RS56819B1 - Na polietilen glikolu bazirani prolek adrenomedulina i njegovo korišćenje - Google Patents

Description

Opis

Pronalazak se odnosi na novi na polietilen glikolu (PEG) bazirani prolek adrenomedulina, na procese za pripremu toga, na korišćenje toga za lečenje i/ili prevenciju oboljenja, i na korišćenje toga za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju oboljenja, naročito kardiovaskularnih, edemtoznih i/ili zapaljenskih poremećaja.

Peptidni hormon od 52 aminokiseline adrenomedulin (ADM) stvara se u nadbubrežnoj žlezdi, plućima, bubregu, srčanom mišiću i drugim organima. Nivoi ADM u plazmi su u nižem pikomolarnom rasponu. ADM je član sa genom za kalcitonin srodni peptid (CGRP) porodice peptida i kao takav se veže na heterodimerski sa G-proteinom spregnuti receptor koji se sastoji od CRLR i RAMP 2 ili 3 (kalcitoninskom receptoru sličan receptor i protein modifikovanja receptorske aktivnosti 2 ili 3). Aktivacija ADM receptora vodi do intraćelijskog porasta adenozin 3', 5'-cikličkog monofosfata (cAMP) u ćelijama koje poseduju receptor. ADM receptori su prisutni na različitim ćelijskim tipovima u gotovo svim organima uključujući endotelske ćelije. Za ADM se misli da se metabolizuje neutralnom endopeptidazom i pretežno uklanja u plućima gde su ADM-receptori visoko eksprimisani [za pregled vidi Gibbons C., Dackor R., Dunworth W., Fritz-Six K., Caron K.M., Mol Endocrinol 21(4),783-796 (2007)].

Eksperimentalni podaci iz literature upućuju na to kako je ADM uključen u različite funkcionalne uloge koje uključuju, između ostalih, regulisanje krvnog pritiska, bronhodilataciju, renalnu funkciju, sekreciju hormona, ćelijski rast, diferencijaciju, neurotransmisiju i modulisanje imunskog odgovora. Nadalje, ADM igra ključnu ulogu kao autokrini faktor tokom proliferisanja i regeneracije endotelskih ćelija [za pregled vidi Garcia M.A., Martin-Santamaria S., de Pascual-Teresa B., Ramos A., Julián M., Martinez A., Expert Opin Ther Targets, 10(2), 303-317 (2006)]

Postoji velika količina dokaza iz literature koja pokazuje kako je ADM neophodan za funkcionisanje intaktne endotelske barijere i kako primena ADM u supra-fiziološkim nivoima vrši snažne antiedemtozne i antiinflamatorne funkcije u različitim zapaljenskim stanjima u eksperimentima sa životinjama uključujući sepsu, akutno oštećenje pluća i zapaljenje creva [za pregled vidi Temmesfeld-Wollbrück B., Hocke A.C., Suttorp N., Hippenstiel S., Thromb Haemost; 98, 944-951 (2007)]

Kliničko testiranje ADM do sada je provedeno u kardiovaskularnim indikacijama sa merljivom hemodinamskom završnom tačkom poput pulmonarne hipertenzije, hipertenzije, zatajenja srca i akutnog infarkta miokarda. ADM je pokazao hemodinamske efekte u nekoliko studija u pacijenata obolelih od pre pomenutih stanja. Međutim, efekti su bili samo kratkotrajni i prestajali su neposredno nakon završetka primene. Ovi nalazi dobro koreliraju sa poznatim farmakokinetičkim profilom ADM. Farmakodinamski efekti obuhvataju između ostalog snižavanje sistemskog i pulmonarnog arterijskog krvnog pritiska i povećanje minutnog volumena srca [Troughton R.W., Lewis L.K., Yandle T.G., Richards A.M., Nicholls M.G., Hipertenzija, 36(4), 588-93 (2000); Nagaya N., Kangawa K., Peptides,.

25(11), 2013-8 (2004); Kataoka Y., Miyazaki S., Yasuda S., Nagaya N., Noguchi T., Yamada N., Morii I., Kawamura A., Doi K., Miyatake K., Tomoike H., Kangawa K., J Cardiovasc Pharmacol, 56(4), 413-9 (2010)]

U sažetku, na temelju dokaza iz mnoštva eksperimentalnih podataka u životinja i prvih kliničkih studija na čoveku, podizanje ADM na suprafiziološle nivoe moglo bi da se smatra ciljnim mehanizmom za lečenje različitih stanja oboljenja u čoveka i životinja. Međutim, glavna ograničenja korišćenja ADM kao terapijskog agensa su nepodesna primenjivost kontinuisane infuzione terapije što onemogućava njegovo korišćenje za većinu potencijalnih indikacija i potencijalno ograničene bezbedonosne granice sa obzirom na hipotenziju koja može da nastane bolus primenom ADM.

Cilj ovog pronalaska je pružiti nova jedinjenja koja mogu da se upotrebe za lečenje oboljenja, određenije kardiovaskularnih, edemtoznih i zapaljenskih poremećaja.

Mnogi terapijski aktivni peptidi ili proteini pate od visokog klirensa in vivo. Postoji nekoliko pristupa formiranju injektabilnog depoa takvih lekova koji uključuju korišćenje makromolekula.

Polimerne matrice koje sadrže molekul leka u nekovalentno vezanom stanju su dobro poznate. Te također mogu da budu injektibilne poput hidrogelova, mikročestica ili micela. Kinetika otpuštanja takvih produkata sa lekom može da bude poprilično nepouzdana sa visokom varijabilnošću među pacijentima. Proizvodnja takvih polimera može da ošteti osetljivu supstancu leka ili ona može da prođe kroz sporedne reakcije sa polimerom tokom njegove razgradnje (D.H. Lee et al., J. Contr. Rel., 2003, 92, 291-299).

Permanentno PEGilovanje peptida ili proteina da se pojača njihova rastvorljivost, smanji imunogenicitet i poveća poluživot smanjivanjem bubrežnog klirensa je dobro poznat koncept od ranih 1980-ih (Caliceti P.,Veronese F.M., Adv. Drug Deliv. Rev.2003, 55, 1261-1277). Za nekoliko lekova ovo je korišteno s uspesima, ali kod mnogo primera PEGilovanje smanjuje efikasnost supstance leka do te mere da taj koncept više nije podesan (T. Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 4897-4904).

Podesna alternativa su na polimeru bazirani prolekovi. Sadašnje definicije za prolekove po IUPAC navode sledeće izraze (International Union of Pure and Applied Chemistry i International Union of Biochemistry: GLOSSARY OF TERMS USED IN MEDICINAL CHEMISTRY (Recommendations 1998); u Pure & Appl. Chem. Vol 70, br.5, 1998, str. 1129-1143):

Prolek: Prolek je bilo koje jedinjenje koje prolazi biotransformisanje pre pokazivanja svojih farmakoloških efekata. Na prolekove može prema tome da se gleda kao na lekove koji sadrže specijalizovane netoksične zaštitne grupe korišćene na privremen način da se promene ili eliminišu neželjene osobine u matičnom molekulu.

Sa nosačem vezani prolek (prolek sa nosačem): Sa nosačem vezani prolek je prolek koji sadrži privremenu vezu dane aktivne supstance sa privremenom grupom nosačem koja daje poboljšane fizičko-hemijske ili farmakokinetičke osobine i koja može lako da se ukloni in vivo, uobičajeno hidrolitičkim cepanjem.

Kaskadni prolek: Kaskadni prolek je prolek kod kojeg cepanje grupe nosača postaje delotvorno tek nakon odmaskiravanja aktivišuće grupe.

Postoji nekoliko primera na PEG baziranih prolekova sa nosačem, većina njih sa potrebom za enzimskim aktivisanjem linkera između aktivnog leka i nosača, većinom iniciranim enzimskim hidrolizovanjem. Budući se estri cepaju veoma lako i nepredvidljivo in vivo, direktni estarski linkeri za prolekove sa nosačem imaju ograničenja njihove sposobnosti korišćenja (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7255-270).

Uobičajeno korišćeni alternativni pristupi su kaskadni linkeri vezani na amin funkcionalnu grupu u peptidu ili proteinu. U kaskadnim linkerima maskirajuća grupa mora da se ukloni kao korak koji ograničava brzinu u kaskadi. Ovo aktiviše linker za razgradnju na drugoj poziciji da se otpusti peptid ili protein. Uobičajeno maskirajuća grupa može da se ukloni enzimskim mehanizmom (R.B.Greenwald et al. u WO2002/089789, Greenwald, et al., J. Med. Chem. 1999, 42, 3657-3667, F.M.H. DeGroot et al. u WO2002/083180 i WO2004/043493, i D. Shabat et al. u WO2004/019993).

Alternativa koja se ne oslanja na enzimsko aktivisanje je koncept od U. Hersel et al. u WO2005/099768. Unjihovom pristupu maskirajuća grupa na fenolu se ukloni na samo o pH zavisan način napadom internog nukleofila. Ovo aktiviše linker za daljnju razgradnju.

Kako je pomenuto od U. Hersel et al. u WO2005/099768, "Nedostatak u iznad pomenutim prolek sistemima opisanim od Greenwald, DeGroot i Shabat je otpuštanje potencijalno toksičnih aromatskih malomolekulskih sporednih produkata poput kvinon metida nakon cepanja privremene veze. Potencijalno toksični entiteti se otpuštaju u 1:1 stehiometriji sa lekom i mogu da dosegnu visoke in vivo koncentracije." Isti problem također postoji za sistem od Hersel et al.

Za male organske molekule postoji mnoštvo različitih prolek pristupa (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7, 255-270). Pristup korišten od U. Hersel et al. kao mehanizam otpuštanja za njihovu maskirajuću grupu korišćen je kao prolek pristup za fenolne grupe malih molekula od kasnih 1980-ih. (W.S. Saari u EP 0296811 i W.S. Saari et al., J. Med. Chem.1990, vol. 33, br.1, str.97-101).

Alternativni na aminu bazirani prolek sistemi su bazirani na sporom hidrolizovanju bishidroksietil glicina kao kaskadnog proleka. Hidroksi grupe bis-hidroksietil glicina su maskirane estrima koji su skloni hidrolizovanju esterazama (R. Greenwald et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 726-734 i D. Vetter et al. u WO 2006/136586).

Poznati su obeleženi adrenomedulin derivati za korišćenje kao agens za snimanje i također terapijski agens (J. Depuis et al. u CA 2567478 i WO 2008/138141). U ovim ADM derivatima kompleksujuća molekulska struktura nalik na kavez sposobna vezati radioaktivne izotope spojena je na N terminus ADM izravno ili putem jedinice razmaknice, potencijalno također uključujući kratke PEG razmaknice. Dijagnostička ili terapijska vrednost tih lekova potiče od ciljane dostave radioaktivnog molekula.

U kontrastu sa prolek pristupima nabrojanima iznad, koji se svi baziraju na maskiranju amin funkcionalnih grupa, ovaj pronaklazak je baziran na maskiranju fenolne grupe tirozina u ADM. Koristi se sa nosačem vezani prolek, baziran na cepanju karbamata na ovoj fenolnoj grupi potpomognutim internim nukleofilom. Ključna prednost u odnosu na druge prolek klase pomenute iznad je toksikološka neškodljivost produkta razgradnje linkera, cikličke uree permanentno spojene na nosač. Nadalje, razgradnja proleka ne zavisi o enzimskim mehanizmima koji mogu da uzrokuju visoku varijabilnost kinetike cepanja među pacijentima. Mehanizam cepanja je isključivo pH zavisan budući se interni amin koji je protonisan pri kiselom pH aktiviše pri višem (neutralnom) pH da deluje kao nukleofil napadajući fenolni karbamat baziran na tirozinu.

U kontekstu ovog pronalaska, sada su opisana jedinjenja koja deluju kao sporo otpuštajući ADM-prolekovi sa produljenim trajanjem farmakološkog dejstva u poređenju sa ADM i koji na temelju ovog specifičnog mehanizma akcije - nakon parenteralne primene - vrše in vivo održive antiinflamatorne i hemodinamske efekte poput stabilizovanja funkcije endotelske barijere i smanjenja krvnog pritiska, odnosno.

Ovaj pronalazak donosi jedinjenja formule

u čemu

n predstavlja broj 0, 1, 2 ili 3,

R<1>predstavlja vodonik, metil, etil, n-propil ili izopropil,

R<2>predstavlja linearni ili razgranati PEG od 20kDa do 80kDa pokriven na kraju sa metoksigrupom,

i soli od toga, solvate od toga i solvate soli od toga.

Jedinjenja prema pronalasku su jedinjenja formule (I) i soli od toga, solvati od toga i solvati soli od toga, jedinjenja koja su obuhvaćena formulom (I) i jesu formule specifikovane ispod i soli od toga, solvati od toga i solvati soli od toga, i jedinjenja koja su obuhvaćena formulom (I) i specifikovana su ispod kao radni primeri i soli od toga, solvati od toga i solvati soli od toga, ako jedinjenja koja su obuhvaćena formulom (I) i specifikovana su ispod već nisu soli, solvati i solvati soli.

Zavisno od njihove strukture, jedinjenja prema pronalasku mogu da postoje u stereoizomernim formama (enantiomerima, dijastereomerima). Pronalazak prema tome obuhvata enantiomere ili dijastereomere i određene smeše od toga. Stereoizomerno homogeni konstituenti iz takvih smeša enantiomera i/ili dijastereomera mogu da se izoluju na poznat način.

Kada jedinjenja prema pronalasku mogu da se pojave u tautomernim formama, ovaj pronalazak obuhvata sve tautomerne forme.

