RS55775B2

RS55775B2 - Tehnike za predviđanje, otkrivanje i smanjenje nespecifične proteinske interferencije u testovima koji uključuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina

Info

Publication number: RS55775B2
Application number: RS20170334A
Authority: RS
Inventors: Judith Baumeister; Marie-Paule Lucienne Armanda Bouche; Carlo Boutton; Marie-Ange Buyse; Veerle Snoeck; Stephanie Staelens
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2022-10-31
Also published as: EP2974737B1; EP2944654A1; SI2723769T2; EP2974737A1; EP3020728A1; EP2944653A1; EP3363813A1; EP3363812A1; SI2723769T1; RS55775B1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina, ili „ISV“, generalno se ovde definiše kao aminokiselinska sekvenca koja:

• sadrži savijanje imunoglobulina ili koja je, pod pogodnim uslovima (kao što su fiziološki uslovi) sposobna da formira savijanje imunoglobulina (konkretno, savijanjem), odnosno tako da se formira varijabilni domen imunoglobulina (kao što su, na primer, VH, VL ili VHH domeni);

• i koja

• formira (ili je pod takvim odgovarajućim uslovima sposobna da formira) varijabilni domen imunoglobulina koji obuhvata mesto vezivanja funkcionalnog antigena (u smislu da ne zahteva interakciju sa drugim varijabilnim domenom imunoglobulina (kao što je VH-VL interakcija) da bi se formiralo mesto vezivanja funkcionalnog antigena).

[0002] Neki primeri pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji su trenutno poznati u struci su VHH i/ili (ostala) Nanotela, antitela dAb‘ i (pojedinačnih) domena. Od njih, od dana podnošenja ove prijave, razna Nanotela su u fazi I i fazi II kliničkih ispitivanja. Zbog toga je važno imati na raspolaganju pouzdane testove za analizu bioloških uzoraka od ljudi koji su tretirani sa ISV (kao što su pacijenti kliničkih ispitivanja i, nakon što se takvi ISV pojave na tržištu, pacijenti koji su tretirani sa takvim ISV).

[0003] Ovo nije važno samo za regulatorne potrebe, nego i za lečenje pacijenata sa biološkim lekovima, jer bi kliničari koji propisuju tretman takođe voleli da imaju na raspolaganju pouzdane testove da prate različite aspekte lečenja.

[0004] Na primer, u kliničkom razvoju molekula biološkog leka, važno je proceniti njihov imunogeni potencijal, a posebno stepen do kog mogu izazvati takozvana „anti-lek antitela“ ili „ADA“. Ovo se određuje pomoću tzv „anti-lek antitela“ ili „ADA (imuno)testova“ (pogledati na primer, pregled od Shankar et al.., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281; kao i Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth.289 (2004), 1-16; Peng et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635; i Loyet et al., J. Immunol. Meth. 345 (2009), 17-28. Takvi ADA testovi i postupci za njihovo izvođenje su standard znanja iz oblasti farmakologije, i oni se rutinski koriste tokom kliničkog razvoja proizvoda bioloških lekova (takođe su i zahtevani od strane različitih regulatornih agencija širom sveta).

[0005] Na primer, kako je opisano na stranama 3 i 4 članka od Mire-Sluis, i kao na primer, takođe prikazano šematski u slikama u članku od Peng, poznat je veliki broj različitih formata ADA testa, kao što su „ELISA-premošćavanje format“, „ELISA-direktni format“, „Indirektni format“, test radiološkog imuno-taloženja (RIP),“površinska plazmonska rezonanca“ i „format elektrohemiluminiscentnog premošćavanja“. Ostali formati za obavljanje ADA imunotestova biće jasni stručnjaku.

[0006] Stručnjak će takođe biti upoznat sa nekoliko različitih komercijalno dostupnih tehnoloških platformi koje su se pokazale kao pogodne za postavljanje i izvršavanje ADA testova. Ovo uključuje, ali se ne ograničava na MSD platformu (Mesoscale), Gyrolab (Gyros) i octet platformu (Fortebio).

[0007] Neki neograničavajući primeri ADA formata testa su takođe šematski prikazani na Slikama 1A do 1C.

[0008] Generalno, treba napomenuti da u takvim ADA testovima za otkrivanje ili merenje ADA protiv ISV, ISV je korišćen kao „analitički agens“ (odnosno kao jedinjenje koje se koristi da detektuje da li je bilo koji ADA prisutni u uzorku koji se testira), i ADA je su „antigen“ (tj. jedinjenje koje treba da se otkrije u uzorku koji je testiran). Prema tome, u ovim testovima, ISV će obično/često biti vezan za nosač (kao što je ELISA ploča), dok će ADA (ako postoji) biti prisutna u uzorku koji je podvrgnut testu.

[0009] Da bi se bolje razumeo ovde opisan pronalazak, treba napomenuti da – kao suprotnost - u postupcima koji se ovde koriste za predviđanje da li će ISV dovesti do proteinske interferencije, ISV se obično koristiti kao „antigen“ (odnosno kao jedinjenje koje treba da se otkrije), i antitelo (koje je kao što je ovde dalje opisano) se koristi kao „analitički agens“ (tj, kao sredstvo za detekciju da li se dati ISV vezuje ili ne, respektivno, i stoga da li ima visok ili povećan rizik da li dovodi do uspona proteinske interferencije ili ne, respektivno). Tako, u ovde opisanom postupku, antitelo koje se koristi kao analitički agens (koji je takođe ovde označen kao „analitičko antitelo“) obično će biti vezan za nosač (tj, na ELISA ploču) i ISV će biti (prisutan) u uzorku koji se testira. Međutim, generalno treba napomenuti da opis nije ograničen na testove u kojima je „analitičko antitelo“ vezano za nosač. Na primer, u alternativnom načinu vršenja ovde opisanih analiza (kao što je prikazano, na primer, na Slici 1 i opisano u Primerima), analitičko antitelo se umesto toga koristi kao agens premošćavanja i tako će pre biti u rastvoru nego vezano za ploču (iako je posredno vezano za ploču preko ISV koji oblaže ploču). Međutim, takođe u specifičnom testu premošćavanja koji je opisan u Primerima (koji je konkurentni test), analitičko antitelo se uvek koristi kao analitički agens (tj. da se utvrdi da li se ISV od interesa vezuje ili ne, respektivno; i stoga ima visok ili povećan rizik od povećanja proteinske interferencije ili ne, respektivno). Takođe je predviđeno da će, na osnovu daljeg opisa ovde, stručnjak moći da dizajnira druge formate testova u kojima analitičko antitelo može da se koristi kao analitički agens kako bi se utvrdilo da li se dati ISV može vezivati ili ne, respektivno; i stoga da li ima visok ili povećan rizik od dovođenja do porasta proteinske interferencije ili ne).

[0010] Kao rezultat istraživanja jednolančanih Fv ili „ScFv“ (koji su konstrukti koji sadrže pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina koji, slično ISV, nisu povezani sa konstantnim domenima), opisano je u struci da C-terminus varijabilnog domena imunoglobulina formira hidrofobnu zakrpu koja je u antitelu smeštena u interfejsu između varijabilnog domena i konstantnog domena, ali koja postaje izložena rastvaraču kada varijabilni domen nije povezan sa konstantnim domenom (Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997)). Takođe je opisano da izložen C-terminus može formirati B-ćelijske epitope koje dovode do porasta i/ili interakuju sa anti-lek antitelima (u nastajanju i/ili već postojećim) (WO 11/07586), čije prisustvo se zatim može odrediti korišćenjem ADA testova navedenih gore. Iz tog razloga, predloženo je da se naprave mutacije nekih aminokiselinskih ostataka koji formiraju deo C-terminusa varijabilnih domena kako bi smanjili navedenu hidrofobnosti i/ili uklonili navedene epitope. Na primer, Nieba et al. predlažu da se mutiraju položaji 11, 14, 41, 84, 87 i/ili 89 od VH regiona (numeracija u skladu sa Kabat), dok je u VW 11/07586 predloženo je se da mutiraju položaji 99, 101 i/ili 148 (AHO numeracija) na VL domeni ili položaji 12, 97, 98, 99, 103 i/ili 144 od VH domena (ponovo AHO numeracija - ovi položaji odgovaraju položajima 11,83, 84, 85, 89 i 103 u skladu sa Kabat numeracijom).

[0011] Međutim, nijedna od ovih referenci ne prepoznaje da neki proteini prisutni u krvi ili serumu pacijenta mogu da interferiraju sa ADA testovima koji uključuju ISV je, i zbog toga ove reference nisu usmerene na (niti nudi rešenje za) problem kako izbeći nespecifičnu proteinsku interferenciju u takvim ADA testovima, tako da omogući ADA testu koji se koristi da odredi pravo prisustvo/razmeru anti-lek antitela (u nastajanju i/ili već postojećim) u uzorku koji se testira.

[0012] WO 2010/042815 se odnosi na VHH fragmente antitela za upotrebu u otkrivanju i lečenju raka. WO2011/073954 se odnosi na antagonist antitela i njihove Fab fragmente protiv GP VI i njihovu upotrebu. WO2013/024059 se odnosi na modifikovane proteine i peptide koji imaju smanjenu sposobnost vezivanja za prethodno postojeća antitela.

[0013] Nasuprot tome, ovaj opis daje postupke i testove koji lako omogućavaju stručnjaku da predvidi da li pojedinični varijabilni domen imunoglobulina hoće ili neće imati sklonost da se podvrgne nespecifičnoj proteinskoj interferenciji u ADA testu. Ovde opisani postupci i testovi takođe omogućavaju stručnjaku, kada se utvrdi da varijabilni domen može imati sklonost ili rizik da bude podvrgnut proteinskoj interferenciji u ADA testu, da lako testira (predložene) modifikacije za varijabilni domen kako bi predvideo da li će svaka takva (predložena) modifikacije smanjiti ili u suštini potpuno izbeći takvu proteinska interferencija.

[0014] Ovaj pronalazak je definisan u zahtevima. Ovaj pronalazak takođe opisuje brojne modifikacije koje se mogu učiniti varijabilnim domenima kako bi se smanjila ili suštinski izbeglo takva proteinska interferencija. Prema jednom neograničavajućem aspektu, ova modifikacija obuhvata dodavanje ograničenog broja (kao što je dalje ovde opisano) aminokiselinskih ostataka (kao što je dalje ovde opisano) do C-terminalnog kraja varijabilnog domena. Neočekivano je otkriveno da, za više različitih varijabilnih domena ili konstrukata zasnovani na tome, čak dodavanje jednog aminokiselinskog ostatka na C-terminalnom kraju (kao što je jedan alanin ostatak) može značajno ili čak suštinski potpuno ukloniti problem proteinske interferencije u ADA testovima, iako dodavanjem jedne takve aminokiseline samo po sebi nije dovoljno da „pokrije“ ili „zakopa“ hidrofobnu zakrpu, koja je prema Nieba et al. prisutna na C-terminalnom delu ISV. Slično, ali bez želje da se ograničava pronalazak na bilo koji način ili bilo kojim mehanizmom ili objašnjenjem, takođe se pretpostavlja da dodavanje jedne takve aminokiseline neće biti dovoljno da „pokrije“ ili „zakopa“ bilo kakve B-ćelijske epitope koji prema WO 11/07586 mogu biti prisutni na C-terminusu varijabilnog domena takođe treba napomenuti da, iako prema ovom specifičnom aspektu sadašnjeg pronalaska, dodavanje ograničenog broja ili čak jedne aminokiselinu na C-terminusu varijabilnog domena (tj. bez ikakvih zamene u samoj C-terminalnoj regiji, kao što je predloženo od Nieba et al i WO 11/07586) može - i u mnogim slučajevima hoće - značajno smanjiti ili čak u suštini ukloniti problem nespecifične proteinske interferencije, gde su takođe u okviru ovog aspekta pronalaska takva dodavanja C-terminalnom kraju koja su u kombinaciji sa mutacijama u C-terminalnom regijom. U tom smislu, međutim, treba napomenuti da pronalazak nije posebno ograničen u pogledu obrazloženja za pravljenje takvih mutacija. Na primer, poznato je pravljenje mutacija aminokiselinskih ostatke u C-terminusu (uključujući na tim položajima koji su eksplicitno navedeni odNieba et al. i u WO 11/07586) u cilju humanizacije varijabilnog domena (uključujući, bez ograničenja, VHHdomena), ili kako bi se „kamilizovao“ VHdomen (referenca, na primer, upućuje na WO 08/020079 i nekih druge primene Ablynx N.V. na koje se poziva ovde).

[0015] Predviđeno je da se postupci, testovi i modifikacije o kojima se ovde govori mogu primeniti na bilo koji varijabilni domen koji nije povezan sa ili na drugi način u vezi sa konstantnim domenom (ili sa drugom grupom ili peptidnim delom koji funkcioniše tako da „zaštiti“, „pokrije“ ili „zakopa“ C-terminalnu regiju varijabilnog domena) i uopštenije, sa svakim varijabilnim domenom koji ima C-terminalne regije koje su izložene rastvaraču. Međutim, prema jednom poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, modifikacije se mogu posebno primeniti na varijabilne domene teškog lanca (VHdomene), a prema jednom specifičnom aspektu pronalaska, na VHHdomene.

[0016] Takođe je predviđeno da se postupci, testovi i modifikacije koji su ovde opisani mogu pogodno primeniti na proteinske konstrukte koji sadrže jedan ili više varijabilnih domena, a posebno takve konstrukte kod kojih varijabilni domen formira C-terminalni deo konstrukta ili, u slučaju postupaka i testova koji su ovde opisani, u kojima je C-terminalna regija varijabilnog domena na drugi način izložena rastvaraču. Ponovo, prema jednom poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, modifikacije se primenjuju na konstrukte u kojima VHdomen (a naročito VHHdomen) formira C-terminalni deo konstrukta ili, u slučaju postupaka i testova koji su ovde opisani, je na drugi način izložena rastvaraču.

[0017] Neki neograničavajući primeri takvih konstrukata su multivalentni, multispecifični (kao što su bispecifični) ili multiparatopični (kao što su biparatopični) konstrukti koji sadrže dva ili više ISV povezanih direktno ili preko jednog ili više pogodnih veznika (sa opet, prema jednom specifičnom aspektu, VHili VHHdomenom) i formiraju C-terminalni deo takvog konstrukta. Na primer, i bez ograničenja, takav konstrukt može se u potpunosti sastojati od VHdomena, i posebno od Nanotela (tj. VHHdomena, humanizovanih VHHdomena ili kamilizovanih VHdomena), ponovo povezanih direktno ili preko jednog ili više pogodnih veznika. Za neke neograničavajuće primere takvih konstrukata i opšte učenje o tome kako takva konstrukti mogu da se naprave (posebno na osnovu Nanotela) referenca je, na primer, Conrath et al., JBC 276, 10(9), 7346 (2001) kao i pregled članka od strane Muyldermans. Pregledi u Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001).

[0018] Međutim, na primer, takođe je predviđeno da se pronalazak može primeniti na druge konstrukte koji imaju varijabilni domen izložen rastvaraču, a naročito imaju varijabilni domen na svom C-terminusu, poput, na primer, jednolančanih Fv, i posebno scFv koji imaju svoj varijabilni domen teškog lanca na C-terminusu.

[0019] U ovom opisu i patentnim zahtevima, pojmovi poput „ISV“, „analitički agens“ i „proteinska interferencija“ imaju značenje kao što je dalje ovde definisano.

[0020] Posebno, ISV kako je ovde opisan može naročito biti ili Nanotelo ili (drugi) ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koji sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0021] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što lek zasnovan na ISV) poželjno ima takav naveden (ili barem jedan) ISV na svom C-terminalnom kraju. Opet, navedeni ISV može naročito biti ili Nanotelo ili (drugi) ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koji sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0022] Ovde opisani pronalazak je posebno namenjen i podoban da se primenjuje na ISV koje sadrže, zasnivaju se na i/ili su izvedeni iz varijabilnih domena teškog lanca, poput VH domena (uključujući ljudski VH domen) i Nanotela poput VHH domena (uključujući humanizovane i sekvencono-optimizovane VHH domene) ili kamilizovanih VH domena. To mogu biti sintetički (npr. dobijeni polazeći od sintetičke biblioteke i/ili zasnovanih na fiksnim okvirnim regijama), polu-sintetički (npr. humanizovani, kamilizovani ili sekvencnooptimizovani ili dobijeni sazrevanjem afiniteta ili CDR graftovanjem, počevši iz prirodnog VH ili VHH domena) ili potpuno prirodni VH ili VHH domeni. Pronalazak će stoga ovde dalje biti opisan sa pozivanjem na ISV koji su, su zasnovani i/ili su izvedeni iz VH ili VHH domena.

[0023] Pri utvrđivanju ovog pronalaska otkriveno je da, u nekim testovima (kao što je, na primer, u ADA imunotestovima) koji se koriste za analizu bioloških uzoraka (kao što su uzorci krvi, uključujući celu krv, serum i plazmu, okularnu tečnost, bronhoalveolarnu tečnost/BALF, cerebrospinalnu tečnost ili druge uzorke bioloških tečnosti) može doći do proteinske interferencije, i da takva proteinska interferencija može da dovede do nespecifičnog signala u nekim od ovih testova i/ili u nekom od ovih uzoraka. Takođe je otkriveno da do takve proteinske interferencije može doći ne samo u uzorcima koji su uzeti od pacijenata koji su tretirani sa ISV (i posebno sa Nanotela, ili sa proteinima, polipeptidima ili drugim biološkim lekovima koji sadrže najmanje jedan takvo ISV ili Nanotelo) i/ili kojima su isto to primenjeno (kao što su pacijenti ili klinički ispitanici), ali i u uzorcima iz pacijenata koji nisu nikada dobili su ISV (što pokazuje da je takva interferencija verovatno zbog nespecifične protein-protein interakcije sa prethodno postojećim proteinima, pre nego bilo koji ADA koji se pojavljuje).

[0024] Iako je utvrđeno da takva proteinska interferencija i/ili takav signal u takvim testovima nisu povezani sa bilo kakvim promenama ili smanjenjem farmakoloških svojstava (kao što su farmakokinetička/PK ili farmakodinamička/PD svojstva) od ISV, bilo bi poželjno imati dostupne tehnike za predviđanje, otkrivanje, redukciju i/ili po mogućstvu izbegavanje takve nespecifične proteinske interferencije. Ovo je opšti cilj ovog pronalaska.

[0025] Posebno, ovaj pronalazak daje, i u nekim specifičnim, ali neograničavajući aspektima, se odnosi na:

• testove koji se mogu koristiti da se predvidi da li dati ISV podleže takvoj proteinskoj interferenciji i/ili dovodi do porasta takvog (nespecifičnog) signala u takvom testu (kao što je na primer u ADA imunotestu). Takvi prediktivni testovi mogu na primer da se koriste za testiranje da li dati ISV može da ima sklonost da dovede do porasta takve proteinske interferencije i/ili takvog signala; da se izabere ISV koji nije ili je manje sklon takvoj proteinskoj interferenciji ili takvom signalu; kao test koji se može upotrebiti da se utvrdi da će određene modifikacije na ISV (u potpunosti ili delimično) smanjiti sklonost da se dovede do porasta takve interferencije ili takvog signala; i/ili kao test koji se može upotrebiti za usmeravanje modifikacije ili poboljšanje nekog ISV kako bi se smanjila sklonost da može povećati proteinska interferencija ili signal;

• postupke za modifikaciju i/ili poboljšanje ISV kako bi se uklonila ili smanjila njegova sklonost da može povećati proteinsku interferenciju ili signal;

• modifikacije koje se mogu uvesti u ISV koje uklanjaju ili smanjuju sklonost da može povećati proteinsku interferenciju ili signal;

• ISV koji su posebno odabrani (na primer, pomoću ovde opisanih testova) da nemaju ili imaju nisku/smanjenu sklonost da mogu povećati proteinsku interferenciju ili signal;;

• modifikovani i/ili poboljšani ISV tako da nemaju ili imaju nisku/smanjenu sklonost da mogu povećati proteinsku interferenciju ili signal;;

[0026] Na primer, u prvom neograničavajućem aspektu, opis se odnosi na postupak koji se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu) izazvati (ili imati visok ili povećan rizik od dovedu do rasta) proteinska interferencija u imunotestu (tj. nakon što je dat pacijentu, uzorak biološke tečnosti dobijen od navedenog pacijenta, i navedeni uzorak su podvrgnuti imunotestu kao što je dalje ovde opisano), navedeni postupak obuhvata izvođenje imunotesta tako da najmanje obuhvata sledeće korake:

(i) dovođenje u dodir navedenog ISV ili Nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelu) sa antitelom koje je dobijeno iz ljudskog pacijenta i koje je odabrano, proizvedeno i/ili izolovano na osnovu svoje sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj ISV ili Nanotela („analitičko antitelo"); i

(ii) utvrđivanje da li je navedeni ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu) vezan navedenim antitelom u navedenom imunotestu.

