RS56219B1

RS56219B1 - Antitela protiv csf-1r

Info

Publication number: RS56219B1
Application number: RS20170817A
Authority: RS
Inventors: Jacqueline Francoise Doody; Yanxia Li
Original assignee: Imclone Llc
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2017-11-30
Also published as: HRP20171153T1; AR080698A1; EP2552966A1; DK2552966T3; AU2011232850B2; PT2552966T; KR101439719B1; US20110243947A1; JP5767310B2; CA2795081A1; WO2011123381A1; JP2013529183A; HUE036379T2; MX2012011234A; EP2552966B1; US8263079B2; SI2552966T1; EP3156419A1; ES2640909T3; SG183829A1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak je usmeren na oblasti imunologije i tretmana kancera. Specifičnije, predmetni pronalazak je usmeren na humana antitela koja se vezuju za humani receptor za faktor-1 stimulisanja kolonije (CSF-1R).

[0002] Receptor faktora-1 stimulisanja kolonije (CSF-1R), takođe poznat kao M-CSFR ili CD-115, (humana CSF-1R varijanta; SEQ ID NO:15) (humani CSF-1R; SEQ ID NO:16; Uniprot Assession #P07333), kodirana c-fms genom, je receptor tirozin kinaze selektivno eksprimiran na ćelijskim linijama makrofaga i granulocita kod normalnih pojedinaca i na tumorskim ćelijama kod kancera. Postoje dva poznata liganda, faktor-1 stimulisanja kolonije (CSF-1) (humani CSF-1; SEQ ID NO:17)(Uniprot Assession #P09603), takođe poznat kao M-CSF, i IL-34 (humani IL-34; SEQ ID NO:18)(Uniprot Assession #Q6ZMJ4), koji se vezuje za ekstracelularni domen CSF-1R. Nakon vezivanja CSF-1 ili IL-34, CSF-1R dimerizuje, što dovodi do transfosforilacije receptora i fosforilacije i aktivacije nishodnih signalnih molekula kao što su MAPK i Akt. Fosforilacija CSF-1R rezultuje u: (1) proliferaciji i diferencijaciji makrofaga iz hemtopoetskih progenitorskih stem ćelija i (2) preživljavanju i migraciji makrofaga u različite organe i tkiva u telu, naročito stromu tumora. CSF-1R može takođe biti eksprimiran na površini tumorskih ćelija.

[0003] Antitela na mišji CSF-1R nisu unakrsno reaktivna kod ljudi i kao posledica toga bila bi neefikasni terapeutici za tretiranje kancera kod ljudi.

[0004] Humana antitela protiv CSF-1R su opisana u PCT objavi WO2009/026303 (Brasel, et al.). Takva antitela ne indukuju antitelo-zavisnu ćelijski-posredovanu citotoksičnu (ADCC) aktivnost protiv ćelija vezanih sa antitelima. ADCC se dešava kada se antitelo vezuje za ćeliju koja eksprimira antigen (ciljna ćelija), stvarajući Fc region antitela dostupnim za vezivanje sa Fc receptorom na ćelijama prirodnim ubicama, monocitima, neutrofilima i dendritskim ćelijama (efektorna ćelija). Antitela opisana u Brasel, nisu sposobna da dovedu zajedno ciljnu ćeliju i efektornu ćeliju za iniciranje ubijanja ciljne ćelije.

[0005] Antitela na ligand nisu unakrsno reaktivna. Stoga antitela na CSF-1 na inhibiraju vezivanje IL-34 za CSF-1R i antitela na IL-34 ne inhibiraju CSF-1 vezivanje sa CSF-1R. Vezivanje liganda sa receptorom može imati efekat na rast kancera. Dodatno, antitela na ligand se ne internalizuju, niti indukuju CSF-1R degradaciju, niti stimulišu ADCC aktivnost protiv ćelija.

[0006] Postoji potreba za multifunkcionalnim antitelima koja blokiraju vezivanje liganada sa CSF-1R i takođe indukuju ADCC aktivnost protiv ćelija vezanih sa antitelima.

[0007] Antitela predmetnog pronalaska imaju prednost u odnosu na poznata antitela jer imaju mnoštvo funkcija. Antitela pronalaska blokiraju CSF-1 i IL-34 vezivanje za receptor, čime sprečavaju dimerizaciju receptora i rezultujuću fosforilaciju intracelularnih tirozinskih ostataka, funkcije koje su kritične za sprečavanje rasta tumora izazvano makrofagama. Antitela pronalaska internalizuju i indukuju CSF-1R degradaciju. Važno je da dodatno blokiranju vezivanja liganda, antitela pronalaska poboljšavaju ADCC aktivnost stimulisanjem ubijanja ćelija tumora i tumor-povezanih makrofaga i monocita. Antitela pronalaska takođe istovremeno utiču na aktivnost makrofaga, aktivnost koja ima glavnu ulogu u napredovanju tumora. Usled mnoštva terapeutskih funkcija koje imaju, antitela predmetnog pronalaska imaju značajnu prednost u odnosu na antitela poznata u tehnici.

REZIME PRONALASKA

[0008] Jedan aspekt predmetnog pronalaska je antitelo, koje specifično vezuje humanu CSF-1R varijantu (SEQ ID NO:15), koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 10 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je antitelo koje specifično vezuje humani CSF-1R (SEQ ID NO:16), laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 10 i teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 9. U sledećem aspektu predmetnog pronalaska, antitelo sadrži dva laka lanca gde svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 10 i dva teška lanca gde svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 9.

[0009] Ovde su opisane izolovane DNK i polinukleotidi/polinukleinske kiseline koje kodiraju antitela prethodno opisana, ekspresioni vektori koji sadrže polinukleotide, i ćelije domaćini koje sadrže polinukleotide. Ovde su opisani postupci za prečišćavanje antitela ili njihovih fragmenata. Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže samo antitela predmetnog pronalaska ili sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom. Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela predmetnog pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljviim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.

[0010] Dodatno, ovde su opisani postupci za inhbiciju rasta ćelije kancera, i postupci za tretiranje leukemije, karcinoma dojke i prostate, kod sisara, primenom efikasne količine antitela. Ovde su opisani postupci za inhibiciju rasta ćelije kancera, i postupci za treitranje leukemije, karcinoma endometrijuma, dojke i prostate, kod sisara, primenom efikasne količine antitela. Ovde su dalje opisani postupci inhibiranja rasta ćelije kancera, i postupci za treitranje leukemije, karcinoma endometrijuma, dojke i prostate, kao i kancera jajnika, kolorektalnog kancera, hepatocelularnog kancera, kancera bubrega, multiplog mijeloma, i Hodgkin-ovog limfoma. Antitela predmetnog pronalaska mogu se koristiti za tretiranje neoplastičnih bolesti, uključujući solidne tumore, i za tretman karcinoma dojke i prostate. U sledećem aspektu, antitela predmetnog pronalaska mogu se koristiti za tretiranje neoplastičnih bolesti, uključujući solidne tumore, i za tretman karcinoma dojke, endometrijuma, i prostate. U sledećem aspektu, antitela predmetnog pronalaska mogu se koristiti za tretiranje neoplastičnih bolesti, uključujući solidne tumore, i za tretman karcinoma dojke, endometrijuma, prostate, jajnika, kolorektalnog, hepatocelularnog i renalnog karcinoma.

[0011] Jedan aspekt predmetnog pronalaska je antitelo za upotrebu u terapiji, ili za upotrebu u tretmanu ili za upotrebu kao medikament. U sledećem aspektu, prethodno opisana antitela su za upotrebu u tretiranju kancera. Predmetni pronalazak se može koristiti za tretiranje kancera koji uključuju ali nisu ograničeni na leukemiju, kancer dojke i kancer prostate. U jednom aspektu, predmetni pronalazak se može koristiti za tretiranje kancera koji uključuju, ali nisu ograničeni na leukemiju, kancer dojke, kancer endometrijuma i kancer prostate. U sledećem aspektu, predmetni pronalazak se može koristiti za tretiranje kancera koji uključuju, ali nisu ograničeni na leukemiju, kancer dojke, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer jajnika, kolorektalni kancer, hepatocelularni kancer, kancer bubrega, multipli mijelom, i Hodgkin-ov limfom.

[0012] Predmetni pronalazak takođe uključuje antitelo predmetnog pronalaska za upotrebu u tretiranju kancera uključujući obezbeđivanje ili primenu efikasne količine drugog anti-kancer tretmana gde anti-kancer tretman uključuje, ali nije ograničen na agens koji sprečava angiogenezu, hemoterapeutski agens, ili anti-neoplastični agens. Dodatno, anti-neoplastični agens uključuje, ali nije ograničen na docetaksel, paklitakael, Herceptin® i doksorubicin. Anti-kancer tretman je primenjen na pacijenta kao dodatak antitelu koje je ovde opisano. Antitelo je primenjeno pre, tokom, u značajnom stepenu istovremeno sa, ili nakon započinjanja terapije sa drugim anti-kancer tretmanom ili drugim anti-neoplastičnim agensom.

[0013] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu antitela pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman kancera. U jednom aspektu kancer je leukemija, kancer dojke, ili kancer prostate. U jednom apsektu kancer je leukemija, kancer dojke, kancer endometrijuma, ili kancer prostate. U sledećem aspektu predmetnog pronalaska kancer je leukemija, kancer dojke, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer jajnika, kolorektalni kancer, hepatocelularni kancer, kancer bubrega, multipli mijelom, ili Hodgkin-ov limfom. Upotreba antitela uključuje obezbeđivanje ili primenu efikasne količine drugog anti-kancer tretmana, gde anti-kancer tretman uključuje, ali nije ograničen na agens koji sprečava angiogenezu, hemoterapeutski agens, ili anti-neoplastični agens. Dodatno, anti-neoplastični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na docetaksel, paklitaksel, Herceptin® i doksorubicin. Antikancer tretman je primenjen na pacijenta kao dodatak ovde opisanom antitelu. Ovo antitelo je primenjeno pre, tokom, značajno istovremeno sa, ili nakon započinjanja terapije sa drugim anti-kancer tretmanom ili drugim antineoplastičnim agensom.

[0014] Ovde je opisan postupak za tretiranje kancera kod sisara, koji sadrži primenu na pomenutog sisara kome je to potrebno efikasne količine antitela predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta. Kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od leukemije, kancera dojke, kancera endometrijuma, i kancera prostate. Kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od leukemije, kancera dojke, kancera endometrijuma, kancera prostate, kancera jajnika, kolorektalnog kancera, hepatocelularnog kancera, kancera bubrega, kancera pankreasa, multiplog mijeloma, i Hodgkin-ovog limfoma. Dodatno, postupak može dodatno sadržati primenu drugog anti-kancer tretmana na pomenutog sisara. Anti-kancer tretman je izabran iiz grupe koja se sastoji od agensa koji sprečava angiogenezu, hemoterapeutskog agensa, i antineoplastičnog agensa. Anti-neoplastični agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od docetaksela, paklitaksel, Herceptin® i doksorubicina.

[0015] Ovde su opisani postupci korišćenja antitela, ili kompozicija, za tretiranje sisara kome je to potrebno, na primer, da se inhibira angiogeneza ili metastaza kosti, ili da se inhibira tumor ili hiperproliferativni rast ili da se tretiraju inflamatorne bolesti. Pronalazak dalje obezbeđuje antitela, ili kompozicije, za upotrebu u tretmanu sisara kome je to potrebno, na primer, za inhibiciju angiogeneze ili metastaze kosti, ili inhibiciju tumora ili hiperproliferativnog rasta ili inflamatornih bolesti.

[0016] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na proizvod farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ovde opisano antitelo. Dodatno proizvod ili farmaceutska kompozicija može takođe uključiti dodatni farmaceutski agens, anti-neoplastični agens, ili anti-kancer agens ili tretman, uključujući, ali ne ograničavajući se na, docetaksel, paklitaksel, Herceptin® ili doksorubicin, dat u kombinaciji sa ovde opisanim antitelom istovremeno, zasebno ili sekvencijalno u terapiji.

[0017] Pronalazak obezbeđuje korišćenje nivoa CSF-1 u uzorcima krvi, seruma, plazme, tumorskim ćelijama ili cirkulišućim tumorskim ćelijama kao indikatora uspešnog tretmana sa CSF-1R antitelom predmetnog pronalaska kod pacijenata ukoliko kancer ima CSF-1R eksprimiran na površini tumor-povezanih makrofaga. Ovde je opisan postupak za tretiranje kancera kod pacijenta, koji sadrži korake: (1) merenje nivoa CSF-1 u uzorku uzetom od pacijenta gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija ili cirkulišućih tumorskih ćelija, i (2) primenu na pacijenta antitela predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta ukoliko su nivoi CSF-1 veći od nivoa CSF-1 pronađenih u kontrolnoj populaciji.

[0018] Pronalazak obezbeđuje korišćenje nivoa IL-34 u uzorcima krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija, ili cirkulišućih tumorskih ćelija, kao indikatora uspešnog tretmana sa CSF-1R antitelom predmetnog pronalaska kod pacijenata. Ovde je opisan postupak tretiranja kancera kod pacijenta, koji sadrži korake: (1) merenja nivoa IL-34 u uzorku uzetom od pacijenta, gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija ili cirkulišućih tumorskih ćelija, i (2) primene na pacijenta antitela predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta ukoliko su nivoi IL-34 viši od nivoa IL-34 pronađenih u kontrolnoj populaciji.

[0019] Ovde je opisan postupak za određivanje da li je subjekat koji ima kancer kandidat za režim tretmana sa anti-CSF-1R antitelom, gde je pomenuto antitelo antitelo predmetnog pronalaska koji sadrži: (1) ex vivo ili in vitro određivanje nivoa CSF-1 u uzorku od subjekta, gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija i cirkulišućih tumorskih ćelija; i (2) gde je povećanje nivoa CSF-1, u poređenju sa nivoom CSF-1 kod pojedinca koji ne boluje od kancera, indikativno da je subjekat kandidat za režim tretmana sa anti-CSF-1R antitelom.