U kontekstu ovog pronalaska, poželjne soli su fiziološki prihvatljive soli jedinjenja prema pronalasku. Također su uključene soli koje same nisu podesne za farmaceutske primene ali, na primer, mogu da se koriste za izolovanje ili prečišćavanje jedinjenja prema pronalasku.

Fiziološki prihvatljive soli jedinjenja prema pronalasku uključuju kiselinske adicione soli mineralne kiseline, karboksilne kiseline i sulfonske kiseline, na primer soli hlorovodične kiseline, bromovodične kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline, metansulfonske kiseline, etansulfonske kiseline, toluensulfonske kiseline, benzensulfonske kiseline, naftalendisulfonske kiseline, sirćetne kiseline, trifluorosirćetne kiseline, propionske kiseline, mlečne kiseline, vinske kiseline, jabučne kiseline, limunske kiseline, fumarne kiseline, maleinske kiseline i benzojeve kiseline.

Fiziološki prihvatljive soli jedinjenja prema pronalasku također uključuju soli uobičajenih baza, na primer i poželjno soli alkalnog metala (npr. natrijum i kalijum soli), soli zemnoalkalnog metala (npr. kalcijum i magnezijum soli) i amonijum soli izvedene iz amonijaka ili organskih amina koji poseduju 1 do 16 atoma ugljenika, na primer i poželjno etilamina, dietilamina, trietilamina, etildiizopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, dicikloheksilamina, dimetilaminoetanola, prokaina, dibenzilamina, N-metilmorfolina, arginina, lizina, etilendiamina i N-metilpiperidina.

U kontekstu pronalaska, solvati se odnose na one forme jedinjenja prema pronalasku koje, u čvrstom ili tečnom stanju, formiraju kompleks koordinacijom sa molekulima rastvarača. Hidrati su specifična forma solvata, u čemu koordinacija je sa vodom. Poželjni solvati u kontekstu ovog pronalaska su hidrati.

U kontekstu pronalaska pokriven na kraju sa metoksi-grupom pomenutom u R<2>znači kako je polietilen glikol (PEG) supstituisan sa metoksi grupom na kraju koji nije vezan na kiseonik, tj. - PEG 40kDa-OMe.

Prednost je dana jedinjenja formule (I) u čemu

n predstavlja broj 1 ili 2,

R<1>predstavlja vodonik ili metil,

R<2>predstavlja linearni PEG 40kDa pokriven na kraju sa metoksi-grupom.

Prednost je također dana jedinjenjima formule (I) u čemu

n predstavlja broj 1 ili 2,

R<1>predstavlja vodonik,

R<2>predstavlja linearni PEG 40kDa pokriven na kraju sa metoksi-grupom.

Prednost je također dana jedinjenjima formule (I) u čemu n predstavlja broj 1.

Prednost je također dana jedinjenjima formule (I) u čemu R<1>predstavlja vodonik.

Prednost je također dana jedinjenjima formule (I) u čemu atom ugljenika na koji je vezan -NHR<1>supstituent poseduje S konfiguraciju.

Prednost je također dana jedinjenjima formule (I) u čemu R<2>predstavlja linearni PEG 40kDa pokriven na kraju sa metoksi-grupom.

Prednost je također dana jedinjenjima formule (I) koja poseduju strukturu formule (Ia)

u čemu

n, R<1>i R<2>su svaki kako je definisano iznad,

i solima od toga, solvatima od toga i solvatima soli od toga.

Definicije specifičnih radikala dane u određenim kombinacijama ili poželjnim kombinacijama radikala su, bez obzira na specifikovanu određenu kombinaciju radikala, također zamenjene sa bilo kojim definicijama radikala drugih kombinacija.

Veoma naročita prednost je dana kombinacijama dva ili više iznad pomenutih poželjnih raspona.

Pronalazak nadalje donosi proces za pripremu jedinjenja formule (I), ili soli od toga, solvata od toga ili solvata soli od toga, u čemu jedinjenja formule (II)

u čemu

n i R<1>su svaki kako je definisano iznad,

reaguju sa jedinjenjima formule (III)

u čemu

R<2>je kako je definisano iznad.

Reakcija se uopšteno provodi u inertnim rastvaračima, poželjno u temperaturnom rasponu od 0°C do 50°C pri standardnom pritisku.

Inertni rastvarači su, na primer, citratni puferi, glicin-hidrohlorid puferi, ftalatni puferi ili acetatni puferi sa pH 3 do 5, prednost se daje citratnom puferu sa pH 4.

Jedinjenje formule (III) je poznato ili može da se sintetizuje poznatim procesima iz odgovarajućih početnih jedinjenja.

Jedinjenja formule (II) su poznata ili mogu da se pripreme reagovanjem jedinjenja formule (IV)

u čemu

n i R<1>su svaki kako je definisano iznad,

u prvom stepenu sa jedinjenjem formule (V)

i u drugom stepenu sa kiselinom.

Reakcija u prvom stepenu se uopšteno izvodi u inertnim rastvaračima, u prisustvu dehidratizujućeg reagensa, opcionalno u prisustvu baze, poželjno u temperaturnom rasponu od sobne temperature do 70°C pri standardnom pritisku.

Inertni rastvarači su, na primer, halougljovodonici poput dihlorometana, trihlorometana ili 1,2-dihloroetana, etri poput dioksana, tetrahidrofurana ili 1,2-dimetoksietana ili drugi rastvarači poput acetona, dimetilformamida, dimetilacetamida, 2-butanona ili acetonitrila. Jednako je moguće da se koriste smeše rastvarača. Prednost je dana dimetilformamidu.

Podesni dehidratizujući reagensi u ovom kontekstu su, na primer, karbodiimidi, na primer N,N'-dietil-, N,N'-dipropil-, N,N'-diizopropil-, N,N'-dicikloheksilkarbodiimid, N-(3-dimetilamino-izopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDC), N-cikloheksilkarbodiimid-N'-propiloksimetilpolistiren (PS-karbodiimid), ili karbonil jedinjenja poput karbonildiimidazola, ili 1,2-oksazolijum jedinjenja poput 2-etil-5-fenil-1,2-oksazolijum 3-sulfata ili 2-tert-butil-5-metilisoksazolijum perhlorata, ili acilamino jedinjenja poput 2-etoksi-1-etoksikarbonil-1,2dihidrokvinolina, ili propanfosfonski anhidrid, ili izobutil hloroformat, ili bis-(2-okso-3-oksazolidinil)fosforil hlorid ili benzotriazoliloksitri(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat, ili O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HBTU), benzotriazol-1-il-N-tetrametil-uronijum tetrafluoroborat (TBTU), 2-(2-okso-1-(2H)-piridil)-1,1,3,3-tetrametiluronijum tetrafluoroborat (TPTU) ili O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU), ili 1-hidroksibenzotriazol (HOBt), ili benzotriazol-1-iloksitris(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat (BOP), ili benzotriazol-1-iloksitris(pirolidino)fosfonijum heksafluorofosfat (PYBOP), ili N-hidroksisukcinimid, ili smeše ovih sa bazom.

Baze su, na primer, karbonati alkalnog metala, na primer natrijum karbonat ili kalijum karbonat, ili natrijum hidrogenkarbonat ili kalijum hidrogenkarbonat, ili organske baze poput trialkilamina, na primer trietilamin, N-metilmorfolin, N-metilpiperidin, 4-dimetilaminopiridin ili N,N-diizopropiletilamin, prednost se daje N,N-diizopropiletilaminu.

Poželjno, kondenzovanje se izvodi sa TBTU u prisustvu N,N-diizopropiletilamina.

Reakcija drugog stepena se opcionalno izvodi u inertnim rastvaračima, poželjno u temperaturnom rasponu od sobne temperature do 60°C pri standardnom pritisku.

Inertni rastvarači su, na primer, halougljovodonici poput dihlorometana, trihlorometana, ugljenik tetrahlorida ili 1,2-dihloroetana, ili etri poput tetrahidrofurana ili dioksana, prednost se daje dihlorometanu.

Kiseline su, na primer, trifluorosirćetna kiselina ili hlorovodonik u dioksanu, prednost se daje koncentrovanoj trifluorosirćetnoj kiselini. Koncentrovana trifluorosirćetna kiselina može da se koristi uz dodatak hvatača poput vode, fenola, tioanisola i 1,2-etandiola. Prednost je dana 1 do 5% svakog od tih hvatača.

Jedinjenje formule (V) je poznato ili može da se sintetizuje poznatim procesima iz odgovarajućih početnih jedinjenja (primer 14A).

Jedinjenja formule (IV) su poznata ili mogu da se pripreme reagovanjem jedinjenja formule (VI)

u čemu

n i R<1>su svaki kako je definisano iznad,

sa izvorom paladijuma(0) i redukujućim agensom.

Reakcija se uopšteno provodi u inertnim rastvaračima, opcionalno u prisustvu slabe baze, poželjno u temperaturnom rasponu od 0°C do 50°C pri standardnom pritisku.

Inertni rastvarači su, na primer, halougljovodonici poput dihlorometana, trihlorometana ili 1,2-dihloroetana, etri poput dioksana, tetrahidrofurana ili 1,2-dimetoksietana, ili drugi rastvarači poput acetona, dimetilformamida, dimetilacetamida, 2-butanona ili acetonitrila. Jednako je moguće da se koristi smeše rastvarača. Prednost je dana tetrahidrofuranu.

Izvori paladijuma(0) su, na primer, tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) ili izvori paladijuma(0) koji su redukovani in situ do paladijuma(0) tokom reakcije, prednost se daje tetrakis(trifenilfosfin)-paladijumu(0).

Redukujući agensi su, na primer, mravlja kiselina ili trietil silan, prednost se daje mravljoj kiselini.

Baze su, na primer, trietilamin, N,N-diizopropiletilamin ili rastvor kalijum fosfata, prednost se daje trietilaminu.

Jedinjenja formule (VI) su poznata ili mogu da se pripreme reagovanjem jedinjenja formule (VII)

u čemu

n i R<1>su svaki kako je definisano iznad,

sa jedinjenjem formule (VIII)

Reakcija se uopšteno provodi u inertnim rastvaračima, u prisustvu dehidratizujućeg reagensa, opcionalno u prisustvu baze, poželjno u temperaturnom rasponu od sobne temperature do 70°C pri standardnom pritisku.

Inertni rastvarači su, na primer, halougljovodonici poput dihlorometana, trihlorometana ili 1,2-dihloroetana, etri poput dioksana, tetrahidrofurana ili 1,2-dimetoksietana, ili drugi rastvarači poput acetona, dimetilformamida, dimetilacetamida, 2-butanona ili acetonitrila. Jednako je moguće da se koriste smeše rastvarača. Prednost je dana dihlorometanu.

Podesni dehidratizujući reagensi u ovom kontekstu su, na primer, karbodiimidi, na primer N,N'-dietil-, N,N'-dipropil-, N,N'-diizopropil-, N,N'-dicikloheksilkarbodiimid, N-(3-dimetilamino-izopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDC), N-cikloheksilkarbodiimid-N'-propiloksimetilpolistiren (PS-karbodiimid), ili karbonil jedinjenja poput karbonildiimidazola, ili 1,2-oksazolijum jedinjenja poput 2-etil-5-fenil-1,2-oksazolijum 3-sulfata ili 2-tert-butil-5metilizoksazolijum perhlorata, ili acilamino jedinjenja poput 2-etoksi-1-etoksikarbonil-1,2-dihidrokvinolina, ili propanfosfonski anhidrid, ili izobutil hloroformat, ili bis-(2-okso-3-oksazolidinil)fosforil hlorid ili benzotriazoliloksitri(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat, ili O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N,N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HBTU), benzotriazol-1-il-N-tetrametil-uronijum tetrafluoroborat (TBTU), 2-(2-okso-1-(2H)-piridil)-1,1,3,3-tetrametiluronijum tetrafluoroborat (TPTU) ili O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU), ili 1-hidroksibenzotriazol (HOBt), ili benzotriazol-1-iloksitris(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat (BOP), ili benzotriazol-1-iloksitris(pirolidino)fosfonijum heksafluorofosfat (PYBOP), ili N-hidroksisukcinimid, ili smeše ovih sa bazom.

Baze su, na primer, karbonati alkalnog metala, na primer natrijum karbonat ili kalijum karbonat, ili natrijum hidrogenkarbonat ili kalijum hidrogenkarbonat, ili organske baze poput trialkilamina, na primer trietilamin, N-metilmorfolin, N-metilpiperidin, 4-dimetilaminopiridin ili N,N-diizopropiletilamin, prednost se daje N,N-diizopropiletilaminu.

Poželjno, kondenzovanje se izvodi sa HATU u prisustvu N,N-diizopropiletilamina.

Jedinjenja formule (VII) i (VIII) su poznata ili mogu da se sintetizuju poznatim procesima iz odgovarajućih početnih jedinjenja.

Priprema jedinjenja prema pronalasku može da se ilustruje sledećim šemom sintetizovanja:

Jedinjenja prema pronalasku pokazuju nepredviđeni korisni spektar farmakološke aktivnosti.

Prema tome ona su podesna za korišćenje kao medikamenti za lečenje i/ili prevenciju oboljenja u ljudi i životinja.

Jedinjenja prema pronalasku su istaknuta kao specifični adrenomedulin (ADM) otpuštajući prolekovi.

Ovaj pronalazak nadalje donosi za korišćenje jedinjenja prema pronalasku za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, naročito kardiovaskularnih, edemtoznih i/ili zapaljenskih poremećaja.

