[go: up one dir, main page]

RS55589B1 - Antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i njihova terapeutska primena - Google Patents

Antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i njihova terapeutska primena

Info

Publication number
RS55589B1
RS55589B1 RS20170010A RSP20170010A RS55589B1 RS 55589 B1 RS55589 B1 RS 55589B1 RS 20170010 A RS20170010 A RS 20170010A RS P20170010 A RSP20170010 A RS P20170010A RS 55589 B1 RS55589 B1 RS 55589B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sec
corresponds
acid sequence
seq
sequence according
Prior art date
Application number
RS20170010A
Other languages
English (en)
Inventor
Christiane Otto
Siegmund Wolf
Christoph Freiberg
Axel Harrenga
Simone Greven
Mark Trautwein
Sandra Bruder
Andrea Eicker
Andreas Wilmen
Original Assignee
Bayer Ip Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42091520&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55589(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bayer Ip Gmbh filed Critical Bayer Ip Gmbh
Publication of RS55589B1 publication Critical patent/RS55589B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A61P5/30—Oestrogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na antitelo 006-H08 protiv prolaktinskog receptora i obezbeđuje rekombinantne regione koji vežu antigen i antitela i funkcionalne fragmente koji sadrže takve regione koji vežu antigen, pri čemu pomenuti specifično vežu i neutralizuju prolaktinski receptor, na nukleinske sekvence koje kodiraju pomenuta antitela, vektore koji sadrže pomenute, farmaceutske kompozicije koje ih sadrže i na njihovu primenu u tretmanu ili prevenciji benignih bolesti i indikacija kojima koristi inhibiranje signaliziranja koje je posredovano sa prolaktinskim receptorom poput enđometrioze, adenomioze, ne-hormonske kontracepcije kod žena, benigne bolesti dojke, mastalgije (bol u dojkama), inhibicije laktacije, benigne hiperplazije prostate, fibroida kao i hiper- i normoprolaktinemskog gubitka kose, i ko-tretmana tokom kombinovane hormonske terapija sa ciljem inhibiranja proliferacije ćelija iz epitela mlečnih žlezda.
Postoji neostvarena medicinska potreba za tretmanom brojnih benignih bolesti i indikacija poput enđometrioze, adenomioze, ne-hormonske kontracepcije kod žena, benignih bolesti dojke, mastalgije, inhibicije laktacije, benigne hiperplazije prostate, fibroida, hiper- i normoprolaktinemskog gubitka kose, i prevencije proliferacije ćelija iz epitela mlečnih žlezda tokom kombinovane (tj. estrogen plus progestin) hormonske terapije.
Prolaktin (PRL) je polipeptidni hormon koji se sastoji od 199 amino-kiselina. PRL pripada porodici hormona rasta (GH) (placentalni laktogen - PL), a sintetizuje se u laktotrofnim ćelijama iz hipofize i u nekoliko izvan-hipofiznih tkiva poput limfocita. ćelija epitela mlečnih žlezda, miometrijuma, i prostate. Dva različita promotora regulišu sintezu PRL u hipofizi i izvan nje (BioEssavs 28:1051-1055, 2006).
PRL se veže na PRL receptor (PRLR). pojedinačni transmembranski receptor koji pripada klasi 1 superporodici citokinskih receptora (Endocrine Revievvs 19:225-268, 1998). PRLR postoji u tri različite izoforme. kratka, duga, i srednja forma koje mogu da se razlikuju na osnovu dužine njihovih citoplazmatskih repova. Nakon vezanja liganda, proces od više koraka aktiviše PRLR. PRL reaguje preko svojeg veznog mesta 1 sa jednim molekulom PRLR, a tada preko svojeg veznog mesta 2 privlači drugi receptorski molekul koje daje aktivni đimer PRLR. PRLR dimerizacija dovodi do pređominantnog aktivisanja JAK/STAT puta (Janus kinaza/signalni transduceri i aktivatori transkripcije). Nakon dimerizacije receptora, JAK (predominantno JAK2) spojen sa receptorom, transfosforilišu i aktivišu jedan drugoga. Osim toga, PRLR se takođe fosforiliše i može da se veže na SH2-domen kojeg sadrže belančevine poput STAT. STAT vezani na receptor se nakon toga fosfori I isu, disociraju sa receptora i translociraju u jedro gde stimulišu transkripciju ciljanih gena. Osim toga, opisano je i aktivisanje Ras-Raf-MAPK puta i aktivisanje citoplazmatske src-kinaze uz pomoć PRLR (pregledni članak: Endocrine Reviews 19: 225-268. 1998). PRLR-posredovano signaliziranje igra ulogu u brojnim procesima poput razvoja mlečnih žlezda, laktacije, reprodukcije, rasta tumora dojke i prostate, autoimunih bolesti, opšteg rasta i metabolizma, i imunomodulacije (Endocrine Revievvs 19: 225-268. 1998; Annu. Rev. Physiol. 64: 47-67, 2002).
Trenutno, potpuna interferencija sa PRLR-posredovanim signaliziranjem nije moguća. Jedini način da se interferiše sa PRLR-posredovanim signaliziranjem je inhibicija lučenja PRL iz hipofize uz pomoć bromokriptina i drugih agonista dopaminskog receptora 2 (Nature Clinical Practice Endocrinologv and Metabolism 2(10): 571-581, 2006). Ovi agensi, međutim, ne suprimiraju sintezu PRL izvan hipofize koje može uspešno da kompenzira kada je inhibirana sinteza PRL u hipofizi i da omogući gotovo normalno PRLR-posredovano signaliziranje (Endocrine Revievvs 19:225-268,1998). Prema tome, nije iznenađujuće da su agonisti dopaminskog receptora tipa 2 beskorisni kod pacijenata koji pate od raka dojke ili autoimunih bolesti poput Svstemskog lupusa ili reumatoidnog artritisa (Breast Cancer Res. Treat. 14:289-29, 1989; Lupus 7:414-419, 1998) mada je prolaktin važan kod ovih bolesti. Lokalna sinteza prolaktina u ćelijama raka dojke ili limfocitima. koji igraju ključnu ulogu kod karcinoma dojke ili autoimunih bolesti, nije bila blokirana uz pomoć agonista dopaminskog receptora.
Martinez i sar. opisuju daje PRLR eksprimiran u normalnom endometrijumu ali ne u endometrijskom tkivu (Acta Obstetrica i Ginecolgica Scandinavia (2002), 81 (1), 5-10). Bohnet i sar. otkrivaju da je tretman pacova sa anti-PRLR antitelima dovodi do inhibicije laktacije, odnosno antitela antagonizuju PRLR-posredovano signaliziranje (Endocrinologv Societv (1978), 102 (6). 1657-1661). Sissom i sar. opisuju upotrebu anti-PRLR antitelain vivoza inhibiciju karcinoma dojke i hipertrofije prostate u hiperprolaktinemskih mužjaka miševa (American Journal of Pathologv, American Societv for Investigative Pathology
(1988) 133 (3) 589-595. EP 2025683 (Inst Nat Sante Rech Med (2009) opisuje varijante prolaktina kao antagonista PRLR za tretman bolesti koje uključuju efekte PRLR-upravljanja. npr. benigni ili maligni tumori dojke, prostate, hiperprolaktinemija, poremećaji reprodukcije, hipermastija. Foitzik i sar. diskutuju efekte prolaktina na gubitak kose i predlažu upotrebu antagonista prolaktina receptora za lečenje gubitka kose (Aktuelle Dermatologie. 31 (3), 109-116.
Unatoč malopre pomenutih pokušaja da se obezbede sredstva za tretman ili prevenciju benignih bolesti i indikacija poput enđometrioze, adenomioze, ne-hormonske kontracepcije kod žena, benigne bolesti dojke i mastalgije. inhibicije laktacije, benigne hiperplazije prostate, fibroida, hiper- i normoprolaktinemskog gubitka kose, i ko-tretmana tokom kombinovane hormonske terapije sa ciljem sprečavanja proliferacije ćelija epitela dojke, ne postoje jedinjenja koja mogu da zadovolje pomenutu medicinsku potrebu. Prema tome, cilj ovoga pronalaska je da resi pomenuti problem uz pomoć obezbeđivanja jedinjenja koja su terapeutici za pomenute benigne bolesti i indikacije.
Identifikovana su nova antitela koja su specifična i imaju visoki afinitet za PRLR pa na taj način neutralizuju PRLR-posredovano signaliziranje čime donose terapeutsku korist pacijentu.
Blokada aktivisanja PRLR uz pomoć antitela koja neutralizuju PRLR dovodi do kompletne inhibicije PRLR-posredovanog signaliziranja. Suprotno, agonisti dopaminskog receptora mogu samo da interferišu sa pojačanim PRLR-posredovanim signaliziranjem kao odgovor na povećanu sekreciju prolaktina u hipofizi, ali ne i sa povećanim PRLR-posredovanim signaliziranjem koje je posledica aktivisanja PRLR mutacije ili lokalno povećane proizvodnje prolaktina.
Prema tome, problem je rešen uz pomoć obezbeđivanja antitela 006-H08, njegovih fragmenata koji vežu antigen, ili njegovih varijanata za tretman malopre pomenutih benignih bolesti i indikacija, koji se vežu na PRLR sa visokim afinitetom efektivno neutralizujući PRLR-posredovano signaliziranje, i koji su preferirano unakrsno-reaktivni sa PRLR iz drugih vrsta poputMacacca mulattaiMacacca fascicularts. Mus musculusiliRattus norve<g>icus.
Neka PRLR antitela su već opisana u predmetnoj prijavi WO2008/022295 (Novartis) i u US patentu 7,422,899 (Biogen). Ovaj pronalazak se bazira na otkriću novih antitela koja su specifična za i imaju visoki afinitet prema PRLR pa na taj način neutralizuju PRLR-posredovano signaliziranje i mogu da obezbede terapeutsku korist subjektu (sekvence novih antitela su kao šta je navedeno u SEK. ID BR: 34, 40, 46, i 52). Antitela iz ovoga pronalaska, koja mogu da budu humana ili humanizovana ili himerna ili humana-projektovana, mogu da se koriste u više konteksta koji su ovde detaljnije objašnjeni.
Prema tome, predmet ovoga pronalaska je antitelo ili fragment koji veže antigen, pri čemu pomenuto antitelo antagonizuje signaliziranje koje je posredovano prolaktinskim receptorom.
Nova antitela '002-H06', '002-H08', '006-H07', '001-E06'. '005-C04<*>su predmet odgovarajućih predmetnih prijava.
\ n vivokarakterizacija ovih antitela u mišjim modelima bolesti je moguća samo sa antitelom koje pokazuje unakrsnu reaktivnost s mišjim prolaktinskim receptorom. Samo antitelo 005-C04, koje je opisano u odgovarajućoj aplikaciji, pokazuje dovoljnu unakrsnu reaktivnost s mišjim prolaktinskim receptorom i stoga je jedino antitelo koje se može koristiti u mišjim in vivo modelima. Rezultati dobijeni ovim antitelom dokazuju stoga kao surogat opštu efikasnost za sva ostala antitela za neutralizaciju prolaktinskog receptora koji su objavljeni u odgovarajućim aplikacijama u analiziranim modelima bolesti.
Antitela su bila karakterizovana u nekoliko ćelijskih sistema sa ciljem da se odrede njihova specifičnost prema vrstama i njihov potencijal kao i efikasnost u različitim ogledima koji se bave inaktivisanjem PRLR-posredovanog signaliziranja (vidi Primere 5-10). Ogledi za proliferaciju su provedeni uz pomoć ćelija Nb2-ll iz pacova (Primer 6, Slika 6) ili ćelija Ba/F koje su bile stabilno transtektovane sa humanim PRLR (Primer 5. Slika 5) ili sa mišjim PRLR (Primer 10, Slika 10). Dok Novartis-ovo antitelo XHA 06.983 nije pokazalo aktivnost prema PRLR iz pacova i miša. Novartis-ovo antitelo XHA06.642 je pokazalo aktivnost protiv PRLR iz pacova, ali ne i protiv PRLR iz miša. XHA 06.642 je inhibiralo PRLR-posredovano signaliziranje kod ljudi (Primer 5, 7. 8). Novo antitelo iz ovog pronalaska 006-H08 je pokazalo najveći potencijal u odnosu na inhibiciju proliferacije Ba/F ćelija koje su stabilno transfektovane sa humanim PRLR (Primer 5. Slika 5). Novo antitelo 005-C04 iz odgovarajuće predmetne prijave je jedino antitelo koje pokazuje unakrsnu-aktivnost prema mišjem (Primer 10, 9) i ljudskim PRLR (Primeri 5, 7. 8). Suprotno od Novartis-ovog antitela XHA06.642, novo antitelo 005-C04 je, prema tome. prikladno za testiranje inhibicije PRLR-posredovanog signaliziranja u mišjim modelima. Sva druga antitela, koja su otkrivena u ovoj predmetnoj prijavi ili u odgovarajućim predmetnim prijavama, su specifična za humani PRLR. Osim ogleda za ćelijsku proliferaciju (Primeri 5, 6, 10), privedeni su i ogledi sa luciferazom kao reporterom primenom HEK293 ćelija koje su stabilno transfektovane sa humanim (Primer 8) ili mišjim (Primer 9) PRLR i prolazno transfektovane sa reporter genom za luciferazu pod kontrolom LHRE (elementi odgovora na laktogeni hormon). Primenom pomenutih sistema, nemogućnost Novartis-ovog antitela XHA06.642 da efikasno blokira signaliziranje posredovano sa mišjim PRLR postaje ponovo vidljivo (Primer 9). Suprotno, novo antitelo 005-C04 (odgovarajuća predmetna prijava)'blokira aktivisanje reporter gena za luciferazu uz pomoć mišjeg PRLR (Primer 9). STAT5 fosforilacija u ljudskim T47D ćelijama je korišćena kao dodatni ogled sa ciljem da se analizira inhibitomo delovanje pomenutih antitela na humani PRLR (Primer 7, Slika 7). Kao šta je očekivano, nespecifična antitela su bila neaktivna u svim analiziranim eksperimentalnim paradigmama (ogledima).
Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za inhibiranje rasta PRLR-pozitivnih ćelija i napredovanja malopre pomenutih benignih bolesti i indikacija uz pomoć obezbeđivanja antitela protiv PRLR. Obezbeđena su humana monoklonska antitela, njihovi fragmenti koji vežu antigen, i varijante pomenutih antitela i fragmenata, koji specifično vežu izvan-ćelijski domen (ECD) PRLR (SEK. ID BR: 70) ili humane polimorfne varijante SEK. ID Br: 70 poput I146L i 176V varijanata koje su opisane u PNAS 105 (38). 14533, 2008. i J. Clin. Hndocrinol. Metab. 95 (1), 271, 2010.
Takođe je opisano antitelo koje se veže na epitop izvan-ćelijskog domena prolaktinskog receptora i njegove humane polimorfne varijante, pri čemu amino-kiselinska sekvenca izvan-ćelijskog domena prolaktinskog receptora odgovara SEK. ID BR: 70. a nukleinska sekvenca odgovara SEK. ID BR: 71.
Antitela, fragmenti koji vežu antigen, i varijante pomenutih antitela i fragmenata iz ovoga pronalaska se sastoje od varijabilnog regiona iz lakog lanca i varijabilnog regiona iz teškog lanca. Varijante pomenutih antitela ili fragmenata koji vežu antigen koji se razmatraju u ovom pronalasku su molekule u kojima se održava vezna aktivnost pomenutog antitela ili fragmenta koji veže antigen prema PRLR (za sekvence vidi tabelu 5).
Takođe je opisano antitelo ili fragment koji veže antigen, pri čemu se pomenuto antitelo ili fragment koji veže antigen takmiče sa antitelom 006-H08 ili njegovim definisanim zrelim varijantama. Sekvence pomenutih antitela i njihove zrele varijante su prikazani u tabeli 5.
Takođe su opisani antitelo ili fragment koji veže antigen,
a. pri čemu su amino-kiselinske sekvence varijabilnog teškog i lakog regiona najmanje 60%, bolje 70%, još bolje 80%, ili 90%. ili čak najbolje 95% identični sa SEK. ID BR: 34 šta se tiče domena varijabilnog teškog lanca i identični sa SEK. ID BR: 40 šta se tiče domena varijabilnog lakog lanca, ili
b. pri čemu su amino-kiselinske sekvence domena varijabilnog teškog lanca i lakog lanca zrele forme antitela 006-H08 najmanje 60%, bolje 70%, još bolje 80%, ili 90%. ili nabolje 95% identične, ili c. pri čemu su amino-kiselinske sekvence CDR najmanje 60%, bolje 70%, još bolje 80%, još bolje 90%, ili čak najbolje 95% identične sa SEK. ID BR: 1, 7 i 13 šta se tiče domena teškog lanca, i sa SEK. ID BR: 18. 24, i 29 šta se tiče domena varijabilnog lakog lanca.
U sledećoj izvedbi, opisano je antitelo ili fragment koji vežu antigen koji sadrže CDR-ove iz antitela 006-H08, pri čemu SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRL SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 varijabilnog lakog lanca odgovara KCDR1. SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3, pri čemu
a. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRL SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2. SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 78 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 90 odgovara LCDR3; ili
b. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDR1, SEK. ID BR: 75 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 82 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 91 odgovara LCDR3; ili
c. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 82 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 29
odgovara LCDR3; ili
d. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 86 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 29
odgovara LCDR3; ili
e. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl. SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 87 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 100
odgovara LCDR3; ili
f. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 87 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 92
odgovara LCDR3; ili
g. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. dok SEK. ID BR: 89 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 93
odgovara LCDR3; ili
h. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. dok SEK. ID BR: 79 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 101
odgovara LCDR3, ili
i. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 76 odgovara HCDR2. SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 89 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 90
odgovara LCDR3; ili
j. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR. 18 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 100
odgovara LCDR3: ili
k. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 varijabilnog lakog
lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 97
odgovara LCDR3; ili
1. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRL SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 98
odgovara LCDR3; ili
m. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl. SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 83 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 99
odgovara LCDR3; ili
n. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 96
odgovara LCDR3; ili
o. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 94
odgovara LCDR3: ili
p. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74
odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 88 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDR1, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK.
ID BR: 90 odgovara LCDR3; ili
q. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl. SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2. SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 81 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl. SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 95
odgovara LCDR3; ili
r. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 75 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. dok SEK. ID BR: 18 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 29
odgovara LCDR3; ili
s. SEK. ID BR: I varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 77 odgovara HCDR2. SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3; ili
t. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. dok SEK. ID BR: 80 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara 1CDR2 i SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3; ili
u. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. dok SEK. ID BR: 85 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl. SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3; ili v. SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl. SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 84 varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3.
U jednoj izvedbi su opisani humano antitelo 006-H08. ili njegova zrela forma, pri čemu pomenuto antitelo
1. a. 006-H08 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 46 i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 34, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 52, i amino-kiselinskoj sekvenci
SEK. ID BR: 40.
2. b. 006-H08-12-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 331, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 143, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 353. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 165, 3. c. 006-H08-13-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 332, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 144, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 354. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 166, 4. d. 006-H08-13-6-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 333, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 145, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 355, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 167, 5. e. 006-H08-14-6-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 334. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 146, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 356, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 168, 6. f. 006-H08-15-5 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 335, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 147, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 357, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 169, 7. g. 006-H08-19-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 336, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 148. dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 358. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 170, 8. h. 006-H08-29-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 337, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 149, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 359. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 171,9.i. 006-H08-32-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 338, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 150, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 360. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 172, 10. j. 006-H08-33-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 339, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 151, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 361, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 173, 11. k. 006-H08-33-16-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 340, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 152, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 362, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 174, 12. 1. 006-H08-35-17-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 341, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 153, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 363, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 175, 13. m. 006-H08-35-17-4 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 342, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 154. dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 364, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 176, 14. n. 006-H08-35-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 343, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 155. dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 365, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 177. 15. o. 006-H08-36-17-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 344, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 156, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 366, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 178, 16. p. 006-H08-37-19-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 345. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 157, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 367, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 179. 17. q. 0O6-H08-39-7 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 346, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 158, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 368, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 180, 18. r. 006-H08-48-5 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 347, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 159, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 369. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 181, 19. s. 006-H08-53-27-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 348, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 160, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 370, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 182, 20. t. 006-H08-59-30-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 349. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 161, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 371, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 183, 21. u. 006-H08-63-32-4 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 350, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 162. dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 372, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 184, 22. v. 006-H08-65-33-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 351, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 163, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 373. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 185. 23. w. 006-HO8-58-35-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 352. i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 164, dok domen varijabilnog lakog lanca odgovara nukleinskoj sekvenci SEK. ID BR: 374, i amino-kiselinskoj sekvenci SEK. ID BR: 186. Takođe su opisani antitelo ili fragment koji veže antigen iz malopre pomenutih antitela, pri čemu a. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, Četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,7,13, 18,24,29, ili b. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,74,13,78,24, 90, ili c. pomenut antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,75, 13, 82,24, 91, ili d. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,7,13. 82, 24, 29, ili e. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,7. 13, 86,24,29, ili f. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri. četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,74, 13,87,24, 100, ili g. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri. četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,74, 13,87.24,92 ili h. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri. četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1.74, 13,89,24. 93 ili i. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,74, 13,79,24, 101 ili j. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,76, 13,89,24, 90 ili k. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri. četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1.7. 13, 18,24, 100 ili 1. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK.
ID BR: 1,7, 13, 18.24. 97 ili
m. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,7, 13, 18, 24. 98 ili n. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,74, 13,18, 24, 99 ili o. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri. četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,7, 13. 18,24. 96 ili p. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,7, 13, 18, 24, 94 ili q. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,74. 13.88, 24, 90 ili r. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,74, 13,81,24, 95 ili s. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,75, 13, 18, 24, 29 ili t. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,77. 13,18, 24, 29 ili u. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK. ID BR: 1,7, 13, 80. 24, 29 ili v. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri. Četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK.
ID BR: 1,7, 13, 85. 24, 29 ili
w. pomenuto antitelo sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR koji odgovaraju SEK.
ID BR: 1.7. 13,84,24,29.
U drugoj izvedbi ovoga pronalaska antitelo 006-H08 se sastoji od regiona koji veže antigen koji specifično veže ili ima visoki afinitet za jedan ili više regiona PRLR. pri čemu je njegova amino-kiselinska sekvenca prikazana u SEK. ID BR: 70. amino-kiselinske pozicije 1 do 210, pri čemu pomenuti afinitet je najmanje 100 nM, preferirano najmanje oko 100 nM, bolje manje pod oko 30 nM, čak još bolje s preferiranim afinitetom manjim od oko 10 nM ili čak još bolje s preferiranim afinitetom manjim od 1 nM. ili čak još bolje manjim od 30 pM.
Takođe, predmet ovog pronalaska je malopre pomenuto antitelo 006-H08 u koje je teški konstantni region modilikovani ili nemodifikovani IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4.
Tabela 1 predstavlja sažetak disocijacijskih konstanti i disocijacijskih stopa reprezentativnih antitela iz ovoga pronalaska, kao šta je određeno uz pomoć površinske plazmonske rezonancije (Biacore) sa monomernim izvan-ćelijskim domenima PRLR (SEK. ID BR: 70) na direktno imobiliziranim antitelima.
lgGl format je korišćen za određivanje afiniteta na bazi ćelija, koji je određen uz pomoć sortiranja ćelija aktivisanih fluorescencijom (FACS) u kombinaciji sa Scatchard-ovom snalizom.
Tabela 2 prikazuje veznu snagu reprezentativnih IgG antitela prema humanoj liniji ćelija raka dojke (T47D) i prema ćelijama limfoma pacova (linija Nb2).
GENERISANJE ANTITELA
Sa ciljem da se izoluje panel antitela koja su sposobna da funkcionalno blokiraju humani i mišji PRLR, paralelno su istraživana dva formataphage- dhplaybiblioteke sa sintetičkim humanim antitelom koji su nazvani n-CoDeR<*>iz Bioinvent (Soderlind et al. 2000, Nature BioTechnologv. 18, 852-856.) i koji eksprimiraju scFv i Fab fragmente. Mete koje su korišćene za izbor scFv ili Fab su bile rastvorljivi ECD iz humanog PRLR (amino-kiselinske pozicije 1 do 210 iz SEK. ID BR. 70) i iz mišjeg PRLR (amino-kiselinske pozicije 1 do 210 iz SEK. ID BR: 72), koji su bili primenjeni kao biotinilovana (NHS-LC biotin, Pierce) i ne-biotinilovana varijanta, ali i kao humana linija ćelija raka dojke T47D koje eksprimiraju
PRLR.
Kombinovanje brojnih pristupa uphage- displaytehnologiji (PDT) je korišćeno sa ciljem da se izoluju humana monoklonska antitela sa visokim afinitetom i koja su specifična za PRLR uz pomoć kombinovanja belančevina i pomeranja celih ćelija i razvojem specifičnih alata. Alati za pomeranje i postupci proveravanja uključuju ECD iz humanog i mišjeg PRLR koji se rekombinantno eksprimiraju kao fuzija sa Fc domenom (R&D Svstems, kataloški br. 1167-PR i 1309-PR; poz. 1-216 iz SEK. ID BR: 70 i 72, pri čemu je svaki fuzionisan na Fc domen iz humanog IgGl, poz. 100 do 330 u humanom IgGl), izvan-ćelijski domen iz humanog PRLR koji se rekombinantno eksprimira kao fuzija sa priveskom od šest histidina (SEK. ID BR: 70), HEK293 i ćelije mišjeg limfoma iz linije Ba/F, obe linije stabilno transfektovane sa humanim i mišjim PRLR, i ćelije raka dojke iz linije T47D i ćelije limfoma pacova iz linije Nb2 od kojih svaka prirodno eksprimira PRLR, a primenjeno je i razvijanje procedura pomeranja i testova za proveravanje koji su sposobni da identifikuju antitela koja neutralizuju i preferencijalno se vežu na PRLR koji je izložen na površini ćelije i koja mogu da unakrsno reaguju sa PRLR iz miša i pacova (vidi primer 6 i 10).
Proveravanje je provedeno tako da su najpre identifikovani oni molekuli koji mogu da se vežu na humani PRLR, a eventualno i na mišji PRLR, u ELISA ogledu primenom rekombinantno eksprimiranih antigena. Tada, ćelijsko vezanje Fab i scFv fragmenata na T47D ćelije je ispitivano uz pomoć FACS analize, a nakon toga i uz pomoć testiranja aktivnosti pomenutih agenasa da neutralizuju unutar-ćelijsko signaliziranje. Za tu svrhu je određivana inhibicija fosforilacije PRLR, STAT5 i ERK1/2 u T47D ćelijama (vidi primer 14). scFv i Fab koji su nabolje blokirali funkciju su konvertovani u pune IgGl molekule i testirani sa ciljem da ini se provere monovalentni afiniteti prema ECD iz PRLR i inhibitorna aktivnost primenom ogleda sa reporter genom za luciferazu kao i primenom ogleda proliferacije sa ćelijama čiji je rast zavisan o prolaktinu. Kombinovanje pomenutih specifičnih postupaka je omogućilo izolovanje novog antitela '006-H08' koje je predmet ovoga pronalaska, kao i izolovanje antitela '002-H06', '002-H08'. '006-H07, '001-E06', '005-C04' koja su predmet odgovarajućih aplikacija.
PEPTIDNE VARIJANTE
Antitela iz ovoga pronalaska nisu ograničena na specifične peptidne sekvence koje su ovde obezbeđene. Pre, ovaj pronalazak takođe opisuje varijante pomenutih polipeptida. Pozivajući se na ovaj instantni opis i konvencionalno dostupnih tehnologija i referenca, stručnjak će moći da pripremi, testira i primeni funkcionalne varijante ovde opisanih antitela, pri čemu treba da se ima na umu da varijante koje mogu da se vežu i da funkcionalno blokiraju PRLR spadaju u okvire ovoga pronalaska.
Varijanta može da uključuje, na primer, antitelo koje ima najmanje jedan izmenjen region koji određuje komplementarnost (CDR) (hiper-varijabilni) i/ili okvir (FR) (varijabilni) domen/pozicijuvis- u- vispeptidne sekvence koja je ovde opisana. Kako bi se ovaj koncept bolje ilustrovao sledi kratak opis strukture antitela.
