[go: up one dir, main page]

RS57446B1 - Peptidi i kompozicije za lečenje oštećenja zgloba - Google Patents

Peptidi i kompozicije za lečenje oštećenja zgloba

Info

Publication number
RS57446B1
RS57446B1 RS20180794A RSP20180794A RS57446B1 RS 57446 B1 RS57446 B1 RS 57446B1 RS 20180794 A RS20180794 A RS 20180794A RS P20180794 A RSP20180794 A RS P20180794A RS 57446 B1 RS57446 B1 RS 57446B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
polypeptide
amino acid
angptl3
amino acids
Prior art date
Application number
RS20180794A
Other languages
English (en)
Inventor
Kristen Johnson
Jian Shi
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of RS57446B1 publication Critical patent/RS57446B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1891—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/59—Compounds containing 9, 10- seco- cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems
    • A61K31/593—9,10-Secocholestane derivatives, e.g. cholecalciferol, i.e. vitamin D3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A61K38/014—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from connective tissue peptides, e.g. gelatin, collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/225—Calcitonin gene related peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/17—Angiopoietin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Opis
POVEZANE PRIJAVE
[0001] OVA PRIJAVA SE POZIVA NA PRIORITET I PREDNOST PRIVREMENE AMERIČKE PATENTNE PRIJAVE BR. 61/775,400, PODNETE 8. MARTA 2013, I PRIVREMENE AMERIČKE PATENTNE PRIJAVE BR. 61/938,123, PODNETE 10. FEBRUARA 2014.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Osteoartritis (OA) predstavlja najčešći mišićnoskeletalni poremećaj. Približno 40 miliona Amerikanaca je trenutno pogodjeno; predvidja se da će se taj broj povećati na 60 miliona tokom sledećih dvadeset godina kao rezultat starenja populacije i povećanja očekivanog životnog veka, čineći ga četvrtim vodećim uzrokom invalidnosti. OA se odlikuje sporim degenerativnim propadanjem zgloba uključujući i zglobnu hrskavicu (koja sadrži ćelije i matriks koji obezbedjuje podmazivanje i oblaganje zgloba) i subhondralnu kost koja leži ispod zglobne hrskavice. OA može da se smatra posledicom različitih etioloških faktora. Na primer, može da bude izazvan abnormalnim biomehaničkim stresom, ili genetskim ili stečenim abnormalnostima zglobne hrskavice ili kosti. Trenutne terapije za OA uključuju oslobadjanje od bola pomoću oralnih NSAID ili selektivnih inhibitora ciklooksigenaze 2 (COX-2), intra-artikularnu (IA) injekciju sredstava kao što su kortikosteroidi i hijaluronan, i hirurške pristupe.
[0003] Oštećenje zgloba, npr., akutna povreda zgloba, kao što je kidanje meniskusa ili ligamenta, ili intra-artikularna fraktura može takodje da vodi artritisu, npr., posttraumatskom artritisu. Budući da zglobna hrskavica ima ograničenu sposobnost oporavka, čak i neprimetno oštećenje može često da se pogorša tokom vremena i dovede do OA. Savremeno lečenje povrede zgloba može da uključuje hirurško lečenje i druge invazivne postupke usmerene na regeneraciju oštećenih zglobova, kao i lečenje sredstvima za smanjenje bola i zapaljenja.
[0004] Mezenhimske matične ćelije (MSC) su prisutne u adultnoj zglobnoj hrskavici i nakon izolovanja mogu da budu programirane in vitro da podlegnu diferencijaciji u hondrocite i druge mezenhimske ćelijske linije, i mogu da se koriste za regeneraciju hrskavice. Delimično, proces je regulisan faktorima rasta (TGFβ, BMP), serumskim uslovima i kontaktom ćelija-ćelija. WO2011/008773 opisuje peptidne kompozicije i upotrebu ovih kompozicija u lečenju ili prevenciji artritisa i povrede zgloba i za indukciju diferencijacije mezenhimskih ćelija u hondrocite. Dodatno, WO2012/129562 opisuje jedinjenja malog molekula, kompozicije i upotrebu ovih kompozicija za ublažavanje artritisa i povrde zgloba i za indukciju diferencijacije mezenhimskih ćelija u hondrocite.
[0005] Iako su hirurške tehnike i regenerativna tehnologija napravile izvestan napredak u obnavljanju hrskavice, usporavanju degeneracije, i poboljšale popravku oštećenja zgloba, postoji neprekidna potreba za poboljšanjem kompozicija i postupaka za efikasnu regeneraciju hrskavice, lečenje oštećenja zgloba i pobpljšanje ili sprečavanje pojave OA.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na identifikaciju novih varijanti polipeptida i proteina angiopoetinu-sličnog polipeptida 3 (ANGPTL3), koje imaju poboljšana farmaceutska svojstva, npr., koje su stabilnije, manje podložne proteolizi i enzimskoj razgradnji nego divlji tip ANGPTL3. Takodje su obezbedjene farmaceutske kompozicije i postupci za lečenje oštećenja zgloba ili povrede zgloba, i postupci za ublažavanje ili sprečavanje pojave artritisa, oštećenja zgloba ili povrede zgloba kod sisara.
[0007] Prema tome, obezbedjeni su polipeptidi otporni na proteazu koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti aminokiselinske sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od bilo koje ili više sekvenci iz TABELE 1, gde polipeptidi sadrže aminokiselinu koja je polarna aminokiselina različita od K ili R na položaju 423, odredjeno u odnosu na celokupnu dužinu polipeptidne sekvence ANGPTL3, SEQ ID NO:1. U nekim primerima izvodjenja aminokiselina na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, je Q ili S. U odredjenim primerima izvodjenja, aminokiselina na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, je Q. U odredjenim primerima izvodjenja, aminokiselina na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, je S. U odredjenim primerima izvodjenja, aminokiselina na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, je deletirana. Pored toga, obezbedjeni polipeptidi imaju hondrogenu aktivnost.
[0008] U nekim primerima izvodjenja, obezbedjeni polipeptid sadrži sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70. U nekim primerima izvodjenja polipeptid sadrži sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid sadrži bilo koju od sekvenci iz TABELE 1. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid sadrži bilo koju od SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70. U nekim primerima izvodjenja polipeptid sadrži bilo koju od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid je bilo koja od sekvenci iz TABELE 1. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid je bilo koja od SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70. U nekim primerima izvodjenja polipeptid je bilo koja od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64.
[0009] Polipeptidi prema pronalasku mogu da budu PEG-ilovani. U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi prema pronalasku mogu da sadrže heterologi peptid kao fuzioni protein, koji može izborno da bude fuzionisan na amino-kraju ili na karboksi-kraju polipeptida, pri čemu je polipeptid fuzionisan sa bilo kojim od humanog serum albumina (HSA), konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina (Fc), polihistidina, glutation S transferaze (GST), tioredoksina, proteina A, proteina G, ili maltozavezujućeg proteina (MBP), ili njihovog fragmenta. Takodje su obezbedjeni polinukleotidi koji kodiraju polipeptide prema pronalasku; vektori koji sadrže polinukleotide koji kodiraju polipeptide; i ćelije-domaćini koje sadrže takve vektore.
[0010] Predmetni pronalazak takodje obezbedjuje farmaceutske kompozicije koje sadrže polipeptide prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Takve kompozicije mogu da se koriste u lečenju, poboljšanju ili sprečavanju artritisa ili oštećenja zgloba kod pacijenta. Primeri stanja kod kojih može biti koristi od takvih postupaka uključuju, ali nisu ograničeni na artritis (npr., osteoartritis, traumatski artritis), i oštećenje zgloba (npr., akutna povreda zgloba).
[0011] Obezbedjene upotrebe uključuju lečenje subjekta koji ima, ili ima rizik od pojave oštećenja zgloba i/ili artritisa, koje obuhvata primenu kod subjekta terapijski efikasne količine jednog ili više polipeptida prema pronalasku ili njihove farmaceutske kompozicije. Dalje su obezbedjeni inventivni polipeptidi za upotrebu u postupcima indukcije diferencijacije mezenhimskih matičnih ćelija u hondrocite.
[0012] Ovi i drugi aspekti prema pronalasku, uključujući dodatna svojstva, prednosti, i primere izvodjenja prema pronalasku, biće opisani i objašnjeni sa više detalja u detaljnom opisu koji sledi i priloženim patentnim zahtevima pronalaska.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0013]
Slika 1 šematski prikazuje hANGPTL3 proteine konstruisane da poboljšaju stabilnost proteina i povećaju proteolitičku otpornost. Tokom proizvodnje proteina sa proteinskim i peptidnim sekvencama divljeg tipa, zapaženo je 100% sečenja izmedju Lys423 i Ser424. Za smanjivanje proteolize, stvoreni su različiti mutantni peptidi u kojima je Lys 423 mutatiran u Gln ili Ser; ili je Ser424 mutatiran u Thr; ili je Lys 423 deletiran.
Slika 2A i B predstavlja grafičke prikaze ekspresije proteina specifičnih za hrskavicu u prisustvu ili odsustvu ANGPTL3 i konstrukata dobijenih genetskim inženjeringom. Fiksirane ćelije su obojene za 2A kvantitativno odredjivanje prokolagena tipa 2A (PIIANP) ili 2B kvantitativno odredjivanje kolagena tipa II da bi se odredio % ćelija koje diferenciraju u hondrocite nakon obrade kao što je opisano u primerima. Slika 2C prikazuje grafički prikaz kvantitativnog odredjivanja u ogledu angiogeneze u prisustvu ili odsustvu ANGPTL3 ili konstrukata dobijenih genetskim inženjeringom, u poredjenju sa proteinom koji predstavlja pozitivnu kontrolu, bFGF. Ukupna dužina krvnog suda i broj tačaka grananja su predstavljale kvantitativne mere angiogeneze. Iako su drugi autori prijavili angiogenu aktivnost kod ANGPTL3, i ovo ispitivanje potvrdjuje aktivnost sličnu onoj kod FGF; rezultati su ukazali na to da značajna aktivnost nije zadržana u C-terminalnom ANGPTL3 konstruktu.
Slika 3 daje grafičke prikaze koji pokazuju povećanje ekspresije specifičnih proteina hrskavice u prisustvu ANGPTL3 ili konstrukata dobijenih genetskim inženjeringom. 3A. Ćelije su procenjivane deset dana nakon tretmana upotrebom qRT-PCR za merenje ekspresije RNK za specifične proteine hrskavice posle tretmana kao što je opisano. Lubricin, agrekan i Sox9 predstavljaju proteine povezane sa hrskavicom; IGF i IFITM1 predstavljaju potencijal diferencijacije, a osteokalcin i kolagen tipa X predstavljaju proteine srodne kostno/fibroznim proteinima. 3B. Ćelije su procenjivane tri dana nakon tretmana kao što je opisano. Povišena ekspresija agrekana je primećena nakon tretmana polipeptidom C-terminalnog regiona konstrukta dobijenog genetskim inženjeringom ili ANGPTL1 divljeg tipa.
Slika 4 predstavlja grafički prikaz aktivnosti ANGPTL3 i konstrukata dobijenih genetskim inženjeringom u zaštiti hrskavice. 4A: Oslobadjanje glikozaminoglikana (GAG), indikatora oštećenja matriksa, inhibirano je rastućom količinom ANGPTL3 i mutantnih konstrukata. Ex vivo ogledi inhibicije oslobadjanja GAG (indikator oštećenja matriksa) izvedeni su korišćenjem govedje hrskavice tretirane u prisustvu ili odsustvu konstrukata kao što je opisano. 4B i 4C: Oslobadjanje NO je inhibirano rastućom količinom ANGPTL3 i konstrukata dobijenih genetskim inženjeringom kao što je naznačeno. Hondrociti su tretirani u prisustvu ili odsustvu konstrukata kao što je opisano, što je praćeno ogledima sa Greiss-ovom reakcijom za odredjivanje inhibicije oslobadjanja NO kao indikatora zaštite hrskavice.
Slika 5 predstavlja grafički prikaz koji pokazuje inhibiciju ekspresije kolagena tipa X (indikatora aktivnosti obrazovanja fibrozne hrskavice) u prisustvu konstrukata pod hipertrofičkim uslovima. Primarni hondrociti su tretirani u prisustvu ili odsustvu konstrukata pod hipertrofičkim uslovima kao što je opisano, nakon čega je odredjena ekspresija kolagena tipa X, procenjena imunofluorescencijom, kao mera obrazovanja fibrozne i hipertrofičke hrskavice/diferencijacije hondrocita. 5A prikazuje rezultate C-terminalnog ANGPTL3 divljeg tipa ili genetski konstruisanog konstrukta. 5B prikazuje rezultate C-terminalnog ANGPTL3 (WT) ili konstrukata dobijenih genetskim inženjeringom 242KQ ili 242Kdel ili C-terminalnog ANGPTL1.
Slika 6 predstavlja šematski prikaz paradigme doziranja (6A), praćen grafičkim prikazom (6B) umanjenja stepena ozbiljnosti oboljenja zgloba posle lečenja mišjim ANGPTL3 (17-460) mereno pomoću ocenjivanja erozije hrskavice lateralnog femoralnog kondila.
Slika 7. predstavlja grafički prikaz merenja nesposobnosti (indikator bola) kod miševa nakon hirurškog izazivanja oštećenja hrskavice i sledstvenog lečenja sa ANGPTL3-konstruktima jednom nedeljno tokom tri nedelje (počevši od 7. dana).7A predstavlja merenja nesposobnosti 35. dana nakon hirurške intervencije; i 7B predstavlja merenja uradjena 56. dana nakon hirurške intervencije.
Slika 8. predstavlja grafički prikaz ocenjivanja ukupnog stepena ozbiljnosti oboljenja zgloba i poboljšanja stepena ozbiljnosti oštećenja hrskavice indukovanog kolagenazom kod miševa nakon 3 tretmana jednom nedeljno (dani 7, 14 i 21) ANGPTL3-konstruktima (naznačeno).
Slika 9. prikazuje rezultate oštećenja zgloba u modelu kidanja meniskusa pacova nakon tretmana genetski konstruisanim ANGPTL3-konstruktom. Slika 9A predstavlja grafički prikaz sadržaja proteoglikana u zglobovima pet nedelja nakon tretmana; Slika 9B predstavlja grafički prikaz rezultata ocenjivanja stepena ozbiljnosti femoralnog zgloba pet nedelja nakon tretmana. Rezultati ilustruju poboljšanje oštećenja hrskavice indukovanog hirurškim odvajanjem meniskusa kod pacova nakon 3 tretmana jednom nedeljno (dani 7, 14 i 21) ANGPTL3-konstruktima (naznačeno).
Slika 10 prikazuje rezultate oštećenja zgloba u modelu kidanja meniskusa pacova nakon tretmana genetski konstruisanim ANGPTL3-konstruktom. Slika 10A predstavlja grafički prikaz procenta oporavka in vivo mereno prema stepenu ozbiljnosti, intenziteta safranina O, površine hrskavice i debljine hrskavice. Slika 10B predstavlja grafički prikaz merenja nesposobnosti (indikator bola) kod pacova nakon hirurškog izazivanja oštećenja hrskavice i tretmana nakon toga.
Slika 11 predstavlja grafički prikaz odredjivanja rezultata ukupnog bruto stepena ozbiljnosti kao ilustraciju poboljšanja oštećenja hrskavice izazvanog hirurškim razaranjem medijalnog meniskusa kod pasa nakon doziranja dva puta nedeljno počevši od 4. dana (svaka doza od 1.5 μg/dozi ili 15 μg/dozi), ili pojedinačna doza od 30 μg data samo 7. dana.
DETALJAN OPIS
[0014] Predmetni pronalazak se zasniva, bar delimično, na identifikaciji angiopoetinu-sličnih polipeptida 3 (ANGPTL3) koji stimulišu hondrocitnu diferencijaciju mezenhimskih matičnih ćelija i koji su otporni na sečenje proteazama (npr., proteazama sličnim tripsinu). WO2011/008773 opisuje kompozicije ANGPTL3 peptida i upotrebu peptidnih kompozicija za lečenje ili sprečavanje artritisa i povrede zgloba i za indukciju diferencijacije mezenhimskih ćelija u hondrocite. Mi smo pronašli da su ANGPTL3 proteini divljeg tipa podložni isecanju proteazom i nestabilnosti i identifikovali varijante sekvence kako bi ublažili ovaj efekat. Predmetni pronalazak tako obezbedjuje kompozicije poboljšanog peptida za oporavak hrskavice. Posebno, obezbedjeni su ANGPTL3 peptidi modifikovani prema predmetnom pronalasku tako da imaju povećanu otpornost na proteazu u poredjenju sa polipeptidom ANGPTL3 divljeg tipa. Takodje su obezbedjene kompozicije i upotrebe ovih kompozicija u lečenju, sprečavanju ili poboljšanju artritisa ili povrede zgloba primenom polipeptida prema pronalasku u zglob, tkivo hrskavice ili tkivo koje okružuje hrskavicu, ili sistematski. Osim toga, pronalazak obezbedjuje inventivne polipeptide za upotrebu u postupcima za indukciju diferencijacije mezenhimske matične ćelije u hondrocite.
Definicije
[0015] Izraz “otporan na proteazu”, kako je ovde korišćeno, odnosi se na polipeptid koji sadrži modifikaciju koja čini polipeptid manje podložnim na sečenje proteazom sličnom tripsinu od odgovarajućeg nemodifikovanog polipeptida divljeg tipa. Ovde su opisani ANGPTL3 polipeptidi otporni na proteazu koji imaju aminokiselinsku supstituciju, u odnosu na nativnu sekvencu peptida divljeg tipa, na R ili K ostatku.
[0016] “ANGPTL3” se odnosi na člana familije proteina angoipoetina. Aminokiselinska sekvenca ANGPTL3 (GenBank pristupni br. NP_055310.1) prikazana je u SEQ ID NO:1; i odgovarajuća polinukleotidna sekvenca koja je prikazana kao SEQ ID NO: 2 (NCBI referentni broj sekvence NM014495.2, gde sekvenca koja kodira ANGPTL3 sadrži nt 52-1434 iz SEQ ID NO:2). “ANGPTL3 polipeptid” se odnosi na eksprimirani polipeptid koji se javlja u prirodi. U svrhu predmetnog otkrića, numerisanje aminokiseline je tipično odredjeno u odnosu na celu dužinu sekvence humanog ANGPTL3 polipeptida divljeg tipa (SEQ ID NO:1). Tako, u primerima izvodjenja u kojima polipeptid prema pronalasku sadrži samo C-terminalni deo cele dužine ANGPTL3, ali ne i N-terminalni deo, iako je peptid dugačak manje od 460 aminokiselina, numerisanje položaja se zasniva na SEQ ID NO:1. Na primer, pozivanje na položaj 423 u ANGPTL3 polipeptidu prema pronalasku odnosi se na položaj 423 u SEQ ID NO:1, iako ANGPTL3 polipeptid prema pronalasku može da bude po sebi dugačak samo 200 aminokiselina. U odredjivanju aminokiseline u sekvenci od interesa koja “odgovara” položaju u referentnoj sekvenci, kao što je SEQ ID NO:1, ovo se sprovodi optimalnim poravnanjem sekvenci, npr., korišćenjem uobičajenih parametara poravnanja CLUSTAL ili uobičajenih parametara poravnanja BLAST 2 i poredjenjem sekvenci. Na primer, položaj 423 u sekvenci od interesa koji je “odredjen u odnosu na SEQ ID NO:1”, ili aminokiselina koja “odgovara” položaju 423 u SEQ ID NO:1, označava aminokiselinu koja se poravnava sa položajem 423 u SEQ ID NO:1 kada je sekvenca od interesa optimalno poravnata sa SEQ ID NO:1.