Za ovaj pronalazak, izraz "lečenje" ili "lečiti" uključuje inhibisanje, odgađanje, olakšavanje, mitigaciju, zaustavljanje, smanjivanje ili uzrokovanje regresije oboljenja, poremećaja, okolnosti ili stanja, razvoja i/ili progresije od toga, i/ili simptoma od toga. Izraz "prevencija" ili "prevenisanje" uključuje smanjivanje rizika bolovanja od, dobijanja, ili doživljavanja oboljenja, poremećaja, okolnosti ili stanja, razvoja i/ili progresije od toga, i/ili simptoma od toga. Izraz prevencija uključuje profilaksu. Lečenje ili prevencija oboljenja, poremećaja, okolnosti ili stanja mogu da budu delimični ili potpuni.

Na temelju njihovih farmakoloških osobina, jedinjenja prema pronalasku mogu da se upotrebljavaju za lečenje i/ili prevenciju kardiovaskularnih oboljenja, određenije zatajenja srca, naročito hroničnog i akutnog zatajenja srca, dijastoličkog i sistoličkog (kongestivnog) zatajenja srca, akutnog dekompenzovanog zatajenja srca, srčane insuficijencije, koronarne bolesti srca, angine pektoris, infarkta miokarda, ishemijsko reperfuzijske ozlede, ishemijskog i hemoragijskog moždanog udara, arterioskleroze, ateroskleroze, hipertenzije, naročito esencijalne hipertenzije, maligne esencijalne hipertenzije, sekundarne hipertenzije, renovaskularne hipertenzije i hipertenzije sekundarne renalnim i endokrinim poremećajima, hipertenzijskog oboljenja srca, hipertenzijskog oboljenja bubrega, pulmonarne hipertenzije, naročito sekundarne pulmonarne hipertenzije, pulmonarne hipertenzije nakon pulmonarnog embolizma sa i bez akutnog cor pulmonale, primarne pulmonarne hipertenzije i periferne arterijske okluzivne bolesti.

Jedinjenja prema pronalasku su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju gestacijskog [trudnoćom indukovanog] edema i proteinurije sa i bez hipertenzije (preeklampsije).

Jedinjenja prema pronalasku su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju pulmonarnih poremećaja, poput hroničnog opstruktivne bolesti pluća, astme, akutnog i hroničnog pulmonarnog edema, alergijskog alveolitisa i pneumonitisa zbog udahnute organske prašine i čestica fungalnog, aktinomicetskog ili drugog porekla, akutnog hemijskog bronhitisa, akutnog i hroničnog hemijskog pulmonarnog edema (npr. nakon udisanja fosgena, azotnog oksida), neurogenog pulmonarnog edema, akutnih i hroničnih pulmonarnih manifestacija zbog radijacije, akutnih i hroničnih interstitijskih poremećaja pluća (poput ali ne i ograničeno na lekom indukovane interstitijske poremećaje pluća, npr. sekundarno lečenju bleomicinom), akutne ozlede pluća/akutnog sindroma respiratornog distresa (ALI/ARDS) u odraslih ili deteta uključujući novorođenče, ALI/ARDS sekundarnog pneumoniji i sepsi, aspiracione pneumonije i ALI/ARDS sekundarnog aspiraciji (poput ali ne i ograničeno na aspiracionu pneumoniju zbog povraćenog želučanog sadržaja), ALI/ARDS sekundarnog udisanju dimnog gasa, akutne ozlede pluća povezane sa transfuzijom (TRALI), ALI/ARDS ili akutne pulmonarne insuficiencije nakon hirurškog zahvata, traume ili opekline, ventilatorom indukovane ozlede pluća (VILI), ozlede pluća nakon aspiracije mekonijuma, pulmonarne fibroze i visinske bolesti.

Jedinjenja prema pronalasku su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju hroničnih oboljenja bubrega (stepeni 1-5), renalne insuficiencije, dijabetičke nefropatije, hipertenzijskog hroničnog oboljenja bubrega, glomerulonefritisa, brzo progresivnog i hroničnog nefritičkog sindroma, nespecifičnog nefritičkog sindroma, nefrotskog sindroma, hereditarnih nefropatija, akutnog i hroničnog tubulo-intersticijskog nefritisa, akutne ozleda bubrega, akutnog zatajenja bubrega, posttraumatskog zatajenja bubrega, traumatske i postproceduralne ozlede bubrega, kardiorenalnog sindroma te zaštitu i funkcionalno poboljšanje transplantata bubrega.

Jedinjenja su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju dijabetes melitusa i njegovih posledičnih simptoma, poput npr. diabetičke makro- i mikroangiopatije, dijabetičke nefropatije i neuropatije.

Jedinjenja prema pronalasku mogu nadalje da se koriste za lečenje i/ili prevenciju poremećaja centralnog i perifernog nervnog sistema poput virusnog i bakterijskog meningitisa i encefalitisa (npr. Zoster encefalitis), ozlede mozga, primarne ili sekundarne [metastaza] maligne neoplazme mozga i kičmene moždine, radikulitisa i poliradikulitisa, Gilen-Bareovog sindroma [akutni (post)infektivni polineuritis, Miler Fišer sindrom], amiotrofičke lateralne skleroze [progresivna spinalna mišićna atrofija], Parkinsonove bolesti, akutnih i hroničnih polineuropatija, bola, cerebralnog edema, Alchajmerove bolesti, degenerativnih oboljenja nervnog sistema i demijelinizujućih oboljenja centralnog nervnog sistema poput ali ne i ograničeno na multiplu sklerozu.

Jedinjenja prema pronalasku su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju portalne hipertenzije i fibroze jetre [ciroza] i njenih posledica poput ezofagealnih proširenih krvnih sudova i ascitesa, za lečenje i/ili prevenciju pleuralnih efuzija sekundarnih malignim bolestima ili zapaljenjima i za lečenje i/ili prevenciju limfedema i edema sekundarnog proširenim venama.

Jedinjenja prema pronalasku su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju inflamatornih poremećaja gastrointestinalnog trakta poput zapaljenske bolesti creva, Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa te toksičnih i vaskularnih poremećaja creva.

Jedinjenja prema pronalasku su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju sepse, septičkog šoka, sindroma sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS) neinfektivnog porekla, hemoragijskog šoka, sepse ili SIRS sa disfunkcijom organa ili multiorganskim zatajenjem (MOF), traumatskog šoka, toksičnog šoka, anafilaktičkog šoka, urtikarije, uboda insekta i sa ujedom povezanih alergija, angioneurotičkog edema [divovska urtikarija, Kvinkeov edem], akutnog laringitisa i traheitisa te akutnog opstruktivnog laringitisa [krup] i epiglotitisa.

Jedinjenja su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju oboljenja reumatskog tipa i drugih formi oboljenja koja se smatraju autoimunim oboljenjima poput ali ne i ograničeno na poliartritis, eritematozni lupus, sklerodermu, purpuru i vaskulitis.

Jedinjenja prema pronalasku su nadalje podesna za lečenje okularne hipertenzije (glaukom), dijabetičke retinopatije i makularnog edema.

Jedinjenja prema pronalasku mogu nadalje da se koriste za lečenje i/ili prevenciju sa operacijom povezanih stanja ishemije i posledičnih simptoma od toga nakon hirurških intervencija, određenije intervencija na srcu koristeći srce-pluća mašinu (npr. operacije bajpasa, implantati srčanih zalisaka), intervencija na karotidnim arterijama, intervencija na aorti i intervencija sa instrumentalnim otvaranjem ili penetracijom krova lobanje.

Jedinjenja su nadalje podesna za opšte lečenje i/ili prevenciju u slučaju hirurških intervencija sa ciljem ubrzavanja zaceljivanja rane i skraćivanja vremena rekonvalescencije. Ona su nadalje podesna za promovisanje zaceljivanja rane.

Jedinjenja su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju poremećaja koštane gustine i strukture poput ali ne i ograničeno na osteoporozu, osteomalaciju i sa hiperparatiroidizmom povezanih koštanih poremećaja.

Jedinjenja su nadalje podesna za lečenje i/ili prevenciju seksualnih disfunkcija, određenije erektilne disfunkcije muškarca.

Poželjna jedinjenja su podesna za lečenje i/ili prevenciju zatajenja srca, koronarne bolesti srca, ishemijskog i/ili hemoragijskog moždanog udara, hipertenzije, pulmonarne hipertenzije, periferne arterijske okluzivne bolesti, preeklampsije, hronične opstruktivne bolesti pluća, astme, akutnog i/ili hroničnog pulmonarnog edema, alergijskog alveolitisa i/ili pneumonitisa zbog udahnute organske prašine i čestica fungalnog, aktinomicetskog ili drugog porekla, i/ili akutnog hemijskog bronhitisa, akutnog i/ili hroničnog hemijskog pulmonarnog edema, neurogenog pulmonarnog edema, akutnih i/ili hroničnih pulmonarnih manifestacija zbog radijacije, akutnih i/ili hroničnih intersticijskih poremećaja pluća, akutnih ozleda pluća/ akutnog sindroma respiratornog distresa (ALI/ARDS) u odraslih ili deteta uključujući novorođenče, ALI/ARDS sekundarnog pneumoniji i sepsi, aspiracione pneumonije i ALI/ARDS sekundarnog aspiraciji, ALI/ARDS sekundarnog udisanju dimnog gasa, sa transfuzijom povezane akutne ozlede pluća (TRALI), ALI/ARDS i/ili akutne pulmonarne insuficijencije nakon hirurškog zahvata, traume i/ili opeklina, i/ili ventilatorom indukovane ozlede pluća (VILI), ozlede pluća nakon aspiracije mekonijuma, pulmonarne fibroze, visinske bolesti, hroničnih oboljenja bubrega, glomerulonefritisa, akutne ozlede bubrega, kardiorenalnog sindroma, limfedema, zapaljenske bolesti creva, sepse, septičkog šoka, sindroma sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS) neinfektivnog porekla, anafilaktičkog šoka, zapaljenske bolesti creva i/ili urtikarije.

Još poželjnija jedinjenja su podesna za lečenje i/ili prevenciju zatajenja srca, hipertenzije, pulmonarne hipertenzije, astme, akutnog i/ili hroničnog hemijskog pulmonarnog edema, akutne ozlede pluća/akutnog sindroma respiratornog distresa (ALI/ARDS) u odraslih ili deteta uključujući novorođenče, ALI/ARDS sekundarnog pneumoniji i sepsi, aspiracione pneumonije i ALI/ARDS sekundarnog aspiraciji, ALI/ARDS sekundarnog udisanju dimnog gasa, sa transfuzijom povezane akutne ozlede pluća (TRALI), ALI/ARDS i/ili akutne pulmonarne insuficijencije nakon hirurškog zahvata, traume i/ili opeklina, i/ili ventilatorom indukovane ozlede pluća (VILI), ozlede pluća nakon aspiracije mekonijuma, sepse, septičkog šoka, sindroma sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS) neinfektivnog porekla, anafilaktičkog šoka, zapaljenske bolesti creva i/ili urtikarije.

Ovaj pronalazak nadalje donosi korišćenje jedinjenja prema pronalasku za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, određenije poremećaja pomenutih iznad.

Ovaj pronalazak nadalje donosi korišćenje jedinjenja prema pronalasku za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, određenije poremećaja pomenutih iznad.

Ovaj pronalazak nadalje donosi postupak za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, određenije poremećaja pomenutih iznad, koristeći aktivnu količinu jedinjenja prema pronalasku.

Pronalazak nadalje donosi medikamente koji obuhvataju jedinjenje prema pronalasku i jedan ili više daljnjih aktivnih sastojaka, određenije za lečenje i/ili prevenciju poremećaja pomenutih iznad. Primerno i poželjno kombinacije aktivnog sastojka su:

ACE inhibitori, antagonisti angiotenzin receptora, agonisti beta-2 receptora, inhibitori fosfodiesteraze, agonisti glukokortikoid receptora, diuretici, ili rekombinantni angiotenzin konvertujući enzim-2 ili acetilsalicilna kiselina (aspirin).

U poželjnom izvođenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa ACE inhibitorom, poput, kao primer i poželjno, enalaprila, kvinaprila, kaptoprila, lizinoprila, ramiprila, delaprila, fosinoprila, perindoprila, cilazaprila, imidaprila, benazeprila, moeksiprila, spiraprila ili trandoprila.

U poželjnom izvođenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa antagonistom angiotenzin receptora, poput, kao primer i poželjno, losartana, kandesartana, valsartana, telmisartana ili embusartana.

U poželjnom izvođenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa agonistom beta-2 receptora, poput, kao primer i poželjno, salbutamola, pirbuterola, salmeterola, terbutalina, fenoterola, tulobuterola, klenbuterola, reproterola ili formoterola.

U poželjnom izvođenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa inhibitorom fosfodiesteraze (PDE), poput, kao primer i poželjno, milrinona, amrinona, pimobendana, cilostazola, sildenafila, vardenafila ili tadalafila.

U poželjnom izvođenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa agonistom receptora glukokortikoida, poput, kao primer i poželjno, kortiozola, kortizona, hidrokortizona, prednisona, metil-prednisolona, prednilidena, deflazakorta, fluokortolona, triamkinolona, deksametazona ili betametazona.

U poželjnom izvođenju pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju u kombinaciji sa diureticima, poput, kao primer i poželjno, furosemida, torasemida i hidrohlorotiazida.

Ovaj pronalazak se nadalje odnosi nmedikamente koji obuhvataju najmanje jedno jedinjenje prema pronalasku, normalno zajedno sa jednim ili više inertnih, netoksičnih, farmaceutski podesnih ekscipijensa, i na korišćenje toga za prethodno pomenute svrhe.