[0020] Ovde je dodatno opisan postupak za određivanje da li je subjekat koji ima kancer kandidat za režim tretmana sa anti-CSF-1R antitelom, gde je pomenuto antitelo antitelo predmetnog pronalaska, koji sadrži: (1) ex vivo ili in vitro određivanje nivoa IL-34 u uzorku od subjekta, gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija i cirkulišućih tumorskih ćelija; i (2) gde je povećanje nivoa IL-34, u poređenju sa nivoom IL-34 kod pojedinca koji ne boluje od kancera, indikativno da je subjekat kandidat za režim tretmana sa anti-CSF-1R antitelom.

[0021] Pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za CSF-1R. Antitela imaju najmanje jednu osobinu izabranu od (a) inhibicije vezivanja CSF-1 ili IL-34 sa CSF-1R; (b) inhibicije aktivacije CSF-1R; (c) smanjenja fosforilacije CSF-1R; (d) smanjenja aktivacije MAPK; (e) smanjenja aktivacije Akt; (f) smanjenja količine CSF-1R; i (g) indukcije ADCC. Poželjan primer izvođenja pronalaska ima osobine (a) do (g).

[0022] Jedan aspekt predmetnog pronalaska je antitelo koje specifično vezuje humanu CSF-1R varijantu (SEQ ID NO:15) ili humani CSF-1R (SEQ ID NO:16), i inhibira signalizaciju CSF-1R, internalizuje i indukuje CSF-1R degradaciju, i stimuliše antitelo-zavisnu ćelijskiposredovanu citotksičnu (ADCC) aktivnost protiv različitih ćelija uključujući tumore, makrofage i monocite. SEQ ID NO:15 i SEQ ID NO:16 razlikuju se u jednoj aminokiselini na položaju 54 koji je izvan vezujućeg regiona.

[0023] Kao što je ovde korišćeno, termin "antitelo" uključuje molekule imunoglobulina koj sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana sa disulfidnim vezama. Pojedinačni lanci se mogu saviti u domene koji imaju slične veličine (110-125 aminokiselina) i strukture, ali različitih funkcija.

[0024] Laki lanac može sadržati jedan varijabilni region (ovde skraćen kao VL) i/ili jedan konstantni domen (ovde skraćen kao CL). Laki lanci humanih antitela (imunoglobulina) su ili kapa (K) laki lanci ili lambda (λ) laki lanci. Namera je da izraz VL, kao što je ovde korišćeno, uključuje i varijabilne regione od kapa-tipa lakih lanaca (VK) i od lambda-tipa lakih lanaca (Vλ). Teški lanac može takođe sadržati jedan varijabilni domen (ovde skraćen kao VH) i/ili, zavisno od klase ili izotipa antitela, tri ili četiri konstantna domena (CH1, CH2, CH3 i CH4) (ovde zajedno skaraćeno kao CH). Kod ljudi, izotipovi su IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, pri čemu su IgA i IgG dodatno podeljeni u potklase ili podtipove (IgA1-2 i IgG1-4). Predmetni pronalazak uključuje antitela bilo kojih prethodno pomenutih klasa ili potklasa. Humani IgG1 je poželjan izotip za antitela predmetnog pronalaska.

[0025] Tri regiona, nazvana hipervarijabilni ili regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), nalaze se u svakom od VL i VH, koji su podupreti manje varijabilnim regionima nazvanim okvirnim (ovde skraćeno kao FR). Aminokiseline su dodeljene određenom CDR regionu ili domenu u skladu sa Kabat konvencijom (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci.

190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991).). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDRs i četiri FRs, raspoređenih od aminoterminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Deo antitela koji se sastoji od VL i VH domena je označen Fv (varijabilni fragment) i čini antigen-vezujuće mesto. Jednolančani Fv (scFv) je fragment antitela koji sadrži VL domen i VH domen na jednom polipeptidnom lancu, gde su N terminus jednog domena i C terminus drugog domena vezani fleksibilnim linkerom.

[0026] "Izolovano antitelo" je antitelo koje (1) je delimično, u značajnom stepenu, ili potpuno prečišćeno iz smeše komponenti; (2) je identifikovano i izdvojeno i/ili rekuperovano iz komponente iz njegove prirodne sredine; (3) je monoklonsko; (4) je oslobođeno drugih proteina od iste vrste; (5) je eksprimirano u ćeliji od druge vrste; ili (6) se ne nalazi u prirodi. Komponente, kao što je ovde korišćeno, isključuju antitelo predmetnog pronalaska. Kontaninirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičke ili terapeutske upotrebe antitela, i mogu uključiti enzime, hormone, i druge proteinske i ne-proteinske rastvore. Primeri izolovanih antitela uključuju antitelo koje je prečišćeno na osnovu afiniteta, antitelo koje je napravljeno od strane hibridoma ili druge ćelijske linije in vitro, i humano antitelo izvedeno iz transgenog miša.

[0027] Termin "monoklonsko antitelo," kao što je ovde korišćeno, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije u značajnom stepenu homogenih antitela, npr., pojedinačna antitela koja čine populaciju su u značajnom stepenu identična izuzev mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi ili minornih post-translacionih varijacija koje mogu biti prisutne. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv pojedinačnog antigenog mesta (takođe poznatog kao determinanta ili epitop). Dodatno, za razliku od preparata konvencionalnih (poliklonskih) antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti, svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinante na antigenu. Modifikator "monoklonski" označava da je karakter antitela dobijen iz u značajnom stepenu homogene populacije antitela, i ne treba ga shvatiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim naročitim postupkom.

[0028] Termin "humano antitelo," kao što je ovde korišćeno, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji odgovaraju sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (kao što je opisano u Kabat et al., prethodno). Humana antitela pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani od strane sekvenci imunoglobulina humane klicine linije (npr., mutacije uvedene slučajnom ili za mesto specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDRs. Humano antitelo može imati najmanje jedan položaj zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom, npr., aminokiselinski ostatak koja poboljšava aktivnost koji nije kodiran od strane sekvence imunoglobulina humane klicine linije. Međutim, nije namera da termin "humano antitelo", kao što je ovde korišćeno, uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije druge vrste sisara, kao što je miš, graftovane u humane okvirne sekvence. Nije namera da postupci za proizvodnju "humanog antitela", kao što je ovde korišćeno uključuju antitela proizvedena u ljudskom biću.

[0029] Izraz "rekombinantno humano antitelo" uključuje humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinatnim sredstvima, kao što su antitela eksprimirana korišćenjem rekombinatnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, antitela izolovana iz rekombinatne, kombinatorne humane biblioteke antitela, antitela izolovana iz životinje koja je transgena za humane gene imunoglobulina, ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim načinima koji uključuju splajsing sekvenci gena humanog imunoglobulina sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina humane klicine linije.

[0030] Fc (fragment, kristalizirajući region) je oznaka za deo ili fragment antitela koji se sastoji od uparenih konstantnih domena teškog lanca. U IgG antitelu, na primer, Fc se sastoji od CH2 i CH3 domena teškog lanca. Fc IgA ili IgM antitela dodatno sadrži CH4 domen. Fc je povezan sa vezivanjem Fc receptora, aktivacijom antitelo-zavisne ćelijski-posredovane citotoksičnosti (ADCC) i/ili ćelijski posedovane citotoksičnosti (CMC). Za antitela kao što su IgA i IgM, koja su kompleksi višestrukih IgG sličnih proteina, formiranje kompleksa zahteva Fc konstantne regione.

[0031] Stoga, antitela pronalaska uključuju, ali nisu ograničena na, izolovana antitela, humana antitela, humanizovana antitela, rekombinantna humana antitela, monoklonska antitela uključujući mimetike antitela ili sadrže delove antitela koji imitiraju strukturu i/ili funkciju antitela. Funkcionalni fragmenti uključuju antigen vezujuće fragmente koji se vezuju za CSF-1R antigen. Na primer, fragmenti antitela sposobni za vezivanje za CSF-1R, ili njegovim delom, i koji su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom uključuju bivalentne fragmente kao što su (Fab’)2 sa intaktnim inter-lančanim disulfidnim vezama, monovalentni fragmenti kao što su Fab (fragment, antigen vezujući) koji se odnosi na fragmente antitela koje se sastoji od VL-CL i VH-CH1 domena i ne zadržava zglobni region teškog lanca (npr., digestijom papainom), Fabs koji zadržavaju zglobni region teškog lanca, Facb (npr., digestijom plazminom), F(ab’)2, Fab’ kojem nedostaju disulfidne veze, pFc’ (npr., digestijom pepsinom ili plazminom), Fd (nprg., digestijom pepsinom, delimičnom redukcijom i reagregacijom) i Fv ili scFv (npr., sa tehnikama molekularne biologije). Takođe je namera da fragmenti antitela uključuju, npr., antitela bez domena, linearna antitela, jednolančana antitela, scFv, antitela sa jednim domenom, multivalentna jednolančana antitela, multi-specifična antitela obrazovana od fragmenata antitela uključujući diatela, triatela i slično, koji se specifično vezuju sa antigenima.

[0032] Zglobni region razdvaja Fab i Fc delove antitela, obezbeđuje pokretljivost Fabs međusobno i u odnosu na Fc, kao i uključuje višestruke disulfidne veze za kovalentno vezivanje dva teška lanca.

[0033] Razvijeni su formati antitela koji zadržavaju specifičnost vezivanja, ali imaju druge karakteristike koje mogu biti poželjne, uključujući na primer, bispecifičnost, multivalentnost (više od dva vezujuća mesta), i kompaktna veličina (npr., samo vezujući domeni). Antitela predmetnog pronalaska su specifična za CSF-1R. Specifičnost antitela odnosi se na selektivno prepoznavanje antitela naročitog epitopa antigena. Antitela predmetnog pronalaska, na primer, mogu biti monospecifična ili bispecifična. Bispecifična antitela (BsAbs) su antitela koja imaju dve antigen-vezujuće specifičnosti ili mesta. Gde antitelo ima više od jedne specifičnosti, prepoznati epitopi mogu se povezati sa jednim antigenom ili sa više od jednog antigena. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifična antitela koja vezuju dva različita antigena, sa najmanje jednom specifičnošću za CSF-1R.

[0034] Specifičnost predmetnih antitela za CSF-1R može se odrediti na osnovu afiniteta i/ili aviditeta. Afinitet, predstavljen konstantnom ravnoteže za disocijaciju antigena sa antitelom (KD), meri snagu vezivanja između antigene determinante i vezujućeg mesta antitela.

[0035] Antitela pronalaska vezuju se za epitop CSF-1R lociran na segmentima ekstracelularnog domena (ovde jednostavno označeni kao "domeni" ili "ECD"). Termin "epitop" kao što je ovde korišćeno odnosi se na izdvojena, trodimenzionalna mesta na antigenu koja su prepoznata od strane antitela pronalaska. Epitopi su imunološki aktivni regioni na kompleksnom antigenu, regioni koji se zaista vezuju za B-ćelijski receptor, i koji su zaista vezani sa rezultujućim molekulima antitela koji su proizvedeni od strane B ćelije. Antigeni generalno sadrže najmanje jedan epitop i obično više od jednog epitopa. Epitopi na proteinskim antigenima mogu biti linearni ili nelinearni. Linearni epitopi su oni koji se sastoje od susednih aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci proteina. Linearni epitopi mogu i ne moraju zahtevati konformaciono savijanje da bi formirali nativnu trodimenzionalnu strukturu i izazvali imuni odgovor koji proizvodi antitela sa vezujućom specifičnošću za antigen. Nelinearni epitopi se sastoje od nesusednih aminokiselinskih ostataka. Stoga, nelinearni epitopi uvek zahtevaju izvesni stepen savijanja proteina da bi se doveli potrebni aminokiselinski ostaci u međusobnu blizinu da bi se formirala nativna trodimenzionalna struktura i izazvao imuni odgovor koji proizvodi antitela sa vezujućom specifičnošću za antigen.

[0036] Antitela predmetnog pronalaska takođe ukljčuju ona za koja su karakteristike vezivanja poboljšane direktnom mutacijom, postupcima sazrevanja prema afinitetu, fagnim prikazom, ili mešanjem lanaca. Afinitet i specifičnost mogu se modifikovati ili poboljšati mutiranjem CDR i/ili FW ostataka i skriningom za antigen vezujuća mesta koja imaju poželjne karakteristike (videti npr., Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403(1995)). CDRs su mutirani na različite načine. Jedan način je randomizacija pojedinačnih ostataka, ili kombinacije ostataka, tako da su u populaciji, inače identičnih antigen vezujućih mesta, subsetovi od dve do dvadeset aminokiselina nalaze na određenim položajima. Alternativno, mutacije mogu biti uvedene u okviru opsega ostataka PCR postupcima sklonim greškama (videti npr., Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-96 (1992)). U sledećem primeru, vektori fagnog prikaza koji sadrže gene varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu se propagirati u mutator sojevima E. coli (videti npr., Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-68 (1996)). Ovi postupci mutageneze su ilustrativni za mnoge postupke poznate stručnjacima.

[0037] Pogodan način za stvaranje supstitucionih varijanti je sazrevanje prema afinitetu korišćenjem fagnog prikaza. Ukratko, nekoliko mesta CDR regiona su mutirani da bi se stvorile sve moguće aminokiselinske supstitucije na svakom mestu. Varijante antitela tako stvorene prikazane su na monovalentni način od čestica filamentoznog faga kao fuzije se proizvodom M13 gena III spakovanom unutar svake čestice. Zatim je izvršen skrining fagno prikazanih varijanti u odnosu na njihovu biološku aktivnost (npr., afinitet vezivanja (KD), specifičnost, EC50) kao što je ovde opisano. Da bi se identifikovali kandidati mesta CDR regiona za modifikaciju, može se izvesti alanin skening mutageneza da bi se identifikovali ostaci CDR regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, slučajna mutageneza se može izvesti na jednoj ili više CDR sekvenci na jednom ili više položaja ostataka, ili dok je CDR operativno povezan sa varijabilnim regionom ili dok je CDR nezavisan od druge sekvence varijabilnog regiona i zatim je izmenjeni CDR vraćen u varijabilni region korišćenjem tehnologije rekombinatne DNK. Kada su takve varijante antitela stvorene i eksprimirane, panel varijanti je podvrgnut skriningu kao što je ovde opisano, i antitela sa supseriornim osobinama u jednom ili više relevantnih testova mogu biti izabrana za dalji razvoj.