[0017] Pojmovi “peptidomimetik” i “mimetik” odnose se na sintetsko hemijsko jedinjenje koje ima suštinski ista funkcionalna svojstva kao polipeptid koji se javlja u prirodi, ili se ne javlja u prirodi (npr., ANGPTL3), ali drugačija (mada obično slična) strukturna svojstva. Peptidni analozi se uobičajeno koriste u ovoj oblasti kao nepeptidna aktivna jedinjenja (npr., lekovi) sa osobinama analognim onim kod uzorka peptida. Takva nepeptidna jedinjenja su označena kao "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici" (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); i Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)). Peptidni mimetici koji su strukturno slični sa terapeutski korisnim peptidima mogu da se koriste za proizvodnju ekvivalentnog ili poboljšanog terapijskog ili profilaktičkog dejstva. Uopšteno, peptidomimetici su strukturno slični paradigmi polipeptida (tj., polipeptidu koji ima biološku ili farmakološku aktivnost), kao što je pronadjeno kod polipeptida od interesa, ali imaju jednu ili više peptidnih veza izborno zamenjenih vezom odabranom iz grupe koja se sastoji od, npr., -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, i -CH2SO-. Mimetik može da bude ili u celini sačinjen od sintetskih, neprirodnih analoga aminokiselina, ili da bude himerni molekul delom od prirodnih peptidnih aminokiselina i delom od neprirodnih analoga aminokiselina. Mimetik može takodje da uključuje bilo koju količinu konzervativnih supstitucija prirodnih aminokiselina sve dok takve supstitucije suštinski ne menjaju strukturu i/ili aktivnost mimetika.
[0018] Pojmovi "polipeptid," "peptid" i "protein" se ovde koriste medjusobno zamenljivo da označe polimer aminokiselinskih ostataka. Pojmovi se primenjuju na polimere aminokiselina u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na polimere prirodnih aminokiselina i na polimere neprirodnnih aminokiselina. Polipeptidi, peptidi i proteini prema pronalasku sadrže ANGPTL3 peptidomimetike otporne na proteazu koji imaju hondrogenu aktivnost.
[0019] Pojam "aminokiselina" odnosi se na prirodne i sintetske aminokiseline, kao i na analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama. Prirodne aminokiseline su one koje su kodirane genetskim kodom, kao i one aminokiseline koje su naknadno modifikovane, npr., hidroksiprolin, ɣ-karboksiglutamat, i O-fosfoserin. Aminokiselinski analozi se odnose na jedinjenja koja imaju istu baznu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina, tj., α ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu, i R grupu, npr., homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (npr., norleucin) ili modifikovan peptidni skelet, ali zadržavaju istu baznu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina. Prirodno kodirane aminokiseline su 20 uobičajenih aminokiselina (alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin) kao i pirolizin, pirolin-karboksi-lizin i selenocistein.
[0020] "Konzervativno modifikovane varijante" se primenjuje i na aminokiselinske sekvence i na sekvence nukleinskih kiselina. U odnosu na odredjene sekvence nukleinskih kiselina, konzervativno modifikovane varijante se odnose na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili suštinski identične aminokiselinske sekvence, ili kada nukleinska kiselina ne kodira aminokiselinsku sekvencu, na suštinski identične sekvence. Zbog degeneracije genetskog koda, veći broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju aminokiselinu alanin. Na taj način, na svakom položaju na kome je alanin specifikovan kodonom, kodon može da bude izmenjen u bilo koji od odgovarajućih opisanih kodona bez izmene kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinske kiseline su "tihe varijacije", koje predstavljaju jednu vrstu konzervativno modifikovanih varjacija. Svaka polipeptidna sekvenca u ovom tekstu koja je kodirana polinukleotidom obuhvata svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Stručnjak u oblasti će prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin, i TGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može da bude modifikovan da bi dao funkcionalno identičan molekul. Prema tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid se podrazumeva u svakoj opisanoj sekvenci.
[0021] Stručnjak u oblasti će prepoznati da pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije u nukleinskoj kiselini, peptidu, polipeptidu, ili proteinskoj sekvenci koje menjaju, dodaju ili deletiraju pojedinačnu aminokiselinu ili mali procenat aminokiseline u odnosu na originalno kodiranu aminokiselinsku sekvencu rezultuju u "konzervativno modifikovanoj varijanti" gde izmena proizvodi supstituciju aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom i/ili polipeptidnom sekvencom koja proizvodi strukturno sličan protein koji ima sličnu funkcionalnu aktivnost kao originalni protein. Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbedjuju funkcionalno slične aminokiseline su dobro poznate u stanju tehnike. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatne i ne isključuju polimorfne varijante, homologe izmedju vrsta, i alele prema pronalasku.
[0022] Pojam “konzervativne aminokiselinske supstitucije” odnosi se na supstituciju (konceptualno ili na neki drugi način) aminokiseline iz jedne takve grupe drugačijom aminokiselinom iz iste grupe. Jedan primer supstitucije se zasniva na ispitivanju normalizovanih frekvencija aminokiselinskih izmena izmedju odgovarajućih proteina homologih organizama (videti, npr., Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Prema takvim analizama, grupe aminokiselina mogu da budu definisane tamo gde se aminokiseline unutar grupe razmenjuju prvenstveno jedna sa drugom i, stoga su medjusobno najsličnije po svom uticaju na ukupnu strukturu proteina (videti, npr., Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Jedan primer skupa aminokiselinskih grupa definisanog na ovaj način uključuje: (i) naelektrisanu grupu, koja se sastoji od Glu i Asp, Lys, Arg i His; (ii) pozitivno-naelektrisanu grupu, koja se sastoji od Lys, Arg i His; (iii) negativno-naelektrisanu grupu, koja se sastoji od Glu i Asp; (iv) aromatičnu grupu, koja se sastoji od Phe, Tyr i Trp; (v) grupu sa azotnim prstenom, koja se sastoji od His i Trp; (vi) veliku alifatičnu nepolarnu grupu, koja se sastoji od Val, Leu i Ile; (vii) blago-polarnu grupu, koja se sastoji od Met i Cys; (viii) grupu sa malim ostatkom, koja se sastoji od Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln i Pro; (ix) alifatičnu grupu koja se sastoji od Val, Leu, Ile, Met i Cys; i (x) malu hidroksilnu grupu koja se sastoji od Ser i Thr. Drugi primeri konzervativnih supstitucija zasnovanih na zajedničkim fizičkim svojstvima su supstitucije unutar sledećih grupa :1) Alanin (A), Glicin (G); 2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W); 7) Serin (S), Treonin (T); i 8) Cistein (C), Metionin (M) (videti, npr., Creighton, Proteins (1984)).
[0023] “Procenat identičnosti sekvence” odredjuje se poredjenjem dve optimalno poravnate sekvence preko prozora za poredjenje, gde udeo aminokiselinske sekvence ili polinukleotidne sekvence u prozoru za poredjenje može da sadrži adicije ili delecije (tj., praznine) u poredjenju sa referentnom sekvencom (npr., polipeptid prema pronalasku), koji ne sadrži adicije ili delecije, za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se izračunava odredjivanjem broja položaja na kojima se javljaju identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak u obe sekvence da bi se dobio broj podudarnih položaja, deljenjem broja podudarnih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru za poredjenje i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence.
[0024] Pojmovi “identičan” ili procenat “identičnosti,” u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste sekvence. Dve sekvence su "suštinski identične" ako dve sekvence imaju specifičan procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti (tj., 95% identičnosti, izborno 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti u specifikovanom regionu, ili, kada nije naznačeno, duž cele sekvence), kada se uporede i poravnaju za najveće moguće poklapanje preko prozora za poredjenje, ili označenog regiona mereno upotrebom jednog od sledećih algoritama za poredjenje sekvenci ili ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledom. Pronalazak obezbedjuje polipeptide koji su suštinski identični sa polipeptidima, redom, ovde datim kao primer (npr., bilo koja od SEQ ID NO: 11-42), kao i njihove upotrebe uključujući, ali bez ograničenja upotrebu za lečenje ili sprečavanje artritisa ili povrede zglobe. Izborno, za nukleinske kiseline, identičnost postoji u regionu koji je dužine najmanje 150 nukleotida, ili poželjinje u regionu koji je dužine 300 do 450 ili 600 ili više nukleotida, ili cele dužine referentna sekvence. Za aminokiselinsku sekvencu, izborno, identičnost postoji u regionu koji ima dužinu od najmanje 50 aminokiselina, ili poželjnije u regionu koji ima dužinu 100 do 150 ili 200 ili više aminokiselina, ili dužinu cele referentne sekvence.
[0025] Za poredjenje sekvenci, obično jedna sekvenca ima ulogu referentna sekvence sa kojom se ispitivane sekvence porede. Kada se koristi algoritam za poredjenje sekvenci, ispitivane i referentne sekvence se unose u kompjuter, koordinate podsekvence se označavaju, ako je potrebno, i odredjuju se programski parametri algoritma sekvence. Uobičajeni parametri programa mogu da se koriste, ili mogu da se odrede alternativni parametri. Algoritam za poredjenje sekvenci tada izračunava procenat identičnosti sekvence za ispitivane sekvence u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu parametara programa.
[0026] “Prozor za poredjenje”, kako se ovde koristi, uključuje upućivanje na segment bilo kog broja susednih položaja odabranih iz grupe koja se sastoji od 50 do 600, obično oko 75 do oko 200, češće oko 100 do oko 150 na kojima sekvenca može da se poredi sa referentnom sekvencom sa istim brojem susednih položaja nakon što se dve sekvence optimalno poravnaju. Postupci poravnavanja sekvenci za poredjenje su dobro poznati u ovoj oblasti. Optimalno poravnanje sekvenci za poredjenje može da se izvede, npr., algoritmom za lokalnu homologiju prema Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, algoritmom za homologno poravnanje prema Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, postupkom za pretraživanje sličnosti prema Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, kompjuterskim primenama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA), ili ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledom (videti, npr., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995, dodatak)).
[0027] Dva primera algoritama koji su pogodni za odredjivanje procenta identičnosti sekvenci i sličnosti sekvenci su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani u Altschul et al. (1977) Nuc.
Acids Res. 25:3389-3402, odnosno Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Program za izvodjenje BLAST ispitivanja je javno dostupan putem Nacionalnog centra za biotehnološke informacije. Ovaj algoritam uključuje prvo identifikovanje parova sekvenci koje imaju visok rezultat (HSP) putem identifikovanja kratkih reči dužine W u ispitivanoj sekvenci, koje se ili podudaraju ili zadovoljavaju neke pozitivno-ocenjene granične vrednosti rezultata T kada se poravnaju sa reči iste dužine sekvence iz baze podataka. T se označava kao granična vrednost rezultata susedne reči (Altschul et al., supra). Ovi polazni pogoci susedne reči deluju kao seme za započinjanje pretraga za pronalaženje dužih HSP koje ih sadrže. Pogoci reči se produžavaju u oba smera duž svake sekvence sve dok kumulativni rezultat poravnanja može da se poveća. Kumulativni rezultati se izračunavaju upotrebom, za nukleotidne sekvence, parametara M (nagradni rezultat za par ostataka koji se podudaraju; uvek > 0) i N (kazneni rezultat za ostatke koji se ne podudaraju; uvek < 0). Za aminokiselinske sekvence, matrica za dodeljivanje rezultata koristi se za računanje kumulativnog rezultata. Produžavanje pogodaka reči u svakom smeru se zaustavljaju kada: kumulativni rezultat poravnanja opada za veličinu X u odnosu na svoju maksimalno dostignutu vrednost; kumulativni rezultat pada na nula ili ispod, zbog akumulacije jednog ili više poravnanja ostataka sa negativnim rezultatom; ili dostizanja kraja bilo koje sekvence. Parametri BLAST algoritma W, T, i X odredjuju osetljivost i brzinu poravnanja. Program BLASTN (za nukleotidne sekvence) koristi kao podrazumevanu vrednost dužine reči (W) od 11, očekivanje (E) ili 10, M=5, N=-4 i poredjenje oba lanca. Za aminokiselinske sekvence, program BLASTP koristi kao podrazumevanu vrednost dužine reči od 3, i očekivanje (E) od 10, i matricu za dodeljivanje rezultata BLOSUM62 (videti Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) poravnanja (B) od 50, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4, i poredjenje oba lanca.
[0028] Algoritam BLAST takodje izvodi statističku analizu sličnosti izmedju dve sekvence (videti, npr., Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Jedna mera sličnosti koju obezbedjuje algoritam BLAST je najmanja suma verovatnoće (P(N)), koja ukazuje na verovatnoću da podudaranje dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence može da se dogodi slučajno. Na primer, nukleinska kiselina se smatra sličnom referentnoj sekvenci ako je najmanja suma verovatnoće u poredjenju ispitivane nukleinske kiseline sa referentnom nukleinskom kiselinom manja od oko 0.2, poželjnije manja od oko 0.01, i najpoželjnije manja od oko 0.001.
[0029] Pojam “izolovani”, kada je primenjen na nukleinsku kiselinu ili protein, označava da je nukleinska kiselina ili protein prečišćen tako da je suštinski lišen drugih ćelijskih komponenata sa kojima je povezan u prirodnom stanju. Često je u homogenom ili gotovo homogenom stanju. Može da bude ili suv ili u vodenom rastvoru. Čistoća i homogenost mogu da se odrede upotrebom tehnika analitičke hemije koje su poznate i obično se koriste u ovoj oblasti, npr., elektroforeze na poliakrilamidnom gelu, tečne hromatografije visokih performansi, itd. Protein koji je dominantna vrsta prisutan u preparatu je suštinski prečišćen. Pojam “prečišćen” u nekim primerima izvodjenja označava da protein stvara u suštini jednu traku na elektroforetskom gelu. Tipično, to znači da je protein bar 85% čist, poželjnije bar 95% čist, i najpoželjnije bar 99% čist.
[0030] Pojam "hijaluronska kiselina" se ovde koristi tako da uključuje derivate hijaluronske kiseline koji obuhvataju estre hijaluronske kiseline, soli hijaluronske kiseline i takodje uključuje pojam hijaluronan. Oznaka takodje uključuje i oblike male i velike molekulske težine hijaluronana i umreženih hijaluronana ili hilana. Primeri takvih hijaluronana su Synvisc™ (Genzyme Corp. Cambridge, Mass.), ORTHOVISC™ (Anika Therapeutics, Woburn, Mass.), HYALGAN™ (Sanofi-Synthelabo Inc., Malvern, Pa.), i ProVisc (Alcon/Novartis).
[0031] Kako se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
Angiopoetinu-slični polipeptidi 3 otporni na proteazu
[0032] Angiopoetinu-sličan protein 3 je član angiopoetinu-slične familije sekretornih faktora. Prvenstveno se eksprimira u jetri, i ima karakterističnu strukturu angiopoetina, koja se sastoji od signalnog peptida, N-terminalnog bispiralnog domena (CCD) i C-terminalnog fibrinogenu (FBN)-sličnog domena. Pokazano je da se angiopoetinu-sličan protein 3 vezuje za αV/β3 integrine i sam FBN-sličan domen bio je dovoljan da indukuje adheziju endotelijalnih ćelija i in vivo angiogenezu (Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277: 17281-17290, 2002). Endogeni ANGPTL3 se uobičajeno iseca in vivo u amino-terminalne i karboksi-terminalne fragmente. Kao što je prethodno ukratko prikazano i dalje opisano u ovom tekstu, predmetni pronalazak razmatra upotrebu različitih ANGPTL3 proteina otpornih na proteaze koji imaju hondrogenu aktivnost.
[0033] U nekim primerima izvodjenja, izolovani polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od bilo koje od sekvenci iz TABELE 1, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1. Polipeptidi prema pronalasku imaju hondrogenu aktivnost. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od bilo koje od SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U sledećem primeru izvodjenja, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od bilo koje od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost.
[0034] U nekim primerima izvodjenja, izolovani polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od bilo koje od sekvenci iz TABELE 1, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od bilo koje od SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U sledećem primeru izvodjenja, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od bilo koje od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost.
[0035] U nekim primerima izvodjenja, izolovani polipeptid ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od bilo koje od sekvenci iz TABELE 1, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423 ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid ima najmanje 95% identičnosti, sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od bilo koje od SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U sledećem primeru izvodjenja, polipeptid ima najmanje 95% identičnosti, sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od bilo koje od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost.
[0036] U nekim primerima izvodjenja, izolovani polipeptid je aminokiselinska sekvenca odabrana od bilo koje od sekvenci iz TABELE 1. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid je aminokiselinska sekvenca odabrana od bilo koje od SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70. U sledećem primeru izvodjenja, polipeptid je aminokiselinska sekvenca odabrana od bilo koje od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64.
TABELA 1: Konstrukti varijanti ANGPTL3
[0037] Modifikovani ANGPTL3 polipeptidi koji su ovde opisani imaju najmanje jednu supstituciju u C-terminalnom delu polipeptida koja čini polipeptid otpornim na proteazu. Supstitucija je na R ili K ostatku tako da polipeptidi imaju povećanu otpornost, npr., na tripsinu-slične proteaze. Bilo koja polarna aminokiselina može da bude zamena za R ili K na položaju 423 u ANGPTL3 polipeptidu otpornom na proteazu prema pronalasku. U nekim primerima izvodjenja, zamena je H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim primerima izvodjenja, zamena je S ili Q. U nekim primerima izvodjenja, zamena je Q. U nekim primerima izvodjenja zamena je S. U nekim primerima izvodjenja, peptid otporan na proteazu ima polarnu aminokiselinu na položaju 423, u odnosu na SEQ ID NO:1, koja nije K ili R. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid prema pronalasku sadrži aminokiselinu na položaju 423 koja predstavlja polarnu aminokiselinu. Na primer, aminokiselina na položaju 423 može da bude Q ili S ili druga polarna aminokiselina. U odredjenim primerima izvodjenja polipeptid prema pronalasku ima Q na položaju 423. U drugim primerima izvodjenja polipeptid prema pronalasku ima S na položaju 423. U nekim primerima izvodjenja, zamena na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, je Q ili S. U drugim primerima izvodjenja polipeptid prema pronalasku ima deleciju na položaju 423 odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1.
