RS56493B1 - Kompozicija za regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva - Google Patents

Description

Opis

[Oblast tehnike]

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju za regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva.

[Stanje tehnike]

[0002] Fibroza tkiva izaziva se prekomernom proizvodnjom i akumulacijom ekstracelularne matrice u tkivu, koja je uglavnom kolagen. Kada je tkivo oštećeno stimulansom kao što je oksidativni stres, hipoksija, zapaljenje, ili apoptoza, oštećeno tkivo se popravlja menjanjem sa ekstracelularnom matricom, ali u slučaju da je oštećenje ozbiljno ili u slučaju da takva stimulacija postane hronična, akumulacija ekstracelularne matrice postaje prekomerna, i tkivo ne može uspešno da izvede svoju funkciju. Fibroza je prmećena u raznim tipovima organa, kao što je jetra, pankreas, pluća, bubreg, koštana srž, i srce, i smatralo se da kolagen-proizvodeće ćelije kao što su miofibroblasti povezani sa stanjem bolesti. Koncencionalno, smatralo se da je fibroza nepovratan fenomen i da kada tkivo jednom postane fibrozno, ono se ne vraća u svoje prvobitno stanje, ali nedavno, pojavili su se izveštaji koji sugerišu da se fibroza može preokrenuti, i da kada prethodno pomenuti stimulus nestane, ekstracelularna matrica akumulirana u tkivu se smanjuje (videti Ne-patentne dokumente 1 do 3).

[0003] Međutim, postoje detaljni izveštaji koji se objašnjavaju šta se specifično dešava u tkivu nakon što se patološka amukulacija ekstracelularne matrice smanjuje, i do sada je bilo potpuno nepoznato da se regeneracija normalnog tkiva odvija u takvom fibroznom tkivu ili da je regeneracija normalnog tkiva moguća.

[0004] Dalje, fibroza tkiva ne samo da uključuje fibroze za koje je uzrok bolesti jasan i može se ukloniti, kao što je fibroza izvedena iz virusne infekcije, konzumiranja alkohola, droga, itd., već takođe uključuje fibroze kod kojih je direktan uzrok bolesti nejasan, kao što je na primer kriptogena ciroza, idiopatska pulmonarna fibroza, ili idiopatska mijelofibroza, i one kod kojih je direktan uzrok bolesti poznat, ali je poreklo bolesti nejasno ili je teška za uklanjanje, kao što je na primer primarna bilijarna ciroza, nealkoholičarski steatohepatitis (NASH)-izvedena hepatična fibroza, i pimarni sklerozni holangitis. Tkivo sa prisustvom takve fibroze, kod koje je teško ukloniti uzrok bolesti, je u stanju u kojem je uvek izloženo fibroznom stimulusu, ali je do sada bilo potpuno nepoznato da se patološka akumulacija ekstracelularne matrice u takvom fibroznom tkivu može smanjiti, i svakako nepoznato da se takvo tkivo može regenerisati.

[0005] Patentni dokument 1 opisuje an astrocit-specifični nosač leka koji sadrži derivat retinoida i/ili a analog vitamina A kao konstituent; postupak za dostavu leka upotrebom istog; lek koji sadrži istog; i terapeutski postupak sa upotrebom tog leka. Vezivanjem bosača leka sa derivatom retinoida kao što je vitamin A ili analog vitamina A ili njegovim enkapsuliranjem u nosač leka, lek za terapeutsku primenu može se specifično dostaviti do astrocita. Kao rezultat, astrocit-povezana bolest može se efikasno i efektivno inhibirati ili sprečiti minimizirajući sporedne efekte. Kako lek inhibira aktivnost ili rast astrocita, na primer, siRNK protiv HSP47 koji je kolagen-specifičan molekul šaperon, može biti ekapsulirana u drugi nosač. Na taj način, lučenje kolagena tip I do tip IV može se inhibirati u isto vreme i, zauzvrat tome, fibroza može biti efikasno inhibirana. Patentni dokument 2 opisuje postupak za tretiranje bolesti jetre ili oštećenja jetre, koja uključuju, ali se ne ograničava na fibrozu jetre, i/ili pomoć pri oporavku od bolesti jetre, koja uključuje ali se ne ograničava na fibrozu jetre, ili oštećenja jetre nekog subjekta, uključuje transplantaciju humanih mazenhimalnih matičnih ćelija iz pupčane vrpce (HUMSCs) dobijenih od Wharton's Jelly-a, u područje bolesti ili oštećenja jetre tog subjekta. Patentni dokument 3, koji predstavlja stanje tehnike u skladu sa članom 54(3) EPC, opisuje nosač za dostavu neke supstance do ćelija u bubregu koje proizvode ekstracelularnu matricu, pri čemu taj nosač uključuje retinoid kao ciljani agens, agens za tretiranje renalne fibroze koji koristi nosač, proces za njihovu proizvodnju, produkcioni komplet, postupak za tretiranje renalne fibroze koji koristi agens za tretiranje renalne fibroze, itd.

[Dokumenti iz stanja tehnike]

[Ne-patentni dokumenti]

[0006]

[Ne-patentni dokument 1] Issa et al., Gastroenterology.2004; 126(7): 1795-808

[Ne-patentni dokument 2] Iredale, J Clin Invest.2007; 117(3): 539-48

[Ne-patentni dokument 3] Sato et al., Nat Biotechnol.2008; 26(4): 431-42

[Patentni dokument 1] EP 1842557 A1

[Patentni dokument 2] US 2009/232781 A1

[Patentni dokument 3] EP 2583691 A1

[Suština ovog pronalaska]

[Problemi koji se rešavaju ovim pronalaskom]

[0007] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi kompoziciju za terapeutsko regenerisanje normalnog tkiva u tkivu u kojem je prisutna fibroza.

[Sredstvo za rešavanje tih problema]

[0008] Izvođenjem intenzivnog ispitivanja u cilju rešavanja prethodno navedenih nedostataka, pronalazači su pronašli da se čak i u fibroznom tkivu koje kontinuirano prima fibrozni stimulus, kolagen koji je akumuliran u tom tkivu može redukovati a, samim tim, normalno tkivo može se regenerisati iz fibroznog tkiva uklanjanjem kolagena akumuliranog u tkivu čime se obezbeđuje da u njemu ima dovoljno mesta u kojem matične ćelije mogu da rastu i da se diferenciraju, čime se postiže ovaj pronalazak. Kako je prethodno opisano, iako je poznato da kada nestane fibrozni stimulus, može se manjiti ekstracelularna matrica akumulirana u tkivu, do sada je bilo potpuno nepoznato da se u fibroznom tkivu koje kontinuirano prima fibrozni stimulus kolagen akumuliran u tom tkivu može redukovati i da se može regenerisati normalno tkivo iz tog fibroznog tkiva aktivno uklanjajući kolagen akumuliran u tom tkivu, a to su neočekivana otkrića.

[0009] Prema tome, ovaj pronalazak odnosi se na sledeće.

(1) Farmaceutska kompozicija za upotrebu u regeneraciji normalnog tkiva rastom i diferencijacijom matičnih ćelija u prostoru formiranom zbog smanjenja kolagena akumuliranog u fibroznom tkivu, gde to fibrozno tkivo kontinuirano prima fibrozni stimulus, pri čemu ta kompozicija obuhvata kolagen-redukujuću supstancu i retinoid, u kojoj je kolagen-redukujuća supstanca vezana za ili uključena u nosač odabran iz grupe koju čine micela, lipozom, mikrosfera i nanosfera, pri čemu je retinoid vezan za nosač hemijskim i/ili fizčkim postupkom, i pri čemu retinoid specifično dostavlja kolagen-redukujuću supstancu do kolagen-proizvodećih ćelija. (2) Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa (1), u kojoj je kolagen-redukujuća supstanca odabrana iz grupe koju čine supresor proizvodnje kolagena pomoću kolagenproizvodećih ćelija, promoter razgradnje kolagena, i supresor inhibitora razgradnje kolagena. (2) Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa (2), u kojoj je supresor proizvodnje kolagena pomoću kolagen-proizvodećih ćelija odabran iz grupe koju čine TGFβ inhibitor, HGF ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, PPARγ ligand, inhibitor angiotenzina, PDGF inhibitor, relaksin ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, supstanca koja inhibira proizvodnju i lučenje komponente ekstracelularne matrice, supresor ćelijske aktivnosti, supresor ćelijskog rasta, i apoptoza-indukujuća supstanca.

(4) Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa (2), u kojoj promoter razgradnje kolagena predstavlja kolagenazu ili promoter proizvodnje kolagenaze.

(5) Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa (2), u kojoj supresor inhibitora razgradnje kolagena predstavlja TIMP inhibitor.

[Efekti ovog pronalaska]

[0010] U skladu sa ovim pronalaskom, postaje jasno da se normalno tkivo može regenerisati iz fibroznog tkiva, pri čemu do sada nije bilo poznato da se takva regeneracija normalnog tkiva može dogoditi. To omogućava da se normalno tkivo terapeutski regeneriše iz fibroznog tkiva, a nova regenerativna terapija za fibroznu bolest postaje moguća.

[0011] Dalje, u skladu sa ovim pronalaskom, postaje moguće da se tretira fibrozno tkivo koje je kontinuirano izloženo fibroznom stimulusu, a kako je shvaćen mdicinski tretman zasve tipove fibroznih bolesti koje uključuju fibroznu bolest za koju ne postoji ni jedna konvencionalna efektivna terapija i fibroznu bolest za koju jedino postoji tretman koji uključuje transplantaciju organa, može se očekivati ogroman doprinos u medicinskom i veterinarskom lečenju.

[Kratak opisa crteža]

[0012]

[FIG.1] FIG.1 je fotografski dijagram koji pokazuje ukupan izgled jetri sakupljenih iz test pacova i Azanobojene slike njihovih reprezentativnih sekcija.

[FIG.2] FIG.2 je fotografski dijagram koji pokazuje lokalizaciju α-SMA u reprezentativnim sekcijama jetre sakupljenih iz test pacova.

[FIG.3] FIG.3 je fluorescentna slika koja pokazuje lokalizaciju DAPI i GFP na transplantacionim mestima hepatičnih matičnih ćelija.

[FIG.4] FIG.4 pokazuje slike sjajnog polja i GFP fluorescentne slike transplantacionih mesta hepatičnih matičnih ćelija.

[FIG.5A] FIG.5A je fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene GFAP antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi (200× uvećanje).

[FIG.5B] FIG.5B je fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene GFAP antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi (400× uvećanje).

[FIG.6] FIG.6 je 200× uvećan fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene α-SMA antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi.

[FIG.7] FIG.7 je 200× uvećan fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene albumin antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi.

[FIG.8] FIG.8 je 200× uvećan fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene CK19 antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi.

[FIG.9A] FIG.9A je fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene ve-CAD antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi (200× uvećanje).

[FIG.9B] FIG.9B je fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene ve-CAD antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi (400× uvećanje).

[FIG.10] FIG.10 je 200× uvećan fotografski dijagram koji poredi DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene albumin antitelom na mestu VA-lip siRNKgp46-tretirane grupe na kojem nisu transplantirane hepatične matične ćelije.

[FIG.11] FIG.11 je fluorescentna slika koja pokazuje intracelularna distribucija FAM-obeležene siRNK u stelatnim ćelijama pankreasa pacova.

[FIG.12] FIG.12 je grafikon koji pokazuje rezultat FACS analize u odnosu na siRNK inkorporiran u stelatne ćelije pankreasa pacova. Respektivno prikazan u sekvenci od gore prikazani su rezultati netretirane grupe, Lip siRNKgp46-FAM-tretirane grupe, VA-lip siRNKgp46-FAM-tretirane grupe, VA-lip siRNKgp46-FAM RBP antitelo-tretirane grupe, i Lip siRNKgp46-FAM RBP antitelo-tretirane grupe. [FIG.13] FIG.13 je Western blot slika koja pokazuje supresiju ekspresije gp46 u stelatnim ćelijama pankreasa pacova pomoću siRNKgp46. A prikazuje razliku u supresionom efektu u skladu sa VA-lip siRNKgp46 koncentracijom, a B prikazuje trajanje supresionog efekta.

