RS57089B1 - Monoklonska antitela za gt468 za lečenje kancera - Google Patents

Description

Opis

[0001] Terapije zasnovane na antitelima uspešno su uvedene u kliniku i istakle su se kao terapije koje najviše obećavaju u onkologiji tokom poslednje decenije.

[0002] Terapije zasnovane na antitelima za kancer imaju potencijal veće specifičnosti i profil manjih sporednih dejstava u odnosu na konvencionalne lekove. Razlog je precizno razlikovanje između normalnih i neoplastičnih ćelija od strane antitela i činjenica da se njihov način delovanja bazira na manje toksičnim imunološkim anti-tumorskim mehanizmima, kao što su aktivacija komplementa i angažovanje citotoksičnih imunskih ćelija.

[0003] Mete terapija zasnovanih na antitelima moraju imati posebne kvalitete, koji čine osnovu za odgovarajuću diskriminaciju između normalnih i neoplastičnih ćelija. Očigledno, meta sa ili isključivim ograničenjem na tumorske ćelije i koja se potpuno ne može detektovati u normalnim tkivima je idealna za razvoj efikasnih i sigurnih terapeutika na bazi antitela. U drugom aspektu, prekomerna ekspresija visokog nivoa može biti osnova za terapijski prozor i slaba sporedna dejstva koja su data kao primer pomoću receptora tipa 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER-2), koji je kao rezultat amplifikacije gena dobra meta za antitelo trastuzumab (Herceptin).

[0004] Ostale mete za antitela koja su ili već odobrena ili su u kliničkom razvoju za tumorsku terapiju imaju posebne osobine, koje se ne zasnivaju na numeričkoj prekomernoj ekspresiji ciljnih molekula na tumorskim ćelijama. U slučaju antitela za proteoglikan MUC-1, peptidni ponavljajući epitop u osnovi mete je podglikozilovan u tumorskim ćelijama i time izmenjen u njegov odgovarajući ekvivalent. U slučaju antitela za CD20 (rituksimab), CD52 (Campath1H) i CD22 (epratuzumab), mete antitela imaju uporedive nivoe ekspresije na tumorskim ćelijama i normalnim limfocitima. Ovde, ablacija normalnih ćelija od strane antitela se može tolerisati, jer matične ćelije negative za metu uspostavljaju normalan limfocitni repertoar. Drugi primeri diferencijalne pristupačnosti meta antitela su karcinoembrionalni antigen (CEA) i karboanhidraza IX (CA9). Oba antigena su eksprimirana na normalnom epitelijumu debelog creva i bubrega, redom. Međutim, radioaktivno obeležena imidžing antitela dobro prave razliku između tumorskog i normalnog tkiva, a citotoksična antitela se dobro tolerišu. Ovo je najverovatnije zbog ograničene ekspresije CA9 i CEA na luminalnoj strani normalnog epitelnog tkiva gde IgG antitela nemaju pristup. Takođe u ovu kategoriju spada i adhezioni molekul epitelnih ćelija antigena (antigen epithelial cell adhesion molekul - Ep-CAM). Kao homotipski ćelijski adhezioni molekul za epitelne ćelije, on je lokalizovan u međućelijskom prostoru. Intrigantno, dok su anti-Ep-CAM antitela veoma toksična, antitela srednjeg afiniteta se dobro tolerišu. Ovo ukazuje na dostupnost Ep-CAM mete na normalnim ćelijama, ali takođe ukazuje na to da kinetika vezivanja antitela može otvoriti terapijski prozor.

[0005] Osam antitela je odobreno za lečenje neoplastičnih bolesti, većina njih, međutim kod limfoma i leukemije (Adams, G. P. & Weiner, L. M. (2005) Nat. Biotechnol.23, 1147-1157). Samo tri mAbs (monoklonska antitela), naime Herceptin, Avastin i Erbitux, su usmerena na tipove solidnih kancera, koji čine više od 90% mortaliteta izazvanog kancerom. Znatna preostala medicinska potreba, značajna klinička korist odobrila je mAbs koja su već obezbeđena i njihov značajan komercijalni uspeh u potpunosti je motivisao talas inovativnih pristupa koji je postao spreman ne samo za razvoj terapija zasnovanih na antitelima za proširene grupe pacijenata, već i za poboljšanje njihove efikasnosti (Brekke, O. H. & Sandlie, I. (2003) Nat. Rev. Drug Discov.2, 52-62; Carter, P. (2001) Nat. Rev. Cancer 1, 118-129).

[0006] Jedan od izazova koje treba savladati za pojavu sledeće generacije poboljšanih terapeutika baziranih na antitelima je izbor odgovarajućih ciljnih molekula, što je ključ za povoljan profil toksičnosti/efikasnosti.

[0007] Aktuelna antitela koja su dostupna za lečenje solidnih kancera zahvaljujući ekspresiji njihovih meta na normalnim tkivima ne koriste dovoljno kumulativnu snagu načina delovanja ugrađenu u molekule antitela. Her2/neu, na primer, meta Herceptina, ekspimira se u mnogim normalnim ljudskim tkivima uključujući srčani mišić (Crone, S. A., Zhao, Y. Y., Fan, L., Gu, Y., Minamisawa, S., Liu, Y., Peterson, K. L., Chen, J., Kahn, R., Condorelli, G. et al. (2002) Nat. Med. 8, 459-465). Kao posledica, Herceptin je dizajniran sa smanjenom imunološkom potencijom i ne može se davati u maksimalnoj efikasnoj dozi zbog inače neprihvatljive toksičnosti. Ovo "tupljenje potencijalno oštrog noža" ograničava terapijsku efikasnost Herceptina.

[0008] Pored nedostatka ekspresije u normalnim tkivima relevantnim za toksičnost, snažna i visoka ekspresija na površini tumorskih ćelija i pokazivanje funkcije napredovanja tumora su poželjne karakteristike za idealnu metu (Houshmand, P. & Zlotnik, A. (2003) Curr. Opin. Cell Biol. 15, 640-644).

[0009] Korišćenjem pretrage integrisanih podataka i eksperimentalnog validacionog pristupa za otkrivanje novih meta za terapiju kancera antitelima, identifikovali smo GT468, protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEK ID BR: 2. GT468 je gen specifičan za placentu označen PLAC1, bez detektabilne ekspresije u bilo kom drugom normalnom humanom tkivu. Međutim, često je aberantno aktiviran i visoko eksprimiran u različitim tipovima tumora, naročito raka dojke. RNKi-posredovano utišavanje GT468 u MCF-7 i BT-549 ćelijama kancera dojke duboko oštećuje pokretljivost, migraciju i invaziju i indukuje blok u G1/ S ćelijskog ciklusa sa skoro potpunim ukidanjem proliferacije. Nokdaun (“knock down” - smanjenje ekspresije) GT468 je povezano sa smanjenom ekspresijom ciklina D1 i smanjenom fosforilacijom AKT kinaze. Štaviše, GT468 je lokalizovan na površini kancerskih ćelija i dostupan je za antitela koja antagonizuju biološke funkcije ovog molekula.

[0010] GT468 ima nekoliko osobina koje ga čini veoma atraktivnom metom za terapijska antitela. Kao diferencijacioni antigen ćelijske vrste koja se javlja u ljudskom telu samo u tako izuzetnom stanju kao trudnoća, on je onoliko odsutan u zdravim tkivima relevantnim za toksičnost koliko sopstveni antigen to može biti. Njegova visoka prevalenca u različitim tumorskim entitetima učinila bi veliki broj pacijenata prihvatljivim za lečenje sa terapijama koje ciljaju GT468. U slučaju kancera dojke, na primer, 82% pacijenata nosi ovu metu. Her2/neu, nasuprot toga, meta Herceptina, jedino mAb dostupno za lečenje ovog tipa kancera, je prekomerno eksprimirano kod samo 20-25% pacijenata sa kancerom dojke (Slamon, D. J., Godolphin, W., Jones, L. A., Holt, J. A., Wong, S. G., Keith, D. E., Levin, W. J., Stuart, S. G., Udove, J., Ullrich, A. et al. (1989) Science 244, 707-712). Za kancer pluća i za kancer želuca, u kojem je GT468 izražen u 42 i 58% slučajeva redom, do sada nije odobreno lečenje mAB-om zbog nedostatka odgovarajućih ciljeva kod ovih tipova kancera.

[0011] GT468 je podložan delovanju antitela na živim ćelijama i takva antitela mogu precipitirati antitumorske efekte kao što je inhibicija proliferacije. GT468 je uključen ne samo u proliferaciju već i u pokretljivost ćelija, migraciju i invaziju. Najinteresantnije, svi ovi atributi ne samo da značajno doprinose fenotipu tumora, već su takođe inherentna svojstva humanog trofoblasta, čije fiziološke karakteristike rastu brzo i efikasno napadaju tkivo materice. Očekuje se da se mogu konstruisati mAbs za GT468, koja se mešaju sa svim ovim funkcijama odjednom na vrhu njihovog potencijala da posreduju u imunološkim efektorskim funkcijama kao što su ADCC i CDC.

[0012] US2002/065394 pominje molekul nukleinske kiseline koji kodira PLAC1 i predlaže stvaranje neutralizujućih antitela za ovaj protein. Chen et al.2006 opisuju ekspresiju PLAC1 u kancerskom tkivu želuca. EP1762575 generalno opisuje primenu PLAC1 kao mete za dijagnostifikovanje i lečenje tumora. Koslowski et al. 2007 opisuju PLAC1 kao atraktivan kandidat za ciljane imunoterapijske pristupe. Dong et al. 2008 opisuje PLAC1 kao tumorspecifični antigen sposoban da izazove spontane odgovore antitela kod humanih pacijenata sa kancerom. Nijedan od ovih dokumenata, međutim, ne podučava o ili ne pominje antitelo, koje se vezuje za PLAC1 i posreduje u inhibiciji proliferišućih ćelija.

REZIME PREDMETNOG PRONALASKA

[0013] Predmetni pronalazak generalno obezbeđuje antitela koaj su korisna kao terapeutici za lečenje i/ili sprečavanje bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisana vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, uključujući bolesti povezane sa tumorima kao što je kancer, naročito kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer jajnika, hepatocelularni kancer, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer prostate i kancer jetre.

[0014] U jednom aspektu pronalazak se odnosi na antitelo koje ima sposobnost vezivanja za GT468. Ovo antitelo je dalje definisano i limitirano patentnim zahtevima predmetnog pronalaska. Poželjno, antitelo ima sposobnost vezivanja za GT468 koji se nalaai na ćelijskoj površini i poželjno se vezuje za jedan ili više epitopa koji su smešteni u okviru vanćelijskog domena GT468, poželjno u okviru aminokiselinskih ostataka 23-212 iz GT468, i najpoželjnije se vezuje za epitop koji je lociran u okviru aminokiselinskih sekvenci sa SEK ID BROJEVIMA: 3-10 i 35-79. U jednom poželjnom tehničkom rešenju, antitelo je specifično za jednu ili više aminokiselinskih sekvenci sa SEK ID BROJEVIMA: 3-10 i 35-79. U raznim tehničkim rešenjima, antitelo ima sposobnost vezivanja za peptid koji sadrži amino kiseline 29 do 119, poželjno amino kiseline 29 do 212 i poželjnije amino kiseline 23 do 212 sa SEK ID BR: 2. Poželjno, antitelo se vezuje za kancerske ćelije, posebno ćelije tipova kancera pomenutih iznad i, poželjno, ne vezuje se značajno za ne-kancerske ćelije. Poželjno, vezivanje pomenutog antitela za ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom kao što su kancerske ćelije posreduje u ubijanju pomenutih ćelija /ili inhibira jednu ili više aktivnosti takvih ćelija kao što su pokretljivost, migracija, invazija i proliferacija. Poželjno, antitelo posreduje u ubijanju pomenutih ćelija i/ili inhibira proliferaciju pomenutih ćelija.

[0015] Ubijanje ćelija i/ili inhibicija jedne ili više aktivnosti ćelija, posebno ćelijske proliferacije, pomoću antitela predmetnog pronalaska je poželjno indukovano vezivanjem antitela za GT468 koji je eksprimiran od strane pomenutih ćelija i/ili je povezan sa ćelijskom površinom pomenutih ćelija. Takvo ubijanje ćelija i/ili inhibicija jedne ili više aktivnosti ćelija može se koristiti terapijski kako je ovde opisano. Konkretno, ubijanje ćelija i/ili inhibicija proliferacije ćelija može se koristiti za lečenje ili prevenciju kancera. Inhibicija pokretljivosti, migracije, invazije i/ili proliferacije ćelija može se koristiti za lečenje ili prevenciju kancera, posebno metastaze kancera i metastatsko širenje kancerskih ćelija.

[0016] Ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom su poželjno kancerske ćelije i one su, naročito, odabrane iz grupe koja se satoji od tumorigenih kancerskih ćelija dojke, pluća, želuca, ovarijuma, jetre, kolona, pankreasa, jednjaka, glave-vrata, bubrega i prostate.

[0017] Poželjno antitelo opisano ovde posreduje u ubijanju ćelija pomoću indukovanja lize koja je posredovana citotoksičnošću zavisnom od komplementa (complement dependent citotoxicity - CDC), lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (antibody dependent cellular citotoxicity - ADCC), apoptoze, homotipske adhezije, i/ili fagocitoze, poželjno indukovanjem CDC posredovane lize i/ili ADCC posredovane lize.

[0018] U jednom tehničkom rešenju antitelo opisano ovde ne indukuje CDC posredovanu lizu ćelija.

[0019] Poželjno, ADCC posredovana liza ćelija se odvija u prisustvu efektorskih ćelija, koje su u posebnim tehničkim rešenjima izabrane iz grupe koja se sastoji od monocita, mononuklearnih ćelija, NK ćelija i PMN-a, a fagocitoza je pomoću makrofaga.

[0020] Antitelo pronalaska može biti monoklonsko, himerno, humano, ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela i može biti odabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, poželjno IgG2a i IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, sektetornog IgA, IgD, i IgE antitela.

[0021] Prema svim aspektima pronalaska, GT468 je poželjno humani GT468, koji poželjno ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEK ID BR: 2, poželjnije koji ima aminokiselinsku sekvencu vanćelijskog domena aminokiselinske sekvence u skladu sa SEK ID BR: 2, posebno koji ima aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata od amino kiselina 23 do 212 sa SEK ID BR: 2.

[0022] U posebnom poželjno tehničkom rešenju, antitelo pronalaska se vezuje za nativne epitope od GT468 prisutne na površini živih ćelija kao što su one sa SEK ID BROJEVIMA: 3-10 i 35-79. U dodatnim poželjnim tehničkim rešenjima, antitelo pronalaska je specifično za kancerske ćelije, poželjno kancerske ćelije dojke.

[0023] U posebnim tehničkim rešenjima, GT468 je eksprimiran na i/ili vezan za površinu ćelija.

[0024] Antitela pronalaska se mogu dobiti metodom koja sadrži korak imunizacije životinje sa proteinom ili peptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BROJEVIMA: 2-10 i 35-79, ili imunogenim fragmentom ili njegovim derivatom, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćina koja eksprimira navedeni protein ili peptid, ili imunogeni fragment ili njegov derivat. Poželjno, antitelo pronalaska je specifično za gorepomenute proteine, peptide ili imunogene fragmente ili njihove derivate. U kontekstu proteina ili peptida koji se koristi u imunizaciji derivat se odnosi na varijantu takvog proteina ili peptida koji ima iste imunogene osobine kao protein ili peptid iz kog je izveden. Naročito, derivat proteina ili peptida kada se koristi u imunizaciji za proizvodnju antitela, posebno monoklonskih antitela, obezbeđuje antitela koja imaju istu specifičnost kao i antitela dobijena prilikom korišćenja proteina ili peptida u imunizaciji. Na primer, takav derivat može uključivati deleciju, supstituciju ili adiciju jedne ili više aminokiselina. Posebno, može uključiti adiciju jedne ili više amino kiselina kao što je cistein ili na N-terminusu ili C-terminusu ili oba.

[0025] U naročito poželjnom tehničkom rešenju, antitelo pronalaska je proizvedeno pomoću klona koji ima pristupni br. DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2), DSM ACC2825 (61C11-2B5) ili DSM ACC2823 (78H11-1H6). Takođe je opisano antitelo koje je proizvedeno pomoću klona koji ima pristupni br. DSM ACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2895 (22-1A-1), DSM ACC2893 (22-2A-1), DSM ACC2896 (22-9B-1), DSM ACC2897 (23-33A-1), DSM ACC2891 (23-19A-1), DSM ACC2894 (F11#33F7D12), DSM ACC2892 (4A122D4 1A10), ili DSM ACC2898 (4E91D12 2D4).

[0026] U jednom tehničkom rešenju antitelo predmetnog učenja je vezano za terapijski agens kao što je toksin, radioizotop, lek ili citotoksični agens.

[0027] U dodatnom aspektu pronalazak se odnosi na hibridomom koji je sposoban za proizvodnju antitela pronalaska. Poželjni hibridomi su oni koji imaju pristupni br. DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2), DSM ACC2825 (61C11-2B5), DSM ACC2823 (78H11-1H6). Takođe opisani ovde su hibridom koji je odabran iz grupe koja se sastoji od DSM ACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2895 (22-1A-1), DSM ACC2893 (22-2A-1), DSM ACC2896 (22-9B1), DSM ACC2897 (23-33A-1), DSM ACC2891 (23-19A-1), DSM ACC2894 (F11#33F7D12), DSM ACC2892 (4A122D4 1A10), i DSM ACC2898 (4E91D12 2D4).

[0028] Antitela su dizajnirana ovde pozivanjem na oznaku antitela i/ili pozivanjem na klon koji proizvodi antitelo, npr.4E9-1H9.

[0029] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo pronalaska i/ili njegov konjugat sa terapijskim agensom, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0030] U daljem aspektu pronalazak se odnosi na metodu inhibiranja jedne ili više aktivnosti odabranih od pokretljivosti, migracije, invazije i rasta, poželjno rasta i/ili ubijanja ćelije koja eksprimira GT468 i/ili se karakteriše vezivanjem GT468 sa svojom ćelijskom površinom, koje obuhvata stupanje u kontakt ćelije sa efikasnom količinom antitela pronalaska i/ili njegovog konjugata sa terapijskim agensom. GT468 je poželjno eksprimiran na površini pomenute ćelije.

[0031] U daljem aspektu pronalazak se odnosi na metodu lečenja ili prevencije bolesti ili poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskim površinom koja sadrži administriranje subjektu antitela pronalaska, njegovog konjugata sa terapijskim agensom, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo pronalaska ili njegov konjugat sa terapijskim agensom. Poželjno bolest ili poremećaj je bolest povezana sa tumorom i u posebnim tehničkim rešenjima je odabrana iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera pluća, kancera želuca, kancera jajnika, hepatocelularnog kancera, kancera debelog creva, kancera pankreasa, kancera jednjaka, kancera glave i vrata, kancera bubrega, kancera prostate i kancerajetre. GT468 je poželjno eksprimiran na površini pomenutih ćelija.

[0032] Antitela opisana ovde mogu imati mogućnost da diskriminišu varijante GT468 eskprimirane pomoću različitih tipova ćelija uključujući kancerske ćelije i nemaligne ćelije.

[0033] Termin "vezivanje" u skladu sa pronalaskom poželjno se odnosi na specifično vezivanje. "Specifično vezivanje" znači da se agens kao što je antitelo vezuje jače za metu, kao što je epitop za koji je specifičan u poređenju sa vezivanjem za drugu metu. Agens se veže jače za prvu metu u odnosu na drugu metu ako se vezuje za prvu metu sa konstantom disociacije (KD) koja je niža od konstante disocijacije za drugu metu. Poželjno je konstanta disociacije (KD) za metu za koju se agens posebno vezuje više od 10 puta, poželjno više od 20 puta, poželjnije više od 50 puta, čak poželjnije više od 100 puta, 200 puta, 500 puta ili 1000 puta niža od konstante disociacije (KD) za metu za koju se agens ne vezuje specifično.

[0034] Antitela pronalaska poželjno posreduju u ubijanju ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom pomoću vezivanja sa GT468. Poželjno GT468 je eksprimiran na površini pomenutih ćelija. U jednom tehničkom rešenju, antitela mogu indukovati citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), npr. najmanje oko 20-40% CDC posredovane lize, poželjno oko 40-50% CDC posredovane lize, i poželjnije više od 50% CDC posredovane liza ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom. Alternativno ili kao dodatak indukovanju CDC, antitela mogu da indukuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom u prisustvu efektorskih ćelija (npr., monociti, mononuklearne ćelije, NK ćelije i PMNs). Antitela pronalaska mogu imati sposobnost da indukuju apoptozu ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, indukuju homotipsku adheziju ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom i/ili indukuju fagocitozu ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom u prisustvu makrofaga. Antitela pronalaska mogu imati jedno ili više od iznad opisanih svojstava. Poželjno, antitela pronalaska indukuju CDC posredovanu lizu i ADCC posredovanu lizu ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom i poželjnije indukuju ADCC posredovanu lizu ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom dok one ne indukuju CDC posredovanu lizu pomenutih ćelija. Ciljne ćelije koje služe kao primer za antitela predmetnog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničene na, kancerske ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom kao što su tumorigene kancerske ćelije dojke, pluća, želuca, ovarijuma i hepatocelularne kancerske ćelije. U posebnom poželjnom rešenju, ubijanje ćelija posredovano antitelima pronalaska je GT468 specifično, tj. antitela pronalaska posreduju u ubijanju, poželjno CDC i/ili ADCC posredovanoj lizi, ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom ali ne posreduju u ubijanju ćelija koje ne eksprimiraju GT468 i/ili koje nisu okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom. Antitela opisana iznad mogu biti korišćena da posreduju u ubijanju tumorskih ćelija u lečenju ili prevenciji kancera, kao što su kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer jajnika, hepatocelularni kancer, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer prostate i kancer jetre.

[0035] Antitela mogu biti izvedena iz različitih vrsta, uključujući, ali ne ograničavajući se na miša, pacova, zeca, zamorče i čoveka. Antitela uključuju i himerne molekule u kojima je konstantni region antitela izveden iz jedne vrste, poželjno humane, kombinovan sa antigen vezujućim mestom izvedenim iz druge vrste. Osim toga, antitela uključuju humanizovane molekule u kojima su antigen vezujuća mesta antitela izvedena iz ne-humanih vrsta kombinovana sa konstantnim i okvirnim regionima humanog porekla.

[0036] Antitela uključuju pokliklonska i monoklonska antitela i uključuju IgG2a (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 (npr. IgG3, κ, λ) i IgM antitela. Međutim, drugi izotipovi antitela su takođe obuhvaćeni, uključujući IgG1, IgA1, IgA2, sekretorna IgA, IgD, i IgE antitela. Antitela mogu biti cela antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti uključujući, na primer, Fab, F(ab’)2, Fv, jednolančane Fv fragmente ili bispecifična antitela. Pored toga, antigen-vezujući fragmenti obuhvataju imunoglobulinske fuzione proteine sa vezujućim domenom koji sadrže (i) polipeptid vezujućeg domena (kao što je varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca) koji je fuzionisan sa imunoglobulinskim polipetidom zglobnog regiona, (ii) imunoglobulinski CH2 konstantni region teškog lanca fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) imunoglobulinski CH3 konstantni region teškog lanca fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Ovakvi imunoglobulinski fuzioni proteini sa vezujućim domenom su dalje stavljeni na uvid javnosti u US2003/0118592 i US 2003/0133939.

[0037] Antitela poželjno disociraju od GT468 sa ravnotežnom kontantom disocijacije (KD) od približno 1-100nM ili manje. Poželjno, antitela ne reaguju unakrsno sa povezanim antigenima na površini ćelije i tako ne inhibiraju njihovu fuknkciju.

[0038] U poželjnim tehničkim rešenjima, antitela opisana ovde mogu biti okarakterisana pomoću jednog ili više od sledećih svojstava:

a) Specifičnost za GT468;

b) Afinitet vezivanja za GT468 od oko100 nM ili manje, poželjno, oko 5-10 nM ili manje i, poželjnije, oko 1-3 nM ili manje,

c) sposobnost da posreduju u visokom nivou CDC na ili CD55/59 negativnim ili CD55/59 pozitivnim ćelijama;

d) sposobnost da inhibiraju rast ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom;

e) sposobnost da indukuju apoptozu ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom;

f) sposobnost da indukuju homotipsku adheziju ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom;

g) sposobnost da indukuju ADCC ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom u prisustvu efektorskih ćelija; h) sposobnost da produže preživljavanje subjekta koji ima tumorske ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom; i) sposobnost da iscrpe ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom;

j) sposobnost da iscrpe ćelije koje eksprimiraju niske nivoe GT468 i/ili su okarakterisane vezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom i/ili

k) sposobnost da nagomilavaju GT468 na površini živih ćelija

1

[0039] Anti-GT468 antitela opisana ovde mogu biti derivatizovana, vezana za ili koeksprimirana sa drugim specifičnostima vezivanja. U posebnom tehničkom rešenju, učenja obuhvataju bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za GT468 (npr., anti-GT468 antitelo ili njegov mimetik), i drugu specifičnost vezivanja za efektorsku ćeliju, kao što je specifičnost vezivanja za Fc receptor (npr., Fc-gama receptor, kao što je Fcgama RI, ilib ilo koji drugi Fc receptor) ili T ćelijski receptor, npr., CD3.

[0040] Prema tome, učenje obuhvata bispecifične i multispecifične molekule koji se vezuju i za GT468 i za Fc receptor ili T ćelijski receptor, npr. CD3. Primeri Fc receptora su IgG receptor, Fc-gama receptor (FcyR), kao što je FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), i FcyRIII (CD16). Drugi Fc receptori, kao što su IgA receptori (npr., FcαRI), takođe mogu biti ciljani. Fc receptor je poželjno smešten na površini efektorske ćelije, npr., monocita, makrofaga ili aktivirane mononuklearne ćelije. U poželjnom tehničkom rešenju, bispecifični i multispecifični molekuli se vezuju za Fc receptor na mestu koje se razlikuje od imunoglobulinskog Fc (npr., IgG ili IgA) mesta vezivanja receptora. Stoga, vezivanje bispecifičnih i multispecifičnih molekula nije blokirano fiziološkim nivoima imunoglobulina.