[0027] U ovom postupku, kada su ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu vezani navedenim analitičkim antitelom, može se očekivati da će navedeni ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu dovesti do porasta (ili imaju visok ili povećan rizik porasta) takve proteinske interferencije (kao što je dalje ovde definisano). Na osnovu toga, na primer, navedeni ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu mogu biti modifikovani ili poboljšani kako bi se smanjile ili uklonile sklonosti da dovedu do rasta takve proteinske interferencije (koje može ponovo da se utvrdi korišćenjem testa gore), i neke strategije koje se mogu koristiti za modifikovanje navedenog ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima biće ovde opisane (i npr. uključuju pričvršćivanje malog broja aminokiselinskih ostataka na C-terminalni kraj i/ili uvođenje jedne ili više specifične aminokiselinske supstitucije).

[0028] Tako, generalno, opis stručnjaku čini dostupnim testove i postupke/tehnike koje se mogu koristiti da predvide sklonost jednog ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelu da dovedu do porasta proteinske interferencije i/ili kao sredstvo za poboljšanje ISV kako bi se smanjila ili izbeglo njihova sklonost da dovedu do proteinske interferencije. Na taj način, pronalazak takođe pruža stručnjaku sredstva za odabir ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelu na osnovu njihove niske ili smanjene sposobnosti (ili odsustva sposobnosti) da dovedu do rasta proteinske interferencije. Stoga, opis pruža stručnjaku važna test i alat koji se može upotrebiti u optimizaciji i razvoju ISV, Nanotela, lekova zasnovanih na ISV ili lekova zasnovanih na Nanotelu.

[0029] Takođe, kao što je dalje ovde opisano, pronalazak pokazuje stručnjaku niz načina u kojima ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu mogu biti modifikovani ili poboljšani kako bi se smanjile ili izbegle njihove sklonosti da izazivaju porast proteinske interferencije. Stoga, ovaj pronalazak takođe uglavnom stavlja na raspolaganje modifikovane i/ili poboljšane ISV, Nanotela, lekove zasnovane na ISV ili lekove zasnovane na Nanotelu sa smanjenim, niskim ili bez svojstava da dovedu do proteinske interferencije.

[0030] Kako se dalje ovde opisano, opis se naročito može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu ) dovesti do povećanja proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu, a još bolje u ADA testu. Navedeni ADA test može na primer biti ADA test za generalno detektovanje ili merenje ADA protiv ISV i može naročito biti ADA test za detektovanje ili merenje ADA protiv ISV, koji se koristi u koracima (i) i (ii) gore.

[0031] Ponovo, kao što je ovde navedeno, ISV kako je ovde opisano može naročito biti ili Nanotelo ili drugi ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koji sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0032] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što lek zasnovan na ISV) poželjno ima navedeni (ili barem jedan) takav ISV na svom C-terminalnom kraju. Opet, navedeni ISV može naročito biti ili Nanotelo ili drugi ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koji sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0033] Uzorak koji je testiran u navedenim imuno ili ADA testovima se takođe ovde označava kao „test uzorak“. Da bi se izbegla zabuna, „test uzorak“ ne treba mešati sa biološkim uzorkom koji je ovde korišćen kao polazni materijal za dobijanje (poliklonskog ili monoklonskog) „analitičkog antitela“ koje se koristi u ovom pronalasku.

[0034] Kako se dalje ovde opisano, opis se naročito može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu ) dovesti do povećanja proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu (a naročito u ADA testu) koji podrazumeva korišćenje takvog ISV. Opet, navedeni ADA test može na primer biti ADA test za generalno detektovanje ili merenje ADA protiv ISV i može naročito biti ADA test za detektovanje ili merenje ADA protiv ISV, koji se koristi u koracima (i) i (ii) gore.

[0035] U jednom još određenijem ali neograničavajućem aspektu, opis se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu ) dovesti do povećanja proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu (a naročito u ADA testu) koji je namenjen da se odredi ili izmeri da li uzorak sadrži bilo koji ADA protiv ISV. Opet, na primer, takav imunotest može biti jedan od poznatih tipova ADA testa (za koju je referenca na primer napravljena sa ranijom strukom na ADA testovima koja je ovde citirana) koja se obavlja da se utvrdi ili izmeri da li je neki ADA prema navedenom ISV prisutan u „test uzorku“, pri čemu je navedeni test uzorak uzorak biološke tečnosti (kao što je ovde opisano) koji je dobijen iz pacijenta kom je navedeni ISV davan (kao što je dalje ovde opisano).

[0036] Kako se dalje ovde opisano, u svim ovim aspektima (i daljim aspektima pronalaska koji je ovde opisan), opis se može koristiti za odabir ISV koji nisu ili su manje skloni takvoj proteinskoj interferenciji u takvim imunotestovima ili ADA testovima; kao test ili test koji se može koristiti za testiranje da li će određene modifikacije na ISV (u potpunosti ili delimično) smanjiti sklonost da se dovede do porasta takve interferencije u takvim imunotestovima ili ADA testovima; i/ili kao test ili test koji se može upotrebiti za usmeravanje modifikacija ili poboljšanja nekog ISV kako bi se smanjila sklonost ka dovođenja do porasta takve proteinske interferencije u takvim imunotestovima ili ADA testovima.

[0037] Drugi aspekti, otelotvorenja, prednosti i primene pronalaska će postati jasni iz daljeg opisa ovde: i patentnih zahteva.

[0038] U ovom opisu, kad god se koristi izraz „ISV“, treba razumeti da:

• takav ISV je poželjno Nanotelo, gde je izraz „Nanotelo“ generalno definisan u WO 08/020079 ili WO 09/138519, i stoga u specifičnom aspekt generalno označava VHH, humanizovan VHH ili kamilizovan VH (poput kamilizovanog ljudskog VH) ili generalno sekvence optimizovanog VHH (kao npr. optimizovan za hemijsku stabilnost i/ili rastvorljivosti, maksimalno preklapanje sa poznatim ljudskim okvirnim regijama i maksimalnim eksprimiranjem). Napominje se da su izrazi Nanotelo ili Nanotela registrovani zaštitni znaci Ablynx N.V. i da se stoga mogu nazivati Nanobody® i/ili Nanbodies®);

• izraz „ISV“ u najširem smislu takođe uključuje „biološku materiju zasnovanu na ISV“ i kada je ISV Nanotelo „biološki materiju zasnovan na Nanotelu“. „Biološka materija zasnovana na ISV“ ovde je definisana kao protein, polipeptid ili drugi biološki lek koja sadrži ili se u osnovi sastoji od najmanje jednog (kao što je jedan, dva ili tri) ISV. Slično tome, „biološka materija zasnovana na Nanotelu“ je definisana kao protein, polipeptid ili drugi biološki lek koja sadrži ili se u osnovi sastoji od najmanje jednog (kao što je jedan, dva ili tri) Nanotela. Kao sa izrazom „ISV“, kad god se koristi izraz „biološka materija zasnovana na ISV“, treba razumeti da je takva biološka materija zasnovana na ISV poželjno biološka materija zasnovana na Nanotelu. U kontekstu ovog pronalaska, „biološka materija zasnovana na ISV“ i „biološka materija zasnovana na Nanotelu“ mogu, na primer, biti monovalentni, bivalentni (ili multivalentna), bispecifični (ili multispecifični), i biparatopični (ili multiparatopični) ISV konstrukt ili Nanotelo konstrukt, respektivno. Takođe, svaka biološka materija zasnovana na ISV ili Nanotelu može, na primer, pored jednog ili više (kao što je jedan, dva ili tri) ISV ili Nanotela, opciono dalje sadržati jedan ili više (kao što su jedan ili dva) dalja terapeutska dela i/ili jedan ili više (kao što je jedan ili dva) drugi deo, koji utiču na farmakokinetički profil ili farmakodinamičke osobine biološke materije zasnovane na ISV ili Nanotelu (kao što je njen poluživot). Pogodni primeri takvih daljih terapeutskih ili drugih delova će biti jasni stručnjaku, i na primer, generalno sadrž bilo koji terapeutski aktivan protein, polipeptid ili drugi vezujući domen ili vezujući jedinicu, kao na primer primerne modifikacije kao što su one opisane na stranama 149 do 152 iz WO 09/138159. Biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelu je poželjno terapeutska ili namenjena za upotrebu kao terapeutska (što obuhvata profilaksu i dijagnozu), i za tu svrhu poželjno sadrži najmanje jedan ISV protiv terapeutski relevantnog cilja (kao što su na primer RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 ili drugi interleukina, itd). Za neke specifične ali ne ograničavajuće primere takve biološke materije zasnovane na ISV ili Nanotelu, referenca je, na primer, napravljen u različitim prijavama od Ablynx N.V. (kao što su na primer i bez ograničavanja WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 i WO 2009/068627), kao na primer (i bez ograničavanja) u prijavama kao što su WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 i WO 07/085814. Takođe, u ovoj specifikaciji, ukoliko nije eksplicitno navedeno drugačije, svi ovde navedeni izrazi imaju značenje dato u WO 09/138519 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 09/138519) ili WO 08/020079 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 08/020079). Takođe, gde postupak ili tehnika nisu posebno opisani ovde, mogu se izvesti kao što je opisano u WO 09/138519 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 09/138519) ili WO 08/020079 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 08/020079).

[0039] Posebno, sledeći izrazi imaju isto značenje kao što je dato na, i/ili gde je to primenjivo može se odrediti na način opisan na stranama 62-75 WO 09/138519: „agonist, „antagonist“, „inverzni agonist“, „ne-polarni aminokiselinski ostatak koji nije pod nabojem“, „polarna aminokiselinski ostatak koji nije pod nabojem“, „polarni aminokiselinski ostatak pod nabojem“, „identitet sekvence“, „potpuno isto“ i „razlika aminokiselina“ (kada odnosi na poređenje sekvenci dve aminokiselinske sekvence), „suštinski izolovani (forum)“, „domen“, „vezujući domen“, „antigenska determinanta“, „epitop“, „protiv“ ili „usmeren protiv“ (antigena), „specifičnosti“ i „poluživot“. Pored toga, izrazi „moduliranje“ i „da modulira“, „mesto interakcije“, „specifično za“, „unakrsni blok“, „unakrsno blokiran“, i „unakrsno blokiranje“ i „u suštini nezavisno od pH“ su kao što je definisano na (i/ili može se odrediti kao što je opisano na) stranicama 74-79 iz WO 10/130832 podnosioca. Takođe, kada se odnosi na konstrukte, jedinjenja, proteine ili polipeptida pronalaska, pojmovi poput „monovalentno“, „bivalentno“ (ili „multivalentno“), „bispecifično“ (ili „multispecifično“), i „biparatopično“ (ili „multiparatopično“) mogu imati značenje dato u WO 09/138.519, WO 10/130832 or WO 08/020079.

[0040] Izraz „polu-život“ kako se ovde koristi u odnosu na ISV, Nanotelo, biološku materiju zasnovanu ISV, biološku materiju zasnovanu na Nanotelu ili bilo koju drugu sekvencu aminokiseline, jedinjenje ili polipeptid, može generalno definisati kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 od WO 08/020079, i kao što je navedeno tamo, odnosi na vreme potrebno za koncentraciju u serumu aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida da se smanji za 50%, in vivo, na primer zbog degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili zazor ili sekvesteracije sekvence ili jedinjenje prema prirodnim mehanizmima. In vivo poluživot jedne aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida prema predmetnom pronalasku se može odrediti na bilo koji način poznat per se, kao što je farmakokinetička analizom. Pogodne tehnike će biti jasne stručnjaku u oblasti, i mogu na primer generalno biti kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 od WO 08/020079. Kao što je takođe navedeno u paragrafu o) na strani 57. WO 08/020079, poluživot se može izraziti korišćenjem parametara kao što je t1/2-alfa t1/2-beta i površina ispod krive (AUC). U tom smislu, treba napomenuti da se izraz „polu-život“ kako se ovde koristi, naročito odnosi na t1/2-beta ili terminalni poluživot (gde t1/2-alfa i/ili AUC ili mogu ostati van razmatranja). Referenca je na primer napravljena na Eksperimentalni deo niže, kao i na standardne priručnike, kao što su Kenneth, A et al:

Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists i Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Referenca je takođe napravljena i na "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, objavljeno od Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition (1982). Slično, izrazi „porast polu-života“ ili „povećan polu-život“ su takođe definisani u paragrafu o) na strani 57 u WO 08/020079, i posebno se odnose na povećanje t1/2-beta, sa ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili obadva.

[0041] Kada izraz nije posebno ovde definisan, ona ima svoje uobičajeno značenje u struci, koje će biti jasno stručnjaku. Referenca je, na primer, napravljena na standardne priručnike, kao što su Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); i Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), kao i na opšte stanje tehnike tamo citirano.

[0042] Takođe, ovde su aminokiselinski ostaci jednog Nanotela numerisani prema opštoj numeraciji za VH domen datoj od Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), koji je primenjen na VHH domene od kamila u članku od Riechmann i Muildermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; ili se tamo navodi. Prema ovoj numeraciji, FR1 Nanotela obuhvata aminokiselinske ostatke na položajima 1-30, CDR1 Nanotelo obuhvata aminokiselinske ostatke na položajima 31-35, FR2 Nanotelo obuhvata aminokiseline na položajima 36-49, CDR2 Nanotelo obuhvata aminokiselinske ostatke na položajima 50-65, FR3 Nanotelo obuhvata aminokiselinske ostatke na položajima 66-94, CDR3 Nanotelo obuhvata aminokiselinske ostatke u položajima 95-102, i FR4 Nanotelo obuhvata aminokiselinske ostatke na položajima 103-113. [U tom smislu, treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u struci za VH domene i za VHH domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakoj od CDR može da varira i ne odgovara ukupnom broju aminokiselinskih ostataka koje navodi Kabat numeracija (to jest, jedan ili više položaja prema Kabat numeraciji ne moraju biti okupirani u stvarnom sekvenci, ili stvarni sekvenca može sadržati više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog po Kabat numeraciji). To znači da, generalno, Kabat numeracija može ili ali ne mora da odgovara stvarnoj numeraciji ostataka aminokiselina u stvarnoj sekvenci. Generalno, međutim, može se reći da, prema Kabat numeraciji i bez obzira na broj aminokiselinskih ostataka u CDR, položaj 1 prema Kabat numeraciji odgovara početku FR1 i obrnuto, položaj 36 prema Kabat numeraciji odgovara početku FR2 i obrnuto, položaj 66 prema Kabat numeracija odgovara početku FR3 i obrnuto, i položaj 103 prema Kabat numeraciji odgovara početku FR4 i obrnuto.].

[0043] Alternativni postupci za numeraciju aminokiselinskih ostataka VH domena, koji se takođe mogu primeniti na analogan način na VHH domene kamila i na Nanotela, su postupak opisani od strane Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), takozvana „AbM definicija“ i takozvana „kontakt definicija“. Međutim, u ovom opisu, aspektima i slikama, biće praćena Kabat numeracija primenjena na VHH domene po Riechmann i Muildermans, osim ukoliko nije naznačeno drugačije.

[0044] Takođe treba napomenuti da su Slike, Listing sekvenci i Eksperimentalni deo/Primeri dati samo da ilustruju pronalazak, i ne treba ih tumačiti ili razumeti kao na bilo koji način ograničavajuće za obim pronalaska i/ili priložene patentne zahteve, ukoliko nije eksplicitno drugačije naznačeno ovde.

[0045] Treba dalje naglasiti da predmetni pronalazak nije specifično ograničen na bilo koje uzroke, objašnjenja, hipoteze ili mehanizme od/za proteinske interferencije (i/ili signala nastalih u imunotestovima) koje je uočena u, i koje se može smanjiti prema, predmetnom pronalasku. Međutim, pretpostavlja se da se u krvi ili serumu (ili drugim biološkim tečnostima, kao što su one ovde navedeni) određenih pojedinaca ili grupa pojedinaca mogu nalaziti neki (unapred postojeći) proteini koji pod određenim okolnostima mogu (nespecifično) da se vezuju za ISV, što dovodi do interferencije signala u određenim testovima koji se koriste za analizu uzorka krvi ili serumu dobijenih od takvih pojedinaca. Ovo se, između ostalog, zasniva na posmatranju ostvarenom u postavci ovog pronalaska da se nespecifično proteinska interferencija koje se obrađuje ovim pronalaskom dešava ne samo kada su testirani uzorci dobijeni iz pacijenta koji su prethodno primili ISV, već i kada su testirani uzorci dobijeni iz pacijenta koji nisu prethodno primili ISV.

[0046] Konkretno, na osnovu posmatranja ostvarenih u postavci ovog pronalaska, i iako pronalazak nije ograničen na njih, smatra se da takvi (unapred postojeći) proteini mogu naročito da (budu sposobni da) se vezuju za C-terminalni kraj takvog ISV (koji, u konvencionalnom 4-olančanom monoklonskom antitelu pune veličini, kao i kod „samo teški lanac“ antitela koja se proalaze kod Camelidae, je povezan sa ostatkom antitela - tj. sa CH1 regijom u konvencionalnim monoklonskim i sa zglobnim regionom u Camelidae antitelima teškog lanca, respektivno - i time u takvim antitelima pune veličine može biti zaštićen od takve proteinske interferencije).

[0047] Ovo je potvrđeno nalazima koje su dobili pronalazači u ustanovljenju ovog pronalaska (ti nalazi su dalje ovde opisani) da određene (jednostavne) modifikacije ISV na njihovom C-terminalnom kraju mogu značajno smanjiti ili u suštini sprečiti takva proteinska interferencija. Shodno tome, postupci za modifikovanje ISV na taj način kao ISV koji su modifikovani na ovaj način formira dalje aspekte pronalaska, kako je dalje ovde opisano.

[0048] Predmetni pronalazak se naročito može koristiti za smanjenje ili izbegavanje proteinske interferencije i/ili signala usled nespecifičnog vezivanja u imunotestovima koji se obavljaju na biološkim uzorcima (kao što su uzorci krvi ili seruma) dobijenim od pacijenta kome je (biološki) lek je primenjen (opet, takvi uzorci su ovde takođe označeni kao „test uzorci“). Neki primeri za to su imunolotestovi koji se koriste za karakterizaciju rasporeda leka i formiranje antitela nakon primene biološkog leka na pacijentu, kao što su one na koje se poziva „Guideline on the Clinical Investigation of the Phcarmacokinetics of Therapeutic Proteins“ (dokument CHMP/EVP/89249/2004 od 27. januara, 2007) izdat od strane Komisije za lekove za ljudsku upotrebu (CHMP) Evropske agencije za lekove (EMEA). Kako se navodi na stranama 4 i 5 ovog dokumenta:

„Nekoliko mogućih slabosti je identifikovano i mogu dovesti do pogrešne karakterizacije raspodele leka i formiranja antitela. Treba razmotriti sledeće teme [..]:

Imunotest

Test leka,:

[0049]

[...]

(iii) Intefrerencija endogenim supstancama.

(Iv) Intefrerencija komponentama plazme ili anti-lek antitelom koje se vezuje za analit i inhibira komplementarna vezivanje za antitelo za prepoznavanje.“

[0050] Opis se posebno može koristiti kako bi se predvidele, smanjile ili izbegle ovakve vrste (nespecifične) proteinske interferencije u imunotestovima koji se koriste u analizi test uzoraka/uzorke za analizu od bioloških tečnosti uzetih od pacijenata kojima je primenjen ISV (a posebno Nanotela, ili biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima, kao što je dalje ovde definisano).

[0051] Opis se posebno može koristiti kako bi se predvidele, smanjile ili izbegle ovakve vrste (nespecifične) proteinske interferencije u imunotestovima koji se koriste za karakterizaciju rasporeda leka i/ili za određivanje formiranja bilo kakvih ADA (anti-lek) antitela. U tom smislu, treba napomenuti da generalno u ovoj specifikaciji i u priloženim patentnim zahtevima, kada se koristi formulacija poput „predvidele, smanjile ili izbegle ovakve vrste (nespecifične) proteinske interferencije", to uključuje ne samo predviđanje, smanjenje ili izbegavanje takve proteinske interferencije per se, nego takođe generalno predviđanje, smanjenje ili izbegavanje pojave nespecifičnih signala u imunotestovima (kao što su oni u kojima može doći do (nespecifičnih) signala povezanih sa proteinskom interferencijom, na primer, u ADA testovima), i posebno predviđanje, smanjenje ili izbegavanje, u takvim imunotestovima, pojave nespecifična signala koji, kada se posmatraju u takvom jednom testu, se obično pripisuju, povezani su sa i/ili uzeti kao znak (nespecifična) proteinske interferencije. U tom smislu, trebalo bi generalno biti napomenuti da, kako je ovde navedeno, ovaj pronalazak nije specifično ograničen na bilo koji uzroka, objašnjenje, hipotezu ili mehanizam.