Antitelo se sastoji od dva peptidna lanaca, od kojih svaki sadrži jedan (laki lanac) ili tri (teški lanac) konstantna domena i jedan varijabilni region (VL, VH), od kojih je zadnji uvek sačinjen od Četiri FR regiona (VH: HFR1, HFR2. HFR3, HFR4; VL: LFR1, LFR2, LFR3. LFR4) i tri ispresecana CDR (VL: LCDRl. LCDR2, LCDR3; VH: HCDRl, HCDR2. HCDR3). Mesto za vezanje antigena nastaje od jednog ili više CDR-a dok FR regioni obezbeđuju strukturni okvir za CDR i. tako, igraju važnu ulogu u vezanju antigena. Menjanjem jednog ili više amino-kiselinskih ostataka u CDR ili FR regionu, stručnjak može rutinski da generiše mutirane ili raznovrsne sekvence za antitelo, koje mogu da se ispitaju protiv nekog antigena, kako bi se, na primer, otkrile nove ili poboljšane karakteristike.
Slika 12 obezbeđuje sheme za numerisanje svake amino-kiselinske pozicije u varijabilnim domenima VL i VH. Tabele 3 (VH) i 4 (VL) prikazuju CDR regione za određena antitela iz ovoga pronalaska i međusobno upoređuju amino-kiseline na određenoj i u odnosu na konsenzus ili sekvencu "početnog gena", u kojoj su CDR regioni označeni sa 'X'. Tabele 5 i 6 pomažu da se pripišu SEK. ID brojevi pomenutim antitelima, fragmentima antitela i PRLR varijantama koje su obezbeđene sa ovim pronalaskom.
Stručnjak može da koristi podatke iz Tabela 3, 4, i 5 sa ciljem da dizajnira peptidne varijante koje su unutar delokruga ovog pronalaska. Preferirano je da se pomenute varijante konstruišu uz pomoć menjanja amino-kiselina u jednom ili više CDR regiona; varijanta može takođe da ima jedan ili više promenjenih regiona okvira (FR). Na primer, peptid za FR domen može da bude promenjen tamo gde postoji devijacija u ostatku u odnosu na germinativnu sekvencu. Kada se govori o uporedbi novih antitela sa odgovarajućim konsenzusom ili sekvencom "početnog gena", koje su navedene na SI. 12, ostaci koji su kandidati za promenu uključuju, na primer, sledeće:
. ostatak lizin (K) na poziciji 75 u glutamin (Q) u VH 006-H08 (SEK. ID 34)
. ostatak leucin (L) na poziciji 108 u metionin (M) u VH 006-H08 (SEK. ID 34)
• ostatak treonin (T) na poziciji 110 u izoleucin (I) u VH 006-H08 (SEK. ID 34)
. ostatak fenilalanin (F) na poziciji 67 u leucin (L) u VH 002-H08 (SEK. ID 36).
Nadalje, varijante mogu da se dobiju uz pomoć sazrevanja, tj. uz pomoć primene jednog antitela koje služi kao početna tačku za optimizovanje uz pomoć menjanja jednog ili više amino-kiselinskih ostataka u pomenutom antitelu. preferirano amino-kiselinskih ostataka u jednom ili više CDR-a, i uz proveravanje nastale kolekcije varijanata antitela sa ciljem da se otkriju varijante sa poboljšanim karakteristikama. Posebno je preferirana promena jednog ili više amino-kiselinskih ostataka u LCDR3 iz VL. HCDR3 iz VH. LCDRl iz VL i/ili HCDR2 iz VH. Pomenuta promena može da se postigne uz pomoć sintetizovanja kolekcije DNA molekula primenom tehnologije trinukleotidne mutageneze (TRIM) [Virnekas. B.. Ge. L., Pliickthun, A., Schneider, K.C., Rupicanhofer, G., & Moronev S.E. (1994) Trinucleotide fbsforamidites: ideal reagents for the svnthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600].
Varijante sa konzervativnim amino- kiselinama
Polipeptidne varijante mogu da se načine tako da se sačuva ukupna molekularna struktura peptidne sekvence antitela koje je ovde opisano. Uzimajući karakteristike pojedinačnih amino-kiselina, neke racionalne zamene će odmah biti poznate stručnjaku. Amino-kiselinske supstitucije,//.,"konzervativne supstitucije", mogu da se ostvare, na primer. na bazi sličnosti u polamosti, naboju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i/ili amfipatske prirode uključenih ostataka.
Na primer, (a) ne-polarne (hidrofobne) amino-kiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin. valin, prolin, fenilalanin, triptofan, i metionin; (b) polarne neutralne amino-kiseline uključuju glicin. serin, treonin. cistein, tirozin, asparagin, i glutamin; (c) pozitivno nabijene (bazične) amino-kiseline uključuju arginin, lizin, i histidin; a (d) negativno nabijene (kisele) amino-kiseline uključuju asparginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Tipično, supstitucije mogu da se načine unutar grupa (a)-(d). Osim toga. glicin i prolin mogu da se međusobno zamene na bazi njihove sposobnosti da razaraju a-helikse. Slično, određene amino-kiseline, poput alanina, cisteina, leucina, metionina, glutaminske kiseline, glutamina, histidina i lizina se uobičajeno nalaze u a-heliksima, dok valin, izoleucin, fenilalanin. tirozin, triptofan i treonin se češće nalaze u P-ravnima. Glicin, serin, asparginska kiselina, asparagin, i prolin se uobičajeno nalaze u zavojima. Neke preferirane supstitucije mogu da se načine između sledećih grupa: (i) S i T; (ii) P i G; i (iii) A, V, L i I. Budući da je genetički kod poznat, a dostupne su i tehnike rekombinantne DNA i njene sinteze, stručnjak može lako da konstruiše DNA koje kodiraju varijante sa konzervativnim amino-kiselinama.
Kao šta se ovde koristi, "identičnost sekvence" između dve polipeptidne sekvence uključuju procenal amino-kiselina koje su identične u obe sekvence. "Homologija sekvence" pokazuje procenat amino-kiselina koje su identične ili su konzervativne amino-kiselinske supstitucije. Preferirane polipeptidne sekvence iz ovoga pronalaska imaju identičnost sekvence u CDR regionima od najmanje 60%, bolje najmanje 70% ili 80%, još bolje najmanje 90%, a najbolje najmanje 95%. Preferirana antitela takođe dele homologiju sekvence u CDR regionima od najmanje 80%, bolje 90%, a najbolje 95%. Međutim, sve ovde opisane molekule blokiraju signalizovanje kojim upravlja prolaktinski receptor.
UNA molekuli iz ovoga pronalaska
Ovaj pronalazak takođe se odnosi na DNA molekule koji kodiraju antitelo iz ovoga pronalaska. Pomenute sekvence uključuju, ali bez ograničenja, one DNA molekule koji su predstavljeni sa SEK. ID BR 46 i 52, te 331 do 374.
DNA molekuli ovog pronalaska nisu ograničeni na ovde pomenute sekvence. već takođe uključuju njihove varijante. DNA varijante u ovom pronalasku mogu da se opišu na osnovu njihovih fizičkih karakteristika tokom hibridizacije. Stručnjak će prepoznati da DNA može da se koristi sa ciljem da se identifikuje njen komplement, a budući da je DNA dvo-lančana, njen ekvivalent ili homolog, uz pomoć tehnika hibridizacije nukleinskih kiselina. Takođe treba da se primeti da hibridizacija može da nastupa i kada je komplementarnost manja od 100%. Međutim, primenom odgovarajućih uslova, tehnike hibridizacije mogu da se koriste sa ciljem da se razlikuju DNA sekvence na bazi njihove strukturne srodnosti sa određenom probom. O detaljima vidi Sambrook et al., 1989 [Sambrook. J., Fritsch. E. F. & Maniatis. T.
(1989) Molecular Cloning: A laboratorv manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, USA)] i Ausubel et al., 1995 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman. J. G., Smith. J. A., & Struhl, K. ur. (1995). Current Protocols in Molecular Biologv. New York: John Wiley and Sons].
Strukturna sličnost između dve polinukleotidne sekvence može da se izrazi kao funkcija "strogosti" uslova pod kojima će dve sekvence međusobno da hibridizuju. Kao šta se ovde koristi, termin "strogost" se odnosi uslova koji otežavaju hibridizovanje. Strogi uslovi snažno otežavaju hibridizovanje pa će samo strukturno najsličniji molekuli međusobno da hibridizuju u takvim uslovima. Obrnuto, manje strogi uslovi će favorizovati hibridizovanje molekula koji dele manju strukturnu sličnost. Strogost hibridizovanja, prema tome, direktno pokazuje strukturnu sličnost između sekvenca dveju nukleinskih kiselina. Sleđeći odnosi su korisni kod korelisanja hibridizovanja i sličnosti (pri čemu 1 m je tačka topljenja dupleksa nukleinske kiseline): a. Tm = 69.3 +0.41 (G+C)%
b. Tmdupleksa DNA opada za 1° C sa svakim povećanjem od 1% broja baza koje se ne sparuju.
c. (Tm)fl2 - (Tm)tii=18.5 logiou2/ul
pri čemu ul i p.2 su jonske jakosti oba rastvora.
Strogost hibridizovanja je funkcija brojnih faktora, uključujući ukupnu DNA koncentraciju, jonsku jakost, temperaturu, veličinu probe i prisutnost agenasa koji razaraju vodonikove veze. f;aktori koji promovišu hibridizovanje uključuju visoke koncentracije DNA, visoku jonsku jakost, niske temperature, duže probe i odsutnost agenasa koji razaraju vodonikove veze. Hibridizovanje se tipično provodi u dve faze: faza "vezanja" i faza "ispiranja".
Najpre, tokom faze vezanja, proba se veže na metu u uslovima koji favorizuju hibridizovanje. Strogost se uobičajeno kontroliše tokom ove faze uz pomoć promene temperature. Za jaku strogost, temperatura se uobičajeno kreće između 65° C i 70° C, osim ako se koriste kratke (< 20 nt) oligonukleotidne probe. Reprezentativan rastvor za hibridizovanje sadrži 6x SSC, 0.5% SDS. 5x Denhardt-ov rastvor i 100 ug ne-specifičnenosilac- DNA[vidi Ausubelet al.,deo 2.9, dodatak 27 (1994)]. Naravno, poznati su mnogu različiti, ali funkcionalno ekvivalentni, uslovi puferovanja. Kada je stepen sličnosti (srodnosti) nizak, može da se izabere niska temperatura. Temperature kod kojih se vezanje obavlja kod niske strogosti se kreću između oko 25° C i 40° C. Srednja strogost se kreće između oko 40° C do manje od oko 65° C. Visoka strogost nastupa kod barem oko 65° C.
Drugo, višak probe se odstranjuje uz pomoć ispiranja. U ovoj se fazi uobičajeno primenjuju stroži uslovi. Tako, faza "ispiranja" je najvažnija za određivanje srodnosti uz pomoć hibridizovanja. Rastvori za ispiranje tipično sadrže soli niskih koncentracija. Na primer, rastvor za srednju strogost sadrži 2x SSC i 0.1% SDS. Rastvor za ispiranje kod visoke strogosti sadrži ekvivalent (jonske jakosti) od manje od oko 0.2x SSC, pri Čemu preferirano strogi rastvor sadrži oko ().lx SSC. Temperature koje su povezane sa brojnim strogostima su iste kao i kod malopre pomenutog "vezanja". Rastvor za ispiranje takođe se tipično menja više puta tokom ispiranja. Na primer, tipični uslovi ispiranja kod jake strogosti podrazumevaju dvostruko ponavljanje ispiranja tokom 30 min na 55° C i trostruko ponavljanje tokom 15 min na 60° C.
Prema tome. predmet ovoga pronalaska je izolovana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira entitelo i fragmente za vezanje antigena iz ovoga pronalaska.
Druga izvedba ovoga pronalaska je malopre pomenuta izolovana sekvenca nukleinske kiseline, koja kodira antitela iz ovoga pronalaska, pri Čemu su pomenute sekvence nukleinske kiseline prikazane u Tabeli 5.
Prema tome, ovaj pronalazak obuhvata molekule nukleinske kiseline koje hibridizuju sa molekulima koji su prikazani u Tabeli 5 u uslovima vezanja i ispiranja kod visoke strogosti, pri čemu takvi molekuli nukleinske kiseline kodiraju antitelo ili neki njegov funkcionalni fragment koji imaju karakteristike kao šta je ovde opisano.
Preferirani molekuli (iz mRNA perspektive) su oni koji dele najmanje 75% ili 80%
(preferirano najmanje 85%, bolje najmanje 90%, a najbolje najmanje 95%) identičnosti sekvence sa jednim od DNA molekula koji su ovde opisani. Ovi molekuli blokiraju signaliziranje posredovano prolaktinskim receptorom.
Funkcionalno ekvivalentne varijante
Dodatna klasa DNA varijanata unutar delokruga ovog pronalaska može da se opiše prema produktu kojeg kodiraju. Ovi funkcionalno ekvivalentni geni su karakterizovani time da kodiraju iste peptidne sekvence koje su prikazane u SEK. ID BR: 34-45 zbog degeneriranosti genetičkog koda.
Podrazumeva se da se varijante DNA molekula, koje su ovde obezbeđene, mogu konstruisati na više različitih načina. Na primer, mogu da se konstruišu kao potpuno sintetičke DNA. Postupci za efikasno sintetizovanje oligonukleotida u dužini od 20 do oko 150 nukleotida su lako dostupni. Vidi Ausubelet al.,deo 2.11, dodatak 21 (1993). Oligonukleotidi koji se preklapaju mogu da se sintetizuju i sklope (montiraju) na način kao šta je opisano u Khoranaet al,J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); takođe vidi Ausubelet al., supra,deo 8.2. Sintetičke DNA preferirano se dizajniraju tako da sadrže prikladna restrikciona mesta koja su projektovana na 5'- i 3'-kraju gena kako bi se ubrzalo kloniranje u odgovarajući vektor.
Kao šta je navedeno, postupak za generisanje varijanata treba da počinje sa jednim od DNA koje su ovde opisane, a tada se provodi mesto-usmerena mutageneza. Vidi Ausubelet al., supra,poglavlje 8, dodatak 37 (1997). U tipičnom postupku, ciljna DNA je klonirana u prenosniku od jedno-lančanog DNA bakteriofaga. Jedno-lančana DNA je izolovana i hibridizovana sa oligonukleotidom koji sadrži željenu nukleotidnu izmenu(e). Tada je sintetizovan komplementaran lanac, a dvo-lančani fag je uveden u neki domaćin. Neki od nastalih potomaka će sadržavati željenog mutanta, koje može da se potvrdi uz pomoć DNA sekvenciranja. Osim toga, dostupni su brojni postupci za povećavanje verovatnosti da potomak (fag) bude upravo traženi mutant. Ovi postupci su dobro poznati stručnjacima, a kompleti hemikalija za proizvodnju takvih mutanata su komercijalno dostupni.
Konstrukti rekombinantne DNA iekspresija
Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje konstrukte rekombinantne DNA koji sadrže jednu ili više nukleotidnih sekvenca iz ovoga pronalaska. Rekombinantni konstrukti iz ovoga pronalaska su korisni zajedno sa vektorom, poput plazmida, fagmida. faga ili viralnog vektora, u kojima je ugrađen DNA molekul koji kodira antitelo iz ovoga pronalaska.
Kodirajući gen može da se proizvede primenom tehnika koje su opisane u Sambrooket al..1989, i Ausubelet al.,1989. Alternativno, DNA sekvence mogu da se sintetizuju hemijski uz pomoć, na primer, sintesajzera. Vidi, na primer, tehnike koje su opisane u OLIGONUCLEOTIDE SVNTHESIS (1984, Gait, ur., IRL Press, Oxford), pri čemu je pomenuta literatura ovde uključena u celosti kao referenca. Stručnjak zna spojiti DNA koja kodira varijabilne domene sa genskim fragmentima koji kodiraju konstantne regione brojnih humanih IgG izotipova ili njihovih derivata, mutiranih ili ne-mutiranih. Stručnjak je takođe sposoban da primeni tehnologiju rekombinantne DNA sa ciljem da spoji (fuzioniše) oba varijabilna domena u jedan lanac primenom linkera poput spojnice od petnaest amino-kiselina koja tri puta sadrži glicin-glicin-glicin-glicin-serin. Rekombinantni konstrukti iz ovoga pronalaska dolaze zajedno sa vektorima za eksprimiranje koji su sposobni da proizvedu RNA i/ili belančevine iz kodirajuće DNA. Vektor može dodatno da sadrži regulacione sekvence, uključujući neki promotor koji je operaciono spojen na otvoreni okvir čitanja (ORF). Vektor takođe može da sadrži sekvencu za selektivni marker. Takođe mogu da budu potrebni i specifični signali za inicijaciju i bakterijsku sekreciju kako bi se ostvarila efikasna translacija ugrađenih sekvenca ciljnog kodirajućeg gena.
Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje ćelije domaćine koje sadrže najmanje jednu od DNA iz ovoga pronalaska. Ćelije domaćini mogu budu bukvalno sve ćelije za koje postoje ekspresioni vektori. Mogu da budu. na primer, ćelije viših eukariota, poput ćelija sisara, ćelije nižih eukariota, poput kvaščevih ćelija, a mogu da budu i prokariotske ćelije, poput bakterijskih ćelija. Uvođenje rekombinantnog konstrukta u ćeliju domaćin može da se ostvari uz pomoć transfekcije sa kalcijum fosfatom, DEAE, transfekcije uz pomoć dekstrana, elektroporacije ili infekcije sa fagom.
Ekspresija u bakteriji
Korisni ekspresioni vektori za upotrebu u bakterijama se konstruiraju uz pomoć ugradnje sekvence strukturne DNA koja kodira željenu belančevinu zajedno sa prikladnim signalima za inicijaciju translacije i za terminaciju koji ostvaruju operativni redosled sa nekim funkcionalnim promotorom. Vektor sadrži još i jedan ili više fenotipskih selektivnih markera i početak replikacije zbog održavanja vektora u ćeliji i, ako je potrebno, zbog njegovog umnožavanja u domaćinu. Prikladni prokariotski domaćini za transformaciju uključujuE. col i, Bacillus subtilis, Salmonella iyphimuriumi razne druge vrste iz rodova Pseudomonas, Streptomvces, i Staphvlococcus.
liakterijski vektori mogu da budu na bazi, na primer, bakteriofaga, plazmida ili fagmida. Ovi vektori mogu da sadrže neki selektivni marker i bakterijski početak replikacije koji je izveden iz komercijalno dostupnih plazmida koji tipično sadrže elemente iz dobro poznatog vektora za kloniranje pBR322 (ATCC 37017). Nakon transformacije nekog prikladnog soja domaćina i uzgoj ćelija pomenutog soja do odgovarajuće gustoće kulture, izabrani promotor je de-reprimiran/indukovan uz pomoć poznatih sredstava (na primer, pomak temperature ili hemijska indukcija), a ćelije su kultivirane tokom dodatnog perioda. Ćelije su tipično sakupljene uz pomoć centri tugovanja, razorene uz pomoć fizičkih ili hemijskih načina, a nastao grubi ekstrakt je sačuvan za dodatno prečišćavanje.
Kada se govori o bakterijskim sistemima, brojni ekspresioni vektori mogu da se izaberu u zavisnosti o nameni eksprimiranih belančevina. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina neke belanČevine, na primer za proizvodnju antitela ili za pretragu peptidnih biblioteka, poželjni su vektori koji omogućavaju ekspresiju velikih količina fuzione belančevine koja može lako da se prečisti.
Prema tome, predmet ovoga pronalaska je ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira nova antitela iz ovoga pronalaska.
Ekspresija u sisarima & prečišćavanje
Preferirane regulacione sekvence za ekspresiju u ćelijama-domaćinima sisara uključuju viralne elemente koji omogućavaju visoki nivo ekspresije belančevine u ćelijama sisara. poput promotora i/ili pojačivača koji dolaze iz citomegalovirusa (CMV) (poput CMV promotora/pojačivača), Simian Virusa 40 (SV40) (poput SV40 promotora/pojačivača), adenovirusa. (na primer, veliki kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma virusa. Za dodatni opis viralnih regulacionih elemenata, i njihovih sekvenca, vidi na primer, U.S. 5,168,062 od Stinski, U.S. 4.510,245 od Bellet al.i U.S. 4,968,615 od Schaffneret al.Rekombinantni ekspresioni vektori mogu takođe da sadrže početak replikacije i selektivne rnarkere (vidi, na primer, U.S. 4,399,216, 4,634.665 i U.S. 5,179,017 od Axelet al.).Prikladni selektivni markeri uključuju gene koji omogućavaju rezistenciju na supstancije poput G418, higromicina ili metotreksata. Na primer. gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) omogućava rezistenciju na metotreksat. aneogen na G418.
Transfekcija ekspresionog vektora u ćeliju domaćina može da se provede uz pomoć standardnih tehnika poput elektroporacije, precipitacije sa kalcijum fosfatom, i transfekcije sa DEAE-dekstranom.
Celije-đomaćini sisara koje su prikladne za eksprimiranje antitela, delova za vezanje antigena, ili njihovi derivati, koji su ovde obezbeđeni, uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) [uključujući dhfr-CHO ćelije, koje su opisane u Urlaub & Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koje se koriste sa selektivnih markerom DHFR, na primer, kao staje opisano u R. J. Kaufman & P. A. Sharp (1982) Mol. Bioi. 159:601-621], NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. U nekim izvedbama, ekspresioni vektor je dizajniran tako da se eksprimirana belančevina izlučuje u medijumu u kojem rastu ćelije domaćini. Antitela, delovi koji vežu antigen, ili njihovi derivati mogu da se obnove iz medij uma kulture primenom standardnih postupaka za prečišćavanje belančevina.
Antitela iz ovoga pronalaska ili fragmenti koji vežu antigen mogu da se obnove i prečiste iz kulture rekombinantnih ćelija primenom poznatih postupaka uključujući, ali bez da se ograničavamo na amonijum sulfat ili precipitaciju sa etanolom, izolovanje kiseline, hromatografiju sa BelanČevinom A, hromatografiju sa Belančevinom G, hromatografiju uz anjonsku ili katjonsku izmenu. hromatografiju na fosfo-celulozi, hromatografiju na bazi hidrofobnih interakcija, afinitetnu hromatografiju. hromatografiju sa hidroksilapatitom i hromatografiju sa lektinom. Tečna hromatografija visoke performanse ("HPLC") takođe može da se primeni za prečišćavanje. Vidi, na primer, Colligan, Current Protocols in Immunologv. ili Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons, NY. NY. (1997-2001). na primer, poglavlja 1, 4, 6, 8. 9. 10, od kojih je svako ovde u potpunosti uklopljeno preko reference.
Antitela iz ovoga pronalaska ili njihovi fragmenti za vezanje antigena uključuju prirodno čiste produkte, produkte dobivene procedurama hemijske sinteze, i produkte koji su dobiveni primenom rekombinantnih tehnologija u eukariotskom domaćinu, uključujući, na primer, ćelije kvasca, više biljke, insekta i sisara. U zavisnosti o korišćenom domaćinu tokom procedure rekombinantne proizvodnje, antitelo iz ovoga pronalaska može da bude glikolizovano, ali i ne mora. Takvi postupci su opisani u brojnim standardnim laboratorijskim priručnicima, poputSambrook. supra.poglavlja 17.37-17.42;Ausubel, suprti,poglavlja 10. 12,13, 16, 18 i 20.
Prema tome, predmet ovoga pronalaska su takođe ćelije-domaćini koji sadrže vektor ili molekul nukleinske kiseline, pri čemu ćelija-domaćin može da bude ćelija višeg eukariota, poput ćelije sisara, ćelija nižeg eukariota, poput ćelije kvasca, a može da bude i prokariotska ćelija, poput bakterijske ćelije.
Drugi predmet ovoga pronalaska je postupak za primenu ćelije-domaćina sa ciljem da proizvodi antitelo i fragmente za vezanje antigena, pri čemu pomenuti postupak obuhvata kultiviranje ćelije-domaćina u prikladnim uslovima i obnavljanje pomenutog antitela.
Prema tome. drugi predmet ovoga pronalaska je antitelo, koje je opisano sa ovim pronalaskom, i koje se proizvodi sa ćelijama-domaćinima iz ovoga pronalaska i prečisti do težinske homogenosti od najmanje 95%.
Endometrioza i adenomioza( endometriosis interna )
Endometrioza je benigni. estrogen-zavisni. ginekološki poremećaj koji je karakterizovan prisutnošću enđometrijskog tkiva (žlezde i stroma) izvan šupljine materice. Endometrijske lezije se uglavnom nalaze u paritoneumu karlice, u jajnicima i rektovaginalnom septumu (Obstet. Gvnecol. Clin. North. Am. 24:235-238. 1997). Endometrioza je često povezana sa neplodnošću i simptomima boli poput dismenoreje. Osim toga, mnogi pacijenti pate ođ artoimunih bolesti (Hum. Reprod. 17(19):271 5-2724. 2002). Adenomioza materice takođe poznata kaoendometriosis internapredstavlja posebnu formu enđometrioze koja je ograničena na matericu. U slučaju adenomioze materice, endometrijske žlczdc napadaju miometrijum i zidove materice. U skladu sa teorijom transplantacije, endometrijski fragmenti se izbacuju preko retrogradne menstruacije u peritonealnu šupljinu zdravih i bolesnih žena (Obstet. Gvnecol. 64:151-154, 1984). Četiri glavna faktora se čini da su kritična za uspešno uspostavljanje endometrijskih lezija u šupljinu karlice pacijentica: a) U kasnoj sekretornoj fazi menstrualnog ciklusa, endometrijske ćelije kod zdravih žena postaju apoptotične. Kod pacijentica, obim apoptoze endometrijskih ćelija je vidljivo
smanjen (Fertil. Steril. 69:1042-1047,1998). Prema tome, kod pacijentica postoji veća
verovatnost u odnosu na zdrave žene da endometrijski fragmenti, koji su bili izbačeni u peritonealnu šupljinu retrogradnom menstruacijom, ne odumru već da se uspešno ugrade.
b) Za uspešnu ugradnju (implantaciju) u peritoneum i dugotrajno preživljenje ektopičnih endometrijskih fragmenata, potrebno je da se formiraju novi krvni sudovi (British
Journal of Pharmacology, 149:133-135, 2006).
c) Mnoge pacijentice pate od autoimunih bolesti čime kompromitiraju sopstvene imuno-sisteme (Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002). Ovo dovodi do zaključka da
intaktni imuno-odgovor - kao kod zdravih žena - može da igra ulogu u prevenciji uspostavljanja endometrijskih lezija. d) Lezije moraju da rastu pa zbog toga zavise o prisutnosti mitogenih stimulusa i faktora rasta.
Za tretman enđometrioze, trenutno postoje sledeći pristupi:
a) Analozi hormona koji oslobađa gonadotropin (GnRH): suprimiraju sintezu estradiola u jajnicima i indukuju atrofiju ektopičnih enđometrijkih implanata koji zavise o
prisutnosti estradiola za svoj rast.
b) Inhibitori aromataze: inhibiraju lokalnu proizvodnju estradiola u endometrijskim implantima. indukuju apoptozu i inhibiraju proliferaciju ektopičnih endometrijskih
fragmenata.
c) Modulatori selektivnog estrogenskog receptora: deluju antagonistički protiv estrogenog receptora u normalnim endometrijskim i ektopnim implantima i dovode do atrofije
implantiranog ektopičnog endometrijskog tkiva.
d) Antagonisti progesteronskog receptora: inhibiraju proliferaciju normalnih i ektopičnih ćelija endometrijuma, indukuju diferencijaciju i apoptozu. e) Kombinovana oralna kontracepcijska sredstva: održavajustatus quo,sprečavaju napredovanje bolesti, i indukuju atrofiju ektopičnog i eutopičnog endometrijuma.
f) Hirurško odstranjivanje lezija.