[0041] U još jednom aspektu, predmetno učenje obuhvata anti-GT468 antitela koja su derivatizovana, vezana za ili ko-eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr. Fab' fragmentom). Na primer, antitelo može biti funkcionalno vezano (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili drugačije) za jedan ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo (npr. da proizvede bispecifično ili multispecifično antitelo), citotoksin, ćelijski ligand ili antigen (npr. da proizvede imunokonjugat, kao što je imunotoksin). Antitelo predmetnog pronalaska može biti vezano za druge terapijske grupe, npr., radioizotop, mali molekulski antikancerski lek, rekombinantni citokin ili hemokin. Shodno tome, predmetni pronalazak obuhvata širok spektar konjugata antitela, bispecifičnih i multispecifičnih molekula i fuzionih proteina, od koji se svi vezuju za GT468 koji eksprimiraju ćelije i/ili ćelije koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovim ćelijskim površinom i koje se mogu koristiti da ciljaju druge molekule na takvim ćelijama.

[0042] U daljem aspektu, učenje takođe predviđa GT468-vezujuće proteine izvedene iz neimunoglobulinskih domena, posebno proteina sa jednim lancem. Takvi vezujući proteini i metode za njihovu proizvodnju su opisani, na primer, u Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268. Treba razumeti da učenje dato ovde u pogledu imunoglobulina ili vezujućih molekula izvedenih iz imunoglobulina, takođe se primenjuje na vezujuće molekule izvedene iz ne-imunoglobulinskih domena. Posebno, koristeći takve vezujuće molekule izvedene iz ne-imunoglobulinskih domena moguće je blokirati GT468 ćelije koje eksprimiraju pomenutu metu i/ili koje su okarakterisane povezivanjem navedene mete sa njihovom ćelijskom površinom i tako, dovesti do terapijskih efekata kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti za antitela pronalaska, posebno inhibiciju jedne ili više aktivnosti tumorskih ćelija kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti kao što je proliferacija. Iako nije obavezno, moguće je dodeliti efektorske funkcije antitela takvim ne-imunoglobulinskim vezujućim molekulima npr. fuzijom u Fc region antitela.

[0043] U još jednom aspektu, učenje obezbeđuje kompozicije, npr. farmaceutske i dijagnostičke kompozicije/komplete, koji sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač formulisan zajedno sa jednim ili kombinacijom antitela pronalaska. U posebnom tehničkom rešenju, kompozicija uključuje kombinaciju antitela koja se vezuju za različite epitope ili koja poseduju različite funkcionalne karakteristike, kao što je indukovanje CDC i/ili ADCC i indukovanje apoptoze. U ovom tehničkom rešenju, antitela se mogu koristiti u kombinaciji, npr., kao farmaceutska kompozicija koja sadrži dve ili više anti-GT468 monoklonskih antitela. Na primer, anti-GT468 antitela koja imaju različite ali komplementarne aktivnosti mogu se kombinovati u jednoj terapiji radi postizanja željenog terapijskog efekta. U poželjnom tehničkom rešenju, kompozicija uključuje anti-GT468 antitelo koji posreduje u CDC kombinovano sa drugim anti-GT468 antitelom koje indukuje apoptozu. U drugom tehničkom rešenju, kompozicija uključuje anti-GT468 antitelo koje posreduje u visoko efektivnom ubijanju ciljnih ćelija u prisustvu efektorskih ćelija, u kombinaciji sa drugim anti-GT468 antitelom koje inhibira rast ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koji su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom.

[0044] Predmetno učenje takođe obuhvata istovremenu ili sekvencijalnu primenu dva ili više antiGT468 antitela opisana ovde, gde je poželjno najmanje jedno od pomenutih antitela himerno anti-GT468 antitelo i najmanje jedno dodatno antitelo je humano anti-GT468 antitelo, antitela koja se vezuju za iste ili različite epitope GT468. Poželjno, himerno GT468 antitelo je administrirano prvo praćeno sa administracijom humanog anti-GT468 antitela, gde je humano anti-GT468 antitelo poželjno administrirano u produženom vremenskom periodu, tj. kao terapija održavanja.

[0045] Antitela, imunokonjugati, bispecifični i multispecifični molekuli i kompozicije opisani ovde mogu se koristiti u različitim metodama za inhibiranje rasta ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koji su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom i/ili selektivno ubijaju ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koji su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom stupanjem u kontakt sa ćelijama sa efikasnom količinom antitela, imunokonjugata, bispecifičnog/multispecifičnog molekula ili kompozicije, tako da je rast ćelije inhibiran i/ili je ćelija ubijena. U jednom tehničkom rešenju, metoda obuhvata ubijanje ćelije koja eksprimira GT468 i/ili koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, opciono u prisustvu efektorskih ćelija, na primer, pomoću CDC, apoptoze, ADCC, fagocitoze, ili kombinacijom dva ili više ovih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom koje mogu biti inhibirane ili ubijene korišćenjem antitela opisanih ovde uključuju kancerske ćelije kao što su ćelije dojke, pluća, želuca, jajnika, jetre, debelog creva, pankreasa, jednjaka, glave i vrata, prostate i jetre.

[0046] Shodno tome, antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti za lečenje i/ili sprečavanje različitih bolesti koje uključuju ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom administriranjem antitela pacijentima koji pate od takvih bolesti. Primeri bolesti koje mogu biti tretirane (npr., poboljšane) ili sprečene uključuju, ali nisu ograničene na, tumorigene bolesti. Primeri tumorigenih bolesti, koje se mogu lečiti i/ili sprečiti, uključuju kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer jajnika, hepatocelularni kancer, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer prostate i kancer jetre.

[0047] U posebnom tehničkom rešenju, subjekat kome se administrira antitelo je dodatno tretiran sa hemoterapijskim agensom, zračenjem, ili agensom koji moduliše, npr., pojačava ili inhibira, ekspresiju aktivnosti Fc receptora, npr. Fc-gama receptora, kao što je citokin. Tipični citokini za administraciju tokom lečenja uključuju faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF), interferon (IFN-y), i faktor nekroze tumora (TNF). Tipični terapijski agensi uključuju, između ostalog, antineoplastične agense kao što su doksorubicin, cisplatin, taksotera, 5-fluoruracil, metotreksat, gemcitabin i ciklofosfamid.

[0048] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na strategiju imunizacije za imunizaciju životinja koje ne spadaju u ljudsku vrstu kao što su miševi sa humanim GT468 ili njegovim peptidnim fragmentom da bi se dobila antitela. Poželjni peptidi za imunizaciju su oni izabrani iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 2-10 i 35-79, ili njihovih derivata. Shodno tome, u poželjnim tehničkim rešenjima, antitela pronalaska su ona dobijena imunizacijom korišćenjem

1

peptida odabranih iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 2-10 i 35-79, ili njihovih derivata. Analogno, antitela za GT468 se mogu generisati u transgenoj životinji koja ne spada u ljudsku vrstu, kao što je transgeni miš. Transgena životinja koja ne spada u ljudsku vrstu može biti transgeni miš koji ima genom koji sadrži transgen teškog lanca i transgen lakog lanca koji kodiraju sve ili deo antitela.

[0049] Divlji tip kao i transgene životinje koje ne spadaju u ljudsku vrstu mogu se imunizovati čišćenjem ili obogaćivanjem preparata GT468 antigena i/ili nukleinskih kiselina i/ili ćelija koje eksprimiraju GT468 ili njegov peptidni fragment. Poželjno, životinja koja ne spada u ljudsku vrstu može da proizvede višestruke izotipove humanog monoklonskih antitela za GT468 (npr., IgG, IgA i/ili IgM) podležući V-D-J rekombinaciji i izotipskom prebacivanju. Izotipsko prebacivanje može se odigrati npr. klasičnim ili neklasičnim izotipskim prebacivanjem.

[0050] Shodno tome, u još jednom aspektu, učenje obuhvata izolovane B ćelije iz životinje koja ne spada u ljudsku vrstu kao što je gore opisano. Izolovane B ćelije se zatim mogu imortalizovati fuzijom do imortalizovane ćelije da bi se obezbedio izvor (npr., hibridom) antitela. Takvi hibridomi (tj., koji proizvode antitela opisana ovde) takođe su obuhvaćeni predmetnim učenjem.

[0051] Kao što je dato kao primer ovde, antitela pronalaska mogu se dobiti direktno iz hibridoma koji eksprimiraju antitela ili se mogu klonirati i rekombinantno eksprimirati u ćeliji domaćinu (npr., CHO ćelija ili limfocitna ćelija). Drugi primeri ćelija domaćina su mikroorganizmi, kao što je E. coli, i gljivice, kao što je kvasac. Alternativno, oni se mogu proizvoditi rekombinantno u transgenoj životinji koja ne spada u ljudsku vrstu ili biljci.

[0052] Poželjne ćelije hibridoma za proizvodnju antitela opisanih ovde su one deponovane u DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Nemačka) koje imaju sledeće oznake i pristupne brojeve:

a. 4E9-1H9, pristupni br. DSM ACC2822, deponovano 13. marta 2007.

b. 9B6-2A9, pristupni br. DSM ACC2826, deponovano 13. marta 2007.

c. 59D6-2F2, pristupni br. DSM ACC2824, deponovano 13. marta 2007.

d. 61C11-2B5, pristupni br. DSM ACC2825, deponovano 13. marta 2007.

e. 78H11-1H6, pristupni br. DSM ACC2823, deponovano 13. marta 2007.

f. 22-1A-1, pristupni br. DSM ACC2895, deponovano 11. marta 2007.

g. 22-2A-1, pristupni br. DSM ACC2893, deponovano 11. marta 2007.

h. 22-9B-1, pristupni br. DSM ACC2896, deponovano 11. marta 2007.

i. 23-33A-1, pristupni br. DSM ACC2897, deponovano 11. marta 2007.

j. 23-19A-1, pristupni br. DSM ACC2891, deponovano 11. marta 2007.

k. F11#33F7D12, pristupni br. DSM ACC2894, deponovano 11. marta 2007.

l. 4A12 2D4 1A10, pristupni br. DSM ACC2892, deponovano 11. marta 2007.

m.4E9 1D12 2D4, pristupni br. DSM ACC2898, deponovano 11. marta 2007.

[0053] Poželjna antitela su ona koja su proizvedena i mogu se dobiti iz gore opisanih hibridoma i njihovih himerizovanih i humanizovanih oblika. Dalja poželjna antitela su ona koja imaju specifičnost antitela koja su proizvedena i mogu se dobiti od gore opisanih hibridoma i, naročito, ona koji sadrže deo koji vezuje antigen ili mesto vezivanja antigena, posebno varijabilni region, od antitela koja su proizvedena ili se mogu dobiti iz gore opisanih hibridoma.

[0054] U poželjnim tehničkim rešenjima, antitela, posebno himerizovani oblici antitela uključuju antitela koja sadrže konstantni region teškog lanca (CH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz konstantnog regiona teškog lanca čoveka, kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sa SEK ID BR: 17 ili 24 ili fragment iste. U dodatnim poželjnim tehničkim rešenjima, antitela, posebno himerizovani oblici antitela prema predmetnom učenju uključuju antitela koji sadrže konstantni region lakog lanca (CL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz konstantnog regiona lakog lanca kao što je amino kiselinska sekvenca predstavljena pomoću SEK ID BR: 18 ili 22 ili fragment iste. U posebnom poželjnom tehničkom rešenju, antitela, posebno himerizovani oblici antitela prema tome sadrže antitela koja sadrže CH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humanog CH kao što je sekvenca aminokiselina predstavljena sa SEK ID BR: 17 ili 24 ili njen fragment i koji sadrži CL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humanog CL kao što je sekvenca aminokiseline predstavljena sa SEK ID BR: 18 ili 22 ili njen fragment.

[0055] CH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEK ID BR: 17 može biti kodiran pomoću nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena sa SEK ID BR: 20. CH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEK ID BR: 24 može biti kodiran pomoću nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena sa SEK ID BR: 23. CL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEK ID BR: 18 može biti kodiran pomoću nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena sa SEK ID BR: 19. CL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEK ID BR: 22 može biti kodiran pomoću nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je predstavljena sa SEK ID BR: 21.

1

[0056] "Fragment" ili "fragment aminokiselinske sekvence" kao što je gore korišćeno odnosi se na deo sekvence antitela, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu antitela skraćenu na N- i/ili C-terminusu, koja kada zameni navedenu sekvencu antitela u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za GT468 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što je ovde opisano, npr. CDC posredovana liza ili ADCC posredovana liza. Poželjno, fragment aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% aminokiselinskih ostataka iz pomenute aminokiselinske sekvence. Fragmenti amino kiselinskih sekvenci opisanih ovde mogu biti kodirani odgovarajućim fragmentima sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju navedene amino kiselinske sekvence.

[0057] Predmetno učenje takođe se odnosi na nukleinske kiseline koje sadrže gene ili sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela ili njihove delove, npr. lanac antitela, kako je ovde opisano. Nukleinske kiseline mogu biti sadržane u vektoru, npr. plazmidu, kozmidu, virusu, bakteriofagu ili drugom vektoru koji se koristi npr. konvencionalno u genetičkom inženjerstvu. Vektor može sadržati dodatne gene kao što su marker geni koji omogućavaju izbor vektora u pogodnoj ćeliji domaćina i pod odgovarajućim uslovima. Pored toga, vektor može da sadrži elemente za kontrolu ekspresije koji omogućavaju pravilnu ekspresiju kodirajućih regiona u podesnim domaćinima. Takvi kontrolni elementi su poznati prosečnom poznavaocu oblasti i mogu uključivati promoter, kasetu za splajsovanje i kodon za inicijaciju translacije.

[0058] Poželjno, nukleinska kiselina je operativno vezana za gore navedene kontrolne sekvence ekspresije koje omogućavaju ekspresiju u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama. Kontrolni elementi koji obezbeđuju ekspresiju u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama su dobro poznati prosečnim poznavaocima oblasti.

[0059] Metode za konstruisanje molekula nukleinske kiseline, za konstruisanje vektora koji sadrže gore navedene molekule nukleinske kiseline, za uvođenje vektora u odgovarajuće izabrane ćelije domaćina, za izazivanje ili postizanje ekspresije su dobro poznate u oblasti.

[0060] Dodatni aspekt predmetnog učenja se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja sdarži nukleinsku kiselinu ili vektor kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti.

[0061] Druge karakteristike i prednosti predemetnog učenja će biti očigledni iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

KRATAK OPIS NACRTA

[0062]

1

Slika 1. GT468 je marker za trofoblastično poreklo aberantno aktiviran u kancerskim ćelijama. (A) End-point RT-PCR (End-point označava klasičan, konvencionalni PCR gde se količina produkta određuje na kraju reakcije) od 35 ciklusa u normalnim tkivima, uzorcima primarnog kancera dojke i kancerskim ćelijskim linijama (1, MCF-7; 2, MDA-MB-435S; 3, BT549; 4, MDA-MB-231; 5, SNU-16; 6, LCLC-103H; 7, KYSE-510; 8, KYSE-30; 9, EFO-27; 10, TOV-21G; 11, TOV112D; 12, CAOV-3; 13, EFO-21; 14, FU-OV-1; 15, LNCAP; 16, CAPAN-2). (B) Kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu od 40 ciklusa u normalnim tkivima (1, Testis; 2, Placenta; 3, Mozak; 4, Pluća; 5, Dojka; 6, Kolon; 7, Jetra; 8; Stomak; 9, Bubreg; 10, Prostata; 11, Pankreas; 12, Ovarijum; 13, Slezina; 14, Koža; 15, Miokard; 16, Endometrijum; 17, PBMCs koje odmaraju (koje su u stanju mirovanja); 18, prolif. PBMCs; 19, Nadbubrežna žlezda), uzorcima primarnog kancera dojke i (C) kancerskim ćelijskim linijama. (D) Kvantitativna RT-PCR analiza u realnom vremenu siRNK-posredovanog GT468 utišavanja u MCF-7 i BT-549 ćelijama kancera dojke. (E) Western blot analiza siRNK-posredovanog smanjenja ekspresije GT468 proteina. Kontrolne ćelije ili nisu tretirane ili su transfektovane sa izokrenutim (scrambled) ne-utišavajućim dupleksom (ns-siRNK). (F) Western blot analiza nivoa GT468 proteina u normalnim i neoplastičnim humanim tkivima. (G) Imunohistohemija sekcija koje su izvedene iz normalnog humanog tkiva dojke (levo) i kancera dojke (desno) korišćenjem GT468 specifičnog antitela.

Slika 2. GT468 je protein povezan sa ćelijskom površinom. (A) Bojenje metanolom fiksiranih i (B) nefiksiranih MCF-7 i BT-549 ćelija kancera dojke sa anti-GT468/C-term antitelom nakon transfekcije sa GT468-specifičnom siRNK (siRNK#1) ili ne-utišavajućom siRNK (ns-siRNK).

Slika 3. GT468 ekspresija pospešuje pokretljivost, migraciju i invaziju ćelija kancera dojke. (A) Analiza hemokineze (pokretljivosti) u Transwell testovima migracije sa 5% FCS dodatim u gornju kao i donju komoru je ispitana nakon 12h. (B) Analiza hemotakse MCF-7 i BT-549 ćelija u Transwell testovima migracije 12 h nakon što je 5% FCS dodat u donju komoru samo da se dobije gradijent. (C) Analiza hemotaktičke invazije u Matrigelu 24 h nakon što je 5% FCS kao hemoatraktant dodat u donju komoru.

Slika 4. GT468 ekspresija unapređuje proliferaciju ćelija kancera dojke. (A) Analiza proliferacije u MCF-7 i BT-549 ćelijama 72 h nakon nokdauna je inicirana GT468 specifiččnim siRNK dupleksima. (B) Analiza ćelijskog ciklusa ćelija 72 h nakon inicijacije

1

GT468 utišavanja pokazana kao dijagram sa stubićima ćelijskih frakcija u različitim stanjima ćelijskog ciklusa. (C) Apoptoza ćelija kao što je utvrđeno pomoću bojenja Aneksinom V 72 h nakon transfekcije sa siRNK. Kao pozitivna kontrola za Aneksin V bojenje ćelije su tretirane sa 6 µM Kampotecina tokom 12 h.

Slika 5. GT468 je podložan delovanju antitela koja antagonizuju funkciju. Analiza proliferacije MCF-7 i BT-549 ćelija nakon inkubacije sa različitim količinama anti-GT468 antitela i kontrolnog antitela (izotipska kontrola) tokom 48 h.

Slika 6. Ciklin D1 i AKT kinaza su uključeni u GT468 funkciju. (A) Analiza kvantitativnima RT-PCR u realnom vremenu i (B) western blot analiza ciklina D1 nakon što su ćelije tretirane tokom 72 h sa GT468 specifičnim siRNK dupleksima. Western blot analiza AKT Ser473 fosforilacije nakon (C) 72-osatnog GT468 nokdauna i nakon (D) 1-osatnog tretmana sa anti-GT468/C-term antitelom.

Slika 7. Peptidna ELISA za određivanje specifičnosti antitela za GT468 u hibridomskim supernatantima. Supernatanti hibridoma su samo reaktivni sa peptidima koji su korišćeni za imunizaciju.

Slika 8. Bojenje CHO ćelija transfektovanih sa GT468-eGFP konstruktom pomoću supernatanata hibridoma koji sadrže antitela za GT468. Hibridomski supernatanti specifično boje ćelije koje eksprimiraju GT468-eGFP.

Slika 9. GT468 je podložan delovanju monoklonskih antitela koja antagonizuju funkciju. Analiza proliferacije različitih kancerskih ćelijskih linija nakon inkubacije sa hibridomskim supernatantima tokom 72 h.

Slika 10. Sirov lizat (CrELISA) (A) ili peptid-specifična ELISA (B) za određivanje specifičnosti antitela za GT468 u hibridomskim supernatantima. Hibridomski supernatanti su samo reaktivni sa GT468 lizatom (A) ili odgovarajućim peptidom korišćenim za imunizaciju (B).

Slika 11. Analiza protočnom citometrijom za određivanje specifičnosti antitela za GT468 u hibridomskim supernatantima. Svi hibridomski supernatanti pokazali su specifično bojenje GT468 transfektovanih ćelija, pri čemu bojenje nije opaženo na mok transfektovanim ćelijama.

1

Slika 12. Western blot za određivanje specifičnosti antitela gajenih za GT468 u hibridomskim supernatantima. Svi hibridomski supernatanti pokazali su specifičnu reaktivnost sa lizatima HEK293 ćelija koje su transfektovane sa GT468 pcDNK3.1 ekspresionim plazmidom, pri čemu lizati mok transfektovanih ćelija nisu pokazali signal. Blagi signal supernatanta hibridoma 23-33A-1 u mok lizatu je zbog prelivanja HEK GT468 lizata.

Slika 13. Peptidna ELISA za identifikovanje antitelo-vezujućih epitopa u GT468 proteinu. Svaki od hibridomskih supernatanata 22-1A1, 23-33A-1, i 23-19A-1 je pokazao vezivanje za dva preklapajuća peptida koji pokazuju reaktivnost za linerani epitop GT468. Šabloni vezivanja 22-2A-1 i 22-9B-1 pokazuju reaktivnost za konformacioni epitop (diskontinuirani epitop) GT468 proteina.

Slika 14. GT468 je podložan delovanju monoklonskih antitela koja antagonizuju funkciju. različitih kancerskih ćelijskih linija nakon inkubacije sa prečišćenim hibridomskim supernatantima tokom 72 h ili 120 h.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0063] Antitela opisana ovde mogu biti izolovana monoklonska antitela koja specifično vezuju epitop prisutan na GT468, poželjno epitop koji je smešten sa vanćelijskim domenom GT468, poželjnije SEK ID BROJEVIMA: 3-10 i 35-79. Izolovana monoklonska antitela obuhvaćena predmetnim pronalaskom uključuju IgA, IgG1-4, IgE, IgM, i IgD antitela. U jednom tehničkom rešenju antitelo je IgG1 antitelo, konkretnije IgG1, kapa ili IgG1, lambda izotip. U još jednom tehničkom rešenju antitelo je IgG3 antitelo, konkretnije IgG3, kapa ili IgG3, lambda izotip. U još jednom tehničkom rešenju antitelo je IgG4 antitelo, konkretnije IgG4, kapa ili IgG4, lambda izotip. U još jednom drugom tehničkom rešenju antitelo je IgA1 ili IgA2 antitelo. U još jednom drugom tehničkom rešenju antitelo je IgM antitelo.

[0064] U jednom tehničkom rešenju učenje se odnosi na antitela koja (i) se vezuju za ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, i (ii) koje se ne vezuju za ćelije koje ne eksprimiraju GT468 i/ili koje nisu okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom. Antitela predmetnog učenja poželjno (i) posreduju u ubijanju i/ili inhibiciji proliferacije ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom

1

površinom, i (ii) ne posreduju u ubijanju i/ili inhibiciji proliferacije ćelija koje ne eksprimiraju GT468 i/ili koje nisu okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom.

[0065] U još jednom tehničkom rešenju, predmetno učenje se odnosi na antitela koja (i) se vezuju za tumorske ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, i (ii) koje se ne vezuju za GT468 nekancerskih placentnih ćelija.

[0066] Predmetno učenje takođe uključuje antitela koja (i) posreduju u ubijanju tumorskih ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, i (ii) ne posreduju u ubijanju ćelija koje eksprimiraju GT468 normalne placente.

[0067] Antitela opisana ovde takođe uključuju potpuno humana antitela. Takva antitela mogu biti proizvedena u ne-humanoj transgenoj životinji, npr. transgenom mišu, sposobnom za proizvodnju više izotipova humanih monoklonskih antitela za GT468 podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i izotipskom prebacivanju. Takva transgena životinja takođe može biti transgeni zec za proizvodnju poliklonskih antitela kao što je stavljeno na uvid javnosti u US 2003/0017534.

[0068] Vezivanje antitela pronalaska za GT468 antigen može posredovati u ubijanju ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom (npr. tumorska ćelija), npr. aktivacijom sistema komplementa, i/ili mogu inhibirati proliferaciju ćelija koje eksprimiraju GT468 i /ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom (npr. tumorska ćelija). Alternativno ili dodatno posredovanju u ubijanju ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom i/ili inhibiranjem proliferacije ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 njihovom ćelijskom površinom, vezivanje antitela pronalaska za GT468 antigen može inhibirati pokretljivost, migraciju i/ili invaziju ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 njihovom ćelijskom površinom (npr. tumorska ćelija), i stoga mogu inhibirati metastatsko širenje tumorskih ćelija. Ubijanje ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom može da se odigra pomoću jednog ili više od sledećih mehanizama: citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom; apoptoza ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom; fagocitoza efektorskih ćelija od strane ćelija koje

2

eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom; ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) efektorskih ćelija ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom.

[0069] Kako bi se ovaj pronalazak mogao lakše razumeti, određeni termini su prvo definisani. Dodatne definicije su navedene kroz ceo detaljan opis.

DEFINICIJE TERMINA

[0070] Termin "GT468" poželjno se odnosi na humani GT468, a posebno na (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira amino-sekvencu sa SEK ID BR: 2 kao što je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline sa SEK ID BR : 1 ili (ii) protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2, i uključuje sve varijante, konformacije, izoforme i vrste homologa koje su prirodno izražene ćelijama ili su eksprimirane od strane ćelija koje su transfektovane sa GT468 genom. U jednom tehničkom rešenju, termin "GT468" odnosi se na deo GT468 koji odgovara ekstracelularnom domenu i poželjno se odnosi na aminokiselinsku sekvencu GT468 koja ne uključuje N-terminalni hidrofobni domen. Termin "GT468" obuhvata protein koji sadrži amino kiseline 29 do 119, poželjno amino kiseline 29 do 212 i poželjnije amino kiseline 23 do 212 sa SEK ID BR: 2.

