RS56645B1 - Jedinjenja tetrahidropirolotiazina - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na nova jedinjenja tetrahidropirolotiazina, na farmaceutske kompozicije uključujući jedinjenja, jedinjenja koja se koriste u postupcima za lečenje fizioloških poremećaja, postupke korisne za sintezu datih jedinjenja.

[0002] Predmetni pronalazak pripada oblasti lečenja Alzheimer-ove bolesti i drugih oboljenja i bolesti uključujući amiloidni β (Abeta) peptid, neurotoksični i visoko agregirajući peptidni segment amiloidnog prekursor proteina (APP). Alzheimer-ova bolest je uništavajuće neurodegenerativno oboljenje koje pogađa milione pacijenata na svetu. Imajući u vidu sadašnje agense koji su odobreni i nalaze se na tržištu, i koji omogućavaju samo privremene, simptomatične koristi po pacijenta, postoji značajna neispunjena potreba za lečenjem Alzheimer-ove bolesti.

[0003] Alzheimer-ova bolest je okarakterisana generisanjem, agregacijom, i taloženjem Abeta u mozgu. Na mišijim modelima pokazano je da potpuna ili delimična inhibicija βsekretaze (enzim razlaganja beta-položaja Alzheimer-ovog amiloidnog prekursorskog proteina; BACE) ima značajni efekat na patologije vezane za plak i patologije zavisne od plaka što sugeriše da čak i male redukcije nivoa Aβ peptida mogu dovesti do dugotrajnog značajnog snižavanja opterećenja plakom i snižavanja deficita u sinapsama, time omogućavajući značajna terapeutska poboljšanja, posebno u tretmanu Alzheimer-ove bolesti.

[0004] U patentu US 2009/0209755 otkrivaju se kondenzovani derivati aminodihidrotiazina koji imaju BACE inhibitorsku aktivnost i dalje se opisuju kao korisna terapeutska sredstva za neurodegenerativna oboljenja prouzrokovana Aβ peptidom, kao što je demencija Alzheimer-ovog tipa. Dodatno, u časopisu J. Neuroscience, 31(46), strane 16507-16516 (2011) opisan je (S)-4-(2,4-difluor-5-pirimidin-5-il-fenil)-4-metil-5,6-dihidro-4H-[1,3]tiazin-2-ilamin, kao oralno primenjeni CNS-aktivni BACE inhibitor.

[0005] Poželjni su vrlo aktivni BACE inhibitori koji poseduju dovoljnu CNS penetraciju radi omogućavanja lečenja Abeta oboljenja koja su posredovana peptididima, kao što je Alzheimer-ova bolest. Predmetni pronalazak opisuje određena nova jedinjenja koja su izraziti (potentni) inhibitori BACE. Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje određena jedinjenja koja penetriraju u CNS.

[0006] Shodno tome, predmetni pronalazak otkriva jedinjenje Formule I:

gde R predstavlja H ili F; a

A predstavlja:

ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so. Takođe je otkriven postupak za lečenje pacijenata od Alzheimer-ove bolesti, uključujući primenu delotvorne količine jedinjenja Formule I pacijentu kome je potrebno takvo lečenje, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Takođe je otkriven i postupak za prevenciju progresije umerenog kognitivnog oštećenja kod ljudi u Alzheimer-ovo oboljenje, uključujući primenu delotvorne količine jedinjenja Formule I pacijentu kome je potrebno takvo lečenje, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Takođe je otkriven i postupak inhibicije BACE kod pacijenata, uključujući primenu delotvorne količine jedinjenja Formule I pacijentu kome je potrebno takvo lečenje, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Takođe je otkriven i postupak za inhibiciju BACE-om posredovanog raskidanja amiloidnog prekursor proteina, uključujući primenu pacijentu, kome je potreban takav tretman, delotvorne količine jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Takođe je otkriven postupak za inhibiciju nastajanja Abeta peptida, uključujući primenu delotvorne količine jedinjenja Formule I pacijentu kome je potrebno takvo lečenje, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0007] Nadalje, predmetni pronalazak omogućava da se jedinjenje Formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koriste u terapiji, posebno u lečenju Alzheimer-ove bolesti ili za prevenciju progresije umerenog kognitivnog oštećenja kod ljudi u Alzheimer-ovo oboljenje. Štaviše, predmetni pronalazak omogućava upotrebu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za lečenje Alzheimer-ove bolesti. Predmetni pronalazak takođe omogućava upotrebu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za prevenciju progresije umerenog kognitivnog oštećenja u Alzheimer-ovo oboljenje. Predmetni pronalazak takođe omogućava upotrebu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za inhibiciju BACE. Predmetni pronalazak nadalje omogućava upotrebu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za inhibiciju produkcije (nastajanja) Abeta peptida.

[0008] Predmetni pronalazak nadalje omogućava farmaceutsku kompoziciju, uključujući jedinjenje Formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača, ili ekscipijenata. U specifičnom otelotvorenju, kompozicija nadalje podrazumeva jedan ili više drugih terapeutskih agenasa. Predmetni pronalazak takođe uključuje nove intermedijere i procese za sintezu jedinjenja Formule I.

[0009] Umereno kognitivno oštećenje definisano je kao potencijalno prodromalna faza demencije povezane sa Alzheimer-ovom bolešću zasnovanom na kliničkim nalazima kao i na progresiji ka Alzheimer-ovoj demenciji tokom vremena kod pacijenata koji iskazuju umereno kognitivno oštećenje. (Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)). Izraz "prevencija progresije umerenog kognitivnog oštećenja ka Alzheimer-ovoj bolesti" uključuje usporavanje, zaustavljanje, ili promenu napredovanja umerenog kognitivnog oštećenja ka Alzheimer-ovom oboljenju kod pacijenata.

[0010] Poželjno jedinjenje je:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je slobodna baza posebno poželjna.

[0011] Kako se ovde koristi, termini "tretirati" ili "lečiti" uključuje zadržavanje, usporavanje, zaustavljanje, ili promenu napredovanja ili ozbiljnosti postojećeg simptoma ili poremećaja.

[0012] Kako se ovde koristi, izraz "pacijent" odnosi se na ljude.

[0013] Izraz "inhibicija produkcije Abeta peptida" podrazumeva se da znači opadanje in vivo nivoa Abeta peptida u pacijentu.

[0014] Kako se ovde koristi, izraz " delotvorna količina" odnosi se na količinu ili dozu jedinjenja predmetnog pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koja, posle jednostruke ili višestruke primene pacijentu, omogućava željeni efekat kod pacijenta sa zadatom dijagnozom ili tretmanom.

[0015] Delotvorna količina može se lako odrediti posetom dijagnostičaru odnosno lekaru, kao nekog obučenog u oblasti, koristeći poznate tehnike i posmatrajući rezultate dobijene pod sličnim okolnostima. Prilikom određivanja efektivnog iznosa za pacijenta, broj faktora uticaja razmatra prisutni dijagnostičar odnosno lekar, uključujući, ali ne ograničavajući se na:

tip pacijenta; uzrast, starost, i opšte zdravlje; uključujući specifično oboljenje ili poremaćaj; stepen ili težinu oboljenja ili poremećaja; odgovor individualnog pacijenta; posebnost jedinjenja koje se primenjuje; način primene; karakteristike bioraspoloživosti primenjenog preparata; izabrani režim doziranja; istovremenu upotrebu lekova; i druge relevantne okolnosti.

[0016] Jedinjenja ovog pronalaska su uglavnom efikasni u širokom rasponu doziranja. Na primer, dnevne doze normalno padaju u opseg od oko 0,01 do oko 20 mg / kg telesne težine. U nekim slučajevima nivo doze ispod donje granice pomenutog opsega može biti više nego adekvatna, dok se u nekim drugim slučajevima i dalje mogu primjenjivati veće doze sa prihvatljivim neželjenim efektima. Jedinjenja predmetnog pronalaska poželjno su formulisana kao farmaceutske kompozicije primenljive bilo kojom rutom koja čini jedinjenje biodstupnom, uključujući oralni i parenteralnu način. Najpoželjnija je oralna primena takvih kompozicija. Takve farmaceutske kompozicije i postupci za njihovu pripremu su dobro poznati u stanju tehnike. (videti npr, Remington: The Science i Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0017] Jedna uobičajena obučenost u oblasti podrazumevaće da jedinjenja predmetnog pronalaska mogu postojati u tautomernim formama, kao što je prikazano u Šemi A. Kada se u ovoj patentnoj prijavi poziva na jedan od pojedinačnih tautomera datog jedinjenja, podrazumeva se da obuhvata obe tautomerne forme i sve njihove smeše.

Šema A

[0018] Jedinjenja sadašnjeg pronalaska, ili njihove soli, mogu biti sintetisana različitim postupcima koji su poznati u oblasti, neki od njih su ilustrovani u Šemama, Dobivanje, i Primeri dole ispod. Specifični sintetički koraci za svaki u okviru svakog opisanog postupka mogu se kombinovati na različite načine, ili zajedno sa koracima iz različitih šema, kako bi se dobila jedinjenja Formule I, ili njihove soli. Proizvodi svakog sintetičkog koraka u donjim šema mogu se izolovati uobičajenim postupcima, uljučujući ekstrakciju, uparavanje, taloženje, hromatografiju, filtrovanje, trituraciju, i kristalizaciju.

[0019] Pojedinačni stereohemijski centri su ostali nespecificirani i određeni supstituenti su eliminisani u šemama koje slede radi jasnosti i ta činjenica nije namenjena ograničavanju instruktivnosti šema na bilo koji način. Nadalje, pojedinačni izomeri, enantiomeri, ili diastereomeri se mogu razdvojiti ili razložiti od strane prosečno obučenog u oblasti u bilo kojoj

pogodnoj fazi sinteze jedinjenja Formule I postupcima kao što su tehnike selektivne kristalizacije ili hromatografija na hiralnoj fazi (videti na primer, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, i Rerastvors", John Wiley i Sons, Inc., 1981, i E.L. Eliel i S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley- Interscience, 1994). Oznake "izomer 1" i "izomer 2" odnose se na jedinjenja koja se eluiraju hromatografijom sa hiralne kolone kao prvo i drugo, odnosno, ako je hiralna hromatografija inicirana u ranoj fayi sinteze, ista oznaka se primenjuje i na primere intermedijera koji slede. Pored toga, intermedijeri opisani šemama koje slede sadrže niz zaštitnih grupa na azotoovom atomu. Promenljiva zaštitna grupa može biti ista ili različita u svakom svom pojavljivanju u zavisnosti od specifičnih reakcionih uslova i određene vrste transformacija koje treba izvršiti. Zaštita i uslovi deprotekcije dobro su poznati obučenom u oblasti i opisane su u literaturi (Videti na primer "Greene’s Protective Groups u Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts i Theodora W. Greene, John Wiley i Sons, Inc.2007).