[FIG.14] FIG.14 je grafikon koji pokazuje kvantitativne količine kolagena proizvedenog nakon 72 sati netretiranim ćelijama i ćelijama tretiranim sa svakom od VA-lip siRNKgp46 i VA-lip siRNK nasumična. [FIG.15] FIG.15 je fotografski dijagram koji pokazuje specifičnu dostavu VA-lip siRNKgp46 do stelatnih ćelija pankreasa kod DBTC-tretiranih pacova. A i B su slike imunobojenja anti-α-SMA antitelom i anti-FITC antitelom sekcija pankreasa pacova koji je tretiran tri puta svaki drugi dan sa VA-lip siRNKgp46-FITC i Lip siRNKgp46-FITC respektivno. Slike bojenja a do d na desnoj strani su uvećane slike regiona označenih sa odgovarajućim simbolima na slici bojenja na levoj strani. C prikazuje slike bojenja upotrebom Azan-Mallory bojenja, bojenja anti-α-SMA antitelom, i bojenja anti-FITC antitelom sekcija jetre pacova koji je tretiran tri puta svaki drugi dan sa VA-lip siRNKgp46-FITC. D do F su slike bojenja bojenja sa anti-CD68 antitelom i anti-FITC antitelom pluća, slezine i mrežnjače pacova 24 sata nakon intravenoznog davanja VA-lip siRNKgp46-FITC.

[FIG.16] FIG.16 je dijagram koji pokazuje ekspresiju gp46 proteina u pankreasu 0, 1, 2, 3, i 4 dana nakon VA-lip siRNKgp46 primene kod pacova kojem je VA-lip siRNKgp46 (siRNK 0.75 mg/kg) data 14-tog dana nakon tretiranja sa DBTC. A pokazuje rezultate Western blot analize fragmenata ćelija pankreasa, a B pokazuje rezultat analize kvantitativne koncentracije primenom β-aktina za normalizaciju.

[FIG.17] FIG.17 je dijagram koji pokazuje efekat VA-lip siRNKgp46 u DBTC-indukovanoj fibrozi pankreasa. A prikazuje Azan-Mallory slike bojenja sekcija pankreasa DBTC-tretiranog pacova kome je jedno do VA-lip siRNKgp46, Lip siRNKgp46, i PBS dato 10 puta. B je grafikon koji prikazuje kvantifikaciju komjuterske analize slike regiona koji se pokazuju kao pozitivni u Azan-Mallory slikama bojenja sa A. Podaci su izračinati od 6 polja nasumično ekstrahovanih iz šest pacova iz svake grupe i izraženi kao srednje vrednosti ± standardna devijacija. C je grafikon koji pokazuje sadržaj hidroksiprolina u pankreasu. Podadci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna devijacija.

[FIG.18] FIG.18 je dijagram koji pokazuje efekat VA-lip siRNKgp46 kod DBTC-indukovane fibroze pankreasa. A prikazuje α-SMA slike bojenja pankreasa DBTC-tretiranog pacova nakon tretiranja sa VA-lip siRNKgp46. B je grafikon koji prikazuje kvantifikaciju komjuterske analize slike α-SMA-pozitivnih regiona sa A. Podaci su izračinati od 6 polja nasumično ekstrahovanih iz šest pacova iz svake grupe i izraženi kao srednje vrednosti ± standardna devijacija.

[FIG.19] FIG.19 je dijagram koji pokazuje regeneraciju normalnog tkiva iz fibroznog tkiva pankreasa pomoću VA-lip siRNKgp46. A prikazuje hematoksilin-eozin slike bojenja pankreasa DBTC-tretiranog pacova kome je data VA-lip siRNKgp46 (desno) i Lip siRNKgp46 (levo) 10 puta. Donji dijagrami su uvećani dijagrami svakog regiona a i b sa gornjih dijagrama. B je grafikon koji pokazuje masu pankreasa DBTC-tretiranog pacova.

[FIG.20] FIG.20 je grafikon koji pokazuje efekat na diferencijaciju matičnih ćelija u prisustvu ili odsustvu prostora oko matičnih ćelija. Ordinata prikazuje područje albumin-pozitivne kolonije.

[FIG.21] FIG.21 je grafikon koji pokazuje efekat na diferencijaciju matičnih ćelija u prisustvu ili odsustvu prostora oko matičnih ćelija. Ordinata prikazuje indeks brzine rasta matičnih ćelija.

[Načini izvođenja ovog pronalaska]

[0013] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju, koja sadrži kolagen-redukujuću supstancu, za regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva.

[0014] U ovom pronalasku, 'kolagen-redukujuća supstanca' označava bilo koju supstancu koja može da redukuj količinu kolagena akumuliranog u tkivu. Bez namere da za vezivanjem za bilo koju specifičnu teoriju, kako se kao jedan od razloga akumulacije kolagena u fibroznom tkivu smatrao pomeraj u balansu između proizvodnje i rastvaranja kolagena do proizvodne strane, kolagen-redukujuća supstanca može da uključi ne samo supresor proizvodnje kolagena, već i promoter rastvaranja kolagena i supresor inhibitora promotera rastvaranja kolagena. Prema tome, primeri kolagen-redukujuće supstance uključuju supresor proizvodnje kolagena pomoću kolagen-proizvodećih ćelija, promoter razgradnje kolagena, i supresor inhibitora razgradnje kolagena. Iako ne postoji neko određeno ograničenje, kolagen u ovom pronalasku poželjno je kolagen uključen u fibrozi kao što je na primer kolagen tip I, III, ili V, i naročito poželjan kolagen tip I, koji je prisutan u fibroznom tkivu u najvećoj količini.

[0015] U ovom pronalasku, kolagen-proizvodeće ćelije označavaju bilo koje ćelije koje proizvode kolagen u fibroznom tkivu, a primeri uključuju aktivirane stelatne ćelije i miofibroblaste. Smatralo se da su aktivirane stelatne ćelije i miofibroblasti glavni izvori proizvodnje kolatgena u fibroznom tkivu, a one su okarakterisane ekspresijom α-SMA (α-aktin glatkih mišića). Prema tome, aktivirane stelatne ćelije i miofibroblasti u ovom pronalasku identifikovani su pomoću imunobojenja, itd. primenom anti-α-SMA antitela koje je detektabilno obeleženo.

[0016] Supresor proizvodnje kolagena pomoću kolagen-proizvodećih ćelija uključuje bilo koju supstancu koja direktno ili indirektno suzbija fizičke, hemijske, i/ili fiziološke aktivnosti itd. istih ćelija uključenih u akumulaciju kolagena u fibroznom tkivu, a njihovi primeri uključuju TGFβ (Transformišući faktor rastabeta) inhibitor, HGF (Hepatocitni faktor rasta) ili neku supstancu koja promoviše njihovu proizvodnju, PPARγ (Peroksisomski proliferator-aktiviran gama receptor) ligand, inhibitor angiotenzina, PDGF (Trombocitni faktor rasta) inhibitor, relaksin ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, supstanca koja inhibira proizvodnju i lučenje komponente ekstracelularne matrice, supresor ćelijske aktivnosti, supresor ćelijskog rasta, i apoptoza-indukujuća supstanca.

[0017] Primeri TGFβ inhibitora uključuju skraćeni TGFβ receptor tip II (Qi et al., Proc Natl Acad Sci USA.

1999; 96 (5): 2345-9), rastvorljiv TGFβ receptor tip II (George et al., Proc Natl Acad Sci USA.1999; 96 (22): 12719-24), inhibitor TGFβ aktivnosti kao što je anti-TGFβ antitelo, inhibitor proizvodnje TGFβ kao što je RNKi molekul, ribozim, ili antisens nukleinska kiselina komplementarna sa TGFβ, vektori koji ih eksprimiraju, i ćelije transformisane na taj način. U jednom ostvarenju ovog pronalaska, TGFβ inhibitor inhibira aktivnost i/ili proizvodnju TGFβ1.

[0018] Primeri supstanci koje promovišu proizvodnju HGF ili relaksina uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira HGF ili relaksin, ekspresioni konstrukt koji je sadrži, ekspresione vektore koji ih sadrže, i ćelije transformisane na taj način.

[0019] Primeri PPARγ liganda uključuju endogeni ligand kao što je 15-deoksi-Δ12,14-prostaglandin J2, nitrolinolna kiselina, oksidovani LDL (Lipoprotein male gustine), masnu kiselinu dugog lanca, ili eikozanoid, i egzogeni ligand kao što je tiazolidindion medicinski agens kao što je troglitazon, pioglitazon, roziglitazon, balaglitazon ili rivoglitazon, ili ne-steroidni anti-zapaljenski lek.

[0020] Primeri inhibitora angiotenzina uključuju antagonist receptora angiotenzina kao što je telmisartan, losartan, valsartan, kandesartan cileksetil, olmesartan medoksomil, ili irbesartan.

Angiotenzin uključuje angiotenzine I, II, III, i IV. Dalje, primeri receptora angiotenzina uključuju receptor angiotenzina tip 1 (AT1).

[0021] Primeri PDGF inhibitora uključuju inhibitor PDGF aktivnosti kao što je anti-PDGF antitelo, inhibitor PDGF proizvodnje kao što je RNKi molekul, ribozim, ili antisens nukleinska kiselina komplementarna sa PDGF, vektori koji ih eksprimiraju, i ćelije transformisane na taj način.

[0022] Primeri supstance koja inhibira proizvodnju i lučenje komponente ekstracelularne matrice uključuju supstancu, kao što je RNKi molekul, ribozim, ili antisens nukleinska kiselina, koja suzbija ekspresiju komponente ekstracelularne matrice kao što je kolagen, proteoglikan, tenascin, fibronectin, trombospondin, osteopontin, osteonektin, ili elastin, supstanca koja ima dominantan negativan efekat kao što je dominantan negativan mutant, vektori koji ih eksprimiraju, i ćelije transformisane na taj način. Primeri lekova koji inhibiraju proizvodnju i lučenje kolagena uključuju inhibitore HSP (Protein toplotnog šoka) 47, koji je kolagen-specifični molekulski šaperon c ya intracelularni transport i molekulsko sazrevanje uobičajeno za sintetičke procese za razne vrste kolagena, na primer inhibitori HSP47 ekspresije kao što su RNKi molekul, ribozim, ili antisens nukleinska kiselina komplementarna sa HSP47, supstanca koja ima dominantan negativan efekat kao što je HSP47 dominantan negativan mutant, vektori koji ih eksprimiraju, i ćelije transformisane na taj način.

[0023] Primeri supresora ćelijskog rasta uključuju alkilirajući agens (npr. ifosfamid, nimustin, ciklofosfamid, dakarbazin, melfalan, ranimustin, itd.), antitumor antibiotik (npr. idarubicin, epirubicin, daunorubicin, doksorubicin, pirarubicin, bleomicin, peplomicin, mitoksantron, mitomicin C, itd.), antagonist metabolizma (npr. gemcitabin, enocitabin, citarabin, tegafur-uracil, tegafur-gimeracil-oteracil kalijum kombinovani lek, doksifluridin, hidroksikarbamid, fluorouracil, metotreksat, merkaptopurin, itd.), alkaloid kao što je etopozid, irinotekan, vinorelbin, docetaksel, paklitaksel, vinkristin, vindesin, ili vinblastin, platinasti kompleks kao što je karboplatin, cisplatin, ili nedaplatin, i statin kao što je lovastatin ili simvastatin.

[0024] Primeri supresora ćelijske aktivnosti uključuju inhibitor natrijumskih kanala.

[0025] Primeri apoptoza-indukujuće supstance uključuju jedinjenje 861, gliotoksin, i atorvastatin.

[0026] Primeri promotera razgradnje kolagena uključuju razne tipove kolagenaze i supstancu koja promoviše njihovu proizvodnju. Primeri kolagenaze uključuju MMP familiju, kao što je MMP (Matrica metaloproteinaze) 1, 2, 3, 9, 13, i 14. Primeri promotera proizvodnje kolagenaze uključuju nukleinsku kiselinu koja kodira kolagenazu, ekspresioni konstrukt koji je sadrži, ekspresione vektore koji ih sadrže, i ćelije transformisane na taj način.

[0027] Primeri inhibitora promotera rastvaranja kolagena uključuju TIMP (Inhibitor tkiva metaloproteinaze, TIMP1 i TIMP2, itd.). Prema tome, primeri supresora gore naznačenog inhibitora uključuju inhibitor TIMP aktivnosti kao što je antitelo TIMP, inhibitor TIMP proizvodnje kao što je RNKi molekul, ribozim, ili antisens nukleinska kiselina komplementarnu sa TIMP, vektori koji ih eksprimiraju, i ćelije transformisane na taj način.

[0028] RNKi molekul u ovom pronalasku uključuje RNK kao što je siRNK (mala interferirajuća RNK), miRNK (mikro RNK), shRNK (mala RNK u obliku ukosnice), ddRNK (DNK-usmerena RNK), piRNK (Piwiinteraktivna RNK), rasiRNK (ponovljena povezana siRNK), i njihove modifikacije. Dalje, nukleinska kiselina u ovom pronalasku uključuje RNK, DNK, PNK, i njihove kompozite.

[0029] U ovom pronalasku, 'fibrozno tkivo' označava tkivo u kojem se ekstracelularna matrica, uglavnom kolagen, akumulira u količini večoj od normalne. Pored kolagena, primeri ekstracelularne matrice uključuju proteoglikan, tenascin, fibronectin, trombospondin, osteopontin, osteonektin, i elastin. Količina kolagena koja je akumulirana u tkivu može se kvantifikovati na primer primenom kolilčine hidroksiprolina u tkivu kao indikator ili podvrgavanjem tkiva bojenju kolagena (npr. Masson trichrome bojenje, Azan bojenje, sirius red bojenje, Elastica van Gieson bojenje, itd.) i izvođenjem analize slike. Količina ekstracelularne matrice u fibroznom tkivu u ovom pronalasku može iznositi najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 25%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, ili najmanje 500% u poređenju sa normalnim tkivom. Kako se smatra da proizvodnja kolagena aktiviranim stelatnim ćelijama i/ili miofibroblastima doprinosi fibrozi tkiva, fibrozno tkivo u ovom pronalasku tipično sadrži aktivirane stelatne ćelije i/ili miofibroblaste. Fibrozno tkivo može biti bilo koje tkivo u telu dokle god ima prethodno opisane karakteristike, a njihovi primeri uključuju jetru, pankreas, pluća, bubreg, koštanu srž, glasne žice, grkljan, usnu šupljinu, srce, slezinu, medijastinum, retroperitoneum, matericu, kožu, mlečnu žlezdu, i intestinalni trakt.

[0030] Prema tome, fibrozno tkivo može biti pogođeno područje u raznim fibrozama organa. Primeri fibroze organa uključuju hepatičnu fibrozu, hepatičnu cirozu, formiranje ožiljaka na glasnim žicama, fibrozu sluznice glasnih žica, fibrozu grkljana, pulmonarnu fibrozu, fibrozu pankreasa, mijelofibrozu, mijokardijalni infarkt, fibrozu mijokardijuma praćeno miokardijalnim infarktom, mijokardijalnu fibrozu, endomijokardijalnu fibrozu, fibrozu slezine, medijastinalnu fibrozu, fibrozu jezične submukoze, intestinalnu fibrozu (npr. koja je povezana sa zapaljenskom bolešću creva, itd.), retroperitonealnu fibrozu, fibrozu materice, sklerodermu, i fibrozne bolesti dojki.

[0031] Hepatična fibroza i hepatična ciroza u ovom pronalasku uključuju ne samo one izazvane virusnom infekcijom sa hepatitis B ili C virusom, konzumiranjem alkohola, masnom jetrom, parazitskom infekcijom, urođenoim metaboličkim abnormalnostima, hepatotoksičnom supstancom, itd., već i one za koje uzrok nije specificiran. Prema tome, primeri hepatične ciroze u ovom pronalasku uključuju Charcotovu cirozu, Todd-ovu cirozu, primarnu bilijarnu cirozu, unilobarnu cirozu, sekundarnu bilijarnu cirozu, opstruktivnu cirozu, holangiolitičku cirozu, bilijarnu cirozu, atrofičnu cirozu, cirozu ishrane, postnekrotičnu cirozu, posthepatitičnu cirozu, nodularnu cirozu, kombinovanu cirozu, mikronodularnu cirozu, kompenzovanu cirozu, makronodularnu cirozu, septalnu cirozu, kriptogenu cirozu, dekompenzovanu cirozu, periportalnu cirozu, portalnu cirozu, i alkoholičarsku cirozu.

[0032] Pulmonarna fibroza u ovom pronalasku uključuje ne samo pulmonarnu fibrozu u striktnom značenju već i pulmonarnu fibrozu u širem smislu, koja uključuje zajedničko postojanje sa intersticijalnom upalom pluća. Pulmonarna fibroza u ovom pronalasku može biti izazvana bilo kojom intersticijalnom upalom pluća kao što je na primer infektivna intersticijalna upala pluća povezana sa virusnom upalom pluća, gljivičnom upalom pluća, mikoplazmatskom upalom pluća, itd., intersticijalna upala pluća povezana sa kolagenskom bolešću kao što je reumatoidni artritis, sistemska skleroderma, dermatomiozitis, polimiozitis, kombinovana bolest vezivnog tkiva (MCTD, kombinovana bolest vezivnog tkiva), intersticijalna upala pluća povezana sa izlaganjem radijaciji, intersticijalna upala pluća indukovana supstancom kao što je antikancer agens kao što je bleomicin, Kineski biljni lek kao što je Sho-saiko-to, interferon, antibiotik, ili parakvat, ili idiopatska intersticijalna upala pluća kao što je idiopatska pulmonarna fibroza, nespecifična intersticijalna upala pluća, akutna intersticijalna upala pluća, kriptogena organizaciona upala pluća, intersticijalna pluća bolest povezana sa respiratornim bronhiolitisom, deskvamaciona intersticijalna upala pluća, ili limfocitna intersticijalna upala pluća, te prema tome, pulmonarna fibroza u ovom pronalasku uključuje one kod kojih je intersticijalna upala pluća postala hronična.

[0033] Mijelofibroza u ovom pronalasku uključuje ne samo pimarnu mijelofibrozu već i sekundarnu mijelofibrozu. Primeri sekundarne mijelofibroze uključuju one koje su sekundarne u bolestima kao što je akutna mijeloidna leukemija, akutna leukemija limfoblasta, hronična mijeloidna leukemija, policitemija vera, pimarna trombocitemija, mijelodisplastični sindrom, multiple mijeloma, maligni limfom, karcinom, sistemski lupus eritematozus, ili progresivna sistemska skleroza, ili nakon izlaganja radijaciji.

[0034] Fibroza bubrega u ovom pronalasku može biti izazvana bilo kojim intersticijalnim nefritisom kao što je na primer infektivni intersticijalni nefritis povezan sa streptokoknim nefritisom, stafilokoknim nefritisom, pneumokoknim nefritisom, virusnim nefritisom povezanim sa varičelama, hepatitisom B, hepatitisom C, HIV-om, itd., nefritis izazvan parazitskom infekcijom malarija, gljivični nefritis, nefritis mikoplazme, itd., intersticijaln nefritis povezan sa bolestima kolagena kao što je sistemski lupus eritematozus (lupus nefritis), sistemska skleroderma (kolagenska bolest bubrega), ili Sjogren-ov sindrom, nefritis povezan sa imunološkom bolešću krvnih sudova kao što je purpura nefritis, poliarteritis, rapidno progresivni glomerulonefritis, itd., intersticijalni nefritis povezan sa izlaganjem radijaciji, intersticijalni nefritis indukovan supstancom kao što je supstanca zlata, NSAID, penicilamin, antikancer agens kao što je bleomicin, antibiotik, ili parakvat, itd., alergijski nefritis izazvan ujedom insekta, polenom, ili biljkom iz familije Anacardiaceae, amiloidoza nefritis, dijabetska nefropatija, hronični glomerulonefritis, nefritis povezana sa malignom nefrosklerozom ili bolešću policističnih bubrega, tubulointersticijalni nefritis, nefritis povezan sa gestacijskom toksikozom ili kancerom, membranoproliferativni glomerulonefritis, nefritis IgA nefropatije, kombinovani krioglobulinemični nefritis, nefritis Goodpasture-ov sindroma, Vegenerov granulomatozni nefritis, ili idiopatski intersticijalni nefritis kao što je akutni intersticijalni nefritis, itd., te prema tome, fibroza bubrega u ovom pronalasku uključuje one u kojima je prethodno pomenuti intersticijalni nefritis postao hroničan.

[0035] U ovom pronalasku, fibrozno tkivo je ono koje kontinuirano prima fibrozni stimulus. U ovom pronalasku, fibrozni stimulus označava bilo koju stimulus koji indukuje fibrozu, a primeri uključuju oksidativni stres, hipoksiju, zapaljenje, i apoptozu (videti Ghiassi-Nejad et al., Expert Rev Gastroenterol Hepatol.2008; 2(6): 803-16). Primeri takvog tkiva uključuju fibrozno tkivo koje je pod hroničnim zapaljenjem i tkivo koje je kontinuirano izloženo citotoksičkoj supstanci (npr. tkivo jetre kod kojeg je holestaza izazvana bolešću žučnog kanala, itd.). Dalje, takvo tkivo takođe uključuje tkivo pogođeno fibrozom za koju nije jasan direktan uzrok bolesti, kao što je na primer kriptogena ciroza, idiopatska pulmonarna fibroza, ili idiopatska mijelofibroza, itd., ili pogođeno onom za koju je poznat direktan uzrok bolesti, ali nije jasno poreklo uzroka bolesti ili se teško otklanja, kao što je na primer primarna bilijarna ciroza, hepatične fibroza izazvana nealkoholičarskim steatohepatitisom (NASH), pimarni sklerozni holangitis, idiopatska pulmonarna fibroza, pulmonarna fibroza izvedean od idiopatske intersticijalne upale pluće, pimarna mijelofibroza, fibroza bubrega izvedena od idiopatskog intersticijalnog nefritisa, zapaljenska bolest creva (npr. Kronova bolest, ulcerativni kolitis, itd.), ili sistemska scleroderma, itd.

[0036] U ovom pronalasku, 'regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva' znači sledeće: kako fibroza napreduje, tkivo se zamenjuje fibroznim tkivom, koji je uglavnom ekstracelularna matrica, a regeneracija normalnog tkiva iz fibroznog tkiva u ovom pronalasku namenjena je da preokrene prethodno navedeni tok i zameni proliferirano fibrozno tkivo sa originalnim normalnim tkivom. Prema tome, regeneracija normalnog tkiva iz fibroznog tkiva u ovom pronalasku uključuje ne samo potpuno obnavljanje fibroznog tkiva u prvobitno stanje već i delimično obnavljanje fibroznog tkiva u prvobitno stanje. Stepen regeneracije normalnog tkiva može se proceniti histološkim pregledom uzorka biopsije, itd. na osnovu normalizacije strukture tkiva, smanjenja regiona popunjenog fibroznim tkivom, povećanja regiona popunjenog normalnim tkivom, itd., ili kada je abnormalnost biohemijskog indeksa usled fibroze rimećen pre tretiranje ovom kompozicijom, procena se može izvesti na osnovu poboljšanja tog indeksa, itd.

[0037] U skladu sa ovim pronalaskom, regeneracija normalnog tkiva izvodi se rastom i diferencijacijom matičnih ćelija u prostoru koji je formiran zbog smanjenja kolagena akumuliranog u fibroznom tkivu. Prema tome, ovaj pronalazak odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja služi za regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva u prostoru za rast i diferencijaciju matičnih ćelija, pri čemu se taj prostor formira smanjenjem kolagena akumuliranog u fibroznom tkivu. Ovde, primeri matičnih ćelija uključuju one koje su prvobitno prisutne u tkivu koji je postalo fibrozno (hepatične matične ćelije, matične ćelije pankreasa, matične ćelije pluća, matične ćelije bubrega, matične ćelije koštane srži, matične ćelije srca, matične ćelije slezine, matične ćelije materice, matične ćelije kože, mlečne matične ćelije, intestinalne matične ćelije, mezenhimalne matične ćelije, itd.), one koje su prebačene iz drugog dela u telu i, dalje, one koje su terapeutski primenjene. Štaviše, 'prostor' uključuje ne samo šupljinu unutar tkiva već i prostor sa prostorijom u kojoj se ćelije mogu uvećati i rasti kao što je na primer prostor u kojem je pritisak između ćelija smanjen ili prostor koji je fleksibilan.

[0038] Kompozicija ovog pronalaska dalje sadrži retinoid. Iz razloga što sadrži retinoid, omogućena specifična dostava do kolagen-proizvodeće ćelije, koje su ciljane ćelije, kolagen-redukujuće supstance koja je ciljana za kolagen-proizvodeće ćelije kao što je, na primer, supstanca koja inhibira proizvodnju i lučenje komponente ekstracelularne matrice, HGF ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, MMP ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, TIMP inhibitor, inhibitor TGFβ proizvodnje, relaksin ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, itd., čime se pojačava efekat kolagenredukujuće supstance koja se koristi.

[0039] Iako mehanizam u kojem se izvodi ciljanje pomoću retinoida još uvek nije razjašnjen, pretpostavlja se primera radi da je retinoid koji se vezuje specifično za RBP (Retinol vezujući protein) inkorporiran u kolagen-proizvodeću ćeliju u fibroznom tkivu preko određenog tipa receptora pozicioniranog na površini ćelije. Sposobnost retinoida da funkcioniše kao ciljajući agens za kolagenproizvodeće ćelije opisana je u WO 2006/068232, JP, A, 2009-221164, JP, A, 2010-59124, itd.

[0040] Retinoid je jedan član grupe jedinjenja koja imaju kostur u kojem su četiri izoprenoid jedinice povezane na glava-ka-repu način (videti G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents", 2nd Ed. Portland Press, pp.247-251 (1992)), a vitamin A je generički deskriptor za retinoid koji kvalitativno pokazuje biološku aktivnost retinola. Primeri retinoida koji se mogu primeniti u ovom pronalasku uključuju retinol (koji uključuje sve-trans retinol), retinal, retinoinsku kiselinu (koja uključuje tretinoin), estar retinola i masne kiseline, estar alifatičnog alkohola i retinoinske kiseline, derivat retinoida kao što je etretinat, izotretinoin, adapalenz, acitretin, tazarotenz, ili retinil palmitat, i analog vitamina A kao što je fenretinid (4-HPR) ili beksaroten.

[0041] Među njima, retinol, retinal, retinoinska kiselina, estar retinola i masne kiseline (npr. retinil acetat, retinil palmitat, retinil stearat, i retinil laurat, itd.), i estar alifatičnog alkohola i retinoinske kiseline (npr. etil retinoat, itd.) poželjni su u smislu efiksnosti specifične dostave supstance do kolagenproizvodećih ćelija u fibroznom tkivu.

[0042] Svi izomeri, koji uključuju cis/trans retinoide, uključeni su u obim ovog pronalaska. Retinoid može biti supstituisan jednim ili više supstituenata. Retinoid u ovom pronalasku uključuje ne samo onaj u izolovanom stanju, već i retinoid u stanju u kojem je rastvoren ili umešan u medijumu koji ga može rastvoriti ili ga zadržati. U skladu sa ovim pronalaskom, retinoid se vezuje za nosač koji sadrži kolagenredukujuću supstancu, kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0043] Prethodno pomenuta kompozicija ovog pronalaska može da sadrži komponentu koja sačinjava nosač koja je različita od gore navedenog. Komponenta koja sačinjava nosač u ovom opisu nije naročito ograničena; može se primeniti bilo koja komponenta koja je poznata u medicinskom/farmaceutskom polju, pod uslovom da je ona za koju je moguće najmanje vezivanje sa retionoidom.

[0044] Primeri takve komponente uključuju lipid, na primer, fosfolipid kao što je a glicerofosfolipid, sfingolipid kao što je sfingomijelin, sterol kao što je holesterol, biljno ulje kao što je sojino ulje ili ulje makovog zrnal, mineralno ulje, lecitin kao što je lecitin iz žumanca, i polimer. Među njima, poželjan je onaj koji može da formira lipozom, kao što je na primer prirodni fosfolipid kao što je lecitin, polusintetički fosfolipid kao što je dimiristoilfosfatidilholin (DMPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), ili distearoilfosfatidilholin (DSPC), dioleilfosfatidiltanolamin (DOPE), dilauroilfosfatidilholin (DLPC), ili holesterol.

[0045] Naročito je poželjna komponenta koja može da zaobiđe hvatanje od strane retikuloendotelijalnog sistema, a njeni primeri uključuju katjonske lipide kao što je N-(αtrimetilamonioacetil)-didodecil-D-glutamat hlorid (TMAG), N,N',N'',N'''-tetrametil-N,N',N'',N'''-tetrapalmitilspermin (TMTPS), 2,3-dioleiloksi-N-[2(sperminkarboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminijum trifluoroacetat (DOSPA), N-[1-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), dioktadecildimetilamonijum hlorid (DODAC), didodecilamonijum bromid (DDAB), 1,2dioleiloksi-3-trimetilamoniopropan (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)karbamoil]holesterol (DC-hol), 1,2-dimiristoiloksipropil-3-dimetilhidroksietilamonijum bromid (DMRIE), i O, O'-ditetradekanoil-N-(α-trimetilamonioacetil)dietanolamin hlorid (DC-6-14). U skladu sa ovim pronalaskom, prethodno pomenuti nosač ima 3-dimenzionalni oblik odabran iz grupe koju čine micela, lipozom, mikrosfera, i nanosfera.

[0046] Vezivanje retinoida sa nosačem izvodi se hemijskim i/ili fizčkim postupkom. Vezivanje aktivnog sastojka za nosač ili njegovo uključivanje u nosač takođe se može izvesti umešavanjem aktivnog sastojka i komponente koja konstituiše nosač. Količina retinoida u kompoziciji ovog pronalaska može biti na primer 0.01 do 1000 nmol/µL, a poželjno 0.1 do 100 nmol/µL. Dalje, količina aktivnog sastojka u kompoziciji ovog pronalaska može biti na primer 1 do 10000 ng/µL, a poželjno 10 do 1000 ng/µL, ili 1 do 1000000 µg/kg telesne mase, a poželjno 10 do 100000 µg/kg telesne mase. Količine retinoida i aktivnog sastojka mogu, u nekim slučajevima, biti izvan navedenih opsega u zavisnosti od aktivnosti ovih komponenti, putanje primene kompozicije, učestalosti primene, subjekta kome se daju, itd., a ti slučajevi su takođe uključeni u obim ovog pronalaska. Vezivanje retinoida i/ili aktivnog sastojka za nosač ili uključivanje aktivnog sastojka u nosač može biti izvedeno pre smeštanja aktivnog sastojka na nosač, može biti izvedeno jednovremenim umešavanjem komponente koja konstituiše nosač, retinoida, i aktivnog sastojka, ili može biti izvedeno umešavanjem nosača sa već u njega ugrađenim aktivnim sastojkom, i retinoida. Prema tome, ovde je takođe opisan postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije za regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva, koji uključuje fazu vezivanja retinoida za bilo koji lek-vezujući nosač ili lek-enkapsulirajući nosač, na primer, lipozomski preparat kao što je DaunoXome<(R)>, Doxil, Caelyx<(R)>, ili Myocet<(R)>.

[0047] Kompozicija ovog pronalaska je u nekom obliku tako da se željeni aktivni sastojak može transportovati do kolagen-proizvodećih ćelija u fibroznom tkivu kao meta. Oblik se bira iz grupe koju čine micela, lipozom, mikrosfera, i nanosfera. U ovom pronalasku, sa stanovišta velike efikasnosti dostave, širokog izbora supstanci koje se dostavljaju, lakoće pripreme, itd., među pomenutim poželjan je oblik lipozoma, a katjonski lipozom koji sadrži katjonski lipid naročito je poželjan. Kada je kompozicija u obliku lipozoma, molarni odnos retinoida i lipozom-konstituišućeg lipida poželjno je 8:1 do 1:4, a poželjnije 4:1 do 1:2, uzimajući u obzir efikasnost vezivanja retinoida za nosač ili njegovo uključivanje u nosač.

[0048] Kompozicija ovog pronalaska može da sadrži aktivni sastojak u unutrašnjosti, može da ima aktivni sastojak prikačen za spoljašnjost, ili može biti umešan sa aktivnim sastojkom kako je specificirano u patentnom zahtevu 1. Prema tome, kompozicija ovog pronalaska može biti u obliku kompleksa između lipozoma i aktivnog sastojka, koji je lipopleks; u zavisnosti od putanje primene, načina na koji se oslobađa lek, itd., kompozicija može biti obložena pogodnim materijalom kao što je na primer enterična obloga ili materijal koji se vremenom dezintegriše, ili može biti inkorporirana u pogodan sistem za oslobađanje leka.

[0049] Retinoid je prisutan u obliku u kojem funkcioniše tako da kompozicija koji sadrži retinoid dolazi do i/ili se inkorporira u kolagen-proizvodeću ćeliju, koja je ciljana ćelija, u fibroznom tkivu pri većoj brzini i/ili u većoj količini od kompozicije koja ne sadrži retinoid, a ovo može lako biti potvrđeno na primer dodavanjem obeležene ili kompozicije koja sadrži obeleživač, kulturi ciljanih ćelija i analiziranjem mesta u kojima je obeleživač prisutan kada prođe prethodno određeno vreme. U smislu strukture, na primer, ukoliko je retinoid najmanje delimično izložen spoljašnjosti kompozicije najkasnije pre dostizanja ciljanje ćelije, prethodno pomenuti zahtevi mogu biti zadovoljeni. Bilo da renidoid jeste ili nije izložen spoljašnjosti kompozicije, on može biti procenjen dovođenjem u kontakt kompozicija sa supstancom koja se specifično veziju za retinoid, na primer, retinol-vezivajući protein (RBP), itd., i ispitivanjem vezivanja za kompoziciju.

[0050] Najmanje delimično izlaganje retinoida spoljašnjosti kompozicije najmanje pre nego što on dođe do ciljane ćelije može biti izvedeno na primer podešavanjem odnosa sastavljanja retinoida i nosačkonstituišuće komponente. Dalje, kada se lipidna struktura kao što je lipozom koristi kao nosač, na primer, kada se formira kompleks između lipidne strukture i retinoida, može se koristiti postupak u kojem se lipidna struktura prvo razblažava u vodenom rastvoru, a to se zatim dovodi u kontakt, umešava, itd., sa retinoidom. U ovom slučaju, retinoid može biti u stanju u kojem se rastvara u rastvaraču, na primer, organskom rastvaraču kao što je DMSO. Lipidna struktura o kojoj se ovde govori označava bilo koju 3-dimenzionalnu strukturu, na primer, strukturu sa linearnim, flimastim, sferičnim, itd. oblikom, a koja sadrži lipid kao konstituentnu komponentu, a njeni primeri uključuju lipozom, micelu, lipidnu mikrosferu, i lipidnu nanosferu. Mogućnost nanošenja na neki drugi nosač leka istog ciljajućeg agensa kao onaj koji je primenjen za ciljanje lipozoma opisano je na primer u Zhao i Lee, Adv Drug Deliv Rev.2004; 56 (8) : 1193-204, Temming et al., Drug Resist Updat.2005; 8(6): 381-402, itd.

[0051] Pored kolagen-redukujuće supstance, kompozicija ovog pronalaska može da sadrži supstancu koja redukuje fibrozni stimulus kao aktivni sastojak, ili se može upotrebiti u kombinaciji sa takvom supstancom. Primeri supstance koja redukuje fibrozni stimulus uključuju antioksidans, promoter cirkulacije krvi, anti-zapaljenski lek, antivirusni lek, antibiotik, antiparazitski agens, lek koji štiti jetru, a holeretični lek, i supresor apoptoze. Ove supstance mogu se odabrati kao pogodne u skladu sa tkivom koje je ciljano i stanja bolesti.

[0052] Kompozicija ovog pronalaska može da sadrži obeleživač. Obeležavanje omogućava praćenje uspeha/neuspeha dosatave do ciljanih ćelija, povećanja/smanjenja ciljanih ćelija, itd., i korisno je ne samo na nivou testiranja i ispitivanja već i na kliničkom nivou. Obeleživač može biti odabran od bilo kog obeježivača poznatog stručnjaku iz ove oblasti, kao što je na primer bilo koji radioizotop, magnetski materijal, supstanca koja se vezuje za obeleženu supstancu (npr. antitelo), fluorescentna supstanca, fluorofor, hemiluminescentna supstanca, ili enzim. Obeležavanje može biti pričvršćeno za najmanje jedan konstituent komponente kompozicije ovog pronalaska; na primer, može biti pričvršćen za jedan ili više od aktivnog sastojka, retinoida, i nosač-konstituišuće komponente, ili to obeležavanje može biti sadržano u kompoziciji kao komponenta različita od gore navedenih.

[0053] Izraz 'za kolagen-proizvodeće ćelije u fibroznom tkivu' ili 'za dostavu do kolagen-proizvodećih ćelija u fibroznom tkivu' u ovom pronalasku označava da je pogodno da se koriste kolagen-proizvodeće ćelije u fibroznom tkivu, kao ciljane ćelije, a to uključuje na primer moguće dostavljanje supstance do pomenutih ćelija pri većoj brzini, većoj efikasnosti, i/ili u većim količinama od drugih ćelija, na primer, normalih ćelija. Na primer, nosač za kolagen-proizvodeće ćelije u fibroznom tkivu ili nosač za dostavu do kolagen-proizvodećih ćelija u fibroznom tkivu može dostaviti aktivan sastojak do kolagen-proizvodećih ćelija u fibroznom tkivu pri brzini i/ili efikasnosti od najmanje 1.1 puta, najmanje 1.2 puta, najmanje 1.3 puta, najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta i, dalje, najmanje 3 puta u poređenju sa drugim ćelijama. Kako kompozicija ovog pronalaska sadrži ciljajući agens za kolagen-proizvodeće ćelije u fibroznom tkivu, ona se može pripremiti kao kompozicija za kolagen-proizvodeće ćelije u fibroznom tkivu ili za dostavu do kolagen-proizvodećih ćelija u fibroznom tkivu.

[0054] Kompozicija ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija za upotrebu u medicini i može se dati raznim putanjama koje uključuju oralne i parenteralne putanje; njihovi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, oralne, enteralne, intravenozne, intramuskularne, subkutano, lokalne, intrahepatične, intrabilijarne, intrapulmonarne, traheobronhijalne, intratrahealne, intrabronhijalne, nazalne, intrarektalne, intraarterijske, intraportalne, intraventrikularne, intramedularne, intra-limfnog čvora, intralimfatične, intracelebralne, intratekalne, intracerebroventrikularne, transmukozalne, perkutane, intranazalne, intraperitonealne, i intramaterične putanje, a ona može biti formulisana u doznom obliku koji je pogodan za svaku putanju primene. Takav dozni oblik i postupak formulisanja može biti odabran kako je pogodno primenom bilo kojih poznatih oblika i postupaka (videti npr. 'Hyojun Yakuzaigaku' (Standard Pharmaceuticals Science), Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003).

[0055] Primeri doznih oblika pogodni za oral primene uključuju, ali nisu ograničeni na, prašak, granula, tableta, kapsula, tečnost, suspenzija, emulzija, gel, i sirup, a primeri doznih oblika pogodni za parenteralne primene uključuju injekcije kao što je injekcioni rastvor, injekciona suspenzija, injekciona emulzija, i injekcija u obliku koji se priprema u vreme upotrebe. Formulacije za parenteralne primene mogu biti u obliku kao što je vodeni ili nevodeni izotonični aseptični rastvor ili suspenzija.

[0056] Kompozicija ovog pronalaska može se obezbediti u bilo kojoj konfiguraciji, ali sa stanovišta stabilnosti tokom skladištenja, obezbeđuje se u konfiguraciji koja se može pripremiti u trenutku upotrebe, na primer u konfiguraciji koja omogućava doktoru i/ili farmaceutu, sestri, drugom tehničaru, itd. da je pripremi na mestu tretiranja ili blizu njega. U tom slučaju, kompozicija ovog pronalaska obezbeđena je pomoću jednog ili više kontejnera koji sadrže najmanje jedan njen esencijalni konstituentni element, i prirpema se pre upotrebe, na primer, u okviru 24 sata pre upotrebe, poželjno u okviru 3 sata pre upotrebe, poželjnije neposredno pre upotrebe. Kada se izvodi pripremanje, reagens, rastvarač, oprema za pripremanje, itd. koji su uobičajeno dostupni na mestu pripreme mogu se upotrebiti o potrebi.

[0057] Ovde je takođe opisan komplet za pripremanje kompozicije, pri čemu taj komplet uključuje jedan ili više kontejnera koji sadrže pojedinačno ili u kombinaciji, aktivni sastojak i/ili opciono ciljajući agens ili nosač-konstituišuću supstancu, a takođe se odnosi i na konstituentni element potreban za kompoziciju obezbeđenu u obliku takvog kompleta. Taj komplet može da sadrži, pored prethodno navedenog, instrukcije, elektronski medijum za snimanje kao što je CD ili DVD, itd. povezani sa postupkom pripremanja i postupkom primene kompozicije ovog pronalaska, itd. Dalje, taj komplet može da uključi sve konstituentne elemente za kompletiranje kompozicije ovog pronalaska, ali ne mora uvek da uključuje sve konstituentne elemente. Prema tome, komplet ne mora da uključuje reagens ili rastvarač koji je uobičajeno dostupan na mestu medicinskog tretiranja, eksperimetalnoj ustanovi, itd. kao što je, na primer, sterilna voda, fiziološki slani rastvor, ili glukozni rastvor.

[0058] Ovde je takođe opisan postupak za regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva, pri čemu taj postupak uključuje fazu davanje efektivne količine kompozicije ili kolagen-redukujuće supstance ovog pronalaska subjektu kome je to potrebno. Efektivna količina koja se ovde pominje je količina koja izaziva regenerisanje normalnog tkiva u fibroznom tkivu.

[0059] Količina ekstracelularne matrice može biti kvantitativnno određena raznim postupcima kao što je, na primer, bez ograničavanja, analiza slike specifično obojenih slika ekstracelularne matrice ili merenje markera ekstracelularne matrice. Na primer, kolagen može biti kvantitativo određen merenjem količine markera kolagena marker hidroksiprolin, ili podvrgavanjm tkiva kolagenskom bojenju (npr.

Masson trihrom bojenje, Azan bojenje, sirius red bojenje, Elastica van Gieson bojenje, itd.) i izvođenjem analize slike. Procenat redukcije ekstracelularne matrice u fibroznom tkivu može biti na primer najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70% i, dalje, najmanje 75% u poređenju sa slučajem u kojem kompozicija ovog pronalaska nije data. Ovde, slučaj u kom kompozicija ovog pronalaska nije data uključuje ne samo slučaj u kojem nije izvedena sama primena već i slučaj u kojem sam nosač nije dat, slučaj u kojem je data kompozicija koja odgovara kompoziciji ovog pronalaska osim što ne sadrži aktivni sastojak, i slučaj u kojem je data kompozicija koja odgovara kompoziciji ovog pronalaska osim što ne sadrži retinoid (takozvane negativne kontrole). Dalje, regeneracija normalnog tkiva može biti procenjena histološkim posmatranjem ili primenom obeleženih matičnih ćelija na fibrozno tkivo i izvođenjem ispitivanja njihovog praćenja.

[0060] Efektivna količina je poželjno količina koja ne izaziva sporedni efekat koji prevazilazi dobrobit od primene. Takva količina može se pogodno odrediti nekim in vitro testom primenom uzgojenih ćelija ili testiranjem na životinjskom modelu kao što je miš, pacov, pas, ili svinja, a takvi test postupci dobro su poznati stručnjaku iz ove oblasti. Štaviše, doza leka koji se koristi u ovde opisanom postuku poznata je stručnjaku iz ove oblasti, ili se lako može odrediti prethodno navedenim testovima, itd. Kao životinjski model za fibrozu, mogu se primeniti razni modeli kao što je model hepatične ciroze dobijen primenom ugljen tetrahlorida (CCl4), seruma svinjskog porekla, dimetilnitrosamina (DMN), metionin-holinska deficijentna ishrana (MCDD), konkanavalina A (Con A), podvezivanja žučnog kanala, itd., model pulmonarne fibroze dobijen bleomicinom (BLM), itd., model fibroze pankreasa dobijen dibutiltin dihloridom, itd., i model mijelofibroze kao što je trombopoietin (TPO) transgeni miš (Leukemia Research 29: 761-769, 2005).

[0061] U postupku kakav je ovde opisan, specifična doza kompozicije ili kolagen-redukujuće supstance koja se daje može se odrediti uzimajuću u obzir razna stanja koja se tiču subjekta kome je potrebno tretiranje, kao što je na primer ozbiljnost simptoma, opšt zdravstvenostanje subjekta, godine, težina, i pol subjekta, ishrana, vreme i učestalost davanja, leka upotrebljenog u kombinaciji, reakcijena tretiranje, slaganje sa tretiranjem, itd.

[0062] Kao putanja davanja, postoje razne putanje koje uključuju i oralne i parenteralne primene, a njihovi primeri uključuju oralne, enteralne, intravenozne, intramuskularne, subkutane, lokalne, intrahepatične, intrabilijarne, intrapulmonarne, traheobronhijalne, intratrahealne, intrabronhijalne, nazalne, intrarektalne, intraarterijske, intraportalne, intraventrikularne, intramedularne, intra-limfnog čvora, intralimfatične, intracelebralne, intratekalne, intracerebroventrikularne, transmukozalne, perkutane, intranazalne, intraperitonealne, i intramaterične putanje.

[0063] Učestalost primene zavisi od svojstava kompozicije koja se koristi i prethodno pomenutih stanja subjekta, i može biti brojati više puta na dan (to jest, 2, 3, 4, 5, ili više puta na dan), jednom dnevno, svakih nekoliko dana (to jest, svakih 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, itd.), nekoliko puta nedeljno (npr.2, 3, 4 puta, itd. nedeljno), svake nedelje, ili svakih nekoliko nedelja (to jest, svakih 2, 3, 4 nedelje, itd.).

[0064] U postupku koji je ovde opisan, izraz 'subjekat' označava bilo kog živog pojedinca, poželjno životinju, poželjnije sisara, i najpoželjnije čoveka. Subjekat može biti zdrav ili oboleo od nekog poremećaja, ali obično označava subjekta koji ima fibrozno tkivo ili tkivo koje je u riziku da postane fibrozno. Primeri takvog subjekta uključuju, ali nisu ograničeni na, subjekta koji boluje od fibroze prethodno pomenutih organa ili koji je u riziku da oboli od toga subjekat čije tkivo prima fibrozni stimulus ili je u riziku od njegoog primanja.

[0065] Dalje je opisan postupak za regenerisanje normalnog tkiva iz fibroznog tkiva, pri čemu taj postupak uključuje fazu redukovanja kolagena u fibroznom tkivu i fazu formiranja prostora za rast ćelija i diferencijaciju u fibroznom tkivu.

[0066] U ovom postupku, redukcija kolagena u fibroznom tkivu i formiranje prostora za rast ćelija i diferencijaciju može se izvesti primenom kompozicije ovog pronalaska na fibrozno tkivo.

[Primeri]

[0067] Ovaj pronalazak detaljnije je objašnjen na donjim Primerima, koji služe samo kao ilustracija ovog pronalaska kako je definisano priloženim zahtevima. U donjim Primerima, podaci su izraženi kao prosečne vrednosti (± standardna devijacija). Višestruka poređenja između kontrolne grupe i druge grupe izvedena su primenom Dunnett-ovog testa.

Primer 1. Priprema VA-lip siRNK

(1) Priprema siRNK

[0068] Kao sens lanac i antisens lanac siRNK (Hokkaido System Science Co., Ltd., Sapporo, Japan) ciljan ka baznoj sekvenbci gp46 (GenBank Accession No. M69246), koja je pacovski homolog humanom HSP47, molekulski šaperon sličan kolagenima (tipovi I do IV), upotrebljene su one u nastavku.

A: GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG (sens lanac siRNK koji počinje od 757-me baze na gp46 baznoj sekvenci, SEQ ID NO: 1)

B: GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU (antisens lanac siRNK, SEQ ID NO: 2)

[0069] Kao siRNK nasumična (koja se takođe zove siRNKizmešana), upotrebljene su one u nastavku. C: CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (sens lanac siRNK, SEQ ID NO: 3)

D: GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU (antisens lanac siRNK, SEQ ID NO: 4)

[0070] U nekim eksperimentima, upotrebljeni su sens lanci sa 6'-karboksifluorescein (6-FAM) ili fluorescein izotiocianat (FITC) konjugovani do 5' terminala. Potvrđeno je primenom BLAST pretrage da ove sekvence nemaju homologiju sa drugom poznatom pacovskom mRNK.

(2) Priprema VA-lip siRNK

[0071] Kao katjonski lipid, katjonski lipozom (LipoTrust) koji sadrži

O,O'-ditetradekanoil-N-(α-trimetilamonioacetil)dietanolamin hlorid (DC-6-14), holesterol, i dioleilfosfatidiletanolamin (DOPE) pri molarnom odnosu od 4:3:3 kupljen je od Hokkaido System Science Co., Ltd. (Sapporo, Japan). Pre upotrebe, lipozom je pripremljen pri koncentraciji od 1 mM (DC-6-14) dodavanjem dvostruko destilovane vode (DDW) u liofilizovanu mešavinu uz umešavanje. Kako bi se pripremio VA spojeni lipozom, 200 nmol vitamina A (retinol, Sigma, USA) rastvorenog u DMSO umešano je sa suspenzijom lipozoma (100 nmol kao DC-6-14) u 1.5 mL epruveti uz mešanje na 25°C. Kako bi se pripremio VA spojeni lipozom koji nosi siRNKgp46 (VA-lip-siRNKgp46), rastvor siRNKgp46 (580 pmol/mL u DDW) dodato je u rastvor retinola spojenim sa lipozomom uz mešanje na sobnoj temperaturi. Molarni odnos siRNK i DC-6-14 iznosio je 1:11. Kako bi se dobila željena doza in vitro, VA-lip siRNK je rekonstruisana primenom fosfatnim puferom (PBS).

Primer 2. Eksperiment regenerativne terapije uz upotrebu modela hepatične fibroze kod pacova (1) Priprema modela hepatične fibroze kod pacova

[0072] Model hepatične fibroze kod pacova pripremljen je izvođenjem uobičajenog podvezivanja žučnog kanala na mužijaku SD pacova (telesne mase 150 do 200 g) (Slc Japan, Shizuoka, Japan), a jedinka je 28-osmi dan nakon podvezivanja podvrgnuta ovom eksperimentu. Ovaj model pacova bio je u stanju kod koje je holestaza izazvana uobičajenim podvezivanjem žučnog kanala te je tkivo jetre bilo kontinuirano izloženo fibroznim stimulusom.

(2) Priprema GFP-obeležene hepatične matične ćelije pacova

[0073] GFP-obeležene hepatične matične ćelije pacova sakupljene su iz jetre 4 nedelje starog GFP transgenog pacova (Slc Japan). Prvo je GFP transgeni pacov perfuziran sa EGTA rastvorom i rastvorom kolagenaze, zatim je sakupljena jetra, a sakupljena jetra precizno je isečena, a zatim filtrirana primenom ćelijskog sita (prečnik pora 100 µm). Hankov balansirani slani rastvor (HBSS) 0.25% rastvor albumina goveđeg seruma (BSA) dodati su u dobijenu ćelijsku suspenziju, a mešavina je podvrgnuta centrifugiranjem na 4°C i 500 o/min tokom 2 minutea. Supernatant je sakupljen i podvrgnut centrifugiranju na 4°C i 1300 o/min tokom 5 minuta. Nakon što je uklonjen supernatant, MACS<®>(Magnetom aktivirano sortiranje ćelija) pufer (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) dodat je u precipitat i umešan. Nakon što je izbrojan broj ćelijea, izvedeno je MACS<®>primenom FITC konjugovanog mišjeg anti-CD45 antitela (BD Pharmingen), zečijeg poliklonalno anti-CD133 antitela (Abcam), i mišjeg monoklonalnog anti-EpCAM antitela (Santa Cruz), i CD133-pozitivne, EpCAM-pozitivne, i CD45 negativne ćelije sakupljene su i upotrebljene u ovom eksperimentu kao hepatične matične ćelije pacova.

(3) Tretiranje of model hepatične fibroze kod pacova

[0074] GFP-obeležene hepatične matične ćelije pripremljene u (2) lokalno su transplantirane na modelu hepatične fibroze kod pacova pripremljen u (1) pri kocentraciji od 2 × 10<6>brojanja u 200 µL DME/F12 medijuma.

[0075] 24 sata nakon transplantacija hepatičnih matičnih ćelija, siRNKgp46 enkapsulitana u vitamin A spojenom lipozomu (VA-lip siRNKgp46) ili VA-lip siRNKizmešana kao lažni podatak data je kroz repnu venu svaki drugi dan ukupno 12 puta. Koncentracija date siRNK iznosila je 0.75 mg/kg telesne mase pacova. Molarni odnos vitamina A, lipozoma (LipoTrust, Hokkaido System Science Co., Ltd., Sapporo, Japan), i siRNK iznosio je 11.5:11.5:1.

(4) Bojenje tkiva

[0076] 24 sata nakon 12th primene VA-lip siRNKgp46 iz (3) (to jest, 52-og dana nakon uobičajenog podvezivanja žučnog kanala), sakupljena je jetra tog pacova sa uobičajeno podvezanim žučnim kanalom kojem su transplantirane GFP eksprimirajuće hepatične matične ćelije. Nakon sakupljana, jetra je fiksirana primenom OCT jedinjenje, i pripremljene su zamrznute sekcije. Sekcije jetre fiksirane su primenom 4% paraformaldehida. Neke od sekcija podvrgnute su Azan-bojenju standarsnim postupkom. Neke sekcije podvrgnute su blokiranju sa PBS koji sadrži 5% koziji serum, oprane sa PBS, a zatim reagovane na 4°C preko noći primenom mišjeg monoklonalnog anti-α aktin glatkih mišića (α-SMA) antitela (Sigma), mišjeg monoklonalnog anti-glijalni fibrilarni kiselinski protein (GFAP) antitela (Sigma), zečijeg poliklonalnog anti-albumin antitela (MP Biomedicals), mišjeg monoklonalnog anti-CK19 antitela (Novocastra), i mišjeg monoklonalnog anti-vaskularni endotelijski kaderin (ve-CAD, Vaskularni endotelijski kaderin) antitela (Santa Cruz). Nakon pranja sa PBS, reagovane su sa Alexa555-obeleženim kozjim anti-mišjim IgG antitelom i Alexa555-obeleženim kozjim anti-zečijim IgG antitelom (oba od Invitrogen) na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta. Nakon pranja sa PBS, fiksirane su primenom ProLong<(R)>Gold sa DAPI (Invitrogen) i ispitane fluorescencionim mikroskopom. Umesto reagovanja sa kozjim anti-zečijim antitelom, neki delovi sekcija reagovani su sa α-SMA antitelom (Dako), a zatim podvrgnute bojenju pomoću diaminobenzidina (DAB) i dalje nuklearnom bojenju pomoću hematoksilina.

Rezultati

[0077] FIG.1 prikazuje izgled jetri sakupljen iz test pacova i Azan-obojene slike njihovih reprezentativnih sekcija. U grupi kojoj je data VA-lip siRNKizmešana, jetra je zgrčena, površina nepravilna, akumulacija ekstracelularne matrice koja je obojena plavo široko je primećena u tkivu u Azan-obojenoj slici, a hepatična lobularna struktura je poremećena. Sa druge strane, u grupi kojoj je data VA-lip siRNKgp46, nije bilo primetnog grčenja, površina je bila glatka, nije bilo skoro nikakve akumulacije ekstracelularne matrice u tkivu, i postojalo je jasno smanjenje veličine fibroznog regiona u poređenju sa grupom tretiranom sa VA-lip siRNKizmešana. Dalje, jasno je primećeno da je oporavljena normalna hepatična lobularna struktura, u kojoj su sinusoide proticale radijalno od centralne vene.

[0078] FIG.2 prikazuje α-SMA antitelo DAB-obojene slike. Plavi delovi predstavljaju hematoksilinobojeno jezgro, a tamno braon delovi predstavljaju α-SMA-pozitivne regione. α-SMA poznat je kao marker za aktivirane stelatne ćelije, i smatralo se da su u α-SMA-pozitivnim regionima prisutne aktivirane stelatne ćelije. U VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi postojalo je obeleženo smanjenje aktiviranih stelatnih ćelija u poređenju sa VA-lip siRNKizmešana.

[0079] FIG.3 prikazuje DAPI i GFP fluorescentne slike GFP-obeleženih transplantacionih mesta hepatičnih matičnih ćelija. U VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi, GFP bojenje primećeno je u oko 80% regiona, pri čemu je u VA-lip siRNKizmešana-tretiranoj grupi jedva bilo nešto obojenja.

[0080] FIG.4 prikazuje svetlo polje i GFP fluorescentne slike GFP-obeleženih transplantacionih mesta hepatičnih matičnih ćelija. U VA-lip siRNKizmešana-tretiranoj grupi, oblik ćelija postaje zamućen zbog akumulacije ekstracelularne matrice, naročito u područjima oko krvnih sudova, a sinusoide teku na nasumičan način, dok je u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi oblik ćelija jasan i primećena je struktura sinusoida koje teku radijalno od centralne vene. Dalje, u VA-lip siRNKizmešana-tretiranoj grupi nije bilo GFP obojenja, dok je u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi GFP bojenje primećeno kroz tkivo.

[0081] FIG.5 je poređenje između DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene GFAP antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi (FIG.5A je 200× uvećanje, a FIG.5B je 400× uvećanje). GFAP je protein poznat kao marker za hepatične stelatne ćelije u stanju mirovanja. Ćelije koje eksprimiraju GFAP nisu eksprimirale GFP.

[0082] FIG.6 je poređenje između DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene sa α-SMA antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi at 200× uvećanje. Ćelije koje eksprimiraju α-SMA nisu eksprimirale GFP. Rezultati FIG.5 i 6 nagoveštavaju da hepatične stelatne ćelije nisu izvedene iz hepatičnih matičnih ćelija.

[0083] FIG.7 je poređenje između DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene albumin antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi pri 200× uvećanju. Albumin je marker za hepatocite, i mnoge od ćelije koje eksprimiraju GFP eksprimirale su albumin.

[0084] FIG.8 je poređenje između DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene sa CK19 antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi pri 200× uvećanju. CK19 je marker za epitelijalne ćelije žučnog kanala, a CK19-pozitivne ćelije koje formiraju žučni kanal eksprimirale su GFP.

[0085] FIG.9 je poređenje između DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene ve-CAD antitelom u VA-lip siRNKgp46-tretiranoj grupi (FIG.9A je 200× uvećanje, a FIG.9B je 400× uvećanje). ve-CAD poznat je kao marker za endotelijalne ćelije krvnih sudova, i kod nekih ćelija koje eksprimiraju GFP ćelije, primećene su ćelije koje eksprimiraju ve-CAD.

[0086] FIG.10 je poređenje između DAPI i GFP fluorescentne slike i slike fluorescentno obojene albumin antitelom na mestu VA-lip siRNKgp46-tretirane grupe gde ćelije nisu transplantirane, pri 200× uvećanju. Na mestu gde ćelije nisu transplantirane, nisu primećene GFP-eksprimirajuće ćelije.

Diskusija

[0087] Kako su ćelije koje eksprimiraju GFP bile ćelije izvedene iz transplantiranih hepatičnih matičnih ćelija, zbog primene VA-lip siRNKgp46, na mestu transplantacije ćelija fibrozni region smanjen je u veličini i hepatične matične ćelije diferencirale su se u hepatocite, epitelijalne ćelije žučnog kanala, i endotelijalne ćelije krvnih sudova, čime se pokazuje da je regenerisano normalno tkivo jetre. To jest, postaje jasno da tretiranje koje uključuje primenu VA-lip siRNKgp46 ne samo da leči hepatičnu fibrozu već i indukuje regenraciju jetre. Dalje, rezultat u VA-lip siRNKizmešana-tretiranoj grupi u kojoj se nisu mogle primetiti hepatične matične ćelije (FIG.3) sugeriše da je redukcija u veličini fibroznog regiona zbog VA-lip siRNKgp46 duboko uključena u rast i diferencijaciju hepatičnih matičnih ćelija.

Primer 3. Specifična dostava stelatnih ćelija pomoću VA

(1) Izolovanje stelatnih ćelija pankreasa pacova (PSC)

[0088] Stelatne ćelije pankreasa pacova (PSC) izolovane su primenom postupka centrifugacije sa gradijentom gustine u skladu sa prethodnim izveštajem (Apte et al. Gut 1998; 43: 128-133). Ćistoća je ocenjena mikroskopskim pregledom, autofluorescencijom endogenog VA, i imunocutohemijskim postupkom primenom monoklonalnog antitela (1:25, Dako) za desmin, koji je mišični aktin umređavajući protein. Vijabilnost ćelija procenjena je tripan plavo ekskluzijom. I ćelijska čistoća i vijabilnost prešle su 95%. Ćelije su uzgajane u Iskovom modifikovanom Dulbeko medijumu (Iskov modifikovani Dulbeko medijum: IMDM) dopunjen sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS) na 37°C sa 95% vazduha/5% CO2pod vlažnim okruženjem.

(2) Analiza intracelularne distribucije za VA-lip siRNKgp46-FAM

[0089] pPSC pacova (pimarne stelatne ćelije pankreasa, pimarne PSC) zasejane su tako da je bilo 1 × 10<4>ćelija po komori u Lab-Tek pokrivnom staklu sa komorama. VA-lip siRNKgp46-FAM ili Lip siRNKgp46-FAM dodati su ćelijama tako da je finalna koncentracija siRNK iznosila 50 nM. Ćelije su uzgajane u 10% FBS-koji sadrži DMEM tokom 30 minuta, a medijum je zamnjen svežim medijumom.30 minuta nakon i 2 sata nakon tretiranja, ćelije su oprane sa PBS tri puta, i fiksirane tretiranjem sa 4% paraformaldehidom na 25°C tokom 15 minuta. Nakon fiksiranja, ćelije su oprane sa PBS tri puta i izložene ProLong<(R)>Gold sa DAPI (Invitrogen) tokom 1 minuta kako bi se tako obojilo jezgro. Intraćelijska lokalizacija FAM-obeležene siRNKgp46 procenjena je primenom fluorescencionog mikroskopa (Keyence, BZ-8000).

(3) FACS analiza VA-lip siRNKgp46-FAM

[0090] pPSC pacova (1 × 10<4>ćelije) tretirane su sa VA-lip siRNKgp46-FAM (50 nM siRNK) u prisustvu 10% FBS i uzgajane tokom 30 minuta. Radi ispitivanja blokiranja, pre nego što je dodata VA-lip siRNKgp46-FAM, 1 × 10<4>ćelije tretirane su sa mišjim anti-RBP antitelom (10 µg/mL, BD Pharmingen), ili mišjim IgG1(10 µg/mL, Dako) kao negativna kontrola, tokom 30 minuta. Srednja vrednost fluorescencionog inteziteta (MFI) VA-lip siRNKgp46-FAM-tretiranih ćelija procenjenja je primenom FACScalibur-a sa CellQuest softverom (Becton Dickinson).

(4) Western blot analiza

[0091] Kako bi se procenio nokdaun efekat siRNKgp46, izveden je Western blot eksperiment. Specifično, proteinski ekstrakti PSC respektivno tretirani sa VA-lip siRNKgp46 (1 nM, 5 nM, 50 nM), VA-lip-siRNK nasumična (50 nM), i Lip-siRNKgp46 (50 nM) tokom 30 minuta, odvojeni su primenom 4/20 SDS-poliakrilamid gela, transferovani na nitrocelulozni film, ispitani sa antitelom (Stressgen) na HSP47 (gp46) ili antitelom (Cell Signaling) na β-aktin, i obeleženi sa antitelom vezanim za peroksidazu (Oncogene Research Products, Boston, MA) kao sekundarno antitelo. Konačno, ćelije su vizualizovane pomoću ECL Western blot detekcionog sistema (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL).

[0092] Dalje, kako bi se potvrdilo trajanje supresije ekspresije gp46, PSC su tretirane sa VA-lip siRNKgp46 (50 nM) tokom 30 minuta, a zatim uzgajane tokom 24 sata, 48 sati, 72 sata, i 96 sati, i nakon čega je ovaj protein ekstrahovan i podvrgnut Western blot eksperimentu na isti način kako je prethodno opisano, zajedno sa onom 30 minuta nakon tretiranje sa VA-lip-siRNK nasumičnom (50 nM).

(5) Kvantitativno određivanje proizvodnje kolagena

[0093] pPSC pacova zasejane su u ploči za uzgajanje tkiva sa 6 bazenčića pri gustini od 5 × 10<4>ćelije/bazenčić u 10% FBS-koji sadrži DMEM. Nakon uzgajanja od 24 sata, pPSC pacova su tretirane sa VA-lip siRNKgp46 (50 nM siRNK) i VA-lip siRNK nasumična (50 nM siRNK). Ćelije su uzgajane u 10% FBS-koji sadrži DMEM tokom 30 minuta, a medijum je zatim zamenjen sa svežim medijumom.72 sata nakon tretiranja, ćelije su oprane sa PBS tri puta, a kolagen koji se nataložio u bazenčiću obojen je primenom sirius red (Biocolor, Belfast, UK) u skladu sa prethodnim izveštajem (Williams et al. Gut 2001; 49: 577-583). Nevezana boja je uklonjena pranjem, a vezani kompleks je rastvoren u 0.5% natrijum hidroksidu. Kvantitativna analiza kolagena izvedena je analizom inteziteta apsorbovanja pri 540 nm, a rezultat je izražen kao procenat u odnosu na netretiranu kontrolu.

Rezultati

[0094] FIG.11 prikazuje fluorescentne slike intracelularne distribucije FAM-obeležene siRNK. Dve slike na levoj strani su fluorescentne slike PSC tretiranih sa VA-lip siRNKgp46-FAM, a dve slike na desnoj strani su fluorescentne slike PSC tretiranih sa Lip siRNKgp46-FAM. Gornje dve slike su 30 minuta nakon tretiranja, a donje dve slike su slike 2 sata nakon tretiranja.30 minuta nakon tretiranja sa VA-lip siRNKgp46-FAM, slaba zelena fluorescencija usled FAM u granularonom šablonu primećena unutar citoplazme, a 2 sata nakon tretiranja, tamniji granularni šablon primećen je u regionu oko jezgra. U poređenju sa tim, u Lip siRNKgp46-FAM-tretiranoj grupi, nije primećena nikakva zelena fluorescencija 30 minuta nakon tretiranja, a fluorescencija oko jezgra 2 sata nakon tretiranja bila je bleda.

[0095] FIG.12 prikazuje grafike rezultata FACS analize. Rezultati netretirane grupe, Lip siRNKgp46-FAM-tretirane grupe, VA-lip siRNKgp46-FAM-tretirane grupe, VA-lip siRNKgp46-FAM RBP antitelo-tretirane grupe, i Lip siRNKgp46-FAM RBP antitelo-tretirane grupe koji su prikazani u sekvenci od gore.U rezultatima FACS analize, u poređenju sa VA-lip siRNKgp46-FAM-tretiranom grupom, u VA-lip siRNKgp46-FAM RBP antitelo-tretiranoj grupi, jačina fluorescencije suzbijena je do istog nivoa kao i u Lip siRNKgp46-FAM-tretiranoj grupi, što sugeriše da je uključivanje VA-lip siRNKgp46 u PSC posredovano RBP receptorom.

[0096] FIG.13A prikazuje rezultate Western blot analize, koji pokazuju razliku u supresionom efektu u skladu sa koncentracijom. Kod ćelija tretiranih sa VA-lip siRNKgp46, primećeno je da je supresija ekspresije gp46 zavisna od konventracije VA-lip siRNKgp46, pri čemu je ekspresija gotovo potpuno suzbijena pri 50 nM, dok supresija ekspresije nije primećena sa VA-lip siRNK nasumičnom ili Lip siRNKgp46.

[0097] FIG.13B prikazuje rezultat Western blot analize za utvrđivanje trajanja supresionog efekta. Kada je izvedeno tretiranje sa VA-lip siRNKgp46, u ćelijama uzgajanim 72 sata nakon tretiranja, primećena je označena supresija gp46. Prema tome, potvrđeno je je efekat suzbijanja ekspresije gp46 nastavljen najmanje 72 sata nakon tretiranja.

[0098] FIG.14 je grafikon koji prikazuje kvantitativno određivanje količine kolagena proizvedenog nakon 72 sata u netretiranim ćelijama i ćelijama tretiranim sa VA-lip siRNKgp46 i VA-lip siRNK nasumičnom respektivno. U poređenju sa netretiranim ćelijama i ćelijama tretiranim sa VA-lip siRNK nasumičnom, kada je izvedeno tretiranje sa VA-lip siRNKgp46, potvrđena je označena supresija proizvodnje kolagena.

Diskusija

[0099] Iz prethodnih rezultata može se videti da, in vitro, VA-lip siRNKgp46 je inkorporirana specifično u PSC pomoću RBP receptor-posredovanog uključivanja u tako suzbijenu ekspresiju gp46, a kao rezultat, proizvodnja kolagena je znbačajno suzbijena. To sugeriše da u pankreasu koji je pogođen fibrozom pankreasa, VA-lip siRNKgp46 može redukovati kolagen.

Primer 4. Eksperiment regenerativne terapije modela fibroze pankreasa kod pacova

(1) Priprema modela fibroze pankreasa kod pacova

[0100] Korišćeni su mužijaci Lewis pacova telesne mase od 150 do 200 g (Charles River). U skladu sa prethonim izveštajem (Inoue et al. Pankreas 2002; 25: e64-70), dibutiltin dihlorid (Dibutiltin dihlorid, DBTC) rastvoren je u 1 delu etanola, a zatim umešan sa 2 dela glicerola i 2 dela dimetil sulfoksida (DMSO) u tako pripremljenom rastvoru (DBTC rastvor), a količina koja odgovara do 5 mg (DBTC) /kg (telesne mase) data je pacovu kroz desnu karotidnu arteriju upotebom šprica.

(2) In vivo lokalizacija VA-lip siRNKgp46-FITC u pankreasu pacova i drugom tkivu

[0101] Nakon 43 dana od početka primene DBTC, u trenutku kada je ozbiljna fibroza pankreasa primećena, 1 µL/g telesne mase VA-lip siRNKgp46-FITC ili Lip siRNKgp46-FITC dato je DBTC-tretiranom pacovu kroz repnu venu. Davanje je izvedeno pod normalnim protiskom tri puta svaki drugi dan sa 0.75 mg/kg siRNK svaki put.24 sata nakon finalne primene, pacov je žrtvovan ispiranjem sa fiziološkim slanim rastvorom, i sakupljeni su pankreas i ostali organi (jetra, pluća, slezina, i mrežnjača). Uzorci organa fiksirani su sa 10% paraformaldehidom, a parafinski fiksirane sekcije obojene su primenom Azan-Mallory boje. Imunohistohemijsko bojenje izvedeno je postupkom polimera dekstrana primenom svakog od monoklonalnog anti-α-SMA antitela (1:1000, Sigma), anti-CD68 antitela (1:500, Dako), i anti-FITC antitela (1:500, Abcam) i pomoću Envision Kompleta (Dako), a nakon toga su izvedena bojenja pomoću DAB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) i nuklearno bojenje pomoću Gill-ovog hematoksilin rastvora (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

(3) Western blot analiza

[0102] Kako bi se procenilo trajanje supresije ekspresije pomoću siRNKgp46 in vivo, proteinski ekstrakti iz pankreasa 0, 1, 2, 3, i 4 dana nakon intravenoznog davanja VA-lip siRNKgp46, podvrgnuti su Western blot analizi na isti način kao i za primer 3.(4).

(4) In vivo siRNKgp46 tretiranje

[0103] Tri grupe pacova (n = 6 po grupi) korišćeni su za histološku evaluaciju.43 dana nakon primene DBTC, svaka grupa je tretirana primenom PBS, VA-lip siRNK nasumična, i VA-lip siRNKgp4610 puta respektivno (0.75 mg/kg siRNK, data 10 puta svaki drugi dan). Sve primene su izvedene kroz repnu venu pod normalnim pritiskom sa količinom od 1 µL/g telesne mase. Pankreas je fiksiran sa 10% paraformaldehida i fiksirano u parafinu, a sekcija je zatim obojena primenom Azan-Mallory boje i hematoksilin-eozin boje. Imunohistohemijsko bojenje izvedeno je postupkom polimera dekstrana, primenom monoklonalnog anti-α-SMA antitela (1:1000, Sigma) i pomoću Envision kompleta (Dako), izvedena su naknadno bojenje pomoću DAB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) i nuklearno bojenje pomoću Gill-ovog hematoksilin rastvora (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Kako bi se izvelo precizno kvantitativno određivanje regiona obojenog sa Azan-Mallory, hematoksilin-eozin, i α-SMA, četiri blago uvećana polja (100×) nasumično su odabrane za svaki sekcije pankreasa pacova i ispitane primenom mikroskopa (Axioplan 2; Carl Zeiss, Inc). Digitalna slika uzeta je sistemom video snimanja primenom sistema digitalne TV kamere (Axiocam High Resolution color, Carl Zeiss, Inc.). Odnos regiona obojenog sa Azan-Mallory i α-SMA u digitalnoj mikroskposkoj fotografiji određen je primenom programa automatske softverske analize (KS400, Carl Zeiss, Inc.).

(5) Ispitivanje hidroksiprolina

[0104] Sadržaj hidroksiprolina određen je Weidenbach postupkom u skladu sa prethonim izveštajem (Weidenbach et al. Digestion 1997; 58: 50-57). Ukratko, preostale ćelije pankreasa centrifugirane su pri 3000 o/min tokom 15 minuta, pelet je kompletno hidrolizovan u 6 N HCl pri 96°C tokom 16 sati, pH je podešena na 6.5 do 7.5, i ponovo je izvedena centrifugacija (pri 3000 o/min tokom 15 minuta).25 µL alikvota osušeno je na 60°C, a talog je rastvoren u 1.2 mL 50% izopropanola i inbkubisan u 200 mL pufera sirćetne kiseline/lumunske kiseline (pH 6.0) koji sadrži 0.56% hloramin T Rastvor (Sigma). Nakon inkubisanja na 25°C tokom 10 minuta, 1 mL Ehrlich-ovog reagensa je dodato, a mešavina je inkubisana na 50 °C tokom 90 minuta. Nakon hlađenja, izmerena je apsorpcija na talasnoj dužini od 560 nm.

(6) Aktivnost kolagenaze fragmenata ćelija pankreasa

[0105] Merenje aktivnosti kolagenaze izvedeno je modifikovanim postupkom prethodnog izveštaja (Iredale et al. J. Clin. Invest.1998; 102: 538-549). Ukratko, pankreas sakupljen iz pacova divljeg tipa i pacovskog modela fibroze pankreasa i koji su zamrznuti tečnim azotom, smrvljeni su na ledu u uzorkovanom puferu (50 mM Tris, pH 7.6, 0.25% Triton X-100, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl2) koji sadrži inhibitor serin i tiol proteaze (PMSF 0.1 mM, leupeptin 10 µM, pepstatin A 10 µM, aprotinin 25 µg/mL, jodoacetamid 0.1 mM). Ćelijski fragmenti centrifugirani su na 4°C i 14000 g tokom 30 minuta, čime je uklonjen ćelijski višak i proteinski agregati. Aktivnost kolagenaze u ćelijskim fragmentima pankreasa određena je primenom EnzCheck Kolagenaza Test Kolagen Konjugat kompleta (Molecular Probes) u skladu sa istrukcijom proizvođača. Paralelno sa tim, izvedena je analiza primenom pogodne negativne kontrole i pozitivne kontrole (bakterijska kolagenaza), a rezultati su izraženi kao fluorescencija degradiranog kolagena po mg proteina (određeno optičkom gustinom pri 280 nm u poređenju sa standardom albumina u serumu).

Rezultati

[0106] U uzastopnim sekcijama pankreasa, aktivirane stelatne ćelije i siRNKgp46-FITC su imunoobojene, a rezultati su bili takvi da u VA-lip siRNKgp46-FITC-tretiranoj grupi, u regionu gde su se nagomilale aktivirane stelatne ćelije (α-SMA-pozitivne ćelije), identifikovane su FITC-pozitivne ćelije, dok je u Lip siRNKgp46-FITC-tretiranoj grupi, broj FITC-pozitivnih ćelija identifikovanih u α-SMA-pozitivnom regionu bio veoma mali (FIG.15 A i B).

[0107] FITC-pozitivne ćelije u α-SMA-pozitivnom regionu takođe su primećene u uzorcima jetre (FIG.15 C). Ovaj rezultat poklapa se sa saznanjem da DBTC ne samo da indukuje fibrozu pankreasa već i hepatičnu cirozu. U drugim organima pacova, koji uključuju pluća i slezinu, nekoliko ćelija je obojeno sa FITC u regionu sa infiltracijom makrofaga (CD68-pozitivne ćelije) (FIG.15D i E), što sugeriše nespecifično uključivanje siRNKgp46-FITC od strane makrofaga. Mrežnjača je bila negativna na FITC bojenje (FIG.15 F), a to se poklapa sa saznanjem dobijenim primenom VA-lip siRNKgp46-FAM u hepatičnoj cirozi.

Smatralo se da očna jabučica konstruiše nezavistan sistem usled slabe propustljivosti krvno-retinalne barijere.

[0108] Iz rezultata Western blot analize potvrđeno je da se, takođe in vivo, efekat siRNKgp46 suzbijanja ekspresije gp46 nastavlja još najmanje 3 dana (FIG.16A i B).

[0109] DBTC-tretirani pacov kom je data VA-lip siRNKgp4610 puta, procenjen je Azan-Mallory bojenjem (FIG.17 A). Fibrozni region određen komjuterskom analizom slike znajačno je smanjen u uzorku iz VA-lip siRNKgp46-tretirane grupe u poređenju sa kontrolnim uzorkom (P < 0.01) (FIG.17 B). Ovaj rezultat poklapa se sa podacima koji prikazuju jasnu supresiju hidroksiprolina u pankreasu VA-lip siRNKgp46-tretirane grupe (FIG.17 C).

[0110] Kako bi se procenila promena u stelatnim ćelijama u pankreasu pacova nakon tretiranja sa VA-lip siRNKgp46, uzorak pankreasa pacova je nakon tretiranja sa VA-lip siRNKgp46 podvrgnut α-SMA bojenju, a rezultat pokazuje da je broj α-SMA-pozitivnih ćelija značajno smanjen u poređenju sa onim kod pacova tretiranog sa Lip siRNKgp46 i PBS (FIG.18A i B).

[0111] Aktivnost kolagenaze u fragmentima ćelija pankreasa pacova divljeg tipa i VA-lip siRNKgp46-tretiranog DBTC-tretiranog pacova izmerena je na osnovu pretpostavke da poboljšanje fibroze nakon supresije lučenja novog kolagena iz PSC primenom VA-lip siRNKgp46 uključuje kolagenazu izvedenu iz zapaljenskih ćelija i samoh PSC, a rezultati su prikazani u donjoj tabeli.

[Tabela 1]

Tabela 1. Aktivnost kolagenaze u fragmentima ćelija pankreasa pacova

[0112] Kako je prikazano u tabeli, aktivnost kolagenaze kod DBTC-tretiranog pacova skoro je ista kao i kod one kod pacova divljeg tipa.

[0113] Kada se porede hematoksilin-eozin slike bojenja uzoraka pankreasa VA-lip siRNKgp46-tretiranog i Lip siRNKgp46-tretiranog DBTC-tretiranog pacova na dan 65., kod VA-lip siRNKgp46-tretiranog pacova, iako nije kompletno, primećena je jasna normalizacija tkiva pankreasa, dok u tkivu Lip siRNKgp46-tretiranog pacova nije primećena normalizacija (FIG.19 A). Ovo se poklapa sa normalizacijom težine pankreasa VA-lip siRNKgp46-tretiranog DBTC-tretiranog pacova (FIG.19 B).

Diskusija

[0114] Iz prethodno pomenutih rezultata, može se videti da zbog tretiranja sa VA-lip siRNKgp46, siRNKgp46 je specifično inkorporirana u aktivirane stelatne ćelije pankreasa (aPSCs) kako bi tako suzbila ekspresiju gp46; kao rezultat, lučenje kolagena iz aPSC je suzbijeno, a time je iskazan i upadljiv efekat u poboljšanju fibroze pankreasa. Dalje, primećeno je upadljivo smanjenje u aPSC, što je verovatno usled redukcije lučenja kolagena. Posebno je važno napomenuti da tretiranje sa VA-lip siRNKgp46 ne samo da poboljšava fibrozu pankreasa već i indukuje regeneraciju tkiva pankreasa. Uzimajući ovo u obzir zajedno sa rezultatima iz Primera 2, ovu rezultati sugerišu da redukovanje kolagena akumuliranog u fibroznom tkivu omogućava da normalno tkivo postane tkivo-nespecifično regenerisano iz fibroznog tkiva.

Primer 5. Značaj prostora za rast i diferencijaciju matičnih ćelija

[0115] Aktivirane hepatične stelatne ćelije (aHSC) uzgajane su zajedno sa raznim gustinama hepatičnih progenitor ćelija, a efekat postojanja prostora oko ćelija za diferencijaciju hepatičnih progenitor ćelija je ispitan. Kao hepatične progenitor ćelije, upotrebljene su GFP-obeležene hepatične matične ćelije pacova dobijene iz Primera 2 (2), a kao aHSC, upotrebljene su HSC sakupljene iz SD pacova, uzgajane, i jednom provučene. aHSC su sakupljene i uzgajane kako sledi. Prvo, kao je SD pacov infuziran sa EGTA rastvorom i rastvorom kolagenaze, jetra je sakupljena, a sakupljena jetra fino je isečena i filtrirana primenom ćelijskog sita (prečnik pora 100 µm). HBSS 0.25% BSA rastvor dodat je tako dobijenoj ćelijskoj suspenziji, i ta mešavina je centrifugirana pri 4°C i 500 o/min tokom 2 minuta. Supernatant je sakupljen i centrifugiran pri 4°C i 1300 o/min tokom 5 minuta. Nakon što je supernatant uklonjen, HBSS 0.25% BSA rastvor je dodat, a 28.7% Nycodenz rastvor (Axis Shield, Oslo, Norway) dodat je tako da je koncentracija Nycodenz-a iznosila 13.2%, i usledilo je umešavanje. Nakon raslojavanja HBSS 0.25% BSA rastvora, centrifugacija je izvedena pri 4°C i 1400×g tokom 20 minuta. Kad je završeno centrifugiranje, sakupljen je međusloj i uzgajan primenom Dulbecco-ovog Modifikovanog Eagle medijuma (DMEM) 10% fetalni goveđi serum (FBS) medijum tokom 5 dana. Pasaža je izvedena petog dana uzgajanja, a te ćelije su upotrebljene u ovom eksperimentu.

[0116] aHSC su zasejane na umetcima ćelijske kulture (prečnik pora 0.4 µm, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) pri gustini od 5 × 10<4>ćelija/bazenčić i uzgajane u inkubatoru pri 37°C i 5% CO2 primenom DMEM 10% FBS tokom 48 sati.2 dana nakon zasejavanja aHSC, hepatične progenitor ćelije zasejane su u ploču sa 24-bazenčića (BD Falcon) opremljena sa pokrivnim staklom sa tip I kolagenom (IWAKI, Tokyo, Japan) pri gustini od 1 × 10<4>ćelije/bazenčić (mala gustina) i 5 × 10<5>ćelije/bazenčić (konfluenta).

Naknadno, prethodno pomenuti umetci ćelijske kulture koji sadrže aHSC, umetnuti su u bazenčiće ploče sa 24-bazenčića i uzgajani zajedno u inkubatoru pri 37°C i 5% CO2 tokom 10 dana (kao medijum, upotrebljen je DME/F12 (Dulbecco-ov modifikovani Eagle Medijum/Nutrient F-12 Ham) 10% FBS ITS (10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 0.67 µg/L selenijum) 0.1 µM deksametazon 10 mM nicotinamid 50 µg/mL β-merkaptoetanol 2 mM L-glutamin 5 mM Hepes).

[0117] 10-og dana zajedničkog uzgajanja, izvedeno je imunobojenje primenom anti-albumin antitela (zečije poliklonalno, MP Biomedicals), albumin-pozitivne kolonije su uslikane primenom invertovanog mikroskopa (Nikon) pri uvećanju od 100×, a na osnovu slika, izračunato je dobijeno područje albuminpozitivnih kolonija primenom NIS-Elements softvera (Nikon). Rezultati su prikazani na FIG.20.

[0118] U razlilčitom eksperimentu, 10-og dana zajedničkog uzgajanja, merenje ćelijskog rasta izvedeno je primenom Premix WST-1 siste,a za ispitivanje ćelijske proliferacije (Takara, Tokyo, Japan) sa čitačem mikroploča (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Rezultati su prikazani na FIG.21.

[0119] Iz rezultata prikazanih na FIG.20, jasno je da, kada su aHSC uzgajane zajedno sa hepatičnim progenitor ćelijama zasejanim pri maloj gustini, hepatične progenitor ćelije diferencirale su se u veliki broj albumin-pozitivnih hepatocita, ali kada su hepatične progenitor ćelije bile konfluentne, samo veoma mali broj se diferencirao u hepatocite. Kada su hepatične progenitor ćelije uzgajane same, nisu se diferencirale u albumin-pozitivne hepatocite. Dalje, kako je prikazano na FIG.21, kada su hepatične progenitor ćelije zasejane pri istoj gustini pomenutih, njihov potencijal proliferacije bio je manji pod konfluentnim sulovima u odnosu na uslove niske gustine.

[0120] Iz gornjih rezultata, pronađeno je da aktivirane stelatne ćelije indukuju rast i diferencijaciju matičnih ćelija, a postojanje fizičkog prostora oko matičnih ćelija ima značajan efekat na rast i diferencijaciju matičnih ćelija. Kada se to uzme u obzir zajedno sa rezultatima gornjih Primeria, pokazano je da kolagen-redukujuća supstanca izaziva redukciju fibroznog tkiva u fibroznom tkivu, prostor se formira oko matičnih ćelija, a kao rezultat, matične ćelije rastu i diferenciraju se čime se regeneriše normalno tkivo.

LISTA SEKVENCI

[0121]

Claims (5)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u regenerisanju normalnog tkiva rastom i diferencijacijom matičnih ćelija u prostoru formiranom zbog smanjenja kolagena akumuliranog u fibroznom tkivu, gde to fibrozno tkivo kontinuirano prima fibrozni stimulus, pri čemu ta kompozicija obuhvata kolagenredukujuću supstancu i retinoid, u kojoj je kolagen-redukujuća supstanca vezana za ili uključena u nosač odabran iz grupe koju čine micela, lipozom, mikrosfera i nanosfera, pri čemu je retinoid vezan za nosač hemijskim i/ili fizičkim postupkom, i pri čemu retinoid specifično dostavlja kolagen-redukujuću supstancu do kolagen-proizvodećih ćelija.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, u kojoj je kolagen-redukujuća supstanca odabrana iz grupe koju čine supresor proizvodnje kolagena pomoću kolagen-proizvodećih ćelija, promoter razgradnje kolagena, i supresor inhibitora razgradnje kolagena.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, u kojoj je supresor proizvodnje kolagena pomoću kolagen-proizvodećih ćelija odabran iz grupe koju čine TGFß inhibitor, HGF ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, PPARγ ligand, inhibitor angiotenzina, PDGF inhibitor, relaksin ili supstanca koja promoviše njihovu proizvodnju, supstanca koja inhibira proizvodnju i lučenje komponente ekstracelularne matrice, supresor ćelijske aktivnosti, supresor ćelijskog rasta, i apoptozaindukujuća supstanca.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, u kojoj promoter razgradnje kolagena predstavlja kolagenazu ili promoter proizvodnje kolagenaze.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, u kojoj supresor inhibitora razgradnje kolagena predstavlja TIMP inhibitor.