[0071] "Varijante GT468" takođe uključuje oblik GT468 koji se sastoji u suštini od vanćelijskog domena ili ektodomena od GT468. Prema pronalasku, termini "vanćelijski domen" ili "ektodomen" što se tiče GT468 odnose se na deo GT468 koji se nalazi povezan sa površinom ćelija koje eksprimiraju GT468. Poželjno, peomenuti "vanćelijski domen" ili "ektodomen" prisutan je u vanćelijskom odeljku. GT468 "vanćelijski domen" ili "ektodomen" se poželjno odnosi na deo GT468 pune dužine koji nema N-terminalni hidrofobni domen. Prema pronalasku, termin "hidrofobni domen" uzimajući u obzir GT468 odnosi se na deo GT468 koji nije deo vanćelijskog domena i koji poželjno uključuje hidrofobnu sekvencu koja se nalazi blizu N-terminusa GT468. "Hidrofobni domen" GT468 može uključivati sekvencu koja prethodi hidrofobnoj sekvenci i koja se nalazi na N-terminalnom kraju GT468. Šo se tiče SEK ID BR: 2, N-terminalni hidrofobni domen poželjno sadrži aminokiseline od 1 do 22. Biće razumljivo da su bilo koji hidrofobni domeni ili sekvence koji su identifikovani za GT468 polipeptide predmetnog pronalaska identifikovani prema kriterijumima koji se rutinski koriste u oblasti za identifikaciju hidrofobnih domena ili sekvenci. Tačne granice hidrofobnog domena mogu se razlikovati ali najverovatnije za ne više od oko 5 aminokiselina na bilo kom kraju domena, kako je ovde prvobitno identifikovano. Opciono, prema tome,v anćelijski domen GT468 polipeptida može sadržati od oko 5 ili manje aminokiselina na obe strane hidrofobnog domena/vanćelijskog domena kao što je ovde identifikovano.

[0072] "Ćelijska površina" je korišćen u skladu sa njegovim normalnim značenjem u oblasti, i prema tome uključuje spoljašnjost ćelija koja je dostupna za vezivanje od strane proteina i drugih molekula.

[0073] Izraz "GT468 eksprimrina na površini ćelija" znači da se GT468 eksprimiran od strane ćelija nalazi u vezi sa površinom pomenutih ćelija.

[0074] GT468 je povezan sa površinom ćelija ako se nalazi na površini pomenutih ćelija i dostupan je za vezivanje pomoću specifičnih GT468 specifičnih antitela dodatih ćelijama. U poželjnim tehničkim rešenjima, ćelija koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa svojom ćelijskom površinom je ćelija koja eksprimira GT468. Treba razumeti da u slučaju kada je GT468 eksprimiran od strane ćelija, GT468 koji je povezan sa površinom pomenutih ćelija može biti samo deo ekspirmiranog GT468, posebno njegovog vanćelijskog domena kao što je iznad definisano.

[0075] Termin "GT468 varijanta" će obuhvatiti (i) GT468 splajsne varijante, (ii) GT468-posttranslacionalno modifikovane varijante, naročito uključujući varijante sa različitom glikozilacijom kao što je N-glikozilacioni status, (iii) GT468 konformacione varijante, (iv) GT468 varijante u vezi sa kancerom i GT468 varijante koje nisu povezane sa kancerom.

[0076] Termin "splav" se odnosi na membranske mikrodomene bogate sfingolipidom i holesterolom, koji se nalaze u spoljašnjem listastom području plazma membrane ćelije. Sposobnost određenih proteina da se udruže u okviru takvih domena i njihova sposobnost formiranja "agregata" ili "fokalnih agregata" mogu uticati na funkciju proteina. Na primer, translokacija GT468 molekula u takve strukture, nakon vezivanja antitelima predmetnog pronalaska, stvara veliku gustinu GT468 antigen-antitelo kompleksa u plazma membranama. Takva velika gustina GT468 antigen-antitelo kompleksa može omogućiti efikasnu aktivaciju sistema komplementa tokom CDC.

[0077] U skladu sa pronalaskom, temin "bolest" odnosi se na patološko stanje, uključujući kancer, posebno one oblike kancera koji su opisani ovde.

[0078] Pod "tumorom" se misli na abnormalnu grupu ćelija ili tkivo koje raste brzom, nekonstrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon nakon stimulansa koji su pokrenuli novi rast. Tumori pokazuju delimičan ili potpun nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i obično formiraju posebnu masu tkiva, koja može biti ili benigna ili maligna.

[0079] Pod "metastazom" podrazumeva se širenje kancerske ćelije od njenog prvobitnog mesta do drugog dela tela. Formiranje metastaze je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, prodiranja endotelijalnih bazalnih membrana da uđu u telesnu šupljinu i sudove, a zatim nakon transporta pomoću krvi, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnoj lokaciji zavisi od angiogeneze. Metastaza tumora često se javlja čak i nakon uklanjanja primarnog tumora, jer tumorske ćelije ili komponente mogu ostati i razviti metastatski potencijal. U jednom tehničkom rešenju, termin "metastaza" prema pronalasku se odnosi na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je daleko od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova,

[0080] Termin "lečenje bolesti" obuhvata lečenje, skraćivanje trajanja, poboljšanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibiranje progresije ili pogoršanja, ili sprečavanje ili odlaganje nastanka bolesti ili njenih simptoma.

[0081] Uzorak može biti bilo koji uzorak koji je koristan prema predmetnom pronalasku, posebno biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak i može se dobiti na konvencionalan način kao što je biopsija tkiva, uključujući biopsiju štipanjem, i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, fekalija ili drugih telesnih tečnosti. Prema pronalasku, termin "biološki uzorak" takođe uključuje i frakcije bioloških uzoraka.

[0082] Termin "antitelo" odnosi se na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, ili njihovim antigen vezujućim delovima. Termin "antitelo" takođe uključuje sve rekombinantne oblike antitela, posebno antitela opisanih ovde, npr., antitela koja su eksprimirana u prokariotima, neglikozilovana antitela, i bilo koje antigen-vezujuće fragmente antitela i derivate kao što je opisan ispod. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. VH i VL regioni mogu biti dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti, koji su označeni kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), isprekidane sa regionima koji su više konzervisani, označene kao okvirni regioni (framework regions - FR). Svaki VH and VL je sastavljen od tri CDRs i četiri FRs, koji su raspoređeni od amino-terminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu:

2

FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0083] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na molekul koji ima mesto za vezivanje antigena suštinski izveden iz imunoglobulina vrste koja nije ljudska, pri čemu je preostala imunoglobulinska struktura molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Mesto vezivanja antigena može ili sadržati kompletne varijabilne domene fuzionisane na konstantne domene ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) koji su graftovani na odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Mesta za vezivanje antigena mogu biti divljeg tipa ili modifikovana jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana da približno liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela održavaju sve CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR regiona iz mišjeg antitela). Ostali oblici imaju jedan ili više CDR regiona koji se menjaju u odnosu na originalno antitelo.

[0084] Termin "himerno antitelo" odnosi se na ona antitela gde jedan deo svake od amino kiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca je homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homologan odgovarajućim sekvencama u drugoj. Obično varijabilni region i lakih i teških lanaca imitira varijabilne regione antitela izvedenih iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologni sekvencama antitela izvedenih iz drugog. Jedna jasna prednost takvih himernih oblika je da se varijabilni region može pogodno izvesti iz trenutno poznatih izvora koristeći lako dostupne B-ćelije ili hibridome iz organizama domaćina koji ne spadaju u ljudsku vrstu u kombinaciji sa konstantnim regionima izvedenim iz, na primer, humanih ćelijskih preparata. Dok varijabilni region ima prednost jednostavnosti pripremanja i na specifičnost ne utiče izvor, konstantni region koji je ljudskog porekla, će manje verovatno da izazove imuni odgovor od ljudskog subjekta kada se antitela injektiraju nego što bi to konstantni region iz ne-ljudskog izvora. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj konkretan primer.

[0085] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo"), kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvedena fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih pojmom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab’)2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom na zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jednog kraja antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovana CDR regiona koji opciono mogu biti spojeni pomoću sintetičkog veznika. Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih metoda, ili sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu napravljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kome se VL i VH regioni sparuju da formiraju monovalentne molekule (poznati kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takva jedolančana antitela bi takođe trebalo da budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući deo" antitela. Dodatni primer je fuzioni proteini sa vezujućim domenom imunoglobulina koji sadrže (i) polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan za polipeptid zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Polipeptid vezujućeg domena može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni proteini vezujućeg domena imunoglobulina su dalje stavljeni na uvid javnosti u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate prosečnim poznavaocima oblasti, i fragmenti su ispitani na korisnost na isti način kao što su intaktna antitela.

[0086] Termin "epitop" označava determinantu proteina sposobnog za vezivanje za antitelo, pri čemu se termin "vezivanje" ovde poželjno odnosi na specifično vezivanje. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju u tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za drugi, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.

[0087] Termin "diskontinuirani epitop", kako se ovde koristi, označava konformacioni epitop na proteinskom antigenu koji je formiran od najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci proteina.

2

[0088] Termin "bispecifičan molekul" bi trebalo da uključi bilo koji agens, npr., ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa (a) antigenom na površini ćelije, i (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Termin "multispecifični molekul" ili "heterospecifični molekul" bi trebalo da da uključi bilo koji agens, npr., ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa (a) antigenom na površini ćelije, i (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije., i (c) najamnje jednom drugom komponentom. Prema tome, pronalazak uključuje, ali nije ograničen na, bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispecifične molekule koji su usmereni na GT468, kao i na druge mete, kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama. Termin "bispecifična antitela" takođe uključuje diatela. Diatela su bivalentna, bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koriščenjem veznika koji je previše kratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, time prisiljavajući domene da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvarajući dva mesta za vezivanje antigena (videti npr. , Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

[0089] Učenje takođe uključuje derivate antitela opisanih ovde. Termin "derivati antitela" se odnosi na bilo koji modifikovani oblik antitela, npr. konjugat antitela i drugi agens ili antitelo. Kao što je ovde korišćeno, antitelo se "izvede iz" određene sekvence germinativne linije ako je antitelo dobijeno iz sistema imunizacijom životinje ili skriningom biblioteke gena imunoglobulina, a gde je izabrano antitelo najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, još poželjnije najmanje 96%, 97%, 98% ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom germinativnim imunoglobulinom genom. Tipično, antitelo izvedeno iz određene sekvence germinatvne linije neće prikazati više od 10 aminokiselinskih razlika, poželjnije, ne više od 5, ili čak poželjnije, ne više od 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinske razlike od aminokiselinske sekvence kodirane genom imunoglobulina germinativne linije.

[0090] Kako je ovde korišćeno, termin "heteroantitela" odnosi se na dva ili više antitela, njihove derivate, ili regione vezivanja antigena povezane zajedno, od kojih najmanje dva imaju različite specifičnosti. Ove različite specifičnosti uključuju specifičnost vezivanja za Fc receptor na efektorskoj ćeliji i specifičnost vezivanja za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji.

2

[0091] Antitela opisana ovde mogu biti humana antitela. Termin "humana antitela", kako je ovde korišćeno, ima za cilj da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih geminatuvnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela mogu uključivati ostatke aminokiselina koji nisu kodirani humanim imunoglobulinskim sekvencama germinativne linije (npr., mutacije uvedene slučajnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).

[0092] Termin "monoklonsko antitelo" kako je ovde korišćeno odnosi se na preparat molekula antitela pojedinačnog molekularnog sastava. Monoklonsko antitelo pokazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. U jednom tehničkom rešenju, monoklonska antitela se proizvode od strane hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu od životinje koja ne spada u ljudsku vrstu, npr., miša, spojenog sa imortalizovanom ćelijom.

[0093] Termin "rekombinantno antitelo", kako je ovde korišćeno, obuhvata sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana pomoću rekombinantnih sredstava, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna uzimajući u obzir imunoglobulinske gene ili hibridom pripremljen odatle, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih, kombinatorijalnih antitela, i (d) antitela pripremljenih, eksprimiranih, kreiranih ili izolovanih na bilo koji drugi način koji uključuje splajsovanje sekvenci imunoglobulinskih gena sa drugim DNK sekvencama.

[0094] Termin "transfektom", kako je ovde korišćeno, uključuje rekombinantne eukariotske ćelije domaćina koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, biljne ćelije, ili gljivične, uključujući ćelije kvasca.

[0095] Kako je ovde korišćeno, "heterologno antitelo" je definisano u odnosu na transgeni organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj koja se nalazi u organizmu koji se ne sastoji od transgenog organizma, i generalno se izvodi iz vrste koja nije transgeni organizam.

[0096] Kako je ovde korišćeno, "heterohibridno antitelo" se odnosi na antitelo koje ima lake i teške lance različitih organizamskih porekla. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan sa lakim lancem je heterohibridno antitelo.

[0097] Antitela opisana ovde su poželjno izolovana. "Izolovano antitelo", kako je ovde korišćeno, ima za cilj da se odnosi na antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za GT468

2

je suštinski bez antitela koja specifično vezuju antigene osim GT468). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog GT468 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost za druge povezane antigene, npr., iz drugih vrsta (npr., GT468 homolozi vrsta). Pored toga, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom tehničkom rešenju pronalaska, kombinacija „izolovanog“ monoklonskog antitela odnosi se na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanoj kompoziciji.

[0098] Prema pronalasku, termin "vezivanje" poželjno se odnosi na "specifično vezivanje". Kako je ovde korišćeno, "specifično vezivanje" se odnosi na vezivanje antitela za unapred određeni antigen. Tipično, antitelo se vezuje sa afinitetom koji odgovara KD od oko 1 x 10<-7>M ili manje, i vezuje se za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KD koja je najmanje dva reda veličine manja od njegovog afiniteta za vezivanje za ne-specifični antigen (npr., BSA, kazein), osim unapred određenog antigena ili blisko-vezanog antigena.

[0099] Termin "KD" (M), kako je ovde korišćeno, bi trebalo da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije posebne antitelo-antigen interakcije.

[0100] Kako je ovde korišćeno, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca.

[0101] Kako je ovde korišćeno, "izotipsko prebacivanje" odnosi se na fenomen pomoću koga se klasa, ili izotip menja iz jedne Ig klase u druge Ig klase.

[0102] Termin "prirodno se pojavljuje" kako je ovde korišćeno kao što se primjenjuje na objekat odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, prirodno se javlja polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući i viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji.

[0103] Termin "preuređen", kako je ovde korišćen odnosi se na konfiguraciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca ili lakog lanca, gde je V segment pozicioniran odmah pored D-J ili J segmenta u konformaciji koja kodira u suštini kompletan VH ili VL domen, redom. Preuređen imunoglobulinski (antitelo) genski lokus može se identifikovati poređenjem sa DNK germinativne linije; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamer/nonamer homologi element.

[0104] Termin „neuređen“ ili "konfiguracija germinativne linije ", kako je ovde korišćeno u pogledu V segmenta, odnosi se na konfiguraciju gde V segment nije rekombinovan tako da bude odmah pored D ili J segmenta.

2

[0105] Termin "molekul nukleinske kiseline", kako je ovde korišćeno, bi trebalo da obuhvati molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančana ili dvolančana, ali poželjno je dvolančana DNK.

[0106] Nukleinske kiseline opisane prema predmetnom učenju su poželjno izolovane. Termin "izolovana nukleinska kiselina" označava predmetno učenje da je nukleinska kiselina bila (i) amplifikovana in vitro, na primer polimeraznom lančanom reakcijom (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, cepanjem i frakcionisanjem gelektroforezom, ili (iv) sintetisana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju tehnikom rekombinantne DNK.

[0107] Nukleinske kiseline mogu, prema predmetnom učenju, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologne ili heterologne. U poželjnim tehničkim rešenjima, nukleinska kiselina je funkcionalno vezana za sekvence za kontrolu ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na pomenutu nukleinsku kiselinu. Termin "homologna" znači da je nukleinska kiselina prirodno i funkcionalno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije, a termin "heterologna" znači da nukleinska kiselina nije prirodno funkcionalno povezana sa kontrolnom sekvencom ekspresije.

[0108] Nukleinska kiselina, kao što je nukleinska kiselina koja eksprimira RNK i/ili protein ili peptid, i sekvenca za kontrolu ekspresije su "funkcionalno" povezane jedna sa drugom, ako su one kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je ekspresija ili transkripcija navedene nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem pomenute sekvence za kontrolu ekspresije. Ako se nukleinska kiselina translatira u funkcionalni protein, onda, sa sekvencom za kontrolu ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom, indukcija navedene sekvence za kontrolu ekspresije dovodi do transkripcije navedene nukleinske kiseline, bez uzrokovanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili navedena kodirajuća sekvenca koja nije sposobna da bude translatirana u željeni protein ili peptid.

[0109] Termin " sekvenca za kontrolu ekspresije" sadrži promotere, mesta vezivanja ribozoma, pojačivače i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju iRNK. U posebnim tehničkim rešenjima, sekvence za kontrolu ekspresije mogu se regulisati. Tačna struktura sekvenci za kontrolu ekspresije može se razlikovati kao funkcija vrste ili tipa ćelije, ali generalno sadrži 5'-netranskribovane i 5'- i 3'-netranslatirane sekvence koje su uključene u iniciranje transkripcije i translacije, redom, kao je TATA kutija, capping (kaptirajuća) sekvenca, CAAT sekvenca i slično. Još specifičnije, 5'- netranskribovane sekvence kontrole

2

ekspresije sadrže region promotera koji uključuje promotersku sekvencu za transkripcionu kontrolu funkcionalno povezane nukleinske kiseline. Sekvence kontrole ekspresije mogu takođe sadržati sekvence pojačivača ili uzvodne aktivatorske sekvence.

[0110] Prema pronalasku termin "promoter" ili "region promotera" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja se nalazi uzvodno (5') prema sekvenci nukleinske kiseline koja je eksprimirana i kontroliše ekspresiju sekvence obezbeđivanjem mesta za prepoznavanje i vezivanje za RNK-polimerazu. "Region promotera" može uključiti dodatna mesta za prepoznavanje i vezivanje za dodatne faktore koji su uključeni u regulaciju transkripcije gena. Promotor može kontrolisati transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Pored toga, promoter može biti "inducibilan" i može započeti transkripciju kao odgovor na indukujući agens ili može biti "konstitutivni" ako transkripcija nije kontrolisana od strane indukujućeg agensa. Gen koji je pod kontrolom inducibilnog promotera nije eksprimiran ili je izražen samo u maloj meri ako je agens za indukovanje nedostupan. U prisustvu agensa za indukovanje gen se uključuje ili se nivo transcripcije povećava. Ovo je posredovano, uopšte, vezivanjem specifičnog transkripcionog faktora.

[0111] Promoteri koji su poželjni u skladu sa predmetnim učenjem obuhvataju promotere za SP6, T3 i T7 polimerazi, humani U6 RNA promoter, CMV promoter, i veštačke promorete istih (npr. CMV) gde su deo ili delovi fuzionisani za deo ili delove promotera gena drugih ćelijskih proteina kao što je npr. humani GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza), i uključujući ili ne uključujući dodatni intron(e),

[0112] U skladu sa predmetnim učenjem, termin "ekspresija" se koristi u svom najopštijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK ili RNK i proteina/peptida. Takođe sadrži delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, izraz se može izvesti privremeno ili stabilno.

[0113] U poželjnom tehničkom rešenju, molekul nukleinske kiseline je u skladu sa učenjem prisutnim u vektoru, gde je prikladno sa promoterom, koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline. Termin "vektor" se ovde koristi u svom najopštijem značenju i obuhvata bilo koji posrednički nosač za nukleinsku kiselinu koji omogućava da se pomenuta nukleinsku kiselinu, na primer, uvede u prokariotske i/ili eukariotske ćelije i, gde je prikladno, da se integriše u genom. Vektori ove vrste su poželjno replikovani i/ili eksprimirani u ćelijama. Vektori sadrže plazmide, fagmide, bakteriofage ili virusne genome. Termin "plazmid", kako je ovde korišćen se uopšteno odnosi na konstrukt ekstrahromozomskog genetičkog materijala, obično kružnog DNK dupleksa, koji se može replicirati nezavisno od hromozomske DNK.

[0114] Kao vektor za ekspresiju antitela, može biti korišćen bilo koji od tipa vektora u kome su teški lanac i laki lanac antitela prisutni u različitim vektorima ili tipa vektora u kome su teški lanac i laki lanac prisutni u istom vektoru.

[0115] Učenje dato ovde u odnosu na specifične sekvence nukleinskih kiselina i amino kiselina, npr. one prikazane u listi sekvenci, treba tumačiti tako da se takođe odnose na modifikacije navedenih specifičnih sekvenci što rezultira sekvencama koje su funkcionalno ekvivalentne pomenutim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinske sekvence koje pokazuju osobine identične ili slične onima specifičnih sekvenci aminokiselina i sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sekvence aminokiselina koje pokazuju svojstva identična ili slična onima aminokiselinskih sekvenci kodiranih specifičnim sekvencama nukleinskih kiselina. Jedna od važnih osobina je zadržavanje vezivanja antitela za njegovu metu ili održavanje efektorskih funkcija antitela. Poželjno, sekvenca modifikovana prema specifičnoj sekvenci, kada ona zameni specifičnu sekvencu u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za GT468 i poželjno funkcije navedenog antitela kako je ovde opisano, npr. CDC posredovana liza ili ADCC posredovana liza.

[0116] Biće cenjeno od strane prosečnih poznavalaca oblasti da se posebno sekvence CDR, hipervariabilnih i promenljivih regiona mogu modifikovati bez gubitka sposobnosti da vezuju GT468. Na primer, CDR regioni će biti ili identični ili visoko homologni regionima antitela koja su ovde navedeni. Pod "veoma homolognim", pretpostavlja se da od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije, mogu biti načinjene u CDR regionima. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu se modifikovati tako da pokazuju značajnu homologiju sa regionima antitela specifično stavljenih ovde na uvid javnosti.

[0117] Treba razumeti da specifične nukleinske kiseline koje su ovde opisane takođe uključuju nukleinske kiseline modifikovane radi optimizacije upotrebe kodona kod posebne ćelije domaćina ili organizma. Razlike u upotrebi kodona između organizama mogu dovesti do raznih problema vezanih za heterolognu gensku ekspresiju. Optimizacija kodona promenom jednog ili više nukleotida prvobitne sekvence može rezultirati optimizacijom ekspresije nukleinske kiseline, posebno u optimizaciji efikasnosti translacije, u homolognom ili heterolognom domaćinu u kome se eksprimira navedena nukleinska kiselina. Na primer ako se prema predmetnom pronalasku koriste nukleinske kiseline koje su izvedene iz humanih i kodirajućih konstantnih regiona i/ili okvirnih regiona antitela, npr. za pripremanje himernih ili humanizovanih antitela, mogu se poželjno modifikovati navedene nukleinske kiseline radi optimizacije upotrebe kodona, posebno ako navedene nukleinske kiseline, opciono spojene sa heterolognim nukleinskim kiselinama kao što se nukleinske kiseline koje su izvedene iz drugih

1

organizama kao što je ovde opisano, eksprimiraju u ćelijama iz organizma različitog od ljudskog kao što je miš ili hrčak. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju humane regione teškog i lakog lanca kao što su one u skladu sa SEK ID BROJEVIMA: 19 i 20, redom, mogu biti modifikovane da uključe jednu ili više, poželjno, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 i poželjno do 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ili 100 ili više nukleotidnih zamena koje rezultiraju optimizovanom upotrebom kodona ali koje ne rezultiraju promenom aminokiselinske sekvence. Takve nukleotidne zamene se poželjno odnose na zamene nukleotida u SEK ID BROJEVIMA: 19 i 20, redom, koje su odabrane od zamena prikazanih u sledećem ravnjanju SEK ID BROJEVIMA: 19 i 20, redom, sa njihovim modifikovanim ekvivalentima i koje ne rezultiraju promenom u kodirajućoj aminokiselinskoj sekvenci ili se odnose na odgovarajuće zamene na odgovarajućim pozicijama u drugim sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju konstantne regione humanog lakog i teškog lanca, redom. Poželjno, sve zamene prikazane u sledećim ravnanjima SEK ID BROJEVIMA: 19 i 20, redom, sa njihovim modifikovanim ekvivalentima i koje ne rezultiraju promenom u kodirajućoj aminokiselinskoj sekvenci su izvršene u sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju konstantne regione humanog lakog i teškog lanca, redom.

Ravnanje SEK ID BR: 19 i SEK ID BR: 21:

Ravnanje SEK ID BR: 20 i SEK ID BR: 23:

2

[0118] Pored toga, može biti poželjno u skladu sa predmetnim učenjem da se modifikuju aminokiselinske sekvence opisane ovde, posebno one humanih konstantnih regiona teškog lanca da bi se sekvenca prilagodila željenom alotipu, npr. alototipu koji je pronađen u kavkaskoj populaciji. Takve modifikacije su poželjno izabrane iz grupe koja sadrži sledeće zamene aminokiselina u okviru SEK ID BR: 17 ili na odgovarajućim pozicijama u okviru drugog huamnih konstantnih regiona teškog lanca: K93R, D235E i L237M. Poželjno, sve ove modifikacije su uključene u aminokiselinske sekvence humanih konstantnih regiona teškog lanaca.

[0119] U skladu sa predmetnim učenjem, termin "odgovarajuće pozicije" odnosi se na nukleotide ili aminokiseline ostatke koje su u ravnanju sekvenci dve nukleinske kiseline ili proteinske sekvence poravnate jedna s drugim.

[0120] Poželjno stepen identičnosti između specifične sekvence nukleinske kiseline opisane ovde i sekvence nukleinske kiseline koja je modifikovana u odnosu na ili koja je varijanta navedene specifične sekvence nukleinske kiseline će biti najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% ili najoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Što se tiče varijanti nukleinske kiseline GT468, stepen identičnosti se poželjno daje za region od najmanje oko 300, najmanje oko 400, najmanje oko 450, najmanje oko 500, najmanje oko 550, najmanje oko 600 ili najmanje oko 630 nukleotida. U poželjnim tehničkim rešenjima, stepen identičnosti se daje za celu dužinu referentne sekvence nukleinske kiseline, kao što su sekvence nukleinskih kiselina date u listi sekvenci. Poželjno, dve sekvence su sposobne da hibridizuju i formiraju stabilan dupleks jedna sa drugim, a hibridizacija se poželjno izvodi pod uslovima koji omogućavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (strogi uslovi). Strogi uslovi su opisani, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., urednici, John Wiley & Sons, Inc., Njujork i odnose se, na primer, na hibridizaciju na 65°C u puferu za hibridizaciju (3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polivinilpirolidon, 0.02% goveđi serum albumim, 2.5 mM NaH2PO4(pH 7), 0.5% SDS, 2 mM

4

EDTA). SSC je 0.15 M natrijum hlorid/0.15 M natrjum citrat, pH 7. Nakon hibridizacije, membrana na koju je DNK prebačena je isprana, na primer, u 2 X SSC na sobnoj temperaturi i zatim u 0.1-0.5 X SSC/0.1 X SDS na temperaturama do 68°C.