[0052] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, opis se može koristiti za predviđanje, izbegavanje ili smanjenje takve proteinska interferencija u „anti-lek antitelo“ ili „ADA“ testovima koji se izvode na uzorcima (tj, „test uzorci“) bioloških tečnosti uzetih od pacijenata kojima je primenjen ISV (a posebno Nanotela, ili biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima, kao što je dalje ovde definisano).

[0053] U drugom specifičnom ali ne ograničavajućem aspektu, opis se može koristiti za predviđanje, izbegavanje ili smanjenje takve proteinske interferencije (i/ili nespecifičnih signala obično su povezane sa istim) u „anti-lek antitelo“ ili „ADA“ testovima koji se koriste za otkrivanje, merenje i/ili karakterisanje prisustva (bilo kog) anti-lek antitela protiv jednog ili više ISV (a posebno Nanotela, ili biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima, kao što je dalje ovde definisano). Konkretno, opis se može koristiti za predviđanje, izbegavanje ili smanjenje takve proteinske interferencije u „anti-lek antitelo“ ili „ADA“ testovima koji se izvode na uzorcima (tj, „test uzorci“) bioloških tečnosti uzetih od pacijenata kojima je primenjen ISV ili Nanotelo (ili biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima, kao što je dalje ovde definisano). Na primer, opis se može koristiti za predviđanje, izbegavanje ili smanjenje takve proteinske interferencije u takvim „anti-lek antitelo“ ili „ADA“ testovima koji se koriste za otkrivanje, merenje i/ili karakterisanje prisustva (bilo kog) anti-lek antitela protiv ISV ili Nanotela (ili biološke materije zasnovane na ISV ili biološke materije zasnovane na Nanotelima, kao što je dalje ovde definisano) koji je primenjivan na pacijentu iz kog je dobijen uzorak (bilo u kontekstu kliničkog ispitivanja i/ili u kontekstu terapije).

[0054] Stoga, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, opis se može koristiti za predviđanje, izbegavanje ili smanjenje takve proteinske interferencije (i/ili nespecifičnih signala obično povezanih sa istim) u biološkim uzorcima (tj, „test uzorci“) dobijenim iz pacijenta kome su primenjena jedna ili više takvih ISV ili Nanotela (ili biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima, kao što je dalje ovde definisano), gde su navedeni uzorci pogodni za i/ili namenjeni za upotrebu u imunotestovima, kao što je ADA test. Kao što je navedeno, takav biološki uzorak može biti krv (uključujući celu krvi, serum ili plazmu), okularna tečnost, bronhoalveolarna tečnost/BALF, cerebrospinalna tečnost ili bilo koji drugi pogodna biološka tečnost ili uzorak koji je pogodan za upotrebu u imunotestu, a posebno u ADA testu.

[0055] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, takav test uzorak može da bude dobijen iz pacijenta koji je podvrgnut višestrukoj primeni (na primer, najmanje 1 do 3 odvojena primena tokom perioda od najmanje 10 dana, kao što je najmanje mesec dana ili duže) i/ili hroničnom lečenju (tj. tretmana tokom najmanje 10 dana, kao što je najmanje mesec dana) sa ISV, Nanotelom, biološkom materijom zasnovanom na ISV (kao što je dalje ovde definisano) ili biološkom materijom zasnovanom na Nanotelima (kao što je dalje ovde definisano). Takva ISV, Nanotelo, biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima mogu se, na primer, davati navedenom pacijentu u kontekstu terapije ili u kontekstu kliničkog ispitivanja.

[0056] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, takav test uzorak može da bude dobijeni iz pacijenta, kom su bili primenjivani ISV, Nanotelo, biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima, koji imaju (i/ili im je pružen) povećan polu-život (kao što je ovde definisano, i u odnosu na monovalentni ISV), na primer, poluživot od najmanje 1 dana, poželjno najmanje 3 dana, još poželjnije najmanje 7 dana, kao što je na najmanje 10 dana u pacijentu kom je isto to primenjivano/se primenjuje.

[0057] ISV, Nanotelo, biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima su dati sa povećanim polu-životom putem funkcionalizacije i/ili uključivanjem u konstrukt dela ili vezujuće jedinice koja povećava polu-život konstrukta. Primeri takvih funkcionalizacija, delova ili vezujućih jedinica će biti jasni stručnjaku i mogu na primer biti kao što je ovde opisano, i na primer mogu da obuhvataju pegilaciju, fuziju za serum albumin, ili fuziju peptida ili vezujuće jedinice koja se može vezati za serumski protein kao što serum albumin. Takav peptid za vezivanje serum-albumina ili vezujući domen može biti bili koji pogodni peptid za vezivanje seruma-albumina ili vezujući domen sposoban da poveća poluživot konstrukta (u poređenju sa istim konstruktom bez peptida za vezivanje serum-albumina ili njegovog vezujućeg domena), i mogu posebno biti vezujući peptidi kao što je opisano u WO 2008/068280 od strane podnosioca zahteva (i posebno WO 2009/127691 i US prijava 61/301,819 koja nije ponovo podneta, obe od strane podnosioca zahteva), ili ISV za vezivanje serum-albumina (kao što je Nanotelo za vezivanje serum-albumina; npr. Alb-1 ili humanizovana verzija Alb-1 kao što je Alb-8, na koje se poziva, na primer, u WO 06/122787).

[0058] Stoga, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, takav biološki uzorak može da bude dobijen iz pacijenta kom su primenjivani ISV, Nanotelo, biološka materija zasnovana na ISV ili biološka materija zasnovana na Nanotelima, koji sadrže (ljudski) peptid za vezivanje serum albumina ili vezujući domen.

[0059] Kao što je već gore navedeno, u jednom neograničavajućem aspektu, opis se generalno odnosi na postupak koji se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima) izazvati porast (ili ima visoku ili povećanu sklonost da mogu izazvati porast) proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu (tj. nakon što je navedeni ISV primenjen pacijentu, uzorak biološke tečnosti je dobijen od navedenog pacijenta, i navedena biološka tečnost je podvrgnuta imunotestu kao što je dalje ovde opisano), navedeni postupak obuhvata sprovođenje imunotesta da najmanje obuhvata korake:

(i) dovođenje u dodir navedenog ISV ili Nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima) sa antitelom koje je dobijeno iz ljudskog pacijenta i koje je odabrano, proizvedeno i/ili izolovano na osnovu svoje sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj jednog ISV ili Nanotela („analitičko antitelo“); i (ii) utvrđivanje da li su navedeni ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima) vezani navedenim antitelom u navedenom imunotestu.

[0060] Ponovo, kao što je navedeno ovde, ISV kao što je ovde opisan može naročito biti ili Nanotelo ili (drugi) ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koje sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0061] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što lek zasnovan na ISV) poželjno ima navedeni (ili barem jedan) takav ISV na svom C-terminalnom kraju. Opet, navedeni ISV može naročito biti ili Nanotelo ili (drugi) ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koje sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0062] U alternativnom otelotvorenju, koja je takođe dodatno ovde opisano, umesto navedenog antitela dobijenog iz ljudskog pacijenta, može da se koristi monoklonsko antitelo ovde označeno kao „21-4-3“ (ili „21-4“ skraćeno, pogledati SEQ ID NO je 35 i 3-6 za VH i VL sekvence). 21-4 je generisan korišćenjem tehnologije hibridoma počevši od miša imunizovanog sa Nanotelo konstruktom od SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825, kako je dalje opisano u Primeru 7, i hibridoma ćelijska linija (nazvane „ABH0015“) koja eksprimira 21- 4 je deponovana 4. juna 2012. kod BCCM, Gent, Belgija, pod pristupnim brojem LMBP-9680-CB. Za monoklonski 21-4 se pokazalo da prepoznaje C-terminus Nanotelo konstrukt SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825, čiji se C-terminalni kraj sastoji od Nanotela (humanizovana VHH) podignutog protiv Von Vilebrand Faktor (vWF).21-4 je prvobitno podignut kao analitički reagensa za upotrebu u otkrivanju protein Nanotela (naročito, Nanotelo konstrukta od SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825) u uzorcima (seruma); iznenađujuće, sada je otkriveno da 21-4 takođe može da se koristi kako bi se predvidelo da li ISV ima sklonost da se podvrgne nespecifičnoj proteinskoj interferenciji (više nego neki drugi, uporedivi (mišji) monoklonski, podignuti protiv Nanotelo konstrukta od SEQ ID NO: 98, u WO 2006/122825 ili protiv drugih Nanotela).

[0063] Posebno, utvrđeno je da ako merenje vezivanje 21-4 na ISV (ili na proteina ili polipeptida koji sadrži ISV na svom C-terminalnom kraju, ili slični protein ili polipeptid kao što je navedeno ovde) daje RU vrednost manju od 500 (nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulske težine proteina, prema formuli [RU izmeren]/[MW proteina] x 10<6>), kada se određuje u skladu sa protokolom navedenim u Primeru 9, da navedeni ISV ili protein verovatno neće imati sklonost da se podvrgnu proteinskoj interferenciji (uz stepen sigurnosti obezbeđen podacima navedenim u Primere u nastavku). Za potrebe gornje formuli, MW se može izračunati kao zbir svih MW svih aminokiselinskih ostataka prisutnih u ISV.

[0064] Prema tome, bilo koji ovde opisan ISV, protein ili polipeptid poželjno ima takvu RU vrednost za vezivanje 21-4 manju od 500 (određeno prema protokolu navedenom u Primeru 9, i nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku težinu ISV ili proteina upotrebljenog prema gore navedenoj formuli).

[0065] Tako, ovaj aspekt opisa se generalno odnosi na postupak koji se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima) izazvati porast (ili ima visoku ili povećanu sklonost da mogu izazvati porast) proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu (tj. nakon što je navedeni ISV primenjen pacijentu, uzorak biološke tečnosti je dobijen od navedenog pacijenta, i navedena biološka tečnost je podvrgnuta imunotestu kao što je dalje ovde opisano), navedeni postupak obuhvata sprovođenje imunotesta da najmanje obuhvata korake:

(i) dovođenje u dodir navedenog ISV ili Nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima) sa monoklonskim antitelom 21-4 (koristi se kao „analitičko antitelo“); i

(ii) utvrđivanje da li su navedeni ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima) vezani navedenim monoklonskim antitelom 21-4 u navedenom imunotestu.

[0066] Navedeni postupak posebno se može izvesti korišćenjem BiaCore ili slične tehnike, a još određenije korišćenjem protokola koji je naveden u Primeru 9. Kao što je ovde navedeno, kada vezivanje ISV ili leka zasnovanog na ISV u tom protokolu pokazuje RU vrednost manju od 500 (nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku težinu ISV ili proteina, prema formuli [ [RU izmeren]/[MW proteina] x 10<6>), navedeni ISV ili protein zasnovan na ISV verovatno neće biti vezani nijednim faktorom interferencije koji su prisutni u krvi ili serumu ljudskog bića i/ili verovatno neće imati sklonost da se podvrgnu nespecifičnoj proteinskoj interferenciji u jednom ADA testa (tj. unutar stepena sigurnosti navedenog u eksperimentalnom delu dole).

[0067] Ponovo, kao što je navedeno ovde, ISV kao što je ovde opisan može naročito biti ili Nanotelo ili (drugi) ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koje sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0068] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što lek zasnovan na ISV) poželjno ima takav naveden (ili barem jedan) ISV na svom C-terminalnom kraju. Opet, navedeni ISV može naročito biti ili Nanotelo ili (drugi) ISV (tj. osim Nanotela) koji je VH domen ili koji sadrži VH domen; a poželjno je Nanotelo.

[0069] Kao što se takođe ovde pominje, gore navedeni postupak koji koristi 21-4 takođe se može koristiti za određivanje da li su ISV ili protein ili polipeptid koji sadrže ISV vezani (ili imaju sklonost da budu vezani) faktorima interferencije koji su prisutni u krvi ili serumu ljudskog bića.

[0070] Takođe, kako je ovde navedeno, predviđeno je da navedeni postupak koji koristi 21-4 takođe može da se koristiti za predviđanje da li će bilo koji protein ili polipeptid (kao što je fragment antitela ili ScFv) koji ima VH domen na svom C-terminalnom kraju biti vezani (ili imaju sklonost da budu vezani) faktorima interferencije koji su prisutni u krvi ili serumu ljudskog bića i/ili imaju sklonost da se podvrgnu proteinskoj interferenciji u ADA testu.

[0071] Pored 21-4, predviđeno je da antitelo ili fragment antitela (kao što je pogodan Fab fragmenta) koji sadrže varijabilne domene teškog lanaca i lakog lanca od 21-4 (pogledati SEQ ID NOs: 35 i 36 , respektivno) ili čak samo CDR sekvence od 21-4 (pogodno kalemljene u druge pogodne VH i VK okvire) mogu takođe da se koriste u postupcima koji su ovde opisani.

[0072] Kako je dalje ovde opisano, opis se naročito može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu) dovesti do porasta proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu koji je ADA test.

Navedeni ADA test može na primer biti ADA test za detektovanje ili merenje ADA protiv ISV generalno, i može naročito biti ADA test za detektovanje ili merenje ADA protiv ISV koji se koristi u koracima (i) i (ii) gore.

[0073] U jednom posebnom poželjnom ali neograničavajućem aspektu, opis se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu) dovesti do porasta proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu (a naročito, u ADA testu) koja podrazumeva korišćenje takvog ISV. Opet, navedeni ADA test može na primer biti ADA test za detektovanje ili merenje ADA protiv ISV generalno, i može naročito biti ADA test za detektovanje ili merenje ADA protiv ISV koji se koristi u koracima (i) i (ii) gore.

[0074] U jednom još određenijem ali neograničavajućem aspektu, opis se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu) dovesti do porasta proteinske interferencije (kao što je dalje ovde opisano) u imunotestu (a naročito, u ADA testu) koja podrazumeva korišćenje takvog ISV. Na primer, takav imunotest može biti: ADA test (tj. koji uključuje ISV) koji se izvodi kako bi se utvrdilo ili izmerilo da li je neki ADA prema navedenom ISV prisutan u uzorku koji je testiran, pri čemu je navedeni uzorak je uzorak biološke tečnosti (kao što je ovde opisano) koji se dobija iz pacijenta kom je davan navedeni ISV (kao što je dalje ovde opisano). Na primer, kao što je dalje navedeno, takav biološki uzorak može biti krv (uključujući celu krv, serum ili plazmu), okularna tečnost, bronhoalveolarna tečnost/BALF, cerebrospinalna tečnost ili bilo koji drugi pogodna biološka tečnost ili uzorak koji je pogodan za upotrebu u imunotestu, a posebno u ADA testu.

[0075] Kako je dalje ovde opisano, u svim ovim aspektima (i daljim aspektima pronalaska koji je ovde opisan), pronalazak se takođe može koristiti za odabir ISV koji nisu ili su manje skloni takvoj proteinskoj interferenciji u takvim imunotestovima ili ADA testovima; kao test koji se može koristiti za testiranje da li će određene modifikacije ISV (u potpunosti ili delimično) smanji sklonost da se dovede do takve interferencije u takvim imunološkim ili ADA testova; i/ili kao test ili test koji se može upotrebiti za usmeravanje modifikacije ili poboljšanja nekog ISV kako bi se smanjila sklonost ka dovođenju do rasta takve proteinske interferencije u takvim imunotestovima ili ADA testovima kakvi ovde opisani.

[0076] Kao što je navedeno, korak (i) postupka koji je ovde opisan obuhvata dovođenje u dodir ISV ili Nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelu) sa antitelom koje je dobijeno iz ljudskog pacijenta i koje je izabrano/izolovano na osnovu svoje sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj jednog ISV ili Nanotela (kao što je dalje ovde opisano). U navedenom koraku (i) postupka koji je ovde opisan, „navedeni ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelu)“ se koristi kao antigen u imunotestu (tj. kao supstanca koja se detektuje). Takođe, u navedenom koraku (i), „antitelo koje je dobijeno iz ljudskog pacijenta i koje je izabrano/izolovano na osnovu svoje sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj jednog ISV ili Nanotela“ koristi se kao analitički reagens (tj. na isti način kao i druga antitela koja se koriste u imunotestovima da detektuje prisustvo antigena ka kom su usmerena).

[0077] Kao što je već navedeno, i kako bi se bolje razumeo ovde opisan pronalazak, treba napomenuti da, u koraku (i), ISV se obično koristiti kao „antigen“ (tj, jer jedinjenje treba detektovati), i „analitičko antitelo“ će se koristiti kao analitički agens (tj, kao sredstvo za detekciju da li se dati ISV vezuje ili ne, respektivno; i stoga ima visok ili povećan rizik od dovođenja do rasta proteinske interferencije ili ne, respektivno). Na primer, kada se korak (i) izvodi u ELISA formatu, „antitelo/analitički agens“ obično će biti vezan za nosač (tj, na ELISA ploču) i ISV će biti (prisutan) u uzorku koji se testira.

[0078] Nasuprot tome, treba napomenuti da se u ADA testovima za detektovanje ili merenje ADA protiv ISV, ISV koristi kao „analitički agens“ (odnosno kao jedinjenje koje se koristi da detektuje da li je bilo koji ADA prisutan) i ADA je „antigen“ (tj, jedinjenje koje treba da se detektuje). Tako, u ovim testovima, ISV će obično/često biti vezan za nosač (kao što je ELISA ploča), dok će ADA (ako postoji) biti prisutna u uzorku koji je podvrgnut testu.

[0079] Međutim, kao što je već navedeno, treba generalno napomenuti da opis nije ograničen na testove u kojima je „analitičko antitelo“ vezano za nosač. Na primer, u alternativnom načinu vršenja testa prema pronalasku (kao što je prikazano u Primeru 5), analitičko antitelo se umesto toga koristi kao agens za premošćavanje i stoga će pre biti u rastvoru nego vezano za ploču (iako je posredno vezan za ploču preko ISV kojim je obložena na ploči). Međutim, takođe u specifičnom testu (premošćavanja) opisanom u Primeru 5 (koji je kompetitivni test) analitičko antitelo se uvek koristi kao analitički agens (tj. da se utvrdi da li se ISV od interesa vezuje ili ne, respektivno; i stoga ima visok ili povećan rizik od dovođenja do rasta proteinske interferencije ili ne, respektivno). Takođe je predviđeno da će, na osnovu daljeg opisa ovde, stručnjak moći da dizajnira druge formate testova u kojima se analitičko antitelo može koristiti kao analitički agens kako bi se utvrdilo da li se dati ISV može vezati ili ne, respektivno; i stoga ima visoku ili povećan rizik od dovođenja do rasta proteinske interferencije ili ne).

[0080] „Analitičko antitelo“ koje se koristi u koraku (i) može biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo.

[0081] Kada je analitičko antitelo poliklonsko antitelo, može na primer biti poliklonsko antitelo (priprema) koje je pribavljeno/prečišćeno/izolovano iz biološkog uzorka dobijenog od ljudskog pacijenta (kao što su krv, plazma, B-ćelije ili drugi pogodni biološki uzorak ili tečnost iz kojih se poliklonska antitela mogu pogodno izolovati). Ovo može biti npr. odgovarajući biološki uzorak koji je pribavljen od ljudskog pacijenta kome je davan najmanje jedan ISV (kao što je ISV koji se koristi u koraku (i), ali to nije neophodno ili esencijalno), ali takođe može biti (i poželjno je) pogodan biološki uzorak iz ljudskog pacijenta koji nikada nije primio niti bio tretiran sa ISV. Ono što je još važnije je da je poliklonsko antitelo dobijeno iz navedenog biološkog uzorka postupkom koji uključuje korak barem jedan korak afiniteta pomoću matrice afiniteta ili kolone koja nosi ISV kao grupu afiniteta (i jedan ili više drugih koraka za dobijanje/prečišćavanje/izolovanje poliklonskih antitela poznat per se). Na primer, poliklonsko antitelo može da bude dobijeno iz takvog biološkog uzorka pomoću hromatografije afiniteta korišćenjem kolone afiniteta koja nosi ISV, kako je, na primer, opisano u Primeru 2. Ovo može biti izvedeno npr. korišćenjem dobro poznatih tehnika za imunoafinitetnu hromatografiju za izolovanje antitela iz biološkog uzorka, koristeći matricu afiniteta koja nosi ISV kao antigen. Ovakve tehnike su generalno poznate u struci i njihovi pogodni primeri će biti jasni stručnjaku na osnovu ovde navedenih obelodanjenja.

