[go: up one dir, main page]

RS57894B1 - Tretman fibroze - Google Patents

Tretman fibroze

Info

Publication number
RS57894B1
RS57894B1 RS20181140A RSP20181140A RS57894B1 RS 57894 B1 RS57894 B1 RS 57894B1 RS 20181140 A RS20181140 A RS 20181140A RS P20181140 A RSP20181140 A RS P20181140A RS 57894 B1 RS57894 B1 RS 57894B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fibrosis
expression
antibody
fibroblasts
antibodies
Prior art date
Application number
RS20181140A
Other languages
English (en)
Inventor
Stuart Alexander Cook
Sebastian Schaefer
Original Assignee
Singapore Health Serv Pte Ltd
Nat Univ Singapore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=55274842&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57894(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Singapore Health Serv Pte Ltd, Nat Univ Singapore filed Critical Singapore Health Serv Pte Ltd
Publication of RS57894B1 publication Critical patent/RS57894B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na dijagnozu i lečenje fibroze.
Stanje tehnike
[0002] Fibroza je značajni proces koji predstavlja kritičan deo zarastanja rana. Prekomerna fibroza je uobičajena kod mnogih retkih i uobičajenih bolesnih stanja, i važna je za patogenezu bolesti. Bolesti koje karakteriše prekomerna fibroza uključuju, ali nisu ograničene na: sistemsku sklerozu, sklerodermu, hipertrofičnu kardiomiopatiju, dilatiranu kardiomiopatiju (DCM), atrijalnu fibrilaciju, ventrikularnu fibrilaciju, miokarditis, cirozu jetre, bolesti bubrega, bolesti oka, astmu, artritisa i idiopatske plućne fibroze. Uprkos velikom uticaju na ljudsko zdravlje, terapeutski i dijagnostički pristupi fibrozi su i dalje neuslišena medicinska potreba.
[0003] Prava fiziološka uloga Interleukina 11 (IL-11) ostaje nejasna. IL-11 je najjače povezan sa aktivacijom hematopoetskih ćelija i sa proizvodnjom trombocita, ali takođe je pro-, kao i anti-upalni, proangiogen i važan za neoplaziju. Poznato je da TGFβ1 ili povreda tkiva može izazvati eksprimiranje IL-11 (Zhu, M. i dr. IL-11 ublažava imunološku ishemiju jetre/repurfuzionu povredu (IRI) putem STAT3 signalnog puta kod miševa. PLOS ONE 10, (2015); Yashiro, R. i dr. Transformacija faktora rasta-beta stimuliše proizvodnju interleukina-11 ljudskom periodontalnom ligamentu i gingivalnim fibroblastima. J. Clin. Periodontol. 33, 165-71 (2006); Obana, M. i dr. Terapeutska aktiviranje transduktora signala i aktivatora transkripcije 3 interleukinom-11 poboljšava srčanu fibrozu nakon infarkta miokarda.. Circulation 121, 684-91 (2010); Tang, W., Yang, L., Yang, Y. C., Leng, S. X. & Elias, J. A. Transformacija faktora rasta-beta stimuliše transkripciju interleukina-11 putem kompleksnih aktivirajući protein-1 zavisne puteve. J. Biol. Chem.273, 5506-13 (1998)).
[0004] Uloga IL-11 u fibrozi nije jasna iz objavljene literature. Smatra se da je IL-11 važan za fibrozu i upale u plućima (Tang, W. i dr. Ciljano eksprimiranje IL-11 u mišjim disajnim putevima izaziva limfocitnu upalu, preuređenje bronhija i opstrukciju disajnih puteva. J. Clin. Invest. 98, 2845-53 (1996)) i nivo eksprimiranja je u korelaciji sa nivoima kolagena u koži (Toda, M. i dr. Polarizovano in vivo eksprimiranje IL-11 i IL-17 između akutnih i hroničnih lezija kože. Journal of Allergy and Clinical Immunology 111, 875-881 (2003)) i respiratornom sistemu (Molet, S., Hamid, Q. & Hamilos, D. IL-11 i IL-17 eksprimiranje u nosnim polipima: Odnos sa depozicijom i supresijom kolagena intranazalnim flutikazon propionatom. The Laryngoscope 113, (2003); Minshall i dr. Eksprimiranje IL-11 se povećava kod teške astme: asocijacija sa epitelnim ćelijama i eozinofilom. The Journal of allergy and clinical immunology 105, (2000)).
[0005] Međutim, većina studija pokazuje da je IL-11 antibakterijski: u srcu (Obana, M. i dr. Terapeutska aktiviranje transduktora signala i aktivatora transkripcije 3 interleukinom-11 poboljšava srčanu fibrozu nakon infarkta miokarda. Circulation 121, 684-91 (2010); Obana, M. i dr. Terapijska primena IL-11 pokazuje efekte postkondicioniranja protiv ishemije-povrede reperfuzije putem STAT3 u srcu. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology 303, H569-77 (2012); US 2010/093976 A1) i bubregu (Stangou, M. i dr. Uticaj IL-11 na glomerularno eksprimiranje TGF-beta i ekstracelularne matrice kod nefrotoksičnog nefritisa kod Wistar Kyoto pacova. Journal of nephrology 24, 106-11 (2011); Ham, A. i dr. Kritična uloga interleukina-11 u izofluranom posredovanoj zaštiti od ishemijske akutne povrede bubrega kod miševa. Anesthesiology 119, 1389-401 (2013))i protivupalno u nekoliko tkiva i hroničnih upalnih oboljenja (Trepicchio & Dorner. Terapeutska upotreba interleukina-11 u lečenju upalne bolesti. (1998). doi:10.1517/13543784.7.9.1501). Smatra se da je molekularni mod delovanja IL-11, generalno, regulacija nivoa eksprimiranja mRNK iz RNK preko STAT3-posredovane transkripcije (Zhu, M. i dr. IL-11 ublažava imunološku ishemiju jetre/repurfuzionu povredu (IRI) putem STAT3 signalnog puta kod miševa. PLOS ONE 10, (2015)).
[0006] WO 98/36061 A2 obelodanjuje upotrebu agenasa koji inhibiraju aktivnost posredovanu IL-6 receptorom za lečenje rana i fibroze. WO 00/78336 A1 detektuje postupke za lečenje ili inhibiranje formiranja fibroze tkiva pomoću IL-13 antagonista.
Sažetak pronalaska
[0007] Ovaj pronalazak pruža antitelo koje se može vezati za interleukin 11 (IL-11) ili IL-11 receptor α (IL-11Rα) i inhibirati signalizaciju posredovanu sa IL-11, za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja fibroze kod čoveka, kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0008] Predmetno obelodanjenje se odnosi na lečenje, prevenciju ili ublažavanje fibroze kod pacijenta kom je potreban tretman putem primene agensa koji može inhibirati dejstvo Interleukina 11 (IL-11). Pronalazači su identifikovali da IL-11 ima pro-fibroznu aktivnost. Predmetno obelodanjenje posebno se odnosi na inhibiranje pro-fibrotičke aktivnosti IL-11. Varijacije predmetnog obelodanjenja se odnose na inhibiciju ili prevenciju pro-fibrotičkog signala posredovanog sa IL-11, npr. kao što je posredovanog vezivanjem IL-11 za IL-11 receptor.
[0009] Agensi koji su ovde obelodanjeni sposobni da inhibiraju delovanje IL-11 mogu sprečiti ili smanjiti vezivanje IL-11 na IL-11 receptor.
[0010] Agensi koji su ovde obelodanjeni sposobni da inhibiraju dejstvo IL-11 mogu vezati IL-11 da formiraju kompleks koji sadrži agens i IL-11. Kompleks može biti ne-kovalentni ili kovalentni kompleks. U nekim otelotvorenjima, formiranje agens:IL-11 kompleksa može sprečiti ili smanjiti sposobnost IL-11 da se veže na IL-11 receptor. U nekim otelotvorenjima takva prevencija ili redukcija može biti rezultat smanjenja produktivnog vezivanja IL-11 na IL-11 receptor, tj. smanjenja sposobnosti IL-11 da započne signalizaciju posredovanu IL-11 receptorom. U nekim otelotvorenjima formiranje agens:IL-11 kompleksa može izolovati IL-11 dalje od IL-11 receptora, čime se sprečava ili smanjuje kontakt IL-11 sa IL-11 receptorom i/ili sprečava ili smanjuje količina IL-11 dostupna za vezivanje IL-11 receptora. U nekim otelotvorenjima agens može biti receptor mamac.
[0011] Agensi koji su ovde obelodanjeni sposobni da inhibiraju delovanje IL-11 mogu se vezati za IL-11 receptor. Agens koje vezuje IL-11 receptor može sprečiti ili smanjiti sposobnost IL-11 da se veže na IL-11 receptor (IL-11R).
[0012] Takođe je ovde obelodanjen tretman, prevencija ili ublažavanje fibroze kod pacijenta kom je potreban tretman pomoću primene agensa koji može sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11 ili IL-11 receptora (IL-11R).
[0013] Takođe je ovde obelodanjen agens koje može inhibirati dejstvo Interleukina 11 (IL-11) za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja fibroze.
[0014] Takođe je ovde obelodanjena upotreba agensa koji može inhibirati dejstvo IL-11 u proizvodnji leka za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja fibroze.
[0015] Takođe je ovde obelodanjen postupak lečenja ili prevencije fibroze, gde postupak obuhvata davanje pacijentu, kom je potreban tretman, terapeutski efikasne količine agensa koji može inhibirati delovanje IL-11.
[0016] U nekim otelotvorenjima agens koji je sposoban da inhibira dejstvo IL-11 je agens sposoban za sprečavanje ili smanjenje vezivanja IL-11 na IL-11 receptor.
[0017] U nekim otelotvorenjima agens koji je sposoban da inhibira dejstvo IL-11 je IL-11 vezujući agens. IL-11 vezujući agensi mogu biti izabrani iz grupe koju čine: antitelo, polipeptid, peptid, oligonukleotid, aptamer ili mali molekul. U nekim otelotvorenjima IL-11 vezujući agens je antitelo. U nekim otelotvorenjima IL-11 vezujući agens je receptor mamac.
[0018] U nekim otelotvorenjima agens koji je sposoban da inhibira dejstvo IL-11 je IL-11 receptor (IL-11R) vezujući agens. IL-11R vezujući agensi mogu biti izabrani iz grupe koju čine: antitelo, polipeptid, peptid, oligonukleotid, aptamer ili mali molekul. U nekim otelotvorenjima IL-11R vezujući agens je antitelo.
[0019] Takođe je ovde obelodanjen agens sposoban za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja fibroze.
[0020] Takođe je ovde obelodanjena upotreba agensa koji može sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11 ili IL-11R u proizvodnji leka za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja fibroze.
[0021] Takođe je ovde opisan postupak za lečenje ili sprečavanje fibroze, gde postupak obuhvata davanje pacijentu, kom je potreban tretman, terapeutski efikasne količine agensa koji može sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11 ili IL-11R.
[0022] U nekim otelotvorenjima agens sposoban za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R je mali molekul ili oligonukleotid.
[0023] U nekim otelotvorenjima fibroza koju treba tretirati ili sprečiti je fibroza srca, jetre ili bubrega. U nekim otelotvorenjima fibroza koju treba tretirati ili sprečiti je fibroza oka. U nekim otelotvorenjima fibroza je u srcu i povezana je sa disfunkcijom muskulature ili električnih svojstava srca ili debljanjem zidova ili ventila srca. U nekim otelotvorenjima fibroza je u jetri i povezana je sa hroničnom bolešću jetre ili cirozom jetre. U nekim otelotvorenjima fibroza je u bubregu i povezana je sa hroničnom bubrežnom bolešću.
[0024] U nekim otelotvorenjima postupak lečenja ili prevencije obuhvata davanje pomenutog agensa pacijentu kod kog je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore. U nekim otelotvorenjima postupak lečenja ili prevencije obuhvata davanje pomenutog agensa pacijentu kod kog je utvrđeno da je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore. U nekim otelotvorenjima postupak lečenja ili prevencije obuhvata određivanje da li je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore kod pacijenta i davanje pomenutog agensa pacijentu kod kog je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore.
[0025] Takođe je ovde prikazan postupak određivanja da li je pacijent pogodan za lečenje ili prevenciju fibroze pomoću agensa koji može inhibirati dejstvo IL-11, gde postupak obuhvata određivanje, opciono in vitro, da li je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore kod pacijenta.
[0026] Takođe je ovde prikazan postupak izbora pacijenta za lečenje ili prevenciju fibroze pomoću agensa koji može inhibirati delovanje IL-11, gde postupak obuhvata određivanje, opciono in vitro, da li je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore kod pacijenta.
[0027] Takođe je ovde obelodanjen postupak dijagnoze fibroze ili rizika od razvoja fibroze kod pacijenta, gde postupak obuhvata određivanje, opciono in vitro, regulacije na gore IL-11 ili IL-11R u uzorku dobijenom od pacijenta.
[0028] U nekim otelotvorenjima postupak je postupak potvrđivanja dijagnoze fibroze kod pacijenta za kog se sumnja da ima fibrozu.
[0029] U nekim otelotvorenjima postupak dalje obuhvata odabir pacijenta za tretman sa agensom koje može da inhibira dejstvo IL-11 ili sa agensom koji može da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 ili IL-11R.
[0030] Takođe je ovde obelodanjen postupak za davanje prognoze pacijentu koji ima, ili se sumnja da ima fibrozu, gde postupak obuhvata određivanje, opciono in vitro, da li su IL-11 ili IL-11R regulisani u uzorku dobijenom od pacijenta i, na osnovu određivanja, obezbeđuju prognozu za lečenje pacijenta sa agensom koje može da inhibira dejstvo IL-11 ili sa agensom koji može da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 ili IL-11R.
[0031] Ova postupak može dalje obuhvatati odabir pacijenta koji je određen da ima IL-11 ili IL-11R regulisan na gore za tretman sa agensom koje može da inhibira dejstvo IL-11 ili sa agensom koji može da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 ili IL -11R.
[0032] Takođe je ovde obelodanjen postupak dijagnoze fibroze ili rizika od razvoja fibroze kod pacijenta, gde postupak obuhvata određivanje, opciono in vitro, jednog ili više genetskih faktora kod pacijenta koji predviđaju regulaciju na gore eksprimiranja IL-11 ili IL-11R ili povećanje aktivnosti IL-11 ili IL-11R.
[0033] U nekim otelotvorenjima postupak je postupak potvrđivanja dijagnoze fibroze kod pacijenta za kog se sumnja da ima fibrozu.
[0034] U nekim otelotvorenjima postupak dalje obuhvata odabir pacijenta za tretman sa agensom koji može da inhibira dejstvo IL-11 ili sa agensom koji može da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 ili IL-11R.
[0035] Takođe je opisan ovde postupak je davanje prognoze pacijentu koji ima, ili je sumnja da ima fibrozu, gde postupak obuhvata određivanje, opciono in vitro, jednog ili više genetskih faktora kod pacijenta koji predviđaju regulaciju na gore eksprimiranja IL-11 ili IL-11R ili povećanje aktivnosti IL-11 ili IL-11R.
[0036] Takođe je ovde prikazan postupak za lečenje fibroze kod čoveka, gde postupak obuhvata davanje ljudskom pacijentu, kom je potreban tretman, terapeutski efikasne količine anti-interleukin 11 (IL-11) antitela, pri čemu se anti-IL-11 antitelo vezuje za IL-11 i inhibira signalizaciju posredovanu sa IL-11
[0037] Takođe je ovde obelodanjen postupak lečenja fibroze kod pacijenta, gde postupak sadrži:
(i) određivanje, opciono in vitro, da li je eksprimiranje IL-11 ili interleukin 11 receptor a(IL-11R) regulisano na gore kod pacijenta; i
(ii) primenu pacijentu kod kog je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore terapeutski efikasne količina antitela IL-11 anti-IL-11, pri čemu se antitelo IL-11 vezuje za IL-11 i inhibira IL-11 posredovanu signalizaciju.
[0038] Takođe je ovde obelodanjen postupak lečenja fibroze kod pacijenta, gde postupak sadrži:
(i) određivanje, opciono in vitro, jednog ili više genetskih faktora kod pacijenta koji predviđaju regulaciju na gore eksprimiranja ili aktivnosti interleukina 11 (IL-11) ili interleukin 11 receptora (IL-11R);
(ii) odabira pacijenta za tretman na osnovu odluke iz (i); i
(ii) davanje odabranom pacijentu terapeutski efikasne količine antitela anti-IL-11, gde se antitelo IL-11 vezuje za IL-11 i inhibira signalizaciju posredovanu sa IL-11.
Opis
IL-11 i IL-11 receptor
[0039] Interleukin 11 (IL-11), takođe poznat kao inhibitorni faktor adipogeneze, je pleiotropni citokin i član porodice IL-6 citokina koji uključuje IL-6, IL-11, IL-27, IL-31, onkostatin, faktor inhibicije leukemije (LIF), kardiotrofin-1 (CT-1), kortiotrofinski citokin (CLC), cilijarni neurotrofični faktor (CNTF) i neuropoetin (NP-1).
[0040] IL-11 se transkribuje kanonskim signalnim peptidom koji pruža efikasno lučenje iz ćelija. Nezreli oblik ljudskog IL-11 je polipeptid 199 aminokiselina, dok zreli oblik IL-11 kodira protein od 178 aminokiselinskih ostataka (Garbers and Scheller., Biol. Chem. 2013; 394(9):1145-1161). Ljudska IL-11 aminokiselinska sekvenca dostupna je pod UniProt pristupnim brojem P20809 (P20809.1 GI:124294). Rekombinantni ljudski IL-11 (oprelvekin) je takođe komercijalno dostupan. IL-11 iz drugih vrsta, uključujući miša, pacova, svinju, kravu, nekoliko vrsta košljoriba i primata, takođe su klonirani i sekvencirani.
[0041] U ovoj specifikaciji IL-11 se odnosi na IL-11 iz bilo koje vrste i uključuje izoforme, fragmente, varijante ili homologe IL-11 iz bilo koje vrste. U poželjnim varijantama vrsta je ljudska (Homo sapiens). Izoforme, fragmenti, varijante ili homolozi IL-11 mogu opciono da se karakterišu kao najmanje 70%, poželjno 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom nezrelog ili zrelog IL-11 iz date vrste, npr. ljudski. Izoforme, fragmenti, varijante ili homolozi IL-11 mogu se opciono karakterisati sposobnošću da vezuju IL-11Rα (poželjno od iste vrste) i stimulišu transdukciju signala u ćelijama koje eksprimiraju IL-11Rα i gp130 (npr. kao što je opisano kod Curtis i dr. Blood, 1997, 90(11); ili Karpovich i dr. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80). Fragment IL-11 može biti bilo koje dužine (po broju aminokiselina), mada opciono može biti najmanje 25% dužine zrelog IL-11 i može imati maksimalnu dužinu od 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% dužine zrelog IL-11. Fragment IL-11 može imati minimalnu dužinu od 10 aminokiselina, i maksimalnu dužinu od 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ili 195 aminokiselina
[0042] IL-11 signalizira homodimer široko prisutnog eksprimiranog β-receptor glikoproteina 130 (gp130, poznat i kao glikoprotein 130, IL6ST, IL6-beta ili CD130). Gp130 je transmembranski protein koji formira jednu podjedinicu receptora citokina tipa I sa familijom receptora IL-6. Specifičnost se dobija preko pojedinačnog α-receptora IL-11 (IL-11Rα), koji ne učestvuje direktno u transdukciji signala, iako početni događaj vezivanja citokina na α-receptor dovodi do konačne formacije kompleksa sa β-receptorima. IL-11 aktivira nizvodni put signalizacije, koji je pretežno mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK)-kaskada i Janus kinaza/signalni transduktor i aktivator transkripcije (Jak/STAT) put (Garbers i Scheller, supra).
[0043] Ljudski gp130 (uključujući 22 aminokiselinski signalni peptid) je 918 aminokiselinski protein, i zreli oblik ima 866 aminokiselina, uključujući ekstracelularni domen 597 aminokiselina, transmembranski domen 22 aminokiseline i intracelularni domen 277 aminokiselina. Ekstracelularni domen proteina sadrži modul za vezivanje citokina (CBM) od gp130. CBM gp130 obuhvata Ig-sličan domen D1, i fibronektin tipa III domene D2 i D3 od gp130. Aminokiselinska sekvenca ljudskog gp130 dostupna je pod Genbank pristupnim brojem NP_002175.2.
[0044] Ljudski IL-11Rα je polipeptid 422 aminokiselina (Genbank pristupni broj NP_001136256.1 GI:218505839) i deli -85% nukleotida i identičnosti aminokiselinske sekvence sa mišjim IL-11Rα (Du i Williams., Blood Vol, 89, No,11, June 1, 1997). Prijavljene su dve izoforme IL-11Rα, koje se razlikuju u citoplazmatičnom domenu (Du i Williams, supra). IL-11 receptor α-lanac (IL-11Rα) deli mnoge strukturne i funkcionalne sličnosti sa α-lancem IL-6 receptora (IL-6Rα). Ekstracelularni domen pokazuje 24% identičnosti aminokiselina uključujući karakterističan konzerviran Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) motiv. Kratkom citoplazmatičnom domenu (34 aminokiseline) nedostaju oblasti 1 i 2 koje su potrebne za aktiviranje JAK/STAT signalnog puta.
[0045] IL-11Rα vezuje svoj ligand sa niskim afinitetom (Kd ~10 nmol/L) i sam nije dovoljan da transdukuje biološki signal. Generisanje receptora visokog afiniteta (Kd ~400 do 800 pmol/L) sposobnog za transdukciju signala zahteva ko-eksprimiranje IL-11Rα i gp130 (Curtis i dr (Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12; Hilton i dr., EMBO J 13:4765, 1994; Nandurkar i dr., Oncogene 12:585, 1996). Vezivanje IL-11 na ćelijsku površinu IL-11Rα indukuje heterodimerizaciju, fosforilaciju tirozina, aktivaciju gp130 i MAPK i/ili Jak/STAT signalizaciju kao što je gore opisano.
[0046] Lokacije za vezivanje receptora na mišji IL-11 su mapirane i identifikovane su tri lokacije - lokacije I, II i III. Vezivanje na gp130 smanjuje se supstitucijama na području II regiona i supstitucijama na području III regiona. Mutanti područja III ne pokazuju detektabilnu agonističku aktivnost i imaju IL-11Rα antagonistsku aktivnost (Cytokine Inhibitors Chapter 8; edited by Gennaro Ciliberto and Rocco Savino, Marcel Dekker, Inc.2001).
[0047] U principu, rastvorljivi IL-11Rα takođe može formirati biološki aktivne rastvorljive komplekse sa IL-11 (Pflanz i dr., 1999 FEBS Lett, 450, 117-122) povećavajući mogućnost da, slično IL-6, IL-11 može u nekim slučajevima vezati rastvorljivi IL-11Rα pre vezivanja gp130 ćelijske površine (Garbers i Scheller, supra). Curtis i dr (Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12)opisuju eksprimiranje rastvorljivog mišjeg IL-11 receptor alfa lanca (sIL-11R) i ispituju signalizaciju u ćelijama koje eksprimiraju gp130. U prisustvu gp130, ali ne i transmembranskog IL-11R, sIL-11R posredno zavisi od IL-11 diferencijacije leukemičnih ćelija M1 i proliferacije u Ba/F3 ćelijama i ranim intracelularnim događajima, uključujući fosforilaciju gp130, STAT3 i SHP2 slične signalizaciji preko transmembranskog IL -11R.
[0048] U ovoj specifikaciji, IL-11 receptor (IL-11R) se odnosi na polipeptid sposoban za vezivanje IL-11 i indukovanje transdukcije signala u ćelijama koje eksprimiraju gp130. IL-11 receptor može biti iz bilo koje vrste i uključuje izoforme, fragmente, varijante ili homologe receptora IL-11 iz bilo koje vrste. U poželjnim varijantama vrsta je ljudska (Homo sapiens). U nekim otelotvorenjima IL-11 receptor može biti IL-11Rα. Izoforme, fragmenti, varijante ili homolozi IL-11Rα mogu se opciono karakterisati kao da imaju najmanje 70%, poželjno 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom IL-11Rα iz date vrste, npr. ljudske. Izoforme, fragmente, varijante ili homolozi IL-11Rα mogu se opciono karakterisati sposobnošću vezivanja IL-11 (poželjno od iste vrste) i stimulisati transdukciju signala u ćelijama koje eksprimiraju IL-11Rα i gp130 (npr. kao što je opisano kod Curtis i dr. Blood, 1997, 90(11) ili Karpovich i dr. Mol. Hum. Reprod. 20039(2): 75-80). Fragment IL-11 receptora mogu biti bilo koje dužine (po broju aminokiselina), mada opciono mogu biti najmanje 25% dužine zrelog IL-11Ra i imati maksimalnu dužinu od 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% dužine zrelog IL-11Rα. Fragment IL-11 receptor fragmenta može imati minimalnu dužinu od 10 aminokiselina, i maksimalnu dužinu od 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400 ili 415 aminokiselina.
Agens sposoban da spreči delovanje IL-11
[0049] Signalizacijski put IL-11 nudi više načina za inhibiciju signalizacije IL-11. Na primer, inhibicija se može postići sprečavanjem ili smanjivanjem vezivanja IL-11 na IL-11 receptor. Kao rezultat, pogodni agensi mogu da ciljaju IL-11 ili njegov receptor.
[0050] U nekim otelotvorenjima agensi koji mogu inhibirati dejstvo IL-11 mogu se vezati za IL-11 i sprečiti ili smanjiti IL-11 posredovane signale, npr. preko IL-11 receptora. U nekim otelotvorenjima agensi koji mogu inhibirati dejstvo IL-11 mogu se vezati za IL-11 receptor i sprečiti ili smanjiti IL-11 stimulisanu signalizaciju.
[0051] Agensi koji se vezuju za IL-11 mogu inhibirati IL-11 posredovanu signalizaciju blokirajući vezivanje IL-11 na IL-11 receptor i/ili smanjivanjem količine IL-11 dostupnog za vezivanje za njegov receptor. Pogodni IL-11 vezujući agensi mogu biti IL-11 inhibitori ili IL-11 antagonisti.
[0052] IL-11 vezujući agensi, npr. anti-IL-11 antitela, prema predmetnom obelodanjenju, mogu pokazati najmanje jednu od sledećih osobina:
a) Vezivanje se na ljudski IL-11 sa KDod 1 μM ili manje, poželjno od ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤10nM, ≤1nM ili ≤100pM;
b) Inhibiranje signalizacije posredovane sa IL-11 putem receptora IL-11Ra, npr. u ćelijskom testu u kom ćelije ko-eksprimiraju IL-11Rα i gp130. Pogodne analize na bazi ćelija su uključivanje<3>H-timidina i testovi za proliferaciju ćelija Ba/F3, opisani u npr. Curtis i dr. Blood, 1997, 90(11) i Karpovich i dr. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80. Na primer, IC50za IL-11 vezujući agens može se odrediti kultivacijom Ba/F3 ćelija koje eksprimiraju IL-11Rα i gp130 u prisustvu ljudskog IL-11 i IL-11 vezujućeg agensa i merenja uključivanja<3>H-timidina u DNK. Pogodni IL-11 vezujući agensi mogu pokazati IC50od 10 μg/ml ili manje, poželjno od ≤ 5 μg/ml, ≤ 4 μg/ml, ≤ 3,5 μg/ml, ≤ 3 μg/ml, ≤ 2 μg/ml, ≤ 1 μg/ml, ≤ 0,9 μg/ml, ≤ 0,8 μg/ml, ≤ 0,7 μg/ml, ≤ 0,6 μg/ml ili ≤ 0,5 μg/ml u takvom testu.
c) Inhibiranje proliferacije fibroblasta, npr. proliferacije kardijalnih/atrijalnih fibroblasta. Ovo se, na primer, može proceniti analizom u kojoj se fibroblasti stimulišu IL-11 ili TGFβ1, i proliferacija ćelija se prati kao što je ovde opisano.
d) Inhibiranje generisanja miofibroblasta, npr. od srčanih/atrijalnih fibroblasta. Ovo se, na primer, može proceniti analizom u kojoj se fibroblasti stimulišu IL-11 ili TGFβ1, i proizvodnja miofibroblasta se prati, npr. merenjem nivoa αSMA.
e) Inhibiranje proizvodnje ekstracelularnih matrica fibroblastima, npr. kardijalnim/atrijalnim fibroblastima. Ovo se, na primer, može proceniti analizom u kojoj se fibroblasti stimulišu sa IL-11 ili TGFβ1, i meri se proizvodnja komponenti ekstracelularnih matrica.
f) Inhibiranje kolagena i/ili periostin gena ili eksprimiranje proteina u fibroblastima, npr. kardijalnim/atrijalnim fibroblastima. Ovo se, na primer, može proceniti u testu u kom se fibroblasti stimulišu sa IL-11 ili TGFβ1, i mere se kolagen i/ili periostin gena ili eksprimiranje proteina.
[0053] IL-11 vezujući agensi mogu biti bilo koje vrste, ali u nekim otelotvorenjima IL-11 vezujući agens može biti antitelo, polipeptid, peptid, oligonukleotid, aptamer ili mali molekul.
[0054] Pogodna anti-IL-11 antitela će poželjno biti vezana za IL-11 (antigen), poželjno ljudski IL-11, i mogu imati konstantu disocijacije (KD) od ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤10nM, ≤1nM ili ≤100pM. Afinitet vezivanja antitela za njegovu metu je često opisan kod smislu njegove konstante disocijacije (KD). Afinitet vezivanja se može izmeriti poznatim u struci, kao što su površinska plazmonska rezonanca (SPR) ili radiooznačen test vezivanja antigena (RIA) izveden sa Fab verzijom antitela i molekula antigena.
[0055] Anti-IL-11 antitela mogu biti antagonistička antitela koja inhibiraju ili smanjuju biološku aktivnost IL-11.
[0056] Anti-IL-11 antitela mogu biti neutralizujuća antitela koja neutrališu biološki efekat IL-11, npr. njegovu sposobnost da stimuliše produktivnu signalizaciju preko IL-11 receptora.
[0057] Neutralizujuća aktivnost može se meriti sposobnošću neutralizacije IL-11 izazvane proliferacije u T11 ćelijskoj liniji plazmacitoma miša (Nordan, R. P. i dr. (1987) J. Immunol.139:813).
[0058] Primeri poznatih anti-IL-11 antitela uključuju klon 6D9A monoklonskog antitela, klon KT8 (Abbiotec), klon M3103F11 (BioLegend), klon 1F1, klon 3C6 (Abnova Corporation), klon GF1 (LifeSpan Biosciences), klon 13455 (Source BioScience) i klon 22626 (R & D Systems, korišćeni u Bockhorn i dr. Nat. Commun. (2013) 4(0):1393; monoklonski mišji IgG2A; Catalog No. MAB218; R&D Systems, MN, USA).
[0059] Antitela mogu opciono biti odabrana da ne pokazuju značajnu unakrsnu reaktivnost sa jednim ili više ljudskih, npr. rekombinantni ljudski, IL-6, CNTF, LIF, OSM, CLC ili CT-1.
[0060] Peptidni ili polipeptidni IL-11 vezujući agensi mogu biti bazirani na receptoru IL-11, npr. IL-11 vezujući fragment IL-11 receptora. U jednom otelotvorenju, pogodni IL-11 vezujući agensi mogu da sadrže IL-11 vezujući fragment IL-11Rα lanca, i mogu poželjno biti rastvorljivi i/ili isključiti jedan ili više, ili sve transmembranske domene. Takvi molekuli se mogu opisati kao mamac receptori.
[0061] Curtis i dr (Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12) objavljuje da je rastvorljivi mišji IL-11 receptor alfa lanac (sIL-11R) bio sposoban da antagonizuje aktivnost IL-11 kada se testira na ćelijama koje eksprimiraju transmembranski IL-11R i gp130. Oni su predložili da posmatrani IL-11 antagonizam putem sIL-11R zavisi od ograničavanja broja gp130 molekula na ćelijama koje već eksprimiraju transmembranski IL-11R.
[0062] Upotreba rastvorljivih mamac receptora kao osnova za inhibiciju transdukcije signala i terapeutske intervencije je takođe prijavljena kod drugih signalnih molekula: parova receptora, npr. VEGF i VEGF receptor (De-Chao Yu i dr., Molecular Therapy (2012); 205, 938-947; Konner and Dupont Clin Colorectal Cancer 2004 Oct;4 Suppl 2:S81-5).