[0121] Poželjno će stepen sličnosti, poželjno identičnosti između specifične sekvence aminokiseline opisane ovde i aminokiselinske sekvence koja je modifikovana u odnosu na ili koja je varijanta navedene specifične aminokiselinske sekvence kao što je između aminokiselinskih sekvenci koje pokazuju značajnu homologiju biti najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, čak poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Što se tiče GT468 polipeptidnih varijanti, stepen sličnosti ili identičnosti se daje poželjno za region od najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, najmanje oko 200, najmanje oko 210 ili 212 amino kiselina. U poželjnim tehničkim rešenjima, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne amino kiseline kao što su aminokiselinske sekvence navedene u listi sekvenci.

[0122] Sve gore opisane modifikovane sekvence ili varijante sekvenci su u okviru predmetnog učenja.

[0123] "Sličnost sekvence" označava procenat amino kiselina koji su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve polipeptidne ili sekvence nukleinske kiseline ukazuje na procenat amino kiselina ili nukleotida koji su identični između sekvenci.

[0124] "Procentualna identičnost" se dobija nakon najboljeg poravnanja, taj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence se distribuiraju nasumično i preko njihove cele dužine. Upoređivanje sekvenci između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence konvencionalno se vrši upoređivanjem ovih sekvenci nakon optimalnog ravnjanja, pomenuto poređenje se vrši pomoću segmenta ili "prozora poređenja" kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvence. Optimalno ravnanje sekvence za upoređivanje može se proizvesti, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije po Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math.

2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije po Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48, 443, pomoću metode pretrage sličnosti po Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics softverskom paketu, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0125] Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih pozicija između dve sekvence koje se upoređuju, deleći ovaj broj sa brojem položaja upoređenih i množenjem rezultata dobijenog sa 100 kako bi se dobo procenat identičnosti između ove dve sekvence.

[0126] "Konzervativne supstitucije" mogu se izvesti, na primer, na osnovu sličnosti u polaritetu, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i/ili amfipatskoj prirodi uključenih ostataka. Na primer: (a) nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, tryiptofan, i metionin; (b) polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; (c) pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline uključuju arginin, lizin i histidin, i (d) negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Supstitucije se obično mogu vršiti u okviru grupa (a)-(d). Pored toga, glicin i prolin mogu biti zamenjeni jedan sa drugim na osnovu njihovih sposobnosti da poremete α-helikse. Neke poželjne supstitucije mogu biti načinjene među sledećim grupama: (i) S i T, (ii) P i G i (iii) A, V, L i I. Uzimajući u obzir poznati genetski kod, i rekombinantne i sintetičke DNK tehnike, kvalifikovan naučnik može lako da konstruiše DNK koje kodiraju konzervativne aminokiselinske varijante.

[0127] Predmetno učenje sadrži antitela u kojima su izvršene izmene u regionu Fc u cilju da se promene funkcionalna ili farmakokinetička svojstva antitela. Takve promene mogu dovesti do smanjenja ili povećanja C1q vezivanja i CDC ili FcyR vezivanja i ADCC. Supstitucije mogu, na primer, biti napravljene u jednom ili više aminokiselinskih ostataka konstantnog regiona teškog lanca, čime se uzrokuje promena u efektorskoj funkciji dok se zadržava sposobnost da se veže za antigen u poređenju sa modifikovanim antitelom, cf. US 5,624,821 i US 5,648,260.

[0128] In vivo polu-život antitela može se poboljšati modifikovanjem „salvage“ receptorskog epitopa iz konstantnog domena Ig ili konstantnog domena sličnog Ig, tako da molekul ne sadrži intaktni CH2 domen ili intaktni Ig Fc region, cf. US 6,121,022 i US 6,194,551. In vivo poluživot može se dalje povećati pravljenjem mutacija u regionu Fc, npr. supstitituisanjem treonina za leucin na poziciji 252, supstitituisanjem treonina za serin na poziciji 254 ili supstitituisanjem treonina za fenilalanin na položaju 256, cf. US 6,277,375.

[0129] Pored toga, šablon glikozilacije antitela može biti modifikovan u cilju da se promeni efektorska funkcija antitela. Na primer, antitela mogu biti eksprimirana u transfektomu koji ne dodaje fukoznu jedinicu normalno prikačenu za Asn na poziciji 297 Fc regiona da bi se povećao afinitet Fc regiona za Fc-Receptore koji, za uzvrat, daju povećanu ADCC antitela u prisustvu NK ćelija, cf. Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. Pored toga, modifikacija glikozilacije može se načiniti da bi se modifikovala CDC.

[0130] Alternativno, u još jednom tehničkom rešenju, mutacije se mogu slučajno uvoditi duž celog ili dela kodirajuće sekvence anti-GT468 antitela, kao što je saturacijska mutageneza, a rezultujuća modifikovana anti-GT468 antitela se mogu ispitivati za aktivnost vezivanja.

[0131] Termin "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćina"), kako je ovde korišćeno, treba da se odnosi na ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Treba shvatiti da takvi termini imaju za cilj da se ne odnose samo na posebnu ćeliju subjekta, već na potomstvo takve ćelije. Pošto se u narednim generacijama mogu pojaviti određene modifikacije usled mutacije ili uticaja životne sredine, takvo potomstvo možda, u stvari, nije identično sa roditeljskom ćelijom, ali je i dalje obuhvaćeno terminom "ćelija domaćina" kako je ovde korišćeno. Rekombinantne ćelije domaćina uključuju, na primer, transfektome, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije i limfocitne ćelije.

[0132] Kako je ovde korišćeno, termin "subjekat" uključuje bilo koju životinju koja spada u ljudsku vrstu ili koja ne spada u ljudsku vrstu. Termin "životinja koja ne spada u ljudsku vrstu" obuhvata sve kičmenajke, npr., sisare i one koji nisu sisari, kao što su primati koji ne spadaju u ljudsku vrstu, ovce, psi, krava, pilići, vodozemci, gmizavci itd.

[0133] Termin „transgena životinja "odnosi se na životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgene teških i/ili lakih lanaca, ili transhromozome (bilo integrisih ili neintegrisanih u prirodnu genomsku DNK životinje) i koja je poželjno sposobna da eksprimira transgene. Na primer, transgeni miš može imati humani transgen lakog lanca i ili humani transgen teškog lanca ili humani transhromozom teškog lanca, tako da miš proizvodi humana anti-GT468 antitela kada je imunizovan sa GT468 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju GT468. Humani transgen teškog lanca može se integrisati u hromozomsku DNK miša, kao što je slučaj kod transgenih miševa, npr., HuMAb miševi, kao što su HCo7 ili HCol2 miševi, ili humani transgen teškog lanca može biti održavan ektrahromozomalno, kao u slučaju za transhromozomalne (npr., KM) miševe opisane u WO 02/43478. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi mogu biti sposobni da proizvedu više izotipova humanih monoklonskih atitela za GT468 (npr., IgG, IgA i/ili IgE) podležući V-D-J rekombinaciji i izotipskom prebacivanju.

[0134] "Smanjiti" ili "inhibirati" kako je ovde korišćeno označava sposobnost da se uzrokuje globalno smanjenje, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije od 75% ili više, u nivou, npr., nivou proliferacije ćelija.

Mehanizmi mAb delovanja

[0135] Iako ono što sledi obezbeđuje razmatranja u vezi sa mehanizmom koji leži u okviru terapijske efikasnosti pronalaska antitela, ne sme se smatrati ograničavajućim za pronalazak na bilo koji način.

[0136] Antitela opisana ovde poželjno interaguju sa komponentama imunog sistema, poželjno kroz ADCC ili CDC. Antitela pronalaska se takođe mogu koristiti za ciljanje opterećenja (npr., radioizotopi, lekovi ili toksini) da direktno ubiju tumorske ćelije ili se mogu koristiti sinergistički sa tradicionalnim hemoterapijskim agensima, napadajući tumore pomoću komplementarnih mehanizama delovanja koji mogu uključiti antitumorske imunske odgovore koji mogu biti kompromitovani zahvaljujući neželjenim dejstvima citotoksičnosti hemoterapeutika na T limfocitima. Međutim, antitela pronalaska mogu takođe vršiti dejstvo jednostavno vezivanjem za GT468 na površini ćelije, tako, npr. blokirajući proliferaciju ćelija.

Citotoksičnost posredovana ćelijom zavisna od antitela

[0137] ADCC opisuje sposobnost ubijanja ćelija efektorskih ćelija kako je ovde opisano, posebno limfocita, koja poželjno zahteva da ciljana ćelija bude označena antitelom.

[0138] ADCC poželjno se javlja kada se antitela vezuju za antigene na tumorskim ćelijama i Fc domeni antitela angažuju Fc receptore (FcR) na površini imunskih efektorskih ćelija. Nekoliko familija Fc receptora je identifikovano, a specifične ćelijske populacije karakteristično eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC se može posmatrati kao mehanizam koji direktno indukuje varijabilni stepen neposrednog uništavanja tumora koji dovodi do prikazivanja antigena i indukcije reakcija T-ćelija usmerenih ka tumoru. Poželjno, in vivo indukcija ADCC će dovesti do T-ćelijskih odgovora usmerenih ka tumoru i odgovora antitela izvedenih iz domaćina.

Citotoksičnost zavisna od komplementa

[0139] CDC je još jedna metoda ubijanja ćelija koja može biti regulisana od strane antitela. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 su takođe vrlo efikasni u usmeravanju CDC preko klasičnog puta aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigen-antitelo rezultira otkrivanjem više Clq vezujućih mesta u neposrednoj blizini CH2 domena molekula antitela koji učestvuju kao što su IgG molekuli (Clq je jedna od tri podkomponente komplementa Cl). Poželjno ova otkrivena mesta vezivanja Clq pretvaraju prethodnu interakciju Clq-IgG sa niskim afinitetom u jednu koja ima veliki aviditet, što pokreće kaskadu događaja koji uključuju seriju drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja, efektor-ćelijskih hemotaktičkih/aktivirajućih agenasa C3a i C5a. Poželjno, kaskada komplementa završava se u formiranju membranskog kompleksa za napad, što stvara pore u ćelijskoj membrani što olakšava slobodan prolaz vode i rastvora u i iz ćelije.

Proizvodnja antitela

[0140] Antitela pronalaska mogu biti proizvedena raznim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskog antitela, npr., standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija po Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su procedure hibridizacije somatskih ćelija poželjne, u principu se mogu koristiti druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr. virusne ili onkogene transformacije B-limfocita ili tehnike fagnog displeja pomoću biblioteka gena antitela.

Poželjni sistem životinja za pripremanje hibridoma koji sekretuje monoklonska antitela je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro uspostavljena procedura. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju poznati su u oblasti. Fuzioni partneri (npr., mišje mijelomske ćelje) i procedure fuzije su takođe poznati.

[0141] Drugi poželji sistemi životinja za pripremanje hibridoma koji sekretuju monoklonska antitela su sistem pacova i zeca (npr. opisano u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).

[0142] U još jednom poželjnom tehničkom rešenju, humana monoklonska antitela usmerena ka GT468 mogu se generisati koristeći transgene ili transhromozomalne miševe koji nose delove ljudskog imunološkog sistema, radije nego sistem miša. Ovi transgeni i transhromosomski miševi uključuju miševe poznate kao miševi HuMAb miševi i KM miševi, koji se ovde nazivaju "transgeni miševi". Proizvodnja humanih antitela kod takvih transgenih miševa može se izvesti kao što je detaljno opisano za CD20 u WO2004/035607, sada odobren npr. kao EP1558648 (B1) ili EP2330130 (B1).

[0143] Još jedna strategija za stvaranje monoklonskih antitela je direktno izolovanje gena koji kodiraju antitela iz limfocita koji proizvode antitela definisane strategije npr. videti Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoklonsko antitela from single, isolated lymphocytes producing antitela of defined strategy. Za detalje o inženjeringu rekombinantnih antitela videti takođe Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Imunizacije

[0144] Da bi se generisala antitela za GT468, miševi se mogu imunizovati sa peptidima koji su konjugovani sa nosačem izvedenim iz GT468 sekvence, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog GT468 antigena ili njegovim fragmenatima i/ili ćelijama koje eksprimiraju GT468, kako je opisano. Alternativno, miševi se mogu imunizovati sa DNK koja kodira humani GT468 pune dužine (npr. SEK ID BR: 1) ili njegove fragmente, posebno one koji kodiraju SEK ID BROJEVIMA: 3-10 i 35-79. U slučaju da imunizacije koje koriste prečišćeni ili obogaćeni preparat GT468 antigena ne rezultiraju u antitelima, miševi se takođe mogu imunizovati sa ćelijama koje eksprimiraju GT468, npr., ćelijska linija, za izazivanje imunoloških odgovora.

[0145] Imunološki odgovor može biti nadgledan tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma koji se dobijaju preko repne vene ili retroorbitalnih krvarenja. Miševi sa dovoljnim titrima anti-GT468 imunoglobulina mogu se koristiti za fuzije. Miševi se mogu pojačati intraperitonealno ili intravenski sa ćelijama koje eksprimiraju GT468 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine kako bi se povećao obim specifičnih hibridoma koji sekretuju antitela.

Generisanje hibridoma koji proizvode monoklonska antitela

[0146] Za generisanje hibridoma koji proizvode monoklonska antitela za GT468, splenociti i ćelije limfnog čvora od imunizovanih miševa mogu biti izolovani i fuzionisani sa odgovarajućom immortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. Dobijeni hibridomi se zatim mogu ispitati za proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bunarići mogu zatim da se ispitaju pomoću ELISA za hibridome koji sekretuju antitela. Pomoću imunofluorescencije i FACS analize korišćenjem ćelija koje eksprimiraju GT468, mogu se identifikovati antitela sa specifičnošču za GT468. Hibridomi koji sekretuju antitela mogu se ponovo naneti na ploču, ponovo se ispitati, i ako su i dalje pozitivni za anti-GT468 monoklonska antitela, antitela mogu biti subklonirana ograničavajućim razblaženjem. Stabilni subklonovi se zatim mogu kultivisati in vitro da generišu antitelo u medijumu za kulturu tkiva za karakterizaciju.

Generisanje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela

[0147] Antitela pronalaska mogu takođe biti proizvedena u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i metoda genske transfekcije kao što su dobro poznate u oblasti (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

4

[0148] Na primer, u jednom tehničkom rešenju, gene(i) od interesa, npr., geni antitela, mogu biti ligirani u ekspresioni vektor kao što je eukariotski ekspresioni plazmid kao što je korišćeno pomoću GS genskog ekspresionog sistema stavljenog na uvid javnosti u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841 ili drugih sistema ekspresije dobro poznatih u oblasti. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima antitela može biti uveden u eukariotske ćelije domaćina kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293T ćelije ili HEK293 ćelije ili alternativno druge eukariotske ćelije kao što su čelije izvedene iz biljaka, ćelije gljivica ili kvasca. Metoda korišćena da se uvedu ovi geni mogu biti metode opisane u oblasti kao što je elektroporacija, liofektin, lipofektamin ili druge. Nakon uvođenja ovih gena antitela u ćeliej domaćina, ćelije koje eksprimiraju antitelo mogu bitiidentifikovane i odabrane. Ove ćelije predstavljaju transfektome koji zatim mogu biti amplifikovani za njihov nivo ekspresije i poboljšani da proizvedu antitela. Rekombinanta antitela mogu zatim biti izolovana i prečišćena iz ovih supernatanata kultura i/ili ćelija.

[0149] Alternativno, klonirani geni antitela mogu biti eksprimirani u drugim ekspresionim sistemima, koji uključuju prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, npr. E. coli. Pored toga, antitela mogu biti proizvedena u transgenim životinjama koje ne spadaju u ljudsku vrstu, kao što je u mleku ovaca ili u jajima kokoški, ili u transgenim biljkama; videti npr. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; i Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem.380: 825-839.

Primena delimičnih sekvenci antitela radi ekspresije intaktnih antitela (tj. humanizacija i hmerizacija).

a) Himerizacija

[0150] Mišja monoklonska antitela se mogu koristiti kao terapijska atitela kod ljudi kada su obeležene toksinima ili radioaktivnim izotopima. Neobeležena mišja antitela su visoko imunogena kod čoveka kada se primenjuju u više navrata što dovodi do smanjenja terapijskog efekta. Glavna imunogenost je posredovana pomoću konstantnih regiona teškog lanca. Imunogenost mišjih antitela kod čoveka može se smanjiti ili potpuno izbeći ako su odgovarajuća antitela himerizovana ili humanizovana. Himerna antitela su antitela, različiti delovi koji su izvedeni iz različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju varijabilni region izveden iz mišjeg antitela i konstantnog regiona humanog imunoglobulina. Himerizacija antitela se postiže spajanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjeg antitela sa konstantnim regionom teškog i lakog lanca čoveka (npr. kao što je opisao Kraus et al., u Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). U poželjnom tehničkom rešenju himerna antitela se generišu spajanem humanog konstantnog regiona kapa-lakog lanca sa varijabilnim regionom lakog lanca miša. U takođe poželjnom aspektu himerske antitela mogu se generisati spajanjem humanog konstantnog regiona lambda-lakog lanca sa varijabilnim regionom lakog lanca miša. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG1, IgG3 i IgG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za generiranje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.

b) Humanizacija

[0151] Antitela ineraguju sa ciljnim antigenima preko aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest regiona teškog i lakog lanca koji određuju komplementarnost (CDRs). Iz tog razloga, aminokiselinske sekvence unutar CDR regiona su više raznolike između pojedinih antitela od sekvenci izvan CDR regiona. Pošto su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antiteloantigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koji imitiraju svojstva specifičnih prirodno nastalih anttela konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnih prirodno nastalih antitela graftovanih na okvirne sekvence iz različitog antitela sa različitim svojstvima (videti, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.86: 10029-10033). Ovakve okvirne sekvence mogu se dobiti iz javnih DNK baza podataka koje uključuju sekvence gena antitela germinativne linije. Ove sekvence germinativne sekvence će se razlikovati od zrelih genskih sekvenci antitela, jer ne sadrže potpuno složene varijabilne gene, koji se formiraju time što se V (D) J spajaju tokom sazrevanja B ćelija. Genske sekvence germinativne linije će se takođe razlikovati od sekvenci visokog afinitetnog antitela sekundarnog repertoara pojedinačno ravnomerno duž varijabilnog regiona. Na primer, somatske mutacije su relativno retke u amino terminalnom delu okvirnog regiona 1 i u karboksi-terminalnom delu okvirnog regiona 4. Pored toga, mnoge somatske mutacije značajno ne menjaju vezujuća svojstva antitela. Iz tog razloga nije neophodno da se dobije celokupna DNK sekvenca određenog antitela kako bi se ponovo kreiralo intaktio rekombinantno antitelo sa osobinama vezivanja sličnim onima iz originalnog antitela (videti WO 99/45962). Delimične sekvence teškog i lakog lanca koje obuhvataju CDR regione su obično dovoljne za ovu svrhu. Delimična sekvenca se koristi da bi se odredilo koji germinativni varijabilni i genski segmenti koji se spajaju doprinose varijabilnim genima rekombinovanog antitela. Sekvenca germinativne linije se zatim koristi za popunjavanje nedostajućih delova varijabilnih regiona. Vodeće sekvence teških i lakih lanaca se cepaju tokom sazrevanja proteina i ne doprinose osobinama finalnog antitela. Da bi se dodale sekvence koje nedostaju, klonirane cDNK sekvence mogu se kombinovati sa sintetičkim oligonukleotidima pomoću ligacije ili PCR amplifikacije. Alternativno, čitav varijabilni region se može sintetisati kao skup kratkih, preklapajućih, oligonukleotida i kombinovati pomoću PCR amplifikacije da bi se stvorio potpuno sintetički klon varijabilnog regiona. Ovaj proces ima određene prednosti kao što je eliminacija ili inkluzija ili određena restrikciona mesta. ili optimizacija određenih kodona.

[0152] Nukleotidne sekvence transkripta teških i lakih lanaca iz hibridoma koriste se za dizajniranje preklapajućeg seta sintetičkih oligonukleotida za stvaranje sintetičkih V sekvenci sa identičnim kapacitetima kodiranja aminokiselina kao prirodnih sekvenci. Sintetičke sekvence teškog i kapa lanca mogu se razlikovati od prirodnih sekvenci na tri načina: lanci ponovljenih nukleotidnih baza su prekinuti da bi se olakšala sinteza oligonukleotida i PCR amplifikacija; optimalna mesta za inicijaciju translacije su inkorporirana prema Kozakovim pravilima (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); i HindIII mesta su projektovana uzvodno od mesta inicijacije translacije.

[0153] I za varijabilne regione teškog i lakog lanca, optimizovane kodirajuće i odgovarajuće nekodirajuće sekvence lanca su podeljene na 30-50 nukleotida približno na sredini odgovarajućeg ne-kodirajućeg oligonukleotida. Prema tome, za svaki lanac, oligonukleotidi se mogu sastaviti u preklapajuće dvolančane setove koji obuhvataju segmente od 150-400 nukleotida. Zatim se pulovi koriste kao šabloni za proizvodnju PCR amplifikacionih proizvoda od 150-400 nukleotida. Tipično, jedan set varijabilnih regiona oligonukleotida biće podeljen na dva pula koji se zasebno amplifikuju da generišu dva PCR proizvoda koji se preklapaju. Ovi proizvodi koji se preklapaju zatim se kombinuju pomoću PCR amplifikacije da bi se formirao kompletan varijabilni region. Takođe može biti poželjno uključiti preklapajući fragment konstantnog regiona teškog ili lakog lanca u PCR amplifikaciju da bi se generisali fragmenti koji se lako mogu klonirati u konstrukte ekspresionog vektora.

[0154] Rekonstruisani himerizovani ili humanizovani varijabilni regioni teškog i lakog lanca se zatim kombinuju sa kloniranim sekvencama promotera, lidera, inicijacije translacije, konstantnm regionom, 3’ netranslatiranim, poliadenilacije, i terminacije transkripcije da se formiraju konstrukti ekspresionog vektora. Ekspresioni konstrukti teškog i lakog lanca se mogu kombinovati u pojedinačni vektor, ko-transfektovan, serijski transfektovan, ili odvojeno transfektovan u ćelije domaćina koje su zatim fuzionisane da formiraju ćeliju dmaćina koja eksprimira oba lanca. Plazmidi za kontruisanje ekspresionih vektora za humani IgGκ su opisani ispod. Plazimidi su konstruisani tako da PCR amplifikovane cDNK sekvence V teškog i V kapa

4

lakog lanca mogu biti korišćene da se rekonstruišu kompletno minigeni teškog i lakog lanca. Ovi plazmidi se mogu koristiti za ekspresiju kompletno humanog ili himernog IgG1, Kapa ili IgG4, Kapa antitela. Slični plazmidi mogu se konstruisati za ekspresiju drugih izotipova teškog lanca ili za ekspresiju antitela koja sadrži lambda lake lance.

[0155] Tako, u drugom aspektu pronalaska, strukturne karakteristike anti-GT468 antitela pronalaska, koriste se za stvaranje strukturno povezanih humanizovanih anti-GT468 antitela koja zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu osobinu antitela pronalaska, kao što je vezivanje za GT468. Još specifičnije, jedan ili više CDR regiona monoklonskih antitela miša mogu se rekombinantno kombinovati sa poznatim humanim okvirnim regionima i CDR regionima radi stvaranja dodatnih, rekombinantno-konstruisanih, humanizovanih anti-GT468 antitela pronalaska.

Vezivanje za ćelije koje eksprimiraju antigen

[0156] Sposobnost antitela da veže GT468 se može odrediti korišćenjem standardnih testova za vezvanje, kao što su oni prikazani u primerima (npr., ELISA, Western Blot, imunofluorescencija i analiza protočnom citometrijom).

Karakterizacija vezivanja antitela

[0157] Da se prečiste anti-GT468 antitela, odabrani hibridomi se mogu gajiti u „spinner“ sudovima od dva litra za prečišćavanje monoklonskog antitela. Alternativno, anti-GT468 antitela se mogu proizvoditi u bioreaktorima zasnovanim na dijalizi. Supernatanti se mogu filtrirati i, ako je potrebno, koncentrovai pre afinitetne hromatografije sa protein G-sefarozom ili protein A-sefarozom. Eluirani IgG se može proveriti gel elektroforezom i tečnom hromatografijom visoke performanse kako bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor se može zameniti u PBS, a koncentracija može da se odredi pomoću OD280korišćenjem 1.43 koeficijenta ekstinkcije. Monoklonska antitela se mogu alikvotirati i čuvati na -80°C.

[0158] Za određivanje da li su se odabrana anti-GT468 monoklonska antitela vezala za jedinstvene epitope, mutageneza usmerena na mesto ili mutageneza usmerena na više mesta može biti korišćena.

Određivanje izotipa

[0159] Za određivanje izotipa prečišćenih antitela, izotipski ELISA testovi sa raznim komercijalnim kitovima (npr. Zymed, Roche Diagnostics) mogu biti izvedeni. Bunarići mikrotitarskih ploča mogu biti obloženi sa anti-mišjim Ig. Nakom blokiranja, ploče su reagovale sa monoklonskim antitelima ili prečišćenim izotipskim kontrolama, na ambijentalnoj temperaturi tokom dva sata. Bunarići zatim mogu da reaguju sa ili mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3, IgA mišjim IgM-specifičnim probama konjugovanim sa peroksidazom. Nakon ispiranja, ploče mogu biti razvijene sa ABTS supstratom (1 mg/ml) i analizirane na OD od 405-650. Alternativno, komplet za određivanje izotipova mišjeg monoklonskog antitela IsoStrip Mouse Monoclonal Antitelo Isotyping Kit (Roche, Kat. Br. 1493027) može biti korišćen kako je opisano od strane proizvođača.