[0038] U nekim primerima izvodjenja, polipeptid prema pronalasku je dužine 250 aminokiselina ili manje i sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70.
[0039] U nekim primerima izvodjenja, pronalazak obezbedjuje upotrebu hondrogenih ANGPTL3 proteina otpornih na proteazu celokupne dužine. U nekim primerima izvodjenja, pronalazak obezbedjuje ANGPTL3 proteine otporne na proteazu koji sadrže C-terminalni deo ANGPTL3 sekvence, ili njihovu hondrogenu varijantu. U odredjenim primerima izvodjenja ANGPTL3 proteinima nedostaje amino-terminalni kraj nativnog proteina. U nekim primerima izvodjenja, ANGPTL3 proteinima otpornim na proteazu prema pronalasku nedostaje CCD domen i/ili nedostaje značajna CCD aktivnost. Na taj način, u nekim primerima izvodjenja, ANGPTL3 proteini otporni na proteazu prema pronalasku sadrže bar fragment (npr., najmanje 100, 150, 200, 220 ili 215 susednih aminokiselina) karboksi-terminalnog domena humanog ANGPTL3 proteina, ili suštinski identičnu sekvencu karboksi-terminalnoj sekvenci humanog ANGPTL3 proteina, gde polipeptid i njihove varijante zadržavaju hondrogenu aktivnost. U nekim primerima izvodjenja, polipeptidu otpornom na proteazu prema pronalasku nedostaje najmanje deo C-terminalne sekvence, npr., nedostaje 5, 10, 15, ili 20 aminokiselina sa C-terminalnog kraja SEQ ID NO:1 (tj., nedostaje 456-460, 451-460, 446-460 ili 441-460 iz SEQ ID NO:1) .
[0040] U nekim primerima izvodjenja, ANGPTL3 polipeptid otporan na proteazu prema pronalasku sadrži susedne aminokiseline koje odgovaraju aminokiselinskim regionima: aminokiseline 241-455, ili 241-460 iz SEQ ID NO:1; aminokiseline 242-455, ili 242-460 iz SEQ ID NO:1; aminokiseline 233-455 ili 233-460 iz SEQ ID NO:1; aminokiseline 228-455 ili 228-460 iz SEQ ID NO:1, aminokiseline 226-455 ili 226-260 ili aminokiseline 225-455 ili 225-260 iz SEQ ID NO:1 u kojima aminokiselina na položaju 423 predstavlja zamenu za R ili K, ili je aminokiselina na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, deletirana. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid otporan na proteazu sadrži susedne aminokiseline koje odgovaraju aminokiselinskim regionima 207-455 ili 207-460 iz SEQ ID NO:1 u kojima aminokiselina na položju 423 predstavlja zamenu za R ili K ili je deletirana. U nekim primerima izvodjenja, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim primerima izvodjenja, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim primerima izvodjenja, zamena je S ili Q. U nekim primerima izvodjenja, zamena je Q. U odredjenim primerima izvodjenja, uključena je delecija na položaju 423 u odnosu na SEQ ID NO:1.
[0041] Pronalazak dodatno obezbedjuje polipeptid otporan na proteazu, gde polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinama 240-454 iz SEQ ID NO:1, aminokiselinama 241-455 iz SEQ ID NO:1, ili aminokiselinama 242-455 iz SEQ ID NO:1 sa supstitucijom ili delecijom na aminokiselini koja odgovara položaju 423 u SEQ ID NO:1, gde zamenjena aminokiselina nije R ili K, i gde polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U drugim primerima izvodjenja, polipeptid sadrži aminokiseline 240-454 iz SEQ ID NO:1, aminokiseline 241-455 iz SEQ ID NO:1, ili aminokiseline 242-455 iz SEQ ID NO:1, gde svaki polipeptid ima supstituciju ili deleciju na aminokiselini koja odgovara položaju 423 u SEQ ID NO:1, gde je zamenjena aminokiselina Q ili S.
[0042] U nekim primerima izvodjenja, ANGPTL3 polipeptid otporan na proteazu prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, identičnosti sa aminokiselinama 242-455 ili 242-460 iz SEQ ID NO:1; 241-455 ili 241-460 iz SEQ ID NO:1; aminokiselinama 233-455 ili 233-460 iz SEQ ID NO:1; aminokiselinama 228-455 ili 228-460 iz SEQ ID NO:1, aminokiselinama 226-455 ili 226-260 iz SEQ ID NO:1, ili aminokiselinama 225-455 ili 225-260 iz SEQ ID NO:1 u kojima aminokiselina predstavlja zamenu za R ili K na položaju 423, ili je aminokiselina na položaju 423 deletirana. U nekim primerima izvodjenja, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim primerima izvodjenja, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim primerima izvodjenja, zamena je S ili Q. U nekim primerima izvodjenja zamena je Q. U odredjenim primerima izvodjenja postoji deletirani ostatak na položaju 423 u odnosu na SEQ ID NO:1.
[0043] U nekim primerima izvodjenja, ANGPTL3 polipeptid otporan na proteazu prema pronalasku je dužine 250 ili 240 ili manje aminokiselina i sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, i SEQ ID NO:70. U nekim primerima izvodjenja, ANGPTL3 polipeptid otporan na proteazu prema pronalasku ima dužinu od 230 ili 225 ili manje aminokiselina i sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70.
[0044] Dalje su obelodanjeni ANGPTL3 proteini otporni na proteazu prema pronalasku koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti, ili najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti, sa C-terminalnom sekvencom ANGPTL3 proteina psa, goveda ili konja. U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 proteini otporni na proteazu prema otkriću sadrže bar fragment (npr., najmanje 100, 150, 200, 215 susednih aminokiselina) nativne sekvence ANGPTL3 proteina psa (SEQ ID NO:4), konja (SEQ ID NO:5), ili goveda (SEQ ID NO:6), ili sekvencu koja je suštinski identična nativnoj sekvenci ANGPTL3 proteina psa, goveda, ili konja, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U nekim aspektima otkrića, izolovani polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti, ili najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti, sa SEQ ID NO:42 ili SEQ ID NO:43, gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U nekim aspektima otkrića, polipeptid ima najmanje 95% identičnosti, ili najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti, sa SEQ ID NO:42, ili SEQ ID NO:43 gde polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423 ili polipeptid sadrži deleciju na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i polipeptid ima hondrogenu aktivnost. U izvesnim aspektima otkrića polipeptid sadrži SEQ ID NO:42, ili SEQ ID NO:43. U sledećem aspektu otkrića, polipeptid je SEQ ID NO:42, ili SEQ ID NO:43.
[0045] U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 otporan na proteazu prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, ili najmanje 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinama 232-454 iz SEQ ID NO:4, aminokiselinama 240-454 iz SEQ ID NO:4, aminokiselinama 227-454 iz SEQ ID NO:4, ili aminokiselinama 224-454 iz SEQ ID NO:4 u kojoj je R ili K zamenjeno aminokiselinom ili postoji delecija R ili K. U nekim aspektima otkrića, supstitucija ili delecija je na položaju 422 SEQ ID NO:4, koji odgovara položaju 423 SEQ ID NO:1. U nekim aspektima otkrića, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je S ili Q. U nekim aspektima otkrića, zamena je Q. U nekim aspektima otkrića delecija aminokiseline se nalazi na položaju 422 SEQ ID NO:4.
[0046] U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 otporan na proteazu prema opisu sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, ili najmanje 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinama 233-455 iz SEQ ID NO:5, aminokiselinama 241-455 iz SEQ ID NO:5, aminokiselinama 228-455 iz SEQ ID NO:5, ili aminokiselinama 225-455 iz SEQ ID NO:5 u kojoj je R ili K zamenjeno aminokiselinom ili postoji delecija R ili K. U nekim aspektima otkrića, supstitucija ili delecija je na položaju 423 SEQ ID NO:5, koji odgovara položaju 423 SEQ ID NO:1. U nekim aspektima otkrića, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim primerima izvodjenja, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim primerima izvodjenja, zamena je S ili Q. U nekim aspektima otkrića, zamena je Q. U nekim aspektima otkrića delecija aminokiseline je na položaju 423 SEQ ID NO:5.
[0047] U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 otporan na proteazu prema opisu sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, ili najmanje 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinama 233-455 SEQ ID NO:6, aminokiselinama 241-455 SEQ ID NO:6, aminokiselinama 228-455 SEQ ID NO:6, ili aminokiselinama 225-455 SEQ ID NO:6 u kojoj je R ili K zamenjeno aminokiselinom ili postoji delecija R ili K. U nekim aspektima otkrića, supstitucija ili delecija se nalazi na položaju 422 SEQ ID NO:6, koji odgovara položaju 423 SEQ ID NO:1. U nekim aspektima otkrića, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je S ili Q. U nekim aspektima otkrića, zamena je Q. U nekim aspektima otkrića delecija aminokiseline je na položaju 422 SEQ ID NO:6.
[0048] U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 polipeptid otporan na proteazu opisa sadrži susedne aminokiseline koje odgovaraju aminokiselinskim regionima: aminokiselinama 240-454 iz SEQ ID NO:4; aminokiselinama 232-454 iz SEQ ID NO:4; aminokiselinama 227-454 iz SEQ ID NO:4, ili aminokiselinama 224-454 iz SEQ ID NO:4 u kojoj je R ili K zamenjeno aminokiselinom ili postoji delecija R ili K. U nekim aspektima otkrića, supstitucija ili delecija je na položaju 422 SEQ ID NO:4 (koji predstavlja položaj 423 odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1). U nekim aspektima otkrića, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je S ili Q. U nekim aspektima otkrića, zamena je Q. U nekim aspektima otkrića delecija aminokiseline je na položaju 422 SEQ ID NO:4.
[0049] U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 polipeptid otporan na proteazu opisa sadrži susedne aminokiseline koje odgovaraju aminokiselinskim regionima: aminokiselinama 241-455 iz SEQ ID NO:5; aminokiselinama 233-455 iz SEQ ID NO:5; aminokiselinama 228-455 iz SEQ ID NO:5, ili aminokiselinama 225-455 iz SEQ ID NO:5 u kojoj je R ili K zamenjeno aminokiselinom ili postoji delecija R ili K. U nekim aspektima otkrića, supstitucija ili delecija je na položaju 423 (koji predstavlja položaj 423 odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1). U nekim aspektima otkrića, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je S ili Q. U nekim aspektima, zamena je Q. U nekim aspektima otkrića delecija aminokiseline je na položaju 423 SEQ ID NO:5.
[0050] U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 polipeptid otporan na proteazu opisa sadrži susedne aminokiseline koje odgovaraju aminokiselinskim regionima: aminokiselinama 241-455 iz SEQ ID NO:6; aminokiselinama 233-455 iz SEQ ID NO:6; aminokiselinama 228-455 iz SEQ ID NO:6, ili aminokiselinama 225-455 iz SEQ ID NO:6 u kojoj je R ili K zamenjeno aminokiselinom ili postoji delecija R ili K. U nekim aspektima otkrića, supstitucija ili delecija je na položaju 422 SEQ ID NO:6 (koji predstavlja položaj 423 odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1). U nekim aspektima otkrića, zamena je polarna aminokiselina, npr., H, N, Q, S, T, A, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je H, N, Q, S, T, ili Y. U nekim aspektima otkrića, zamena je S ili Q. U nekim aspektima otkrića, zamena je Q. U nekim primerima izvodjenja postoji delecija na položaju 422 SEQ ID NO:6.
[0051] ANGPTL3 proteini prema pronalasku kao što je gore opisano mogu da uključuju sekvence nativnog ANGPTL3 proteina koje oivičavaju regione koji su prethodno opisani. Alternativno, u nekim primerima izvodjenja, ANGPTL3 proteini prema pronalasku mogu da uključuju oivičavajuće sekvence ANGPTL3 proteina koji nije nativni. Na primer, deo ANGPTL3 proteina koji ima hondrogenu aktivnost može da bude fuzionisan sa jednim ili više fuzionih partnera i/ili heterologih aminokiselina tako da obrazuje fuzioni protein. Sekvence fuzionih partnera mogu da uključuju, ali nisu ograničene na aminokiselinske obeleživače, ne-L (npr., D-) aminokiseline ili druge aminokiselinske mimetike za produžavanje in vivo poluživota i/ili otpornosti na proteazu, sekvence sa ciljnim delovanjem ili druge sekvence.
[0052] U nekim primerima izvodjenja, polipeptid prema pronalasku je PEG-ilovan. U nekim primerima izvodjenja, polipeptid prema pronalasku je fuzionisan sa heterologim peptidom. U odredjenim primerima izvodjenja polipeptid je fuzionisan sa bilo kojim od humanog serum albumina (HSA), konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina (Fc), polihistidina, glutation S transferaze (GST), tioredoksina, proteina A, proteina G, maltoza-vezujućeg proteina (MBP), ili fragmenta bilo kog od gore navedenog/navedenih heterologih polipeptida. U odredjenim primerima izvodjenja heterologi polipeptid je fuzionisan na amino-terminalnom kraju poliptida prema pronalasku. U dodatnim ili alternativnim primerima izvodjenja heterologi polipeptid je fuzionisan na karboksiterminalnom kraju polipeptida prema pronalasku.
[0053] ANGPTL3 proteini prema pronalasku imaju hondrogenu aktivnost i otporni su na proteazu. Kao što je ovde definisano, hondrogeneza ili hondrogena aktivnost odnosi se na razvoj hondrocita iz MSC. Indikatori hondrogene aktivnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, proizvodnju matriksa hrskavice. Proizvodnja matriksa hrskavice može da se meri različitim markerima, na primer, kao proizvodnja Sox9, kolagena tipa II, ili glikozaminoglikana (GAG). U nekim primerima izvodjenja, proizvodnja GAG se meri kao marker proizvodnje matriksa hrskavice. U nekim primerima izvodjenja, trostruko povećanje proizvodnje GAG sa ekspresijom proteina specifičnog za hrskavicu ukazuje na pozitivnu proizvodnju matriksa hrskavice.
[0054] Otpornost polipeptida na proteazu može da se proceni korišćenjem bilo kog poznatog ogleda koji meri sečenje polipeptida pomoću serin proteaze kao što je tripsin. U nekim primerima izvodjenja, proteaza koja se koristi za procenu podložnosti proteolizi je serin proteaza tripsin. Polipeptid se smatra otpornim na proteazu ako ima smanjenu osetljivost na tripsin u poredjenju sa svojim analogom divljeg tipa. Primer ogleda je merenje količine isečenog proizvoda koji je nastao kada je polipeptid izložen tripsinu tokom odredjenog perioda vremena, u poredjenju sa odgovarajućim nativnim humanim peptidom. Sečenje može da se meri upotrebom bilo kog poznatog ogleda, npr., SDS PAGE ili LCMS. Ilustrativni ogled je obezbedjen u odeljku sa primerima.
[0055] Ilustrativni ogled, ograničena proteoliza putem tripsinolize izvodi se inkubiranjem 10 ng proteina koji treba da se proceni sa tripsinom pri masenom odnosu od 8000:1 (protein:tripsin) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Reakcija tripsinolize može zatim da se ugasi dodavanjem sirćetne kiseline da bi se reakcija dovela na pH 3.0. Ugašeni uzorci se zatim odvojeno analiziraju pomoću SDS-PAGE, npr., na 4-12% Tris-Bis gelu da bi se razlikovali proteini koji su otporni na sečenje od onih koji su isečeni, prema pojavi fragmenta koji je stvoren isecanjem tripsinom. Proizvod sečenja je odsutan ili redukovan kod polipeptida otpornih na proteazu u poredjenju sa njihovim analogom divljeg tipa.
[0056] U nekim aspektima otkrića, ANGPTL3 polipeptidi prema pronalasku će sadržati najmanje jednu aminokiselinu koja nije prirodno kodirana. U nekim aspektima otkrića, polipeptid sadrži 1, 2, 3, 4, ili više neprirodnih aminokiselina. Postupci pravljenja i uvodjenja aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi u protein su poznati. Videti, npr., američke patente br.7,083,970; i 7,524,647. Opšti principli proizvodnje ortogonalnih translacionih sistema koji su pogodni za pravljenje proteina koji sadrže jednu ili više željenih neprirodnih aminokiselina su poznati u stanju tehnike, kao opšti postupci za proizvodnju ortogonalnih translacionih sistema. Na primer, videti medjunarodnu objavu broj WO 2002/086075, pod naslovom "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO 2002/085923, pod naslovom "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" WO 2004/094593, pod naslovom "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" WO 2005/019415, podnetu 7. jula 2004; WO 2005/007870, podnetu 7 jula 2004; WO 2005/007624, podnetu 7 jula 2004; WO 2006/110182, podnetu 27 oktobra 2005, pod naslovom "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS" i WO 2007/103490, podnetu 7. marta 2007, pod naslovom "SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST ĆELIJE." Za diskusiju o ortogonalnim translacionim sistemima koji ugradjuju neprirodne aminokiseline, i postupcima za njihovu proizvodnju i upotrebu, videti takodje, Wang and Schultz, (2005) "Expanding the Genetic Code." Angewandte Chemie Int Ed 44: 34-66; Xie and Schultz, (2005) "An Expanding Genetic Code." Methods 36: 227-238; Xie and Schultz, (2005) "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire." Curr Opinion in Chemical Biology 9: 548-554; i Wang, et al., (2006) "Expanding the Genetic Code." Annu Rev Biophys Biomol Struct 35: 225-249; Deiters, et al, (2005) "In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli." Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524; Chin, et al., (2002) "Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli." J Am Chem Soc 124: 9026-9027; i medjunarodnu objavu br. WO2006/034332, podnetu 20. septembra 2005. Dodatni detalji se nalaze u američkim pat. br. 7,045,337; br. 7,083,970; br. 7,238,510; br. 7,129,333; br.7,262,040; br.7,183,082; br.7,199,222; i br.7,217,809.