[0082] Takvo poliklonsko antitelo (priprema) može posebno biti IgG (ili fragment IgG).

[0083] Na primer, to može biti poliklonsko antitelo koje je dobijeno pomoću postupka koji uključuje (imuno)afinitetnu hromatografiju, sprovedenu na uzorku biološke tečnosti dobijene iz ljudskog pacijenta, koristeći, kao antigen vezan za matricu afiniteta, ISV (i posebno Nanotelo, kao što je VHH, humanizovan i/ili sekvencno-optimizovan VHH ili kamilizovan VH, poput kamilizovanog ljudskog VH) koji ne sadrži C-terminalno obeležavanje (tj. čiji se C -terminus završava aminokiselinskom sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33)). Konkretno, ISV se koristi kao antigen vezan za matricu afiniteta koja može biti humanizovan ili sekvencno-optimizovan VHH (ili alternativno odgovarajući kamilizovan ljudski VH) čiji se C-terminus završava sa aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO: 33). U jednom specifičnom ali neograničavajućem aspektu, ISV koji se koristi kao antigen vezan za matricu afiniteta može biti humanizovan ili sekvencno-optimizovan VHH koji, kao rezultat takve humanizacija ili sekvencne-optimizacije, sadrži prolin (P) ostatak na položaju 14 tamo gde odgovarajući „naivni“ VHH sadrži alanin (A) na položaju 14 (drugim rečima, ISV koji se koristi kao antigen je humanizovana verzija VHH koji prirodno sadrži alanin na položaju 14, čiji je alanin ostatak, kao rezultat humanizacije i/ili sekvencne-optimizacije, zamenjen prolin (P) ostatkom). ISV koji se koristi kao antigen može takođe sadržati jednu ili više drugih aminokiselinskih supstitucija kao rezultat takve humanizacije ili sekvencne-optimizacije, na primer, generalno opisano u WO 08/020079 ili WO 09/138519.

[0084] Neki specifični primeri ISV koje se mogu koristiti kao antigen za generisanje/izolovanje „analitičkog antitela“ koje se koristi u ovom pronalasku su dati u SEQ ID NO: 1 i 2.

[0085] Ponovo, postupak koji se koristi za dobijanje poliklonskog antitela može, pored koraka (imuno)afiniteta, takođe da sadrži jedan ili više daljih koraka za izolovanje/prečišćavanje poliklonskog antitela iz biološkog uzorka (sproveden ili pre ili posle koraka afiniteta). Opet, takvi koraci i tehnike za njihovo izvođenje će biti jasni stručnjaku.

[0086] Stoga, u jednom aspektu, opis obuhvata postupak kao što je dalje opisano koji sadrži korake (i) i (ii) koji su ovde opisani, gde je „analitičko antitelo“ (tj. antitelo koje je pribavljeno od ljudskog pacijenta i koje je izabrano/izolovano na osnovu svoje sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj jednog ISV ili Nanotela) dobijeno iz biološkog uzorka dobijenog od ljudskog pacijenta (pri čemu je navedeni biološki uzorak onaj uzorak koji je pogodan za upotrebu u postupku za generisanja/izolovanja antitela iz navedenog uzorka) postupkom koja sadrži najmanje jedan korak afiniteta (kao što je korak afinitetne hromatografije, poput imunoafinitetne hromatografije) u kojoj se ISV (a poželjno Nanotelo) koristi kao antigen, a poželjno ISV se koristi kao antigen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) kao C-terminalnu sekvencu, a još poželjnije humanizovano i/ili sekvencno-optimizovano Nanotelo se koristi kao antigen koji obuhvata amino-kiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) kao C-terminalnu sekvencu, i čak poželjnije humanizovano i/ili sekvencno-optimizovano Nanotelo se koristi kao antigen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu VTVSS ( SEQ ID NO: 33) kao C-terminalnu sekvencu i koji sadrži prolinski ostatak na položaju 14, kao što je Nanotelo koje obuhvata aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) kao C-terminalnu sekvencu i koje sadrži prolin ostatak na položaju 14 koji je u Nanotelo uveden kao rezultat navedene humanizacije i/ili sekvencne-optimizacije (na primer, da zameni alanin ostatak koji se prirodno javlja na navedenom položaju u VHH koji je humanizovan i/ili sekvencnooptimizovan).

[0087] Gore navedeni ISV se takođe može koristiti u postupcima za izolovanje monoklonskih antitela (ponovo počevši od pogodnog biološkog uzorka dobijenog od ljudskog bića) koja su pogodna za upotrebu u ovom pronalasku kao „analitička antitela“.

[0088] Na primer, takvo monoklonsko antitelo se može dobiti počevši od krvi, B-ćelija ili drugog pogodnog uzorka ili materijala za izolovanje antitela, može biti izabrano na osnovu svoje sposobnosti da prepozna i/ili se veže za (C-terminalni kraj od) ISV ili Nanotela (u kojima, opet, ISV, koji je upotrebljen kao antigen tokom ispitivanja i/ili selekcije, je poželjno kao što je opisano u prethodnim paragrafima, uključujući preferencije navedene za takav ISV/antigen). Takvi ispitivanje i selekcija se mogu obaviti na bilo koji pogodan način, na primer korišćenjem selekcije B-ćelija i/ili tehnikama proširenja suštinski istih ili pogodno sličih tehnikama selekcije B-ćelija opisanim u EP 0488 470, WO 92/02551, EP 1633 787, WO 01/55216, WO 02/26829, WO 04/051268, WO 04/102198 ili WO 04/106377 ili tehnikama sličnim onim Nanoklonskim tehnikama opisanim u WO 06/079372 (ali korišćenjem ljudskih B-ćelija pre nego kamiljih B-ćelija).

[0089] Nakon što su jedna ili više B-ćelija identifikovane/izolovane da eksprimiraju odgovarajuće antitelo, navedeno antitelo može biti izolovano, eksprimirano i/ili proizvedeno na bilo koji pogodan način. Na primer, navedene B-ćelije mogu biti učinjene besmrtnim kao hibridomi koje proizvode željeno antitelo/antitela (upotrebom tehnika dobro poznatih per se za generisanje hibridoma počevši od izabranih B-ćelija), i navedeno antitelo/antitela može se zatim izolovati od (supernatanta kulture) navedenih hibridoma, ponovo koristeći pogodne tehnike dobro poznate u struci i opisane u različitim priručnicima i uputstvima, a takođe opisane i/ili pozvane na u patentnim publikacijama navedenim u prethodnom paragrafu.

[0090] Alternativno, navedene B-ćelije mogu biti proširene pomoću tehnika proširivanja B-ćelija poznatih per se, i antitelo/antitela mogu biti izolovani iz (supernatanta kulture) navedenih proširenih B-ćelija. Ponovo, ovo može biti izvedeno upotrebom odgovarajućih tehnika dobro poznatih u struci i opisanih u raznim priručnicima i uputstvima, kao i opisanih i/ili pozvanih na njih u patentnim publikacijama navedenim u prethodnim paragrafima.

[0091] U još jednoj alternativi, DNK koja kodira antitelo/antitela od interesa može se dobiti (npr. amplifikacijom) od navedenih B-ćelija, ili drugih pogodnih ćelija, bilo direktno (na primer, korišćenjem pogodnih tehnika jednoćelijskog PCR kloniranja) ili nakon pogodnog proširenja željenih B-ćelija. Navedeni DNK se zatim može pogodno eksprimirati u pogodnoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu kako bi se dobilo željeno antitelo/antitela. Ponovo, ovo može biti izvedeno upotrebom odgovarajućih tehnika dobro poznatih u struci i opisanih u raznim priručnicima i uputstvima, kao i opisanih i/ili pozvanih na u patentnim publikacijama navedenim u prethodnim paragrafima.

[0092] Takođe je moguće za stvaranje monoklonskih antitela koja su pogodna za upotrebu kao „analitička antitela“ postupkom koji uključuje repertoarsko kloniranje (polazeći od pogodnog uzorka dobijenog od ljudskog pacijenta) i ispitivanjem kloniranog repertoara za antitela koja se vezuju na ISV koji se koristi kao antigen (u kojima je opet, ISV, upotrebljen kao antigen tokom ispitivanja i/ili selekcije, poželjno kao što je opisano u prethodnim paragrafima, uključujući preferencije navedene za takav ISV/antigen). Postupci za kloniranje repertoara i različite tehnike za prikazivanje kloniranih repertoara za selekciju i ispitivanje (kao što je prikazivanje faga, prikazivanje ribozoma, i prikazivanje kvasaca) biće jasni stručnjaku i, na primer, opisani su u EP 0589877, EP 0774511, PU 90/14430 i EP 0368 684), kao i raznim priručnicima na temu.

[0093] Generalno, biološki uzorak koji se koristi kao početna tačka za dobijanje (poliklonskog ili monoklonskog) analitičkog antitela može biti bilo koji odgovarajući uzorak (tj. pogodne kao polazni materijal za dobijanje poliklonskog ili monoklonskog antitela, respektivno) dobijen od bilo kog pogodnog ljudskog pacijenta. U jednom specifičnom ali neograničavajućem aspektu, takva uzorak može, na primer, da se dobije od žene, a posebno od žene nakon menopauze. Tako, u jednom specifičnom ali neograničavajućem aspektu, analitička antitela, koja se koriste u koracima (I) i (ii) gore, dobijena su polazeći od biološkog uzorka koji je dobijen/izveden od žene nakon menopauze (ili je izveden od jednog antitela koje je dobijeno/izvedeno od žene nakon menopauze).

[0094] Takođe, biološki uzorak koji se koristi kao početna tačka za dobijanje (poliklonskog ili monoklonskog) analitičkog antitela može se dobiti od pacijenta kom je prethodno primenjen ISV (na primer, kao deo kliničkog ispitivanja ili terapeutski), ali je poželjno dobijen od pacijenta kom ISV nije prethodno primenjen.

[0095] Međutim, treba napomenuti da opis nije posebno ograničen na izvor analitičkog/analitičkih antitela koja se koriste, i dokazano je da je moguće u nekim slučajevima, korišćenjem ovde opisanih tehnika, da se dobiju (generišu, izoluju) druga pogodna analitičke antitela iz drugih izvora, uključujući komercijalno dostupne ljudsku krv ili plazmu (i čak krv, plazmu ili B-ćelije iz drugih vrsta sisara ili primata, kao na primer od babuna ili makaki rakojeda).

[0096] Kao što je navedeno, (poliklonska ili monoklonska) analitička antitela koja se koriste u koracima (i) i (ii) treba da budu takva da su sposobna da prepoznaju ili da se vežu za C-terminalni kraj ISV ili Nanotela, i najpoželjnije su odabrana i/ili izolovana na osnovu te sposobnosti da se vežu za C-terminalni kraj ISV ili Nanotela.

[0097] Kao što se vidi sa Slike 2, kada se ISV zasniva na ili je izveden od VH ili VHH domena, C-terminalni kraj ISV sadrži aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33), i shodno tome analitičko antitelo treba da bude sposobno da prepozna svaku ISV koji ima aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) na svom C-terminalnom kraju. Kao što se može dalje videti sa Slike 2, (barem neke od aminokiselinskih ostataka u) sekvenca VTVSS (SEQ ID NO: 33) je deo pretpostavljenog epitopa na ISV koja takođe uključuje, između ostalih ostataka, aminokiselinski ostatak na položaju 14 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu tog položaja u aminokiselinskoj sekvenci, kao što su položaji 11, 13 i 15) i može takođe sadržati aminokiselinski ostatak na položaju 83 ( i aminokiselinske ostatke pored/blizu tog položaja u aminokiselinskoj sekvenci, kao što su položaji 82, 82a, 82b i 84) i/ili aminokiselinski ostatak na položaju 108 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu tog položaja u aminokiselinskoj sekvenci, kao što je položaj 107. Položaj 109 je prvi V od C-terminalne VTVSS (SEQ ID NO: 33) sekvence i pokazano je da, na primer, položaj 110 takođe može imati uticaj na proteinsku interferenciju). Na ovo se takođe kolektivno ovde odnosi kao na „C-terminalnu regiju“, što podrazumeva da ta C-terminalna regija barem sadrži C-terminalnu sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) i aminokiselinski ostatak na položaju 14, a može sadržati aminokiselinske ostatke na položajima 83 i 108, a možda i aminokiselinske ostatke na položajima 13, 15, 82b, 83, 84 i 107.

[0098] Kao što je već navedeno, i ponovo bez ograničavanja bilo kojom hipotezom ili objašnjenjem, kod 4-orolančanog monoklonskog antitela pune veličine, ili antitela pune veličine koje ima samo teški lanac, kao ona što su prisutna kod kamila, C-terminalni kraj VH ili VHH domena je povezan sa ostatkom antitela - tj. CH1 regijom kod konvencionalnih monoklonskih ili sa zglobnom regijom kod kamiljih antitela teškog lanca, respektivno - i time, u takvim antitelima pune dužine može biti zaštićen od takve proteinske interferencije) i/ili obuhvaćen VH/VL interakcijom (u konvencionalnim 4-orolančanim antitelima) tako da je „C-terminalna regija“ i stoga obično nije izložena rastvaraču i/ili dostupna kao mesto interakcije za proteine koji su prisutni u krvi, serumu ili telu osobe kojoj se takav ISV daje. Međutim, ako se koriste ISV ili Nanotelo per se (tj. nevezano za bilo koji drugi deo antitela), ili ako se koristi lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima koji nose ISV ili Nanotelo na svom C-terminalnom kraju, ovaj C-terminalni epitop je dostupan za (nespecifičnu) interakciju sa drugim proteinima, i ponovo bez ograničavanja bilo kojom hipotezom ili objašnjenjem, pretpostavlja se da ova C-terminalna regija sada može biti dostupna da se podvrgne (nespecifičnoj) interakciji proteina sa jednim ili više proteina koji su prethodno postojeći u „test uzorku“ (na primer, jedan ili više IgG) koji treba da se testira i da to može da prouzrokuje proteinska interferencija i/ili nespecifične signale u imunotestu (a posebno u ADA testovima).

[0099] Kao što je navedeno, postupci koji su ovde opisani mogu da se koristiti za predviđanje, smanjenje ili izbegavanje takve interakcije proteina, a takođe mogu da se koristi kao sredstvo za usmeravanje modifikacije na ISV, Nanotelu, leku zasnovanom na ISV ili leku zasnovanom Nanotelima, tako kao da se istom obezbedi (delimično ili, poželjno, suštinski potpuno) smanjena sklonost da dovede do takvog porasta u proteinskoj interferenciji.

[0100] Kao što će biti jasno iz prethodnog paragrafa, i ponovo bez ograničavanja bilo kojom hipotezom ili objašnjenjem, posebno je očekivano (i deo opisa ovog pronalaska) da će (određene) modifikacije na „C-terminalnoj regiji“ promeniti (i poželjno smanjiti) sklonost jednog ISV da se podvrgne nespecifičnoj interakciji proteina, i to je ono što je primećeno eksperimentalno (pogledaj, na primer, eksperimentalne rezultate predstavljene u Primerima 1C i 3 u nastavku).

[0101] Na osnovu toga, i ponovo bez ograničavanja bilo kojom hipotezom ili objašnjenjem, predmetni pronalazak takođe daje određene modifikacije koje se mogu uvesti za ovu svrhu u C-terminalnu regiju ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima (čija se (potencijalna) efikasnost može testirati korišćenjem postupaka koji su ovde opisani). Isto tako, na osnovu ovog opisa, predviđeno je da će stručnjak u ovoj oblasti moći da izabere, dizajnira ili predložiti druge (kandidate za) modifikacije u C-terminalnoj regiji koji bi mogli da se uvedu za tu svrhu (a čija se (potencijalna) efikasnost ponovo može testirati korišćenjem postupaka koji su ovde opisani).

[0102] Vraćajući se na analitičko antitelo koje se koristi u opisu, to je poželjno (poliklonsko ili monoklonsko) antitelo koje prepoznaje C-terminalnu regiju (kao što je definisano gore) od ISV, a posebno ali bez ograničavanja, C-terminalnu regiju Nanotela.

[0103] Na primer, u jednom specifičnom neograničavajućem aspektu, „analitičko antitelo“ može biti poliklonsko ili monoklonsko koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže, i posebno specifično veže) za C-terminalnu regiju ISV ili Nanotelo čija se krajnja C-terminalna sekvenca završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33), ali ne prepoznaje (i/ili nije sposobno da se specifično veže za) C-terminalnu regiju ISV ili Nanotela (što može biti drugačiji ISV, ali je poželjno isti ISV) u kom postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala sekvence peptida ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID BR: 33).

[0104] U drugom, specifičnijem ali i dalje neograničavajućem aspektu, „analitičko antitelo“ može biti poliklonsko ili monoklonsko koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže, i posebno se specifično veže) C-terminalnu regiju ISV ili Nanotelo čija se krajnja C-terminalna sekvenca završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33) i kod kog je položaj 14 aminokiselina koja se prirodno ne javlja na položaju 14 i/ili je modifikovana u odnosu na aminokiselinu koja se prirodno javlja na položaju 14 (na primer kao rezultat humanizacije, kamilizacije i/ili optimizacije sekvence), ali ne prepoznaje (i/ili nije sposobno da se specifično veže za) C-terminalnu regiju ISV ili Nanotela (što može biti drugačiji ISV, ali je poželjno isti ISV) u kom postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala sekvence peptida ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID BR: 33); i/ili u kom je položaj 14 aminokiselina koja prirodno nastaje na položaju 14 (na primer alanin ili, kada ISV prirodno sadrži prolin na položaju 14, prolin).

[0105] Na primer, „analitičko antitelo“ može takođe biti poliklonsko ili monoklonsko koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže, i posebno se specifično veže) C-terminalnu regiju ISV ili Nanotelo čija se krajnja C-terminalna sekvenca završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33) i kod kog je položaj 14 prolin (i naročito kada je položaj 14 modifikovan do prolina, na primer, kao rezultat humanizacije, kamilization i/ili optimizacije sekvenca), ali ne prepoznaje C-terminalnu regiju ISV ili Nanotela ( što može biti drugačiji ISV, ali je poželjno isti ISV) u kom postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala sekvence peptida ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID BR: 33); i/ili u kom je položaj 14 je alanin.

[0106] „Analitičko antitelo“ može takođe biti poliklonsko ili monoklonsko koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže, i posebno specifično se veže) C-terminalnu regiju ISV ili Nanotelo čija se krajnja C-terminalna sekvenca završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33) i kod kog je položaj 14 prolin (pogotovu gde se prolin ostatak prirodno javlja na navedenom položaju u datom ISV), ali ne prepoznaje C-terminalnu regiju ISV ili Nanotela ( što može biti drugačiji ISV, ali je poželjno isti ISV) u kom postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala sekvence peptida ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID BR: 33); i/ili u kom je položaj 14 i dalje (prirodan ili nemodifikovani) prolin.

[0107] „Analitičko antitelo“ može takođe, na primer biti poliklonsko ili monoklonsko koje prepoznaje (C-terminalnu regiju) sekvence od ISV ovde pod nazivom „Nb 3.4“ (SEQ ID NO: 5), ali ne prepoznaje (C-terminalnu regiju) sekvence od ISV ovde pod nazivom „Nb 3.1“ (SEQ ID NO: 3) i/ili (i poželjno) ne prepoznaje sekvencu od ISV ovde pod nazivom „Nb 3.2“ (SEQ ID NO: 4).

[0108] Za gore navedene svrhe, da li „analitička antitelo“ prepoznaje (ili ne) ISV ili Nanotelo (i/ili jeste ili nije u stanju da se (specifično) veže za ISV ili Nanotelo) može se odrediti primenom bilo kog odgovarajuće testa vezivanja (kao što je Biacore), ali može se takođe odrediti korišćenjem ili Biacore testa opisanog u Primeru 3 ili ADA testa kao što je ADA test premošćavanja/kompetetivni test opisan u Primeru 5 (pogledati takođe Slike 1A do 1C i posebno Sliku 1B).