Analiza protočnom citometrijom

[0160] Da bi se pokazalo prisustvo anti-GT468 antitela u serumu imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju GT468, može se koristiti protočna citometrija. Ćelijske linije koje eksprimiraju prirodno ili posle transfekcije GT468 i negativne kontrole bez ekspresije GT468 (uzgajaju se pod standardnim uslovima rasta) mogu se mešati sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u hibridomskim supernatantima ili u PBS koji sadrži 1% FBS, i mogu biti inkubirane na 4 °C za 30 min. Posle ispiranja, anti-IgG antitela obeležena sa APC ili Alexa647 mogu se vezati za monoklonsko antitelo vezano za GT468 pod istim uslovima kao i primarno bojenje antitela. Uzorci se mogu analizirati protočnom citometrijom pomoću FACS instrumenta korišćenjem svojstva svetlosti i bočnog rasipanja da se gejtuju (ograniče) pojedinačne, žive ćelije. Da bi se u jednom merenju razlikovala GT468-specifična monoklonska antitela od ne-specifičnih veziva može se koristiti metoda ko-transfekcije. Ćelije privremeno transfektovane sa plazmidima koji kodiraju GT468 i fluorescentni marker mogu se obojiti kao što je gore opisano. Transfektovane ćelije mogu se detektovati u različitom kanalu fluorescencije od ćelija obojenih antitelom. Kako većina transfektovanih ćelija eksprimira oba transgena, GT468-specifična monoklonska antitela se pre svega vezuju za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se ne-specifična antitela vezuju u uporedivom odnosu sa ne-transfektovanim ćelijama. Alternativni test koji koristi fluorescentnu mikroskopiju može se koristiti kao dodatak ili umesto analize protočnom citometrijom. Ćelije se mogu obojiti tačno kao što je gore opisano i ispitano fluorescentnom mikroskopijom.

4

Imunofluorescentna mikroskopija

[0161] Da bi se pokazalo prisustvo anti-GT468 antitela u serumu imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju GT468, može se koristiti analiza imunofluorescentnom mikroskopijom. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju ili spontano ili nakon transfekcije GT468 i negativne kontrole kojima bez GT468 ekspresije su gajene u pločicama sa komorama pod standardnim uslovima za rast u DMEM/F12 medijumu, obogaćenom sa 10 % fetalnim telećims erumom (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 IU/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelije mogu biti fiksirane sa metanolom ili paraformaldehidom ili se ostaviti netretirane. Ćelije zatim reaguju sa monoklonskim antitelima za GT468 tokom 30 min. na 25°C. Nakon ispiranja, ćelije će izreagovatu sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom (Molecular Probes) pod istim uslovima. Ćelije mogu zatim biti ispitane fluoresentnom mikroskopijom.

[0162] Ukupni nivoi GT468 u ćelijama se mogu opaziti kada su ćelije fiksirane metanolom ili fiksirane paraformaldehidom i permeabilizovane sa Triton X-100. U živim ćelijama i nepermeabilizovanim, može se ispitati površinska lokalizacija GT468 ćelija fiksiranih paraformaldehidom. Pored toga, ciljanje GT468 na čvrstim vezama može se analizirati pomoću istovremenog bojenja sa markerima za čvrste veze kao što je ZO-1. Pored toga, mogu se ispitati efekti vezivanja antitela i lokalizacije GT468 unutar ćelijske membrane.

Western Blot

[0163] Anti-GT468 IgG može se dalje testirati na reaktivnost sa GT468 antigenom pomoću Western blotinga. Ukratko, ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju GT468 i odgovarajuće negativne kontrole mogu se pripremiti i podvrgnuti natrijum-dodecil sulfat (SDS) poliakrilamidnoj gel elektroforezi. Nakon elektroforeze, odvojeni antigeni će biti prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani i ispitani monoklonskim antitelima da bi se testirali. Vezivanje IgG se može detektovati korišćenjem anti-mišje IgG peroksidaze i razviti pomoću ECL supstrata.

Imunohistohemija

[0164] Anti-GT468 mišji IgG mogu dalje biti testirani za reativnost sa GT468 antigenom pomoću imunohistohemije na način dobro poznat prosečnom poznavaocu oblasti, npr. korišćenjem kriosekcija fiksiranih paraformaldehidom ili acetonom ili tkivnih sekcija u parafinu fiksiranih sa paraformaldehidom iz uzoraka nekancerskog tkiva ili kancerskog tkiva

4

koji su dobijeni od pacijenata tokom rutinskim hirurških procedura ili iz miševa koji nose tumorske ksenografte inokulirane sa ćelijskim linijama koje eksprimriaju spontano ili nakon transfekcije GT468. Za imunobojenje, antitela reaktivna na GT468 mogu biti inkubirana praćeno sa kozjim antimišjim ili kozjim anti-zečjim antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena (DAKO) prema uputstvima proizvođača.

Fagocitno delovanje i ubijanje ćelija od strane antitela in vitro

[0165] Pored vezivanja specifično za GT468, anti-GT468 antitela se mogu testirati zbog njihove sposobnosti da posreduju u fagocitozi i ubijanju ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovim ćelijskom površinom. Testiranje aktivnosti monoklonskog antitela in vitro će obezbediti inicijalni skrining pre testiranja in vivo modela.

Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC):

[0166] Ukratko, polimorfonuklearne ćelije (polymorphonuclear cells - PMNs), NK ćelije, monociti, mononuklearne ćelije ili druge efektorske ćelije, iz zdravih donora mogu se prečistiti Ficoll Hypaque density centrifugiranjem na osnovu gustine, nakon čega sledi liza kontaminiranih eritrocita. Isprane efektorske ćelije se mogu suspendovati u RPMI obogaćenom sa 10% toplotom inaktiviranog fetalnog telećeg seruma ili, alternativno sa 5% toplotom inaktiviranim humanim serumom i pomešati sa ciljnim ćelijama obeleženim sa<51>Cr koje eksprimiraju GT468 i/ili koji su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, u različitim odnosima efektorskih ćelija u odnosu na ciljne ćelije. Alternativno, ciljne ćelije mogu biti obeležene sa ligandom koji povećava fluorescenciju (BATDA). Visoko fluorescentni helat Europijuma sa poboljšavajućim ligandom koji je oslobođen od mrtvih ćelija može se meriti fluorometrom. Druga alternativna tehnika može da koristi transfekciju ciljne ćelije sa luciferazom. Dodato lucifer žuto može potom biti oksidovano samo pomoću vijabilnih ćelija. Prečišćeni anti-GT468 IgG se zatim može dodati u različitim koncentracijama. Irelevantni humani IgG se može koristiti kao negativna kontrola. Analize se mogu izvoditi tokom 4 do 20 sati na 37 °C u zavisnosti od tipa efektorskih ćelija koja se koristi. Uzorci se mogu analizirati za citolizu merenjem oslobađanja<51>Cr ili prisustvom EuTDA helata u supernatantu kulture. Alternativno, luminescencija koja nastaje iz oksidacije lucifer žuotg može biti mera vijabinih ćelija.

[0167] Anti-GT468 monoklonska antitela mogu takođe biti testirana u raznim kombinacijama da bi se odredilo da li je citoliza poboljšana sa više monoklonskih antitela.

4

Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC):

[0168] Monoklonska anti-GT468 antitela mogu biti testirana za njihovu sposobnost da posreduju CDC korišćenjem raznih poznatih tehnika. Na primer, serum za komplement može biti dobijen iz krvi na način poznat prosečnom poznavaocu oblasti. Da bi se odredila CDC aktivnost mAbs, različite metode mogu biti korišćene. 51Cr oslobađanje se na primer može meriti ili povišena propustljivost membrane može biti procenjena testom isključivanja propidijum jodida (PI). Ukratko, ciljne ćelije se mogu isprati i 5x 10<5>/ml se može inkubirati sa raznim koncentracijama mAb tokom 10-30 min. na sobnoj temperaturi ili na 37°C. Serum ili plazma mogu zatim biti dodati do finalne koncentracije od 20% (v/v) i ćelije se inkubiraju na 37°C tokom 20-30 min. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu se dodati u PI rastvor u FACS epruveti. Smeša može zatim da se analizira odmah analizom na protočnom citometru korišćenjem FACSArray.

[0169] U alternativnom testu, indukcija CDC može se odrediti na adherentnim ćelijama. U jednom tehničkom rešenju ovog testa, ćelije su zasađene 24 h pre testa u gustini od 3 x 10<4>/bunariću u mikrotitarskim pločama sa ravnim dnom za tkivne kulture. Sledeći dan medijum za rast je uklonjen i ćelije su inkubirane u triplikatima sa antitelima. Kontrolne ćelije su inkubirane sa medjumom za rast uli medijumom za rast koji sadrži 0.2% saponina za određivanje lize pozadine i maksimalne lize, redom. Nakon inkubacije tokom 20 min. na sobnoj temperaturi supernatant je uklonjen i 20% (v/v) humana plazma ili serum u DMEM (prethodno zagrejano na 37°C) je dodata u ćelije u inkubirana je tokom još 20 min. na 37°C. Sve ćelije iz svakog uzorka su dodate u rastvor propidijumjodida (10 µg/ml). Zatim, supernatanti su zamenjeni sa PBS koji sadrži 2.5 µg/ml etidijum bromida i emisija fluorescencije nakon ekscitacije na 520 nm je izmerena na 600 nm korišćenjem Tecan Safire. Procenat specifične lize je izračunat kao što sledi: % specifična liza = (fluorescencija uzorkafluorescencija pozadine)/ (fluorescencija maksimalne lize-fluorescencija pozadine) x 100.

Inhibicija ćelijske proliferacije pomoću monoklonskih antitela:

[0170] Da bi se testirala sposobnost za inicijaciju apoptoze, monoklonska anti-GT468 antitela mogu, na primer, biti inkubirana sa GT468 pozitivnim tumorskim ćelijama ili GT468 transfektovanim tumorskim ćelijama na 37°C tokom oko 20 sati. Ćelije se mogu sakupiti, isprati u Aneksin-V vezujućem pufer (BD biosciences), i inkubirati sa Aneksin V konjugovati sa FITC ili APC (BD biosciences) tokom 15 min. u mraku. Sve ćelije iz svakog uzorka se mogu dodati u PI rastvor (10 µg/ml in PBS) u FACS epruveti i proceniti odmah protočnom

4

citometrijom (kao iznad). Alternativno, generalna inhibicija ćelijske proliferacije monoklonskim antitelima se može detektovati sa komercijalno dostupnim kompletima. DELFIA komplet za ćelijsku proliferaciju (Perkin-Elmer, Kat. br. AD0200) je ne-izotopski imunoesej zasnovan na merenju inkorporacije 5-bromo-2’-deoksiuridina (BrdU) tokom sinteze DNK proliferišućih ćelija u mikropločama. Inkorporirani BrdU se detektuje korišćenjem monoklonskog antitela obeleženog europijumom. Da bi se dozvolila detekcija antitela, ćelije su fiksirane i DNK denaturisana korišćenjem Fix rastvora. Nevezano antitelo je isprano i DELFIA induktor je dodat da disociraju joni europijuma od obeleženpg antitela u rastvor, gde oni mogu formirati visoko fluoresentne helate sa komponentama DELFIA induktora. Izmerena fluorescencija - korišćenje vremenski-razlučene fluorometrije u detekciji - je proporcionalno sintezi DNK u ćeliji svakog bunarića.

Prekliničke studije

[0171] Monoklonska antitela koja se vezuju za GT468 takođe mogu biti testirana u in vivo modelu (npr. imuno deficijentni miševi koji nose tumorske ksenografte inokulirane sa ćelijskim linijama koje eksprimiraju GT468, moguće posle transfekcije) da se odredi njihova efikasnost u kontrolisanju rasta tumorskih ćelija koje eksprimiraju GT468.

[0172] In vivo studije nakon fomiranja kseografta tumorskih ćelija koje eksprimiraju GT468 u imunokompromitovane miševe ili druge životinje mogu se obavljati korišćenjem antitela pronalaska. Antitela se mogu administrirati na miševe bez tumora, praćeno ubrizgavanjem tumorskih ćelija za merenje efekata antitela kako bi se sprečilo stvaranje tumora ili simptoma povezanih sa tumorom. Antitela se mogu miševe sa tumorom da bi se utvrdila terapijska efikasnost odgovarajućih antitela za smanjenje rasta tumora, metastaze ili simptoma povezanih sa tumorom. Aplikacija antitela se može kombinovati sa administracijom drugih supstanci kao što su citostatski lekovi, inhibitori faktora rasta, blokatori ćelijskog ciklusa, inhibitori angiogeneze ili druga antitela za određivanje sinergističke efikasnosti i potencijalne toksičnosti kombinacija. Da bi se analizirali sporedni efekti posredovani antitelima pronalaska životinje mogu biti inokulirane sa antitelima ilikontrolnim reagensima i temeljno ispitane za simptome kojimogu biti povezani sa terapijom GT468-antitelom. Mogući sporedni efekti in vivo primene GT468 antitela posebno uključuju toksičnost na tkivima koja eksprimiraju GT468 uključujući placentu. Antitela koja prepoznaju GT468 kod čoveka i u drugim vrstama, npr. miševima, su posebno korisna da predvide potencijalne sporedne efekte posredovane primenom monoklonskih GT468-antitela kod ljudi.

4

Mapiranje epitopa

[0173] Mapiranje epitopa prepoznatih od strane antitela pronalaska može da se izvede kao što je opsiano detaljno u "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) od strane Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 od strane Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

I. Bispecifični/multispecifični molekuli koji se vezuju za GT468

[0174] U još jednom tehničkom rešenju pronalaska, antitela za GT468 mogu biti derivatizovana ili povezana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr. Fab' fragmentom), kako bi se generisao bispecifičan ili multispecifičan molekul koji se vezuje za više vezujućih mesta ili ciljnih epitopa. Na primer, antitelo pronalaska može biti funkcionalno vezano (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili drugačije) za jedan ili više drugih vezujućih molekula, kao što je još jedno antitelo, peptid ili vezujući mimetik.

[0175] Prema tome, predmetno učenje uključuje bispecifične i multispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu specifičnost vezivanja za GT468 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop. U posebnom tehničkom rešenju, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr. humani Fc-gamaRI (CD64) ili humani Fc-alfa receptor (CD89), ili T ćelijski receptor, npr. CD3. Stoga, učenje uključuje bispecifične i multispecifične molekule sposobne za vezivanje za efektorske ćelije koje eksprimiraju Fc-gamaR, i Fc-alfaR ili Fc-epsilonR (npr. monociti, makrofagi ili polimorfonuklearne ćelije (PMNs)), i za ciljne ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom. Ovi bispecifični i multispecifični molekuli mogu da ciljaju ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom za efektorske ćeije i mogu da aktiviraju Fc receptorom-posredovanoe delovanje efektorskih ćelija, kao što je fagocitoza ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), oslobađanje citokina, ili stvaranje superoksidnog anjona.

[0176] Bispecifični i multispecifični molekuli mogu dalje da uključe treću specifičnost vezivanja, pored anti-Fc specifičnosti vezivanja i anti-GT468 specifičnosti vezivanja. U jednom tehničkom rešenju, treća specifičnost vezivanja je deo antipoboljšavajućeg faktora (EF), npr. molekul koji se vezuje za površinski protein uključen u citotoksičnu aktivnost i time povećava imuni odgovor na ciljnu ćeliju. "Deo antipoboljšavajućeg faktora" može biti antitelo, funkcionalni fragment antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr., antigen ili receptor, i time rezultuje u poboljšavanju efekta determinanti vezivanja za Fc receptor ili ciljni ćelijski antigen. "Deo antipoboljšavajućeg faktora" se može vezati za Fc receptor ili ciljni ćelijski antigen. Alternativno, deo antipoboljšavajućeg faktora se može vezati za entitet koji je različit od entiteta za koju se vezuju prve i druge specifičnosti vezivanja. Na primer, deo antipoboljšavajućeg faktora se može vezati za citotoskične T ćelije (npr., putem CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili druge imunske ćelije, što dovodi do povećanog imunološkog odgovora prema ciljnoj ćeliji).

[0177] U jednom tehničkom rešenju, bispecifični i multispecifični molekuli sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo, uključujući, npr., Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, ili jednolančani Fv. Antitelo može takođe biti dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili njihov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što je opisano u Ladner et al., US 4,946,778. Antitelo može takođe biti fuzioni protein sa vezujućim domenom imunoglobulina kao što je stavljeno na uvid javnosti u US2003/0118592 i US 2003/0133939.

[0178] U jednom tehničkom rešenju bispecifični i multispecifični molekuli sadrže specifičnost vezivanja za Fc-gamaR ili Fc-alfaR present na površini efektorske ćelije, i drugu specifičnost vezivanja za ciljni ćelijski antigen, npr., GT468.

[0179] U jednom tehničkom rešenju, specifičnost vezivanja za Fc receptor je obezbeđena pomoću monoklonskog antitela, čije vezivanje nije blokirano humanim imunoglobulinom G (IgG). Kako je ovde korišćeno, termin "IgG receptor" odnosi se na bilo koji od osam gena gama-lanaca koji se nalaze an hormozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih ili solubilnih receptorskih izoformi koje su grupisane u tri Fc-gama receptorske klase: Fc-gamaRI (CD64), Fc-gamaRII (CD32), i Fc-gamaRIII (CD16). U jednom poželjnom tehničkom rešenju, Fc-gama receptor je humani visoko afinitetni Fc-gamaRI.

[0180] Proizvodnja i karakterizacija ovih poželjnih monoklonskih antitela su opisani od strane Fanger et al. u WO 88/00052 i u US 4,954,617. Ova antitela se vezuju za epitop od Fc-gamaRI, Fc-gamaRII ili FcgamayRIII na mestu koje koje se razlikuje od Fcγ vezujućeg mesta receptora i, tako, njihovo vezivanje nije blokirano suštinski fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-Fc-gamaRI antitela korisna u ovom pronalasku su mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. U drugim tehničkim rešenjima, anti-Fcy receptorsko antitelo je humanizovan oblik monoklonskog antitela 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela je opisana u Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol.155 (10): 4996-5002 i WO 94/10332. Ćelijska linija koja proizvodi H22 antitelo je deponovana u Američkoj kolekciji tipova kultura - American

1

Type Culture Collection 4. novembra 1992 pod oznakom HA022CL1 i ima pristupni broj CRL 11177.

[0181] U još nekim drugim poželjnim tehničkim rešenjima, specifičnost vezivanja za Fc receptor je obezbeđena pomoću antitela koje se vezuje za humani IgA receptor, npr., Fc-alfa receptor (Fc-alfaRI (CD89)), tvezivanje koje poželjno nije blokirano humanim imunoglobulinom A (IgA). Termin "IgA receptor" ibi trebalo da obuhvati genski proizvod jednog alfagena (Fc-alfaRI) koji se nalazi na hromozomu 19. Poznato je da ovaj gen kodira nekoliko alternativno splajsovanih transmembranskih izoformi od 55 do 110 kDa. Fc-alfaRI (CD89) je konstitutivno eksprimiran na monocitima/makrofagima, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne na populaciji ne-efektorskih ćelija. Fc-alfaRI ima srednji afinitet i za IgA1 i za IgA2, koja se povećava po izlaganju citokinima kao što su G-CSF ili GM-CSF (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Četiri Fc-alfaRI-specifična monoklonska antitela, identifkovana kao A3, A59, A62 i A77, koja vezuju Fc-alfaRI izvan IgA ligand vezujućeg domena, su opisana (Monteiro, R. C. et al. (1992) J.Immunol. 148: 1764).

[0182] Fc-alfaRI i Fc-gamaRI su poželjni aktivirajući receptori za upotrebu u skladu sa predmetnim učenjem jer (1) su eksprimirani primarno na imunskim efektorskim ćelijama, npr. monocitima, PMNs, makrofagima i dendriskim ćelijama; (2) su eksprimirani na visokim nivoima (npr., 5,000-100,000 po ćeliji); (3) su posrednici citotoksičnih aktivnosti (npr., ADCC, fagocitoza); (4) posreduju poboljšanom antigenskom prikazivanju antigena, uključujući i sopstvene antigene, usmerene ka njima.

[0183] U još jednom tehničkom rešenju bispecifičan molekul se sastoji od dva monoklonska antitela prema pronalasku koja imaju komplementarna funkcionalna dejstva, tako što jedno atitelo pretežno radi indukovanjem CDC-a i drugo antitelo pretežno radi indukovanjem apoptoze.

[0184] „Specifično antitelo efektorske ćelije ", kako je ovde korišćeno, odnosi se na antitelo ili funkcionalni fragment antitela koje vezuje Fc receptor efektorskih ćelija. Poželjna antitela za primenu u predmetnom pronalasku vezuju Fc receptor efektorskih ćelija na mestu koje nije vezano endogenim imunoglobulinom.

[0185] Kako je ovde korišćeno, termin "efektorska ćelija" odnosi se na ćeliju imunog sistema koja je uključena u efektorsku fazu imunog odgovora, suprotno kognitivnim i aktivacionim fazama imnog odgovora. Imunske ćelije koje služe kao primer obuhvataju ćelije mijeloidnog ili limfoidnog porekla, npr. limfo cite (npr., B ćelije i T ćelije uključujući citolitičke T ćelije (CTLs), ćelije ubice, ćelije prirodne ubice, makrofage, monocite, eozinofile, neutrofile,

2

polimorfonuklearne ćelije, granulocite, mastocite, i bazofile. mast ćelije i bazofili. Neke efektorske ćelijeeksprimriaju specifične Fc receptore i sprovode specifične imunološke funkcije. U poželjnim tehničkim rešenjima, efektorska ćelija je sposobna da indukuje ćelijsku citotoksičnosti zavisnu od antitela (ADCC), na primer, neutrofil sposoban da indukuje ADCC. Na primer, monociti, makrofagi koji eksprimiraju FcR su uključeni u specifično ubijanje ciljnih ćelija i prikazivanje antigena drugim komponentama imunog sistema ili vezivanje za ćelije koje prikazuju antigene. U drugim tehničkim rešenjima, efektorska ćelija može fagocitovati ciljni antigen, ciljnu ćeliju ili mikroorganizam. Ekspresija određenog FcR na efektorskoj ćeliji može se regulisati pomoću humoralnih faktora kao što su citokini. Na primer, utvrđeno je da je ekspresija Fc-gamaRI pozitivno regulisana interferonom gama (IFN-y). Ova poboljšana ekspresija povećava citotoksično delovanje ćelija koje nose Fc-gamaRI na mete. Efektorska ćelija može fagocitovati ili lizirati ciljni antigen ili ciljnu ćeliju.

[0186] "Ciljna ćelija" označava svaku nepoželjnu ćeliju kod subjekta (npr., čoveka ili životinje), koja se može ciljati antitelom pronalaska. U poželjnim tehničkim rešenjima, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira ili prekomerno eksprimira GT468 i/ili koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa njenom ćelijskom površinom. Ćelije koje eksprimiraju GT468 i ili koje su obeležene povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom tipično uključuju tumorske ćelije.

[0187] Bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalska mogu biti napravljeni korišćenjem hemijskih tehnika (videti npr., D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), "polidom" tehnika (Videti US 4,474,893, do Čitanja), ili tehnika rekombinantne DNK.

[0188] Posebno, bispecifični i multispecifični molekuli opisani ovde mogu biti pripremljeni konjugovanjem kostituentnih specifičnosti vezivanja, npr., anti-FcR i anti-GT468 specifičnosti vezivanja, korišćenjem metoda poznatih u oblaszi. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog i multispecifičnog molekula se može generisati odvojeno i zatim konjugovati jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, mnoštvo kuplujućih agenasa za unakrsno povezivanje mogu biti korišćeni za kovalentnu konjugaciju. Primeri agenasa za unakrsno povezivanje ukljuluju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA), 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina) (DTNB), ofenilendimaleimid(oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), i sulfo sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) (videti npr., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med.160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 82: 8648). Druge metode uključuju one opisane od strane Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), i Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Poželjni konjugovani agensi su SATA i sulfo-SMCC, oba dostupna od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0189] Kada specifičnosti vezivanja su antitela, ona se mogu konjugovati preko sulfhidrilnog vezivanja C-terminalnog zglobnog regiona dva teška lanca. U naročito poželjnom tehničkom rešenju, zglobni region je modifikovan da sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, poželjno jedan, pre konjugacije.

[0190] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu biti kodirane u istom vektoru i eksprimirane i sastavljene u istoj ćeliji domaćina. Ova metoda je posebno korisna tamo gde je bispecifičan i multispecifičan molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifičan i multispecifičan molekul pronalaska, npr., bispecifičan molekul, može biti jednolančani molekul, kao što je jednolančano bispecifično antitelo, jednolančani bispecifični molekul koji sadrži jednolančano antitelo i vezujuću determinantu, ili jednolančani bispecifičan molekul koji sadrži dve vezujuće determinante. Bispecifični i multispecifični molekuli mogu takođe biti molekuli sa jednim lancem ili mogu sadržati najmanje dva molekula sa jednim lancem. Metode za pripremanje bi- i multispecifičnih molekula su opisane na primer u US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; i US 5,482,858.

[0191] Vezivanje bispecifičnhi i multispecifičnih molekula za njihove specifične mete mogu biti potvrđeni enzimskim imunosorbent esejom (ELISA), radioimunoesejom (RIA), FACS analizom, bioesejom (npr., inhibicija rasta), ili Western Blot esejom. Svaki od ovih eseja generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog značaja korišćenjem obeleženog reagensa (npr., antitelo) specifičnog za kompleks od interesa. Na primer, FcRantitelo kompleksi se mogu detektovati koršćenjem npr., enzimom-vezanog antitela ili fragmenta antitela koji prepoznaje i specifično se vezuje za antitelo-FcR komplekse. Alternativno, kompleksi se mogu detektovati korišćenjem bilo koje od različitih drugih imunoloških analiza. Na primer, antitelo može biti radioaktivno obeleženo i korišćeno u radioimunoeseju (RIA) (videti, na primer, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Mart, 1986). Radioaktivni izotop može da se detektuje takvim načinima kao što su primena γ-brojača ili scintilacionim brojačem ili pomoću autoradiografije.

4

II. Imunokonjugati

[0192] U još jednom aspektu, predmetno učenje predstavlja anti-GT468 antitelo konjugovano za terapijski segment ili agens, kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresant) ili radioizotop. Takvi konjugati ovde se nazivaju "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina nazivaju se "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za i, posebno, ubija ćelije. Primeri uključuju taksol, cithkalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe.