[0057] "Aminokiselina koja nije prirodno kodirana" odnosi se na aminokiselinu koja nije jedna od uobičajenih aminokiselina ili pirolizin, pirolin-karboksi-lizin, ili selenocistein. Drugi izrazi koji mogu da se koriste kao sinonimi sa pojmom "aminokiselina koja nije prirodno kodirana" su "aminokiselina koja nije prirodna", "neprirodna aminokiselina", "aminokiselina koja se ne javlja u prirodi" i njihove različite verzije napisane sa crticom i bez crtice. Pojam "aminokiselina koja nije prirodno kodirana" takodje uključuje, ali nije ograničen na aminokiseline koje se javljaju putem modifikacije (npr. posttranslacione modifikacije) prirodno kodirane aminokiseline (uključujući, ali bez ograničenja, 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin, pirolin-karboksi-lizin i selenocistein), ali nisu prirodno ugradjene u rastući lanac polipeptida u translacionom kompleksu. Primeri takvih aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi uključuju, ali nisu ograničeni na, N-acetilglukozaminil-L-serin, N-acetilglukozaminil-L-treonin, i O-fosfotirozin.
[0058] Aminokiselina koja nije prirodno kodirana je tipično bilo koja struktura koja ima bilo koji supstituentni bočni lanac koji nije onaj koji je korišćen u dvadest prirodnih aminokiselina. Zbog toga što se aminokiseline koje nisu prirodno kodirane prema pronalasku tipično razlikuju od prirodnih aminokiselina samo prema strukturi bočnog lanca, aminokiseline koje nisu prirodno kodirane obrazuju amidne veze sa drugim aminokiselinama, uključujući, ali bez ograničenja, one koje jesu ili nisu prirodno kodirane, na isti način na koji su obrazovane u prirodnim polipeptidima. Medjutim, aminokiseline koje nisu prirodno kodirane imaju grupe bočnog lanca koje ih čine različitim od prirodnih aminokiselina. Na primer, R izborno sadrži alkil-, aril-, acil-, keto-, azido-, hidroksil-, hidrazin, cijano-, halo-, hidrazid, alkenil, alkinl, etar, tiol, seleno-, sulfonil-, borat, boronat, fosfo, fosfono, fosfin, heterocikličnu, enon, imin, aldehid, estar, tioacid, hidroksilamin, amino grupu, ili slično, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Druge neprirodne aminokiseline od interesa koje mogu da budu pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na aminokiseline koje sadrže fotoaktivirajuće unakrsno-povezujuće aminokiseline, spin-obeležene aminokiseline, fluorescentne aminokiseline, metal-vezujuće aminokiseline, aminokiseline koje sadrže metal, radioaktivne aminokiseline, aminokiseline sa novim funkcionalnim grupama, aminokiseline koje kovalentno ili nekovalentno interaguju sa drugim molekulima, foto-zaključane i/ili foto-izomerizujuće aminokiseline, aminokiseline koje sadrže biotin ili analog biotina, glikozilovane aminokiseline kao što je šećerom supstituisani serin, drugim ugljenim hidratom modifikovane aminokiseline, aminokiseline koje sadrže keto-grupu, aminokiseline koje sadrže polietilen glikol ili polietar, aminokiseline supstitutuisane teškim atomom, aminokiseline koje mogu da se hemijski i/ili pomoću svetlosti isecaju, aminokiseline sa produženim bočnim lancima u poredjenju sa prirodnim aminokiselinama, uključujući ali bez ograničenja polietre ili ugljovodonike dugog lanca, uključujući, ali bez ograničenja, one veće od oko 5 ili veće od oko 10 ugljenika, ugljenikom vezane aminokiseline koje sadrže šećer, redoksaktivne aminokiseline, aminokiseline koje sadrže amino-tioacid, i aminokiseline koje sadrže jedan ili više toksičnih fragmenata.
[0059] Primeri aminokiselina koje nisu prirodno kodirane koje mogu da budu pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku i koje su korisne za reakcije sa polimerima rastvorljivim u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na one sa karbonil, aminooksi, hidrazin, hidrazid, semikarbazid, azid i alkin reaktivnim grupama. U nekim primerima izvodjenja, aminokiselina koje nisu prirodno kodirane sadrže saharidni fragment. Primeri takvih aminokiselina uključuju N-acetil-L-glukozaminil-L-serin, N-acetilL-galaktozaminil-L-serin, N-acetil-L-glukozaminil-L-treonin, N-acetil-L-glukozaminil-L-asparagin i O-manozaminil-L-serin. Primeri takvih aminokiselina takodje uključuju primere u kojima je N- ili O-veza koja se prirodno javlja izmedju aminokiseline i saharida zamenjena kovalentnom vezom koja se ne nalazi uobičajeno u prirodi uključujući, ali bez ograničenja, alken, oksim, tioetar, amid i slično. Primeri takvih aminokiselina takodje uključuju saharide koji se ne nalaze uobičajeno u prirodnim proteinima kao što su 2-deoksi-glukoza, 2-deoksigalaktoza i slično.
[0060] Druga vrsta modifikacije koja može izborno da se uvede u ANGPTL3 proteine prema pronalasku (npr. u polipeptidni lanac ili N- ili C-terminalni deo), npr., za produžavanje in vivo poluživota, je PEG-ilacija ili ugradjivanje polietilen glikol polimera dugog lanca (PEG). Uvodjenje PEG ili polimera PEG dugog lanca povećava efektivnu molekulsku težinu predmetnih polipeptida, na primer, da bi se sprečila brza filtracija u urin. U nekim primerima izvodjenja, lizinski ostatak u ANGPTL3 sekvenci je konjugovan sa PEG neposredno ili preko linkera. Takav linker može da bude, na primer, Glu ostatak ili acil ostatak koji sadrži tiol funkcionalnu grupu za vezivanje pogodno modifikovanog PEG lanca. Alternativni postupak za uvodjenje PEG lanca je da se prvo uvede Cys ostatak na C-terminusu ili na ostacima izloženim rastvaraču kao što su zamene za Arg ili Lys ostatke. Ovaj Cys ostatak se zatim povezuje na mesto-specifičan način sa PEG lancem koji sadrži, na primer, maleimidnu funkciju. Postupci za ugradnju PEG ili polimera PEG dugog lanca su dobro poznati u stanju tehnike (opisani, na primer, kod Veronese, F. M., et al., Drug Disc. Today 10: 1451-8 (2005); Greenwald, R. B., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 217-50 (2003); Roberts, M. J., et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 459-76 (2002)), čiji je sadržaj ovde obuhvaćen po referenci. Drugi postupci polimernih konjugacija poznati u stanju tehnike mogu takodje da se koriste u predmetnom pronalasku. U nekim primerima izvodjenja, poli(2-metakriloiloksietil fosforilholin) (PMPC) se uvodi kao polimerni konjugat sa ANGPTL3 proteinima prema pronalasku (videti, npr., WO2008/098930; Lewis, et al., Bioconjug Chem., 19: 2144-55 (2008)). U nekim primerima izvodjenja, polimerni konjugat sa ANGPTL3 proteinima koji sadrži fosforilholin može da se koristi u predmetnom pronalasku. Stručnjak u ovoj oblasti će lako prepoznati da i drugi biokompatibilni polimerni konjugati mogu da se koriste.
[0061] Nedavno objavljen alternativni pristup za ugradnju PEG ili PEG polimera putem ugradnje aminokiselina koje nisu prirodne (kao što je gore opisano) može da se sprovede sa predmetnim polipeptidima. Ovaj pristup koristi razvijeni par tRNK/tRNK-sintetaza i kodiran je ekspresionim plazmidom pomoću amber-supresorskog kodona (Deiters, A, et al. (2004). Bio-org. Med. Chem. Lett.
14, 5743-5). Na primer, moguće je ugraditi p-azidofenilalanin u predmetne polipeptide i zatim sprovesti reakciju sa PEG polimerom koji ima acetilen fragment u prisustvu redukujućeg sredstva i jona bakra za olakšavanje organske reakcije poznate kao "Huisgen [3+2]cikloadicija".
[0062] U odredjenim aspektima, predmetno otkriće takodje obuhvata specifične mutacije ANGPTL3 proteina sa ciljem da se izmeni glikozilacija polipeptida. Takve mutacije mogu da budu odabrane tako da uvedu ili eliminišu jedno ili više mesta glikozilacije, uključujući, ali bez ograničenja O-vezana ili N-vezana mesta glikozilacije. U odredjenim primerima izvodjenja, ANGPTL3 proteini predmetnog pronalaska imaju glikozilaciona mesta i obrasce koji su neizmenjeni u odnosu na ANGPTL3 proteine koji se javljaju u prirodi. U izvesnim aspektima otkrića, varijanta ANGPTL3 proteina uključuje glikozilacionu varijantu u kojoj je broj i/ili tip glikozilacionih mesta izmenjen u odnosu na ANGPTL3 proteine koji se javljaju u prirodi. U izvesnim aspektima otkrića, varijanta polipeptida sadrži veći ili manji broj N-vezanih glikozilacionih mesta u odnosu na nativni polipeptid. N-vezano glikozilaciono mesto se odlikuje sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde aminokiselinski ostatak ozačen kao X može da bude bilo koji aminokiselinski ostatak osim prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka da bi se stvorila ova sekvenca obezbedjuje potencijalno novo mesto za adiciju N-vezanog ugljenohidratnog lanca. Alternativno, supstitucije koje eliminišu ovu sekvencu će ukloniti postojeći N-vezani ugljenohidratni lanac. U izvesnim aspektima otkrića, obezbedjuje se preuredjivanje N-vezanih ugljenohidratnih lanaca, pri čemu se jedno ili više N-vezanih glikozilacionih mesta (obično ona koja su prirodna) eliminišu, i stvaraju se jedno ili više novih N-vezanih mesta.
[0063] Primeri varijanti ANGPTL3 proteina uključuju cisteinske varijante u kojima se jedan ili više cisteinskih ostataka deletiraju, ili zamenjuju drugu aminokiselinu (npr., serin) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu ANGPTL3 proteina koji se javljaju u prirodi. U izvesnim aspektima otkrića, cisteinske varijante mogu da budu korisne kada ANGPTL3 proteini moraju da budu ponovo umotani u biološki aktivnu konformaciju, na primer posle izolacije nerastvorljivih inkluzionih tela. U izvesnim aspektima otkrića, cisteinske varijante imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog polipeptida. U izvesnim aspektima otkrića, cisteinske varijante imaju jednak broj cisteinskih ostataka da bi se smanjile interakcije koje rezultuju iz nesparenig cisteina.
[0064] U nekim primerima izvodjenja, funkcionalne varijante ili modifikovani oblici ANGPTL3 proteina uključuju fuzione proteine ANGPTL3 proteina prema pronalasku i jednog ili više fuzionih domena. Dobro poznati primeri fuzionih domena uključuju, ali nisu ograničenni na polihistidin, Glu-Glu, glutation S transferazu (GST), tioredoksin, protein A, protein G, konstantni region teškog lanca imunoglobulina (Fc), maltoza-vezujući protein (MBP), i/ili humani serum albumin (HSA). Fuzioni domen ili njegov fragment može da bude odabran tako da doprinosi željenom svojstvu. Na primer, neki fuzioni domeni su naročito korisni za izolovanje fuzionih proteina afinitetnom hromatografijom. U svrhu afinitetnog prečišćavanja koriste se relevantne matrice za afinitetnu hromatografiju, kao glutation-, amilaza-, i nikl- ili kobalt-konjugovane smole. Mnoge od takvih matrica su dostupne u obliku "kita", kao što je sistem za prečišćavanje Pharmacia GST i sistem QLAexpress<TM>(Qiagen) koji su korisni sa (HIS6) fuzionim partnerima. Kao drugi primer, fuzioni domen može da bude odabran tako da olakšava detekciju ANGPTL3 proteina. Primeri takvih domena za detekciju uključuju različite fluorescentne proteine (npr., GFP) kao i "epitopske oznake", koje obično predstavljaju kratke peptidne sekvence za koje je dostupno specifično antitelo. Dobro poznate epitopske oznake za koje su specifična monoklonska antitela lako dostupna uključuju FLAG, hemaglutinin virusa influence (HA), i c-myc oznake. U nekim slučajevima, fuzioni domeni imaju mesto za sečenje proteazom, kao što je za faktor Xa ili trombin, što omogućava relevantnoj proteazi da delimično digestira fuzione proteine i time oslobodi rekombinantne proteine iz njih. Oslobodjeni proteini mogu zatim da budu razdvojeni od fuzionog domena naknadnim hromatografskim razdvajanjem. U odredjenim primerima izvodjenja, ANGPTL3 protein je fuzionisan sa domenom koji stabilizuje ANGPTL3 protein in vivo ("stabilizujući" domen). Pod "stabilizujućim" se podrazumeva bilo šta što povećava polu-život u serumu, bez obzira da li je to posledica smanjenog razaranja, sniženog klirensa u bubregu, ili drugog farmakokinetičkog dejstva. Poznato je da fuzije sa Fc delom imunoglobulina doprinose poželjnim farmakokinetičkim svojstvima širokog opsega proteina. Slično tome, fuzije sa humanim serum albuminom mogu da doprinesu željenim svojstvima. Drugi tipovi fuzionih domena koji mogu da budu odabrani uključuju multimerizaciju (npr., dimerizaciju, tetramerizaciju) domena i funkcionalnih domena (koji donose dodatnu biološku funkciju, ukoliko je poželjno). Fuzije mogu da budu konstruisane tako da je heterologi peptid fuzionisan na amino terminusu polipeptida prema pronalasku i/ili na karboksilnom terminusu polipeptida prema pronalasku.
Nukleinske kiseline koje kodiraju angiopoetinu-slične polipeptide 3 otporne na proteazu
[0065] Otkriće takodje obezbedjuje nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide prema pronalasku otporne na proteazu i ekspresione vektore i ćelije domaćine za ekspresiju polipeptida otpornog na proteazu. U drugim aspektima, otkriće obezbedjuje polinukleotid koji kodira polipeptid prema pronalasku i ekspresione vektore i ćelije domaćine koje sadrže takav polinukleotid. U nekim aspektima otkrića, polinukleotid je optimizovan za ekspresiju u ćelijama domaćinima. U nekim aspektima, otkriće obezbedjuje postupak za poboljšanje ili sprečavanje artritisa ili povrede zgloba kod humanog pacijenta, gde postupak obuhvata: primenu na zglob pacijenta ekspresionog vektora koji kodira polipeptid prema pronalasku posle čega ekspresija polipeptida poboljšava ili sprečava artritis ili povredu zgloba kod pacijenta. U nekim aspektima otkrića, pacijent ima artritis ili povredu zgloba. U nekim aspektima otkrića, osoba nema, ali je pod rizikom od, artritisa ili povrede zgloba. U nekim aspektima otkrića, artritis je osteoartritis, artritis kao posledica traume, ili autoimunski artritis.
[0066] Eksprimiranje polipeptida prema opisu koristi rutinske tehnike u oblasti rekombinantne genetike. Osnovni tekstovi koji opisuju opšte postupke za upotrebu u ovom pronalasku uključuju Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; serije Ausubel et al. eds. (2007 sa ažuriranjem tokom 2010) Current Protocols in Molecular Biology, medju ostalim poznatim u ovoj oblasti.
[0067] Za ekspresiju mogu da se koriste bilo koje pogodne ćelije-domaćini poznate u stanju tehnike, na primer, sisarske ćelije-domaćini, bakterijske ćelije-domaćini, ćelije-domaćini kvasca, insekatske ćelije-domaćini, itd. I prokariotski i eukariotski ekspresioni sistemi su široko dostupni. U nekim primerima izvodjenja, ekspresioni sistem podrazumeva sisarsku ćelijsku ekspresiju, kao što je CHO ćelijski ekspresioni sistem. U nekim primerima izvodjenja, nukleinska kiselina može da bude kodon-optimizovana da olakša ekspresiju u željenoj ćeliji domaćinu.
[0068] Nevirusni vektori i sistemi uključuju plazmide i epizomalne vektore, koji obično sadrže ekspresionu kasetu za ekspresiju proteina ili RNK, i humane veštačke hromozome (videti, npr., Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Na primer, nevirusni vektori koji su korisni za ekspresiju polipeptida prema pronalasku u sisarskim (npr., humanim) ćelijama uključuju pThioHis A, B & C, pcDNA3. I/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), MPSV vektore, i brojne druge vektore poznate u ovoj oblasti za ekspresiju drugih proteina. Korisni virusni vektori uključuju, ali bez ograničenja, vektore na bazi adenovirusa, vektore na bazi adeno-asociranih virusa, vektore na bazi herpes virusa, vektore na bazi SV40, vektore na bazi papiloma virusu, vektore na bazi HBP Epštajn-Bar virusa, vektore na bazi virusa kokošijih boginja, vektore na bazi vakcinija virusa i Semliki Forest virusa (SFV).
[0069] Izbor ekspresionog vektora zavisi od ćelije-domaćina koja je namenjena za ekspresiju vektora. Obično, ekspresioni vektori sadrže promotor i druge regulatorne sekvence (npr., pojačivače) koje su operativno vezane za polinukleotide koji kodiraju polipeptid prema pronalasku. U nekim aspektima otkrića, koristi se inducibilni promotor da bi se sprečila ekspresija insertovanih sekvenci osim pod indukujućim uslovima. Inducibilni promotori uključuju, npr., arabinozu, lacZ, metalotioneinski promotor, glukokortikoidne promotore ili promotor toplotnog šoka. Pored toga, drugi regulatorni elementi mogu takodje da budu ugradjeni da poboljšaju ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema pronalasku, npr., pojačivači, ribozom-vezujuće mesto, sekvence za završetak transkripcije, i slično.
[0070] U nekim aspektima otkrića, nukleinska kiselina koja kodira polipeptid opisa može takodje da uključuje sekvencu koja kodira sekrecionu signalnu sekvencu tako da se polipeptid sekretuje iz ćelije-domaćina. Takva sekvenca može da bude obezbedjena pomoću vektora, ili kao deo ANGPTL3 nukleinske kiseline koja je prisutna u vektoru.
[0071] Postupci za uvodjenje ekspresionih vektora koji sadrže polinukleotidne sekvence od interesa variraju u zavisnosti od tipa ćelijskog domaćina. Na primer, transfekcija pomoću kalcijum hlorida se uobičajeno koristi za prokariotske ćelije, dok obrada sa kalcijum fosfatom ili elektroporacija mogu da se koriste za druge ćelije-domaćine (videti uopšteno Sambrook et al., gore u tekstu). Drugi postupci uključuju, npr., elektroporaciju, obradu kalcijum fosfatom, lipozomski posredovanu transformaciju, injekciju i mikroinjekciju, balističke postupke, virozome, imunolipozome, polikatjon, konjugate nukleinske kiseline, “golu” DNK, veštačke virione, fuziju sa strukturnim proteinom VP22 herpes virusa, preuzimanje DNK pojačano sredstvom, i ex vivo transdukciju. Za dugotrajnu proizvodnju visokog prinosa rekombinantnih proteina, stabilna ekspresija će često biti poželjna. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju polipeptide prema pronalasku mogu da se pripreme korišćenjem ekspresionih vektora prema pronalasku koji sadrže mesta početka virusne replikacije ili endogene ekspresione elemente i selektabilne marker gene.