[0109] Pogodni formati/tehnike za izvođenje takvog testa biće jasne stručnjaku na osnovu opisa ovde, i na primer uključuju (bez ograničavanja):

• Kolorimetrijski test kao što je ELISA sa analitičkim antitelom obloženim direktno ili indirektno na ploču i detekciju vezanog ISV sa monoklonskim ili poliklonskim anti-ISV antitelom. Druge korisne alternativne tehnologije za ovu postavku uključuju, ali nisu ograničene na, elektrohemiluminiscenciju (MSD platforma), fluorescenciju (DELFIA, GYROS), i druge postupke koje se oslanjaju na sekundarnu detekciju vezanog ISV.

• Rezonanciju površinskog plazmona (kao što je Biacore) ili drugi biosenzorni postupak u realnom vremenu (tj. osim pomoću SPR) sa direktno ili indirektno imobilisanim analitičkim antitelom i praćenjem vezivanja naknadno ubrizganog/primenjenog ISV. Ovim postupcima ne treba dalja detekcija vezanog ISV. Reprezentativni postupak za izvođenje ove vrste je test opisan u Primeru 3.

• Analizirajući konkurentno ponašanje ISV u testu premošćavanja (ADA test) pomoću analitičkog antitela umesto ADA sadrži biološku tečnost. Za premošćavanje testa mogu da se koriste različite tehnologije, kao što su ELISA, na MSD platformi.

Reprezentativni postupci za obavljanje ove vrste su šematski prikazani na Slikama 1A do 1C i jedan specifični primer ove vrste testa je takođe opisan u Primeru 5.

• Bilo koji hromatografski postupci u kojima je analitičko antitelo imobilizovano na hromatografskoj matrici i specifično hvatanje/izolovanje ISV iz rastvora.

[0110] Nakon što je pogodno analitičko antitelo dobijeno primenom jednog od ovde opisanih postupaka ili u jednom od primera (ili u suštini ekvivalentim postupkom), navedeno analitičko antitelo se može koristiti za određivanje da li dati ISV ili Nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima) dovode do porasta (ili imaju visoku ili povećanu sklonost da mogu dovesti do porasta) proteinske interferencije (kao što je ovde definisano), tj. obavljanjem gore opisanih koraka (i) i (ii). Kao što je već ovde opisano, ovo generalno obuhvata dovođenje u dodir ISV, Nanotelo, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima sa analitičkim antitelom i utvrđivanja da li se navedeni ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima prepoznaju (i/ili su vezani, i naročito specifično vezani) od strane navedenog analitičkog antitela (a posebno da li je C-terminalna regija navedenog ISV ili Nanotela ili bilo kog ISV ili Nanotela koje formira C-terminalni kraj navedenog leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima prepoznaje od strane navedenog analitičkog antitela).

[0111] Ovo se generalno može sprovesti korišćenjem bilo koje pogodne tehnike za utvrđivanje da li je antigen (u ovom slučaju, ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima) vezan za antitelo, a odgovarajuće tehnike (imuno)testa će biti jasne stručnjaku. Neki neograničavajući primeri su pogodne ELISA tehnike (uključujući na primer sendvič ELISA); u kojima, zavisno od ELISA formata koji se koristi (kao što će biti jasno stručnjaku), analitičko antitelo ili ISV mogu biti obloženi na ploči i analitičko antitelo ili ISV mogu biti obeležena za detektovanje. Druge tehnike mogu, na primer uključiti upotrebu BIAcore instrumenta (gde je opet analitičko antitelo ili ISV možda obloženo na čipu, pogledati, npr., Primer 3). Druga alternativa može biti kompetetivni test premošćavanja (kao npr. prikazan u Primeru 5), gde se testira sposobnost ISV da se nadmeće sa drugim ISV, Nanotelima, lekovima zasnovanim na ISV ili lekovima zasnovanim na Nanotelima, za koje je poznato da se vezuju od strane analitičkog antitela (ili obratno). Ove i druge pogodne tehnike za određivanje da li su dati ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima (specifično) vezani ili prepoznati od analitičkog antitela biće jasno stručnjaku na osnovu opisa ovde.

[0112] Takođe će biti jasno, na osnovu opisa ovde, da se predmetni opis (a naročito analitičko antitelo koje se koristi u predmetnom pronalasku) može koristiti za određivanje da li dati ili ne dati ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima sadrže mesto interakcije (kao što je mesto interakcije prisutno na ili u okviru C-terminalne regije, i/ili čija C-terminalna regija formira deo) koje je sposobno da prolazi kroz (nespecifičnu) interakciju proteina sa jednim ili više proteina ili drugih komponenti koje mogu biti prisutne u biološkom uzorku (tj. „test uzorku“) dobijenim iz pacijenta koji treba da bude podvrgnut imunotestu poput ADA testu (naročito, ADA testu za određivanje prisustva bilo kog ADA protiv ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima). Stoga, kada su ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima prepoznati od strane analitičkog antitela koja se koristi u ovom pronalasku, vrlo je verovatno da navedeni ISV, Nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima sadrže takvo (dostupno ili izloženo) mesto interakcije, i stoga će imati sklonost da dovedu do rasta takve proteinske interferencije (kao što je ovde definisano) kada se koriste u takvom imuno ili ADA testu za testiranje test uzorka. Kao što će biti jasno stručnjaku, to je nešto što je poželjno izbegavati, ili selekcijom/korišćenjem drugog ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima ako je moguće, ili modifikovanjem ISV, Nanotelo, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima, tako da će njihova sklonost ka takvoj proteinskoj interferenciji biti značajno smanjena ili suštinski uklonjena (opet, ovo može da se testira pomoću postupka i analitičkog antitela koji su opisani ovde).

[0113] Kao što će takođe biti jasno stručnjaku na osnovu opisa ovde, takva modifikacija može, na primer, da obuhvata izradu jedne ili više modifikacija (kao što je umetanje, dodavanje, brisanje ili supstitucija aminokiselina) na mestu interakcije na ISV, Nanotelu, leku zasnovanom na ISV ili leku zasnovanom na Nanotelima, tako da će njegova sposobnost da se podvrgne (nespecifičnoj) proteinskoj interakciji sa jednim ili više proteinom ili drugim komponentama koje mogu biti prisutne u test uzorku biti smanjena ili uklonjena. Ponovo, ovo se može obaviti ograničenim pristupom pokušaja i pogrešaka, uvođenjem jedne ili više modifikacija, a zatim testiranjem da li je ova sposobnost smanjena ili ne, ponovo koristeći postupke i analitičko antitelo koji je ovde obelodanjeno. Na primer, jedna ili više takvih modifikacija mogu se uvesti, a zatim se sposobnost modifikovanog ISV da se veže za analitičko antitelo može uporediti sa onom originalnog/nemodifikovanog ISV. Alternativno, koristeći format kompetetivnog premošćavanja (kao što je, npr., prikazano u Primeru 5), ili korišćenjem BIAcore (videti, npr., Primer 3), može da se odredi sposobnost modifikovanog ISV da se (i dalje) nadmeće sa originalnim ISV za vezivanje analitičkog antitela.

[0114] Ponovo, i iako ovaj pronalazak nije ograničen bilo kojom hipotezom ili objašnjenjem, na osnovu eksperimentalnih dokaza koji su postavljen u donjim primerima, pronalazači su otkrili da se ovo mesto interakcije najverovatnije nalazi na/blizu C-terminalne regije (kao što je ovde definisano) ili da navedeno mesto obrazuje deo C-terminalne regije (ili da C-terminalna regija obrazuje deo ovog mesta interakcije). Ovo je, na primer, makar delimično zasnovano na zapažanju, ako ISV ima sklonost da dovodi do rast takve proteinske interferencije i ima VTVSS (SEQ ID NO: 33) kao aminokiselinske ostatke na svom C-terminalnom kraju, da pripajanje ograničenog broj aminokiselinskih ostataka (1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5), ili alternativno, oznake ili drugog peptida, proteina ili drugog dela na ovaj C-terminalni kraja, obično značajno smanjuje ili u suštinski uklanja navedenu sklonost. U nekim slučajevima, utvrđeno je da čak i dodavanjem 1, 2 ili 3 aminokiselinskih ostataka na C-terminalni VTVSS (SEQ ID NO: 33) (koji može biti bilo koja pogodna aminokiselina ili kombinacija aminokiselina, od kojih sve mogu da budu nezavisno izabrane iz bilo prirodnih aminokiselina poput onih navedenih u Tabeli A-2 na strani 64 od WO 09/138519, na primer i bez ograničavanja na alanin, glicin, valin, leucin ili izoleucin) može već značajno da smanje ili u suštini ukloni navedenu sklonost. Ovo je takođe delom zasniva na zapažanju da u nekim slučajevima, kada prirodni VHH sadrži alanin ostatak na položaju 14 (koji, kako je navedeno, formira deo C-terminalne regije; pogledati Sliku 2), prirodni VHH često nema (ili ima nisku) sklonost da dovede do porasta takve proteinske interferencije, dok odgovarajući VHH kod koga je alanin na položaju 14 zamenjen sa prolinskim ostatkom (na primer, za potrebe humanizacije ili sekvencne optimizacije) može kao rezultat toga imati povećanu sklonost da da dovede do porasta takve proteinske interferencije (tj. u odnosu na VHH sa alaninom na položaju 14).

[0115] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na VHH, Nanotelo (kako je ovde definisano, a posebno humanizovan VHH ili kamilizovan VH, kao što je kamilizovan ljudski VH) ili drugi ISV (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima sa VHH, Nanotelom ili drugim ISV na svom C-terminalnom kraju) koji je modifikovan (npr. uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, dodavanja ili brisanja), i posebno modifikovan u C-terminalnim regijama (kao što je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija ili dodavanje u C-terminalnoj regiji), tako da (i) ima suštinski smanjenu sklonost (kao što je najmanje statistički relevantno smanjenje sklonosti) da dovede do porasta proteinske interferencije (kako je ovde definisano); i/ili tako da (ii) ima, u ovde opisanom postupku pronalaska (kao u specifičnom testu opisanom u Primeru 3 ili 5), značajno smanjenu sposobnost da bude vezan analitičkim antitelom kako je ovde opisano (kao što je poliklonsko antitelo opisano u Primeru 2 i korišćeno u Primerima 3 i 5), u oba slučaja poželjno u odnosu na isti VHH, Nanotelo ili ISV, ali bez modifikacija.

[0116] Tako, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na VHH, Nanotelo (kako je ovde definisano, a posebno humanizovan VHH ili kamilizovan VH, kao što je kamilizovan ljudski VH) ili drugi ISV (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na Nanotelima sa VHH, Nanotelom ili drugim ISV na svom C-terminalnom kraju) koji je VHH ili VH domen (tj. ISV koji je VH domen ili je izveden od VH domena) i/ili koji je zasnovan ili je izveden iz (aminokiselinske sekvence od) VHH ili VH domena, gde VHH, Nanotelo ili ISV sadrže aminokiselinsku sekvencu VTVSS(X)n(SEQ ID NO: 34) na svom C-terminalnom kraju, gde n od 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1), i gde je svaki X (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je uvek nezavisno izabran (a poželjno nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I), međutim, što se može videti iz podataka prikazanih u nastavku, drugi (poželjno prirodni) aminokiselinski ostaci ili kombinacije navedenih poželjnih aminokiselinskih ostataka sa drugim aminokiselinskim ostacima (kao što su serin, prolin, treonin i/ili lizina) mogu se takođe koristiti). Poželjno, navedeni VHH, Nanotelo ili ISV sa aminokiselinskom sekvencom VTVSS(X)n(SEQ ID NO: 34) na svom C-terminalom kraju, takav je da (i) ima suštinski smanjenu sklonost (kao što je najmanje statistički relevantno smanjenje sklonosti) da dovede do porasta proteinske interferencije (kako je ovde definisano); i/ili tako da (ii) ima, u ovde opisanom postupku pronalaska (kao u specifičnom testu opisanom u Primeru 3 ili 5), značajno smanjenu sposobnost da bude vezan analitičkim antitelom kako je ovde opisano (kao što je poliklonsko antitelo opisano u Primeru 2), u oba slučaja poželjno u odnosu na isti VHH, Nanotelo ili ISV, ali sa aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID nO: 33) na svom C-terminalnom kraju. Referenca je na primer napravljen u testu i podaci su predstavljeni u Primeru 3.

[0117] Gore navedeni VHH, Nanotela ili (drugi) ISV su poželjno takvi da imaju RU vrednost za vezivanje za 21-4 manje od 500 (određuje se prema protokolu navedenom u Primeru 9, i nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekularne težine). Takođe, treba napomenuti da svaki put kad se poziva u ovom opisu ili u patentnim zahtevima na bilo koju C-terminalnu sekvencu VTVSS(X)n(uključujući bilo koji od aspekata (a) do (p) iznad, da prema jednom specifičnom aspektu pronalaska, nijedan od aminokiselina X nije cisteinski ostatak.

[0118] Na primer, u nekim poželjnim aspektima, C-terminalni kraj od ISV ili konstrukt koji sadrži ISV (kada je ovaj C-terminalni kraj ISV, VHH ili Nanotelo izveden od VH) može biti:

(a) VTVSS(X)n, gde je n = 1 i X = Ala;

(b) VTVSS(X)n, gde je n = 2 i svaki X = Ala;

(c) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i svaki X = Ala;

(d) VTVSS(X)n, gde je n = 2 i barem jedan X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile);

(e) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem jedan X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile);

(f) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem dva X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile);

(g) VTVSS(X)n, gde je n = 1 i X = Gly;

(h) VTVSS(X)n, gde je n = 2 i svaki X = Gly;

(i) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i svaki X = Gly;

(j) VTVSS(X)n, gde je n = 2 i barem jedan X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile);

(k) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem jedan X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile);

(l) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem dva X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile);

(m) VTVSS(X)n, gde je n = 2 i svaki X = Ala ili Gly;

(n) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i svaki X = Ala ili Gly;

(o) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem jedan X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile); ili

(p) VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem dva X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile);

gde su aspekti (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) i (n) posebno poželjni, gde su aspekti gde je n =1 ili 2 poželjni i aspekti gde je n = 1 posebno poželjni.

[0119] Takođe treba napomenuti da svaki put kad se poziva u ovom opisu ili u patentnim zahtevima na bilo koju C-terminalnu sekvencu VTVSS(X)n(uključujući bilo koji od aspekata (a) do (p) iznad, da prema jednom specifičnom aspektu pronalaska, nijedna od aminokiselina X nije cisteinski ostatak.

[0120] Stoga, u jednom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 1 i X = Ala (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0121] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 2 i svaki X = Ala (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0122] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 2 i barem jedan X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0123] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem jedan X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0124] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem dva X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0125] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i svaki X = Ala (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0126] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 1 i X = Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0127] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 2 i svaki X = Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0128] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i svaki X = Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0129] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 2 i barem jedan X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0130] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem jedan X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0131] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem dva X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0132] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 2 i svaki X = Ala ili Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0133] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i svaki X = Ala ili Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0134] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem jedan X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0135] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 3 i barem dva X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline ali se poželjno nezavisno biraju od Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0136] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n = 1, 2 ili 3 u kom je svaki X = Ala ili Gly.

[0137] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, u kom:

• n = 1, 2 ili 3 u kom je svaki X = Ala ili Gly; ili

• n = 2 ili 3 u kom je svaki osim jednog X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo kojih prirodnih aminokiselina ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile)

ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).

[0138] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), koji je Nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence (gde su Nanotela poželjna) koja ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, u kom:

• n = 1, 2 ili 3 u kom je svaki X = Ala ili Gly; ili

• n = 2 ili 3 u kom barem jedan X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo kojih prirodnih aminokiselina ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

• n = 2 ili 3 u kom je svaki osim jednog X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo kojih prirodnih aminokiselina ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i poželjno takvo Nanotelo) na svom C-terminalnom kraju.

[0139] U gore navedenim aspektima, pod navedeni (drugi) "ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden od VH sekvence" misli se na bilo koji ISV koji obuhvata VH sekvencu ili koji je izveden od VH sekvence i koji nije Nanotelo (tj. nije VHH, humanizovan VHH ili kamilizovan VH). Na primer, takav (drugi) ISV može na primer biti antitelo (jednog) domena zasnovano na VH, dAb™ zasnovan na VH, ili mikrotelo zasnovano na VH (pogledati WO 00/29004).

[0140] Ponovo, treba napomenuti da, svaki put kada se ovde poziva na jedan od ISV, on ima C-terminalnu VTVSS(X)nsekvencu (uključujući, bez ograničavanja, ISV naveden u prethodnim aspektima) koja prema jednom specifičnom aspektu pronalaska, nijedan od aminokiselina X nije cisteinski ostatak.

[0141] Kako je dalje ovde opisano, bilo koji takav protein ili polipeptid može na primer da bude konstrukt koji sadrži dva ili više ISV (kao što su dva ili više Nanotela), opciono vezane putem jednog ili više pogodnih veznika. Tako, na primer, takav konstrukt može biti bivalentni, trivalentni četvorovalentni ili petovalentni konstrukt (kao što je bivalentni, trivalentni četvorovalentni ili petovalentni Nanotelo konstrukt) i može na primer biti bivalentni, trivalentni četvorovalentni ili petovalentni konstrukt(kao što je bivalentni, trivalentni četvorovalentni ili petovalentni Nanotelo konstrukt) koji je bispecifični, trispecifični ili biparatopični konstrukt (uključujući na primer monospecifični, bispecifični ili biparatopični konstrukt koji se takođe može vezati za serumski albumin (poželjno) ili drugi protein seruma za produženje poluživota).

[0142] Ponovo, Nanotela, ISV i proteini/polipeptidi prema svakom od aspekata opisanih gore su poželjno takvi da imaju RU vrednost za vezivanje 21-4 manje od 500 (određuje se prema protokolu koji je naveden u Primeru 9, nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku težinu ISV ili proteina koji upotrebljen prema gore navedenoj formuli).

[0143] Kao što je ovde navedeno, takođe je predviđeno da pronalazak takođe može da se primeni na drugim proteinima ili polipeptidima (a posebno na fragmentima antitela kao što su Fab fragmenti ili drugim proteinima ili polipeptidima zasnovanim na fragmentima antitela, kao što su scFv) koji imaju VH-domen na svom C-terminalnom kraju. Prema tome, u sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na takav protein ili polipeptid (kao što je scFv) koji ima VH domen na svom C-terminalnom kraju sa aminokiselinskom sekvencom VTVSS(X)n(SEQ ID NO: 34) na svom C-terminalnom kraju, gde n je 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5, i gde je svaki X (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran (a poželjno nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I). Ponovo, prema nekim specifičnim aspektima, navedeni C-terminalni kraj može biti u skladu sa bilo kojim od (a) do (p) gore, i poželjno prema jednom od (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) ili (n), sa n kao 1 , 2 ili 3 i poželjno 1 ili 2.

[0144] Ponovo, takvi proteini ili polipeptidi su poželjno takvi da imaju RU vrednost za vezivanje 21-4 manju od 500 (određuje se prema protokolu navedenom u Primeru 9, a nakon prilagođavanja izmerene RU vrednost za molekularnu težinu ISV ili proteina upotrebljenog prema gore navedenoj formuli). Takođe, opet, prema jednom specifičnom aspektu ovog aspekta pronalaska, nijedna od aminokiselina X u C-terminalnoj sekvenci VTVSS (X)nnije cisteinski ostatak.

[0145] Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski ISV ili protein ili polipeptid koji sadrži bar jedan terapeutski ISV, gde su navedeni ISV, protein ili polipeptid kako je dalje ovde opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranicama, a još bolje ISV, protein ili polipeptid koji imaju C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata), i najmanje jedan pogodan nosač, razblaživač ili ekscipijens (npr. pogodni za farmaceutsku upotrebu), i opciono jedna ili više druga aktivna supstanca. Takvi sastavi, nosači, razblaživači ili ekscipijensi mogu, na primer biti, kao što je opisano u WO 08/020079, farmaceutski sastavi koji sadrže Nanotelo ili protein ili polipeptid koji sadrži barem jedno Nanotelo (i kao što je već navedeno, prema predmetnom pronalasku, ISV je takođe poželjno Nanotelo).

[0146] Pronalazak se dalje odnosi na ISV ili protein ili polipeptid koji sadrži najmanje jedan ISV za primenu u terapiji bolesti kod čoveka (npr. pacijenta kome je potrebna takva terapija), pri čemu su ISV, protein ili polipeptid kao što je dalje ovde opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranicama, a još bolje ISV, protein ili polipeptid koji imaju C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata).

[0147] Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu nekog ISV ili proteina ili polipeptida koji sadrži najmanje jedan ISV u pripremi farmaceutskog sastava, gde su navedeni ISV, protein ili polipeptid kako je dalje ovde opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranicama, a još bolje ISV, protein ili polipeptid koji imaju C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata).