GnRH analozi, razni SERM, i inhibitori aromataze stvaraju snažne nus-pojave i dovode do
vrućih talasa i gubitka koštane mase kod mladih žena koje pate od enđometrioze. Tretman agonistima progesteronskog receptora dovodi do prestanka ovulacije, neregularnog menstrualnog krvarenja praćeno amenorejom, gubitka telesne težine i depresije. Zbog povećanog rizika od venskog trombembolizma. kombinovana oralna kontraceptivna sredstva
se ne preporučuju ženama koje su starije od 35 godina, pušačicama cigareta i gojaznim osobama. Hirurško odstranjivanje lezija je praćeno visokom frekvencijom povratka poremećaja.
Antitela iz ovoga pronalaska interferišu sa PRLR-posredovanim signaliziranjem koje je stimulisano preko prolaktina koji se proizvodi u hipofizi i lokalno ili zbog prisutnosti aktivirajućih PRLR mutacija pa su, prema tome, efektivnija od agonista dopamin-2 receptora koji interferiše samo sa sekrecijom prolaktina u hipofizi.
Prema tome, predmet ovoga pronalaska je antitelo 006-H08 ili fragmenti koji vežu antigen, kao sta je opisano u ovom pronalasku, koje se koristi kao lek.
PRL i PRLR se eksprimiraju u materici i igraju važnu ulogu u normalnoj fiziologiji materice; PRL može da deluje kao snažni mitogen i ima imuno-modulatornu ulogu. U ovom pronalasku je prikazano da promena u PRL/PRLR sistemu utiče na ljudsku endometriozu. Analiza ekspresije PRL i PRLR u endometrijumu zdrave žene i u endometrijumu i lezijama pacijentica (vidi Primer 2) primenom kvantitativnog Taqman PCR je prikazana na Slikama 1 i 2.
Kao šta je prikazano na Slici 1 (PRL ekspresija) i Slici 2 (PRLR ekspresija), PRL i njegov receptor su snažno pozitivno regulisani u endometrijskim lezijama. Ovo otkriće po prvi puta nudi eksperimentalni dokaz da autokrino PRL signaliziranje može da igra važnu ulogu u uspostavljanju, rastu, i održavanju endometrijskih lezija.
Antitela protiv PRLR su bila uspešno testirana na životinjskom modeluendometriosis interna,tj. adenomioza materice kod miševa (vidi Primer 20). Adenomioza se karakterizuje sa infiltriranim rastom endometrijskih žlezda u miometrijskom sloju endometrijuma. Slična je formi enđometrioze koja je ograničena na matericu - jedina forma enđometrioze koju mogu da razviju vrste koje nemaju menstrualni ciklus. Danazol, koji je efektivan kod kliničkih tretmana pacijenata koji pate od enđometrioze, takođe je efektivan i u tretmanu adenomioze materice (Life Sciences 51:1119-1125, 1992). Međutim, danazol je androgeni progestin i uzrokuje snažne androgene nus-pojave kod mladih žena, zbog čega mu je upotreba ograničena.
Antitela iz ovoga pronalaska rešavaju problem obezbeđivanja novih tretmana ili profilakse enđometrioze, a istovremeno uzrokuju manje nus-pojava upoređeno sa trenutnim standardnim terapijama.
Takođe je opisano korišćenje neutralizacije PRLR antitela i fragmenata koji vežu antigen za tretiranje ili prevenciju enđometrioze i adenomioze( endometriosis interna).
Drugi aspekt ovoga pronalaska je upotreba antitela i fragmenata koji vežu antigen, kao staje opisano u ovom pronalasku, za tretman ili prevenciju enđometrioze i adenomioze
( endometriosis interna).
Ženska kontracepcija bez hormona
Trenutni pristupi za žensku kontracepciju su kako sledi:
a) Kombinovani oralna sredstva za kontracepciju sadrže estrogene i progestine.
Progestogena komponenta posreduje efekt kontracepcije preko negativne povratne
sprege koja utiče na hipotalamusno-hipofizno-gonađalnu osovinu. Estrogena komponenta obezbeđuje kontrolu nad krvarenjem i potencira gestageno delovanje uz pomoć indukovanja progesteronskog receptora u ciljnim ćelijama.
b) Intrauterine naprave koje sadrže samo progestine. Lokalno oslobođeni progestin dovodi endometrijum u stanje koje je rezistentno na implantaciju. Osim toga, cervikalni mukus
(sluz) postaje gotovo neprobojan za spermatozoide.
c) Pilule i implanti koji sadrže samo progestin. Progestin inhibira ovulaciju preko negativne povratne sprege koja deluje na hipotalamusno-hipofizno-gonadalnu osovinu.
Osim toga. permeabilnost cervikalnog mukusa za spermatozoide je smanjena.
d) Vaginalni prsteni koji sadrže etinilstradiol i progestine.
Glavna nus-pojava kombinovanih oralnih sredstva za kontracepciju je povećani rizik od
venske tromboembolije (VTE). Štaviše. pretile žene i pušačice. kao i žene koje pate od autoimunih bolesti poput lupusa i žene starije od 35 godina, ne mogu koristiti kombinovana oralna sredstva za kontracepciju.
Intrauterine naprave i implanti koji sadrže samo progestine mogu da dovedu do disfunkcionalnog krvarenja u materici.
Pilule samo sa progestinom mogu da uzrokuju neregularna krvarenja, metroragiju( spotting),amenoreju. Rizik od vanmaterične trudnoće se povećava. Debljanje i smanjivanje gustoće kostiju su dodatne nus-pojave.
Vaginalni prsteni mogu da dovedu do vaginitisa. leukoreje ili ekspulziju.
PRLR-deficijentni miševi su dobiveni pre nekoliko godina (Genes Dev 11:167-178, 1997). Interesantno. PRLR-deifcijentne ženke, ali ne i mužjaci, su potpuno sterilne. PRLR"'" ženke pokazuju zastoj u razvoju jajašca odmah nakon fertilizacije, tj. ovaj zastoj se odnosi na razvoj pre implantacije. Samo veoma mali broj oocita dosegne stepen blastociste pri čemu ne mogu da se implantiraju kod mutiranih ženka, ali se razvijaju u normalne embrione u surogat-ženkama divljeg tipa nakon transplantacije. Fenotip neplodnosti PRLR-deficijentnih miševa može da se zaobiđe uz pomoć dodavanja progesterona do sredine trudnoće. Očito. PRLR-posredovano signaliziranje igra važnu ulogu u održavanju i funkcioniranju žutog tela( corpus luteum)šta se tiče proizvodnje progesterona koji je neophodan za pojavu i održavanje trudnoće. Osim toga, PRLR-deficijentne ženke, ali ne i mužjaci, imaju smanjenu telesnu težinu usled smanjenja mase trbušnih masnih naslaga i nivoa leptina.
Do sada nije pronađena mutacija koja inaktiviše humani PRLR, pa prema tome tačna uloga PRLR-posredovanog signaliziranja kod ljudi još uvek nije poznata. Međutim, postoje ozbiljne naznake da je takođe i kod ljudi minimalni novo prolaktina potreban za pojavu uspešne trudnoće. Pacijentice koje pate od primarne neplodnosti zbog nedostatka hiperprolaktinskog žutog tela se tretiraju sa bromokriptinom. U nekim slučajevima, nivoi prolaktina su bili prekomerno suprimirani, a skraćene lutealne faze su ponovo ponovljene (Bohnet HGet al.u Lisuride and other dopamine agonists, ur.: D.B. Calneet al,Raven Press, New York, 1983). Iz tih podataka je zaključeno da hiper- i hipo-prolaktinske faze negativno interferišu sa plodnosti žena. Ovo može da sc objasni sa interakcijom PRL sa svojim receptorom. U slučaju niskih prolaktinskih nivoa, aktivisanje receptora nije zadovoljavajuće, dok u slučaju hiperprolaktinemije aktivisanje receptora takođe nije zadovoljavajuće jer su svi receptori blokirani sa jednim molekulom prolaktina i ne mogu da se dimerizuju. Drugim rečima. dozni odgovor na prolaktin je u formi zvona, a optimalno aktivisanje receptora se postiže samo u tačno određenom rasponu koncentracija. Druga studija ukazuje na to da nedostatak ekspresije prolaktina u endometrijumu pacijentica dovodi do neuspeha rane implantacije (Human Reprod. 19:1911-1916, 2004). Štaviše, pokazano je daex vivoprolaktin može da spreći apoptozu kultiviranih ljudskih granutoznih ćelija čime održava ranu funkciju žutog tela kao staje demonstrirano i kod PRLR-deficijentnih miševa (Human Reprod. 18: 2672-2677, 2003).
Sa ciljem da se testira kontraceptivna efikasnost antitela koja neutralizuju PRLR. miševi su primili (uz pomoć injekcije) specifična i nespecifična antitela protiv PRLR pa su pareni sa ženkama kao šta je opisano u primeru 11. Pratio se broj jedinki u leglu i veličina svake jedinke u tretiranim grupama. Eksperiment na slici 11 pokazuje da tretman sa neutralizujućim antitelom iz ovoga pronalaska potpuno sprečava skotnost miševa koji su bili testirani sa dozom od 30 mg/kg telesne težine.
Upoređeno sa malopre pomenutim standardnim pristupima, ženska kontracepcija sa antitelima koja neutralizuju PRLR ima nekoliko prednosti: • antitela mogu se primenjuju na pušačicama. pretilim i starijim ženama kao i na ženama koje pate odlupus erythematodes(PRLR antitela mogu čak da budu korisna i za tretman lupusa, a i za smanjivanje trbušnih masnih naslaga, tj. PRLR-deficijentni miševi imaju manje trbušnih masnih naslaga).
• antitela protiv PRLR ne povećavaju rizik od VTE (venska tromboembolija).
• suprotno od estrogena i progestina, koji se koriste u kombinovanim oralnim sredstvima za kontracepciju, neutralizovanje PRLR-posredovanog signaliziranja dovodi do inhibicije epitelne proliferacije dojki, a za razliku od hormonskih pristupa kontrole plodnosti, možda čak i štiti korisnice od raka dojke.
Takođe je opisana upotreba PRLR antitela koja neutralizuju PRLR i fragmenata koji se vežu za antugen za žensku kontracepciju s smanjenim nus-pojavama u poređenju sa standardnim tretiranjem.
Takođe je opisana upotreba antitela i fragmenata koji se vežu za antugen kao što je opisano u ovom pronalasku za žensku kontracepciju sa smanjenim nus-pojavama u poređenju sa standardnim tretiranjem.
Benigna bolest dojki i mastalgija
Benigna bolest dojke obuhvata brojne simptome, poput fibrocistične promene dojki, adenoma dojke, mastalgije, i makrocista. 30-50% žena u razdoblju pre menopauze pate od fibrocistične promene dojke (Epidemiol Rev 19:310-327, 1997). U zavisnosti o starosti žene, benigna bolest dojke može da se manifestuje preko raznih fenotipa (J Mammarv Gland Biol Neoplasia 10: 325-335, 2005): tokom ranih reproduktivnih faza (15-25 godina) kada nastupa lobularni razvoj normalnih dojki, benigna bolest dojke rezultuje u adenom dojke. Primećeni su slučajevi jednog velikog adenoma dojke kao i slučajevi više adenoma. Ovi adenomi dojke se sastoje od stromalnih, ali i od epitelnih ćelija i nastaju iz lobula. U zreloj reproduktivnoj fazi (25-40 godina), dojke prolaze kroz kliničke promene tokom svakog menstrualnog ciklusa. Bolesna žena pati od kliničke mastalgije i ima nekoliko nodula u svojim dojkama. Kasnije (35-55 godina starosti), normalne dojke smanjuju svoju veličinu i funkciju pri čemu kod bolesnih dojki mogu da se primete makrociste i epitelna hiperplazija sa ili bez atipije. Ove forme benigne bolesti dojke su praćene sa pojačanom proliferacijom epitelnih ćelija pri čemu se povećava rizik od razvijanja karcinoma dojke. Ovaj rizik može da iznosi do čak 11% ako su prisutne atipične ćelije (atipije) u frakciji ćelija koje proliferiraju (Zentralbl Gvnakol 119: 54-58, 1997). 25% žena u dobi od 60-80 godina takođe pati od benigne bolesti dojke, pri čemu su Često zamenska terapija sa estrogenom ili gojaznost razlozi upornosti benigne bolesti dojke nakon menopauze (Am J Obstet Gvnecol 154: 161-179. 1986).
Patofiziologija fibrocistične promene dojke je određena zbog prevlasti estrogena i nedostatka progesterona koje rezultuje u hiperproliferaciju vezivnih tkiva (fibroza) koje je praćeno lakultativnom proliferacijom epitelnih ćelija. Kao staje već pomenuto, rizik od raka dojke se povećava kod pacijentica koje pokazuju povećanu proliferaciju epitelnih ćelija u llbrocističnim fokusima. Klinički, fibrocistična promena dojke se manifestuje bolom i prekomernom osetljivošću dojki. 70% pacijentica sa fibrocističnom promenom dojke pati od insuficijencije žutog tela ili od nemogućnosti ovuliranja (Am J Obstet 154: 161-179, 1986). Insuficijencija žutog tela rezultuje smanjenim nivoima progesterona i prevlasti estrogena. Mastalgija (bol u dojkama) zahvata oko 70% žena u nekom trenutku tokom reproduktivnog perioda. Bol u dojkama može. ali ne mora da bude povezana sa drugim kriterij um ima premenstrualnog sindroma. Pokazano je da žene koje pate od mastalgije nakon stimulisanja hipotalamusno-hipofizne osovine oslobađaju povećanu količinu prolaktina (Clin Endocrinol 23:699-704, 1985).
Standardne terapije benigne bolesti dojke i mastalgije su:
1)Bromokriptin
Bromokriptin je agonist dopamina koji blokira sintezu prolaktina u hipofizi, ali ne i lokalnu sintezu prolaktina i u ćelijama epitela mlečnih žlezda. Prema tome, efektivan je samo u onim formama mastalgije i benigne bolesti dojki koje zavise o povećanim sistemskim nivoima prolaktina. Glavne nus-pojave bromokriptina su: Mučnina, povraćanje, edem, hipotenzija, vrtoglavica, gubitak kose, glavobolja, i halucinacije.
2)Danazol
Danazol je androgeni progestin koji, preko svojeg anti-gonadotrofnog delovanja, sprečava prevlast estrogena koja se primećuje kod benigne bolesti dojke. Glavne nus-pojave su: Neregularan menstrualni ciklus, depresija, bubuljice, hirzutizam (kosmatost kod žena), produbljivanje glasa, i valunzi kao i debljanje.
3) Tamoksifen
Tamoksifen je selektivan modulator estrogenskog receptora sa anti-estrogenim delovanjem u dojkama i estrogenim delovanjem u materici. Glavne nus-pojave su: Postmenstrualni simptomi poput gubitka koštane mase i valunga, ciste u jajnicima, i karcinom endometrijuma,
4) Progestini
Progestini inhibiraju benignu bolest dojke preko hipofizno-gonadalne osovine, inhibiranja ovulacije i smanjivanja nivoa estrogena. Smanjivanje nivoa estrogena dovodi do menopauzalnih simptoma poput gubitka koštane mase i valunga.
5) Kombinovana oralna kontraceptivna sredstva niske doze
Ovaj tretman se ne primenjuje kod žena starijih od 35 godina, pušačica kao i kod dijabetičarki i gojaznih žena.
Uopšteno, nivoi prolaktina su povećani kod jedne trećine žena sa benignom bolesti dojke. Zbog toga šta estrogeni pojačavaju sekreciju prolaktina u hipofizi, porast nivoa prolaktina u serumu se smatra posledicom prevlasti estrogena kod pomenute bolesti. Objavljeno je da aktivisanje PRLR mutacije je često prisutno kod žena koje pate od multiplih adenoma dojke - koje podseća na podtip fibrocistične promene dojke (Paul Kellv, Breast Congress Turin. 2007 i Proc Natl Acad Sci 105: 14533-14538; 2008).
Benigna bolest dojke, mastalgija i premenstrualna osetljivost dojki imaju zajednički patofiziološki mehanizam: pojačano prolaktinsko signaliziranje. Povećano prolaktinsko signaliziranje može da bude posledica:
• sistemske hiperprolaktinemije (zbog adenoma hipofize)
• lokalne hiperprolaktinemije (zbog sinteze prolaktina u proliferirajućim epihelnim ćelijama mlečnih žlezda). Lokalna hiperprolaktinemija se ne pretvara u stanje povećanih nivoa prolaktina u krvi • konstitutivnog aktivnog PRLR signaliziranja kada su nivoi prolaktina normalni (zbog aktivisanja PRLR mutacije).
Uzimajući u obzir da neke forme benigne bolesti dojke mogu prerasti u rak dojke, postoji medicinska potreba da se razvije tretman za pomenutu bolest.
Sa ciljem da se demonstrira efikasnost antitela koja neutralizuju PRLR na prekliničkom modelu benigne bolesti dojke, primenjen je mišji model na bazi hiperprolaktinemije. Odraslim Balb/c miševima su transplantirani parčići hipofize (iz genetički identičnih jedinka) ispod bubrežne kapsule kao šta je opisano u Primeru 16 (U: Methods in Mammarv Gland Biologv and Breast Cancer Research. 101-107. 2000). Sistemska hiperprolaktinemija je dovela do povećane proliferacije ćelija epitela u mlečnim žlezdama, a stimulisala je i bočno grananje i lobuloalveolarni razvoj upoređeno sa ne-tretiranom kontrolnom grupom miševa. Najteže forme ljudskih fibrocističnih promena dojke koje uzrokuju povećani rizik od razvoja raka su karakterizovane sa povećanom proliferacijom ćelija epitela. Kao šta je opisano u Primeru 16. antitela koja neutralizuju PRLR su testirana na Balb/c miševima i upoređena sa ne-specifičnim antitelom pri čemu je praćena sposobnost da se:
• blokira bočno grananje i lobuloalveolarni razvoj
• inhibira proliferacija ćelija epitela mlečnih žlezda
• inhibira fosforilacija STAT5, transcripcijski faktor koji se normalno aktiviše i fosforiliše nakon aktivisanja PRLR.
Kao šta je pokazano na Slikama 15A-C, antitela koja neutralizuju PRLR blokiraju sve malopre pomenute paradigme na dozno-zavisan način.
Takođe je opisana upotreba antitela koja neutralizuju PRLR ili fragmenata koji vežu antigen za tretman benigne bolesti dojke i mastalgije kod pre- i post-menopauzalnih žena.
Drugi aspekt ovoga pronalaska je upotreba antitela ili fragmenata koji vežu antigen, kao šta je opisano u ovom pronalasku, za tretman benigne bolesti dojke i mastalgije kod pre- i post-menopauzalnih žena.
I nhibicija laktacije
Prolaktin je glavni hormon koji je odgovoran za laktaciju nakon porođaja. Ovo je potvrđeno uz pomoć fenotipa PRLR-deficijentnih miševa. Čak heterozigotni miševi imaju izražene probleme sa laktacijom i su potpuno nesposobni da doje svoje potomke (Frontiers in Neuroendocrinologv 22: 140-145, 2001).
Zbog više razloga, žena ponekad mora da prekine dojenje, na primer. uzimanje lekova koji su potencijalno opasni za plod, ozbiljne infekcije (mastitis, nefritis), obilno krvarenje posle porođaja, i ozbiljne bolesti majke poput dijabetesa, raka. i slabosti i bolesti ploda. Trenutno, agonisti dopaminskog receptora poput bromokriptina i lisurida su korisni za inhibiciju laktacije nakon poroda. Međutim, ova jedinjenja mogu da uzrokuju snažne nus-pojave poput mučnine, povraćanja, edema, hipotenzije, vrtoglavice, gubitka kose. glavobolje, i halucinacija. Osim toga, agonisti dopaminskog receptora se ne mogu koristiti kod žena koje pate od kardiovaskularnih bolesti i hipertenzije. Dodatni nedostatak bromokriptina je kratki polu-život koje zahteva da se lek uzima 4-6 puta dnevno tokom perioda od 14 dana.
Sa ciljem da se testira efikasnost antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor kod miševa, ženke NMRI miševa su sparene sa mužjacima. Nakon poroda, veličina legla je bila podešena na 8 životinja, a ženke su bile tretirane sa specifičnim i ne-specifičnim antitelima protiv PRLR kao šta je opisano u primeru 15. Težina potomaka je praćena na dnevnoj bazi, a služila je kao mera laktacijske sposobnosti majke. Očitanja su detaljno opisana u primeru 15, a rezultati su prikazani na slici 14A-D. Antitela koja neutralizuju PRLR pokazuju dozno-zavisnu inhibiciju laktacije i dovode do involucije mlečnih žlezda i smanjene proizvodnje mlečnih belančevina.
Takođe je opisana upotreba antitela koja neutralizuju PRLR za inhibiciju laktacije.
Drugi predmet ovoga pronalaska je upotreba antitela 006-H08 i fragmenata za vezanje antigena kao staje opisano u ovom pronalasku za inhibiranje laktacije.
Benigna hiperplazija prostate
Benigna hiperplazija prostate (BPH) je četvrto najčešće zdravstveno stanje starijih muškaraca. Povećanje prostate je progresivno stanje koje zavisi o dobi pojedinca, a zahvata više od 50% muškaraca iznad 50 godine života. BPH je karakterizovano hiperplazijom stromalnih i epitelnih ćelija prostate, koje dovodi do nastanka velikih diskretnih nodula u periuretralnom regionu prostate koji pritiskaju mokraćni kanal. Tako, glavna posledica BPH je narušeni tok mokraće.
Standardne terapije za BPH obuhvataju upotrebu/primenu:
a) antagonista al-adrenergičkog receptora (na primer, tamsulosin, alfuzosin, terazosin, doksazosin) koji olakšavaju BPH simptome u donjem mokraćnom sistemu. Pomenuti
smanjuju opstrukciju izlaza iz bešike tako da blokiraju stimulaciju glatke muskulature
prostate posredstvom alfa-receptora. Glavne nus-pojave su neželjene vasodilatorne događaje, vrtoglavica i neuspelaejakulacija.
b) inhibitora 5a-reduktaze (na primer, finasterid); inhibitori 5ct-reduktaze sprečavaju nastanak dihidrotestosterona, aktivne forme testosterona u prostati, koji je odgovoran za
povećanje prostate. Glavne nus-pojave su seksualna disfuncija, poput erektilnih poremećaja i smanjeni libido.
c) transuretralne resekcije prostate (TURP); ovaj hirurški tretman je povezan sa visokom morbidnosti. Nus-pojave su krvarenje, inkontinencija, formiranje struktura, gubitak
ejakulacije, i perforacija bešike.
d) stenta prostate; stent se uvodi u deo prostate oko mokraćnog kanala kako bi obezbedio pravilan protok mokraće. Glavne nus-pojave su skorevanje (enkruistacija). infekcija
mokraćnog kanala, te migracija stenta. Štaviše. stent se mora odstraniti pre bilo koje
transuretralne manipulacije.
Kao staje opisano za mlečne žlezde, PRL i PRLR deluju na autokrini/parakrini način (J. Clin. Invest. 99: 618 str., 1997) u prostati.
Kliničke studije pokazuju daje hiperprolaktinemija (i akromegalija) povezana sa povećanjem prostate i stromalne akumulacije upalnih ćelija. Ljudski hormon rasta može da se veže na ljudski PRLR u prisustvu cinka koje može da objasni zašto akromegalija može da dovede do benigne hiperplazije prostate. Nivoi PRL u serumu su često povećani kod pacijenata sa BPH.
Transgene životinje koje prekomerno i svestrano eksprimiraju PRL gen, razvijaju ozbiljnu stromalnu hiperplaziju prostate, koje pokazuje da je PRL veoma važan patofiziološki faktor za pojavu hiperplazije prostate (Endocrinologv 138: 4410 str.. 1997). Nadalje, lokalna prekomerna ekspresija PRL u transgenim miševima pod kontrolom probasinskog promotora, koji je specifičan za prostatu, rezultuje stromalnom ekspanzijom, nakupljanjem upalnih ćelija i fokalnom epitelijalnom displazijom koje su osnovne karakteristike ljudske BPH (Endocrinologv 144: 2269 str.. 2003). PRLR je visoko eksprimiran u prostati (Primer 3, Slika 3). Varijacija u ekspresiji PRLR belančevine je primećena u tkivu prostate pacova nakon opadanja nivoa hormona i tretmana (Primer 4, Slika 4). Osim PRLR. ćelije prostate takođe eksprimiraju prolaktin.
Kao šta je opisano u Primeru 17. mužjacima Balb/c miševa su bili presađeni parčići hipofize ispod bubrežne kapsule nakon čega su razvili benignu hiperplaziju prostate. U ovom modelu takođe je testiran efekt antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i ne-specifičnih antitela na benignu hiperplaziju prostate. Očitanja su opisana u Primer 17. Kao šta je opisano na Slici 16. antitela koja neutralizuju PRLR inhibiraju benigni rast prostate pa su, prema tome, prikladna za tretman benigne hiperplazije prostate.
Takođe je opisana upotreba antitela ili fragmenata koji vežu antigen koji neutralizuju PRLR za tretman benigne hiperplazije prostate.
Drugi aspekt ovoga pronalaska je upotreba antitela ili fragmenata koja vežu antigen, kao šta je opisano u ovom pronalasku, za tretman benigne hiperplazije prostate.
Hiper- prolaktinski gubitakkose
Tretman gubitka kose još uvek je neostvareni cilj. Kosa na glavi raste u ciklusima: anagena faza je karakterizovana akutnim rastom kose. katagena faza pokazuje involuciju, a nakon toga sledi telogena faza (odmaranje). Egzogena faza (oslobađanje mrtve kose) se poklapa sa krajem telogene faze. Gubitak kose može da bude posledica narušenog rasta kose u bilo kojoj pomenuto j fazi.
Telogeni gubitak kose može da ima više uzroka (fiziološki i emocionalni stres, medicinska stanja, nedostatak gvožđa i cinka), a važno je to šta muška ćelavost u svojim ranim fazama pokazuje telogeni gubitak kose (Cleveland clinic journal of medicine 2009; 76: 361-367). Anageni gubitak kose je često posledica zračenja ili hemoterapije.
Minoskidil i Finasterid se koriste za tretman androgenog gubitka kose, dok se glikokortikoidi koriste kodalopecia areata.Uopšteno, svi ovi tretmani imaju nus-pojave (finasterid: gubitak libida i impotencija kod muškarca, glikokortikoidi: dijabetes, debljanje, osteoporozu). a problem tretiranja gubitka kose nije rešen u potpunosti. Kod glodara. eksperimenti brijanja odraslih životinja su korišćeni za analizu efekta jedinjenja na gubitak kose pri čemu se ponovni rast dlaka na obrijanom području koristi kao način očitanja rezultata eksperimenta (British Journal of Dermatologv 2008; 159: 300-305). Brijanje odraslih životinja (dlaka se uglavnom nalazi u telogenoj fazi) potiče anagenu fazu koju karakterizuje rast krzna.
U eksperimentima opisanim u Primeru 17 (benigna hiperplazija prostate), životinjama su presađeni izogeni parčići hipofize, a tada su obrijane. Tokom izvođenja eksperimenata, neočekivano je otkriveno da je kod životinja, kojima su bili presađeni izogeni parčići hipofize, ozbiljno narušen ponovni rast dlaka u obrijanim područjima. Tretman sa antitelima koja neutralizuju PRLR. ali ne i sa ne-specifičnim antitelima. stimuliše rast dlaka (Slika 17). Ova opservacija pokazuje da je povećano signaliziranje posredovano prolaktinskim receptorom uključeno u rastu kose. Sa ciljem da se sve ovo detaljnije analizira, provedeni su daljni eksperimenti brijanja analogno prethodno opisanim eksperimentima (British Journal of DermatoIogy 2008; 159: 300-305). Ovi dodatni eksperimenti brijanja su opisani u Primeru 18. Eksperimenti pokazuju da antitela koja neutralizuju PRLR mogu da stimulišu rast dlaka kod mužjaka i ženki miševa sa povećanim normalnim nivoom prolaktina.
Antitela iz ovoga pronalaska rešavaju problem obezbeđivanja novih tretmana za gubitak kose kod žena i muškaraca sa povećanim i normalnim nivoom prolaktina.
Takođe je opisana upotreba antitela ili fragmenata koji vežu antigen koji neutralizuju PRLR za tretman ili prevenciju gubitka kose kod povećanog i normalnog nivoa prolaktina.