[0193] Pogodni terapijski agensi za formiranje imunokonjugata uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), agense za alkilovanje (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatina), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin) , antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC) i anti-mitotike (npr., vinkristin i vinblastin). U poželjnom tehničkom rešenju, terapijski agens je citotoksični agens ili radiotoksični agens. U drugom tehničkom rešenju, terapijski agens je imunosupresant. U još jednom tehničkom rešenju terapijski agens je GM-CSF. U poželjno tehničkom rešenju, terapijski agens je doksorubicin, cisplatin, bleomicin, sulfat, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid ili ricin A.

[0194] Antitela mogu takođe biti konjugovana za radioizotop, npr., jodin-131, itrijum-90 ili indijum-111, da se generišu citotoksične radiofarmaceutske supstance za lečenje GT468-povezanih poremećaja, kao što je a kancer. Konjugati antitela koji su ovde opisani mogu biti korišćeni za modifikovanje datog biološkog odgovora, i segment leka ne treba tumačiti kao ograničen na klasične hemijske terapijske agense. Na primer, segment leka može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, enzimatski aktivni toksin ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa ili difterijski toksin; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-y, ili, modifikatori biološkog odgovora kao što su, na primer, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 ("IL2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije granulocitne makrofagne kolonije ("GM-CSF"), faktor stimulacije kolonije granulocita ("G-CSF") ili drugi faktori rasta.

[0195] Tehnike za konjugovanje takvog terapijskog segmenta za antitela su dobro poznate, videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (urednici ), str.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2. izdanje), Robinson et al. urednici.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (urednici ), str. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Terapheutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (urednici), str. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

[0196] U daljem tehničkom rešenju, antitela mogu biti prikačena za veznik-helator, npr.

III. Farmaceutske kompozicije

[0197] U još jednom aspektu, predmetno učenje obuhvata kompoziciju, npr., farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jedno ili kombinaciju antitela opisanih ovde. Farmaceutska kompozicija može biti formulisana sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, kao i bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao što su one otkriveni u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. U jednom tehničkom rešenju, kompozicije uključuju kombinaciju više (npr., dva ili više) izolovanih antitela pronalaska koja deluju različitim mehanizmima, npr., jedno antitelo koje uglavnom deluje indukcijom CDC u kombinaciji sa drugim antitelom koje pretežno deluje indukovanjem apoptoze.

[0198] Farmaceutska kompozicijas predmetnog učenja može takođe biti administrirana u kombinovanoj terapiji, tj . kombinovana sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može da uključi kompoziciju predmetnog učenja sa najamnje jednim anti-inflamatornima gensom ili najmanje jednim imunosupresivnim agensom. U jednom tehničkom rešenju takvi terapijski agensi uključuju jedan ili više anti-inflamatornih agenasa, kao što su steroidni lek ili ili NSAID (nesteroidni anti-inflamatorni lek). Poželjni agensi uključuju, na primer, aspirin i drugi salicilati, Cox-2 inhibitori, kao što je rofecoksib (Vioxx) i celekoksib (Celebrex), NSAIDs kao što je ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproksen (Naprosyn), sulindak (Clinoril), diklofenak (Voltaren), piroksikam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumeton (Relafen), etodolak (Lodine), oksaprozin (Daypro), i indometacin (Indocin).

[0199] U još jednom tehničkom rešenju, takvi terapijski agenti obuhvataju agense koji vode do depleciej ili funkcionalne inaktivacije regulatornih T ćelija kao što su niska doza ciklofosfamida, anti-CTLA4 antitela, anti-IL2 ili anti-IL2-receptor antitela.

[0200] U još jednom tehničkom rešenju, takvi terapijski agensi uključuju jedan ili više hemoterapeutika, kao što su derivati Taksola, taksotera, gemcitabin, 5-Fluoruracil, doksorubicin (Adriamycin), cisplatin (Platinol), ciklofosfamid (Cytoxan, Procytox, Neosar). U još jednom tehničkom rešenju, antitela predmetnog učenja mogu da se administriraju u kombinaciji sa hemoterapijskim agensima, koji poželjno pokazuju terapijsku efikasnost kod pacijenata koji boluju od kancera dojke, pluća, želuca i/ili ovarijuma, ili drugih tipova kancera npr. kao što je ovde opisano.

[0201] U još jednom tehničkom rešenju, antitela predmetnog učenja mogu biti administrirana u kombinaciji sa radioterapijom i/ili autolognim perifernim matičnim ćelijama ili transplantacijom koštane srži.

[0202] U još jednom drugom tehničkom rešenju, antitela predmetnog učenja mogu biti administrirana u kombinaciji sa jednim ili više antitela odabranih od anti-CD25 antitela, anti-EPCAM antitela, anti-EGFR, anti-Her2/neu, i anti-CD40 antitela.

[0203] U još jednom daljem tehničkom rešenju, antitela predmetnog učenja mogu biti administrirana u kombinaciji sa anti-C3b(i) antitelom u cilju povećanja aktivacije komplementa.

[0204] Kako je ovde korišćeno, "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata bilo koje i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i agense koji odlažu apsorpciju, i slično koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, subukatnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnua dmiistraciju (npr., pomoću injekcije ili infuzije). U zavisnosti od puta administracije, aktivno jedinjenje, tj., antitelo, bispecifičan i multispecifičan molekul, može biti obloženo materijalom radi zaštite od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.

[0205] "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost osnovnog jedinjenja i ne daje nikakve neželjene toksikološke efekte (videti npr., Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci.66: 1-19).

[0206] Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one koje su izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforna i slično, kao i od netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatske mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanoične kiseline, hidroksi alkanoične kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one koji se dobijaju iz zemno alkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i od netoksičnih organskih amina, kao što je N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.

[0207] Kompozicija predmetnog učenja može da se administrira raznim metodama poznatim u oblasti. Kao što će prepoznati prosečan poznavalac oblasti, put i/ili način administracije će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Aktivna jedinjenja mogu se pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzo otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i sisteme za mikrokapsulirano isporučivanje. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Metode za pripremu takvih formulacija su opšte poznate prosečnim poznavaocima oblasti. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Njujork, 1978.

[0208] Da bi se administriralo jedinjenje pronalaska određenim putevima administracije, može biti neophodno da se obloži jedinjenje sa, ili ko-administrira jedinjenje sa, materijalom radi prevencije njegove inaktivacije. Na primer, jedinjenje može da se administrira subjektu u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomi, ili razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju fiziološki rastvor i vodene rastvore pufera. Lipozomi obuhvataju vodau-ulju-u-vodi CGF emulzije kao i konvencionalne lipozome (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

[0209] Farmaceutski prihvatljiv nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne prahove za pripremu na licu mesta sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti. Osim što bilo koji konvencionalni medijum ili agens nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama pronalaska. Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporirati u kompozicije.

[0210] Teraijske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga određena struktura koja odgovara visokoj koncentraciji leka. Nosač može biti rastvarač ili sredstvo za disperziju koje sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilenglikol i tečni polietilenglikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, primenom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i primenom surfaktanata. U mnogim slučajevima biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može biti izazvana uključivanjem u kompoziciji agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatina.

[0211] Sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremiti inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom.

[0212] Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjne metode pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija), koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilnog filtriranog rastvora.

[0213] Dozni režimi se prilagođavaju da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, jedan bolus može biti administriran, nekoliko podeljenih doza može se administrirati tokom vremena ili doza može biti srazmerno smanjena ili povećana, kao što je pokazano potrebama terapijske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u dozni jedinični oblik za lakšu administraciju i uniformnost doziranja. Jedinični dozni oblik kao što je ovde upotrebljeno odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifičnost za jedinične dozne oblike pronalaska diktira i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja koja su inherentna u oblasti sastavljanja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.

[0214] Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što je askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slično; i (3) agense za heliranje metala, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetnakiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.

[0215] Za terapijske kompozicije, formulacije predmetnog učenja uključuju one pogodne za oralnu, nazalnu, topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, vaginalnu i/ili parenteralnu primenu. Formulacije mogu biti pogodno predstavljene u jediničnom doznom obliku i mogu se pripremiti bilo kojim metodama poznatim u farmaciji. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa materijalom nosača za proizvodnju jedinstvenog doznog oblika variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči, i od posebnog načina primene. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa materijalom nosača za proizvodnju jedinstvenog doznog oblika će generalno biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat.

[0216] Generalno, od sto posto procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0.01 procenta do oko devedeset-devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 1 procenta do oko 30 procenata.

[0217] Formulacije koje su pogodni za vaginalnu administraciju, takođe uključuju pesarije, tampone, kreme, gelove, paste, pene ili formulacije u spreju koje sadrže takve nosače koji su poznati u oblasti kao prikladni. Dozni oblici za topikalnu ili transdermalnu administraciju kompozicija ovog pronalaska obuhvataju prahove, sprejeve, masti, paste, kreme, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalante. Aktivno jedinjenje se može mešati u sterilnim uslovima sa farmaceutskim prihvatljivim nosačem i sa bilo kojim konzervansima, puferima ili propelansima koji mogu biti potrebni.

[0218] Fraze "parenteralna administracija" i "administriran parenteralno" kako je ovde korišćeno označava načine administracije osim enteralne i topikalne administracije, obično pomoću injekcije, i uključuje, bez grančenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsulanur, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0219] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu biti korišćeni u farmaceutskim kompozicijama uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što su maslinovo ulje i injektabilni organski estri, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestice u slučaju disperzija, i primenom surfaktanata.

[0220] Ove kompozicije mogu takođe sadržati adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, sredstva za emulzifikaciju i sredstva za disperziju. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti i procedurama za sterilizaciju, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, paraben, hlorobutanol, fenol sorbinska kiselina i slično. Takođe je poželjno uključiti izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično u kompozicije. Pored toga, produžena apsorpcija injekcionog farmaceutskog oblika može biti ostvarena uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što je aluminijum monostearat i želatin.

[0221] U jednom tehničkom rešenju monoklonska antitela pronalaska su administrirana u kristalnom obliku subkutanom injekcijom, cf. Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939. Kada su jedinjenja predmetnog pronalaska administrirana kao farmaceutske supstance, ljudima ili životinjama, ona mogu biti data sama ili u farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži, na primer, 0.01 do 99.5% (poželjnije, 0.1 do 90%) oaktivnog sastojska u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0222] Bez obzira na odabrani nači administracije, jedinjenja koja su ovde opisana, koja mogu biti korišćena u pogodnom hidratisanom obliku, i/ili farmaceutske kompozicije opisane ovde, se formulišu u farmaceutski prihvatljivim doznim oblicima konvencionalnim metodama koje su poznate prosečnim poznavaocima oblasti.

[0223] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama mogu se menjati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna da postigne željeni terapijski odgovor za određenog pacijenta, kompoziciju, i način primene, bez toksičnosti za pacijenta. Odabrani nivo doze zavisiće od raznih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija koje su upotrebljene, puta administracije, vremena administracije, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje je korišćeno, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, starosti, pola, mase, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istoriju pacijenta koji se leči, i sličnih faktora koji su poznati u medicinskoj oblasti.

[0224] Lekar ili veterinar koji su prosečno stručni u toj oblasti mogu lako odrediti i propisati efikasnu količinu farmaceutske kompozicije koja je potrebna. Na primer, lekar ili veterinar bi mogao započeti doze jedinjenja predmetnog učenja upotrebljenih u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima nižim od potrebnih za postizanje željenog terapijskog efekta i postepeno povećavati dozu do postizanja željenog efekta. Generalno, pogodna dnevna doza kompozicije biće ona količina jedinjenja koja je najniža doza koja je efikasna za proizvodnju terapijskog efekta.

1

Takva efikasna doza će generalno zavisiti od gore opisanih faktora. Poželjno je da administracija bude intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana, poželjno administrirana proksimalno ka mestu cilja. Ako je poželjno, efikasna dnevna doza terapijske kompozicije može se primenjivati kao dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza koje se daju odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom celog dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. Iako je moguće da se jedinjenje predmetnog pronalska administrira samostalno, poželjno je da se jedinjenje administrira kao farmaceutska formulacija (kompozicija).

[0225] U jednom tehničkom rešenju, antitela predmetnog učenja mogu se administrirati infuzijom, poželjno sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, kako bi se smanjili toksični neželjeni efekti. Administracija se takođe može obavljati kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati. Takav režim se može ponoviti jedan ili više puta po potrebi, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Doziranje se može odrediti ili prilagoditi merenjem količine cirkulišućih monoklonskih anti-GT468 antitela nakon administracije u biološkom uzorku korišćenjem anti-idiotipskih antitela koja ciljaju anti-GT468 antitela.

[0226] U još jednom tehničkom rešenju, antitela se administriraju terapijom održavanja, kao što je, npr., jednom nedeljno tokom perioda od 6 meseci ili više.

[0227] U još jednom drugom tehničkom rešenju, antitela u skladu sa predmetnim učenjem mogu biti administrirana režimom koji uključuje jednu infuziju antitela za GT468 praćenu infuzijom antitela za GT468 koji je konjugovan za radioizotop. Režim se može ponoviti, npr., 7 do 9 dana kasnije.

[0228] Terapijske kompozicije se mogu administrirati sa medicinskim uređajima koji su poznati u oblasti. Na primer, u poželjnom tehničkom rešenju, terapijska kompozicija se može administrirati sa hipodermijskim uređajem za ubrizgavanje bez igala, kao što su uređaji koji su stavljeni na uvid javnosti u US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; ili US 4,596,556.

[0229] Primeri dobro poznatih implanata i modula koji su korisni u predmentom pronalasku obuhvataju one opisane u: US 4,487,603, koji stavlja na uvid javnosti implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za dispenzovanje leka pri kontrolisanoj brzini; US 4,486,194, koji stavlja na uvid javnosti terapijski uređaj za administraciju lekova kroz kožu; US 4,447,233, koji stavlja na uvid javnosti infuzionu pumpu za lekove za isporučivanje leka preciznom infuzionom brzinom; US 4,447,224, koji stavlja na uvid javnosti implantabilni aparat za infuziju sa varijabilnim protokom ta kontinuiranu isporuku leka; US 4,439,196, koji stavlja na uvid

2

javnosti osmotski sistem za isporučivanje leka koji ima odeljke od više komora; i US 4,475,196, koji stavlja na uvid javnosti osmotski sistem za isporučivanje leka.

[0230] Mnogi takvi implanti, sistemi za isporučivanje, i moduli su poznati prosečnim poznavaocima oblasti. U određenim tehničkim rešenjima, antitela opisana ovde mogu biti formulisana da se osigura ispravna distribucija in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Da bi se osiguralo da će jedinjenja pronalaska preći BBB (ako je poželjno), ona mogu biti formulisana, na primer, u lipozomima. Za metode proizvodnje, videti, npr., US 4,522,811; US 5,374,548; i US 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više segmenata koji se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, i tako poboljšavaju ciljanu isporuku leka (videti, npr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Ciljajući segmenti koji su dati kao primer uključuju folat ili biotin (videti, npr., US 5,416,0160od Low et al.); manozidaze (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); antitela (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett.357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); i receptor surfaktantnog proteina A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol.1233: 134).

[0231] U jednom tehničkom rešenju, terapijska jedinjenja opisana ovde su formulisana u lipozomima. U poželjnijem tehničkom rešenju, lipozomi uključuju ciljajući segment. U najpoželjnije tehičkom rešenju, terapijska jedinjenja u lipozomima se isporučuju bolus injekcijom na mesto proksimalno do željenog područja, npr. mesto tumora. Kompozicija mora biti fluidna u meri u kojoj postoji lako ubrizgavanje. Mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se sačuvati od kontaminacije mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice.

[0232] U daljem tehničkom rešenju, antitela predmetno učenja se mogu formulisati da se spreći ili smanji njihov transport preko placente. Ovo se može učiniti metodama koje su poznate u oblasti, npr., PEGilacijom antitela ili primeom F(ab)2’ fragmenata. Dodatno se može uputiti na "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin konjugats. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; i na "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol.74: 279-283.

[0233] "Terapijski efikasna doza" za tumorsku terapiju može se meriti objektivnim tumorskim odgovorima koji mogu biti ili potpuni ili delimični. Potpuni odgovor (complete response - CR) definisan je bez kliničkog, radiološkog ili drugog dokaza bolesti. Delimični odgovor (partial response - PR) nastaje iz smanjenja agregatne veličine tumora veće od 50%. Srednje vreme do progresije je mera koja karakteriše izdržljivost objektivnog odgovora tumora.

[0234] "Terapijski efikasna doza" za tumorsku terapiju može se meriti i njenom sposobnošću da stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može se proceniti u sistemu životinjskog modela koji predviđa efikasnost kod tumora čoveka. Alternativno, ova osobina kompozicije može se proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija ili apoptozu in vitro testovima poznatim prosečnom poznavaocu oblasti. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora ili na neki drugi način poboljšati simptome kod subjekta. Prosečan poznavalac oblasti bi mogao utvrditi takve količine na osnovu takvih faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma subjekta, i određena kompozicija u put administracije koji su odabrani.

[0235] Kompozicija mora biti sterilna i fluidna u meri u kojoj se kompozicija može isporučiti špricem. Pored vode, nosač može biti izototoničan puferski fiziološki rastvor, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično) i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, primenom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i primenom surfaktanata. U mnogim slučajevima je poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol ili sorbitol, i natrijum-hlorid u kompoziciji. Dugotrajna apsorpcija injektabilnih kompozicija može može se izazvati uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat ili želatin.

[0236] Kada je aktivno jedinjenje podesno zaštićeno, kao što je opisano iznad, jedinjenje može biti oralno administrirano, na primer, sa inertnim razblaživačem ili prilagodljivim jestivim nosačem.

IV. Primene i metode pronalaska

[0237] Antitela (uključujući imunokonjugate, bispecifičane/multispecifične molekule, preparate i ostale derivate opisane ovde) predmetnog učenja imaju brojne terapijske korisnosti koje uključuju lečenje poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom. Na primer, antitela se mogu administrirati ćelijama u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo, ili ljudskim subjektima, npr. in vivo, da se leče ili spreče razni poremećaji kao što su oni opisani ovde. Kako je ovde upotrebljeno, termin "subjekat" je namenjen uključivanju životinja koje spadaju u judsku vrtsu i koje ne spadaju u ljudsku vrstu koje reaguju na antitela za GT468. Poželjni subjekti uključuju

4

humane pacijente koji imaju poremećaje koji mogu biti korigovani ili poboljšani ubijanjem obolelih ćelija, posebno ćelija koje karakteriše izmenjena ekspresija GT468 i/ili izmenjena ekspresija povezivanja GT468 sa njihovom ćelijskom površinom u poređenju sa normalnim ćelijama.

[0238] Terapijski efekat u tretmanima opisanim ovde je poželjno postignut kroz funkcionalne karakteristike antitela pronalaska da posreduju u ubijanju ćelija npr. indukovanjem lize koja je posredovana citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), lize koja je posredovana ćelijskom citotoksičnošču zavisnom od antitela (ADCC), apoptozom, homotipksom adhezijom, i/ili fagocitozom, poželjno indukovanjem CDC posredovane lize, i/ili ADCC posredovane lize.

[0239] Na primer, u jednom tehničkom rešenju, antitela predmetnog učenja mogu se koristiti za lečenje subjekta sa tumorigenim poremećajem, npr. poremećaj koji se karakteriše prisustvom tumorskih ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koji je okarakterisan povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom uključujući, na primer, kancer dojke. Primeri tumorigenih bolesti koje se mogu lečiti i/ili sprečiti obuhvataju sve kancere koji eksprimiraju GT468 i tumorske entitete uključujući kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer jajnika, hepatocelularni kancer, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer prostate i kancer jetre. Ovi kanceri mogu biti u ranim, srednjim ili naprednim stadijumima, npr. metastaza.

[0240] Farmaceutske kompozicije i metode lečenja opisane u skladu sa predmetnim učenjem ogu takođe biti korišćene za imunizaciju ili vakcinaciju ad se spreči bolest opisana ovde.

[0241] U još jednom tehničkom rešenju, antitela mogu biti korišćena da se detektuju nivoi GT468 ili posebni oblici GT468, ili nivoi ćelija koje sadrže GT468 na površini njihovih membrana, ti nivoi mogu biti vezani za određene bolesti ili simptome bolesti kao što je opisano iznad. Alternativno, antitela mogu biti korišćena da istroše ili ineraguju sa funkcijom ćelija a koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, time implicirajući ove ćelija kao važne medijatore bolesti. Ovo se može postići kontaktiranjem uzorka i kontrolnog uzorka sa anti-GT468 antitelom pod uslovima koji omogućavaju stvaranje kompleksa između antitela i GT468. Bilo koji kompleksi formirani između antitela i GT468 su detektovani i upoređeni u uzorku i kontrolnom uzorku, tj. referentnom uzorku.

[0242] Antitela predmetnog učenja mogu se inicijalno testirati na njihovu vezujuću aktivnost povezanu sa terapijskim ili dijagnostičkim primenama in vitro. Na primer, antitela mogu biti testirana korišćenjem testova na protočnom citometru kako je ovde opisano.

[0243] Pored toga, može se analizirati aktivnost antitela u aktiviranju najmanje jedne aktivnosti efektorske ćelije posredovane efektorom uključujući inhibiranje rasta i/ili ubijanje ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom. Na primer, može se analizirati sposobnost antitela da aktivira CDC i/ili apoptozu. Ovde su opisani protokoli za ispitivanje CDC-a, homotipske adhezije, molekularnog grupisanja ili apoptoze.

[0244] Antitela predmetnog učenja mogu se koristiti za dobijanje in vivo ili in vitro jedne ili više sledećih bioloških aktivnosti: inhibiranje rasta i/ili diferencijacije ćelije koja eksprimira GT468 i/ili koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa njenom ćelijskom površinom; ubijanje ćelija koja eksprimira GT468 i/ili koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa njenom ćelijskom površinom; da posreduje u fagocitozi ili ADCC ćelije koje eksprimira GT468 i/ili koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa svojom ćelijskom površinom u prisustvu efektorskih ćelija; za posredovanje u CDC ćelije koja eksprimira GT468 i/ili koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa svojom ćelijskom površinom u prisustvu komplementa; za posredovanje u apoptozi ćelije koja eksprimira GT468 i/ili koja je okarakterisana povezivanjem GT468 sa svojom površinom ćelije; za indukciju homotipske adhezije; i/ili za indukciju translokacije u lipidne splavove po vezivanju GT468.

[0245] U posebnom tehničkom rešenju, antitela su korišećena in vivo or in vitro da se leče, spreče ili dijagnostikuju razne bolesti povezane sa GT468. Primeri bolesti povezanih sa GT468 uključuju, između ostalih, kancere kao što je kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer ovarijuma, hepatocelularni kancer, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer jednkanja, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer prostate, i kancer jetre.

[0246] Pogodni putevi administracije kompozicija antitela pronalaska in vivo i in vitro su dobro poznati u oblasti i mogu ih odabrati prosečni poznavaoci oblasti.

[0247] Kao što je prethodno opisano, anti-GT468 antitela predmetnog učenja mogu se koadministrirati sa jednim ili drugih više terapijskih agenasa, npr. citotoksičnim agensom, radiotoksičnim agensom, antiangiogenim agensom ili imunosupresivnim agensom za smanjenje indukcije imunih odgovora na antitela. Antitelo može biti povezano sa agensom (kao što je imunokompleks) ili može biti administrirano odvojeno od agensa. U drugom slučaju (odvojena administracija), antitelo se može administrirati pre, posle ili istovremeno sa agensom ili se može primeniti sa drugim poznatim terapijama, npr., anti-kancerskom terapijom, npr. zračenjem. Takvi terapijski agenti uključuju, između ostalog, anti-neoplastične agense kao što je gore navedeno. Ko-administracija anti-GT468 antitela predmetnog učenja sa hemoterapijskim agensima obezbeđuje anti-kancerska agensa koja funkcionišu preko različitih mehanizama koji iamju citotoksični efekat na tumorske ćelije. Takva ko-administracija može rešiti probleme usled razvoja rezistencije na lekove ili antigeničnosti tumora ćelija što bi ih učinilo nereaktivnim sa antitelom.

[0248] U još jednom posebnom tehničkom rešenju, subjekat kome je administrirano antitelo dodatno se leči sa antiagionim agensom uključujući antitela koaj ciljaju VEGF ili VEGFR i jedno ili više hemijskih jedinjenja koja inhibiraju angiogenezu. Prethodni tretman ili paralelna primena ovih lekova može poboljšati penetraciju antitela u velikim tumorima.

[0249] U još jednom posebnom tehničkom rešenju, subjekat kome je administrirano antitelo dodatno se leči sa jedinjenjem koje inhibira signalizaciju receptora za faktor rasta uključujući monoklonska antitela koaj se vezuju za EGFR receptor kao i za hemijska jedinjenja koja inhibiraju signalizaciju iniciranu od strane EGFR, Her1 ili Her2/neu receptora.

[0250] Efektorske ćelije specifične za cilj, npr., efektorske ćelije vezane za kompozicije (npr. antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) predmetnog učenja takođe se mogu koristiti kao terapijski agensi. Efektorske ćelije za ciljanje mogu biti humani leukociti kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Ostale ćelije uključuju eozinofile, ćelije prirodne ubice i druge ćelije koje sadrže IgG ili IgA receptor. Po želji, efektorske ćelije se mogu dobiti od subjekta koji se tretira. Efektorske ćelije specifične za cilj mogu se administrirati kao suspenzija ćelija u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj ćelija administriran može biti u rasponu od 10<8>do 10<9>, ali će se varirati u zavisnosti od terapijskog cilja. Uopšteno, količina će biti dovoljna da se dobije lokalizacija na ciljnoj ćeliji, npr. tumorske ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa svojom ćelijskom površinom, kao i da utiču na ubijanje ćelija npr. fagocitozom. Putevi administracije takođe mogu varirati.

[0251] Terapija sa efektorskim ćelijama specifičnim za cilj može se izvesti u vezi sa drugim tehnikama za uklanjanje ciljanih ćelija. Na primer, anti-tumorska terapija korišćenjem kompozicija pronalaska i/ili efektorskih ćelija obezbeđenih sa ovim kompozicijama može se koristiti u kombinaciji sa hemoterapijom. Pored toga, kombinovana imunoterapija može se koristiti za usmeravanje dve različite citotoksične populacije efektora prema odbacivanju tumorskih ćelija. Na primer, anti-GT468 antitela povezana sa anti-Fc-RI ili anti-CD3 mogu se koristiti u kombinaciji sa IgG ili IgA-receptor specifičnim vezujućim agensima.