[0148] Pronalazak se dalje odnosi na postupak tretmana koji sadrži primenu na ljudskom pacijentu (npr. pacijentu kom je potreban takav tretman) jednog ISV ili proteina ili polipeptida koji sadrži najmanje jedan ISV u pripremi farmaceutskog sastava, gde su navedeni ISV, protein ili polipeptid kako je dalje ovde opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranicama, a još bolje ISV, protein ili polipeptid koji imaju C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata); ili farmaceutska sastav (kao što je gore opisano) koji sadrži najmanje jedan takav ISV, protein ili polipeptid.

[0149] U vezi sa navedenim, biće jasno da je terapeutska upotreba ISV, proteina i polipeptida koji su ovde opisani veoma važan aspekt pronalaska, jer takva terapeutska upotreba (ili klinički razvoj takvih ISV, proteina i polipeptida za takvu terapeutsku upotrebu) može uključivati korišćenje ADA testova za određivanje da li se navedeni je ISV, protein ili polipeptid imunogena (npr. može dovesti do porasta ADA kada se primenjuje na ljudskom pacijentu). U tom smislu, takođe će biti jasno da tek treba pozabaviti zabrinutosti o mogućoj imunogenosti, kada se terapeutsko sredstvo koristi u dužem vremenskom periodu (tokom nedelja, meseci ili godina), i/ili ima polu-život (izražen kao t1/2-beta) kod ljudskog pacijenta od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jedne nedelje, i do 10 dana ili više.

[0150] Tako, prema jednom specifičnom aspektu pronalaska, ISV, protein, polipeptid ili farmaceutski sastav, kako su ovde opisani, namenjeni su za lečenje hronične bolesti kod ljudi i/ili je takav ISV, protein, polipeptid, kao što su opisano ovde, namenjen da bude prisutan u cirkulaciji pacijenta (tj. na farmakološki aktivnim nivoima) kom se primenjuje (npr. u terapeutski aktivnoj dozi) u periodu od jedne nedelje, poželjno najmanje dve nedelje, kao što je najmanje par meseci; ISV, protein, polipeptid, kao što su ovde opisani, su takvi da imaju poluživot (poželjno izražen kao t1/2-beta) kod ljudskog pacijenta od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jedan nedelje, i do 10 dana ili više. Takav ISV, protein, polipeptid ili farmaceutski sastav, kao što je ovde opisano, namenjen je da se daje čoveku kao dve ili više doze koje se primenjuju tokom perioda od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jedna nedelja, na primer najmanje dve nedelje ili bar jedan mesec, ili čak i duže (tj. najmanje 3 meseca, najmanje 6 meseci ili najmanje godinu dana), ili čak hroničnq primena.

[0151] Opis se dalje odnosi na postupak za (značajno) smanjenje ili suštinsko uklanjanje sklonosti ISV, Nanotela ili lekova zasnovanih na ISV ili lekova zasnovanih na Nanotelima da dovedu do proteinske interferencije, gde navedeni postupak obuhvata barem sledeće korake:

• opciono određivanje sklonosti ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima da dovede do povećanja proteinske interferencije, koristeći postupak koji barem sadrži korake (i) i (ii) kao što je opisano ovde;

• modifikovanje navedenog ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima uvođenjem jedne ili više aminokiselinske supstitucije, dodavanja ili brisanja u navedenom ISV ili Nanotelu, ili na C-terminalu ISV ili Nanotela (ako postoji) leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog Nanotelima; a naročito uvođenjem jedne ili više aminokiselinske supstitucija ili dodavanje u C-terminalnoj regiji navedenog ISV ili Nanotela, ili u C-terminalnoj regiji C-terminala ISV ili Nanotela (ako postoji) leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog Nanotelima, na primer dodavanjem C-terminalom kraju od sekvence 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5, aminokiselinskih ostataka gde su svi nezavisno odabrani od svih prirodnih aminokiselina (kao što su oni navedene u Tabeli A-2 na strani 64 od WO 09/138519, na primer i bez ograničavanja od alanina, glicina, valina, leucina i izoleucina); • određivanje sklonosti tako modifikovanog ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima da dovede do povećanja proteinske interferencije, koristeći postupak koji barem sadrži korake (i) i (ii) kao što je opisano ovde; opciono na način koji omogućava poređenje sklonosti tako modifikovanog ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima da dovede do porasta proteinske interferencije sa sklonosti originalnog ISV, ISV, Nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na Nanotelima da dovede do proteinske interferencije (uključujući, bez ograničavanja, poredeći ih u kompetetivnom testu za vezivanje za analitičko antitela kako je ovde opisano). Alternativno, može da se koristi postupak opisan ovde koji uključuje upotrebu 21-4.

[0152] Pronalazak će sad dalje biti opisan putem narednih neograničavajućih poželjnih aspekata, primera i slika, gde:

• Slika 1A do 1C šematski prikazuje neke neograničavajuće primere ADA test formata.

Neki reprezentativni ali neograničavajući protokoli za sprovođenje tih testova su navedeni u Primeru 4.

• Slika 2 šematski prikazuje reprezentativnu 3D strukturu ISV, kao što je Nanotelo.

• Slika 3 je kriva vezivanja (dobijena koristeći BIACORE test opisan u Primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 3.4 do 3.9 (SEQ ID NO: 5 do 10) za imobilisano poliklonsko antitelo dobijeno u Primeru 2.

• Slika 4 je kriva vezivanja (dobijena koristeći BIACORE test opisan u Primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 3.4, 3.11, 3.12 i 3.13 (SEQ ID NO: 5, 12, 13 i 14) za imobilisano poliklonsko antitelo dobijeno u Primeru 2.

• Slika 5 je kriva vezivanja (dobijena koristeći BIACORE test opisan u Primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 3.4, 3.14 i 3.15 (SEQ ID NO: 5, 15 i 16) za imobilisano poliklonsko antitelo dobijeno u Primeru 2.

• Slika 6 je kriva vezivanja (dobijena koristeći BIACORE test opisan u Primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 3.1, 3.2 i 3.4 (SEQ ID NO: 3, 4 i 5) za imobilisano poliklonsko antitelo dobijeno u Primeru 2.

• Slika 7 je kriva vezivanja (dobijena koristeći BIACORE test opisan u Primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 4.1 i 4.2 (SEQ ID NO: 17 i 18) za imobilisano poliklonsko antitelo dobijeno u Primeru 2.

• Slika 8 je kriva vezivanja (dobijena koristeći BIACORE test opisan u Primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 6.1, 6.2, 6.4 i 6.5 (SEQ ID NO's 19 do 22) za imobilisano poliklonsko antitelo dobijeno u Primeru 2.

• Slika 9 daje Tabelu koja prikazuje sekvence korišćene u Primeru 8 (SEQ ID NO: 37 do 89) i postavlja odgovarajuću referentnu sekvencu.

[0153] Sekvence na koje se poziva u ovom opisu i patentnim zahtevima date su u Tabeli A u nastavku (SEQ ID NO: 1 do 37) i na Slici 9 (SEQ ID NO: 38 do 89).

TABELA A

Eksperimentalni deo:

Primer 1: Generisanje poliklonskog analitičkog antitela.

[0154] Poliklonsko antitelo (IgG fragment) koje može da se koristiti kao „analitičko antitelo“ generisano je kao što sledi:

A. Identifikovanje pogodnih uzoraka plazme za izolovanje poliklonskog antitela [0155] Dvadeset uzoraka plazme iz zdravih osoba koje nikada nisu tretirane sa ISV procenjeno je za prisustvo antitela protiv ISV koje može da se koristi kao analitičko antitelo u pronalasku.

[0156] ISV koji je prvobitno korišćen u ovom primeru je SEQ ID NO: 1. Potom, kako bi se potvrdilo da interakcija nije specifična za ovaj određen ISV, već da je nespecifična proteinprotein interakcija koji se može pojaviti u brojnim ISV, testovi u nastavku su ponovljeni sa drugim ISV (pogledati paragraf C) u nastavku). Kao alternativa za SEQ ID NO: 1, na primer mogu da se koristite SEQ ID NO: 2.

[0157] Korišćen test bio je ECL (Elektrohemiluminiscencija) zasnovan na testu premošćavanja koji koristi biotinilovan ISV (biotinilovana varijanta SEQ ID NO: 1) za snimanje i sulfo-označavanje ISV kako bi se otkrila anti-lek antitela. Sličan format se takođe koristi za obavljanje ADA testova. Biotinilovanje i sulfo-označavanje ISV su izvršeni upotrebom standardne hemije kuplovanja na primarnim aminima korišćenjem Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) i Sulfo-oznaka NHS-Estera (MSD), odnosno u skladu sa uputstvima proizvođača. Uzorci plazme su razblaženi 1/5 u PBS/0,1% kazeina i inkubirani 30 minuta na 37°C, 600 RPM u 96-komoričnim polipropilenskim pločama. Uzorci (50 pL) su zatim razblaženi 1/3 u 1:1 smeši (100 µL) 2 µg/mL biotinilovanog i 2 µg/ml sulfo-označenog ISV (SEQ ID NO: 1) i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi, 600 RPM. MSD MA®96-komorične standardne streptavidin ploče su blokirane sa 150 µL/po komorici Superblock® T20 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim isprane 3 puta sa PBS/0,05% Tween20 (= pufer za ispiranje). Uzorak/1: 1 smeše (biotinilovan i sulfo-označen ISV (SEQ ID NO:.1) (50,0 µL) je premešten iz polipropilenske ploče na MSD ploču i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi, 600 RPM ploče su isprane tri puta pre dodavanja 2 x pufera za čitanje (MSD) (150 µL/komorica) i čitanja ECL jedinice (ECLU) na MSD instrumentu (Sector Imager 2400 čitač). Uzorci su ispitivani kao pozitivni ili negativni korišćenjem ispitivanja granične tačke utvrđene tokom postupka validacije. Ispitivanje granične tačke je izračunato na osnovu pozadinskih vrednosti od 118 pojedinačnih uzoraka plazme zdravih pojedinaca koji nikada nisu bili tretirani sa ISV, koristeći odgovarajuće statističke analize kao što je preporučeno od strane smernice za razvoj ADA testa (Shankar, 2008). Korišćena je neparametarska procena, i granična vrednost je izračunata na osnovu 95-og percentila, nakon isključenja spoljnih članova.

[0158] Šest uzoraka plazme su jasno označeni kao pozitivni: IHuP#002-001-ABL-01, IHuP#002-001-ABL-08, IHuP#002-001-ABL-10, IHuP#002-001-ABL-15, IHuP#002-001-ABL-19 i IHuP#002-001-ABL-20 (Tabela I).

[0159] Ovi uzorci su dalje analizirani u postavci premeštanja leka (potvrdni test) da se potvrdi specifičnost pozitivnog ishoda posmatranja (Tabela II). Stoga, uzorci su razblaženi 1/5 u PBS/0,1% kazeina koji sadrži 12,5 µg/mL ISV (SEQ ID NO: 1) i inkubirani 30 minuta na 37°C, 600 RPM u 96-komoričnoj polipropilenskoj ploči. Uzorci (50 pL) su zatim razblaženi 1/3 u 1: 1 smeši (100 µL) 2 µg/ml biotinilovanog i 2 µg/ml sulfo-označenog ISV (SEQ ID NO: 1) i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi, 600 RPM. Zatim, uzorak/1: 1 smeše (biotinilovan i sulfo-obeležen ISV) (50,0 µL) je premešten iz polipropilenske ploče na blokiranu MSD MA<®>96-komoričnu standardu Streptavidin ploču kao što je opisano gore za test posmatranja i inkubiran e tokom 1 sata na RT, 600 min. Ploče su isprane tri puta pre dodavanja 2 x pufera za čitanje (MSD) (150 µL/komorica) i čitanja ECL jedinica (ECLU) na MSD instrumentu (Sector Imager 2400 čitač). Uzorci su potvrđeni kao pravi pozitivni korišćenjem potvrdnim graničnih tački određenih tokom postupka validacije i izračunati na ECL odgovoru od 118 pojedinačnih uzoraka plazme zdravih osoba koje nikada nisu tretirane sa ISV, koji su dostigli vrhunac sa 50 µg/ml ISV (SEQ ID NO: 1) koristeći odgovarajuće statističke analize kao što je preporučeno od strane smernice za razvoj ADA testa (Shankar, 2008). Minimalno smanjenje signala od 50% izračunato je na osnovu intervala pouzdanosti od 99%.

[0160] Uzorci koji su bili pozitivni na testu premošćavanja zasnovanom na ECL i koji su potvrđeni kao pozitivni u testu sa postavkom premeštanja leka, izabrani su kao izvor za generisanje poliklonskog antitela koristeći hromatografiju afiniteta.

Tabela I: rezultati posmatranja 20 uzoraka plazme u ADA ISV testu.

Tabela II: Potvrda pozitivnog posmatranja plazma uzorka u potvrđujućem testu. Potvrdna granična tačka od 50% je korišćena za procenu rezultata. Jedan uzorak nije potvrđen kao zaista pozitivan uzorak

[0161] Dodatnih tri uzorka seruma od pojedinaca koji nisu tretirani sa ISV su takođe procenjivani korišćenjem testa premošćavanja zasnovanog na ECL koji je opisan gore i potvrđen korišćenjem testa sa postavkom premeštanja leka.

[0162] Dva uzorka seruma su jasno označena kao pozitivna u testu premošćavanja zasnovanom na ECL: IHUS#B09032311A3 i IHUS#B09032311A20 (Tabela III). Dva pozitivno ispitana uzorka su dalje analizirana u testu sa postavkom premeštanja leka kako bi se potvrdila specifičnost pozitivnog ishoda ispitivanja.

Tabela III: Rezultati ispitivanja i potvrde za 3 uzorka seruma i odgovarajuć pročišćen IgG fragment

B. Generisanje pročišćenog poliklonskog IgG framenta.

[0163] Poliklonsko IgG je prečišćeno iz uzoraka IHUS#B09032311A3 i IHUS#B09032311A20 (pogledati gore) upotrebom Protein G HP Spin Trap kolona (GE Healthcare) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, posle uklanjanja rastvora skladištenja od kolone uz pomoć centrifugiranja (30s pri 100x g), kolona je ekvilibrisana dodavanjem pufera za vezivanje (20 mM natrijum fosfata, pH 7,0). Posle centrifugiranja, rastvor koji sadrži željeno poliklonsko je dodat (mak 1 mg u 600 µL) i kolona je inkubirana tokom 4 minuta uz nežno mešanje. Kolona je zatim centrifugirana i isprana 2x sukcesivnim dodavanjem pufera za vezivanje(600ml) i centrifugiranjem. Posle dodavanja 400 µL eluacionog pufera (0,1 M glicin-HCI, pH 2,7) i mešanja inverzijom, antitelo je eluirano centrifugiranjem u 30 µL pufera za neutralizaciju (1M Tris-HCl, pH 9,0).

[0164] Kako bi se potvrdilo da IgG fragment dobijen na taj način učestvovao u nespecifičnom vezivanju za ISV, prečišćeno IgG antitelo je analizirano u gore opisanom testu premošćavanja zasnovanom na ECL i potvrđeno je pomoću testa sa postavkom premeštanja leka, koji je korišćen pod A) gore. U oba uzorka (IHUS#B09032311A3 i IHUS#B09032311A20), za prečišćeno IgG antitelo je potvrđeno da je uključeno u nespecifična vezivanje što dovodi do pozitivnog signala na testovima (Tabela III). Ovo je potvrdilo da bi prečišćeni poliklonski IgG mogao da se koristiti kao „analitičko antitelo“, i korišćen je kao takav u (ispitivanjima) Primera 3 i 5.

C. Nespecifično vezivanje za druge ISV.

[0165] Da bi se utvrdilo da li se proteinske interferencije posmatra specifičnim za jedan ISV, i/ili je specifično za određenu regiju, epitop ili antigenu determinantu na ISV, i/ili za određene mutacije učinjene divljem tipu ISV (kao što su jedna ili više mutacija humanizacije), test premošćavanja zasnovan na ECL i test sa postavkom premeštanja leka (i kao što je opisano pod A) gore, gde se SEQ ID NO: 1 koristi kao sulfo-označen ISV) su ponovljeni korišćenjem uzoraka plazme IHUS#B09032311A3, IHUS#B09032311A20 i IHUS#B09032311A1. Kako ti uzorci plazme sadrže poliklonsko „analitičko“ antitelo izolovano pod B), to takođe pruža informacije o specifičnosti, selektivnost i prepoznavanju epitopa od poliklonskog analitičkog antitela.

[0166] Osam ISV su testirani (SEQ ID NO 23 do 30, odnosno – pogledati Tabelu A gore), od kojih je jedan bio divljeg tipa VHH (SEQ ID NO: 23), dok su preostalih 7 humanizovane verzije sekvence divljeg tipa sa različitim humanizujućim supstitucijama. Dva ISV (SEQ ID NO: 29 i 30) takođe sadrže dodatne aminokiselinske ostatke na C-terminusu (1 i 3 dodatna alanin ostataka, respektivno).

[0167] Podaci su prikazani u Tabeli IV. Bez ograničavanja bilo kojim objašnjenjem ili hipotezom, može se videti da se izmene C-terminalne regije (kao što je ovde definisano) očigledno snažno mogu da utiču na stepen u kom korišćeni uzorci plazme mogu dovesti do porasta proteinske interferencije. Na primer, može se videti da dodavanje jednog ili tri aminokiselinska ostataka na C-terminus snažno može smanjiti sklonost ka porastu proteinske interferencije (na primer, samo 18 i 13% smanjenje u ECLU testu sa uzorkom IHUS#B09032311A3 za SEQ ID NO: 29 i 30, u odnosu na smanjenje 90% za SEQ ID NO: 28, što je odgovarajuća humanizovana varijanta bez ikakvih aminokiselinskih ostataka dodatih na C-terminusu). Slično, uvođenje prolinskog ostatka na položaju 14 sekvence divljeg tipa može očigledno takođe snažno da utiče na stepen u kom korišćeni uzorci plazme mogu da dovedu do proteinske interferencije (na primer, samo 20% smanjenja u ECLU testu sa uzorkom IHUS#B09032311A3 za sekvencu divljeg tipa SEQ ID NO: 23, u poređenju sa 91% smanjenja za SEQ ID NO: 24, sekvencu divljeg tipa sa supstitucijom A14P). K83R i Q108L, koji su takođe supstitucije bliske C-terminalnoj regiji, takođe dovode do određenog povećanja sklonosti ka izazivanju proteinske interferencije, ali ne onoliko koliko supstitucija A14P, i ukupan kombinovani efekat A14P K83R K108L supstitucije može da se negira dodavanjem jednog ili više aminokiselinskih ostataka C-terminusu (uporediti ponovo podatake za SEQ ID NO: 29 i 30 sa podacima za druge humanizovane varijante).

[0168] Na osnovu ovih podataka, takođe je zaključeno da je očigledno, poliklonsko analitičko antitelo generalno prepoznalo C-terminalnu regiju (kao što je ovde definisano) od ISV. Kao što se može videti sa Slike 2, položaja 14 (i u manjoj meri položaji 83 i 108) takođe čine delove C-terminalne regije ISV (kada se uzima u obzir trodimenzionalna ternarnom struktura ISV).

Tabela IV: Procena različitih varijanti Nanotela kao takmace u ISV ADAD testu koristeći analitičko antitelo.

Primer 2: pročišćavanje afiniteta analitičkog antitela

[0169] Ovaj primer opisuje dva postupka koja se mogu koristiti za izolovanje, iz biološke tečnosti ljudskog pacijenta, analitičkog antitela koje je u stanju da prepozna i/ili veže C-terminalni kraj ISV. Antitelo se izoluje iz 4 različitih uzoraka seruma koji su karakterisani time da indukuju pozitivan signal u ADA testu, prema testu opisanom u Primeru 1.

[0170] Polazeći od uzoraka seruma, svaki od ovih protokola daje prečišćenu pripremu faktora interferencije koji se mogu koristiti kao analitički antitela u ovde opisanim postupcima. Ovi postupci se takođe generalno koriste za prečišćavanje faktora interferencije za druge svrhe (na primer, faktori interferencije pročišćeni koristeći protokole u nastavku su takođe eksperimentalno korišćeni u Primeru 8, kako bi pokazali da je vezivanje za ISV ili ISV-konstrukt od strane monoklonskog 21-4 predvidljivo za vezivanje istog ISV ili ISV-konstrukta faktorima interferencije, i stoga sklonost navedenog ISV ili ISV-konstrukta da se podvrgne nespecifična proteinskoj interferenciji u jednom ADA testu).