Jedinjenja prema pronalasku mogu da deluju sistemski i/ili lokalno. Za tu svrhu, mogu da se primene na podesan način, na primer parenteralnim, pulmonarnim, nazalnim, sublingvalnim, lingvalnim, bukalnim, dermalnim, transdermalnim, konjunktivalnim, optičkim putem ili kao implantat ili stent.

Jedinjenja prema pronalasku mogu da se primene u formama za primenu podesnim za te puteve primene.

Parenteralna primena može da se izvrši sa izbegavanjem koraka apsorpcije (npr. intravenozno, intraarterijalno, intrakardijačno, intraspinalno ili intralumbarno) ili sa uključivanjem apsorpcije (npr. intramuskularno, supkutano, intrakutano, perkutano ili intraperitonealno). Forme za primenu podesne za parenteralnu primenu uključuju preparate za injekciju i infuziju u formi rastvora, suspenzija, emulzija, liofilizata ili sterilnih prašaka.

Podesne za druge puteve primene su, na primer, farmaceutske forme za inhalaciju (uključujući inhalatore praška, nebulizatore), kapi za nos, kapi za oči, rastvori ili sprejevi; filmovi/vaferi ili vodene suspenzije (losioni, smeše za protresanje), lipofilne suspenzije, pomade, kreme, transdermalni terapijski sistemi (npr. flasteri), mleka, paste, pene, prašci za posipanje, implantati ili stentovi.

Parenteralna primena je poželjna, naročito intravenozna primena.

Jedinjenja prema pronalasku mogu da se konvertuju u navedene forme za primenu. To može da se uradi na način poznat per se mešanjem sa inertnim, netoksičnim, farmaceutski podesnim ekscipijensima. Ti ekscipijensi uključuju nosače (na primer mikrokristalna celuloza, laktoza, manitol), rastvarače (npr. tečni polietilen glikoli), emulgatore i disperzante ili agense za kvašenje (na primer natrijum dodecilsulfat, polioksisorbitan oleat), veziva (na primer polivinilpirolidon), sintetičke i prirodne polimere (na primer albumin), stabilizatore (npr. antioksidansi, na primer askorbinska kiselina), boje (npr. neorganski pigmenti, na primer oksidi gvožđa) i maskirajuće arome i/ili mirise.

Uopšteno je nađeno kao korisno, u slučaju parenteralne primene, primeniti količine od oko 0,001 do 5 mg/kg, poželjno oko 0,01 to 1 mg/kg, telesne težine da se postignu efektivni rezultati.

Ipak, u nekim slučajevima može da bude neophodno odstupiti od navedenih količina, određenije kao funkcija telesne težine, puta primene, individualnog odgovora na aktivni sastojak, prirodu pripreme i vremena ili intervala tokom kojeg se dešava primena. Na primer, manje od prethodno pomenute minimalne količine može da bude dovoljno u nekim slučajevima, dok u drugim slučajevima navedena gornja granica mora da se prekorači. U slučaju primene većih količina, može da bude preporučljivo podeliti ih u više individualnih doza tokom dana.

Sledeći radni primeri ilustruju pronalazak. Pronalazak nije ograničen na primere.

Procenti u sledećim testovima i primerima su, ako nije drugačije navedeno, težinski procenti; delovi su težinski delovi. Razmere rastvarača, razmere razblaženja i podaci o koncentraciji za tečnost/tečnost rastvore su svaki bazirani na zapremini.

A. Primeri

Skraćenice

AA aminokiselina

Acm acetamidometil

ADM adrenomedulin (humani)

ADM(2-52) peptidna sekvenca ADM AA 2 do AA 52, uključujući disulfidnu vezu i C-terminalni amid

približ. približno

Boc tert-butiloksikarbonil

CDI karbonildiimidazol

d dan(a), dublet (u NMR)

TLC tankoslojna hromatografija

DCI direktno hemijsko jonizovanje (u MS)

dd dublet dubleta (u NMR)

DIEA N,N-diizopropiletilamin

DMAP 4-dimetilaminopiridin

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO dimetil sulfoksid

od teorijskog od teorijskog (u prinosu)

ekv. ekvivalent(i)

ESI elektrosprej jonizovanje (u MS)

Fmoc (9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil

H čas(ovi)

HATU O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat HPLC tečna hromatografija pod visokim pritiskom, visoke performanse

LC-MS sa tečnom hromatografijom spregnuta masena spektroskopija

m multiplet (u NMR)

min minut(i)

MS masena spektroskopija

NMR spektroskopija nuklearnom magnetskom rezonancijom

pbf 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil

PEG polietilen glikol

RP reverzna faza (u HPLC)

RT sobna temperatura

Rtretenciono vreme (u HPLC)

s singlet (u NMR)

TBTU benzotriazol-1-il-N-tetrametil-uronijum tetrafluoroborat

tBu tert-butil

TFA trifluorosirćetna kiselina

THF tetrahidrofuran

Trt tricil

Nomenklatura aminokiselina i peptidnih sekvenci je prema:

International Union of Pure and Applied Chemistry i International Union of Biochemistry: Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (Recommendations 1983). U: Pure & Appl. Chem. 56, vol.5, 1984, str.595-624.

LC-MS i MS postupci

Postupak 1 (LC-MS): Tip instrumenta: Waters ACQUITY SQD UPLC sistem; kolona: Waters Acquity UPLC HSS T31,8 µ 50 mm x 1 mm; mobilna faza A: 11 voda 0,25 ml 99% jačine mravlja kiselina, mobilna faza B: 11 acetonitril 0,25 ml 99% jačine mravlja kiselina; gradijent: 0,0 min 90% A → 1,2 min 5% A → 2,0 min 5% A; pećnica: 50°C; tok: 0,40 ml/min; UV-detekcija: 210 - 400 nm.

Postupak 2 (LC-MS): MS tip instrumenta: Waters (Micromass) Quattro Micro; HPLC tip instrumenta: Agilent 1100 serija; kolona: Thermo Hypersil GOLD 3 µ 20 mm x 4 mm; mobilna faza A: 11 voda 0,5 ml 50% jačine mravlja kiselina, mobilna faza B: 11 acetonitril 0,5 ml 50% jačine mravlja kiselina; gradijent: 0,0 min 100% A → 3,0 min 10% A → 4,0 min 10% A; pećnica: 50°C; tok: 2,0 ml/min; UV-detekcija: 210 nm.

Postupak 3 (HPLC): Tip instrumenta: HP 1200 serija; UV DAD; kolona: Fenomenex Luna 5 µm C5100Å, 150 mm x 4,6 mm; mobilna faza A: 11 voda 0,5 ml 50% jačine mravlja kiselina, mobilna faza B: 11 acetonitril 0,5 ml 50% jačine mravlja kiselina; gradijent: 0,0 min 95%A → 5 min 5% A; → 5,8 min 95% A → 6,2 min 95% A; brzina toka: 2,5 ml/min; pećnica: RT; UV detekcija: 210 nm.

Postupak 4 (HPLC): Tip instrumenta: HP 1200 serija; UV DAD; kolona: Merck Chromolith Fastgradient RP1850 mm x 2 mm; mobilna faza A: 11 voda 0,5 ml 50% jačine mravlja kiselina, mobilna faza B: 11 acetonitril 0,5 ml 50% jačine mravlja kiselina; gradijent: 0,0 min 95%A → 2,9 min 5% A → 3,2 min 5% A; brzina toka: 3 ml/min; pećnica: RT; UV detekcija: 210 nm.

Postupak 5 (DCI MS): Tip instrumenta: Thermo Fisher-Scientific DSQ; hemijsko jonizovanje; reaktant amonijak gas; temperatura izvora: 200°C; energija jonizovanja 70eV.

Postupak 6 (MALDI MS): Tip instrumenta Kratos PC-Compact SEQ V1.2.2 MALDI TOF MS, pozitivni jonizacioni mod, Linearna visina, snaga: 75.

Sintetizator mikrotalasa: Biotage Emrys Initiator II sintetizator, sa varijabilnom veličinom vijale do 20 ml reakcione zapremine i "Robot 60" procesor uzorka

pH 4 citratni pufer: Fluka No.82566; citratni pufer pH 4, stabilizovan sa natrijum azidom sastav: limunska kiselina, ~0,056 M; natrijum azid, ~0,05%; natrijum hlorid, ~0,044 M; natrijum hidroksid, ~0,068 M.

40 kDa metoksi poli(etilenglikol) maleimido propionamid (linearni 40k mPEG maleimid); CAS No 724722-89-8; od Dr. Reddys Inc., Lot No.233101301; težinski prosek molekulska težina, Mw (GPC) 40500 Da; polidisperzitet (GPC) 1,08.

Početna jedinjenja

Primer 1A

Alil-N-(tert-butoksikarbonil)-O-[(4-nitrofenoksi)karbonil]-L-tirozinat

36,7 g (114,3 mmol) N-Boc-L-tirozin alil estra, 23,0 g (114,3 mmol) 4-nitrofenil hloroformata, 17,5 ml (125,7 mmol) trietilamina i 1,40 g (11,4 mmol) 4-dimetilamino piridina se kombinuju u 1000 ml dihlorometana i mešaju pri sobnoj temperaturi tokom 2 h. Reakciona smeša se ekstraktuje sa približ.500 ml vode i sa približ.250 ml rastvora soli i osuši preko približ.100 g natrijum sulfata. Rastvarač se ukloni rotacionim evaporisanjem (približ. 40°C, približ.200 mbar, približ.30 min.) i produkt se rastvori u toplom dietil etru, te kristalizuje preko noći pri 4°C. Kristali se profiltruju, isperu sa hladnim dietil etrom i osuše u visokom vakuumu (približ.0,1 mbar, 18 h). Prinos je 29,86 g, (59,6 mmol, 52% od teorijskog) željenog produkta.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,23 min., m/z = 487 (M+H)+

Primer 2A

(2S)-4-{[(4-{(2S)-3-(aliloksi)-2-[(tert-butoksikarbonil)amino]-3-oksopropil}fenoksi)karbonil]-amino}-2-[(tert-butoksikarbonil)amino]buterna kiselina

4,0 g (8,22 mmol) jedinjenja iz primera 1A se rastvori u 60 ml dihlorometana. Dodaju se 1,795 (8,22 mmol) (2S)-4-amino-2-[(tert-butoksikarbonil)amino]buterne kiseline i 1,43 ml (8,22 mmol) N,N-diizopropiletilamina. Reakciona smeša se podeli u 3 porcije. Porcije se greju tokom 30 min u zatvorenoj epruveti pri 75°C u sintetizatoru mikrotalasa. Iz kombinovane reakcione smeše rastvarač se ukloni rotacionim evaporisanjem (približ.40°C, približ. 200 mbar, približ.30 min). Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ.600 ml silika gela. Korišćeni rastvarači su dihlorometan/etil acetat 4/1, dihlorometan/etil acetat 1/1, dihlorometan/metanol 4/1 i dihlorometan/ metanol 1/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 4,02 g (6,54 mmol, 80% od teorijskog) željenog produkta.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,07 min., m/z = 564 (M-H)-

Primer 3A

Alil O-({(3S)-4-{[(2R)-1-amino-1-okso-3-(tricilsulfanil)propan-2-il]amino}-3-[(tertbutoksi-karbonil)amino]-4-oksobutil}karbamoil)-N-(tert-butoksikarbonil)-L-tirozinat

2,50 g (4,42 mmol) jedinjenja iz primera 2A se rastvori u 100 ml dihlorometana. Dodaju se 1,602 g (4,42 mmol) S-tricil-L-cisteinamida, 0,77 ml (4,42 mmol) N,N-diizopropiletilamina i 1,68 g (4,42 mmol) HATU. Reakciona smeša se podeli u 5 porcija. Porcije se greju tokom 30 min u zatvorenoj epruveti pri 60°C u sintetizatoru mikrotalasa. Iz kombinovane reakcione smeše rastvarač se ukloni rotacionim evaporisanjem (približ.40°C, približ.200 mbar, približ.

30 min.). Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ.600 ml silika gela. Korišćeni rastvarači su dihlorometan/etil acetat 2/1, dihlorometan/etil acetat 1/1, dihlorometan/metanol 20/1 i dihlorometan/metanol 10/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 4,12 g (3,30 mmol, 75% od teorijskog, 73% čistoće) željenog produkta.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,36 min., m/z = 911 (M+H)+

Primer 4A

O-({(3S)-4-{[(2R)-1-amino-1-okso-3-(tricilsulfanil)propan-2-il]amino}-3-[(tertbutoksikarbonil)-amino]-4-oksobutil}karbamoil)-N-(tert-butoksikarbonil)-L-tirozin

4,14 g (4,55 mmol) jedinjenja iz primera 3A se rastvori u 90 ml tetrahidrofurana. Dodaju se 3,17 ml (22,8 mmol) trietilamina, 0,86 ml (22,8 mmol) mravlje kiseline i 0,526 g (0,455 mmol) tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma(0). Reakciona smeša se meša preko noći pri sobnoj temperaturi. Reakcija se razblaži sa približ.100 ml vode i dvaput ekstraktuje sa približ.100 ml dihlorometana. Kombinovane organske faze se ekstraktuju sa rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ.500 ml silika gela. Korišćeni rastvarači su dihlorometan, dihlorometan/metanol 20/1 i dihlorometan/metanol 1/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 2,62 g sirovog produkta 94,5% čistoće. Produkt se nadalje prečisti preparativnom RP-HPLC na C18 sa voda/metanol gradijentom da se dobije 2,35 g (2,70 mmol, 59% od teorijskog) čistog produkta.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,22 min., m/z = 871 (M+H)+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 7.92 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.28-7.35 (m, 12H), 7.25-7.28 (t, 3H), 7.15-7.20 (m, 4H), 6.95 (d, 2H), 4.29 (q, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.11 (m, 3H), 2.90 (m, 1H), 2.36 (m, 2H), 1.84 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 1.34 (d, 18H).