Drugi aspekt ovoga pronalaska je upotreba antitela ili fragmenata koji vežu antigen, kao šta je opisano u ovom pronalasku, za tretman ili prevenciju hiper-prolaktinskog gubitka kose.
Kombinovana hormonska terapija
Za tretman valunga kod post-menopauzalnih žena koje još uvek imaju matericu se koriste kombinacije estrogena (estradiol, ili konjugirani konjski estrogeni = CEE) i progestina (na primer, medroksiprogesteron acetat (MPA). progesteron, drospirenon, levonorgestrel). Progestini se moraju dodati kao bi inhibirali proliferaciju ćelija epitela materice koja je potaknuta estradiolom. Međutim, dodavanje progestina povećava proliferaciju ćelija epitela mlečnih žlezda. Budući da normalne kao i tumorske ćelije epitela mlečnih žlezda odgovaraju proliferacijom na kombinovani tretman estrogena i progestina, relativni rizik od raka dojke je povećan nakon tretmana CEE + MPA (JAMA 233: 321-333; 2002).
Kada se ženi, koja prima kombinovanu hormonsku terapiju, antitela koja neutralizuju PRLR administriraju svaki mesec ili svaki drugi mesec doći će do inhibiranja povećane proliferacije ćelija epitela dojke.
Kao šta je opisano u Primeru 19, prethodno razvijeni mišji model je upotrebljen za kvantitativnu analizu efekata progestina u materici i dojkama (Endocrinology 149: 3952-3959, 2008). Miševima su izvađeni jajnici, a životinje su 14 dana nakon toga tretirane tokom tri sedmice sa prenosnikom ili 100 ng estradiola plus 100 mg/kg progesterona kako bi se oponašala hormonska zamenska terapija. Životinje su tretirane jednom sedmično sa specifičnim antitelima protiv PRLR (10 mg/kg ili 30 mg/kg) ili ne-specifičnim antitelima (30 rng/kg). Analizirani su efekti antitela koja neutralizuju PRLR na proliferativnu aktivnost u dojkama pod kombinovanom hormonskom terapijom.
Antitela predmetnog pronalaska rešavaju problem za tretiranje pojačane proliferacije epitelnih ćelija dojke stoje uočava kod kombinovane hormonske terapije.
Takođe je opisana upotreba antitela ili fragmenata koji vežu antigen koji neutralizuju PRLR u kombinovanoj hormonskoj terapiji (tj. terapija estrogen plus progestin) za inhibiranje proliferacije epitelnih ćelija dojke.
Takođe je opisana upotreba antitela ili fragmenata koji vežu antigen kao što je opisano u ovom pronalasku u kombinovanoj hormonskoj terapiji (tj. terapija estrogen plus progestin) za inhibiranje proliferacije epitelnih ćelija dojke.
DEFINICIJE
Ciljni antigen, ljudski "PRLR", kao šta se ovde koristi, se odnosi na ljudski polipeptid koji ima bitno (uglavnom) istu amino-kiselinsku sekvencu u svojem izvan-ćelijskom domenu kao i amino-kiseline na pozicijama 1 do 210 iz SEK. ID BR. 70 i njegove prirodne alele i/ili varijante. "ECD iz PRLR". kao šta se ovde koristi, se odnosi na izvan-ćelijski deo PRLR koji je predstavljen sa malopre pomenutim amino-kiselinama. Osim toga, ciljani ljudski PRLR takođe obuhvata mutirane verzije receptora, poput aktivirajuće mutacije 1146L koja je opisana od autora Paul Kelly (Proc Natl Acad Sci USA. 105 (38): 14533-14538, 2008; i usna komunikacija, Turin, 2007).
Kao šta se ovde koristi, fraza "terapeutski efektivna količina" se odnosi na količinu terapeutskog ili profilaktičkog antitela koja je dovoljna da potakne željeni terapeutski ili profilaktički efekt ili odgovor, uključujući ublažavanje nekih ili svih simptoma bolesti ili smanjivanje predispozicija na tu bolest, kada se pomenuto administrira u skladu sa željenim režimom za tretman.
Kao Šta se ovde koristi, antitelo "se veže specifično na", je "specifično za" ili "specifično prepoznaje" neki antigen (konkretno ovde PRLR) ukoliko pomenuto antitelo može da diskriminira između takvog antigena i jednog ili više referentnih antigena, jer vezna specifičnost nije apsolutno, već relativno svojstvo. U svojoj najopštijoj formi (i kada se ne pominje definisana referenca), "specifično vezanje" se odnosi na sposobnost antitela da diskriminira između ciljanog antigena i nekog drugog antigena, na osnovu, na primer, jednog ili više od sledećih postupaka. Takvi postupci obuhvataju, ali bez ograničenja, Western-blot. ELISA-, RIA-, ECL-. IRMA-oglede i peptidne skenove. Na primer, može da se provede standardni ELISA ogled. Procena može da se ostvari preko razvijanja standardne boje (na primer, sekundarno antitelo sa peroksidazom iz hrena i tetrametil benzidin sa hidrogenperoksidom). Reakcija u rupicama se procenjuje uz pomoć optičke gustoće, na primer, na 450 nm. Tipična pozadina (=negativna reakcija) može da bude 0.1 OD; tipična pozitivna reakcija može da bude 1 OD. To znači da razlika između pozitivnog i negativnog može da bude veća ođ 10-puta. Tipično, određivanje vezane specifičnosti se provodi korišćenjem ne samo pojedinačnog referentnog antigena, već seta od oko tri do pet antigena koji nisu slični, poput mleka u prahu, BSA, transferina i slično. Međutim, "specifično vezanje" takođe može da se odnosi na sposobnost antitela da diskriminira između ciljnog antigena i jednog ili više sličnih antigena, koji se koriste kao referentne tačke. Dodatno, "specifično vezanje" može da se odnosi na sposobnost antitela da diskriminira između različitih delova svojeg ciljanog antigena, na primer, različiti domeni, supdomeni ili regioni PRLR, poput epitopa u N-terminalnom ili C-terminalnom regionu ECD iz PRLR, ili između jedne ili više ključnih amino-kiselinskih ostataka ili poteza amino-kiselinskih ostataka u ECD iz PRLR.
"Afinitet" ili "vezani afinitet", Kd, se često određuju merenjem ravnotežne konstante asocijacije (ka) i ravnotežne konstante disocijacije (kd) i računanjem koeficijenta kd naspram ka (Kd= kd/ka). Termin "imunospecifično" ili "specifično vezanje" znači da se antitelo veže na PRLR ili na njegov ECD sa afinitetom Kdkoji je niži ili jednak IO"<6>M (monovalentni afinitet). Termin "visoki afinitet" znači da afinitet Ko sa kojim se antitelo veže na PRLR ili njegov ECD je niži ili jednak IO"<7>M (monovalentni afinitet). Antitelo može da ima značajno veći afinitet za ciljni antigen u odnosu na druge molekule. Antitelo može takođe da ima značajno veći afinitet za ciljani antigen u odnosu na njegove homologe, na primer, najmanje 1.5-puta, 2-puta, 5-puta 10-puta, 100-puta, 10"<3>puta, 10"<4->puta, lO '-puta, 10"<6->puta ili veći relativni afinitet za ciljani antigen. Takvi afiniteti mogu lako da se odrede uz pomoć konvencionalnih tehnika, poput ravnotežne dijalize; korišćenjem instrumenta BIAcore 2000, primenom opštih procedura koje su opisane od strane proizvođača; uz pomoć radio-imuno-ogleda koji koristi radio-označeni ciljani antigen; ili uz pomoć nekog drugog postupka koji je poznat stručnjaku. Podaci za afinitet mogu da se analiziraju, na primer, uz pomoć postupka od autora Scatchardet al.,Ann N.Y. Acad. ScL, 51: 660 (1949).
Kao šta se ovde koristi, fraza "antitela koja antagonizuju prolaktinski posredovano signaliziranje" je namenjena da se odnosi na blokiranje aktivisanja prolaktinskog receptora uz pomoć antitela iz ovoga pronalaska koje dovodi do potpune inhibicije signaliziranja koje je posredovano prolaktinskim receptorom.
Kao šta se ovde koristi, fraza "antitela se takmiče za vezanje" se odnosi na kompeticiju između jednog antitela i drugog antitela ili više antitela za vezanje na prolaktinski receptor.
Termin "antitelo" se koristi u širokom smislu i uključuje potpuno sklopljena antitela. monoklonska antitela, poliklonska antitela. multispecifična antitela (na primer, bispecifična antitela), fragmente antitela koji mogu da vežu antigen (na primer, Fab', F'(ab)2. Fv, jedno-lančana antitela, diatela), antitela iz kamile i rekombinantne peptide koji obuhvataju sve šta je do sada pomenuto pod uslovom da pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitela mogu da sadrže različite konstantne domene (Fc domeni) u svojem teškom lancu koji je preferirano izveden iz IgGl, IgG2. ili IgG4 izotipa (vidi ispod). Mogu da se uvedu mutacije za modifikovanje efektorskih funkcija. Identifikovani su amino-kiselinski ostaci u Fc-domenu koji igraju dominantnu ulogu u interakcijama sa belančevinom Clq iz komplementa i Fc receptorima, a mutacije koje utiču na efektorske funkcije su opisane (pregledni članak: Labrijn et al.. Current Opinion in Immunologv 20: 479-485, 2008). Posebno, aglikozilacija IgGl može da se postigne uz pomoć mutiranja asparagina u alanin ili asparagina u glutamin na amino-kiselinskoj poziciji 297. koje dovodi do ukidanja antitelom-potaknute ćelijski-posredovane citotoksičnosti (ADCC) (Sazinskv et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51): 20169, 2008; Simmons et al., J. of Immunological Methods 263: 133-147, 2002). Zamena lizina sa alaninom na poziciji 322 dovodi do smanjivanja ADCC i odstranjivanja citotoksičnosti koja je potaknuta komplementom (CDC), dok simultana zamena oba leucina na pozicijama 234 i 235 sa alaninima omogućava izbegavanje ADCC i CDC [Hezareh et al., J. of Virologv, 75 (24): 12161-12168, 2001]. Sa ciljem da se IgG4 izotipovi primene kao bivalentni terapeuticiin vivokoji zadržavaju aviditet, može da se uvede modifikacija na način da se provede promena serin-u-prolin u 'središnjem regionu drške' (Schuurman, J. et al. Immunology 97: 693-698, 1999). Tendencija ljudskih IgG2 molekula da formiraju heterogene kovalentne dimere može da se zaobiđe zamenom jednog od cisteina na poziciji 127, 232 i 233 sa serinom (Allen et al., Biochemistry, 2009. 48 (17). str. 3755-3766). Alternativni format sa smanjenom efektorskom funkcijom može da bude IgG2m4 format, koji je izveden iz IgG2 koji sadrži četiri IgG4-specifićne promene amino-kiselinskih ostataka (An et al., mAbs l (6), 2009). Fragmenti antitela mogu da se proizvedu uz pomoć tehnika rekombinantne DNA ili uz pomoć encimskog ili hemijskog cepanja intaktnog antitela koje je opisano ispod. Ne-ograničavajući primeri za monoklonska antitela uključuju mišja, himerna. humanizovana. humana, i Humane Projektovane™ imunoglobuline, antitela, himerne fuzione belančevine koje sadrže sekvence koje su izvedene iz imunoglobulina, ili muteine ili njihove derivate; pri čemu svakoje opisano ispod. Predviđeni su i multimeri ili agregati intaktnih molekula i/ili fragmenata, uključujući hemijski derivatizovana antitela.
Termin "monoklonsko antitelo", kao šta se ovde koristi, se odnosi na antitelo koje je dobiveno iz populacije uglavnom homogenih antitela, tj„ pojedinačna antitela koja Čine populaciju su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu da budu prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, jer su usmerena na jedno antigeno mesto. Nadalje, za razliku od preparata konvencionalnih (poliklonskih) antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanata (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jednog determinanta na antigenu. Osim po svojoj specifičnosti, monoklonska antitela su napredna u tome šta ih sintetizuje homogena kultura, koja nije kontaminirana sa drugim imunoglobulinima sa različitim specifičnostima i karakteristikama.
Termin "monoklonska" pokazuje karakter antitela koje je dobiveno iz uglavnom homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači kao da se odnosi na antitelo koje je dobiveno uz pomoć nekog posebnog postupka. Na primer. monoklonska antitela za upotrebu mogu da se dobiju uz pomoć tehnologije hibridoma koja je prvi puta opisana od autora Kohleret al.Nature, 256: 495 [1975], ili može da se dobije primenom tehnologije rekombinantne DNA (vidi, na primer, U.S. Patent BR. 4,816,567). "Monoklonska antitela" mogu takođe da budu rekombinantna, himerna, humanizovana, humana, Human Projektovana™, ili fragmenti antitela, na primer.
"Imunoglobulin" ili "nativno antitelo" je tetramerna gliko-belančevina. Kod prirodnih imunoglobulina, svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) ijedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje "varijabilni" region od oko 100 do 110 ili više amino-kiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-temiinalni deo svakog lanca definiše konstantni region koji je primarno odgovoran za efektorsku funkciju.
Imunoglobulini mogu da se podele u različite klase u zavisnosti o amino-kiselinskoj sekvenci konstantnog domena njihovih teških lanaca. Teški lanci su klasifikovani kao mu (ji), delta (A), gama (y), alfa (a), i epsilon (e), a definišu izotip antitela kao lgM, IgD, IgG. IgA, i IgE. Nekoliko od pomenutih mogu dalje da se podele u pod-klase ili izotipe. na primer. IgGl. IgG2, IgG3, IgG4, IgAl i IgA2. Različiti izotipi imaju različite efektorske funkcije; na primer. IgGl i IgG3 izotipi često imaju ADCC aktivnost. Humani laki lanci su klasifikovani kao kapa (K) i lambda (A.) laki lanci. U lakim i teškim lancima, varijabilni i konstantni regioni su spojeni sa "J" regionom od oko 12 ili više amino-kiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje "D" region od oko 10 ili više amino-kiselina. Vidi Fundamental Immunologv, Pogl.
7 (Paul, W., ur., 2. izd. Raven Press, N.Y. (1989)).
"Funkcionalan fragment" ili "fragment antitela koji veže antigen" nekog ovde pomenutog antitela/imunoglobulina se definiše kao fragment antitela/imunoglobulina( na primer,varijabilni region IgG) koji zadržava region za vezanje antigena. "Region za vezanje antigena" nekog antitela se tipično nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona antitela, //'., CDR-1, -2, i/ili -3 regioni; međutim, varijabilni "okvirni" regioni mogu takođe da igraju važnu ulogu kod vezanja antigena, tako da obezbeđuju platformu za CDR-e. Preferirano, "region za vezanje antigena" obuhvata barem amino-kiselinske ostatke 4 do 103 iz varijabilnog lakog (VL) lanca i 5 do 109 iz varijabilnog teškog (VH) lanca, bolje amino-kiselinske ostatke 3 do 107 iz VL i 4 do 111 iz VH, a posebno su preferirani kompletni VL i VH lanci [amino-kiselinske pozicije 1 do 109 iz VL i 1 do 113 iz VH, pri čemu se numerisanje amino-kiselinskih pozicija primenjuje u skladu sa instrukcijama iz baze podataka Kabat (Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218)]. Preferirana klasa imunoglobulina za upotrebu u ovom pronalasku je IgG.
Termin "hipervarijabilni" region se odnosi na amino-kiselinske ostatke iz varijabilnih domena VH i VL nekog antitela ili funkcionalnog fragmenta koji je odgovoran za vezanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži amino-kiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili CDR [tj., ostatke 24-34 (LCDRl). 50-56 (LCDR2) i 88-97 (LCDR3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 29-36 (HCDRl), 48-66 (HCDR2) i 93-102 (HCDR3) u varijabilnom domenu teškog lanca kao Šta je opisano na SI. 12] i/ili one ostatke iz hipervarijabilne petlje [tj., ostatke 26-32 (unutar LCDRl), 50-52 (unutar LCDR2) i 91-96 (unutar LCDR3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (unutar HCDRl), 53-55 (unutar HCDR2) i 96-101 (u HCDR3) u varijabilnom domenu teškog lanca kao staje opisano od autora Chothiaet al..).Mol.Biol. 196: 901-937 (1987)].
Ne-ograničavajući primeri za fragmente nekog antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2. Fv. domene antitela (dAb). fragmente iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR), jedno-lančana antitela (scFv), fragmente jedno-lančanog antitela. diatela, triatela. tetratela, minitela. linearna antitela (Zapataet al..Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995)); rekombinantna antitela koja heliraju, tritela ili bitela, intratela. nanotela. male modularne imuno farmaceuti ke (SMIP), domen imunoglobulinske fuzione belančevine koja veže antigen, antitela iz kamile, antitelo koje sadrži VHH, ili njihove muteine ili derivate, i polipeptide koji sadrže najmanje jedan deo nekog imunoglobulina koji je dovoljan da se ostvari vezanje specifičnog antigena od sprane pomenutog polipeptida, poput CDR sekvence. sve dok pomenuto antitelo zadržava svoju biološku aktivnost; i multispecifična antitela koja nastaju iz fragmenata antitela (C. A. K Borrebaeck, urednik (1995) Antibodv Engineering (Breakthroughs in Molecular Biologv). Oxford Universitv Press; R. Kontermann & S. Duebel, urednici (2001) Antibodv Engineering (Springer Laboratorv Manual), Springer Verlag). Smatra se da antitelo koje nije "bispecifično" ili "bifunkcionalno" ima dva identična vezna mesta. F(ab')2ili Fab mogu da se projektuju tako da se minimizuju ili potpuno otklone intermolekularne disulfidne interakcije koje postoje između Cm i O domena. Digestija antitela sa papainom stvara dva identična fragmenta za vezanje antigena, "Fab" fragmenti, od kojih svaki ima jedno mesto za vezanje antigena, i rezidualni "Fc" fragment, čije ime pokazuje sposobnost da lako kristalizuje. Tretman sapepsinom daje F(ab')2 fragment koji sadrži dva "Fv" fragmenta. "Fv" fragment je minimalni fragment antitela koji sadrži potpuno mesto za prepoznavanje i vezanje antigena. Ovaj region se sastoji od dimera koji obuhvata varijabilni domen jednog teškog- i jednog lakog-lanca koji su povezani tesnim, ne-kovalentnim spojem. U ovoj konfiguraciji tri CDR-a iz svakog varijabilnog domena reaguju kako bi definisali mesto za vezanje antigena na površini VH-VL dimera. Zajedno, šest CDR-a omogućavaju da antitelo prepoznaje neki specifični antigen. Međutim, čak i pojedinačni varijabilni domen (ili pola nekog Fv koji sadrži samo tri CDR-a koja su specifična za neki antigen) ima sposobnost da prepoznaje i veže antigen.
"Jedno-lančani Fv" ili "sFv" ili "scFv" fragmenti antitela obuhvataju VH i VL domene, pri čemu su pomenuti domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu.
Preferirano, Fv polipeptid dodatno sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da Fv formira željenu strukturu za vezanje antigena. O detaljima sFv vidi
Pluckthun, The Pharmacologv of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg & Moore ur., Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994).
Fab fragment takođe sadrži konstantni domen iz lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) iz teškog lanca. Fab fragmenti se razlikuju od Fab' fragmenata time šta sadrže nekoliko novih ostataka na karboksi-terminusu CH1 domena iz teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz regiona drške. Fab'-SH se ovde koristi kao oznaka za Fab' gde cisteinski ostaci iz konstantnog domena sadrže slobodnu tiol-grupu. F(ab')2 fragmenti su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata koji između sebe imaju dršku od cisteina.
"Okvir" ili FR ostaci su oni ostaci iz varijabilnog domena koji ne spadaju u ostatke koji čine hipervarijabilni region.
Fraza "konstantni region" se odnosi na deo molekula antitela koji omogućava efektorske funkcije.
Termin "mutein" ili "varijanta" mogu da se koriste kao sinonimi, a odnose se na polipeptidnu sekvencu nekog antitela koja sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku supstituciju, deleciju. ili inserciju u varijabilnom regionu ili đelu koji je ekvivalentan sa varijabilnim regionom, pod uslovom da pomenuti mutein ili varijanta zadržava željeni vezani afinitet ili biološku aktivnost.
Muteini mogu da budu značajno homologni ili uglavnom identični sa parentnim antitelom.
Termin "derivat" se odnosi na antitela koja su kovalentno modifikovana uz pomoć tehnika ubikvitacije, konjugacije sa terapeutskim ili dijagnostičkim agensima, označavanja (na primer, sa radionuklidima ili raznim encimima), dodavanja kovalentnog polimera poput pegilovanja (deriviranja sa polietilen glikolom) i insertiranja ili zamene uz pomoć hemijske sinteze ne-prirodnih amino kiselina.
"Humano" antitelo ili funkcionalni fragment humanog antitela je ovde definisano kao takvo koje nije himerno ili "humanizovano" i ne potiče iz (celo ili delomično) ne-ljudskih vrsta. Humano antitelo ili funkcionalni fragment antitela može da se dobije od ljudi ili može da bude sintetičko humano antitelo. "Sintetičko humano antitelo" ovde je definisano kao antitelo
koje ima sekvencu koja je, potpuno ili delomično, izvedenain silicoiz sintetičkih sekvenca koje su dobivene na bazi analize sekvenca poznatih humanih antitela.In silicodizajn sekvence humanog antitela ili njegovog fragmenta može da se ostvari, na primer, uz pomoć analize baze podataka koja sadrži sekvence humanih antitela ili fragmenata i dizajniranja polipeptidne sekvence koja obuhvata podatke iz pomenute baze. Drugi primer za humano antitelo ili funkcionalni fragment je kodirajuća nukleinska kiselina koja je izolovana iz biblioteke sa sekvencama za antitelo ljudskog porekla ((/., pomenuta biblioteka se bazira na antitelima koja su uzeta iz prirodnog ljudskog izvora). Primeri za humana antitela uključuju antitela na bazi n-CoDeR kao šta je opisano od autora Cartsson & Soderlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001), Soderlinet al.Nat. Biotech. 18. 852-856 (2000) i u U.S.
Patentu BR. 6,989,250.
"Humanizovano antitelo" ili funkcionalni fragment humanizovanog antitela ovde je definisano kao takvo koje je (i) izvedeno iz ne-ljudskog izvora( na primer,transgenični miš koji ima heterologni imuno-sistem), pri čemu se pomenuto antitelo bazira na sekvenci iz humane germinativne linije; ili (ii) CDR-presađeno, pri čemu CDR-i potiču iz varijabilnog domena ne-ljudskog porekla, dok jedan ili više okvira varijabilnog domena su ljudskog porekla, a konstantni domen (ako postoji) je takođe ljudskog porekla.
Fraza "himerno antitelo", kao šta se ovde koristi, se odnosi na antitelo koje sadrži sekvencu koja je izvedena iz dva različita antitela (vidi, na primer. U.S. Patent BR. 4,816,567) koja tipično potiču iz različitih izvora. Najčešće, himerna antitela sadrže fragmente humanog i mišjeg antitela, a opšte uzeto konstantne humane i mišje varijabilne regione.
"Humana Projektovana'<M>" antitela su generisana uz pomoć menjanja parentne sekvence u skladu sa postupcima koje su razvili Stuđnickaet al.,U.S. Patentni BR. 5,766,886. a takva su antitela iz SEK. ID BR 58, 61, 64, 67 koja su opisana u patentnoj prijavi WO08/022295.
Antitelo iz ovoga pronalaska može da se izvede iz genske biblioteke sa rekombinantnim antitelima. Razvoj tehnologija za proizvodnju repertoara gena za rekombinantna humana antitela, i za izlaganje kodiranih fragmenata antitela na površini filamentoznog bakteriofaga. je obezbedio rekombinantne pristupe za direktnu proizvodnju i selekcioniranje humanih antitela. koji takođe mogu da se primene na humanizovana, himerna, i mišja antitela ili na rnuteine. Antitela koja su proizvedena uz pomoć fag-tehnologije se proizvode kao fragmenti za vezanje antigena - uobičajeno Fv ili Fab fragmenti - u bakterijama pa im nedostaju efektorske funkcije. Efektorske funkcije mogu da se uvedu uz pomoć jedne od dveju strategija: fragmenti mogu da budu projektovani kao kompletna antitela za ekspresiju u ćelijama sisara, ili kao bispecifični fragmenti antitela sa drugim mestom za vezanje koje je sposobno da potakne efektorsku funkciju. Tipično. Fd fragment (VH-CH1) i laki lanac (VL-CL) iz antitela se odvojeno kloniraju uz pomoć PCR-a, nakon čega se nasumično rekombiniraju u kombinatorijskim bibliotekama izlaganja faga, a tada se selekcioniraju na sposobnost vezanja tačno određenog antigena. Fab fragmenti se eksprimiraju na površini faga, tj.. fizički su spojeni sa genima koji ih kodiraju. Tako, selekcioniranje Fab uz pomoć vezanja antigena istovremeno selekcionira sekvencu koja kodira Fab. koja tada može da bude umnožena. Nakon nekoliko runda vezanja na antigen i ponovnog umnožavanja - procedura koja se zove pomeranje - izoluju se i umnožavaju Fab koji su specifični za neki antigen.
Brojne procedure su opisane za dobivanje humanih antitela izphage- displaybiblioteka. Takve biblioteke mogu da se pripreme u jednom glavnom okviru, u kojem se različitiin vivo-fbrmirani (tj. izvedeni iz ljudi) CDR-i ostavljaju da rekombiniraju kao šta je opisano u Carlsson & Soderlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001), Soderlinet cd.Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000) i U.S. Patentu BR. 6.989.250. Alternativno, takva biblioteka antitela može da se bazira na amino-kiselinskim sekvencama koje su dizajniranein silicoi kodirane sa nukleinskim kiselinama koje su kreirane sintetički.In silicodizajnirane sekvence antitela se postiže, na primer, uz pomoć analiziranja baze podataka sa ljudskim sekvencama i uz pomoć razvijanja polipeptidne sekvence koja sadrži pomenute podatke. Postupci za dizajniranje i dobivanjein.s-zV/co-kreiranih sekvenca su opisane, na primer, u Knappiket al,J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebset al,J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; i U.S. Patentu BR. 6,300,064. Za detaljan opisphage~ dixplaytehnika vidi dokument WO08/022295 (Novartis).
Alternativno, antitelo iz ovoga pronalaska može da potiče iz životinja. Takvo antitelo može da bude humanizovano ili Humano Projektovano kao šta je opisano u dokumentu WO08/022295 (Novartis); takvo antitelo može da potiče iz transgeničnih životinja [vidi takođe dokument WO08/022295 (Novartis)].
Kao šta se ovde koristi, različite 'forme' antigena, na primer PRLR, su ovde detinisane kao molekuli različitih belančevina koji su produkt različitih translacionih ili post-translacionih modifikacija, poput, ali bez ograničenja, razlika u splajsovanju primarnog transkripta prolaktinskog receptora, razlika u glikozilaciji. i razlika u post-translacionom proteolitičkom cepanju.
Kao šta se ovde koristi, termini 'epitop' uključuje bilo koju determinantu belančevine koja je sposobna da se specifično veže na neki imunoglobulin ili receptor iz T-ćelija. Epitopne determinante uobičajeno se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupiranja molekula poput amino-kiselina ili šećernih bočnih lanaca i obično poseduju specifične tro-dimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naboja. Smatra se da se dva antitela 'vežu na isti epitop' ako se u nekom kompetetivnom ogledu jedno antitelo takmiči sa drugim antitelom za vezanje, pri čemu se koriste bilo koji poznati postupci, a preferirano sve amino-kiseline iz epitopa se vežu na oba antitela.
Termin 'zrelo antitelo' ili 'zreli fragmenti koji vežu antigen' poput zrelih Fab varijanata uključuje derivate nekog antitela ili fragmente koji se jače vežu - tj. vežu se sa povećanim afinitetom - na neki određeni antigen poput izvan-ćelijskog domena PRLR. Sazrevanje je proces identifikovanja manjeg broja mutacija unutar šest CDR-a nekog antitela ili fragmenta koje dovodi do povećanja veznog afiniteta. Proces sazrevanja obuhvata kombinovanje postupaka molekularne biologije za uvođenje mutacija u pomenuto antitelo i proveravanje da li se vezanje poboljšalo.