[0252] Bispecifični i multispecifični molekuli opisani ovde mogu takođe biti korišćeni da modulišu Fc-gamaR ili Fc-alfaR nivoe na efektorskim ćelijama, kao što je kaptiranje (capping) i elimisanje receptora na ćelijskoj površini. Smeše antti-Fc receptora mogu takođe biti korišćeni za ovu svrhu.

[0253] Kompozicije (npr., antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) predmetnog učenja koje imaju mesta vezivanja komplementa, kao što su delovi IgG1, -2 ili -3 ili IgM koji vezuju komplement, mogu se takođe koristiti u prisustvu komplementa. U jednom tehničkom rešenju, ex vivo tretman populacije ćelija koja sadrži ciljne ćelije sa vezujućim agensom predmetnog učenja i odgovarajućih efektorskih ćelija može se dopuniti dodatkom komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih vezujućim agensom predmetnog učenja može se poboljšati vezivanjem proteina komplementa. U još jednom tehničkom rešenju ciljne ćelije prevučene sa kompozicijama takođe mogu biti lizirane pomoću komplementa. U još jednom tehničkom rešenju, kompozicije učenja ne aktiviraju komplement.

[0254] Kompozicije predmetnog učenja mogu se takođe administrirati zajedno sa komplementom. Prema tome, učenje obuhvata kompozicije koje sadrže antitela, multispecifične ili bispecifične molekuli i serum ili komplement. Ove kompozicije su povoljne u tome što se komplement nalazi u neposrednoj blizini antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli.

[0255] Alternativno, antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli i komplement ili serum mogu se zasebno administrirati. Vezivanje kompozicija predmetnog učenja na ciljne ćelije može prouzrokovati translokaciju GT468 antigen-antitelo kompleksa u lipidne splavove ćelijske membrane. Takva translokacija stvara veliku gustinu antigen-antitelo kompleksa koji mogu efikasno aktivirati i/ili poboljšati CDC.

[0256] Takođe u okvitu obima predmetnog učenja su kompleti koji sadrže kompozicije antitela opisane ovde (npr., antitela i imunokonjugati) i uputstva za upotrebu. Komplet može dalje sadržati jedan ili više dodatnih reagensa, kao što je imunosupresivni reagens, citotoksični agens ili radiotoksični agens ili jedna ili više dodatnih antitela pronalaska (npr., antitelo koje ima komplementarnu aktivnost).

[0257] Prema tome, pacijenti koji su tretirani kompozicijama antitela pronalaska mogu se dodatno administrirati (pre, istovremeno sa. ili nakon administracije antitela pronalaska) sa drugim terapijskim agensom, kao što je citotoksični ili radiotoksični agens, što poboljšava ili povećava terapijski efekat antitela predmetnog učenja.

[0258] U drugim tehničkim rešenjima, subjekat može biti dodatno tretiran sa agensom koji moduliše, npr. poboljšava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Fc-gama ili Fc-alfa receptora pomoću, na primer, tretiranja subjekta sa citokinom. Poželjni ciotkini uključuju faktor stimulacije kolonija (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulovita-makrogafa (GM-CSF), interferon-y (IFN-y), i faktor nekroze tumora (TNF). Drugi važni agensi za povećanje terapijske efikasnosti antitela i farmaceutskih kompozicija koji su ovde opisani su β-glukani koji su homopolisaharidi razgranatih ostataka glukoze i proizvode se od različitih biljaka i mikroorganizama, na primer, bakterija, algi, gljivica, kvasca i žitarica. Fragmenti β-glukana proizvedeni pomoću organizama mogu takođe biti korišćeni. Poželjno, β-glukan je polimer β(1,3) glukoze gde najmanje neke od osnovnih jedinica glukoze, npr.3-6 % osnovnih jedinica glukoze, poseduju grane kao što su β(1,6) grane.

[0259] U posebnom tehničkom rešenju, učenje obezbeđuje metode za detekciju prisustva antigena GT468 u uzorku, ili merenje količine GT468 antigena, koji sadrži stupanje u kontakt uzorka, i kontrolnog uzorka, sa antitelom koje se specifično vezuje za GT468, pod uslovima koji omogućavaju stvaranje kompleks između antitela ili njegovog dela i GT468. Zatim se detektuje formiranje kompleksa, pri čemu je razlika formiranja kompleksa između uzorka u odnosu na kontrolni uzorak indikativna za prisustvo GT468 antigena u uzorku.

[0260] U još jednom drugom tehničkom rešenju, učenje obezbeđuje metodu za detekciju prisustva ili kvantifikovanja količine ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koji su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom in vivo ili in vitro. Ova metoda sadrži (i) administraciju subjektu kompozicije pronalaska kojugovane sa detektabilnim markerom; i (ii) izlaganje subjekta sredstvu za detektovanje navedenog detektabilnog markera za identifikaciju oblasti koje sadrže ćelije koje eksprimiraju GT468 i/ili koje su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom.

[0261] Metode opisane iznad su korisne, posebno, za dijagnostikovanje bolesti povezanih sa GT468 i/ili lokalizaciju bolesti povezanih sa GT468 kao što su kancerske bolesti. Poželjno je količina GT468 u uzorku koja je veća od količine GT468 u kontrolnom uzorku indikativna za prisustvo bolesti povezanih sa GT468 kod subjekta, posebno čoveka, iz kojeg se dobija uzorak.

[0262] U još jednom tehničkom rešenju imunokonjugati pronalaska se mogu koristiti za ciljanje jedinjenja (npr., terapijski agensi, oznake, citotoksini, radiotoksini, imunosupresanti, itd.) do ćelija koji imaju GT468 povezan sa svojom površinom povezivanjem takvih jedinjenja za antitelo. Prema tome, učenje takođe obezbeđuje metode za lokalizaciju ex vivo ili in vitro ćelija koje eksprimiraju GT468 i/ili koji su okarakterisane povezivanjem GT468 sa njihovom ćelijskom površinom, kao što su cirkulišuće tumorske ćelije.

[0263] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima koje ne bi trebalo tumačiti tako da ograničavaju obim pronalska.

PRIMERI

Primer 1: Materijali i metode

[0264] Tehnike i metode koje su ovde pomenute se izvode na način koji je sam po sebi poznat i kao što je opsiano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, . izdanje (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, ili kao št je opsiano ispod. Sve metode uključujući primenu kompleta i reagenasa se izvode u skladu sa informacijama proizvođača.

Tkiva i ćelijske linije

[0265] Rad u vezi sa rekombinantnom DNK je izveden sa zvaničnom dozvolom i u skladu sa pravilima državne vlade Rheinland-Pfalz. Tkiva su dobijena kao humani materijali u višku tokom rutinskih dijagnostičkih ili terapijskih procedura i čuvana su na -80°C do upotrebe. Ćelijske liniej kancera dojke MCF-7 iBT549 su gajene u kulturi u DMEM/10% FCS.

RNK-izolacija, RT-PCR i RT-PCR u realnom vremenu

[0266] Ekstrakcija RNK, sinteza prvog lanca cDNK, RT-PCR i RT-PCR u realnom vremenu su izvedeni kao što je prethodno opisano (Koslowski, M., Sahin, U., Huber, C. & Tureci, O. (2006) Hum. Mol. Genet. 15, 2392-2399). Za analizu na kraju reakcije (end-point) GT468-specifični oligonukleotidi (sens 5’-AAA TTT GGC AGC TGC CTT CAC-3’; antisens 5’-TGA TGC CAC ATT CAG TAA CAC-3’, 60°C hibridizacija) su korišćeni u RT-PCR od 35 ciklusa. Kvantitativni analiza ekspresije u realnom vremenu je izvedena u triplikatima RT-PCR od 40 ciklusa. Nakon normalizacije sa HPRT (sens 5’-TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3’; antisens 5’-GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3’, 62°C hibridizacija) GT468 transkripti u uzorcima tumora su kvantifikovani u odnosu sa normalna tkiva korišćenjem ΔΔCT izračunavanja. Specifičnost PCR reakcija je potvrđena kloniranjem i sekvenciranjem proizvoda amplifikacije iz proizvoljno odabranih uzoraka.

Bioinformatika

[0267] Za in silico kloniranje trofoblast-specifičnih molekula modifikovana je i adaptirana strategija pretrage podataka detaljno opisana na drugim mestima (Koslowski, M., Bell, C., Seitz, G., Lehr, H. A., Roemer, K., Muntefering, H., Huber, C., Sahin, U. & Tureci, O. (2004) Cancer Res. 64, 5988-5993; Koslowski, M., Tureci, O., Bell, C., Krause, P., Lehr, H. A., Brunner, J., Seitz, G., Nestle, F. O., Huber, C. & Sahin, U. (2002) Cancer Res.62, 6750-6755; Koslowski, M., Sahin, U., Huber, C. & Tureci, O. (2006) Hum. Mol. Genet. 15, 2392-2399). Ukratko, hijerarhijska pretraga ključnih reči banke gena GenBank kombinovana je sa oduzimanje digitalne biblioteke cDNK.

[0268] Za pretragu sekvenci nukleotida po ključnoj reči izvršen je pristup banci gena GenBank za gene koji su označeni da se specifično eksprimiraju u placenti ili tkivu trofoblasta korišćenjem sistema ENTREZ Search i Retrieval System (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez). Program za pretragu homologije sekvenci BLASTN (http://ncbi.nlm.nih.gov/blast) je pušten sekvencijalno za svaki nukleotid nasuprot svim humanim nukleotidnim sekvencama da se spreče nepotrebne radnje. Kao drugi filter elektronski Northern (eNorthern) je izveden za sve klonove koji su dobijeni pretragom po ključnoj reči pomoću BLAST pretrage svake od DNK sekvenci od interesa nasuprot EST baze podataka na NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Bilo je uzeto u obzir da nekoliko biblioteka cDNK u javnom domenu nije pravilno označeno (Scheurle, D., DeYoung, M. P., Binninger, D. M., Page, H., Jahanzeb, M. & Narayanan, R. (2000) Cancer Res.60, 4037-4043).

[0269] Za digitalno oduzimanje cDNK xProfiler alat Projekta anatomije kancerskog genoma -Cancer Genome Anatomy Project na NCBI (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) je korišćen, što poredi gensku ekspresiju izmešu dva pula (A i B) cDNK bliblioteka gde svaki pul može biti ili pojedinačna biblioteka ili nekoliko biblioteka. Opcije pretrage za Pul A i Pul B su podešene na "Homo sapiens" za organizam i "sve EST biblioteke" za grupu bliblioteka da se pretraže sve biblioteke cDNK u dbEST. Sve biblioteke cDNK pripremljene iz placente i tkiva trofoblasta koje odgovaraju parametrima pretrage dodeljeni su Pulu A isključujući biblioteke mešovitih tkiva. Za Pul B izabrane su sve cDNK biblioteke pripremljene iz normalnih tkiva, izuzev placente, trofoblasta, testisa, jajnika i fetusa celog tela.

[0270] Za analizu GT468 promotorskog regiona EMBOSS CpGPlot (Rice, P., Longden, I. & Bleasby, A. (2000) Trends Genet.16, 276-277) softver je korišćen. Pored toga, analiza GT468 proteinske sekvence je izvedena sa MEMSAT3 (Jones, D. T., Taylor, W. R. & Thornton, J. M. (1994) Biochemistry 33, 3038-3049), TMpred (Hofmann, K. & Stoffel, W. (1993) Biol. Chem.

1

Hoppe-Seyler 374, 166), i GOR IV (Garnier, J., Osguthorpe, D. J. & Robson, B. (1978) J. Mol. Biol. 120, 97-120).

Antiserum, imunofluorescencija i imunohistohemija

[0271] Poliklonski antiserum koji je gejan za aa 117-127 GT468 je generisan pomoću proizvodnje posebnih antitela (custom antibody service) (Squarix, Marl, Nemačka). Imunohistohemija je izvedena na kriosekcijama tkiva korišćenjem kompleta VECTOR NovaRED Substrate Kit (Vector, Burlingame, CA) u skladu sa upustvima proizvođača. Za Western blot analizu je korišćeno 30 µg ukupnog proteina koji je ekstrahovan iz ćelija liziranih sa Triton-X. Ekstrakti su razblaženi u puferu za redukovanje uzorka (Roth, Karlsruhe, Germany), povrdgnuti SDS-PAGE i zatim prebačeni elektrotransferom na PVDF membranu (Pall, East Hills, NY). Imunobojenje je izvedeno sa antitelima koja su reaktivna na pAKT (Cell Signaling, Danvers, MA), AKT (Cell Signaling, Danvers, MA), ciklinom D1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i beta-aktinom (Abcam, Cambridge, UK) praćeno sa detekcijom primarnog antitela sa kozjim anti-mišjim i kozjim antizečjim sekundarnim antitelima koja su konjugovana sa peroksidazom rena (Dako, Glostrup, Danska).

siRNK dupleksi

[0272] TGT468 siRNK dupleks (Qiagen, Hilden, Germany) (sens 5’-r(CCA UGA GAG UAG CCA GCA)dTdT-3’, antisens 5’-r(UUG CUG GCU ACU CUC AUG G)dAdG-3’) su ciljali nukleotide 670-690 GT468 iRNK sekvence (NM_021796.3). Kao kontrola mešoviti siRNK dupleks (sens 5’-r(UAA CUG UAU AAU CGA CUA G)dTdT-5’, antisens 5’-r(CUA GUC GAU UAU ACA GUU A)dGdA-3’) je korišćen. Za proučavanja GT468 utišavanja ćelije su transfektovane sa 10nM siRNK dupleksa korišćenjem HiPerFect reagensa za transfekciju (Qiagen) u skladu sa upustvima proizvođača. Svi rezultati su reprodukovani sa drugim setom GT468 siRNK dupleksa (sens 5’-r(GGU UCA GGA CAA AGU CCA A)dTdT-3’, antisens 5’-r(UUG GAC UUU GUC CUG AAC C)dGdG-3’) koji ciljaju nukleotide 342-362.

Analiza ćelijske proliferacije nakon transfekcije siRNK

[0273] 24 h nakon transfekcije sa siRNK dupleksima 1x10<4>ćelija je kultivisano tokom 48 h u medijumu koji je obogaćen sa 10% FCS. Proliferacija je analizirana merenjem inkororporacije BrdU u novo sintetisane DNK lance korišćenjem kompleta za ćelijsku proliferaciju DELFIA

2

(Perkin Elmer, Boston, MA) u skladu sa upustvima proizvođača na Wallac Victor2 multi-label brojaču (Perkin Elmer, Boston, MA).

Analiza ćelijskog ciklusa

[0274] Ćelije su kultivisane u medijumu koji je obogaćen sa 10% FCS u varirajućim koncentracijama. 72h nakon transfekcije sa siRNK dupleksima ćelije su sakupljene, EtOH-fiksirane, i bojene sa propidijumjodidon pre analize DNK sadržaja protočnom citometrijom. Ćelije u različitim fazama ćelijskog ciklusa su kvantifikovane korišćenjem CellQuest™ Pro (BD, Franklin Lakes, NJ) i FlowJo™ (Tree Star, Ashland, OR) softvera za analizu protočnom citometrijom. Ćelije u apoptozi su kvantifikovane pomoću bojenja AneksinomV 48 h i 72 h nakon siRNK transfekcije.

Test ćelijske migracije i invazije in vitro

[0275] Testovi ćelijske migracije su izvedeni u komorama sa transbunarićima sa membranama koje imaju veličinu pora od 8.0 µm (BD Biosciences, San Jose, CA) sa ćelijama koje su kultivisane u medijumu bez seruma tokom 12h pre eksperimenata. Za siRNK eksperimente ćelije su prebačene u sudove bez seruma 24 n nakon transfekcije sa siRNK dupleksima kao što je opisano iznad. 4x10<4>ćelija u 400 µl medijuma za kulture bez seruma je dodato u gornju komoru. Donje komore su sadržale 800 µl medijuma za kulture koji je obogaćen sa 5% FCS kao hemoatraktantom. 24 h kasnije ćelije koje su migrirale na donju stranu membrane su fiksirane u ledeno-hladnom metanolu; membrane su izrezane, postavljene na mikroskopske pločice i montirane sa Hoechst (Dako, Glostrup, Danska) za fluorescentnu mikroskopiju. Ćelije u pet nasumičnih vidnih polja (100x uveličanje) su izbrojane za svaku membranu. Svi eksperimenti su urađeni u triplikatima. Efekti na hemokinezu ćelija su analizirani korišćenjem iste eksperimentalne postavke sa hemoatraktantom koji je dodat i u donju i u gornju komoru. Za testove in vitro invazije gornje komore su pripremljene sa 100µl Matrigela (BD Biosciences, San Jose, NJ) razblaženog do 1mg/ml u emdijumu bez seruma. Komore su inkubirane na 37°C tokom 5 h radi formiranja gela.

Analiza ćelijske proliferacije nakon inkubacije sa antitelima

[0276] Kancerske ćelijske linije koje endogeno eksprimiraju GT-468 BT-549, Caov-3, EFO-21, MCF-7, i MDA-MB-231 su inkubirane sa supernatantom hibridoma razblaženom 1:2 u DMEM medijumu za ćelijske kulture tokom 72 h. Proliferacija je analizirana merenjem inkorporacije BrdU u novo sintetisane DNK lance korišćenjem DELFIA kompleta za ćelijsku proliferaciju (Perkin Elmer) u skladu sa upustvima proizvođača na Wallac Victor2 multi-label brojaču (Perkin Elmer).

[0277] Alternativno, kancerske ćelijske linije koje endogeno eksprimiraju GT-468 SK-BR-3 i MCF-7, redom, su inkubirane sa HPLC-prečišćenim hibridomskim supernatantima koji su razblaženi u DMEM medijumu za ćelijske kulture tokom 72 h ili 120 h u koncetracijama kao što je označeno. Proliferacija je analizirana kao što je opisano iznad.

Imunofluorescenta mikroskopija

[0278] U cilju da se pokaže prisustvo anti-GT468 antitela u serumu inunizovanih miševa ili vezovanje monoklonstih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju GT468, imunofluoresentna mikroskopska analiza je korišćena. CHO ćelije transfektovane sa GT468-eGFP su gajene u pločicama sa komorama pod standardnim uslovima za rast u DMEM/F12 medijumu, koji je obogaćen sa 10 % fetalnim telećim serumom (FCS), 2 mM L-glutaminom, 100 IU/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelije su zatm fiksirane sa metanolom ili paraformaldehideom/0. 1%Saponinom. Ćelije su inkubirane sa antitelima za GT468 tokom 60 min. na 25°C. Nakon ispiranja, ćelije su inkubirane sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom (Molecular Probes) pod istim uslovima.

GT468 peptid-specifična ELISA

[0279] Ploče sa mikrobunarićima (Nunc) su obložene tokom jednog sata na 37°C sa relevantnim GT468 peptidom (5µg/ml). Blokiranje je izvedeno sa PBS 3% BSA preko noći na 4°C. Nakon ispiranja tri puta sa PBS, ploče su nalivene sa hibridomskim supernatantima (razblažene 1:5 ili 1: 10 u PBS 3% BSA, 50ml po bunariću) i inkubirani 1h na sobnoj temperaturi (orbitalno šejkiranje na 90 rpm). Sekundarno antitelo (HRPO-konjugovani kozji anti-mišji IgG, Jackson Immunoresearch) u PBS 3% BSA je dodato nakon ispiranja tri puta sa PBS, i inkubirano1h na sobnoj temperaturi uz orbitalno šejkiranje na 90 rpm. Nakon finalnog koraka ispiranja (tri puta sa PBS), rastvor supstrata koji se sastoji od 1.5mM ABTS u 100mM natrijum acetata (pH 5.2) je dodat. Neposredno pre upotrebe, rastvor supstrata je obogaćen sa 0.3µl po ml 30% H2O2. Apsorpcija na 405nm je izmerena na Tecan Safire čitaču ploča (Tecan) nakon 30-60 min.

4

Imunizacije

[0280] U proizvodnji klonova koji su deponovani pod pristupnim br. DSM ACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2), DSM ACC2825 (61C11-2B5), DSM ACC2823 (78H11-1H6), Balb/c ili C57/BL6 su imunizovani sa KLH-kuplovanim peptidima. 50µg peptida sa 50µl Montanida ISA 50V kao adjuvansom su ubrizgani intraperitoenalno (i.p.) na dane 1, 15, 45, i 86. Prisustvo antitela koji su usmereni na GT468 u serumu miševa je praćeno sa peptid-specifičnom ELISA na dane 24, 57, i 92.

[0281] Miševi sa detektabilnim imunskim odgovorima su pojačani (boosted) tri dana pre splenektomije za generisanje monoklonskih antitela.

[0282] U svim drugim slučajevima, Balb/c ili C57/BL6 miševi su imunizovani sa GT468 pcDNA3.1 plazmidom sa PEI Manoyom kao adjuvansom intramuskularno (i.m.) na dan 1 i 15. Posle toga, 50mg peptida sa 50ml Montanida ISA 50V kao adjuvansa (intraperitonealno) ili 150mg proteina sa nekompletnim Freund-ovim adjuvansom (IFA) (subkutano) su ubrizgani na dane 30 i 45. Prisustvo antitela usmerenih na GT468 u serumu miševa je praćeno sa peptidspecifičnom ELISA ili CrELISA. Miševi sa detektabilnim imunskim odgovorima su pojačani tri dana pre splenektomije za generisanje monoklonskih antitela.

Generisanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela za GT468

[0283] Mišji splenociti su izolovani i fuzionisani sa PEG ćelijskom linijom mišjeg mijeloma na osnovu standardnih protokola. Dobijeni hibridomi su zatim ispitani za proizvodnju imunoglobulina sa GT468 specifičnošću korišćenjem peptidspecifične ELISA, GT468 CrELISA i CHO ćelije su transfektovane sa GT468-eGFP pomoću IF.

[0284] Pojedinačne ćelijske suspenzije spleničnih limfocita iz imunizovanih miševa su fuzionisane sa P3X63Ag8U.1 nesekretujućim mišjim mijelomskim ćelijama (ATCC, CRL 1597) u odnosu 2:1 korišćenjem 50% PEG (Roche Diagnostics, CRL 738641). Ćelije su nalivene na ploče približno u 3 x 10<4>/bunariću u mikrotitarskim pločama sa ravnim dnom, praćeno sa oko dvonedeljnom inkubacijom u selektivnom medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 2% hibridomske fuzije i dodatka za kloniranje (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1363 735) plus 10 mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamicin i 1x HAT (Sigma, CRL H0262). Nakon 10 do 14 dana pojedinačni bunarići su ispitani pomoću peptid-specifične ELISA za anti-GT468 monoklonska antitela. Antitela koja sekretuju hibridome su ponovo postavljena, ispitana ponovo i, ako su i dalje pozitivna za antiGT468 monoklonska antitela, subklonirana su pomoću ograničavajućeg razblaživanja. Stabilni subkloni su zatim kultivisani in vitro da bi se generisale male količine antitela u medijumu za tkivnu kulturu za karakterizaciju. Izabran je najmanje jedan klon iz svakog hibridoma, koji je zadržao reaktivnost parentalnih ćelija (pomoću ELISA i IF).

Određivanje izotipova

[0285]Za određivanje izotipova hibridomskih supernatanata, IsoStrip komplet za određivanje izotipova mišjih monoklonskih antitela (Roche, Kat br.1493027) je korišćen kao što je opisano od strane proizvođača.

CrELISA procedura korišćenjem sirovih lizata bakterijskih lizata koji eksprimiraju GT468

Pripremanje antigena

[0286] E. coli XLOLR bakterije su trasformisane ili sa GT468 pQE plazmidom ili pQE koji se se manje insertuje (biće nazvani kao „referenca“) i gajese su u LB medijumu na A600 nm ∼0,35 E. Proteinska ekspresija je indukovana sa 2 mM IPTG, i ćelije su ostavljene da rastu tokom dodatnih 4 h na 37 °C. Pravilna indukcija proteinske ekspresije i njegova kinetika su praćeni analizom Coomassie gela. Bakterije su oborene i resuspendovane u maloj zapremini PBS pH 7.2 koji sadrži 0.2 mM proteaznog inhibitora AEBSF-hidohlorid (AppliChem). Ćelije su postavljene na led i poremećene sonifikacijom (Branson Sonic Power A Smithkline). GT468 i referentni lizati su razblaženi do koncentracije ukupnih proteina od 2 mg/ml u PBS koji sadrži 0.2 mM AEBSF i 20% (v/v) glicerola. Alikvoti su naglo zamrznuti u azotu i čuvani na -70 °C do upotrebe.

• Sprovođenje enzim-vezanog imunosorbent testa

[0287] Pre upotrebe, GT468, kao i referentni lizati, je razblažen u puferu za premazivanje (100 mM HEPES, pH 7.2), zatim prebačen u mikrotitarske ploče sa ravnim dnom F96 Maxisorp (50 m1/well, Nunc) i adsorbovan tokom 2 h na 37 °C.

[0288] Nakon imobilizacije antigena, ploče su isprane dva puta sa puferom za ispiranje (50 mM Tris, 150 mM natrijum hlorid, pH 7.2) koji sadrži 0.1 % Tween 20, i zatim dva puta bez deterdženta. Pedeset mikrolitara humanog seruma razblaženog 1:100 je dodato po bunariću i inkubirano je tokom 1 h na orbitalnom šejkeru na ambijentalnoj temperaturi. U nekim eksperimentima, humani serumi su prethodno tretirani pre podvrgavanja testu.

[0289] Svaki pojedinačni uzorak seruma je testiran u duplikatu paralelno na bunarićima koji su presvučeni sa GT468 ili refentnim lizatom. Ploče su isprane ponovo kao što je opisano iznad i inkubirane tokom 1 h na sobnoj temperaturi sa 50 µl/bunariću sekundarnog antitela (kozje antihumano IgG-AP, Dianova) razblaženog 1:5000 u 50 mM HEPES (pH 7.4) koji sadrži 3% (m/v) mleka u prahu. Ploče su razvijene sa 100 µl/bunariću rastvora supstrata [2 mg 4-nitrofenil fosfat dinatrijum so heksahidrat (Merck) po ml ALP-pufera (Roche Diagnostics, Manhajm, Nemačka)] tokom 30 min na sobnoj temperaturi, i vrednosti apsorbance su odmah očitane na 405 nm na čitaču mikroploča (Victor2 Wallac, Perkin-Elmer, Turku, Finska).