[0063] Kao takav, u nekim otelotvorenjima IL-11 vezujući agens može biti pružen u obliku mamac receptora, npr. rastvorljivog IL-11 receptor. Opisan je da nadmetanje za IL-11 koji pruža mamac receptor dovodi do delovanja IL-11 antagonista (Curtis i dr., supra).
[0064] Mamac IL-11 receptori poželjno vezuju IL-11 i/ili IL-11 komplekse koji čine ove vrste nedostupnim za vezivanje za receptore gp130, IL-11Rα i/ili gp130: IL-11Ra. Kao takvi, oni deluju kao „mamac“ receptori za IL-11 i IL-11 koji sadrže komplekse, u suštini na isti način na koji etanercept deluje kao mamac receptor za TNFα. Signalizacija posredovana sa IL-11 je smanjena u odnosu na nivo signalizacije u odsustvu mamac receptora.
[0065] Mamac IL-11 receptori poželjno se vezuju za IL-11 putem jednog ili više modula vezivanja citokina (CBM). CBC su, ili su izvedeni ili homologni CBM prirodnih molekula receptora za IL-11. Na primer, mamac IL-11 receptori mogu da sadrže ili se sastoje od jednog ili više CBM koji su izvedeni od ili homologni CBM od gp130 i/ili IL-11Rα.
[0066] U nekim otelotvorenjima, mamac IL-11 receptor može sadržati ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja odgovara modulu vezivanja citokina gp130. U nekim otelotvorenjima, mamac IL-11 receptor može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja odgovara modulu vezivanja citokina IL-11Rα. Ovde aminokiselinska sekvenca koja „odgovara“ referentnom regionu ili sekvenci datog peptida/polipeptida ima najmanje 60%, npr. najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom referentnog regiona/sekvence. Gp130, IL-11Rα i IL-11 mogu biti iz bilo koje vrste i uključuju izoforme, fragmente, varijante ili homologe iz bilo koje vrste.
[0067] U nekim otelotvorenjima mamac receptor može biti u stanju da veže IL-11, npr. sa afinitetom vezivanja od barem 100μM ili manje, opciono od 10μM ili manje, 1μM ili manje, 100nM ili manje, ili oko 1 do 100nM. U nekim otelotvorenjima mamac receptor može sadržati sve ili deo IL-11 vezujućeg domena i može opciono nedostajati sve ili deo transmembranskih domena. receptor mamac može opciono biti spojenog sa konstantnim regionom imunoglobulina, npr. IgG Fc regionom.
[0068] U nekim otelotvorenjima IL-11 vezujući agens može biti pružen u obliku malog molekula inhibitora IL-11, npr. IL-11 inhibitor opisan kod Lay i dr., Int. J. Oncol. (2012); 41(2): 759-764.
[0069] Agensi koji se vezuju za IL-11 receptor (IL-11R) mogu inhibirati IL-11 posredovanu signalizaciju blokirajući vezivanje IL-11 na IL-11R ili sprečavanje transdukcije signala putem gp130 ko-receptora. Pogodni IL-11R vezujući agensi mogu biti IL-11R inhibitori ili IL-11R antagonisti. U poželjnim otelotvorenjima IL-11R je IL-11Rα i odgovarajući vezujući agensi mogu vezati polipeptid IL-11Rα i mogu biti inhibitori ili antagonisti IL-11Rα.
[0070] IL-11R vezujući agensi, npr. anti-IL-11R antitela, prema predmetnom obelodanjenju, mogu pokazati najmanje jednu od sledećih osobina:
a) Vezivanje se na ljudski IL-11R sa KDod 1 μM ili manje, poželjno od ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤10nM, ≤1nM ili ≤100pM;
b) Inhibiranje signalizacije IL-11R, npr. u ćelijskom testu u kom ćelije ko-eksprimiraju IL-11RRα i gp130. Pogodne analize na bazi ćelija su uključivanje<3>H-timidina i testovi za proliferaciju ćelija Ba/F3, opisani u npr. Curtis i dr. Blood, 1997, 90(11) i Karpovich i dr. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80. Na primer, IC50za IL-11R vezujući agens može se odrediti kultivacijom Ba/F3 ćelija koje eksprimiraju IL-11RRα i gp130 u prisustvu ljudskog IL-11R i IL-11R vezujućeg agensa i merenja uključivanja<3>H-timidina u DNK. Pogodni IL-11R vezujući agensi mogu pokazati IC50od 10 μg/ml ili manje, poželjno od ≤ 5 μg/ml, ≤ 4 μg/ml, ≤ 3,5 μg/ml, ≤ 3 μg/ml, ≤ 2 μg/ml, ≤ 1 μg/ml, ≤ 0,9 μg/ml, ≤ 0,8 μg/ml, ≤ 0,7 μg/ml, ≤ 0,6 μg/ml ili ≤ 0,5 μg/ml u takvom testu.
c) Inhibiranje proliferacije fibroblasta, npr. proliferacije kardijalnih/atrijalnih fibroblasta. Ovo se, na primer, može proceniti analizom u kojoj se fibroblasti stimulišu IL-11 ili TGFβ1, i proliferacija ćelija se prati kao što je ovde opisano.
d) Inhibiranje generisanja miofibroblasta, npr. od srčanih/atrijalnih fibroblasta. Ovo se, na primer, može proceniti analizom u kojoj se fibroblasti stimulišu IL-11 ili TGFβ1, i proizvodnja miofibroblasta se prati, npr. merenjem nivoa αSMA.
e) Inhibiranje proizvodnje ekstracelularnih matrica fibroblastima, npr. kardijalnim/atrijalnim fibroblastima. Ovo se, na primer, može proceniti analizom u kojoj se fibroblasti stimulišu sa IL-11R ili TGFβ1, i meri se proizvodnja komponenti ekstracelularnih matrica.
f) Inhibiranje kolagena i/ili periostin gena ili eksprimiranje proteina u fibroblastima, npr. kardijalnim/atrijalnim fibroblastima. Ovo se, na primer, može proceniti u testu u kom se fibroblasti stimulišu sa IL-11 ili TGFβ1, i mere se kolagen i/ili periostin gena ili eksprimiranje proteina.
[0071] IL-11R vezujući agensi mogu biti bilo koje vrste, ali u nekim otelotvorenjima IL-11R vezujući agens može biti antitelo, polipeptid, peptid, oligonukleotid, aptamer ili mali molekul.
[0072] Pogodna anti-IL-11R antitela će poželjno biti vezana za IL-11R (antigen), poželjno ljudski IL-11R, i mogu imati konstantu disocijacije (KD) od ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤10nM, ≤1nM ili ≤100pM. Afinitet vezivanja antitela za njegovu metu je često opisan kod smislu njegove konstante disocijacije (KD). Afinitet vezivanja se može izmeriti poznatim u struci, kao što su površinska plazmonska rezonanca (SPR) ili radiooznačen test vezivanja antigena (RIA) izveden sa Fab verzijom antitela i molekula antigena.
[0073] Anti-IL-11R antitela mogu biti antagonistička antitela koja inhibiraju ili smanjuju biološku aktivnost IL-11R. Anti-IL-11R antitela mogu biti antagonistička antitela koja inhibiraju ili smanjuju bilo koju funkciju IL-11R, posebno signalizaciju. Na primer, antagonist IL-11R antitela može inhibirati ili sprečiti vezivanje IL-11 na IL-11R ili može inhibirati ili sprečiti da veza IL-11Rα sa gp130 formira funkcionalni receptorski kompleks sposoban za produktivnu signalizaciju, npr. kao odgovor na IL-11 vezivanje.
[0074] Anti-IL-11R antitela mogu biti neutralizujuća antitela koja neutrališu biološki efekat IL-11R, npr. njegovu sposobnost da stimuliše produktivnu signalizaciju preko IL-11 receptora.
[0075] Neutralizujuća aktivnost može se meriti sposobnošću neutralizacije IL-11R izazvane proliferacije u T11 ćelijskoj liniji plazmacitoma miša (Nordan, R. P. i dr. (1987) J. Immunol.139:813).
[0076] Primeri poznatih anti-IL-11R antitela uključuju klon 025 monoklonskog antitela (Sino Biological), klon EPR5446 (Abcam), klon 473143 (R & D sistemi), klonove 8E2 i 8E4 opisani u US 2014/0219919 A1 i monoklonska antitela opisana u Blanc i dr (J. Immunol Methods.2000 Jul 31;241(1-2);43-59).
[0077] IL-11R vezujući agensi na bazi peptida ili polipeptida mogu biti bazirani na IL-11, npr. mutant, varijanta ili vezujući fragment IL-11. Pogodni agensi na bazi peptida ili polipeptida mogu se vezati za IL-11R na način koji ne dovodi do iniciranja transdukcije signala ili daje suboptimalnu signalizaciju. IL-11 mutanti ove vrste mogu delovati kao konkurentni inhibitori endogenog IL-11.
[0078] Na primer, V147A je antagonist IL-11 u kom je aminokiselina 147 mutirana od triptofana do alanina, što uništava tzv. „mesto III“ od IL-11. Ovaj mutant se može vezati za IL-11R, ali angažovanje homodimera gp130 ne uspeva, što rezultuje efikasnom blokadom signalizacije IL-11 (Underhill-Day i dr., 2003; Endocrinology 2003 Aug;144(8):3406-14). Lee i dr (Am J respire Cell Mol Biol. 2008 Dec; 39(6):739-746) takođe govori o generaciji mutant IL-11 antagonista („mutein“) sposobnog za specifično inhibiranje vezivanja IL-11 na IL-11Rα.
[0079] Menkhorst i dr (Biology of Reproduction May 1, 2009 vol.80 no.5920-927) opisuju PEGilovan IL-11 antagonist, PEGIL11A (CSL Limited, Parkvill, Victoria, Australia) koji je efikasan pri inhibiranju delovanja IL-11 kod ženki miševa.
[0080] Pasqualini i dr. Cancer (2015) 121(14):2411-2421 opisuje peptidomimetički lek usmeren na ligand, peptidomimetik-11 (BMTP-11) koji cilja metastaze kostiju, sposoban za vezivanje za IL-11Rα.
[0081] U nekim otelotvorenjima IL-11R vezujući agens može biti pružen u obliku inhibitora malog molekula IL-11R.
[0082] Pronalazači su identifikovali da je regulacije na gore IL-11 eksprimiranja u skladu sa molekularnim mehanizmom fibroze i da inhibicija aktivnosti IL-11 dovodi do smanjenja molekularne osnove fibroze. Shodno tome, u nekim aspektima predmetnog obelodanjenja lečenje, prevencija ili ublažavanje fibroze može se obezbediti primenom agensa za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 od strane ćelija pacijenta, npr. fibroblastima ili miofibroblastima.
[0083] Pogodni agensi mogu biti bilo koje vrste, ali u nekim otelotvorenjima agens sposoban za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 može biti mali molekul ili oligonukleotid.
[0084] Taki i dr (Clin Exp Immunol. 1998 Apr; 112(1): 133-138) opiuju smanjenje eksprimiranja IL-11 u reumatoidnim sinovijalnim ćelijama nakon lečenja sa indometacinom, deksametazonom ili interferonomgama (IFNγ).
[0085] U nekim aspektima, agens sposoban za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 može biti oligonukleotid sposoban da potisne ili umanji eksprimiranje IL-11.
[0086] Prema tome, predmetno obelodanjenje takođe uključuje upotrebu tehnika poznatih u struci za terapeutsko regulisanje eksprimiranja IL-11. To uključuje upotrebu antisens oligonukleotida i RNK interferencije (RNKi). Kao i u drugim aspektima predmetnog obelodanjenja, ove tehnike mogu se koristiti u lečenju fibroze.
[0087] Shodno tome, predmetni pronalazak pruža postupak za lečenje ili prevenciju fibroze, gde postupak obuhvata davanje pacijentu, kom je potreban tretman, terapeutski efikasne količinu agensa koji može sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11, pri čemu agens sadrži vektor koji sadrži terapeutski oligonukleotid sposoban da potisne ili umanji eksprimiranje IL-11.
[0088] Takođe je ovde prikazan postupak za lečenje ili prevenciju fibroze, gde postupak obuhvata davanje pacijentu, kom je potreban tretman, terapeutski efikasne količine agensa koji može sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11, pri čemu agens sadrži oligonukleotidni vektor, opciono virusni vektor, kodirajući terapeutski oligonukleotid koji se može eksprimirati u ćelijama pacijenta, eksprimirani terapeutski oligonukleotid može da potisne ili umanji eksprimiranje IL-11.
[0089] Sposobnost agensa da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 može se analizirati određivanjem sposobnosti agensa da inhibira IL-11 gen ili eksprimiranje proteina pomoću fibroblasta ili miofibroblasta, npr. srčanih/atrijalnih fibroblasta ili miofibroblasta. Ovo se, na primer, može proceniti testom u kojom se fibroblasti ili miofibroblasti stimulišu IL-11 ili TGFβ1, i meri se eksprimiranje IL-11 gena ili proteina.
[0090] Smanjenje količine IL-11R dostupnog za vezivanje za IL-11 i iniciranje produktivne signalizacije pruža alternativno agens za smanjenje nivoa stimulisane signalizacije IL-11. Shodno tome, u srodnim aspektima koji su ovde obelodanjeni, lečenje, prevencija ili ublažavanje fibroze mogu se obezbediti primenom agensa koji može sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11R ćelijama pacijenta, npr. fibroblastima ili miofibroblastima.
[0091] U nekim otelotvorenjima, agens sposoban za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11R može biti oligonukleotid sposoban da potisne ili umanji eksprimiranje IL-11R.
[0092] Shodno tome, predmetno obelodanjenje takođe uključuje upotrebu tehnika poznatih u struci za regulaciju terapeutske regulacije IL-11R eksprimiranja. To uključuje upotrebu antisens oligonukleotida i RNK interferencije (RNKi). Kao i u drugim aspektima predmetnog obelodanjenja, ove tehnike mogu se koristiti u lečenju fibroze.
[0093] Prema tome, predmetno obelodanjenje pruža postupak za lečenje ili sprečavanje fibroze, i postupak obuhvata davanje pacijentu, kom je potreban tretman, terapeutski efikasne količine agensa koji može
1
sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11R, pri čemu agens sadrži vektor koji sadrži terapeutski oligonukleotid sposoban da potisne ili umanji eksprimiranje IL-11R.
[0094] Predmetno obelodanjenje takođe pruža postupak za lečenje ili prevenciju fibroze, gde postupak obuhvata davanje pacijentu, kom je potreban tretman, terapeutski efikasne količine agensa koji može sprečiti ili smanjiti eksprimiranje IL-11R, pri čemu agens sadrži oligonukleotidni vektor, opciono virusni vektor, koji kodira terapeutski oligonukleotid koji se može eksprimirati u ćelijama pacijenta, gde eksprimirani terapeutski oligonukleotid može da potisne ili umanji eksprimiranje IL-11R.
[0095] Sposobnost agensa da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11R može se analizirati određivanjem sposobnosti agensa da inhibira eksprimiranje IL-11R gena ili proteina pomoću fibroblasta ili miofibroblasta, npr. srčanih/atrijalnih fibroblaste ili miofibroblasta. Ovo se, na primer, može proceniti u analizi u kojoj su fibroblasti ili miofibroblasti stimulisani sa IL-11 ili TGFβ1, i meri se IL-11R gen ili eksprimiranje proteina.
[0096] U poželjnim otelotvorenjima, IL-11R može biti IL-11Rα.
Antitela
[0097] U ovoj specifikaciji „antitelo“ obuhvata fragment ili derivat antitela, ili sintetičko antitelo ili fragment sintetičkog antitela.
[0098] Antitela mogu biti pružena u izolovanom ili prečišćenom obliku. Antitela mogu biti formulisana kao farmaceutski sastav ili lek.
[0099] S obzirom na današnje tehnike u odnosu na tehnologiju monoklonskih antitela, antitela mogu biti pripremljena za većinu antigena. Deo koji se vezuje za antigen može biti deo antitela (na primer, Fab fragment) ili fragmenta sintetičkog antitela (na primer Fv fragment sa jednim lancem [ScFv]). Odgovarajuća monoklonska antitela za izabrane antigene mogu se pripremiti poznatim tehnikama, na primer onim obelodanjenim u „Monoclonal Antibodies: A manual of techniques“, H Zola (CRC Press, 1988) i „Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications“, J G R Hurrell (CRC Press, 1982). Himerna antitela su razmatrana od strane Neuberger i dr (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799).
[0100] Monoklonska antitela (mAb) su korisna u postupcima pronalaska i predstavljaju homogenu populaciju antitela koja specifično ciljaju jedan epitop na antigenu.
[0101] Poliklonska antitela su korisna u postupcima pronalaska. Poželjni su monospecificna poliklonska antitela. Pogodna poliklonska antitela mogu se pripremiti korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci.
[0102] Antigen vezujući fragmenti antitela, kao što su Fab i Fab2fragmenti, takođe se mogu koristiti/pružiti kao genetski angažovani antitela i fragmenti antitela. Varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) domeni antitela su uključeni u prepoznavanje antigena, što je činjenica koja se prvi put prepoznaje kod ranih eksperimenata za digestiju proteaza. Dalja potvrda je pronađena „humanizacijom“ antitela glodara. Varijabilni domeni glodarskog porekla mogu biti spojeni sa konstantnim domenima ljudskog porekla tako da rezultujuće antitelo zadrži antigenu specifičnost glodarskog antitela (Morrison i dr (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855).
[0103] Ta antigenska specifičnost određena varijabilnim domenima i nezavisna od konstantnih domena poznata je iz eksperimenata koji uključuju bakterijsko eksprimiranje fragmenata antitela, koji sadrže jedan ili više varijabilnih domena. Ovi molekuli uključuju molekule slične Fabu (Better i dr (1988) Science 240, 1041); Fv molekule (Skerra i dr (1988) Science 240, 1038); jednolančane Fv (ScFv) molekule gde su VH i VL partnerski domeni povezani preko fleksibilnog oligopeptida (Bird i dr (1988) Science 242, 423; Huston i dr (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879 ) i jednodomenska antitela (dAb) koja sadrže izolovane V domene (Ward i dr (1989) Nature 341, 544). Opšti pregled tehnika uključenih u sintezu fragmenata antitela koji zadržavaju svoja specifična vezujuća mesta se nalazi u Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.
[0104] Pod „ScFv molekulima“ podrazumevamo molekule u kojima su VH i VL partnerski domeni kovalentno povezani, npr. fleksibilnim oligopeptidom.
[0105] Fab, Fv, ScFv i dAb fragmenti antitela mogu se svi eksprimirati i izlučiti iz E. coli, omogućujući tako laku proizvodnju velikih količina pomenutih fragmenata.
[0106] Cela antitela i F(ab')2fragmenti su „bivalentni“. Pod „bivalentnim“ mislimo da pomenuta antitela i F(ab')2fragmenti imaju dva mesta za kombinovanje antigena. Nasuprot tome, Fab, Fv, ScFv i dAb fragmenti su monovalentni, i imaju samo jedno mesto za kombinovanje antigena. Sintetička antitela koja se vezuju za IL-11 ili IL-11R takođe mogu biti napravljena korišćenjem tehnologije prikaza faga, kako je dobro poznato u struci.
[0107] Antitela mogu biti proizvedena procesom sazrevanja afiniteta u kom se generiše modifikovano antitelo koje ima poboljšanje afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa nemodifikovanim roditeljskim antitelom. Afinitetno zrela antitela mogu biti proizvedene postupcima poznatim u struci, npr. Marks i dr.,Rio/Technology 10:779-783 (1992); Barbas i dr. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier i dr. Gene 169:147-155 (1995); Yelton etal. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson i dr., J. Immunol.154(7):3310-159 (1995); i Hawkins i dr, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
[0108] Antitela prema ovom obelodanjenju poželjno pokazuju specifično vezivanje za IL-11 ili IL-11R. Antitelo koje se specifično vezuje za ciljani molekul poželjno vezuje cilj sa većim afinitetom, i/ili sa većim trajanjem nego što se vezuje za druge mete. U jednom aspektu, stepen vezivanja antitela sa nepovezanim ciljem je manji od oko 10% vezivanja antitela za cilja kao što je mereno, npr., ELISA ili radioimunotestom (RIA). Alternativno, specifičnost vezivanja može se reflektovati u smislu afiniteta vezivanja gde se antitelo vezuje za IL-11 ili IL-11R sa KDkoji je najmanje 0,1 reda veličine (tj. 0,1 X 10<n>, gde je n ceo broj koji predstavlja red veličine) veći od KDantitela prema drugom ciljanom molekulu, npr. drugi član porodice IL-11, kao što je IL-6 ili IL-6 receptor. Ovo opciono može biti najmanje 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5 ili 2,0.
[0109] Antitela mogu biti detektabilno označena ili, barem, sposobna za detektovanje. Takva antitela su korisna i za in vivo (npr. postupci snimanja) i in vitro (npr. postupci ispitivanja) primene. Na primer, antitelo može biti označeno radioaktivnim atomom ili obojenim molekulom ili fluorescentnim molekulom ili molekulom koji se lako može detektovati na bilo koji drugi način. Pogodni detektabilni molekuli uključuju fluorescentne proteine, luciferaze, supstrate enzima i radiooznake. Vezujući deo može biti direktno označen detektabilnom oznakom ili može biti indirektno označen. Na primer, vezujući deo može biti neoznačeno antitelo koje može da se detektuje drugim antitelom koje je označeno. Alternativno, drugo antitelo može biti vezano za njegov biotin i vezivanje označenog streptavidina na biotin se koristi za indirektno označavanje prvog antitela.
[0110] Aspekti predmetnog obelodanjenja uključuju bi-specifična antitela, npr. sastavljena od dva različita fragmenta dva različita antitela, tako da bi-specifično antitelo vezuje dva tipa antigena. Jedan od antigena je IL-11 ili IL-11R, bi-specifično antitelo koje sadrži fragment koji je ovde opisan koji se vezuje za IL-11 ili IL-11R. Antitelo može sadržati različit fragment koji ima afinitet za drugi antigen, koji može biti bilo koji željeni antigen. Tehnike za pripremu bi-specifičnih antitela su dobro poznate u struci, npr. pogledati Mueller, D i dr., (2010 Biodrugs 24 (2): 89-98), Wozniak-Knopp G i dr., (2010 Protein Eng Des 23 (4): 289-297. Baeuerle, PA i dr., (2009 Cancer Res 69 (12): 4941-4944).
[0111] U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo pruženo je kao fuzioni protein dva jednolančana varijabilna fragmenta (scFV), koji sadrže VH i VL IL-11 ili IL-11R vezujućeg antitela ili fragmenta antitela i VH i VL drugog antitela ili fragmenta antitela.
[0112] Bispecifična antitela i bispecifični antigen vezujući fragmenti mogu biti pruženi u bilo kom odgovarajućem formatu, kao što su oni formati opisani u Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197. Na primer, bispecifično antitelo ili bispecifični antigen vezujući fragment može biti konjugat bispecifičnog antitela (npr. IgG2, F(ab')2ili CovX-telo), bispecifičan IgG ili IgG-sličan molekul (npr. IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 2 u 1-IgG, mAb<2>ili Tandemab uobičajeni LC), asimetrični bispecifični IgG ili IgG-molekul (npr. kih IgG, kih IgG uobičajeni LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, naelekstrisani ili SEED-telo), mali bispecifični molekul antitela (npr. diatelo (Db), dsDb, DART, scDb, tandAbs, tandem scFv (taFv), tandem dAb/VHH, trostruko telo, trostruka glava, Fab-scFv ili F(ab')2-scFv2), bispecifični Fc i CH3 fuzioni protein (npr. taFv-Fc, Di-diatelo, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc ili scFv-kih-CH3), ili bispecifični fuzioni protein (npr. scFv2-albumin, scDbalbumin, taFv-toksin, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-citokin2). Pogledati posebno Sliku 2 od Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19.
[0113] Postupci za proizvodnju bispecifičnih antitela obuhvataju hemijska unakrsna antitela ili fragmente antitela, npr. sa redukovanim disulfidima ili ne-redukovanim tioeterskim vezicama, na primer kao što je opisano kod Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology.
14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16. Na primer, N-sukcinimidil-3-(-2-piridilditio)-propionat (SPDP) se može koristiti za hemijsko prepletanje, npr. Fab fragmenti preko zglobne regije SH- grupa, za stvaranje disulfidno vezanih bispecifičnih F(ab)2heterodimera.
[0114] Ostali postupci za proizvodnju bispecifičnih antitela uključuju fiksiranje hibridoma za proizvodnju antitela, npr. sa polietilen glikolom, kako bi se proizvela ćelija kvadroma sposobna da luči bispecifično antitelo, na primer kako je opisano kod D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology.14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16.
[0115] Bispecifična antitela i bispecifični antigen vezujući fragmenti takođe se mogu rekombinantno proizvesti eksprimiranjem iz npr. konstrukta nukleinske kiseline koji kodira polipeptide za antigen vezujuće molekule, na primer kao što je opisano kod Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), ili francuski, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med.2000; 40:333-339.
[0116] Na primer, konstrukt DNK koji kodira varijabilne domene lakog i teškog lanca za dva antigen vezujuća domena (tj. varijabilni domeni lakog i teškog lanca za antigen vezujući domen sposobni za vezivanje IL-11 ili IL-11R, i l varijabilni domeni lakog i teškog lanca za antigen vezujući domen sposobni za vezivanje za drugi ciljani protein), uključujući i sekvence koje kodiraju odgovarajući veznik ili domen za dimerizaciju između antigen vezujućih domena, mogu se pripremiti tehnikom molekularnog kloniranja. Rekombinantno bispecifično antitelo može posle toga biti proizvedeno eksprimiranjem (npr. in vitro) konstrukta u odgovarajućoj ćeliji domaćina (npr. sisarska ćelija domaćin), i zatim se eksprimirani rekombinantno bispecifično antitelo može opciono pročistiti.
Aptameri
[0117] Aptameri, takođe nazvani ligandi nukleinskih kiselina, su molekuli nukleinske kiseline koji se karakterišu sposobnošću da se vezuju za ciljani molekul sa visokom specifičnošću i visokim afinitetom. Skoro svaki aptamer identifikovan do danas je molekul koji se ne javlja u prirodi.
[0118] Aptameri do datog cilja (npr. IL-11 ili IL-11R) mogu biti identifikovani i/ili proizvedeni postupkom sistematske evolucije liganda pomoću eksponencijalnog obogaćivanja (SELEX™). Aptameri i SELEX su opisani u Tuerk i Gold (sistemska evolucija liganda eksponencijalnim obogaćivanjem: RNK ligandi za bakteriofag T4 DNK polimerazu. Science.1990 Aug 3;249(4968):505-10) i u WO91/19813.
[0119] Aptameri mogu biti molekuli DNK ili RNK i mogu biti jednolančani ili dvolančani. Aptamer može sadržati hemijski modifikovane nukleinske kiseline, na primer u kojima su šećer i/ili fosfat i/ili baza hemijski modifikovani. Takve modifikacije mogu poboljšati stabilnost aptamera ili učiniti aptamer otpornijim na degradaciju i mogu uključiti modifikaciju na 2' položaju riboze.
[0120] Aptameri se mogu sintetisati postupcima koji su dobro poznati kvalifikovanoj osobi. Na primer, aptameri mogu biti hemijski sintetisani, npr. na čvrstoj potpori.
[0121] Sinteza čvrste faze može koristiti hemiju fosforamidita. Ukratko, čvrsto podržani nukleotid je detritilisan, i zatim spojeni sa odgovarajućim aktiviranim nukleozidnim fosforamiditom u cilju formiranja veze fosfitnog triestra. Zatim se može desiti ograničavanje, praćeno oksidacijom trifester fosfita sa oksidantom, tipično jodom. Tada se ciklus može ponoviti da se sastavi aptamer.
[0122] Aptameri se mogu smatrati ekvivalentom nukleinske kiseline monoklonskih antitela i često imaju Kdu nM ili pM opsegu, npr. manje od 500nM, 100nM, 50nM, 10nM, 1nM, 500pM, 100pM. Kao i kod monoklonskih antitela, oni mogu biti korisni u skoro svakoj situaciji u kojoj je potrebno vezivanje mete, uključujući upotrebu u terapijskim i dijagnostičkim primenama, in vitro ili in vivo. In vitro dijagnostičke aplikacije mogu uključiti upotrebu u detektovanju prisustva ili odsustva ciljanog molekula.
[0123] Aptameri prema predmetnom obelodanjenju mogu biti pruženi u prečišćenom ili izolovanom obliku. Aptameri prema predmetnom obelodanjenju mogu se formulisati kao farmaceutski preparat ili lek.
[0124] Pogodni aptameri mogu opciono imati minimalnu dužinu od 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 nukleotida
[0125] Pogodni aptameri mogu opciono imati maksimalnu dužinu od 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ili 80 nukleotida
1
[0126] Pogodni aptameri mogu opciono imati dužinu od 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ili 80 nukleotida.
Oligonukleotidna represija eksprimiranja IL-11 ili IL-11R
[0127] Oligonukleotidni molekuli, posebno RNK, mogu se koristiti za regulisanje eksprimiranja gena. Ovo uključuje antisens oligonukleotide, ciljanu degradaciju mRNK kod malih interferišućih RNK (siRNK), post-transkripcionog utišavanja gena (PTGs), razvojno regulisane sekvencijalno translacione represije mRNK od mikrRNK (miRNK) i ciljanog transkripcionog utišavanja gena.
[0128] Antisens oligonukleotid je oligonukleotid, poželjno jednolančani, koji cilja i vezuje se, komplementarnim vezivanjem sekvence, na ciljani oligonukleotid, npr. mRNK. Kada je ciljani oligonukleotid mRNK, vezivanje antisensa na mRNK blokira translaciju mRNK i eksprimiranje genskog proizvoda. Antisens oligonukleotidi mogu biti dizajnirani tako da vezuju sens genomsku nukleinsku kiselinu i inhibiraju transkripciju ciljane nukleotidne sekvence.
[0129] S obzirom na poznate sekvence nukleinskih kiselina za IL-11 (npr. poznate mRNK sekvence dostupne od GenBank® pod pristupnim brojem BC012506.1 GI:15341754 (ljudska), BC134354.1 GI:126632002 (mišja), AF347935. 1 GI:13549072 (pacovska)) i IL-11R (npr. poznate mRNK sekvence dostupne od GenBank® pod pristupnim brojem NM_001142784.2 GI:391353394 (ljudska), NM_001163401.1 GI:254281268 (mišja), NM_139116.1 GI:20806172 (pacovska)), oligonukleotidi mogu biti dizajnirani da potisnu ili utišaju eksprimiranje IL-11 ili IL-11R. Takvi oligonukleotidi mogu imati bilo koju dužinu, ali mogu poželjno biti kratki, npr. manje od 100 nukleotida, npr. 10-40 nukleotida ili 20-50 nukleotida i mogu sadržati nukleotidnu sekvencu koja ima potpunu ili skoro potpunu komplementarnost (npr. 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% komplementarnost) sekvenci nukleotida odgovarajuće dužine u ciljanom oligonukleotidu, npr. IL-11 ili IL-11R mRNK. Komplementarni region nukleotidne sekvence može imati bilo koju dužinu, ali poželjno je najmanje 5, i opciono ne više od 50, nukleotida duga, npr.6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili 50 nukleotida.
[0130] Represija eksprimiranja IL-11 ili IL-11R poželjno će dovesti do smanjenja količine IL-11 ili IL-11R eksprimiranih od strane ćelije, npr. fibroblastom ili miofibroblastom. Na primer, u datoj ćeliji represija IL-11 ili IL-11R primenom odgovarajuće nukleinske kiseline rezultovaće smanjenjem količine IL-11 ili IL-11R, eksprimiranih od strane te ćelije u odnosu na netretiranu ćeliju. Represija može biti delimična. Poželjni stepen represije je najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, 70%, 80%, 85% ili 90%. Nivo represije između 90% i 100% smatra se „utišavanjem“ eksprimiranja ili funkcije.
[0131] Prikazana je uloga RNKi mehanizma i malih RNK u ciljanju heteroromatskih kompleksa i epigenskog utišavanja gena u specifičnim hromozomskim lokusima. Post-transkripciono utišavanje zavisno od dvolančane RNK (dsRNK), takođe poznato kao RNK interferencija (RNKi), je fenomen u kom dsRNK kompleksi mogu ciljati specifične gene homologije za utišavanje u kratkom vremenskom periodu. Deluje kao signal koji podstiče degradaciju mRNK sa sekvencijalnim identičnošću. 20-nt siRNK je generalno dovoljno dugačak da indukuje gensko-specifično utišavanje, ali dovoljno kratko da izbegne odgovor domaćina. Smanjenje eksprimiranja ciljanih genskih proizvoda može biti obimno sa 90% utišavanja izazvanim od strane malo molekula siRNK. Terapije bazirane na RNKi su napredovale u kliničke studije Faza I, II i III za brojne indikacije (Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433).