Primer 5A

tert-butil-metil(2-oksotetrahidrofuran-3-il)karbamat

Jedinjenje se sintetizuje prema Alberico, Dino; Paquin, Jean-Francois; Lautens, Mark;

Tetrahedron, 2005, vol.61, str. 6283 - 6297.

5,18 g (25,7 mmol) tert-butil(tetrahidro-2-okso-3-furanil)karbamata, 4,81 ml (77,2 mmol) jodometana se rastvore u 100 ml suvog dimetil fomamida. Rastvor se ohladi na 0°C i doda se 1,34 g (60% u mineralnom ulju, 33,5 mmol) natrijum hidrida. Reakcija se zagreje na sobnu temperaturu i meša preko noći. Reakciona smeša doda se u približ.400 ml vode i smeša se ekstraktuje tri puta sa približ.300 ml etil acetata. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 8,70 g (25,7 mmol, 100% od teorijskog, 63% čistoće) željenog produkta.

Analitički podaci su u skladu sa literaturom. Produkt se koristi u sledećem koraku sintetizovanja bez daljnjeg prečišćavanja.

Primer 6A

2-[(tert-butoksikarbonil)(metil)amino]-4-(1,3-diokso-1,3-dihidro-2H-izoindol-2-il)buterna kiselina

8,70 g (približ.25 mmol, približ.63% čistoće) jedinjenja iz primera 5A se rastvori u 560 ml dimetil formamida. Dodaju se 8,23 g (44,4 mmol) kalijum o-ftalimida i reakciona smeša se greje na 150°C tokom 7 h. Približ.400 ml rastvarača se ukloni rotacionim evaporisanjem (približ. 60°C, približ.10 mbar, približ.30 min.). Reakciona smeša se izlije na smešu približ.

100 ml vode, 200 g leda i 15 ml sirćetne kiseline. Nakon topljenja preostalog leda, reakciona smeša se profiltruje i filtrat se ekstraktuje 3 puta sa približ.100 ml dihlorometana.

Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ. 70 ml silika gela. Korišćeni rastvarači su dihlorometan/etil acetat 9/1 do dihlorometan/etil acetat 6/4. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 2,39 g (6,04 mmol, 24% od teorijskog) produkta.

LC-MS (postupak 1): Rt= 0,92 min., m/z = 363 (M+H)+

Primer 7A

4-amino-2-[(tert-butoksikarbonil)(metil)amino]buterna kiselina

11,8 g (32,6 mmol) jedinjenja iz primera 6A se rastvori u približ.640 ml etanola i doda se 23,8 ml (488 mmol) hidrazin hidrata u reakcionu smešu. Nakon mešanja preko noći, reakciona smeša se profiltruje i filtrat se koncentriše do suva pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt se rastvori u etanolu i doda se približ.50 g silika gela, rastvarač se ukloni pod smanjenim pritiskom. Nastala čvrsta supstanca doda se na približ.500 g kolone silika gela i hromatografiše. Korišćeni rastvarači su dihlorometan/metanol 9/1 do dihlorometan/metanol 1/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 2,98 g (12,8 mmol, 39% od teorijskog) produkta.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,21 min., m/z = 233 (M+H)+

DCI MS (postupak 5): m/z = 233 (M+H)<+>

Primer 8A

4-{[(4-{(2S)-3-(aliloksi)-2-[(tert-butoksikarbonil)amino]-3-oksopropil}fenoksi)karbonil]-amino}-2-[(tert-butoksikarbonil)(metil)amino]buterna kiselina

0,931 g (1,92 mmol) jedinjenja iz primera 1A se rastvori u 30 ml dihlorometana. Doda se 0,455 g (1,92 mmol) jedinjenja iz primera 7A. Reakciona smeša se podeli u 2 porcije. Porcije se greju tokom 30 min u zatvorenoj epruveti pri 80°C u sintetizatoru mikrotalasa. Iz kombinovane reakcione smeše rastvarač se ukloni pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt se prečisti preparativnom RP-HPLC na C18 koloni sa voda metanol gradijentom od 9/1 do 1/9. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 0,523 g (0,85 mmol, 44% od teorijskog) željenog produkta kao smešu 2 dijastereomera.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,08 i 1,11 min., m/z = 578 (M-H)-

Primer 9A

Alil O-[(4-{[(2R)-1-amino-1-okso-3-(tricilsulfanil)propan-2-il]amino}-3-[(tertbutoksikarbonil)-(metil)amino]-4-oksobutil)karbamoil]-N-(tert-butoksikarbonil)-L-tirozinat

2,24 g (3,86 mmol) jedinjenja iz primera 8A se rastvori u 100 ml dihlorometana. Dodaju se 1,401 g (3,86 mmol) S-tricil-L-cisteinamida, 0,67 ml (3,86 mmol) N,N-diizopropiletilamina i 1,47 g (3,86 mmol) HATU. Reakciona smeša se podeli u 5 porcija. Porcije se greju tokom 30 min u zatvorenoj epruveti pri 60°C u sintetizatoru mikrotalasa. Iz kombinovane reakcione smeše rastvarač se ukloni rotacionim evaporisanjem (približ.40°C, približ.200 mbar, približ.

30 min.). Sirovi produkt se prečisti preparativnom RP-HPLC na C18 koloni sa voda metanol gradijentom od 9/1 do 1/9. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 3,26 g (2,75 mmol, 71% od teorijskog, 78% čistoće) željenog produkta kao smešu dijastereomera.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,41 i 1,43 min., m/z = 924 (M+H)+

Primer 10A

O-[(4-{[(2R)-1-amino-1-okso-3-(tricilsulfanil)propan-2-il]amino}-3-[(tertbutoksikarbonil)-(metil)amino]-4-oksobutil)karbamoil]-N-(tert-butoksikarbonil)-L-tirozin

2,2 g (2,38 mmol) jedinjenja iz primera 9A se rastvori u 48 ml tetrahidrofurana. Dodaju se 1,66 ml (11,9 mmol) trietilamina, 0,45 ml (11,9 mmol) mravlje kiseline i 0,275 g (0,238 mmol) tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma(0). Reakciona smeša se meša preko noći pri sobnoj temperaturi. Reakcija se razblaži sa približ.50 ml vode i dvaput ekstraktuje sa približ.50 ml dihlorometana. Kombinovane organske faze se ekstraktuju sa rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ.100 g silika gela. Korišćeni rastvarači su dihlorometan, dihlorometan/metanol 50/1 i dihlorometan/metanol 4/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 1,44 g (1,61 mmol, 68% od teorijskog) produkta kao smešu dijastereomera.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,20 i 1,24 min., m/z = 884 (M+H)+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 8.00 (m, 1H), 7.65-7.90 (m, 4H), 7.18-7.35 (m, 18H), 7.10 (m, 2H), 6.96 (m, 4H), 4.60 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.05 (m, 2H), 3.00 (m, 4H), 2.75 (m, 6H), 2.36 (m, 3H), 2.00 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.40 (m, 3H), 1.35 (s, 18H).

Primer 11A

N<5>-[(4-{(2S)-3-(aliloksi)-2-[(tert-butoksikarbonil)amino]-3-oksopropil}fenoksi)karbonil]-N<2>-(tert-butoksikarbonil)-L-ornitin

6,00 g (12,33 mmol) jedinjenja iz primera 1A se rastvori u 120 ml dihlorometana. Doda se 2,57 g (12,33 mmol) N<2>-(tert-butoksikarbonil)-L-ornitina. Reakciona smeša se podeli u 6 porcija. Porcije se greju tokom 90 min u zatvorenoj epruveti pri 75°C u sintetizatoru mikrotalasa. Kombinovana reakciona smeša se ekstraktuje sa približ.100 ml zasićenog rastvora amonijum hlorida. Vodena faza se dvaput povratno ekstraktuje sa približ.30 ml dihlorometana svaki put. Kombinovane organske faze se ekstraktuju sa približ.50 ml rastvora soli i osuše preko natrijum sulfata. Rastvarač se ukloni pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ.600 ml silika gela.

Korišćeni rastvarači su dihlorometan, dihlorometan/metanol 40/1 do dihlorometan/metanol 1/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 2,63 g (4,06 mmol, 33% od teorijskog, 89% čistoće) željenog produkta. LC-MS (postupak 1): Rt= 1,03 min., m/z = 578 (M-H)-

Primer 12A

N<5>-[(4-{(2S)-3-(aliloksi)-2-[(tert-butoksikarbonil)amino]-3-oksopropil}fenoksi)karbonil]-N<2>-(tert-butoksikarbonil)-L-ornitil-S-tricil-L-cisteinamid

1,20 g (2,07 mmol) jedinjenja iz primera 11A se rastvori u 48 ml dihlorometana. Dodaju se 0,750 g (2,07 mmol) S-tricil-L-cisteinamida, 0,36 ml (2,07 mmol) N,N-diizopropiletilamina i 0,787 g (2,07 mmol) HATU. Reakciona smeša se podeli u 3 porcije. Porcije se greju tokom 30 min u zatvorenoj epruveti pri 60°C u sintetizatoru mikrotalasa. Iz kombinovane reakcione smeše rastvarač se ukloni rotacionim evaporisanjem (približ.40°C, približ.200 mbar, približ.

30 min.). Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ.400 ml silika gela. Korišćeni rastvarači su dihlorometan/etil acetat 2/1, dihlorometan/etil acetat 1/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 1,30 g (1,5 mmol, 56% od teorijskog, 82% čistoće) željenog produkta.

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,35 min., m/z = 924 (M+H)+

Primer 13A

N<2>-(tert-butoksikarbonil)-N<2>-[(4-{(2S)-2-[(tert-butoksikarbonil)amino]-2-karboksietil}fenoksi)-karbonil]-L-ornitil-S-tricil-L-cisteinamid

3,06 g (2,33 mmol) jedinjenja iz primera 12A se rastvori u 46 ml tetrahidrofurana. Dodaju se 1,63 ml (11,6 mmol) trietilamina, 0,44 ml (11,6 mmol) mravlje kiseline i 0,265 g (0,233 mmol) tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma(0). Reakciona smeša se meša preko noći pri sobnoj temperaturi. Reakcija se razblaži sa približ.50 ml vode i dvaput ekstraktuje sa približ.50 ml dihlorometana. Kombinovane organske faze se ekstraktuju sa rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt se rastvori u dihlorometanu i hromatografiše preko približ.500 ml silika gela. Korišćeni rastvarači su dihlorometan, dihlorometan/metanol 40/1 i dihlorometan/metanol 1/1. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i koncentrišu do suva pod smanjenim pritiskom. Ovo daje 1,40 g sirovog produkta 86% čistoće. Produkt se nadalje prečisti preparativnom RP-HPLC na C18 koloni sa voda/metanol gradijentom da se dobiju 2 frakcije: 0,93 g produkta (45% od teorijskog).

LC-MS (postupak 1): Rt= 1,18 min., m/z = 885 (M+H)+

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 7.89 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.25-7.35 (m, 12H), 7.20-7.25 (m, 6H), 7.10-7.20 (m, 3H), 6.95 (d, 2H), 4.29 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.11 (d, 1H), 3.00 (m, 4H), 2.75 (m, 2H), 2.36 (m, 3H), 1.64 (m, 1H), 1.51 (m, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.32 (s, 9H).

Primer 14A

ADM (2-52) vezan na amidnu smolu baziranu na Tentagelu

[0141]

Peptid se sastavi u koracima na Tentagel baziranoj amidnoj smoli u automatizovanom sintetizatoru peptida (Protein Technologies Inc. Symphony). 8 poli-propilenskih reakcionih sudova se koristi paralelno izvodeći identičnu hemiju. Svaki sud se napuni sa 0,05 mmol na Tentagelu bazirane Rink smole za ukupnu veličinu šarže 0,4 mmol.

Svaka aminokiselina se doda u 8-rostrukom molarnom višku u odnosu na punjenje smole. Aminokiseline su zaštićene sa Fmoc kao N-terminalnom zaštitnom grupom i zaštitne grupe navedene ispod se koriste za funkcionalne grupe bočnog lanca. Također se dodaju 188 mg (0,59 mmol, 7,8 ekv.) TBTU i 0,21 ml (1,2 mmol, 16 ekv.) DIEA. Reakcije se izvode u DMF kao rastvaraču, dok se DMF koristi u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje. Reakciono vreme po aminokiselini je približ.1 čas. Cepanje Fmoc zaštitnih grupa se postigne koristeći 20% piperidin/DMF, dok se 20% piperidin/DMF koristi u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje.