Terapeutski postupci
Terapeutski postupci obuhvataju administriranie subjektu u potrebi terapeutski efektivnu količinu antitela o kojem je reč u ovom pronalasku. "Terapeutski efektivna" količina ovde je definisana kao količina antitela koja je dovoljna da blokira proliferaciju PRLR-pozitivnih ćelija u tretiranom delu tela subjekta i to u formi pojedinačne doze ili primenom multi-doznog režima, pri čemu se pomenuto daje samo za sebe ili kombinovano s drugim agensima, koje dovodi do ublažavanja štetnog stanja, pod uslovom da je primenjena količina toksikološki prihvatljiva. Subjekt može da bude čovek ili ne-ljudska životinja (na primer, zec, pacov, miš, majmun ili neki drugi niži primat).
Antitelo iz ovoga pronalaska može da se ko-administrira zajedno s poznatim lekovima, a u nekim slučajevima antitelo može da bude modiftkovano samo po sebi. Na primer, antitelo može da bude konjugirano sa nekim imunotoksinom ili radioizotopom s ciljem dodatnog pojačavanja efikasnosti. Inventivna antitela mogu da se koriste kao terapeutici ili kao pomagala za dijagnozu u brojnim situacijama kada je PRLR nepoželjno visoko eksprimiran. Poremećaji i uslovi koji su posebno prikladni za tretman sa antitelom iz ovoga pronalaska su endometrioza, adenomioza. ne-hormonska kontracepcija kod žena, benigna bolest dojke i mastalgija, inhibicija laktacije, benigna hiperplazija prostate, fibroidi. gubitak kose u uslovima hiper i normalnih nivoa prolaktina, i ko-tretman tokom kombinovane hormonske terapije sa ciljem inhibiranja proliferacije ćelija epitela mlečnih žlezda.
S ciljem da se tretiraju malopre pomenuti poremećaji, farmaceutske kompozicije za primenu u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se formulišu na konvencionalan način primenom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosilaca ili ekscipijenata (pomoćnih sredstava). Antitelo iz ovoga pronalaska može da se administrira primenom bilo kojeg prikladnog načina, koje može da varira u zavisnosti o tipu poremećaja koji se tretira. Moguće rute za administriranje uključuju parenteralnu( na primer,intramišićno, intravensko, intraarterijalno, intraperitonealno, ili supkutano), intrapulmonalno i intranazalno, a ako je poželjan lokalni imunosupresivni tretman, intralezionalno administriranje. Osim toga, antitelo iz ovoga pronalaska može da se administrira pulsnom infuzijom, sa,na primer,opadajućim dozama antitela. Preferirano, doziranje se obavlja injekcijama, a najpovoljnije su intravenske ili supkutane injekcije, delomično u zavisnosti o tome da li se radi o kratkom administriranju ili hroničnom. Količina koja će se administrirati zavisi o brojnim faktorima poput kliničkih simptoma, težine pojedinca i da li se istovremeno administriraju i neki drugi lekovi. Stručnjak prepoznaje da ruta za administriranje varira u zavisnosti o poremećaju ili stanju koje se tretira.
Određivanje terapeutski efektive količine nekog novog polipeptida, u skladu s ovim pronalaskom, značajno zavisi o specifičnim osobinama pacijenta, ruti za administriranje. i prirodi poremećaja koji se tretira. Opšte instrukcije mogu da se pronađu, na primer. u publikacijama International Conference on Harmonisation i u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, poglavlja 27 t 28, str. 484-528 (18. izd., Alfonso R. Gennaro, Ur., Easton, Pa.: Mack Pub. Co.. 1990). Specifičnije, određivanje terapeutski efektive količina zavisi o faktorima poput toksičnosti i efikasnosti samog leka. Toksičnost rnože da se odredi uz pomoć postupaka koji su poznati stanju tehnike, a mogu da se pronađu u malopre navedenim referencama. Efikasnost može da se odredi primenom pomenutih instrukcija zajedno sa postupcima koji su opisani u Primerima.
Farmaceutske kompozicije i administriranje
Ovaj pronalazak takođe se odnosi na farmaceutske kompozicije koje mogu da sadrže PRLR antitela. sama za sebe ili u kombinaciji s najmanje jednim drugačijim agensom, poput stabilizatora, pri čemu se pomenute mogu administrirati u bilo kojem sterilnom, biokompatibilnom farmaceutskom nosiocu, uključujući, ali bez ograničenja, slani rastvor, puferovani slani rastvor, dekstrozu, i vodu. Bilo koji od pomenutih molekula može da se pacijentu administrira sam za sebe. ili zajedno sa drugim agensima, lekovima ili hormonima, primenom farmaceutskih kompozicija u kojima su pomenuti pomešani sa ekscipijentom(ima) ili farmaceutski prihvatljivim nosiocima. U jednoj izvedbi ovoga pronalaska, farmaceutski prihvatljivi nosilac je farmaceutski inertan.
Ovaj pronalazak takođe se odnosi na administriranje farmaceutskih kompozicija. Takvo administriranje se postiže parenteralno. Postupci za parenteralnu dostavu uključuju topikalno, intra-arterijalno (direktno u tumor), intramišićno supkutano, intramedularno, intratekalno, intraventrikularno, intravensko. intraperitonealno. intrauterno ili intranazalno administriranje. Osim aktivnih sastojaka, pomenute farmaceutske kompozicije mogu da sadrže prikladne farmaceutski prihvatljive nosioce koji obuhvataju ekscipijente i pomoćna sredstva koja ubrzavaju procesiranje aktivnih jedinjenja u preparate koji mogu da se koriste farmaceutski. Dodatni detalji o tehnikama za formulisanje i administriranje mogu da se pronađu u najnovijem izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences (Ur. Maack Publishing Co, Easton. Pa.).
Farmaceutske formulacije za parenteralno administriranje uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja. Kod injekcija, farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se formulišu u vodenim rastvorima, preferirano u fiziološki kompatibilnim puferima poput Hank-ovog rastvora, Ringer-ovog rastvora, ili fiziološkog puferovanog slanog rastvora. Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže supstancije koje povećavaju viskoznost pomenute suspenzije, poput natrijum karboksimetil celuloze, sorbitola, ili dekstrana. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja mogu da se pripreme u formi prikladnih uljanih suspenzija za injekcije. Prikladni lipofilni rastvarači ili prenosnici uključuju masna ulja poput ulja od sušama, ili sintetičke estere masnih kisela, poput etil oleata ili triglicerida. ili liposoma. Opciono, suspenzija može takođe da sadrži prikladne stabilizere ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja kako bi se pripremili visoko koncentrovani rastvori.
Za topikalno ili nazalno administriranje, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju određenoj barijeri koja treba da se pređe. Takvi penetranti su opšte poznati stanju tehnike.
Parenteralno administriranje takođe obuhvata postupke za dostavu koji uključuju intra-arterijalno, intramišićno, supkutano. intramedularno, intratekalno, i intraventrikularno, intravensko. intraperitonealno, intrauterno. vaginalno. ili intranazalno administriranje.
Kompleti hemikalija
Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na farmaceutske pakete i komplete hemikalija koji sadrže jedan ili više kontejnera koji su ispunjeni s jednim ili više sastojaka malopre pomenutih kompozicija iz ovoga pronalaska. Zajedno sa takvim kontejnerom(ima) mogu da dolaze i objave o propisima vladine agencije za regulisanje proizvodnje, upotrebe ili prodaje farmaceutika ili bioloških produkata, koja navode dozvolu proizvodnje, upotrebe ili prodaje pomenutog produkta za ljudsku primenu.
U drugoj izvedbi, pomenuti kompleti hemikalija mogu da sadrže DNA sekvence koje kodiraju antitela iz ovoga pronalaska. Preferirano. DNA sekvence koje kodiraju ova antitela su obezbeđene u nekom plazmidu koji je prikladan za transfekciju i ekspresiju u nekoj ciljanoj ćeliji. Pomenuti plazmid može da sadrži promotor (Često inducibilan promotor) za regulisanje ekspresije DNA u ćeliji domaćinu. Plazmid može takođe da sadrži odgovarajuća restrikcijska mesta kako bi se ubrzala ugradnja drugih DNA sekvenci u plazmid s ciljem da se proizvedu razna antitela. Pomenuti plazmidi mogu takođe da sadrže brojne druge elemente za olakšavanje kloniranja i ekspresije kodiranih belančevina. Takvi elementi su dobro poznati stručnjacima i uključuju, na primer, prikladne markere, kodone za inicijaciju, kodone za terminaciju, i slično.
Proizvodnja i skladištenje
Farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se proizvedu na način koji je poznat stanju tehnike, na primer, uz pomoć procesa konvencionalnog mešanja, rastvaranja, granuliranja, pripremanja dražeja, ispiranja, pripreme emulzija, enkapsuliranja. zarobljavanja ili liofilizovanja.
Farmaceutska kompozicija može da se obezbedi u formi liofilizovanog praha u 1 mM - 50 mM histidinu, 0.1% - 2% saharozi. 2% - 7% manitolu u pH rasponu od 4.5 do 5.5 pri čemu se pomenuti prah rastvara u puferu neposredno pre upotrebe.
Nakon šta se farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedinjenje iz ovoga pronalaska, formulišu u nekom prihvatljivom nosiocu, pomenute mogu da se spreme u nekom odgovarajućem kontejneru i označe za tretman predviđenog zdravstvenog stanja. Za administriranje antitela protiv PRLR, pomenuta oznaka uključuje količinu, frekvenciju i postupak za administriranje.
Terapeutski efektivna doza
Farmaceutske kompozicije koje su prikladne za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom uključuju kompozicije u kojima se aktivni sastojci nalaze u količinama koje su dovoljne da se ostvari namenjena svrha, tj. tretman nekog određenog stanja koje je karakterizovano ekspresijom PRLR. Način određivanja efektivne doze je poznat stručnjacima.
Za bilo koje jedinjenje, terapeutski efektivna doza može da se inicijalno proceni uz pomoć ogleda sa ćelijskim kulturama, na primer, ćelije limfoma, ili u životinjskim modelima, uobičajeno miševi, pacovi. zečevi, psi, svinje ili majmuni. Životinjski model se takođe koristi sa ciljem da se postigne željeni koncentracioni raspon i ruta za administriranje. Takva informacija može da se koristi sa ciljem da se odrede korisne doze i rute za administriranje ljudima.
Terapeutski efektivna doza se odnosi na količinu belančevine ili njenog antitela. antagonista, ili inhibitora koji ublažavaju simptome ili stanja. Terapeutska efikasnost i toksičnost takvih jedinjenja može da se odredi uz pomoć standardnih farmaceutskih procedura u ćelijskim kulturama ili na eksperimentalnim životinjama, na primer. ED>o (doza koja je terapeutski efektivna u 50% populacije) i LD50(doza koja je letalna za 50% populacije). Dozni omer između terapeutskih i toksičnih efekata se naziva terapeutski indeks, i može da se izrazi kao omer ED50/LD50. Farmaceutske kompozicije koje imaju velike terapeutske indekse su preferirane. Podaci koji su dobiveni iz ogleda u ćelijskoj kulturi i na studijama na životinjama se koriste za formulisanje raspona doze koji je prikladan za ljude. Doziranje pomenutih jedinjenja preferirano ima raspon koji odgovara cirkulatornim koncentracijama koje podrazumeva ED50uz malu ili nikakvu toksičnost. Doze variraju u pomenutom rasponu u zavisnosti o korišćenoj doznoj formi, osetljivosti pacijenta, i ruti za administriranje.
Tačnu dozu određuje lekar uzimajući u obzir stanje pacijenta koji treba da primi takav tretman. Doziranje i administriranje se podešavaju kako bi se obezbedili dovoljni nivoi aktivnog ostatka ili održavao željeni efekt. Dodatni faktori koji mogu da se uzmu u obzir obuhvataju ozbiljnost bolesnog stanja, na primer. veličinu i lokaciju endometrijskih lezija; dob. težina i pol pacijenta; dijeta, raspored i frekvencija administriranja, lekovi koji se istovremeno upotrebljavaju, osetljivost na reakciju, i tolerancija/odgovor na terapiju. Dugo-clelujuće farmaceutske kompozicije mogu da se administriraju svaka 3 do 4 dana, svake sedmice, ili jednom svake dve sedmice, ili jednom mesečno u zavisnosti o polu-životu i stopi izlučivanja iz tela pojedine formulacije.
Normalne dozne količine mogu da variraju od 0.1 do 100,000 ug, pa do ukupne doze od oko 2 g. u zavisnosti o ruti za administriranje. Informacije0pojedinačnim doziranjima i postupcima za dostavu se nalaze u literaturi. Vidi dokumente US. 4.657,760; US 5,206.344; ili US 5,225,212. Stručnjaci će koristiti različite formulacije za polinukleotide nego za belančevine ili njihove inhibitore. Slično, dostava polinukleotida ili polipeptida će zavisiti o pojedinačnim ćelijama, stanjima, lokacijama, itd. Preferirane specifične aktivnosti za radio-označeno antitelo mogu da se kreću u rasponu od 0.1 do 10 mCi/mg belančevine (Rivaet al,Clin. Cancer Res. 5: 3275s-3280s. 1999; Wonget al.Clin. Cancer Res. 6: 3855-3863. 2000; Wagneret al.,J. Nuclear Med. 43: 267-272, 2002).
Ovaj pronalazak je dodatno opisan uz pomoć sledećih primera. Primeri koji su ovde obezbeđeni samo ilustruju pronalazak tako da se referiraju na specifične izvedbe. Pomenuti primeri, dok ilustruju neke specifične aspekte ovoga pronalaska, nemaju za cilj da ograniče ili zaobiđu okvir ovoga pronalaska.
Svi primeri su provedeni primenom standardnih tehnika, koje su dobro poznate i spadaju u uobičajenu rutinu stručnjaka, osim kada su opisani detaljno. Rutinske tehnike molekularne biologije sledećih primera mogu da se provedu kao šta je opisano u standardnim laboratorijskim priručnicima, poput Sambrooket al,Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2. izd.; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
OPIS SLIKA
Slika 1: Ekspresija mRNA prolaktina (PRL-mRNA) (analizirana TaqMan PCR-om u realnom vremenu) u ljudskom endometrijumu i u lezijama (ektopično tkivo) zdravih žena i žena koje pate od enđometrioze.
Slika 2: Ekspresija mRNA prolaktinskog receptora (PRLR-mRNA) (analizirana TaqMan PCR-om u realnom vremenu) u ljudskom endometrijumu i u lezijama (ektopično tkivo) zdravih žena i žena koje pate od enđometrioze.
Slika 3: Northern-blot analiza ekspresije PRLR gena u tkivima pacova. Genska ekspresija PRLR ukazuje na visoku ekspresiju u placenti i prostati.
Slika 4: Westem-blot analiza PRLR ekspresija u prostatama pacova koji su bili tretirani sa različitim hormonima. Tretman sa estradiolom zdravih i kastriranih pacova dovodi do pozitivnog regulisanja (porast) PRLR belančevine u prostatama pacova dok tretman sa dihidrotestosteronom zdravih pacova ne utiče na PRLR ekspresiju u prostati ako se uporedi sa tretmanom zdravih životinja samo sa prcnosnikom. Slika 5: Inhibicija prolaktinski-aktivisane proliferacije Ba/F (=Baf) ćelija (koje stabilno eksprimiraju ljudski PRLR) uz pomoć neutralizovanja PRLR sa antitelima i nespecifičnim kontrolnim antitelima. IC50vrednosti su određene za sledeća antitela u IgGl formatu: 005-C04 (zatvoreni krugovi): 1.29 ug/ml = 8.6 nM; 006-H08 (otvoreni krugovi): 0.15 ug/ml =1 nM; HE06.642 (zatvoreni trougaonici): 0.34 u.g/ml = 2.2 nM;
002-H06 (otvoreni trougaonici): 0.54 ug/ml = 3.6 nM; 002-H08 (zatvoreni kvadrati): 0.72 ug/ml = 4.8 nM; nespecifično kontrolno antitelo (otvoreni kvadrati): nema inhibicije ćelijske proliferacije.
Slika 6: Inhibicija prolaktinski-indukovane proliferacije ćelija limfoma pacova (NB2 ćelije) uz pomoć antitela koja neutralizuju PRLR i nespecifičnih kontrolnih antitela. Sledeće ICsovrednosti su određene: XHA06.642 (zatvoreni krugovi): 10 p.g/ml = 67 nM; XHA06.983 (otvoreni krugovi): nema efekta na proliferaciju ćelija limfoma pacova; nespecifično kontrolno antitelo (zatvoreni trougaonik): nema efekta kod 10 ug/ml.
Slika 7: Inhibicija prolaktinski-stimulisane STAT5 fosforilacije u T47D ćelijama uz pomoć neutralizovanja PRLR sa antitelima i nespecifičnim kontrolnim antitelom. Nespecifično kontrolno antitelo (FITC) ne inhibira STAT5 fosforilaciju u T47D ćelijama. Obrnuto, antitela XHA06.642. 005-C04 (= IgGl 005-C04), i 006-H08 (= IgGl 006-H08) inhibiraju fosforilaciju STAT5 u T47D ćelijama na dozno-zavisan način.
Slika 8: Efekti antitela koja neutralizuju PRLR i nespecifičnih kontrola na prolaktinski-aktivisane aktivnosti reporter gena za luciferazu primenom HEK293 ćelija koje su stabilno transfektovane sa humanim prolaktinskim receptorom (hPRLR) i prolazno eksprimiraju gen za luciferazu pod kontrolom elemenata koji odgovaraju na laktogeni hormon (LHRE). IC50vrednosti su određene za sledeća antitela u IgGl formatu: 006-H08 (zatvoreni krugovi): 0.83 ug/ml = 5.5 nM; HE06.642 (otvoreni krugovi): 0.63 ug/ml = 4.2 nM; nespecifično kontrolno antitelo (zatvoreni trougao): nema inhibicije delovanja luciferaze.
Slika 9: Efekti neutralisanja PRLR sa antitelima i nespecifičnim kontrolama na prolaktinski-aktivisanu aktivnost reporter gena za luciferazu primenom HEK293 ćelija koje su stabilno transfektovane sa mišjim prolaktinskim receptorom (mPRLR) i prolazno ekspimiraju gen za luciferazu pod kontrolom elemenata koji odgovaraju na laktogeni hormon (LHRE). IC50vrednosti su određene za sledeća antitela u IgGl formatu: 005-C04 (zatvoreni trougaonici): 0.45 pg/ml = 3 nM; XHA06.642 (zatvoreni krugovi): »50 ug/ml » 333 nM, nespecifično kontrolno antitelo (otvoreni krugovi): nema inhibicije delovanja luciferaze.
Slika 10: Inhibicija prolaktinski-aktivisane proliferacije Ba/F (= Bal) ćelija (koje stabilno eksprimiraju mišji prolaktinski receptor) uz pomoć antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i nespecifičnih kontrolnih antitela. IC50vrednosti su određene za sledeća antitela u IgGl formatu: nespecifično FITC antitelo (zatvoreni kvadrati): nema inhibicije ćelijske proliferacije; HE06.642 (zatvoreni krugovi): »> 30 ug/ml »> 200 nM; 001-E06 (otvoreni krugovi): 43.7 ug/ml = 291 nM; 001-D07 (zatvoreni trougaonici): 16.5 ug/ml - 110 nM; 005-C04 (otvoreni trougaonici): 0.74 p.g/ml = 4.9 nM.
Slika 11: Stope skotnosti i srednja veličina legla ženki miševa koje su bile tretirane sa slanim rastvorom puferovanim sa fosfatom (= prenosnik), nespecifičnim kontrolnim antitelom (FITC IgGl) ili neutralizujućim antitelom IgGl 005-C04 (=005-C04). Stope skotnosti su bile 87.5% (ženke koje su bile tretirane sa prenosnikom), 75%
(ženke koje su bile tretirane sa 10 mg/kg nespecifičnog antitela). 100% (ženke koje su bile tretirane sa 10 mg/kg IgGl 005-C04), i 0% (ženke koje su bile tretirane sa 30 mg/kg IgGl 005-C04). Srednja veličina legla je bila 10.9 životinja (ženke koje su bile tretirane sa prenosnikom), 12.3 životinja (ženke koje su bile tretirane sa 10 mg/kg nespecifičnog antitela), 13 životinja (ženke koje su bile tretirane sa 10 mg/kg IgGl 005-C04) i 0 životinja (ženke koje su bile tretirane sa 30 mg/kg IgGl 005-C04).
Slika 12: Kabat-numerisanje okvirnih pozicija amino-kiselina u skladu sa Johnson & Wu (Nucleic Acids Res. 2000. 28, 214-218).
Slika 13: Rezultati FACS analize sa izabranim antitelima protiv PRLR (005-C04. 001-E06. HE06642). Vezanje antitela je određeno kod Fiksne koncentracije u HEK293 ćelijama koje eksprimiraju ljudski i mišji PRLR upoređeno sa linijom parentalnih ćelija koje ne eksprimiraju PRLR.
Slika 14A: Prirast legla za svaki postpartalni dan izražen kao procenat prirasta u odnosu na postpartalni dan 1. Prikazan je prirast legla za netretirane majke (zatvoreni krugovi), za majke koje su bile tretirane sa 10 mg/kg nespecifičnog mišjeg IgG2a antitela (otvoreni krugovi), i za majke koje su bile tretirane sa neutralizujućim antitelom 005-C04 koje sadrži mišje IgG2a konstantne domene (= IgG2a 005-C04) kod doza od 10 mg/kg (zatvoreni trougaonici) i 30 mg/kg (otvoreni trougaonici). Strelice pokazuju dane tokom kojih je provedeno injektiranje antitela. Postoji značajno opadanje prirasta legla kod majki koje su bile tretirane sa 30 mg/kg lgG2a 005-C04 nakon 8. postpartalnog dana.
Slika 14B: Inkrementalan (postepen) prirast legla dan za danom izražen kao procenat prirasta u odnosu na postpartalni dan 1. Prikazani su rezultati iz legla sa netretiranim majkama (zatvoreni krugovi), majkama koje su bile tretirane sa 10 mg/kg nespecifičnog mišjeg lgG2a antitela (otvoreni krugovi), majkama koje su bile tretirane sa neutralizujućim antitelom 005-C04 koje sadrži mišje IgG2a konstantne domene (= IgG2a 005-C04) sa dozom od 10 mg/kg (zatvoreni trougaonici) i 30 mg/kg (otvoreni trougaonici). U osnovi, Slika 14A prikazuje nagib grafikona koji je prikazan na Slici 14A. Dnevni prirast legla netretiranih majki i majki koje su bile tretirane sa 10 mg/kg nespecifičnog antitela oscilira oko 30% od prirasta postpartalnog dana 1. Obrnuto, tretman majki sa 30 mg/kg lgG2a 005-C04 uzrokuje značajno smanjivanje prirasta nakon 7. dana (<*>p<0.05;<***>p<0.005 naspram prirasta legla majki koje su bile tretirane sa nespecifičnim antitelom) dok tretman sa 10 mg/kg IgG2a 005-C04 uzrokuje značajno smanjivanje dnevnog prirasta nakon 11. dana (p<0.05 naspram prirasta legla majki koje su bile tretirane sa nespecifičnim antitelom). Strelice pokazuju dane nakon primene antitela.
Slika 14C: Histološke sekcije mlečnih žlezda majki koje doje. MleČne žlezde netretiranih majki ili majki koje su tretirane sa nespecifičnim antitelom su ispunjene sa kanalima koji proizvode mleko. Obrnuto, involucija mlečnih žlezda, koja se manifestira pojavom masnih ostrva (crne strelice), je indukovana uz pomoć neutralizujućeg antitela IgG2a 005-C04 na dozno-zavisan način.
Slika 14D: Ekspresija mlečnih belančevina u mlečnim žlezdama majki koje doje. Ekspresija mlečnih belančevina beta kazein (Csn-2), kisele belančevine sirutke (WAP), i IGF-1 je smanjeno na dozno-zavisan način kod majki koje su bile tretirane sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgG2a 005-C04), ali ne i sa nespecifičnim antitelom. Ekspresija gena je bila normalizovana do nivoa ekspresije belančevine koja veže TATA-kutiju (TBP).
SlikalSA: Nastanak bočnih grana i struktura koje sliče alveolama u mišjem hiperprolaktinemskom modelu za benignu bolest dojke. Antitelo koje neutralizuje PRLR (IgGl 005-C04) (= 005-C04) inhibira bočno grananje i formiranje struktura sličnih alveolama kod doza od 10 i 30 mg/kg u miševima kojima je bio presađen deo hipofize.
Slika 15B: Obim hiperplazije epitela i proliferacije ćelija epitela u hiperprolaktinemskom mišjem modelu za benignu bolest dojke. Neke BrdlJ-pozitivne ćelije su označene sa belim strelicama. Antitela koja neutralizuju PRLR (IgGl 005-C04) (= 005-C04) blokiraju hiperplaziju epitela i proliferaciju epitelnih ćelija u mlečnim žlezdama.
Slika 15C: Obim STAT5 fosforilacije kod hiperprolaktinemskog mišjeg modela za benignu bolest dojke. Neke fosfo-STAT5-pozitivne ćelije su označene sa belim strelicama. Antitela koja neutralizuju PRLR (IgGl 005-C04) (= 005-C04) potpuno blokiraju STAT5 fosforilaciju kada se primenjuju kod doze od 30 mg/kg.
Slika 16: Inhibicija rasta prostate uz pomoć antitela koja neutralizuju PRLR (005-C04) koja sadrže mišje IgG2a konstantne domene (= IgG2a 005-C04). Presađeni delovi hipofize stimulišu rast prostate upoređeno sa netretiranim lažno-operisanim miševima. Tretman sa antitelima koja neutralizuju PRLR sa dozom antitela od 10 mg/kg i dozom od 30 mg/kg inhibira rast prostate (<***>p<0.005 naspram netretiranih, lažno-operiranih miševa).
Slika 17: Antitela koja neutralizuju PRLR stimulišu rast krzna kada životinja sa hiperprolaktinemijom. Fotografije su napravljene tri sedmica nakon presađivanja delova hipofize (i brijanja) mužjacima miševa koji su bili korišćeni u eksperimentima koji su opisani u Primeru 17 i na Slici 16. Hiperprolaktinemija inhibira rast krzna na obrijanim delovima. Antitela koja neutralizuju PRLR, ali ne i nespecifična antitela. stimulišu rast krzna u hiperprolaktinemskim uslovima kod doza od 10 i 30 mg/kg antitela 005-C04 (= IgG2a 005-C04).
Slika 18: Antitela koja neutralizuju PRLR, ali ne i nespecifična antitela. stimulišu rast krzna na obrijanim delovima hiper- i normoprolaktinemskih mužjaka i ženki miševa (Primer 18). Antitela koja neutralizuju PRLR su, prema tome, prikladna za tretman gubitka krzna u normo- i hiperprolaktinemskim uslovima kod muškarca (Slika 18 B) i žene (Slika 18A).
Slika 19: Antitela koja neutralizuju PRLR. ali ne i nespecifična kontrolna antitela. inhibiraju pojačanu proliferaciju ćelija epitela u mlečnim žlezdama nakon kombinovane hormonske terapije, tj. kombinovane terapije sa estrogenom i
progestinom.
Procenjen je apsolutni broj proliferirajućih ćelija duktalnog epitela u 4 unakrsna-preseka mlečne žlezde, a medijane su prikazane kao horizontalni histogrami na slici. Proliferacija ćelija epitela kod miševa kojima su izvađeni jajnici i koji su bili tretirani samo sa prenosnikom je prilično niska (medijana = 0). Tretman sa estradiolom dovodi do ograničene stimulacije proliferacije ćelija epitela (medijana = 9), dok je maksimalna proliferacija ćelija epitela mlečnih žlezda primećena tokom tretmana sa estrogenom i progesteronom zajedno (medijana = 144). Tretman sa antitelom koje neutralizuje prolaktinski receptor (005-C04)
(medijana = 84 nakon tretmana sa 10 mg/kg 005-C04; medijana = 27 nakon tretmana sa 30 mg/kg 005-C04), ali ne i tretman sa nespecifičnim kontrolnim antitelom (medijana = 154), uzrokuje dozno-zavisno opadanje proliferacije ćelija epitela mlečne žlezde gotovo do nivoa kada je korišćen samo estradiol.