Analiza protočnom citometrijom

[0290] HEK293 ćelije koje su transfektovane sa GT468 pcDNA3.1 plazmidom ili plazmidom koji se manje insertuje (mok) su sakupljene, fiksirane sa ledeno-hladnim metanolom, i blokirane sa PBS/10%FCS tokom 30 min. Ćelije su inkubirane supernatantom hibridoma tokom1h, isprane dva puta sa PBS/1 FCS tokom 10 min, i inkubirane sa kozijim anti-mišjim Cy3 sekundardnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Laboratories).

Western blotovi

[0291] Lizati celih ćelija HEK293 ćelija transfektovanih sa GT468 pcDNA3.1 plazmidom ili ili plazmidom koji se manje insertuje (mok) su pripremljene korišćenjem pufera za lizu zasnovanog na Triton-X (50mM HEPES (pH 7,4), 10%(v/v) Glicerol, 1% (v/v) Triton X-100, 150mM NaCl, 1,5mM MgCl2, 5mM EDTA, 100mM NaF). Ekstrakti su razblaženi u puferu za redukovanje uzorka (Roth), podvrgnuti SDS-PAGE i zatim prebačeni elektrotransferom na PVDF membranu (Pall). Imunobojenje je izvedeno sa poliklonskim antitelom koje je reaktivo na GT468 (Koslowski et al. 2007) praćeno detekcijom primarnog antitela sa kozjim antizečjim sekundardnim antitelima koja su konjugovana sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch Laboratories).

Primer 2: GT468 je aberantno aktivan i visoko eksprimiran u raznim tumorima

[0292] Da bi se identifikovali geni trofoblasta specifični za placentu, strategija pretrage podataka na nivozu genoma je adaptirana, koji smo mi originano razvili za in silico identifikaciju molekula specifičnih za germinativnu ćeliju (Koslowski, M., Bell, C., Seitz, G., Lehr, H. A., Roemer, K., Muntefering, H., Huber, C., Sahin, U. & Tureci, O. (2004) kancer Res. 64, 5988-5993; Koslowski, M., Tureci, O., Bell, C., Krause, P., Lehr, H. A., Brunner, J., Seitz, G., Nestle, F. O., Huber, C. & Sahin, U. (2002) Cancer Res.62, 6750-6755; Koslowski, M., Sahin, U., Huber, C. & Tureci, O. (2006) Hum. Mol. Genet.15, 2392-2399). U principu, hijerarhijska pretraga ključnih reči GenBank banke gena je kombinovana sa digitalnim oduzimanjem cDNK-biblioteke za predviđanje autentičnih placenta-specifičnih gena. Ovim pristupom identifikovan je GT468.

[0293] GT468 iRNK je istražena u sveobuhvatnom setu normalnih i neopslastičnih tkivnih uzoraka pomoću end-point RT-PCR i kvantitativnog RT-PCR u realnom vremenu. Potvrđeno je da je GT468 ekspresija ograničena na placentu. U svim drugim uzorcima normalnog tkiva količine transkripata su ispod ili na granici detekcije visoko senzitivnog RT-PCR (Sl.1A, B, C, Tab. 1). Jedini izuzetak je testis, iako je sa nivoima transkripta 3 do 4 logaritma niži nego one opažene u placenti.

Tabela 1. Ekspresija GT468 u tkivima i ćelijskim linijama klasifikovana pomoću end-point RT-PCR

(nastavak)

[0294] U 38% (86/225) primarnih tkivnih uzoraka za različite tipove kancera i 55% (22/40) tumorskih ćelisjkih linija, međutim, aberantna aktivacija ovog gena sa drugačije tesno kontrolisanom transkripcijom je pronađena. Pevalenca i nivoi transkripta GT468 su najviši kod kancera dojke i ćelijskih linija kancera dojke (Sl.1A, B, C).44 od 62 (82%) uzorci primarnog kancera dojke su bili pozitivni za GT468 ekspresiju (definisanu kao najmanje 100-puta iznad pozadine u ne-trofoblastičnim normalnim tkivima), sa 24% (15/62) koji su pokazali nisku (100-1000puta), 40% (25/62) koji su pokazali srednju (1000-10.000puta), i 17% (11/62) koji su pokazali visoku (>10.000puta) ekspresiju (Sl. 1B). Pored toga, pronašli smo GT468 transkripciju u 21 od 50 (42%) uzoraka kancera pluća kao i u kanceru želuca i ovarijuma (Tab.

1). Indukcija GT468 nije korelisala sa histološkim podtipom, stadijumom tumora ili stepenom tumora.

Primer 3: GT468 se nalazi na površini kancerskih ćelija i dostupan je antitelima

[0295] Poliklonsko zečje antitelo (zešji anti-GT468/C-term) za GT468-specifičan peptidni epitop (aa 117-127 of SEK ID BR: 2) je napravljen. Specifičaost antitela je verifikovana utišavanjem gena GT468 korišćenjem male interferirajuće RNK (siRNK). Da bi se isključilo delovanje siRNK van mete sprovedeni su eksperimenti sa dva seta GT468 specifičnih siRNK dupleksa, „scrambled“ ne-utišavajući oligonukelotidi (scrambled označava sekvence sa istim sastavom ali ne i strukturom) i ne-transfektovane ćelije. Transfekcijom ćelijskih linija kancera dojke MCF-7 i BT-549 sa ovim siRNK dupleksima stabilna i reproducibilna redukcija konstitutivne GT468 iRNK ekspresije za 80-90% u poređenju sa kontrolama je postignuta (Sl.

1D). Konstituent sa ovim opažanjem, 26 kDa traka, detektovan u skladu sa predviđenom veličinom GT468 u Western blotu, skoro je kompletno nestao u obe ćelijske linije (Sl. 1E), dokazujući i snažan nokdaun GT468 proteinske ekspresije i specifičnost antitela.

[0296] Western Blot bojenje GT468 proteina u uzorcima humanih primarnih tkiva sa zečjim anti-GT468/C-term potvrdilo je da je ovaj gen detektabilan u kancerskim uzorcima u nivoima koji se mogu uporediti sa placentom kao jedino normalno tkivo koje je eksprimirano u (Sl.

1F). Imunohistohemija sa zečjim anti-GT468/C-term na sekcijama humanog kancera dojke pokazala je specifičnu imunoreaktivnost u uzorcima koji su se pokazali kao pozitivni za GT468 iRNK ekspresijau pomoću RT-PCR. Bojenje je ograničeno na populaciju neoplastičnih ćelija, dok susedne stromalne i ne-neoplastične epitelne ćelije, kao i odgovarajuća normalna tkiva pacijenta nisu bili reaktivni (Sl. 1G). Imunobojenje tumorskih ćelija je naglašeno na plazma membrani, pružajući dokaz da je GT468 protein ćelijske površine.

[0297] In silico analiza topologije GT468 proteinske sekvence predvidela je da hidrofobni domen obuhvata aa 5 do 22 praćeno sa velikim vanćelijskim domenom koji kontituišu aa 23 do 212. Amino kiseline 29 do 119 vanćelijskog dela GT468 predstvaljaju skraćeni domen zone pellucida (ZP). ZP domen se može naći u raznim vanćelijski izloženim, proteinima sličnim receptoru, uključujući TGF-beta receptor tipa III, uromodulin, glikoprotein GP2 kao i receptore sperme ZP2 i ZP3 (Bork, P. & Sander, C. (1992) FEBS Lett. 300, 237-240) i uključen je u polimerizaciji (Jovine, L., Janssen, W. G., Litscher, E. S. & Wassarman, P. M. (2006) BMC. Biochem. 7, 11). Subćelijska lokalozacija konstitutivno eksprimiranog GT468 je procenjena imunofluorescentnom mikroskopijom MCF-7 i BT-549 ćelija kancera dojke koje su obojene sa zečjim anti-GT468/C-term, koji ima njegov epitop (aa 117 do 127) u pretpostavljenom vanćelijskom delu proteina. Obe ćelijske linije pokazale su različito bojenje na ćelijskoj membrani (Sl. 2A). Gubitak signala po siRNKindukovanom nokdaunu GT468 ekspresije potvrdio je specifičnost bojenja. Najvažnije je da je specifično membransko bojenje opaženo ne samo na nativnim ćelijama fiksiranim metanolom već i na nefiksiranim (Sl. 2B), što implicira da je epitop antitela dostupan bez permeabilizacije ćelijske membrane i time podržava predviđenu topologiju sa vanćelijskom lokalizacijom karboksi-terminusa.

Primer 4: siRNK indukovano utišavanje gena GT468 inhibira pokretljivost, migraciju i invaziju i blokira proliferaciju kancerskih ćelija

[0298] Da bi se odredio biološki značaj GT468 u tumorskim ćelijama, ispitivani su efekti njegovog siRNK indukovanog utišavanja gena na esencijalne ćelijske funkcije.

[0299] Prvo, ispitivan je učinak ćelijskih linija karcinoma dojke MCF-7 i BT-549 u testovima za migraciju sa transbunarićima. Osnovna pokretljivost (hemokineza) obe ćelijske linije procenjena je dodavanjem 5% FCS kao hemoatraktanta i za gornju i donju komoru sistema značajno je inhibirana GT468 specifičnim siRNK dupleksima (Sl. 3A). Stoga, takođe smo opazili značajno smanjenje usmerenog hemotaktičkog migracionog kapaciteta ćelija (Sl.3B). Štaviše, aktivnost hemoinvazije ćelija bila je duboko pogođena sa GT468 siRNK tretmanom, pošto ćelije nisu mogle da migriraju duž gradijenta hemoatraktanta probijanjem barijere Matrigela (Sl.3C).

[0300] Sledeće, opaženo je je proliferacija tumorskih ćelija kao što je izmerena pomoću BrdU inkororporacije u DNK smanjena za 80-90% u obe ćelijske linije pomoću GT468 specifičnih siRNK dupleksa (Sl.4A). Analiza ćelijskog ciklusa otkrila je jasan G1/S zastoj u ćelijama koje su transfektovane sa GT468 siRNK kao osnovni uzrok za proliferacijski blok (Sl.4B). Vitalnost ćelija nije pogođena i bojenje Aneksinom V nije dalo indikacije za apoptotičku ćelijsku smrt (Sl. 4C).

Primer 5: Tretman kancerskih ćelija a anti-GT468 antitelima inhibira rast ćelije

[0301] Merili smo proliferaciju MCF-7 i BT-549 ćelija inkubiranih sa zečjim anti-GT468/C-term i nereaktivnim kontrolnim antitelom. Ciljanje GT468 rezultiralo je efikasnom inhibicijom proliferacije obe ćelijske linije u zavisnosti od koncentracije (Sl.5).

1

Primer 6: Nizvodni efekti siRNK-indukovanog utišavanja i antitelom-indukovane funkcionalne antagonizacije GT468

[0302] Proliferacija i progresija ćelijskog ciklusa u eukariotskim ćelijama je vođena ciklinima i ciklin zavisnim kinazama (CDKs). Pojedinačni ciklini deluju u različitim fazama ćelijskog ciklusa stimulisanjem aktivnosti serije CDKs. Restrikciona kontrolna tačka je posredovana ciklin D- i E-dependent kinazni familijama families (Morgan, D. O. (1997) Annu. Rev. Cell Dev. Biol.13, 261-291; Sherr, C. J. (2000) Cancer Res. 60, 3689-3695). Da bi se ispitalo da li GT468 utišavanje izaziva opaženu disregulaciju ćelijskog ciklusa putem promene ciklin ekspresije, utvrđena je ekspresija ciklina D1, D2, D3 i ciklina E u MCF-7 i BT-549 ćelijama kancera dojke tretiranih sa GT468 siRNK.

[0303] Interesantno, značajna redukcija ckilin D1 transkripata kako je izmereno pomoću PCR-a u realnom vremenu (Sl. 6A) kao i ciklin D1 proteinskih nivoa u Western blotu (Sl. 6B) odigrala se kao posledica GT468 nokdauna. Nije opažena promena u nivoima transkripcije za druge cikline koji su analizirani.

[0304] Ciklin D1 je poznat kao glavni regulator progresije G1 u S ćelijskog ciklusa. Interesantno, u tumorigenezi spoaričnog kancera dojke, premokerma ekspresija ciklina D1 se smatra ranim događajem (Caldon, C. E., Daly, R. J., Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2006) J. Cell Biochem.97, 261-274; Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104). Ciklini D-tipa su nestabilni, i njihova idukcija, sinteza, i sklapanje sa njihovim katalitičkim partnerima svi zavise od uporne mitogene signalizacije. Tako, ciklini D-tipa deluju kao senzori faktora rasta, formirajući aktivme kinaze kao odgovor na vanćelijske faktore (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104; Sherr, C. J. (1993) Cell 73, 1059-1065). Pokazano je kod kancera dojke, da je ekspresija ciklina D1 kontrolisana preko puta zavisnog od fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K)/AKT- (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104; D’Amico, M., Hulit, J., Amanatullah, D. F., Zafonte, B. T., Albanese, C., Bouzahzah, B., Fu, M., Augenlicht, L. H., Donehower, L. A., Takemaru, K. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32649-32657; Muise-Helmericks, R. C., Grimes, H. L., Bellacosa, A., Malstrom, S. E., Tsichlis, P. N. & Rosen, N. (1998) J. Biol. Chem.273, 29864-29872). AKT inaktivira kinazu 3beta glikogen sintaze (GSK-3β), time povećavajući transkripciju ciklina D1 kao i proteolitički promet i njegove proteinske nivoe u nukleusu (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia.9, 95-104, Diehl, J. A., Cheng, M., Roussel, M. F. & Sherr, C. J. (1998) Genes Dev.12, 3499-3511; Radu, A., Neubauer, V.,

2

Akagi, T., Hanafusa, H. & Georgescu, M. M. (2003) Mol. Cell Biol.23, 6139-6149). Dodatno, AKT put je važan regulator pokretljivosti kancerskih ćelija i migracije (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia.9, 95-104, Cantley, L. C. (2002) Science 296, 1655-1657; Luo, J., Manning, B. D. & Cantley, L. C. (2003) Cancer Cell 4, 257-262), dve druge funkcije u kojima je GT468 očigledno uključen. Ovo nas je podstaklo da analiziramo da li GT468 utiče na regulaciju AKT kinaze u MCF-7 i BT-549 ćelijama.

[0305] Konstitutivna fosforilacija i hiperaktivacija AKT-a uzastopno sa prekomernom aktivacijom PI3K često se primećuje u tumorskim ćelijama. Kvantifikacija nivoa fosforilacije Ser473AKT-a (pAKT) nakon utišavanja GT468 pomoću siRNK tehnologije i njegovo funkcionalno antagoniziranje sa oba anti-GT468 antitelom/C-term dovelo je do značajnog smanjenja nivoa pAKT-a posebno u MCF-7 ćelijama (Sl.6C), ukazujući na to da je aktivacija AKT kinaze uključena u izvršavanje nizvodnih efekata GT468. Interesantno je da je negativna regulacija pAKT manje izražena u BT-549 ćelijama, kojima nedostaje PTEN i zbog toga imaju viši nivo prekomerne aktivacije PI3K.

Primer 7: GT468-specifična monoklonska antitela

[0306] Peptidi koji imaju sekvence u skladu sa SEK ID BROJEVIMA: 3-10 su korišćene za generisanje hibridoma koji proizvode monoklonska antitela. Na primer, imunizacija korišćenjem peptida sa SEK ID BR: 3 dala je hibridome 4E9-1H9 i 9B6-2A9, imunizacija korišćenjem peptida sa SEK ID BR: 4 dala je hibridom 59D6-2F2, imunizacija korišćenjem peptida sa SEK ID BR: 6 dala je hibridome 61C11-2B5 i 78H11-1H6.

[0307] Peptid-specifična ELISA je izvedena da se osigura specifično vezivanje monoklonskog antitela. Hibridomski supernatanti su testirani u razblaženju 1:5 ili 1:10 na odgovarajuće peptide kojis u korišćeni zaimunizaciju miševa. Kao kontrola svi hibridomski supernatanti su testirani za dva irelevantna peptida. Sva monoklonska antitela reagovala su specifično samo sa odgovarajućim peptidom koji se koristi za imunizaciju miševa (Sl.7).

[0308] Specifično vezivanje monoklonskih antitela za GT468 protein pune dužine je analiziran imunofluorescentnom (IF) microskopijom. 24 h nakon transfekcije GT468-eGFP fuzionog konstrukta CHO ćelije su bojene sa hibridomskim supernatantima (1:5 razblaženje). Spajanje eGFP signala i signala sekundarnog anti-mišjeg antitela (Alexa555) pokazalo je bojenje samo GT468-eGFP transfektovanih ćeli j adok su ne-transfektovane ćelije bile negativne (Sl.8).

[0309] Radi analize uticaja vezivanja monoklonskih antitela za GT468 na proliferaciju kancerskih ćelija, kancerske ćelijske linije koje endogeno eksprimiraju GT468 - BT-549, Caov3, EFO-21, MCF-7, i MDA-MB-231 su inkubirane sa hibridomskim supernatantima (1:2 razblaženje) tokom 72 h. Proliferacija ćelija je izmerena pomoću BrdU inkorporacije u DNK. Dok monoklonsko antitelo 4E9 1H9 nije promenilo proliferaciju ćelija pri korišćenoj koncentraciji, antitela 9B6 2A9 i 59D6 2F2 su jasno smanjila proliferaciju svih analiziranih ćelijskih linija ćelija (Sl.9).

[0310] Prema tome, pokazano je da mogu da se proizvedu monoklonska antitela koja selektivno ciljaju GT468 eksprimiran od strane ćelija. Pored toga, pokazano je da mogu da se proizvedu monoklonska antitela za GT468 koja inhibiraju proliferaciju kancerskih ćelija koje eksprimiraju GT468.

Primer 8: GT468-specifična monoklonska antitela dobijena od imunizacije sa GT468 pcDNA3.1 plazmidom praćeno sa ubrizgavanjem peptida / proteina

[0311] Dvostruka intramuskularna imunizacija korišćenjem GT468 DNK praćena dvostrukom subkutanom administracijom rekombinantnog GT468 proteina dovela je do hibridoma 22-1A-1, 22-2A-1, 22-9B-1, 23-33A-1 i 23-19A-1. Dvostruka intramuskularna imunizacija korišćenjem GT468 DNK praćena dvostrukom intraperitonealnom administracijom peptida prema SEK ID BR: 10 dovela je do hibridoma F11#33F7D12. Dvostruka intramuskularna imunizacija korišćenjem GT468 DNK praćena dvostrukom intraperitonealnom administracijom peptida prema SEK ID BR: 3 rezultirala je hibridomima 4A122D4 1A10 i 4E9 1D12 2D4.

[0312] Sledeća tabela navodi dobijena antitela i njihove izotipove.

Tabela 2. Monoklonska antitela dobijena pomoću imunizacije sa GT468 DNK praćeno sa ubrizgavanjem peptida / proteina

4

[0313] Sirov lizat (CrELISA) je izveden kako bi se obezbedilo specifično vezivanje monoklonskih antitela iz hibridoma 22-1A-1, 22-2A-1, 22-9B-1, 23-33A-1 i 23-19A-1. Hibridomski supernatanti su testirani za lizat E. coli transformisanom sa GT468 pQE ekspresionim vektorom. Kao kontrola, hibridomski supernatanti su testirani na lizatu E.coli transformisanom sa pQE plazmidom koji se manje insertuje (mok). Sva monoklonska antitela reagovala su specifično samo sa specifičnim GT468 lizatom (Sl.10A).

[0314] Peptid-specifična ELISA je izvedena kako bi se obezbedilo specifično vezivanje monoklonskih antitela iz hibridoma F11#33F7D12, 4A12 2D4 1A10, i 4E9 1D12 2D4. Hibridomski supernatanti su testirani za odgovarajući peptid koji je korišćen za imunizaciju miševa. Kao kontrola, hibridomski supernatanti su testrirani za irelevantni peptid. Monoklonska antitela su reagovala specifično samo sa odgovorajućim peptidom korišćenim za imunizaciju miševa (Sl.10 B).

[0315] Specifično vezivanje monoklonskih antitela za GT468 protein pune dužine je analizirano analizom na protočnom citometru kako je ovde opisano. Za analizu na protočnom citometru monoklonskog antitela 4E9 1D12 2D4 prolazno transfektovane HEK ćelije sa brzinom transfekcije od približno.40% su korišćene. Svi hibridomski supernatanti su pokazali specifično bojenje GT468 transfektovanih ćelija, dok bojenje transfektovanih mok ćelija nije opaženo (Sl.11).

[0316] Specifično vezivanje monoklonskih antitela za GT468 protein pune dužine je analizirano Western blotom. Svi hibridomski supernatanti su pokazali specifičnu reaktivnost sa lizatima HEK293 ćelija transfektovanih sa GT468 pcDNA3.1 ekspresionim plazmidom, dok lizati mok transfektovanih ćelija nisu pokazali signal (Sl. 12; Veruje se da je slab signal hibridomskog supernatanta 23-33A-1 u mok lizatu nastao iz prelivanja HEK GT468 lizata).

[0317] Peptidna ELISA je izvedena da se identifikuju epitope u GT468 proteinu za koje se vezuju monoklonska antitela. Kompletna GT468 proteinska sekvenca je sintetisana kao set od 51 preklapajućeg peptida (15meri) sa preklapanjem od 11 aa. Svi hibridomski supernatanti su testirani u ELISA testu za specifično vezivanje za ove peptide. Kao kontrola, irelevantni peptid je korišćen. Svi supernatanti su pokazali specifično vezivanje za GT468 peptide. Hibridomski supernatanti 22-1A-1, 23-33A-1, i 23-19A-1 svaki je pokazao vezivanje za dva preklapajuća peptida ukazujući na reaktivnost za linearni epitop GT468. Šabloni vezivanja 22-2A-1 i 229B-1 su bili više kompleksni, ukazujući na reaktivnost za konformacione epitope GT468 proteina.

[0318] Da bi se analizirao uticaj vezivanja monoklonskih antitela za GT468 na proliferaciju kancerskih ćelija, kancerske ćelije koje endogeno eksprimiraju GT468 SK-BR-3 (4A122D4 1A10) ili MCF-7 (4E91D12 2D4) su inkubirane sa prečišćenim hibridomskim supernatantima tokom 72 h ili 120 h u koncentracijama kao što je naznačeno na Sl. 14. Proliferacija ćelija je izmerena pomoću BrdU inkorporacije u DNK. Dok irelevantno kontrolno monoklonsko antitelo nije promenilao proliferaciju ćelija, monoklonska antitela 4A122D4 1A10 i 4E91D12 2D4 jasno su smanjila proliferaciju ćelija na način zavistan od koncentracije (Sl.14).

LISTA SEKVENCI

[0319]

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

1

2

4

1

11

��

1

14

1

1

1

1

1

11

11

11

11

11

11

11

12

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se vezuje za aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 i koje posreduje u inhibiciji proliferacije ćelija, gde pomenute ćelije eksprimiraju protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 i/ili su naznačene vezivanjem proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 sa njihovom ćelijskom površinom.

2. Antitelo iz patentnog zahteva 1 gde je pomenuta inhibicija proliferacije ćelija indukovana vezivanjem pomenutog antitela za protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 eksprimiranog od strane pomenutih ćelija i/ili vezanog sa površinom pomenutih ćelija, poželjno vezivanjem pomenutog antitela za vanćelijski domen proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 eksprimiranog od strane pomenutih ćelija i/ili vezanog sa površinom pomenutih ćelija.

3. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2 gde pomenute ćelije koje eksprimiraju protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 i/ili su naznačene vezivanjem proteina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 sa njihovom ćelijskom površinom su kancerske ćelije, poželjno izabrane iz grupe koja se sastoji od tumorigenih ćelija kancera dojke, pluća, želuca, ovarijuma i hepatocelularnog karcinoma.

4. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3 koje je monoklonsko, himerno, humano ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela.

5. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4 odabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, poželjno IgG2a i IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, sekretornog IgA, IgD, i IgE antitela.

6. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5 gde se aminokiselinska sekvenca pomenutog proteina sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa SEK ID BR: 2.

7. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6 gde je pomenuti protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 eksprimiran na površini pomenutih ćelija.

8. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-7 koje se može dobiti metodom koja sadrži korak imunizacije životinje sa proteinom ili peptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 2-10 i 35-79, ili imunogenim fragmentom ili derivatom istog, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćina koja eksprimira pomenuti protein ili peptid, ili imunogeni fragment ili derivat istog.

9. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 8, gde je pomenuto antitelo proizvedeno pomoću klona koji je deponovan pod pristupnim br. DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2) ili DSM ACC2823 (78H11-1H6).

10. Hibridom koji proizvodi antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9 ili hibridom koji je deponovan pod pristupnim br. DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2) ili DSM ACC2823 (78H11-1H6).

11. Konjugat koji sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9 koje je vezano za terapijski agens, poželjno toksin, radioizotop, lek ili citotoksični agens.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9 i/ili konjugat iz patentnog zahteva 11, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

13. Antitelo iz bilo kog patentnog zahteva 1-9 i/ili konjugat iz patentnog zahteva 11 za primenu u metodi lečenja.

14. Antitelo za primenu iz patentnog zahteva 13 konjugat za primenu iz patentnog zahteva 13 ili farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 12 za primenu u metodi lečenja ili prevencije tumorske ili kancerske bolesti ili poremećaja.

15. Antitelo za primenu iz patentnog zahteva 14 konjugat za primenu iz patentnog zahteva 14 ili farmaceutska kompozicija za primenu iz patentnog zahteva 14 gde bolest ili poremećaj je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera pluća, kancera želuca, kancera ovarijuma i hepatocelularnog kancera.

16. Antitelo za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 13 do 15, konjugat za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 13 do 15 ili farmaceutska kompozicija za primenu iz patentnih zahteva 13 do 15 gde je pomenuti protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEK ID BR: 2 eksprimiran na površini pomenutih ćelija.