[0072] U nekim aspektima otkrića, nukleinske kiseline koje kodiraju ANGPTL3 polipeptide otporne na proteazu prema pronalasku mogu da se dostave pacijentu za lečenje povrede ili bolesti povezane sa zglobom. Dostava takvih nukleinskih kiselina može da se postigne korišćenjem bilo kojih sredstava poznatih u stanju tehnike, ali se obično izvodi upotrebom direktne injekcije u pogodjeni zglob. U nekim aspektima otkrića, DNK se dostavlja kao “gola” DNK upotrebom direktne injekcije u zglob. U nekim aspektima otkrića, koristi se viralni vektor, uključujući, ali bez ograničenja, vektor na bazi adenovirusa ili adeno-asociranog virusa, vektor na bazi herpes virusa, vektor na bazi virusa kokošijih boginja, ili vektor na bazi vakcinija virusa.
Postupci terapijske upotrebe polipeptida, i indikacije
[0073] Obezbedjeni postupci prema pronalasku uključuju farmaceutske kompozicije koje sadrže inventivne polipeptide za upotrebu u lečenju subjekta koje obuhvata primenu kod subjekta terapijski efikasne količine polipeptida prema pronalasku, gde subjekt ima, ili je pod rizikom od oštećenja zgloba ili artritisa. Pronalazak takodje obezbedjuje farmaceutske kompozicije koje sadrže inventivne polipeptide za upotrebu u poboljšanju ili sprečavanju artritisa ili povrede zgloba kod humanog pacijenta, pri čemu upotreba obuhvata: primenu na zglob pacijenta kompozicije koja sadrži efikasnu količinu polipeptida prema pronalasku, čime se poboljšava ili sprečava artritis ili povreda zgloba kod pacijenta. U nekim primerima izvodjenja, pacijent ima artritis ili povredu zgloba. U nekim primerima izvodjenja, osoba nema, ali je pod rizikom od artritisa ili povrede zgloba. U nekim primerima izvodjenja, artritis je osteoartritis, artritis usled traume, ili autoimunski artritis. U nekim primerima izvodjenja, kompozicija primenjena kod pacijenta dodatno sadrži hijaluronsku kiselinu.
[0074] U drugom aspektu, pronalazak obezbedjuje postupak indukovanja diferencijacije mezenhimskih matičnih ćelija u hondrocite, pri čemu postupak obuhvata, dovodjenje u kontakt mezenhimskih matičnih ćelija sa dovoljnom količinom polipeptida prema pronalasku da bi se indukovala diferencijacija matičnih ćelija u hondrocite. U nekim primerima izvodjenja, postupak se izvodi in vivo i matične ćelije su prisutne u humanom pacijentu.
[0075] Predvidjeno je da se polipeptidi, kompozicije, i upotrebe prema predmetnom pronalasku mogu koristiti za lečenje, poboljšanje ili sprečavanje bilo kog tipa oštećenja zglobne hrskavice (npr., oštećenje zgloba ili povreda) uključujući, na primer, oštećenje nastalo zbog traumatskog dogadjaja ili kidanja tetive ili ligamenta. U nekim primerima izvodjenja, proteini prema pronalasku se primenjuju za sprečavanje ili poboljšanje artritisa ili oštećenja zgloba, na primer tamo gde postoji genetska ili porodična istorija artritisa ili oštećenja zgloba, ili povreda zgloba, ili pre ili tokom hirurške operacije zgloba. U nekim primerima izvodjenja polipeptidi i kompozicije se koriste za lečenje oštećenja zgloba. U odredjenim primerima izvodjenja oštećenje zgloba je traumatska povreda zgloba. U drugim primerima izvodjenja oštećenje zgloba je oštećenje nastalo zbog starenja ili neaktivnosti. U drugim primerima izvodjenja oštećenje zgloba je oštećenje nastalo zbog autoimunskog poremećaja. U nekim primerima izvodjenja prema pronalasku, polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska mogu da se koriste za lečenje, poboljšanje ili sprečavanje osteoartritisa. U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi i kompozicije se koriste za poboljšanje ili sprečavanje artritisa kod subjekta pod rizikom da ima ili može da dobije artritis. U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi, i kompozicije se koriste za poboljšanje ili sprečavanje oštećenja zgloba kod subjekta pod rizikom da ima ili može da dobije oštećenje zgloba.
[0076] U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska se koriste u postupku za stimulaciju proliferacije hondrocita i proizvodnje hrskavice u hrskavičavim tkivima koja su oštećena, npr., zbog traumatske povrede ili hondropatije. U odredjenim primerima izvodjenja polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska su korisni za lečenje oštećenja hrskavice u zglobovima, npr., na zglobnim površinama, npr., u kičmi, ramenu, laktu, ručnom zglobu, zglobovima prstiju, kuku, kolenu, gležnju, i zglobovima stopala. Primeri bolesti ili poremećaja kod kojih se može javiti korist od tretmana uključuju osteoartritis, reumatoidni artritis, druge autoimunske bolesti, ili disekantni osteohondritis. Osim toga, oštećenje ili kidanje hrskavice se dogadja kao rezultat izvesnih genetskih ili metaboličkih poremećaja, deformitet hrskavice se često vidja u oblicima patuljastog rasta kod ljudi, i/ili je oštećenje ili kidanje hrskavice često rezultat rekonstructivne hirurške intervencije; na taj način bi polipeptidi, kompozicije, i postupci predstavljali korisnu terapiju kod ovih pacijenata, bilo sami ili zajedno sa drugim pristupima.
[0077] Dalje je predvidjeno da polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska mogu da se koriste za lečenje, poboljšanje ili sprečavanje različitih poremećaja hrskavice i/ili udruženih simptoma ili dejstava takvih stanja. Primeri stanja ili poremećaja za lečenje, poboljšanje i/ili sprečavanje pomoću polipeptida i kompozicija prema pronalasku, uključuju, ali bez ograničenja sistemski lupus eritematozis, reumatoidni artritis, juvenilni hronični artritis, osteoartritis, degenerativnu bolest diska, spondiloartropatije, Ehlers-Danlosov sindrom, sistemsku sklerozu (skleroderma) ili oboljenje tetiva. Druga stanja ili poremećaji koja mogu da imaju koristi od tretmana polipeptidima za poboljšanje povezanih dejstava uključuju idiopatske inflamatorne miopatije (dermatomiozitis, polimiozitis), Sjogrenov sindrom, sistemski vaskulitis, sarkoidozu, autoimunsku hemolitičku anemiju (imunska pancitopenija, paroksizmalna noćna hemoglobinurija), autoimunsku trombocitopeniju (idiopatska trombocitopenična purpura, imunski posredovana trombocitopenija), tiroiditis (Graves-ova bolest, Hašimotov tiroiditis, juvenilni limfocitni tiroiditis, atrofički tiroiditis), dijabetes melitus, imunski posredovanu renalnu bolest (glomerulonefritis, tubulointerstitialni nefritis), demijelinizacione bolesti centralnog i perifernog nervnog sistema kao što je multiple skleroza, idiopatska demijelinizaciona polineuropatija ili Giljen-Bareov sindrom, i hronična inflamatorna demijelinizaciona polineuropatija, hepatobilijarne bolesti kao što je infektivni hepatitis (hepatitis A, B, C, D, E i drugi nehepatotropni virusi), autoimunski hronično aktivni hepatitis, primarnu bilijarnu cirozu, granulomatozni hepatitis, i sklerozni holangitis, inflamatornu bolest creva (ulcerativni kolitis: Kronova bolest), enteropatiju osetljivu na gluten, i Viplovu bolest, autoimunski ili imunski posredovane bolesti kože uključujući bolesti bulozne kože, multiformni eritem i kontaktni dermatitis, psorijazu, alergijske bolesti kao što je astma, alergijski rinitis, atopični dermatitis, preosetljivost na hranu i urtikarija, imunološke bolesti pluća kao što su eozinofilna pneumonija, idiopatska pulmonalna fibroza i hipersenzitivni pneumonitis, bolesti povezane sa transplantacijom uključujući odbacivanje kalema i bolest kalem-protiv-domaćina.
[0078] “Pacijent”, kako je ovde korišćeno, odnosi se na bilo koji subjekt kod koga se primenjuje terapijski polipeptid prema pronalasku. Predvidjeno je da polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska mogu da se koriste u lečenju sisara. Kako je ovde korišćeno “subjekt” se odnosi na bilo kog sisara, uključujući ljude, domaće životinje i životinje sa farme, i životinje iz zoološkog vrta, životinje koje se koriste u sportovima ili kućne ljubimce, kao što su goveda (npr. krave), konji, psi, ovce, svinje, zečevi, koze, mačke, itd. U nekim primerima izvodjenja prema pronalasku, subjekt je čovek. U odredjenim primerima izvodjenja, subjekt je konj. U drugim primerima izvodjenja subjekt je pas.
[0079] U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi prema pronalasku mogu da budu heterologi za sisara koji treba da se leči. Na primer, humani ANGPTL3 protein prema pronalasku se koristi u tretmanu životinje kao što je konj, govedo ili pas. U nekim primerima izvodjenja, heterologi ANGPTL3 protein prema pronalasku može da se koristi za umnožavanje populacije hondrocita u kulturi za transplantaciju. U nekim aspektima otkrića, umnožene kulture će zatim izborno biti pomešane sa polipeptidima i kompozicijama koje su homologe za sisara koji treba da se tretira, i smeste u prostor zgloba ili direktno u oštećenje hrskavice. Polipeptidi prema pronalasku se koriste u lečenju artritisa ili oštećenja zgloba kod humanog pacijenta. Korišćenjem proteina izvedenog iz iste vrste sisara kao ona koja se tretira, mogu da se izbegnu neplanirani imunski odgovori.
[0080] U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska primenjuju se direktnom injekcijom u sinovijalnu tečnost zgloba, sistemskom primenom (oralna ili intravenska) ili direktno u oštećenje hrskavice, ili same ili kombinovane sa pogodnim nosačem za produženo oslobadjanje proteina. U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi ili kompozicije se primenjuju u biokompatibilnom matriksu ili skeli. Polipeptidi, kompozicije, i postupci predmetnog pronalaska mogu takodje da se koriste u kombinaciji sa hirurškom procedurom na pogodjenom zglobu. Primena polipeptida prema pronalasku može da se dogodi pre, tokom ili u kombinaciji sa, i/ili posle hirurške procedure. Na primer, polipeptidi i kompozicije prema pronalasku mogu da se koriste za umnožavanje populacije hondrocita u kulturi za autologu ili alogenu implantaciju hondrocita (ACI). Hondrociti mogu da budu izborno implantirani sa istovremenim tretmanom koji se sastoji od primene polipeptida i kompozicija predmetnog pronalaska. U ovim postupcima, na primer, hondrociti mogu da se artroskopski sakupe sa nepovredjene male noseće površine oštećenog zgloba, i mogu da se kultivišu in vitro, izborno u prisustvu polipeptida i kompozicija predmetnog pronalaska i/ili drugih faktora rasta da bi se povećao broj ćelija pre transplantacije. Umnožene kulture se zatim izborno mešaju sa polipeptidima i kompozicijama predmetnog pronalaska i/ili smeštaju u prostor zgloba ili direktno u oštećenje. U odredjenim primerima izvodjenja, umnožene kulture (izborno sa polipeptidima predmetnog pronalaska) se smeštaju u prostor zgloba suspendovane u matriksu ili membrani. U drugim primerima izvodjenja, polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više periostealnih ili perihondrijalnih kalema koji sadrže ćelije koje obrazuju hrskavicu i/ili pomažu da se transplantirani hondrociti ili prekursorske ćelije hondrocita drže na mestu. U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi i kompozicije predmetnog pronalaska se koriste za popravku oštećenja hrskavice u kombinaciji sa drugim postupcima, uključujući ali bez ograničenja ispiranje zgloba, stimulaciju kosne srži, abrazionu artroplastiku, subhondralno bušenje, ili mikrofrakturu proksimalne subhondralne kosti. Izborno, nakon primene polipeptida i kompozicija predmetnog pronalaska i rasta hrskavice, dodatni hirurški tretman može da bude koristan za pogodno oblikovanje novoobrazovane/novoobrazovanih površina hrskavice.
Farmaceutske kompozicije
[0081] Terapijske kompozicije koje sadrže obezbedjene polipeptide su u okviru obima predmetnog pronalaska, i posebno su razmatrane u svetlu identifikacije nekoliko polipeptidnih sekvenci koje pokazuju poboljšanu stabilnost i otpornost na proteazu. Na taj način, u sledećem aspektu, pronalazak obezbedjuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapijski efikasnu količinu polipeptida prema pronalasku. U odredjenim primerima izvodjenja, farmaceutske kompozicije dodatno sadrže farmaceutski ili fiziološki prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvodjenja, farmaceutska kompozicija dalje sadrži hijaluronsku kiselinu ili njen derivat.
[0082] Osim toga, pronalazak obezbedjuje polipeptide za upotrebu u lečenju, poboljšanju ili sprečavanju artritisa ili povrede zgloba kod humanog pacijenta, pri čemu tretman obuhvata: primenu na zglob pacijenta kompozicije koja sadrži efikasnu količinu polipeptida prema pronalasku, poboljšavajući ili sprečavajući na taj način artritis ili povredu zgloba kod pacijenta. U nekim primerima izvodjenja, pacijent ima artritis ili povredu zgloba. U nekim primerima izvodjenja, pojedinac nema, ali je pod rizikom od artritisa ili povrede zgloba. U nekim primerima izvodjenja, artritis je osteoartritis, artritis usled traume, ili autoimunski artritis. U nekim primerima izvodjenja, primenjena kompozicija dodatno sadrži hijaluronsku kiselinu.
[0083] U drugom aspektu, pronalazak obezbedjuje polipeptide za upotrebu u postupku za indukciju diferencijacije mezenhimskih matičnih ćelija u hondrocite, pri čemu postupak obuhvata dovodjenje u kontakt mezenhimskih matičnih ćelija sa dovoljnom količinom polipeptida prema pronalasku za indukciju diferencijacije matičnih ćelija u hondrocite. U nekim primerima izvodjenja, postupak se izvodi in vivo, matične ćelije su prisutne u humanom pacijentu, i dovodjenje u kontakt obuhvata primenu na zglob pacijenta kompozicije koja sadrži efikasnu količinu polipeptida prema pronalasku, indukujući tako diferencijaciju matičnih ćelija u hondrocite, i stvaranje hrskavice.
[0084] Terapijske kompozicije koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide prema pronalasku mogu da budu dostavljene pacijentu za lečenje povrede ili bolesti povezane sa zglobom. U nekim aspektima otkrića, farmaceutske kompozicije sadrže “golu” DNK koja kodira polipeptid prema pronalasku. U nekim aspektima otkrića, viralni vektor se koristi za postizanje dostavljanja i farmaceutska kompozicija sadrži vektor koji kodira polipeptid prema pronalasku, uključujući, ali bez ograničenja, vektor na bazi adenovirusa ili vektor na bazi adeno-asociranog virusa, vektor na bazi herpes virusa, vektor na bazi virusa kokošjih boginja, ili vektor na bazi vakcinija virusa. Farmaceutske kompozicije sadrže terapijski efikasnu količinu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema pronalasku sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim nosačem.
[0085] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbedjeni polipeptidi se razmatraju za upotrebu kao lek za lečenje oštećenja zgloba. U odredjenim primerima izvodjenja obezbedjeni su polipeptidi prema pronalasku za upotrebu kao lek za poboljšanje artritisa ili oštećenja zgloba. U nekim primerima izvodjenja artritis je osteoartritis, artritis usled traume ili autoimunski artritis. U nekim primerima izvodjenja oštećenje zgloba je traumatska povreda zgloba, autoimunsko oštećenje, oštećenje povezano sa starenjem, ili oštećenje povezano sa neaktivnošću. U drugim aspektima otkrića, obezbedjena je nukleinska kiselina koja kodira polipeptid prema pronalasku za upotrebu u leku.
[0086] Formulacije pogodne za primenu uključuju ekscipijense, uključujući ali bez ograničenja, vodene i nevodene rastvore, izotonične sterilne rastvore, koji mogu da sadrže antioksidanse, pufere, bakteriostatike, i rastvorljive supstance koje čine formulaciju izotoničnom, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da uključuju sredstva za suspendovanje, sredstva za rastvaranje, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore i konzervanse. U odredjenim primerima izvodjenja farmaceutske kompozicije sadrže terapijski efikasnu količinu peptida u smeši sa farmaceutski prihvatljivim sredstvom za formulaciju odabranim tako da odgovara načinu primene, formatu dostave, i željenoj dozi. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences (18<th>Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), i sledeća izdanja iste. Primarno sredstvo za dostavu ili nosač u farmaceutskim kompozicijama može da bude vodeno ili nevodeno po svojoj prirodi. Na primer, pogodno sredstvo za dostavu ili nosač za injekciju može da bude voda, fiziološki rastvor ili veštački cerebrospinalni fluid, izborno obogaćen drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Na primer, puferi mogu da se koriste, npr., za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na neznatno nižem pH, obično u opsegu od oko pH 5 do oko pH 8, i mogu izborno da uključuju sorbitol, serum albumin, deterdžent, ili druge dodatne sastojke. U odredjenim primerima izvodjenja farmaceutske kompozicije koje sadrže polipeptide ili nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema pronalasku mogu da se pripreme za skladištenje u liofilizovanom obliku korišćenjem odgovarajućih ekscipijenasa (npr., saharoze).
[0087] U drugim primerima izvodjenja formulacija sa sredstvom, kao što su injektabilne mikrosfere, bioerodirajuće čestice, polimerna jedinjenja, perle, ili lipozomi ili druge biokompatibilne matrice koje obezbedjuju kontrolisano ili dugotrajno oslobadjanje polipeptida ili nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema pronalasku može da bude dostavljena putem depo injekcije. Na primer, polipeptidi ili nukleinska kiselina koja kodira polipeptid prema pronalasku mogu da budu inkapsulirani u lipozome, ili formulisani kao mikročestice ili mikrokapsule ili mogu da budu ugradjene u druga sredstva za dostavu, kao što su biorazgradivi polimeri, hidrogelovi, ciklodekstrini (videti na primer Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., medjunarodne PCT objave br. WO 03/47518 i WO 03/46185), poli(laktatna-ko-glikolna)kiselina (PLGA) i PLCA mikrosfere (videti, na primer američki pat. br. 6,447,796 i objavu američke patentne prijave br. US 2002130430), biorazgradive nanokapsule, i bioadhezivne mikrosfere, ili proteinski vektori (O'Hare and Normand, medjunarodna PCT objava br. WO 00/53722) ili upotrebom konjugata. Drugi pogodni mehanizmi za dostavu uključuju uredjaje za dostavu koji mogu da se implantiraju.