[0132] U struci su ove RNK sekvence označene kao „kratke ili male interferišuće RNK“ (siRNK) ili „mikroRNK“ (miRNK) u zavisnosti od svog porekla. Oba tipa sekvence mogu se koristiti za regulisanje na dole eksprimiranja gena vezivanjem za komplementarne RNK i za pokretanje eliminacije mRNK (RNKi) ili za zaustavljanje mRNK translacije u protein. siRNK se dobija preradom dugih dvolančanih RNK i kada se u prirodi pronađu tipično su egzogenog porekla. Mikro-interferišuće RNK (miRNK) su endogeno kodirane male nekodirajuće RNK, dobijene preradom kratkih ukosnica. I siRNK i miRNK mogu inhibirati translaciju mRNK koje imaju delimično komplementarne ciljane sekvence bez cepanja RNK i degradiraju mRNK koje imaju potpuno komplementarne sekvence.
[0133] Prema tome, ovo obelodanjenje pruža upotrebu oligonukleotidnih sekvenci za regulisanje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R.
[0134] siRNK ligandi su tipično dvolančani i, kako bi se optimizovala efikasnost regulisanja na dole funkcija ciljanog gena posredovna sa RNK, poželjno je da se odabere dužina siRNK molekula kako bi se obezbedilo tačno prepoznavanje siRNK od strane RISC kompleksa koji posreduje prepoznavanje siRNK od strane mRNK meta, i tako da je siRNK dovoljno kratak da smanji odgovor domaćina.
[0135] miRNK ligandi su tipično jednolančani i imaju regione koji su delimično komplementarni, što omogućuje ligandima da formiraju ukosnicu. miRNK su geni RNK koji se transkribuju iz DNK, ali nisu prevedeni u protein. DNK sekvenca koja kodira miRNK gen je duža nego miRNK. Ova DNK sekvenca uključuje miRNK sekvencu i približni reverzni komplement. Kada se ova DNK sekvenca transkribuje u jednolančani RNK molekul, miRNK sekvenca i njen parni bazni par reverznog komplementa formiraju delimično dvolančani RNK segment. Dizajn mikroRNK sekvenci razmatran je od strane John i dr, PLoS Biology, 11 (2), 1862-1879, 2004.
[0136] Tipično, RNK ligandi namenjeni da imitiraju efekte siRNK ili miRNK imaju između 10 i 40 ribonukleotida (ili njihovih sintetičkih analoga), poželjnije između 17 i 30 ribonukleotida, poželjnije između 19 i 25 ribonukleotida i najpoželjnije između 21 i 23 ribonukleotida. U nekim aspektima obelodanjenja, korišćenjem dvolančane siRNK, molekul može imati simetrične 3' prepuste, npr. jedan ili dva (ribo) nukleotida, tipično UU od dTdT 3' prepusta. Na osnovu obelodanjenja koje je ovde dato, kvalifikovana osoba može lako dizajnirati odgovarajuće siRNK i miRNK sekvence, na primer koristeći resurse kao što je Ambion siRNK tragač. siRNK i miRNK sekvence mogu biti sintetički proizvedene i dodate egzogeno kako bi se uzrokovalo regulisanje gena na dole, ili biti proizvedeni pomoću sistema eksprimiranja (npr. vektora). U poželjnom otelotvorenju siRNK se sintetički sintetiše.
[0137] Duže dvolančane RNK mogu se obraditi u ćeliji kako bi proizvele siRNK (pogledati na primer Myers (2003) Nature Biotechnology 21:324-328). Duži dsRNK molekul može imati simetrične 3' ili 5' prepuste, npr. jedan ili dva (ribo) nukleotida, ili može imati tupe krajeve. Duži dsRNK molekuli mogu biti 25 nukleotida ili duži. Poželjno, duži dsRNK molekuli su između 25 i 30 nukleotida. Još poželjnije, duži dsRNK molekuli su između 25 i 27 nukleotida. Najpoželjnije, duži dsRNK molekuli su dužine 27 nukleotida. DsRNK dužine 30 nukleotida ili više mogu biti eksprimirane korišćenjem vektora pDECAP (Shinagawa i dr., Genes and Dev., 17, 1340-5, 2003).
[0138] Druga alternativa je eksprimiranje kratkog ukosnica RNK molekula (shRNK) u ćeliji. shRNK su stabilniji od sintetičkih siRNK. shRNK se sastoji od kratkih inverznih ponavljanja razdvojenih sekvencom malih petlji. Jedno obrnuto ponavljanje je dodatak genskom cilju. U ćeliji, shRNK je obrađen od strane DICER u siRNK koja degradira mRNK ciljane gene i suzbija eksprimiranje. U poželjnom otelotvorenju shRNK se proizvodi endogeno (unutar ćelije) transkripcijom iz vektora. shRNK se može proizvoditi u ćeliji transfektovanjem ćelije sa vektorom koji kodira shRNK sekvencu pod kontrolom promotera RNK polimeraze III, kao što je ljudski H1 ili 7SK promoter ili promotor RNK polimeraze II. Alternativno, shRNK se može egzogeno sintetisati (in vitro) transkripcijom iz vektora. shRNK se zatim može direktno uneti u ćeliju. Poželjno, molekul shRNK sadrži delimičnu sekvencu IL-11 ili IL-11R. Poželjno, shRNK sekvenca je dužine između 40 i 100 baza, poželjnije dužine između 40 i 70 baza. Stabla ukosnica su poželjno dužine između 19 i 30 baznih parova. Stablo može sadržati G-U parove kako bi stabilizovalo strukturu ukosnice.
[0139] siRNK molekuli, duži dsRNK molekuli ili miRNK molekuli mogu se rekombinantno napraviti transkripcijom sekvence nukleinske kiseline, poželjno sadržane u vektoru. Poželjno, siRNK molekul, duži dsRNK molekul ili miRNK molekul sadrži delimičnu sekvencu IL-11 ili IL-11R.
[0140] U jednom otelotvorenju, siRNK, duži dsRNK ili miRNK se proizvode endogeno (unutar ćelije) transkripcijom iz vektora. Vektor se može uneti u ćeliju na bilo koji način koji je poznat u struci. Opciono, eksprimiranje RNK sekvence može se regulisati pomoću promotera specifičnog za tkivo (npr. specifičnog za srce, jetru, bubreg, ili oko). U daljem otelotvorenju, siRNK, duži dsRNK ili miRNK se proizvode egzogeno (in vitro) transkripcijom iz vektora.
[0141] Pogodni vektori mogu biti oligonukleotidni vektori konfigurisani da eksprimiraju oligonukleotidni agens sposoban za IL-11 ili IL-11R represiju. Takvi vektori mogu biti virusni vektori ili plazmidni vektori. Terapeutski oligonukleotid može biti inkorporiran u genom virusnog vektora i operativno vezan za regulatornu sekvencu, npr. promoter, koji pokreće svoje eksprimiranje. Izraz „operativno povezani“ može
1
uključivati situaciju u kojoj su izabrana nukleotidna sekvenca i regulatorna nukleotidna sekvenca kovalentno vezani na takav način da se eksprimiranje nukleotidne sekvence podvrgava uticaju ili kontroli regulatorne sekvence. Prema tome, regulatorna sekvenca je operativno vezana za odabranu nukleotidnu sekvencu ako regulatorna sekvenca može da izvede transkripciju nukleotidne sekvence koja čini deo ili celinu izabrane nukleotidne sekvence.
[0142] Virusni vektori koji kodiraju promotor-eksprimirane siRNK sekvence su poznati u struci i imaju prednost dugotrajnog eksprimiranja terapeutskog oligonukleotida. Primeri uključuju lentivirale (Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433), adenovirus (Shen i dr., FEBS Lett 2003 Mar 27;539(1-3)111-4) i retroviruse (Barton and Medzhitov PNAS November 12, 2002 vol.99, no.2314943-14945).
[0143] U drugim otelotvorenjima vektor može biti konfigurisan da pomogne isporuku terapeutskog oligonukleotida na mesto na kom je potrebna represija eksprimiranja IL-11 ili IL-11R. Takvi vektori obično uključuju kompleksiranje oligonukleotida sa pozitivno naelektrisanim vektorima (npr. katjonski peptidi koji penetriraju ćeliju, katjonski polimeri i dendrimi i katjonski lipidi); konjugovanje oligonukleotida sa malim molekulima (npr. holesterol, žučne kiseline i lipidi), polimeri, antitela i RNK; ili inkapsulirajući oligonukleotid u formulacijama nanočestica (Wang i dr., AAPS J. 2010 Dec; 12(4): 492-503).
[0144] U jednom otelotvorenju, vektor može sadržati sekvencu nukleinske kiseline i u sens i u antisens orjentaciji, tako da kada se eksprimiraju u RNK, sens i antisens sekcije će se povezati kako bi se formirala dvolančana RNK.
[0145] Alternativno, siRNK molekuli mogu biti sintetisani pomoću standardnih postupaka sinteze čvrste ili rastvorne faze koji su poznati u struci. Veze između nukleotida mogu biti fosfodiestarske veze ili alternative, na primer, vezujući grupe formule P(O)S, (tioat); P(S)S, (ditioat); P(O)NR'2; P(O)R'; P(O)OR6; CO; ili CONR'2 gde R je H (ili so) ili alkil (1-12C) i R6 je alkil (1-9C) spojen sa susednim nukleotidima putem -O- ili -S-.
[0146] Modifikovane nukleotidne baze mogu se koristiti pored prirodnih baza, i mogu dati pogodna svojstva siRNK molekulima koji ih sadrže.
[0147] Na primer, modifikovane baze mogu povećati stabilnost siRNK molekula, čime se smanjuje potreba za utišavanjem. Pružanje modifikovanih baza može takođe da pruži siRNK molekule koji su više ili manje stabilni od neizmenjene siRNK.
[0148] Izraz 'modifikovana nukleotidna baza' obuhvata nukleotide sa kovalentno modifikovanom bazom i/ili šećerom. Na primer, modifikovani nukleotidi uključuju nukleotide koji imaju šećere koji su kovalentno vezani za organske grupe niske molekulske mase, različite od hidroksilne grupe na 3' položaju, i osim fosfatne grupe u 5'-položaju. Tako modifikovani nukleotidi mogu takođe uključiti 2' supstituisane šećere kao što je 2'-O-metil-; 2'-O-alkil; 2'-O-alil; 2'-S-alkil; 2'-S-alil; 2'-fluoro-; 2'-halo ili azido-riboza, analoge karbocikličnog šećera, a-anomerne šećere; epimerne šećere, kao što su arabinoza, ksiloza ili lizos, piranozne šećere, furanozne šećere i sedoheptulozu.
[0149] Modifikovani nukleotidi su poznati u struci i uključuju alkilovane purine i pirimidine, acilovane purine i pirimidine i druge heterocikle. Ove klase pirimidina i purina su poznate u struci i uključuju pseudoizocitozin, N4,N4-etanocitozin, 8-hidroksi-N6-metiladenin, 4-acetilcitozin,5-(karboksihidroksilmetil) uracil, 5 fluorouracil, 5-bromouracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetilaminometil uracil, dihidrouracil, inozin, N6-izopentil-adenin, 1-metiladenin, 1-metilpseudouracil, 1-metilguanin, 2,2-dimetilguanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-metiladenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometil uracil, 5-metoksi amino metil-2-tiouracil, -D-manosilkenozin, 5-metoksikarbonilmetiluracil, 5metoksiuracil, 2 metiltio-N6-izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina metil ester, psueouracil, 2-tiocitozin, 5-metil-2 tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5metiluracil, N-uracil-5-oksisirćetna kiselina metilester, uracil 5-oksisirćetna kiselina, kenozin, 2-tiocitozin, 5-propiluracil, 5-propilcitozin, 5-etiluracil, 5etilcitozin, 5-butiluracil, 5-pentiluracil, 5-pentilcitozin, i 2,6,diaminopurin, metilpsuedouracil, 1-metilguanin, 1-metilcitozin.
[0150] Postupci koji se odnose na upotrebu RNKi za utišavanje gena kod C. elegans, Drosophila, biljaka i sisarima poznati su u struci (Fire A, i dr., 1998 Nature 391:806-811; Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001); Hammond, S. M., i dr., Nature Rev. Genet.2, 110-1119 (2001); Tuschl, T. Chem. Biochem.2, 239-245 (2001); Hamilton, A. i dr., Science 286, 950-952 (1999); Hammond, S. M., i dr., Nature 404, 293-296 (2000); Zamore, P. D., i dr.,
1
Cell 101, 25-33 (2000); Bernstein, E., i dr., Nature 409, 363-366 (2001); Elbashir, S. M., i dr., Genes Dev.
15, 188-200 (2001); WO0129058; WO9932619, i Elbashir S M, i dr., 2001 Nature 411:494-498).
[0151] Prema tome, predmetno obelodanjenje pruža nukleinsku kiselinu koja je sposobna, kada se odgovarajuće unosi u ili eksprimira unutar sisara, npr. čoveka, ćelija koja inače eksprimira IL-11 ili IL-11R, suzbija eksprimiranje IL-11 ili IL-11R sa RNKi.
[0152] Nukleinska kiselina može imati značajnu identičnost sekvence sa delom IL-11 ili IL-11R mRNK, kako je definisano u GenBank pristupnom br. NM_000641.3 GI:391353405 (IL-11) ili U32324.1 GI:975336 (IL-11R) ili komplementarna sekvenca pomenutoj mRNK.
[0153] Nukleinska kiselina može biti dvolančana siRNK. (Kako će kvalifikovana osoba razumeti, i kako je objašnjeno dalje u nastavku, siRNK molekul može takođe uključivati i kratku 3' DNK sekvencu.)
[0154] Alternativno, nukleinska kiselina može biti DNK (obično dvolančana DNK) koja, kada se transkribuje u ćeliji sisara, daje RNK koja ima dva komplementarna dela spojena preko razmaknice, tako da RNK uzima oblik ukosnice kada komplementarni delovi hibridizuju jedni sa drugima. U ćeliji sisara struktura ukosnice može se odvojiti iz molekula enzimom DICER, kako bi se dobila dva različita, ali hibridizovana, molekula RNK.
[0155] U nekim poželjnim otelotvorenjima, nukleinska kiselina je uglavnom ciljana na sekvencu jedne od SEQ ID NO 2 do 5 (IL-11, Slika 11) ili na jedan od SEQ ID NO 7 do 10 (IL-11R, Slika 12).
[0156] Očekuje se da su samo jednolančani (tj. ne-samo-hibridizovani) regioni mRNK transkripta odgovarajuće mete za RNKi. Stoga se predlaže da druge sekvence, koje su veoma bliske u IL-11 ili IL-11R mRNK transkriptu sekvenci koja predstavlja jednu od SEQ ID NO 2 do 5 ili 7 do 10, takođe mogu biti pogodne mete za RNKi. Takve ciljane sekvence su poželjno dugačke 17 do 23 nukleotida i poželjno se preklapaju sa jednim od SEQ ID NO 2 do 5 ili 7 do 10 po najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ili svih 19 nukleotida (na bilo kom kraju jednog od SEQ ID NO 2 do 5 ili 7 do 10).
[0157] Prema tome, predmetno obelodanjenje pruža nukleinsku kiselinu koja je sposobna, kada se odgovarajuće uvede ili eksprimira u ćeliji sisara koja inače eksprimira IL-11 ili IL-11R, suzbije eksprimiranje IL-11 ili IL-11R pomoću RNKi, pri čemu je nukleinska kiselina generalno ciljana na sekvencu jedne od SEQ ID NO 2 do 5 ili 7 do 10.
[0158] Pod „uglavnom ciljanjem“, nukleinska kiselina može da cilja sekvencu koja se preklapa sa SEQ ID NO 2 do 5 ili 7 do 10. Konkretno, nukleinska kiselina može da cilja sekvencu u mRNK ljudske IL-11 ili IL-11R što je malo duže ili kraće od jedne od SEQ ID NO 2 do 5 ili 7 do 10 (poželjno dužine od 17-23 nukleotida), ali je inače identična jednoj od SEQ ID NO 2 do 5 ili 7 do 10.
[0159] Očekuje se da savršena identičnost/komplementarnost između nukleinske kiseline i ciljane sekvence, iako poželjni, nisu neophodni. Shodno tome, nukleinska kiselina može uključivati pojedinačnu neusklađenost u poređenju sa mRNK od IL-11 ili IL-11R. Očekuje se, međutim, da će prisustvo čak i jedne neusaglašenosti verovatno dovesti do smanjene efikasnosti, tako da je poželjno odsustvo neusaglašenosti. Kada su prisutni, 3' prepusti se mogu isključiti iz razmatranja broja neusaglašenosti.
[0160] Izraz „komplementarnost“ nije ograničen na konvencionalno bazno uparivanje između nukleinske kiseline koja se sastoji od prirodnih ribo- i/ili deoksiribonukleotida, ali takođe uključuje bazno uparivanje između mRNK i nukleinskih kiselina koje uključuju ne-prirodne nukleotide.
[0161] U jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina (ovde se naziva dvolančana siRNK) uključuje dvolančane RNK sekvence prikazane na Slici 13 (IL-11, SEQ ID NO 11 do 14).
[0162] U još jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina (ovde se naziva dvolančana siRNK) uključuje dvolančane RNK sekvence prikazane na Slici 14 (IL-11R, SEQ ID NO 15 do 18).
[0163] Međutim, takođe se očekuje da će nešto kraće ili duže sekvence usmereni na isti region IL-11 ili IL-11R mRNK takođe biti efikasne. Konkretno, očekuje se da će dvolančane sekvence dužine između 17 i 23 bp biti efikasne.
[0164] Lanci koji formiraju dvolančanu RNK mogu imati kratke 3' dinukleotidne prepuste, koji mogu biti DNK ili RNK. Upotreba 3' prepusta DNK nema efekta na aktivnost siRNK u poređenju sa 3' RNK prepustom, ali smanjuje troškove hemijske sinteze nukleinskih kiselina (Elbashir i dr., 2001c). Zbog toga mogu biti poželjni DNK dinukleotidi.
1
[0165] Kada su prisutni, prepusti dinukleotida mogu biti simetrični jedni u odnosu na druge, iako to nije neophodno. Zaista, 3' prepust sens (gornjeg) lanca je irelevantan za RNKi aktivnost, jer ne učestvuje u prepoznavanju i degradaciji mRNK (Elbashir i dr., 2001a, 2001b, 2001c).
[0166] Dok eksperimenti RNKi na Drosophila pokazuju da antisens 3' prepusti mogu učestvovati u prepoznavanju i ciljanju mRNK (Elbashir i dr. 2001c), 3' prepusti se ne vide kao neophodni za RNKi aktivnost siRNK u ćelijama sisara. Stoga se smatra da nepravilno kalemljenje 3' prepusta ima malo efekta kod ćelija sisara (Elbashir i dr.2001c; Czauderna i dr.2003).
[0167] Zbog toga se može primeniti bilo koji dinukleotidni prepust u antisens lancu siRNK. Bez obzira na to, dinukleotid je poželjno -UU ili -UG (ili -TT ili -TG ako je prepust DNK), poželjnije -UU (ili -TT). UU (ili -TT) dinukleotidni prepust je najefikasniji i konzistentan je sa (tj. sposoban je da formira deo) RNK polimeraze III kraja transkripcijskog signala (terminatorski signal je TTTTT). Prema tome, ovaj dinukleotid je najpoželjniji. Mogu se koristiti i dinukleotidi AA, CC i GG, ali su manje efikasni i, prema tome, manje poželjni.
[0168] Štaviše, 3' prepusti se mogu potpuno izostaviti iz siRNK.
[0169] Predmetno obelodanjenje takođe pruža jednolančane nukleinske kiseline (ovde se nazivaju jednolančane siRNK), odnosno sastoje se od komponentne ćelije jedne od pomenutih dvolančanih nukleinskih kiselina, poželjno sa 3'-prepustima, ali opciono bez njih. Predmetno obelodanjenje takođe sadrži komplete koje sadrže parove takvih jednolančanih nukleinskih kiselina, koji su sposobni da hibridizuju jedan sa drugim in vitro kako bi se formirali pomenuti dvolančani siRNK, koji se zatim mogu uneti u ćelije.
[0170] Predmetno obelodanjenje takođe daje DNK koja, kada se transkribuje u ćeliju sisara, daje RNK (ovde se takođe naziva i shRNK) koja ima dva komplementarna dela koji su sposobni da se sami hibridizuju kako bi proizveli dvolančani motivi, npr. uključujući sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No. 11 do 14 ili 15 do 18 ili sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od prethodno navedenih sekvenci pomoću jedne supstitucije baznog para.
[0171] Komplementarni delovi će se obično pridružiti razmaknicom, koja ima odgovarajuću dužinu i sekvencu kako bi se omogućilo da se dva komplementarna dela hibridizuju jedni sa drugima. Dva komplementarna (tj. sens i antisens) dela mogu biti spojeni 5'-3' u bilo kom redosledu. Razmaknica će obično biti kratka sekvenca, otprilike 4-12 nukleotida, poželjno 4-9 nukleotida, poželjnije 6-9 nukleotida.
[0172] Poželjno, 5' kraj razmaknice (neposredno 3' od uzvodnog komplementarnog dela) sastoji se od nukleotida -UU- ili -UG-, opet poželjno -UU- (ipak, opet, korišćenje ovih određenih dinukleotida nije neophodno). Pogodna razmaknica, preporučena za upotrebu u pSuper sistemu od OligoEngine (Seattle, Washington, USA) je UUCAAGAGA. U ovom i drugim slučajevima, krajevi razmaknica mogu se međusobno hibridizovati, npr. produžavajući dvolančani motiv izvan tačnih sekvenci od SEQ ID NO 11 do 14 ili 15 do 18 sa malim brojem (npr.1 ili 2) baznih parova.
[0173] Slično tome, transkribovana RNK poželjno uključuje 3' prepust od nizvodnog komplementarnog dela. Opet, ovo je poželjno -UU ili -UG, još poželjnije -UU.
[0174] Takvi shRNK molekuli se onda mogu cepati u ćeliji sisara enzimom DICER kako bi se dobila dvolančana siRNK kao što je gore opisano, u kom jedan ili svaki lanac hibridizovane dsRNK uključuje 3' prepust.
[0175] Tehnike za sintezu nukleinskih kiselina predmetnog obelodanjenja su, naravno, dobro poznate u struci.
[0176] Kvalifikovana osoba je u stanju da konstruiše odgovarajuće vektore transkripcije za DNK predmetnog obelodanjenja koristeći dobro poznate tehnike i komercijalno dostupne materijale. Konkretno, DNK će biti povezana sa kontrolnim sekvencama, uključujući promoter i sekvencu završetka transkripcije.
[0177] Posebno pogodni su komercijalno dostupni pSuper i pSuperior sistemi od
[0178] OligoEngine (Seattle, Washington, USA). Oni koriste promoter polimeraze-III (H1) i T5sekvenca transkripcionog terminatora koja doprinosi dva U ostatka na 3' kraju transkripta (koji, nakon DICER obrade, daje 3' UU prepust jednog lanca siRNK).
1
[0179] Drugi pogodan sistem je opisan kod Shin i dr. (RNA, 2009 May; 15(5): 898-910), koji koristi drugi promoter polimeraze-III (U6).
[0180] Dvolančane siRNK predmetnog obelodanjenja mogu se uvesti u ćelije sisara in vitro ili in vivo koristeći poznate tehnike, kao što je opisano kod nastavku, za suzbijanje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R.
[0181] Slično tome, vektori transkripcije, koji sadrže DNK predmetnog obelodanjenja, mogu se uvesti u tumorske ćelije in vitro ili in vivo koristeći poznate tehnike, kao što je opisano kod nastavku, za transijento ili stabilno eksprimiranje RNK, kako bi se potisnulo eksprimiranje IL-11 ili IL-11R.
[0182] Shodno tome, predmetno obelodanjenje takođe pruža postupak suzbijanja eksprimiranja IL-11 ili IL-11R kod sisarske, npr. ljudske, ćelije, gde postupak obuhvata davanje ćeliji dvolančane siRNK prema pronalasku ili vektora transkripcije prema pronalasku.
[0183] Slično tome, predmetno obelodanjenje dalje pruža postupak za lečenje fibroze, gde postupak obuhvata davanje pacijentu dvolančane siRNK ili vektora transkripcije koji je ovde obelodanjen.
[0184] Predmetno obelodanjenje dalje pruža dvolančane siRNK i vektore transkripcije koji su ovde obelodanjeni, za upotrebu u postupku lečenja, poželjno u postupku lečenja fibroze.
[0185] Predmetno obelodanjenje dalje pruža upotrebu dvolančanih siRNK i vektora transkripcije koji su ovde prikazani u pripremi leka za lečenje fibroze.
[0186] Predmetno obelodanjenje dalje daje sastav koji sadrži dvolančanu siRNK ili vektor transkripcije koji je ovde prikazan u smeši sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Pogodni nosači uključuju lipofilne nosače ili vezikule, što može pomoći u prodoru ćelijske membrane.
[0187] Materijali i postupci pogodne za primenu siRNK dupleksa i DNK vektora predmetnog obelodanjenja su dobro poznati u struci i poboljšani postupci su u razvoju, s obzirom na potencijal RNKi tehnologije.
[0188] Generalno, dostupne su mnoge tehnike za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije sisara. Izbor tehnike zavisi od toga da li se nukleinska kiselina prenosi u kultivisane ćelije in vitro ili in vivo u ćelijama pacijenta. Tehnike pogodne za prenos nukleinske kiseline u ćelije sisara in vitro uključuju upotrebu lipozoma, elektroporacije, mikroinženjeringa, fuzija ćelija, DEAE dekstrana i taloženja kalcijum fosfata. In vivo tehnike prenosa gena obuhvataju transfekciju sa virusnim (obično retroviralnim) vektorima i transfekcijom posredovanom virusima obloženim sa protein-lipozomom (Dzau i dr. (2003) Trends in Biotechnology 11, 205-210).
[0189] Posebno, odgovarajuće tehnike za ćelijsku primenu nukleinskih kiselina predmetnog obelodanjenja i in vitro i in vivo su objavljeni u sledećim člancima:
Opšti pregledi: Borkhardt, A. 2002. Blocking oncogenes in malignant cells by RNA interference--new hope for a highly specific cancer treatment? Cancer Cell. 2:167-8. Hannon, G.J. 2002. RNA interference. Nature.418:244-51. McManus, M.T., i P.A. Sharp.2002. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet.3:737-47. Scherr, M., M.A. Morgan, i M. Eder.2003b. Gene silencing mediated by small interfering RNAs in mammalian cells. Curr Med Chem.10:245-56. Shuey, D.J., D.E. McCallus, i T. Giordano.2002. RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention. Drug Discov Today.7:1040-6.
[0190] Sistemska dostava pomoću lipozoma: Lewis, D.L., J.E. Hagstrom, A.G. Loomis, J.A. Wolff, i H. Herweijer. 2002. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nat Genet. 32:107-8. Paul, C.P., P.D. Good, I. Winer, i D.R. Engelke. 2002. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol. 20:505-8. Song, E., S.K. Lee, J. Wang, N. Ince, N. Ouyang, J. Min, J. Chen, P. Shankar, i J. Lieberman. 2003. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med.9:347-51. Sorensen, D.R., M. Leirdal, i M. Sioud.2003. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice. J Mol Biol.327:761-6.
[0191] Prenos posredovan virusom: Abbas-Terki, T., W. Blanco-Bose, N. Deglon, W. Pralong, i P. Aebischer.2002. Lentiviral-mediated RNA interference. Hum Gene Ther.13:2197-201. Barton, G.M., i R. Medzhitov.2002. Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:14943-5. Devroe, E., i P.A. Silver.2002. Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol.2:15. Lori, F., P. Guallini, L. Galluzzi, i J. Lisziewicz. 2002. Gene therapy approaches to HIV infection. Am J Pharmacogenomics. 2:245-52. Matta, H., B. Hozayev, R. Tomar, P. Chugh, i P.M. Chaudhary. 2003. Use of lentiviral vectors for delivery of small interfering RNA. Cancer Biol Ther.2:206-10. Qin, X.F., D.S. An,
1
I.S. Chen, i D. Baltimore. 2003. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100:183-8. Scherr, M., K. Battmer, A. Ganser, i M. Eder. 2003a. Modulation of gene expression by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA. Cell Cycle.2:251-7. Shen, C., A.K. Buck, X. Liu, M. Winkler, i S.N. Reske.2003. Gene silencing by adenovirus-delivered siRNA. FEBS Lett.539:111-4.
[0192] Peptidna isporuka: Morris, M.C., L. Chaloin, F. Heitz, i G. Divita. 2000. Translocating peptides i and proteins and their use for gene delivery. Curr Opin Biotechnol.11:461-6. Simeoni, F., M.C. Morris, F. Heitz, i G. Divita. 2003. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31:2717-24. Other technologies that may be suitable for delivery of siRNA to the target cells are based on nanoparticles or nanocapsules such as those described in US patent numbers 6,649,192B i 5,843,509B.
Formulacije
[0193] U terapeutskim primenama, agensi sposobni da inhibiraju delovanje IL-11 ili agensa koji su sposobni da spreče ili smanjuju eksprimiranje IL-11 ili IL-11R, poželjno se formulišu kao lek ili farmaceutski sastav zajedno sa jednim ili više drugih farmaceutski prihvatljivih sastojaka dobro poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvante, ekscipijente, razblaživače, punila, pufere, konzervanse, antioksidante, lubrikante, stabilizatore, solubilizere, surfaktante (npr. agensi za vlaženje), agense za bojenje, agense za aromatizaciju i agense za zaslađivanje.
[0194] Izraz „farmaceutski prihvatljiv“ kad se ovde koristi odnosi se na jedinjenja, sastojke, materije, sastave, oblike doziranja itd., koji su u okviru razumne medicinske procene pogodni za upotrebu u dodiru sa tkivima predmetnog pacijenta (npr. čoveka) bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacije, srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika. Svaki nosač, adjuvant, ekscipijent itd. takođe mora biti „prihvatljiv“ u smislu da bude kompatibilan sa drugim sastojcima formulacije.
[0195] Pogodni nosači, adjuvansi, ekscipijenti itd. mogu se naći u standardnim farmaceutskim tekstovima, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; i Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994.
[0196] Formulacije mogu biti pripremljene bilo kojim postupcima koji su poznati u farmaciji. Takvi postupci uključuju korak uključivanja aktivnog jedinjenja sa nosačem koji čini jedan ili više pomoćnih sastojaka. Generalno, formulacije se pripremaju ravnomerno i intimno dovodeći u vezu aktivno jedinjenje sa nosačima (npr. tečnim nosačima, fino podeljenim čvrstim nosačima itd.), i zatim oblikovanjem proizvod, ako je potrebno.
[0197] Formulacije mogu biti pripremljene za topikalne, parenteralne, sistemske, intravenozne, intraarterijalne, intramuskularne, intratekalne, intraokularne, intraekonktivne, subkutane, oralne ili transdermalne načine primene koje mogu uključivati injekciju. Injektibilne formulacije mogu sadržati odabrani agens u sterilnom ili izotoničnom medijumu.
[0198] Upotreba je poželjno u „terapeutski efikasnoj količini“, što je dovoljno da pokaže koristi za pojedinca. Aktuelna količina koja se primenjuje, brzina i vremenski period primene zavisiće od prirode i težine bolesti koja se leči. Prepisivanje terapije, npr. odluke o doziranju itd., u nadležnosti su lekara opšte prakse i drugih lekara, i obično uzimaju u obzir poremećaj koji treba lečiti, stanje pacijenta, mesto isporuke, način primene i druge faktore poznate lekarima. Primeri navedenih tehnika i protokola mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.
Fibroza
[0199] Kad se ovde koristi, „fibroza“ se odnosi na formiranje viška fibroznog vezivnog tkiva kao rezultat viška taloženja komponenti ekstracelularnih matrica, na primer kolagena. Vlaknasto vezivno tkivo karakteriše ekstracelularna matrica (ECM) sa visokim sadržajem kolagena. Kolagen može biti pružen u pramenovima ili vlaknima, koji se mogu poređati nepravilno ili poravnato. ECM fibroznog vezivnog tkiva može takođe uključiti glikozaminoglikane.