Primer 2A: prečišćavanje koristeći protein A i hromatografiju afiniteta

[0171] U prvom koraku, IgG fragment antitelo je obogaćen iz uzoraka seruma koristeći protein A hromatografiju afiniteta. Tipične kolone koje su služile za ovo obogaćivanje uključuju HiTrap MabselectSure i MabSelectXtra (GE Healthcare); PorosMabCapture A (Applied Biosystems). Prečišćavanje IgG antitela iz uzoraka seruma izvedeno je na automatizovan i sličan način u svim eksperimentima. Hromatografski prolazi su izvršena na AKTA pročišćavač sistema (GE Healthcare) i beleženi u realnom vremenu pomoću UNICORN softvera za prečišćavanje proteina (GE Healthcare). Ukratko, uzorak seruma je razblažen 1:1 sa D-PBS (Dulbekov fosfatni puferom) i 0,22 µm filtriran pre postavljanja na kolonu pri fiksnoj stopi protoka od 0,5 mL/min. Kolona je isprana kako bi se uklonile nespecifične komponente vezivanja tokom 5 zapremina kolone korišćenjem D-PBS pri brzini protoka od 0,5 mL/min. IgG fragment je eluiran kiselinskom eluacijom, koristeći 100 mM glicin pH 2,6 pufer, i protoka od 0,5 mL/min. Posle eluacije, fragmenti su neutralizovani primenom 1,5 M Tris pufera pH 8,8. SDS-PAGE je izveden da potvrdi izolaciju IgG antitela u eluaciji.

[0172] U drugom koraku, IgG interferencije su dodatno obogaćene primenom protein A prečišćenog IgG fragmenta od 4 različita seruma na ISV uparene kolone afiniteta. Preciznije, IgG interferencije su dodatno obogaćene vezivanjem za kolonu koja sadrži ISV sa sekvencom SEQ ID NO: 1. Za ovo, ISV je kovalentno vezan za Sefaroza 4 brz tok (GE Healthcare) koristeći CNBr (cijanbromid) -postupak uparivanja u skladu sa procedurom proizvođača. Afinitetno prečišćavanje je izvedeno na automatizovan i sličan način u svim eksperimentima. Hromatografska ponavljanja su izvršena na AKTA sistemima prečićavanja i beležena u UNICORN. Ukratko, IgG obogaćen uzorak (do 10 mL naneta zapremine) nanet je kolonu po fiksnoj stopi protoka od 0,5 mL/min. Kolona je isprana kako bi se uklonile nespecifične komponente vezivanja tokom 5 zapremina kolone korišćenjem D-PBS pri brzini protoka od 0,5 mL/min. ISV-vezujuće komponente su eluirane kiselinskom eluacijom, koristeći 100 mM glicin pH 2,6 pufer, i protoka od 0,5 mL/min. Posle eluacije, fragmenti su neutralizovani primenom 1,5 M Tris pufera pH 8,8. Fragmenti su analizirani korišćenjem SDS-PAGE čime je potvrđena izolacija IgG antitela u eluatu (podaci nisu prikazani).

[0173] Ovi fragmenti su sakupljeni i koriste se za dalje analiza poput onih opisanih u Primeru 3.

Primer 2B: prečišćavanje korišćenjem CaptureSelect™ hromatografije.

[0174] Alternativno, faktor interferencije je dobijen od plazme i prečišćen korišćenjem komercijalno dostupnog afinitetne smole za vezivanje IgA CaptureSelect hIgA™ (BAC BV), koji je zasnovan na varijabilnim domenima samo teškog lanca (VHH) koji su uzvedeni od kamila. Prikupljena „IgA fragment“ koji sadrži IgA zajedno sa interferentnim IgG je potom nanet na protein A kolonu za uklanjanje IgA fragmenta. Protein A kolona je obrađena u skladu sa generičkim IgG uslovima prečišćavanja (tekući pufer: PBS; pufer za eluaciju: 100 mM glicin pH = 2,7; post eluaciona neutralizacija putem 1M Tris). Faktor interferencije je dobijen od protein A eluacije pri > 95% prinosu.

[0175] U varijaciji ovog postupka, koristi se druga CaptureSelect afinitetna smola (CaptureSelect Alpha-1 antitripsin smola, komercijalno dostupna afinitetna smola zasnovana na VHH, bez ciljanja bilo kakvih proteina povezanih sa antitelom). Ova smola je dala visoku efikasnost vezivanja faktora interferencije i omogućila selektivnu eluaciju u 2 koraka: antitripsin putem neutralne pH eluacije pomoću 2,0 M MgCl2, praćeno eluacijomfaktora interferencije putem kiselog koraka (0,1 M glicina pH3,0, slično protein A/G uslovima eluacije; neutralizacija pomoću 1,5M Tris). Ovo pročišćavanje u jednom koraku dalo je prinos do 15 µg interferirajućeg IgG1 po mL plazme visoke interferencije, što je približno 0,3% ukupnog prisutnog IgG. Opciono, neutralizovan fragment interferencije može biti odsoljen i dalje prečišćen pomoću kolone isključivanja veličine koja je uravnotežena u D-PBS.

Primer 3: Uticaj različitih ISV zamena na sklonost ISV da dovede do proteinske interferencije

[0176] Kao što je navedeno u opisu gore, ovaj pronalazak stavlja na raspolaganje određene testove i tehnike koji omogućavaju da se proceni da li će ili ne dati ISV imati sklonost da dovede do proteinske interferencije. Oni uključuju test premošćavanja zasnovan na ECL i test sa postavkom premeštanja leka korišćen u Primeru 1, kao i BIACORE test opisan u ovom Primeru 3 i test premošćavanja/nadmetanja ADA koji su opisani u narednim Primerima.

[0177] Kao što je takođe navedeno u opisu gore, ovi testovi se takođe mogu koristiti da se odredi da li specifične promene (kao što su aminokiselinska brisanja, supstitucije ili dodavanja) mogu uticati (i poželjno smanjiti) sklonost datog ISV da dovede do porasta proteinske interferencije. Neke od ovih promena biće ili će postati jasne stručnjaku na osnovu ovog opisa i eksperimentalnih podataka prikazanih u Primeru 1 i ovom Primeru 3.

[0178] Kao što je već naznačeno podacima generisanim u Primeru 1, čini se da određene mutacije na ili blizu C-terminalne regije (kao što je ovde definisano) jednog ISV mogu (snažno) uticati na njegovu sklonost da dovede do proteinske interferencije. Na primer, deluje da dodavanje nekoliko aminokiselinskih ostataka C-terminusu (kao što su 1 ili 3 alaninski ostaci) snažno smanjuje sklonost ISV da dovede do porasta proteinske interferencije i deluje da bi mogao da negira prisustvo drugih supstitucija (na primer, u ili blizu C-terminalne regije) za koje deluje da povećavaju sklonost ka dovođenju do rasta proteinske interferencije (na primer, A14P supstitucija).

[0179] U ovom Primeru 3, efekat ostalih supstitucija kao i efekat dodavanja dodatnih aminokiselina na C-terminusu je ispitivan upoređivanjem povezanih ISV sa različitim supstituentima koristeći analitičko poliklonsko antitelo generisano u Primeru 2. Analiza je urađena merenjem kinetike interakcije između svakog ispitivanog ISV i analitičkog poliklonskog pomoću površinske rezonancije plazmona (SPR) koristeći Biacore™ T100 biosensor od GE Healthcare. ISV testirani u ovom Primeru 3 su oni od SEQ ID NO 3 do 22 (pogledati Tabelu A iznad i Tabelu V u nastavku).

[0180] U tipičnom eksperimentu, rastvor poliklonskog antitela je pripremljen na 10 µg/ml u 10 mM NaOAc pH5,0. Ovo poliklonsko antitelo je zatim imobilizovano na CM5 senzorskom čipu kuplovanjem amina EDC/NHS postupkom (EDC = N-etil-N'-[3-dietilamino-propil]-karbodiimid; NHS = N-hidroksisukcinimid) prema proceduri proizvođača. Iimobilizovana količina dala je približno 2700 jedinica odgovora (RU). Fiksirana koncentracija od 500 nM ISV je zatim ubrizgana na površini tokom 120 sekundi pri brzini protoka od 45 µL po minuti. Zato što nije mogao da se identifikuje efikasan regeneracioni pufer, vreme disocijacije je izduženo u 2400 sekundi. Signal dobijen ubrizgavanjem ISV na prazne ćelije protoka je oduzet od signala dobijenog ubrizgavanjem ISV na poliklonskim antitelom vezane ćelije protoka. Prazne ćelije protoka su aktivirane/deaktivirane na sličan način kao ćelije protoka za poliklonska antitela, ali bez dodavanja proteina. Takođe, prazna injekcija (HBS-EP tekući pufer (HBS = Hepes puferisan rastvor: GE Healthcare) je oduzeta kako bi se ispravilo moguće odstupanje osnovice.

[0181] Kako bi se ispitao efekat dodavanja aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom kraju, uticaj dodavanja 1 ili 2 alanina i 1, 2 ili 3 glicina ispitivan je poređenjem vezivanja ISV sa različitim dodacima, koristeći analitičko poliklonsko antitelo generisano kao što je opisano u Primeru 2. ISV generisan i testiran za tu svrhu je Nanotelo (NB) 3.4 do 3.9 (SEQ ID NO: 5 do 10).

[0182] Kao reprezentativni primer vrste dobijenih podataka, Slika 3 prikazuje vezivanje Nanotela NB) 3.4 do 3.9 na imobilisano poliklonsko antitelo. Tabela V rezimira dobijene rezultate.

TABELA V

[0183] Kako bi se ispitao efekat (drugih) supstitucija u C-terminalnoj regiji, uticaj različitih supstitucija je ispitivan upoređivanjem povezanih ISV koji sadrže ove supstitucije, koristeći isto analitičko poliklonsko antitelo kao što je opisano gore. Analiza je izvršena kao što je gore opisano.

[0184] ISV koji sadrže supstitucije koje su testirane su Nanotelo (NB) 3.1, 3.2 i 3.4 (SEQ ID NO 3, 4 i 5); Nanotelo (NB) 3.10 do 3.15 (SEQ ID NO 11 do 16), koji su upoređeni sa Nanotelom (NB) 3.4; Nanotelo (NB) 4.1 i 4.2 (SEQ ID NO 17 i 18) i Nanotelo (NB) 6.1, 6.2, 6.4 i 6.5 (SEQ ID NO 19 do 22).

[0185] Kao reprezentativni primeri vrste dobijenih podataka:

• Slika 4 prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 3.4, 3.11, 3.12 i 3.13 za imobilisano poliklonsko antitelo;

• Slika 5 prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 3.4, 3.14 i 3.15 za imobilisano poliklonsko antitelo;

• Slika 6 prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 3.1, 3.2 i 3.4 za imobilisano poliklonsko antitelo;

• Slika 7 pokazuje vezivanje Nanotela (NB) 4.1 i 4.2 za imobilisano poliklonsko antitelo;

• Slika 8 prikazuje vezivanje Nanotela (NB) 6.1, 6.2, 6.4 i 6.5 za imobilisano poliklonsko antitelo.

[0186] Tabele VI, VII i VIII sumiraju dobijene rezultate.

TABELA VI

TABELA VII

TABELA VIII

[0187] Opet, bez ograničavanja bilo kojom specifičnom hipotezom ili objašnjenjem, podaci predstavljeni gore pokazuju da (različite) supstitucije C-terminalne regije (kao što je ovde definisano) ISV mogu izmeniti/poboljšati njegovu sklonost da dovede do porasta proteinske interferencije.

Primer 4: reprezentativni protokoli za obavljanje ADA testova na Slici 1.

[0188] Ovaj primer daje neke reprezentativne ali neograničavajuće uslove koji bi mogli da se koriste za obavljanje ADA testova nadmetanja/premošćavanja, šematski prikazane na Slici 1:

• ADA test Slike 1A u rastvoru: uzorci 100% matrica, 30', 37°C, kiseli tretman korišćenjem sirćetne kiseline u 10 matrici, 5', RT, uzorak prethodne inkubacije/kiselinske neutralizacije: ISV-sulfo (: Tris) 1:1 :1 (1:0,9:0,9:0,1), 1 sat, RT; na posudi 1 sat, RT; pranje 3x, pufer za čitanje 4x

• ADA test Slike 1B u rastvoru: uzorci 20% matrica, 30', 37°C, uzorak prethodne inkubacije: ISV- -Sulfo 1:1:1, 1 sat, RT, na posudi 1 sat, RT, Vash 3k, pufer za čitanje 2x

• Sekvencijalni ADA test Slike 1C: Capture ISV-Bio, 1 sat, RT, pranje 3x, uzorci 20% matrica, 15', RT, na posudi dva sata, RT, pranje 3x, detektovanje ALX-0141-sulfo, 1 sat, RT , pranje 3x, pufer za čitanje 4x

Primer 5: Predviđanje osetljivosti ISV za nespecifičnu proteinsku interferenciju koristeći analitičko antitelo.

[0189] Ovaj primer opisuje ADA testove nadmetanja/premošćavanja koristeći analitičko antitelo koje se može koristiti za predviđanje osetljivosti ISV za nespecifičnu proteinsku interferenciju.

[0190] ISV koji se testira je razblažen do koncentracije od 10 µg/ml i inkubiran sa analitičkim antitelom na 400 ng/ml, prečišćeni prema Primeru 2, i inkubiran na 37°C pri 600 rpm u 96-komoričnim polipropilenskim pločama. Uzorci (50 pL) su zatim razblaženi 1/3 u 1:1 smeši (100 µL) 2 µg/mL biotinilovanog i 2 µg/ml sulfo-označenog ISV (SEQ ID NO: 1) i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi, 600 RPM. MSD MA®96-komorične standardne streptavidin ploče su blokirane sa 150 µL/po komorici Superblock® T20 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim isprane 3 puta sa PBS/0,05% Tween20 (= pufer za ispiranje). Uzorak/1: 1 smeše (biotinilovan i sulfo-označen ISV (SEQ ID NO:.1) (50,0 µL) je premešten iz polipropilenske ploče na MSD ploču i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi, 600 RPM. Ploče su isprane tri puta pre dodavanja 2 x pufera za čitanje (MSD) (150 µL/komorica) i čitanja ECL jedinice (ECLU) na MSD instrumentu (Sector Imager 2400 čitač).

[0191] Korišćenjem ovog testa, ISV na SEQ ID NO 23 do 30 su testirani i upoređeni. Podaci su prikazani u Tabeli X. Ovi podaci ne samo da pokazuju da se test opisan u ovom Primeru može koristiti za predviđanje sklonosti jednog ISV da dovede do porasta proteinske interferencije, već generisani podaci potvrđuju saznanja iz ranijih Primera o efektu supstitucije u C- terminalnoj regiji. Kao što se vidi, dodavanje 3 (i u manjem obimu 1) alaninskih ostataka na C-terminusu potpuno humanizovanog ISV ukida njegov kapacitet da se nadmeće sa vezivanjem analitičkog antitela. Mutirajući položaj 14 na varijanti divljeg tipa ISV od alanina do prolina jasno povećava njegov kapacitet kao takmaca na testu, (= čineći ISV varijantu podložniju nespecifičoj proteinskoj interferenciji), dok mutiranje položaja 83 i 108 nije jasno uticalo na osetljivost ISV na nespecifičnu proteinsku interferenciju.

Tabela IX

Primer 6: Uticaj dodavanja aminokiselina na C-terminus anti- OX40L Nanotela na potentnost njihovog OX40L blokiranja.

[0192] Ovaj primer pokazuje da C-terminalno proširenje nema nikakvog uticaja na aktivnost ili potentnost blokiranja Nanotela.

[0193] In vitro potentnost trovalentnog bispecifičnog sekvencno-optimizovanog anti-OX40L Nanotela Nb 3.16 (SEQ ID NO: 31) je poređena sa potentnosti odgovarajućeg Nanotela koje sadrži jedan dodatni Ala na svom C-terminusu Nb 3.17 (SEQ ID NO : 32).

[0194] Prvi test, test aktivacije T-ćelija, obavlja se kao što sledi. PBMC su izolovane iz sloja belih ćelija u ugrušcima krvi (Red Cross, Gent, Belgija) od zdravih donora pomoću Ficoll Paque Plus reagensa (GE Healthcare) i isprane pomoću RPMI 1640 kompletnog medijuma (RPMI1640 GlutaMAX 25 mM HEPES 10% fetalni goveđi serum 1% penicilin/streptomicin; invitrogen). PBMC (1x10<5>ćelija/komorica) su stimulisani sa fitohaemaglutininom (PHA-L; finalna koncentracija 0,6mg/ml) pre dodavanja do 1x10<4>hOX40L eksprimirajućih CHO ćelija (ozračenih sa gama scintilatorom na 3000 RAD; UZ Gent, Belgija) i serijski razblaženi sa anti-OX40L Nanotela RPMI 1640 kompletnim medijumom i inkubirnia 22 sata na 37°C u CO2inkubatoru. Proizvodnja IL2 od strane PBMC je merena u ELISA. Komorice Maxisorp ploče su nanete preko noći na 4°C sa anti-ljudskim IL2 monoklonskim antitelom (BD Biosciences). Nakon ispiranja i blokiranja obloženih komorica, dodat je 1⁄2 rastvor ćelijskog supernatanta. Kao standard, uključeno je 1⁄2 serijsko razblaženje ljudskog rekombinantnog IL2 (BD Biosciences) polazeći od 2000 pg/ml.

Detekcija je izvršena upotrebom biotinilovanog anti-ljudskog IL2 monoklonskog antitela (BD Biosciences) i HRP konjugovanog streptavidina (Thermo Scientific) i esTMB (SDT reagenasa). Reakcija je zaustavljena sa 1N HCl i OD je očitana na 450 nm. Očekivano, jačina trovalentnog bispecifičnog sekvencno-optimizovanog Nanotela Nb 3.17 (IC50 = 0,13nM, 95% CI = 0,098-0,17nM) je poređena sa ofNb 3,16 (IC50 = 0,10nM, 95% CI = 0,071-0,15 nM) .

[0195] U drugom testu nadmetanja zasnovanom naELISA, serija razređenja (od 1,5mM do 0,083 pM) Nanotela je prethodno inkubirana preko noći na sobnoj temperaturi sa 100ng/ml ljudskog OX40/Fc (R&D System) i 10 ng/ml biotinilovanog ljudskog OX40L (R&D System, in-house biotinilovano kao što je opisano u Primeru 1) u PBS 0,1% BSA 0,01% Tween-20. Dalje, uzorci su inkubirani na Maxisorp ploči obloženoj sa 10 µg/ml anti-ljudskog Fc Nanotela (in-house generisani) i blokirani sa PBS 1% BSA 0.1% Tween-20. Vezan ljudski OX40/Fc je detektovan korišćenjem HRP konjugovanog streptavidina (Thermo Scientific) i sTMB (SDT reagenasi). Reakcija je zaustavljena sa 1N HCl i OD je očitan na 450 nm. U skladu sa testom baziranim na ćelijama, potentnost trovalentnog bispecifičnog sekvenco-optimizovanoh Nanotela Nb 3.17 (IC50 = 0,178nM, 95% CI = 0,152-0,200nM) je poređena sa onom od Nb 3.16 (IC50 = 0.179nM, 95% CI = 0.149-0.215nM).

Primer 7: generisanje monoklonskog antitela 21-4-3.

[0196] Dve grupe različitih linija miševa (BALB/c i NMRI - tri miša svaka) imunizovani su intraperitonealno sa Nanotelo konstruktom od SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825, u voda-uulju emulziji jednakih zapremina antigena i Freundovog potpunog ili nepotpunog adjuvanta) tokom perioda od 39 dana, uz pojačavanje dok nisu dobijeni pogodne antiserumski titri.