[0038] Dodatno antitelima specifično opisanim ovde, druga "u značajnom stepenu homologa" modifikovana antitela mogu se lako dizajnirati i proizvesti korišćenjem različitih tehnika rekombinatne DNK koje su dobro poznate stručnjacima. Na primer, okvirni regioni mogu varirati u odnosu na nativnu sekvencu na nivou primarne strukture po supstitucijama nekoliko aminokiselina, terminalnih i intermedijernih adicija ili delecija, i slično. Dodatno, mnoštvo različitih humanih okvirnih regiona može se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji kao osnova za humanizovane imunoglobuline predmetnog pronalaska. Generalno, modifikacije gena mogu se lako postići mnoštvom dobro poznatih tehnika, kao što je mutageneza usmerena na mesto.

[0039] Ovde su opisane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju težak lanac anti-CSF-1R antitela, koje sadrži bilo koij od VH regiona ili njihovih delova, ili bilo koji od VH CDRs, uključujući bilo koju njihovu varijantu, kao što je ovde opisano. Ovde su opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju laki lanac anti-CSF-1R antitela koji sadrži bilo koji od VL regiona, ili njihovog dela ili bilo koji od VL CDRs, uključujući bilo koju njihovu varijantu kao što je ovde opisano. Ovde su opisane sekvence nukleinske kiseline antitela 1, SEQ ID NOs 13 i 14 za teški lanac i laki lanac respektivno.

[0040] Antitela predmetnog pronalaska mogu se proizvesti postupcima poznatim u tehnici. Postupci uključuju imunološki postupak opisan od strane Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdon et al. eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam) in Monoclonal Antiboby Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas (Campbell ed., 1984); kao i postupkom rekombinantne DNK opisanim od strane Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989). Antitela se takođe mogu dobiti iz biblioteka koje nose kombinacije VH i VL domena u obliku scFv ili Fab. VH i VL domeni mogu biti kodirani nukleotidima koji su sintetički, delimično sintetički, ili izvedeni iz prirodnih. Predmetni pronalazak može se napraviti bibliotekama fagnog prikaza koje nose fragmente humanog antitela. Drugi izvori humanih antitela su transgeni miševi konstruisani da eksprimiraju humane imunoglobuiinske gene.

[0041] Jedan primer izvođenja preparata antitela je ekspresija nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo prema pronalasku kod transgene životinje koja ima ubačen značajni deo humanog genoma koji proizvodi antitelo i načinjen je deficijentnim u proizvodnji endogenih antitela. Transgene životinje uključuju, ali nisu ograničene na miševe, kozu i zeca. Antitela predmetnog pronalaska su napravljena sa transgenim miševima. Dodatni primer izvođenja pronalaska uključuje ekspresiju antitelo-kodirajućeg gena u, na primer, mlečnoj žlezdi životinje za sekreciju polipeptida tokom laktacije.

[0042] Uobičajeni postupak za proizvodnju "humanizovanih" antitela je graftovanje CDR sekvenci iz MAb (proizvedena imunizovanjem glodara domaćina) na humanu osnovu Ig, i transfektovanje himernih gena u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) koje zauzvrat proizvode funkcionalno antitelo koje izlučuju CHO ćelije.

[0043] Podrazumeva se da aminokiselinski ostaci koji su primarne determinante vezivanja antitela sa jednim domenom mogu biti unutar Kabat ili Chothia definisanih CDRs, ali mogu takođe uključivati druge ostatke, kao što su, na primer, ostaci koji bi inače bili zakopani u VH-VL interfejsu VH-VL heterodimera.

[0044] Protein korišćen za identifikaciju CSF-1R vezujućeg antitela pronalaska je poželjno CSF-1R i, poželjnije, ekstracelularni domen CSF-1R. CSF-1R ekstracelularni domen može biti slobodan ili konjugovan sa drugim molekulom. Antitela ovog pronalaska mogu biti fuzionisana sa dodatnim aminokiselinskim ostacima. Takvi aminokiselinski ostaci mogu biti peptidni tag, možda da olakša izolaciju ili IgG FC deo da se optimizuje dimerizacija. Takođe su predviđeni drugi aminokiselinski ostaci za ciljanje antitela na specifične organe ili tkiva.

[0045] Fragmenti antitela se mogu proizvesti sečenjem celog antitela, ili ekspresijom DNK koja kodira fragment. Fragmenti antitela mogu se pripremiti postupcima opisanim od strane Lamoyi et al., J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983) and by Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Takvi fragmenti mogu sadržati jedan ili oba Fab fragmenta ili F(ab’)2 fragment. Takvi fragmenti mogu takođe sadržati jednolančani fragment varijabilnog regiona antitela, tj. scFv, diatela, ili druge fragmente antitela. Postupci proizvodnje takvih funkcionalnih ekvivalenata su opisani u:; European Patent Application Publication No. EP 239,400 (Winter); PCT Publication WO 89/09622 (Hann, et al.); European Patent Application Publication No. EP 338,745 (Owens, et al.); i European Patent Application Publication No. EP 332,424 (Beldler, et al.).

[0046] Poželjne ćelije domaćini za transformaciju vektora i ekspresiju antitela predmetnog pronalaska su sisarske ćelije, npr., NS0 ćelije (ne-sekretorne (0) ćelije mijeloma miša), 293, SP20 i CHO ćelije i druge ćelijske linije limfoidnog porekla kao što su ćelija limfoma, mijeloma, ili hibridoma. Alternativno se mogu koristiti drugi eukariotski domaćini, kao što su kvasci.

[0047] Antitela predmetnog pronalaska se mogu izolovati ili prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući precipitaciju sa amonijum sulfatom ili natrijum sulfatom praćenom sa dijalizom sa fiziološkim rastvorom, jono-izmenjivačkom hromatografijom, afinitetnom ili imuno-afinitetnom hromatografijom, kao i gel filtracijom ili zonskom elektroforezom. Poželjan postupak prečišćavanja za antitela predmetnog pronalaska je Protein-A afinitetna hromatografija.

[0048] DNK koja kodira humana antitela može se pripremiti rekombinacijom DNK koja kodira humane konstantne regione i varijabilne regione, različite od CDRs, u značajnom stepenu izvedene ili isključivo iz odgovarajućih regiona humanog antitela i DNK koja kodira CDRs izvedene iz čoveka.

[0049] Pogodni izvori DNK koji kodiraju fragmente antitela uključuju bilo koju ćeliju, kao što su ćelije hibridoma i slezine koje eksprimiraju antitelo pune dužine. Fragmenti se mogu korisiti sami po sebi kao ekvivalenti antitela, ili mogu biti rekombinovani u ekvivalente, kao što je prethodno opisano. DNK rekombinacija i druge tehnike opisane ovde mogu se izvesti poznatim postupcima. Drugi izvor DNK je bibiloteka antitela fagnog prikaza, kao što je poznato u tehnici.

[0050] Dodatno, ovde su opisani ekspresioni vektori koji sadrže polinukleotidne sekvence opisane prethodno operativno povezane sa kontrolnom sekvencom kao što je ekspresiona sekvenca, promotor i/ili enhanser sekvenca. Razvijeno je mnoštvo ekspresionih vektora za efikasnu sintezu polipeptida antitela u prokariotskim sistemima, kao što su bakterije i eukariotski sistemi, uključujući, ali se ne ograničavajući na, sisteme kulture ćelija kvasca i sisara. Ovde opisani vektori mogu sadržati segmente hromozomskih, nehromozomskih i sintetičkih DNK sekvenci.

[0051] Može se koristiti bilo koji pogodni ekspresioni vektor. Na primer, prokariotski klonirajući vektori uključuju plazmide iz E. coli, kao što su colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM, i RP4. Prokariotski vektori takođe uključuju derviate fagne DNK kao što je M13 i drugi filamentozni jednolančani DNK fagi. Primer vektora korisnog u kvascu je 2 m plazmid. Pogodni vektori za ekpresiju u sisarskim ćelijama uključuju dobro poznate derivate SV-40, CMV, adenovirusa, retrovirus-izvedene DNK sekvence, i šatl vektore izvedene iz kombinacije funkcionalnih sisarskih vektora, kao što su oni prethodno opisani, i funkcionalni plazmidi i fagna DNK. Dodatni eukariotski ekspresioni vektori su poznati u tehnici (npr., P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981); Kaufmann and Sharp, J. Mol. Biol.159: 601-21 (1982); Scahill et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 80: 4654-59 (1983); Urlaub and Chasin, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77: 4216-20) (1980).

[0052] Ekspresioni vektori korisni kao što su ovde opisani sadrže najmanje jednu ekspresionu kontrolnu sekvencu koja je operativno povezana sa DNK sekvencom ili fragmentom koji treba eksprimirati. Kontrolna sekvenca je ubačena u vektor da bi kontrolisala i regulisala ekspresiju klonirane DNK sekvence. Primeri korisnih ekspresionih kontrolnih sekvenci su lac sistem, trp sistem, tac sistem, trc sistem, glavni regioni operatora i promotora lambda faga, kontrolni region fd proteina omotača, glikolitički promotori kvasca, npr., promotor 3-fosfoglicerat kinaze, promotori kisele fosfataze kvasca, npr., Pho5, promotori faktora alfaparenja kvasca, i promotori izvedeni iz polioma, adenovirusa, retrovirusa, i simian virusa, npr., rani i kasni promotori SV40, i sekvence poznate da kontrolišu ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih ćelija i njihovih virusa ili njihove kombinacije.

[0053] Gde je poželjno da se eksprimira genski konstrukt kod kvasca, pogodni selekcioni gen za upotrebu kod kvasca je trp1 gen prisutan u plazmidu kvasca YRp7. trp1 gen obezbeđuje selekcioni marker za mutantni soj kvasca kome nedostaje sposobnost da raste u triptofanu, na primer, ATCC No. 44076. Prisustvo trp1 lezija u genomu ćelije domaćina kvasca onda obezbeđuje efikasno okruženje za detekciju transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično tome, Leu2-deficijentni sojevi kvasca (ATCC 20,622 ili 38,626) dopunjeni su poznatim plazmidima koji nose Leu2 gen.

[0054] Ovde su opisane rekombinantne ćelije domaćini koje sadrže rekombinantne vektore prethodno opisane. Antitela predmetnog pronalaska se mogu eksprimirati u ćelijskim linijama drugačijim od hibridoma. Nukleinske kiseline, koje sadrže sekvence koje kodiraju polipeptid prema pronalasku, mogu se koristiti za transformaciju pogodnih sisarskih ćelija domaćina.

[0055] Ćelijske linije određene preference su izabrane na osnovu visokih nivoa ekspresije, konstitutivne ekspresije proteina od interesa i minimalne kontaminacije od proteina domaćina. Sisarske ćelijske linije dostupne kao ćelije domaćini za ekspresiju su dobro poznate u tehnici i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije, kao što su, ali ne ograničavajući se na, COS-7 cells, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije bubrega novorođenog hrčka (BHK) i mnoge druge uključujući ćelijske linije limfoidnog porekla kao što su ćelije limfoma, mijeloma, ili hibridoma. Pogodne dodatne eukariotske ćelije uključuju kvasac i druge gljive. Korisni prokariotski domaćini uključuju, na primer, E. coli, kao što je E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. Coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, i E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, kao što je Bacillus subtilis, i Streptomyces.

[0056] Ove rekombinantne ćelije domaćini mogu se koristiti da proizvedu antitelo, ili njegov fragment, kultivacijom ćelija pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju antitela ili njegovog fragmenta i prečišćavanje antitela ili njegovog fragmenta iz ćelija domaćina ili medijuma koji okružuje ćeliju domaćina. Ciljanje eksprimiranog antitela ili fragmenta za sekreciju u rekombinantnoj ćeliji domaćinu može se olakšati umetanjem signalne ili sekretorne lider sekvence koja kodira peptid na 5’ kraj antitelo-kodirajućeg gena od interesa. Ovi sekretorni lider peptid elementi mogu se izvesti ili iz prokariotskih ili iz eukariotskih sekvenci. Shodno tome, pogodni sekretorni lider peptidi su korišćeni, koji su aminokiseline spojene za N-terminalni kraj polipeptida za direktno kretanje polipeptida van citosola ćelije domaćina i sekreciju u medijum.

[0057] Transformisane ćelije domaćini su kultivisane postupcima poznatim u tehnici u tečnom medijumu koji sadrži izvore ugljenika koji se mogu asimilovati (ugljeni hidrati kao što su glukoza ili laktoza), azota (aminokiseline, peptidi, proteini ili proizvodi njihove degradacije kao što su peptoni, amonijum soli i slično), i neorganske soli (sulfati, fosfati i/ili karbonati natrijuma, kalijuma, magnezijuma i kalcijuma). Medijum dalje sadrži, na primer, supstance koje promovišu rast, kao što su elementi u tragovima, na primer gvožđe, cink, mangan i slično.

[0058] Postupak za tretiranje rasta tumora kod sisara primenom na sisara efikasne količine antitela je ovde takođe opisan. Pogodna stanja za tretiranje prema predmetnom pronalasku uključuju ćelije koje poželjno eksprimiraju CSF-1R. Dok nije namera da se vezuje za bilo koji određeni mehanizam, predmetni postupci obezbeđuju tretman rasta ćelija kancera uključujući, na primer, one kod kojih je neoplastični rast, metastaze kosti, odbacivanje transplanta organa ili autoimuni poremećaj kao što je autoimuna bolest stimulisana sa CSF-1R.

[0059] "Tretman" ili "tretirati", u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na terapeutski tretman uključujući inhibiciju, usporavanje, smanjenje ili reverziju napredovanja stanja koje je u osnovi, ili neželjene fiziološke promene povezane sa bolešću ili poremećajem, poboljšavanje kliničkih simptoma stanja ili sprečavanje pojave kliničkih simptoma stanja. Korisni ili poželjni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjenje stepena bolesti ili poremećaja, stabilizaciju bolesti ili poremećaja (tj., gde se bolest ili poremećaj ne pogoršava), odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti ili poremećaja, poboljšanje ili palijaciju bolesti ili poremećaja, i remisiju (bilo delimična ili totalna) bolesti ili poremećaja, bilo da je detektabilna ili nedetektabilna. Tretman takođe može značiti produžavanje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem ukoliko se ne primi tretman. Oni kojima je potreban tretman uključuju one koji već imaju bolest. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se može koristiti kao medikament.

[0060] U ovde opisanim postupcima, terapeutski efikasna količina antitela pronalaska je primenjena na sisara ili pacijenata kome je to potrebno. Dodatno, farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati terapeutski efikasnu količinu anti-CSF-1R antitela pronalaska. "Terapeutski efikasna količina" ili "efikasna doza" odnosi se na količinu efikasnu, u dozama i u neophodnim vremenskim periodima, da postigne željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efikasna količina antitela može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnost antitela ili dela antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Drugi faktori uključuju primenu, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, bilo da je pacijent čovek ili životinja, drugih primenjenih lekova, i da li je tretman profilaktički ili terapeutski. Iako su humana antitela pronalaska naročito korisna za primenu na ljude, ona se takođe mogu primeniti na druge sisare. Namera je da termin sisar kao što je ovde korišćen uključuje, ali nije ograničen na, ljude, laboratorijske životinje, kućne ljubimce i domaće životinje. Terapeutski efikasna količina je takođe ona kod koje su bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela nadmašeni terapeutski korisnim efektima.

[0061] Dozni režimi se mogu podesiti da bi se obezbedio optimum željenog odgovora (npr., terapeutski ili profilaktički odgovor). Doze tretmana se mogu titrovati korišćenjem rutinskih postupaka poznatih stručnjacima da bi se optimizovala bezbednost i efikasnost. Dozni raspored će tipično biti u opsegu od jedne bolus doze ili kontinuirane infuzije do višestrukih primena dnevno (npr., svakih 4-6 časova), ili kao što je indikovano od strane zaduženog lekara i stanja pacijenta. Primer neograničavajućeg opsega za terapeutski efikasnu količinu antitela pronalaska je 0.1-50 mg/kg, poželjnije 3-35 mg/kg, i još poželjnije 5-20 mg/kg. Količine doze i učestanost biće određeni od strane lekara koji tretira pacijenta i mogu uključiti doze od manje od 1 mg/kg do preko 100 mg/kg date dnevno, tri puta nedeljno, nedeljno, jednom svake dve nedelje, ili manje često. Treba napomenuti, međutim, da predmetni pronalazak nije ograničen na bilo koju određenu dozu.

[0062] Anti-CSF-1R antitela se mogu primeniti u kombinaciji sa jednim ili više drugih antikancer tretmana uključujući, ali se ne ograničavajući na, agens koji sprečava angiogenezu, hemoterapeutski agens, i anti-neoplastični agens. Bilo koji pogodni anti-kancer agens se može koristiti, kao što je hemoterapeutski agens, zračenje, antitelo ili njihova kombinacija.

[0063] Anti-kancer agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, anti-neoplastične agense, antitela, ađuvanse, i prolekove. Anti-neoplastični agensi koji su trenutno poznati u tehnici, ili koji se procenjuju, mogu se grupisati u mnoštvo klasa uključujući, na primer, inhibitore mitoze, alkilujuće agense, anti-metabolite, interkalirajuće antibiotike, inhibitore faktora rasta, inhibitore ćelijskog ciklusa, enzime, inhibitore topoizomeraze, agense protiv preživljavanja, modifikatore biološkog odgovora, anti-hormone, i agense koji sprečavaju angiogenezu. Primeri alkilujućih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, cisplatin, ciklofosfamid, melfalan, i dakarbazin. Primeri anti-metabolita uključuju, ali nisu ograničeni na, doksorubicin, daunorubicin, paklitaksel, gemcitabine, ALIMTA® i inhibitore topoizomeraze irinotekan (CPT-11), aminokamptotecin, kamptotecin, DX-8951f, topotekan (topoizomeraza I), etoposid (VP-16), i teniposid (VM-26) (topoizomeraza II). Kada je anti-neoplastični agens zračenje, izvor zračenja može biti ili spoljašnji (terapija eksternim zračenjem - EBRT) ili unutrašnji (brahiterapija- BT) na pacijenta koji se tretira. Doza primenjenog anti-neoplastičnog agensa zavisi od brojnih faktora, uključujući, na primer, tip agensa, tip i težinu tumorra koji se tretira, i puta primene agensa. Treba naglasiti, međutim, da predmetni pronalazak nije ograničen na bilo koju određenu dozu. U jednom aspektu, docetaksel je poželjan kao anti-neoplastični agens pronalaska. U drugim aspektima pronalaska paklitaksel, Herceptin® i doksorubicin su poželjni anti-neoplastični agensi.

[0064] Anti-CSF-1R antitela pronalaska se mogu primeniti sa antitelima koja neutrališu druge receptore uključene u rast tumora ili angiogenezu. Anti-CSF-1R antitelo je korišćeno u kombinaciji sa antagonistom receptora koji se specifično vezuje za Her2. Drugi primer takvog receptora je VEGFR. Anti-CSF-1R antitelo se može korisiti u kombinaciji sa VEGFR antagonistom. CSF-1R antitelo se takođe može primeniti u kombinaciji sa jednim ili više pogodnih ađuvansa, kao što su, na primer, citokini (IL-10, IL-4 i IL-13, na primer) ili dugi imuno stimulatori, kao što su, ali ne ograničavajući se na, hemokin, tumor-povezane antigene, i peptide.

[0065] U predmetnom pronalasku, bilo koji pogodni postupak ili put može se koristiti za primenu anti-CSF-1R antitela pronalaska, i izborno, da bi se zajedno primenili antineoplastični agens i/ili antagonisti drugih receptora. U kombinovanoj terapiji predmetnog pronalaska, anti-CSF-1R antitelo može se primeniti pre, tokom, u značajnom stepenu istovremeno sa, ili nakon započinjanja terapije sa drugim agensom, uključujući, ali se ne ograničavajući na docetaksel, paklitaksel, Herceptin® ili doksorubicin, kao i bilo koju njihovu kombinaciju. Režimi anti-neoplastičnog agensa korišćenog prema pronalasku, uključuju bilo koji režim za koji se veruje da je optimalno pogodan za tretman pacijentovog neoplastičnog stanja. Različiti maligniteti mogu zahtevati upotrebu specifičnih anti-tumorskih antitela i specifične anti-neoplastične agense, koji će se odrediti po principu od pacijenta do pacijenta. Putevi primene uključuju, na primer, oralnu, intravensku, intraperitonealnu, potkožnu, ili intramuskularnu primenu. Doza primenjenog antagonista zavisi od brojnih faktora, uključujući, na primer, tipa anagonista, tipa i težine tumora koji se tretira i puta primene antagonista. Treba naglasiti, međutim, da predmetni pronalazak nije ograničen na bilo koji određeni postupak ili put primene.

[0066] Anti-CSF-1R antitela pronalaska, kada su korišćena kod sisara u svrhu profilakse ili tretmana, poželjno su formulisana kao farmaceutske kompozicije. Takve farmaceutske kompozicije i procesi za pripremanje istih dobro su poznate u tehnici. Videti, npr. Remenigton: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A., et al., eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995).

[0067] U sledećem aspektu pronalaska, antitela pronalaska se mogu primeniti zajedno sa, ili hemijski ili biosintetički sa, anti-kancer agensima, anti-neoplastičnim ili agensima koji sprečavaju angiogenezu ili detektabilne agense koji proizvode signal. Anti-tumorski agensi povezani sa antitelom uključuju bilo koje agense koji uništavaju ili oštećuju neovaskulaturu ili tumor ili makrofage za koje se vezalo antitelo ili okruženje ćelije za koju se antitelo vezalo. Predmetni pronalazak može biti anti-CSF-1R antitelo primenjeno kao konjugat, uključujući, ali se ne ograničavajući na, imunokonjugat, koji se specifično vezuje za receptor i doprema toksin nakon ligand-toksin internalizacije. Antitelo-agens konjugat se može direktno međusobno vezati ili preko linkera, peptida ili ne-peptida. Na primer, anti-tumorski agens ili anti-makrofagni agens je toksični agens kao što su anti-neoplastični agensi ili radioizotop. Pogodni anti-neoplastični agensi, uključujući hemoterapeutske agense, poznati su stručnjacima i razmatrani su u nastavku. Pronalazak dalje predviđa anti-CSF-1R antitela povezana sa ciljnim ili reporter delovima, uključujući putem primera samo anti-neoplastične agense, druga antitela ili reportere, kao što su radio-obeleženi izotopi, u dijagnostičkom sistemu gde je detektabilni agens koji proizvodi signal konjugovan sa antitelom.

[0068] Ovde je opisan postupak inhibicije angiogeneze koji sadrži primenu kompozicije koja sadrži antitelo ili fragment antitela pronalaska na sisara u vremenu i količini efikasnoj da inhibira angiogenezu. Slično tome, antitela se mogu koristiti u postupcima inhibicije metastaza tumora kod sisara primenom kompozicije koja sadrži antitelo pronalaska na sisara u vremenu i količini efikasnoj da inhibira metastazu tumora.

[0069] Ovde je opisan postupak inhibicije infiltracije makrofaga u stromu tumora i stimulisanja rasta tumora koji sadrži primenu kompozicije koja sadrži antitelo pronalaska na sisara u vremenu i količini koja je efikasna da inhibira efekte makrofaga na rast tumora. Slično tome, antitela se mogu koristiti u postupcima ublažavanja erozije kosti oko tumorske metastaze kod sisara primenom kompozicije koja sadrži antitelo pronalaska na sisara u vremenu i količini koja je efikasna da inhibira eroziju kosti.

[0070] Pronalazak predviđa korišćenje CSF-1R liganda (CSF-1 ili IL-34) kao biomarkera u krvi, serumu, plazmi, tumorskim ćelijma ili cirkulišućim tumorskim ćelijama, pacijenata sa kancerom koji odgovaraju na tretman kada kancer ima CSF-1R eksprimiran na površini tumor-povezanih makrofaga. Ovde je opisan postupak predviđanja uspešnog tretmana pacijenta sa antitelom ili fragmentom predmetnog pronalaska merenjem nivoa CSF-1 u krvi u uzorku gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od seruma, plazme, tumorskih ćelija, ili cirkulišućih tumorskih ćelija. Ovde je opisan postupak za tretiranje kancera kod pacijenta, koji sadrži korake: (1) merenja nivoa CSF-1 u uzorku uzetom od pacijenta gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija i cirkulišućih tumorskih ćelija, i (2) primene antitela pronalaska ili njegovog fragmenta na pacijenta, ukoliko su nivoi CSF-1 viši od CSF-1 nivoa nađenih u kontrolnoj populaciji. Pronalazak dalje predviđa postupak predviđanja uspešnog tretmana pacijenta sa antitelom ili fragmentom predmetnog pronalaska merenjem nivoa IL-34 u krvi u uzorku gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od seruma, plazme, tumorskih ćelija ili cirkulišućih tumorskih ćelija. Ovde je opisan postupak tretiranja kancera kod pacijenta, koji sadrži korake: (1) merenja nivoa IL-34 u uzorku uzetom od pacijenta gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija i cirkulišućih tumorskih ćelija, i (2) primene antitela predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta na pacijenta ukoliko su nivoi IL-34 veći od nivoa IL-34 nađenih u kontrolnoj populaciji.

[0071] Predmetni pronalazak takođe predviđa postupak za određivanje da li je subjekat koji ima kancer kandidat za anti-CSF-1R antitelo-zasnovani režim tretmana kancera, gde je pomenuto antitelo antitelo predmetnog pronalaska koji sadrži: (1) ex vivo ili in vitro određivanje nivoa CSF-1 u uzorku subjekta, gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija i cirkulišućih tumorskih ćelija; i (2) gde je povećanje u nivou CSF-1, u poređenju sa nivoom CSF-1 kod pojedinca koji ne boluje od kancera, indikativno da je subjekat kandidat za anti-CSF-1R antitelo-zasnovani režim tretmana kancera.

[0072] Predmetni pronalazak dalje predviđa postupak za određivanje da li je subjekt koji ima kancer kandidat za anti-CSF-1R antitelo-zasnovani režim tretmana kancera, gde je pomenuto antitelo antitelo predmetnog pronalaska, koji sadrži: (1) ex vivo ili in vitro određivanje nivoa IL-34 u uzorku subjekta, gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija i cirkulišućih tumorskih ćelija; i (2) gde je povećanje u nivou IL-34, u poređenju sa nivoom IL-34 kod pojedinca koji ne boluje od kancera, indikativno da je subjekat kandidat za anti-CSF-1R antitelo-zasnovani režim tretmana kancera.

[0073] Predmetni pronalazak takođe predviđa postupak za određivanje da li je subjekt koji ima kancer kandidat za antitelo-zasnovani režim tretmana kancera, gde je pomenuto antitelo antitelo predmetnog pronalaska, koji sadrži: (1) ex vivo ili in vitro određivanje nivoa CSF-1, IL-34, ili oba, u uzorku subjekta, gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, tumorskih ćelija i cirkulišućih tumorskih ćelija; i (2) gde je povećanje u nivou CSF-1, IL-34, ili oba, u poređenju sa nivoom CSF-1, IL-34, ili oba, kod pojedinca koji ne boluje od kancera, indikativno da je subjekat kandidat za anti-CSF-1R antitelo-zasnovani režim tretmana kancera.

[0074] Nivoi CSF-1 ili IL-34 se mogu meriti mnoštvom postupaka uključujući komercijalno dostupne komplete (R&D Systems za CSF-1 i USCN Life Sciences, Inc. Za IL-34). U jednoj takvoj tehnici, bilo koji od CSF-1 ili IL-34 standarda ili uzoraka dodati su na ploču prethodno obloženu sa antitelima na humani CSF-1 ili IL-34 da bi se omogućilo vezivanje CSF-1 ili IL-34 za antitela. Nakon ispiranja nevezanih CSF-1 ili IL-34 i drugih proteina, dodato je sekundarno antitelo koje prepoznaje anti-CSF-1 ili IL-34 antitelo, respektivno. Sekundarno antitelo je kuplovano sa peroksidazom rena koja emituje plavičastu boju kada je supstrat dodat komoricama. Intenzitet boje u korelaciji je sa količinom CSF-1 ili IL-34 koja se nalazi u ploči.

[0075] Kako se CSF-1 i IL-34 prirodno nalaze u zdravom ljudskom telu, morala bi se odrediti bazalna vrednost CSF-1 i IL-34 u kontrolnoj populaciji. Kontrolna populacija može uključivati grupu pojedinaca koji nisu dijagnostifikovani da imaju kancerozno stanje ili znake infekcije. Shodno tome, kontrolna populacija će ustanoviti opseg nivoa CSF-1 i IL-34 koji su normalni ili bazalna vrednost za zdrave pojedince. Na primer, nivoi CSF-1 su 68% ili 77% veći u serumu pacijenata sa kancerom dojke ili kolorektalnim kancerom, respektivno, nego u serumu kontrolnih grupa (Lawicki et al., Clin. Chim. Acta 317: 112-116 (2006); Mroczho et al., Clin. Chim. Acta 380: 208-212 (2007)). U jednom aspektu pronalaska, nivoi CSF-1R liganda su najmanje 50% veći u uzorcima pacijenata sa kancerom nego u uzorcima iz kontrolne populacije. Opseg CSF-1 i/ili IL-34 nivoa u kontrolnoj populacijii će biti poređen sa nivoom CSF-1 i/ili IL-34 identifikovanim iz uzorka ili uzoraka pacijenta da bi se odredilo da li je nivo CSF-1 i/ili IL-34 pacijenta veći od bazalnog opsega kontrolne populacije.

[0076] U jednom aspektu, antitela predmetnog pronalaska su za upotrebu u tretmanu kancera gde kancer ćelije izlučuju ligand. U sledećem aspektu, antitela predmetnog pronalaska su za upotrebu u tretiranju kancera gde ćelije kancera izlučuju CSF-1. U sledećem primeru, antitela predmetnog pronalaska su za upotrebu u treitiranju kancera gde ćelije kancera izlučuju IL-34.

[0077] Ovde su opisani kompleti za inhibiciju rasta tumora i/ili angiogeneze koji sadrže terapeutski efikasnu količinu humanog anti-CSF-1R antitela. Kompleti mogu dalje sadržati antitelo ili njegov fragment i dodatni agens uključujući dodatne anti-kancer agense, antineoplastične agense ili tretmane, uključujući, ali se ne ograničavajući na docetaksel, paklitaksel, Herceptin® ili doksorubicin. Alternativno, ili dodatno, kompleti mogu sadržati bilo koji pogodni antagonist, na primer, receptora drugog faktora uključenog u tumorigenezu ili angigogenezu razmatranu u nastavku. Ovde opisani kitovi mogu dalje sadržati ađuvans.

[0078] Shodno tome, predmetna antitela receptora mogu stoga biti korišćena in vivo i in vitro za istraživačke, dijagnostičke, profilaktičke, ili postupke tretmana, koji su dobro poznati u tehnici.

PRIMERI

[0079] Sledeći primeri dalje ilustruju pronalazak. Detaljni opisi konvencionalnih postupaka, kao što su oni upotrebljeni u konstruisanju vektora i plazmida, insercija gena koji kodiraju polipeptide u takve vektore i plazmide, introdukcija plazmida u ćelije domaćine, i njihova ekspresija i determinacija gena i genskih proizvoda mogu se dobiti iz brojnih publikacija, uključujući Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Coligan, J. et al. Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated (2007).

Ekspresija i prečišćavanje humanih Anti-CSF-1R antitela

[0080] Za svako antitelo, konstruisati pogodnu nukelotidnu sekvencu teškog lanca, na primer SEQ ID NO. 13 za Antitelo 1 u pogodni ekspresioni plazmid, na primer pGSHC, i konstruisati pogodnu nukleotidnu sekvencu lakog lanca, na primer SEQ ID NO. 14 za Antitelo 1 u pogodan ekspresioni plazmid, kao što je pGSLC, pogodnim postupkom kao što je PCR kloniranje. Da bi se ustanovila stabilna ćelijska linija, ko-transfektovati u pogodnu liniju ćelija domaćina, kao što su NSO ili CHO ćelije, sa linearizovanim plazmidima teškog i lakog lanca elektroporacijom i kultivisati u pogodnom medijumu kao što je Dulbecco’s Modified Eagle Medium bez glutamina sa dijalizovanim fetalnim telećim serumom i dodatkom glutamin sintetaze. Izvršiti skrining klonova u odnosu na ekspresiju antitela sa enzimskim imunoadsorpcionim testom (ELISA) i selektovati najvećeg proizvođača za kulture u bocama sa mešalicom. Prečistiti antitela pogodnim postupkom kao što je protein-A afinitetna hromatografija.

[0081] Tabela 1 obezbeđuje aminokiselinske sekvence i SEQ ID NOs. različitih CDRs Antitela 1 predmetnog pronalaska. Sve CDR sekvence su određene korišćenjem Kabat konvencije. Tabela 2 obezbeđuje SEQ ID NOs. različitih sekvenci koje se odnose na predmetni pronalazak. Sekvence polinukleinske kiseline koje kodiraju aminokiselinske sekvence opisane u nastavku su takođe uključene u obim predmetnog pronalaska.

Tabela 1: Aminokiselinska sekvenca Antitela 1

Tabela 2: Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NOs. Antitela 1

Enzimski imunoadsorpcioni test (ELISA) vezivanja

[0082] Za test vezivanja CSF-1R binding assay, obložiti 96-komornu ploču sa rastvorljivim rekombinatnim humanim-CSF-1R-Fc fuzionim proteinom (R&D Systems) (1 µg/µL x 100 µL) zapečatiti ploču, i inkubirati preko noći na 4°C. Isprati komorice 3 puta sa PBS (fosfatno puferovani fiziološki rastvor) sa 0.2% TWEEN-20® (PBS/T), zatim blokirati komorice 1 čas na sobnoj temperaturi (20-25°C) (RT) sa PBS koji sadrži 3% goveđi serum albumin (BSA). Aspirirati BSA-PBS smešu i isprati ploče 3 puta sa PBS/T. Napraviti serijska razblaženja antitela 1 ili kontrolnog IgG (počinjući od 3 µL/µL i razblažiti 3-struko) i dodati 100 µL komoricama 1 čas na RT. Isprati komorice tri puta sa PBS/T. Nakon ispiranja, inkubirati ploču sa 100 anti-humannog F(ab’)2 fragment specifičnog-HRP konjugata (Jackson ImmunoResearch) u PBS (razblaženje 1:5000) na RT 1 čas. Isprati ploče 5 puta sa PBS/T i zatim inkubirati sa 100 µL 1:1 preparata supstrata TMB peroksidaze i rastvorom B peroksidaze (KPL) 15 minuta na RT. Zaustaviti kolorimetrijsku reakciju dodavanjem 100 µL 0.1 M H2SO4. Prikupiti podatke korišćenjem čitača mikroploča podešenom na 450 nm. Analizirati podatke apsorbance sa GraphPad Prism softverom da bi se izračunala ED50. ED50, ili polovina maksimalne efikasne doze, je doza neophodna da se postigne 50% maksimalnog vezivanja.

[0083] ED50antitela 1 prema humanom CSF-1R je 9.7x10<-11>M, registrovana kao 0.09 nM. Antitelo 1 pokazuje snažno vezivanje za CSF-1R.

Enzimski imunoadsorpcioni test (ELISA) blokiranja

ELISA koja pokazuje da antitela blokiraju CSF-1/CSF-1R interakciju

[0084] Obložiti 96-komorne mikrotitarske ploče sa (0.5 µg/µL x 10.0 µL) CSF-1 (R&D Systems) na 4°C preko noći. Isprati komorice 3 puta sa PBS/T, zatim blokirati sa 100 µL 3% BSA/PBS 1 čas na RT. Isprati ponovo 3 puta sa PBS/T. Razblažiti rastvorljivi humani rh-CSF-1R-Fc fuzioni protein (R&D Systems) do finalne koncentracije od 0.250 µg/mL u PBS. Istovremeno, razblažiti Antitelo 1 u PBS do finalne koncentracije od 200 nM. Serijski razblažiti Antitelo 1 u 1:3 inkrementima od inicijalnih 200 nM do 3x10<-12>M. Kombinovati 100 µL rh-CSF-1R-Fc sa 100µL svakog razblaženja Antitela 130 minuta na RT. Inkubirati 100 µL Antitela 1:CSF-1R-Fc smeše 1 čas na RT u CSF-1-obloženim komoricama. Nakon 1 časa inkubacije na RT, isprati 3 puta sa PBS/T i pločama dodati 1:5000 razblaženje antihumanog IgG-Fc-HRP konjugovanog antitela 1 čas na RT. Isprati ploče 5 puta sa PBS/T i zatim inkubirati sa 100 µL 1:1 preparata supstrata TMB peroksidaze i rastvora B peroksidaze (KPL) 15 minuta na RT. Zaustaviti kolorimetrijsku reakciju dodavanjem 100 µL 0.1 M H2SO4. Prikupiti podatke korišćenjem čitača mikroploča podešenom na 450 nm. Analizirati podatke apsorbance sa GraphPad Prism softverom da bi se izračunala ID50. ID50, ili polovina maksimalne inhibitorne koncentracije, je koncentracija antitela koja izaziva 50% inhibicije vezivanja liganda za receptor.

[0085] IC50 antitela 1 vezivanje za humani CSF-1R je 8.1x10<-10>M, registrovana kao 0.81 nM. Antitelo 1 inhibira CSF-1 vezivanje za CSF-1R, čime se sprečava CSF-1R aktivacija sa CSF-1 ligandom.

ELISA koja pokazuju da antitela blokiraju IL-34/CSF-1R interakciju

[0086] Obložiti 96-komorne mikrotitarske ploče sa (0.5 µg/µL x 100 µL) IL-34 (R&D Systems) na 4°C preko noći. Isprati komorice 3 puta sa PBS/T, zatim blokirati sa 100 µL 3% BSA/PBS 1 čas na RT. Isprati ponovo sa 3 puta PBS/T. Razblažiti rastvorljivi humani rh-CSF-1R-Fc fuzioni protein (R&D Systems) do finalne koncentracije od 0.250 µg/mL u PBS. Istovremenno, razblažiti Antitelo 1 u PBS do finalne koncentracije od 200 nM. Serijski razblažiti Antitelo 1 u 1:3 inkrementima od inicijalnih 200 nM do 3x10<-12>M. Kombinovati 100 mL rh-CSF-1R-Fc sa 100 mL svakog razblaženja antitela 1 30 minuta na RT. Inkubirati 100 µL antitela 1-CSF-1R-Fc smeša 1 čas na RT u IL-34-obloženim komoricama. Nakon 1 časa inkubacije na RT, isprati 3 puta sa PBS/T i dodati 1:5000 razblaženja anti-humanog IgG-Fc-HRP konjugovanog antitela pločama 1 čas na RT. Isprati ploče 5 puta sa PBS/T i zatim inkubirati sa 100 µL 1:1 preparatom TMB supstrata peroksidaze i rastvora B peroksidaze (KPL) 15 minuta na RT. Zaustaviti kolorimetrijsku reakciju dodavanjem 100 µL 0.1 M H2SO4Prikupiti podatke korišćenjem čitača mikroploča podešenom na 450 nm. Analizirati podatke apsorbance sa GraphPad Prism softverom da bi se izračunala ID50. ID50, ili polovina maksimalne inhibitorne koncentracije, je koncentracija antitela koja izaziva 50% inhibicije vezivanja liganda za receptor.

[0087] IC50antitela 1 vezivanje za humani CSF-1R je 7.0x10<-10>M, registrovano kao 0.71 nM. Antitelo 1 inhibira IL-34 vezivanje za CSF-1R, čime sprečava aktivaciju CSF-1R sa IL-34 ligandom.

Analiza kinetike vezivanja sa površinskom plazmon rezonancom / Biacore® analiza

[0088] Meriti kinetiku vezivanja Antitela 1 za CSF-IR-Fc na 25°C na Biacore® 2000 SPR Biosensor (GE Healthcare). Imobilisani rastvorljivi CSF-IR-Fc fuzioni protein (koncentracija od 10 µg/mL i pH 5), u opsegu od 395 do 1200 jedinica za odgovor, na CM5 čipu korišćenjem satndardnog protokola kuplovanja amina. Koristiti HBS-EP (0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 mM NaCl, i 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20) kao tekući pufer tokom merenja afiniteta vezivanja. Izvesti analize interakcije kada su antitela u rastvoru injektirana u koncentracijama u opsegu od 1.5-100 nM preko pripremljene površine CM5 senzor čipa. Injektirati antitela tokom 3 minuta za vezivanje i dozvoliti da disociraju 15 minuta. Izvesti regeneraciju imobilisanog proteina sa 10 µL/min injekcijom 20 mM HCL. Koristiti BIAevaluation verziju 4.1 softvera za određivanje Ka (kon) i Kd (koff) formiranja kompleksa simultanim globalnim fitovanjem podataka na 1:1 Langmuir model. Izračunati ravnotežnu konstantu asocijacije (KA) iz odnosa 1/KDmerenog molarno (1/M). Izračunati ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) iz odnosa stope konstanti Kd/Ka mereno u molima (M).

[0089] Prosečna Ka, Kd, i KD vrednosti za višestruke Biacore® analize za Antitelo 1 sa humanim CSF-1R su rezimirani u Tabeli 3.

Tabela 3: Kinetika vezivanja antitela sa rekombinantnim humanim CSF-1R

Antitelo 1 pokazuje visoki afinitet vezivanja za CSF-1R.

Fosforilacija CSF-1R detektovana sa Western Blot

[0090] Zasejati NIH3T3 ćelije stabilno transfektovane sa CSF-1R ćelijama u 12-komornu ploču sa gustinom od 5x10<5>ćelija/komorici u 1 mL komorice Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1 µg/mL geneticina 5 časova. Isprati monoslojeve dva puta u PBS i kultivisati preko noći u 0.9 mL/komorici DMEM sa 1% FBS. Napraviti serijska razblaženja antitela 1 u DMEM (počinjući sa 1 µg/mL i razblažiti 3-struko) i dodati 100 µL komoricama 2 časa na 37°C. Stimulisati ćelije sa 100 ng/mL CSF-1 ili IL-34 ligandom 10 minuta i zatim staviti na led i isprati sa ledeno hladnim PBS. Lizirati ćelije u 100 µL 50 mM Hepes (pH 7.5150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaPPi, 50 mM NaF) i tabletom inhibitora proteaze (Roche) na ledu 10 minuta. Pročistiti lizirane ćelije centrifugiranjem na 4°C. Napuniti 20 µL lizata na denaturišući gel za elektorforezu i blotovati na nitroceluloznoj membrani. Detektovati tirozin-fosforilisani CSF-1R na blotu korišćenjem anti-fosfoCSF-1R antitela sa 1 µg/mL (Cell Signaling). Odrediti CSF-1R signalizaciju probama blota ili sa anti-fosfo-MAPK (razblaženje 1:500) ili anti-fosfo-Akt (1:1000) (Cell Signaling). Da bi se osigurala jednaka napunjenost staza, testirati blotove sa anti-CSF-1R antitelima (1 µg/mL; R&D Systems) ili antiaktin antitelima (1:2000; Sigma). Inkubirati sva primarna antitela sa mešanjem na rokeru 1 čas na RT; praćeno sa odgovarajućim sekundarnim antitelom konjugovanim sa HRP, takođe sa mešanjem na rokeru 1 čas na RT. Vizuuelizovati trake sa hemiluminescentnim reagensom (GE Healthcare).

[0091] NIH-3T3 ćelije stabilno transfektovane sa CSF-1R pokazuju brzu fosforilaciju CSF-1R kada su stimulisane ili sa CSF-1 ili IL-34. Prisustvo antitela 1 inhibira CSF-1R fosforilaciju, čak i kada su nivoi antitela na 1 nM, ukazujući da vezivanje antitela 1 za CSF-1R sprečava aktivaciju receptora ili sa CSF-1 ili sa IL-34. Inhibicija CSF-1R fosforilacije takođe vodi smanjenju fosforilacije signalnih molekula korišćenih od strane ili CSF-1 ili IL-34 puta. I Akt i MAPK, koji su nishodno od CSF1-R, smanjili su nivoe fosforilacije kada su ćelije inkubirane sa 100 nM do 1 nM Antitela 1. Stoga, Antitelo 1 sprečava CSF-1R aktivaciju i aktivaciju kaskade kinaze koja sledi nakon stimulavije CSF-1R. Nije bilo razlike u nivou proteina aktina i CSF-1R između staza, što je dokazano jednakim hemiluminescentnim signalom u svakoj stazi viđenom kada su blotovi testirani sa antitelima protiv ovih molekula. Stoga, inhibicija CSF-1R fosforilacije nije usled tehničkih teškoća sa nejednakim punjenjem uzoraka proteina već pravi prikaz smanjene signalizacije.

Testovi internalizacije i degradacije

Antitelo 1 indukuje internalizaciju CSF-1R receptora

[0092] Na ploču staviti NIH-3T3-CSF-1R ćelije na 8-komornim pločicama sa komorama (Nunc) i inkubirati na 37°C dok ćelije ne pokriju 50% površine komorica. Ostaviti da se pločice ohlade do 4°C pre početka eksperimenta u suspenziji smeše voda:led. Inkubirati ćelije sa 5 µg/mL Antitela 1 i odmah preneti na 37°C 15 minuta do 4 časa da bi se omogućilo da se odigra internalizacija. Nastaviti inkubiranje zasebnog seta pločica u suspenziji smeše voda:led 15 minuta do 4 časa sa 5 µg/mL Antitela 1 kao kontrolom. Inkubacija na 4°C sprečava internalizaciju CSF-1 receptora, stoga je bilo kakav uočeni signal iz ćelije artefakt. Nakon inkubacije, isprati ćelije dva puta sa hladnim PBS pre fiksacije ćelija sa ledeno hladnim 1% paraformaldehidom 15 minuta. Nakon ispiranja tri puta sa hladnim PBS, permeabilizovati ćelije u PBS koji sadrži 0.5% saponin i 1% BSA 5 minuta i zatim isprati ponovo u PBS koji sadrži 1% BSA. Obeležiti sa kozjim Cy3 anti-humanim IgG (razblaženje 1:5000) 1 čas da bi se fluorescentno obeležilo Antitelo 1. Izvesti tri finalna ispiranja sa PBS pre postavljanja na GelMount (Biomeda) i pokrivanjem pločica sa pokrovnim staklom. Fluorescentno obeleženo Antitelo 1 može se vizuelizovati mikroskopski da bi se odredila ćelijska lokalizacija pod različiti uslovima opisanim prethodno.

[0093] Nakon mikroskopskog pregleda, Antitelo 1 je uočeno na periferiji ćelije na 4°C pre početka eksperimenta. Prebacivanje ćelija na 37°C omogućava brzu internalizaciju Antitelo l/CSF-1R kompleksa, obično uočeno u okviru 15 minuta. Nakon 1 ili 2 časa inkubacije sa Antitelom 1, svi antitelo/CSF-1R kompleksi su perinuklearni sa veoma malo vizuelizovanih na plazma membrani, ukazujući da vezivanje Antitela 1 za CSF-1R indukuje receptor na brzu internalizaciju i ostanak unutar ćelije. Ćelije držane na 4°C do 2 časa pokazuju samo periferno bojenje ćelije, bez internalizacije Antitela 1. Stoga, internalilzacija antitelo/CSF-1R je ATP-zavisan proces koji se dešava unutar 15 minuta od dodavanja antitela ćelijama.

Antitelo 1 indukuje degradaciju CSF-1R receptora

[0094] Zasejati NIH-3T3-CSF-1R ćelije sa 5x10<5>ćelija/komorici u 12 komornoj ploči u 1 mL DMEM medijuma koji sadrži 10% FBS i 1 mg/mL geniticin. Nakon inkubiranja ćelija na 37°C 5 časova, pločama dodati ili 100 ng/mL CSF-1 ili 15 µg/mL Antitela 1. Poznato je da CSF-1 indukuje internalizaciju i degradaciju CSF-1R, čime služi kao pozitivna kontrola za eksperiment. Dozvoliti da CSF-1 ostane na ćelijama 1 i 5 časova pre sakupljanja ćelija. U drugim komoricama, inkubirati 24 i 48 časova sa Antitelom 1 pre sakupljanja ćelija. Aspirirati medijum, lizirati ćelije i pustiti pročišćene lizate na gelove (kao što je prethodno opisano). Testirati prenete proteine sa anti-CSF-1R antitelima da bi se odredila količina receptora za svaki uslov. Testirati iste blotove sa anti-aktin antitelima da bi se normalizovali nivoi proteina. Kvantifikovati nivoe CSF-1R i aktina korišćenjem Multi-Gauge programa da bi se izmerila gustina traka na Western blot. Relativni ukupni nivo CSF-1R proteina predstavljen je ukupnom gustinom CSF-1R trake podeljenom sa gustinom odgovarajuće trake sa aktinom.

[0095] CSF-1 inkubacija sa NIH-3T3-CSF-1R ćelijama dovodi do degradacije CSF-1R u okviru 1 časa tretmana, i nivoi CSF-1R su prepolovljeni do 5 časova. Degradacija CSF-1R kada je inkubiran sa Antitelom 1 nije tako izražena; Antitelo 1 smanjuje nivoe CSF-1R za jednu četvrtinu. Nakon 48 časova, nivoi degradacije ostaju isti, ukazujući da stopa degradacije ostaje ista. Stoga, vezivanje Antitela 1 za CSF-1R dovodi do degradacije receptora u ćelijama.

Antitelo-zavisna ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) Antitela 1

[0096] Osim inhibicije vezivanja CSF-1 za CSF-1R i indukovanja internalizacije i degradacije CSF-1R, Antitelo 1 takođe inhibira CSF-1R okidanjem ADCC odgovora.

[0097] NKM-1 ćelije humane leukemije su zasejane sa 2x10<5>ćelija/mL u 25 µL RPMI medijumu koji sadrži 10% Ultra-Low IgG FBS i 3 ng/mL humanog IL-2 u 96 komornoj ploči. Napraviti 1:3 serijska razblaženja 1 µg/mL Antitela 1 ili na IgG1 ili na IgG2 osnovi, dodavanjem 25 µL/komorici. Nakon 15 minuta inkubacije, zasejati 25 µL sa 3x10<6>ćelija/mL humanih NK ćelija (Lonza) i inkubirati dodatnih četiri časa na 37°C. Dodati 10 mL pufera za lizu aCella-TOX kit (Cell Technology) i dovesti do RT 15 minuta. Dodati 125 µL low IgG FBS i centrifugirati ploče 1 minut na 750 xg. U Optiplates (Perkin Elmer), dodati 50 µL Enzyme Assay Diluent iz aCella-TOX kit i pažljivo preneti 50 µL ćelijskog supernatanta na Optiplates. Pripremiti enzimski test reagens i detekcioni reagens prema uputstvima iz kompleta, dodajući u Optiplates 100 µL enzimskog test reagensa što je neposredno praćeno sa 50 µL detekcionog reagensa. Očitati ploče u luminometru 20 minuta nakon dodavanja reagenasa.

[0098] ADCC aktivnost se povećava na Antitelo 1 dozno-zavisni način sa 9% NKM-1 ćelijama ubijenim kada su koncentracije Antitela 1 dostigle 1 µg/mL. Nasuprot tome, kada je Antitelo 1 klonirano u IgG2 osnovu nema promene u ADCC aktivnosti sa povećanjem količina Antitela 1. Stoga Antitelo 1, IgG1 molekul, indukuje ADCC ćelija za koje se vezuje.

Mapiranje epitopa

[0099] Prethodne objave su odredile da se CSF-1 vezuje za prva tri Ig domena CSF-1R. Wang et al., Mol. Cell. Biol.13: 5348 (1993). Antitelo 1 vezuje CSF-1R i inhibira vezivanje CSF-1 za humani CSF-1R, stoga se mora vezivati za ili blizu prva tri Ig domena CSF-1R. Da bi se odredilo koji epitopi Antitela 1 se vezuju za CSF-1 R molekul, prva tri Ig domena miša i čoveka su međusobno zamenjeni (videti Tabelu 4). Antitelo 1 ne prepoznaje mišji CSF-1R stoga, ukoliko je mišji Ig domen inseriran u kritični vezujući region humanog CSF-1R, vezivanje antitela se neće dogoditi.

[0100] Ubaciti modifikacije prva tri Ig domena u humanu CSF-1R osnovu koja sadrži preostala dva C-najterminalnija Ig domena ekstracelularnog domena. Fuzionisati ove konstrukte sa Fc delom IgG molekula za lakšu proizvodnju proteina i stabilnost molekula.

Tabela 4: CSF-1R Ig domeni

Himera 1 stoga sadrži mišji Ig domen 1, humani Ig domen 2 i humani Ig domen 3 (m,h,h), humani Ig domeni 4 i 5 fuzionisani su sa Fc tagom. Himera 2 do himera 7 su kao što sledi: m,m,h (himera 2), m,m,m (himera 3), h,m,h (himera 4), h,m,m (himera 5), h,h,m (himera 6) i m,h,m (himera 7) fuzionisani sa dva zadnja Ig domena humanog CSF-1R i zatim Fc tagom.

[0101] Vezivanje Antitela 1 za himerne CSF-1R proteine određeno je vezujućim ELISAs i Biacore® kao što je prethodno opisano. Ukratko, obložiti ploče sa 100 µL 200 ng/mL humanih, mišjih ili himera 1-7 proteina preko noći. Nakon ispiranja i blokiranja ploča, dodati Antitelo 1 u replikama sa 100 nM koncentracijom. Dodati anti-humana Fab sekundarna antitela konjugovana sa HRP sa koncentracijom od 1:10,000 da bi se detektovalo vezivanje Antitela 1 za CSF-1 R molekule.

[0102] Kao što je očekivano, Antitelo 1 se vezuje za humani ali ne i mišji CSF-1R u ELISA vezujućim testovima. Antitelo 1 se vezuje slabo sa himerama koje sadrže prvi ili drugi humani Ig domen, ali ne za one koje sadrže prvi ili drugi mišji Ig domen. Antitelo 1 se snažno vezuje za himere koje sadrže oba i prvi i drugi Ig domen humanog CSF-1R. Svi drugi konstrukti ne vezuju Antitelo 1. Stoga, Antitelo 1 se vezuje za Ig domene jedan i dva, ali zahteva oba domena za snažno vezivanje za humani CSF-1R kada je procenjivano u vezujućem testu. Podaci sa Biacore® rekapituliraju podatke sa ELISA. Bilo koji himerni konstrukt koji nije sadržao humani drugi Ig domen nije vezivao Antitelo 1 čak i kada su nivoi antitela bili na 1 µM, ukazujući da je drugi Ig domen neophodan za vezivanje Antitela. Vezivanje Antitela 1 je dodatno poboljšano kada je prvi Ig domen bio takođe humanog porekla. Stoga, Antitelo 1 se primarno vezuje za drugi Ig domen CSF-1R ali ima neke korisne kontakte sa prvim Ig domenom.

Testovi diferencijacije i proliferacije

Diferencijacija makrofaga sa CSF-1

[0103] Zasejati monocite (Lonza) sa gustinom od 4x10<5>ćelija/mL u svaku komoru 8-komorne pločice u 900 µL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS i 100 ng/mL hCSF-1. Napraviti serijska razblaženja antitela 1 u RPMI (počinjući sa 1 µg/mL i razblaživati 3-struko) i dodati 100 µL komoricama. Inkubirati na 37°C, uz zamenu medijuma svaka tri dana dok se ne uoči vidljivo vezivanje monocita za ploču i elongacija, koja je karakteristična za diferencijaciju makrofaga.

[0104] Monociti tretirani sa 2 nM ili višim koncentracijama Antitela 1 u prisustvu CSF-1 ne uspevaju da se diferenciraju u makrofage, zadržavajući njihovu okruglu morfologiju karakterističnu za monocite. CSF-1 indukcija monocita za diferencijaciju u makrofage može se inhibirati sa Antitelom 1 sa IC50od 0.25 nM. Dodatno, mnogi umuru tokom tretmana, jer ne mogu da prežive bez kontinuirane stimulacije sa CSF-1.

Diferencijacija makrofaga sa IL-34

[0105] Zasejati monocite (Lonza) sa gustinom od 4x10<5>ćelija/mL u svaku komoru 8-komorne pločice u 900 µL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS i 100 ng/mL hCSF-1. Napraviti serijska razblaženja Antitela 1 u RPMI (počinjući sa 1 µg/mL i razblaživati 3-struko) i dodati 100 µL komoricama. Inkubirati na 37°C, uz zamenu medijuma svaka tri dana dok se ne uoči vidljivo vezivanje monocita za ploču i elongacija, koja je karakteristična za diferencijaciju makrofaga..

[0106] Monociti tretirani sa 2 nM ili višim koncentracijama Antitela 1 u prisustvu IL-34 ne uspevaju da se diferenciraju u makrofage, zadržavajući njihovu okruglu morfologiju karakterističnu za monocite. IL-34 indukcija monocita za diferencijaciju u makrofage može se inhibirati sa Antitelom 1 sa IC50od 0.3 nM. Dodatno, mnogi umuru tokom tretmana, jer ne mogu da prežive bez kontinuirane stimulacije sa CSF-1.

Proliferacija monocita sa CSF-1

[0107] Zasejati monocite (Lonza) sa gustinom od 3000 ćelija/komorici u 96-komornoj ploči u prisustvu RPMI 1640 medijuma koji sadrži 10% FBS i 100 ng/mL CSF-1. Sledećeg dana, zameniti medijum i dodati Antitelo 1 serijski razblaženo od 20 nM do 0.01 nM (1:3-struko razblaženje). Tri dana kasnije zameniti medijum sa svežim medijumom koji sadrži 10% FBS, 100 ng/mL CSF-1 i antitelo i dozvoliti ćelijama da rastu dodatnih 5 dana. Po dodavanju 100 µL CellTiter Glo luminescentnog pufera i supstrata (Promega), šejkirati ćelije 10 minuta i očitati luminescenciju kao indikator vijabilnosti.

[0108] IC50 Antitela 1 koja inhibira 50% rasta monocita je 1.4x10<-10>M, registrovana kao 0.1 nM. IC50za CSF-1 indukciju rasta monocita u prisustvu antitela 1 ukazuje da Antitelo 1 inhibira proliferaciju monocita u kulturi.

Proliferacija monocita sa IL-34

[0109] Zasejati monocite (Lonza) sa gustinom od 3000 ćelija/komorici u 96-komornoj ploči u prisustvu RPMI 1640 medijuma koji sadrži 10% FBS i 100 ng/mL IL-34. Sledećeg dana, zameniti medijum i dodati Antitelo 1 serijski razblaženo od 20 nM do 0.01 nM (1:3-struka razblaženja). Tri dana kasnije zameniti medijum svežim koji sadrži 10% FBS, 100 ng/mL IL-34 i antitelo i dozvoliti ćelijama da rastu dodatnih 5 dana. Po dodavanju 100 µL CellTiter Glo luminescentnog pufera i supstrata (Promega), šejkirati ćelije 10 minuta i očitati luminescenciju kao indikator vijabilnosti.

[0110] IC50 Antitela 1 koja inhibira 50% rasta monocita je 0.5 nM. IC50 za IL-34 indukciju rasta monocita u prisustvu Antitela 1 ukazuje da Antitelo 1 inhibira proliferaciju monocita u kulturi.

Test proliferacije za tumorske ćelijske linije sa CSF-1

[0111] Zasejati NKM-1 ćelije leukemije sa 1x10<4>ćelija/mL u 100 µL RPMI 1640 medijuma koji sadrži 1% FBS u 96-komornoj ploči preko noći. Dodati 20 ng/mL CSF-1 ćelijama u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 1% FBS i 20 nM do 0.01 nM serijski razblaženo Antitelo 1 (1:3-struka razblaženja). Inkubirati dodatna 3 dana na 37°C. Nakon dodavanja 100 µL CellTiter Glo luminescentnog pufera i supstrata (Promega), šejkirati ćelije 10 minuta pre očitavanja luminescencije (kao indikator vijabilnosti).

[0112] IC50za NKM-1 rast u prisustvu antitela 1 je 7.6x10<-11>M, registrovano kao 0.07 nM. Ovo ukazuje da Antitelo 1 inhibira proliferaciju NKM-1 ćelija u kulturi.

In Vivo modeli tumora gde je CSF-1R eksprimiran na površini tumora

Produženo preživljavanje NKM-1 miševa koji nose humanu leukemiju tretiranih sa Antitelom 1

[0113] Zračiti Nu/nu miševe subletalno sa 200 rad/mišu 24 časa pre intravenske injekcije sa 2.5x10<6>NKM-1 ćelija leukemije. Dodatna 24 časa kasnije, randomizovati miševe u 4 grupe koje primaju ili 60 mg/kg humanog IgG, 60 mg/kg, 20 mg/kg ili 5 mg/kg Antitela 1 dva puta nedeljno. Pratiti miševe na dnevnoj bazi u odnosu na preživljavanje. Odrediti P vrednosti log rangiranjem Mantel Cox testom.

Tabela 5: Povećano preživljavanje miševa tretiranih sa - Antitelo I nosećim NKM-1 ćelijama leukemije

[0114] Antitelo 1 povećava preživljavanje miševa koji nose NKM-1 ćelije leukemije kao što se vidi u Tabeli 5.

In Vivo modeli tumora gde je CSF-1R eksprimiran na površini tumor-povezanih makrofaga

[0115] Anti-CSF-1R Antitelo 1 je u potpunosti humano antitelo koje prepoznaje humani oblik CSF-1R, ali ne mišji oblik receptora. Stoga, anti-mišje antitelo je neophodno da bi se izveo dokaz koncepta in vivo studija gde je CSF-1R eksprimiran na makrofagu. Ove studije se odnose na ulogu mišjih makrofaga na rast humanih tumora u modelima mišjih ksenograftova. Anti-mišje antitelo bi uticalo na mišje makrofage, ali ne na tumor, omogućavajući da se izmeri efekat stromalnih makrofaga na rast tumora. Sledeći eksperimenti su izvedeni sa Antitelom 2, pacovskim-anti-mišjim CSF-1R antitelom.

Efikasnost Anti-mišjeg CSF-1R mAb u AN3CA ksenograft modelu humanog endometrijalnog karcinoma

[0116] Nu/nu miševi (ženke, 7-8 nedelje starosti) injektirane su sa 5x10<6>AN3CA ćelija/mišu u levi bok. Kada tumori dostignu oko 200 mm<3>, randomizovati miševe u grupe od 12 miševa/tretmanu.

[0117] Pripremiti Antitelo 2 i IgG pacova u fiziološkom rastvoru sa koncentracijom od 6 mg/mL i primeniti potkožno tri puta nedeljno sa 40 mg/kg. Na dan 15 registrovati zapremine tumora i izračunati % T/C. Analizirati zapremine tumora korišćenjem RM ANOVA. T/C% od 66% je izračunat za tretiranu grupu sa Antitelom 2 nasuprot kontrolnoj grupi sa IgG pacova. Ovi rezultati pokazuju značajnu inhibiciju tumora (p=0.045) kod životinja tretiranih sa Antitelom 2.

Efikasnost Anti-mišjih CSF-IR mAb u HCC1954 ksenograft modelu humanog karcinoma dojke

[0118] Injektirati Nu/nu (ženke, 7-8 nedelje; Charles River Laboratories) miševe potkožno sa 1x10<7>HCC1954 ćelija/mišu. Kada tumori dostignu 300 mm<3>veličine, randomizovati miševe po veličini tumora, rasporediti 12 životinja u svakoj grupi tretmana. Pripremiti IgG pacova i Antitelo 2 u fiziološkom rastvoru na koncentraciji od 6 mg/mL i primeniti potkožno, tri puta nedeljno. Dozirati IgG pacova životinjama sa 40 mg/kg i dozirati Antitelo 2 životinjama ili sa 40 mg/kg ili 10 mg/kg u svakoj injekciji. Registrovati mere tumora dva puta nedeljno; 37 dana nakon prve injekcije izračunati T/C%. Analizirati zapremine tumora korišćenjem RM ANOVA.

[0119] Kao što je prikazano na Tabeli 6, T/C% od 77% bio je izračunat za tretiranu grupu koja je primala 10 mg/kg i T/C% od 56% za tretiranu grupu sa 40 mg/kg na dan 37 kao odnos relativnih zapremina tumora nasuprot kontrolne grupe sa fiziološkim rastvorom. Rezultati pokazuju značajnu inhibiciju tumora (p=0.0014) kod životinja tretiranih sa 40 mg/kg Antitela 2.

Antitumorski efekat Anti-mišjeg CSF-1R mAb u DU145 ksenograft modelu humane prostate

[0120] Potkožno injektirati Nu/nu miševe (mužjaci, 7-8 nedelja starosti) sa 15x10<6>DU145 ćelija/mišu u levi bok. Kada tumori dostignu oko 250 mm<3>, randomizovati miševe u grupe od 12 miševa/tretmanu.

[0121] Pripremiti Antitelo 2 i IgG pacova u fizioločkom rastvoru sa koncentracijom od 6 mg/mL i primeniti subkutano tri puta nedeljno sa 40 i 10 mg/kg. Na dan 21 registrovati zapremine tumora i izračunati % T/C za 10 mg/kg i 40 mg/kg. Analizirati zapremine tumora korišćenjem RM ANOVA.

[0122] Kao što je prikazano na Tabeli 6, T/C% od 50 i 43 je izračunat za treitrane grupe od 10 mg/kg i 40 mg/kg respektivno nasuprot kontrolnoj grupi sa IgG pacova. Ovi rezultati pokazuju značajnu inhibiciju tumora (p=<0.0001 za obe koncentracije) kod životinja tretiranih sa Antitelom 2.

Tabela 6: Inhibicija ksenograftova humanog tumora sa Antitelom 2

Smanjena infiltracija makrofaga kod tumora HCC1954 dojke i DU145 prostate tretiranih sa Anti-mišjim CSF-1R mAb

[0123] Ukloniti tumore iz životinja u HCC1954 (dojka) i DU145 (prostata) studijama na životinjama opisanim prethodno. Seći tumore duž najduže ose i staviti ih u 10% formalin preko noći na 4°C uz mešanje na rokeru. Nakon 24 časa, isprati 2 puta u PBS tokom 20 minuta, zatim dodati rastvore progresivno većih koncentracija etanola, dok tumor ne bude u 100% etanolu. Zameniti etanol sa ksilenom sa nekoliko inkubacija u 100% ksilenu i ukalupiti tumor u parafinu. Iseći parafinske blokove na debljinu od 4 mm i postaviti na staklene pločice. Deparafinisati i rehidrirati tkivo progresivnim inkubacijama u ksilenu nakon čega slede povećane koncentracije vode u etanolu. Zagrevati pločice sa tumorom u Target Retrieval Solution (Dako) 3 minuta u mikrotalasnoj pre blokiranja endogenih peroksidaza sa 3% H2O210 minuta na RT. Blokirati nespecifično vezivanje proteina sa Protein Block (Dako) 10 minuta pre dodavanja anti-mišjeg makrofag-specifičnog antitela pacova, F4/80 (2 µg/mL; Serotec) konjugovanim sa biotinom i inkubirati preko noći na 4°C. Inkubirati u HRP-Streptavidin (razblaženje 1:1000; Jackson Immuno Research) 45 minuta na RT i isprati 3 puta. Razviti u DAB (Dako) po uputstvima iz kompleta, zaustaviti reakciju sa dva ispiranja u vodi. Kratko kontrastno obojiti sa Mayer-ovim hematoksilinom (10 minuta; Dako) nakon toga isprati vodom, potapiti u kiseli alkohol, drugi put isprati vodom i bojenje u plavo korišćenjem amonijačne vode. Dehidrirati, pročistiti i pokriti pokrovnim staklom korišćenjem medijuma za trajne preparate. Analizirati 5 slika iz tri životinje za svaku tretiranu grupu. Korišćenjem ImagePro softvera, odrediti broj makrofaga/površini za svaku tretiranu grupu.

Tabela 7: Infiltracija makrofaga kod tumora tretiranih sa Anti-mišjim CSF-1R mAb Antitelom 2

[0124] Kao što se vidi na Tabeli 7, broj makrofaga je smanjen u oba modela tumora, naročito duž periferije. Stoga, tretmani Antitelom 2 dovode do smanjenja infiltracije makrofaga tumora, ukazujući da je anti-mišje CSF-1R antitelo odgovorno za depleciju populacije makrofaga u ovim tumorima.