[0200] Kad se ovde koristi, „višak vlaknastog vezivnog tkiva“ odnosi se na količinu vezivnog tkiva na datoj lokaciji (npr. dato tkivo ili organ, ili deo datog tkiva ili organa) koja je veća od količine vezivnog tkiva prisutnog na tom položaju u odsustvu fibroze, npr. u normalnim, ne-patološkim uslovima. Kad se ovde koristi, „višak taloženja komponenti ekstracelularnih matrica“ odnosi se na nivo taloženja jedne ili
2
više komponenti ekstracelularnih matrica koji su veći od nivoa taloženja u odsustvu fibroze, npr. u normalnim, nepatološkim uslovima.
[0201] Ćelijski i molekularni mehanizmi fibroze su opisani u Wynn, J. Pathol. (2008) 214(2): 199-210, i Wynn and Ramalingam, Nature Medicine (2012) 18:1028-1040.
[0202] Glavni ćelijski efektori fibroze su miofibroblasti, koji proizvode kolagen-bogatu ekstracelularnu matricu.
[0203] Kao odgovor na povrede tkiva, oštećene ćelije i leukociti proizvode pro-fibrotičke faktore kao što su TGFβ, IL-13 i PDGF, koji aktiviraju fibroblaste za αSMA-eksprimiranje miofibroblasta i regrutuju miofibroblaste do mesta povrede. Miofibroblasti proizvode veliki broj ekstracelularnih matrica i važni su posrednici u pomaganju kontrakturi i zatvaranju rane. Međutim, u uslovima trajne infekcije ili tokom hronične upale može doći do prekomerne aktivacije i regrutacije miofibroblasta, i samim tim i prekomerne proizvodnje ekstracelularnih matričnih komponenti, što rezultuje stvaranjem viška vlaknastog vezivnog tkiva.
[0204] U nekim otelotvorenjima fibroza se može pokrenuti patološkim stanjima, npr. stanjima, infekcijama ili bolesnim stanjima koja dovode do proizvodnje pro-fibrotičkih faktora kao što je TGFβ1. U nekim otelotvorenjima, fibroza može biti uzrokovana fizičkim povredama/stimulansima, hemijskim povredama/stimulansima ili povredama/stimulansima iz okruženja. Fizičke povrede/stimulansi mogu se pojaviti tokom operacije, npr. jatrogeni uzroci. Hemijske povrede/stimulansi mogu uključiti fibrozu indukovanu lekovima, npr. nakon hronične primene lekova kao što su bleomicin, ciklofosfamid, amiodaron, prokainamid, penicilamin, zlato i nitrofurantoin (Daba i dr., Saudi Med J 2004 Jun; 25(6): 700-6). Povrede/stimulansi iz okruženja mogu uključiti izlaganje azbestnim vlaknima ili silicijum dioksidu.
[0205] Fibroza se može javiti u mnogim tkivima tela. Na primer, fibroza se može javiti u jetri (npr. ciroza), plućima, bubregu, srcu, krvnim sudovima, očima, koži, pankreasu, crevima, mozgu i koštanoj srži. Fibroza se takođe može pojaviti u više organa istovremeno.
[0206] U otelotvorenjima ovde, fibroza može uključivati organ gastrointestinalnog sistema, npr. jetre, tankog creva, debelog creva ili pankreasa. U nekim otelotvorenjima, fibroza može uključivati organ respiratornog sistema, npr. pluća. U otelotvorenjima, fibroza može uključivati organ kardiovaskularnog sistema, npr. srca ili krvnih sudova. U nekim otelotvorenjima fibroza može uključiti kožu. U nekim otelotvorenjima, fibroza može uključivati organ nervnog sistema, npr. mozak. U nekim otelotvorenjima, fibroza može uključivati organ urinarnog sistema, npr. bubrege. U nekim otelotvorenjima, fibroza može uključivati organ mišićno-skeletnog sistema, npr. mišićno tkivo.
[0207] U nekim poželjnim otelotvorenjima, fibroza je srčana ili miokardna fibroza, hepatična fibroza ili bubrežna fibroza. U nekim otelotvorenjima srčana ili miokardna fibroza je povezana sa disfunkcijom muskulature ili električnih svojstava srca, ili debljanjem zidova ventila srca. U nekim otelotvorenjima fibroza je fibroza atrijuma i/ili ventrikula srca. Lečenje ili prevencija atrijalne ili ventrikularne fibroze može pomoći u smanjenju rizika ili pojave atrijalne fibrilacije, ventrikularne fibrilacije ili infarkta miokarda.
[0208] U nekim poželjnim otelotvorenjima hepatična fibroza je povezana sa hroničnom oboljenjem jetre ili cirozom jetre. U nekim poželjnim otelotvorenjima bubrežna fibroza je povezana sa hroničnom bolesti bubrega.
[0209] Bolesti/stanja koje karakteriše fibroza u skladu sa predmetnim obelodanjenjem uključuju, ali nisu ograničene na: respiratorna stanja kao što su plućna fibroza, cistična fibroza, idiopatska plućna fibroza, progresivna masivna fibroza, skleroderma, obliterativni bronhiolitis, Hermanski-Pudlakov sindrom, azbestoza, silikoza, hronična plućna hipertenzija, AIDS-povezana plućna hipertenzija, sarkoidoza, tumorska strom kod plućnih bolesti i astme; hronična bolest jetre, primarna bilijarna ciroza (PBC), šistosomalna bolest jetre, ciroza jetre; kardiovaskularna stanja kao što su hipertrofična kardiomiopatija, dilatirana kardiomiopatija (DCM), fibroza atrijuma, atrijalna fibrilacija, fibroza ventrikula, ventrikularna fibrilacija, fibroza miokarda, Brugada sindrom, miokarditis, endomikardijalna fibroza, infarkt miokarda, fibrotička vaskularna bolest, hipertenzivna srčana bolest, aritmogena desna ventrikularna kardiomiopatija (ARVC), tubulointerstijalna i glomerularna fibroza, ateroskleroza, varikozne vene, cerebralni infarkti; neurološka stanja kao što su glioza i Alchajmerova bolest; mišićna distrofija kao što je Dukenova mišićna distrofija (DMD) ili Bekerova mišićna distrofija (BMD); gastrointestinalna stanja kao što su Kronova bolest, mikroskopski kolitis i primarni sklerozni holangitis (PSC); stanja kože kao što su skleroderm, nefrogena sistemska fibroza i kutis keloid; artrofibroza; Dupuitrenova kontraktura; medijastinalna fibroza; retroperitonealna fibroza; mielofibroza; Peironie-ova bolest; adhezivni kapsulitis; bolest bubrega (npr. renalna fibroza, nefritički sindrom, Alportov sindrom, nefropatija povezana sa HIV-om, policistična bolest bubrega, Fabrijeva bolest, dijabetična nefropatija, hronični glomerulonefritis, nefritis povezan sa sistemskim lupusom); progresivna sistemska skleroza (PSS); hronična bolest grafta protiv domaćina; bolesti oka, kao što je Grejvova optalmopatija, epiretinalna fibroza, retinalna fibroza, subretinalna fibroza (npr. povezana sa makularnom degeneracijom (npr. vlažna makularna degeneracija povezana sa starosnom dobi (AMD)), dijabetička retinopatija, glaukom, fibroza rožnjače, post-hirurška (npr. fibroza zadnje kapsule posle operacije katarakte ili mehur nakon trabekulektomije za glaukom), konjunktivalna fibroza, subkonjunktivna fibroza, artritis, fibrotička pred-neoplastična i fibrotička neoplastična bolest, i fibroza izazvana hemijskim ili ekološkim povredama (npr. hemoterapijom raka, pesticidima, zračenjem/radioterapijom raka).
[0210] Razumeće se da su mnogi od gore navedenih bolesti/stanja međusobno povezani. Na primer, fibroza ventrikula može se desiti nakon infarkta miokarda i povezana je sa DCM, HCM i miokarditisom.
[0211] U određenim aspektima, bolest/poremećaj može biti jedna od plućne fibroze, atrijalne fibrilacije, ventrikularne fibrilacije, hipertrofične kardiomiopatije (HCM), dilatirane kardiomiopatije (DCM), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), ciroze, hronične bolesti bubrega, skleroderma, skleroze, keloida, cistične fibroze, Kronove bolesti, post-hirurške fibroza ili fibroze mrežnjače.
[0212] Lečenje, prevencija ili ublažavanje fibroze prema predmetnom obelodanjenju može biti od fibroze koja je povezana sa regulacijom na gore IL-11, npr. regulacija na gore IL-11 u ćelijama ili tkivu u kom se pojavljuje ili može doći do fibroze ili regulacija na gore ekstracelularnog IL-11 ili IL-11R.
[0213] Lečenje ili ublažavanje fibroze može biti efikasno za sprečavanje progresije fibroze, npr. kako bi se sprečilo pogoršanje stanja ili usporila brzina razvoja fibroze. U nekim otelotvorenjima tretman ili ublažavanje mogu dovesti do poboljšanja fibroze, npr. smanjenje količine deponovanih kolagenskih vlakana.
[0214] Sprečavanje fibroze može se odnositi na sprečavanje pogoršanja stanja ili prevenciju razvoja fibroze, npr. sprečavajući da se fibroza rane faze razvija na kasniju, hroničnu, fazu.
Pacijent
[0215] Pacijent kom je potreban tretman može biti bilo koja životinja ili čovek. Pacijent je poželjno sisar, poželjnije čovek. Pacijent može biti ne-ljudski sisar, ali je poželjnije čovek. Pacijent može biti muško ili žensko. Pacijent može biti bolesnik.
Uzorak
[0216] Uzorak dobijen od pacijenta može biti bilo koje vrste. Biološki uzorak može biti uzet iz bilo kog tkiva ili telesne tečnosti, npr. uzorak krvi, uzorak izveden iz krvi, uzorak seruma, uzorak limfe, uzorak sperme, uzorak pljuvačke, uzorak sinovijalne tečnosti. Uzorak izveden iz krvi može biti izabrani fragment krvi pacijenta, npr. odabran fragment koja sadrži ćelije ili fragment plazme ili seruma. Uzorak može sadržati uzorak tkiva ili biopsiju; ili ćelije izolovane od pacijenta. Uzorci se mogu sakupljati poznatim tehnikama, kao što je biopsija ili aspirat za iglu. Uzorci se mogu čuvati i/ili obraditi za naknadno određivanje nivoa eksprimiranja IL-11.
[0217] Uzorci se mogu koristiti za određivanje regulacije na gore IL-11 ili IL-11R kod pacijenta od kojeg je uzet uzorak.
[0218] U nekim poželjnim otelotvorenjima uzorak može biti uzorak tkiva, npr. biopsija, uzeta iz srca, jetre ili bubrežnog tkiva. U nekim otelotvorenjima uzorak može biti uzorak tkiva, npr. biopsija, uzeta iz oka.
[0219] Uzorak može sadržati ćelije i može poželjno sadržati fibroblaste i/ili miofibroblaste. U nekim otelotvorenjima, fibroblasti ili miofibroblasti mogu se dobiti od srca, jetre ili bubrežnog tkiva, npr. mogu biti kardijalni fibroblaste ili srčani miofibroblasti (npr. pogledati Colby i dr., Circulation Research 2009;105:1164-1176), hepatički fibroblasti ili hepatički miofibroblasti (npr. pogledati Zeisberg i dr., The Journal of Biological Chemistry, August 10, 2007, 282, 23337-23347; Brenner., Fibrogenesis & Tissue Repair 2012, 5(Suppl 1):S17) ili bubrežni fibroblasti ili bubrežnih miofibroblasti (npr. pogledati Strutz and Zeisberg. JASN November 2006 vol. 17 no. 11 2992-2998). U nekim otelotvorenjima, fibroblasti ili miofibroblasti se mogu dobiti od tkiva očiju, npr. mogu biti kornealni fibroblasti.
Regulacija na gore eksprimiranja IL-11 ili IL-11R
[0220] Neki aspekti i otelotvorenja predmetnog obelodanjenja se odnose na detektovanje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R, npr. u uzorku dobijenom od pacijenta.
[0221] U nekim aspektima i otelotvorenjima, predmetno obelodanjenje se odnosi na regulaciju na gore eksprimiranja (prekomernog eksprimiranja) IL-11 ili IL-11R (kao proteina ili oligonukleotida koji kodira odgovarajuće IL-11 ili IL-11R) i detektovanje takve regulacije na gore kao indikatora pogodnosti za tretman sa agensom koji može inhibirati dejstvo IL-11 ili sa agensom sposobnim da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 ili IL-11R.
[0222] Regulacije na gore eksprimiranja IL-11 ili IL-11R sadrži eksprimiranje IL-11 ili IL-11R na nivou koji je veći nego što se normalno očekuje za ćeliju ili tkivo određenog tipa. Regulacija na gore se može odrediti određivanjem nivoa eksprimiranja IL-11 ili IL-11R u ćeliji ili tkivu. Poređenje može biti između nivoa eksprimiranja IL-11 ili IL-11R u uzorku ćelije ili tkiva od pacijenta, i referentnog nivoa IL-11 ili IL-11R, npr. vrednosti ili opsega vrednosti koji predstavljaju normalan nivo eksprimiranja IL-11 ili IL-11R za isti ili odgovarajući tip ćelije ili tkiva. U nekim otelotvorenjima referentni nivoi mogu se odrediti detektovanjem eksprimiranja IL-11 ili IL-11R u kontrolnom uzorku, npr. u odgovarajućim ćelijama ili tkivu od zdravog pacijenta, ili iz zdravog tkiva istog pacijenta. U nekim otelotvorenjima referentni nivoi mogu se dobiti od standardne krive ili skupa podataka.
[0223] Nivoi eksprimiranja mogu biti kvantifikovani za apsolutno poređenje, ili se mogu izvršiti relativna poređenja.
[0224] U nekim otelotvorenjima može se smatrati da je regulacija na gore IL-11 ili IL-11R prisutna kada je nivo eksprimiranja u test uzorku najmanje 1,1 puta veći od referentnog nivoa. Još poželjnije, nivo eksprimiranja može biti izabran od najmanje 1,2, najmanje 1,3, najmanje 1,4, najmanje 1,5, najmanje 1,6, najmanje 1,7, najmanje 1,8, najmanje 1,9, najmanje 2,0, na najmanje 2,1, najmanje 2,2, najmanje 2,3, najmanje 2,4 najmanje 2,5, najmanje 2,6, najmanje 2,7, najmanje 2,8, najmanje 2,9, najmanje 3,0, najmanje 3,5, najmanje 4,0, najmanje 5,0, najmanje 6,0, najmanje 7,0, najmanje 8,0, najmanje 9,0, ili najmanje 10,0 puta većeg od referentnog nivoa.
[0225] IL-11 ili IL-11R nivoi eksprimiranja mogu se odrediti jednim od već poznatih in vitro tehnika testiranja, kao što su analize na bazi PCR-a, in-situ hibridizacioni testovi, analize protočne citometrije, imunološki ili imunohistokemijski testovi.
[0226] Kao primer, odgovarajuće tehnike uključuju postupak detektovanja nivoa IL-11 ili IL-11R u uzorku dovođenjem u dodir uzorka sa agensom koji može vezati IL-11 ili IL-11R i detektovati formiranje agens i IL-11 ili IL-11R kompleksa. Agens može biti bilo koji odgovarajući vezujući molekul, npr. antitelo, polipeptid, peptid, oligonukleotid, aptamer ili mali molekul i mogu se opciono označiti kako bi se omogućilo detektovanje, npr. vizuelizacijom formiranih kompleksa. Pogodne oznake i načini za njihovo detektovanje dobro su poznate stručnjacima, i uključuju fluorescentne oznake (npr. fluorescein, rodamin, eozin i NDB, zeleni fluorescentni protein (GFP), helate retkih zemnih metala kao što su europijum (Eu), terbijum (Tb ) i samarijum (Sm), tetrametil rodamin, Teksas crvena, 4-metil umbeliferon, 7-amino-4-metilkumarin, Cy3, Cy5), izotopski markeri, 32P, 33P, 35S), oznake hemiluminiscencije (na primer, akridinium estar, luminol, izoluminol), enzimi (npr. peroksidaza, alkalna fosfataza, glukoza oksidaza, betagalaktozidaza, luciferaza), antitela, ligandi i receptori. Tehnike detektovanja su dobro poznate stručnjacima i mogu se odabrati kako bi odgovarale agensu za označavanje. Pogodne tehnike uključuju PCR amplifikaciju oznaka oligonukleotida, masenu spektrometrija, detektovanje fluorescencije ili boje, npr. nakon enzimske konverzije supstrata reporterskim proteinima ili detektovanjem radioaktivnosti.
[0227] Analize mogu biti konfigurisane da kvantifikuju količinu IL-11 ili IL-11R u uzorku. Kvantifikovane količine IL-11 ili IL-11R iz test uzorka mogu se upoređivati sa referentnim vrednostima, i upoređivanje se koristi kako bi se odredilo da li test uzorak sadrži količinu IL-11 ili IL-11R koja je viša ili niža od one referentne vrednost za izabrani stepen statističke značajnosti.
[0228] Kvantifikacija otkrivenog IL-11 ili IL-11R može se koristiti za određivanje regulacije na gore ili dole gena koji kodiraju IL-11 ili IL-11R. U slučajevima kada test uzorak sadrži fibrotičke ćelije, takva regulacija, smanjenje regulacije ili pojačanje se može uporediti sa referentnom vrednošću, kako bi se utvrdilo da li postoji bilo kakva statistički značajna razlika.
Izbor pacijenta
2
[0229] Pacijent može biti odabran za tretman na osnovu utvrđivanja da pacijent ima regulisan na gore nivo eksprimiranja IL-11 ili IL-11R. IL-11 ili IL-11R mogu stoga delovati kao marker fibroze koji je pogodan za tretman sa agensom koje može da inhibira dejstvo IL-11 ili sa agensom koji može da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 ili IL -11R.
[0230] Regulacija na gore može biti u datom tkivu ili u odabranim ćelijama iz datog tkiva. Poželjno tkivo može biti iz srca, jetre ili bubrega. Poželjno tkivo može biti iz oko. Poželjni tip ćelije može biti fibroblast ili miofibroblast. Regulacija na gore se takođe može odrediti u tečnosti iz cirkulacije, npr. krvi ili uzorku izvedenom iz krvi. Regulacija na gore može biti regulacija ekstracelularnog IL-11 ili IL-11R.
[0231] Određivanje nivoa IL-11 ili IL-11R može biti izvedeno analizom, poželjno in vitro, na uzorku dobijenom od pacijenta, kako je ovde opisano.
[0232] Posle selekcije, pacijentu se može pružiti tretman za fibrozu primenom agensa koji može inhibirati dejstvo IL-11 ili agensa sposobnog za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R.
[0233] U nekim otelotvorenjima, pacijentu je možda dijagnostikovana fibroza, sumnja se da ima fibrozu ili se smatra rizičnim za razvoj fibroze i od značaja je da li će pacijent imati koristi od tretmana sa agensom koje može da spreči delovanje IL-11, ili sa agensom sposobnim za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R. U takvim otelotvorenjima, pogodnost pacijenta za takav tretman može se utvrditi utvrđivanjem da li je eksprimiranje IL-11 ili IL-11R regulisano na gore kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima eksprimiranje IL-11 ili IL-11R je lokalno ili sistemski regulisano na gore kod pacijenta.
Dijagnoza i prognoza
[0234] Detektovanje regulacije na gore eksprimiranja IL-11 ili IL-11R takođe se može koristiti u postupku dijagnostike fibroze ili rizika od razvoja fibroze kod pacijenta, kao i u postupcima prognoziranja ili predviđanja odgovora pacijenta na tretman sa agensom koji može inhibira delovanje IL-11 ili agensa sposobnog za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R.
[0235] U nekim otelotvorenjima može se sumnjati da je pacijent imao fibrozu, npr. na osnovu prisustva drugih simptoma koji ukazuju na fibrozu u telu pacijenta ili u odabranim ćelijama/tkivima tela pacijenta ili se smatra rizičnim za razvoj fibroze, npr. zbog genetske predispozicije ili izloženosti uslovima životne sredine, kao što su azbestna vlakna.
[0236] Određivanje regulacije na gore IL-11 ili IL-11R može potvrditi dijagnozu ili pretpostavku dijagnoze fibroze ili može potvrditi da je pacijent pod rizikom od razvoja fibroze. Određivanje takođe može dijagnostikivati stanje ili predispoziciju kao pogodne za lečenje agensom koje može inhibirati dejstvo IL-11 ili agensom sposobnim za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R.
[0237] Kao takav, može se obezbediti postupak pružanja prognoze za pacijenta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, gde postupak obuhvata utvrđivanje da li je IL-11 ili IL-11R regulisan na gore u uzorku dobijenom od pacijenta, i na osnovu određivanja, pruža prognozu za lečenje pacijenta sa agensom koji može inhibirati dejstvo IL-11 ili agensom sposobnim da spreči ili smanji eksprimiranje IL-11 ili IL-11R.
[0238] U nekim aspektima, postupke dijagnoze ili postupke prognoziranja ili predviđanja odgovora pacijenta na tretman sa agensom koji može inhibirati dejstvo IL-11 ili agensom sposobnim za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R možda ne zahteva određivanje nivoa IL-11 ili IL-11R, ali može biti zasnovano na određivanju genetskih faktora kod pacijenta koji predviđaju regulaciju na gore eksprimiranja IL-11 ili IL-11R ili regulaciju na gore aktivnosti IL-11 ili IL-11R. Takvi genetski faktori mogu uključivati određivanje genetskih mutacija, pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (SNP) ili amplifikacije gena u IL-11 i/ili IL-11R koja je u korelaciji sa i/ili prediktivna regulacije na gore eksprimiranja IL-11 ili IL-11R ili aktivnost ili signalizirajuće aktivnosti posredovane sa IL-11. Upotreba genetskih faktora za predviđanje predispozicije za bolesno stanje ili odgovor na tretman je poznata u struci, npr. pogledati Peter Stärkel Gut 2008;57:440-442; Wright i dr., Mol. Cell. Biol. March 2010 vol. 30 no. 6 1411-1420.
[0239] Genetski faktori mogu se analizirati postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, uključujući analize na bazi PCR-a, npr. kvantitativni PCR, kompetetivan PCR. Određivanje prisustva genetskih faktora, npr. u uzorku dobijenom od pacijenta, može se potvrditi dijagnoza fibroze i/ili pacijent može biti klasifikovan pod rizikom od razvoja fibroze i/ili pacijent može biti identifikovan kao pogodan za tretman sa agensom koje može da inhibira dejstvo IL-11 ili agensom sposobnim za sprečavanje ili smanjenje eksprimiranja IL-11 ili IL-11R.
[0240] Neki postupci mogu obuhvatati određivanje prisustva jednog ili više SNP povezanih sa lučenjem IL-11 ili podložnosti razvoju fibroze. SNP su obično bi-alelični i stoga se mogu lako odrediti koristeći jedan od brojnih konvencionalnih testova poznatih stručnjacima (npr. Anthony J. Brookes. The essence of SNPs. Gene Volume 234, Issue 2, 8 July 1999, 177-186; Fan i dr., Highly Parallel SNP Genotyping. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2003. 68: 69-78; Matsuzaki i dr., Paralelna genotipizacija preko 10,000 SNP korišćenjem jednog primera na nizu oligonukleotidnih nizova sa visokom gustinom. Genome Res.
2004.14: 414-425).
[0241] Postupci mogu obuhvatati određivanje koji je alel SNP prisutan u uzorku dobijenom od pacijenta. U nekim otelotvorenjima određivanje prisustva malih alela može biti povezano sa povećanim lučenjem IL-11 ili podložnošću za razvoj fibroze.
[0242] Shodno tome, predmetno obelodanjenje pruža postupak za skrining pacijenta, gde postupak sadrži:
dobijanje uzorka nukleinske kiseline od pacijenta;
određivanje koji je alel prisutan u uzorku na položaju polimorfnog nukleotida jednog ili više SNP navedenih na Slici 33 i/ili Slici 34 i/ili Slici 35 ili SNP u neuravnoteženoj veze sa jednim od navedenih SNP-a sa r<2>≥ 0,8.
[0243] Postupak određivanja može sadržati utvrđivanje da li je mali alel prisutan u uzorku na odabranom polimorfnom položaju nukleotida. Može sadržati utvrđivanje da li su prisutni 0, 1 ili 2 minorni alel.
[0244] Postupak skrininga može biti ili biti deo postupka za određivanje osetljivosti pacijenta na razvoj fibroze ili postupak dijagnoze ili prognoze kako je ovde opisano.
[0245] Ovaj postupak može dalje obuhvatiti korak identifikacije pacijenta koji ima podložnost ili povećan rizik od razvoja fibroze, npr. ako je pacijent određen da ima mali alel na polimorfnom nukleotidnom položaju. Ova postupak može dalje obuhvatati korak izbora pacijenta za tretman sa agensom koji može inhibirati dejstvo Interleukina 11 (IL-11) i/ili davanje agensa koji može inhibirati dejstvo Interleukina 11 (IL-11) pacijentu kako bi se pružilo lečenje fibroze kod pacijenta, ili za sprečavanje razvoja ili progresije fibroze kod pacijenta.
[0246] SNP koji se mogu odrediti uključuju jedan ili više SNP-a navedenih na Slici 33, Slici 34 ili Slici 35. U nekim otelotvorenjima postupak može obuhvatati određivanje jednog ili više SNP-a navedenih na Slici 33. U nekim otelotvorenjima postupak može obuhvatiti određivanje jednog ili više SNP-a navedenih na Slici 34. U nekim otelotvorenjima postupak može obuhvatati određivanje jedne ili više SNP-a navedenih na Slici 35. SNP mogu biti izabrani za određivanje je imaju nisku vrednost P ili FDR (lažna stopa otkrivanja).
[0247] U nekim otelotvorenjima SNP su odabrani kao dobri prediktori odgovora na tretman protiv IL-11 na osnovu regulacije VSTstim u trans (Slike 33). U nekim otelotvorenjima postupak može obuhvatati određivanje koji je alel prisutan za jedan ili više od sledećih SNP-a: rs10831850, rs4756936, rs6485827, rs7120273 i rs895468. U nekim otelotvorenjima SNP su odabrani kao dobri prediktori odgovora na tretman protiv IL-11 na osnovu na VSTstim-VSTunstim regulacije u cis (Slika 34).
[0248] U nekim otelotvorenjima SNP su odabrani kao dobri prediktori odgovora na tretman protiv IL-11 na osnovu na VSTstim-VSTunstim regulacije u trans (Slika 35). U nekim otelotvorenjima postupak može obuhvatati određivanje koji je alel prisutan za jedan ili više od sledećih SNP-a: rs7120273, rs10831850, rs4756936, rs6485827 (Slika 35).
[0249] SNP: rs7120273, rs10831850, rs4756936, rs6485827 su u visokoj neravnotežni vezivanja (LD) jedni sa drugim na hromozomu 11 (u takozvanom LD bloku), i stoga su vrlo često ko-nasleđeni.
[0250] Kvadrat korelacije frekvencija gena (r<2>) odražava stepen neravnoteže vezivanja (LD) između dva SNP-a. Kao rezultat LD između SNP-a u lokalnim i, dakle, ko-nasleđenim regionima genoma, genotip datog SNP-a može se zaključiti određivanjem genotipa SNP-a označavanja/proksi SNP-a. Prag LD koji se koristi u struci za identifikaciju uparenih SNP-a označavanja/proksi SNP-a je a r<2>vrednost 0,8 (Wang i dr.
2005, Nat. Rev. Genet.6(2): 109-18; Barrett i dr.2006, Nat Genet., 38 (6): 659-662). Prema tome, genotip datog SNP-a može se zaključiti određivanjem genotipa SNP-a označavanja/proksi SNP-a u neravnoteži vezivanja sa r<2>vrednosti ≥ 0,8.
2
[0251] Nukleotidna sekvenca SNP-a je indikovana pomoću broja „rs“. Potpuna sekvenca je dostupna od strane baze podataka pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (dbSNP) od National Center for biotechnology Information (NCBI) dostupne na: https://vvv.ncbi.nlm.nih.gov/snp.
[0252] Postupci dijagnoze ili prognoze mogu se izvesti in vitro na uzorku dobijenom od pacijenta, ili nakon obrade uzorka dobijenog od pacijenta. Kada se uzorak prikupi, pacijent nije obavezan da bude prisutan in vitro kako bi se izveo postupak dijagnoze ili prognoze, i stoga je postupak može biti onaj koji se ne izvodi na ljudskom ili životinjskom telu.
[0253] Ostali dijagnostički ili prognostički testovi mogu se koristiti zajedno sa onima opisanim ovde kako bi se poboljšala tačnost dijagnoze ili prognoze ili potvrdio rezultat dobijen upotrebom testova koji su ovde opisani.
[0254] Postupci prema predmetnom obelodanjenju mogu se izvesti, ili proizvodi mogu biti prisutni, in vitro, ex vivo, ili in vivo. Izraz „in vitro“ ima za cilj da obuhvati eksperimente sa materijalima, biološkim supstancama, ćelijama i/ili tkivima u laboratorijskim uslovima ili u kulturi, dok termin „in vivo“ ima za cilj da obuhvati eksperimente i procedure sa netaknutim višećelijskim organizmima. „Ex vivo“ se odnosi na nešto prisutno ili što se odvija izvan organizma, npr. izvan ljudskog ili životinjskog tela, koji može biti na tkivu (npr. celim organima) ili ćelijama uzetim iz organizma.
[0255] Predmetno obelodanjenje uključuje kombinaciju aspekata i opisanih karakteristika, osim u slučaju kada je takva kombinacija očigledno nedopustiva ili izričito izbegnuta.
[0256] Naslovi poglavlja koji se ovde koriste su samo u organizacione svrhe i ne smeju se tumačiti kao ograničavajući za opisane teme.
[0257] Aspekti i otelotvorenja predmetnog obelodanjenja sada će biti ilustrovani, na primer, u odnosu na prateće podatke. Dalji aspekti i otelotvorenja biće očigledni stručnjacima.
[0258] Kroz ovu specifikaciju, uključujući zahteve koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sastoji se“ i varijacije kao što su „obuhvata“ i „sadrži“ će podrazumevati uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog celog ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka.
[0259] Treba napomenuti da, kad se koriste u specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju i oblike množine, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. Rasponi mogu biti ovde eksprimirani kao „od“ jedne određene vrednosti, i/ili do „druge“ određene vrednosti. Kada je takav raspon eksprimiran, drugo otelotvorenje uključuje od jedne posebne vrednosti i/ili do druge posebne vrednosti. Slično tome, kada se vrednosti izraze kao aproksimacije, upotrebom prethodnika „oko“, biće shvaćeno da određena vrednost formira još jedno otelotvorenje.
Kratak opis slika
[0260] Otelotvorenja i eksperimenti koji ilustruju principe pronalaska sada će biti razmatrani u vezi sa pratećim slikama, gde:
Slika 1. TGFβ1 stimulacija reguliše na gore IL-11 u fibroblastima. Primarni fibroblaste izvedeni su iz ljudskog atrijalnog tkiva 80 osoba i inkubirane su 24 sata sa i bez TGFβ1 (5ng/ml). (a) Grafik pokazuje da je IL-11 najviše regulisan na gore gen u stimulisanim fibroblastima TGFβ1 u poređenju sa 11,433 eksprimiranih gena (FPKM ≥ 0,5). (b) Grafik pokazuje da je eksprimiranje IL-11 značajno povećano više od 8 puta u projeku nakon aktivacije fibroblasta sa TGFβ1 (FDR = 9,1x10<-125>). (c) Grafik pokazuje da je RT-qPCR potvrđene promene na osnovu eksprimiranja IL-11 RNK (TGFB1 /TGFB1-; R2= 0,94) i (d) Grafik pokazuje ELISA je otkrio značajno povećanje proteina IL-11 koji je lučio stimulisanim fibroblastima.
Slika 2. Ljudski atrijalni fibroblasti su inkubirani bilo sa 5 ng/ml TGFβ1 ili 5 ng/ml IL-11 tokom 24 časa. Grafici pokazuju bojenje ćelija za (a) α-SMA (miofibroblasti), (b) EdU (proliferacija), (c) kolagen i (d) periostin za identifikaciju miofibroblasta i visoko proliferativnih ćelija i kvantifikaciju proizvodnje ekstracelularnih matričnih proteina. Utvrđeno je da IL-11 povećava odnos miofibroblasta i indukuje proizvodnju kolagena i periostina sličnom brzinom kao što je signalizacija TGFβ1. Ovaj eksperiment je više puta ponavljen sa sličnim rezultatima.