Sekvenca sprezanja je kako sledi:

1. Tyr(tBu) (Tyr = Y = AA 52 humanog ADM)

2. Gly (Gly = G = AA 51 humanog ADM)

3. Gln(Trt) (Gin = Q = AA 50 humanog ADM) 4. Pro (Pro = P = AA 49 humanog ADM)

5. Ser(tBu) (Ser = S = AA 48 humanog ADM) 6. He (lie = I = A A 47 humanog ADM)

7. Lys(Boc) (Lys = K = AA 46 humanog ADM) 8. Ser(tBu) (Ser = S = AA 45 humanog ADM) 9. Arg(pbf) (Arg = R = AA 44 humanog ADM) 10. Pro (Pro = P = AA 43 humanog ADM)

11. Ala (Ala = A = AA 42 humanog ADM)

12. Val (Val = V = AA 41 humanog ADM)

13. Asn(Trt) (Asn = N = AA 40 humanog ADM) 14. Asp(OtBu) (Asp = D = AA 39 humanog ADM) 15. Lys(Boc) (Lys = K = AA 38 humanog ADM) 16. Asp(OtBu) (Asp = D = AA 37 humanog ADM) 17. Lys(Boc) (Lys = K = AA 36 humanog ADM) 18. Asp(OtBu) (Asp = D = AA 35 humanog ADM) 19. Thr(tBu) (Thr = T = AA 34 humanog ADM) 20. Phe (Phe = F = AA 33 humanog ADM)

21. Gln(Trt) (Gin = Q = AA 32 humanog ADM) 22. Tyr(tBu) (Tyr = Y = AA 31 humanog ADM) 23. He (He = I = AA 30 humanog ADM)

24. Gln(Trt) (Gin = Q = AA 29 humanog ADM) 25. His(Trt) (His = H = AA 28 humanog ADM) 26. Ala (Ala = A = AA 27 humanog ADM)

27. Leu (Leu = L = AA 26 humanog ADM)

28. Lys(Boc) (Lys = K = AA 25 humanog ADM) 29. Gln(Trt) (Gin = Q = AA 24 humanog ADM) 30. Val (Val = V = AA 23 humanog ADM)

31. Thr(tBu) (Thr = T = AA 22 humanog ADM) 32. Cys(Trt) (Cys = C = AA 21 humanog ADM) 33. Thr(tBu) (Thr = T = AA 20 humanog ADM) 34. Gly (Gly = G = AA 19 humanog ADM)

35. Phe (Phe = F = AA 18 humanog ADM) 36. Arg(pbf) (Arg = R = AA 17 humanog ADM)

37. Cys(Acm) (Cys = C = AA 16 humanog ADM)

38. Gly (Gly = G = AA 15 humanog ADM)

39. Phe (Phe = F = AA 14 humanog ADM)

40. Ser(tBu) (Ser = S = AA 13 humanog ADM)

41. Arg(pbf) (Arg = R = AA 12 humanog ADM)

42. Leu (Leu = L = AA 11 humanog ADM)

43. Gly (Gly = G = AA 10 humanog ADM)

44. Gln(Trt) (Gln = Q = AA 9 humanog ADM)

45. Phe (Phe = F = AA 8 humanog ADM)

46. Asn(Trt) (Asn = N = AA 7 humanog ADM)

47. Asn(Trt) (Asn = N = AA 6 humanog ADM)

48. Met (Met = M = AA 5 humanog ADM)

49. Ser(tBu) (Ser = S = AA 4 humanog ADM)

50. Gln(Trt) (Gln = Q = AA 3 humanog ADM)

51. Arg(pbf) (Arg = R = AA 2 humanog ADM)

Oksidovanje na smoli se postigne koristeći Cys(Trt) i Cys(Acm) zaštitu sa istovremenim cepanjem zaštitnih grupa i oksidovanjem u disulfidnu vezu koristeći jod (8 ekvivalenata joda plus 8 ekvivalenata DIEA sa reakcionim vremenom od 30 minuta). Oksidovanje se potvrdi cepanjem uzorka, te analizovanjem koristeći HPLC i MALDI-MS.

8 šarži se sakupi za daljnje korišćenje.

Primer 15A

O-{[(3S)-3-amino-4-{[(2R)-1-amino-1-okso-3-sulfanilpropan-2-il]amino}-4-oksobutil]-karbamoil}-L-tirozil-adrenomedulin(2-52)

U 0,075 mmol jedinjenja primera 14A dodaju se 520 mg (0,6 mmol, 8 ekv.) jedinjenja primera 4A. Također se dodaju 188 mg (0,59 mmol, 7,8 ekv.) TBTU i 0,21 ml (1,2 mmol, 16 ekv.) DIEA. Reakcija se izvodi sa DMF kao rastvaračem, dok se DMF koristi u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje. Reakciono vreme je približ.1 čas pri sobnoj temperaturi. Peptid se odcepi sa smole uz istovremeno opšte uklanjanje zaštite koristeći koncentrovanu TFA u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje, dok TFA sadrži hvatače (1- 5% svakog od vode, fenola, tioanisola i 1,2-etandiola), sa reakcionim vremenom od 2 1⁄2 h. Sirovi produkt se liofilizuje i prečisti RP-hromatografijom koristeći 0,1% TFA u vodi i 0,1% TFA u acetonitrilu kao mobilne faze da se obezbedi da pH ostane ispod 4 čitavo vreme tokom procesa prečišćavanja i liofilizovanja. Sve frakcije koje sadrže ispravan jon po MALDI-MS analizovanju se sakupe. Prinos je 44,0 mg parcijalno prečišćenog peptida (približ.0,0035 mmol, približ.4,7% od teorijskog; procenjena čistoća: približ. 50%, glavna nečistoća: ADM (2-52)).

MALDI MS (postupak 6): m/z = 6275(M+H)<+>i 5866 (nečistoća: (ADM(2-52)+H)<+>)

Primer 16A

O-{[4-{[(2R)-1-amino-1-okso-3-sulfanilpropan-2-il]amino}-3-(metilamino)-4-oksobutil]-karbamoil}-L-tirozil-adrenomedulin(2-52)

U 0,075 mmol jedinjenja primera 14A dodaju se 530 mg (0,6 mmol, 8 ekv.) jedinjenja primera 10A. Također se dodaju 188 mg (0,59 mmol, 7,8 ekv.) TBTU i 0,21 ml (1,2 mmol, 16 ekv.) DIEA. Reakcija se izvodi sa DMF kao rastvaračom, dok se DMF koristi u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje. Reakciono vreme je približ.1 čas pri sobnoj temperaturi. Peptid se odcepi sa smole uz istovremeno opšte uklanjanje zaštite koristeći koncentrovanu TFA u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje, dok TFA sadrži hvatače (1- 5% svakog od vode, fenola, tioanisola i 1,2-etandiola), sa reakcionim vremenom od 2 1⁄2 hrs. Sirovi produkt se liofilizuje i prečisti RP-hromatografijom koristeći 0,1% TFA u vodi i 0,1% TFA u acetonitrilu kao mobilne faze da se obezbedi da pH ostane ispod 4 čitavo vreme tokom procesa prečišćavanja i liofilizovanja. Sve frakcije koje sadrže ispravan jon po MALDI-MS analizovanju se sakupe. Prinos je 34,0 mg parcijalno prečišćenog peptida (približ.0,0026 mmol, približ.3,5% od teorijskog; procenjena čistoća: približ. 50%, glavna nečistoća: ADM (2-52)).

MALDI MS (postupak 6): m/z = 6289(M+H)<+>i 5866 (nečistoća: (ADM(2-52)+H)<+>)

Primer 17A

O-{[(4R)-4-amino-5-{[(2R)-1-amino-1-okso-3-sulfanilpropan-2-il]amino}-5-oksopentil]-karbamoil}-L-tirozil-adrenomedulin(2-52)

U 0,075 mmol jedinjenja primera 14A dodaju se 530 mg (0,6 mmol, 8 ekv.) jedinjenja primera 13A. Također se dodaju 188 mg (0,59 mmol, 7,8 ekv.) TBTU i 0,21 ml (1,2 mmol, 16 ekv.) DIEA. Reakcija se izvodi sa DMF kao rastvaračem, dok se DMF koristi u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje. Reakciono vreme je približ.1 čas pri sobnoj temperaturi. Peptid se odcepi sa smole uz istovremeno opšte uklanjanje zaštite koristeći koncentrovanu TFA u količini dovoljnoj da nabubri smolu i slobodno ju agituje, dok TFA sadrži hvatače (1- 5% svakog od vode, fenola, tioanisola i 1,2-etandiola), sa reakcionim vremenom od 2 1⁄2 hrs. Sirovi produkt se liofilizuje i prečisti RP-hromatografijom koristeći 0,1% TFA u vodi i 0,1% TFA u acetonitrilu kao mobilne faze da se obezbedi da pH ostane ispod 4 čitavo vreme tokom procesa prečišćavanja i liofilizovanja. Sve frakcije koje sadrže ispravan jon po MALDI-MS analizovanju se sakupe. Prinos je 47 mg parcijalno prečišćenog peptida (približ.0,0037 mmol, približ.5,0% od teorijskog; procenjena čistoća: približ.50%, glavna nečistoća: ADM (2-52)).

MALDI MS (postupak 6): m/z = 6289(M+H)<+>i 5866 (nečistoća: (ADM(2-52)+H)<+>) Radni primeri

Primer 1

O-{[(3S)-3-amino-4-({(2R)-1-amino-3-[(2,5-diokso-1-{3-okso-3-[(2-{ω-metoksi-polioksietilen[40kDa]}etil)amino]propil}pirolidin-3-il)sulfanil]-1-oksopropan-2-il}amino)-4-oksobutil]karbamoil}-L-tirozil-adrenomedulin(2-52)

44 mg sirovog peptida iz primera 15A mešaju se sa 426 mg (10,5 µmol, 1,5 ekv., nabavljeno od Dr. Reddys) 40 kDa metoksi poli(etilen glikol) maleimido propionamida u 9 ml citratnog pufera od pH 4 preko noći pri sobnoj temperaturi. Sirova reakciona smeša se injektira u dve porcije u sistem za preparativnu HPLC sa Fenomenex Luna 10µ Proteo C5100A AXIA 250 mm x 21,2 mm kolonom i hromatografiše sa voda/acetonitril (oba sa 0,1% TFA) gradijentom. Frakcije se sakupe u epruvete od 20 ml na automatskom kolektoru frakcija. Da se obezbedi dovoljna kiselost, svaka vijala se napuni sa 0,5 ml sirćetne kiseline pre sakupljanja.

ADM(2-52), koji je sporedni produkt iz primera 15A i koji nije prošao kroz PEGilovanje u ovoj reakciji, kao i nereagovani PEG se potpuno uklone.

Sve frakcije koje sadrže primer 1 se kombinuju. Acetonitril se parcijalno ukloni na rotacionom evaporatoru pri temperaturi vodene kupelji od 30°C i približ.50 mbar tokom približ. 30 min.

Nakon dodavanja 0,5 ml sirćetne kiseline, preostali rastvor se liofilizuje. Ukupni prinos primera 1 je 109 mg (2,35 µmol, 33% od teorijskog).

HPLC (postupak 3): Rt= 4,23 – 4,30 min

Primer 2

O-{[(3-N-metil-amino-4-({(2R)-1-amino-3-[(2,5-diokso-1-{3-okso-3-[(2-{ω-metoksi-polioksietilen[40kDa]}etil)amino]propil}pirolidin-3-il)sulfanil]-1-oksopropan-2-il}amino)-4-oksobutil]karbamoil}-L-tirozil-adrenomedulin(2-52)

15 mg sirovog peptida iz primera 16A mešaju se sa 145 mg (3,58 µmol, 1,5 ekv., nabavljeno od Dr. Reddys) 40 kDa metoksi poli(etilen glikol) maleimido propionamida u 5 ml citratnog pufera sa pH 4 preko noći pri sobnoj temperaturi. Sirova reakciona smeša se injektira u sistem za preparativnu HPLC sa Fenomenex Jupiter 10µ C18300A 250 mm x 21,2 mm kolonom i hromatografiše sa voda/acetonitril (oba sa 0,1% TFA) gradijentom. Frakcije se sakupe u epruvete od 20 ml na automatskom kolektoru frakcija. Da se obezbedi dovoljna kiselost, svaka vijala se napuni sa 0,5 ml sirćetne kiseline pre sakupljanja.

ADM(2-52), koji je sporedni produkt iz primera 16A i koji nije prošao kroz PEGilovanje u ovoj reakciji, kao i nereagovani PEG se potpuno uklone.

Sve frakcije koje sadrže primer 2 se kombinuju. Acetonitril se parcijalno ukloni na rotacionom evaporatoru pri temperaturi vodene kupelji od 30°C i približ.50 mbar tokom približ. 30 min.

Nakon dodavanja 0,5 ml sirćetne kiseline, preostali rastvor se liofilizuje. Ukupni prinos primera 2 je 50 mg (1,08 µmol, 43% od teorijskog).

HPLC (postupak 4): Rt= 2,02 – 2,08 min

Primer 3

O-{[(4S)-4-amino-5-({(2R)-1-amino-3-[(2,5-diokso-1-{3-okso-3-[(2-{ω-metoksi-polioksietilen[40kDa]}etil)amino]propil}pirolidin-3-il)sulfanil]-1-oksopropan-2-il}amino)-5-oksopentil]karbamoil}-L-tirozil-adrenomedulin(2-52)

15 mg sirovog peptida iz primera 17A mešaju se sa 145 mg (3,58 µmol, 1,5 ekv., nabavljeno od Dr. Reddys) 40 kDa metoksi poli(etilen glikol) maleimido propionamida u 5 ml citratnog pufera sa pH 4 preko noći pri sobnoj temperaturi. Sirova reakciona smeša se injektira u sistem za preparativnu HPLC sa Fenomenex Jupiter 10µ Proteo 90A AXIA 250 mm x 21,2 mm kolonom i hromatografiše sa voda/acetonitril (oba sa 0,1% TFA) gradijentom. Frakcije se sakupe u epruvete od 20 ml na automatskom kolektoru frakcija. Da se obezbedi dovoljna kiselost, svaka vijala se napuni sa 0,5 ml sirćetne kiseline pre sakupljanja.

ADM(2-52), koji je sporedni produkt iz primera 17A i koji nije prošao kroz PEGilovanje u ovoj reakciji, kao i nereagovani PEG se potpuno uklone.

Sve frakcije koje sadrže primer 3 se kombinuju. Acetonitril se parcijalno ukloni na rotacionom evaporatoru pri temperaturi vodene kupelji od 30°C i približ.50 mbar tokom približ. 30 min.