[0088] Doza jedinjenja predmetnog pronalaska za lečenje gore pomenutih bolesti ili poremećaja varira u zavisnosti od načina primene, starosti i/ili telesne težine subjekta, i stanje subjekta koji treba da se leči, i konačno će biti odredjena od strane nadležnog lekara ili veterinara. Doza primenjena kod subjekta, u kontekstu predmetnog pronalaska treba da bude dovoljna za postizanje korisnog odgovora kod subjekta tokom vremena. Takva doza je “terapijski efikasna količina”. Prema tome, odgovarajuća doza može da bude odredjena efikasnošću odredjenog proteina ili nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema pronalasku koji su u pitanju i stanjem subjekta, kao i telesnom težinom ili površinom oblasti koja treba da se tretira. Veličina doze će takodje biti odredjena postojanjem, prirodom, i stepenom bilo kojih neželjenih sporednih efekata koji prate primenu konkretnog proteina ili vektora kod konkretnog subjekta. Primena može da se postigne putem pojedinačne ili podeljenih doza, ili kao kontinuirana infuzija putem uredjaja za implantaciju ili katetera. Frekvencija doziranja će zavisiti od farmakokinetičkih parametara polipeptida ili nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema pronalasku u korišćenoj formulaciji. Kliničar može da titrira dozu i/ili modifikuje primenu da bi se postigla željena terapijska dejstva. Tipične doze su u opsegu od oko 0.01 µg/kg do oko 100 mg/kg, u zavisnosti od faktora. U odredjenim primerima izvodjenja, doze su u opsegu od oko 0.1 µg/kg do oko 10 mg/kg; ili oko 0.1 µg/kg; oko 0.5 µg/kg; oko 1 µg/kg; oko 2 µg/kg; oko.5 µg/kg; oko 10 µg/kg; oko 15 µg/kg; oko 20 µg/kg; oko 25 µg/kg; oko 30 µg/kg; oko 35 µg/kg; oko 40 µg/kg; oko 45 µg/kg; oko 50 µg/kg; oko 55 µg/kg; oko 60 µg/kg; oko 65 µg/kg; oko 75 µg/kg; oko 85 µg/kg; oko 100 µg/kg. U odredjenim primerima izvodjenja doza je oko 50 µg/kg; oko 100 µg/kg; oko 150 µg/kg; oko 200 µg/kg; oko 250 µg/kg; oko 300 µg/kg; oko 350 µg/kg; oko 400 µg/kg; oko 450 µg/kg; oko 500 µg/kg; oko 550 µg/kg; oko 600 µg/kg; oko 650 µg/kg; oko 700 µg/kg; oko 750 µg/kg; oko 800 µg/kg; oko 850 µg/kg; oko 900 µg/kg; oko 950 µg/kg; oko 1 mg/kg; oko 2 mg/kg; oko 3 mg/kg; oko 4 mg/kg; oko 5 mg/kg; oko 6 mg/kg; oko 7 mg/kg; oko 8 mg/kg; oko 9 mg/kg; oko 10 mg/kg.
Metode primene
[0089] Bilo koji postupak za dostvu polipeptida prema pronalasku do pogodjenog zgloba mogu da se koriste. U praktikovanju ovog pronalaska, kompozicije mogu da se primene parenteralno, na primer da se injektuju, npr., intra-artikularno (tj., u zglob), intravenski, intramuskularno, subkutano; infuzijom, ili implantacijom, npr., u membranu, matriks, uredjaj, itd. Pri injektovanju, infuziji ili implantaciji, dostava može da bude usmerena u pogodno tkivo ili zglob, i dostava može da bude usmerena bolus dostava ili kontinuirana dostava. U nekim primerima izvodjenja dostava može da bude u pogodno tkivo smešteno u neposrednoj blizini pogodjenog zgloba. U nekim primerima izvodjenja dostava može da bude putem difuzije, ili posredstvom bolusa sa vremenskim oslobadjanjem. U nekim primerima izvodjenja, sistem sa kontrolisanim oslobadjanjem (npr., pumpa) može da bude smeštena u blizini terapijskog cilja, npr., zgloba na koji se polipeptid primenjuje. U drugim primerima izvodjenja, kompozicije mogu da budu odabrane za ingestiju, npr., inhalaciju ili oralnu dostavu.
[0090] Terapijski polipeptidi predmetnog pronalaska mogu takodje da se koriste efikasno u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sredstava (npr., hijaluronska kiselina ili njen derivat ili so, faktor rasta (npr., FGF18, BMP7), hondrogeno sredstvo (npr., oralni kalcitonin lososa, SD-6010 (iNOS inhibitor), vitamin D3 (holekalciferol), hidrolizat kolagena, rusalatid acetat, nesaponifikovane supstance avokada i soje (ASU), jedinjenje opisano u WO2012/129562, kartogenin), steroidom, nesteroidnim anti-inflamatornim sredstvom (NSAID), itd.) u zavisnosti od željene terapije ili dejstva na poboljšanje ili pojačanje terapijskog dejstva oba. Ovaj tretman može da uključuje primenu oba sredstva kod pacijenta u isto vreme, bilo kao pojedinačne kompozicija ili farmakološke formulacije koja uključuje oba sredstva, ili primenom dve odvojene kompozicije ili formulacije, gde jedna kompozicija uključuje polipeptid prema pronalasku i druga uključuje drugo sredstvo/sredstva. Primena terapijske kompozicije koja sadrži polipeptid prema pronalasku može da prethodi ili sledi nakon primene drugog sredstva u intervalima u opsegu od minuta do nedelja.
[0091] Formulacije jedinjenja mogu da se skladište u sterilnim fiolama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, ili kao dehidratisani ili liofilizovani prah. Formulacije mogu da budu date u jednodoznim ili višedoznim hermetički zatvorenim kontejnerima, kao što su ampule i fiole. U nekim primerima izvodjenja formulacije mogu da budu date u jedno- ili višekomornim napunjenim injekcionim špricevima (npr., špricevi za tečnost, lizo-špricevi). Rastvori i suspenzije mogu da se pripreme iz sterilnih prahova, granula i tableta kao što su one koje su prethodno opisane.
[0092] Takodje su opisani kitovi koji sadrže polipeptide ili nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema pronalasku. U jednom aspektu opisani su kitovi za dobijanje pojedinačne dozne jedinice. Kit sadrži prvi kontejner koji sadrži osušeni polipeptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema pronalasku i drugi kontejner koji ima vodenu formulu za rekonstituciju. U izvesnim aspektima otkrića jedan kontejner sadrži jednokomorni napunjeni injekcioni špric. U drugim aspektima otkrića kontejneri su obuhvaćeni u vidu multikomornog napunjenog injekcionog šprica.
Primeri
[0093] Primeri koji slede dati su kao ilustracija, a ne kao ograničenje za pronalazak za koji se traži zaštita.
Primer 1: Konstrukti peptida Angptl3 otpornih na proteazu
[0094] Različiti mutanti nastali skraćivanjem N-terminalnog kraja su konstruisani da bi se uklonile O-vezane glikozilacije i olakšala biofizička karakterizacija proteina. Za identifikaciju peptida otpornih na proteazu, aminokiselinske supstitucije su uvedene na različite položaje peptidnih fragmenata humanog Angptl3 koji odgovaraju C-terminalnom regionu peptida. Slika 1 prikazuje položaje mutacija u humanom Angptl3. Konstrukti su na početku pripremljeni sa His oznakama. Mutantni proteini su bili: 225-460 K423Q (225KQ), 225-460 S424T(225ST), 226-460 K423Q (226KQ), 226-460 K423S (226KS), 228-460 K423Q (228KQ), 228-460 S424T (228ST), 233-460 K423Q (233KQ), 233-460 K423S (233KS), 241-460 K423Q (241KQ), 241-460 K423S (241KS), 241-460 Kdel (241Kdel), 242-460 K423Q (242KQ), 242-460 K423S (242KS) i 242-460 Kdel (242Kdel).
[0095] His-označeni proteini su eksprimirani u HEK Freestyle<TM>ćelijama i prečišćeni pomoću Ni-NTA hromatografije na koloni. C-terminalni konstrukti bez dodatih oznaka su takodje klonirani, prečišćeni prethodno opisanim postupkom (Gonzalez R et al PNAS 2010). Ukratko, ciljni protein sa signalnom sekvencom (1-16) je kloniran u sisarski ekspresioni vektor sa citomegalovirusnim promotorom. Na 96 časova posle transfekcije DNK/PEI u HEK 293 Freestyle (Invitrogen), medijumi koji sadrže sekretovani ciljni protein su sakupljeni i prečišćeni na Hi-Trap SP koloni (GE Healthcare). Protein je eluiran u intervalu izmedju 50 mM MES (pH 6.0), 125 mM NaCl do 50 mM MES (pH 6.0), 150 mM NaCl. SDS-PAGE je potvrdila da je prečišćeni protein imao najmanje 95% čistoće.
[0096] Otpornost na proteazu procenjena je kao što sledi. Ograničena tripsinoliza izvedena je inkubacijom 10 ng svakog pripremljenog proteina sa tripsinom u masenom odnosu od 8000:1 (protein:tripsin) tokom jednog časa na sobnoj temperaturi. Reakcija tripsinolize je zatim ugašena dodavanjem sirćetne kiseline da bi se reakcija dovela na pH 3.0, i ugašeni uzorci su ispitivani pomoću LC/MS. Pik na 5 min RP HPLC koji odgovara masi 43 C-terminalne aminokiseline (S424-E460) bio je uočljiv za odgovarajuće konstrukte proteina divljeg tipa. Mesto sečenja bilo je na istom mestu, tj., izmedju K423 i S424, kao što je zapaženo tokom proizvodnje proteina divljeg tipa ANGPLT3 cele dužine. Ovaj pik je bio odsutan kada je Lys na mestu sečenja mutiran u Gln. Svaki od peptidnih konstrukata 225KQ, 228KQ, 233KQ, 233KS, 241KQ, i 242KQ; i divljeg tipa 225 peptida je pripremljen i ispitan. Pik koji odgovara masi 43 C-terminalne aminokiseline bio je odsutan kada je Lys na mestu sečenja bio mutiran u Gln ili Ser za svaki od konstrukata, ili kada je Lys na položaju 423 bio deletiran.
Primer 2: Ogledi vezivanja integrina
[0097] Integrin αVβ3 Pripremljeni peptidi 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ i 242KQ su ispitani in vitro za vezivanje integrina αVβ3. Ukratko, ploče Maxisorp su obložene sa 2 µg/ml integrina αVß3, i različite koncentracije polipeptidnog konstrukta (naznačeno) su dodate. Vezani peptid je detektovan dodatkom anti-ANGPTL3 mAb što je praćeno kozjim anti-mišjim IgG antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena. Svi ispitani peptidi su zadržali ili poboljšali kapacitet vezivanja integrina. EC50za svaki je odredjena iz podataka o vezivanju, i rezultati su prikazani u TABELI 2.
TABELA 2: In vitro vezivanje ANGPTL3 i konstrisanih polipeptidnih konstrukata za integrine
[0098] Integrin α5β1 Pripremljeni peptidi 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ i 242KQ su ispitani in vitro za vezivanje integrina α5β1. Ploče su obložene sa 2 µg/ml kao što je gore opisano, ali sa integrinom α5ß1, i različite koncentracije polipeptidnog konstrukta (naznačeno) su dodate, i detekcija je sprovedena što je gore opisano. Svi ispitani peptidi su zadržali ili poboljšali kapacitet vezivanja integrina. EC50za svaki je odredjena iz podataka o vezivanju, i rezultati su prikazani u TABELI 2.
Primer 3: Funkcionalno ispitivanje konstrukata
[0099] Ćelijska kultura i diferencijacija. Primarne mezenhimske matične ćelije izvedene iz kosne srži čoveka (hMSC) bile su sortirane pomoću FACS i pokazano je da su >98% pozitivne za CD29, CD44, CD166 i CD105 i <0.1% pozitivne za CD45; i za eksperimente su korišćene ćelije u pasažama 2-8. Rezidentne MSC ćelije hrskavice čoveka (hCR-MSC) izvedene su iz humanih primarnih hondrocita zgloba, koji su razdvojeni na pojedinačne ćelije, klonalno gajene u MSCGM i validirane kao MSC kroz hondrogenu, osteogenu i adipogenu diferencijaciju. Ćelije su bile sortirane pomoću FACS i pokazano je da su >98% pozitivne za CD166 i CD105. Ćelije hCR-MSC su kultivisane do 20 pasaža bez izmene ćelijskog profila, odredjene su stope rasta ili diferencijacije.
[0100] Hondrogeneza. Peptidni konstrukti prema pronalasku su procenjeni u fizičkim i funkcionalnim testovima za procenu aktivnosti hondrogeneze.
[0101] Konstrukati dobijeni genetskim inženjeringom koji su ovde obezbedjeni izvedeni su iz ANGPTL3 koji pripada familiji od sedam identifikovanih ANGPTL proteina koji imaju strukturnu sličnost sa angiopoetinima, ali kojima nedostaje sposobnost vezivanja za Tie2 receptor i stoga imaju drugačije funkcije. ANGPTL proteini sadrže N-terminalni bispiralni domen (CCD) i C-terminalni fibrinogenu-sličan domen (FLD), i veruje se da su čvrsto regulisani svojim mikrookruženjem i interakcijama sa ekstracelularnim matriksom (ECM) kao što su fibronektin i integrini. Conklin et al., Genomics 62(3): 477-482 (1999); Goh YY, et al., Am J Pathol 177(6): 2791-2803 (2010); Goh YY, et al J Biol Chem 285(43): 32999-33009(2010). Sekvence za članove familije ANGPTL koji su najsrodniji ANGPTL3, ANGPTL1 (cela dužina i C-terminalni domen) i ANGPTL4 (cela dužina i C-terminalni domen) date su u tabeli 3; a tabela 5B prikazuje poravnanje duž C-terminalnih domena ovih članova familije. Identičnosti sekvence duž ekstracelularnih domena i C-terminalnih domena ANGPTL1, ANGPTL4, kao i drugih angiopoietinskih proteina ANGPTL7, ANGPT1 i ANGPT2 date su u tabeli 5A. C-terminalni domen (CT) ANGPTL3 deli 37% identičnosti sekvence sa CT ANGPTL1 i 40% identičnosti sekvence sa CT ANGPTL4.
[0102] 2D hondrogeneza na bazi ćelija indukovana je in vitro i procenjena kao što je prethodno opisano kod Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717. Ukratko, primarne mezenhimske matične ćelije izvedene iz kosne srži čoveka (hMSC) zasejane su u medijum za rast, koji je zatim redom zamenjen medijumom za hondrogenu stimulaciju sa i bez konstrukata.
[0103] Da bi se na početku snimilo obrazovanje nodula, bunarčići su fiksirani i obojeni bojom rodamin B pri čemu su noduli bili lako detektovani vizuelno i snimci su uradjeni pomoću svetlosnog mikroskopa. Da bi se olakšala visokopropusna detekcija i kvantitativno odredjivanje na bazi snimka, hondrogeni noduli su obojeni bojom Nil crveno koja se nespecifično vezuje za kolagene. Noduli obojeni bojom Nil crveno su kvantitativno odredjeni na Acumen eX3 (uredjaj za snimanje velikog sadržaja) putem pobudjivanja 488-laserom za brzu detekciju nodula.
TABELA 3: Sekvence familije ANGPTL
TABELA 4: Hondrogeneza proteina-članova familije ANGPTL
[0104] 2D hondrogeneza zasnovana na ćelijama indukovana je in vitro i procenjena kao što je prethodno opisano kod Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717. Ukratko, primarne mezenhimske matične ćelije izvedene iz kosne srži čoveka (hMSC) zasejane su u medijumu za rast koji je zatim redom zamenjen medijumom za hondrogenu stimulaciju sa i bez konstrukata, i kultivisane 7 ili 14 dana. Ćelije su zatim fiksirane formaldehidom, oprane i potom obojene korišćenjem standardnih imuno-citohemijskih tehnika da bi se detektovali proteini primarne hrskavice prokolagena tipa 2A (PIIANP) (slika 2A) i kolagena tipa II (slika 2B). Za detekciju kolagena tipa II, ćelije su digestirane sa 0.2% kolagenaze II (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ) koja je dodata rastvoru za permeabilizaciju. Detektovana imuno-fluorescencija za svaki protein je kvantitativno odredjena pomoću snimanja visokog sadržaja (Image Express Ultra (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornija)), upotrebom protokola za bodovanje ćelija na više talasnih dužina, i kao što je prethodno opisano. Videti sliku 2. Ekspresija agrekana je praćena pripremanjem ćelija kao što sledi: ukratko, primarne hMSC (5000 ćelija) je zasejano u ploču Griener sa 384 bunarčića. Nakon 24 časa medijum za rast je uklonjen i zamenjen sa 25µl DMEM koji sadrži 1% FBS. Zatim su u svaki bunarčić dodati proteinski konstrukti u naznačenoj dozi, i kulture su gajene na 37°C tokom 3 dana. Ćelije were su fiksirane sa 10% formalina i podvrgnute imunocitohemijskim postupcima za detekciju ekspresije proteina agrekana. Bunarčići su snimljeni pomoću ImageXpress Ultra i kvantitativno odredjeni pomoću protokola za bodovanje ćelija na više talasnih dužina, n=6/koncentracija proteina. Rezultati su prikazani na slici 3B u odnosu na kontrolu (ćelije stimulisane bez konstrukta, sam razblaživač) za C-terminalni (225-460) ANGPTL3 WT divljeg tipa, konstrukt dobijen genetskim inženjeringom 242KQ ili 242Kdel ili ANGPTL1 cele dužine, srodnog člana familije ANGPTL proteina. Slični rezultati su vidjeni u eksperimentima u kojima je korišćen svaki od 225WT, 225KQ, 226KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ i 242KQ konstrukata.
[0105] Ogledi za hondrogenezu su sprovedeni upotrebom ogleda i postupaka koji su opisani ranije i u ovom tekstu za dodatne članove familije srodne ANGPTL. Eksperimenti su izvedeni da bi se ispitalo da li blisko srodni proteini poseduju hondrogenu aktivnost, i da li je aktivnost sačuvana na C-terminalnom kraju proteina. ANGPTL1 i ANGPTL4 su pokazali aktivnost u ogledima obrazovanja nodula; medjutim, samo je ANGPTL1 ispoljio indukciju kolagena tipa II u ogledima hondrogeneze. Videti tabelu 4. Rezultati aktivnosti obrazovanja nodula i ogleda indukcije kolagena tipa II prikazani su u tabeli 4. Dodatna karakterizacija ANGPTL1 je ovde opisana. Videti druge delove ovog primera i slike 3-5.