Antitela koja neutralizuju PRLR su, prema tome, prikladna za tretman pojačane proliferacije ćelija epitela mlečne žlezde u uslovima kombinovane hormonske terapije, tj. tretmana estradiol plus progesteron.
Slika 20: Antitela koja neutralizuju PRLR, ali ne i nespecifična kontrolna antitela. inhibirajuendometriosis internakod miševa. Rezultati su prikazani u formi bodova bolesti kao šta je opisano u Primeru 20. Medijana bodova bolesti za svaku eksperimentalnu grupu je prikazana kao horizontalni histogram. Normoprolaktinemični miševi su razviliendometriosis internado nekog stepena (medijana bodova bolesti = 0.25). Hiperprolaktinemija zbog presađenih delova hipofize povećava bodove bolesti, pri čemu više životinja pati od pomenute bolesti (medijana bodova bolesti - 2.5). Dok tretman sa 30 mg/kg nespecifičnog antitela jednom (medijana bodova = 2.5) ili dva pita (medijana bodova = 2) sedmično nema uticaja na bolest, tretman sa specifičnim neutralizujućim antitelom uzrokuje dozno-zavisni porast broja bolesnih životinja; medijana bodova bolesti u svim slučajevima u kojima je korišćeno specifično antitelo je bila nula. Primetljivo, sve životinje koje su primile 10 ili 30 mg/kg specifičnog antitela, dva puta sedmično, su potpuno izlečene, a bodovi njihovih bolesti su bili značajno manji od bodova bolesti kod normoprolaktinemskih miševa. Antitela koja neutralizuju PRLR su, prema tome, prikladna za tretmanendometriosis interna(- adenomioza materice) iendometriosis externakod žena.
Slika 21: Ogledi za vezanje zrelih 006-H08 Fab varijanata upotrebom homogenetime-tesolvedfluorescentne (HTRF) analize: SupernatantiE. colikoji sadrže Fab su testirani na vezanje imobilizovanog izvan-ćelijskog domena humanog PRLR preko kompeticije za IgGl molekule 006-H08. Slika ilustruje vezanje Fab varijanata u formi histogram-dijagrama. Intenziteti signala (na 665 nM) za pet različitih vremena inkubacije su predstavljeni na y-osovinama, a imena Fab varijanata na x-osovinama. Niži signali u poređenju s kontrolnim Fab 006-H08 za danu vremensku tačku pokazuju poboljšano vezanje za PRLR. Svi Fab-ovi koji su izlistani u Delu 1 predstavljaju poboljšano vezanje, dok su u Delu 2 prikazani binderi s poboljšanim vezanjem, kao i neki bez poboljšanja.
SEK. ID BR:1 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDRl, 006-H08
SEK. ID BR:2 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDRl, 002-1106
SEK. ID BR:3 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDRl, 002-H08
SEK. ID BR:4 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDRl, 006-H07
SEK. ID BR:5 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDRl, 001-E06
SEK. ID BR:6 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDRl, 005-C04
SEK. ID BR:7 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR2, 006-H08
SEK. ID BR:8 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR2, 002-H06
SEK. ID BR:9 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR2, 002-H08
SEK. ID BR: 10 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR2, 006-H07
SEK. ID BR:11 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR2, 001-E06
SEK. ID BR: 12 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR2, 005-C04
SEK. ID BR:13 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR3, 006-H08, 002-H06 SEK. ID BR:14 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR3, 002-H08
SEK. ID BR:15 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR3, 006-H07
SEK. ID BR:16 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR3. 001-E06
SEK. ID BR: 17 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu HCDR3, 005-C04
SEK. ID BR: 18 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDRl, 006-H08
SEK. ID BR:19 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDRl, 002-H06
SEK. ID BR:20 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDRl, 002-H08
SEK. ID BR:21 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDRl, 006-H07
SEK. ID BR:22 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDRl, 001-E06
SEK. ID BR:23 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDRl, 005-C04
SEK. ID BR:24 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR2, 006-H08, 002-H08 SEK. ID BR:25 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR2, 002-H06
SEK. ID BR:26 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR2, 006-H07
SEK. ID BR:27 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR2, 001-E06
SEK. ID BR:28 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR2, 005-C04
SEK. ID BR:29 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR3, 006-H08
SEK. ID BR:30 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR3. 002-H06, 00I-E06 SEK. ID BR:31 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR3. 002-H08
SEK. ID BR:32 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR3, 006-H07
SEK. ID BR:33 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu LCDR3. 005-C04
SEK. ID BR:34 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH. 006-H08
SEK. ID BR:35 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH. 002-H06
SEK. ID BR:36 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, 002-H08
SEK. ID BR:37 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, 006-H07
SEK. ID BR:38 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, 001-E06
SEK. ID BR:39 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, 005-C04
SEK. ID N0.-40 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, 006-H08
SEK. ID BR:41 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, 002-H06
SEK. ID BR:42 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, 002-H08
SEK. ID BR:43 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, 006-H07
SEK. ID BR:44 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, 001-E06
SEK. ID BR.-45 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, 005-C04
SEK. ID BR:46 predstavlja nukleinsku sekvencu VH, 006-H08
SEK. ID BR:47 predstavlja nukleinsku sekvencu VI I, 002-H06
SEK. ID BR:48 predstavlja nukleinsku sekvencu VH, 002-H08
SEK. ID BR:49 predstavlja nukleinsku sekvencu VH, 006-1107
SEK. ID BR:50 predstavlja nukleinsku sekvencu VH, 001-E06
SEK. ID BR:51 predstavlja nukleinsku sekvencu VH, 005-C04
SEK. ID BR:52 predstavlja nukleinsku sekvencu VL. 006-H08
SEK. ID BR:53 predstavlja nukleinsku sekvencu VL, 002-H06
SEK. ID BR:54 predstavlja nukleinsku sekvencu VL. 002-H08
SEK. ID BR:55 predstavlja nukleinsku sekvencu VL, 006-H07
SEK. ID BR:56 predstavlja nukleinsku sekvencu VL. 001-E06
SEK. ID BR:57 predstavlja nukleinsku sekvencu VL, 005-C04
SEK. ID BR:58 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, HE06642, Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:59 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, XHA06642. Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:60 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, XHA06983. Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:61 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL. HE06642
SEK. ID BR:62 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, XHA06642 Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:63 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL. XHA06983 Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:64 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH. HE06642
SEK. ID BR:65 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH. XHA06642 Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:66 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VH, XHA06983 Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:67 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL. HE06642
SEK. ID BR:68 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, XHA06642, Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:69 predstavlja amino-kiselinsku sekvencu VL, XHA06983, Novartis
(WO2008/22295)
SEK. ID BR:70 predstavlja humani ECD PRLR, amino-kiseline na poziciji 1-210, SI domen 1-100 (SI domen. konstrukt 1 -102), S2 domen 101-210
SEK. ID BR: 71 predstavlja CDS humani ECD PRLR, nukleotidi na poziciji 1-630 SEK. ID BR: 72 predstavlja mišji ECD_PRLR, amino-kiseline na poziciji 1-210 SEK. ID BR: 73 predstavlja CDS mišjeg ECD PRLR, nukleotidi na poziciji 1-630
SEK. ID BR: 74 predstavlja HCDR2. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 75 predstavlja HCDR2, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 76 predstavlja HCDR2, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 77 predstavlja HCDR2. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 78 predstavlja LCDRl. zrele 006-1108 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 79 predstavlja LCDRl. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 80 predstavlja LCDRl, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 81 predstavlja LCDRl. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 82 predstavlja LCDRl, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 83 predstavlja LCDRl. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 84 predstavlja LCDRl, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 85 predstavlja LCDRl, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 86 predstavlja LCDRl, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 87 predstavlja LCDRl. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 88 predstavlja LCDRl, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 89 predstavlja LCDRl. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 90 predstavlja LCDR3. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 91 predstavlja LCDR3, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 92 predstavlja LCDR3. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 93 predstavlja LCDR3. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 94 predstavlja LCDR3, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 95 predstavlja LCDR3, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 96 predstavlja LCDR3, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 97 predstavlja LCDR3, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 98 predstavlja LCDR3, zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 99 predstavlja LCDR3. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 100 predstavlja LCDR3. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 101 predstavlja LCDR3. zrele 006-H08 varijante, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 143 predstavlja VH, 006-H08-12-2, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 144 predstavlja VH, 006-H08-13-2, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 145 predstavlja VH. 006-H08-13-6-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 146 predstavlja VH, 006-H08-13-6-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 147 predstavlja VH, 006-H08-15-5. amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 148 predstavlja VH, 006-H08-19-1. amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 149 predstavlja VH, 006-H08-29-1, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 150 predstavlja VH, 006-H08-32-2, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 151 predstavlja VH, 006-H08-33-0. amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 152 predstavlja VH, 006-H08-33-16-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 153 predstavlja VH, 006-H08-35-17-1. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 154 predstavlja VH, 006-H08-35-17-4, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 155 predstavlja VH, 006-H08-35-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 156 predstavlja VH. 006-H08-36-17-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 157 predstavlja VH, 006-H08-37-19-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 158 predstavlja VH, 006-H08-39-7. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 159 predstavlja VH, 006-H08-48-5. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 160 predstavlja VH, 006-H08-53-27-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 161 predstavlja VH. 006-H08-59-30-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 162 predstavlja VH. 006-H08-63-32-4, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 163 predstavlja VH. 006-H08-65-33-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 164 predstavlja VH. 006-H08-68-35-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 165 predstavlja VL, 006-H08-12-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 166 predstavlja VL, 006-H08-13-2. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 167 predstavlja VL, 006-H08-13-6-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 168 predstavlja VL, 006-H08-14-6-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 169 predstavlja VL, 006-H08-15-5, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 170 predstavlja VL, 006-H08-19-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 171 predstavlja VL. 006-H08-29-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 172 predstavlja VL. 006-H08-32-2. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 173 predstavlja VL, 006-H08-33-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 174 predstavlja VL, 006-H08-33-16-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 175 predstavlja VL. 006-H08-35-17-1. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 176 predstavlja VL, 006-H08-35-17-4, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 177 predstavlja VL. 006-H08-35-1. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 1 78 predstavlja VL, 006-H08-36-17-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 179 predstavlja VL. 006-H08-37-19-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 180 predstavlja VL, 006-H08-39-7, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 181 predstavlja VL, 006-H08-48-5. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 182 predstavlja VL, 006-H08-53-27-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 183 predstavlja VL. 006-H08-59-30-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 184 predstavlja VL, 006-H08-63-32-4, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 185 predstavlja VL, 006-H08-65-33-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 186 predstavlja VL, 006-H08-68-35-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 331 predstavlja VH, 006-H08-12-2, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 332 predstavlja VH. 006-H08-13-2, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 333 predstavlja VH, 006-H08-13-6-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 334 predstavlja VH, 006-H08-14-6-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 335 predstavlja VH, 006-H08-15-5. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 336 predstavlja VH, 006-H08-19-1. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 337 predstavlja VH, 006-H08-29-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 338 predstavlja VH, 006-H08-32-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 339 predstavlja VH, 006-H08-33-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 340 predstavlja VH, 006-H08-33-16-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 341 predstavlja VH, 006-H08-35-17-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 342 predstavlja VH, 006-H08-35-17-4. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 343 predstavlja VH, 006-H08-35-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 344 predstavlja VH. 006-H08-36-17-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 345 predstavlja VH, 006-H08-37-19-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 346 predstavlja VH, 006-H08-39-7, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 347 predstavlja VH, 006-H08-48-5. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 348 predstavlja VH, 006-H08-53-27-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 349 predstavlja VH, 006-H08-59-30-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 350 predstavlja VH, 006-H08-63-32-4, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 351 predstavlja VH, 006-1108-65-33-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 352 predstavlja VH, 006-H08-68-35-2. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 353 predstavlja VL. 006-H08-12-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 354 predstavlja VL, 006-H08-13-2. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 355 predstavlja VL, 006-H08-13-6-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 356 predstavlja VL, 006-H08-14-6-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 357 predstavlja VL, 006-H08-15-5. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 358 predstavlja VL, 006-H08-19-1, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 359 predstavlja VL, 006-H08-29-1. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 360 predstavlja VL. 006-H08-32-2, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 361 predstavlja VL, 006-H08-33-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 362 predstavlja VL, 006-H08-33-16-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 363 predstavlja VL, 006-H08-35-17-1. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 364 predstavlja VL, 006-H08-35-17-4, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 365 predstavlja VL, 006-H08-35-1. amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 366 predstavlja VL. 006-H08-36-17-0. amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 367 predstavlja VL, 006-H08-37-19-0. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 368 predstavlja VL, 006-H08-39-7, amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 369 predstavlja VL, 006-H08-48-5. amino-kiselinska sekvenca
SEK. ID BR: 370 predstavlja VL. 006-H08-53-27-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 371 predstavlja VL, 006-H08-59-30-0, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 372 predstavlja VL, 006-H08-63-32-4, amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 373 predstavlja VL, 006-H08-65-33-2. amino-kiselinska sekvenca SEK. ID BR: 374 predstavlja VL, 006-H08-68-35-2. amino-kiselinska sekvenca
PRIMERI
Primer 1
Izolovanje cilino- specifičnih antitelaiz phase - displavbibliotekazahumana antitela
Sa ciljem da se izoluje panel antitela koja su sposobna da neutralizuju delovanje ljudskog PRLR, triphage- displaybiblioteke za humano antitelo, koje eksprimiraju Fab i scFv fragmente, su paralelno istraživane. Meta koja je korišćena za pomeranje biblioteke je rastvorljivi izvan-ćelijski domen (ECD) prolaktinskog receptora predstavljen sa amino-kiselinama 25-234, pripremljen kao Šta je opisano iznad u dokumentu WO08/022295 (Novartis). Alternativne mete su bile ECD iz PRLR koji je C-terminalno spojen na šest histidina ili na humani IgGl-Fc domen preko linkera sa amino-kiselinskom sekvencom "izoleucin-glutamat-glicin-arginin-metionin-aspartat".
Selekcija ciljno-specifičnih antitela izphage- displaybiblioteke je provedena u skladu sa postupcima koji su opisani od Markset al.(Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004). Ukratko,phage- displaybiblioteka je inkubirana s 50 pmol biotinilovanog ECD na sobnoj temperaturi tokom 1 h, a nastao kompleks je tada zarobljen uz pomoć 100 ul suspenzije sa kuglicama streptavidina (Dvnabeads<*>M-280 Streptavidin. Invitrogen). Ne-specifični fagi su odstranjeni ispiranjem kuglica uz pomoć pufera za ispiranje (PBS + 5% mleko). Vezani fagi su eluirani s 0.5 ml 100 nM trietilamina (TEA,) a odmah nakon toga neutralizovani dodavanjem jednakog volumena IM TRIS-C1 pH 7.4. Eluirana grupa faga je korišćena za inficiranje TG1 ćelijaE. coliu logaritamskoj fazi, a fagmid je obnovljen kao šta je opisano (Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004). Selekcija je ponovljena tokom ukupno tri runde. Pojedinačnim kolonijama naraslim iz TGl ćelija, koje su bile inficirane sa eluiranim fagom iz treće runde pomeranja, je ispitana vezana aktivnost uz pomoć ELISA ogleda. Ukratko, pojedinačne kolonije koje su dobivene iz TG1 ćelija, koje su bile inficirane sa eluiranim fagom, su korišćene za inokulaciju medij uma u pločicama sa 96-rupica.
Mikrokulture su uzgajane do OD60o=0.6 kada je potaknuta ekspresija rastvorljivog fragmenta antitela uz pomoć dodavanja 1 mM IPTG nakon preko-noćne kulture u šejker-inkubatoru na 30° C. Bakterijske ćelije su oborene u talog, a periplazmatski ekstrakt je pripremljen i korišćen kako bi se detektovala vezana aktivnost antitela prema ECD koji je bio imobiliziran na zidovima mikropločica sa 96-rupica (Imunosorb mikropločice sa 96-rupica sa ravnim dnom, Nunc) primenom standardnog ELISA protokola uz instrukcije proizvođača.
Afiniteti antitela protiv prolaktinskog receptora (PRLR) za vezanje rekombinantnog izvan-ćelijskog domena (ECD) su procenjeni primenom Biacore"' 2000 i korišćeni za rangiranje antitela na osnovu afiniteta.
Primer2
Kvantitativna analiza ekspresije gena zaprolaktin i prolaktinskireceptorprimenom
TagManPCR analize u realnom vremenuu eu- iektopičnom endometrijumu i
c ndometriiumskim lezijama iz pacijenataizdravih kontrola
Taqman PCR analiza u realnom vremenu je provedena primenom sistema ABI Prism 7700 Sequence Detector u skladu sa instrukcijama proizvođača (PE Applied BioSvstems), a opisana je u Endocrinolgv 2008, 149 (8): 3952-3959) i poznata je stručnjacima. Relativni nivoi ekspresije PRL i PRLR su normalizovani do nivoa ekspresije ciklofilina. Mi smo analizirali ekspresiju PRL i PRLR u endometrijumu zdravih žena i endometrijumu i endometrijumskim lezijama iz pacijentica primenom kvantitativne Taqman PCR analize u realnom vremenu. Ekspresija prolaktina i njegovog receptora je očito pozitivno regulisana u endometrijumskim lezijama upoređeno sa zdravim enđometrijumom ili endometrijumom koji je dobiven od pacijentica.
Rezultati su pokazani na Slici 1 i 2.
Ovi nalazi pokazuju da autokrino prolaktinsko signaliziranje igra ulogu u razvoju i održavanju enđometrioze i adenomioze materice( endometriosis interna,forma enđometrioze koja je ograničena na matericu).
P<r>imer 3
Analiza ekspresijeprolaktinskogreceptorau ljudskom tkivuuzpomoćNorthern- blota
RNA je izolovana iz različitih tkiva pacova i prenesena na najlonsku membranu nakon gel-elektroforeze. Membrane su postepeno hibridizovane sa radioaktivno označenim molekulima cDNA prolaktinskog receptora pacova ili [3-aktina (kao kontrola opterećenja), isprane, i izložene filmu. Vrpce odgovaraju molekulima mRNA za prolaktinski receptor pacova i (i-aktina. Rezultati pokazani na Slici 3 pokazuju jaku ekspresiju prolaktinskog receptora u placenti, prostati, jajnicima i nadbubrežnoj žlezđi.
Primer 4
Regulacijaekspresijebelančevinezaprolaktinski receptor u prostatipacova -uticaj
kastracije ihormonskih tretmana
Pacovi su bili kastrirani ili su ostali intaktni. Intaktne životinje su tretirane dnevno tokom 14 dana sa prenosnikom (intaktno), DHT (3 mg/kg), ili E2 (0.4 mg/kg). Nakon toga, prostate su izolovane iz životinja svih tretiranih grupa, a iz njih su izolovane belančevine. Ekstrakti belančevina su odvojeni uz pomoć gel-elektroforeze i preneseni na membranu. Prolaktinski receptor je detektovan uz pomoć komercijalno dostupnog antitela MA610 (Santa Cruz Biotechnologv). Rezultati su prikazani na Slici 4 i pokazuju hormonsku regulaciju prolaktinskog receptora u prostati pacova.
Primer 5
Inhibicija prolaktinski- indukovane proliferacije BaF3ćelija ( stabilno transfektovanesa
ljudskim prolaktinskim receptorom)uz pomoćantitela koja neutralizujuprolaktinski
receptori nespecifičnih kontrolnih antitela
Sa ciljem da se analizirain vitroefikasnost antitela koja neutralizuju PRER. primenjena je inhibicija prolaktinski-aktivisane ćelijske proliferacije BaF3 ćelija. Ćelije su bile stabilno transfektovane sa ljudskim PRLR pa su rutinski kultivirane u RPM1 koji sadrži 2 mM glutamina u prisutnosti 10% FCS i 10 ng/ml ljudskog prolaktina. Nakon šest časova izgladnjavanja u medijumu bez prolaktina koji sadrži 1% FCS, ćelije su posejane u pločice sa 96-rupica u gustoći od 10000 ćelija po rupici. Ćelije su stimulisane sa 20 ng/ml prolaktina i ko-inkubirane sa rastućim dozama antitela koje neutralizuje PRLR tokom dva dana. Proliferacija ćelija je bila analizirana primenom ogledaCellTiter- Glo Lumimscent Cetl Viability Assay(Promega). Generisane su krive odgovora na dozu za inhibiranje prolaktinski-stimulisanog rasta iz kojih su izračunate IC50vrednosti. Kao negativna kontrola je korišćeno stimulisanje sa nespecifičnim kontrolnim antitelom.
Krive odgovora na dozu i ICso vrednosti su prikazani na Slici 5. Nespecifično antitelo nije inhibiralo proliferaciju BaF ćelija koje su eksprimirale ljudski PRLR. dok su specifičnaE.ntitela blokirala proliferaciju ćelija i pokazala različite potencijale. Neutralizujuće antitelo 006-H08 je pokazalo najveći potencijal u ovom primeru.
Primer6
I nhibicija prolaktinski- indukovane proliferacije ćelija limfoma pacova uz pomoć
s pecifičnih i nespecifičnih antitela
In vitroefikasnost antitela koja neutralizuju PRLR je takođe bila testirana uz pomoć inhibicije prolaktinski-zavisne proliferacije ćelija limfoma pacova (Nb2-ll ćelije). Nb2-ll ćelije su rutinski uzgajane u RPM1 koji je sadržavao 10% FCS i 10% konjskog seruma. Pre započinjanja ogleda sa ćelijskim rastom, ćelije su uzgojene tokom 24 h u istom medijumu koji sadrži 1% umesto 10% FCS. Nakon toga, ćelije su posejane u pločice sa 96-rupica u medijumu koji nije sadržavao FCS u gustoći od 10000 ćelija po rupici. Ćelije su stimulisane sa 10 ng/ml humanog prolaktina u prisutnosti ili odsutnosti rastućih doza antitela za neutralizovanje PRLR ili kontrolnog antitela tokom 2 dana. Nakon toga, ćelijska proliferacija je testirana uz pomoć ogledaCel! Titer~ Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega). Krive odgovora na dozu i IC™ vrednosti su prikazane na Slici 6. Nespecifično antitelo i aititelo XHA06.983, koja se ne vežu na PRLR iz pacova, nisu blokirala proliferaciju Nb2-11 ćelija. XHA06.642, koje se veže na PRLR iz pacova, blokira proliferaciju Nb2-11 ćelija.
Primer7
I nhibicija prolaktinski- indukovane STAT5 fosforilacije u T47D ćelijama uz pomoć
antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor
Sa ciljem da se analizirain vitroefikasnost antitela koja neutralizuju PRLR u dodatnom ogledu, korišćena je inhibicija STAT5 fosforilacije u ljudskim T47D ćelijama sa prolaktinom. T47D ćelije su uzgajane u RPMI koji sadrži 10% FCS i 2 mM glutamina. Ćelije su posejane u pločice sa 24-rupica u gustoći od 0.5x10^ ćelija po rupici. Sledećeg dana, ćelije su izgladnjavane tokom 1 h u serumu bez RPMI. Nakon toga, ćelije su inkubirane sa ili bez različitih doza antitela koje neutralizuje PRLR ili sa nespecifičnim kontrolnim antitelom u odsutnosti ili prisutnosti 20 ng/ml humanog prolaktina tokom 30 min. Nakon toga. ćelije su isprane i lizirane u 70 ul pufera za liziranje. Lizati su centri fugo vani, a supernatant je smrznut na -80° C. Ekstrakti su analizirani uz pomoć Western-blota (anti-pSTAT5A/B antitelo iz 07-586; razređeno 1:1000). Za potrebe kontrole opterećenja, ogoljeni blotovi su inkubirani sa antitelom protiv beta-tubulina (ab7287, razređeno 1:500). Rezultati su prikazani na Slici 7. Osim nespecifičnog FITC antitela. sva antitela koja neutralizuju PRLR su blokirala STAT5 fosforilaciju ljudskih T47D ćelija na dozno-zavisan način. Sva testirana antitela se vežu na ljudski PRLR sa visokim afinitetom.
Primer 8
Inhibicija delovanja reporter genazaluciferazu u Hek293 ćelijama koje su stabilno
transfektovanesaljudskim PRLR-analiza uz pomoć antitela koje neutralizuje
prolaktinski receptor i nespecifičnog kontrolnog antitela
Sa ciljem da se dodatno analizirain vitroefikasnost antitela koje neutralizuje PRLR, bio je korišćen ogleda sa reporter genom. HEK293HEK293 ćelije koje su stabilno transfektovane sa ljudskim PRLR su prolazno transfektovane sa reporter genom za luciferazu pod kontrolom LHRE elemenata (elementi koji odgovaraju na laktogeni hormon) tokom 7 h. Nakon toga. ćelije su posejane u gustoći od 20000 ćelija po rupici na pločici sa 96-rupica (0.5% serum bez harkoala, DMEM). Sledećeg dana je dodano 300 ng/ml humanog prolaktina sa i bez rastućih doza antitela koje neutralizuje PRLR ili kontrolno antitelo. Nakon 24 h je određena aktivnost luciferaze. Rezultati su prikazani na Slici 8. Suprotno od nespecifičnog antitela. 006-H08 i HE06.642 su inhibirala aktivnost luciferaze u HEK.293 ćelijama koje su stabilno transfektovane sa ljudskim PRLR.
Primer 9
Inhibicija aktivnosti reporter gena za luciferazu u Hek293 ćelijama koje su stabilno
transfektovane sa mišjim PRLR - analiza uz pomoć antitela koja neutralizuju
prolaktinski receptorinespecifičnih kontrolnih antitela
Sa ciljem da se dodatno analizirain vitroefikasnost antitela koje neutralizuje PRLR na mišjem prolaktinskom receptoru, bio je korišćen ogled sa reporter genom. HEK293 ćelije koje su stabilno transfektovane sa mišjim PRLR su prolazno transfektovane sa reporter genom za luciferazu pod kontrolom elemenata LHRE (elementi koji odgovaraju na laktogeni hormon) tokom 7 h. Nakon toga, ćelije su posejane u gustoći od 20000 ćelija po rupici na pločici sa 96-rupica (0.5% serum bez harkoala, DMEM). Sledećeg dana je dodano 200 ng/ml humanog prolaktina sa ili bez rastućih doza antitela koje neutralizuje PRLR ili kontrolno antitelo. Nakon 24 h je određena aktivnost luciferaze. Rezultati su prikazani na Slici 9. Dok antitelo 005-C04 (zatvoreni trougaonici) pokazuje visoku aktivnost (IC50vrednost = 3 nM), antitelo HE06.642 (zatvoreni krugovi) ne pokazuje aktivnost sve do doze od 330 nM. Nespecifično kontrolno antitelo (otvoreni krugovi) je potpuno neaktivno. Za razliku od antitela HE06.642 (Novartis), antitelo 005-C04 može da blokira PRLR-posredovano signaliziranje kod miša.
Primer 10
Inhibicija prolaktinski- indukovane proliferacije BaF3 ćelija ( stabilno transfektovanesa
mišjim prolaktinskim receptorom) uz pomoć antitela koja neutralizuju prolaktinski
receptor i nespecifičnih kontrolnih antitela
Sa ciljem da se analizirain vitroefikasnost antitela koja neutralizuju PRLR, bila je korišćena inhibicija prolaktinski-aktivisane ćelijske proliferacije Ba/F3 ćelija. Ćelije su stabilno transfektovane sa mišjim PRLR pa su rutinski uzgajane u RPMI koji sadrži 2 mM glutamina u prisutnosti 10% FCS i 10 ng/ml ljudskog prolaktina. Nakon šest časova gladovanja u medijumu koji ne sadrži prolaktin, a sadrži 1% FCS, ćelije su posejane na pločicu sa 96-rupica u gustoći od 10000 ćelija po rupici. Ćelije su stimulisane sa 40 ng/ml prolaktina i ko-inkubirane sa rastućim dozama antitela koja neutralizuju PRLR tokom dva dana. Ćelijska proliferacija je analizirana primenom ogledaCellTiter- Glo Luminescent Cell Viahility Assav(Promega). Generisane su krive odgovora na dozu koje prikazuju inhibiciju prolaktinski-stimulisanog ćelijskog rasta, a tada su izračunate IC50vrednosti. Kao negativna kontrola je korišćena stimulacija sa nespecifičnim kontrolnim antitelom.
Krive odgovora na dozu i IC50vrednosti su prikazane na Slici 10. Nespecifično kontrolno antitelo (zatvoreni kvadrati) ne deluje na mišji PRLR. Primećena je samo ograničena inhibicija aktivisanja mišjeg PRLR uz pomoć antitela HE06.642, 00I-E06, i 001-D07. Samo antitelo 005-C04 potpuno blokira aktivisanje mišjeg PRLR.
Primer 11
Kontraceptivni efekt antitela koje neutralizuje prolaktinski receptor ( IgGl 005- C04)
kodmiševa
Sa ciljem da se testira uticaj antitela koje neutralizuje prolaktin na fertilnost miševa, 12-sedmica stare ženke i mužjaci NMRI miševa su pareni tokom 7 dana (dan 0 - dan 7). Ženke su tretirane tokom dana -3, 0. 3, i 6 uz pomoć intraperitonealne injekcije slanog rastvora pufcrovanog sa fosfatom, nespecifičnim IgGl kontrolnim antitelom (anti-FITC, 10 mg/kg), ili neutralizujućim IgGl antitelom 005-C04 (= IgGl 005-C04) u koncentraciji od 10 ili 30 mg po kg telesne težine koje je bilo rastvoreno u slanom rastvoru koji je bio puferovan sa fosfatom. 10 ženki je korišćeno u svakoj eksperimentalnoj grupi. Svaki mužjak je paren sa dve ženke, pri čemu je jedna ženka dolazila iz negativne kontrolne grupe koja je bila tretirana sa slanim rastvorom puferovanim sa fosfatom ili sa nespecifičnim antitelom, a druga ženka je tretirana sa specifičnim neutralizujućim antitelom. Parenja u kojima nije bilo barem jedne skotne ženke su bila isključena iz procesa evaluacije podataka. Parametri ogleda su srednja veličina legla i stope skotnosti (izmereni kao %) izračunati kao broj u leglu po eksperimentalnoj grupi podeljen sa brojem teoretski mogućih brojeva u leglu iz određene grupe. Rezultati su prikazani na Slici 11.
Slika 11A prikazuje dobivene stope skotnosti. Stope skotnosti su kako sledi: 87.5% u grupi miševa koji su bili tretirani sa slanim rastvorom puferovanim sa fosfatom,
75% u grupi miševa koji su tretirani sa nespecifičnim kontrolnim antitelom (10 mg/kg), 100% u grupi miševa koji su bili tretirani sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgGl 005-C04; 10 mg/kg), i
0% u grupi miševa koji su bili tretirani sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgGl 005-C04;
30 mg/kg).
Slika 11B prikazuje dobivene veličine legla u različitim eksperimentalnim grupama. Veličine legla su kako sledi: • 10.9 miševa po leglu u grupi miševa koji su bili tretirani sa slanim rastvorom puferovanim sa fosfatom, • 12.3 miševa po leglu u grupi miševa koji su bili tretirani sa nespecifičnim kontrolnim antitelom (10 mg/kg), • 13 miševa po leglu u grupi miševa koji su bili tretirani sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgGl 005-C04; 10 mg/kg), i • 0 miševa po leglu u grupi miševa koji su bili tretirani sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgGl 005-C04; 30 mg/kg).
Rezultati iz ove studije parenja pokazuju da antitelo koje neutralizuje prolaktinski receptor (IgGl-005-C04) potpuno sprečava skotnost miševa u dozi od 30 mg/kg telesne težine.
Primer 12
Grupisanje epitopa
Eksperimenti grupisanja epitopa su provedeni uz pomoć Biacore uz praćenje simultanog vezanja parova antitela protiv PRLR na ECD-PRLR (SEK. ID BR: 70). Ukratko, prvo antitelo je kovalentno i mobi lizi rano na senzorski čip preko kuplovanja primarnog amina primenom n-hidroksisukcinamida (NHC) i N-etil-N'-dimetilaminopropii karbodiimida (EDC). Nezauzeta vezana mesta na površini su tada blokirana sa etanolamidom. Rastvorljivi ECD-PRLR (SEK. ID BR: 70) je zarobljen na površini uz pomoć imobiliziranog antitela pa, prema tome. epitop zarobljenog antitela je blokiran uz pomoć svih vezane ECD-PRLR molekula. Drugo antitelo je odmah nakon toga provedeno po površini kako bi se vezalo na i mobilizirani ECD-PRLR. Dva antitela koja prepoznaju iste ili preklapajuće epitope ne mogu da se vežu na ECD-PRLR, dok antitela koja prepoznaju udaljene epitope mogu da se vežu. Površina antitela je regenerisana uz pomoć glicina (pH 2.8) kako bi se odstranile vezane belančevine, a tada je proces ponovljen sa drugim antitelima. Testirane su sve kombinacije antitela. Reprezentativni rezulti su prikazani u Tabeli 7. Antitela 006-H08. 002-H06, 002-H08, 006-H07 i XHA06983 se kompetetivno vežu jedno na drugo na ECD-PRLR. koje pokazuje da ciljaju preklapajuće epitope (epitopna grupa 1. Tabela 6). Osim toga, pomenuta antitela se kompetetivno vežu na PRL, koje je takođe slučaj za 001-E06 (epitopna grupa 2. Tabela 6). Ovo antitelo cilja različito mesto na ECD-PRLR od već pomenutih. Konačno, antitelo 005-C04 se kompetetivno veže na HE06.642 i XHA06.642 bez da se takmiči za vezanje na PRI. (epitopna grupa 3, Tabela 6).
Primer 13
Unakrsna- reaktivnost antitela prema mišjem i ljudskom PRLR kojiseeksprimira na
površinama ćelija
Sa ciljem da se odrede vezane karakteristike antitela protiv PRLR prema mišjim i ljudskim PRLR, koji je eksprimiran na površinama ćelija, vezanje je testirano uz pomoć protočne đtometrije sa HEK293 ćelijama koje stabilno eksprimiraju ljudski i mišji PRLR. Pomenute ćelije i parentalna HEK293 ćelijska linija bez PRLR su sakupljene, centri fugo vane i resuspendovane kod približno 5x10" ćelija/ml u lxPBS koji je sadržavao 2% FBS i 0.1% natrijum azid (FACS pufer). Antitela 005-C04. 001-E06 i HE06.642 su razređena do 2-puta finalne koncentracije u FACS puferu pa su dodana u odgovarajuće rupice sa primercima (50 ul/rupici). Za potrebe sekundarnog antitela i auto fluorescentnih kontrola u odgovarajuće rupice je dodano 50 ul FACS pufera. 50 ul ćelijske suspenzije je dodano u svaku rupicu sa primerkom. Primerci su inkubirani na 4° C tokom jednog časa. isprani dva puta sa hladnim FACS puferom i resuspendovani u FACS puferu koji je sadržavao PE-konjugirani kozji anti-Ijudski IgG razređen 1:100. Nakon 30 min od inkubacije na 4° C, ćelije su isprane dva puta sa hladnim FACS puferom, resuspendovane u FACS puferu koji je sadržavao I mg/ml propidijum jodid (Invitrogen, San Diego, CA) i analizirane uz pomoć protočne citometrije. Kao šta je prikazano na Slici 13, antitela 005-C04 i 001-E06 se vežu na ljudski i mišji PRLR na pomenutim ćelijama, dok HE06.642 veže samo humani PRLR. Ovaj nalaz je konzistentan sa nalazom koji je opisan u primeru 9 u vezi sa nedostatkom efikasnost HE06.642 u ogledu sa mišjim PRLR koji je zavisan o reporter genu za luciferazu. Mada se 005-C04 i HE06.642 kompetetivno vežu na ljudski PRLR, različite vezane karakteristike oba antitela u odnosu na mišji PRLR ukazuje na razlike u njihovim epitopnim specifičnostima.
Primer 14
lnhibitorna aktivnost FabiscFv antitela u ćelijskim kaskadama za signaliziranje
Sa ciljem da se funkcionalno karakterizuje aktivnost Fab i scFv u PRLR-potaknutim kaskadama za signaliziranje, izmerena je inhibicija samo-fosforilovanja PRLR, i transkripcionih regulatora ERK1/2 i STAT5 u ljudskim T47D ćelijama tretiranim sa prolaktinom. T47D ćelije su uzgojene u RPMI koji je sadržavao 2 mM L-glutamin. 10% FBS bez harkoala i insulin-transferin-selenijum-A (Gibco). Ćelije su posejane na pločice sa 6 rupica ili pločice sa 96-rupica u gustoći od 1.5xl0<6>ćelija po rupici. Sledećeg dana, medijum za rast je obnovljen. Tokom trećeg dana, ćelije su gladovale tokom 1 časa u RPMI bez seruma. Nakon toga, ćelije su inkubirane sa ili bez različitih doza antitela koja neutralizuju PRLR ili nespecifičnog kontrolnog antitela u prisutnosti 500 ng/ml humanog prolaktina tokom 5 min. Nakon toga, ćelije su isprane i lizirane u puferu za liziranje. Lizati su centrifugovani. a supematanti su smrznuti na -80° C. Primerci su testirani uz pomoć ogleda ELISA prema instrukcijama iz kompleta hemikalijaDuoSet IC " Human Phospho- Prolaciin R"(R&D Svstems) za merenje fosforilovanja PRLR prema instrukcijama iz kompleta hemikalijaPathScan Fosfo- STATS ( Tyr694) Sanchvich ELISA(Cell Signaling Technologv: #7113) za merenje fosforilovanja STAT5 i prema instrukcijama iz kompleta hemikalijaPhospho- ERK1/ ERK2(R&D Systems) za merenje fosforilovanja ERK1/2. Tabela 8 obezbeđuje pregled antagonističke aktivnosti za izabrane pogotke za Fab ili scFv format kod fiksne doze od 7.5 ug po ml.
Primer 15
Antitela koia neutralizuju PRLR inhibiraju laktaciju kod miševa
Odrasle NMRI ženke su parene sa NMRI mužjacima. Tokom postpartalnog dana 1, veličina legla je podešena na 8 miševa po laktirajućoj majci. Težina potomaka je određivana dnevno tokom jutra, a merenje je započeto tokom postpartalnog dana 1. Majke koje su laktirale ili nisu tretirane (zatvoreni krugovi na Slici 14A,B) ili su bile tretirane intraperitonealno sa nespecifičnim antitelom (10 mg/kg telesne težine; otvoreni krugovi na Slici 14A.B), ili sa antitelom koje neutralizuje PRLR (005-C04) koje sadrži mišje IgG2a konstantne domene (= lgG2a 005-C04; 10 mg/kg, zatvoreni trougaonici na Slici 14A, B) ili sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgG2a 005-C04; 30 mg/kg, otvoreni trougaonici na Slici 14A, B). Grupa je obuhvatala 5-6 laktirajućih majki po eksperimentalnom razredu. Majke su tretirane sa specifičnim ili nespecifičnim kontrolnim antitelima tokom postpartalnog dana 1, 3, 6, 9. 10, i 12 (koje je označeno sa strelicama na Slici 14A, B). Rezultati su prikazani na Slici 14. Slika 14A prikazuje dnevni prirast legla za svaki postpartalni dan u formi procenata odgovarajuće težine legla tokom dana 1. Od postpartalnog dana 8 nadalje, primećena je značajna razlika u prirastu po leglu između potomaka majki koje su bile tretirane sa antitelima koja neutralizuju PRLR i potomaka majki koje su ostale netretirane ili su primile nespecifična kontrolna antitela. Zbog etičkih razloga, nekoliko legla je moralo biti uništeno tokom postpartalnog dana 10 u eksperimentalnoj grupi sa majkama koje su primile najjače doze antitela koje neutralizuje PRLR. Na Slici 14B rezultati su prikazani na drugačiji način. Diferencijalni prirast po leglu dan-za-danom je prikazan kao procenat prirasta po leglu u odnosu na postpartalni dan 1. U osnovi. Slika 14B prikazuje nagib grafikona prikazanih na Slici 14A. Diferencijalno dnevno povećanje prirasta legla oscilira oko 30% u odnosu na početnu težinu legla tokom postpartalnog dana 1 za legla netretiranih majki ili majki koje su bile tretirane sa nespecifičnim antitelom. Postoji značajno opadanje dnevnog povećanja prirasta legla u leglima majki koje su bile tretirane sa antitelima koje neutralizuju PRLR sa dozom od 30 mg/kg telesne težine od dana 7 nadalje (<*>p<0.05;<***>p<0.005 naspram legla majki koje su bile tretirane sa nespecifičnim antitelom). Od postpartalnog dana 11 nadalje, dnevno povećanje prirasta legla je značajno smanjeno takođe u leglima majki koje su bile tretirane sa antitelom koje neutralizuje PRLR sa dozom od 10 mg/kg ako se uporedi sa leglima majki koje su bile tretirane sa nespecifičnim kontrolnim antitelima (p<0.05 naspram legla majki koje su bile tretirane sa nespecifičnim antitelom). Zaključno, postoje dozno-zavisni efekti antitela koje neutralizuje PRLR (IgG2a 005-C04) koji utiču na inhibiciju laktacije. Slika 14C prikazuje histološke preparate (preseke) mlečnih žlezda laktirajućih majki iz različitih eksperimentalnih grupa. Mlečne žlezde netretiranih majki i majki koje su bile tretirane sa nespecifičnim kontrolnim antitelima su ispunjene sa kanalima koje proizvode mleko. Suprotno, postoje naznake involucije mlečnih žlezda kod majki koje su tretirane sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgG2a 005-C04). Crne strelice na Slici 14C pokazuju masna ostrvca u tkivu mlečnih žlezda (primetite dozno-zavisni efekt specifičnog antitela IgG2a 005-C04 na obim involucije mlečnih žlezda (Slika 14C)). Osim toga. analizirana je i ekspresija glavnih mlečnih belančevina, beta-kazeina (Csn-2), kisele belančevine sirutke (WAP). i IGF-1 u mlečnim žlezdama majki iz različitih eksperimentalnih grupa (Slika 14D). Genska ekspresija je normalizovana do ekspresije belančevine koja veže TATA-kutiju (TBP). Antitelo koje neutralizuje PRLR (IgG2a 005-C04) je na dozno-zavisan način smanjilo ekspresiju mlečnih belančevina dok nespecifično antitelo (10 mg/kg) nije pokazalo nikakav značajan efekat. Antitelo koje neutralizuje PRLR (IgG2a 005-C04) je na dozno-zavisan način blokiralo laktaciju i uzrokovalo involuciju mlečnih žlezda kod laktirajućih majki koje pokazuje njegovu korisnost u inhibiciji laktacije.
Primer 16
Antitelakoja neutralizuju PRLRsuprikladnazatretman benignebolestidojke
Aktivirajuća PRLR mutacija ili lokalna ili sistemska hiperprolaktinemija mogu da uzrokuju benignu bolest dojke. Prema tome. korišćen je hiperprolaktinemski mišji model sa ciljem da se indukuje pojačana proliferacija u mlečnoj žlezdi (oznaka najtežih forma benigne bolesti dojke). Tokom dana 0. 12-sedmica starim ženkama Balb/c miševa su presađeni delovi hipofize ispod bubrežne kapsule ili nisu operisane. Miševi sa presađenim delovima hipofize nisu tretiran ili su bili tretirani (intraperitonealno) sa nespecifičnim antitelom (10 mg/kg), antitelom koje neutralizuje PRLR (005-C04 u IgGl formatu) (= IgGl 005-C04; 10 mg/kg), ili sa antitelom koje neutralizuje PRLR (IgGl 005-C04; 30 mg/kg) tokom dana 0. 3. 7, 11. i 15. Veličina eksperimentalne grupe je bila 8-10 životinja. Tokom dana 17 nakon transplantacije delova hipofize, miševi su žrtvovani. Dva časa pre žrtvovanja, životinje su primile intraperitonealnu injekciju BrdU sa ciljem da se prati proliferacija ćelija epitela. Leva lingvalna mlečna žlezda je fiksirana u Carnoy-ev rastvor, a tada su pripremljeni preparati rnlečne žlezde i obojeni saCarmine alaum(Slika 15A). Desna lingvalna mlečna žlezda je tokom noći fiksirana u 4% formalinu koji je bio puferovan sa fosfatom. Mlečne žlezde su naknadno uklopljene u parafin, a imuno-bojenja sa BrdU su provedena kao šta je opisano ranije (Endocrinologv 149 (8): 3952-3959: 2009). Osim toga, provedeno je i imuno-bojenje sa pSTAT5 (antitelo protiv pSTAT5 od Abcam-a, ab32364, razređeno 1:60) sa ciljem da se prati inhibicija PRLR-posredovanog signaliziranja kao odgovor na tretman sa antitelima koja neutralizuju PRLR. Slika 15A pokazuje uvećanja preparata mlečne žlezde iz različitih eksperimentalnih grupa. Mlečne žlezde odraslih miševa kojima nisu bili presađeni delovi hipofize imaju kanale i vršne pupoljke, dok se kod miševa kojima su bili presađeni delovi hipofize primećuje ekstremno grananje i nastanak alveolarnih struktura. Tretman sa nespecifičnim antitelom (10 mg/kg) nije inhibirao bočno grananje i nastanak alveolarnih struktura. Suprotno, tretman sa antitelom koje neutralizuje IgGl 005-C04 u dozi od 10 mg/kg telesne težine dovodi do potpune inhibicije bočnog grananja u 8 od 10 životinja kojima su bili presađeni delovi hipofize, dok tretman sa IgGl 005-C04 u dozi od 30 mg/kg potpuno inhibira bočno grananje u 9 od 9 životinja kojima su presađeni delovi hipofize. Histološka analiza i imuno-bojanje sa BrdU su prikazani na Slici 15B. Presađivanje delova hipofize dovodi do hiperplazije epitela koja ne može da se inhibira uz pomoć tretmana sa nespecifičnim antitelom, dok kod miševa kojima su bili presađeni delovi hipofize i koji su bili tretirani sa antitelom koje neutralizuje PRLR u dozi od 10 ili 30 mg/kg telesne težine nema hiperplazije. Neke BrdU-pozitivne ćelije, koje predstavljaju ćelije koje se nalaze u S-fazi ćelijskog ciklusa koje će se podeliti, su označene sa belim strelicama na Slici I5B. Miševi koji su bili tretirani sa neutralizujućim antitelom IgGl 005-C04 (30 mg/kg telesne težine) pokazuju gotovo potpunu inhibiciju proliferacije ćelije epitela u mlečnim žlezdama. Neke od ćelija koje su pozitivne za fosfo-STAT5 su označene sa belim strelicama na Slici 15C. Tretman sa 30 mg/kg IgGl 005-C04 uzrokuje potpunu inhibiciju fosforilacije STAT5. koje ukazuje na potpunu blokadu PRLR-posredovanog signaliziranja.
Rezultati u Slikama 15A, B, i C pokazuju da antitela koja neutralizuju PRLR su prikladna za tretman mastopatije, benigne proliferativne bolesti mlečne žlezde. Antitela koja neutralizuju PRLR inhibiraju proliferaciju ćelija mlečnog epitela i aktivisanje fosfo-STAT5.
Primer 17
Tretman benigne hiperplazije prostatesaantitelima koja neutralizuju PRLR
Benigna hiperplazija prostate je uspostavljena u mužjacima Balb/c miševa uz pomoć presađivanja dva dela hipofize ispod bubrežne kapsule u dobi od 8 sedmica. Kontrolna grupa nije operisana. Miševi kojima su bili presađeni delovi hipofize nisu bili tretirani ili su primili intraperitonealne injekcije nespecifičnog antitela (10 mg/kg), ili antitela koje neutralizuje PRLR (005-C04) koje sadrži mišje IgG2a konstantne domene (= IgG2a 005-C04) u dozama od 10 i 30 mg/kg telesne težine. Injekcije sa antitelom su započete na dan presađivanja delova hipofize (=dan 0), i nastavljene tokom dana 3, dana 7, dana 11, dana 15, dana 18. dana 22, i dana 25 nakon transplantacije delova hipofize. Miševi su žrtvovani tokom dana 28. Određena je relativna težina ventralne prostate. Rezultati su prikazani na Slici 16. Presađivanje delova hipofize je rezultovalo povećanjem relativne težine prostate. Tretman sa 10 mg/kg i 30 mg/kg antitela koje neutralizuje PRLR (IgG2a 005-C04) smanjuje težinu prostate, dok tretman sa nespecifičnim kontrolnim antitelom nije dao nikakav efekt. Antitela koja neutralizuju PRLR su, prema tome. prikladna za tretman benigne hiperplazije prostate.
Tokom dana 18 nakon presađivanja delova hipofize je postalo jasno da je, kod životinja kojima su bili presađeni delovi hipofize, rast dlaka bio umanjen. Antitela koja neutralizuju PRLR stimulišu rast dlake u hiperprolaktinemskim uslovima. Reprezentativne fotografije su prikazane na Slici 17. Prema tome, antitela koja neutralizuju PRLR mogu da se koriste za tretman hiperprolaktinemskog gubitka kose.
Primer 18
Efekt antitela koja neutralizuju PRLR na rastkose
Dorzalna dlaka 8-seđmica starih mužjaka i ženski C57BL/6 miševa je odstranjena uz pomoć električnog brijača kao šta je opisano ranije (British Journal of Dermatolog}' 2008; 159:300-305). Hiperprolaktinemija je indukovana u nekim grupama uz pomoć presađivanja delova hipofize ispod bubrežne kapsule, dok su životinje u preostalim grupama ostale normoprolaktinemske. Životinje su tretirane sa antitelima specifičnim za PRLR (IgG2a 005-C04)ilinespecifičnim kontrolnim antitelima (30 mg/kg, intraperitonealno) jednom sedmično (započinjući tokom dana 0 koji je dan presađivanja delova hipofize). Naknadne injekcije antitela su provedene tokom dana 7 i 14. Nakon tri sedmice, ponovni rast dlake je bio vidljiv kao tamna mrlja na ljubičasto-beloj obrijanoj koži pa je izmeren procenat obrijane površine koji je postao taman. Ženke miševa su žrtvovane 15 dana nakon brijanja, a mužjaci su žrtvovani 18 dana nakon brijanja.
Sledeće eksperimentalne grupe su korišćene (veličina grupa je iznosila 6 miševa):
1. obrijane ženke
2. obrijane ženke kojima su bili presađeni delovi hipofize
3. obrijane ženke kojima su bili presađeni delovi hipofize + 30 mg/kg nespecifičnog antitela IgG2a 005-C04 jednom sedmično 4. obrijane ženke kojima su bili presađeni delovi hipofize + 30 mg/kg specifičnog antitela jednom sedmično
5. obrijane ženke + 30 mg/kg nespecifičnog antitela jednom sedmično
6. obrijane ženke + 30 mg/kg specifičnog antitela jednom sedmično
7. obrijani mužjaci
8. obrijani mužjaci kojima su bili presađeni delovi hipofize
9. obrijani mužjaci kojima su bili presađeni delovi hipofize + 30 mg/kg nespecifičnog antitela jednom sedmično 10. obrijani mužjaci kojima su bili presađeni delovi hipofize + 30 mg/kg specifičnog antitela IgG2a 005-C04 jednom sedmično
11. obrijani mužjaci + 30 mg/kg nespecifičnog antitela jednom sedmično
12. obrijani mužjaci + 30 mg/kg specifičnog antitela jednom sedmično
Reprezentativne slike životinja iz različitih grupa su prikazane na Slici 18, a procenat površine na kojem je ponovno narasla dlaka je prikazan na Slici 18.
Antitela koja neutralizuju PRLR. ali ne i nespecifična antitela, stimulišu ponovni rast kose u hiper- i normoprolaktinemskim uslovima kod mužjaka i ženki miševa. Antitela koja neutralizuju PRLR su. prema tome. prikladna za tretman gubitka kose kod žena i muškaraca u hiper- i normoprolaktinemskim uslovima.
Primer 19
Inhibicija pojačane proliferacije ćelija mlečnog epitela uz pomoć antitela koja
neutralizuju PRLR
Sa ciljem da se testira efekt antitela koja neutralizuju PRLR na pojačanu proliferaciju ćelija mlečnog epitela, koja je aktivisana kombinovanom hormonskom terapijom (tj. terapija estrogen plus progestin), primenjen je prethodno opisani mišji model koji omogućava kvantifikovanje proliferativnih efekata u materici i mlečnim žlezdama (Endocrinologv 149:3952-3959, 2008). 6-sedmica starim ženkama C57BL/6 miševa su odstranjeni jajnici. 2 sedmice nakon odstranjivanja jajnika, životinje su tretirane supkutano sa dnevnim injekcijama sa prenosnikom (etanol/ulje od kikirikija 10%/90%) ili sa 100 ng estradiola plus 100 mg/kg progesterona tokom dve sedmice. Životinje su tretirane jednom sedmično sa intraperitonealnim injekcijama antitela koje neutralizuje PRLR (10 mg/kg i 30 mg/kg) u mišjem IgG2a formatu ili sa nespecifičnim antitelom (30 mg/kg) tokom tri sedmice. Autopsija je provedena tokom dana 36 nakon odstranjivanja jajnika. Dva Časa pre usmrćivanja životinje su primile intraperitonealnu injekciju bromodeoksiuridina (BrdU) koji je bio rastvoren u slanom rastvoru koji jc bio puferovan sa fosfatom (70 mg/kg telesne težine). Proksimalno, 2/3 desne lingvalne mlečne žlezde je analizirano na proliferaciju ćelija mlečnog epitela (BrdU imuno-bojanje) kao šta je opisano prethodno (Endocrinologv 149:3952-3959, 2008).
Eksperiment je obuhvatao sledeće grupe:
1. životinje sa odstranjenim jajnicima koje su bile tretirane sa prenosnikom
2. životinje sa odstranjenim jajnicima koje su bile tretirane sa 100 ng estradiola
3. životinje sa odstranjenim jajnicima koje su bile tretirane sa 100 ng estradiola (E) i 100 mg/kg progesterona (P) 4. životinje sa odstranjenim jajnicima koje su bile tretirane sa E + P i 10 mg/kg specifičnog antitela 005-C04 5. životinje sa odstranjenim jajnicima koje su bile tretirane sa E + P i 30 mg/kg specifičnog antitela 005-C04 6. životinje sa odstranjenim jajnicima koje su bile tretirane sa E2 + P i 30 mg/kg nespecifičnog kontrolnog antitela.
Rezultati su prikazani na Slici 19. Procenjen je apsolutan broj ćelija duktalnog epitela koje proliferiraju u 4 unakrsna-preseka mlečne žlezde. Medijane su prikazane kao horizontalni histogrami. Proliferacija ćelija epitela životinja kojima su odstranjeni jajnici i koji su bili tretirani sa prenosnikom je niska. Tretman sa estradiolom dovodi do određene stimulacije proliferacije epitelnih ćelija, ali je maksimalna proliferacija ćelija mlečnog epitela primećena kod tretmana sa estrogenom plus progesteronom (Slika 19). Tretman sa antitelom koje neutralizuje prolaktinski receptor (005-C04), ali ne i sa nespecifičnim kontrolnim antitelom uzrokuje dozno-zavisno opadanje proliferacije ćelija mlečnog epitelnih gotovo do nivoa primećenih kod tretmana samo sa estradiolom.
Antitela koja neutralizuju PRLR su, prema tome, prikladna za tretiranje pojačane proliferacije ćelija mlečnog epitela pod kombinovanom hormonskom terapijom, tj. tretmanom estradiol plus progesteron.
Primer 20
Tretman adenomioze materice(^ endometriosis interna )u SHN miševima sa antitelima
ko ja neutralizuju PRLR
Sa ciljem da se testira efikasnost antitela koja neutralizuju PRLR u endometriozi. korišćen je mišji model za adenomiozu materice (SHN miševi) koji se oslanja na sistemsku hiperprolaktinemiju (Acta anat. 116:46-54.1983). Hiperprolaktinemija kod SHN miševa je indukovana presađivanjem delova hipofize ispod bubrežne kapsule 7-sedmica starih ženki miševa (Acta anal. 116:46-54,1983). Antitela koja neutralizuju PRLR (10 mg/kg ili 30 rng/kg) ili nespecifična antitela (30 mg/kg) su administrirana intraperitonealno, započinjući jednu sedmici nakon transplantiranja hipofize. Infiltracija žlezdanog tkiva u mišićni sloj materice je procenjena kao šta je ranije opisano (Laboratorv Animal Science 1998,48:64-68). Tretman sa antitelima je proveden tokom 9 sedmica jednom ili dva puta sedmično uz pomoć intraperitonealnih injekcija. Tokom autopsije (dan 70 nakon transplantacije hipofize), materice su bile fiksirane tokom noći u puferovani 4% formalin pa su uklopljene u parafin. Stepen adenomioze( =endometriosis interna)je procenjen kako sledi:
Razred 0 = bez adenomioze
Razred 0.5 = unutrašnji sloj miometrijuma gubi svoju koncentričnu orijentaciju Razred 1 = žlezde endometrijuma napadaju unutrašnji sloj miometrijuma
Razred 2 = žlezde endometrijuma između unutrašnjeg i spoljnog sloja miometrijuma materice
Razred 3 = žlezde endometrijuma napadaju spoljni sloj miometrijuma materice
Razred 4 = žlezde endometrijuma izvan spoljnog sloja miometrijuma materice. Eksperiment je obuhvatao sledeće eksperimentalne grupe:
1. Životinje kojima nisu presađeni delovi hipofize, tj. normoprolaktinemski miševi
2. Životinje kojima su presađeni delovi hipofize, tj. hiperprolaktinemski miševi
3. Životinje kojima su presađeni delovi hipofize, koje su bile tretirane sa nespecifičnim kontrolnim antitelom jednom sedmično sa dozom od 30 mg/kg 4. Životinje kojima su presađeni delovi hipofize, koje su bile tretirane sa nespecifičnim kontrolnim antitelom dva puta sedmično sa dozom od 30 mg/kg 5. Životinje kojima su presađeni delovi hipofize, koje su tretirane sa antitelom koje neutralizuje prolaktinski receptor (005-C04) u mišjem IgG2a formatu jednom sedmično sa dozom od 10 mg/kg 6. Životinje kojima su presađeni delovi hipofize, koje su tretirane sa antitelom koje neutralizuje prolaktinski receptor (005-C04) u mišjem IgG2a formatu dva puta sedmično sa dozom od 10 mg/kg 7. Životinje kojima su presađeni delovi hipofize, koje su tretirane sa antitelom koje neutralizuje prolaktinski receptor (005-C04) u mišjem lgG2a formatu jednom sedmično sa dozom od 30 mg/kg 8. Životinje kojima su presađeni delovi hipofize, koje su tretirane sa antitelom koje neutralizuje prolaktinski receptor (005-C04) u mišjem lgG2a formatu dva pita sedmično sa dozom od 30 mg/kg.
Rezultati su prikazani na Slici 20. Bodovi za svaku životinju iz svake tretirane grupe su prikazani (dodeljeni) pojedinačno, a medijane za svaku tretiranu grupu su prikazane kao horizontalni histogrami. Normoprolaktinemski miševi su razviliendometriosis internado nekog stepena (medijana bodova bolesti = 0.25). Hiperprolaktinemija usled presađene hipofize povećava bodove bolesti, pri čemu više životinja pati od pomenute bolesti (medijana bodova bolesti = 2.5). Dok tretman sa 30 mg/kg nespecifičnog antitela jednom sedmično ili clva puta sedmično nema uticaja na bolest, tretman sa specifičnim neutralizujućim antitelima pokazuje dozno-zavisno opadanje bodova bolesti. Primetljivo, sve životinje koje su primile 10 ili 30 mg/kg specifičnog antitela dva puta sedmično su potpuno izlečene, a bodovi njihove bolesti su značajno manji od bodova bolesti kod nonnoprolaktinemskih miševa (Slika 20). Antitela koja neutralizuju PRLR su. prema tome, prikladna za tretmanendometriosis interna(= adenomioza materice) iendometriosis externakod žena.
Primer 21
Sazrevanje varijanata antitela:
Afinitetno sazrevanje antitela je proces od dva koraka pri čemu se kombinuju saturacijska rnutageneza i visoko-efi kasna pretraga na bazi rupica sa ciljem iden ti likovanja malog broja mutacija koje dovode do porasta afiniteta. U prvoj rundi afinitetnog sazrevanja, provodi se pozicijska diversifikacija antitela divljeg tipa uz pomoć mesto-usmerene mutageneze uz korišćenje NNK-trinukleotidnih kaseta (pri Čemu N predstavlja mešavinu koja sadrži 25% svakog adeninskog, timinskog, gvaninskog, i citozinskog nukleotida, a K predstavlja mešavinu koja sadrži 50% svakog timinskog i gvaninskog nukleotida) prema instrukcijama iz BMC Biotechnologv 7: 65, 2007. Na taj način, svih 20 amino-kiselina se uvodi u svaku individualnu amino-kiselinsku poziciju. Ovakvo pozicijsko randomiziranje je ograničeno na šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR). U drugoj rundi afinitetnog sazrevanja, korisne supstitucije se rekombiniraju i pretražuju sa ciljem pronalaženja novih poboljšanja.
Proveravanje zrelih 006-H08 Fab varijanata uz pomoć homogenetime- resolved
fluorescentne analize (HTRF):
U mikrotitarskim pločicama sa 96 rupica su tokom 30 minuta inkubirani normalizovani supernatanti E. Coli i 8 nM biotonilovana ekstracelularna domena PRLR zajedno s 1 nM Streptavidin-Europium. Posle toga su dodani 200 mM KG i 50 nM Alexa Fluor 649-obeleženi IgGl od 006-H08. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5, 20, 35, 50 i 65 minuta, respektivno. U naznačenim vremenskim tačkama, izmerena je apsorpcija kod 665 nm (i 620 nm) primenom čitačaEnVision MultilabelReader(Perkin Elmer). Dobiveni rezultati su prikazani na Slici 21.

Claims (19)

1. Antitelo 006-H08 ili njegove definisane zrele varijante u skladu sa tabelom 5 ili njegovi fragmenti za vezanje antigena,naznačeni time,što antagonizuju signaliziranje posredovano prolaktinskim receptorom (PRLR) i koji se vežu na epitope izvan-ćelijskog domena prolaktinskog receptora i njegovih ljudskih polimorfnih varijanata pri čemu amino-kiselinska sekvenca pomenutog izvan-ćelijskog domena prolaktinskog receptora odgovara SEK. ID BR: 70, a nukleinska sekvenca odgovara SEK. ID BR: 71, pri čemu SEK. ID BR: 1 varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl. SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. a SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3, ili pri čemu a. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 78 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2 i SEK. ID BR: 90 odgovara LCDR3; ili b. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 75 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 82 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, te SEK. ID BR: 91 odgovara LCDR3; ili c. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 82 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, te SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3; ili d. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2. SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. dok SEK. ID BR: 86 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, te SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3; ili e. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 87 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, te SEK. ID BR: 100 odgovara LCDR3; ili f. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 87 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, te SEK. ID BR: 92 odgovara LCDR3: ili g. SEK. ID BR: I iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 89 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, te SEK. ID BR: 93 odgovara LCDR3; ili h. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 79 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 101 odgovara LCDR3; ili i. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 76 odgovara HCDR2. a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 89 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl. SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 33 odgovara LCDR3; ili j. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 100 odgovara LCDR3; ili k. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 97 odgovara LCDR3; ili 1. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl. SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 98 odgovara LCDR3; ili m. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 83 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl. SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 99 odgovara LCDR3; ili n. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 96 odgovara LCDR3; ili o. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 94 odgovara LCDR3; ili p. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl. SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 88 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 90 odgovara LCDR3; ili q. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 74 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 81 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 95 odgovara LCDR3; ili r. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 75 odgovara HCDR2. a SEK. ID BR: 13 odgovara to HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2. a SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3; ili s. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 77 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 18 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3; ili t. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2. a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 80 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRl, SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3: ili u. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3. dok SEK. ID BR: 85 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRL SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2. a SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3 9; ili v. SEK. ID BR: 1 iz varijabilnog teškog lanca odgovara HCDRl, SEK. ID BR: 7 odgovara HCDR2, a SEK. ID BR: 13 odgovara HCDR3, dok SEK. ID BR: 84 iz varijabilnog lakog lanca odgovara LCDRL SEK. ID BR: 24 odgovara LCDR2, a SEK. ID BR: 29 odgovara LCDR3.
2. Antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, što antitelo a. 006-H08 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 46, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 34, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 52, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 40, b. 006-H08-12-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 331, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 143, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 353, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 165, c. 006-H08-132-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 332, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 144, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 354, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 166, d. 006-H08-13-6-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 333, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 145, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 355, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 167, e. 006-H08-14-6-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 334, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 146, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 356, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 168, f. 006-H08-15-5 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 335, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 147, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 357, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 169, g. 006-H08-19-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 336, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 148, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 358, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 170, h. 006-H08-29-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 337, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 149, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 359, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 171. i. 006-H08-32-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 338. i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 150, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 360, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 172, j. 006-H08-33-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 339, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 151, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 361, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 173, k. 006-H08-16-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 340. i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 152, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 362, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 174. 1. 006-H08-35-17-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 341, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 153, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 363, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 175, m. 006-H08-35-I7-4 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 342, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 154, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 364, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 176, n. 006-H08-35-1 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 343, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 155, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 365, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 177, o. 006-H08-36-17-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 344, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 156, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 366, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 178, p. 006-H08-37-19-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 345, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 157. te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 367, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 179, q. 006-H08-39-7 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 346, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 158. te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 368. i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 180, r. 006-H08-48-5 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 347, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 159, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 369, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 181, s. 006-H08-53-27-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 348, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 160, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 370, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 182, t. 006-H08-59-30-0 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 349, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 161, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 371, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 183, u. 006-H08-63-32-4 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 350, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 162, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 372, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 184, v. 006-H08-65-33-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 351. i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 163, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 373, i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 185. w. 006-H08-68-35-2 sadrži domen varijabilnog teškog lanca koji odgovara nukleinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 352, i amino-kiselinskoj sekvenci u skladu sa SEK. ID BR: 164, te domen varijabilnog lakog lanca sa nukleinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 374. i amino-kiselinskom sekvencom u skladu sa SEK. ID BR: 186.
3. Antitelo u skladu sa zahtevima 1 i 2, naznačeno time, što se sastoji od regiona za vezanje antigena koji se specifično veže na ili ima visoki afinitet za vezanje na jedan ili više regiona iz PRLR, čija je amino-kiselinska sekvenca prikazana u SEK. ID BR: 70, i preko ljudskih polimorfnih varijanata iz SEK. ID BR: 70, amino-kiselinske pozicije 1 do 210, pri Čemu afinitet iznosi najmanje 100 nM, poželjno manje od oko 100 nM, još poželjnije afinitet je manji od oko 10 nM, ili čak još poželjnije afinitet je manji od 1 nM.
4. Antitelo iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 3, naznačeno time, što je teška konstanta modifikovani ili nemodifikovani IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4.
5. Izolovana nukleinska sekvenca, naznačena time, što kodira antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4.
6. Ekspresioni vektor, naznačen time, što sadrži nukleinsku sekvencu iz zahteva 5.
7. Ćelija-đomaćin, naznačena time. Što sadrži vektor iz zahteva 6 ili molekul nukleinske kiseline iz zahteva 5, pri Čemu pomenuta ćelija-domaćin je ćelija višeg eukariota, kao što je ćelija sisara, ćelija nižeg eukariota, kao što je kvaščeva, ili prokariotska ćelija, kao što je bakterijska ćelija.
8. Postupak primene ćelije-domaćina iz bzahteva 7, naznačen time, što se koristi za proizvodnju antitela ili fragmenta za vezanje antigena, koje obuhvata kultiviranje ćelija iz zahteva 7 u prikladnim uslovima i obnavljanje pomenutog antitela.
9. Antitelo ili fragment za vezanje antigena iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 4, naznačeno time, stoje prečišćeno do najmanje 95% težinske homogenosti.
10. Upotreba antitela ili fragmenta za vezanje antigena u skladu sa bilo kojem od zahteva od 1 do 4, naznačena time, što se koristi kao lek.
11. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4 i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac koji obuhvata recipijente i pomoćna sredstva.
12. Kompleti hemikalija (kitovi) koji sadrže antitelo prema bilo kojem zahtevu od 1 do 4, naznačeni time, što sadrže terapeutski efikasnu količinu antitela 006-H08 ili njegove zrele varijante, pakovani u kontejneru, pri čemu navedeni komplet hemikalija (kit) proizvoljno sadrži drugi terapeutski agens.
13. Antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4, naznačeno time. što se upotrebljava kao lek za tretman i/ili prevenciju enđometrioze i adenomioze{ endometriosis interna).
14. Antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4, naznačeno time, što se upotrebljava kao lek za tretman benigne bolesti dojke i mastalgije.
15. Antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4. naznačeno time, što se upotrebljava kao lek za inhibiranje laktacije.
16. Antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4. naznačeno time, što se upotrebljava kao lek za tretman benigne hiperplazije prostate.
17. Antitelo ili fragment za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4, naznačeno time. što se upotrebljava kao lek za tretman hiper- i normoprolaktinemskog gubitka kose.
18. Upotreba antitela u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4. ili u formi farmaceutske kompozicije prema zahtjevu 11, naznačena time. što sadrži PRLR antitela ili fragmente za vezanje antigena u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4 za priređivanje farmaceutske formulacije za parenteralnu dostavu, pri čemu postupci za parenteralnu dostavu uključuju topikalno, intra-arterijalno, intramišićno. supkutano, intramedularno, intratekalno, intraventrikularno, intravensko, intraperitonealno, intrauterno. vaginalno, ili intranazalno administriranje.
19. Farmaceutska kompozicija u skladu sa zahtevom 11, naznačena time, što sadrži PRLR antitela ili fragmente za vezanje antigena u skladu sa bilo kojom od zahteva od 1 do 4 u kombinaciji s najmanje jednim drugim agensom.
RS20170010A 2009-12-10 2010-11-18 Antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i njihova terapeutska primena RS55589B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09075546A EP2332995A1 (en) 2009-12-10 2009-12-10 Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use
PCT/EP2010/067742 WO2011069795A1 (en) 2009-12-10 2010-11-18 Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use
EP10782255.3A EP2510006B1 (en) 2009-12-10 2010-11-18 Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55589B1 true RS55589B1 (sr) 2017-06-30

Family

ID=42091520

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160915A RS55277B1 (sr) 2009-12-10 2010-11-18 Antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i njihova terapeutska primena
RS20170010A RS55589B1 (sr) 2009-12-10 2010-11-18 Antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i njihova terapeutska primena

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160915A RS55277B1 (sr) 2009-12-10 2010-11-18 Antitela koja neutralizuju prolaktinski receptor i njihova terapeutska primena

Country Status (40)

Country Link
US (6) US9241989B2 (sr)
EP (13) EP2332995A1 (sr)
JP (7) JP2013513361A (sr)
KR (2) KR101790366B1 (sr)
CN (6) CN102858804A (sr)
AP (1) AP2012006343A0 (sr)
AR (6) AR079349A1 (sr)
AU (2) AU2010330165B2 (sr)
BR (2) BR112012014048B1 (sr)
CA (6) CA2783514A1 (sr)
CL (2) CL2012001540A1 (sr)
CR (2) CR20120312A (sr)
CU (2) CU20120092A7 (sr)
CY (2) CY1118209T1 (sr)
DK (2) DK2510002T3 (sr)
DO (2) DOP2012000159A (sr)
EA (2) EA028678B1 (sr)
EC (2) ECSP12011966A (sr)
ES (2) ES2603352T3 (sr)
GT (1) GT201200186A (sr)
HR (2) HRP20161401T1 (sr)
HU (2) HUE030143T2 (sr)
IL (2) IL220149A (sr)
IN (2) IN2012DN05082A (sr)
LT (2) LT2510006T (sr)
MA (1) MA33888B1 (sr)
ME (1) ME02577B (sr)
MX (2) MX339343B (sr)
NZ (2) NZ600511A (sr)
PE (3) PE20171134A1 (sr)
PH (2) PH12012501129A1 (sr)
PL (2) PL2510006T3 (sr)
PT (2) PT2510006T (sr)
RS (2) RS55277B1 (sr)
SG (2) SG181511A1 (sr)
SI (2) SI2510002T1 (sr)
TN (1) TN2012000294A1 (sr)
TW (5) TWI508744B (sr)
WO (6) WO2011069795A1 (sr)
ZA (2) ZA201204214B (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2332995A1 (en) * 2009-12-10 2011-06-15 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use
ES2765418T3 (es) 2010-03-01 2020-06-09 Bayer Healthcare Llc Anticuerpos monoclonales optimizados contra el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI)
EP2530089A1 (en) 2011-06-03 2012-12-05 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Neutralising prolactin receptor antibody Mat3 and its therapeutical use
EA036225B1 (ru) 2012-03-14 2020-10-15 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы и их применения
US8883979B2 (en) * 2012-08-31 2014-11-11 Bayer Healthcare Llc Anti-prolactin receptor antibody formulations
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
RS57259B1 (sr) 2012-12-24 2018-08-31 Abbvie Inc Prolaktin receptor vezujući proteini i njihova upotreba
US20160002342A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-07 Xinghang Ma Anti-prolactin receptor antibody formulations
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
US9545451B2 (en) 2013-08-21 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PRLR antibodies and methods for killing PRLR-expressing cells
EP3139955B1 (en) 2014-04-30 2024-03-20 President and Fellows of Harvard College Fusion proteins for treating cancer and related methods
WO2016054603A2 (en) 2014-10-02 2016-04-07 City Of Hope Multivalent meditopes, meditope-binding antibodies and uses thereof
TWI703156B (zh) 2015-01-30 2020-09-01 學校法人埼玉醫科大學 抗ａｌｋ２抗體
KR20180025865A (ko) 2015-07-06 2018-03-09 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 다중특이적 항원 결합 분자 및 이의 용도
EP3448891A1 (en) 2016-04-28 2019-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
EP3548514A1 (en) 2016-11-29 2019-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating prlr positive breast cancer
FR3062213B1 (fr) * 2017-01-20 2021-02-26 Endodiag Utilisation du recepteur cd71 dans la detection et le traitement de l’endometriose
TW201836647A (zh) 2017-04-06 2018-10-16 美商艾伯維有限公司 抗－ｐｒｌｒ抗體藥物軛合物（ａｄｃ）及其用途
EP3621618A4 (en) * 2017-05-12 2021-01-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF GASTROPARESIA USING TRIAZASPIRO (4.5) DECANONE
KR20200027494A (ko) 2017-07-10 2020-03-12 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 남성 및 여성 패턴 탈모를 위한 프로락틴 수용체 항체
KR20200118151A (ko) 2018-02-07 2020-10-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료 단백질 전달을 위한 방법 및 조성물
WO2019169330A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Oncolix, Inc. Method for treating cancers expressing prolactin receptor
CN109627340B (zh) * 2018-12-05 2021-02-12 上海交通大学 Cd3和prlr双特异性抗体及其构建与应用
US10467487B1 (en) * 2018-12-11 2019-11-05 Chongqing Jinkang New Energy Automobile Co., Ltd. Fusion-based traffic light recognition for autonomous driving
CN112425568A (zh) * 2020-12-11 2021-03-02 上海市计划生育科学研究所 一种建立具有emt特征的良性前列腺增生bph犬模型的方法
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
CN114853890B (zh) * 2022-03-16 2023-04-28 沈阳三生制药有限责任公司 一种prlr抗原结合蛋白及其制备方法和应用
CN114634574B (zh) * 2022-04-18 2022-12-20 先进生物(苏州)有限公司 抗B7H6的scFv抗体、其编码基因及其应用
CN120842400A (zh) * 2023-04-24 2025-10-28 深圳真实生物医药科技有限公司 泌乳素受体抗体及其用途
CN117285625B (zh) * 2023-11-24 2024-01-23 南京佰抗生物科技有限公司 抗泌乳素蛋白的单克隆抗体及应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US4986615A (en) 1988-10-17 1991-01-22 The Vendo Company Vending apparatus
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
GB9105245D0 (en) * 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
JP2001500865A (ja) * 1996-09-13 2001-01-23 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 避妊の非ホルモン法
GB9701425D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
US6867187B2 (en) * 2000-12-22 2005-03-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition and method for modulating somatolactogenic function
EP1325930A1 (en) * 2002-01-08 2003-07-09 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mammal prolactin variants
CA2509825A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 The Ohio State University Antagonists for human prolactin
GB0305790D0 (en) * 2003-03-13 2003-04-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel Composition
EP1810690B1 (en) * 2004-10-28 2012-01-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-IL-5 receptor antibody for use in treating endometriosis.
WO2006089678A2 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Bioinvent International Ab Antibodies and peptides binding to hiv tat, and uses thereof
GB0517878D0 (en) * 2005-09-02 2005-10-12 Bioinvent Int Ab Immunotherapeutic treatment
US7422899B2 (en) 2005-10-05 2008-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Antibodies to the human prolactin receptor
PL2059535T3 (pl) 2006-08-18 2014-04-30 Novartis Ag Przeciwciało specyficzne względem PRLR i jego zastosowanie
JP2010530215A (ja) 2007-05-30 2010-09-09 オークランド ユニサービシス リミテッド 成長ホルモンおよび関連ホルモンの阻害剤、ならびにそれらの使用方法
EP2025683A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Variants of prolactin as antagonists of its receptor
EP2332995A1 (en) * 2009-12-10 2011-06-15 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use
WO2011139375A1 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Antibodies directed against carbonic anhydrase ix and methods and uses thereof
GB201020995D0 (en) * 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2567979A1 (en) 2013-03-13
EP2510005A1 (en) 2012-10-17
HUE031631T2 (en) 2017-07-28
CN102884082B (zh) 2015-05-20
CA2783514A1 (en) 2011-06-16
WO2011069797A1 (en) 2011-06-16
HRP20161401T1 (hr) 2016-12-16
PT2510006T (pt) 2017-01-20
CA2783678A1 (en) 2011-06-16
AP2012006343A0 (en) 2012-06-30
CN102858801A (zh) 2013-01-02
US20120315276A1 (en) 2012-12-13
RS55277B1 (sr) 2017-02-28
US9649374B2 (en) 2017-05-16
HRP20170016T1 (hr) 2017-02-24
KR101765968B1 (ko) 2017-08-08
SG181513A1 (en) 2012-07-30
ZA201204213B (en) 2014-08-27
TW201130506A (en) 2011-09-16
CA2783610C (en) 2018-10-30
PL2510002T3 (pl) 2017-02-28
WO2011069794A1 (en) 2011-06-16
WO2011069795A1 (en) 2011-06-16
TW201130507A (en) 2011-09-16
EP2510007A1 (en) 2012-10-17
EP2332995A1 (en) 2011-06-15
PT2510002T (pt) 2016-11-23
EP2567980A1 (en) 2013-03-13
JP2013513361A (ja) 2013-04-22
KR20120112527A (ko) 2012-10-11
KR20120112528A (ko) 2012-10-11
US20130022606A1 (en) 2013-01-24
CN102858804A (zh) 2013-01-02
CN102741291A (zh) 2012-10-17
EA028678B1 (ru) 2017-12-29
DOP2012000159A (es) 2012-09-30
TWI508744B (zh) 2015-11-21
BR112012014048B1 (pt) 2021-10-26
MA33888B1 (fr) 2013-01-02
PE20121360A1 (es) 2012-10-11
EP2570435A1 (en) 2013-03-20
IL220149A (en) 2017-09-28
EP2510002B1 (en) 2016-08-24
PE20171134A1 (es) 2017-08-09
CY1118209T1 (el) 2017-06-28
PH12012501131A1 (en) 2017-08-23
AU2010330161A1 (en) 2012-07-05
JP2013513364A (ja) 2013-04-22
BR112012015852A8 (pt) 2017-06-27
AU2010330161B2 (en) 2015-07-09
HK1180700A1 (en) 2013-10-25
CA2783513C (en) 2018-08-14
CU20120093A7 (es) 2012-10-15
HK1180354A1 (en) 2013-10-18
CY1118407T1 (el) 2017-06-28
LT2510006T (lt) 2016-12-12
SI2510006T1 (sl) 2017-02-28
AU2010330165B2 (en) 2015-07-16
DK2510002T3 (en) 2016-11-28
BR112012015852A2 (pt) 2017-05-23
AR079349A1 (es) 2012-01-18
TW201138817A (en) 2011-11-16
EP2567978A1 (en) 2013-03-13
TW201130504A (en) 2011-09-16
ZA201204214B (en) 2014-08-27
CA2783513A1 (en) 2011-06-16
WO2011069798A1 (en) 2011-06-16
AR079641A1 (es) 2012-02-08
IL220149A0 (en) 2012-07-31
TW201130505A (en) 2011-09-16
LT2510002T (lt) 2016-11-25
ME02577B (me) 2017-06-20
DOP2012000160A (es) 2012-09-30
EP2510006B1 (en) 2016-11-09
IN2012DN05078A (sr) 2015-10-23
US20130272968A1 (en) 2013-10-17
MX2012006620A (es) 2012-06-21
EP2570436A1 (en) 2013-03-20
EA029327B1 (ru) 2018-03-30
CN102947338A (zh) 2013-02-27
DK2510006T3 (en) 2017-01-23
EP2510002A1 (en) 2012-10-17
EP2510004A1 (en) 2012-10-17
AR079348A1 (es) 2012-01-18
PL2510006T3 (pl) 2017-06-30
EP2510006A1 (en) 2012-10-17
EP2567977A1 (en) 2013-03-13
IL220151A0 (en) 2012-07-31
PE20121561A1 (es) 2012-11-25
CL2012001540A1 (es) 2013-01-18
CN102947338B (zh) 2015-11-25
HUE030143T2 (en) 2017-04-28
JP2013513365A (ja) 2013-04-22
CA2783651A1 (en) 2011-06-16
SI2510002T1 (sl) 2016-12-30
NZ600511A (en) 2014-01-31
NZ600512A (en) 2014-11-28
TN2012000294A1 (en) 2013-12-12
WO2011069795A4 (en) 2011-08-18
US20120321632A1 (en) 2012-12-20
CL2012001539A1 (es) 2012-10-12
ES2603352T3 (es) 2017-02-27
WO2011069799A1 (en) 2011-06-16
BR112012014048A2 (pt) 2017-10-31
AR079352A1 (es) 2012-01-18
TWI487536B (zh) 2015-06-11
CR20120312A (es) 2012-08-27
AR079350A1 (es) 2012-01-18
BR112012015852B8 (pt) 2021-05-25
CN102884082A (zh) 2013-01-16
SG181511A1 (en) 2012-07-30
EA201200851A1 (ru) 2013-01-30
CA2783654A1 (en) 2011-06-16
CN102858803A (zh) 2013-01-02
ECSP12011965A (es) 2012-07-31
EA201200860A1 (ru) 2013-01-30
IN2012DN05082A (sr) 2015-10-09
ES2610654T3 (es) 2017-04-28
CA2783610A1 (en) 2011-06-16
US20130129739A1 (en) 2013-05-23
JP6199930B2 (ja) 2017-09-20
MX339343B (es) 2016-05-20
JP2013513362A (ja) 2013-04-22
JP2013513559A (ja) 2013-04-22
CU23973B1 (es) 2013-12-27
US20130171147A1 (en) 2013-07-04
GT201200186A (es) 2014-01-06
AU2010330165A1 (en) 2012-07-19
AR079351A1 (es) 2012-01-18
PH12012501129A1 (en) 2012-11-05
JP2013513363A (ja) 2013-04-22
MX2012006621A (es) 2012-10-05
US9241989B2 (en) 2016-01-26
BR112012015852B1 (pt) 2020-12-29
JP6066474B2 (ja) 2017-01-25
JP2015180690A (ja) 2015-10-15
KR101790366B1 (ko) 2017-10-26
WO2011069796A1 (en) 2011-06-16
CR20120310A (es) 2012-08-01
EP2510003A1 (en) 2012-10-17
ECSP12011966A (es) 2012-07-31
CU20120092A7 (es) 2012-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2783513C (en) Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use
HK1172632A (en) Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use