Nakon dodavanja 0,5 ml sirćetne kiseline, preostali rastvor se liofilizuje. Ukupni prinos primera 3 je 19,5 mg (0,42 µmol, 17% od teorijskog).

HPLC (postupak 4): Rt= 2,02 – 2,08 min

B. Procena farmakološke aktivnosti

Podesnost jedinjenja prema pronalasku za lečenje oboljenja može da se demostruje koristeći sledeće sisteme eseja:

1) Opisi testova (in vitro)

1a) Testovi na reporter ćeliji sa rekombinantnim adrenomedulin receptorom Aktivnost jedinjenja prema pronalasku se kvantifikuje uz pomoć rekombinantne ćelijske linije ovarija kineskog hrčka (CHO) koja nosi humani adrenomedulin-receptor. Aktivacija receptora sa ligandima može da se meri luminescencijom ekvorina. Konstrukcija ćelijske linije i postupak merenja detaljno su opisani [Wunder F., Rebmann A., Geerts A, i Kalthof B., Mol Pharmacol, 73, 1235-1243 (2008)]. Ukratko: Ćelije se zaseju na neprozirne mikrotitarske ploče sa 384 čašice uz gustinu od 4000 ćelija/čašici i rastu tokom 24 h. Nakon uklanjanja medijuma za kulturu, ćelije se nanesu sa 0,6 µg/ml celenterazina u Tyrode rastvoru bez Ca<2+>(130 mM natrijum hlorid, 5 mM kalijum hlorid, 20 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina), 1 mM magnezijum hlorid, i 4,8 mM natrijum hidrogenkarbonat, pH 7,4) suplementovanog sa 0,2 mM 3-izobutil-1-metilksantina (IBMX) tokom 3 h u inkubatoru za ćelijsku kulturu. Jedinjenja se dodaju u Tyrode rastvoru bez kalcijuma<2+>koji sadrži 0,1% albumina goveđeg seruma tokom 6 min. Neposredno pre dodavanja kalcijuma<2+>do finalne koncentracije od 3 mM započne se merenje luminescencije ekvorina korištenjem podesnog luminometra. Luminescencija se meri tokom 60 s. U tipičnom eksperimentu jedinjenja se testiraju u koncentracionom rasponu od 1 x 10<-13>do 3 x 10<-6>M.

Kako bi se odredilo otpuštanje aktivnog adrenomedulina iz jedinjenja prema pronalasku, jedinjenja se inkubiraju pri različitim koncentracijama tokom različitih vremenskih perioda do 24 h u Tyrode rastvoru suplementovanom sa fetalnim telećim serumom, medijumom za ćelijsku kulturu ili plazmom iz različitih vrsta pri pH 7,4. Sadržina kalcijuma<2+>odnosnih inkubacionih medijuma se puferuje dodavanjem 4 mM EDTA (etilen diamin tetrasirćetna kiselina) pre dodavanja uzoraka reporterskim ćelijama sa adrenomedulin receptorom.

Nakon odgovarajuće prethodne inkubacije, primeri izvođenja aktivišu reportersku ćeliju sa adrenomedulin receptorom snažnije nego pre prethodne inkubacije. Ovo je naznačeno činjenicom da su EC50vrednosti određene faktorom do 10 manjim nakon prethodne inkubacije nego pre i objašnjivo je otpuštanjem aktivnog adrenomedulina iz jedinjenja.

Reprezentativne EC50vrednosti za primere izvođenja pre i nakon inkubacije tokom 24 h u puferu suplementovanom sa 2,5% fetalnog telećeg seruma su dane u sledećoj Tabeli 1: Tabela 1

1b) Eseji transcelularne električne rezistencije u endotelskim ćelijama

Aktivnost jedinjenja prema pronalasku se karakterizuje u in vitro esejima permeabilnosti u humanim umbilikalnim venskim ćelijama (HUVEC, Lonza). Korišćenjem ECIS aparata (ECIS: detekcija električne ćelija-supstrat impedancije; Applied Biophysics Inc; Troy, NY) promene transendotelske električne resistencije (TEER) preko endotelskog monosloja se kontinuirano mere korišćenjem male zlatne elektrode na kojoj su zasejane ćelije. HUVEC se uzgajaju na pločama senzorne elektrode sa 96 čašica (96W1E, Ibidi GmbH, Martinsried) do konfluentnih monoslojeva i hiperpermeabilnost može da se indukuje inflamatornim stimulusima poput trombina, TNF-α, IL-1β, VEGF, histamina i vodonik peroksida za koje je sve pokazano da uzrokuju prekid kontakata endotelskih ćelija i redukovanje TEER. Trombin se koristi pri finalnoj koncentraciji od 0,5 U/ml. Testna jedinjenja se dodaju pre ili nakon dodavanja trombina. U tipičnom eksperimentu jedinjenja se testiraju u koncentracionom rasponu od 1 x 10<-10>do 1 x 10<-6>M.

Primeri izvođenja inhibišu trombinom indukovanu hiperpermeabilnost u ovom testu pri koncentracijama od ≤ 10<-6>M.

1c) In vitro eseji permeabilnosti u endotelskim ćelijama

U drugom in vitro modelu endotelske hiperpermeabilnosti aktivnost jedinjenja prema pronalasku se ispita sa obzirom na modulisanje makromolekulske permeabilnosti. Humane ćelije endotela umbilikalne vene (HUVECS) se uzgoje do konfluencije na fibronektinom prevučenim Transwell<®>filter membranama (ploče sa 24 čašice, 6,5 mm umeci sa 0,4 µM polikarbonatne membrane; Costar #3413) koji razdvajaju gornju od donje komore za ćelijsku kulturu sa endotelskim ćelijama koje rastu na dnu gornje komore. Medijum gornje komore je suplementovan sa 250 µg/ml 40 kDa FITC-dekstrana (Invitrogen, D1844).

Hiperpermeabilnost monosloja je indukovana dodavanjem trombina u finalnoj koncentraciji od 0,5 U/ml. Uzorci medijuma se sakupe iz donje komore svakih 30 min i meri se relativna fluorescencija kao parametar za promene makromolekulske permeabilnosti tokom vremena u podesnom fluorimetru. Dodavanje trombina indukuje gotovo udvostručavanja prelaska FITC-dekstrana preko endotelskih monoslojeva. U tipičnom eksperimentu jedinjenja se testiraju u koncentracionom rasponu od 1 x 10<-10>do 1 x 10<-6>M.

Primeri izvođenja inhibišu trombinom indukovanu hiperpermeabilnost u ovom testu pri koncentracijama od ≤ 10<-6>M.

2. Opisi testa (in vivo)

2a) Merenje krvnog pritiska i brzine srca u telemeterijom praćenih, normotenzivnih Wistar pacova

Kardiovaskularni efekti indukovani jedinjenjima prema pronalasku ispitaju se u slobodno kretajućih svesnih ženki Wistar pacova (telesna težina > 200 g) radiotelemetrijskim merenjem krvnog pritiska i brzine srca. Ukratko, telemetrijski sistem (DSI Data Science International, MN, SAD) je sastavljen od 3 osnovna elementa: implantabilnih odašiljača (TA11PA-C40), prijemnika (RA1010) i na računaru baziranog programa za prikupljanje (Dataquest™ A.R.T. 4.1 za Windows). Pacovi se opreme sa implantatima pritiska za hronično korišćenje barem 14 dana pre eksperimenata. Senzorni kateter se poveže sa 4-0 šavovima nekoliko puta da se dobije stoper 0,5 cm od vrha katetera. Tokom implantacije katetera pacovi se anesteziraju sa pentobarbitalom (Nembutal, Sanofi: 50 mg/kg i.p.). Nakon izbrijavanja abdominalne kože, napravi se abdominalna incizija centralnom linijom i tečnošću ispunjeni senzorni kateter se umetne uzvodno u izloženu silaznu aortu između ilijačne bifurkacije i renalnih arterija. Kateter se zaveže nekoliko puta kod stopera. Vrh telemetrijskog katetera je smešten neposredno kaudalno prema renalnim arterijama i obezbeđen tkivnim lepkom. Telo odašiljača je pričvršćeno na unutarnji peritonealni zid pre zatvaranja abdomena. Koristi se dvoslojno zatvaranje abdominalnog reza, sa individualnim zašivanjem peritoneuma i mišićnog zida nakon čega sledi zatvaranje vanjske kože. Za posthiruršku zaštitu protiv infekcija i bola injektira se jedinstvena doza antibiotika (oksitetraciklin 10% R, 5,0 ml/kg s.c., Beta-Pharma GmbH&Co, Nemačka) i analgetika (Rimadyl R, 5,0 ml/kg s.c., Pfizer, Nemačka). Konfiguracija hardvera je opremljena za 24 životinje. Svaki kavez za pacova smešten je na vrhu individualne platforme prijemnika.

Nakon aktivacije implantiranih odašiljača, on-line sistem za prikupljanje podataka uzorkuje podatke i konvertuje telemetrijske signale o pritisku u mm Hg. Referenca barometrijskog pritiska omogućuje utvrđivanje odnosa apsolutnog pritiska (relativno prema vakuumu) prema ambijentalnom atmosferskom pritisku. Program za prikupljanje podataka je unapred definisan da uzorkuje hemodinamske podatke za intervale od 10 s svakih 5 minuta. Sakupljanje podataka u datoteku se započne 2 časa pre primene testnih jedinjenja i završi nakon okončanja 24-h ciklusa. U tipičnom eksperimentu testna jedinjenja se primenjuju kao bolus bilo supkutano ili intravenozno pri dozama od 1 do 1000 µg/kg telesne težine (u odnosu na peptidnu komponentu).

Adrenomedulin divljeg tipa (Bachem, H-2932) indukuje smanjenje krvnog pritiska u ovom testu sa trajanjem od ≤ 4 h kada se testira pri dozama od ≤ 300 µg/kg telesne težine [Slika 1].

Slika 1: 24 časovni profili prosečnog arterijskog krvnog pritiska (MABP) zabeleženi od telemetrijski praćenih normotenzivnih ženki Wistar pacova nakon supkutane primene ADM ili nosača kako je navedeno (istačkana linija). Podatkovne tačke se iscrtaju kao srednje vrednosti ± SEM uprosečenih 30 min intervala od 4 životinje po grupi. Jedan čas nakon primene životinje tretirane sa ADM pokazuju prosečno smanjenje MABP od gotovo 20% pri vrhuncu (ispunjeni krugovi). Nakon oko 3,5 časa MABP se vrati na osnovne nivoe i bude u rasponu onoga od nosačem tretiranih životinja (otvoreni krugovi).

U ovom testu supstance prema ovom pronalasku indukuju smanjenje krvnog pritiska do 10 h pri dozama od ≤ 500 µg/kg telesne težine (u odnosu na peptidnu komponentu) [Slika 2].

Slika 2: 24 časovni profili prosečnog arterijskog krvnog pritiska (MABP) zabeleženi od telemetrijski praćenih normotenzivnih ženki Wistar pacova nakon supkutane primene primera 1 ili nosača kako je navedeno (istačkana linija). Podatkovne tačke se iscrtaju kao srednje vrednosti ± SEM uprosečenih 30 min intervala od 6 životinja po grupi. Primena primera 1 pri dozi od 150 µg/kg (u odnosu na peptidnu komponentu) smanjuje MABP za oko 15 do 19% do 6 h nakon primene (ispunjeni krugovi). Između 6 h i 14 h nakon primene MABP se postepeno vrate na osnovne vrednosti i konačno su u rasponu onih od nosačem tretiranih životinja.

2b) Esej vaskularnog propuštanja u koži u Wistar pacova

Test intrakutanog izlaganja histaminu se upotrebi da se proceni efekt jedinjenja prema pronalasku na funkciju vaskularne barijere u zdravih životinja. Muški Sprague Dawley pacovi (telesne težine >200 g) se anesteziraju sa izofluranom (2%-3% u ambijentalnom vazduhu) i postave u supinirani položaj. Abdomen se obrije i umetne se kateter u femoralnu venu. Samo nosač (0,5 ml PBS 0,1% albumina goveđeg seruma) ili testna jedinjenja pri odgovarajućim dozama se primenjuju kao i.v. bolus injekcije. Nakon 15 min primeni se druga injekcija od 100 µl/kg 2% rastvora Evans plavog (Sigma) i neposredno nakon toga 100 µl rastvora histamina odgovarajućih koncentracija (na primer 0 – 2,5 - 5 - 10 - 20 - 40 µg/ml) se injektiraju intrakutano u abdominalnu kožu. Evans plavo je boja koja snažno veže proteine plazme i prema tome koristi se kao indikator za ekstravazaciju proteinima bogate tečnosti i vaskularno curenje. 30 min nakon ovog postupka pacovi se žrtvuju prekomernom dozom izoflurana i naknadnom vratnom disklokacijom, te se abdominalna koža ekscizira. Urtike se eksciziraju korišćenjem 8 mm udarnog biopsera, uzorci tkiva se izvažu i prenesu u formamid na 48 h kako bi se ekstrahiralo Evans plavo. Uzorci se mere pri talasnim duljinama od 620 nm i 750 nm na podesnom fotometru, te se sadržina Evans plavog u uzorcima korektuje za hem pigmente prema formuli A620 (korektovano) = A620 - (1,426 X A750 0,030) i izračuna na temelju standardne krive. [postupak prilagođen iz Wang L.F., Patel M., Razavi H.M., Weicker S., Joseph M.G., McCormack D.G., Mehta S., Am. Respir Crit Care Med, 165(12), 1634-9 (2002)].