Slika 3. Inhibicija IL-11 sa neutralizacijom antitela sprečava TGFβ1-indukovanu fibrozu. Ljudski atrijalni fibroblasti su stimulisani sa TGFβ1 (5ng/ml), TGFβ1 i antitelom protiv IL-11 ili TGFβ1 i
2
kontrolom izotipova. Grafici i fotografije pokazuju obojene ćelije nakon 24 sata za (a) α-SMA, (b) EdU, (c) kolagen i (d) periostin za identifikaciju miofibroblasta i visoko proliferativnih ćelija i kvantifikaciju proizvodnje ekstracelularnih matričnih proteina. Fluorescencija je kvantifikovana na platformi Operetta do 21 polja po stanju. Ovaj eksperiment se sa sličnim rezultatima ponavlja sa fibroblastima izvedenim od različitih osoba. U prisustvu antitela koje blokira IL-11, TGFβ1-stimulisani fibroblasti imaju smanjen odnos miofibroblasta, manje su proliferativni i eksprimiraju manje kolagena i periostina u poređenju sa kontrolnim ćelijama. Ovo pokazuje da je IL-11 esencijalna komponenta signalizacionog puta TGFβ1 koja deluje u autokrinima i/ili parakrinima, i njegova inhibicija smanjuje pro-fibrotičke efekte ovog ključnog regulatora fibroze kod ljudi.
Slika 4. TGFβ1 stimulacija reguliše na gore IL-11 u fibroblastima. Primarni fibroblasti izvedene su iz ljudskog atrijalnog tkiva 80 osoba i inkubirani su 24 sata sa i bez TGFβ1 (5ng/ml). (a) Grafik pokazuje da je IL-11 bio najviše regulisan na gore transkript RNK u TGFβ1 stimulisanim fibroblastima u poređenju sa 11,433 eksprimiranih gena (FPKM ≥ 0,5) preko genoma, kao što je procenjeno globalnim profiliranjem transkriptoma. (b) Grafik pokazuje da IL-11 eksprimiranje u ne stimulisanim (TGF-β-) i stimulisanim (TGF-β ) primarnim ljudskim fibroblastima u poređenju sa svim ljudskim tkivima, kao što je procenjeno GTEX projektom (Consortium, Gte. Human genomics. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) pilot analysis: multitissue gene regulation in humans. Science (New York, N.Y.) 348, (2015)) detektuje visoku specifičnost povišenih nivoa IL-11 na fibroblastima i posebno aktiviranim fibroblastima, čiji potpis nije shvaćen na nivou celog organa koji sadrži više tipova ćelija, i malo, IL11-eksprimirajućih, fibroblasta.
Slika 5. IL-11 deluje kao autokrini faktor na fibroblastima i indukuje sopstveno eksprmiranje samo putem regulacije translacije. Primarni fibroblasti su stimulisani sa TGF-β tokom 24 sata. (a) Grafik pokazuje da se eksprimiranje IL-11 RNK značajno povećalo (FDR = 9,1x10<-125>) više od 8 puta u proseku kod preko 80 osoba. (b) Grafik pokazuje rezultate ELISA testa koji potvrđuju značajno povećanje proteina IL-11 koji se luče stimulisanim fibroblastima (t-test). (c) Grafik pokazuje da inkubacija primarnih fibroblasta sa IL-11 ne povećava nivo IL-11 RNK (RT-qPCR). (d) Grafik pokazuje da inkubacija primarnih fibroblasta sa IL-11 značajno izaziva lučenje IL-11 proteina (Dunnett), kako je otkrio ELISA. Prilagođene P-vrednosti su date kao **** P <0,0001.
Slika 6. IL-11 pogoni proliferaciju i aktivaciju fibroblasta, kao i proizvodnju ekstracelularnih matrica i neophodan je za TGFβ1-posredovan fibrozni odgovor. Srčani fibroblasti izvedeni iz 3 osobe inkubirani su tokom 24 časa sa TGFβ1 (5 ng/ml), IL-11 (5 ng/ml) ili TGFβ1 i neutralizujućim IL-11/kontrolnim antitelom. Grafici i fotografije pokazuju rezultate bojenja ćelija nakon inkubacije za (a) α-SMA sadržaj za procenu fragmenta miofibroblasta, (b) EdU za aktivno praćenje proliferacije ćelija (c) Periostin za procenu proizvodnje ECM-a. Fluorescencija je merena operativnom platformom za 14 polja u 2 komorice za svakog pacijenta. Grafici takođe pokazuju lučenje markera fibroze IL-6 (d), TIMP1 (e) i MMP2 (f), kao što je procenjeno preko ELISA. Fluorescencija je normalizovana za kontrolnu grupu bez stimulacije i ispisana je srednja vrednost sa standardnom devijacijom. IL-11 indukuje fibrotički odgovor na sličnim nivoima kao što je TGFβ1, i inhibicija IL-11 spasava TGFβ1 fenotip na nivou proteina. Prilagođene P-vrednosti su date kao * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ili **** P <0,0001 eksperimentalnih grupa u poređenju sa nestimulisanim ćelijama (Dunnett). Viškovi su uklonjeni (ROUT, Q = 2%).
Slika 7. IL-11 promoviše sintezu proteina kolagena i baca pro-fibrotički efekat TGFβ1 na nivo RNK. srčane fibroblaste izvedene iz 3 osobe inkubirane su tokom 24 časa sa TGFβ1 (5 ng/ml), IL-11 (5 ng/ml) ili TGFβ1 i neutralizujućim IL-11 antitelom. Nakon inkubacije (a) Grafik pokazuje rezultate nakon inkubacije bojenja ćelija za kolagenom koristeći Operetta test; florescencija je kvantifikovana kao što je prethodno opisano za Sliku 6, (b) Grafik pokazuje koncentrisane kolagene procenjene sa Sirius Red bojenjem i (c) Grafik pokazuje nivo kolagena RNK izmeren RT-qPCR. IL-11 indukuje fibrotički odgovor na sličnim nivoima kao TGFβ1 samo na nivou proteina. Veće eksprimiranje transkripta kolagena RNK od strane TGFβ1 nije dovelo do povećane proizvodnje proteina ako je IL-11 neutralizovan antitelom. Prilagođene vrednosti P su date kao * P <0,05, *** P <0,001 ili **** P <0,0001 eksperimentalnih grupa u poređenju sa nestimulisanom kontrolnom grupom ćelija (Dunnett).
Slika 8. IL-11 je marker i aktivator fibroze u više tkiva. Eksprimiranje IL-11 može biti indukovano raznovrsnim skupom pro-fibrotičkih stimulansa osim TGFβ1. (a) Grafik pokazuje efekat TGFβ1 na IL-11 eksprimiranje. (b) Grafik pokazuje da ET-1 (Endotelin) reguliše IL-11 u hepatičkim i
2
pulmonarnim fibroblastima; (c) Grafik pokazuje PDGF (faktor rasta izveden iz trombocita) indukuje IL-11 eksprimiranje kod renalnih fibroblasta. Nivoi IL-11 RNK su mereni pomoću RT-qPCR; prilagođene P-vrednosti su date kao * P <0,05, ** P <0,01 ili **** P <0,0001 (Dunnett). kako bi se istražio sistemski efekat IL-11, samo fiziološki rastvor (sivi) ili rekombinantni IL-11 (crni) ubrizgani su 6 puta nedeljno kod C57BL/6 miševa (200μg/kg). Sadržaj kolagena u tkivu je procenjen sa analizom hidroksiprolina (QuickZyme) na nivou proteina i rezultati su prikazani na grafiku (d). Tkiva životinja tretiranih sa rIL-11 imaju veći sadržaj kolagena od kontrole (ANOVA, p = 0,012). (e) Fotografije western blota koje pokazuju αSMA nivoe povećavaju se u bubrezima i srcu IL-11 tretiranih miševa, što ukazuje na prisustvo miofibroblasta.
Slika 9. Dijagram koji ilustruje ulogu IL-11 kao suštinskog regulatora fibrotičkog odgovora. IL-11 je suštinski regulator potreban za fibrotički odgovor. Kao odgovor na oštećenje tkiva ili hroničnu upalu, citokini kao što su TGFβ1, ET-1 ili PDGF su oslobođeni da regulišu na gore transkripciju gena markera fibroze. Autokrini agens IL-11 se zatim proizvodi u odgovoru na ove uzvodne stimuluse kako bi se obezbedila efikasna translacija transkripta regulisanih na gore u funkcionalno relevantne proteine na specifičan način u ćeliji. Inhibicija IL-11 blokira sintezu ključnih ekstracelularnih matriksa i proteina miofibroblasta i sprečava pro-fibrotičko delovanje raznovrsnog skupa uzvodnih stimulusa.
Slika 10. Inhibicija IL-11 zaustavlja sintezu proteina kolagena u odgovor na pro-fibrotičke citokine ANG2 (Angiotenzin II), PDGF i ET-1. Srčani fibroblasti su inkubirane tokom 24 časa sa ANG2, PDGF ili ET-1 i neutralizujućim IL-11 antitelom. Prateće ćelije inkubacije su obojene kolagenom, i florescencija je kvantifikovana. Ovi stimulusi indukuju fibrozni odgovor na sličnom nivou sa TGFβ1. Međutim, eksprimiranje kolagena se ne povećava ako se IL-11 neutrališe sa antitelom. P-vrednosti su date kao: **** P <0,0001 (t-test).
Slika 11. Nukleotidna sekvenca ljudskog IL-11, uzeta iz Genbank pristupnog broja gi|391353405|ref|NM_000641.3 (Homo sapiens interleukin 11 (IL11), transkript varijanta 1, Mrna) [SEQ ID NO: 1]. Podvučena sekvenca kodira IL-11 mRNK. Osenčene sekvence su korišćene za dizajniranje IL-11 knockdown siRNK i prikazane su zasebno kao SEQ ID NO 2 do 5. SEQ ID NO 3 i 4 se međusobno preklapaju u okviru SEQ ID NO: 1.
Slika 12. Nukleotidna sekvenca ljudske IL-11Rα, uzeta iz Genbank pristupnog broja (mRNK ljudski interleukin-11 receptor alfa lanca, kompletni cds) [SEQ ID NO: 6]. Podvučena sekvenca kodira IL-11Rα mRNK. Osenčene sekvence su korišćene za dizajniranje IL-11Ra sekvence siRNK i prikazane su zasebno kao SEQ ID NO 7-10.
Slika 13. Tabela koja prikazuje siRNK sekvence [SEQ ID NO 11 do 14] za knockdown ua IL-11.
Slika 14. Tabela koja prikazuje siRNK sekvence [SEQ ID NO 15 do 18] za knockdown za IL-11Rα.
Slika 15. Grafik pokazuje siRNK knockdown IL-11Rα u HEK ćelijama.
Slika 16. Grafik pokazuje dubinu čitanja za celokupno transkriptno sekvenciranje ljudskih atrijalnih fibroblasta od 160 osoba sa i bez stimulacije sa TGFβ1.
Slika 17. Grafici koji pokazuju eksprimiranje endotelnih, kardiomiocitnih i fibroblastnih marker gena utvrđenih RNK-sekvencioniranjem porekla tkiva (uzorci ljudskih atrijalnih tkiva, n = 8) i primarne, nestimulisane fibroblastne kulture. (A) PECAM1, (B) MIH6 (C) TNNT2, (D) COL1A2, i (E) ACTA2.
Slika 18. Grafici koji pokazuju regulaciju na gore IL-11 eksprimiranja u fibroblastima kao odgovor na stimulaciju sa TGFβ1. (A i B) Grafici koji pokazuju stepen promene u eksprimiranju gena u fibrozi; IL-11 je najviše regulisan na gore gen u odgovoru na tretman TGFβ1. (C) IL-11 lučenje fibroblasta kao odgovor na stimulaciju sa TGFβ1. (D) Upoređivanje eksprimiranja gena IL-11 u tkivu zdravih pojedinaca i atrijalnih fibroblasta, sa ili bez TGFβ1 stimulacije. (E) Korespodencija stepena promene u IL-11 eksprimiranju kao što je određeno RNK-sekvencioniranjem u poređenju sa qPCR.
Slika 19. Grafici koji pokazuju indukciju lučenja IL-11 u primarnim fibroblastima od strane različitih profibrotičkih citokina, kao što je utvrđeno pomoću ELISA. (A) TGFβ1, ET-1, Angll, PDGF, OSM i IL-13 indukuju IL-11 lučenje, i IL-11 takođe indukuje IL-11 eksprimiranje u pozitivnoj povratnoj petlji. (B) Grafik pokazuje da ELISA detektuje samo izvorni IL-11 koji je
2
izlučen iz ćelija i ne detektuje rekombinantni IL-11 koji se koristi za IL-11 stimulirano stanje. (C) i (D) Ćelije su stimulisane rekombinantnim IL-11, izmereni je IL-11 RNK i nivo proteina prirodnog IL-11 je meren u supernatantu ćelijske kulture pomoću ELISA u navedenim vremenskim tačkama.
Slika 20. Grafici i slike koji prikazuju generisanje miofibroblasta i izradu ECM i eksprimiranja citokina, atrijalni fibroblasti kao odgovor na stimulaciju sa TGFβ1 ili IL-11. (A) generisanje miofibroblasta i proizvodnja ECM primarnim atrijalnim fibroblastima nakon stimulacije sa TGFβ1 ili IL-11, mereno fluorescencnom mikroskopijom nakon bojenja α-SMA, kolagena ili periostina. (B) Sadržaj kolagena supernatanta ćelijske kulture, kao što je utvrđeno Sirius Red bojenjem. Lučenje markera fibroze (C) IL-6, (D) TIMP1 i (E) MMP2 mereno pomoću ELISA. (F) Aktiviranje mišjih fibroblasta stimulacijom sa rekombinantnim ljudskim ili mišjim IL-11. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001 [Srednja vrednost ± SD, Dunnett].
Slika 21. Grafici koji pokazuju profibrotički efekat IL-11. (A) Mišji fibroblasti različitih tkiva porekla mogu se aktivirati sa IL-11 i prikazati povećanu proizvodnju ECM-a. [ Srednja vrednost ± SD, Dunnett]. Injekcija miševima sa rekombinantnim IL-11 ili AngII rezultuje (B) povećanjem telesne težine [Srednja vrednost ± SEM], i (C) povećanje sadržaja kolagena (što je određeno pomoću HPA testa). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001 [Srednja vrednost ± SD, Dunnett].
Slika 22. Grafici i slike pokazuju da je IL-11 potreban pro-fibrotički efekat TGFβ1 na fibroblaste.
(A) generisanje miofibroblasa i proizvodnja ECM primarnim atrijalnim fibroblastima, sa ili bez stimulacije sa TGFβ1, i u prisustvu/odsustvu neutralizujućeg anti-IL-11 antitela ili izotipa kontrole IgG, mereno fluorescencnom mikroskopijom posle bojenja za (A) α-SMA, (B) EdU ili (C) Periostin. (D do F) Lučenje markera fibroze (D) IL-6, (E) TIMP1, i (F) MMP2 je analiziran pomoću ELISA. Fluorescencija je normalizovana na kontrolnoj grupi bez stimulacije. [Srednja vrednost ± SD, Dunnett] * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ili **** P <0,0001.
Slika 23. Grafici i slike pokazuju uticaj neutralizacije IL-11 na proizvodnju kolagena izazvanog TGFβ1. Proizvodnju kolagena kardijalnim fibroblastima sa ili bez stimulacije sa TGFβ1, i u prisustvu/odsustvu neutralizujućeg anti-IL-11 antitela ili IgG-kontrole izotipa, kako je utvrđeno (A) Operetta test ili (B) Sirius Red bojenje [Srednja vrednost ± SD, Dunnett] * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ili **** P <0,0001.
Slika 24. Grafici koji pokazuju sposobnost različitih antagonista IL-11 i IL-11Rα da inhibiraju fibrozu. In vitro su analizirani ljudski atrijalni fibroblasti tretirani su neutralizujućim antitelom protiv IL-11, neutralizujućim antitelom protiv IL-11Rα, mamacIL-11 receptor molekulom koji se vezuje za IL-11, siRNK koja smanjuje IL-11 eksprimiranje ili siRNK koja reguliše na dole IL-11 RA eksprimiranje i uticaj na TGFβ1-pogonjen pro-fibrotički odgovor u fibroblastima. [Srednja vrednost ± SD, Dunnett] * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ili **** P <0,0001.
Slika 25. Grafici sa stubićima koji pokazuju odovor fibroblasta iz IL-11-RA knockout miševa na pro-fibrotički tretman. Fibroblasti izvedeni iz IL-11RA WT (+/+), heterozigotnih (+/-) i homozigotnih null (-/-) miševa su inkubirani tokom 24 časa sa TGFβ1, IL-11 ili AngII (5 ng/ml).
(A) Procenat miofibroblasta utvrđen analizom αSMA sadržaja, (B) Procenat proliferujućih ćelija, kao što je određeno bojom za EdU, (C) Sadržaj kolagena i (D) Proizvodnja ECM merena detektovanjem periostina [Srednja vrednost ± SD].
Slika 26. Grafici koji pokazuju efekat neutralizacije IL-11 na fibrozu kao odgovor na različite profibrotičke stimuluse. Fibroblasti su kultivisani in vitro u prisustvu/odsustvu raznih različitih profibrotičkih faktora i u prisustvu/odsustvu neutralizujućeg anti-IL-11 antitela ili pan-anti-TGFβ antitela (A) Proizvodnja kolagena i (B) generisanje miofibroblasa kao što je određeno analizom αSMA eksprimiranja. [Srednja vrednost ± SD, Dunnett] * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ili **** P <0,0001.
Slika 27. Grafici sa stubićima koji pokazuju eksprimiranje markera fibroze u atrijumu i srcu WT i IL-11 RA(-/-) životinja nakon lečenja sa Angll tretmanom. (A) Sadržaj kolagena, meren pomoću analize hidroksiprolina. (B) Eksprimiranje kolagena (Col1A2). (C) αSMA (ACTA2) eksprimiranje.
(D) Eksprimiranje (Fn1) fibronektina.
Slika 28. Grafici koji pokazuju efekat IL-11RA knockout na folat-indukovanu bubrežnu fibrozu, mereno količinom kolagena u tkivu bubrega.
2
Slika 29. Šema eksperimentalnih procedura za analizu fibroze u (A) plućima, (B) koži i (C) oku za IL-11RA-/- miševe u poređenju sa IL-11RA+/+ miševima.
Slika 30. Tačkasti graici koji prikazuju stepen promene u eksprimiranju gena. (A) Stepen promene u eksprimiranju gena u fibroblastima nakon stimulacije sa TGFβ1, IL-11 ili TGFβ1 i IL-11. (B) Stepen promene u eksprimiranju gena kod fibroblasta dobijenih od IL-11RA+/+ i IL-11RA-/-miševa nakon stimulacije sa TGFβ1.
Slika 31. Fotografije pokazuju efekat IL-11RA knockout na zarastanje rana i fibrozu u oku nakon trabekulektomije (filtraciona hirurgija). (A) Delovi oka IL-11RA+/+ (VT) i IL-11RA-/- (KO) životinja 7 dana nakon operacije filtracije. (B) Sazrevanje kolagenskih vlakana kao što je procenjeno tehnikom picro-sirius crvene/polarizacione svetlosti (Szendröi i dr. 1984, Acta Morphol Hung 32, 47-55); više fibroza se primećuje kod WT miševa nego KO miševi.
Slika 32. Grafici koji pokazuju efekat manac IL-11 receptora na fibrozu kao odgovor na stimulaciju sa TGFβ1. Fibroblasti su kultivisani in vitro u prisustvu/odsustvu TGFβ1 (5 ng/ml), u prisustvu ili odsustvu (A) D11R1 (mamac receptor 50aa veznik) ili (B) D11R2 (mamac Receptor 33aa veznik), u različitim različitim koncentracijama. Generisanje miofibroblasa posle 24 sata (tj. procenat aktiviranih fibroblasta) određen je analizom αSMA eksprimiranja.
Slika 33. Tabela koja prikazuje SNP regulaciju IL-11 VSTstimkod trans.
Slika 34. Tabela koja prikazuje SNP regulaciju IL-11 VSTstim- VSTunstimkod cis.
Slika 35. Tabela koja prikazuje SNP regulaciju IL-11 VSTstim- VSTunstimkod trans.
Slike 36A, 36B, 36C i 36D. Grafici koji pokazuju regulaciju odgovora IL-11 od strane lokalnih SNP-a. RNK nestimulisanih i stimulisanih (TGFB1, 5ng/ml, 24 sata) fibroblasta izvedenih iz 69 genotipizovanih pojedinaca je sekvencioniran. Uzorci su grupisani prema genotipu i povećanje eksprimiranja IL-11 (VSTstim-VSTunstim) poređeno je između grupa sa 0, 1 ili 2 minornih alela. Slika 37. Grafici koji pokazuju regulaciju odgovora IL-11 od strane udaljenih SNP-a. RNK nestimulisanih i stimulisanih (TGFB1, 5ng/ml, 24 sata) fibroblasta izvedenih iz 69 genotipizovanih pojedinaca je sekvenciran. Uzorci su grupisani prema genotipu i povećanje eksprimiranja IL11 (VSTstim-VSTunstim) poređeno je između grupa sa 0 ili 1 minor alela.
Slike 38A, 38B, 38C i 38D. Grafici koji pokazuju da je IL-11 potreban pro-fibrotički efekat TGFβ1 u fibroblastima jetre. Aktiviranje i proliferacija primarnih ljudskih fibroblasta jetre, sa ili bez stimulacije sa TGFβ1, i u prisustvu/odsustvu neutralizujućeg anti-IL-11 antitela ili izotipa IgG kontrole, mereno analizom proporcije (A) α-SMA pozitivnih ćelija, (B) EdU pozitivnih ćelija, (C) Kolagen pozitivnih ćelija i (D) Periostin pozitivnih ćelija u poređenju sa nestimulisanim ćelijama (osnovica). [Srednja vrednost ± SD, Dunnett] * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ili **** P <0,0001.
Slika 39. Grafik sa stubićima pokazuje da je IL-11 potreban za pro-fibrotičke efekte TGFβ1 u fibroblastima kože. Aktiviranje fibroblasta kože miševa, sa ili bez stimulacije sa TGFβ1, i u prisustvu/odsustvu neutralizujućeg anti-IL-11 antitela, mereno analizom procenta α-SMA pozitivnih ćelija (aktiviranih fibroblasta).
Slika 40. Grafik sa stubićima pokazuje migraciju ćelija fibroblasta pluća sa i bez signalizacije IL-11. Migracija fibroblasta pluća iz IL-11RA+/+ (WT) i IL-11RA-/- (KO) životinja analizirana je u in vitro testu bez stimulusa, ili u prisustvu TGFβ1 ili IL-11.
Primeri
Primer 1
[0261] Fibrotički odgovor karakteriše široko rasprostranjena molekularna promena u aktiviranim rezidualnim fibroblastima. Kako bi se utvrdila uloga IL-11 kao ključnog markera ove tranzicije, procenili smo i rangirali globalne razlike eksprimiranja RNK u atrijalnim fibroblastima izvedenim od 80 osoba pre i 24 sata posle aktivacije transformacije beta-1 faktora rasta (TGFβ1). Kultivisali smo primarne fibroblaste izvedene iz atrijuma 80 osoba koje su bile podvrgnute kardiohirurgiji zbog bolesti koronarne arterije. Fibroblasti su proučavani ex vivo na početku i nakon stimulacije sa TGFβ1 (moćnim pro-fibrotičkim stimulusom) korišćenjem profilnog eksprimiranja duž genoma (RNK-Seq) u kombinaciji sa fenotipskim testovima i genotipizacijom.
[0262] Eksprimiranje IL-11 je značajno indukovano u odgovoru na tretman TGFβ1 sa nivoima RNK koji se uvećavaju za 30x (> 8x u proseku). Eksprimiranje IL-11 bilo je veće od eksprimiranja svih drugih pojedinačnih gena (Slike 1a,b), što znači da je od 11.500 gena eksprimiranih u fibroblastima IL-11 najznačajniji regulisano na gore. Ova regulacija na gore IL-11 je potvrđena sa RT-qPCR kao i ELISA eksperimentima (Slike 1c,d), što ukazuje na povećanu proizvodnju i oslobađanje IL-11 proteina u aktiviranim fibroblastima je glavni pokretač fibroze.
[0263] Kako bi se procenilo da IL-11 deluje kao autokrinalni faktor signalizacije koji dovodi do fibroze, inkubirali smo nestimulisane atrijalne fibroblaste sa rekombinantnim IL-11 i nadgledali proliferaciju ćelija, generaciju miofibroblasta, kao i eksprimiranje kolagena i periostina na nivou proteina. Posmatrali smo porast proizvodnje kolagena, proliferacije ćelija i eksprimiranja periostina na nivoima sličnim onima izazvanim signalizacijskim putem TGFβ1. IL-11 aktivirani fibroblaste se takođe razlikuju u α-SMA+ miofibroblastima (Slika 2).
[0264] Pored svoje pro-fibrotičke funkcije, takođe je utvrđeno da IL-11 igra ključnu ulogu u samom TGFβ1 indukovanom fibroznom odgovoru. Inhibicija IL-11 sa neutralizujućim anti-ljudskim IL-11 monoklonskim antitelom (Monoklonski mišji IgG2A; Klon #22626; Kataloški br. MAB218; R&D Systems, MN, USA) su smanjili aktivaciju fibroblasta kroz TGFβ1. Ćelije inkubirane sa TGFβ1 nisu generisale više ekstracelularnih matričnih proteina kada je bilo antitelo IL-11 prisutno (Slika 3).
[0265] Pokazali smo da IL-11 neutralizujuća antitela sprečavaju aktivaciju fibroblasta izazvanu sa TGFβ1.
Primer 2
[0266] Upala i oštećenje tkiva podstiču dinamičan proces koji uključuje regrutovanje, proliferaciju i aktivaciju fibroblasta za stvaranje ekstracelularne matrice i iniciranje zarastanja i ožiljka rane. Ovaj fibrotički odgovor karakteriše široko rasprostranjena molekularna promena u aktiviranim rezidualnim fibroblastima koje može izazvati TGFβ1, multifunkcionalni citokin koji se oslobađa lokalnih i infiltracionih ćelija.
[0267] Kako bismo identifikovali ključne markere ove tranzicije, procenili smo i rangirali globalne razlike eksprimiranja RNK putem sekvenciranja transkriptoma u atrijalnim fibroblastima izvedenih iz 80 osoba pre i 24 časa posle tretmana TGFβ1. Kao što je razmatrano u Primeru 1, eksprimiranje IL-11 značajno je regulisano na gore u aktiviranim fibroblastima i po prvi put smo pokazali da je transkripcijski odgovor IL-11 veći od transkripcionog odgovora svih drugih pojedinačnih gena regulisanih fibrozom (Slika 4a). Upoređivanje nivoa eksprimiranja IL-11 u našem model sistemu sa različitim ljudskim tkivima pokazalo je da su visoki nivoi IL-11 takođe veoma specifični za fibrotički odgovor (Slika 4b), što ga čini idealnim markerom za procenu stepena fibroze u ljudskom telu.
[0268] Kako bismo dalje procenili da li IL-11 deluje kao autokrini signalni faktor koji dovodi do fibroze, potvrdili smo da regulacija na gore IL-11 RNK (Slika 5a) dovodi do povećanja lučenja IL-11 (Slika 5b) od atrijalnih fibroblasta. Inkubacija fibroblasta sa IL-11 nije povećala eksprimiranje IL-11 RNK (Slika 5c), već je dovela do povećanja lučenja IL-11 iz ćelija (Slika 5d). Ovo pokazuje da IL-11 ima autokrini efekat na fibroblaste koji regulišu proizvodnju IL-11 proteina na translacionom nivou.
[0269] Zatim smo inkubirali atrijalne fibroblaste sa TGFβ1, rekombinantnim IL-11 ili TGFβ1 i neutralizujućim anti-ljudskim IL-11 monoklonskim antitelima (monoklonski mišji IgG<2A>; Klon #22626; Kataloški br. MAB218; R&D Systems, MN, USA) i pratili smo proliferacija ćelija, generisanje miofibroblasa, kao i periostinsko eksprimiranje na nivou proteina. Posmatrali smo povećanje aktiviranih fibroblasta (αSMA-pozitivnih ćelija), proizvodnju periostina i proliferaciju ćelija na sličnom nivou za fibroblaste stimulisane sa TGFβ1 i IL-11. Pored svoje pro-fibrotičke funkcije, takođe je utvrđeno da IL-11 igra ključnu ulogu u samoj TGFβ1 fibrozi. Pro-fibrotički efekat TGFβ1 je inhibiran kada smo neutralisali IL-11 sa antitelom (Slika 6a-c). Isti uzorak je primećen kada smo pratili lučenje markera fibroze kao što su IL6, MMP2 i TIMP1 (Slika 6d-f).
[0270] Zatim smo pratili depoziciju kolagena, patognomonskog obeležja fibrotičkog odgovora, koristeći niz ispitivanja na nekoliko regulatornih nivoa eksprimiranja gena. Utvrđeno je da TGFβ1 povećava intracelularni kolagen (Slika 7a), luči kolagen (Slika 7b), kao i nivoe kolagenske RNK (Slika 7c), kako se očekuje. Odgovor na IL-11 je primećen samo na nivou proteina (Slika 7a, b), i ne na nivou RNK (Slika
1
7c). Stimulacija sa TGFβ1 paralelno sa inhibicijom IL-11 dovela je do povećanja kolagenske RNK, ali ovaj TGFβ1-vođen efekat nije prosleđen na nivo proteina.
[0271] Kako bismo dodatno utvrdili centralnu ulogu IL-11 u fibrozi nizvodno od višestrukih profibrotičkih stimulusa, procenili smo eksprimiranje IL-11 kod populacija fibroblasta izvedenih iz četiri različita tkiva u odgovoru na TGFβ1 (Slika 8a), ET-1, (Slika 8b) i PDGF (Slika 8c). Takođe smo sistemski primenili rekombinantni IL-11 na C57BL/6 miševe i nadgledali eksprimiranje kolagena i αSMA. Proizvodnja kolagena je povećana preko bubrega, srca i jetre (Slika 8d), i takođe smo otkrili i aktivnije fibroblaste u srcu i bubregu, naznačene višim nivoima proteina αSMA (Slika 8e).
[0272] Naši nalazi pokazuju novu i centralnu ulogu IL-11 kod fibroze i, što je najvažnije, pokazuju da je IL-11 nizvodno od ključnih pro-fibrotičkih stimulusa u nekoliko tkiva. Ovi rezultati pokazuju da je IL-11 neophodan za TGFβ1 kako bi se nastavio od regulacije transkripcije do translacije proteina. Inhibicija IL-11 zaustavlja pro-fibrotički efekat TGFβ1 na transkriptu (Slika 9).
Primer 3: Anti-IL-11 antitela inhibiraju pro-fibrotičke stimuluse
[0273] U eksperimentima sličnim onima opisanim u odnosu na Sliku 3c, atrijalni fibroblasti su bili izloženi drugim pro-fibrotičkim stimulusima u obliku angiotenzina II (ANG 2), faktora rasta iz trombocita (PDGF) i endotelina 1 (ET-1), i merena je proizvodnja kolagena.
[0274] Pored indukcije IL-11 mRNK eksprimiranja, svaki od ANG2, PDGF i ET-1 indukovao je eksprimiranje IL-11 proteina. Inhibicija IL-11 sa neutralizujućim anti-ljudskim IL-11 monoklonskim antitelom (monoklonski mišji IgG2A; Klon #22626; Kataloški br. MAB218; R&D Systems, MN, USA) blokirao je pro-fibrotički efekat svakog od ovih pro-fibrotičkih stimulusa (Slika 10), što ukazuje na to da je IL-11 centralni efektor glavnih pro-fibrotičkih stimulusa (TGFβ1, ANG2, PDGF i ET- 1).
Primer 4: IL-11R knockdown
[0275] HEK-ćelije su transfektovane (24 sata) sa ne-ciljajućom (NT)siRNK, ili sa jednom od četiri različite siRNK protiv IL11RA1 receptora (siRNK 5-8; Slika 14; SEQ ID NO 15 do 18). RNK je ekstrakovana i testirana za IL11RA1 mRNK eksprimiranje pomoću qPCR. Podaci su prikazani na Slici 15 kao nivoi eksprimiranja mRNK u odnosu na kontrolu (NT).