[0197] Nakon gušenja stimulisanih miševa u CO2, slezine su aseptično uklonjene i pripremljena je jedna suspenzija ćelija prikupljenih slezina. Ćelije slezine i mijeloma ćelije su isprane nekoliko puta sa DMEM i fuzionisane u prisustvu 1 ml 50% (v/v) PEG 3350 (odnos ćelije slezine i SP2/03:1). Za fuziju su korišćene mijeloma ćelijske linije SP2/0-Ag14 iz German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ GmbH, Braunschweig). Ova ćelijska linija je hibrid između BALB/c ćelija slezine i mijeloma ćelijske linije P3k63Ag8. Tako proizvedeni hibridomi su resuspenzovani u CGM koji sadrži 20% FCS i aminopterin (HAT medijum) i postavljeni na ploču (140 µL/komorica) u osam 96-komoričnih ploča sa ravnim dnom za kulturu tkiva (Corning-Costar) koje sadrže 140 µL/komorica CGM ( 20% FCS) sa peritoneuma ekskudata ćelijama kao hranljivim ćelijama. Ploče su inkubirane tokom 10 dana u potpunom medijumu rasta (CGM) koji sadrži DMEM sa dodacima 2-merkaptoetanola, L-glutamina, stabilnog glutamina, HT i ne esencijalnih aminokiselina (u koncentracijama koje preporučuje dobavljač) i FCS na različitim koncentracijama (10%, 15% ili 20%). Tokom ovog perioda ćelije su hranjene dva puta sa HAT medijumom. Supernatanti ćelijske kulture iz ćelija hibridoma obično sadrže 1 do 20 µg/ml antitela, koja su testirana u ELISA vezivanju kako bi se potvrdilo vezivanje za Nanotelo konstrukta SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825.

[0198] Ćelije od pozitivnih komorica koje proizvode IgG su prebačene u komorice 48-komoričnih ploča i kultivisane tokom 2- 4dana (u zavisnosti od karakteristika rasta ćelija). Vezujući ELISA na ALX081 i ljudski/cinomolgni IgG su sprovedeni kako bi se isključila nespecifična vezivna sredstva. Hibridoma ćelije koje eksprimiraju vezivna sredstva koja su specifična za Nanotelo konstrukt SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825 su dva puta klonirana primenom ograničenog razblaživanja. Nakon fuzije i ponovnog ispitivanja, identifikovano je 7 primarnih kultura koje proizvode antitela protiv ALX-081. Sve ove primarne kulture proizvele su antitela koja ne reaguju unakrsno sa ljudskom ili cinomolgnim IgG. Primarne kulture su klonirane (dva puta).

[0199] Klonu 21-4 (jedan od klonova koji stabilno proizvode antitela protiv ALX-081 posle drugog kloniranja) je data oznaka „ABH0015“, i deponovan je kod kod Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) in Gentu, Belgija, 4. juna 2012. pod prijemim brojem LMBP-9680-CB. Mišje monoklonsko proizvedeno od strane ABH0015 nazvano je 21-4-3: određivanje izotipa za 21-4-3 pokazalo je IgG1 teški lanac i kapa laki lanac, koji su sekvencirani (pogledati SEQ ID NO: 35 i 36, respektivno). Za 21-4-3 se pokazalo da vezuje C-terminalnu regiju Nanotelo konstrukta SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825 (podaci nisu prikazani).

Primer 8: vezivanje 21-4 na ISV je predvidljivo za sklonost ISV da se podvrgne nespecifičnoj proteinskoj interferenciji

[0200] Ovaj Primer, zajedno sa sledećim Primerom 9, pokazuje da vezivanje monoklonskog 21-4 na ISV može da se koristiti za predviđanje (u stepenima sigurnosti navedenim u ovom Primeru) da li će dati ISV imati sklonost da se podvrgne nespecifičnoj proteinskoj interferenciji (npr. u ADA testu).

[0201] Ovaj Primer 8 naročito pokazuje da 21-4 može da se koristiti da se predvidi da li određene predložene modifikacije datog ISV (kao što je dodavanje jednog ili više aminokiselinskih ostataka C-terminalnom delu ISV i/ili supstitucija jedne ili više aminokiselinskih supstitucija unutar C-terminalne regije ISV) dovesti do smanjenja sklonosti navedenog ISV da se podvrgne nespecifičnoj proteinskoj interferenciji.

[0202] Ukratko, skup od 53 različitih Nanotela i Nanotelo konstrukata (pogledati Sliku 9 i SEQ ID NO: 38 do 89) je testiran za vezivanje monoklonskog 21-4-3. Ista Nanotela i Nanotelo konstrukti su takođe testirani za vezivanje prečišćenih priprema faktora interferencije dobijenog od tri različita ljudska donora (ovde označeni kao „Donor 8“, „Donor 19“ i „ Donor 30“), kako bi se videlo da li postoji bilo kakva korelacija između vezivanja od strane 21-4 i od strane prečišćenog faktora interferencije.

[0203] Utvrđeno je da je vezivanje ISV od strane 21-4 zaista može da se koristi za predviđanje vezivanja istog ISV do strane faktora interferencije (u okviru ukupnog stepena poverenja koji daju podaci navedeni u ovom dokumentu).

[0204] Kako bi se ovo demonstriralo, kako je opisano dole navedenim eksperimentalnim podacima, vezivanje 53 Nanotela ili Nanotelo konstrukata (kao što je navedeno na Slici 9, pogledati SEQ ID NO: 38 do 89) od strane 21-4 mereno je koristeći Biacore T100 (prema dole navedenom protokolu) i upoređeno je sa vezivanjem referentnog Nanotela ili konstrukta (takođe uvršteno na Slici 9), kako je mereno koristeći isti Biacore instrument i isti protokol. Rezultati su prikazani u Tabeli X u nastavku.

Tabela X

[0205] Za svaki od 53 Nanotela ili Nanotelo konstrukata koji se testiraju, referenca je izabrana tako da u odnosu na referencu, testirana Nanotela ili Nanotelo konstrukti imaju jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom kraju (koji su dodati da bi se ispitao efekat takvog dodavanja na proteinske interferencije, a naročito kako bi se smanjila navedena interferencija) i/ili jednu ili više mutacija u okviru C-terminalne regije (npr. kao rezultat humanizacije u odnosu na referencu).

[0206] Rezultati su izraženi kao procenat smanjenja vezivanja (mereno kao RU jedinice) za dato Nanotelo naspram vezivanje reference (takođe mereno RU jedinicama - na primer, ako je izmeren nivo vezivanja (RU) referentnog Nanotela je 276, a nivo vezivanja datog Nanotelo (takođe u RU) 9, onda je smanjenje nivoa vezivanja na nivou [9 RU/276 RU] x 100% = 3%), što znači smanjenje 97% u poređenju sa referencom (100%).

[0207] Slično, vezivanje prečišćenog faktora interferencije iz svakog od tri donora za svaki od 53 Nanotela ili Nanotelo konstrukata je izmereno korišćenjem istog Biacore instrumenta u odnosu na vezivanje prečišćenog faktora interferencije za isto referentno Nanotelo ili konstrukt. Rezultati su slično izraženi kao procenat smanjenja vezivanja faktora interferencije za dato Nanotelo ili Nanotelo konstrukt u odnosu na referencu.

[0208] Utvrđeno je da za suštinski sva Nanotela ili Nanotelo konstrukte u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodato C-terminalnom kraju u odnosu na referencu, da je vezivanje faktora interferencije dramatično smanjeno. Ovo opet potvrđuje da dodavanje jednog ili više aminokiselinskih ostataka C-terminalnom kraju ISV (VTVSS) može smanjiti nespecifičnu proteinsku interferenciju u ADA testu. Takođe je utvrđeno da, u većini slučajeva, samo činjenje supstitucije unutar C-terminalne regije (tj. bez dodavanja jednog ili više aminokiselinskih ostataka C-terminusu) u poređenju sa referencom često nije imalo sličan dramatičan uticaj na vezivanje faktora interferencije.

[0209] Podaci su zatim dalje analizirani kako bi se utvrdilo da li je smanjenje vezivanja sa 21-4 u odnosu na referencu na bilo koji način u korelaciji sa smanjenjem vezivanja svake od tri različite pripreme prečišćenog faktora interferencije u odnosu na referencu. Takve korelacije su pronađene.

[0210] Na primer, utvrđeno je da od 54 testirana Nanotela ili Nanotelo konstrukta, 36 je pokazalo smanjenje vezivanje 21-4 više od 70% u odnosu na njihovu odgovarajuću referentnu sekvencu (gde većina od tih 36 ima jedan ili više dodatni aminokiselinski ostatak na C-terminusu, u nekim slučajevima u kombinaciji sa supstitucijom unutar C-terminalne regije). Od ovih 36, 32 su takođe pokazali smanjenje u vezivanju faktora interferencije u poređenju sa referencom za više od 50% (i u velikom broju slučajeva, posebno za Nanotela ili Nanotelo konstrukte sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka dodatih C-terminusu, smanjenje je daleko veće od 50%, kao što je više od 70%, ili čak i više od 90%, pogledajte podatke date u Tabeli X). Ovo pokazuje da je u 32 od 36 slučajeva (tj.89%), smanjenje vezivanja sa 21-4 od više od 70% (u odnosu na referencu = 100%) predvidljivo za smanjenje u vezivanju faktora interferencije za više od 50% (u odnosu na istu referencu). Radi jasnoće, u svakom slučaju, smanjenje je izračunato kao 100% - [procenat dat u Tabelama u nastavku za nivo smanjenja postignut sa testiranim Nanotelom].

[0211] Slično, utvrđeno je da od 53 testirana Nanotela ili Nanotelo konstrukta, 33 pokazuju smanjeno vezivanje 21-4 više od 90% u poređenju sa svojom odgovarajućom referentnom sekvencom (opet, a većina od njih 33 ima jedan ili više dodatni aminokiselinski ostatak na C-terminusu, u nekim slučajevima u kombinaciji sa supstitucijom unutar C-terminalne regije). Od 33, 32 su takođe pokazali smanjenje u vezivanju faktora interferencije u poređenju sa svojom referentnom sekvencom za više od 50% . Ovo pokazuje da je u 32 od 33 slučajeva (tj.

97%), smanjenje vezivanja sa 21-4 više od 90% (u poređenju sa referencom) predvidljivo za smanjenje u vezivanju faktora interferencije za više od 50% (u odnosu na istu referencu).

[0212] Takođe treba napomenuti da takvo smanjenje vezivanja faktora interferencije za više od 50% (što dokazuje smanjenje vezivanja sa 21-4 od više od 70%) znači da takvi faktori interferencije suštinski više ne interferiraju sa ADA testom za ISV u pitanju: ekperimentalna potvrda koristeći ADA test pokazala je da kada je vezivanje faktorom interferencije smanjeno za više od 45%, da ne može da se primeti značajan uticaj prisustva faktora interferencije na ADA testu. U tom smislu, posebno će biti jasno stručnjaku da će to još više biti slučaj kada se vezivanje faktorom interferencije svede na stepen daleko veći od 50% (kao što je više od 70% ili čak više od 90%), kao što je primećeno u nekim slučajevima (pogledati opet ovde predstavljene podatake).

[0213] U stvari, otkriveno je da je smanjenje od više od 45% vezivanja sa 21-4 je indikativno za smanjenje vezivanja faktorom interferencije više od 45%, što, kao što je navedeno, znači da faktor interferencije ne interferira sa ADA testom.

[0214] Osim toga, ovde predstavljeni podaci o povezanosti (smanjenju) vezivanja sa 21-4 i (smanjenja) vezivanja sa faktorom interferencije takođe omogućavaju pronalazačima da postave apsolutnu vrednost za vezivanje sa 21-4 ispod koje se može očekivati (u okviru sigurnosti date podacima iznesenim u ovom Primeru 8) da ISV ili konstrukt zasnovan na ISV neće biti podložni vezivanju faktorom interferencije na način koji bi mogao utiče na ADA test. Kao što je navedeno u sledećem Primeru 9, ova vrednost je 500 RU (određena i izračunata kao što je navedeno u Primeru 9).

[0215] Monoklonski 21-4 je prečišćen iz kulture medijuma hibridoma dobijenog u gornjem Primeru 7, kao što sledi: hibridoma ćelije koje sekretuju monoklonsko antitelo 21-4-3 kultivisane su u rotacionim bocama u medijumu bez seruma (CD Hybridoma, Gibco, dopunjeno sa 8MM L-glutaminom (Invitrogen) i 1×holesterolom (250× holesterol lipid koncentrat, Gibco)) u zapremini od 100 ml ili 500mL. Očušćen supernatant je filtriran, a mišji IgG1 je zarobljen na Protein A koloni (HiTrap MabSelect SuRe, 5mL, GE Healthcare) po smanjenoj stopi protoka od 2 mL/min. Vezano antitelo je eluirano u 0,1 M citrat puferu pH3,0 i eluacioni fragmenti (od 5mL) su direktno neutralisani sa 1 mL 1M TRIS PH9.

Čistoća antitela je potvrđena redukcionim i ne-redukcionim SDS-PAGE.

[0216] Prečišćene pripreme faktora interferencije od Donora 8 i 19 dobijene su iz uzoraka seruma od navedenih donora posredstvom prečišćavanja afiniteta, kao što je opisano u Primeru 2A. Faktor interferencije od Donora 30 dobijen je iz seruma uzorka Donora 30, kao što je opisano u Primeru 2B.

[0217] Kako bi se odredilo vezivanje 21-4 za svaki od Nanotela ili Nanotelo konstrukata, korišćen je protokol opisan u Primeru 9.

[0218] Vezivanje faktora interferencije od tri donora za svaki od Nanotela ili Nanotelo konstrukata je određeno korišćenjem Biacore T100 u suštini kao što je opisano u Primeru 3, koristeći faktor interferencije od svakog od donora 8, 19 i 30, neposredno imobilisan na CM5 senzorski čip.

Primer 9: protokol za predviđanje da li će ISV imati sklonost da se podvrgne nespecifičnoj proteinskoj interferenciji (korišćenjem monoklonskog 21-4).

[0219] Merenja vezivanja su izvedena korišćenjem Biacore T100 koristeći CM5 T120416 senzorski čip, sa tekućim puferom HBS-EP , 25°C.21-4 je zarobljen putem imobilisanog zečjeg anti-mišjeg IgG, jer je otkriveno da direktno imobilisana mAb 21-4-3 površina ne može efikasno da se regeneriše. Upotrebljen anti-mišji IgG je poliklonsko zečje anti-mišje IgG antitelo koje reaguje sa svim IgG potklasama, IgA i IgM (GE Healthcare; Cat#BR-100838; Lot#10056316). Imobilizacija anti-mišjeg IgG je izvedena korišćenjem manualnog uparivanja amina upotrebom sedmominutne injekcije NHS/EDC za aktiviranje, i sedmominutne injekcije 1M etanolamin HCI pH 8,5 za deaktiviranje (Biacore, komplet za uparivanje amina). Uslovi vezivanja su navedeni u Tabeli XI. Na osnovu nivoa imobilizacije i MW proteina, teorijski Rmaxza mAb21-4-3 vezivanje za imobilisani anti-mišji IgG bio je ~13000RU (gde se jedan mAb21-4-3 molekul vezuje za jedan anti-mišji IgG molekul).

Tabela XI

[0220] Uslovi korišćeni za eksperiment vezivanja (Biacore T100) koristeći 21-4 imobilisan na taj način dati su u tabeli XII. Anti-mišja IgG površina može uspešno da se regeneriše nakon zarobljavanja mAb21-4-3 i injekcije svih uzoraka (sa ograničenim povećanjem baznog nivoa nakon svake regeneracije).

Tabela XII

[0221] Gore navedeni protokol je korišćen za generisanje podataka o vezivanju 21-4 navedenih u Tabeli X. Kada su razmatrane apsolutne vrednosti za RU (nakon prilagođavanja izmerene RU vrednost za molekulske težine ISV, proteina ili polipeptida prema formuli ([izmeren RU]/[MW proteina] x 10<6>), utvrđeno je da su Nanotela i Nanotelo konstrukti navedeni u Tabeli X koji su imali dodatni alanin ostatak i koji su pokazali >90% smanjenja vezivanje, kako 21- 4, tako i faktora interferencije, uopšteno govoreći dobijeni sa vrednostima RU na između 30RU i 400RU (gde odgovarajuća referentna Nanotela ili polipeptidi - kao što je navedeno na Slici 9 - imaju vrednosti RU više od 1000, obično više od 1500, a često više od 2000) .

[0222] Na osnovu ovoga, smatralo se da će (prilagođena) RU vrednost manja od 500 u ovom testu jasno ukazati na ISV (ili protein ili polipeptid koji sadrži barem jedan ISV, kako je ovde opisano) koji c(u suštini) neće biti vezan faktorima interferencija na način koji bi interferirao sa ADA testom.

Claims

Patentni zahtevi 1. Protein ili polipeptid za primenu u terapiji, gde protein ili polipeptid sadrže pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV) na svom C-terminalnom kraju, gde je navedeni ISV ili VHH, sekvencno-optimizovan VHH, humanizovan VHH ili kamilizovan VH, ili je ISV onaj koji obuhvata VH sekvencu koja nije VHH, sekvencno-optimizovan VHH, humanizovan VHH ili kamilizovan VH ili koji je izveden od VH sekvence, gde ISV ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je: - n = 1, 2 ili 3 gde je svaki X = Ala ili Gly; ili - n = 1, 2 ili 3 gde je svaki X = Ala; ili - n = 1, 2 ili 3 gde je svaki X = Gly; ili - n = 2 ili 3 gde je barem jedan X = Ala ili Gly ; ili - n = 2 ili 3 gde su svi osim jednog X = Ala ili Gly, i gde protein ili polipeptid uključuju serum albumin vezujući peptid ili serum albumin vezujući domen i imaju polu-život izražen kao t1/2-beta kod ljudskog pacijenta tokom bar 3 dana, pod uslovom da pomenuti protein ili polipeptid nije
2. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde su serum albumin vezujući peptid, ili serum albumin vezujući domen, serum albumin vezujući ISV.
3. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde n = 1 ili n = 2.
4. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde n = 2 ili 3 i barem X = Ala ili Gly ili n = 2 ili 3 i svi osim jednog X = Ala ili Gly, gde je preostali aminokiselinski ostatak X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline.
5. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 4, gde je preostali aminokiselinski ostatak X nezavisno izabran od od Val, Leu i/ili Ile.
6. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde je: - n = 1, 2 ili 3 gde je svaki X = Ala ili Gly; ili - n = 1, 2 ili 3 gde je svaki X = Ala; ili - n = 1, 2 ili 3 gde je svaki X = Gly.
7. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde X nije cistein.
8. Protein ili polipeptid za primenu u terapiji, gde protein ili polipeptid sadrže ISV na svom C-terminalnom kraju, gde je navedeni ISV ili VHH, sekvencno-optimizovan VHH, humanizovan VHH ili kamilizovan VH, ili je ISV onaj koji obuhvata VH sekvencu koja nije VHH, sekvencno-optimizovan VHH, humanizovan VHH ili kamilizovan VH ili that je izveden od VH sekvenca, gde ISV ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)n, gde je n od 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5, i gde je svaki X aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran , uz uslov da X nije cistein, i gde protein ili polipeptid uključuju serum albumin vezujući peptid ili serum albumin vezujući domen i imaju polu-život izražen kao t1/2-beta kod ljudskog pacijenta tokom bar 3 dana, pod uslovom da pomenuti protein ili polipeptid nije
9. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 8, gde n je 1 ili 2.
10. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde je svaki X prirodna aminokiselina.
11. Protein ili polipeptid za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 8-10, gde je svaki X izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).
12. Protein ili polipeptid za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-11, gde je navedeni C-terminalni ISV VHH, sekvencno-optimizovan VHH, humanizovan VHH ili kamilizovan VH.
13. Protein ili polipeptid za primenu prema patentnom zahtevu 8, gde je serum albumin vezujući peptid, ili serum albumin vezujući domen, serum albumin vezujući ISV.
14. Farmaceutski sastav za primenu u terapiji, koji obuhvata protein ili polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, i barem odgovarajući nosač, rastvarač ili ekscipijens.
15. Farmaceutski sastav za primenu u terapiji prema patentnom zahtevu 14, gde: - navedeni sastav, protein ili polipeptid je namenjen za tretman hronične bolesti kod ljudskog bića, i/ili - navedeni protein, polipeptid je namenjen da bude prisutan u cirkulaciji pacijenta kom je primenjen tokom perioda od barem jedne nedelje; i/ili - navedeni protein, polipeptid je takav da ima polu-život izražen kao t1/2-beta kod ljudskog pacijenta tokom bar 3 dana; i/ili - navedeni protein, polipeptid ili farmaceutski sastav je namenjen da bude primenjen ljudskom biću kao dve ili više doza koje su primenjene tokom perioda od bar 3 dana.
16. Farmaceutski sastav za primenu u terapiji prema patentnom zahtevu 15, gde je navedeni protein, polipeptid namenjen da bude prisutan u cirkulaciji pacijenta na farmaceutski aktivnim nivoima na kojima je primenjen kao terapeutski aktivna doza tokom perioda od bar jedne nedelje.
17. Farmaceutski sastav za primenu u terapiji prema patentnom zahtevu 15 ili 16, gde je navedeni protein, polipeptid ili farmaceutski sastav namenjen da bude primenjen ljudskom biću kao dve ili više doza koje su hronično primenjene.