Značaj makrofaga i CSF-1 nivoa na napredovanje tumora

[0125] Dodatno dojki i prostati, inhibicija rasta tumora, kao i tretman mnogih kancera može se korisno uticati primenom Antitela 1. Neki tipovi tumora kao što je kancer bubrega eksprimiraju CSF-1R na njihovoj ćelijskoj površini i njihov rast može biti direktno inhibiran tretmanom sa Antitelom 1 (Soares, et al., Modern Pathol. 22: 744-752 (2009)). Drugi tipovi tumora kao što je Hodgkin-ov limfom i multipli mijelom, koji imaju veliku tumor-povezanu populaciju makrofaga mogu imati koristi od tretmana Antitelom 1, gde Antitelo 1 može eliminisati makrofage koje indukuju rast tumora (Steidl, et al. New Engl. J. Med. 362: 875-885 (2010); Zheng, et al., Blood 114: 3625-3628 (2009)). Dodatno, tumori koji izlučuju CSF-1 osetljivi su na tretman sa anti-CSF-1 ili CSF-1R, kao što je kolorektalni kancer (Aharinejad, et al., Cancer Res. 62: 5317-5324 (2002)) i bili bi odgovarajući za tretman Antitelom 1. Dodatno, kancer jajnika, hepatocelularni karcinom i karcinomi ćelija bubrega, čija je visoka ekspresija CSF-1 u korelaciji sa lošom prognozom bi svi bili kandidati za tretman Antitelom 1 (Toy, et al., Gyn. Oncol. 80: 194-200 (2001); Zhang, et al., Gyn. Oncol. 107: 526-531 (2007);. Zhu, et al, J. Clin. Oncol. 26: 2707-2716 (2008); Gerharz, et al., Urol. 58: 821-827 (2001)).

Rast ne-CSF-1R eksprimirajućih tumora koji poseduju tumor-povezane makrofage inhibiran je sa anti-CSF-1R antitelima samo ukoliko izlučuju CSF-1

[0126] Zasejati tumorske ćelijske linije HCC1954 (dojka), DU145 (prostata) i Pc3 (prostata) sa 5x10<5>ćelija/mL 48 časova u medijumu za rast koji sadrži 1% FBS. Sakupiti, pročistiti, i analizirati medijum korišćenjem R&D Quantikine Human M-CSF Assay Kit (R&D Systems). Odrediti CSF-1 nivoe u vremenu 0 i 48 č kao pg/mL.

[0127] Na 0 časova, kao što je očekivano, nije bilo prepoznatljvog CSF-1 u medijumu. Međutim, u okviru 48 časova, HCC1954 ćelije su izlučile 3613 pg/mL CSF-1 dok su DU145 ćelije proizvele 4019 pg/mL. Nasuprot tome, medijum sa Pc3 ćelijama sadržao je samo 39 pg/mL CSF-1. Ćelijska linija prostate Pc3 je stavljena u miševe za rast da bi se proverilo da li je nedostatak ekspresije CSF-1 u korelaciji sa rezistencijom na Anti-CSF-1R tretman.

[0128] Injekirati 5x10<6>Pc3 ćelija prostate potkožno u gole miševe (mužjaci, 7-8 nedelja starosti) i dozvoliti da tumor dostigne 300 mm<3>pre podele u grupe za tretman od 12 miševa svaka. Dozirati životinje ili sa 40 mg/kg IgG pacova, 40 mg/kg Antitela 2 ili 10 mg/kg Antitela 2 tri puta nedeljno dok kontrolni tumori ne dostignu 2000 mm<3>. Izmeriti zapremine tumora i izračunati T/C% za svaku tretiranu grupu na dan 18 kao odnos relativnih zapremina tumora nasuprot kontrolnoj grupi sa IgG pacova. Analizirati zapremine tumora sa RM ANOVA.

Tabela 8: Korelacija CSF-1 i rezistencije na Anti-CSF-1R tretman

[0129] Ne postoji razlika u rastu između kontrolnih grupa tretiranih sa IgG pacova nasuprot grupa tretiranih sa Antitelom 2, što ukazuje da povišeni nivoi CSF-1 mogu biti biomarker za tretman sa anti-CSF-1R antitelima. Sekrecija CSF-1 je korelisana sa osetljivošću na Anti-CSF-1R tretman kada je CSF-1R eksprimiran na površini tumor-povezanih makrofaga.

[0130] Injektirati ćelije, kao što je detaljno dato u Tabelama 9 i 10 u nastavku, potkožno u gole miševe i dozvoliti da tumori dostignu 300 mm<3>pre podele u grupe za tretman od 12 miševa svaka. Dozirati životinje prema režimu tretmana detaljno datom u Tabelama 9 i 10 u nastavku tri puta nedeljno dok kontrolni tumori ne dostignu 2000 mm<3>. Izmeriti zapremine tumora i izračunati T/C% za svaku tretiranu grupu kao osnos relativnih zapremina tumora nasuprot kontrolnoj grupi sa IgG pacova. Analizirati zapremine tumora korišćenjem RM ANOVA.

Tabela 9: Osetljvost u tumorskim modelima sa sekrecijom CSF-1

Tabela 10: Osetljivost u tumorskim modelima bez sekrecije CSF-1

[0131] Svi tumori koji izlučuju CSF-1 (Tabela 9) odgovaraju na anti-CSF-1R tretman sa Antitelom 2, dok oni tumori koji ne izlučuju CSF-1 (Tabela 10) ne odgovaraju ili samo slabo odgovaraju na anti-CSF-1R Antitelo 2. Sekrecija CSF-1 je korelisana sa osetljivošću anti-CSF-1R tretmana kod tumorskih modela gde je CSF-1R eksprimiran na površini tumorpovezanih makrofaga. Shodno tome, povećani CSF-1 nivoi funkcionišu kao potencijalni indikator osetljivosti ili biomarker kada je CSF-1R eksprimiran na površini tumor-povezanih makrofaga.

[0132] CSF-1R može takođe biti eksprimiran na površini tumorskih ćelija. Sekrecija CSF-1 nije korelisana sa osetljivošću anti-CSF-1R tretmana za ekspresiju CSF-1R na površini ćelije tumora.

Nivoi IL-34 kod tumora i uzorci seruma pacijenta

[0133] Dodatno CSF-1, IL-34 se takođe može vezati za CSF-1R, indukovati fosforilaciju receptora, i aktivirati nishodne signalne molekule, koji dovode do diferencijacije makrofaga i preživljavanja. I CSF-1 i IL-34 se vezuju za IgG domene u ekstracelularnom regionu CSF-1R (Lin, et al., Science, 320: 807-11 (2008)) i vezivanje oba liganda za CSF-1R može biti inhibirano sa Antitelom 1 (IC50= 0.81 nM i IC50=0.71 nM za inhibiciju CSF-1 i IL-34 vezivanje sa Antitelom 1, respektivno, kao što je prethodno razmatrano). Tretman NIH-3T3 ćelija stabilno transfektovanih sa CSF-1R sa Antitelom 1 inhibira fosforilaciju CSF-1R sa IL-34 (kao što je prethodno razmatrano). Dodatno, IL-34 indukcija diferencijacije monocita u makrofage i proliferacija makrofaga može se inhibirati sa Antitelom 1. sa IC50 od 0.3 nM i 0.5nM, respektivno (kao što je prethodno razmatrano), što je uporedivo sa rezultatima uočenim sa CSF-1. Stoga, aktivnost IL-34 i njegova inhibicija sa Antitelom 1 su slični onoj uočenoj sa CSF-1.

[0134] Nivoi IL-34 su povišeni kod mnogih tumorskih ćelija uključujući tumorske ćelijske linije dojke, prostate i endometrijuma. Dodatno, subpopulacija pacijenata sa tumorom prostate i dojke ima visoke nivoe IL-34 proteina u svom serumu. Shodno tome, kako IL-34 funkcioniše skoro identično kao CSF-1 i sekrecija CSF-1 je korelisana sa osetljivošću anti-CSF-1R tretmana, povišeni nivoi IL-34 takođe funkcionišu kao indikator osetljivosti ili biomarker.

Kombinovane studije tumora dojke

[0135] Injektirati Nu/nu miševe (ženke, 7-8 nedelja starosti) potkožno sa 1x10<7>HCC-1954 ćelija dojke/mišu i dozvoliti da tumori dostignu 300 mm<3>pre tretmana. Randomizovati miševe u grupe od 12 i tretirati kao što sledi:

Tabela 11: Kombinovane studije tumora dojke

[0136] Izmeriti zapremine tumora i izračunati T/C% za svaku tretiranu grupu kao odnos relativnih zapremina tumora nasuprot kontrolne grupe. Analizirati zapremine tumora korišćenjem RM ANOVA.

[0137] U svim studijama prikazanim na Tabeli 11, Antitelo 2, Herceptin®, Doksorubicin i Paklitaksel inhibiraju rast tumora kao jedini agensi. Međutim, kombinovanjem Antitela 2 sa tumor-ciljajućim agensima ima aditivni efekat koji ukazuje da će kombinacija anti=CSF-1R antitela sa hemoterapeutikom ili drugim agensom koji deluje na tumor biti efikasnija od ovih reagenasa zasebno.

Kombinovane studije tumora prostate

[0138] Injektirati Nu/nu miševe (mužjaci, 7-8 nedelja starosti) potkožno sa 1.5x10<7>DU145 ćelija prostate/mišu i dozvoliti da tumori dostignu 300 mm<3>pre tretmana. Raqndomizovati miševe u grupe od 10 i tretirati kao što sledi:

Tabela 12: Kombinovana studija tumora prostate

[0139] Izmeriti zapremine tumora i izračunati T/C% za svaki tretman kao odnos realtivnih zapremina tumora nasuprot kontrolne grupe. Analizirati zapremine tumora korišćenjem RM ANOVA.

[0140] Kombinovanje Antitela 2 sa docetakselom ima aditivni efekat koji ukazuje da će kombinacija sa hemoterapeuticima kod kancera prostate biti efikasnija od hemoterapoeutskih agenasa zasebno.

Dodatne sekvence

[0141]

SEQ ID NO.9

SEQ ID NO.10

SEQ ID NO.11

SEQ ID NO.12

SEQ ID NO.13

SEQ ID NO.14

SEQ ID NO.15

SEQ ID NO.16

SEQ ID NO.17

SEQ ID NO.18

LISTING SEKVENCI

[0142]

<110> Eli Lilly and Company

<120> ANTITELA PROTIV CSF-1R

<130> X18903

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 2

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 6

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 8

<210> 9

<211> 450

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 9

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 10

<210> 11

<211> 469

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 11

<210> 12

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 12

<210> 13

<211> 1407

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 13

<210> 14

<211> 838

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 14

<210> 15

<211> 972

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Sintetički konstrukt

<400> 15

<210> 16

<211> 972

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17 <211> 554

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 17

<210> 18

<211> 242

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje specifično vezuje humanu CSF-1R varijantu (SEQ ID NO. 15), koje sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:9 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:10.

2. Antitelo koje specifično vezuje humani CSF-1R (SEQ ID NO. 16), koje sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:9 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:10.

3. Antitelo prema patentnim zahtevima 1-4 ili 2 koje sadrži dva teška lanca, od kojih svaki sadrži aminokoelinsku sekvencu prema SEQ ID NO:9. i dva laka lanca, od kojih svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:10.

4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.

5. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4 koja dalje sadrži dodatno farmaceutsko sredstvo.

6. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 za upotrebu kao lek.

7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 za upotrebu u lečenju kancera.

8. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što kancer je leukemija, kancer dojke, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer jajnika, kolorektalni kancer, hepatocelularni kancer, kancer bubrega, multipli mijelom ili Hodgkin-ov limfom.

9. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time što kancer je leukemija, kancer dojke, kancer endometrijuma ili kancer prostate.

10. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačeno time što kancer je leukemija, kancer dojke ili kancer prostate.

11. Antitelo za upotrebu prema patentnim zahtevima 6-10, naznačeno time što antitelo se primenjuje pre, u toku, značajno istovremeno sa, ili posle početka terapije sa drugim tretmanom protiv kancera.

12. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeno time što navedeni tretman protiv kancera je izabran iz grupe koja se sastoji od sredstva koje sprečava angiogenezu, hemoterapeutskog sredstva i anti-neoplastičnog sredstva.

13. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačeno time što navedeno antineoplastično sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od docetaksela, paklitaksela, Herceptin® i doksorubicina.

14. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta, koje sadrži merenje nivoa CSF-1 u uzorku uzetom od pacijenta gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, ćelija tumora i cirkulišućih ćelija tumora, i primenu na pacijenta antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ako su nivoi CSF-1 viši od nivoa CSF-1 nađenih u kontrolnoj populaciji.

15. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta, koje sadrži merenje nivoa IL-34 u uzorku uzetom od pacijenta gde je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, ćelija tumora i cirkulišućih ćelija tumora, i primenu na pacijenta antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ako su nivoi IL-34 viši od nivoa IL-34 nađenih u kontrolnoj populaciji.

16. Postupak za određivanje da li je subjekat koji ima kancer kandidat za režim lečenja kancera na bazi anti-CSF-1R antitela, pri čemu je navedeno antitelo antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, koji sadrži:

ex vivo ili in vitro određivanje nivoa CSF-1, ili IL-34, ili oba, u uzorku subjekta, pri čemu je uzorak izabran iz grupe koja se sastoji od krvi, seruma, plazme, ćelija tumora i cirkulišućih ćelija tumora, gde je povećanje u nivou CSF-1, ili IL-34, ili oba, u poređenju sa nivoom CSF-1, ili IL-34, ili oba, u individui koja ne pati od kancera, indikativno za to da je subjekat kandidat za režim lečenja kancera na bazi anti-CSF-1R antitela.