Primer 5: Uloga IL-11 kod fibroze
5.1 IL-11 je regulisan na gore kod fibroze
[0276] Kako bi se razumeli molekularni procesi koji su u osnovi tranzicije fibroblasta u aktivirane miofibroblaste, atrijalno tkivo je dobijeno od više od 200 pacijenata koji su prošli operaciju srčanog bajpasae u National Heart Centre Singapore. Ćelije su kultivisane in vitro na niskom prolazu (prolaz <4) i bilo nestimulisane ili stimulisane sa TGFβ1 tokom 24 časa. Kasnije smo izvršili analizu visokih protokola RNK sekvence (RNK-seq) nestimulisanih fibroblasta i ćelija stimulisanih prototipskim pro-fibrotičkim stimulusom TGFβ1 preko 160 osoba; prosečna dubina čitanja je bila ~70M čitanja po uzorku (upareni kraj 100bp, Slika 16).
[0277] Kako bi se obezbedila čistoća atrijalnih fibroblastnih ćelijskih kultura, analizirali smo eksprimiranje gena markera genotipova endotelnih ćelija, kardiomiocita i fibroblastnih ćelija iz atrijuma (Hsu i dr., 2012 Circulation Cardiovasc Genetics 5, 327-335) u RNK-seq skupu podataka.
[0278] Rezultati su prikazani na Slikama 17A do 17E i potvrđuju čistoću atrijalne fibroblastne kulture.
[0279] Eksprimiranje gena je procenjeno od strane RNK-seq tkiva porekla (uzorci ljudskog atrijalnog tkiva, n=8) i primarne, nestimulisane kulture fibroblasta. Ne/vrlo nisko eksprimiranje markera endotelne ćelije PECAM1 (Slika 17A), i markeri kardiomiocita MIH6 (Slika 17B) i TNNT2 (Slika 17C) detektovani su u uzorcima kulture ćelija fibroblasta.
[0280] Markeri za fibroblaste COL1A2 (Slika 17D) i ACTA2 (Slika 17E) bili su visoko eksprimirani u poređenju sa tkivom porekla.
[0281] Zatim, RNK-seq podaci su analizirani kako bi se identifikovali geni čije se eksprimiranje povećava ili smanjuje nakon stimulacije sa TGFβ1, i ove informacije su integrisane sa velikim RNK-seq skupom podataka preko 35+ ljudskih tkiva pruženih projektom GTEx (The GTEx Consortium, 2015 Science 348, 648-660)). To je omogućilo identifikaciju potpisa eksprimiranja gena koji su bili specifični za tranziciju fibroblast-miofibroblasta.
2
[0282] Rezultati su prikazani na Slikama 18A do 18E. Preko 10000+ gena eksprimiranih u fibroblastima, IL-11 je bio najzastupljeniji gen u odgovoru na stimulaciju sa TGFβ1, au proseku preko 160 osoba je regulisano više od 10 puta (Slika 18A).
[0283] Regulacije na gore eksprimiranja IL-11 potvrđena je pomoću ELISA analize supernatanta ćelijske kulture fibroblasta stimulisanih sa TGFβ1 (Slika 18C). U poređenju sa nivoom nivoa eksprimiranja IL-11 u drugim tkivima zdravih pojedinaca, ovaj odgovor je bio vrlo specifičan za aktivirane fibroblaste (Slika 18D). Različite promene stepena IL-11 RNK eksprimiranja takođe su potvrđene qPCR analizom (Slika 18E).
[0284] Zatim, fibroblasti su kultivisani in vitro i stimulisani sa nekoliko drugih poznatih pro-fibrotičkih faktora: ET-1, ANGII, PDGF, OSM i IL-13, kao i sa ljudskim rekombinantnim IL-11. Za analizu regulacije na gore IL-11, proizveden u reakciji na stimulaciju sa IL-11, potvrđeno je da ELISA može samo da detektuje matični IL-11 izlučen iz ćelija i ne detektuje rekombinantni IL-11 koji se koristi za stimulacije (Slika 19B ).
[0285] Rezultati su prikazani na Slici 19A. Utvrđeno je da svaki faktor značajno indukuje lučenje IL-11 od fibroblasta. Prikazano je da IL-11 deluje u autokrinoj petlji u fibroblastima, što može rezultovati regulacijom na gore IL-11 proteina čak i 100 puta nakon 72 sata (Slika 19D).
[0286] Zanimljivo je da je ova autokrina petlja za IL-11 slična autokrinoj proizvodnji IL-6. IL-6 je iz iste porodice citokina i takođe signalizuje preko gp130 receptora (Garbers and Scheller, 2013 Biol Chem 394, 1145-1161), koji se predlaže da obezbedi kontinuirano preživljavanje i rast plućnih ćelija i karcinoma dojke (Grivennikov and Karin, 2008 Cancer Cell 13, 7-9).
[0287] Nije detektovano povećanje nivoa IL-11 RNK u odgovoru na stimulaciju IL-11 (Slika 19D). Za razliku od TGFβ1, koji povećava eksprimiranje IL-11 na nivou RNK i proteina, izgleda da IL-11 reguliše na gore eksprimiranje IL-11 samo na post-transkripcijskom nivou.
5.2 IL-11 ima profibrotičku ulogu u fibrozi srčanog tkiva
[0288] Kako bi se istražilo da li je autokrini IL-11 pro- ili anti-fibrotički, fibroblasti su kultivisani in vitro sa rekombinantnim IL-11 i analizirnai su fragmenti miofibroblasta (αSMA-pozitivnih ćelija) i proizvodnja ekstracelularnih matrica.
[0289] Eksprimiranje αSMA, kolagen i periostin praćeni su pomoću Operetta High-Content Imaging System na automatizovanovom načinu visokog propuštanja. Paralelno, lučenje proteina markera fibroze, kao što su MMP2, TIMP1 i IL-6, analizirano je pomoću ELISA testova, i nivoi kolagena su potvrđeni kalorimetrijskom Sirius Red analizom supernatanta ćelijske kulture.
[0290] Ukratko, atrijalni fibroblasti izvedeni od 3 osobe su inkubirane u 2 komorice u toku 24 sata bez stimulacije, sa TGFβ1 (5 ng/ml) ili sa IL-11 (5 ng/ml). Nakon inkubacije, ćelije su obojene da analiziraju α-SMA sadržaj kako bi procenili fragment miofibroblasta, i za kolagene i periostin kako bi se procenila proizvodnja ECM. Fluorescencija je merena na 7 polja po komorici. Supernatant od 2 komorice po pojedincu takođe je procenjen za sadržaj kolagena Sirius Red bojenjem. Signal je normalizovan u kontrolnoj grupi bez stimulacije. Lučenje markera fibroze IL-6, TIMP1 i MMP2 analizirano je preko ELISA.
[0291] Rezultati su prikazani na Slikama 20A do 20F. TGFβ1 aktivirani fibroblasti i povećana proizvodnja ECM (Slika 20A). Neočekivano, i za razliku od anti-fibrotičke uloge opisane za IL-11 u srčanom tkivu u naučnoj literaturi, rekombinantni IL-11 je prouzrokovao povećanje učešća miofibroblasta u kulturama fibroblasta, i takođe je promovisao proizvodnju kolagenskih proteina ekstracelularnih matrica i periostin u istoj meri kao i TGFβ1 (Slika 20A). I IL-11 i TGFβ1 citokini takođe su značajno povećali lučenje profibrotičkih markera IL-6, TIMP1 i MMP2 (Slike 20B do 20E), i na sličan nivo.
[0292] Pronalazači su pretpostavili da kontradikcija između predmetnog otkrića da je IL-11 profibrotičan u srčanom tkivu, i antifibrotičke uloge opisane u literaturi može biti povezana sa upotrebom ljudskog IL-11 kod glodara u prethodnim studijama (Obana i dr., 2010, 2012; Stangou i dr., 2011; Trepicchio and Dorner, 1998).
[0293] Kako bi se istražila ova hipoteza, izvršena su serijska razblaženja ljudskog i mišjeg IL-11, i aktiviranja ljudskih atrijalnih fibroblasta (Slika 20F). Nije bilo aktivacije fibroblasta pri niskim koncentracijama ljudskog IL-11 na mišjim ćelijama, što ukazuje na to da prethodna zapažanja funkcije IL-11 delom mogu biti uzrokovana IL-11-nespecifičnim opažanjima.
5.3 IL-11 ima profibrotičku ulogu u fibrozi različitih tkiva
[0294] Kako bi se testiralo da li su profibrotička dejstva IL-11 specifična za atrijalne fibroblaste, ljudski fibroblasti izvedeni iz nekoliko različitih tkiva (srca, pluća, kože, bubrega i jetre) su kultivisane in vitro, stimulisana ljudskim IL-11, i aktivacijom fibroblasta i ECM proizvodnja je analizirana kako je gore opisano. Uočena je povećana aktiviranje fibroblasta i proizvodnja ECM u poređenju sa ne-stimulisanim kulturama u fibroblastima izvedenim iz svakog od analiziranih tkiva.
5.3.1 Fibroza jetre
[0295] Kako bi se testiralo da li je signalizacija IL-11 važna kod fibroze jetre, ljudski primarni fibroblasti jetre (Cell Biologics, Cat #:H-6019) su kultivisani pri niskom prolazu u 96-komoričnim pločama, i nisu stimulisani, stimulisani su sa TGFβ1 (5ng/ml, 24 sata), IL-11 (5 ng/ml, 24 sata) ili su inkubirani i sa TGFβ1 (5 ng/ml) i sa neutralizujućim IL-11 antitelom (2 μg/ml) ili i sa TGFβ1 (5 ng/ml) i sa antitelom za kontrolu izotipa. Aktiviranje fibroblasta (αSMA pozitivne ćelije), proliferacija ćelija (EdU pozitivne ćelije) i proizvodnja ECM (periostin i kolagen) analizirana je korišćenjem Operetta platforme.
[0296] Rezultati eksperimenata sa primarnim fibroblastima jetre su prikazani na Slikama 38A do 38D. Otkriveno je da IL-11 aktivira fibroblaste jetre, i utvrđeno je da je signalizacija IL-11 neophodna za profibrotičko delovanje TGFβ1 u fibroblastima jetre. I aktiviranje i proliferacija fibroblasta su inhibirani neutralisanjem anti-IL-11 antitela.
5.3.2 Fibroza kože
[0297] kako bi se testiralo da li je signalizacija IL-11 važna kod fibroze kože, primarni mikrobroblasti kožne miševa su kultivisane pri niskom prolazu u96-komoričnim pločama i nisu stimulisani, stimulisani su sa TGFβ1 (5ng/ml, 24 sata) ili su inkubirani 24 sata i sa TGFβ1 (5 ng/ml) i sa neutralizujućim IL-11 antitelom (2 μg/ml). Aktiviranje fibroblasta (αSMA pozitivne ćelije) je zatim analizirana pomoću Operetta platforme.
[0298] Rezultati su prikazani na Slici 39. TGFβ1-posredovana aktiviranje fibroblasta kože je inhibirana neutralisanjem anti-IL-11 antitela.
5.3.3 Fibroza u više organa
[0299] Dalje, mišji rekombinantni IL-11 je injektiran (100 μg/kg, 3 dana/nedeljno, 28 dana) u miševe kako bi se testirao da li IL-11 može da dovede do globalne fibroze tkiva in vivo.
[0300] Rezultati su prikazani na Slici 21. U poređenju sa Angll injekcijom (citokin koji uzrokuje povećanje krvnog pritiska i hipertrofiju srca), IL-11 je takođe povećao težinu srca, ali i težinu bubrega, pluća i jetre indeksiranu za telesnu težinu (Slika 21B). Procena sadržaja kolagena u ovim problemima pomoću hidroksiprolinskog testa pokazala je povećanje proizvodnje kolagena u ovim tkivima, što ukazuje na fibrozu kao verovatni uzrok povećanja telesne težine (Slika 6C). Eksprimiranje gena markera fibroze ACTA2 (= αSMA), Col1a1, Col3a1, Fn1, Mmp2 i Timp1 takođe je detektovano pomoću qPCR analize RNK izolovane od tkiva srca, bubrega, pluća i jetre ovih životinja.
Primer 6: Terapeutski potencijal antagonizma IL-11/IL-11R
6.1 Inhibicija fibrotičkog odgovora pomoću neutralizujućih antagonista IL-11/IL-11R
[0301] Zatim je istraženo da li je autokrinalna petlja IL-11 lučenja potrebna za pro-fibrotički efekat TGFβ1 na fibroblaste.
[0302] IL-11 je inhibiran korišćenjem komercijalno dostupnog neutralizujućeg antitela (monoklonski mišji IgG2A; Klon #22626; Kataloški br. MAB218; R&D Systems, MN, SAD). Fibroblasti su tretirani sa TGFβ1 u prisustvu ili odsustvu antitela, i mereni su aktiviranje fibroblasa, procenat proliferacionih ćelija i ECM proizvodnje i markeri fibrotičkog odgovora.
[0303] Ukratko, atrijalni fibroblasti izvedene od 3 osobe su inkubirani 24 sata sa TGFβ1 (5 ng/ml) ili TGFβ1 u prisustvu neutralizujućeg anti-IL-11 antitela ili antitela koji kontroliše izotip. Nakon inkubacije, ćelije su obojene za αSMA kako bi se odredio fragment miofibroblasta, procenat proliferirajućih ćelija je određen analizom ćelija za EdU inkorporiranje, i periostin je meren kako bi se odredila proizvodnja ECM.
4
Fluorescencija je merena operativnom platformom za 14 polja u 2 komorice za svakog pojedinca. Ispitivanje markera fibroze IL-6, TIMP1 i MMP2 takođe su analizirano pomoću ELISA. Fluorescencija je normalizovana za kontrolnu grupu bez stimulacije.
[0304] Rezultati su prikazani na Slikama 22A do 22F. Utvrđeno je da inhibicija IL-11 poboljšava fibrozu izazvanu sa TGFβ1, i pokazalo se da je IL-11 bitan za pro-fibrotički efekat TGFβ1. Pronađeno je da inhibicija IL-11 „spašava“ fenotip TGFβ1 na nivou proteina.
[0305] Takođe je analizirana proizvodnja kolagena. srčane fibroblaste izvedene od 3 osobe inkubirane su tokom 24 časa sa TGFβ1 (5 ng/ml) ili TGFβ1 i neutralizujućim IL-11 antitelom. Nakon inkubacije, ćelije su obojene kolagenom koristeći Operetta test, i florescencija je kvantifikovana kao što je gore opisano. Izlučeni nivo kolagena u supernatantu ćelijske kulture ocenjen je Sirius Red bojenjem.
[0306] Rezultati su prikazani na Slikama 23A i 23B i potvrđuju anti-fibrotički efekat inhibicije IL-11 koristeći neutralizujuće antitelo.
[0307] Zatim, sposobnost nekoliko drugih IL-11/IL-11R antagonista za inhibiranje fibroze je analizirana in vitro koristeći atrijalni fibroblast, TGFβ1-indukovani test tranzicije miofibroblasta opisan gore.
[0308] Ukratko, ćelije ljudskih atrijalnih fibroblasta su kultivisane in vitro, u prisustvu/odsustvu: (i) neutralizujućeg anti-IL-11 antitela, (ii) IL-11 RA-gp130 fuzionog proteina (iii) neutralizujućeg anti -IL-11 RA antitela, (iv) tretmana sa siRNK usmerenom protiv IL-11 ili (v) tretmana sa siRNK usmerenom protiv IL-11RA. Procenat aktiviranih fibroblasta (miofibroblasta) analiziran je procenom sadržaja αSMA kao što je gore opisano.
[0309] Rezultati su prikazani na Slici 24. Svaki od antagonista IL-11/IL-11R signalizacije je bio u stanju da ukine TGFβ1-posredovani profibrotički odgovor.
Primer 7: In vivo potvrda profibrotičke uloge za signalizaciju IL-11/IL-11R
7.1 In vitro studije koje koriste ćelije dobijene od IL-11RA gena knock-out miševa
[0310] Svi miševi su uzgajani i smešteni u istoj prostoriji, i ad libitum su im obezbeđeni hrana i voda. Miševi bez funkcionalnih alela za IL-11Rα (IL-11RA1 KO miševi) bili su na C57BI/6 genetičkoj pozadini. Miševi su bili od 9-11 nedelja stari, i težina životinja se nije značajno razlikovala.
[0311] Kako bi se dodatno potvrdili anti-fibrotički efekti inhibicije IL-11/IL-11R signalizacije, primarni fibroblasti su generisane od IL-11RA gena knock-out miševa i inkubirani sa primarnim fibroblastnim ćelijama koje su sakupljene iz IL-11RA+/+ (tj. divlji tip), IL-11RA+/- (tj. heterozigotni knockout) i IL-11RA-/- (tj. homozigotni knockout) životinje sa TGFβ1, IL-11 ili Angll. Analizirani su aktiviranje i proliferacija fibroblasta i ECM proizvodnja.
[0312] Fibroblasti izvedeni iz IL-11RA+/+, IL-11RA+/- i IL-11RA-/- miševi su inkubirani tokom 24 sata sa TGFβ1, IL-11 ili Angll (5 ng/ml). Nakon inkubacije, ćelije su obojene za αSMA sadržaj kako bi se procenio deo miofibroblasta, za EdU kako bi se identifikovao fragment proliferirajućih ćelija, i za kolagen i periostin kako bi se procenila proizvodnju ECM-a. Fluorescencija je merena korišćenjem Operetta platforme.
[0313] Rezultati su prikazani na Slikama 25A do 25D. Za IL-11RA-/- miševe je otkriveno da ne reaguju na pro-fibrotičke stimuluse. Ovi rezultati sugerišu da je signalizacija IL-11 takođe potrebna za fibrozu izazvanu sa Angll.
[0314] Zatim je istraživano da li je to istina i za druge pro-fibrotičke citokine. Ukratko, fibroblasti su kultivisani in vitro u prisustvu/odsustvu raznih različitih pro-fibrotičkih faktora (ANG2, ET-1 ili PDGF), i u prisustvu/odsustvu neutralizujućeg anti-IL-11 antitela ili pan-anti-TGFβ antitela. Nakon 24 sata, proizvodnja kolagena od strane ćelija je određena analizom korišćenjem Operetta sistema kao što je gore opisano, i generisanje miofibroblasta određeno je analizom αSMA eksprimiranja kao što je gore opisano.
[0315] Rezultati su prikazani na Slikama 26A i 26B. Utvrđeno je da je IL-11 potreban za fibrozu nizvodno od različitih profibrotičkih stimulusa i na taj način je identifikovan kao centralni posrednik fibroze izazvane raznim različitim profibrotičkim faktorima.
[0316] U daljem eksperimentu, uloga IL-11 signalizacije ispitana je kod fibroze pluća, koristeći in vitro test grebanja migracije fibroblasta pluća. Kao odgovor na pro-fibrotičke stimuluse, fibroblasti se aktiviraju i migriraju unutar fibrotičke niše u telu. Stopa migracije ćelija je mera ćelija-ćelija i ćelija-matrica interakcija i model za zarastanje rana in vivo (Liang i dr., 2007; Nat Protoc.2(2):329-33).
[0317] Fibroblasti izvedeni iz plućnog tkiva iz divljeg tipa (WT) i takođe homozigotnih IL-11RA(-/-) knockout miševa su uzgajani na niskom prolazu na plastičnoj površini sve dok nisu formirali uniformni ćelijski monosloj. Tada je stvorena ogrebotina u ćelijskom sloju, i nadgledanje ćelijske migracije blizu ogrebotine bilo je u odsustvu stimulacije, ili u prisustvu TGFβ1 ili IL-11. Slike koje su snimljene na slikama u dve vremenske tačke odmah nakon stvaranja ogrebotine i tokom 24 sata korišćene su za određivanje površine pokrivene ćelijama, i stopa migracije je upoređena između WT i KO fibroblasta. Migracija ćelija (površina ogrebotine pokrivena ćelijama nakon 24 sata) normalizovana je na stopu migracija WT ćelija bez stimulusa.
[0318] Rezultati su prikazani na Slici 40. Pokazano je da se plućni fibroblasti izvedeni iz WT miševa brže migriraju u prisustvu TGFβ1 i IL-11, što ukazuje na pro-fibrotički efekat oba citokina u plućnim fibroblastima. Ćelije koje nemaju IL-11 signalizaciju izvedenu od KO miševa migriraju sporije u odnosu na WT ćelije. Takođe nisu migrirali brže u prisustvu TGFβ1. Analiza ogrebotine otkrila je da plućni fibroblasti koji nemaju signalizaciju IL-11 imaju smanjenu stopu migracije ćelija i u prisustvu TGFβ1 ili IL-11 i na početku. Prema tome, inhibicija IL-11 signalizacije je antihibrotična u plućima.
7.2 Srčana fibroza
[0319] Ispitivana je efikasnost inhibicije IL-11 za lečenje fibrotičkih poremećaja in vivo. Mišji model za srčanu fibrozu, u kom je fibroza indukovana tretmanom sa Angll, korišćen je za ispitivanje da li su IL-11RA-/- miševi zaštićeni od srčane fibroze.
[0320] Ukratko, implantirana je pumpa, i miševi IL-11RA(+/+) i knockout (KO) IL-11 RA(-/-) su tretirani sa Angll (2 mg/kg/dan) 28 dana. Na kraju eksperimenta, sadržaj kolagena je procenjen u arterijama miševa korišćenjem kalorimetrijskog test kompleta na bazi hidroksiprolina, i analiziran je nivo RNK eksprimiranja markera ili fibroze Col1A2, αSMA (ACTA2) i fibronektina (Fn1) sa qPCR.
[0321] Rezultati su prikazani na Slikama 27A do 27D. Otkriveno je da su IL-11 RA-/- miševi zaštićeni od profibrotičkih efekata Anglla.
7.3 Bubrežna fibroza
[0322] Mišji model za bubrežnu fibrozu je upostavljen kod divljih (WT) IL-11 RA(+/+) i knockout (KO) IL-11 RA(-/-) miševa intraperitonealnom injekcijom folne kiseline (180 mg/kg) u nosaču (0,3M NaHCO3); kontrolnim miševima je dat samo nosač. Bubrezi su uklonjeni 28 dana nakon injekcije, odmereni i ili fiksirani u 10% neutralnom puferisanom formalinu za Masonov trihrome i Sirius bojenje, ili su brzo zamrznuti za ispitivanje kolagena, RNK i proteina.
[0323] Ukupna RNK je ekstrakovana iz brzo zamrznutog bubrega korišćenjem Trizol reagensa (Invitrogen) i Qiagen TissueLyzer postupkom praćenja prečišćavanja RNeasy kolone (Qiagen). CDNK je pripremljena pomoću cDNK iScriptTM kompleta sinteze, u kom je svaka reakcija sadržala 1μg ukupne RNK, prema instrukcijama proizvođača. Kvantitativna analiza eksprimiranja RT-PCR gena izvršena je na tri uzorka sa bilo TaqMan (Applied Biosystems) ili brzom SYBR zelenom (Qiagen) tehnologijom koristeći StepOnePlusTM (Applied Biosystems) tokom 40 ciklusa. Podaci o eksprimiranju su normalizovani na nivo eksprimiranja GAPDH mRNK i koristili smo postupak 2-ΔΔCt za izračunavanje promene u preklapanju. Brzo zarznuti bubrezi su podvrgnuti kiseloj hidrolizi zagrevanjem u 6M HCI u koncentraciji od 50 mg/ml (95°C, 20 sati). Količina ukupnog kolagena u hidrolizatu kvantifikovana je na osnovu kolorimetrijskog detektovanja hidroksiprolina pomoću test kompleta QuickZyme Total Collagen (QuickZyme Biosciences) prema uputstvima proizvođača.
[0324] Rezultati analize su prikazani na Slici 28. Pokazano je da folat-indukovana bubrežna fibroza zavisi od IL-11 posredovane signalizacije. Značajno povećanje sadržaja kolagena u bubrežnom tkivu primećeno je kod IL-11 RA+/+ miševa, što ukazuje na fibrozu bubrega. Nema značajnog povećanja sadržaja kolagena kod IL-11 RA-/- miševa. Životinje deficitarne za signalizaciju IL-11 imale su značajno manje taloženja kolagena u bubrezima nakon toksične povrede u poređenju sa divljim životinjama.
7.4 Fibroza pluća
[0325] IL-11 je potvrđen kao ključni posrednik fibroze u plućima, koži i očima u daljim in vivo modelima koji koriste IL-11 RA-/- knockout miševe. Šeme eksperimenata su prikazane na Slikama 29A do 29C.
[0326] Za analizu plućne fibroze, IL-11RA miševi i IL-11RA+/+ miševi su tretirani intratrahealnom primenom bleomicina na dan 0 za utvrđivanje fibrotičkog odgovora u plućima (plućna fibroza). Fibroza pluća se razvija za 21 dan, pri čemu se životinje žrtvuju i analiziraju zbog razlika u markerima fibroze između životinja sa ili bez signalizacije IL-11. IL-11RA-/- miševi imaju smanjeni fibrotički odgovor u plućnom tkivu u poređenju sa miševima IL-11RA+/+, što potvrđuje smanjeno eksprimiranje markera fibroze.
7.5 Fibroza kože
[0327] Kako bi se analizirala fibroza kože, IL-11 RA-/- miševi i IL-11RA+/+ miševi se tretiraju subkutanom primenom bleomicina na dan 0 kako bi se utvrdio fibrotički odgovor na koži. Fibroza kože se razvija za 28 dana, pri čemu se životinje žrtvuju i analiziraju zbog razlika u markerima fibroze između životinja sa ili bez signalizacije IL-11. IL-11RA-/- miševi imaju smanjeni fibrotički odgovor u kožnom tkivu u poređenju sa miševima IL-11 RA+/+, što potvrđuje smanjeno eksprimiranje markera fibroze.
7.6 Fibroza očiju
[0328] Za analizu fibroze u očima, IL-11RA-i miševi i IL-11RA+/+ miševi se podvrgavaju trabekulektomiji na dan 0 za iniciranje reakciju zarastanja rane u oku. Fibroza očiju razvija se u roku od 7 dana. Fibrotički odgovor se meri i upoređuje između IL-11RA-/- miševa i IL-11 RA+/+ miševa. IL-11 RA-/- miševi imaju smanjeni fibrotički odgovor u očnim tkivima u poređenju sa IL-11RA+/+ miševima, što potvrđuje smanjeno eksprimiranje markera fibroze.
7.7 Ostala tkiva
[0329] Efekat IL-11RA knockout na fibrozu je takođe analiziran u mišjim modelima fibroze za druga tkiva, kao što su jetra, creva, i takođe se analizira u modelu koji se odnosi na multiorgansku (tj. sistemsku) fibrozu. Fibrotički odgovor se meri i upoređuje između IL-11 RA-/- miševa i IL-11RA+/+ miševa. IL-11 RA-/- miševi imaju smanjeni fibrotički odgovor u odnosu na IL-11RA+/+ miševe, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
Primer 8: Analiza molekularnih mehanizama koji podrazumevaju indukciju fibroze poagensom IL-11
[0330] Smatra se da je kanonski režim delovanja IL-11 regulacija eksprimiranja RNK preko STAT3-posredovane transkripcije (Zhu i dr., 2015 PLoS ONE 10, e0126296), kao i aktiviranjem ERK-a.
[0331] Aktiviranje STAT3 je primećeno nakon stimulacije sa IL-11. Međutim, kada se fibroblasti inkubiraju sa TGFβ1, primećuje se samo aktiviranje kanonskog SMAD puta i ERK puteva, i aktiviranje STAT3 nije primećena, čak i uprkos činjenici da se IL-11 luči kao odgovor na TGFβ1. Samo ERK aktiviranje je zajedničko i za transdukciju signala TGFβ1 i IL-11.
[0332] Unakrsna komunikacija između TGFβ1 i IL-6 signalizacije je prethodno opisana, pri čemu TGFβ1 blokira aktivaciju STAT3 pomoću IL-6 (Walia i dr., 2003 FASEB J. 17, 2130-2132). S obzirom na blisku vezu između IL-6 i IL-11, slična unakrsna komunikcija može se primetiti za signalizaciju posredovanu sa IL-11.
[0333] Pronalazači su pomoću RNK-seq analize istraživali da li je regulacija brojnosti RNK osnovni mehanizam za povećanje eksprimiranja proteina markera fibroze u odgovoru na IL-11, što bi ukazalo na STAT3 kao osnovni signalni put za IL-11 posredovane profibrotičke procese. Fibroblasti su inkubirani 24 sata, ili bez stimulusa, ili u prisustvu TGFβ1, IL-11 ili TGFβ1 i IL-11.
[0334] Rezultati su prikazani na Slici 30A. TGFβ1 indukuje eksprimiranje kolagena, ACTA2 (αSMA) i druge markere fibroze na nivou RNK. Međutim, IL-11 nije regulisao eksprimiranje ovih gena, već drugačiji skup gena.
[0335] Analiza genske ontologije ukazuje na to da pro-fibrotički efekat u fibroblastima potiče iz IL-11-regulisanog RNK eksprimiranja. I TGFβ1 i IL-11 regulišu skoro potpuno različit skup gena na nivou RNK.
[0336] Dok TGFβ1 povećava lučenje IL-11, ciljani IL-11 geni nisu regulisani kada su prisutni i TGFβ1 i IL-11. Ovo ukazuje na to da TGFβ1 reguliše IL-11 i istovremeno blokira kanonsku regulaciju eksprimiranja RNK preko STAT3-a, slično onome što je poznato o interakciji puteva TGFβ1 i IL-6 (Walia i dr., 2003 FASEB J.17, 2130-2132).
[0337] Takođe smo analizirali da li su razlike u eksprimiranju RNK izazvane sa TGFβ1 zavisne od signalizacije IL-11, analizom promena u eksprimiranju RNK u fibroblastima dobijenim od IL-11 RA-/-miševa u poređenju sa IL-11 RA+/+ miševima. RNK eksprimiranje regulisano sa TGFβ1 se i dalje primećuje kada su IL-11 RA knockout ćelije stimulisane sa TGFβ1, i nivoi RNK αSMA, kolagena itd su i dalje regulisani na gore u odsustvu IL-11 signalizacije (kod IL-11 RA-/- fibroblasta). Kada je ispitivan profibrotički efekat IL-11 i anti-fibrotički efekat inhibicije IL-11 in vitro, smanjeno eksprimiranje markera fibroze se posmatra samo na nivou proteina, i ne na nivou transkripcije, kao što je određeno sa qPCR.
[0338] Poznato je da je aktiviranje ne-kanoničkih puteva (npr. transdukcija ERK signala) ključna za profibrotičko dejstvo TGFβ1 (Guo and Wang, 2008 Cell Res 19, 71-88). Verovatno je da će ne-kanonski putevi biti važni za signalizaciju svih poznatih pro-fibrotičkih citokina i da je IL-11 post-transkripcioni regulator koji je neophodan za fibrozu.
Primer 9: Ljudska anti-ljudska IL-11 antitela
[0339] Potpuno ljudska anti-ljudska IL-11 antitela razvijena su putem prikaza faga.
[0340] Rekombinantni ljudski IL-11 (Kataloški broj Z03108-1) i rekombinantni mišji IL-11 (Kataloški broj Z03052-1) su dobijeni od GenScript (NJ, USA). Rekombinantni ljudski IL-11 je eksprimiran u CHO ćelijama, i kao Fc-označena verzija, i kao verzija bez oznake. Mišji IL-11 bez oznake je eksprimiran u HEK293 ćelijama.
[0341] IL-11 bioaktivnost rekombinantnog ljudskog IL-11 i mišjeg IL-11 potvrdila je in vitro analizu primarnih ćelija kulture fibroblasta.
[0342] Rekombinantni, biotinilovani ljudski IL-11 i mišji IL-11 takođe su pripremljeni biotinilacijom rekombinantnih ljudski IL-11 i mišjih IL-11 molekula, prema standardnim postupcima.
[0343] Antitela sposobne da se vezuju za ljudski IL-11 i mišji IL-11 (tj. unakrsno reaktivna antitela) identifikovana su pikazom faga koristeći ljudsku naivnu biblioteku pomeranjem biotinilovanog i nebiotinilovanog rekombinantnog ljudskog i mišjeg IL-11 na osnovu 16 različitih strategija pomeranja.
[0344] Prikaz faga je identifikovao 175 scFv veznika, kao 'pre pogotke'. Analiza sekvence CDR sekvenci iz ovih 175 scFv identifikovala je 86 jedinstvenih scFv.
[0345] Rastvorljivi scFv su proizvedeni rekombinantnom eksprimiranjem u E. coli i pomoću ELISA analizirani za svoju sposobnost da se vezuju za ljudski IL-11 i mišji IL-11. Ukratko, odgovarajući antigen je obložen u komoricama ELISA ploče, supernatant ćelijske kulture koji sadrži odgovarajuću scFv je dodat u razblaženju 1:2, i detektovano je vezivanje.