TABELA 5: Homologija sekvence izmedju članova angiopoetinu-slične familije čoveka 5A: Identičnost sekvence izmedju članova angiopoetinu-slične familije čoveka (ECD ili CTD)
5B: Poravnanje sekvence C-terminalnih domena članova angiopoetinu-slične familije čoveka hANGPTL1(271-491) /hANGPTL3(241-460) /hANGPTL4(179-406)
[0106] Ispitivanje ekspresije RNK je takodje korišćeno za procenu ekspresije specifičnih proteina hrskavice. Ukratko, qRT-PCR hMSC su gajene u sedimentnoj kulturi (1x10<6>ćelija/talogu) tokom 3, 7, 10, 21 dana u medijumu DMEM bez seruma, 1X ITS sa dodatim konstruktima (kao što je naznačeno). Medijum je zamenjivan svaka 3 dana. Ekspresija iRNK za lubricin, agrekan, Sox9, IGF1, IFITM1, osteokalcin i kolagen tipa X je kvantitativno odredjena korišćenjem Roche LightCycler (podaci su sakupljeni iz 3 eksperimenta izvedena u duplikatu (n=6)). Slika 3A predstavlja podatke o ekspresiji 10. dana za 242KQ i 225WT. Podaci o genskoj ekspresiji su bili slični za sve gene 3, 7. i 21. dana.
[0107] Prethodno je pokazano da ANGPTL3 cele dužine ima aktivnost hondrogeneze u mezenhimskim matičnim ćelijama i čoveka i miša. Ispitivana je aktivnost konstrukata u mezenhimskim matičnim ćelijama čoveka, miša, pacova i psa da bi se pokazala sposobnost ukrštene reaktivnosti sa dodatnim vrstama. Ćeljie CR-MSC miša, pacova, čoveka i psa su kultivisane sa konstruktima kao što je gore opisano tokom 18 dana. Kulture su fiksirane i obojene korišćenjem standardnih imunocitohemijskih tehnika za detekciju hondrocit- specifičnog proteina, i ćelije pozitivne na kolagena tipa II su kvantitativno odredjene upotrebom snimanja visokog sadržaja. Slično višestruko povećanje količine kolagena tipa II koji je kvantitativno odredjen, potvrdjeno je za svaku vrstu procenjivanih ćelija.
[0108] Hondroprotekcija. Hondroprotektivna aktivnost peptidnih konstrukata je procenjivana u funkcionalnim ogledima.
[0109] Ogled inhibicije oslobadjanja glikozaminoglikana (GAG) ex vivo (indikator oštećenja matriksa) izveden je kao što je opisano kod Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717-721. Ukratko, govedja hrskavica je izdvojena, isečena na simetrične krugove i stavljena u kulturu organa. Režnjevi su tretirani 48 časova sa 20 ng/ml TNFα i 10 ng/ml onkostatina M (OSM) (medijatori inflamacije), za indukciju razgradnje matriksa hrskavice, u prisustvu ili odsustvu proteinskih konstrukata da bi se odredio procenat inhibicije oslobadjanja glikozaminoglikana (GAG). Rezultati prikazani na slici 4A prikazuju podatke sakupljene od 4 donora, n=12 sa konstrukatima dobijenim genetskim inženjeringom kao što je naznačeno i WT 225-460.
[0110] Ogled inhibicije azot oksida (NO) in vitro (indikator hondroprotekcije) izveden je kao što je opisano kod Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717-721. Ukratko, primarni hondrociti su tretirani 48 časova sa proteinskim konstruktima kao što je naznačeno. Izvedena je Greiss-ova reakcija da bi se odredilo dejstvo konstrukata na inhibiciju oslobadjanja NO. Rezultati prikazani na slici 4B prikazuju rezultate sa konstrukatima dobijenim genetskim inženjeringom kao što je naznačeno i C-terminalnim fragmentom 225-460 divljeg tipa. Rezultati prikazani na slici 4C prikazuju rezultate sa C-terminalnim ANGPTL1 divljeg tipa, genetskim inženjeringom dobijenim ANGPTL3 242KQ ili kontrolom.
[0111] Inhibicija obrazovanja fibrozne hrskavice. Primarni humani hondrociti zgloba kultivisani su kao što je gore opisano uz dodatak askorbinske kiseline i u prisustvu ili odsustvu konstrukata (naznačeno) tokom 14 dana za indukciju hipertrofije, i ekspresija kolagena tipa X je procenjivana pomoću imunoflurescencije. Rezultati prikazani na slici 5A prikazuju podatke sa konstruktima 225WT ili 242KQ kao što je naznačeno. Rezultati prikazani na slici 5B prikazuju podatke sa C-terminalnim ANGPTL1 divljeg tipa, genetskim inženjeringom dobijenim ANGPTL3 242KQ ili 242Kdel ili C-terminalnim ANGPTL3 fragmentom 225-460 divljeg tipa, kao što je naznačeno. Prisustvo divljeg tipa ili aktivnih konstrukata dovodi do inhibitornog dejstva na obrazovanje fibrozne hrskavice pod hipertrofičnim uslovima, kao što je utvrdjeno ekspresijom kolagena tipa X.
[0112] Angiogeneza. Prijavljeno je da C-terminalni domen ANGPTL3 proteina divljeg tipa ima angiogenu aktivnost i svojstva in vitro i in vivo u kornealnom modelu pacova. Videti Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277(19): 17281-17290 (2002). Da bi se utvrdio mogući rizik od indukcije novih krvnih sudova nakon in vivo primene C-terminalnog ANGPTL3, izvedeni su in vitro ogledi angiogeneze. Ukratko, primarne humane endotelijalne ćelije umbilikalne vene (HUVEC) su preko noći izgladnjivane bez seruma sa osnovnim medijumom za endotelijalne ćelije. Ćelije su zatim obeležene zelenom bojom za praćenje ćelija i dodate unapred obloženim matrigel pločama sa dodatim proteinskim konstruktom (naznačeno). Nakon kultivisanja tokom 18 časova u prisustvu ANGPTL3 cele dužine (50 ng/mL) ili 242KQ (50 ng/mL) ili bFGF (50 ng/mL) koji je korišćen kao pozitivna kontrola, broj tačaka grananja i ukupna dužina obrazovanih sudova je kvantitativno odredjena upotrebom snimanja visokog sadržaja kao mera angiogene aktivnosti. Nasuprot dejstvu koje je primećeno u prisustvu ANGPTL3 cele dužine ili pozitivne kontrole, nije otkriveno značajno povećanje ni u jednom parametru kada su ćelije inkubirane sa 242KQ. Videti sliku 2C.
[0113] CR-MSC postoje unutar hijalinske zglobne hrskavice i njihov broj se povećava kao odgovor na povredu. Nakon povrede tkiva hrskavice, ove ćelije imaju kapacitet da učestvuju u procesu oporavka, ali ne mogu same da dovedu do dovoljnog oporavka hrskavice. Pacijentima zbog toga ostaje zglobna hrskavica kojoj nedostaje dovoljna sposobnost da podrži bezbolne pokrete zgloba i često im je potrebna hirurška intervencija i/ili zamena zgloba da bi se njihov kvalitet života održao. Našli smo da ANGPTL3 i naročito genetičkim inženjeringom dobijeni ANGPTL3 peptidi otporni na proteazu imaju sposobnost da usmeravaju diferencijaciju humanih CR-MSC u hondrocite, specifično sekretujući proteine hijalinske zglobne hrskavice kolagen tipa II i Sox9, uz inhibiciju obrazovanja fibrozne hrskavice označenog ekspresijom kolagena tipa X.
[0114] Prema našem saznanju, ekspresija ANGPTL3 nije prijavljena niti primećena u našim ispitivanjima upotrebom western blot postupka u humanim hondrocitima, humanim MSC ili humanim sinovijalnim fibroblastima. U zglobovima glodara, malo ili nimalo ekspresije nije nadjeno putem imunohistohemije (IHC). Medjutim, u sinovijalnom fluidu humanog osteoartritisa (n=2), detektovan je nizak nivo ANGPTL3 (1.3-6.0 ng/mL) pomoću enzimski vezanog imunosorbentnog ogleda (ELISA), ukazujući na to da u oštećenom zglobu, protein koji se nalazi u sistemskoj cirkulaciji može da udje u sinovijalnu šupljinu.
Primer 4: Ispitivanje konstrukata in vivo
[0115] Hirurški model akutne povrede kod miša. Hirurška transekcija prednjeg ukrštenog ligamenta (ACL), medijalnog tibijalnog ligamenta meniskusa (MMTL), i medijalnog kolateralnog ligamenta (MCL) desnog kolena C57BL/6 miševa (n=12/grupi) je izvedena da bi se indukovala nestabilnost zgloba kolena što vodi OA fenotipu, prilagodjeno iz prethodno opisanog modela prema Glasson, S.S., et al., Osteoarthritis Cartilage 15, 1061 (2007). Za procenu potencijalne terapijske koristi od tretmana sa ANGPTL3, 15 nedelja nakon hirurške intervencije, miševima je intraartikularno data doza kao što je naznačeno na slici 6A jednom nedeljno u nedeljama 17-19: doza mANGPTL3 = 200 ng/kolenu. Kvantitativne procene tibijalnog platoa su uradjene na skali 0-4, pri čemu je 0 normalan nalaz, a 5 ozbiljan osteoartritis (kidanje hrskavice celom debljinom). Dva isečka iz svakog miša su su ocenjivana naslepo od strane dva nezavisna posmatrača (slika 6B).
[0116] Ublažavanje osteoartritisom indukovanog bola kod životinja mereno je testiranjem nesposobnosti, ili odredjivanjem procenta vremena tokom koga je miš stajao na hirurški tretiranom ekstremitetu nasuprot netretiranog ekstremiteta korišćenjem uredjaja za praćenje nesposobnosti. Slika 7 prikazuje rezultate očitavanja, koji predstavljaju odgovor na bol 35. i 56. dana posle operacije koji je prikazan kao % težine koja leži na operisanom ekstremitetu nasuprot neoperisanog ekstremiteta. Tretman prikazuje rezultate za životinje koje su primile dozu kao što je gore opisano mišjeg ANGPTL3 (WT17-460) cele dužine ili C-terminalni humani ANGPTL3 (WT225-460).
[0117] Mišji model hroničnog OA (indukovanog kolagenazom VII) Još jedan široko korišćeni životinjski model osteoartritisa, model hronične povrede zgloba indukovan kolagenazom VII, korišćen je za procenu efikasnosti konstrukata in vivo. Model i procena je izvedena kao što je prethodno opisano. Videti van der Kraan, P.M., et al., Am. J. Pathol. 135, 1001 (1989); i Johnson, K., et al., Science 336, 717 (2012). Ukratko, period od tri (3) dana inflamacije je praćen destabilizacijom zgloda indukovanom kolagenazom, što je rezultovalo u blagom do umerenom oštećenju hrskavice. Intraartikularna primena konstrukata sprovodjena je nakon indukcije u koleno jednom nedeljno tokom tri nedelje, počevši 3 nedelje nakon dodavanja kolagenaze VII. Četrdeset (42) dana nakon lečenja, zglobovi su sakupljeni i secirani. Histološko ocenjivanje ozbiljnosti stanja zgloba femoralnog i tibijalnog platoa omogućilo je kvantitativno odredjivanje oporavka tkiva. Rezultat ozbiljnosti stanja zgloba odredjen je putem histološkog ocenjivanja kao što je opisano u prethodnom tekstu. Slika 8 prikazuje oporavak sa konstruktima 225WT, 225KQ, 228KQ, 233KQ, i 241KQ. Za potvrdu prisustva proteina u zglobu (dugotrajno zadržavanje unutar zgloba), tkivo je fiksirano i obojeno na prisustvo proteinskog konstrukta divljeg tipa pomoću imunohistohemije. Ispitivanja su potvrdila prisustvo proteina ukazujući na intra-artikularno zadržavanje ANGPTL3 (nije primećeno dejstvo na lipide/trigliceride, procenjeno korišćenjem standardnog metaboličkog panela, podaci nisu prikazani).
[0118] Histološka ispitivanja na isečcima obojenim bojom safranin O i ocenjivanje medijalnog tibijalnog platoa (za detekciju proteoglikana na mestu povrede, kao što je gore opisano) otkrilo je regeneraciju matriksa hrskavice (podaci nisu prikazani). Kvantitativna ispitivanja su potvrdila zamenu proteoglikana sličnu nivoima koji su vidjeni kod naivnog miša, dok kontrole sa nosačem nisu pokazale sličnu zamenu. Isečci tkiva su takodje obojeni kao što je gore opisano za kolagen tipa II 8 nedelja nakon injekcije povrede. Kvantitativna ispitivanja su potvrdila povećanje kolagena tipa II u zglobovima tretiranim konstruktom sličnih nivoa onima koji su vidjeni kod naivnog miša; dok kontrole sa nosačem nisu pokazale slično povećanje (podaci nisu prikazani).
Model kidanja meniskusa kod pacova
[0119] Pacovski model hirurške povrede takodje je korišćen za procenu in vivo efikasnosti konstrukata. Model i procena su početno izvedeni kao što je prethodno opisano kod Gerwin N. et al. Osteoarthritis Cartilage. dodatak 3: S24 (2010). Ukratko, na zglobu kolena je obrijana koža i medijalni kolateralni ligament (MCL) je izolovan putem incizije, i MCL je stabilizovan i skalpelom je načinjen distalni rez na meniskusu. U nedeljama 1, 2 i 3 nakon operacije, proteinski konstrukt ili kontrola sa nosačem su injektovani intra-artikularno, zatim su zglobovi sakupljeni i secirani 4 i 6 nedelja nakon operacije. Histološko ocenjivanje ozbiljnosti stanja zgloba femoralnog i tibijalnog platoa je izvedeno za kvantitativno odredjivanje oporavka tkiva kao što je gore opisano. Prikazani su podaci za 6 nedelja ispitivanja.
[0120] Zdrava hijalinska hrskavica je zamenila oštećenu nakon tretmana. Histološko ispitivanje i ocenjivanje lateralnog tibijalnog platoa hrskavice obojene bojom safranin O je izvedeno kao što je gore opisano i kvantitativno odredjeno. Rezultati su pokazali da se kod životinja tretiranih sa 242KQ konstruktom javlja regeneracija matriksa hrskavice i zamena proteoglikana sličnih nivoa onima koji se vidjaju kod naivnog pacova, dok kontrole sa nosačem nisu pokazale sličnu zamenu. Videti sliku 9. Slični rezultati su zapaženi sa 225WT.
[0121] Neznatno izmenjen model hirurški indukovanog kidanja meniskusa od onog koji je gore opisan korišćen je za izazivanje oštećenja hrskavice kod mužjaka pacova Lewis u cilju ispitivanja efikasnosti 242KQ u podsticanju oporavka hrskavice in vivo. Na pacovima je izvedena hirurška intervencija da bi se potpuno pokidao medijalni kolateralni ligament i medijalni meniskus za destabilizaciju zgloba tako da buduće nošenje težine vodi brzoj degeneraciji hrskavice. Incizija je načinjena da bi se presekao ligament sa obe strane igle, čime se osigurava potpuno presecanje. Sečivo skalpela je zatim zavučeno ispod patelarnog ligamenta u sinovijalni prostor i šiljati vrh je korišćen za zasecanje meniskusa. Uspešan rez je postignut kada se zglob dislocira lateralno. Jednu nedelju posle operacije, pacovima je intra-artikularnom injekcijom data doza 242KQ ili fiziološki rastvor u zapremini od 25 uL u intra-artikularni sinovijalni prostor.
[0122] Dvadeset osam dana posle hirurškog kidnja meniskusa i dvadeset jedan dan posle intraartikularne injekcije fiziološkog rastvora ili konstrukta, ispitivane životinje su eutanazirane i pogodjeni zglobovi su sakupljeni za ispitivanje, fiksirani u 10% formalinu u PBS-u, dekalcifikovani mravljom kiselinom, i obloženi parafinom pre sečenja. Napravljeni su koronalni isečci i obojeni bojom safranin O ili ostavljeni neobojeni za buduće imunohistohemijsko bojenje. Ispitivanja su otkrila da je medijalni tibijalni plato imao najveću količinu oštećenja hrskavice i odlučeno je da se oceni efikasnost 242KQ samo za ovu oblast zgloba. Upotrebom sistema ocenjivanja OARSI, rezultati ozbiljnosti stanja hrskavice su procenjeni za šest isečaka širinom tibijalne hrskavice za svaku životinju (N=10) slepim očitavanjem. Očitavanje je uradjeno dvaput u različitim vremenskim tačkama i nakon toga je izračunata srednja vrednost da bi se dobili rezultati oštećenja hrskavice. Dodatno, analize objektivnog ocenjivanja su izvedene sa prilagodjenim protokolom stvorenim u Matlab. Algoritam je identifikovao površine zglobne hrskavice i objektivno kvantitativno odredio dodatne parametre hrskavice (zonalne analize, intenzitet boje safranin O, površina hrskavice, debljina hrskavice). Rezultati su prikazani na slici 10A.
[0123] Oporavak strukture hrskavice nije uvek povezan sa oslobadjanjem od bola, naročito kod ljudi. Iako je fiziologija i hod glodara značajno drugačiji od ljudskog, 242KQ je procenjivan da bi se odredilo da li ima bilo kakvog poboljšanja u hodu ili dužini vremena provedenog na operisanom ekstremitetu posle tretmana. Nadgledanje nesposobnosti je sprovedeno na pacovima tretiranim sa 242KQ. Pacovi su podvrgnuti modifikovanoj operaciji meniskusa kao što je gore opisano. Jednu nedelju nakon operacije, 242KQ je injektovan u sinovijalni prostor. Na dan 28, pacovi su smešteni na monitor za praćenje nesposobnosti na zadnjim ekstremitetima i 30 uzastopnih očitavanja je izvedeno tokom 10 minuta za svakog pacova da bi se odredio procenat provedenog vremena (raspodela težine) na svakom zadnjem ekstremitetu. Ovi podaci su ukazali na preraspodelu težine indukovanu bolom. Utvrdjeno je da u modelu kidanja meniskusa kod pacova, tretman sa 242KQ jednu nedelju nakon operacije dovodi do delimičnog obnavljanja sposobnosti jednakog nošenja težine kod pacova. Videti sliku 10B.