[0020] Pojedinac prosečno obučen u oblasti će uvažavati što su jedinjenja predmetnog pronalaska sastavljena od jezgra koje sadrži najmanje dva centra hiralnosti:

Šema B

Iako predmetni pronalazak obuhvata sve pojedinačne enantiomere, kao i smeše enantiomera navedenog jedinjenja, uljučujući racemate, jedinjenja sa apsolutnom konfiguracijom atoma ugljenika označenih sa 1 i 2 kao što je ilustrovano u Šemi B predstavljaju poželjna jedinjenja ovog pronalaska.

[0021] Skraćenice koje se ovde koriste definišu se prema Aldrichimica Acta, Vol.17, No.1, 1984. Druge skraćenice su definisane na sledeći način: "APP" odnosi se na amiloidni prekursorski protein; "BOC" se odnosi na terc-butiloksikarbonil; "CSF" se odnosi na cerebrospinalnu tečnost; "DCC" odnosi se na 1,3-dicikloheksilkarbodiimid; "DIC" se odnosi na diizopropilkarbodiimid; "DMEM" se odnosi na Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; "DMSO" odnosi se to dimetil-sulfoksid; "EDCI" odnosi se na 1- (3-dimetilaminopropil)- 3-etilkarbodiimid hidrohlorid; "ee" odnosi se na enantiomerni višak; "EtOAc" odnosi se na etil-acetat; "NPR" odnosi se na primer; "F12" odnosi se na Ham-ov medijum F12; "FBS" odnosi se na fetalni goveđi serum; "FRET" odnosi se na prenos fluorescentne rezonancione energije; "HEK" odnosi se na ljudski embrionalni bubreg; "HOAc" odnosi se na sirćetnu kiselinu; "HOAt" odnosi se na 1-hidroksi- 7-azobenzotriazol; "HOBt" odnosi se na 1-hidroksilbenzotriazol hidrat; "HPLC" odnosi se na tečnu hromatografiju visokih performansi; "h“ odnosi se na sat ili sate; "IC50" odnosi se na koncentraciju agensa koji proizvodi 50% maksimalnog inhibitorskog mogućeg odgovora za dato jedinjenje; "min" odnosi se na minut ili minute; "MTBE" odnosi se na metil terc-butil etar; "PDAPP" odnosi se na prekursorski amiloidni protein izveden iz krvnih pločica; "Prep" odnosi se na pripremu (dobivanje); "RFU" odnosi se na relativnu fluorescentnu jedinicu; "Rt" odnosi se na retenciono vreme; "RT" odnosi se na sobnu temperaturu; "SCX" odnosi se na jaku katjonsku razmenu; "SFC" odnosi se na hromatografiju superkritičnim fluidom; i "THF" se odnosi na tetrahidrofuran.

[0022] U dole datim šemama, svi supstituenti su prethodno definisani, osim ako to nije drugačije naznačeno. Reagensi i polazni materijali su uobičajeno dostupni stručnjacima.

Ostali reagensi i polazni materijali se mogu sintetisati standardnim tehnikama organske i heterociklične hemije prema analognim sintezama poznatih strukturno-sličnih jedinjenja i postupaka opisanih u Dobivanje i Primeri koji prate uvođenje bilo koje nove procedure.

Šema 1

[0023] U šemi 1 prikazano je dobivanje oksima (4) i (8). Oksim se može upotrebiti za formiranje bicikličnog izoksazola (5). Supstituisana aromatična grupa može se uvesti u različitim mestima sinteze, kao što je to prikazano u šemi 1, Korak 1 i Korak 7. "PG" je zaštitna grupa razvijena za amino grupu, kao što su karbamati i alil grupa. Te grupe su dobro poznate i cenjene u oblasti.

[0024] U reakciji u 2 koraka, keton sa beta halogenom kao supstituentom (1) se može alkilovati (3, korak 1) pomoću zaštićenog alilin amina (2) korišćenjem neorganske baze kao što je kalijum karbonat a zatim tretirati hidroksilamin hidrohloridom i organskom bazom kao što je piridin u polarnom protičnom rastvaraču kao što je etanol, dajući oksim (4, korak 2). Oksim (4) se može zatim pretvoriti u biciklični izoksazol (5) 3 2 ciklizacijom koristeći neki od postupaka kao što je zagrevanje oksima (4) u nepolarnom rastvaraču kao što je toluen ili ksilen, kako bi se dobio biciklični izoksazol (5, korak 3). Alternativno, oksim se može formirati polazeći od dimetil acetala (6) koji se tretira sa kiselinom kao što je mravlja kiselina kako bi se dobio aldehid (7, korak 4). U koraku 5, aldehid (7) se zatim može pretvoriti u oksim (8) pomoću hidroksilamin hidrohlorida u prisustvu baze kao što je natrijum acetat trihidrat. Biciklični izoksazol (9) se može formirati iz oksima (8) kako je to prikazano u korakom 6 koristeći vodeni rastvor natrijum hipohlorita. U koraku 7, zaštićeni biciklični izoksazol (9) zatim reaguje sa aromatičnim organolitijumskim reagensom ili Grignard-ovim reagensom da bi se zaštitio biciklični izoksazol (5).

Šema 2

[0025] U šemi 2 ilustrovani su različiti načini za dobivanje zaštićenog pirolo tiazina (12). Zaštićeni biciklični izoksazol (5) se može tretirati praškastim Zn u sirćetnoj kiselini ili Raney niklom u polarnom rastvaraču kao što je etanol pod uslovima hidrogenizacije pod pritiskom da se dobije aminopirolidin metanol (13, Korak 11). Aminopirolidinski derivat metanola (13) zatim reaguje sa benzoil izotiocijanatom u polarnom rastvaraču, kao što je THF za čime sledi dodavanje 1,1-karbonildiimidazola (CDI), pri čemu nastaje zaštićeni pirolidin tiazin (12, Korak 12). Alternativno, amin bicikličnog izoksazola (5) može reagovati sa benzoil izotiocijanatom da bi se dobila tiourea (10, korak 8), za čime sledi se u koraku 9, izoksazolni prsten otvara cinkom u prahu u sirćetnoj kiselini da bi se dobilo hidroksi jedinjenje (11). Hidroksil jedinjenje (11) se zatim tretira pomoću CDI u polarnom aprotičnom rastvaraču kao što je THF ili 1-hlor-N, N, 2-trimetilpropenilaminom u DCM da bi se formirao zaštićeni pirolidin tiazin (12, Korak 10). Kondenzovani pirolidin tiazin (12) se takođe može formirati pomoću Mitsunobu-ove reakcije upotrebom trifenilfosfina i diizopropil azodikarboksilata (DIAD).

Šema 3

[0026] U šemi 3 prikazana je konverzija pirolo tiazina (12) u anilin (14, korak 13); ovaj poslednji se zatim može acilovati (alkanoilovati), posle čega sledi deprotekcija i heteroarilovanje pirolidina. Deprotekcija tiazinskog amina dovodi do jedinjenja Formule I.

[0027] Azido-dehalogenovanje odgovarajućeg pirolo tiazina (12) se izvodi u prisustvu izvora azida, kao što je natrijum azid. Takve reakcije azido-dehalogenovanja su dobro poznate i cenjene u struci. Redukcija nastalog azidnog intermedijera u anilin (14, koraka 13) može se izvršiti pod uslovima hidrogenizacije što je dobro poznato, i opisano je u oblasti, ili redukcionim agensima dobro poznatim u stanju tehnike kao što su LiAlH4, NaBH4, PPh3.

[0028] BOC zaštićeni pirolidin se može deprotektovati pod kiselim uslovima dobro poznatim u oblasti (korak 1 koraka 14). Zatim deprotektovani pirolidin može biti heteroarilovan u reakciji nukleofilne aromatične supstitucije (SNAr) pomoću supstituisanog aromatičnog pirimidina koristeći organsku bazu kao što je diizopropiletilamin, trietilamin, ili N, N, N, N'-tetrametilguanidin, pri čemu nastaje jedinjenje 15 (korak 2 koraka 14). Anilin (15) se može derivatizovati pomoću heteroaromatičnih karboksilnih kiselina (16) pod uslovima kuplovanja (korak 1 koraka 15). Osoba obučena u oblasti će prepoznati da postoji niz postupaka i reagenasa za formiranje amida u reakcijama karboksilnih kiselina i amina. Na primer, reakcija odgovarajućeg anilina (15) sa odgovarajućom kiselinom jedinjenja 16 u prisustvu reagensa za kuplovanje i aminske baze kao što je DIPEA ili trietilamin, daće jedinjenje Formule I posle uklanjanja zaštite tiazinamina. Reagensi za kuplovanje uključuju karbodiimide kao što su DCC, DIC, EDCI, i aromatične oksime kao što su HOBt i HOAt. Pored toga, uronijum ili fosfonijum soli ne-nukleofilnih anjona kao što su HBTU, HATU, PiBOP, i PiBrOP mogu se koristiti umesto tradicionalnih reagensa za kuplovanje. Aditivi kao što je DMAP mogu se koristiti za pospešivanje reakcija. Alternativno, zaštićeni anilinski amin (15) može se acilovati pomoću supstituisanih benzoil hlorida u prisustvu baze kao što je trietilamin ili piridin. Zaštićeni tiazin amin se zatim može ukloniti zaštitom organske baze kao što je piridin i metilhidroksilamin hidrohlorid u polarnom aprotičnom rastvaraču kao što je etanol ili neorganska baza kao što je litijum hidroksid u metanolu, dajući jedinjenja Formule I.

[0029] Opciono, farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja Formule I mogu se dobiti reakcijom odgovarajuće slobodne baze Formule I i odgovarajućih farmaceutski prihvatljivih kiselina u pogodnom rastvaraču pod standardnim uslovima. Pored toga, do formiranja takvih soli može doći istovremeno posle deprotekcije grupe za zaštitu azota. Formiranje takvih soli je dobro poznato i cenjeno u struci. Vidi, na primer, Gould, P.L., "Soli selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Soli Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); i Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Stručnjak prosečno obučen u oblasti će uvažavati da se jedinjenja Formule I lako pretvaraju i mogu biti izolovana kao farmaceutski prihvatljiva so, kao što je to hidrohloridna so.

Sinteze i primeri

[0030] Sledeće sinteze i primeri nadalje ilustruju pronalazak. Osim ako to nije naznačeno suprotno, ovde prikazana jedinjenja imenovana su i numerisana pomoću Symyx® Draw verzija 3.2 ili verzija 4.0 (Symyx Rastvors, Inc.) ili IUPACNAME ACDLABS.

Sinteza 1

1-(3-Bromfenil)-2-(diallilamino)etanon

[0031]

[0032] Kalijum karbonat (38,8 g, 281 mmol) se doda 3-bromfenacil bromidu (60 g 216 mmol) u acetonitrilu (430 mL), i reakciona smesa se ohladi u atmosferi azota na 0 °C. Diallilamin (34,6 mL, 280,63 mmol) se doda zatim ukapavanjem tokom 1 sata i reakciona smesa se ostavi da se zagreje preko noći na 22 °C. Sirova reakciona smesa se zatim koncentruje a ostatak se ekstrahuje vodom (300 mL) i MTBE (300 mL). Vodeni sloj se odbaci a organski sloj se ispere vodom (100 mL, 2 x) i zasićenim rastvorom natrijum hlorida (100 mL). Organski sloj se osuši preko natrijum sulfata, filtruje, i rastvarač se upari do konstatne težine pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (62 g, 98%). ES/MS (m/e): 294 (M+1).

Sinteza 2

Benzil N-(2,2-dimetoksietil)karbamat

[0033]

[0034] Na rastvor aminoacetaldehid dimetil acetala (25 mL, 229 mmol) u toluenu (120 mL) deluje se na 0 °C 4,85 M rastvorom natrijum hidroksida (70,8 mL, 343,5 mmol). Reakciona smesa se meša na 0 °C tokom 10 minuta i benzil hlorformijat (33,8 mL, 229 mmol) se doda zadržavajući tokom dodavanja unutrašnju temperaturu ispod 20 °C.

Reakciona smesa se zatim zagreje do sobne temperature tokom 4 sata. Organski sloj se zatim odvoji, ispere zasićenim rastvorom natrijum hlorda, suši preko natrijum sulfata, i koncentruje do suva pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (54 g, 98 %). ES/MS (m/e): 240 (M+H).

Sinteza 3

Benzil N-allil-N-(2,2-dimetoksietil)karbamat

[0035]

[0036] Rastvor benzil N-(2,2-dimetoksietil)karbamata (50 g, 208,9 mmol) u toluenu (180 mL) tretira se čvrstim kalijum hidroksidom (51,6 g, 919,69 mmol) pod azotom. Posle 10 minuta, doda se benziltrietilamonijum hlorid (0,8 g, 3,1 mmol). Posle drugih 10 minuta rastvor allil bromida (33 g, 272,8 mmol) u toluenu (50 mL) se doda ukapavanjem tokom 10 minuta. Nastala smesa meša se na 50 °C tokom 48 sata. Reakciona smesa se ohladi do sobne temperature i prekida pomoću voda. Organski sloj se zatim odvoji, ispere zasićenim rastvorom natrijum hlorda, suši preko magnezijum sulfata, i koncentruje do suva pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (44 g, 75 %). ES/MS (m/e): 280 (M+H).

Sinteza 4

Benzil N-allil-N-(2-oksoetil)karbamat

[0037]

[0038] Rastvor benzil N-allil-N-(2,2-dimetoksietil)karbamata (30 g, 107 mmol) u mravljoj kiselini (36,8 mL, 860 mmol) i vodi (4,84 mL) meša se preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smesa se zatim koncentruje i razblaži smesom heksani/etil acetat (1:2) i voda. Organski sloj se zatim odvoji, ispere zasićenim rastvorom natrijum hlorida do pH=6, i suši preko natrijum sulfata. Rastvarač se upari pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (25 g, 99 %). ES/MS (m/e): 234 (M+H).

Sinteza 5

1-(3-Bromfenil)-2-(diallilamino)etanon oksim

[0039]

[0040] Rastvor 1-(3-bromfenil)-2-(diallilamino)etanona (60 g, 204,7 mmol) u etanolu (720 mL) i piridinu (24,8 mL, 307 mmol) meša se 15 minuta na 22 °C. Hidroksilamin hidrohlorid (17 g, 246 mmol) se doda u porcijama rastvoru tokom 1 sata. Reakciona smesa se zatim zagreva na 50 °C tokom 2 sata a zatim zagreva na 70 °C tokom 16 sati. Rastvarač se upari a ostatak particioniše u vodi (300 mL) i metil terc-butil etru (300 mL). Organski sloj se zatim odvoji i ispere vodom (100 mL, 2 x) i zasićenim rastvorom natrijum hlorida (100 mL). Organski sloj se osuši preko natrijum sulfata, filtruje, i upari do suva pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (75,5 g, 79%). ES/MS (m/e): 309 (M+1).

Sinteza 6

Benzil N-alil-N-[2-hidroksiiminoetil]karbamat

[0041]

[0042] U rastvor benzil N-allil-N-(2-oksoetil)karbamata (25 g, 107 mmol) u acetonitrilu (150 mL) doda se hidroksilamin hidrohlorid (9,68 g, 139 mmol) i rastvor natrijum acetat trihidrata (16 g, 117,9 mmol) u vodi (75 mL). Reakciona smesa se preko noći meša na sobnoj temperaturi. Acetonitril se upari i vodeni rastvor se ekstrahuje etil acetatom. Organski sloj se zatim odvoji, suši preko magnezijum sulfata, i koncentruje u vakuumu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (24 g, 90 %). ES/MS (m/e): 249 (M+H).

Sinteza 7

5-Allil-6a-(3-bromfenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol

[0043]

[0044] Sirovi 1-(3-bromfenil)-2-(diallilamino)etanon oksim (75,5 g, 195,34 mmol) rastvori se u toluenu (600 mL) i refluksuje tokom 12 sati. Rastvarač se upari in vacuo i ostatak se rastvori u smesi vodene 1 N HCl (1 L) i metil terc-butil etra (300 mL). Reakciona smesa meša se tokom 15 minuta i doda se dijatomejska zemlja (10 g). Reakciona smesa meša se dodatnih 20 minuta i filtruje kroz dijatomejsku zemlju. Filter kolač se ispere dodatnom vodenom 1 N HCl (200 mL) i metil terc-butil etrom (200 mL). Organski sloj se zatim odvoji i ispere pomoću 1 N HCl (2 × 100 mL). Vodeni slojevi se kombinuju i pH podesi na 9 pomoću NaOH 50% w/w. Vodena smesa se ekstrahuje pomoću metil terc-butil etra (3 × 250 mL). Kombinovani organski sloj se suši preko natrijum sulfata i filtruje. Filtrat se upari i suši u vakuumu pri čemu se dobiva crvena čvrsta supstanca (60 g). Crvena čvrsta supstanca se rastvori heptanom (600 mL) i reakciona smesa se zagreva na refluksu tokom 20 minuta. Doda se aktivni ugalj (2 g) i reakciona smesa se filtruje kroz dijatomejsku zemlju. Filtrati se koncentruju na atmosferskom pritisku do krajnje zapremine od 300 mL. Rastvor se ohladi na 22 °C i meša tokom 3 sata. Svetlo žuta čvrsta supstanca se sakupi filtrovanjem i suši u vakuumu do konstatne težine pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (40 g, 60%). ES/MS (m/e): 309 (M+1).

Sinteza 8

Benzil 3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilat

[0045]

[0046] Rastvor benzil N-allil-N-[2-hidroksiiminoetil]karbamata (24 g, 96,6 mmol) u dihlormetanu (338 mL) tretira se ukapavanjem tokom 10 minuta pomoću 5% w/w vodenog rastvora natrijum hipohlorita (106,08 mmol, 143,06 mL). Nastala smesa meša se preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smesa se hvata pomoću 40 % vodenog rastvora natrijum bisulfita (7 g). Organski sloj se zatim odvoji, suši preko magnezijum sulfata, i koncentruje u vakuumu. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela eluirajući pomoću 5 % etil acetat u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (18 g, 75 %). ES/MS (m/e): 247 (M+H).

Sinteza 9

Benzil 6a-(5-brom-2-fluor-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilat

[0047]

[0048] Rastvor 1,6 M n-butil litijuma u heksanima (25,4 mL, 40,6 mmol) doda se na -78 °C ukapavanjem rastvoru of 4- brom-1-fluor-2-iodbenzena (12,22 g, 40,6 mmol) u tetrahidrofuranu (60 mL) pri čemu nastaje žuti rastvor koji se meša na -78 °C tokom 15 minuta. Bor trifluorid eterat (5,14 mL, 40,6 mmol) se na -78 °C doda drugom rastvoru benzil 3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (5 g, 20,3 mmol) u tetrahidrofuranu (60 mL) i reakciona smesa se meša na -78 °C tokom 5 minuta. Nastali rastvor se dodaje prethodno spremljenoj organolitijumskoj smesi na -78 °C pomoću kanule. Kombinovana reakciona smesa se meša tokom 30 minuta na -78 °C. Reakcija se potom prekida pomoću zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida i zagreje do sobne temperature. Reakciona smesa se ekstrahuje pomoću etil acetata (3 x) i organski ekstrakti se kombinuju, suše preko natrijum sulfata, filtruju i rastvarač se ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 35 minuta gradijentom 5% do 100% etil acetat u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (2,27 g, 27%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 421/423 (M+H).

Sinteza 10

Benzil 1-(benzoilkarbamotioil)-6a-(5-brom-2-fluor-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilat

[0049]

[0050] Benzoil izotiocijanat (2,87 mL, 21,28 mmol) se doda ukapavanjem rastvoru benzil 6a-(5-brom-2-fluor-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (5,977 g, 14,2 mmol) u tetrahidrofuranu (95 mL) i reakciona smesa se meša preko noći pod azotom. Rastvarač se ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 35 minuta gradijentom 5% do 100% etil acetat u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (6,05 g, 73%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 584/586 (M+H).

Sinteza 11

[1-Allil-4-amino-4-(3-bromfenil)pirolidin-3-il]metanol

[0052] Rastvor 5-allil-6a-(3-bromfenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirolo[3,4-c]izoksazola (40 g, 129,4 mmol) u sirćetnoj kiselini (400 mL) tretira se na 22 °C cinkom u prahu (42,3 g, 646,8 mmol) koji se dodaje u jednoj porciji. Reakciona smesa se snažno meša na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Etil acetat (400 mL) se doda i reakciona smesa se filtruje kroz dijatomejsku zemlju. Filtrat se upari a ostatak suši u vakuumu. Ostatak se ekstrahuje vodom (300 mL) i MTBE (300 mL). pH se podesi na 8 pomoću natrijum hidroksida 50% w/w i organski sloj se zatim odvoji, suši preko natrijum sulfata, i filtruje. Filtrat se upari a ostatak suši u vakuumu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (41 g, 97%). ES/MS (m/e): 311 (M+1).

Sinteza 12

Benzil 3-(benzoilkarbamotioilamino)-3-(5-brom-2-fluor-fenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-1-karboksilat

[0053]

[0054] A smesa benzil 1-(benzoilkarbamotioil)-6a-(5-Brom-2-fluor-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidropirolo[3,4-c]izoksazol-5-karboksilata (6,05 g 10,4 mmol) i zinka (prah, <10 mikrona) (6,77 g, 103,5 mmol) meša se u sirćetnoj kiselini (52 mL) na sobnoj temperaturi preko noći pod azotom. Reakciona smesa se rastvori pomoću etil acetat i filtruje kroz dijatomejsku zemlju. Rastvarač se ukloni in vacuo i ostatak se rastvori etil acetatom, vodom i zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Reakciona smesa se ekstrahuje pomoću etil acetata (3 ×), kombinovani vodeni slojevi se kombinuju i suše preko natrijum sulfata, filtruje i rastvarač ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 30 minuta gradijentom 5% do 100% EtOAc u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (5,222 g, 86%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 586/588 (M+H).

Sinteza 13

[(3R,4S)-1-Allil-4-amino-4-(3-bromfenil)pirolidin-3-il]metanol; (2R,3R)-2,3-bis[(4-metilbenzoil)oksi]butandikiselina

[0055]

[0056] Rastvor [1-allil-4-amino-4-(3-Bromfenil)pirolidin-3-il]metanola (77 g, 235 mmol) u izopropil alkoholu (914 mL) se zagreva na 70 °C. Rastvoru se doda di-p-toluoil-L-vinska kiselina (86,2 g, 223 mmol) i reakciona smesa se ohladi na 22 °C tokom 2 sata i meša preko noći. Kašasta smesa se filtruje i sakuplja se svetlo žuta čvrsta supstanca koja se ispere izopropil alkoholom. Čvrsta supstanca se osuši u vakuumu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (63 g, 36%). ES/MS (m/e): 311 (M+1). Proizvod se analizira reversno-faznom hiralnom hromatografijom: analiza izomera koji se prvi eluira (Kolona: Chiralpak ID-34.6 x 50 mm; eluent: 70:30, vodeni 20 mM amonijum bikarbonat : acetonitril; protok: 1.5 mL/min na UV 215 nm) potvrđuje da je dobijen enantiomerni višak (96% ee) datog enantiomera na osnovu Rt= 1.26 minuta.

Sinteza 14

[(3R,4S)-1-Allil-4-amino-4-(3-bromfenil)pirolidin-3-il]metanol

[0057]

[0058] [(3R,4S)-1-Allil-4-amino-4-(3-bromfenil)pirolidin-3-il]metanol; (2R,3R)-2,3-bis[(4-metilbenzoil)oksi]butan dikiselina (63 g 85,8 mmol) pomeša se sa vodenom 1 N HCl (800 mL) i etil acetatom (400 mL) i reakciona smesa meša se tokom 15 minuta na 22 °C. Slojevi se razdvoje i pH vodenog sloja se podesi na 10 pomoću natrijum hidroksida 50% w/w. Vodena smesa se ekstrahuje pomoću metil terc-butil etra (3 × 250 mL). Kombinovani vodeni sloj se suši preko magnezijum sulfata, filtruje i upari do suva pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (27 g, 99%). ES/MS (m/e): 311 (M+1).

Sinteza 15

N-[(4aR,7aS)-6-Alil-7a-(3-bromfenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0059]

[0060] Rastvor [(3R,4S)-1-allil-4-amino-4-(3-bromfenil)pirolidin-3-il]metanola (27 g; 86,7 mmol) u tetrahidrofuranu (270 mL) se ohladi na -5 °C u atmosferi azota. Benzoil izotiocijanat (12,3 mL, 91 mmol) se doda ukapavanjem održavajući temperaturu ispod 0 °C. Reakciona smesa se ostavi da se zagreje na 22 °C tokom 1 sata. 1,1’-Karbonildiimidazol (28,1 g, 173,5 mmol) se doda u jednoj porciji i reakciona smesa meša se tokom 1 sata na 22 °C a zatim zagreva na refluksu tokom 16 sati. Rastvarač se ukloni in vacuo i ostatak suši u vakuumu. Sirovi materijal se particioniše u metil terc-butil etru (500 mL) i vodi (250 mL). Organski sloj se zatim odvoji, suši preko magnezijum sulfata, filtruje i upari do suva. Sirovi materijal se prečišćava preko silika gela gradijentom 90/10 do 60/40 metilen hlorid / etil acetat pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (27 g, 68%). ES/MS (m/e): 456 (M+1).

Sinteza 16

Benzil 2-benzamido-7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0062] 1,1’-Karbonildiimidazol (2,87 g, 17.7 mmol) se doda rastvoru benzil 3-(benzoilkarbamotioilamino)-3-(5-brom-2-fluor-fenil)-4-(hidroksimetil)pirolidin-1-karboksilata (5.198 g, 8.86 mmol) u tetrahidrofuranu (52 mL). Reakciona smesa meša se tokom 1,5 sata na sobnoj temperaturi a zatim reakciona smesa se zagreva na refluksu preko noći pod azotom. Reakciona smesa se ohladi, razblaži vodom, i ekstrahuje pomoću etil acetata (3 x). Kombinovani organski slojevi se suše preko natrijum sulfata, filtruje se, i rastvarač ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 30 minuta gradijentom 5% do 100% EtOAc u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (2,93 g, 58%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br).568/570 (M+H)

Sinteza 17

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-Bromfenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0063]

[0064] Smesa N-[(4aR,7aS)-6-allil-7a-(3-bromfenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3] tiazin-2-il]benzamida (1 g, 2,19 mmol) i N,N-dimetilbarbiturne kiseline (0,868 g, 5,48 mmol) u hlorformu (22 mL) se na sobnoj temperaturi degasira provođenjem azota kroz nastalu kašastu suspenziju na s.t. tokom 5 min. Reakciona smesa se tretira pomoću tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma (0,261 g, 219 µmoles) i meša se tokom 1,5 sata pod azotom.

[0065] U drugom balonu se smesa N-[(4aR,7aS)-6-allil-7a-(3-bromfenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (22,2 g, 48,6 mmol) i N,N-dimetilbarbiturne kiseline (19,28 g, 121,6 mmol) u hlorformu (486 mL) degasira provođenjem azota kroz kašastu suspenziju na s.t. tokom 5 min. Reakciona smesa tretira se pomoću tetrakis(trifenilfosfin) paladijuma (5,79 g, 4,86 mmol) i meša se tokom 2 sata pod azotom.

[0066] Dve reakcije se kombinuju i rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva sirovi proizvod. Sirovi materijal se prečišćava preko silika gela pomoću tokom 30 minuta gradijentom 0,5% do 10% metanol u dihlormetanu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (22,4 g, 100%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 416/418 (M+H).

Sinteza 18

N-[7a-(5-Brom-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0067]

[0068] Jodtrimetilsilan (2,21 mL, 15,46 mmol) se doda ukapavanjem na sobnoj temperaturi rastvoru benzil 2-benzamido-7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilatu (2,93 g, 5,15 mmol) u acetonitrilu (44 mL). Reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi tokom dva sata i rastvarač se ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava pomoću SCX kolone smesom 3:1 dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7 N amonijačni metanol pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (2,098 g, 94%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 434/436 (M+H).

Sinteza 19

terc-Butil (4aR,7aS)-2-benzamido-7a-(3-bromfenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0070] Rastvor N-[(4aR,7aS)-7a-(3-bromfenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (22,4 g, 36,69 mmol) u dihlormetanu (367 mL) na sobnoj temperaturi se tretira pomoću di-t-butildikarbonata (8,81 g, 40,36 mmol) za čime sledi dodavanje trietilamina (7,67 mL, 55,04 mmol) i reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 sata pod azotom. Rastvarač se ukloni in vacuo i sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela pomoću tokom 25 minuta gradijentom 5% do 100% etil acetat u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (20,22 g, 100%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 516/518 (M+H).

Sinteza 20

terc-Butil 2-benzamido-7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0071]

[0072] Di-t-butildikarbonat (1,16 g, 5,31 mmol) i trietilamin (1,01 mL, 7,25 mmol) dodaju se rastvoru N-[7a-(5-brom-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (2,098 g, 4,83 mmol) u dihlormetanu (48 mL). Reakciona smesa meša se tokom 1 sata na sobnoj temperaturi pod azotom. Rastvarač se ukloni in vacuo i sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 30 minuta gradijentom 5% to 100% EtOAc u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (2,556 g, 99%). ES/MS (m/e): (<79>Br/<81>Br) 534/536 (M+H).

Sinteza 21

terc-Butil (4aR,7aS)-7a-(3-aminofenil)-2-benzamido-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0073]

[0074] Rastvor terc-butil (4aR,7aS)-2-benzamido-7a-(3-bromfenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilata (5 g, 9,7 mmol) i trans-N,N’-dimetil-1,2-cyclohexanediaminu (220,3 mg, 1,5 mmol) u etanolu (100 mL) se tretira natrijum azidom (1,30 g, 19,4 mmol). Vodeni rastvor L-askorbinske kiseline natrijumove soli (0,66 M, 3,2 mL, 2,1 mmol) i voda se doda (10 mL) i azot se produva preko vrha balona. Reakciona smesa tretira vodenim rastvorom of bakar(II)sulfat pentahidrata (0,33 M, 3,2 mL, 1,1 mmol) i reakciona smesa se odmah zagreva na prethodno zagrejanoj vrućoj ploči na 80 °C tokom 1,5 sata pod azotom. Posle zagrevanja dobiva se homogena smesa. Reakciona smesa se ohladi i doda se se smesa led/voda. Reakciona smesa se ekstrahuje pomoću etil acetata (3x). Kombinovani organski slojevi se suše preko natrijum sulfata, filtruju, i rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva sirovi proizvod azida. Sirovi proizvod azida se pomeša sa 10% paladijumom na ugljeniku (2 g) u hladnom etanolu (150 mL) i atmosfera reakcione smese se zameni koristeći vakuum/azot a zatim vakuum/vodonik. Reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi na 30 psi vodonika tokom 2 sata. Atmosfera reakcione smese se zameni vazduhom i reakciona smesa se filtruje kroz dijatomejsku zemlju koristeći dihlormetan za ispiranje taloga. Rastvarač se ukloni iz filtrata in vacuo i sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela pomoću 50% etil acetata u dihlormetanu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (4 g, 91%). ES/MS (m/e): 453 (M+H).