[0346] Rezultati ELISA analize su otkrili:
• 8 scFV sposoban da se vezuje samo za ljudski IL-11;
• 6 scFv sposoban da se vezuje samo za mišji IL-11;
• 32 scFv prikazuje samo slabo vezivanje za ljudski/mišji IL-11, sa visokim odnosom signala i šuma, i;
• 40 scFv ima unakrsnu reaktivnost i za ljudski IL-11 i za mišji IL-11.
[0347] Od ovih 86 scFV izabrano je 56 kandidata za dalju funkcionalnu karakterizaciju. Za dalje analize, scFV su klonirani u scFV-Fc format u E. coli.
[0348] VH i VL sekvence antitela klonirane su u vektore eksprimiranja za stvaranje scFv-Fc (ljudsk IgG1) antitela. Vektori su transijentno eksprimirani u ćelijama sisara koje su kultivisani u medijumima bez seruma i izolovani proteinom A za prečišćavanje.
Primer 10: Funkcionalna karakterizacija ljudskih anti-ljudskih IL-11 antitela
[0349] Antitela opisana u Primeru 9 su analizirana u in vitro analizi za Svoju sposobnost da (i) inhibiraju signalizaciju posredovanu ljudskim IL-11, i (ii) inhibiraju signalizaciju posredovanu mišjim IL-11. Afinitet antitela za ljudski IL-11 takođe je analiziran pomoću ELISA.
10.1 Sposobnost inhibicije signalizacije posredovane ljudskim IL-11
[0350] Za ispitivanje sposobnosti za neutralizaciju signalizacije posredovane ljudskim IL-11, ljudski fibroblasti srčanog atrijuma su kultivisani u komoricama 96-komoričnih ploča u prisustvu TGFβ1 (5 ng/ml) tokom 24 časa, u prisustvu ili odsustvu anti- IL-11 antitela. TGFβ1 promoviše eksprimiranje IL-11, što zauzvrat dovodi do tranzicije mirnih fibroblasta u aktivirane, aSMA-pozitivne fibroblaste. Prethodno je pokazano da neutralizovanje IL-11 sprečava TGFβ1-indukovanu tranziciju u aktivirane, aMA-pozitivne fibroblaste.
[0351] Eksprimiranje αSMA analizirano je sa Operetta High-Content Imaging System na automatskom režimu rada sa visokim protokom.
[0352] U ne-stimulisanim kulturama, -29.7% (= 1) fibroblasta bili su aSMA-pozitivni, aktivirani fibroblasti na kraju 24-časovnog perioda kultivisanja, dok je -52% (= 1,81) fibroblasta bilo aMA-pozitivno u kulturama koje su stimulisane sa TGFβ1 u odsustvu anti-IL-11 antitela.
[0353] Anti-IL-11 antitela (2 μg/ml) su dodata filozofskim kulturama koje su stimulisane sa TGFβ1, i na kraju 24-časovnog perioda kultivisanja određen je procenat aSMA-pozitivnih fibroblasta. Procenat je normalizovan na osnovu procenta aSMA-pozitivnih fibroblasta posmatranih u kulturama fibroblasta koji nisu stimulisani sa TGFβ1.
[0354] 28 antitela je dokazano da su sposobna za neutralizaciju signalizacije posredovane od strane ljudskog IL-11.
[0355] Komercijalno monoklonsko mišje anti-IL-11 antitelo (monoklonski mišji IgG2A; Klon #22626; Kataloški br. MAB218; R&D Systems, MN, USA) takođe je analiziran zbog sposobnosti u eksperimentima da inhibira signalizaciju od strane ljudskog IL-11. Utvrđeno je da ovo antitelo može da smanji procenat aktiviranih fibroblasta na 28,3% (= 0,99).
[0356] Nekoliko klonova neutralisalo je signalizaciju od strane ljudskog IL-11 u većoj meri od komercijalno dostupnog mišjeg anti-IL-11 antitela (industrijski standard).
10.2 Sposobnost inhibicije signalizacije posredovane mišjim IL-11
[0357] Ispitivana je i sposobnost ljudskih antitela da inhibiraju signalizaciju posredovanu mišjim IL-11, sledeći istu proceduru kao što je opisano u odeljku 10.1 iznad, ali koristeći mišije dermalne fibroblaste umesto ljudskih atrijalnih fibroblasta.
[0358] Nakon 24 časa u kulturi, oko 31,8% (= 1) ne-stimulisanih ćelija u kulturi je aktivirano fibroblastima. Stimulacija sa TGFβ1 rezultovala je dvolančanim povećanjem procenta aktiviranih fibroblasta (68,8% = 2,16) u poređenju sa ne-stimulisanim kulturama.
[0359] Prikazana su antitela koja su u stanju da neutrališu signalizaciju posredovanu mišjim IL-11. Monoklonski mišji IgG2Aklon #22626, katalog br. MAB218 anti-IL-11 antitelo je takođe analizirano za sposobnost da inhibira signalizaciju pomoću mišjeg IL-11. Utvrđeno je da ovo antitelo može smanjiti procenat aktiviranih fibroblasta na 39,4% (= 1,24).
[0360] Nekoliko klonova neutralisalo je signalizaciju pomoću mišjeg IL-11 u većoj meri od komercijalno dostupnog mišjeg anti-IL-11 antitela (industrijski standard).
10.3 Analiza afiniteta antitela za ljudski IL-11
[0361] Ljudska anti-ljudska IL-11 antitela su pomoću ELISA testa analizirana za svoj afiniteta vezivanja za ljudski IL-11.
[0362] Rekombinantni ljudski IL-11 je dobijen od Genscript i peroksidazom rena (HRP) konjugovano antiljudsko IgG (Fc-specifično) antitelo dobijen je od Sigma. Corning 96-komorične ploče sa ELISA dobijene su od Sigma. Pierce 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) supstrat komplet za ELISA dobijen je od Life Technologies (0,4 g/ml TMB rastvor, 0,02% vodonik peroksida u puferu sa limunskom kiselinom). Goveđi serum albumin i sumporna kiselina dobijeni su od Sigma. Pufer za pranje je sadržao 0,05% Tween-20 u fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatom (PBS-T). ScFv-Fc antitela su generisana kao što je gore opisano. Prečišćene mišje i ljudske IgG kontrole kupljene su od Life Technologies. Tecan Infinite 200 PRO NanoQuant se koristi za merenje apsorpcije.
[0363] Criss-Cross analiza serijskog razblaživanja je izvršena kao što je opisano od strane Hornbeck i dr., (2015) Curr Protoc Immunol 110, 2.1.1-23 kako bi se odredila optimalna koncentraciju antigena oblaganja, primarnih i sekundarnih antitela.
[0364] Indirektni ELISA je izveden kako bi se procenio afinitet vezivanja primarnih ScFv-Fc antitela na 50% efektivne koncentracije (EC50) kao što je prethodno opisano (Unverdorben i dr., (2016) MAbs 8, 120-128.). ELISA ploče su prekrivene sa 1 μg/mL rekombinantnog ljudskog IL-11 preko noći na 4°C, i preostala mesta vezivanja su blokirana sa 2% BSA u PBS. ScFv-Fc antitela su razblažena u 1% BSA u PBS, titrirana kako bi se dobila radna koncentracija od 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,78, 0,195 i 0,049 ng/mL i inkubirana u duplikatima 2 sata na sobnoj temperaturi. Detektovanje antigen-antitelo vezivanja obavljeno je sa 15,625 ng/mL HRP-konjugovanim anti-ljudskim, IgG (Fc-specifičnim) antitelom. Nakon 2 časa inkubacije sa detekcionim antitelom, u toku 15 min dodato je 100 μl TMB supstrata, i hromogena reakcija je zaustavljena sa 100 μl 2 M H2SO4.
[0365] Čitanje apsorpcije je mereno na 450 nm sa korekcijom referentne talasne dužine na 570 nm. Podaci su uklopljeni grafičkim softverom GraphPad Prism sa transformacijom logova koncentracija antitela, praćeno nelinearnom regresionom analizom sa asimetričnom (pet-parametarskom) logističkom krivom odgovora na dozu za određivanje pojedinačnih vrednosti EC50.
[0366] Isti materijali i postupci kao što je prethodno opisano izvedeni su kako bi se odredio afinitet vezivanja za mišja monoklonska anti-IL-11 antitela, sa izuzetkom korišćenog HRG-konjugovanog antimišjeg IgG (H i L) umesto HRP-konjugovanog anti- ljudskog IgG.
[0367] Isti materijali i postupci kao što je prethodno opisano su izvedeni kako bi se utvrdio afinitet vezivanja za ljudska monoklonska anti-IL-11 antitela i mišja monoklonske anti-IL-11 antitela na rekombinantnom mišjem IL-11 dobijenom od Genscript.
[0368] Rezultati ELISA testova korišćeni su za određivanje EK50 vrednosti za antitela.
10.4 Sposobnost da inhibira signalizaciju posredovanu ljudskim IL-11 u različitim tkivima [0369] Ispitivana je sposobnost antitela za neutralizaciju signalizacije posredovanu sa IL-11 kod fibroblasta dobijenih iz raznih različitih tkiva, u suštini kao što je opisano u odeljku 10.1 osim što se, umesto ljudskih srčanih atrijalnih fibroblasta, za eksperimente koriste ljudski fibroblasti izvedeni iz jetre, pluća, bubrega, oka, kože, pankreasa, slezine, creva, mozga i koštane srži.
[0370] Utvrđeno je da anti-IL-11 antitela mogu da neutrališu signalizaciju u fibroblastima izvedenim iz više različitih tkiva, što je određeno posmatranjem relativnog smanjenja proporcije aSMA-pozitivnih fibroblasta na kraju 24 sata perioda kultivisanja u prisustvu anti-IL-11 antitela u poređenju sa kulturom u odsustvu antitela.
Primer 11: Inhibicija fibroze in vivo koristeći anti-IL-11 antitela
[0371] Prikazana je terapeutska upotreba anti-ljudskih IL-11 antitela u in vivo mišjim modelima fibroze za različita tkiva.
11.1 Srčana fibroza
[0372] Pumpa se implantira, i miševi se tretiraju sa Angll (2 mg/kg/dan) tokom 28 dana.
[0373] Neutralizujuća anti-IL-11 antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Na kraju eksperimenta, sadržaj kolagena je procenjen u atrijumima miševa korišćenjem kalorimetrijskog test kompleta na bazi hidroksiprolina, i analiziran je nivo RNK eksprimiranja markera ili fibroze Col1A2, αSMA (ACTA2) i fibronektina (Fn1) od strane qPCR.
[0374] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11 antitelima imaju smanjen fibrotički odgovor u srčanom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim sa kontrolnim antitelima, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
11.2 Bubrežna fibroza
[0375] Uspostavljen je mišji model za bubrežnu fibrozu, u kojoj se fibroza indukuje intraperitonealno ubrizgavanje folne kiseline (180 mg/kg) u nosaču (0,3 M NaHCO); kontrolnim miševima je davat samo nosač.
[0376] Neutralizujuća anti-IL-11 antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Bubrezi se uklanjaju na 28. dan, mere se i, ili fiksiraju u 10% neutralnom puferisanom formalinu za Masonovo trihrom i Sirius bojenje, ili brzo zamrzavaju za ispitivanje kolagena, RNK i proteina.
4
[0377] Ukupna RNK se ekstrakuje iz zamrznutog bubrega pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) i Qiagen TissueLyzer postupka, praćeno RNeasy kolonskim (Qiagen) prečišćavanjem. CDNK je pripremljena pomoću iScriptTM cDNK kompleta za sintezu, gde je svaka reakcija sadržala 1μg ukupne RNK, prema instrukcijama proizvođača. Kvantitativna analiza eksprimiranja gena RT-PCR se izvodi na tri uzorka, bilo sa TaqMan (Applied Biosystems) ili brzom SYBR zelenom (Qiagen) tehnologijom koristeći StepOnePlusTM (Applied Biosystems) tokom 40 ciklusa. Podaci o eksprimiranju su normalizovani do nivoa eksprimiranja GAPDH mRNK, i postupak 2-ΔΔCt se koristi za izračunavanje stepena promene. Brzo zamrznuti bubrezi se podvrgavaju kiseloj hidrolizi zagrevanjem u 6M HCI u koncentraciji od 50 mg/ml (95°C, 20 sati). Količina ukupnog kolagena u hidrolizatu se kvantifikuje na osnovu kolorimetrijskog detektovanja hidroksiprolina pomoću QuickZyme Total Collagen test kompleta (QuickZyme Biosciences) prema uputstvima proizvođača.
[0378] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11 antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u bubrežnom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je dokazano smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
11.3 Fibroza pluća
[0379] Miš se tretira intratrahealnom primenom bleomicina na dan 0 za utvrđivanje fibrotičkog odgovora u plućima (plućna fibroza).
[0380] Neutralizujuća anti-IL-11 antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Miševi se žrtvuju na dan 21, i analiziraju se za razlike u markerima fibroze.
[0381] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11 antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u plućnom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je dokazano smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
11.4 Fibroza kože
[0382] Miševi se tretiraju subkutanom primenom bleomicina na dan 0 kako bi se uspostavio fibrotički odgovor na koži.
[0383] Neutralizujuća anti-IL-11 antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Miševi se žrtvuju na dan 21, i analiziraju se za razlike u markerima fibroze.
[0384] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11 antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u kožnom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je dokazano smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
11.5 Fibroza očiju
[0385] Miši prolaze trabekuektomiju na dan 0 kako bi se inicirala reakcija zarastanja rana u oku.
[0386] Neutralizujuća anti-IL-11 antitela ili kontrolna antitela se primenjuju kod različitih grupa miševa intravenskim injekcijama, i fibroza se prati u tkivu oka.
[0387] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11 antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u očnim tkivima u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je dokazano smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
11.6 Ostala tkiva
[0388] Efekat lečenja neutralizujućim anti-IL-11 antitelima na fibrozu je takođe analiziran u mišjim modelima fibroze za druga tkiva, kao što su jetra, bubrezi, creva i takođe se analizira u modelu koji se odnosi na višeorgansku (tj. sistemsku) fibrozu.
[0389] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11 antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je potvrđeno smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
Primer 12: Anti-ljudska IL-11Rα antitela
[0390] Mišja monoklonska antitela usmerena protiv ljudskog IL-11Rα proteina generisana su na sledeći način.
[0391] cDNK koja kodira aminokiselinu za ljudski IL-11Rα je klonirana u plazmide eksprimiranja (Aldevron GmbH, Freiburg, Germany).
[0392] Miševi su imunizovani intradermalnom primenom zlatnih čestica obloženih sa DNK pomoću ručnog uređaja za bombardovanje čestica („genski pištolj“). Uzorci seruma su sakupljeni od miševa nakon serije imunizacija i testirani u protočnoj citometriji na HEK-ćelijama koje su transijentno transfektovane sa ljudskim IL-11Rα plazmidima eksprimiranja (ćelijsko eksprimiranje ljudskog IL-11Rα transijentno transfektovanih HEK ćelija potvrđeno je sa anti-oznaka antitelima koja prepoznaju oznaku dodatu N-terminusu IL-11Rα proteina).
[0393] Ćelije koje proizvode ćelije za antibiotike su izolovane od miševa i spojene sa ćelijama mijeloma miševa (Ag8) prema standardnim procedurama.
[0394] Hibridomi koji proizvode antitela specifična za IL-11Rα su identifikovani skriningom za sposobnost vezivanja za IL-11Rα eksprimiranje HEK ćelija protočnom citometrijom.
[0395] Ćelijske pelete pozitivnih ćelija hibridoma pripremljene su korišćenjem agensa za zaštitu od RNK (RNAlater, cat # AM7020 od strane ThermoFisher Scientific) i dalje obrađivane za sekvenciranje varijabilnih domena antitela.
[0396] Sekvenciranje je izvršeno pomoću BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kompleta (Life Technologies®) u skladu sa uputstvima proizvođača. Svi podaci su prikupljeni korišćenjem 3730xl DNK Analyzer sistema i Unified Data Collection softvera (Life Technologies®). Sastavljanje sekvence obavljeno je pomoću CodonCode Aligner (CodonCode Corporation). Mešani bazni pozivi bili su rešeni automatskim dodeljivanjem najčešćeg baznog poziva mešovitim baznim pozivima. Pretežnost je određena i frekvencijom baznog poziva, i individualnim kvalitetom baznih poziva.
[0397] Ukupno je proizvedeno 17 mišjih monoklonskih anti-ljudskih IL-11Rα antitela.
Primer 13: Funkcionalna karakterizacija anti-ljudskih IL-11Rα antitela
13.1 Sposobnost inhibiranja signalizacije posredovane ljudskim IL-11/IL-11R
[0398] Kako bi se ispitala mogućnost anti-IL-11Rα antitela za neutralizaciju signalizacije posredovane ljudskim IL-11/IL-11R, kardiološki atrijalni ljudski fibroblasti su kultivisane u komoricama 96-komorčnih ploča u prisustvu TGFβ1 (5 ng/ml) za 24 sata, u prisustvu ili odsustvu anti-IL-11Rα antitela. Ovaj profibrotički stimulus promoviše eksprimiranje IL-11, koji zauzvrat dovodi do tranzistije nestabilnih fibroblasta u aktivirane, aMA-pozitivne fibroblaste. Prethodno je pokazano da neutralizovanje IL-11 sprečava TGFβ1- indukovanu tranziciju na aktivirane, aMA-pozitivne fibroblaste.
[0399] Anti-IL-11Rα antitela (2 μg/ml) su dodate u kulture fibroblasta koje su stimulisane sa TGFβ1, i na kraju 24-časovnog perioda kultivisanja određen je procenat αSMA-pozitivnih fibroblasta. Procenat je normalizovan na osnovu procenta aSMA-pozitivnih fibroblasta posmatranih u kulturama fibroblasta koji nisu stimulisani sa TGFβ1.
[0400] Eksprimiranje αSMA analizirano je sa Operetta High-Content Imaging System na automatskom načinu rada sa visokim protokom.
[0401] Stimulacija sa TGFβ1 rezultovala je za 1,58 puta povećanjem broja aSMA-pozitivnih, aktiviranih fibroblasta na kraju 24-časovnog perioda kulture u odsustvu anti-IL-11Rα antitela.
[0402] Komercijalno mišje monoklonsko anti-IL-11 antitelo (monoklonski mišji IgG2A; Klon #22626; Kataloški br. MAB218; R&D Systems, MN, USA) je uključen kao kontrola. Utvrđeno je da je ovo antitelo smanjilo procenat aktiviranih fibroblasta za 0,89 puta od procenta aktiviranih fibroblasta u nestimulisanim kulturama (tj. u odsustvu stimulacije sa TGFβ1).
[0403] Utvrđeno je da anti-IL-11Rα antitela mogu inhibirati IL-11/IL-11R signalizaciju kod ljudskih fibroblasta, i nekoliko ih je sposobno da inhibiraju signalizaciju IL-11/IL-11R u većoj meri od monoklonskog anti- IL-11 antitela.
13.2 Sposobnost inhibiranja signalizacije posredovane sa mišjim IL-11
[0404] Ispitivana je takođe i mogućnost anti-IL-11Rα antitela da inhibiraju signalizaciju posredovanu mišjim IL-11, sledeći istu proceduru kao što je opisano u odeljku 13.1 gore, ali koristeći atrijalne fibroblaste miševa umesto ljudskih atrijalnih fibroblasta.
[0405] Stimulacija sa TGFβ1 dovela je do povećanja za 2,24 puta broja aSMA-pozitivnih, aktiviranih fibroblasta na kraju 24-časovnog perioda kultivisanja u odsustvu anti-IL-11Rα antitela.
[0406] Komercijalno mišje monoklonsko anti-IL-11 antitelo (monoklonski mišji IgG2A; Klon #22626; Kataloški br. MAB218; R&D Systems, MN, USA) je uključen kao kontrola. Utvrđeno je da je ovo antitelo smanjilo procenat aktiviranih fibroblasta za 1,44 puta od procenta aktiviranih fibroblasta u nestimulisanim kulturama (tj. u odsustvu stimulacije sa TGFβ1).
[0407] Utvrđeno je da anti-IL-11Rα antitela mogu inhibirati IL-11/IL-11R signalizaciju kod mišjih fibroblasta, i nekoliko ih je sposobno da inhibiraju signalizaciju IL-11/IL-11R u većoj meri od monoklonskog anti- IL-11 antitela.
13.3 Skrining za sposobnost vezivanja IL-11Rα
[0408] Hibridomi miševa koji proizvode anti-ljudska IL-11Rα antitela su subklonirani, i supernatant ćelijske kulture iz subkloniranih hibridoma analiziran je pomoću „mešanje-i-merenje“ iQue testa za (i) sposobnost vezivanja za ljudskog IL-11Rα i (ii) unakrsnu reaktivnost za antigen koji nije IL-11Rα.
[0409] Ukratko, označene kontrolne ćelije (ne eksprimiraju IL-11Rα na površini ćelije) i neoznačene ciljane ćelije koje eksprimiraju ljudski IL-11Rα na svojoj površini (posle transijentne transfekcije sa plazmidom koji kodira FLAG-označeni ljudski IL-11 Ra) pomešani su zajedno sa supernatantom ćelijske kulture (koji sadrži mišja-anti-IL-11Rα antitela) i sekundarnim detekcionim antitelima (fluorescentno označeno anti-mišje IgG antitelo).
[0410] Ćelije su zatim analizirane koristeći HTFC Screening System (iQue) za dve oznake (tj. oznaka ćelije i oznaka na sekundarnom antitelu). Detektovanje sekundarnog antitela na neoznačenim IL-11Rα eksprimirajućim ćelijama pokazala je sposobnost mišjih-anti-IL-11Rα antitela da se vezuju za IL-11Rα. Detektovanje sekundarnog antitela na označenim, kontrolnim ćelijama pokazala je unakrsnu reaktivnost mišijh-anti-IL-11Rα antitela za cilj koji nije IL-11Rα.
[0411] Kao uslov pozitivne kontrole, označene i neoznačene ćelije su inkubirane sa mišjim anti-FLAG oznaka antitelom kao primarnim antitelo.
[0412] Većina subkloniranih hibridoma eksprimirala je antitela koja su se mogla vezati za ljudski IL-11Rα i koja su prepoznala ovaj cilj sa visokom specifičnošću.
13.4 Analiza afiniteta antitela za ljudski IL-11Rα
[0413] Antitela protiv ljudskog IL-11Rα su pomoću ELISA testa analizirana za svoj afiniteta vezivanja za ljudski IL-11Rα.
[0414] Rekombinantni ljudski IL-11Rα dobijen od Genscript i peroksidazom rena (HRP) konjugovano anti-ljudsko IgG (Fc-specifično) antitelo dobijen je od Sigma. Corning 96-komorične ploče sa ELISA dobijene su od Sigma. Pierce 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) supstrat komplet za ELISA dobijen je od Life Technologies (0,4 g/ml TMB rastvor, 0,02% vodonik peroksida u puferu sa limunskom kiselinom). Goveđi serum albumin i sumporna kiselina dobijeni su od Sigma. Pufer za pranje je sadržao 0,05% Tween-20 u fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatom (PBS-T). Prečišćene mišje i ljudske IgG kontrole kupljene su od Life Technologies. Tecan Infinite 200 PRO NanoQuant se koristi za merenje apsorpcije.
[0415] Criss-Cross analiza serijskog razblaživanja je izvršena kao što je opisano od strane Hornbeck i dr., (2015) Curr Protoc Immunol 110, 2.1.1-23 kako bi se odredila optimalna koncentraciju antigena oblaganja, primarnih i sekundarnih antitela.
[0416] Indirektni ELISA je izveden kako bi se procenio afinitet vezivanja mišjih anti-IL- 11Rα antitela na 50% efektivne koncentracije (EC50) kao što je prethodno opisano (Unverdorben i dr., (2016) MAbs 8, 120-128.). ELISA ploče su prekrivene sa 1 μg/mL rekombinantnog ljudskog IL-11 preko noći na 4°C, i preostala mesta vezivanja su blokirana sa 2% BSA u PBS. Antitela su razblažena u 1% BSA u PBS, titrirana kako bi se dobila radna koncentracija od 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,78, 0,195 i 0,049 ng/mL i inkubirana u duplikatima 2 sata na sobnoj temperaturi. Detektovanje antigen-antitelo vezivanja obavljeno je sa 15,625 ng/mL HRP-konjugovanim anti-mišjim antitelom. Nakon 2 časa inkubacije sa detekcionim antitelom, u toku 15 min dodato je 100 μl TMB supstrata, i hromogena reakcija je zaustavljena sa 100 μl 2 M H2SO4. Čitanje apsorpcije je mereno na 450 nm sa korekcijom referentne talasne dužine na 570 nm. Podaci su uklopljeni grafičkim softverom GraphPad Prism sa transformacijom logova koncentracija
4
antitela, praćeno nelinearnom regresionom analizom sa asimetričnom (pet-parametarskom) logističkom krivom odgovora na dozu za određivanje pojedinačnih vrednosti EC50.
13.5 Sposobnost inhibiranja signalizacije ljudskog IL-11/IL-11R u različitim tkivima
[0417] Ispitivana je sposobnost antitela za neutralizaciju signalizacije IL-11/IL-11R u fibroblastima dobijenim iz više različitih tkiva, u suštini kao što je opisano u odeljku 13.1 osim što se, umesto ljudskih srčanih atrijalnih fibroblasta, za eksperimente koriste ljudski fibroblasti izvedeni iz jetre, pluća, bubrega, oka, kože, pankreasa, slezine, creva, mozga i koštane srži.
[0370] Utvrđeno je da anti-IL- 11Rα antitela mogu da neutrališu signalizaciju IL-11/IL-11R u fibroblastima izvedenim iz više različitih tkiva, što je određeno posmatranjem relativnog smanjenja proporcije aSMA-pozitivnih fibroblasta na kraju 24 sata perioda kultivisanja u prisustvu anti-IL-11 antitela u poređenju sa kulturom u odsustvu antitela.
Primer 14: Inhibicija fibroze in vivo koristeći anti-IL-11Rα antitela
[0419] Prikazana je terapeutska upotreba antitela anti-ljudskih IL-11Rα in vivo u mišjim modelima fibroze za različita tkiva.
14.1 Srčana fibroza
[0420] Pumpa se implantira, i miševi se tretiraju sa Angll (2 mg/kg/dan) tokom 28 dana.
[0421] Neutralizujuća anti-IL-11Rα antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Na kraju eksperimenta, sadržaj kolagena je procenjen u atrijumima miševa korišćenjem kalorimetrijskog test kompleta na bazi hidroksiprolina, i analiziran je nivo RNK eksprimiranja markera ili fibroze Col1A2, αSMA (ACTA2) i fibronektina (Fn1) bi qPCR.
[0422] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11Rα antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u srčanom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
14.2 Bubrežna fibroza
[0423] Uspostavljen je mišji model za bubrežnu fibrozu, u kom se fibroza indukuje intraperitonealnim ubrizgavanjem folne kiseline (180 mg/kg) u nosaču (0,3 M NaHCO); kontrolnim miševima je dat samo nosač.
[0424] Neutralizujuća anti-IL-11Rα antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Bubrezi se uklanjaju na 28. dan, meri im se težina, i ili fiksiraju u 10% neutralnom puferisanom formalinu za Masonov trihrom i Sirius bojenje ili brzo zamrzavaju za ispitivanje kolagena, RNK i proteina.
[0425] Ukupna RNK se ekstrakuje iz brzo zamrznutog bubrega pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) i Qiagen TissueLyzer postupka, praćeno RNeasy kolonskim (Qiagen) prečišćavanjem. cDNK je pripremljena pomoću iScriptTM cDNK kompleta za sintezu, gde je svaka reakcija sadržala 1μg ukupne RNK, prema instrukcijama proizvođača. Kvantitativna analiza eksprimiranja gena RT-PCR se izvodi na tri uzorka, bilo sa TaqMan (Applied Biosystems) ili brzom SYBR zelenom (Qiagen) tehnologijom koristeći StepOnePlusTM (Applied Biosystems) tokom 40 ciklusa. Podaci o eksprimiranju su normalizovani do nivoa eksprimiranja GAPDH mRNK, i postupak 2-ΔΔCt se koristi za izračunavanje stepena promene. Brzo zaleđeni bubrezi se podvrgavaju kiseloj hidrolizi zagrevanjem u 6M HCI u koncentraciji od 50 mg/ml (95°C, 20 sati). Količina ukupnog kolagena u hidrolizatu se kvantifikuje na osnovu kolorimetrijskog detekcioniranja hidroksiprolina pomoću QuickZyme Total Collagen test kompleta (QuickZyme Biosciences) prema uputstvima proizvođača.
[0426] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11Rα antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u bubrežnom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je potvrđeno smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
14.3 Fibroza pluća
[0427] Miš se tretira intratrahealnom primenom bleomicina na dan 0 za utvrđivanje fibrotičkog odgovora u plućima (plućna fibroza).
[0428] Neutralizujuća anti-IL-11Rα antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Miševi se žrtvuju na dan 21, i analiziraju se za razlike u markerima fibroze.
[0429] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11Rα antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u plućnom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je potvrđeno smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
14.4 Fibroza kože
[0430] Miši tretiraju subkutanom primenom bleomicina na dan 0 kako bi se uspostavio fibrotički odgovor na koži.
[0431] Neutralizujuća anti-IL-11Rα antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Miševi se žrtvuju na dan 21, i analiziraju se za razlike u markerima fibroze.
[0432] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11Rα antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u kožnom tkivu u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je dokazano smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
14.5 Fibroza očiju
[0433] Miševi prolaze trabekuektomiju na dan 0 da iniciraju reakciju zarastanja rana u oku.
[0434] Neutralizujuća anti-IL-11Rα antitela ili kontrolna antitela se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama, i fibroza se prati u očnim tkivima.
[0435] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11Rα antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u očnim tkivima u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelima, što je dokazano smanjenjem eksprimiranja markera fibroze.
14.6 Ostala tkiva
[0436] Efekat lečenja neutralizujućim anti-IL-11Rα antitelima na fibrozu je takođe analiziran u mišjim modelima fibroze za druga tkiva, kao što su jetra, bubrege, creva i takođe se analizira u modelu koji se odnosi na višeorgansku (tj. sistemsku) fibrozu.
[0437] Miševi tretirani neutralizujućim anti-IL-11Rα antitelima imaju smanjeni fibrotički odgovor u odnosu na miševe tretirane kontrolnim antitelima, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
Primer 15: Mamac IL-11 receptori
15.1 Mamac IL-11 receptor konstrukti
[0438] Mamac IL-11 receptor molekuli su projektovani i klonirani u vektor pTT5 za rekombinantno eksprimiranje u 293-6E ćelijama.
[0439] Ukratko, umetak za plazmid koji sadrži cDNK koja kodira domene D1, D2 i D3 vezane za ligand gp130 u okviru sa cDNK koja kodira vezni region bilo 50 aminokiselina ili 33 aminokiseline, i zatim cDNK koja kodira domene D2 i D3 vezivanja liganda ljudske IL-11Rα, i zatim cDNK koja kodira FLAG oznaku. Umetak cDNK je inkorporirao lidersku sekvencu, Kozak sekvence na 5' kraju, i uključio 5' EkoRI restrikciono mesto i 3' HindIII restrikciono mesto (nizvodno od zaustavnog kodona) za umetanje u pTT5 vektor.
[0440] Dva konstrukta koji kodiraju mamac IL-11 receptor molekul, koji imaju ili 50 aminokiselina ili 33 aminokiselinsku sekvencu, su označeni kao mamac IL-11 receptor 1 (D11R1) i mamac IL-11 receptor 2 (D11R2).
15.2 Eksprimiranje i prečišćavanje mamac IL-11 receptora
[0441] Konstrukti su transfektovani u 293-6E ćelije za rekombinantno eksprimiranje i prečišćavanje.
[0442] 293-6E ćelije su uzgajane u FreeStyle™ 293 Ekpression Medium (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) serumu. Ćelije su održavane u erlenmajer bocama (Corning Inc., Acton, MA) na 37°C sa 5% CO2na orbitalnom mikseru (VWR Scientific, Chester, PA).
[0443] Jedan dana pre transfekcije, ćelije su zasejane u odgovarajućoj gustini u Corning erlenmajer boce. Na dan transfekcije, DNK i transfekcioni reagens su pomešani u optimalnom odnosu, i zatim su dodati u
4
bocu sa ćelijama spremnim za transfekciju. Rekombinantni plazmidi koji kodiraju D11R1 i D11R2 transijentno su transfektovani u suspenzivne 293-6E ćelijske kulture u dva odvojena dana.
[0444] Supernatante ćelijske kulture su sakupljene na dan 6 i korišćene su za prečišćavanje. Ukratko, mešavine ćelijske kulture su centrifugirane i filtrirane. 0,5 ml smole je dodato supernatantima ćelijske kulture i inkubirano je 3-4 sata kako bi se uhvatio ciljani protein.
[0445] Nakon pranja i elucije sa odgovarajućim puferima, eluirane frakcije analizirale su sa SDS-PAGE i Western blot korišćenjem Rabbit anti-FLAG poliklonskog antitela (GenScript, Cat.No.A00170) kako bi se potvrdilo eksprimiranja FLAG-označenih mamac IL-11 receptor molekula.
[0446] Pročišćene vrste su kvantifikovane i skladištene na -80°C.
Primer 16: Funkcionalna karakterizacija mamac IL-11 receptora
16.1 Sposobnost inhibiranja signalizacije posredovane sa ljudskim IL-11
[0447] Za ispitivanje sposobnosti za neutralizaciju signalizacije posredovane sa ljudskim IL-1a, ljudski fibroblaste srčanog atrijuma su kultivisane u komoricama 96-komoričnih ploča u prisustvu TGFβ1 (5 ng/ml) tokom 24 sata, u prisustvu ili odsustvu različitih koncentracija D11R1 ili D11R2.
[0448] TGFβ1 promoviše eksprimiranje IL-11, što zauzvrat dovodi do tranzicije nepromenljivih fibroblasta u aktivirane, aMA-pozitivne fibroblaste. Prethodno je pokazano da neutralizovanje IL-11 sprečava TGFβ1-indukovanu tranziciju na aktivirane, aMA-pozitivne fibroblaste.
[0449] Eksprimiranje αSMA analizirano je sa Operetta High-Content Imaging System na automatskom načinu rada sa visokim protokom.
[0450] D11R1 ili D11R2 su dodati u kulture fibroblasta koji su stimulisani sa TGFβ1 u konačnim koncentracijama od 5 ng/ml, 50 ng/ml i 500 ng/ml, i na kraju 24-časovnog perioda kulture, određen je procenat aMA-pozitivnih fibroblasta u kulturi.
[0451] I D11R1 i D11R2 su pokazali da su sposobni za neutralizaciju signalizacije posredovane ljudskim IL-11 na način koji zavisi od doze.
[0452] Rezultati eksperimenata su prikazani na Slikama 32A i 32B. I D11R1 i D11R2 su pokazali da su sposobni za neutralizaciju signalizacije posredovane ljudskim IL-11 na način koji zavisi od doze.
[0453] IC50za molekule D11R1 i D11R2 je određen da je ~1 nM.
16.2 Sposobnost inhibiranja signalizacije posredovane sa mišjim IL-11
[0454] Ispituje se sposobnost D11R1 i D11R2 da inhibiraju signalizaciju posredovanu mišjim IL-11, sledeći istu proceduru kao što je opisano u odeljku 16.1 gore, ali koristeći mišje dermalne fibroblaste umesto ljudskih atrijalnih fibroblasta.
[0455] D11R1 i D11R2 su pokazali da mogu da neutrališu signalizaciju IL-11/IL-11R kod fibroblasta mišje kože, što je određeno posmatranjem relativnog smanjenja proporcije aSMA-pozitivnih fibroblasta na kraju 24-časovnog perioda kultivisanja u prisustvu D11R1 ili D11R2 u poređenju sa kulturom u odsustvu mamac IL-11 receptora.
16.3 Analiza afiniteta mamac IL-11 receptora za IL-11
[0456] D11R1 i D11R2 se analiziraju za svoj afiniteta vezivanja za ljudski IL-11 pomoću ELISA testa.
[0457] Rekombinantni ljudski IL-11R dobijen od Genscript i peroksidazom rena (HRP) konjugovano antiljudsko IgG (Fc-specifično) antitelo dobijen je od Sigma. Corning 96-komorične ploče sa ELISA dobijene su od Sigma. Pierce 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) supstrat komplet za ELISA dobijen je od Life Technologies (0,4 g/ml TMB rastvor, 0,02% vodonik peroksida u puferu sa limunskom kiselinom). Goveđi serum albumin i sumporna kiselina dobijeni su od Sigma. Pufer za pranje je sadržao 0,05% Tween-20 u fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatom (PBS-T). Tecan Infinite 200 PRO NanoQuant se koristi za merenje apsorpcije.
[0458] Indirektni ELISA je izveden kako bi se procenio afinitet vezivanja mišjih anti-IL- 11Rα antitela na 50% efektivne koncentracije (EC50) kao što je prethodno opisano (Unverdorben i dr., (2016) MAbs 8, 120-128.). ELISA ploče su prekrivene sa 1 μg/mL rekombinantnog ljudskog IL-11 preko noći na 4°C, i preostala mesta vezivanja su blokirana sa 2% BSA u PBS. Antitela su razblažena u 1% BSA u PBS,
4
titrirana kako bi se dobila radna koncentracija od 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,78, 0,195 i 0,049 ng/mL i inkubirana u duplikatima 2 sata na sobnoj temperaturi. Detektovanje antigen-antitelo vezivanja obavljeno je sa 15,625 ng/mL HRP-konjugovanim anti-FLAG antitelom. Nakon 2 časa inkubacije sa detekcionim antitelom, u toku 15 min dodato je 100 μl TMB supstrata, i hromogena reakcija je zaustavljena sa 100 μl 2 M H2SO4. Čitanje apsorpcije je mereno na 450 nm sa korekcijom referentne talasne dužine na 570 nm. Podaci su uklopljeni grafičkim softverom GraphPad Prism sa transformacijom logova koncentracija antitela, praćeno nelinearnom regresionom analizom sa asimetričnom (pet-parametarskom) logističkom krivom odgovora na dozu za određivanje pojedinačnih vrednosti EC50.
[0459] Isti materijali i postupci kao što je prethodno opisano su izvedeni kako bi se odredio afinitet vezivanja za rekombinantni mišji IL-11 dobijenog od Genscript-a.
16.4 Sposobnost da inhibira signalizaciju posredovanog ljudima IL-11 u različitim tkivima
[0417] Ispitivana je sposobnost mamac IL-11 receptora D11R1 i D11R2 za neutralizaciju signalizacije posredovane sa IL-11 u fibroblastima dobijenim iz više različitih tkiva, u suštini kao što je opisano u odeljku 18.1 osim što se, umesto ljudskih srčanih atrijalnih fibroblasta, za eksperimente koriste ljudski fibroblasti izvedeni iz jetre, pluća, bubrega, oka, kože, pankreasa, slezine, creva, mozga i koštane srži.
[0370] Utvrđeno je da D11R1 i D11R2 mogu da neutrališu signalizaciju posredovanu sa IL-11 u fibroblastima izvedenim iz više različitih tkiva, što je određeno posmatranjem relativnog smanjenja proporcije aSMA-pozitivnih fibroblasta na kraju 24 sata perioda kultivisanja u prisustvu mamac IL-11 receptora u poređenju sa kulturom u odsustvom mamac IL-11 receptora.
Primer 17: Inhibicija fibroze in vivo koristeći mamac IL-11 receptore
[0462] Prikazana je terapeutska upotreba mamac IL-11 receptora u in vivo mišjim modelima fibroze za različita tkiva.
17.1 Srčana fibroza
[0463] Pumpa se implantira, i miševi se tretiraju sa Angll (2 mg/kg/dan) tokom 28 dana.
[0464] Mamac IL-11 receptori D11R1 ili D11R2 se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Na kraju eksperimenta, sadržaj kolagena je procenjen u atrijumima miševa korišćenjem kalorimetrijskog test kompleta na bazi hidroksiprolina, i analiziran je nivo RNK eksprimiranja markera ili fibroze Col1A2, αSMA (ACTA2) i fibronektina (Fn1) bi qPCR.
[0465] Miševi tretirani mamac IL-11 receptorima imaju smanjeni fibrotički odgovor u srčanom tkivu u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim nosačem/netretiranim, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
17.2 Bubrežna fibroza
[0466] Uspostavljen je mišji model za bubrežnu fibrozu, u kom se fibroza indukuje intraperitonealnim ubrizgavanjem folne kiseline (180 mg/kg) u nosaču (0,3 M NaHCO); kontrolnim miševima je dat samo nosač.
[0467] Mamac IL-11 receptori D11R1 ili D11R2 se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Bubrezi se uklanjaju na 28. dan, meri im se težina, i ili fiksiraju u 10% neutralnom puferisanom formalinu za Masonov trihrom i Sirius bojenje ili brzo zamrzavaju za ispitivanje kolagena, RNK i proteina.
[0468] Ukupna RNK se ekstrakuje iz brzo zamrznutog bubrega pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) i Qiagen TissueLyzer postupka, praćeno RNeasy kolonskim (Qiagen) prečišćavanjem. cDNK je pripremljena pomoću iScriptTM cDNK kompleta za sintezu, gde je svaka reakcija sadržala 1μg ukupne RNK, prema instrukcijama proizvođača. Kvantitativna analiza eksprimiranja gena RT-PCR se izvodi na tri uzorka, bilo sa TaqMan (Applied Biosystems) ili brzom SYBR zelenom (Qiagen) tehnologijom koristeći StepOnePlusTM (Applied Biosystems) tokom 40 ciklusa. Podaci o eksprimiranju su normalizovani do nivoa eksprimiranja GAPDH mRNK, i postupak 2-ΔΔCt se koristi za izračunavanje stepena promene. Brzo zaleđeni bubrezi se podvrgavaju kiseloj hidrolizi zagrevanjem u 6M HCI u koncentraciji od 50 mg/ml (95°C, 20 sati). Količina ukupnog kolagena u hidrolizatu se kvantifikuje na osnovu kolorimetrijskog detektovanja hidroksiprolina pomoću QuickZyme Total Collagen test kompleta (QuickZyme Biosciences) prema uputstvima proizvođača.
4
[0469] Miševi tretirani mamac IL-11 receptorima imaju smanjeni fibrotički odgovor u bubrežnom tkivu u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim nosačem/netretiranim, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
17.3 Fibroza pluća
[0470] Miš se tretira intratrahealnom primenom bleomicina na dan 0 za utvrđivanje fibrotičkog odgovora u plućima (plućna fibroza).
[0471] Mamac IL-11R receptori D1R1 ili D11R2 se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Miševi se žrtvuju na dan 21, i analiziraju se za razlike u markerima fibroze.
[0472] Miševi tretirani mamac IL-11 receptorima imaju smanjeni fibrotički odgovor u plućnom tkivu u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim nosačem/netretiranim, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
17.4 Fibroza kože
[0473] Miši tretiraju subkutanom primenom bleomicina na dan 0 kako bi se uspostavio fibrotički odgovor na koži.
[0474] Mamac IL-11R receptori D1R1 ili D11R2 se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama. Miševi se žrtvuju na dan 21. i analiziraju se za razlike u markerima fibroze.
[0475] Miševi tretirani mamac IL-11 receptorima imaju smanjeni fibrotički odgovor u kožnom tkivu u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim nosačem/netretiranim, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
17.5 Fibroza očiju
[0476] Miševi prolaze proceduru trabekuektomije kako je opisano u primeru 75 iznad, kako bi se inicirala reakcija zarastanja rana u oku.
[0477] Mamac IL-11R receptori D1R1 ili D11R2 se daju različitim grupama miševa intravenskim injekcijama, i fibroza se prati u očnim tkivima.
[0478] Miševi tretirani mamac IL-11 receptorima imaju smanjeni fibrotički odgovor u očnom tkivu u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim nosačem/netretiranim, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
17.6 Ostala tkiva
[0479] Efekat lečenja mamac IL-11 receptorima na fibrozu je takođe analiziran u mišjim modelima fibroze za druga tkiva, kao što su jetra, bubrege, creva i takođe se analizira u modelu koji se odnosi na višeorgansku (tj. sistemsku) fibrozu.
[0480] Fibrotički odgovor se meri i upoređuje između miševa tretiranih mamac IL-11 receptorima i netretiranih miševa, ili kontrolama tretiranim sa nosačem. Miševi tretirani mamac IL-11 receptorima imaju smanjeni fibrotički odgovor u kožnom tkivu u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim nosačem/netretiranim, što je potvrđeno smanjenim eksprimiranjem markera fibroze.
Primer 18: Genetski biomarkeri za IL-11 odgovor
[0481] Pored merenja IL-11 proteina kao potencijalnog biomarkera za fibrozu, razvili smo analizu koja može predvideti status lučenja IL-11 kod ljudi. Ovaj test se može koristiti kao prateća dijagnostika u kliničkim studijama vezanim za IL-11.
[0482] Prvo smo generisali RNK-seq podatke (Slika 16) i odredili genotip 69 etnički prilagođenih (kineskih) pojedinaca u kohortu koristeći SNP niz na osnovu hibridizacije fluorescentne sonde dobijen od Illumina ( HumanOmniExpress 24).
[0483] Zatim smo izvršili eQTL analizu širokog spektra vezivanja za procenu da li pojedinačni nukleotidni polimorfizmi (SNPs) utiču na nivoe RNK transkripta od IL-11 ili IL-11RA u nestimulisanim fibroblastima, u fibroblastima stimulisanim sa TGFB1 (5ng/ml, 24 sata). Takođe smo testirali da li je povećanje IL-11 po stimulaciji TGFβ1 (= odgovor) zavisilo od genotipa.
4
[0484] U početku smo kvantifikovali pročitan broj za IL-11 i IL-11RA kod svih pojedinaca i transformisali ove tačke korišćenjem pristupa varijansne stabilizacije (VST) DESeq2 postupka (Love i dr., Genome Biology 201415:550). Zatim smo razmotrili eksprimiranje IL-11 i IL-11RA u ne-stimulisanim (VSTunstim) i stimulisanim (VSTstim) ćelijama. Kako bismo procenili porast IL-11, izračunali smo i delta u eksprimiranju kao VSTstim- VSTunstim. Pre analiza smo korigovali vrednosti eksprimiranja pomoću kovarijata kao što je serija biblioteke za sekvenciranje RNK, RNK RIN ocena kvaliteta , koncentracija biblioteke, veličina fragmenta biblioteke, starost, pol. SNP i eksprimiranje transkripta, ili delta eksprimiranje, parovi su analizirani pomoću matričnog pristupa eQTL (Andrey A. Shabalin., Bioinformatics 2012 May 15; 28(10): 1353-1358).
[0485] Nismo opazili varijacije cis ili trans što je značajno uticalo na eksprimiranje IL-11 u nestimulisanim ćelijama. Međutim, detektovali smo udaljene SNP koje su regulisale izraz u stimulisanim = fibroznim fibroblastima. Ove varijante stratifikuju populaciju između pojedinaca koji eksprimiraju nizak nivo IL-11 i onih koji eksprimiraju visoke količine IL-11 kod fibroze. Takođe smo otkrili lokalne i udaljene varijante koje su predvidele povećanje eksprimiranja IL-11 kao odgovor na TGFβ1. Ove varijante mogu se koristiti za stratifikaciju pojedinaca na visoke i niske reakcije kod fibroze.
[0486] Identifikovane SNP su prikazane na Slikama 33 do 35, i prateći podaci su prikazani na Slikama 36 i 37.
4
1
2
4
1
2
4
1

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje je sposobno da se veže za Interleukin 11 (IL-11) ili IL-11 receptor α (IL-11Rα) i inhibira signalizaciju posredovanu sa IL-11, za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze kod ljudi.
2. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema patentnom zahtevu 1, gde je antitelo sposobno da spreči ili smanji vezivanje IL-11 za IL-11 receptor.
3. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je antitelo IL-11 vezujuće antitelo.
4. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je antitelo IL-11Rα vezujuće antitelo.
5. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, gde je fibroza srca, jetre, bubrega ili oka.
6. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, gde je fibroza u srcu, i povezana je sa disfunkcijom muskulature ili električnim svojstvima srca, ili zadebljavanjem zidova ili ventila srca.
7. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, gde je fibroza u jetri, i povezana je sa hroničnom bolesti jetre i cirozom jetre.
8. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, gde je fibroza u bubregu, i povezana je sa hroničnom bolesti bubrega.
9. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, gde je fibroza u oku, i može biti retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, subretinalna fibroza.
10. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 9, gde postupak tretmana ili prevencije fibroze obuhvata primenu navedenog antitela pacijentu kod kog je IL-11 ili IL-11R eksprimiranje regulisano na gore.
11. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 10, gde postupak tretmana ili prevencije fibroze obuhvata primenu navedenog antitela pacijentu kod kog je utvrđeno da je IL-11 ili IL-11R eksprimiranje regulisano na gore.
12. Antitelo za primenu u postupku tretmana ili prevencije fibroze prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 11, gde postupak tretmana ili prevencije fibroze obuhvata određivanje da li je IL-11 ili IL-11R eksprimiranje regulisano na gore kod pacijenta, primena navedenog antitela pacijentu kod kog je IL-11 ili IL-11R eksprimiranje regulisano na gore.
2
RS20181140A 2015-12-16 2016-12-16 Tretman fibroze RS57894B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1522186.4A GB201522186D0 (en) 2015-12-16 2015-12-16 Treatment of fibrosis
EP16822941.7A EP3298040B1 (en) 2015-12-16 2016-12-16 Treatment of fibrosis
PCT/EP2016/081430 WO2017103108A1 (en) 2015-12-16 2016-12-16 Treatment of fibrosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57894B1 true RS57894B1 (sr) 2019-01-31

Family

ID=55274842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181140A RS57894B1 (sr) 2015-12-16 2016-12-16 Tretman fibroze

Country Status (24)

Country Link
US (16) US10035852B2 (sr)
EP (7) EP3431498A1 (sr)
JP (2) JP6753933B2 (sr)
KR (2) KR102720360B1 (sr)
CN (2) CN108495861B (sr)
AU (7) AU2016369407B2 (sr)
CA (1) CA3007750A1 (sr)
CY (1) CY1120950T1 (sr)
DK (1) DK3298040T3 (sr)
ES (1) ES2692773T3 (sr)
GB (1) GB201522186D0 (sr)
HR (1) HRP20181692T1 (sr)
HU (1) HUE041433T2 (sr)
LT (1) LT3298040T (sr)
NZ (1) NZ744307A (sr)
PL (1) PL3298040T3 (sr)
PT (1) PT3298040T (sr)
RS (1) RS57894B1 (sr)
SG (2) SG10201908380TA (sr)
SI (1) SI3298040T1 (sr)
SM (1) SMT201800601T1 (sr)
TR (1) TR201815415T4 (sr)
WO (1) WO2017103108A1 (sr)
ZA (1) ZA201803727B (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201522186D0 (en) 2015-12-16 2016-01-27 Singapore Health Services Pte Ltd And Nat University Of Singapore The Treatment of fibrosis
US20180186871A1 (en) 2016-12-16 2018-07-05 Singapore Health Services Pte Ltd. Il-11 antibodies
GB201621439D0 (en) 2016-12-16 2017-02-01 Singapore Health Services Pte Ltd And Nat Univ Of Singapore IL-11Ra Antibodies
GB201716733D0 (en) * 2017-10-12 2017-11-29 Nat Univ Singapore Treatment of SMC mediated disease
GB201806918D0 (en) * 2018-04-27 2018-06-13 Enleofen Bio Pte Ltd Combination treatment for eye fibrosis
GB201809699D0 (en) * 2018-06-13 2018-08-01 Singapore Health Serv Pte Ltd IL-11 antibodies
GB201809700D0 (en) * 2018-06-13 2018-08-01 Singapore Health Serv Pte Ltd IL-11 antibodies
KR20210138579A (ko) 2019-01-21 2021-11-19 싱가포르 헬스 서비시즈 피티이 엘티디 간독성의 치료
GB201902419D0 (en) 2019-02-22 2019-04-10 Singapore Health Serv Pte Ltd Treatment of kidney injury
US11813311B2 (en) 2019-05-03 2023-11-14 Singapore Health Services Pte Ltd. Treatment and prevention of metabolic diseases
GB201906291D0 (en) 2019-05-03 2019-06-19 Singapore Health Serv Pte Ltd Treatment and prevention of metabolic diseases
EP4009971A1 (en) * 2019-08-05 2022-06-15 Novocure GmbH Increasing cancer cells' sensitivity to tumor treating fields (ttfields) by inhibiting il11 activity
KR102270700B1 (ko) * 2019-11-01 2021-06-30 한국과학기술연구원 폐 섬유증의 예방 또는 치료를 위한 올리고뉴클레오티드 중합체와 생체 적합성 양이온성 펩타이드로 이루어지는 폐 특이적 약물 전달체 및 이의 이용
GB202009292D0 (en) 2020-06-18 2020-08-05 Singapore Health Serv Pte Ltd Treatment and prevention of disease caused by type IV collagen dysfunction
JP2023537422A (ja) * 2020-08-13 2023-08-31 サンシャイン・レイク・ファーマ・カンパニー・リミテッド Ｉｌ－１１の抗体及びその使用
GB202017244D0 (en) 2020-10-30 2020-12-16 Nat Univ Singapore Methods to extend health-span and treat age-related diseases
CA3211686A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Bayer Aktiengesellschaft Inhibitors of il-11 or il-11ra for use in the treatment of abnormal uterine bleeding
US20250092126A1 (en) 2021-07-26 2025-03-20 Boehringer Ingelheim International Gmbh Treatment and prevention of alcoholic liver disease
AU2022339767A1 (en) 2021-08-30 2024-04-11 Lassen Therapeutics, Inc. Anti-il-11rα antibodies
CN115068442A (zh) * 2021-09-13 2022-09-20 荣灿生物医药技术(上海)有限公司 核酸的纳米颗粒组合物、其制备方法和用途
US20250082608A1 (en) 2021-12-16 2025-03-13 Singapore Health Services Pte Ltd. Treatment and prevention of glomerular disease
CN115414346B (zh) * 2022-08-29 2023-09-29 湖南复瑞生物医药技术有限责任公司 一种应用胺碘酮构造肺纤维化模型的方法
GB202218388D0 (en) 2022-12-07 2023-01-18 Vvb Bio Pte Ltd GP130 antigen-binding molecules
WO2024225979A1 (en) 2023-04-25 2024-10-31 Vvb Bio Pte Ltd Anti il-11 antibody
CN119080927B (zh) * 2023-06-05 2025-06-24 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种结合il-11的抗体、其抗原结合片段及应用
GB202311050D0 (en) 2023-07-19 2023-08-30 Vvb Bio Pte Ltd GP130 antigen-binding molecules
CN117085137A (zh) * 2023-10-10 2023-11-21 上海交通大学医学院附属第九人民医院 Il-11抑制剂及其在抗瘢痕治疗中的应用
CN117964734B (zh) * 2024-03-04 2025-12-26 四川大学 一种重组人白介素-11突变体及其与化学分子偶联缀合物和其制备方法与应用
GB202405551D0 (en) 2024-04-19 2024-06-05 Vvb Bio Pte Ltd Combination treatment
GB202408044D0 (en) 2024-06-06 2024-07-24 Vvb Bio Pte Ltd gp130 antigen-binding molecules

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2084987C (en) 1990-06-11 2007-02-13 Larry Gold Nucleic acid ligands
CA2208457A1 (en) 1994-12-22 1996-06-27 Genetics Institute, Inc. Human interleukin-11 receptor
ES2093562B1 (es) 1995-05-26 1997-07-01 Univ Santiago Compostela Estabilizacion de sistemas coloidales mediante formacion de complejos ionicos lipido-polisacarido.
US6126933A (en) 1995-06-27 2000-10-03 Genetics Institute Methods of treating inflammatory bowel diseases by administering IL-11
US5679339A (en) 1995-06-27 1997-10-21 Keith; James Method of using IL-11 for treating spondyloarthropies
US6540993B1 (en) 1995-06-27 2003-04-01 Wyeth Method of treating inflammatory bowel disease using a topical formulation of IL-11
US6649192B2 (en) 1996-07-29 2003-11-18 Universidade De Santiago De Compostela Application of nanoparticles based on hydrophilic polymers as pharmaceutical forms
GB9702944D0 (en) * 1997-02-13 1997-04-02 Univ Manchester Reducing fibrosis
GB9721961D0 (en) 1997-10-16 1997-12-17 Glaxo Group Ltd Novel molecules
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
CA2237915A1 (en) 1998-05-19 1999-11-19 Stephen Shaughnessy Osteoporosis treatment
US6953777B2 (en) 1999-03-11 2005-10-11 Genetics Indtitute LLC Use of interleukin-11 to prevent immune-mediated cytotoxicity
AU5756100A (en) * 1999-06-21 2001-01-09 Genetics Institute Inc. Treatment of fibrosis by antagonism of il-13 and il-13 receptor chains
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB0021668D0 (en) 2000-09-04 2000-10-18 Smithkline Beecham Plc New use
AU2002362088A1 (en) 2001-12-06 2003-06-23 Catholic University Method and composition for inducing weight loss
BR0314356A (pt) 2002-09-16 2005-07-19 Wyeth Corp Formulações de liberação retardada para administração oral de um agente terapêutico polipetìdeo e métodos utilizando as mesmas
EP1709074A4 (en) 2003-12-16 2008-06-11 Commw Scient Ind Res Org CYTOKIN BINDING DOMAINS
US20060019890A1 (en) 2004-01-15 2006-01-26 Kapoun Ann M Method for treating cardiac remodeling following myocardial injury
WO2005098041A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 University Of Florida Research Foundation, Inc. Detection and treatment of fibrotic disorders
ES2309427T3 (es) 2004-08-27 2008-12-16 Conaris Research Institute Ag Secuencias de nucleotidos optimizidas que codifican para sgp130.
WO2007067602A1 (en) 2005-12-06 2007-06-14 Wyeth Interleukin-11 compositions and methods of use
AU2007271734B2 (en) 2006-07-05 2012-03-29 Certa Therapeutics Pty. Ltd. Therapeutic compounds
US8361966B2 (en) * 2006-10-27 2013-01-29 Osaka University Use of interleukin-11 as therapeutic agent for heart disease
WO2009033743A1 (en) * 2007-09-13 2009-03-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
ES2536877T3 (es) 2007-10-26 2015-05-29 Csl Limited Muteínas de citocina
US8182814B2 (en) 2007-10-26 2012-05-22 Csl Limited Methods of treating inflammatory airway conditions by inhibition of IL-11 activity
US8518888B2 (en) 2008-10-14 2013-08-27 Csl Limited Method of treatment of gastrointestinal-type cancer with antagonistic antibodies to IL-11R
KR101133769B1 (ko) 2011-04-18 2012-04-09 한국생명공학연구원 신규한 옥사졸리딘계 및 인돌계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물
JP6545105B2 (ja) 2013-02-07 2019-07-17 シーエスエル、リミテッド Ｉｌ−１１ｒ結合タンパク質及びその使用
CN105497893B (zh) 2015-12-10 2019-02-01 黑龙江省科学院高技术研究院 IL-11单克隆抗体在抑制PI3K/Akt信号通路中的应用
GB201522186D0 (en) 2015-12-16 2016-01-27 Singapore Health Services Pte Ltd And Nat University Of Singapore The Treatment of fibrosis
RU2016125115A (ru) 2016-06-23 2017-12-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологического приборостроения с опытным производством Российской Академии наук (ИБП РАН) Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов
GB201621439D0 (en) 2016-12-16 2017-02-01 Singapore Health Services Pte Ltd And Nat Univ Of Singapore IL-11Ra Antibodies
US20180186871A1 (en) 2016-12-16 2018-07-05 Singapore Health Services Pte Ltd. Il-11 antibodies
GB201621431D0 (en) 2016-12-16 2017-02-01 Singapore Health Services Pte Ltd And Nat Univ Of Singapore The Decoy cytokine receptor
RU2016151730A (ru) 2016-12-28 2018-06-29 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологического приборостроения с опытным производством Российской Академии наук (ИБП РАН) Антитела для лабораторной диагностики концентрации интерлейкина-11
GB201716733D0 (en) 2017-10-12 2017-11-29 Nat Univ Singapore Treatment of SMC mediated disease
NL2020093B1 (en) 2017-12-15 2019-06-25 Stahl Int B V Process for producing aqueous polyurethane dispersions in a continuous manner; apparatus suitable for performing such a process; and products obtained by said process
GB201806918D0 (en) 2018-04-27 2018-06-13 Enleofen Bio Pte Ltd Combination treatment for eye fibrosis
GB201809700D0 (en) 2018-06-13 2018-08-01 Singapore Health Serv Pte Ltd IL-11 antibodies
GB201809699D0 (en) 2018-06-13 2018-08-01 Singapore Health Serv Pte Ltd IL-11 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
EP3431500A1 (en) 2019-01-23
US10822405B2 (en) 2020-11-03
ZA201803727B (en) 2019-03-27
US20180371077A1 (en) 2018-12-27
JP7102474B2 (ja) 2022-07-19
KR20180097645A (ko) 2018-08-31
US20180362641A1 (en) 2018-12-20
AU2018229484A1 (en) 2018-10-04
CY1120950T1 (el) 2019-12-11
EP3431499A1 (en) 2019-01-23
US20240360211A1 (en) 2024-10-31
US10894825B2 (en) 2021-01-19
HUE041433T2 (hu) 2019-05-28
EP3428186A1 (en) 2019-01-16
AU2018229484B9 (en) 2019-09-12
US11939374B2 (en) 2024-03-26
AU2018229484B2 (en) 2019-08-08
LT3298040T (lt) 2018-12-10
US10035852B2 (en) 2018-07-31
JP6753933B2 (ja) 2020-09-09
AU2018229482B2 (en) 2019-08-08
GB201522186D0 (en) 2016-01-27
US20180362639A1 (en) 2018-12-20
US20180362635A1 (en) 2018-12-20
DK3298040T3 (en) 2018-11-05
JP2019502689A (ja) 2019-01-31
US10894827B2 (en) 2021-01-19
US10865241B2 (en) 2020-12-15
US20210188962A1 (en) 2021-06-24
CN108495861B (zh) 2023-01-10
HK1254287A1 (zh) 2019-07-19
AU2016369407B2 (en) 2018-09-13
US20180362634A1 (en) 2018-12-20
US20180362640A1 (en) 2018-12-20
AU2018229483B2 (en) 2019-08-08
US10899832B2 (en) 2021-01-26
WO2017103108A1 (en) 2017-06-22
AU2018229487A1 (en) 2018-10-04
US20170174759A1 (en) 2017-06-22
SMT201800601T1 (it) 2019-01-11
US10894826B2 (en) 2021-01-19
AU2018229485A1 (en) 2018-10-04
EP3431498A1 (en) 2019-01-23
CN108495861A (zh) 2018-09-04
AU2018229486A1 (en) 2018-10-04
NZ744307A (en) 2019-03-29
US20180265579A1 (en) 2018-09-20
US20180371078A1 (en) 2018-12-27
KR102720360B1 (ko) 2024-10-22
EP3428188A1 (en) 2019-01-16
SG11201804836RA (en) 2018-07-30
AU2018229482A1 (en) 2018-10-04
CN116036284A (zh) 2023-05-02
US10865240B2 (en) 2020-12-15
US20180362637A1 (en) 2018-12-20
KR20240152973A (ko) 2024-10-22
AU2018229483A1 (en) 2018-10-04
PT3298040T (pt) 2018-11-13
EP3298040B1 (en) 2018-08-01
AU2018229485B2 (en) 2019-08-08
AU2018229487B2 (en) 2019-08-08
CA3007750A1 (en) 2017-06-22
US20180362633A1 (en) 2018-12-20
US10106603B2 (en) 2018-10-23
PL3298040T3 (pl) 2019-07-31
HRP20181692T1 (hr) 2018-12-14
US20180362636A1 (en) 2018-12-20
SI3298040T1 (sl) 2019-01-31
US10870696B2 (en) 2020-12-22
US10927169B2 (en) 2021-02-23
ES2692773T3 (es) 2018-12-05
US20180362638A1 (en) 2018-12-20
US20190002553A1 (en) 2019-01-03
EP3428187A1 (en) 2019-01-16
US10870697B2 (en) 2020-12-22
EP3298040A1 (en) 2018-03-28
US10889642B2 (en) 2021-01-12
AU2018229486B2 (en) 2019-08-08
TR201815415T4 (tr) 2018-11-21
US10865239B2 (en) 2020-12-15
AU2016369407A1 (en) 2018-08-02
JP2020189879A (ja) 2020-11-26
SG10201908380TA (en) 2019-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240360211A1 (en) Treatment of fibrosis