćeni in termedijarni proizvod se do daje antitelu ili, antitelo se dodaje neprečišćenom intermedijarnom proizvodu), čime metod postaje pogodan za konjugaciju zbog toga što eliminiše potrebu za glomaznim korakom prečišćavanja. Što je važno, ovim metodom se dobija h omogeni konjugat bez meÿulančanog unakrsnog povezivanja proteina ili inaktiviranja maleimidnih rezidua, nasuprot meÿulančanom unakrsnom povezivanju proteina i inaktiviranju rezidua maleimida zapaženim u konjugatima pripremljenim t radicionalnom se kvencom reakcij e i pre čišćavanja u dva koraka.
[0018] Reakcija 1 može da se izvede pri visokim koncentracijama heterobifunkcionalnog povezivača, X-L-Y, i efektorske ili reporterske grupe C u reakcionim mešavinama u vodenom rastvaraču, organskom rastvaraču ili organskom/vodenom rastvaraču, što za rezultat ima bržu stopu odvijanja reakcije nego pri nižim koncentracijama u vodenim rastvorima, za ko njugate pripremljene tradicionalnom sekvencom reakcije i prečišćavanja u dva koraka.
[0019] Intermedijarni proizvod X-L-Y'-C, nastao u reakciji 1, može da se čuva neprečišćen u zamrznutom stanju, na niskim temperaturama u vodenom rastvaraču na pogodnom niskom pH (npr., pH ~4-6), u organskim rastvaračima, ili u mešovitim organskim/vodenim smešama, ili u liofilizovanom stanju, tokom produženog vremenskog perioda, a kasnije može da se po meša sa rastvorom antitela, za konačnu reakciju konjugacije pri povišenoj pH vrednosti od oko 4-9, što doprinosi pogodnosti ovog reakcionog niza. Intermedijarni pro izvod može da se razblaž i po potrebi, organskim rastvaračem ili vodenim puferom, ili mešavinom organskog rastvarača i vodenog pufera, pre nego što se pomeša sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju. Izraz "oko", kako se koristi u o vom tekstu u v ezi sa numeričkim vrednostima, treba razu meti tako da se odnosi na sve te brojeve, uključujući sve brojeve i mala odstupanja od njih. Reakcija intermedijarnog proizvoda X-L-Y'-C sa antitelom može da se izvede na vrednostima pH od oko 4 do oko pH 9, poželjno u opsegu pH od oko 5 do 8.7, poželjnije, u opsegu pH od oko 6.5 do oko 8.5, kao što je pH 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3 , 8.4, i 8.5, u tom pH opsegu ili uz mala odstupanja od tih vrednosti. Puferi koji se koriste za r eakciju antitela sa in termedijarnim proizvodom X-L-Y'-C u po željnom pH opsegu od oko 6.5 do 8.5 su puf eri sa p Kavrednostima oko ovog pH opsega, kao što su fosfatni i HEPES pu fer. Ovi poželjni puferi ne bi trebalo da imaju pr imarne ili sekundarne amino grupe, ili druge reaktivne grupe koje mogu da reaguju sa povezivačem X (kao što je N-hidroksisukcinimid estar).
[0020] Stehiometrijska količina ili blagi višak C u odnosu na heterobifunkcionalni povezivač X-L-Y koristi se u prvoj reakciji da bi se osiguralo da svaka Y grupa (ka o što je maleimidna grupa) reaguje pre nego što se neprečišćena mešavina doda antitelu. Opcioni dodatni tretman reagensom za gašenje (kao 4-maleimidobuterna kiselina, 3-maleimidopropionska kiselina, ili N-etilmaleimid, ili jodoacetamid, ili jodoacetamidopropionska kiselina) može se obaviti da bi s e o siguralo da su pre m ešanja sa ant itelom ugašeni svi n eodreagovali C , kako bi se n a najmanju meru svela svaka neželjena tiol-disulfid razmenjujuća reakcija sa nativnim disulfidnim grupama antitela. Posle gašenja polarnim, naelektrisanim tiol-gasećim reagensima (kao što su 4-maleimidobuterna kiselina ili 3-maleimidopropionska kiselina), višak neodreagovalog C konvertuje se u po larni, naelektrisani adukt koji može lako da se izdvoji iz kovalentno povezanog konjugata. Opciono, konačna reakciona mešavina 2, pre prečišćavanja, tretira se nukleofilima, kao što je a mino grupa koja s adrži n ukleofile ( npr., lizin, taurin, hidroksilamin) da bi se ugasio neodreagovali povezivač (X-L-Y'-C).
[0021] Alternativni metod reakcije antitela sa neprečišćenom početnom reakcionom mešavinom majtanzinoida (DMx) i h eterobifunkcionalnog povezivača uključuje mešanje početne reakcione mešavine DMx i heterobifunkcionalnog povezivača (posle završetka reakcije izmeÿu DMx i povezivača) sa antitelom na niskom pH (pH ~5), praćeno dodavanjem pufera ili baze da bi se povećao pH na oko 6.5-8.5 za reakciju konjugacije.
[0022] Ovaj n ovi metod primenjuje se za pripremanje konjugata antitela sa citotoksičnim majtanzinoidnim lekom. Na osnovu karakterizacije konjugata redukujućom SDS- PAGE, protein LabChip elektroforezom, i masenom spektrometrijom, neočekivano, konjugati antitelo-majtanzinoid pripremljeni korišćenjem ovog metoda opisanog u reakcionom nizu 1-2, bili su superiorni u pogledu homogenosti u poreÿenju sa konjugatima pripremljenim tradicionalnom sekvencom reakcije i prečišćavanja u dva koraka. Isto tako, metod konjugacije opisan u o vom pro nalasku, koji uklju čuje reakcioni niz 1 -2, ne zahteva nikakav ko rak prečišćavanja intermedijara i prema tome, značajno je pogodniji od tradicionalnog metoda u dva koraka.
[0023] U primeru objave, opisan je proces pripremanja tioetarski povezanog konjugata sredstva k oje se vezuje za ćeliju i efektorskog ili repo rterskog m olekula, koji uključuje sledeće ko rake: a) dovoÿenje u ko ntakt homobifunkcionalnog po vezivača formule Y-L-Y sa tiol- ili amin-sadržavajućom efektorskom ili reporterskom grupom C (kao što je c itotoksično sredstvo) u r eakcionoj mešavini u vodenom rastvaraču, organskom rastvaraču, ili mešovitom vodenom/organskom rastvaraču, da se dobije Y-L-Y'-C, b) mešanje reakcione mešavine, bez prečišćavanja, sa an titelom u vodenom rastvoru ili m ešavini vodenog/organskog rast varača, da se proizvede ko njugat formule Ab-(Y'-L-Y '-C)m, gde je L kako je de finisano gore; Y je tiol- ili amin-reaktivna grupa kao maleimid ili haloacetamid, ili N-hidroksisukcinimid ili sulfo N-hidroksisukcinimid; Ab j e antitelo; m j e ceo br oj od 1 do 20; Y' je modifikovano Y mesto (kao tioetarska ili amidna veza) posle r eakcije sa ant itelom ili modifikovano Y mesto
1
(kao t ioetarska ili amidna v eza) posle reakc ije sa c itotoksičnim sredstvom ili efektorskom ili reporterskom grupom, i c) prečišćavanje ko njugata fi ltracijom sa tangencijalnim pr otokom, dijalizom, ili hromatografijom (gel filtracija, jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija hidrofobnih interakcija) ili njihovom ko mbinacijom. Reakciona sekvenca predstavljena formulama 3 i 4:
Y-L-Y C ĺ Y-L-Y'-C (3)
Ab Y-L-Y'-C (neprečišćeno iz reakcije 3) ĺ Ab-(Y'-L-Y'-C)m(4)
ne uključuje nikakav korak prečišćavanja intermedijarnog proizvoda Y-L-Y'-C, i prema tome predstavlja pogodan metod konjugacije.
[0024] U još jednom primeru, opisan je proces pripremanja d isulfidno povezanog konjugata sredstva ko je se vezuje za ćeliju sa e fektorskim ili reporterskim molekulom, koji uključuje sledeće korake: a) dovoÿenje u kontakt heterobifunkcionalnog povezivača formule X-L-Ybsa efektorskom ili reporterskom grupom C (kao što je citotoksično sredstvo) u reakcionoj mešavini u vodenom rastvaraču, organskom rastvaraču, ili mešovitom vodenom/organskom rastvaraču, da se d obije intermedijarni proizvod X-L-Yb'-C; b) mešanje reakc ione mešavine, bez prečišćavanja, sa antitelom u vodenom r astvoru ili mešavini vodenog/organskog rastvarača, da se pro izvede ko njugat f ormule A b-(X'-L-Yb'-C)m, gde je L kako je opisano gore; Ybje reakt ivni disulfid kao piridil disulfid ili nitro-piridil disulfid; X je amin-reaktivna grupa kao N-hidroksisukcinimid estar ili sulfo N-hidroksisukcinimid estar; Ab je antitelo; m je ceo broj od 1 do 20; X' j e modifikovano X m esto (kao ami dna veza) posle r akcije s a antitelom; Yb' je modifikovano Ybmesto (disulfid) posle rakcije sa citotoksičnim sredstvom ili efektorskom ili reporterskom grupom; i c) prečišćavanje konjugata filtracijom sa tangencijalnim p rotokom, dijalizom, ili hromatografijom (gel filtracija, jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija hidrofobnih interakcija) ili njihovom kombinacijom. Reakciona sekvenca predstavljena je formulama 5 i 6:
X-L-Yb+ C ĺ X-L-Yb'-C (5)
Ab X-L-Yb'-C (neprečišćeno iz reakcije 5) ĺ Ab-(X'-L-Yb'-C)m(6)
[0025] U još jednom primeru, opisan je proces pripremanja konjugata antitela sa e fektorskim ili r eporterskim grup ama, sa d va t ipa p ovezivača - nesecivim ( tioetarska veza) i secivim (disulfidna veza) - koji uključuje sledeće korake:
a) dovoÿenje u kontakt X-L-Y i X-L-Ybpovezivača sa citotoksičnim sredstvom C da nastanu in termedijarna j edinjenja f ormula X-L-Y'-C i X-L-Yb'-C, b) mešanje reakcionih mešavina, be z pre čišćavanja, sa an titelom u nizu ili i stovremeno kako je navedeno u reakcionim formulama 7-9:
X-L-Y C ĺ X-L-Y'-C (7)
X-L-Yb+ C ĺ X-L-Yb'-C (8)
Ab X-L-Y'-C X-L-Yb'-C (neprečišćeno iz reakcija 7-8)
ĺ Ab-(X'-L-Y'-C)m(X'-L-Yb'-C)m'(9)
da se obezbedi konjugat Ab-(X'-L-Y'-C)m(X'-L-Yb'-C)m', pri čemu su definicije X, L, Y', C, Yb', i m kako je dato gore, i m ' j e ceo broj od 1 d o 20; i c) pre čišćavanje konjugata filtracijom sa tangencijalnim protokom, dijalizom, ili hromatografijom (gel filtracija, jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija hidrofobnih interakcija) il i njihovom kombinacijom. Ova dv a intermedijara povezivač-efektor (X-L-Y'-C i X-L-Yb'-C) mešaju se bez prečišćavanja sa antitelom različitim redosledima (prvo X-L-Y'-C zatim X-L-Yb'-C, ili prvo X-L-Yb'-C zatim X- L-Y'-C ili is tovremeno) u r azličitom odnosu.
[0026] Reakcije 1, 3, 5, i 7-8, mogu da se izvode pri visokim koncentracijama bifunkcionalnog povezivača (X-L-Y, X-L-Yb, ili Y-L-Y) i efektorske ili reporterske grupe C u reakcionim mešavinama u vodenom rastvaraču, organskom rastvaraču, ili organskom/vodenom rastvaraču, što rezultuje bržim stopama reakc ije nego ako se i zvode pr i nižim ko ncentracijama u vodenim rastvorima za konjugate pripremljene tradicionalnom sekvencom reakcije i prečišćavanja u dva koraka gde je rastvorljivost reagenasa ograničavajuća.
[0027] Intermedijarni proizvodi X-L-Y'-C, ili Y-L-Y'-C, ili X-L-Yb'-C nastali u reakcijama 1, 3, 5, i 7-8 mogu da se čuvaju neprečišćeni u zamrznutom stanju, na niskim tempraturama u vodenom rast varaču na odgovarajućem pH, u o rganskim rast varačima, ili u mešovitim organskim/vodenim smešama, ili u liofilizovanom st anju, tokom dužih vremenskih perioda i kasnije mogu da se do daju r astvoru antitela, za zav ršnu r eakciju ko njugacije, što doprinosi pogodnosti ove rekacione sekvence.
1
[0028] Stehiometrijska količina ili blagi višak C u odnosu na heterobifunkcionalni povezivač X-L-Y, ili Y-L-Y, i li X-L-Ybkoristi se u pr voj reakciji da bi se o siguralo da svaka Y grupa (kao što je maleimidna grupa) odreaguje pre nego što se neprečišćena mešavina doda antitelu. Opcioni dodatni tretman reagensom za gaš enje ( kao 4-m aleimidobuterna ki selina, ili 3-maleimidopropionska kiselina, ili N-etilmaleimid, ili jodoacetamid, ili jodosirćetna kiselina) može da se obavi da bi se osiguralo da svaka neodreagovala grupa (kao tiol) u C bude ugašena pre dodavanja antitelu, kako bi se na na jmanju meru svela bil o kakva neže ljena t iol-disulfid razmenjujuća reakcija sa nativnim disulfidnim grupama antitela. Gašenje viška C korišćenjem naelektrisanog, polarnog tiol-gasećeg reagensa, po sle po četne reakcije C sa bifunkcionalnim povezivačem, konvertuje višak C u visoko polarni, vodorastvorljivi adukt koji s e gel filtracijom, dijalizom, ili TFF lako izdvaja iz ko njugata povezanog kovalentnom vezo m. Konačni ko njugovani pro izvod ne sadrži nekovalentno pridruženi C. Opciono, konačne reakcione mešavine 2, 4, 6, i 9, pre prečišćavanja, tretiraju se nukleofilima, kao što je amino grupa koja sadrž i nukleofile (npr., lizin, taurin, hidroksilamin) da bi se ugasili n eodreagovali povezivači (X-L-Y'-C, Y-L-Y'-C, ili X-L-Yb'-C).
[0029] Alternativni metod reakcije antitela sa neprečišćenom početnom reakcionom mešavinom DM x i bifunkcionalnog povezivača uključuje mešanje početne reakcione mešavine DM x i bifunkcionalnog po vezivača ( posle za vršetka r eakcije D Mx-povezivač) sa antitelom na niskom pH (pH ~5 praćeno dodavanjem pufera ili baze da se poveća pH do oko 6.5-8.5, za reakciju konjugacije.
[0030] Veći broj ko pija više od jednog tipa efektora može se konjugovati sa antitelom dodavanjem ant itelu d va ili više intermedijara p ovezivač-efektor, i zvedenih iz d va ili više različitih efektora, bez prečišćavanja, sekvencijalno ili istovremeno.
EFEKTORSKA GRUPA/GRUPE
[0031] Izrazi Efektorska grupa ili Efektorski molekul koriste se naizmenično i izraz "Efektorska grupa/grupe" ili "Efektorski molekul/molekuli", kako se koriste u ovo m tekstu, treba da uk ljuče citotoksična sredstva. U odreÿenim aspektima, može biti poželjno da efektorske grupe ili m olekuli budu pr ikačeni spejserskim ručicama različitih dužina, kako bi se smanjilo potencijalno sterno ometanje. Veći broj kopija više od jednog tipa efektora može se konjugovati sa ant itelom dodavanjem antitelu dva ili više nter medijara po vezivač-efektor izvedenih iz dva ili više različitih efektora, bez prečLćavanja, sekvencijalno ili istovremeno.
1
[0032] Citotoksična sredstva koja mogu da se koriste u predmetnoj objavi uključuju hemioterapijska sredstva ili strukturne analoge hemioterapijskih sredst ava. "Hemioterapijsko sredstvo" je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju kancera. Primeri hemioterapijskih sredstava uključuju alkilirajuća sredstva, kao što su tiotepa i ci klofosfamid (CYTOXAN™); alkil sulfonate kao što su bus ulfan, improsulfan i piposulfan; azi ridine, kao š to su b enzodopa, karbokvon, meturedopa, i u redopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i t rimetilolomelamin; acetogenine (posebno bulatacin i b ulatacinon); kamptotecin (uključujući s intetski analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetske analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (posebno kriptoficin 1 i kr iptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetske analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; az otne iperite kao što su hl orambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin o ksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracilni iper it; ni trozuree kao što su karm ustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su enediinski antibiotici (npr. kalihemicin, posebno kalihemicin-gama1 i kalihemicin t eta I, vi di, npr., Angew Chem In tl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994) ; dinemicin, uključujući d inemicin A; espera micin; kao i neokarzinostatinsku hro moforu i slične hro moproteinske enediinske antibiotske hro mofore), aklacinomizine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karz inofilin; h romomicine, dakt inomicin, dau norubicin, detorubi cin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, do ksorubicin (uk ljučujući morfolino-doksorubicin, c ijanomorfolinodoksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, nitomicine, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, u benimeks, zin ostatin, zo rubicin; a nti-metabolite, kao što s u metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU) ; analoge folne k iseline, kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge, kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimnidinske analoge kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgene, kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenalna sredstva, kao što su ami noglutetimid, mitotan, tr ilostan; o bnavljače folne k iseline, kao što j e frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfomitin; eliptinijum acetat;
1
epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidamin; majtanzinoide, kao što su majtanzin i a nsamitocini; mi toguazon; mi toksantron; m opidamol; ni trakrin; pentost atin; fenamet; pirarubicin; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; pr okarbazin; PSK®; razoksan; rizoksin; sizofiran; spi rogermanijum; tenuazonsku kis elinu; triazikvon; 2,2' ,2"-trihlorotrietilamin; trihotecene (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angvidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("A ra-C"); ciklofosfamid; tiotepu; taksoide, npr. pa klitaksel (TAXOL®, Bri stol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin; 6-t ioguanin; merkaptopurin; me totreksat; analoge platine kao što su ci splatin i karboplatin; vinb lastin; p latinu; eto pozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; v inkristin; v inorelbin; navelbin; novantron; t enipozid; daunomicin; a minopterin; kselodu; ibandro nat; CPT-11; i nhibitor to poizomeraze R FS 2000; difluorometilomitin (difluoromethylomithine, DMFO); retinoinsku kiselinu; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bi lo kojeg od g ore navedenih. U ovu definiciju uk ljučena su i an tihormonska sredst va koja de luju t ako što reguli šu ili inhibiraju delovanje hormona na t umore, kao što su anti estrogeni uklj učujući n a pr imer tamoksifen, raloksifen, aromataza-inhibirajuće 4(5)-imidazole, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i toremifen (Fareston); i antiandrogene, kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserelin; siRNK i far maceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kojeg o d gore navedenih. Druga hemioterapijska sredst va ko ja mogu da se koriste sa predmetnom objavom, objavljena su u US publikaciji br. 20080171040 ili US publikaciji br.20080305044.
[0033] U poželjnom primeru, hemioterapijska c itotoksična sredstva su u suštini citotoksična sredstva sa malim molekulom. "Lek sa malim molekulom" koristi se uopšteno u ovom t ekstu da označi organsko, neorgansko, i li organometalno jedinjenje koje može i mati molekulsku težinu o d na pr imer 100 do 1500, pogodnije o d 120 do 1200, povoljno od 200 do 1000, i tipično ima molekulsku težinu manju od oko 1000. Citotoksična sredstva sa malim molekulom o bjave o buhvataju oligopeptide i dr uge biomolekule sa molekulskom težinom manjom od o ko 1000. Citotoksična sredstva s a malim molekulom dobro su okarakterisana u struci, na primer u WO05058367A2, Evropskim patentnim prijavama br.
85901495 i 8590319, i u U.S. patentu br.4,956,303.
[0034] Poželjna citotoksična sredstva sa malim m olekulom su ona koja dopuštaju vezu sa sredstvom koje se v ezuje za ćeliju. Objava uk ljučuje poznata citotoksična sredstva kao i ona
1
koja mogu postati poznata. Posebno poželjna c itotoksična sredstva sa malim molekulom uključuju citotoksična sredstva.
[0035] Citotoksično sredstvo može biti svako jedinjenje koje rezultuje smrću ćelije, ili koje indukuje smrt ćelije, ili koje na neki način smanjuje vijabilnost ćelije, pri čemu svako citotoksično sredstvo sadrži tiolnu komponentu.
[0036] Poželjna citotoksična sredstva su majtanzinoidna jedinjenja, taksanska jedinjenja, CC-1065 jedinjenja, daunorubicinska jedinjenja i doksorubicinska jedinjenja, pirolobenzodiazepinski dimeri, ka liheamicini, aur istatini i nji hovi analozi i derivati, od kojih su neki opisani kasnije u ovom tekstu.
[0037] Druga ci totoksična sredstva koja nisu obavezno sa malim molekulom, kao siRNK, takoÿe su o buhvaćena o kvirom sadašnje o bjave. Na pr imer, siRNK mogu b iti povezane z a unakrsne povezivače predmetne objave metodima koji se uobičajeno koriste za modifikovanje oligonukleotida (vidi, na primer, US patentne prijave 20050107325 i 20070213292). Prema tome, siRNK u s vojoj 3' i li 5'-fosforomiditnoj formi, re aguje s a j ednim krajem unakrsnog povezivača ko ji nosi hidroksilnu funkcionalnost da bi nastala estarska ve za izmeÿu s iRNK i unakrsnog po vezivača. Slična reak cija siRNK fosforamidita sa unakrsnim povezivačem koji nosi terminalnu amino grupu rezultuje vezom unakrsnog povezivača sa siRN K preko am ina. siRNK detaljno su opisane u U.S. patentnim publikacijama broj: 20070275465, 20070213292, 20070185050, 20070161595, 20070054279, 20060287260, 20060035254, 20060008822, 20050288244, 20050176667.
Majtanzinoidi
[0038] Majtanzinoidi koji mogu da se koriste u predmetnom pronalasku dobro su poznati u struci i m ogu se izolovati iz prirodnih izvora, poznatim metodima ili se mogu pripremiti sintetski, u skladu sa poznatim metodima.
[0039] Primeri pogodnih majtanzinoida uključuju majtanzinol i analoge majtanzinola. Primeri pogodnih analoga majtanzinola uključuju one koji imaju modifikovani aromatični prsten i one koji imaju modifikacije na drugim pozicijama.
[0040] Specifični primeri pogodnih analoga majtanzinola sa modifikovanim aromatičnim prstenom uključuju:
(1) C-19-dehloro (U.S. patent br. 4,256,746) (pripremljen LAH redukcijom ansamitocina P2);
1
(2) C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /-C-19-dehloro (U.S. patenti br.
4,361,650 i 4,307,016) (pripremljen demetilacijom uz korišćenje Streptomyces ili Actinomyces ili dehlorinacijom uz korišćenje LAH); i
(3) C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (- OCOR), /-dehloro (U.S. patent br. 4,294,757) (pripremljen acilacijom uz korišćenje acil hlorida).
[0041] Specifični primeri p ogodnih analoga majtanzinola sa modifikacijama drugih pozicija uključuju:
(1) C-9-SH (U.S. patent br. 4,424,219) (pripremljen reakcijom majtanzinola sa H2S ili P2S5);
(2) C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (U.S. patent br.4,331,598);
(3) C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2O H ili CH2OAc) (U.S. patent br.
4,450,254) (pripremljen iz Nocardia);
(4) C-15-hidroksi/aciloksi (U.S. patent br. 4,364,866) (pripremljen konverzijom majtanzinola korišćenjem Streptomyces);
(5) C-15-metoksi (U.S. patenti br. 4,313,946 i 4,315,929) (izolovan iz Trewia nudiflora);
(6) C-18-N-demetil (U.S. patenti br. 4,362,663 i 4,322,348) (pripremljen demetilacijom majtanzinola korišćenjem Streptomyces); i
(7) 4,5-deoksi (U. S. patent br. 4,371,533) (pripremljen titanijum t rihlorid/LAH redukcijom majtanzinola).
[0042] Sinteza tiol-sadržavajućih majtanzinoida korisnih u predmetnom pronalasku potpuno je objavljena u U.S. patentima br. 5,208,020, 5,416,064, i U. S. patentnoj prijavi br.
20040235840.
[0043] Očekuje se da su korisni svi majtanzinoidi sa tiol komponentom na C-3 poziciji, C-14 poziciji, C-15 poziciji ili C-20 poziciji. Poželjna je C-3 pozicija, a posebno je poželjna C-3 pozicija majtanzinola. Isto tako, poželjni su majtanzinoid sa N-metil-alanin-sadržavajućom C-3 tiol komponentom, i majtanzinoid sa N-metil-cistein-sadržavajućom C-3 tiol komponentom, i analozi svakog od njih.
2
[0044] Specifični pr imeri majtanzinoidnih derivata sa N-metil-alanin-sadržavajućom C-3 tiol komponentom korisnih u pred metnom pronalasku predstavljeni su formulama M1, M2, M3, M6 i M7.
gde:
l je ceo broj od 1 do 10; i
May je majtanzinoid.
gde:
R1i R2su H, CH3ili CH2CH3, i mogu biti isti ili različiti;
m je 0, 1, 2 ili 3; i
May je majtanzinoid.
gde:
n je ceo broj od 3 do 8; i
May je majtanzinoid.
gde:
l je 1, 2 ili 3;
Y0je Cl ili H; i
X3je H ili CH3.
gde:
R1, R2, R3, R4su H, CH3ili CH2CH3, i mogu biti isti ili različiti;
m je 0, 1, 2 ili 3; i
May je majtanzinoid.
[0045] Specifični primeri majtanzinoidnih derivata sa C-3 tiol komponentom korisni u predmetnom pronalasku predstavljeni su formulama M4 i M5.
gde:
o je 1, 2 ili 3;
p je ceo broj od 0 do 10; i
May je majtanzinoid.
gde:
o je 1, 2 ili 3;
q je ceo broj 0 do 10;
Y0je Cl ili H; i
X3je H ili CH3.
[0046] Poželjni majtanzinoidi su oni koji su opisani u U.S. patentima br.
5,208,020; 5,416,064;
6,333.410; 6,441,163; 6,716,821; RE39,151 i 7,276,497.
Taksani
[0047] Citotoksiþno sredstvo prema predmetnoj objavi može biti i taksan.
[0048] Taksani ko ji mogu da se koriste u predmetnoj objavi modifikovani su t ako da sadrže tiolnu ko mponentu. Neki taksani ko risni u predme tnoj objavi im aju formulu T 1 pr ikazanu dole:
2
[0049] Poželjni taksoidi su oni koji su opisani u U.S. patentima br.6,340,701; 6,372,738;
6.436,931; 6,596,757; 6,706,708; 7,008,942; 7,217,819 i 7,276,499.
CC-1065 analozi
[0050] Citotoksiþna sredstva prema predmetnoj objavi mogu biti i CC-1065 analozi.
[0051] Prema predmetnoj objavi, CC-1065 analozi sadrže A podjedinicu i B ili B-C podjedinicu. Poželjni CC-1065 analozi su oni koji su opisani u U.S. patentima br.
5,475,092; 5,595,499;
5,846,545; 6,534,660; 6,586,618; 6,756,397 i 7,049,316.
Analozi daunorubicina/doksorubicina
[0052] Citotoksiþna sredstva pr ema pr edmetnoj objavi mogu biti i anal ozi daunor ubicina ili analozi doksorubicina.
[0053] Analozi daunorubicina i doksorubicina predmetne objave mogu biti modifikovani tako da sadrže tiolnu komponentu. Modifikovani analozi doksorubicina/daunorubicina predmetne objave, koji imaj u tiolnu komponentu, o pisani s u u WO 01/38318. Modifikovani analozi doksorubicina/daunorubicina m ogu se sintetisati poznatim metodima ( vidi, npr., U.S. patent br. 5,146,064).
[0054] Auristatin ukljuþuje auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monometil auristatin E (MMAE) i oni su opisani u U.S. Patentu br. 5,635,483, Int. J. Oncol.
15:367-72 (1999); Molecular Cancer Therapeutics, vol. 3, No. 8, pp. 921-932 (2004); U.S. prijava broj 11/134826. U.S. patentne publikacije. br. 20060074008, 2006022925.
[0055] Citotoksiþna sredstva prema predmetnoj objavi ukljuþuju pirolobenzodiazepinske dimere poznate u struci (US patenti br.
7,049,311; 7,067,511; 6,951,853; 7,189,710; 6,884,799; 6,660,856).
Analozi i derivati
[0056] Struþnjak u o blasti citotoksiþnih sredstava lako üe razumeti da svako od citotoksiþnih sredstava opisanih u o vom tekstu m ože da se m odifikuje na takav n aþin d a rezultujuüe jedinjenje i dalje zadrža va spec ifiþnost i/ili akt ivnost polaznog jedinjenja. Vešt struþnjak üe takoÿe r azumeti da mnoga o d ovih jedinjenja mogu da s e ko riste u mesto citotoksiþnih sredstava opisanih u ovom t ekstu. Prema tome, citotoksiþna sredstva predmetne objave ukljuþuju analoge i derivate jedinjenja opisanih u ovom tekstu.
REPORTERSKA GRUPA/GRUPE
[0057] Izrazi Reporterska grupa ili Reporterski molekul koriste se naizmeniþno i izraz "Reporterska grupa/grupe" ili "Reporterski molekul/molekuli", kako se koriste u ovom tekstu, oznaþavaju supstancu koja se dostavlja specifiþnoj sups tanci ili üelijama pomoüu dela reagensa sa specifiþnim a finitetom, u svrhu dijagnostikovanja ili leþenja; primeri su radioizotopi, paramagnetna kontrastna sredstva, i antikancerska sredstva. Razliþite obeleživaþke ili reporterske grupe korisne su za primenu u stvaranju slike tumora kod obolelih od kancera, primenu u imunotestovima za dijagnostikovanje razliþitih bolesti, leþenje kancera korišüenjem ko njugata r adioaktivni n uklid-ligand, i primenu u afinitetnoj hromatografiji za preþišüavanje bioaktivnih sredstava kao što su proteini, pept idi, i oligonukleidi. Obeleživaþke ili reporterske grupe konjugovane sa sredstvima koja se vezuju za üeliju ukljuþuju fluorofore, i afinitetne obeleživaþe kao što je biotin. Obaveštenja o takvim reporterskim grupama mogu se naüi u US publikaciji broj 2007/0092940. Reporterske grupe ukl juþujuüi, na primer, biotin ili fluorescein mogu da se pr ikaþe i za PEG komponentu konjugata. Brojne pogodne reporterske grupe poznate su u struci , npr., U.S. pat. br. 4,152,411 i Hirschfeld U.S. pat. br.
4,166,105, U.S. pat. br.5,223,242, U.S. pat. br.5,501,952, US publikacija 20090136940.
POVEZIVAýI
[0058] Konjugati mogu da se pr ipreme in vitro metodima. Da bi se lek povezao sa sredstvom koje se vezuje za üeliju, ko risti se po vezujuüa gr upa. Pogodne povezuj uüe gr upe do bro su poznate u struci i ukljuþuju povezivaþe koji ne mogu da se seku i povezivaþe koji mogu da se seku. Po vezivaþ ko ji ne m ože da se se þe je bil o koja hemijska ko mponenta k oja može da poveže c itotksiþno sredstvo sa sredst vom koje s e vezuje za üeliju, na st abilan, k ovalentan naþin. Povezivaþi koji ne mogu da se seku su suštinski otporni na seþenje izazvano kiselinom, seþenje izazvano svetlošüu, seþenje izazvano peptidazom, seþenje izazvano esterazom, i
2
seþenje disulfidne veze. Primeri povezivaþa ko ji ne mogu da se seku uk ljuþuju po vezivaþe koji imaju N-sukcinimidil estarsku, N-sulfosukcinimidil estarsku komponentu, maleimido- ili haloacetil-baziranu komponentu za r eakciju sa lekom, reporterskom grupom ili sredst vom koje se vezuje za üeliju. Unakr sno povezujuüi reagensi koji sadrže ko mponentu baziranu na maleimidu uklj uþuju N-sukcinimi dil 4-(maleimidometil)cikloheksankarboksilat (N-succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylate, SMCC), N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproat), koji je "dugolanþani" analog SMCC (N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate, LC-SMCC), N-sukcinimidil e star ț-maleimidoundekanske k iseline (ț-maleimidoundecanoic acid N -succinimidyl e ster, KMUA), Ȗ-N-sukcinimidil es tar maleimidobuterne k iseline ( Ȗ-maleimidobutyric acid N-suc cinimidyl ester, GMBS), N-hi droksisukcinimid es tar İ-maleimidokapronske kiseline (İ-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester, EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS), N-( Į-maleimidoacetoksi)-sukcinimid estar (N-(Į-maleimidoacetoxy)-succinimide ester, AMAS), s ukcinimidil-6-(ȕmaleimidopropionamido)heksanoat (succinimidyl-6-(ȕ-maleimidopropion-amido)hexanoate, SMPH), N-sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirat (N-succinimidyl 4-(pmaleimidophenyl)-butyrate, SMPB), i N-(p-maleimidofenil)izocijanat (N- (pmaleimidophenyl)isocyanate, PMPI ). Un akrsno povezujuüa sredstva koj a sarže hal oacetilbaziranu ko mponentu uk ljuþuju N-sukcini midil-4-(jodoacetil)-aminobenzoat (N-succinimidyl-4-(iodoacetyl)-aminobenzoate, SIAB), N- sukcinimidil jodoacetat (N-succinimidyl iodoacetate, SIA), N-sukcinimidil bromoacetat (N-succinimidyl bro moacetate, SBA), i N-sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionat ( N-succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate, SBAP).
[0059] Druga unakrsno povezujuüa sredstva bez atoma sumpora, koja formiraju povezivaþe koji ne mogu da se se ku takoÿe se mogu koristiti u inventivnom metodu. Takvi povezivaþi mogu se izvesti i z ko mponenti b aziranih na d ikarboksilnoj kiselini . Pogodne ko mponente bazirane na dikarboksilnoj kiselini u kljuþuju, ali se ne ograniþavaju na ĮȦ-dikarboksilne kiseline opšte formule prikazane dole:
HOOC-X1- Yn-Zm-COOH
gde je X linearna ili granata alkil, alkenil, ili alkinil grupa sa 2 do 20 ugljenikovih atoma, Y je cikloalkil ili cikloalkenil grupa ko ja nosi 3 do 10 ug ljenikovih ato ma, Z je supstituisana i li
2
nesupstituisana aro matiþan grupa ko ja nosi 6 do 10 ug ljenikovih at oma, ili supstituisana il i nesupstituisana heterocikliþna grupa, pri þemu se heteroatom bira izmeÿu N, O ili S, i gde su 1, m, i n, svaki, 0 ili 1, uz uslov da 1, m, i n nisu svi u isto vreme nula.
[0060] Mnogi pove zivaþi ko ji ne mogu da se se ku, objavljeni u o vom tekst u, detaljno su opisani u U.S. patentnoj publikaciji broj 20050169933.
[0061] Povezivaþi ko ji m ogu da se seku su poveziv aþi koji m ogu da se seku pod bl agim uslovima, tj. pod uslovima koji ne utiþu na aktivnost citotoksiþnog sredstva. U ovu kategoriju svrstavaju se mnogi poznati povezivaþi i oni su opisani kasnije u ovom tekstu.
[0062] Povezivaþi osetljivi na dej stvo kiselina su po vezivaþi koji se seku na k iselom pH. Na primer, odreÿeni unutarüelijski odeljci, kao što su endozomi i lizozomi, imaju kiseli pH (pH 4-5), i obezbeÿuju uslove pogodne za seþenje povezivaþa osetljivih na dejstvo kiselina.
[0063] Povezivaþi koji su fotolabilni korisni su na površini tela i u mnogim telesnim dupljama do kojih dopire svetlost. Pored toga, infracrvena svetlost može prodreti kroz tkivo.
[0064] Neki povezivaþi mogu da s e seku peptidazama. Samo odreÿeni peptidi se lako seku unutar üelija ili izvan üelija, vidi, npr. Trouet et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 626-629 (1982), Umemoto et al. 43 Int. J. Can cer, 677-684 (1989), ka o i veza valin-citrulin, koja se seþe lizozomskom hidrolazom (US patent 6,214,345 B1). Pored toga, peptidi su sastavljeni od alfa-amino kiselina i pept idnih veza koje hemijski pred stavljaju amidne veze izmeÿu karboksilata jedne amino-kiseline i alfa-amino grupe druge amino-kiseline. Po drazumeva se da druge amidne veze, kao što su v eze izmeÿu karboksilata i epsilon-amino grupe lizina, nisu peptidne veze i razmatraju se kao veze koje ne mogu da se seku.
[0065] Neki povezivaþi mogu da se seku esterazama. Opet, samo odreÿeni estri mogu da se seku esterazama prisutnim unutar ili izvan üelija. Estri se formiraju kondenzacijom karboksilne kiseline i alkohola. Prosti estri su estri proizvedeni sa prostim alkoholima, kao što su alifatiþni a lkoholi, i ma li c ikliþni i ma li aromatiþni alkoholi. Na primer, o vi pronalazaþi nisu pronašli est erazu koja seþe estar na C-3 po ziciji majtanzina, pošto je alkoholna komponenta estra, majtanzinol, veoma veliki kompleks.
[0066] Poželjni povezivaþki molekuli koji se mogu seüi ukljuþuju, na primer, N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) (vidi, npr., Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)butanoat (N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butanoate, SPDB) (vidi, npr., U.S. patent 4, 563,304), N-sukci nimidil 4-(2-piridilditio)pentanoat (N-succ inimidyl 4-(2-
2
pyridyldithio)pentanoate, SPP) (vidi, npr., CAS registarski broj 341498-08-6), i druge reaktivne unakrsne povezivaþe, kao što su oni opisani u U.S. patentu 6,913,748.
[0067] Drugi povezivaþi ko ji mogu da se upotrebe u predmetnom pr onalasku ukljuþuju naelektrisane povezivaþe ili hidrofilne povezivaþe i opisani su u U.S. patentnim prijavama br.
12/433,604, odnosno 12/433,668.
SREDSTVA KOJA SE VEZUJU ZA ûELIJU
[0068] Sredstva koja se vezuju za üeliju upotebljena u ovoj objavi su proteini (npr., imunoglobulinski i neimunoglobulinski proteini) ko ji se specifiþno vezuju za c iljne antigene na kancerkim üelijama. Ova sredstva koja se vezuju za üeliju ukljuþuju:
x antitela ukljuþujuüi:
o antitela sa zamenjenim površinskim reziduama (U.S. patent br.5,639,641);
o humanizovana ili potpuno humana antitela (humanizovana ili potpuno humana antitela biraju se, bez ograniþavanja, izmeÿu huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CD38, IGF-IR, CNTO 95, B-B4, tr astuzumaba, bivatuzumaba, sibrotuzumaba, i rituksimaba (vidi, npr., U.S. patente br. 5,639,641, 5,665,357, i 7,342,110, Meÿunarodnu patentnu prijavu WO 02/16,401, U.S. publikaciju broj 20060045877, U.S. publikaciju broj 20060127407, U.S. publikaciju broj 20050118183, Pedersen et al., (1994) J. Mol. Biol. 235, 959-973, Roguska et al., (1994) Pr oceedings o f the Nat ional A cademy of Sciences, Vo l 91, 969-973, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995), Welt et al., J. Cli n. Oncol., 12: 1193- 1203 (1994), i Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)); i
o fragmente antitela kao što su sFv, Fab, Fab', i F(ab')2, koji se preferencijalno vezuju za ciljnu üeliju (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys.
89:230-244 (1960));
[0069] Dodatna sredstva koja se vezuju za üeliju ukljuþuju druge proteine i polipeptide koji se vezuju za üeliju, þiji su primeri, bez ograniþavanja:
x Proteini sa ankirinskim ponovcima (DARPini; Zahnd et al., J. Biol. Chem., 281, 46, 35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature
2
Biotechnology, 23, 1257-1268) ili pr oteini sa ponovcima sliþnim a nkirinskim ili sintetski peptidi opisani, na primer, u U.S. publikaciji broj 20070238667; U.S. patentu br. 7,101,675; WO/2007/147213; WO/2007/062466);
x interferoni (npr. Į, ȕ, Ȗ);
x limfokini kao što su IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
x hormoni kao što su insulin, TRH (tirotropin-oslobaÿajuüi hormoni), MSH (melanocitstimulirajuüi hormon), steroidni hormoni, kao što su androgeni i estrogeni; i
x faktori rasta i faktori koji stimulišu ko lonije kao što su E GF, TGF-Į, IGF-1, G -CSF, M-CSF i GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)).
[0070] Kada je sredstvo koje se vezuje za üeliju antitelo, o no se vezu je za antigen ko ji je polipeptid i može biti transmembranski molekul (npr., receptor) i li ligand, k ao što je faktor rasta. Primeri antigena ukljuþuju molekule kao što su renin; hormon rasta ukljuþujuüi humani hormon rasta i goveÿi hormon rasta; oslobaÿajuüi faktor hormona rasta; paratiroidni hormon; tiroid-stimulišuüi ho rmon; lip optoreine; alfa-1-antitripsin; in sulinski A-lanac; in sulinski B-lanac; pro insulin; folikulostimulirajuüi hormon; kalcitonin; lute inizirajuüi hormon; glukagon; faktori koagulacije kao što su faktor vmc, faktor IX, tkivni fakto r (tissue factor, T F), i v on Willebrandov faktor; an tikoagulacioni faktori ka o što su protein C ; at rijalni natriuretiþki faktor; pluüni sur faktanti; plazminogen aktivator, kao što su uroki naza ili pla zminogenaktivator iz humanog ur ina ili p lazminogen-aktivator t kivnog t ipa ( tissue-type p lasminogen activator, t-PA); bombezin; trombin; faktor rasta hematopoeze; faktor nekroze tumora-Į i -ȕ; enkefalinaza; RANTES (regulated o n act ivation normally T- cell expressed and secreted, protein koji s e reguliše posle aktiviranja i normalno ga T-üelija eksprimira i s ekretuje); inflamatorni p rotein humanih makrofaga (MIP-1-alfa); serum a lbumin kao što je humani serum albumin; Mue llerian-inhibirajuüa supstanc a; relaksinski A-lanac; re laksinski B-lanac; prorelaksin; mišji gonadotropinu pr idruženi peptid; protein mi kroorganizama, kao betalaktamaza; DNaza; IgE; an tigen pridružen ci totoksiþnom T-limfocitu (c ytotoxic T-lymphocyte asso ciated ant igen, CTLA), kao što je CT LA-4; inhibin; akt ivin; faktor ras ta vaskularnog endotela ( vascular endo thelial growth factor, VEGF); r eceptori za h ormone ili faktore rasta; protein A ili D; reumatoidni faktori; neurotrofiþni faktor kao što su neurotrofiþni faktor poreklom iz kosti (bone-derived neurotrophic factor, BDNF), neurotrofin-3, -4, -5, ili -6 (NT-3, NT4, NT-5, ili NT-6), ili faktor rasta nerava (nerve growth factor) kao što je NGF-ȕ.; faktor rasta k rvnih p loþica ( platelet-derived growth fac tor, PDGF); faktor rast a fib roblasta
2
(fibroblast growth factor) kao aFGF i bFG F; faktor rasta epiderma (epidermal growth factor, EGF); transformišuüi faktor rasta ( transforming growth factor, TGF) ka o TGF-alf a i TGF-beta, ukljuþujuüi TGF-betal, TGF-ȕ2, TGF- ȕ3, TGF-(ȕ4, ili TGF- ȕ5; insulinu-sliþan faktor rasta-I i -II ( IGF-I i IGF-II); d es(1-3)-IGF-I (m oždani IGF-I), proteini koji s e v ezuju za insulinu sliþan faktor rasta; CD prot eini kao što su CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 i CD40; eritropoetin; osteoinduktivni faktori; imunotoksini; protein morfogeneze kosti (bone morphogenetic protein, BMP); interferon kao interferon-alfa, -beta, i -gama; faktori stimulacije kolonija (colony stimulating factors, CSF), npr., M-CSF, GM-CSF, i G-CSF; interleukini ( interleukin, IL), npr., IL -1 do IL-10; superoks id dismutaza; rece ptori T- üelija; površinski membranski pr oteini; faktor koji ubrzava r azgradnju; virusni ant igen kao , na primer, deo omotaþa HIV; t ransportni proteini; u domljavajuüi receptori; adresini; r egulatorni proteini; integrini kao CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 i VCAM, alfa-V podjedinica het erodimernog humanog integrinskog receptora; tumoru pridruženi antigen kao HER2, HER3 i HER4 receptor; i fragmenti svakog od gore navedenih polipeptida.
[0071] Poželjni antigeni za antitela obuhvaüena predmetnim pronalaskom ukljuþuju CD proteine kao što su CD3, C D4, CD8, CD19, CD20, CD34, i CD46; þlanove familije ErbB receptora kao što su EGF receptor, HER2, HER3 ili HER4 receptor; üelijske adhezione molekule kao što su LFA-1, Macl, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, a lfa4/beta7 integrin, i alfa v/beta3 integrin ukljuþujuüi njihove alfa ili bet a podjedinice (npr. anti-CD 11a, anti-CD 18 ili anti-CD 1 1b an titela); faktore rast a kao VE GF; t kivni fa ktor (T F); T GF-ȕ; a lfa interferon (alfa-IFN); interleukin, kao IL-8; IgE; a ntigene krvnih grupa Apo2, receptor smrti; flk2/flt3 receptor; receptor gojaznosti ( OB); mpl r eceptor; CTLA-4; protein C itd. Najpoželjniji ciljevi ovde su I GF-IR, CanAg, EGF-R, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF , CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD4 0, CD44, CD56, CD138, CA6, Her2/neu, CRIPTO (protein ko ji se pro izvodi n a po višenom ni vou u veüini üelija humanog kanc era dojke), alfa v/beta3 integrin, alfa v/beta5 integrin, TGF- ȕ, CD11a, CD18, Apo2 i C24.
[0072] Tehnike monoklonskih antitela omoguüavaju proizvodnju specifiþnih sredstava koja se vezuju za üeliju u vidu monoklonskih a ntitela. U st ruci su po sebno dobro poznate tehni ke kreiranja monoklonskih antitela proizvedenih imunizovanjem miše va, pacova, hrþaka ili nekog drugog sisara antigenima od interesa kao što su intaktna ciljna üelija, antigeni izolovani iz ciljne üelije, ce li virus, at enuisani celi virus, i virusni proteini kao što su p roteini omotaþa virusa. Senzitizovane humane üelije t akoÿe mogu da se ko riste. Drugi metod krei ranja monoklonskih a ntitela je upot reba fagnih biblioteka sFv ( jednolanþani varijabilni reg ion), posebno humanih sFv (vidi, npr., Griffiths et al, U.S. patent br. 5,885,793; McCafferty et al, WO 92/01047; Liming et al, WO 99/06587.)
[0073] Izbor o dgovarajuüeg sredstva koje se vezuje za üeliju zavisi od odreÿene populacije üelija koju treba ciljati, ali uopšteno, poželjna su monoklonska antitela i njihovi fragmenti koji se preferencijalno vezuju za ciljnu üeliju, ako su na raspolaganju odgovarajuüi.
[0074] Na primer, monoklonsko antitelo My9 je mišje IgG2aantitelo specifiþno za CD33 antigen k oji s e nalazi na üelijama akutne mijeloidne leukemije (acute mye loid leukemia, AML) (Roy et al . Blood 77:2404 -2412 (1991)) i m ože se koris titi za leþenje o bolelih od AML. Sliþno tome, monoklonsko antitelo anti-B4 je mišji I gG1, koji se vezuje za CD 19 antigen na B üelijama (Nadler et al, J. Immunol.131:244-250 (1983)) i može se kor istiti ako su ciljne üelije B üelije ili obolele üelije koje eksprimiraju ovaj antigen, kao što je sluþaj u ne-Hodgkinovom l imfomu ili hro niþnoj l imfoblastnoj leukemiji. S liþno tome, ant itelo N901 j e mišje m onoklonsko I gG1antitelo koje se vezuje za CD56 koji se nalazi na üelijama sitnoüelijskog karcinoma pluüa i na üelijama drugih tumora neuroendokrinog porekla (Roy et al. J. Nat. Can cer Inst. 88:1136-1145 (1996)), h uC242 a ntitelo koje se vezu je za CanAg antigen, trastuzumab ko ji se vezuje za HER2/neu, i anti-EGF recept orsko antitelo koje s e vezuje za EGF receptor.
METODI PREýIŠûAVANJA
[0075] Konjugat, tj., konaþni proizvod predmetnog pronalaska preþišüava se da bi se uk lonili svi neodreagovali ili ne konjugovani efektorski ili reporter ski molekuli, ili ne odreagovali ili nekonjugovani hidrolizovani povezivaþ. Metodi preþišüavanja mogu biti filtracija sa tangencijalnim protokom (tangential flow filtration, TFF, poznata i kao filtracija sa unakrsnim protokom, ultrafiltracija, ili dijafiltracija), gel filtracija, adsorptivna hromatografija, selektivna precipitacija, ili njihova kombinacija. Metodi adsorptivne hromatografije ukljuþuju jonoizmenjivaþku hromatografiju, hromatografiju na hidroksiapatitu, hromatografiju hidrofobnih interakcija (hydrophobic interaction chromatography, HIC), hromatografiju sa hidrofobnom indukcijom naelektrisanja (hydrophobic charge induction chromatography, HCIC), jonoizmenjivaþku hro matografiju mešovitog modaliteta, afinitetnu hromatografiju sa imobilisanim jonom metala (immobilized metal affinity chromatography, IMAC), hromatografiju sa bojom kao ligandom, afinitetnu hromatografiju, i reverzno-faznu hromatografiju. Na primer, k onjugat Ab-(X'-L-Y'-C)mopisan u formuli 2 preþišüava se iz neodreagovalog C ili neodreagovalog/hidrolizovanog povezivaþa X-L-Y ili X-L-Y'-C. Sliþno
1
tome, preþišüavaju se konjugati opisani u formulama 4, 6, i 9. Ovakvi metodi preþišüavanja poznati su struþnjaku u oblasti i mogu se naüi, na primer, u US publikaciji br.2007/0048314.
NEŽELJENI HIDROLIZOVANI POVEZIVAýI ILI UNAKRSNO POVEZIVANJE PROTEINA U KONJUGATIMA
[0076] Tradicionalni metodi ko njugacije u kojima se koristi po þetna reakcija proteina sa heterobifunkcionalnim povezivaþem sa reaktivnom maleimidnom ili haloacetamidnom reziduom im aju dva glavna nedostatka: (i) proizvod konjugacije se može sastojati od hidrolizovanog povezivaþa, zbog inaktivacije u antitelu ugraÿenog povezivaþa vodom, pre reakcije sa efekt orskim ili repo rterskim molekulom; i ( ii) meÿu- ili unut arlanþano unakrsno povezivanje ko njugata, zbog reakcij e maleimidne (ili hal oacetamidne) grupe sa nat ivnim histidinskim, lizinskim, tirozinskim, ili cisteinskim reziduama u proteinu ili peptidu (A. Papini et al., Int. J. Pept. Prot ein Res., 1992, 39, 348- 355; T. Ueda et al., Biochemistry, 1985, 24, 6316-6322). Takvo meÿulanþano unakrsno povezivanje u antitelu bi za rezultat imalo razliþite nereducibilne kovalentne veze i zmeÿu teških i lakih lanaca, ili izmeÿu dva teška lanca, što b i se u analizi redukujuüom SDS-PAGE videlo kao trake veüe molekulske težine od one koja se Rþekuje za t rake lakih i teških lanaca. Takve meÿulanþane ili unutarlanþane unakrsne veze u antitelu videle bi se i na MS kao pikovi aberantnih masa razliþitih od oþekivanih masa antitela sa vezanim repo rterskim i li efekt orskim grupa ma. Za razliku od t radicionalnih metoda konjugacije, metod opisan u ovoj prijavi za rezultat ima konjugate sa visokom homogenošüu, bez bitnih meÿulanþanih unakrsnih veza ili hidrolizovanog povezivaþa.
PRIMERI
[0077] Primeri ko ji s lede, dati su samo radi ilu stracije i n ije im c ilj d a ograniþe predmetni pronalazak.
Primer 1. Konjugacija antitela sa citotoksiþim sredstvom DM1/DM4 korišüenjem heterobifunkcionalnog povezivaþa maleimid-PEGn-NHS ovim metodom (Slika 1) u poreÿenju sa tradicionalnim metodom u dva koraka.
[0078] Stok rastvori DM1 [N<2'>-deacetil-N<2'>-(3-merkapto-1-oksopropil)-majtanzin], ili DM4 [N<2'>-deacetil-N<2'>-(4-merkapto-4-metil-1-oksopentil)majtanzin] ( DMx) t iola i ma leimid-PEGn-NHS bifunkcionalnog povezivaþa napravljeni su u N,N-dimetilacetamidu (N,N-dimethylacetamide, DMA) u k oncentraciji od 30-60 m M. Povezivaþ i DMx t iol pomešaju se
2
jedan sa drugim u DMA ko ji sadrži do 50% v/v 200 m M sukcinatnog pufera, 2 mM EDTA, pH 5.0, da se dobije molarni odnos DMx prema povezivaþu od 1.6:1 i konaþna koncentracija DMx jednaka 15 mM. Posle mešanja, reakciona mešavina se o stavi 1-4 h, a zatim se alikvot reakcione mešavine razblaž i 10 put a i meri se njego va apsor banca na 302-320 nm da bi se odredilo prisustvo preostalog neodreagovalog maleimida, uz korišüenje ekstinkcionog koeficijenta ( ε) maleimida na 302 nm = 620 M<-1>cm<-1>, i ε320 nm ~450 M<-1>cm<-1>. (Dodatna reverzno-fazna HPLC analiza zamrznutog alikvota reakcione mešavine izvedena je kasnije uz praüenje ap sorbance na 302 nm i 252 nm da bi se pot vrdio potpuni gubitak maleimida povezivaþa i formiranje željenog reagensa povezivaþ-DMx u vreme dodavanja reakc ione mešavine ant itelu). Kada se po moüu UV ut vrdi da vi še nema pr isutnog maleimida, alikvot reakcione mešavine se bez preþišüavanja doda u rastvor antitela u fosfatnom puferu (pH 7.5), pod konaþnim uslovima konjugacije od 4 mg/ml Ab, 90% fosfatni pufer/10% DMA, pH 7.5. Reakcija ko njugacije s e o stavi da se o dvija na ambijentalnoj temperaturi, 2 h. Ab-DMx konjugat se preþisti iz viška DMx sa malim molekulom i povezivaþkih reaktanata korišüenjem G25 gel fil tracione kolone ekvilibrisane u fosfatnom puferu na pH 7.5, ili korišüenjem filtracije sa t angencijalnim protokom (TFF). Konjugaciona mešavina s e zat im drži na 4 °C tokom 2 da na, u pu feru na pH 7.5, da se o moguüi disocijacija DM x vrsta prikaþenih z a antitelo nekovalentnim vezama ili labilnim vezama. Konjugat se zatim dijalizira preko noüi, u puferu histidin/glicin na pH 5.5 i z atim fil trira kro z 0.22 µm fi lter da bi s e ko naþno uskladištio. Broj DMx molekula po molekulu Ab (pro sek) u kona þnom konjugatu meri se odreÿivanjem apsorbance konjugat a na 252 i 280 nm i uz ko rišüenje po znatih ekstinkcionih koeficijenata za DMx i antitelo na tim dvema talasnim dužinama.
[0079] Nekoliko razliþitih reakcionih uslova upotrebljeno je za poþetnu reakciju DMx tiola sa heterobifunkcionalnim ma leimid-PEG4-NHS reagensom: 50% DMA/50% vodeni 200 mM sukcinatni pufer pH 5.0, 2 mM EDTA (v/v); ili 60% DMA/40% 200 mM sukcinatni pufer pH 5.0, 2 m M EDT A (v /v); ili 100% DM A s a 1.5 molarnih ekvivalena ta o rganske b aze (na primer N,N'-diizopropil et ilamin ( N,N'-diisopropyl e thylamine), DIPEA, ili 4- metilmorfolin) po molu DM4 tiola.
[0080] U jednoj s eriji e ksperimenata, molarni e kvivalent DMx prema maleimid-PEG4-NHS povezivaþu (kupljeno od Pierce Endogen) variran je od 1.2 do 2.4, i reakciono vreme je bilo 30 min. Broj DMx/Ab meren pos le pre þišüavanja ko njugata, meren je ka o funkcija do datih ekvivalenata DMx po povezivaþu. Uslovi od 1.2 do 2.0 ekviv alenta DM1/povezivaþu dali su konjugate sa s liþnim sadržajem DMx/Ab, što je ukaza lo da neželjena reakc ija DMx tiola na NHS est arskoj strani povezivaþa ne pr edstavlja zna þajan pro blem. Koliþina u nakrsnih veza prisutnih u konaþnim konjugatima takoÿe je bila analizirana redukujuüom SDS PAGE, koja je pokazala da prisustvo unakrsno povezanih kontaminanata znaþajno opada sa poveüanjem odnosa DM1/povezivaþ.
[0081] Jedan o pcioni kor ak gašenja korišüenjem malei midnog ili haloacetamidnog reagensa (kao što su maleimidobuterna kiselina, ili maleimidopropionska kiselina, ili N-etilmaleimid, ili jodoacetamid, ili jodosirüetna k iselina) uveden je posle završetka poþetne reakc ije DMx i heterobifunkcionalnog povezivaþa (pre dodavanja r eakcione mešavine antitelu) da bi s e ugasio višak DMx tiol grupe, kako bi se spreþila neželjena reakcija DMx tiola sa antitelom.
[0082] Alternativni metod reakcije antitela sa nepreþišüenom poþetnom reakcionom mešavinom DMx i heterobifunkcionalnog povezivaþa ukljuþila je mešanje poþetne reakcione mešavine DMx i heterobifunkcionalnog po vezivaþa (po sle završetka r eakcije DMxpovezivaþ) sa a ntitelom na niskom pH ( pH ~5) , pra üeno dodavanjem pufera ili baze da se poveüa pH do 6.5-8.5 za rekciju konjugacije.
[0083] Antitelo-PEG4-Mal-DM1 ili DM4 konjugat napravljen je tradicionalnim metodom konjugacije u dva koraka, r adi uporeÿivanja sa metodom konj ugacije opisanim u ovom pronalasku. Humanizovano antitelo u koncentraciji od 8 mg/ml u fosfatnom puferu na pH 7.5 (50 mM ka lijum f osfat, 50 m M natr ijum hl orid, 2 mM E DTA, pH 7.5) i 5% DMA modifikovano je viškom heterobifunkcionalnog maleimid-PEG4-NHS povezivaþkog reagensa (nabavljen o d P ierce Endogen). Posle 2 h na 25°C, modifikovano antitelo preþišüeno je na gelu G25 hromatografijom da bi se uk lonio višak neodreagovalog, neugraÿenog povezivaþa. Dobitak preþišüenog Ab odreÿen je UV aps orbancom na 280 nm . Bro j vezanih maleimidnih grupa u m odifikovanom Ab odr eÿen je korišüenjem malog a likvota modifikovanog antitela, dodavanjem poznate koliþine tiola (kao što je 2-merkaptoetanol), dodatog u višku u odnosu na maleimid, da bi reago vao sa maleimidnim rez iduama u modifikovanom antitelu, i zatim testiranjem p reostalog tiola Ellmanovim t estom uz korišüenje DTNB reagensa (ekstinkcioni koeficijent TNB tiolata na 412 nm= 14150 M<-1>cm<-1>; Riddles, P. W. et al., Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). Konjugacija modifikovanog Ab sa DM1 ili DM4 tiolom obavljena je pri koncentraciji Ab od 2.5 mg/ml, u reakcionoj mešavini koja se sastojala od 95% fosfatnog pufera, pH 7.5 (50 mM kalijum fosfat, 50 mM natr ijum hlorid, 2 mM EDTA, pH 7.5) i 5% DMA. Višak 1.7 molarnih ekvivalenata DM1 ili DM4 tiola dodat je po molu vezanog maleimida na Ab. Posle reakcije preko noüi na 25°C, ko njugat je st erilno filtriran kori šüenjem 0.22 µm f iltera i preþišüen na gel u iz viška
4
neodreagovalog DM1 ili DM4 korišüenjem G25 ko lone ekvilibrisane u fosfatnom puferu na pH 7.5 (50 m M ka lijum fosfat, 50 mM natrijum hlorid, 2 mM EDTA, pH 7. 5). Pr eþišüeni konjugat je držan n a 4°C, 2 dana , u fosfatnom puferu na pH 7.5 (50 mM kalijum fosfat, 50 mM natrijum hlorid, 2 mM EDTA, pH 7. 5) da bi se o moguüila d isocijacija DM1 il i DM4 vrsta prikaþenih za antitelo nekovalentnim ili labilnim vezama. Konjugat je zatim dijaliziran 2 dana u puferu histidin/glicin, pH 5.5 (130 m M glicin/10 mM his tidin, pH 5.5) i sterilno filtriran ko rišüenjem 0.22 µm fil tera. Broj DM1 ili DM4 molekula po Ab molekulu u konaþnom konjuga tu meren je odreÿivanjem apsorbance ko njugata na 252 i 280 nm korišüenjem poznatih ekstinkcionih koeficijenata za DM1/DM4 i Ab na ovim dvema talasnim dužinama.
[0084] Redukujuüa SDS PAGE obavlja se na uzorcima konjugata i a ntitela korišüenjem NuPage elektroforetskog sistema sa 4-12% Bis Tris Gel (Invitrogen). Toplotom denaturisani i redukovni uzorci n aneti su u koliþini o d 10 µg/liniji. Redukujuüa SDS-PAGE konjugata pripremljenih korišüenjem metoda opisanog u ovom pronalasku pokazala je samo oþekivane trake teškog i l akog l anca ( 50 kDa odnosno 25 kDa) kao g lavne t rake (Sli ka 2) . Nasupr ot tome, konjugati pripremljeni tradicionalnim metodom konjugacije u dva ko raka pokazal i su neželjene t rake unakrsno povezanih vrsta sa molekulskim težinama o d 75, 100, 125, i 150 kDa, koje v erovatno o dgovaraju meÿulanþanim unakrsno povezanim v rstama HL, H2, H2L, odnosno H2L2(Slika 2).
[0085] Analiza Protein LabChip elektroforezom (pod redukujuüim uslovima) konjugata antitelo-PEG4-Mal-DM4 pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku po kazala je Rþekivane trake za teški i laki l anac sa pro centom od 58 i 30% (od ukupnog proteina), što je sliþno onima za nekonjugovano antitelo od 65, o dnosno 30% (Sli ka 3). Nasuprot to me, konjugat pripremljen korišüenjem tradicionalnog metoda konjugacije u dva koraka pokazao je trake teških i lakih l anaca od sa mo 16 o dnosno 8%, i glavne t rake viših molekulskih težina opsega od 94 do 169 kDa, verovatno zbog meÿulanþanog unakrsnog povezivanja. Na osnovu kvantitativne Protein LabChip analize, konjugat pripremljen metodom opisanim u ovoj prijavi je izrazito superioran u o dnosu na o naj koji j e pripremljen ko rišüenjem ko nvencionalnog procesa u dva koraka (Slika 3).
[0086] MS analiza konjugata pr ipremljenih metodom opisanim u o vom pronalasku pokazala je razdvojene pikove konjugata DMx-antitelo za antitelo koje sadrži rast uüe brojeve majtanzinoidnih molekula po molekulu antitela (Slika 4). Nasuprot tome, MS konjugata dobijenih korišüenjem tradicionalnog metoda u 2 koraka bila je gotovo bez razdvajanja, što je ukazivalo na ne homogenost pr eparata kon jugata, verovatno zbog unakrsnog po vezivanja ili inaktiviranog maleimidnog povezivaþa. Na o snovu MS, prema tome, konjugat pripremljen korišüenjem metoda opi sanog u ovom pronalsku superioran je u odnosu na o naj koji je sintetisan tradicionalnim metodom u dva koraka.
[0087] Vezivanje anti-CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1 konjugata pripremljenog metodom opisanim u o vom pronalasku m ereno je proto þnom citometrijom, uz k orišüenje an tigeneksprimirajuüih COLO205 üelija, i naÿeno je da je sliþno vezivanju nekonjugovanog antitela, što ukazuje na to da konjugacija nije št etno delovala na vezivanje a ntitela (Slika 5). Citotoksiþna aktivn ost an ti-CanAg Ab -PEG4-Mal-DM1konjugata pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku merena je in vi tro korišüenjem COLO205 üelija kancera kolona koje eksprimiraju CanAg antigen (Slika 6). Antigen-eksprimirajuüe kancerske üelije zasejane su u ko ncentraciji od oko 1000 üelija/bunarþLüu, na p loþi sa 96 bunarþLüa, u m edijumu z a kulturu üelija, koji sadrži fet alni go veÿi serum i iz lagane s u r azliþitim ko ncentracijama A b-DMx ko njugata. Posl e 5 dana i zlaganja ko njugatu, merene su vij abilne üelije pr eostale u svakom bunarþLüu, uz korišüenje WST-8 t esta (Do jindo Molecular Technologies). Kako je pokazano na Slici 6, anti-CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1 konjugat pripremljen korišüenjem ovog metoda bio je, pri niskim koncentr acijama, vis oko potentan prema CanA g an tigeneksprimirajuüim COLO205 üelijama ka ncera ko lona. C itotoksiþnost anti -CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1 konjugata pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku bila je specifiþna za COLO205 üelije, jer je mogla da se blokira dodavanjem nekonjugovanog antitela u višku.
Primer 2. Konjugacija antitela sa DM1/DM4 ovim metodom, uz korišüenje maleimid-Sulfo-NHS povezivaþa (Slika 7), u poreÿenju sa tradicionalnim sekvencijalnim metodom u dva koraka.
[0088] Stok rastvori DMx tiola i maleimid-Sulfo-NHS heterobifunkcionalnog povezivaþa napravljeni su u N,N-dimetilacetamidu (DMA), u k oncentraciji od 30-60 mM. Povezivaþ i DMx tiol se pomešaju jedan sa drugim u DMA koji sadrži do 40% v/v 200 mM sukcinatnog pufera, 2 mM EDTA, pH 5. 0, da se dobije odnos DMx prema povezivaþu o d 1.6 i konaþna koncentracija DMx jednaka 15 m M. Posle mešanja, reakcija se ostavi 1-4 h i zatim se alikvot reakcione mešavine razblaži 10 puta da bi se izmerila apsorbanca na 302-320 nm i procenio završetak reakcije i odsustvo maleimida. (Dodatna reverzno-fazna HPLC analiza zamrznutog alikvota reakcione mešavine izvedena je kasnije uz praüenje apsorbance na 302 nm i 252 nm da bi se pot vrdio potpuni gubitak maleimida po vezivaþa i f ormiranje željenog reagensa povezivaþ-DMx u vreme dodavanja r eakcione mešavine antitelu). Kada je pomoüu UV utvrÿeno da više nema prisutnog maleimida, alikvot reakcione mešavine se d oda, bez preþišüavanja, u rastvor antitela u fosfatnom puf eru (pH 7.5) pod konaþnim uslovima konjugacije od 4 mg/ml Ab, 90% f osfatni pufer/10% DMA, pH 7.5. Ostavi se da s e reakcija konjugacije odv ija na a mbijentalnoj temperaturi, 2 h. Ab -DMx konjugat se pre þisti iz viška neodreagovalog DMx i neko njugovanih povezivaþkih proizvoda korišüenjem G25 gel filtracione ko lone ekvilib risane u fosfatnom puferu na pH 7.5, il i ko rišüenjem fil tracije s a tangencijalnim protokom. Konjugat se drži na 4 °C, 2 dana, u puferu na pH 7.5 da se omoguüi disocijacija DMx vrsta pr ikaþenih za a ntitelo nekovalentno ili labilnim v ezama. Konjugat se zatim dijalizira preko noüi u puferu histidin/glicin na pH 5.5 i zatim filtrira kroz 0.22 µm filter za konaþno skladištenje. Broj DMx molekula po molekulu Ab (prosek) u konaþnom konjugatu meren je odreÿivanjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm i kor išüenjem poznatih ekstinkcionih koeficijenata za DMx i antitelo na ovim dvema talasnim dužinama.
[0089] Za poreÿenje, Ab-Sulfo-Mal-DMx konjugati pripremljeni su korišüenjem tradicionalnog metoda konjugacije u 2 koraka. Antitelo (Ab) u koncentraciji od 8 mg/ml u pH 7.5 fosfatnom puferu/5% DMA puferu modifikuje se bi funkcionalnim maleimid-Sulfo-NHS povezivaþem u višku. Reakcija se ost avi da se odvija na 20°C, 2 h i zatim se modifikovano Ab pre þisti od vi ška neo dreagovalog povezivaþa korišüenjem G25 hromatografije. Dobitak preþišüenog Ab odreÿuje se UV apsorbancom na 280 nm. Broj vezanih maleimidnih grupa u modifikovanom Ab odreÿuje se korišüenjem malog alikvota modifikovanog antitela, dodavanjem poznate koliþine tiola (kao što je 2-merkaptoetanol), dodatog u višku u odnosu na maleimid, da reaguje sa maleimidnim reziduama u modifikovanom antitelu i zatim testiranjem preostalog t iola E llmanovim testom, uz kor išüenje DT NB reagensa (ekstinkcioni koeficijent TNB tiolata na 412 nm= 14150 M<-1>cm<-1>; Riddles, P. W. et al., Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). Konjugacija modifikovanog Ab sa DMx o bavljena je pr i koncentraciji ant itela o d 2.5 mg/ml u reakcionoj m ešavini ko ja s e sastojala od 95% pH 7.5 fosfatnog pufera/5% DMA (v/v), sa 1.7 molarnih ekvivalenata DMx tiola do datog po m olu maleimida vezanog na Ab. Reakcija se ost avi 8-24 h na 18°C i konjugat se izdvoji iz v iška neodreagovalog DMx po moüu hromatografije za snovane na veliþini þestica. Posle preþišüavanja, konjugat se drž i na 4°C, 2 d ana, u fosfatnom puferu na pH 7.5 da se omoguüi disocijacija DMx vrsta prikaþenih za antitelo nekovalentno ili labilnim vezama. Konjugat se zatim dijalizira preko noüi u puferu histidin/glicin pH 5.5 i zatim sterilno filtrira korišüenjem 0.22 µm fil tera za ko naþno skladištenje. Bro j DMx molekula po Ab molekulu u ko naþnom konjugatu meren je odre ÿivanjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm i kor išüenjem poznat ih eks tinkcionih ko eficijenata za DM x i a ntitelo na o vim d vema talasnim dužinama.
[0090] Redukujuüa SDS PAGE obavlja se korišüenjem uzoraka konjugata i a ntitela (10 µg/liniji) ko rišüenjem NuPage e lektroforetskog s istema sa 4- 12% Bis Tr is Ge l i NuPAGE MOPS SDS r adnog pufera (S lika 8). Trake na gelu sa m olekulskim tež inama 75, 125, i 150 kDa u kazivale s u na meÿulanþane u nakrsno povezane vr ste ( HL, H2L i H2L2respektivno). Poreÿenje Ab-Sulfo-Mal-DM1 konjugata sa ~4 DM1/Ab (linija 3, o vim metodom, i linija 2, tradicionalnim metodom konjugacije u 2 koraka, respektivno) i ~6 DM1/ Ab (linija 5, ovim metodom, i l inija 4, t radicionalnim me todom konjugacije u 2 koraka, r espektivno) jasno pokazuje da konjugati napravljeni metodom opisanim u ovom pronalasku (linije 3 i 5) imaju mnogo manju pro porciju u nakrsno povezanih vrsta velike molekulske t ežine nego konjugati napravljeni tradicionalnim metodom u 2 koraka (linije 2 i 4).
[0091] ] Analiza Protein LabChip elektroforezom (pod redukujuüim uslovima) antitelo-Sulfo-Mal-DM1 konjugata pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku pokazala je glavne trake teškog i l akog lanca sa pro centima o d 70 i 28% ( od ukupnog protein a), što je s liþno onima za nekonjugovano antitelo od 70, o dnosno 30% (Sli ka 9) . Nasuprot to me, konjugat pripremljen korišüenjem tradicionalnog metoda u dva koraka pokazao je teške i lake t rake od samo 53 odnosn o 23%, i gl avne t rake ve üih m olekulskih t ežina u opsegu od 99-152 kDa verovatno zbog meÿulanþanog unakrsnog povezivanja. Na osnovu kvantitativne Protein LabChip analize, konjugat pripremljen metodom opisanim u ovoj patentnoj prijavi mnogo je superiorniji u s mislu izostanka m eÿulanþanih unakrsnih v eza u por eÿenju sa o nim koji j e pripremljen korišüenjem tradicionalnog procesa u dva koraka (Slika 9).
[0092] Ab-Sulfo-mal-DM1 konjugati sa sliþnim sadržajem leka, napravljeni metodom opisanim u ovom pronalasku i tradicionalnim metodom u dva koraka uporeÿivani su analizom LC zasnovanom na veliþini þestica/MS (Slika 10). Konjugati napravljeni metodom opisanim u ovom pronalasku pokazu ju že ljeni MS spektar koji sadrži samo oþekivanu raspodelu p ikova sa masom jednakom Ab-(povezivaþ-DMx)n. U sluþaju konjugata napravljenih t radicionalnim metodom u dva koraka, svi glavni pikovi u spektrima su sadržali jedan ili više hidrolizovanih ili unakrsno povezanih f ragmenata p ovezivaþa, po red žel jenih A b-(povezivaþ-DMx)nkomponenti. Pretpostavljeni mehanizam meÿulanþanog unakrsnog povezivanja ili inaktivacije maleimida vodo m u tradicionalnoj sekvencijalnoj reakciji u 2 kor aka prikazan je na Slici 17, gde ugraÿena maleimidna (ili haloacetamidna) rezidua iz poþetne reakcije antitela sa heterobifunkcionalnim povezivaþem može da reaguje sa unutarmolekulskim (ili meÿumolekulskim) histidinskim, lizinskim, tirozinskim ili cisteinskim reziduama, što rezultuje meÿulanþanim u nakrsnim p ovezivanjem, ili inicijalno ugraÿena maleimidna (ili haloacetamidna) rezidua može da se inaktivira (na primer hidrolizom maleimidnog prstena ili adicijom vode na ma leimid) i tako postane nedo stupna z a brzu r eakciju s a efektorskom ili reporterskom grupom koja sadrž i tiol. Prema tome, LC-MS anali za jasno pokazuje da metod opisan u ovom pronalasku ima prednost proizvodnje homogenog konjugata uz malo ili nimalo hidrolizovanih ili unakrsno povezanih fragmenata povezivaþa vezanih za antitelo.
[0093] Vezivanje anti-CanAg Ab-Sulfo-Mal-DM1 konjugata sa 5.6 majtanzinoida po molekulu ant itela (proseþno), pripremljenog metodom opisanim u o vom pronalasku, mereno je protoþnom citometrijom, uz korišüenje ant igen-eksprimirajuüih COLO205 üelija, i naÿeno je da je sliþno vezivanju nekonjugovanog antitela, što ukazuje na to da konjugacija nije uticala na vezivanje antitela za ciljni antigen (Slika 11). Citotoksiþna aktivnost anti-CanAg Ab-Sulfo-Mal-DM1 konjugata pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku merena je in vitro korišüenjem COLO205 üelija kancera kolona koje ekspr imiraju CanAg an tigen (Sli ka 12) . Antigen-eksprimirajuüe kancerske üelije zasejane su pri gustini od oko 1000 üelija/bunarþLüu, na p loþi s a 96 b unarþLüa, u medijumu za ku lturu üelija ko ji sadrž i f etalni goveÿi s erum i izlagane su raz liþitim koncentracijama Ab-DMx konjugata. Posle 5 dana izlaganja konjugatu, merene su vijabi lne üelije korišüenjem WST-8 testa (Dojindo Molecular Technologies). Kako je po kazano na Slici 12, anti-CanAg Ab-Su lfo-Mal-DM1 ko njugat pripremljen ko rišüenjem ovog m etoda bi o je, pr i niskim koncentracijama, vis oko potentan prema CanAg an tigeneksprimirajuüim COLO205 üelijama kancera kolona. Citotoksiþnost ovog konjugata bil a je specifiþna, jer je mogla da se blokira kompeticijom sa nekonjugovanim antitelom u višku.
[0094] Alternativni metod konjugacije korišüenjem metoda opisanog u ovom pronalasku ukljuþivao je korak gašenja korišüenjem maleimidnih ili h aloacetamidnih reagenasa (kao što su 4-maleimidobuterna kiselina, ili 3- maleimidopropionska kiselina, ili N-etilmaleimid, ili jodoacetamid, ili jodosirüetna kiselina) posle završetka poþetne reakcije DMx i heterobifunkcionalnog povezivaþa (pre dodavanja r eakcione mešavine antitelu) da bi s e ugasio višak DMx tiolnih grupa, u cilju spre þavanja neželjenih reakc ija D Mx tiola sa antitelom. U specifiþnom primeru, posle završetka poþetne reakcije DMx i heterobifunkcionalnog po vezivaþa (pr e do davanja reakc ione mešavine antitelu), doda se 4-maleimidobuterna k iselina da bi se ugasio višak DMx ti olnih grupa sa c iljem spreþavanja neželjenih reakcija DMx tiola sa antitelom tokom reakcije konjugacije. U reakcionu mešavinu DM4 i Sulfo-Mal-NHS heterobifunkcionalnog reagensa koji je sa držao višak DM4 (3 mM), posle završetka željenog kuplovanja DM4 tiola sa maleimidnom grupom heterobifunkcionalnog reage nsa, u reakci onu m ešavinu s e doda dvost ruki m olarni viš ak 4-maleimidobuterne k iseline ( 6 mM), na a mbijentalnoj temperaturi, tokom 20 mi nuta, da se ugasi preo stali DM4 iz po þetne kup lujuüe r eakcije. Bez pr eþišüavanja reakc ione mešavine, alikvot se meša sa rastvorom antitela u fosfatnom puferu (pH 7.5) pod konaþnim uslovima konjugacije od 4 mg/ml Ab, 90% vodeni fosfatni pufer/10%DM A, pH 7.5. Reakcija konjugacije se ostavi da se odvija na ambijentalnoj temperaturi 2 h. Antitelo-DM4 konjugat se preþisti i z viška DM4 malog molekula i povezivaþkog reaktanta k orišüenjem G25 gel filtracione ko lone ek vilibrisane u fosfatnom puferu, na pH 7.5. Konjugaciona mešavina se dalje drž i n a 4 °C, 2 dana, u puf eru na pH 7.5, da s e o moguüi disocijacija DM x vrsta prikaþenih za antitelo nekovalentno ili labilnim vezama. Konjugat se zatim d ijalizira preko noüi u pH 5.5 histidin/glicin pu feru i fi ltrira kr oz 0.22 µm f ilter za ko naþno skladištenje. Proseþan broj DM4 molekula po Ab molekulu u ko naþnom konjugatu meri se odreÿivanjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm i korišüenjem poznatih ekstinkcionih koeficijenata za DM4 i antitelo na ovim dvema talasnim dužinama. Uzorci konjugata analizirani su neredukujuüom SDS PAGE uz korišüenje NuPage elektroforetskog sistema sa 4-12% Bis Tris Gel ( Invitrogen). Toplotom denatur isani uzo rci naneti su u koliþini o d 10 µg/liniji. Neredukujuüa SDS-PAGE konjugata pripremljenog korišüenjem metoda o pisanog u ovom pronalasku ( bez gaše nja) po kazala je t raku lakog lanca (~25 kDa) i traku polovine a ntitela (teški-laki lanac; ~75 kDa) (Slika 18). Sa druge st rane, konjugat pripremljen ko rišüenjem metoda opisanog u ovom pronalasku, tretiran 4-maleimidobuternom kiselinom (da se poklopi višak DMx tiola) imao je znaþajno manje koliþine ovih neželjenih traka (u nivoima uporedivim sa uzorkom n emodifikovanog antitela). Još jedna prednost gašenja poþetne reakcione mešavine DM x i h eterobifunkcionalnog reagensa ( pre konjugacije sa ant itelom) reagensima ko ji i naktiviraju tiol, kao što je 4- maleimidobuterna k iselina, je t a š to tokom reakcije ko njugacije an titela nema "s lobodnih" DMx (DM1 ili DM4) vrsta i pre ma t ome konaþni konjugat posle pr eþišüavanja ne sadrži "slobodne" ili n ekonjugovane DMx vrste. DMx-adukt sa 4-maleimidobuternom kiselinom (ili drugim polarnim tiol-gaseüim reagensima) rastvorljiviji je u vodi o d DMx i p rema tome može lakše da se izdvoji iz kovalentno povezanog konjugata antitelo-DMx.
Primer 3. Konjugacija antitela sa majtanzinoidom (DM1/DM4) uz korišüenje sulfo-NHS-SMCC povezivaþa (Slika 13).
4
[0095] Stok rastvori DM1 ili DM4 tiola (DMx) i sulfo-SMCC heterobifunkcionalnog povezivaþa sa sulfo-NHS grupom (nabavljeno od Pierce Endogen; Slika 13) pripremljeni su u DMA u koncentracijama od 30-60 mM. Povezivaþ i DM1 ili DM4 tiol pomešani su jedan sa drugim u DMA koji s adrži do 40% v/v vodenog 200 mM sukcinatnog pufera, 2 mM EDTA, pH 5.0 da se do bije o dnos DM1 ili DM4 (D Mx) pr ema po vezivaþu o d 1.6:1 i konaþna koncentracija DMx od 6 mM. Posle mešanja, reakcija se ostavi 1-4 h na ambijentalnoj temperaturi i zatim se a likvot reakcione mešavine razblaži 10 puta da bi se izmerila apsorbanca na 302- 320 nm za procenjivanje da li je sa v malei mid o dreagovao. (Dodatna reverzno-fazna HP LC a naliza zamrznutog alikvota r eakcione mešavine izvodi se kas nije u z praüenje ap sorbance na 302 nm i 252 nm da bi se pot vrdio potpuni gubitak maleimida povezivaþa i formiranje željenog sulfo-NHS-povezivaþ-Mal-DMx reagensa u vreme dodavanja reakc ione mešavine a ntitelu). Kada se pomoüu UV ut vrdi da maleimid vi še nije prisutan, alikvot reakcione mešavine se doda u vodeni rastvor antitela u fosfatnom puferu (pH 7.5) pod konaþnim uslovima ko njugacije o d 4 mg/ml Ab, 90% fosfatni pufer (vodeni)/10% DMA (v/v), pH 7.5. Pusti se da se reakcija konjugacije odvija na ambijentalnoj temperaturi, 2 h. Ab-DMx konjugat se preþisti iz viška neodreagovalog reagensa i viš ka DMx uz korišüenje G25 gel filtracione kolone ekvilibrisane u fosfatnom puferu (vodenom) na pH 7.5. Konjugat se drži na 4°C, 2 dana, u puferu na pH 7.5 da se omoguüi disocijacija DMx vrsta prikaþenih za antitelo nekovalentno ili la bilnim ve zama. Konjugat se zatim d ijalizira preko noüi u puferu histidin/glicin na pH 5.5 i potom f iltrira kr oz 0.22 µm f ilter za kona þno skladištenje. Bro j DMx molekula po molekulu Ab u ko naþnom konjugatu m eri s e o dreÿivanjem aps orbance konjugata n a 252 i 280 nm i ko rišüenjem poznat ih e kstinkcionih ko eficijenata za DMx i antitelo na tim dvema talasnim dužinama.
[0096] Za poreÿenje, Ab-SMCC-DMx ko njugati pr ipremljeni su korišüenjem trad icionalnog metoda konj ugacije u 2 kor aka. An titelo (Ab) u ko ncentraciji od 8 mg/ml u 95% pH 6.5 fosfatnom p uferu/5% DMA puf eru modifikuje se uz višak bifunkcionalnog sulfo-SMCC povezivaþa sa sulfo-NHS grupom (nabavljeno od Pierce Endogen). Reakcija se ostavi da se odvija na 25°C, 2 h, i zatim se modifikovano Ab preþisti iz viška neodreagovalog povezivaþa korišüenjem G25 hro matografije. Dobitak preþišüenog Ab o dreÿuje se preko UV apsorbance na 280 nm . Broj vezanih maleimidnih grupa u modifikovanom Ab odreÿuje se k orišüenjem malog a likvota modifikovanog an titela, do davanjem poznate koli þine t iola (kao što j e 2-merkaptoetanol), dodatog u viš ku u odnosu na maleimid, da reaguje sa maleimidnim reziduama u modifikovanom antitelu i z atim testiranjem p reostalog tiola Ellmanovim t estom korišüenjem DTNB reagensa (ekstinkcioni koeficijent TNB tiolata na 412 nm= 14150 M<-1>cm<-1>; Riddles, P. W. et al., Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348- 351). Konjugacija modifikovanog Ab sa DM1 ili D M4 o bavljena je pri koncentraciji antitela o d 2.5 mg/ml u 95% pH 6.5 fosfatnom puferu/5% DMA (v/v), sa 1.7 molarnih e kvivalenata DM1 ili DM4 tiola dodatih po molu maleimida veza nog na Ab. Reakcija se ost avi 8-24 h na 18°C i konjugat se i zdvoji i z viška neodreago valog DM1 ( ili DM4) pomoüu G25 hro matografije. Posle preþišüavanja, konjugat se drži na 4 °C , 2 dana, u fosfatnom puferu na pH 6.5, da se omoguüi hi droliza DM1/D M4 vrsta vez anih slabim vezama. Konjugat se zatim dijalizira preko noüi u puferu histidin/glicin pH 5.5 i zatim filtrira korišüenjem 0. 22 µm fil tera za konaþno skladištenje. Broj DM 1/DM4 molekula po Ab molekulu u konaþnom konjugatu meri se odreÿivanjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm i kor išüenjem pozna tih eks tinkcionih ko eficijenata za DM1/DM4 i ant itelo na o vim dvema talasnim dužinama.
[0097] Redukujuüa S DS PAGE obavljena je na uzorcima ko njugata i antitela ( 10 µg/liniji) korišüenjem NuPage e lektroforetskog si stema ( Invitrogen) sa NuPage 4- 12% Bis Tr is M ini Gel i NuPAGE MOPS SDS radnog pufera (Slika 14). Trake na gelu sa molekulskim težinama od 75, 125, i 150 kDa ukazuju na m eÿulanþane unakrsno povezane vrste (HL, H2L, odnosno H2L2r). Uporeÿivanje Ab-SMCC-DM1 konjugata sa 3.1 D/Ab ( linija 4, ovim meto dom, i linija 3, t radicionalnim me todom u dva koraka, r espektivno) jasno pokazuje da konjugat napravljen metodom opisanim u o vom pronalasku (linija 4) ima mnogo manje u nakrsno povezanih vrsta velike molekulske težine nego konjugati napravljeni tradicionalnim metodom u 2 koraka (linija 3).
[0098] Analiza Protein LabChip elektroforezom (pod redukujuüim uslovima) antitelo-SMCC-DMl konjugata pripremljenog metodom opisanim u ovom pronalasku pokazala je glavne trake teškog i lakog lanca sa procentima od 67 i 30% (od ukupnog proteina), što je sliþno onima za nekonjugovano antitelo od 68, odnosno 30% (Slika 15). Nasuprot tome, konjugat pripremljen korišüenjem tr adicionalnog metoda u dv a kor aka pokazao je t eške i lake t rake od sam o 54 odnosno 24%, i glavne t rake veüih molekulskih t ežina u o psegu od 96-148 kDa, ve rovatno zbog meÿulanþanog unakrsnog povezivanja. Na osnovu kvantitativne Protein LabChip analize, konjugat pripremljen metodom o pisanim u ovoj pat entnoj prij avi mnogo je superiorniji u s mislu izostanka m eÿulanþanih unakrsnih v eza u por eÿenju sa o nim koji j e pripremljen korišüenjem tradicionalnog procesa u dva koraka (Slika 15).
[0099] Ab-SMCC-DM1 konjugati sa s liþnim sadržajem leka, napravljeni metodom opisanim u o vom pronalasku i tr adicionalnim meto dom u dva ko raka, uporeÿivani s u L C a nalizom zasnovanom na veliþini þestica/MS (Slika 16). K onjugat napravljen metodom opisanim u ovom pronalasku pokazuje žel jeni MS spektar koji sadrži samo oþekivanu raspodelu p ikova sa masom jednakom Ab-(povezivaþ-DMx)n. U sluþaju konjugata napravljenog tradicionalnim metodom u dva k oraka, spektar pokazuje heterogenu mešavinu vr sta, koja uk ljuþuje že ljene Ab-(povezivaþ-DMx)nvrste p lus dodatne vrste koje sadrže inaktivirani maleimid i unakrsno povezane fragmente povezivaþa. Pretpostavljeni mehanizmi meÿulanþanog unakrsnog povezivanja i inaktivacije maleimida u tradicionalnoj reakc ionoj se kvenci u 2 koraka prikazani s u na S lici 17, gde ugr aÿena m aleimidna ( ili h aloacetamidna) rezidua iz po þetne reakcije antitela sa heterobifunkcionalnim povezivaþem može da reaguje sa unutarmolekulskim (ili meÿumolekulskim) histidinskim, lizinskim, tirozinskim ili cisteinskim reziduama, što rezultuje meÿulanþanim u nakrsnim po vezivanjem, ili po þetno ugraÿena maleimidna (ili haloacetamidna) rezidua može da se inaktivira hidrolizom i li hidratacijom maleimidne rezidue pre reakcionog koraka sa t iol-sadržavajuüim D M1 ili DM4 (DMx) sredstvom. Prema tome, LC-MS an aliza jasno pokazuje da metod opisan u o vom pronalasku ima prednost proizvodnje homogenog konjugata, uz malo ili nimalo inaktiviranog maleimida ili unakrsno povezanih fragmenata povezivaþa vezanih za antitelo.
Primer 4. Konjugacija antitela sa DM1/DM4 (DMx) sa disulfidnim povezivaþima koji mogu da se seku, ovim metodom (slika 19).
[0100] Stok rastvori koji sadrže DM1 ili DM4 tiol (DMx) i heterobifunkcionalni povezivaþ 4-(2-piridilditio)butanska kiselina-N-hidroksisukcinimid estar (SPDB) pripremljeni su u DMA u koncentraciji od 30-60 mM. Povezivaþi i DMx tiol pomešani su jedan sa drugim u DMA koji sadrži do 40% v/v vodenog 200 m M sukcinatnog pufera, 2 mM EDTA, pH 5.0 da s e dobije odnos DM1 i li DM4 (DMx) prema povezivaþu od 1.6:1 i konaþna koncentracija DMx o d 8 mM. Posle mešanja, r eakcija se o stavi 1 h na amb ijentalnoj temperaturi i zatim se a likvot reakcije doda u vodeni rast vor ant itela u fosfatnom puferu ( pH 7.5), pod ko naþnim uslovima konjugacije od 4 mg/ml Ab, 90% f osfatni pufer (vodeni)/10% DMA (v/v), pH 7.5. Ostavi se da se reakcija ko njugacije o dvija na a mbijentalnoj temperaturi, 2 h. Ab-DMx ko njugat se preþisti iz viška neodreagovalog reagensa i viška DMx korišüenjem G25 gel filtracione kolone ekvilibrisane u pH 7.5 fosfatnom puferu (vodeni). Konjugat se drži na 4°C, 2 da na, u pu feru na pH 7.5 da se o moguüi disocijacija DMx v rsta pr ikaþenih za Ab nekovalentno ili labilnim
4
vezama. Konjugat se zatim dijalizira preko noüi u pH 5.5 histidin/glicin puferu i zatim filtrira kroz 0.22 µm filter za konaþno skladištenje. Broj DMx molekula po molekulu Ab u konaþnom konjugatu meri se odreÿivanjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm uz korišüenje poznatih ekstinkcionih koeficijenata za DMx i antitelo na tim dvema talasnim dužinama.
Primer 5. Pripremanje antitelo-DM1/DM4 (Ab-DMx) konjugata sa disulfidnim i povezivaþima koji ne mogu da se seku, korišüenjem ovog metoda (Slika 20).
[0101] Stok rastvori DM1 ili DM4 tiola (DMx) i NHS-PEGn-Maleimid heterobifunkcionalnog povezivaþa pripremljeni su u N,N-dimetilacetamidu (DMA) u koncentracijama od 30-80 mM. NHS-PEG4-Maleimidni povezivaþ i DMx t iol pomešaju se jedan sa dr ugim u DM A koji sadrži do 40% v/v 200 mM sukcinatnog pufera, 2 mM EDTA, pH 5. 0 da s e dobije molarni odnos DMx pre ma po vezivaþu od 1.6:1 i kona þna ko ncentracija DM x jednaka 8.0 mM. Reakciona mešavina se ostavi da reaguje 2 h na a mbijentalnoj temperaturi. U za sebnoj paralelnoj reakcij i, S PDB po vezivaþ i DM x tiol pomešaju se jedan sa dr ugim i reagu ju na naþin sl iþan uslovima upotr ebljenim za NHS-PEG4-maleimid reakciju, osim što trajanje reakcije iznosi 1 h. Posle završetka obe reakcije i bez preþišüavanja, jednake zapremine PEG4-Mal-DM4 mešavine i SPDB-DM4 mešavine se kombinuju. Alikvot kombinovanih reakcionih mešavina do da se bez pr eþišüavanja u rastvor an titela u fosfatnom puferu (pH 7.5) pod konaþnim usl ovima ko njugacije o d 4 mg/ml Ab, 90% f osfatni pufer (vodeni)/10% DMA (v/v), pH 7.5. Reakcija konjugacije se o stavi da se odvija na ambijentalnoj temperaturi, 2 h. Ab-DMx konjugat se pre þisti i z viška neodreagovalih reage nasa i vi ška DMx ko rišüenjem G25 gel filtracione kolone ekvilibrisane u pH 7.5 fosfatnom puferu (vodeni). Konjugat se drži na 4°C, 2 dan a, u puf eru na pH 7.5, da se omoguüi disocijacija DMx vrsta prikaþenih za Ab nekovalentno ili labilni m vez ama. Konjugat se zatim dij alizira preko noüi u pH 5. 5 histidin/glicin pu feru i zatim filtrira kro z 0.22 µm fil ter za ko naþno skladištenje. Bro j DMx molekula po molekulu Ab u konaþnom konjugatu meri se odreÿivanjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm kor išüenjem poznatih ekstinkcionih koeficijenata za DMx i antitelo na t im dvema talasnim dužinama.
[0102] Ab-(mešani SPDB i PEG4-Mal povezivaþ)-DMx konjugat napravljen metodom opisanim u ovom pronalasku testira se da bi se odredio procenat ugraÿivanja povezivaþa koji može da se seþe u odnosu na povezivaþ koji ne može da se seþe na Ab uporeÿivanjem odnosa DMx po antitelu (D/A) pre i posle DT T (di tiotreitol) tretmana ko njugata, za reduk ovanje disulfidne veze. Da bi se pH r eakcije održao na 7.5 tokom DTT redukcije, konjugat se prvo dijalizira u 250 mM H EPES puferu pH 7.5. Konjugat se zatim redukuje reakcijom sa 25 mM DTT u trajanju od 20 min, na 37°C. Posle reakcije sa DTT, osloboÿeni DMx i DTT se izdvoje iz reakcione mešavine ko rišüenjem G25 ge l filt racione kolone ekvilibrisane u 250 mM HEPES puf eru pH 7.5. Proseþan broj DMx molekula po molekulu Ab u preþišüenom proizvodu meri se o dreÿivanjem apsor bance ko njugata na 252 i 280 nm i kor išüenjem poznatih ekstinkcionih koeficijenata za DMx i ant itelo na t im dvema talasnim dužinama. Odnos izmeÿu D/A DTT-t retiranog konjugata i DTT-netretiranog D/A konjugata koristi se za izraþunavanje procenta DMx pr ikaþenog za Ab neko valentnim vezama. D va dodatna uzorka, konjugati Ab-SPDB-DM4 i Ab-PEG4-Mal-DM4, tretiraju se s a DTT kao pozitivna, odnosno negativna kontrola. Uporeÿivanjem D/A o dnosa pre i posle DTT tr etmana, kontrolni nesecivi Ab-PEG4-Mal-DM4 konjugat pokazao je da su skoro svi v ezani po vezivaþi bili neseciv i (93%) kao što je i oþekivano. Ab-(mešani SPDB i PEG4-Mal povezivaþ)-DMx konjugat koji sadrži i nesecivi i disulfidni povezivaþ, napravljen m etodom opisanim u o vom pronalasku, imao je 41% manje DMx odse þenih DTT tretmanom u o dnosu na ko liþinu gu bitka DMx iz Ab-SPDB-DMx ko njugata koji se sa stojao u potpunosti od secivog povezivaþa. Ovo je pokazalo da je Ab-(mešani SPDB i PEG4-Mal)-DMx konjugat napravl jen metodom opisanim u ovom pro nalasku bi o sastavljen od približno 40% nesecivog i 60% secivog poveziva þa. Izmenom poþetnog odnosa nesecivog i secivog povezivaþkog reagensa, mogu se pr ipremiti konjugati antitela sa majtanzinoidom ili drugim efektorom sa razliþitim odnosom nesecivog i secivog povezivaþa. S lika 21 pr ikazuje maseni spektar deglikozilovanog konjugata opisanog gore, koji se sastoji od antitela sa pro seþno 3.5 molekula majtanzinoida po molekulu antitela, vezanih i d isulfidnim povezivaþima (SPDB) i nesecivim povezivaþima (PEG). MS pokazuje jasne ko njugatske vrste ko je nose i se cive i nesec ive po vezivaþe ( Slika 21) . Na pr imer, konjugatski pik oznaþen kao D2-PEG-SPDB nosi j edan disulf idno povezani i j edan nesecivi tioetar-povezani majtanzinoidni molekul; konjugatski pik oznaþen kao D3-PEG-2SPDB nosi dva disulfidno povezana i jedan nesecivi tioetar-povezani majtanzinoidni molekul; i konjugatski pik o znaþen kao D3-2PEG-SPDB nosi jedan disulfidno povezani i dva neseciva tioetar-povezana majtanzinoidna molekula.
Primer 6. Konjugacija antitela sa majtanzinoidom uz korišüenje SMCC povezivaþa (Slika 22).
[0103] Stok rastvori DM1 tiola i SMCC heterobifunkcionalnog povezivaþa (Pierce) pripremljeni su u DMA , u konc entraciji od 30- 60 mM. Povezivaþ i DM1 t iol pomešani su
4
jedan sa drugim u DMA ko ji je sadržao do 50% v/v vodenog 200 mM sukcinatnog pufera, 2 mM EDTA, pH 5.0 da se dobije odnos DM1 prema povezivaþu od 1.4:1 mol ekvivalenta i konaþna koncentracija DM1 o d 1 d o 6 mM. Posle mešanja, reakcija stoji do 4 h na ambijentalnoj temperaturi i zatim se a likvot r eakcione mešavine razblaži 10-str uko da bi se izmerila apsor banca n a 302-320 nm i da bi se pro cenilo da l i j e sav m aleimid reagovao s a tiolom. Kada se pom oüu UV p okaže da maleimid više nije pr isutan, a likvot reakcije se do da vodenom rastvoru antitela u fosfatnom puferu (pH 7.5-8.5) pod konaþnim ko njugacionim uslovima o d 2.5 m g/ml Ab , 70-80% f osfatni pufer (vodeni)/30-20% DMA (v/v). Reakcija konjugacije se o stavi da se o dvija na a mbijentalnoj temperaturi, 3 h. Ab-D M1 ko njugat se preþisti iz viška neodr eagovalog ili hi drolizovanog r eagensa i viška DM1 ko rišüenjem G25 gel f iltracione ko lone ekvil ibrisane u pH 7.4 f osfatnom puferu (vodeni). Konjugat se za tim dijalizira preko noüi u pH 7.4 fosfatnom puferu (vodeni) i zatim filtrira kroz 0.22 µm filter za konaþno skladištenje. Bro j DM1 molekula po molekulu Ab u ko naþnom konjugatu meri se odreÿivanjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm korišüenjem ekstinkcionih koeficijenata za DM1 i a ntitelo na tim dvema talasnim dužinama. Sliþno tome, mogu se pripremiti konjugati antitela sa D M4 t iolom i SMCC. Ovi konjugat i antitela sa D M1 ili D M4, uz korišüenje SMCC povezivaþa sadrže tioetarski povezivaþ koji ne može da se seþe.
[0104] Ab-SMCC-DM1 konjugat napravljen metodom opisanim u ovom pronalasku okaratkerisan je MS analizom deglikozilovanog ko njugata (Slika 23). Konjugat napravljen metodom opisanim u ovom pronalasku po kazuje željeni MS sp ektar koji sa drži o þekivanu distribuciju pikova sa masom jednakom Ab-(povezivaþ-DM1)n.
Primer 7. Konjugacija antitela sa majtanzinoidom uz korišüenje heterobifunkcionalnih disulfid-sadržavajuüih povezivaþa (SSNPB, SPP).
[0105] Disulfid-sadržavajuüi heterobifunkcionalni povezivaþi SSNPB (N-sulfosukcinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio)butirat) i S PP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat) mogu se koristiti za pripremanje d isulfidno povezanih konjugata antitelo-majtanzinoid, metodom koji je sliþan opisanom za SPDB povezivaþ u Primeru 4. Struktura disulfidno povezanog konjugata pripremljenog korišüenjem SPDB (Slika 19) identiþna je strukturi ko njugata pripremljenog sa SSNPB ( Slika 24). MS dis ulfidno povezanog konjugata pripremljenog korišüenjem SPD B pokazala je r azdvojene pikove sa vrednostima mase koje odgovaraju razliþitom broju majtanzinoidnih molekula prikaþenih za antitelo.
4
Primer 8. Konjugacija antitela sa majtanzinoidom koji sadrži nesecive povezivaþe sa linearnim alkil ugljeniþnim lancem.
[0106] Konjugati koji sadrže nesecivi povezivaþ sa linearnim alkil ugljeniþnim lancem pripremaju se korišüenjem reakcione mešavine majtanzinoida i heterobifunkcionalnog povezivaþa sa linearnim alki l ugl jeniþnim lancem, sliþno metodu o pisanom za SMCC povezivaþ iz primera 6. Na primer, konjugati humanizovanog antitela sa DM 1 pripremaju se korišüenjem BMPS ( N-[ȕ-maleimidopropiloksi]sukcinimid estar) i li GMBS (( N-[Ȗ-maleimidobutiriloksi]sukcinimid e star) povezivaþa kako je pokazano na Slici 26. Poþetna reakciona mešavina ko ja s adrži BMPS ili GMBS (8 mM) i DM1 t iol (10.4 mM) u 60% DMA/40% (v/v) 200 mM sukcinatnom pu feru, pH 5, pokazuje kompletnu reakciju maleimidne komponente (bazirano na opadanju maleimidne apsorbance na 302-320 nm) kada se provera izvrši posle 15 min. Ova reakciona mešavina se doda, u dve porcije sa r azmakom od 30 m in, rastvoru humanizovanog ant itela u ko ncentraciji od 2.5 mg/ml u 80% vodenom EPPS puferu, pH 8.1, koji sadrži 20% DMA (v/v) sa ukupnim povezivaþem dodatim antitelu u koliþini od 8 m olarnih ekvivalenata. Mešavina sa konjugatom se preþišüava na gelu, 4 h, i izloži dijalizi u 2 c iklusa. Konjugati sa odnosom DM1/antitelo od 3.8 i 5.1 pripremljeni su sa dobitkom od 71- 75%, i vi sokim % monomera ( 96.2-97.6%). Analizom HISEP HPLC, o vi konjugati, pripremljeni sa GMBS ili BMPS nisu pokazali pr isustvo nekonjugovanog, slobodnog leka. Sli þni konjugati koji sadrže nese cive po vezivaþe sa linearnim alkil lancima mogu se pripremiti korišüenjem AMAS (N->ȕ-maleimidoacetoksi]sukcinimid estar) ili EMCS (N-[ȕ-maleimidokaproiloksi]sukcinimid e star) ili sulf o-N-hidroksisukcinimid e stara (sulf o-GMBS, sulfo-EMCS), kako je po kazano na S lici 25. Tabela 1 prikazuje % monomera za odabrane ko njugate pripremljene metodom opisanim u o vom pronalasku, ko ji svi pokazuju visok % monomera kada se analiziraju hromatografijom zas novanom na veliþini þestica. Za uporeÿivanje, prikazani su i % monomera za konjugate pripremljene tradicionalnim metodom konjugacije u dva koraka (poþetnom reakcijom antitela sa heterobifunkcionalnim povezivaþem, praüeno reakcijom sa majtanzinoid tiolom).
Tabela 1. % monomera za odabrane konjugate napravljene metodom o pisanim u ovoj patentnoj prijavi, u poreÿenju sa tradicionalnim metodima konjugacije u dva koraka
4
4

Claims (16)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Proces pripremanja p reþišüenog konjugata u rastvoru, naznaþen time, što konjugat ukljuþuje majtanzinoid koji sadrži t iol grupu vezanu za antitelo, proces uklj uþuje korake: (a) dovoÿenje u kontakt majtanzinoida sa bifunkcionalnim povezivaþkim reagensom da bi se po vezivaþ ko valentno prikaþio za majtanzinoid i time pr ipremila nepreþišüena p rva mešavina ko ja sadr ži m ajtanzinoid sa po vezivaþima vezanim za njega, (b) konjugacija antitela sa majtanzinoidom koji ima za sebe vezane povezivaþe, reakcijom nepreþišüene prve m ešavine sa antitelom, da se pri premi druga mešavina, i (c) izlaganje druge mešavine filtraciji sa tangencijalnim protokom, dijalizi, gel filtraciji, adsorpt ivnoj hromatografiji, selektivnoj precipitaciji ili njihovoj kombinaciji da bi se time pripremio preþišüeni konjugat.
2. Proces iz patentnog zahteva 1, naznaþen time, što se korak (b) odvija u rastvoru na pH od oko 4 do oko 9.
3. Proces iz patentnog zahteva 1, naznaþen time, što druga mešavina u koraku (b) suštinski ne sadrž i neželjene unakr sno povezane, hidrolizovane vrste formirane us led unutarmolekulskih ili meÿumolekulskih reakcija.
4. Proces i z bilo kojeg od patentnih za hteva 1-3, naznaþen time, što je majtanzinoid DM1.
5. Proces i z bilo kojeg od patentnih za hteva 1-3, naznaþen time, što je majtanzinoid DM4.
6. Proces iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-5, naznaþen time, što je antitelo monoklonsko antitelo.
7. Proces iz patentnog zahteva 6, naznaþen time, što je antitelo humano ili humanizovano monoklonsko antitelo.
8. Proces iz patentnog zahteva 1, naznaþen time, što je antitelo MY9, anti-B4, C242, ili antitelo koje se vezuje za antigen odabran iz grupe koja se sastoji od EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD79, CD105, CD138, EphA receptora, EphB receptora,
4
EGFR, E GFRvIII, HER2, HER3, m ezotelina, kri pto, alf avbeta3, alfavbeta5, i alphavbeta6integrina.
9. Proces iz patentnog zahteva 7, naznaþen time, što je humano ili h umanizovano antitelo huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CNTO 95, B-B4, trastuzumab, pertuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, rituksimab, ili human o ili humaniz ovano antitelo koje se vezuje za ant igen odabran iz grupe koja se s astoji od EphA2 receptora, CD38, i IGF-IR.
10. Proces iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-9, naznaþen time, što je povezivaþ secivi povezivaþ.
11. Proces iz bilo kojeg od patentnih zah teva 1-9, naznaþen time, što je povezivaþ nesecivi povezivaþ.
12. Proces iz bilo kojeg od patentnih zah teva 1-11, naznaþen time, što pH rastvora u koraku (b) iznosi od 5 do 8.7.
13. Proces iz patentnog zahteva 12, naznaþen time, što pH rastvora u koraku (b) iznosi od 6.5 do 8.5.
14. Proces iz bilo kojeg o d patentnih zahteva 1-13, naznaþen time, što proces ukljuþuje još i korak gašenja majtanzinoida u nepreþišüenoj prvoj mešavini pomoüu reagensa za gašenje, izmeÿu koraka (a) i (b).
15. Proces iz patentnog zahteva 14, naznaþen time, što se reagens za gašenje bira iz grupe koja se sast oji od 4- maleimidobuterne kis eline, 3- maleimidopropionske k iseline, N-etilmaleimida, jodoacetamida, i jodoacetamidopropionske kiseline.
16. Proces iz patentnog zahteva 1, naznaþen time, što se bifunkcionalni povezivaþki reagens bira iz grupe koj a s e sasto ji od N-sukci nimidil 4-(maleimidometil)cikloheksankarboksilata (SMCC), N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksi-(6-amido-kaproata) (LC-SMCC), N-sukcinimidil estra K-maleimidoundekanske kiseline (KMUA), N-sukcinimidil estra Ȗ-maleimidobuterne ki seline (GMBS) , N-hi droksisukcinimid es tra İ-maleimidokapronske kiseline (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estra (M BS), N -(Į-maleimidoacetoksi)-sukcinimid e stra (AMAS), su kcinimidil-6-(ȕmaleimidopropionamido)heksanoata (SMPH), N -sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirata (SMPB), N-(p-m aleimidofenil)izocijanata (PMPI) , N-sukci nimidil-4-(jodoacetil)-aminobenzoata (SIAB), N-sukcinimidil jodoacetata (SIA), N-sukcinimidil bromoacetata (SBA ), N-sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionata (SBA P), N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionata ( SPDP), N-sukci nimidil 4-(2-piridilditio)butanoata (SPDB), i N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoata (SPP).
1
RS20190602A 2009-06-03 2010-06-02 Metodi konjugacije RS58810B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18377409P 2009-06-03 2009-06-03
EP10783998.7A EP2437790B1 (en) 2009-06-03 2010-06-02 Conjugation methods
PCT/US2010/037046 WO2010141566A1 (en) 2009-06-03 2010-06-02 Conjugation methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58810B1 true RS58810B1 (sr) 2019-07-31

Family

ID=43298108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190602A RS58810B1 (sr) 2009-06-03 2010-06-02 Metodi konjugacije

Country Status (27)

Country Link
US (8) US8624003B2 (sr)
EP (2) EP3480202A1 (sr)
JP (7) JP5784592B2 (sr)
KR (4) KR102560218B1 (sr)
CN (2) CN104984360A (sr)
AU (1) AU2010256659B2 (sr)
BR (1) BRPI1010620B8 (sr)
CA (1) CA2761959C (sr)
CY (1) CY1121992T1 (sr)
DK (1) DK2437790T3 (sr)
ES (1) ES2726945T3 (sr)
HK (1) HK1216508A1 (sr)
HR (1) HRP20190898T1 (sr)
HU (1) HUE043645T2 (sr)
IL (7) IL300840A (sr)
LT (1) LT2437790T (sr)
ME (1) ME03479B (sr)
MX (3) MX383013B (sr)
PL (1) PL2437790T3 (sr)
PT (1) PT2437790T (sr)
RS (1) RS58810B1 (sr)
RU (2) RU2765240C2 (sr)
SG (2) SG10201810743WA (sr)
SI (1) SI2437790T1 (sr)
SM (1) SMT201900284T1 (sr)
TR (1) TR201907573T4 (sr)
WO (1) WO2010141566A1 (sr)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
HRP20120794T1 (hr) 2005-08-24 2012-11-30 Immunogen, Inc. Postupak za pripremu proäśišä†enih konjugata lijeka
UY32560A (es) * 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
RS58810B1 (sr) 2009-06-03 2019-07-31 Immunogen Inc Metodi konjugacije
WO2012066581A1 (en) * 2010-11-19 2012-05-24 Venus Remedies Limited Novel conjugates for targeted drug delivery
CN103717262B (zh) 2011-03-29 2017-09-15 伊缪诺金公司 通过一步法制备类美登素抗体缀合物
WO2012177837A2 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
WO2013081471A2 (en) * 2011-08-31 2013-06-06 Nikolai Vladimirovich Bovin Facile laboratory method for localising biomolecules to the surface of cells and viruses
BR112014014464A2 (pt) * 2011-12-13 2017-06-13 Immunogen Inc uso de n-hidroxisuccinimida para melhorar a estabilidade do conjugado
CA2884873C (en) 2012-09-26 2021-11-23 Immunogen, Inc. Improved methods for the acylation of maytansinol
AU2013326897A1 (en) * 2012-10-04 2015-05-07 Immunogen, Inc. Use of an ion exchange membrane to remove impurities from cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014055842A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
MX359599B (es) 2012-10-04 2018-09-12 Immunogen Inc Uso de una membrana de pvdf para purificar conjugados de agentes de unión celular y agentes citotóxicos.
WO2014082080A2 (en) * 2012-11-26 2014-05-30 Callidus Biopharma, Inc. Methods for coupling targeting peptides onto recombinant lysosomal enzymes for improved treatments of lysosomal storage diseases
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
EP2961434A2 (en) 2013-02-28 2016-01-06 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
EP2961435B1 (en) 2013-02-28 2019-05-01 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
EP3514178A1 (en) 2013-03-15 2019-07-24 Novartis AG Antibody drug conjugates
EP2994164B1 (en) 2013-05-08 2020-08-05 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
CN108969753B (zh) 2013-06-14 2022-05-10 康思葆（北京）生物技术有限公司 蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
US10273303B2 (en) 2013-11-13 2019-04-30 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting EGFR and/or HER2 and uses thereof
JP6817064B2 (ja) 2013-11-27 2021-01-20 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合性コンストラクト
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
AU2015210578B2 (en) * 2014-01-29 2020-04-16 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Ligand-cytotoxic drug conjugate, preparation method therefor, and uses thereof
CA2954934C (en) 2014-06-30 2023-09-26 Glykos Finland Oy Drug derivative and conjugates
EA201790334A1 (ru) 2014-08-12 2017-06-30 Новартис Аг Конъюгаты анти-cdh6 антитела с лекарственным средством
GB201416960D0 (en) * 2014-09-25 2014-11-12 Antikor Biopharma Ltd Biological materials and uses thereof
US10428143B2 (en) 2014-09-28 2019-10-01 The Regents Of The University Of California Modulation of stimulatory and non-stimulatory myeloid cells
GB201419184D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
KR20170088905A (ko) * 2014-11-19 2017-08-02 이뮤노젠 아이엔씨 세포 결합 작용제-세포독성 작용제 접합체를 제조하기 위한 공정
DK3223848T3 (da) 2014-11-27 2025-03-03 Zymeworks Bc Inc Fremgangsmåder til anvendelse af bispecifikke antigenbindingskonstrukter målrettet her2
CN107406463A (zh) 2014-12-04 2017-11-28 细胞基因公司 生物分子共轭物
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
CN106243127B (zh) * 2015-06-09 2021-01-26 凯惠科技发展(上海)有限公司 抗体药物偶联物、中间体、制备方法、药物组合物及应用
US20190194315A1 (en) 2015-06-17 2019-06-27 Novartis Ag Antibody drug conjugates
WO2017059551A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Zymeworks Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
CN106606784B (zh) * 2015-10-19 2020-01-21 泰州迈博太科药业有限公司 一种靶向表达egfr肿瘤细胞的前抗体偶联药物及其应用
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
AU2017345454B2 (en) 2016-10-19 2024-10-31 Invenra Inc. Antibody constructs
RU2644280C1 (ru) * 2016-12-12 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Способ получения противоопухолевого коньюгата на основе человеческого сывороточного альбумина, содержащего терапевтические и контрастирующий агенты
CN110234348B (zh) 2016-12-16 2024-06-25 蓝鳍生物医药公司 抗-含cub结构域蛋白1(cdcp1)抗体、抗体药物缀合物及其使用方法
BR112019013107A2 (pt) 2016-12-22 2019-12-17 Università Degli Studi Magna Graecia Catanzaro anticorpos, molécula de ligação, receptor de antígeno quimérico, vetor de expressão, composição farmacêutica, linfócito, ácido nucleico, célula de hibridoma, método para a produção do anticorpo monoclonal e usos
CN110267685B (zh) 2016-12-23 2023-06-20 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
WO2018209239A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
KR102611853B1 (ko) 2017-06-30 2023-12-08 자임워크스 비씨 인코포레이티드 안정화된 키메라 fabs
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
CN111587125A (zh) 2018-01-12 2020-08-25 伊缪诺金公司 抗体药物缀合、纯化和调配的方法
US12060427B2 (en) 2018-03-28 2024-08-13 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporat Drug conjugates of cMET monoclonal binding agents, and uses thereof
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
IL322895A (en) 2018-06-05 2025-10-01 King S College London Btnl3/8-targeted constructs for delivery of cargo to the digestive system
WO2020022363A1 (ja) 2018-07-25 2020-01-30 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの効果的な製造方法
CA3133798A1 (en) * 2019-03-18 2020-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Non-hydrolyzable, non-cleavable, stable linkers for precision therapeutics and uses thereof
WO2020205465A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Purdue Research Foundation Ph-dependent composition matters useful for study and diagnosis of alzheimer's disease
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
CA3146560A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Cybrexa 2, Inc. Peptide conjugates of cytotoxins as therapeutics
CR20220057A (es) 2019-07-10 2022-07-19 Cybrexa 3 Inc Conjugados peptídicos de agentes dirigidos a microtúbulos como terapéuticos
EP4019544A4 (en) * 2019-08-19 2023-10-18 Shenyang Pharmaceutical University ANTIBODY MUTANT AND RELATED APPLICATION
CN113121670B (zh) * 2020-01-15 2022-11-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
US11878986B2 (en) 2020-06-22 2024-01-23 National Health Research Institutes Poly heterocyclic conjugates and their pharmaceutical uses
WO2022182415A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
CA3215049A1 (en) 2021-04-10 2022-10-13 Baiteng ZHAO Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
EP4326768A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
CA3238167A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Maria Leia Smith Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
KR20230125129A (ko) 2022-02-17 2023-08-29 주식회사 노벨티노빌리티 항체-약물 접합체
CN121311508A (zh) 2023-06-09 2026-01-09 徕特康(苏州)生物制药有限公司 抗her2互补性双特异抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
WO2025005240A1 (ja) 2023-06-30 2025-01-02 第一三共株式会社 活性炭材料を使用する精製工程を含む抗体－薬物コンジュゲートの製造方法
AU2024292473A1 (en) 2023-07-19 2026-01-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc
EP4509142A1 (en) 2023-08-16 2025-02-19 Ona Therapeutics S.L. Fgfr4 as target in cancer treatment
TW202535954A (zh) 2023-09-26 2025-09-16 丹麥商珍美寶股份有限公司 Ｐｔｋ７結合劑、其共軛物及使用彼等之方法
WO2025181219A1 (en) 2024-02-29 2025-09-04 Genmab A/S Egfr and c-met bispecific binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
WO2025223455A1 (en) 2024-04-24 2025-10-30 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-ptk7/b7h3 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4166105A (en) 1973-07-30 1979-08-28 Block Engineering, Inc. Dye tagged reagent
SE430062B (sv) 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4152411A (en) 1977-07-27 1979-05-01 Akzona Incorporated High specific activity labeled substances
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4664911A (en) 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
EP0192009B1 (fr) 1985-01-22 1991-09-04 Saint-Gobain Vitrage International Procédé de prèparation d'un poudre à base de formiate d'indium pour la formation d'une couche mince sur un substrat, notamment en verre.
US5223242A (en) 1985-11-05 1993-06-29 The General Hospital Corporation Negatively charged specific affinity reagents
GB8600582D0 (en) 1986-01-10 1986-02-19 Ca Minister Nat Defence Purifying biological materials
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0247730A3 (en) 1986-04-28 1989-04-12 Antibody Technology Limited Antibodies, their preparation and use and products containing them
US4859449A (en) * 1987-09-14 1989-08-22 Center For Molecular Medicine And Immunology Modified antibodies for enhanced hepatocyte clearance
US5241078A (en) 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
JP2818827B2 (ja) 1988-06-24 1998-10-30 サンヨーファイン株式会社 鉄補給飲料
US5024834A (en) 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5714149A (en) * 1989-02-10 1998-02-03 Celltech Therapeutics Limited Crosslinked antibodies and processes for their preparation
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
FR2656555B1 (fr) 1989-12-29 1994-10-28 Serimer Systeme mecanique de guidage automatique d'une ou plusieurs torches d'une unite de soudage a l'arc.
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
CA2048078A1 (en) 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
SE470006B (sv) 1991-09-26 1993-10-25 Corline Systems Ab Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
US5501952A (en) 1992-07-17 1996-03-26 Aprogenex, Inc. Analogues of reporter groups as background reducers in hybridization assays
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
AU5908296A (en) 1995-05-31 1996-12-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for targeted delivery of effector m olecules
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US6340461B1 (en) * 1996-12-17 2002-01-22 David Stephen Terman Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6462070B1 (en) 1997-03-06 2002-10-08 The General Hospital Corporation Photosensitizer conjugates for pathogen targeting
US6371975B2 (en) 1998-11-06 2002-04-16 Neomend, Inc. Compositions, systems, and methods for creating in situ, chemically cross-linked, mechanical barriers
CA2304254C (en) 1997-06-11 2012-05-22 Hans Christian Thogersen Trimerising module
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5958677A (en) 1997-07-28 1999-09-28 The New York Blood Center, Inc. Method for purifying viral nucleic acids
WO1999006587A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
BR9815388A (pt) 1997-10-03 2001-08-21 Galenica Pharmaceuticals Inc Polissacarìdeos formadores de iminas, sua preparação e seu uso como adjuvantes e imunoestimulantes
US6121236A (en) 1998-03-24 2000-09-19 The Children's Medical Center Corporation Multivalent ligands which modulate angiogenesis
WO1999055715A2 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
US5981564A (en) 1998-07-01 1999-11-09 Universite Laval Water-soluble derivatives of paclitaxel, method for producing same and uses thereof
EP1098665B9 (en) 1998-07-13 2003-08-13 The Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
EP1413582B1 (en) 1998-08-27 2006-03-15 Spirogen Limited Dimeric pyrrolobenzodiazepines
AUPQ014799A0 (en) 1999-05-04 1999-05-27 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
WO2001024763A2 (en) 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU765588C (en) 1999-11-24 2004-12-16 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
NZ518764A (en) 1999-12-29 2004-02-27 Immunogen Inc Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
EP1257289A1 (en) 2000-02-08 2002-11-20 The Penn State Research Foundation Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US6632979B2 (en) * 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
CN1494553A (zh) 2001-01-29 2004-05-05 IDECҩ�﹫˾ 改变的抗体及其使用方法
EP1363920B1 (en) 2001-02-07 2006-08-23 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified psma ligands and uses related thereto
CA2444483A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
CA2446806A1 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cd26 monoclonal antibodies as therapy for diseases associated with cells expressing cd26
EP1258255A1 (en) 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
WO2002098897A2 (en) 2001-06-01 2002-12-12 Cornell Research Foundation, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US6576802B2 (en) 2001-06-04 2003-06-10 Shell Oil Company One-step production of 1, 3-propanediol from ethylene oxide and syngas with a catalyst with a phospholanoalkane ligand
CA2469132A1 (en) 2001-12-11 2003-07-03 Merck & Co., Inc. Staphylococcus aureus exopolysaccharide and process
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
WO2003057163A2 (en) 2002-01-03 2003-07-17 Smithkline Beecham Corporation Methods for preparing immunoconjugates
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US6660856B2 (en) 2002-03-08 2003-12-09 Kaohsiung Medical University Synthesis of pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine analogues
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
DK1501369T3 (en) 2002-04-26 2015-09-28 Genentech Inc Non-affinity purification of proteins
ES2593304T3 (es) * 2002-05-02 2016-12-07 Wyeth Holdings Llc Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
US20060182740A1 (en) 2002-06-21 2006-08-17 Biogen Idec, Inc. Buffered formulations for concentrating antibodies and methods of use thereof
PT2357006E (pt) 2002-07-31 2016-01-22 Seattle Genetics Inc Conjugados de fármacos e sua utilização para tratamento do cancro, de uma doença autoimune ou de uma doença infeciosa
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
JP2006500364A (ja) 2002-08-16 2006-01-05 イムノージェン インコーポレーテッド 高い反応性と溶解度を有する架橋剤および小分子薬物の標的化送達用コンジュゲートの調製におけるそれらの使用
EP1549350B1 (en) 2002-10-08 2008-09-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
CN1720331B (zh) 2002-10-30 2013-01-02 纽韦卢森公司 合成双功能复合物的方法
MXPA05004712A (es) 2002-11-07 2005-11-23 Immunogen Inc Anticuerpos anti-cd33 y metodo para tratamiento de leucemia mieloide aguda utilizando los mismos.
EP1608664B1 (en) 2003-03-31 2009-01-28 Council of Scientific and Industrial Research Non-cross-linking pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines as potential antitumour agents and process thereof
CA2522637C (en) 2003-04-17 2014-01-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified irna agents
CA2930485C (en) 2003-05-14 2018-04-10 Immunogen, Inc. Maytansinoid-antibody conjugate compositions
US8088387B2 (en) * 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
SI1651162T1 (sl) 2003-05-20 2016-02-29 Immunogen, Inc. Izboljšani citotoksični agenti, ki vsebujejo nove majtanzinoide
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US7595306B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Method of treating neurodegenerative disease
DK3604537T3 (da) 2003-06-13 2022-02-28 Alnylam Europe Ag Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme
KR101435167B1 (ko) 2003-06-27 2014-11-04 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그용도
WO2005002597A1 (en) 2003-07-02 2005-01-13 Polycord, Inc. Method for delivering polymerized therapeutic agent compositions and compositions thereof
MXPA06005104A (es) 2003-11-05 2007-01-25 Palingen Inc Citotoxicidad de celulas b aumentada en anticuerpos de enlace a cdim.
EP2604282B1 (en) 2003-12-16 2019-06-19 Nektar Therapeutics Method for preparing of monodisperse oligo ethylene glycol
US20050175619A1 (en) 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
US20110064754A1 (en) 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
EP1610818A4 (en) 2004-03-03 2007-09-19 Millennium Pharm Inc MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF
US6951853B1 (en) 2004-03-30 2005-10-04 Council Of Scientific And Industrial Research Process for preparing pyrrolo[2, 1-c] [1,4] benzodiazepine hybrids
US7189710B2 (en) 2004-03-30 2007-03-13 Council Of Scientific And Industrial Research C2-fluoro pyrrolo [2,1−c][1,4]benzodiazepine dimers
US8470315B2 (en) 2004-04-13 2013-06-25 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
JP4584986B2 (ja) 2004-04-27 2010-11-24 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド ２−アリールプロピル部分を含む１本鎖及び２本鎖オリゴヌクレオチド
WO2006073458A2 (en) 2004-04-30 2006-07-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a c5-modified pyrimidine
US20060073528A1 (en) 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
RU2402548C2 (ru) * 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
CA2564076C (en) 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
AU2005327517B2 (en) 2004-06-30 2011-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
AU2005328382C1 (en) 2004-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
JP4193771B2 (ja) 2004-07-27 2008-12-10 セイコーエプソン株式会社 階調電圧発生回路及び駆動回路
CA2574603C (en) 2004-08-04 2014-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
CA2486285C (en) 2004-08-30 2017-03-07 Viktor S. Goldmakher Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
GT200500283A (es) * 2004-10-08 2006-05-08 Inmunoterapia de desordenes autoinmunes
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
CN101193916B (zh) 2004-12-09 2012-09-05 森托科尔公司 抗整联蛋白免疫缀合物、方法和用途
US7408030B2 (en) 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
US20110166319A1 (en) 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
EP2468304A3 (en) 2005-02-11 2012-09-26 ImmunoGen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
EP1868649A4 (en) 2005-04-15 2011-06-29 Immunogen Inc ELIMINATION OF A POPULATION OF HETEROGENEOUS OR MIXED CELLS IN TUMORS
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
ES2424242T3 (es) 2005-07-15 2013-09-30 Angiochem Inc. Uso de polipéptidos de aprotinina como portadores en conjugados farmacéuticos
KR101566393B1 (ko) 2005-08-03 2015-11-05 이뮤노젠 아이엔씨 면역접합체 제형
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
HRP20120794T1 (hr) * 2005-08-24 2012-11-30 Immunogen, Inc. Postupak za pripremu proäśišä†enih konjugata lijeka
KR20080080277A (ko) 2005-09-22 2008-09-03 하다지트 메디칼 리서치 써비시즈 앤드 디벨롭먼트 컴파니 리미티드 치료상으로 활성있는 화합물인 덱스트란과아라비노갈락탄의 복합체
BRPI0617546A2 (pt) * 2005-09-26 2011-07-26 Medarex Inc conjugado de fÁrmaco-anticorpo, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula de tumor, mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de um tumor em um sujeito mamÍfero e composto
EP2298308B1 (en) 2005-11-14 2013-01-16 University Of Southern California Integrin-binding small molecules
US8623356B2 (en) 2005-11-29 2014-01-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerization-activated therapeutic agents
WO2007098611A1 (en) 2006-03-03 2007-09-07 Queen's University At Kingston Compositions for treatment of cancer
US7964415B2 (en) 2006-04-26 2011-06-21 Cardiogenics Inc. Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof
BRPI0711249A2 (pt) * 2006-05-30 2012-03-13 Genentech, Inc. Anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeira, métodos para fabricar um anticorpo, para detectar a presença de cd2 em uma amostra biológica, para tratar uma disfunção proliferativa de células b, para inibir proliferaçõa de células b, para tratar câncer, para fabricar um composto conjugado anti-corpo-droga. imunoconjugados,composições farmacêuticas, formulações farmacêuticas, conjugado anticorpo-droga, compostos conjugados anti-corpo-droga, teste para detectar células b e artigo de fabricação
CA2655379A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
CA2658276A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Sanofi-Aventis Antagonist antibody for the treatment of cancer
US20080213349A1 (en) 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
ES2435779T3 (es) 2007-07-19 2013-12-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico
US8084589B2 (en) 2007-08-31 2011-12-27 University Of Massachusetts Phosphoramidite nucleoside analogs
CA2722696C (en) 2008-04-30 2021-08-10 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
AU2009243009B2 (en) 2008-04-30 2014-09-11 Immunogen, Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
GB0811743D0 (en) 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
WO2010057160A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
CA2750519C (en) 2009-02-05 2018-09-25 Immunogen, Inc. Benzodiazepine derivatives
RS58810B1 (sr) * 2009-06-03 2019-07-31 Immunogen Inc Metodi konjugacije
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
UY32914A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Anticuerpos que se usan específicamente al receptor epha2
MY197016A (en) 2010-02-24 2023-05-20 Immunogen Inc Folate receptor 1 antibodies and immunoconjugates and uses thereof
KR20110103182A (ko) 2010-03-12 2011-09-20 삼성전자주식회사 입체 영상 표시 장치
US20120149732A1 (en) 2010-12-14 2012-06-14 Alexander Chucholowski Multifunctional linkers and methods for the use thereof
SG191965A1 (en) 2011-02-15 2013-08-30 Immunogen Inc Methods of preparation of conjugates
AU2012236403B2 (en) 2011-03-29 2016-08-04 Immunogen, Inc. Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity
CN103717262B (zh) 2011-03-29 2017-09-15 伊缪诺金公司 通过一步法制备类美登素抗体缀合物
MY171008A (en) 2011-03-29 2019-09-23 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
PT2694106T (pt) 2011-04-01 2018-03-05 Immunogen Inc Métodos para aumentar eficácia de terapia de cancro de folr1
US20130071482A1 (en) 2011-09-20 2013-03-21 The University Of Kentucky Research Foundation Block copolymer cross-linked nanoassemblies as modular delivery vehicles
BR112014014464A2 (pt) 2011-12-13 2017-06-13 Immunogen Inc uso de n-hidroxisuccinimida para melhorar a estabilidade do conjugado
WO2014055842A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
AU2013326897A1 (en) 2012-10-04 2015-05-07 Immunogen, Inc. Use of an ion exchange membrane to remove impurities from cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
MX359599B (es) 2012-10-04 2018-09-12 Immunogen Inc Uso de una membrana de pvdf para purificar conjugados de agentes de unión celular y agentes citotóxicos.
US10253099B2 (en) 2012-12-05 2019-04-09 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Conjugates of proteins and multivalent cell-penetrating peptides and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
JP7262507B2 (ja) 2023-04-21
JP2016006071A (ja) 2016-01-14
SI2437790T1 (sl) 2019-07-31
KR20220144827A (ko) 2022-10-27
EP2437790B1 (en) 2019-02-20
SG10201810743WA (en) 2018-12-28
KR102139019B1 (ko) 2020-07-28
IL269580B (en) 2020-06-30
JP6873184B2 (ja) 2021-05-19
AU2010256659B2 (en) 2015-01-29
US20110003969A1 (en) 2011-01-06
ME03479B (me) 2020-01-20
JP2019163276A (ja) 2019-09-26
IL286056A (en) 2021-10-31
US20210163625A1 (en) 2021-06-03
US20190263935A1 (en) 2019-08-29
CA2761959A1 (en) 2010-12-09
IL269580A (en) 2019-11-28
US8624003B2 (en) 2014-01-07
CA2761959C (en) 2018-09-11
IL259869A (en) 2018-07-31
RU2016130501A (ru) 2018-12-07
RU2016130501A3 (sr) 2020-01-29
KR20190015590A (ko) 2019-02-13
PT2437790T (pt) 2019-06-04
IL286056B2 (en) 2023-08-01
EP2437790A1 (en) 2012-04-11
EP3480202A1 (en) 2019-05-08
IL274599A (en) 2020-06-30
US10233257B2 (en) 2019-03-19
DK2437790T3 (da) 2019-05-20
MX2011012794A (es) 2012-05-08
JP2012528874A (ja) 2012-11-15
US11498979B2 (en) 2022-11-15
RU2765240C2 (ru) 2022-01-27
JP5784592B2 (ja) 2015-09-24
JP6114783B2 (ja) 2017-04-12
BRPI1010620B1 (pt) 2021-05-04
CN102448500A (zh) 2012-05-09
US20170002096A1 (en) 2017-01-05
JP2017128590A (ja) 2017-07-27
RU2011153288A (ru) 2013-07-20
US20140179906A1 (en) 2014-06-26
KR20200090974A (ko) 2020-07-29
WO2010141566A1 (en) 2010-12-09
HK1216508A1 (zh) 2016-11-18
US20250249109A1 (en) 2025-08-07
RU2595424C2 (ru) 2016-08-27
TR201907573T4 (tr) 2019-06-21
SMT201900284T1 (it) 2019-07-11
IL216583A0 (en) 2012-02-29
HRP20190898T1 (hr) 2019-08-09
AU2010256659A1 (en) 2011-12-01
KR20120088549A (ko) 2012-08-08
KR102444399B1 (ko) 2022-09-16
CY1121992T1 (el) 2020-10-14
ES2726945T3 (es) 2019-10-10
LT2437790T (lt) 2019-06-10
JP2021113210A (ja) 2021-08-05
MX383013B (es) 2025-03-13
HUE043645T2 (hu) 2019-08-28
BRPI1010620B8 (pt) 2021-05-25
JP2023075187A (ja) 2023-05-30
JP2024099722A (ja) 2024-07-25
SG176068A1 (en) 2011-12-29
MX349210B (es) 2017-07-18
US20180079828A1 (en) 2018-03-22
EP2437790A4 (en) 2015-06-24
US9771432B2 (en) 2017-09-26
IL274599B (en) 2021-09-30
CN104984360A (zh) 2015-10-21
PL2437790T3 (pl) 2019-09-30
IL286056B1 (en) 2023-04-01
KR101947176B1 (ko) 2019-02-12
KR102560218B1 (ko) 2023-07-26
BRPI1010620A2 (pt) 2016-03-15
US9376500B2 (en) 2016-06-28
US10815309B2 (en) 2020-10-27
IL242589B (en) 2018-11-29
JP7481521B2 (ja) 2024-05-10
US20230105468A1 (en) 2023-04-06
IL300840A (en) 2023-04-01
IL259869B (en) 2019-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250249109A1 (en) Conjugation methods
AU2019275619B2 (en) Conjugation methods
HK1165306A (en) Conjugation methods
HK1165306B (en) Conjugation methods
HK40007127A (en) Conjugation methods