Sinteza 22

terc-Butil 7a-(5-amino-2-fluor-fenil)-2-benzamido-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat

[0076] Rastvor terc-butil 2-benzamido-7a-(5-Brom-2-fluor-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilata (2,556 g, 4,8 mmol) i trans-N,N’-dimetil-1,2-cikloheksandiamina (150 mg, 1,1 mmol) u etanolu (50 mL) tretira se pomoću natrijum azida (933 mg, 14,3 mmol). Potom se dodaju vodeni rastvor natrijumove soli L-askorbinske kiseline (0,66 M, 3.2 mL, 2.1 mmol) u vodi (1 mL) i vrh balona napuni se azotom. Reakciona smesa tretira se pomoću vodenog rastvora bakar(II)sulfata pentahidrata (0,33 M, 3,2 mL, 1,1 mmol) i reakciona smesa se pod azotom odmah zagreva na prethodno zagrejanoj vrućoj ploči na 80 °C tokom 1,5 sata. Dobiva se homogena smesa se posle zagrevanja. Reakciona smesa se ohladi, razblaži pomoću smese led-voda, i reakciona smesa se ekstrahuje pomoću etil acetata (3 ×). Kombinovani organski slojevi se suše preko natrijum sulfata, filtruju, i rastvarač ukloni in vacuo pri čemu se dobiva sirovi proizvod azida. Sirovi proizvod azida se pomeša sa 10% paladijuma na ugljeniku (1 g) u hladnom etanolu (150 mL) i atmosfera reakcione smese se zameni koristeći vakuum/azot a zatim vakuum/vodonik. Reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi na 30 psi vodonika tokom 5 sati. Reakciona smesa se izventilira uvodeći vazduh, filtruje kroz dijatomejsku zemlju, i filter kolač se ispere pomoću dihlormetana. Rastvarač se ukloni iz filtrata in vacuo i sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela pomoću 50% etil acetata u dihlormetanu pri čemu nastaje željeno jedinjenje (2,014 g, 89%). ES/MS (m/e): 471 (M+H).

Sinteza 23

terc-Butil (4aR,7aS)-2-benzamido-7a-[3-[(5-fluorpiridin-2-karbonil)amino]fenil]-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin -6-karboksilat

[0077]

[0078] U suspenziju terc-butil (4aR,7aS)-7a-(3-aminofenil)-2-benzamido-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilata (93 mg, 0,21 mmol), 5-fluorpiridin-2-karboksiline kiseline (31,9 mg, 0,23 mmol), 1-hidroksibenzotriazol hidrata (56,7 mg, 0,41 mmol) i 1-(2-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorida (40 mg, 0,21 mmol) u dihlormetanu (4 mL) uz dodatak dimetilformamida (1 ml) doda se diizopropiletilamin (179,2 µL, 1,03 mmol) i nastala smesa meša se na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa se razblaži dihlormetanom (5 mL) i zasićenim vodenom natrijum bikarbonatom (15 mL). Organski sloj se zatim odvoji i ispere zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (10 mL), suši preko natrijum sulfata, filtruje, i rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu nastaje sirovo željeno jedinjenje (105 mg, 89%). ES/MS (m/e): 576 (M+H).

Sinteza 24

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7ail]fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamid; 2,2,2-trifluorsirćetna kiselina

[0079]

[0080] terc-Butil (4aR,7aS)-2-benzamido-7a-[3-[(5-fluorpiridin-2-karbonil)amino]fenil]-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat (105 mg, 0,18 mmol) rastvori se u dihlormetanu (2 mL) i na njega deluje trifluorosirćetnom kiselinom (500 µL, 6,6 mmol).

Nastali žuti rastvor meša se tokom 4 sata na sobnoj temperaturi i rastvarač ukloni in vacuo pri čemu se dobiva sirovi željeni proizvod (190 mg, 100%). ES/MS (m/e): 476 (M+H).

Sinteza 25

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-Aminofenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0081]

[0082] Trifluorsirćetna kiselina (25 mL) se doda rastvoru terc-butil (4aR,7aS)-7a-(3-aminofenil)-2-benzamido4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3 ]tiazin-6-karboksilata (4 g, 8,84 mmol) u dihlormetanu (100 mL) i reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi u atmosferi azota tokom 4 sata. Rastvarač se ukloni in vacuo i sirovi proizvod se prečišćava na SCX koloni koristeći 3:1 dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7 N amonijak u metanolu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (2,49 g, 80%). ES/MS (m/e): 353 (M+H).

Sinteza 26

N-[7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0083]

[0084] Trifluorsirćetna kiselina (10 mL) se doda rastvoru terc-butil 7a-(5-amino-2fluor-fenil)-2-benzamido4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilata (2,013 g, 4,28 mmol) u dihlormetanu (30 mL) i reakciona smesa meša se na sobnoj temperaturi u atmosferi azota tokom 4 sata. Rastvarač se ukloni in vacuo i sirovi proizvod se prečišćava na SCX koloni koristeći 3:1 dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7 N amonijačni metanol pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (1,555 g, 98%). ES/MS (m/e): 371 (M+H).

Sinteza 27

N-[(4aR,7aS)-7a-(3-Aminofenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0085]

[0086] Rastvor N-[(4aR,7aS)-7a-(3-aminofenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamida (2,49 g, 7,06 mmol), 5-fluor-2-hlorpirimidina (3,74 g, 28,26 mmol), i diizopropiletilamina (6,16 mL, 35.32 mmol) u 1,4-dioksanu (60 mL) zagrevaju se na refluksu tokom 4 sata pod azotom. Reakciona smesa se ohladi, razblaži vodom i ekstrahuje etil acetatom (3 x). Objedinjeni organski ekstrakt se suši preko natrijum sulfata, filtruje i rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva sirovi proizvod. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 25 minuta gradijentom 5% do 100% etil acetat u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (2,51 g, 79%). ES/MS (m/e): 449 (M+H).

Sinteza 28

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamid

[0087]

[0088] Rastvor N-[3-[(4aR,7aS)-2-benzamido-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5- fluor-piridin-2-karboksamida; 2,2,2-trifluorsirćetne kiseline (150 mg, 254 µmol), 5-fluor-2-hlorpirimidina (68 mg, 51

µmol) u diizopropiletilaminu (98 µL, 56 µmol) se zagreva u dimetilsulfoksidu (5 mL) preko noći na 40 °C. Dodatna količina 5-fluor-2-hlorpirimidina (68 mg, 51 µmol) i diizopropiletilamina (98 µL, 56 µmol) doda se i reakciona smesa se zagreva preko noći na 50 °C. Dodatna količina 5-fluor-2-hlorpirimidina (68 mg, 51 µmol) i diizopropiletilamina (98 µL, 56 µmol) se doda i reakciona smesa se zagreva preko noći na 50 °C tokom treće noći. Reakciona smesa se ohladi, razblaži zasićenim vodenom natrijum karbonatom (50 mL) pri čemu se dobiva suspenzija koja se filtruje i suši u vakuum sušnici na 50 °C tokom 4 sata pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (60 mg, 41%). ES/MS (m/e): 449 (M+H).

Alternativna Sinteza 28

[0089] N-[(4aR,7aS)-7a-(3-Aminofenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (282 mg, 628,73 µmol) i 5-fluorpiridin-2-karboksilna kiselina (106,46 mg, 754,47 µmol) se pomešaju u dihlormetanu (3 mL) i dimetilformamidu (0,5 mL). 1-Hidroksibenzotriazol (112,70 mg, 817,35 µmol) a potom se doda1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (159,07 mg, 817,35 µmol) i nastala smesa se meša tokom 5 sati na sobnoj temperaturi pod azotom. Reakciona smesa se razblaži vodom i pH se podesi pomoću 1 N NaOH na ∼12. Reakciona smesa se ekstrahuje pomoću etil acetata (3 ×). Objedinjeni organski ekstrakt se suši preko natrijum sulfata, filtruje i rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva sirovi proizvod. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 20 minuta gradijentom 5% do 100% etil acetat u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (327 mg, 91%). ES/MS (m/e): 571 (M+H).

Sinteza 29

N-[7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d] [1,3]tiazin-2-il]benzamid

[0090]

[0091] Rastvor N-[7a-(5-amino-2-fluor-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (705 mg, 1,90 mmol), 5-fluor-2-hlorpirimidina (1,01 g, 7,61 mmol), u diizopropiletilaminu (1,66 mL, 9,52 mmol) se zagreva u 1,4-dioksanu (20 mL) do refluksa tokom 4 sata pod azotom. Reakciona smesa se ohladi, razblaži vodom, i ekstrahuje etil acetatom (3 x). Objedinjeni organski ekstrakt se suši preko natrijum sulfata, filtruje i rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva sirovi proizvod. Proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 25 minuta gradijentom 5% do 100% etil acetat u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (590 mg, 66%). ES/MS (m/e): 467 (M+H).

Sinteza 30

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5- metoksi-pirazin-2-karboksamid

[0092]

[0093] N-[(4aR,7aS)-7a-(3-Aminofenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (400 mg, 891,81 µmol) i 5-metoksipirazin2-karboksilna kiselina (165 mg, 1,07 mmol) se pomešaju u dihlormetanu (4 mL) i dimetilformamidu (0,5 mL). Zatim se doda 1-hidroksibenzotriazol (160 mg, 1,16 mmol) a potom 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (226 mg, 1,16 mmol) i nastala smesa meša se tokom 5 sati na sobnoj temperaturi pod azotom. Reakciona smesa se rastvori u vodi i pH se podesi na ∼12 pomoću 1 N NaOH. Reakciona smesa se ekstrahuje etil acetatom (3 ×). Objedinjeni organski ekstrakt se suši preko natrijum sulfata, filtruje i rastvarač ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava gradijentom preko silika gela tokom 20 minuta 5% do 100% etil acetatom u heksanima pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (482 mg, 92%). ES/MS (m/e): 585 (M+H).

Sinteza 31

N-[3-[2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamid

[0094]

[0095] N-[7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (302 mg, 647 µmol) i 5-fluorpiridin-2-karboksilna kiselina (110 mg, 777 µmol) se pomešaju u dihlormetanu (3 mL) i dimetilformamidu (0,5 mL). Zatim se doda 1-hidroksibenzotriazol (116 mg, 842 µmol) a potom 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (164 mg, 842 µmol) i reakciona smesa meša se preko noći na sobnoj temperaturi pod azotom. Reakciona smesa se razblaži vodom a pH podesi pomoću 1 N NaOH na ∼12 a se potom ekstrahuje pomoću etil acetata (3 x). Objedinjeni organski ekstrakt se filtruje da bi se sakupio nerastvorni materijal. Dobivena čvrsta supstanca se ispere vodom i etil acetatom i suši u vakuumu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje. Organski sloj iz filtrata se osuši preko natrijum sulfata, filtruje i rastvarač ukloni in vacuo. Ostatak se prečišćava gradijentom preko silika gela tokom 20 minuta 5% do 100% etil acetatom u heksanima pri čemu se dobiva dodatna količina željenog jedinjenja u kombinovanom prinosu od (275 mg, 72%). ES/MS (m/e): 590 (M+H).

Sinteza 32

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid, (izomer 1)

[0096]

[0097] Racemski N-[7a-(5-amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (1,694 g, 3,63 mmol) se prečišćava preko hiralne HPLC kolone (Kolona: Chiralcel OJ, 8 x 35 cm; eluent: 90 % metanol (0,2 % dimetiletilamin) i 10% acetonitril; protok 400 mL/min na UV 280 nm). Analiza izomera koji se prvi eluira (Kolona: Chiralcel OJ-H 0,46 x 15 cm; eluent: 10:90 acetonitril:metanol (uz dodatak 0,2% dimetiletilamina); protok: 0,6 mL/min na UV 280 nm) potvrđuje enantiomerni višak (99% ee) enantiomera sa Rt= 6,70 minuta, (723 mg, 43%). ES/MS (m/e): 467 (M+H).

Sinteza 33

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid, (izomer 1)

[0098]

[0099] N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (0,361 g, 0,77 mmol, izomer 1) rastvori se u smesi of dihlormetan (4 mL) i DMF (0,5 mL).5-Metoksipirazin-2-karboksilna kiselina (240 mg, 1,55 mmol), 1-hidroksibenzotriazol (210 mg, 1,55 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (300 mg, 1,55 mmol) se potom dodaju reakcionoj smesi i reakciona smesa se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Potom se reakcioni rastvor sipa direktno na kolonu napunjenu sa 12 g silika gela i prečišćava koristeći kolonu silika gela od 40 g eluirajući gradijentom 0-100% etil acetat/heksani. Proizvod se rastvori u etil acetatu (200 mL), ispere se pomoću 1 N NaOH (2 × 50 mL), i zasićenim rastvorom natrijum hlorida (1 × 50 mL). Prečišćavanje preko silika gela se ponavlja kako je gore opisano pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (350 mg, 74%). ES/MS (m/e): 603 (M+H).

Sinteza 34

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][[1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5-cijano-piridin-2-karboksamid

[0100]

[0101] N-[(4aR,7aS)-7a-(3-Aminofenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (0,30 g, 0,67 mmol) rastvori se u dihlormetanu (10 mL) a potom se dodaju 5-cijanopiridin-2-karboksilna kiselina (129 mg, 0.87 mmol), 1-hidroksibenzotriazol (185 mg, 1,34 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (169 mg, 0,87 mmol). Diizopropiletilamin (0,35 mL, 2 mmol) se doda i reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Materijal se prečišćava direktno gradijentnom hromatografijom preko silika gela eluirajući pomoću 0-100% etil acetat / heksani pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (360 mg, 88%). ES/MS (m/e): 579 (M+H).

Sinteza 35

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-3,5-difluor-piridin-2-karboksamid

[0102]

[0103] N-[(4aR,7aS)-7a-(3-Aminofenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (0,30 g, 0,67 mmol) rastvori se u dihlormetanu (10 mL) a potom se doda 3,5-difluorpiridin-2-karboksilna kiselina (138 mg, 0,87 mmol), 1-hidroksibenzotriazol (185 mg, 1,34 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (169 mg, 0,87 mmol). Diizopropiletilamin (0,35 mL, 2 mmol) se doda i reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa se prečišćava direktno gradijentnom hromatografijom preko silika gela eluirajući pomoću 0-100% etil acetat / heksani pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (330 mg, 84%). ES/MS (m/e): 590 (M+H).

Sinteza 36

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor- fenil]-5-cijano-piridin-2-karboksamid, (izomer 1)

[0105] N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4- d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (0,180 g, 0,39 mmol, izomer 1) rastvori se u smesi of dihlormetana (2 mL) i DMF (0,25 mL). Potom se dodaju 5-cijanopiridin-2-karboksilna kiselina (114 mg, 0,77 mmol), 1-hidroksibenzotriazol (106 mg, 0,77 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (150 mg, 0,77 mmol) i reakciona smesa se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smesa se razblaži vodom (10 mL), doda se etil acetat (10 mL) i rastvor 1 N NaOH (100 mL). Reakciona smesa se ekstrahuje pomoću EtOAc (2 × 100 mL) i kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim rastvorom natrijum hlorda. Organski sloj se osuši preko MgSO4, filtruje ikoncentruje. Ostatak se prečišćavahromatografijomprekosilika gela koristeći se gradijent 0-100% etil acetat / heksani pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (133 mg, 57%).ES/MS(m/e): 597 (M+H).

Sinteza 37

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-3,5-difluor-piridin-2-karboksamid, (izomer 1)

[0106]

[0107] N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-fluor-fenil)-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il] benzamid (0,180 g, 0,39 mmol, izomer 1) rastvori se u smesi dihlormetana (2 mL) i DMF (0,25 mL). Potom se doda 5-cijanopiridin-2-karboksilna kiselina (114 mg, 0,77 mmol), 1-hidroksibenzotriazol (106 mg, 0,77 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (150 mg, 0,77 mmol) i reakciona smesa meša se na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa se razblaži vodom (10 mL) i doda se etil acetat (10 mL) a zatim se sve sipa u rastvor 1 N NaOH (100 mL). Reakciona smesa se ekstrahuje pomoću EtOAc (2 x 100 mL) organski ekstrakti se kombinuju i isperu zasićenim rastvorom natrijum hlorida. Organski sloj se suši preko MgSO4, filtruje i koncentruje. Ostatak se prečišćava hromatografijom silika gela koristeći gradijent 0-100% etil acetat / heksani pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (190mg,80%). ES/MS (m/e): 608 (M+H).

Primer A

N-[3-[2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazina-il]-4-fluor-fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamid

[0108]

[0109] Smesa N-[3-[2-benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamida (293 mg, 497 µmol), O-metilhidroksilamin hidrohlorida (430 mg, 4,97 mmol) i piridina (402 µL, 4,97 mmol) se zagreva u etanolu (13 mL) to 70 °C u zatvorenom balonu tokom 2,5 sata. Dimetil-sulfoksid (3 mL) se doda i reakciona smesa se zagreva na 70 °C preko noći. Dodatni dimetil-sulfoksid (10 mL) se doda i zagrevanje se nastavi na 70 °C tokom 4 sata. Dodatni O-metilhidroksilamin hidrohlorid (208 mg, 2,48 mmol) i piridin (201 µL, 2,48 mmol) se dodaju i reakciona smesa se zagreva na 60 °C tokom 3 sata i reakciona smesa meša se tokom 3 dana na sobnoj temperaturi. U posebnom balonu, se smesa N-[3

[2-benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7ail]-4-fluor-fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamida (276 mg, 468 µmol), O-metilhidroksilamin hidrohlorida (405 mg, 4,68 mmol) i piridina (478 µL, 4,68 mmol) zagreva u etanolu (15 mL) i dimetil-sulfoksidu (4 mL) na 70 °C u zatvorenom balonu preko noći. Dodatni dimetil-sulfoksid (10 mL) se doda i zagrevanje se nastavi na 70 °C tokom 4 sata. Dodatni O-metilhidroksilamin hidrohlorid (195 mg, 2,34 mmol) i piridin (189 µL, 2,34 mmol) se dodaju i zagrevanje se nastavi na 70 °C tokom 3 sata za čime sledi mešanje smese tokom 3 dana na sobnoj temperaturi. Dve reakcione smese se pomešaju i najveći deo rastvarača se ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava preko SCX kolone koristeći 3:1 dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7 N amonijak u metanolu. Sirovi proizvod se nadalje prečišćava preko silika gela tokom 20 minuta 0,5% to 10% gradijentom 7 N amonijačnim metanolom u dihlormetanu pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (451 mg, 96%). ES/MS (m/e): 486 (M+H).

Primer1

N-{3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4a,5,6,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(4H)-il]fenil}-5-fluorpiridin-2-karboksamid hidrohlorid

[0110]

[0111] Smesa N-[3-[(4aR,7aS)-2-benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamida (320 mg, 560 µmol), O-metilhidroksilamin hidrohlorida (485 mg, 5,60 mmol) i piridina (453 µL, 5,60 mmol) u etanolu (15 mL) se zagreva na 65 °C u zatopljenoj viali tokom pet sati. Reakciona smesa se ohladi i rastvarač se ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 30 minuta gradijentom 0,5% do 10% 7 N amonijačnog metanola u dihlormetanu pri čemu se dobiva N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamid (219 mg, 84%). Ovaj materijal se rastvori u dihlormetanu (1 mL) i metanolu (0,5 mL) i doda se 1 M hlorovodonik u dietil etru (0,47 mL, 470 µmol). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (228 mg, 81%). ES/MS (m/e):468 (M+H).

Primer 2

N-{3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4a,5,6,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a(4H)-il]fenil}-5- metoksipirazin-2-karboksamid hidrohlorid

[0112]

[0113] Smesa od N-[3-[(4aR,7aS)-2-benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil] -5-metoksi-pirazin-2-karboksamida (479 mg, 819 µmol), O-metilhidroksilamin hidrohlorida (709 mg, 8.19 mmol) i piridina (663 µL, 8,19 mmol) u etanolu (20 mL) se zagreva na 50 °C u zatvorenom balonu preko noći. Dimetil-sulfoksid (4 mL) se doda i reakciona smesa se zagreva na 70 °C tokom 4 sata pri čemu se dobiva rastvor. Reakciona smesa se ohladi i najveći deo rastvarača se ukloni in vacuo. Voda se doda i pH se podesi na ∼12 pomoću 1 N natrijum hidroksida. Reakciona smesa se ekstrahuje pomoću etil acetata (5 ×). Objedinjeni organski ekstrakt se suši preko natrijum sulfata, filtruje i rastvarač ukloni in vacuo. Sirovi proizvod se prečišćava preko silika gela tokom 30 minuta gradijentom 0,5% do 10% 7 N amonijačnim metanolom u dihlormetanu. Reakciona smesa se prečišćava ponovo preko SCX kolone koristeći 3:1 dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7 N amonijak u metanolu da bi se uklonio preostali dimetil-sulfoksid. Reakciona smesa se na kraju prečišćava preko silika gel tokom 20 minuta gradijentom 0,5% do 10% 7 N amonijačnim metanolom u dihlormetanu pri čemu se dobiva N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid. Ovaj materijal rastvori se u dihlormetanu (1 mL) i metanolu (0.5 mL) i doda se 1 M hlorovodonik u dietil etru (0,66 mL, 660 mmol). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (329 mg, 78%). ES/MS (m/e): 481 (M+H).

Primer 3

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamid hidrohlorid

[0114]

[0115] Racemski N-[3-[2-amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor- fenil]-5-fluor-piridin-2-karboksamid (451 mg, 929 µmol) se prečišćava preko hiralne SFC kolone (Kolona: Chiralcel OD-H (5 um), 2,1 x 25 cm; eluent: 40 % metanol (0,2 % izopropilamin) u CO2; protok 70 mL/min na UV 225 nm). Analiza izomera koji se prvi eluira: Kolona: Chiralcel OD-H (5 µm), 4,6 x 150 mm; eluent: 40% metanol (0,2% izopropilamin) u CO2; protok 5 mL/min na UV 225 nm potvrđuje enantiomerni višak (>99% ee) enantiomer sa Rt= 1,01 minuta (175 mg, 360 µmol). Ovaj materijal (slobodna baza, izomer 1) rastvori se u dihlormetanu (1 mL) i metanolu (0,5 mL) i doda se 1 M hlorovodonika u dietil etru (0,36 mL, 360 µmoles). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (183 mg, 38%). ES/MS (m/e): 486 (M+H).

Primer 4

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid hidrohlorid

[0116]

[0117] N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][[1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid (0,350 g, 0,58 mmol, izomer 1) rastvori se u THF (2 mL) i potom se dodaju metanol (4 mL) i etanol (4 mL). Reakcionoj smesi se potom dodaju O-metilhidroksilamin hidrohlorid (495 mg, 5,81 mmol) i piridin (470 µL, 5,81 mmol) i reakciona smesa se zatim zagreje to 50 °C i meša preko noći. Silika gel (∼10 g) se doda reakcionoj smesi i ona se koncentruje. Dobiveni uzorak se suši preko silika gela, nanese se na praznu patronu (kolonu) i prečišćava eluirajući gradijentom 0-10% 7 N amonijačnog metanola u dihlormetanu. Dobiveni proizvod se prečišćava po drugi put preko SCX kolone koristeći 3:1 dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7 N amonijačni metanol. Proizvod se prečišćava poslednji put preko silika gela gradijentom 0% do 10% 7 N amonijačnog metanola u dihlormetanu pri čemu se dobiva slobodna baza željenog jedinjenja. Ovaj materijal rastvori se u dihlormetanu (5 mL) i doda 1 M hlorovodonik u dietil etru (0,20 mL, 660 µmol). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (71 mg, 23%). ES/MS (m/e): 498 (M+H).

Primer 5

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5-cijano-piridin-2-karboksamid hidrohlorid

[0118]

[0119] N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-5-cijano-piridin-2-karboksamid (360 mg, 0,59 mmol) rastvori se u etanolu (10 mL) i dihlormetanu (2 mL). Zatim se dodaju O-metilhidroksilamin hidrohlorid (504 mg, 5,91 mmol) i piridin (478 mL, 5,91 mmol) i reakciona smesa meša se na sobnoj temperaturi preko vikenda (70 h). Reakciona smesa se zatim zagreje do 60 °C i meša 24 h. Reakciona smesa se koncentruje pri čemu se dobiva sirovi proizvod i prečišćava silika gel hromatografijom koristeći gradijent 0-10% 7 N amonijačnog metanola u dihlormetanu pri čemu se dobiva slobodna baza željenog jedinjenja. Ovaj materijal se rastvori u dihlormetanu (5 mL) i doda 1 M hlorovodonik u dietil etru (0,54 mL, 540 µmol). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (240 mg, 75%). ES/MS (m/e): 475 (M+H).

Primer 6

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]fenil]-3,5-difluor-piridin-2-karboksamid hidrohlorid

[0120]

[0121] N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][[1,3]tiazin-7a-il]fenil]-3,5-difluor-piridin-2-karboksamid (330 mg, 0,53 mmol) rastvori se u THF (10 mL) i razblaži etanolom (10 mL). Posle toga se doda O-metilhidroksilamin hidrohlorid (453 mg, 5,32 mmol) i piridin (430 µL, 5,91 mmol) i reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi preko vikenda (70 h). Reakciona smesa se zatim zagreje do 60 °C i meša tokom 24 h. Silika gel (∼10 g) se doda reakcionoj smesi i ona se koncentruje. Dobiveni uzorak se prečišćava hromatografijom na silika gelu koristeći gradijent 0-10% 7 N amonijačni metanol u dihlormetanu pri čemu se dobiva slobodna baza željenog jedinjenja. Ovaj materijal se rastvori u dihlormetanu (5 mL) i doda 1 M hlorovodonik u dietil etru (0,49 mL, 490 µmol). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (159 mg, 54%). ES/MS (m/e): 486(M+H).

Primer 7

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-cijano-piridin-2-karboksamid hidrohlorid

[0122]

[0123] N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-5-cijano-piridin-2-karboksamid (133 mg, 0,22 mmol, izomer 1) rastvori se u THF (1 mL) i razblaži metanolom (3 mL) i etanolom (3 mL). Potom se dodaju O-metilhidroksilamin hidrohlorid (190 mg, 2,2 mmol) i piridin (180 µL, 2,2 mmol). Reakciona smesa se zatim zagreje do 50 °C i meša preko noći. Silika gel (∼10 g) se doda reakcionoj smesi i ona se koncentruje. Prečišćavanje se vrši hromatografijom na silika gelu eluirajući gradijentom 0-10% 7 N amonijačnog metanola u dihlormetanu. Dobiveni materijal se prečišćava po drugi put preko SCX kolone koristeći 3:1 smesu dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7N amonijačni metanol. Reakciona smesa se prečišćava na posletku preko silika gela gradijentom 0% do 10% 7 N amonijačni metanol u dihlormetanu pri čemu se dobiva slobodna baza željenog jedinjenja. Ovaj materijal rastvori se u dihlormetanu (5 mL) i doda se 1 M hlorovodonik u dietil etru (0,27 mL, 270 µmol). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (114 mg, 97%). ES/MS (m/e): 493 (M+H).

Primer 8

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-3,5-difluor-piridin-2-karboksamid hidrohlorid

[0125] N-[3-[(4aR,7aS)-2-benzamido-6-(5-fluorpirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirolo[3,4-d][1,3]tiazin-7a-il]-4-fluor-fenil]-3,5-difluor-piridin-2-karboksamid (190 mg, 0,31 mmol, izomer 1) rastvori se u THF (1 mL) i razblaži metanolom (3 mL) i etanolom (3 mL). Potom se dodaju O-metilhidroksilamin hidrohlorid (267 mg, 3,1 mmol) i piridin (253 µL, 3,1 mmol) i reakciona smesa se zatim zagreje do 50 °C i meša preko noći. Reakciona smesa se prečišćava preko SCX kolone koristeći 3:1 dihlormetan:metanol a zatim 2:1 dihlormetan:7 N amonijačni metanol. Materijal se prečišćava još jednom preko silika gela koristeći gradijent 0% do 10% 7 N amonijačni metanol u dihlormetanu pri čemu se dobiva slobodna baza željenog jedinjenja. Ovaj materijal rastvori se u dihlormetanu (5 mL) i doda se 1 M hlorovodonik u dietil etru (0,20 mL, 200 µmol). Rastvarač se ukloni in vacuo pri čemu se dobiva željeno jedinjenje (101 mg, 60%). ES/MS (m/e): 504 (M+H).

Postupci rada sa In vitro esejima:

[0126] Tokom in vitro enzimatskih i celularnih eseja, ispitivana jedinjenja se pripremaju u DMSO gradeći 10 mM standardni rastvor. Standardni rastvor se serijski razblaži u DMSO pri čemu se dobiva kriva razblaženja sa deset tačaka sa finalnim koncentracijama jedinjenja između 10 mM do 0,05 nM na ploči sa 96-bunarčića pre izvođenja in vitro enzimatskih eseja i eseja u ćelijama.

In vitro esej inhibicije proteaze:

Ekspresija humanog BACE1

[0127] Humani BACE1 (broj pristupa: AF190725) cDNA iz mozga se klonira from pomoću RT-PCR. Sekvence nukleotida koje odgovaraju odgovarajućoj sekvenci aminokiselina #1 do 460 se ubacuju u cDNA koja kodira humani IgG1(Fc) polipeptid (Vassar et al. 1999). Ovaj fuzioni protein BACE1(1-460) i humani Fc, imenovan kao huBACE1:Fc, grade pJB02 vektor. Humani BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc) se tranziciono ekspresuje u HEK293 ćelijama. 250 µg cDNA svakog konstrukta se pomeša sa Fugene 6 i doda se 1 litru HEK293 ćelija. Četiri dana posle transfekcije, pažljivo kontrolisani medijum se sakuplja radi prečišćavanja.

Prečišćavanja huBACE1:Fc.

[0128] huBACE1:Fc se prečišćava Protein A hromatografijom. Enzim se čuva na -80 °C u malim alikvotima.

Esej BACE1 FRET

[0129] Serijska razblaženja ispitivanog jedinjenja se pripremaju kako je gore opisano. Jedinjenja se nadalje razblaže 20x u KH2PO4puferu. Deset µL svakog razblaženog rastvora se doda svakom bunarčiću u redovima A do H u odgovarajućoj niskoproteinskoj vezivnoj crnoj ploči koja sadrži<reakcionu smesu (25 µL 50 mM KH>2<PO>4<, pH 4.6, 1 mM TRITON® X-100, 1 mg/mL goveđi serum a>lbumin, i 15 µM of FRET supstrata) (videti Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)). Sadržaj se dobro promeša na mućkalici za ploče tokom 10 minuta. Petnaest µL dve stotine pM humanog BACE1(1-460):Fc (videti Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)) u KH2PO4puferu se doda ploči koja sadrži supstrat i ispitivano jedinjenje da bi se započela reakcija. Snimi se RFU reakcione smese u vremenu 0 na eksticacionoj talasnoj dužini 355 nm i emisionoj talasnoj dužini 460 nm, posle kratkog mućkanja na mućkalici za ploče. Reakciona ploča se pokrije aluminijumsom folijom i čuva u tamnom navlaženom inkubatoru na sobnoj temperaturi tokom 16 do 24 h. Izmeri se RFU na kraju inkubacije na istim eksticacionim i emisionim uslovima korišćenim u vremenu 0. Razlika između RFU u vremenu 0 i na kraju inkubacije predstavlja aktivnost BACE1 kao posledicu delovanja ispitivanog jedinjenja. Razlike u RFU se nanose na grafik u zavisnosti od koncentracije inhibitora i kriva se fituje pomoću logističke jednačine od četiri parametra pri čemu se dobivaju EC50 iIC50vrednosti .(videti Sinha,et al., Nature, 402, 537-540 (2000)).

[0130] Sledeća jedinjenja primerima testirana su u osnovi kako je gore opisano i iskazuju sledeću aktivnost na BACE1:

Tabela 1

[0131] Ovi podaci pokazuju da jedinjenja iz Tabele 1 snažno inhibiraju aktivnost prečišćenog rekombinantnog BACE1 enzima in vitro.

Ćelijski testovi za merenje Inhibicije aktivnosti Beta-sekretaze HEK293Swe Eseja cele ćelije

[0132] Rutinski ćelijski test za određivanje inhibicije aktivnosti beta-sekretaze koristi humanu embrionalnu ćelijsku liniju bubrega HEK293p (ATCC Accession No. CRL-1573) stabilno ekspresujući humanu APP751 cDNA koja sadrži prirodnu dvostruku mutaciju Lys651Met652 u Asn651Leu652, uobičajenog imena Švedska mutacija (imena HEK293Swe) i pokazano je da previše proizvodi Abeta (Citron, et al., Nature, 360, 672-674 (1992)). In vitro testovi redukcije Abeta opisani su u literaturi (videti Dovey, et al., Journal of Neurochemistry, 76, 173-181 (2001); Seubert, et al., Nature, 361, 260 (1993); i Johnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1550-1555 (1997)).

[0133] Ćelije (HEK293Swe na 3.5x10<4>ćelija/bunarčić, koji sadrži 200 µL medijum kulture, DMEM koja sadrži 10% FBS) se inkubiraju na 37 °C tokom 4 do 24 h u prisustvu/odsustvu inhibitora (razblažen sa DMSO) na željenu koncentraciju. Na kraju inkubacije, kondicionirani medijum se analizira na aktivnost beta-sekretaze, na primer, analizom Abeta peptida. Totalni Abeta peptidi (Abeta 1-x) određuju se pomoću sendvič ELISA testa, koristeći monoklonalnu 266 kao antitelo hvatač i biotinilovani 3D6 kao antitelo reporter. Alternativno, Abeta 1-40 i Abeta 1-42 peptidi određuju se sendvič ELISA testom, koristeći monoklonalno 2G3 antitelo hvatač za Abeta 1-40, i monoklonalni 21F12 kao antitelo hvatač za Abeta 1-42. Oba, Abeta 1-40 i Abeta 1-42 ELISA testovi koriste biotinilovani 3D6 kao antitelo reporter. Koncentracije otpuštenog Abeta u kondicionirani medijum kao odgovor na tretman jedinjenjem odgovaraju aktivnosti BACE1 u datim uslovima. Kriva inhibicije Abeta od 10 tačaka se crta i fituje pomoću logističke jednačine od 4-parametra dajući EC50 iIC50vrednosti. Sledeći primeri jedinjenja testirana su u osnovi kako je gore opisano i iskazala su sledeću aktivnost tokom efekta snižavanja Abeta:

Tabela 2

[0134] Navedeni podaci pokazuju da jedinjenja iz Tabele 2 snažno inhibiraju nativnu Abeta produkciju u ćelijama.

PDAPP Neuronski

primarni test

[0135] Potvrđujući test sa celokupnom ćelijom takođe se odvija u primarnim neuronskim kulturama generisanim od PDAPP mišjeg trangenskog embriona. Primarni kortikalni neuroni se pripremaju od Embrionskog Dana 16 PDAPP embriona i gaje u pločama sa 96 bunarčića (15 x 10<4>ćelija/bunarčić u DMEM/F12 (1:1) plus 10% FBS). Posle 2 dana in vitro, medijum kulture se zameni pomoću DMEM/F12 (1:1) bez seruma koja sadrži B27 suplement i 2 µM (krajnja) Ara-C (Sigma, C1768). Na dan 5 in vitro, neuroni se inkubiraju na 37 °C tokom 24 h u prisustvu/odsustvu inhibitora (razblažen u DMSO) na željenoj koncentraciji. Na kraju inkubacije, kondicionirani medijumi se analiziraju na dokazaktivnosti beta-sekretaze, na primer,analizom Abeta peptida. Totalni Abeta peptidi (Abeta 1-x) određuju se sendvič ELISA testom, koristeći monoklonalno266 antitelo hvatač ibiotinilovani 3D6 antitelo reporter. Alternativno, Abeta 1-40 i Abeta 1-42 peptidi se određuju sendvič ELISA testom, koristeći monoklonalno 2G3 antitelo kao hvatač za Abeta 1-40, i monoklonalno 21F12 antitelo kao hvatač za Abeta 1-42. Oba testa, Abeta 1-40 i Abeta 1-42 ELISA-e koriste biotinilovani 3D6 kao antitelo reporter. Koncentracije Abeta oslobođenog u kondicionirani medijum posle dejstva jedinjenja odgovara aktivnosti BACE1 na takvim uslovima. Kriva inhibicije Abeta od 10 tačaka se crta i fituje pomoću logističke jednačine od 4-parametra dajući EC50 i IC50 vrednosti. Sledeći primeri jedinjenja testirana su u osnovi kako je gore opisano i iskazala su sledeću aktivnost tokom efekta snižavanja Abeta:

Tabela 3

[0136] Navedeni podaci pokazuju da jedinjenja iz Tabele 3 snažno inhibiraju nativnu Abeta produkciju u ćelijama.

Inhibicija Beta-Sekretaze in vivo

[0137] Nekoliko životinjskih modela, uljučujući miša, zamorče, psa, i majmuna, mogu se koristiti za skrining inhibicije aktivnosti beta-sekretaze in vivo pod uticajem ispitivanog jedinjenja. Životinje koje se koriste u predmetnom pronalasku mogu biti prirodne, transgenske, ili životinje sa genskim nokautom. Na primer, model miša PDAPP, dobiven kako je to opisano u Games et al., Nature 373, 523-527 (1995), i drugi ne-transgenski ili životinje sa genskim nokautom su korisne za analizu in vivo inhibicije Abeta i sAPPbeta produkcije u prisustvu inhibitorskih jedinjenja. Uopšteno rečeno, u 2 do 12 meseci stare PDAPP miševe, miševe sa genskim nokautom ili ne-transgenske životinje primeni se jedinjenje formulisano u nosačima, kao što su kukuruzno ulje, ciklodekstran, fosfatni puferi, PHARMASOLVE®, ili drugi pogodni nosači. Posle jednog do dvadesetčetiri sata posle primene jedinjenja, životinje se žrtvuju, i mozak kao i cerebrospinalna tečnost i plazma se uklone za analizu Abeta, C99, i sAPP fragmenata. (videti May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).

[0138] Tokom standardnih in vivo farmakoloških studija, životinje se doziraju različitim koncentracijama jedinjenja i porede sa kontrolnom grupom istovremeno doziranom samo sa nosačem. Posle nekog vremena, moždano tkivo, plazma, ili cerebrospinalna tečnost se izoluje iz nekih životinja, počevši od vremena 0 radi određivanja osnovne linije. Jedinjenje ili odgovarajući nosač se primenjuju drugim grupama koje se žrtvuju u različitim vremenskim intervalima posle doziranja. Moždano tkivo, plazma, ili cerebrospinalna tečnost se izoluju iz nekih životinja i analiziraju na prisustvo APP proizvoda razlaganja, uljučujući Abeta peptide, sAPPbeta, i druge APP fragmente, na primer, specifičnim sendvič ELISA testovima. Na kraju perioda trajanja testa, životinje se žrtvuju i moždano tkiva, plazma, ili cerebrospinalna tečnost se analiziraju na prisustvo Abeta peptida, C99, i sAPPbeta, već prema potrebi. Moždana tkiva APP transgenskih životinja mogu se takođe analizirati na količinu beta-amiloidnih naslaga posle tretmana jedinjenjem. "Abeta 1-x peptid" kako se ovde koristi odnosi se na zbir Abeta vrsta koje počinju ostatkom 1 i završava se C-terminusom veći od ostatka 28. Na ovaj način detektuje se većina Abeta vrsta što se naziva "ukupni Abeta".

[0139] Životinje (PDAPP ili drugi APP transgenski ili ne-transgenski miševi) tretirane inhibitorom mogu iskazati snižavanje Abeta ili sAPPbeta u moždanim tkivima, plazmi ili cerebrospinalnim tečnostima i smanjenje beta amiloidnih pločica u mozgu, u poredjenju sa kontrolom tretiranom samo nosačem ili kontrolu u vremenu 0. Na primer, 3 sata posle primene 1, 3, ili 10 mg / kg oralne doze jedinjenja iz Primera 1 mladim ženkama PDAPP miševa, Abeta 1-x peptidni nivoi su sniženi približno 34%, 48%, i 53% u hipokampusu mozga, približno 43%, 59% i 66% u moždanom korteksu, u poređenju sa miševima tretiranim samo nosačem.

[0140] Na primer, 3 sata posle primene 1 ili 3 mg / kg oralne doze jedinjenja iz Primera 3, Abeta 1-x peptidni nivoi su se snizili približno 38% i 50% u hipokampusu mozga, i približno 34% i 53% u korteksu mozga, u poređenju sa miševima tretiranim samo nosačem.

[0141] S obzirom na aktivnost iz Primera 1 i 3 u odnosu na BACE enzim in vitro, ovi efekti smanjenja Abeta su konzistentni sa BACE inhibicijom in vivo, što dalje ukazuje na CNS penetraciju iz Primera 1 i 3.

[0142] Ove studije pokazuju da jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju BACE i stoga su korisna u redukciji Abeta nivoa.

Claims (6)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

   gde R predstavlja H ili F; a A predstavlja:

   ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
2. 2. Jedinjenje ili so prema zahtevu 1 koje je:
3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 2 koje je:
4. 4. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema prema bilo kom od zahteva 1-3 za upotrebu u terapiji.
5. 5. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema prema bilo kom od zahteva 1-3 za upotrebu u terapiji Alzheimer-ove bolesti.
6. 6. Farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema bilo kom od zahteva 1-3 sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, diluenata, ili ekscipijenata.