Supstance prema ovom pronalasku smanjuju ekstravazaciju proteinom bogate tečnosti plazme indukovanu izlaganjem histaminu u ovom testu.

2c) Intratrahealna instilacija LPS u miševa

Intratrahealno izlaganje lipopolisaharidu (LPS) se upotrebi da bi se ispitali efekti jedinjenja prema pronalasku na akutnu ozledu pluća. Muški BALB/c miševi (prosečna težina životinje 20-23 g) se anesteziraju sa izofluranom (7%), te se instiluje LPS od E. coli (npr. serotip 055:B5; Sigma) u 100 µl rastvora soli korišćenjem mikropipete. Tipične doze LPS korišćene za izlaganje su u rasponu od 1 do 10 mg/kg telesne težine. Pri različitim vremenskim tačkama pre i nakon instilacije, testna jedinjenja se primene supkutanim putem. Tipične doze su u rasponu od 1 do 300 µg/kg telesne težine. U ovom testu tipične vremenske tačke primene testnih jedinjenja su 15 min pre ili 1 h nakon izlaganja LPS.48 časova nakon instilacije LPS miševi se duboko anesteziraju sa izofluranom i žrtvuju dislokacijom vrata. Nakon kanulacije traheje, izvede se lavaža bronhoalveolarnog prostora sa 0,5 ml ledeno hladnog rastvora soli. Pluća se pripreme i izvažu. Ćelije u tečnosti bronhoalveolarne lavaže (BALF) se izbroje na brojaču ćelija (Cell Dyn 3700, Abbott). U ovom testu za težinu pluća kao meru za plućni edem je reproducibilno nađeno da je povećana za oko 50% ili više u poređenju sa negativnim kontrolama 48 časova nakon izlaganja LPS. Kako težine pluća pokazuju samo veoma nisku varijabilnost u grupama, kao parametar se koristi apsolutna težina pluća. Za brojeve za bele krvne ćelije se uvek nađe da su značajno povećani u odnosu na kontrolu u BALF nakon izlaganja LPS.

Primena supstanci prema ovom pronalasku rezultuje u značajno smanjenim težini pluća i brojevima belih krvnih ćelija u BALF nakon 48 h kada se primene kao bolus pri dozama ≤ 300 µg/kg telesne težine (u odnosu na peptidnu komponentu).

2d) Indukovanje akutne ozlede pluća u mini svinja

Akutna ozleda pluća se indukuje u anesteziranih mini svinja korišćenjem lipopolisaharida (LPS) ili oleinske kiseline kao agensa za izlaganje. Detaljnije: ženke Göttingen minisvinja ca.

3,5 do 5,5 kg telesne težine (Ellegaard, Danska) drže se anesteziranima kontinuiranom i.v.-infuzijom Ketavet®, Dormicum® i Pancuronium® nakon prethodne medikacije sa intramuskularnom injekcijom Ketavet® / Stresnil®. Nakon intratrahealne intubacije životinje se veštački ventiliraju koristeći pedijatrijski respirator (Sulla 808V; Dräger, Nemačka) sa smešom kiseonik vazduh pri respiracijskoj zapremini od 30 do 50 ml i konstantnom frekvencijom od 25 min<-1>. Arterijski PaCO2se podesi na oko 40 mmHg regulisanjem frakcije udisanog kiseonika (FiO2) razmerom kiseonik vazduh smeše. Rutinski se mere sledeći kardiovaskularni i respiratorni parametri nakon postavljanja neophodnih proba i katetera nameštenih na odgovarajuće pretvarače pritiska i opremu za snimanje: centralni venski pritisak (putem leve jugularne vene), arterijski krvni pritisak i brzina srca (BP i HR; putem leve karotidne arterije), pritisak levog ventrikula (LVP; koristeći Milarov kateter [FMI, Mod.:SPC-340S, REF: 800-2019-1, 4F] uveden u levi ventrikul putem desne karotidne arterije), pulmonarni arterijski pritisak (PAP; koristeći ARROW Bermanov angiografski balonski kateter [REF.: AI-071344 Fr.50cm] postavljen u pulmonarnu arterijom putem leve jugularne vene), kardijačna zapremina (CO) i indeks ekstravaskularne plućne vode (EVWLI) korišćenjem PiCCO sistema (Pulsion, Nemačka) spojenog na Pulsion 4F termodilucioni kateter (PV2014L08N) postavljen u desnu femoralnu arteriju. Kateteri za merenje CVP, BP, HR, LVP, i PAP su povezani na Ponemah sistem za snimanje. Analiza gasa arterijske krvi se izvede da se utvrdi PaO2/FiO2. Prema American-European Consensus Conference on ARDS PaO2/FiO2< 300 mmHg se smatra indikativnim za prisustvo akutne ozlede pluća. Zavisno o primenjenom protokolu, trajanje eksperimenata varira između 4 i 5 časova nakon primene izlaganja koje indukuje ozledu pluća. Na kraju eksperimentiranja svinje se žrtvuju iskrvavljivanjem, te se iz pluća sakupi tečnost bronhoalveolarne lavaže (BALF). Ćelijska sadržina BALF odredi se korišćenjem brojača krvnih ćelija (Cell DYN 3700).

U tipičnom izvođenju, akutna ozleda pluća se indukuje intratrahealnom instilacijom lipopolisaharida (LPS; E.coli 0111:B4; Sigma L2630) u rastvoru soli pri dozi od 5mg/kg telesne težine u svako plućno krilo putem endotrahealne cevi. Kao odgovor na izlaganje, PAP i EVWLI se povećaju dok se PaO2/FiO2smanji ispod 300 mmHg. Ćelijska sadržina BALF se značajno poveća. Primena jedinjenja 1 ovog pronalaska kao i.v.-bolus 15 min pre izlaganju LPS ublažava ili preveniše promene indukovane sa LPS.

U drugom protokolu oleinska kiselina (OA; Sigma-Aldrich, 01008) razblažena sa etanolom (1:1) se infuzira i.v. tokom 15 min pri finalnoj dozi od 100 mg/kg telesne težine. Izlaganje sa OA dovodi do povećanja PAP i EVLWI i smanjenja PaO2/FiO2ispod 300 mmHg. Promene se ublaže ili prevenišu primenom jedinjenja 1 ovog pronalaska 15 min pre početka OA infuzije.

Za doze primera 1 ≤ 30 µg/kg telesne težine (u odnosu na peptidnu komponentu) nađeno je da su aktivne u opisanim testnim sistemima.

C. Primerna izvođenja farmaceutskih kompozicija

Jedinjenja prema pronalasku mogu da se konvertuju u farmaceutske preparate na sledeće načine

i.v. rastvor:

Jedinjenje prema pronalasku se rastvori pri koncentraciji ispod zasićenja rastvorljivosti u fiziološki prihvatljivom rastvaraču (na primer puferi sa pH 4 do pH 7, izotonični rastvor natrijum hlorida, 5% rastvor glukoze i/ili 30% rastvor PEG 400). Rastvor se sterilizuje filtrovanjem i napuni u injekcione spremnike, sterilne i slobodne od pirogena.

s.c. rastvor:

Jedinjenje prema pronalasku se rastvori pri koncentraciji ispod zasićenja rastvorljivosti u fiziološki prihvatljivom rastvaraču (na primer na primer puferi sa pH 4 do pH 7, izotonični rastvor natrijum hlorida, 5% rastvor glukoze i/ili 30% rastvor PEG 400). Rastvor se sterilizuje filtrovanjem i napuni u injekcione spremnike, sterilne i slobodne od pirogena.

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Medikament koji sadrži jedinjenje formule

   gde n predstavlja broj 0, 1, 2 ili 3, R<1>predstavlja vodonik, metil, etil, n-propil ili izopropil, R<2>predstavlja linearni ili razgranati PEG od 20kDa do 80kDa pokriven na kraju sa metoksigrupom, ili jednu od njegovih soli, solvata ili solvata njegovih soli, u kombinaciji sa inertnim netoksičnim farmaceutski pogodnim ekscipijentom, pri čemu je medikament u farmaceutskoj formi za inhalaciju.
2. 2. Medikament prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je jedinjenje formule (I) definisano tako da n predstavlja broj 1 ili 2, R<1>predstavlja vodonik ili metil, R<2>predstavlja linearni PEG 40kDa pokriven na kraju sa metoksi-grupom.
3. 3. Medikament prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 2, naznačen time što je jedinjenje formule (I) definisano tako da n predstavlja broj 1 ili 2, R<1>predstavlja vodonik, R<2>predstavlja linearni PEG 40kDa pokriven na kraju sa metoksi-grupom.
4. 4. Medikament prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3, gde je da je farmaceutski oblik za inhalaciju odabran iz grupe koja se sastoji od inhalatora praha i nebulizera.
5. 5. Medikament prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji su dalje u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom odabranim iz grupe koju čine ACE inhibitori, antagonisti angiotenzin receptora, agonisti beta-2 receptora, inhibitori fosfodiesteraze, agonisti glukokortikoidnog receptora, diuretici, rekombinantni angiotenzin konvertujući enzim-2 i acetilsalicilne kiseline.
6. 6. Medikament prema patentnom zahtevu 5, gde je dalji aktivni sastojak odabran iz grupe koja se sastoji od ACE inhibitora odabranog iz grupe koju čine enalapril, kinapril, kaptopril, lizinopril, ramipril, delapril, fosinopril, perindopril, cilazapril, imidapril, benazepril, moeksipril, spirapril i trandopril, antagonist angiotenzin receptor i odabran je iz grupe koju čine losartan, kandesartan, valsartan, telmisartan i embusartan, agonist beta-2 receptor, odabran iz grupe koju čine salbutamol, pirbuterol, salmeterol, terbutalin, fenoterol, tulobuterola, klenbuterola, reproterola i formoterola, inhibitora fosfodiesteraze (PDE) odabranog iz grupe koju čine milrinon, amrinon, pimobendan, cilostazol, sildenafil, vardenafil i tadalafil, agonist glukokortikoidnog receptora odabran iz grupe koja se sastoji od kortiozola, kortizona, hidrokortizona , prednizon, metil-prednizolon, predniliden, deflazakort, fluokortolon, triamcinolol ne, deksametazon i betametazon, diuretik izabran iz grupe koju čine furosemid, torasemid i hidroklorotiazid, rekombinantni angiotenzin konvertujući enzim-2 i acetilsalicilna kiselina.
7. 7. Medikament prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji kardiovaskularnog, edematoznog i/ili inflamatornog poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od srčane insuficijencije, koronarne bolesti srca, ishemijskog i/ili hemoragičnog moždanog udara, hipertenzije, plućne hipertenzije, periferne arterijske okluzivne bolesti, preeklampsije, hronične opstruktivne bolest pluća, astme, akutnog i/ili hroničnog plućnog edema, alergijskog alveolitisa i/ili pneumonitisa usled udisanja organske prašine i gljivičnih čestica, aktinomicetičkog ili drugog porekla, i/ili akutnog hemijskog bronhitisa, akutnog i/ili hroničnog hemijskog plućnog edema, neurogenskog plućnog edema, akutne i/ili hronične plućne manifestacije zbog zračenja, akutnih i/ili hroničnih intersticijskih poremećaja pluća, akutne povrede pluća / akutnog respiratornog distres sindroma (ALI/ARDS) kod odraslih ili dece, uključujući i novorođenčad, ALI/ARDS sekundarnu pneumoniji i sepsi, aspiracionu pneumoniju i ALI/ARDS sekundarnu aspiraciju, ALI/ARDS sekundarna udisanju gasa, transfuzione akutne povreda pluća (TRALI), ALI/ARDS i/ili akutne plućne insuficijencije nakon operacije, traume i/ili opekotina i/ili povreda pluća izazvane ventilacijom (VILI), povrede pluća posle aspiracija mekonijuma, plućne fibroze, planinske bolesti, glomerulonefritisa, akutne povrede bubrega, kardiorenalnog sindroma, limfedema, inflamatorne bolesti creva, sepse, septičnog šoka, sindroma sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS) neinficijskog porekla, inflamatorne bolest creva i urtikarija, koji obuhvata davanje ljudima ili životinjama aktivne količine medikamenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6.
8. 8. Medikament prema patentnom zahtevu 7, gde je kardiovaskularni, edematozni i/ili inflamatorni poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od plućne hipertenzije, hronične opstruktivne plućne bolesti, astme, akutnog i / ili hroničnog plućnog edema, alergijskog alveolitisa i/ili pneumonitisa udisanje organske prašine i gljivičnih čestica, aktinomicetičkog ili drugog porekla i/ili akutnog hemijskog bronhitisa, akutnog i/ili hroničnog hemijskog plućnog edema, neurogenskog plućnog edema, akutnih i/ili hroničnih plućnih manifestacija zbog zračenja, akutnog i/ili hroničnog intersticijskog poremećaja pluća, akutne povreda pluća / akutnog respiratornog distresnog sindroma (ALI/ARDS) kod odraslih ili dece, uključujući novorođenčad, ALI/ARDS sekundarne pneumonije od sepse, aspiracione pneumonije i ALI/ARDS sekundarne aspiracije, ALI/ARDS sekundarne od dima (TRALI), ALI/ARDS i/ili akutne plućne insuficijencije nakon operacije, traume i/ili opekotina i/ili ventilatorne indukovane povrede pluća (VILI), povrede pluća nakon aspiracije mekonijuma, plućne fibroze, planinske bolesti, koji obuhvata davanje ljudima ili životinjama aktivne količine medikamenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6.
9. 9. Jedinjenje formule (Ia)

   ili jedna od njihovih soli, solvati ili solvati njihovih soli.
10. 10. Jedinjenje formule (II)