[0124] Jedan od osnovnih problema tokom spontanog ili hirurškog oporavka hrskavice je zamena hijalinske zglobne hrskavice fibroznom hrskavicom. Da bi se ispitao tip oporavka hrskavice posredovan sa ANGPTL3, isečci kolena pacova sakupljeni pri ispitivanju kidanja meniskusa pacova koja je gore izvedena, obojeni su na prisustvo kolagena tipa II (za označavanje hijalinske zglobne hrskavice) i kolagena tipa X (za označavanje fibrozne hrskavice). Nakon jedne injekcije od 20 µg 242KQ, došlo je do kvalitativnog smanjenja veličine ekspresije kolagena tipa X.
[0125] Dugotrajno zadržavanje 242KQ nakon intravenske i intra-artikularne injekcije u kolena pacova utvrdjeno je obeležavanjem proteina sa<124>I i primenom što je praćeno PET/uCT snimanjem da bi se pratilo zadržavanje. Videti, Gerwin, N., et al. (2006) Advanced drug delivery reviews 58, 226-242. Utvrdjeno je da je srednje vreme zadržavanja (MRT) posle IA injekcije 242KQ u zglob ~17.3 časa što je značajno povećanje u odnosu na objavljeni standard od 2-3 časa (videti TABELU 6) TABELA 6: Perzistentnost 124I 242KQ
[0126] Model povrede zgloba delimičnom meniscektomijom kod psa Procenjivali smo i aktivnost ANGPTL3 na modelu povrede zgloba kod psa. Model i procene su izvedene kao što je opisano kod Connor, J.R., et al., Osteoarthritis and cartilage/OARS, Osteoarthritis Research Society 17, 1236-1243 (2009). Ukratko, na zglobu kolena je obrijana koža i medijalni kolateralni ligament (MCL) je izolovan putem incizije, i MCL je stabilizovan i skalpelom je načinjen distalni rez na meniskusu. Četiri (4) dana nakon operacije, životinje su primile dozu dva puta nedeljno (1.5 ug ili 15 ug), ili pojedinačnu dozu (30 ug) proteinskog konstrukta (pseći ANGPTL3 pune dužine) 7. dana ili kontrolu sa nosačem (injektovano intra-artikularno). Psi su eutanizirani 28. dana i kolena su podvrgnuta histološkom pregledu, seciranju i ocenjivanju kao što je gore opisano u eksperimentima na pacovima i miševima. Slika 10 prikazuje ukupan bruto rezultat oporavka povezan sa tretmanom psećim ANGPTL3. Nakon histološkog ocenjivanja i procene isečaka psećeg zgloba obojenih bojom safranin O, površine na kojima je došlo do najozbiljnijeg gubitka hrskavice u grupama tretiranim fiziološkim rastvorom bile su deo zgloba koji je imao najveće smanjenje oblasti sa lezijom nakon jedne doze od 30 µg cANGPTL3.
SEKVENCE
LISTA SEKVENCI [0127]

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe sekvenci iz TABELE 1, naznačen time što polipeptid sadrži aminokiselinu koja predstavlja polarnu aminokiselinu koja nije K ili R na položaju 423, odredjeno u odnosu na SEQ ID NO:1, i naznačen time što polipeptid ima hondrogenu aktivnost.
2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od sekvenci (i) SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70; ili (ii) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64.
3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od bilo koje od sekvenci (i) SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70; ili (ii) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64.
4. Polipeptid prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
5. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane od bilo koje od sekvenci (i) SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, i SEQ ID NO:70; ili (ii) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ili SEQ ID NO:64.
6. Polipeptid prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28.
7. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 i 5, naznačen time što aminokiselina na položaju 423 predstavlja Q ili S ili je aminokiselina na položaju 423 deletirana.
8. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što je polipeptid PEG-ilovan.
9. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačen time što je polipeptid fuzionisan sa bilo kojim od humanog serum albumina (HSA), konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina (Fc), polihistidina, glutation S transferaze (GST), tioredoksina, proteina A, proteina G, ili maltozavezujućeg proteina (MBP), ili njihovog fragmenta i gde je peptid fuzionisan na amino-terminalnom kraju polipeptida ili na karboksi-terminalnom kraju polipeptida.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9.
11. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, koja dodatno sadrži hijaluronsku kiselinu ili njen derivat, ili dodatno sadrži sredstvo odabrano iz grupe koja se sastoji od oralnog kalcitonina lososa, SD-6010 (iNOS inhibitor), vitamina D3 (holiekalciferol), hidrolizata kolagena, FGF18, BMP7, rusalatid acetata, nesaponifikovanih supstanci avokada i soje (ASU), kartogenina, steroida, i nesteroidnog anti-inflamatornog sredstva (NSAID).
12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu u lečenju, poboljšanju ili sprečavanju artritisa ili oštećenja zgloba kod pacijenta.
13. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za upotrebu u postupku za indukciju diferencijacije mezenhimskih matičnih ćelija u hondrocite.
14. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što se postupak sprovodi in vivo i matične ćelije su prisutne u humanom subjektu.
15. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što subjekt ima artritis ili oštećenje zgloba ili je subjekt u riziku da ima artritis ili oštećenje zgloba.
16. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, naznačen time što je artritis osteoartritis, artritis usled traume, ili autoimunski artritis.
17. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14-16, naznačen time što se primena farmaceutske kompozicije ili polipeptida obavlja (i) tokom ili posle hirurške procedure, (ii) obavlja zajedno sa jednim ili više dodatnih hondrogenih faktora,2 (iii) obavlja zajedno sa bilo kojim od navedenog: stimulacijom kosne srži, zamenom hrskavice, autologom implantacijom hondrocita (ACI), autologom implantacijom hondrocita indukovanom matriksom (MACI), ili (iv) se obavlja u matriksu ili biokompatibilnoj skeli.
RS20180794A 2013-03-08 2014-03-07 Peptidi i kompozicije za lečenje oštećenja zgloba RS57446B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361775400P 2013-03-08 2013-03-08
US201461938123P 2014-02-10 2014-02-10
PCT/US2014/022102 WO2014138687A1 (en) 2013-03-08 2014-03-07 Peptides and compositions for treatment of joint damage
EP14713728.5A EP2964250B1 (en) 2013-03-08 2014-03-07 Peptides and compositions for treatment of joint damage

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57446B1 true RS57446B1 (sr) 2018-09-28

Family

ID=50390286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180794A RS57446B1 (sr) 2013-03-08 2014-03-07 Peptidi i kompozicije za lečenje oštećenja zgloba

Country Status (38)

Country Link
US (4) US9649359B2 (sr)
EP (2) EP3391900A1 (sr)
JP (3) JP6567429B2 (sr)
KR (1) KR102267341B1 (sr)
CN (2) CN105025917B (sr)
AP (1) AP2015008675A0 (sr)
AU (3) AU2014225348B2 (sr)
BR (2) BR112015021269B1 (sr)
CA (1) CA2903448C (sr)
CL (1) CL2015002443A1 (sr)
CO (1) CO7461145A2 (sr)
CR (2) CR20200290A (sr)
CU (1) CU24301B1 (sr)
CY (1) CY1120729T1 (sr)
DK (1) DK2964250T3 (sr)
EA (1) EA035158B1 (sr)
EC (1) ECSP15042898A (sr)
ES (1) ES2684349T3 (sr)
HR (1) HRP20181269T1 (sr)
HU (1) HUE038499T2 (sr)
IL (1) IL240727B (sr)
JO (1) JO3564B1 (sr)
LT (1) LT2964250T (sr)
MX (1) MX365157B (sr)
MY (1) MY173172A (sr)
NZ (1) NZ711037A (sr)
PE (1) PE20151528A1 (sr)
PH (1) PH12015501983B1 (sr)
PL (1) PL2964250T3 (sr)
PT (1) PT2964250T (sr)
RS (1) RS57446B1 (sr)
SG (1) SG11201506490TA (sr)
SI (1) SI2964250T1 (sr)
TN (1) TN2015000385A1 (sr)
TW (1) TWI634124B (sr)
UY (1) UY35368A (sr)
WO (1) WO2014138687A1 (sr)
ZA (1) ZA201505966B (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5602850B2 (ja) 2009-07-14 2014-10-08 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 間葉幹細胞分化
MA38369B1 (fr) 2013-03-08 2018-10-31 Novartis Ag Peptides et compositions pour le traitement d'une lesion de l'articulation
JO3564B1 (ar) 2013-03-08 2020-07-05 Novartis Ag ببتيدات وتركيبات لعلاج ضرر المفاصل
US20190245180A1 (en) 2016-10-24 2019-08-08 Sumitomo Chemical Company, Limited Separator and secondary battery including the separator
US11235025B2 (en) * 2016-11-09 2022-02-01 Icm Co., Ltd. Nkx3.2 fragment and pharmaceutical composition comprising same as active ingredient
CN109963579A (zh) 2016-11-14 2019-07-02 诺华股份有限公司 用于治疗软骨损伤和关节炎的方法和组合物
CN108530619B (zh) * 2017-03-01 2020-12-08 北京大学第三医院 功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
AU2019309727B2 (en) 2018-07-25 2021-12-23 Novartis Ag NLRP3 inflammasome inhibitors
AR116566A1 (es) * 2018-10-03 2021-05-19 Novartis Ag Administración sostenida de polipéptidos similares a la angiopoyetina 3
UY38687A (es) 2019-05-17 2023-05-15 Novartis Ag Inhibidores del inflamasoma nlrp3, composiciones, combinaciones de los mismos y métodos para su uso
MX2022000094A (es) * 2019-07-04 2022-04-27 Cadila Healthcare Ltd Vacuna a base de angptl3 para el tratamiento de enfermedad hepática.
KR102577697B1 (ko) * 2019-11-13 2023-09-14 주식회사 나이벡 염증 및 상처 치료용 펩타이드
JP7298496B2 (ja) 2020-01-31 2023-06-27 トヨタ自動車株式会社 車両
TW202306970A (zh) 2021-05-24 2023-02-16 瑞士商諾華公司 用於治療骨關節炎之方法
JP2024519893A (ja) 2021-05-24 2024-05-21 ノバルティス アーゲー 変形性関節症の治療方法
CN113683678B (zh) * 2021-09-15 2023-11-24 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途
CN113683681B (zh) * 2021-09-15 2023-10-03 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途
WO2023084388A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Novartis Ag Methods for determining the biological activity of angptl polypeptides
CN114377202B (zh) * 2021-12-16 2023-01-24 方向前 适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法
UY40374A (es) 2022-08-03 2024-02-15 Novartis Ag Inhibidores de inflamasoma nlrp3
KR20240087877A (ko) * 2022-12-09 2024-06-20 (주)케어젠 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2025169047A1 (en) 2024-02-05 2025-08-14 Novartis Ag Improved production of angptl3 mimetics

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308236D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Dna vectors
US5462990A (en) 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
US5288931A (en) 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
US6447796B1 (en) 1994-05-16 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres
WO2000053757A2 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
WO1999055869A1 (en) 1998-04-27 1999-11-04 Zymogenetics, Inc. Novel polypeptide growth factors and materials and methods for making them
CA2332109A1 (en) 1998-05-12 1999-11-18 Human Genome Sciences, Inc. 97 human secreted proteins
WO1999067382A2 (en) 1998-06-24 1999-12-29 Compugen Ltd. Angiopoietin-like growth factor sequences
WO2000053722A2 (en) 1999-03-10 2000-09-14 Phogen Limited Delivery of nucleic acids and proteins to cells
GB9912350D0 (en) 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
EP1198568B1 (en) 1999-07-20 2007-07-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US20030013649A1 (en) 2000-01-31 2003-01-16 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
ATE544855T1 (de) 2000-10-16 2012-02-15 Genentech Inc Wisp polypeptide, und deren therapeutische anwendungen
US20030144498A1 (en) 2000-10-16 2003-07-31 Audrey Goddard TIE ligand homologues
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US20030027751A1 (en) 2001-04-10 2003-02-06 Genvec, Inc. VEGF fusion proteins
MXPA03009566A (es) 2001-04-19 2004-12-06 Scripps Research Inst Metodos y composicion para la produccion de pares trna-aminoaciltrna sintetasa ortogonales.
US20030194798A1 (en) 2001-05-24 2003-10-16 Surber Mark W. Minicell compositions and methods
FI117667B (fi) 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
KR20100029861A (ko) 2001-11-16 2010-03-17 제넨테크, 인크. 안지오포이에틴-유사 단백질 3 ａｎｇｐｔｌ3을 함유하는 조성물 및 이를 사용하는 방법
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7141540B2 (en) 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
AP2005003249A0 (en) 2002-09-09 2005-03-31 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals.
DE60329700D1 (en) 2002-10-16 2009-11-26 Scripps Research Inst Glycoproteinsynthese
DE60327369D1 (de) 2002-10-16 2009-06-04 Scripps Research Inst Stellenspezifischer einbau von ketoaminosäuren in proteine
CN103289960B (zh) 2003-04-17 2017-04-26 斯克利普斯研究院 扩展真核生物遗传密码
US20060160175A1 (en) 2003-07-07 2006-07-20 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal leucyl-trna and aminoacyl-trna synthetase pairs and uses thereof
US7527943B2 (en) 2003-07-07 2009-05-05 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal glutamyl-tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pairs and uses thereof
SI1666604T1 (sl) 2003-07-07 2008-08-31 Scripps Research Inst Sestavki ortogonalnih parov lizil-tRNA in aminoacil-tRNA in aminoacil-tRNA-sintetaze in njihove uporabe
US7718410B2 (en) 2004-09-21 2010-05-18 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of alkynyl amino acids into proteins in eubacteria
EP2383340B1 (en) 2004-10-27 2014-07-16 The Scripps Research Institute Orthogonal translation components for the in vivo incorporation of unnatural amino acids
EP1863340A2 (en) 2005-03-11 2007-12-12 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
EP1899457B1 (en) 2005-05-24 2012-09-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for expansion and analysis of cultured hematopoietic stem cells
EP1991680B1 (en) 2006-03-09 2013-08-21 The Scripps Research Institute System for the expression of orthogonal translation components in eubacterial host cells
CN103356694B (zh) 2006-12-06 2015-09-02 生化学工业株式会社 治疗关节炎病症的长效药剂
MX2009006082A (es) 2006-12-08 2009-08-18 Lexicon Pharmaceuticals Inc Anticuerpos monoclonales contra la proteina 3 similar a angiopoyetina (angptl3).
US8575397B2 (en) 2007-02-14 2013-11-05 Biocompatibles Uk Limited Derivatisation of biological molecules
WO2008137641A2 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells
JP5602850B2 (ja) * 2009-07-14 2014-10-08 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 間葉幹細胞分化
JP6161541B2 (ja) 2011-02-03 2017-07-12 ゾーマ テクノロジー リミテッド 細菌中の機能的タンパク質発現を向上させるための方法および物質
WO2012129562A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 The Scripps Research Institute Compounds and methods for inducing chondrogenesis
PT2864360T (pt) 2012-06-25 2018-01-05 The Brigham And Women`S Hospital Inc Terapêuticas dirigidas ao alvo
MA38369B1 (fr) 2013-03-08 2018-10-31 Novartis Ag Peptides et compositions pour le traitement d'une lesion de l'articulation
JO3564B1 (ar) 2013-03-08 2020-07-05 Novartis Ag ببتيدات وتركيبات لعلاج ضرر المفاصل

Also Published As

Publication number Publication date
CY1120729T1 (el) 2019-12-11
AU2016203028B2 (en) 2017-02-02
BR122016021558B1 (pt) 2023-03-28
IL240727B (en) 2019-12-31
AP2015008675A0 (en) 2015-08-31
CA2903448C (en) 2021-03-23
DK2964250T3 (da) 2018-08-06
EA201591661A1 (ru) 2015-12-30
PT2964250T (pt) 2018-10-19
AU2016203028C1 (en) 2017-06-01
CA2903448A1 (en) 2014-09-12
MY173172A (en) 2020-01-02
JP2021178841A (ja) 2021-11-18
UY35368A (es) 2014-10-31
AU2014225348A1 (en) 2015-09-10
ZA201505966B (en) 2017-03-29
BR112015021269B1 (pt) 2023-04-11
CU20150097A7 (es) 2016-05-30
CO7461145A2 (es) 2015-11-30
AU2016203028A1 (en) 2016-05-26
US20160008433A1 (en) 2016-01-14
CR20150466A (es) 2015-10-27
HUE038499T2 (hu) 2018-10-29
WO2014138687A1 (en) 2014-09-12
ECSP15042898A (es) 2019-03-29
PE20151528A1 (es) 2015-11-14
SI2964250T1 (sl) 2018-11-30
CN105025917B (zh) 2020-08-18
US11179442B2 (en) 2021-11-23
TW201444865A (zh) 2014-12-01
EA035158B1 (ru) 2020-05-06
EP3391900A1 (en) 2018-10-24
MX365157B (es) 2019-05-24
US10328126B2 (en) 2019-06-25
KR102267341B1 (ko) 2021-06-21
PL2964250T3 (pl) 2018-10-31
EP2964250A1 (en) 2016-01-13
MX2015011963A (es) 2015-12-09
IL240727A0 (en) 2015-10-29
JP2020015725A (ja) 2020-01-30
CN105025917A (zh) 2015-11-04
US9649359B2 (en) 2017-05-16
TWI634124B (zh) 2018-09-01
CU24301B1 (es) 2017-12-08
US20170252407A1 (en) 2017-09-07
PH12015501983A1 (en) 2016-01-11
SG11201506490TA (en) 2015-09-29
TN2015000385A1 (en) 2017-01-03
HRP20181269T1 (hr) 2018-10-19
CL2015002443A1 (es) 2016-05-20
PH12015501983B1 (en) 2020-09-25
AU2016277608A1 (en) 2017-01-12
AU2014225348B2 (en) 2016-03-31
BR122016021558A2 (pt) 2019-07-30
HK1214754A1 (en) 2016-08-05
NZ711037A (en) 2018-07-27
JO3564B1 (ar) 2020-07-05
LT2964250T (lt) 2018-07-25
US20220184182A1 (en) 2022-06-16
EP2964250B1 (en) 2018-05-16
JP6918871B2 (ja) 2021-08-11
ES2684349T3 (es) 2018-10-02
JP2016510763A (ja) 2016-04-11
JP6567429B2 (ja) 2019-08-28
KR20150125712A (ko) 2015-11-09
AU2016277608B2 (en) 2018-04-05
CN111808182A (zh) 2020-10-23
CR20200290A (es) 2020-08-27
BR112015021269A2 (pt) 2017-10-10
US20200268849A1 (en) 2020-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11179442B2 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage
US20220402987A1 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage
HK40038214A (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage
HK1260928A1 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage
HK1214754B (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage