RS55450B1 - Kompozicije koje sadrže lipazu, proteazu i amilazu za lečenje pankreatične insuficijencije - Google Patents

Description

OBLAST TEHNIKE PRONALASKA

[0001J Predmet ovog pronalaska su kompozicije za tretman stanja, uključujući pankreatičnu insuficijenciju. Kompozicije iz ovog pronalaska sadrže lipazu, proteazu i amilazu u određenom odnosu koji obezbeđuje dobre rezultate kod pacijenata, kao što su oni koji su oboleli od pankreatične insuficijencije. Ovaj pronalazak se takođe odnosi upotrebu ovih kompozicija u tretmanu pankreatične insuficijencije.

POREKLO PRONALAKA

[0002] Varenje čine fiziološki procesi kojima se uneta hrana razgrađuje u hranljive komponente koje se lako apsorbuju. Nakon unošenja, hrana prolazi kroz različite segmente gastrointestinalnog trakta i dolazi do varenja, prvenstveno digestivnim enzimima. Tri grupe enzima za varenje, esencijalnih za ovaj proces, uključuju lipaze (za varenje masti), proteaze (za varenje proteina) i amilaze (za varenje ugljenih hidrata).

[0003] Varenje hrane i apsorpcija hranljivih materija se odigrava u tankom crevu. U njemu se uneta hrana razgrađuje enzimima za varenje do nivoa koji dozvoljava laku apsorpciju. Najviše enzima za varenje luči pankreas i oni dospevaju u tanko crevo preko panreatičnog kanala.

[0004] Za pravilno varenje, ishranu i metabolizam je potrebno delovanje različitih egzokrinih i endokrinih činilaca pankreasa. U egzokrina delovanja pankreasa spada sekrecija proteina koji u tankom crevu funkcionišu kao enzimi za katalizu hidrolize masti u glicerol i masne kiseline, proteina u peptide i amino kiseline i ugljenih hidrata u dekstrine, disaharide i monosaharide, kao što je glukoza. Egzokrina pankreatična insuflcijencija (u daljem tekstu "pankreatična insuficijencija") je rezultat smanjenja pankreatične funkcije i može da bude izazvana brojnim kliničkim poremećajima. Na primer, pankreatična insuficijencija je povezana sa cističnim fibrozama, hroničnim pankreatitisom, akutnim pankreatitisom, kancerom pankreasa i Shwachmann-Diamond sindromom [E.P. DiMagno i saradnici, in hePancreas: Biology, Pathobiologv and Disease, 2d Ed., V. Liang i saradnici, eds., pp. 665-701 (1993)].

[0005]Kod pacijenata kod kojih postoji pankreatična insuficijencija, pankreas ne uspeva da produkuje i/ili luči dovoljne količine enzima za varenje kako bi se obezbedio normalni proces varenja, uključujući varenje masti, proteina i ugljenih hidrata. Kao rezultat, ovi pacijenti pate od malapsorpcije hranljivih materija. Kliničke manifestacije pankreatične insuficijencije obuhvataju abdominalne grčeve, nadutost, dijareju, steatoreju, mučninu i gubitak telesne težine.

[0006]Pankreatična insuficijencija je prisutna kod 89% pacijenata koji boluju od cistične fibroze [D. Borowitz i saradnici, "Use of Fecal Elastase-1 to Identifv Misclassification of Functional Pancreatic Status in Patients with Cvstic Fibrosis", J. Pediatr., 145, pp. 322-326

(2004)]. Cistična fibroza je autosomalni recesivni genetski poremećaj koji primarno utiče na gastrointestinalni i respiratorni sistem [S.M. Rowe i saradnici, "Mechanisms of Disease: Cvstic Fibrosis", N. Engl. J. Med., 352, pp. 1992-2001 (1995)]. Nenormalne količine i viskozitet mukusa koji se produkuju kod pacijenata sa cističnom fibrozom sprečavaju sekreciju dovoljnih količna enzima pankreasa. Smanjena zapremina pankreatične sekrecije dovodi do zgušnjavanja unutar panreatičnih kanala, sprečavajući izlazak enzima i bikarbonata u duodenum. Kao rezultat, pacijenti sa cističnom fibrozom i pankreatičnom insuficijencijom pate od poremećaja varenja i imaju značajnu malapsorpciju masti i proteina. Na primer, ovakvi pacijenti obično apsorbuju manje od 60% hranljivih masti [M. Kraisinger i saradnici, "Clinical Pharmacologv of Pancreatic Enzvmes in Patients with Cvstic Fibrosis and in vitro Performance of Microencapsulated Formulations", J. Clin. Pharmacol, 34, pp. 158-166

(1994)]. Ukoliko se ne leči, maldigestija i malapsorpcija kod pacijenata sa cističnom fibrozom dovode do neuhranjenosti, nesposobnosti da se poveća ili održi telesna težina i do smanjenja rasta kao i pogoršanja hronične gnojne bolesti pluća [K. Gaskin i saradnici, "Improved Respiratorv Prognosis in CF Patients with Normal Fat Absorption", J. Pediatr., 100, pp. 857-862 (1982); J.M. Littlewood i saradnici, "Control of Malabsorption in Cvstic Fibrosis", Paediatr. Drugs,45 2,pp. 205-222 (2000)].

[0007]Savremena standardna terapija za panreatičnu insuficijenciju se primarno zasniva na oralnoj primeni svinjske pankrelipaze koja sadrži smešu lipaze, tripsina, himotripsina, elastaze i amilaze. Mada suplementi svinjskog pankreatičnog enzima sadrže dovoljne količne amilaze, zabeleženo je da pacijenti sa cističnom fibrozom imaju normalne vrednosti amilaze [P.L. Townes i saradnici, "Amvlase Polvmorphism: Studies of Sera and Duodenal Aspirates in Normal Individuals and in Cvstic Fibrosis", Am. J. Hum. Genet, 28, pp. 378-389 (1976)]. U skladu sa tim, veruje se da amilaza nema funkciju u povećanju digestije polisaharida [E. Lebenthal i saradnici, "Enzvme Therapv for Pancreatic Insufiiciency: Present Status and Future Needs," Pancreas, 9, pp. 1-12 (1994)]. Lipaza, proteaza i amilaza komponente su u svinjskim pankreatičnim suplementima obično u odnosu 1:3.5:3.5.

[0008]Suplementi pankreatičnog enzima se obično primenjuju oralno uz obrok. Kako ovi suplementi prolaze kroz sredinu sa niskim pH stomaka, njihova enzimska aktivnost se rapidno smanjuje. Kao rezultat toga, velike količine koncentrata enzima (ponekad čak i do 15 kapsula ili tableta po obroku) su potrebne da se osigura daje prisutna dovoljna aktivnost enzima u proksimalnom delu creva kako bi se prevazišla pankreatična insuficijencija.

[0009]Iz razloga što proteaza i lipaza mogu da postanu ireverzibilno inaktivirane u kiseloj sredini želuca, na produkte pankrelipaze se primenjuju tehnologije enteričnog oblaganja kako bi se enzimi zatvorili u mikročesticama ili se ovi produkti tretiraju zaštitnim enteričkim omotačem na drugi način. Mada ovakvo enteričko oblaganje poboljšava profil produkta, i dalje su potrebne velike količine suplemenata da se dobije terapeutska korist [J.H. Meyer, in Pancreatic Enzvmes in Health and Disease, P.G. Lankisch, ed., pp. 71-88 (1991)]. Predstavljena je linija visoko efikasnog produkta pankrelipaze (Ultrase®), sa ciljem da se smanje količine tableta ili kapsula potrebnih za lečenje pankreatične insuficijencije. Međutim, 1991. godine udruženje obolelih od cistične fibroze Sjedinjenih Država, zajedno sa FDA, je prijavilo više slučajeva fibrozne kolonopatije kod dece sa cističnom fibrozom koja su uzimala ove visoko efikasne produkte [S.C. Fitzsimmons i saradnici, "High-Dose Pancreatic-Enzvme Supplements and Fibrosing Colonopathy in Children with Cystic Fibrosis", N. Engl. J. Med., 336, pp. 1283-1289 (1997)]. Kod ovih pacijenata, fibroze kolona su izazvale suženja što je često zahtevalo hiruršku intervenciju, a u nekim slučajevima koloktomiju.

[0010]Kao način za smanjenje dnevnih doza pankreatičnih enzima, FDA je izbacila visoko efikasne produkte (definisane kao više od 2,500 USP jedinica po kg telesne težine) sa tržišta [D.S. Borowitz i saradnici, "Use of Pancreatic Enzvme Supplements for Patients with Cystic Fibrosis in the Context of Fibrosing Colonopathy", J. Pediatr., 127, pp. 681-684 (1995)]. Pored toga, udruženje obolelih od cistične fibroze Sjedinjenih Država, zajedno sa FDA, je predložilo detaljno ispitivanje karakteristika kompleksa ekstrakta svinjskih enzima [TdJ. Stručna komisija je takođe preporučila ispitivanje alternativnih, kiselo-stabilnih lipaza.

[0011]Bez obzira da lije ili nije dati suplement pankreatičnog enzima enterično obložen, bioraspoloživost ovakvih suplemenata se veoma razlikuje, zbog razlika u kiselosti creva kod samih pacijenata. Kao rezultat, brojni pacijenti uzimaju lekove koji menjaju pH, kao što su blokeri histamin-2 (H2) receptora i inhibitori protonske pumpe (PPI), kako bi poboljšali kliničku efikasnost enzimskih suplemenata [P.G. Lankish, "Enzvme Treatment of Exocrine Pancreatic Insufficiencv in Chronic Pancreatitis', Digestion, 54 (Supp. 2), pp. 21-29 (1993); D. Y. Graham, "Pancreatic Enzvme Replacement: the Effect of Antacids or Cimetidine", Dig. Dis. Sci., 27, pp. 485-490 (1982); J.H. Saunders i saradnici, "Inhibition of Gastric Secretion in Treatment of Pancreatic Insufficiencv", Br. Med. J., 1, pp. 418-419 (1977); H.G. Heijerman i saradnici, "Omeprazole Enhances the Efficacv of Pancreatin (Pancrease) in Cvstic Fibrosis", Ann. Inter. Med., 114, pp. 200-201 (1991); M.J. Bruno i saradnici, "Comparative Effects of Adjuvant Cimetidine and Omprazole during Pancreatic Enzvme Replacement Therapv", Dig. Dis. Sci., 39, pp. 988-992 (1994)].

[0012]Razlike u smislu potencije i farmaceutskih osobina i nedostatak stabilnosti su takođe identifikovani kao važni faktori koji utičnu na loš odgovor nekih pacijenata na uobičajene suplemente pankreatičnih enzima [CL. Chase i saradnici, "Enzvme Content and Acid Stabilitv of Enteric-Coated Pancreatic Enzvme Products in vitro", Pancreas, 30, pp. 180-183

(2005); D.S. Borowitz i saradnici, J. Pediatr., 127,supra;CJ. Povvell i saradnici, "Colonic Toxicity from Pancreatins: a Contemporary Safety Issue", Lancet, 353, pp. 911-915 (1999); E. Lebenthal i saradnici, "Enzvme Therapy for Pancreatic lnsufficiency: Present Status and Future Needs", Pancreas, 9, pp. 1-12 (1994); P. Regan i saradnici, "Comparative Effects of Antacids, Cimetidine and Enteric Coating on the Therapeutic Response to Oral Enzvmes in Severe Pancreatic Insufficiency", N. Eng. J. Med., 297, pp. 854-858 (1977)]. Tu spadaju razlike u aktivnosti enzima od serije do serije, mogućnost da se vremenom izgubi aktivnost zbog izlaganja sunčevoj svetlosti, toploti ili vlažnosti i nedovoljno definisan profil neželjenih reakcija [D.S. Borowitz i saradnici, J. Pediatr., 127,supra].Ostali faktori koji komplikuju terapiju pankreatične insuficijencije obuhvataju razlaganje dodatih enzima u želudačnom soku i/ili intraluminalnim proteazama, asinhronim pražnjenjem enzimskog suplementa iz želuca i hranljivim sastojcima obroka i odlaganje oslobađanja enzima iz enterično-obloženih preparata [P.G. Lankish, Digestion, 54supra;P. Regan i saradnici, N. Eng. J. Med., 297,supra].

[0013]Zbog problema sa potencijom, stabilnošću i bioraspoloživošću koji su karakteristični za uobičajene suplemente pankreatičnih enzima, predložena je upotreba mikrobiološki dobijenih enzima kao alternativa enzimima dobijenih od svinje. Na primer, United States patent 6,051,220 opisuje kompozicije koje uključuju jednu ili više kiselo stabilnih lipaza i jednu ili više kiselo stabilnih amilaza, koje obe potiču od gljiva. United States patentna prijava 2004/0057944 opisuje kompozicije koje sadržeRhizopusdelemar lipazu,Aspergillus melleusproteazu iAspergillus oryzaeamilazu. United States patentna prijava 2001/0046493 opisuje kompozicije koje sadrže unakrsno udvojenu kristalnu bakterijsku lipazu, zajedno sa gljivičnom ili biljnom proteazom i gljivičnom ili bakterijskom amilazom.

[0014]Uprkos ovakvim rezultatima, i dalje postoji potreba za optimizovanjem doznih formulacija kako bi se dalje poboljšala i efikasnost suplemenata pankreatičnih enzima i saglasnost pacijenata. Cilj da se pronađe suplement pankreatičnog enzima koji ispoljava najveću efikasnost pri najnižoj dozi i koji se karakteriše dobro definisanim profilom sigurnosti, je od velike važnosti za sve pacijente koji boluju od pankreatične insuficijencije, uključujući one iz grupe sa cističnom fibrozom.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0015]Cilj ovog pronalaska su kompozicije i njihova upotreba u tretmanu stanja, uključujući pankreatičnu insuficijenciju. U skladu sa preferiranim otelotvorenjem, kompozicije iz ovog pronalaska se karakterišu unakrsno udvojenom kristalnom mikrobiološkom lipazom, mikrobiološkom proteazom i mikrobiološkom amilazom, u odnosu od približno 1.0:1.0:0.15 USP jedinica aktivnih enzima, kako je dato u patentnom zahtevu 1. Kao prednost, karakteristika ovih kompozicija su stabilne komponente enzima koje osiguravaju in vivo oslobađanje aktivnog enzima u gastrointestinalnom traktu i na taj način omogućavaju režim lečenja pankreatične insuficijencije sa malom efektivnom dozom.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0016]Slika 1 ilustruje promenu prosečnog koeficijenta apsorpcije masti ("CFA"), u poređenju sa početnom vrednošću, kod pacijenata tretiranih sa kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom u toku Faze 2 studije. Slika 2 ilustruje promenu prosečnog koeficijenta apsorpcije azota ("CNA"), u poređenju sa početnom vrednošću, kod pacijenata tretiranih sa kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom u toku Faze 2 studije. Slika 3 ilustruje korelaciju između koeficijenta apsorpricje masti ("CFA") i koeficijenta apsorpcije azota ("CNA") pri početnim vrednostima, kod pacijenata tretiranih sa kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom u toku Faze 2 studije. Slika 4 ilustruje korelaciju između koeficijenta apsorpcije masti ("CFA") i koeficijenta apsorpcije azota ("CNA") na nivou tretmana, kod pacijenata tretiranih sa kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom u toku Faze 2 studije. Slika 5 ilustruje razliku korelacije između koeficijenta apsorpcije masti ("CFA") i koeficijenta apsorpcije azota ("CNA") na nivoima tretmana i početne vrednosti, kod pacijenata tretiranih sa kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom u toku Faze 2 studije. Slika 6 ilustruje promenu prosečnog koeficijenta apsorpcije masti ("CFA"), u poređenju sa početnom vrednošću, kod pacijenata sa cističnom fibrozom tretiranih sa različitim dozama u skladu sa ovim pronalaskom u toku Faze 1 studije. Slika 7 ilustruje promenu u prosečnom koeficijentu apsorpcije azota ("CFA"), u poređenju sa početnom vrednošću, kod pacijenata tretiranih sa različitim dozama u skladu sa ovim pronalaskom u toku Faze 1 studije.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0017]Ovaj pronalazak se odnosi na otkriće da su kompozicije koje uključuju lipazu, proteazu i amilazu, u odnosu od približno 1.0:1.0:0.15 USP jedinica aktivnosti enzima, efikasne za lečenje stanja, uključujući pankreatičnu insuficijenciju. Jedinični odnos lipaze prema proteazi prema amilazi omogućava tretman ovih stanja u režimu terapije sa malom dozom koji nije moguć sa uobičajenim suplementima pankreatičnih enzima dobijenih od svinja. Osim toga, ovaj odnos lipaze, proteaze i amilaze izbegava visoku koncentraciju proteaze za koju se smatra, u uobičajenim suplementima enzima, daje odgovorna za fibroznu kolonopatiju [D.S. Borowitz i saradnici, J. Pediatr., 127,supra].

[0018]Kompozicije iz ovog pronalaska uključuju lipazu, proteazu i amilazu u odnosu od približno 1.0:1.0:0.15 USP jedinica aktivnosti enzima, pri čemu je lipaza unakrsno udvojena krisalisana Burkholderia cepacia lipaza, proteaza je kristalisana Aspergillus melleus proteaza a amilaza je amorfna Aspergillus orvzae amilaza.

Definicije

[0019]Treba da se razume da naredni nazivi, ukoliko nije drugačije navedeno, imaju sledeća značenja:

[0020]Naziv "amorfan" se odnosi na bilo koje stanje koje nije stanje kristala, kristalina ili polu-kristalina. Amorfne materije uključuju amorfne čvrste supstance i tečnosti.

[0021]Naziv "kristal" ili "kristalin" se odnosi na jedan oblik čvrstog stanja materije koji uključuje atome uređene u oblik koji se periodično ponavlja u tri dimenzije [videti, na primer, Barrett, Structure of Methals, 2nd ed., (1952)]. Kristalni ili kristalin oblik enzima se razlikuje od njegovog amorfnog ili polu-kristalnog oblika. Kristali pokazuju karakteristične osobine, uključujući strukturu rešetke, karakteristične oblike i optičke osobine kao što je, na primer, indeks refrakcije.

[0022]Naziv "polu-kristalin" se odnosi na čvrsto stanje materije koja ima i kristalne i amorfne regione.

[0023]Naziv "subjekt", "pacijent" ili "pojedinac" se odnosi na bilo kog sisara, uključujući bilo koju životinju koja je klasifikovana kao sisar, uključujući ljude i druge primate.

[0024]Naziv "maldigestija" se odnosi na poremećenu razgradnju hranljivih materija (kao što su masti, proteini i ugljeni hidrati) na svoje apsorptivne sastojke (mono, di- ili oligosaharide, amino kiseline, oligopeptide, masne kiseline i monogliceride). Maldigestija može da nastane zbog više stanja, uključujući pankreatičnu insuficijenciju.

[0025]Naziv "malapsorpcija" se odnosi na poremećenu apsorpciju svarenih hranljivih sastojaka, uključujući vitamine i oligoelemente, u tankom ili debelom crevu. Malapsorpcija može da bude posledica smanjenog mukozalnog preuzimanja od strane sluzokože creva ili zbog određenih poremećaja varenja. Crevna malapsorpcija može da se javi za brojne hranljive sastojke ili za specifične makro hranljive sastojke, to jest, masti, proteine i ugljene hidrate, kao i za mikro hranljive sastojke kao što su kalcijum, magnezijum, gvožđe i vitamini. Malapsorpcija može da bude rezultat više stanja, uključujući pankreatičnu insuficijenciju. Malapsorpcija proteina je označena kao "azotoreja". Malapsorpcija masti je označena kao "steatoreja".

[0026]Naziv "lipaza" se odnosi na enzim koji katalizuje hidrolizu (to jest, razdvajanje hidroksilne grupe i atoma vodonika jedinjenja na fragmente, dodavanjem vode) lipida u glicerol i proste masne kiseline. Ova enzimatična reakcija obično zahteva jone kalcijuma (Ca<2+>). Lipaze koje luči pankreas su ekstremno važne za varenje masti (triglicerida) u gornjem zavoju tankog creva. U skladu sa pronalaskom, lipaza korisna u kompozicijama i njena upotreba u skladu sa ovim pronalaskom je ne-pankreatična lipazaBurkholderia cepacialipaza.

[0027] Generalno, mikrobiološke lipaze mogu da se izoluju iz svog nativnog mikrobiološkog izvora ili mogu da budu rekombinantne mikrobiološke lipaze dobijene tehnologijom rekombinantne DNK iz odgovarajuće ćelije domaćina, izabrane od bilo koje bakterije, kvasca, gljivice, biljke, insekta ili ćelija domaćina sisara u kulturi, preferirano iz bakterije. Rekombinantne lipaze obuhvataju ili su enkodirane nukleinskim kiselinama iz prirodno dobijenih sekvenci lipaze. Pored toga, rekombinantne lipaze uključuju sekvencu amino kiseline koja je homologna ili skoro potpuno identična sa prirodno dobijenom sekvencom kao i one lipaze enkodirane nukleinskom kiselinom koja je homologna ili skoro potpuno identična sa prirodno dobijenom nukleinskom kiselinom koja enkodira lipazu.

[0028] Naziv "proteaza" se odnosi na proteinazu, proteolitički enzim ili peptidazu, enzim koji katalizuje cepanje unutrašnjih amidnih veza peptida u proteinu. Preciznije, proteaze katalizuju konverziju proteina u njihove sastavne amino kiseline cepanjem amidne veze između karboksilne grupe jedne amino kiseline i amino grupe naredne. Proteaze se generalno identifikuju po svom katalitičkom tipu, na primer, peptidaze aspartanske kiseline, cistein (tiol) peptidaze, metalopeptidaze, serin peptidaze, treonin peptidaze, alkalin ili polu-alkalin proteaze, neutralne i peptidaze nepoznatog katalitičkog mehanizma (videti http:// merops. sanger. ac. uk). U skladu sa pronalaskom, proteaza korisna u kompozicijama i njihovoj upotrebi u skladu sa ovim pronalaskom je ne-pankreatična proteazaAspergillus melleusproteaze.

[0029] Generalno, mikrobiološke proteaze mogu da se izoluju iz svog nativnog mikrobiološkog izvora ili mogu da budu rekombinantne mikrobiološke proteaze dobijene tehnologijom rekombinantne DNK iz odgovarajuće ćelije domaćina, izabrane od bilo koje bakterije, kvasca, gljivice, biljke, insekta ili ćelija domaćina sisara u kulturi, preferirano iz gljivica. Rekombinantne proteaze obuhvataju ili su enkodirane nukleinskim kiselinama iz prirodno dobijenih sekvenci proteaze. Pored toga, rekombinantne proteaze uključuju sekvencu amino kiseline koja je homologna ili skoro potpuno identična sa prirodno dobijenom sekvencom kao i one proteaze enkodirane nukleinskom kiselinom koja je homologna ili skoro potpuno identična sa prirodno dobijenom nukleinskom kiselinom koja enkodira proteaze.

[0030] Naziv "amilaza" se odnosi na enzim koji se produkuje u pankreasu a takođe u pljuvačnim žlezdama kod ljudi ali ne kod svih sisara. Pljuvačna amilaza ljudi je poznata kao ptiajlin. Amilaza je glavni enzim varenja odgovoran za varenje ugljenih hidrata, na primer, polisaharida, katalizacijom konverzije dve komponente škroba (amiloza i amilo-pektin) u proste šećere u tankom crevu. Još preciznije, amilaza hidrolizuje škrob, glikogen i dekstrin u oblik glukoze, maltoze i ograničene dekstrine. Klinički, vrednosti amilaze u krvi su često povećane kod stanja akutnog i ponekad hroničnog pankreatitisa. Naziv "ne-pankreatične amilaze" se odnosi na amilaze koje nisu prečišćene iz humanog ili životinjskog pankreatičnog tkiva. U skladu sa ovim pronalaskokm, amilaza jeAspergillus oryzaeamilaza.

[0031]Mikrobiološke amilaze mogu da se izoluju iz svog nativnog mikrobiološkog izvora ili mogu da budu rekombinantne mikrobiološke amilaze dobijene tehnologijom rekombinantne DNK iz odgovarajuće ćelije domaćina, izabrane od bilo koje bakterije, kvasca, gljivice, biljke, insekta ili ćelija domaćina sisara u kulturi, preferirano iz bakterije. Rekombinantne amilaze obuhvataju ili su enkodirane nukleinskim kiselinama iz prirodno dobijenih sekvenci amilaze. Pored toga, rekombinantne amilaze uključuju sekvencu amino kiseline koja je homologna ili skoro potpuno identična sa prirodno dobijenom sekvencom kao i one amilaze enkodirane nukleinskom kiselinom koja je homologna ili skoro potpuno identična sa prirodno dobijenom nukleinskom kiselinom koja enkodira amilaze.

[0032]Nazivi "terapeutski efektivna doza" ili "terapeutski efektivna količina" se odnosi na onu količinu kompozicije koja dovodi do prevencije, do odlaganja ili početka siimptoma ili do poboljšanja simptoma stanja koje se tretira. Terapeutski efektivna količina je količina koja je dovoljna za lečenje, prevenciju, smanjenje ozbiljnosti, odlaganje početka ili smanjenje pojavljivanja jednog ili više simptoma stanja koje se tretira. Stanja koja mogu da se tretiraju upotrebom kompozicija iz ovog pronalaska obuhvataju, na primer, pankreatičnu insuficijenciju, malapsorpciju i maldigestiju.

[0033]Naziv "USP jedinica" se odnosi na jedinicu aktivnog enzima po farmakopeji Sjedinjenih Država prisutnu u sredstvu ili kompoziciji. Jedna USP jedinica lipaze, proteaze ili amilaze je definisana u Pancrelipase, USP, U.S. Pharmacopeia National Formularv, USP 24, pp. 1254-1255 (2000).

Karakteristike kompozicija iz ovog pronalaska

[0034]Kao prednost, kompozicije iz ovog pronalaska poboljšavaju apsorpciju masti, proteina i škroba kod pacijenata koji boluju od stanja kao što je, na primer, pankreatična insuficijencija, dovodeći do poboljšane ishrane i rasta. Kompozicije zadržavaju visok nivo specifične aktivnosti u kiseloj-pepsin sredini. Ovo se događa zbog njihovih enzimskih komponenti koje podnose kiselu sredinu gornjeg gastrointestinalnog trakta, uključujući nizak pH želuca i visoke vrednosti proteaze gastrointestinalnog trakta, što omogućava enzimima da se u aktivnom obliku oslobode u crevima. Kao rezultat toga, kompozicije mogu da se primene u manjim količinama po dozi i manjem broju primena u poređenju sa suplementima pankreatičnih enzima svinje. Na ovaj način se znatno poboljšava saradnja pacijenta.

[0035]Osim toga, kompozicije iz ovog pronalaska mogu da se primene na subjektu bez potrebe za enteričnim oblaganjem ili dodavanja kiselo-supresujućih sredstava. Do ovoga dolazi zato što su mikrobiološki dobijene komponente enzima korišćene u različitim otelotvorenjima kompozicije iz ovog pronalaska mnogo stabilnije na kiselinu stomaka nego pankreatični enzimi svinje.

Lipaza komponenta

[0036]Lipaza komponenta kompozicije iz ovog pronalaska jeBurkholderia cepacialipaza.

[00371Lipaza je preferirano ona koja je stabilna u sredini kiselog pH i/ili ona koja je rezistentna na proteolitičku degradaciju. Lipaza se koristi u obliku koji dozvoljava njenu pojačanu stabilnost u kiselom pH i/ili njenu rezistenciju na proteolitičku degradaciju. U tom smislu, lipaza je u obliku unakrsno udvojenih kristala.

Kristalizacija lipaze

[0038]Kristali lipaze korisni u kompozicijama iz ovog pronalaska mogu da se dobiju koristeći uobičajene postupke, kao što je kristalizacija mase. Videti, na primer, United States patent 6,541,606. Alternativno, kristali lipaze mogu da se dobiju kontrolisanom precipitacijom proteina iz vodenog rastvora ili iz vodenog rastvora koji sadrži organske rastvarače. Videti, na primer, United States patent 5,618,710 i United States patentnu prijavu 2003/0017144. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će znati da u toku kristalizacije treba da se kontrolišu uslovi u koje spadaju, na primer, brzina evaporacije rastvarača, prisustvo odgovarajućih ko-rastvarača i pufera, pH i temperatura.

[0039]Kristali lipaze mogu da se produkuju kombinacijom enzima lipaze koji treba da se kristališe sa odgovarajućim rastvaračem ili vodenim rastvaračem koji sadrži odgovarajuća sredstva za precipitaciju, kao što su soli ili organska sredstva. Rastvarač se kombinuje sa lipazom i opciono podvrgne mešanju na temperaturi za koju je eksperimentalno određeno da odgovara započinjanju kristalizacije i koja je prihvatljiva za održavanje stabilnosti i aktivnosti proteina. Rastvarač može opciono da uključi ko-rastvarače, kao što su dvovalentni katjoni, ko-faktori ili ksaotropi, kao i vrste pufera za kontrolu pH. Eksperimentalno mogu da se odrede potrebne koncentracije ko-rastvarača kako bi se omogućila kristalizacija. Za procese u industriji, kontrolisana precipitacija koja dovodi do kristalizacije najbolje se izvodi jednostavnom kombinacijom proteina precipitanta, ko-rastvarača ili opciono, pufera u procesu na veliko. Alternativno, mogu takođe da se koriste laboratorijski postupci kristalizacije kao što su dijaliza i difuzija uparavanjem. McPherson i saradnici, Methods Enzvmol., 114, pp. 112-120 (1985) i Gilliland, J. Crvstal Grovvth, 90, pp. 51-59 (1988) uključuju sveobuhvatnu listu odgovarajućih uslova u literaturi kristalizacije. Povremeno, inkopatibilija između medijuma za kristalizaciju i unakrsnog veziva mogu da zahtevaju promenu pufera ili rastvarača pre unakrsnog udvajanja.

[0040]Lipaza kristališe pod brojnim uslovima, uključujući pH u rasponu od približno 4-9. Za izradu lipaza komponente kompozicija iz ovog pronalaska, odgovarajući precipitanti uključuju izopropanol, terc-butanol, 2-metil-2,4-pentandiol (MPD), amonijum sulfat, natrijum hlorid, magnezijum hlorid i druge poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici. U odgovarajuće soli spadaju dvovalentni ili monovalentni katjoni i njihove soli.

[0041]Kristali lipaze pogodni u kompozicijama iz ovog pronalaska mogu da imaju dužinu između približno 0.01 um i približno 500 um, alternativno između približno 0.1 um ili između približno 50 um, ili između približno 0.1 um i približno 10 um. Njihov oblik može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od sfera, iglica, šipki, ploča, kao što su heksagoni i kvadrati, romboidi, kocke, piramide i prizme.

Unakrsno udvajanje kristla lipaze

[0042]Kada je dobijanje kristala lipaze u pogodnom medijumu završeno, mogu da se unakrsno udvoje. Rezultat unakrsnog udvajanja je stabilizacija kristalne rešetke uvođenjem kovalentnih veza između molekula proteina konstituenata kristala. Ovo omogućava transfer enzima u drugačiju sredinu koja za dati enzim može, s druge strane, da bude inkopatibilna sa postojanjem kristalne rešetke ili intaktnog enzima.

[0043]Kao rezultat unakrsnog udvajanja kristala lipaze, mogu da budu izmenjeni enizmatička stabilnost (na primer, pH, temperatura, mehanička i/ili hemijska stabilnost), pH profil aktivnosti lipaze, rastvorljivost, ujednačenost veličine ili zapremine kristala, brzina oslobađanja lipaze iz kristala i/ili veličina i oblik pora između pojedinačnih molekula enzima u određenoj kristalnoj rešetki.

[0044]Kao prednost, unakrsno udvajanje se izvodi na takav način da nastali unakrsno udvojeni kristali uključuju lipazu koja ispoljava najmanje približno 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% ili 99.9% ili više aktivnosti lipaze u poređenju sa nemodifikovanom lipazom. Stabilnost može da se poveća za najmanje približno 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%o ili više, u poređenju sa nemodifikovanom lipazom. Stabilnost može da se meri pod uslovima čuvanja, na primer, kao što su stabilnost pH, stabilnost temperature, stabilnost u odnosu na proteazu, uključujući gastrointestinalne proteaze i Pronase™, stabilnost rastvorljivosti ili kao in vivo biološka stabilnost.

[0045]U izvesnim slučajevima, unakrsno udvajanje kristala lipaze usporava rastvaranje lipaze u rastvoru, efikasno imobilišući molekule enzima u mikrokristalne partikule. Nakon što su izloženi aktiviranju u sredini koja okružuje unakrsno udvojene kristale lipaze, kao što su uslovi za upotrebu koji se razlikuju od čuvanja, kristali lipaze se rastvore oslobađajući polipeptid lipaze i/ili povećavajući aktivnost lipaze. Brzina rastvaranja može da se kontroliše jednim ili više od sledećih faktora, na primer: stepenom unakrsnog udvajanja, dužinom vremena izlaganja kristala lipaze sredstvu za unakrsno udvajanje, brzinom dodavanja sredstva za unakrsno udvajanje u kristale lipaze, prirodom sredstva za unakrsno udvajanje, dužinom lanca sredstva za udvajanje, pH, temperaturom, prisustvom sulfahidril reagenasa, kao što su cistein ili glutation, površinom oblasti unakrsno udvojenih kristala lipaze, veličinom unakrsno udvojenih kristala lipaze ili oblikom unakrsno udvojenih kristala lipaze.

[0046]Kristali lipaze mogu da se unakrsno udvoje upotrebom jednog ili kombinacije sredstava za unakrsno udvajanje, uključujući multifunkcionalna sredstva za unakrsno udvajanje, uključujući bifunkcionalne reagense u isto vreme (paralelno) ili u delovima. U različitim otelotvorenjima, unakrsne veze između kristala lipaze se smanjuju ili slabe nakon izlaganja aktivatoru u postojećoj sredini ili nakon izvesnog vremenskog perioda; što dovodi do rastvaranja lipaze ili oslobađanja aktivnosti. Alternativno, unakrsne veze mogu da se pokidaju na mestu vezivanja, što dovodi do rastvaranja proteina ili oslobađanja aktivnosti. Videti, na primer, United States patente 5,976,529 i 6,140,475. Unakrsno udvajanje može da se izvede u skladu sa bilo kojom uobičajenom tehnikom unakrsnog udvajanja.

[0047]Finalna koncentracija sredstva za udvajanje u unakrsno udvojenim kristalima lipaze treba da bude u rasponu između približno 0.001 mM i približno 300 mM, preferirano između približno 1.0 mM i približno 50 mM, a najpoželjnije između približno 2.0 mM i približno 5.0 mM.

[0048]U skladu sa preferiranim oteleotvorenjem ovog pronalaska, sredstvo za unakrsno udvajanje je bis(sulfosukcinimidil) suberat ("BS<3>"). U druga korisna sredstva za unakrsno udvajanje spadaju glutaraldehid, sukcinaldehid, oktan-dialdehid i glioksal. U druga multifunkcionalna sredstva za unakrsno udvajanje spadaju halo-triazini, na primer, cijanurik hlorid; halo-pirimidini, na primer, 2,4,6-trihlor/brom-pirimidin; anhidridi ili halidi alifatičnih ili aromatičnih mono- ili di-karboksilnih kiselina; na primer, maleik anhidrid, (met)akriloil hlorid, hloroacetil hlorid; N-metiloil jedinjenja, na primer, N-metiloil hloro acetamid; di-izocijanati ili diizotiocijanati, na primer, fenilen-l,4-di-izocijanat i aziridini. U druga sredstva za unakrsno udvajanje spadaju epoksidi, kao što su, na primer, di-epoksidi, tri-epoksidi i tetra-epoksidi. Za reprezentativni listing drugih raspoloživih sredstava za unakrsno udvajanje videti, na primer, 2003-2004 izdanje Pierce Chemical Companv Catalog. Drugi primeri sredstava za unakrsno udvajanje obuhvataju: dimetil 3, 3'-ditiobispropionimidat HCl (DTBP); ditiobis (sukcinimidilpropionat) (DSP); bismaleimidoheksan (BMH); 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (DFDNB); dimetilsuberimidat-2HCl (DMS); disukcinimidil glutarat (DSG); disulfosukcinimidil tartarat (Sulfo-DST); l-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid hidrohlorid (EDC); etilen glikolbis [sulfosukcinimidilsukcinat] (Sulfo-EGS); N-[y-maleimidobutiriloksi]sukcinimid estar (GMBS); N-hidroksisulfosukcinimidil-4-azidobenzoat (Sulfo-HSAB); sulfosukcinimidil-6-[a-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]heksanoat (Sulfo-LC-SMPT); bis-[p-(4-azidosalicilamido)etil]disulfid (BASED); i NHS-PEG-Vinilsulfon

(NHS-PEG-VS).

[0049]Takođe mogu da se koriste reverzibilna sredstva za unakrsno udvajanje. Ovakva reverzibilna sredstva za unakrsno udvajanje su multifunkcionalna sredstva za unakrsno udvajanje u kojima je aktivator inkorporiran kao posebna grupa. Reaktivna funkcionalna grupa je uključena u udvajanje reaktivne amino kiseline bočnog lanca u proteinu i aktivatora koji sadrži vezu koja može da se prekine izmenom jednog ili više uslova u postojećoj sredini (na primer, pH, prisustvo redukcionog sredstva, temperatura ili termodinamička aktivnost vode).

[0050]Sredstvo za unakrsno udvajanje može da bude homofunkcionalno ili heterofunkcionalno. Reaktivna funkcionalna grupa (ili ostatak) može, na primer, da bude izabrana od jedne od narednih funkcionalnih grupa ( gde R, R', R" i R'" mogu da budu alkil, aril ili hidrogen grupe): I. Reaktivni acil donorsi, kao što su, na primer: karboksilatni estri RCOOR', amidi RCONHR', acil azidi RCON3, karbodiimidi R-N=C=N-R', N-hidroksiimidni estri, RCO-O-NR', imidoestri R-C=NH<2+>(OR'), anhidridi RCO-C-COR', karbonati RO-CO-O-R', uretani RNHCONHR', kiseli halidi RCOHal (gde je Hal= halogen), acil hidrazidi RCONNR"R" i O-acilizoureatiRCO-0-C=NR'(-NR"R"'). II. Reaktivne karbonilne grupe, kao što su, na primer: aldehidi RCHO i ketoni RCOR', acetali RCO(H2)R' i ketali RR'CChR'R" (reaktivni karbonil koji sadrži karbonilne grupe poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici za imobilizaciju i unakrsno udvajanje proteina (Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Companv 2003-2004; S.S. Wong, Chemistrv of Protein Conjugation and Cross-linking, (1991). III. Alkil ili aril donorsi, kao što su, na primer: alkil ili aril halidi R-Hal, azidi R-N3, sulfatni estri RSO3R', fosfatni estri RPO(OR'3), alkiloksonijum soli R30<+>, sulfonijum R3S<+>, nitratni estri RONO2, Michael-ovi akceptori RCR'=CR"'COR", aril fluoridi ArF, izonitrili RN<+>=C-, haloamini R2N-Hal, alkeni i alkini. IV. Grupe koje sadrže sumpor, kao što su, na primer: disulfidi RSSR', sulfhidrili RSH i epoksidi R2COCR'2. V. Soli, kao što su, na primer: alkil ili aril amonijum soli R}N<+>, karboksilati RCOO-, sulfat ROSO3-, fosfat ROPO3" i amini R3N.

[0051]Reverzibilna sredstva za unakrsno udvajanje uključuju, na primer, aktivator. Aktivator obuhvata alkil, aril ili drugi lanac sa aktivirajućom grupom koja može da reaguje sa proteinom koji treba unakrsno da se udvoji. Ove reaktivne grupe mogu da budu različite grupe, kao što su one osetljive na nukleofiliju, slobodne radikale ili elektrofilno premeštanje, uključujući halide, aldehide, karbonate, uretane, ksntane i epokside, između ostalih. Na primer, reaktivne grupe mogu da budu labilne na kiselinu, bazu, fluorid, enzim, redukciju, oksidaciju, tiol, metal, fotolizu, radikal ili toplotu.

[0052]Unakrsno udvojeni kristal lipaze može da se dobije u praškastom obliku, na primer, liofilizacijom ili sušenjem raspršivanjem. Liofilizacija ili sušenje zamrzavanjem omogućava da se voda izdvoji iz kompozicije, da se dobije kristal koji može da se čuva na sobnoj temperaturi duži vremenski period a nakon toga jednostavno rekonstituiše u izabranom vodenom, organskom ili smeši vodeno-organskog rastvarača, bez formiranja amorfnih suspenzija i sa malim rizikom od denaturacije. Carpenter i saradnici, Pharm. Res., 14, pp. 969-975 (1997). Liofilizacija može da se izvrši postupkom koji je opisan u United States patentu 5,618,710, ili bilo kojim drugim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, unakrsno udvojeni kristal lipaze se prvo zamrzne a nakon toga podvrgne visokom vakuumu u kome kristalna voda sublimiše ostavljajući kristale lipaze koji sadrže samo čvrsto vezane molekule vode.

Karakteristike unakrsno udvojenih kristala lipaze

[00531Enzimatička aktivnost unakrsno udvojenih kristala lipaze može da se meri bilo kojim uobičajenim postupkom. Na primer, aktivnost lipaze može da se odredi spektrofotometrijski kako je opisano u Primeru 6 United States patenta 5,618,710. Aktivnost lipaze može da se proceni praćenjem hidrolize supstrata p-nitrofenil acetata. Cepanje supstrata se prati povećanjem apsorpcije na 400 nm, sa inicijalnom koncentracijom supstrata od 0.005% i početnom koncentracijom enzima od 1.5 x IO"<8>M. Enzim lipaze se doda u 5 ml reaktivne zapremine koja sadrži supstrat u 0.2 M Tris pH 7.0, na sobnoj temperaturi. Pre merenja apsorpcije, kristalisana lipaza se centrifugiranjem ukloni iz reaktivne smeše.

[0054]Alternativno, aktivnost lipaze može da se meriin vitrohidrolizom u maslinovom ulju, kako je opisano u Primerima 2-4 United States patenta 5,614,189.

[0055]Aktivnost lipaze može takođe da se meriin vivo.Na primer, mala zapremina (približno 3 ml) maslinovog ulja ili kukuruznog ulja može da se obeleži sa 99Tc-(V) tiocijanatom, a kristali lipaze mogu da se obeleže sa 11 'rn. Obeležena mast se meša sa hranom za životinje po kojoj su raspršeni obeleženi kristali lipaze. Scintigrafskim snimanjem proksimalnog i distalnog želuca i tankog creva je dobijeno daje <5% aktivnosti preostalo u želucu. Nakon toga se odrede krive pražnjenja za svaki od izotopa (na primer, procenat retencije u želucu u toku vremena) i količine izotopa koje su ušle u proksimalni, srednji i distalni deo tankog creva iz respektivnih regiona od interesa.

[0056]Preferirano, komponente unakrsno udvojene lipaze kompozicije iz ovog pronalaska imaju visoko specifičnu aktivnost. Visoko specifična aktivnost delovanja lipaze je obično ona koja pokazuje specifičnu aktivnost na triolein (maslinovo ulje) veću od 500, 1,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 ili više jedinica/mg proteina.

[0057]Preferirano, unakrsno udvojena komponenta lipaze kompozicije iz ovog pronalaska je tkođe stabilna duži vremenski period u nepovoljnom okruženju u gastrointestinalnim regionima, to jest, gastričnom, duodenalnom i intestinalnom regionu. Na primer, lipaza je preferirano stabilna u toku najmanje jedan sat pri kiselom pH, na primer, u sredini u kojoj je pH manji od 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5 ili manje. Kako se ovde koristi, "stabilan" označava daje kristal lipaze aktivniji od rastvorenog oblika lipaze za date uslove i vreme. Prema tome, stabilan kristal lipaze zadržava veći procenat svoje inicijalne aktivnosti nego odgovarajući rastvorni oblik lipaze. U nekim otelotvorenjima, kristal lipaze zadržava najmanje 10% svoje aktivnosti nakon izlaganja datim uslovima i vremenu. U drugim otelotvorenjima, lipaza zadržava najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više od svoje aktivnosti.

[0058]Alternativno, ili pored toga, kristal unakrsno udvojene lipaze kao komponenta kompozicije iz ovog pronalaska je rezistentan na toplotu. Na primer, u različitim otelotvorenjima, stabilan je najmanje jedan sat na 30°C, 37°C ili 40°C.

Proteaza komponenta

[0059]Proteaza komponenta kompozicije iz ovog pronalaska jeAspergillus melleusproteaza. U skladu sa preferiranim otelotvorenjem, proteaza komponenta kompozicije iz ovog pronalaska je u kristalnom, ne-unakrsno udvojenom obliku. Kristali proteaze mogu da se izrade u skladu sa tehnikama kristalizacije koji su prethodno opisani za lipazu, koristeći, na primer, etanol kao sredstvo za precipitaciju.

Amilaza komponenta

[0060]Amilaza komponenta kompozicija iz ovog pronalaska jeAspergillus oryzae,u amorfnom obliku ili obložena, ili enkapsulirana ili na drugi način formulisana tako da zadržava svoju aktivnost nakon oralne primene.

Kompozicije koje sadrže unakrsno udvojene kristale lipaze, proteazu i amilazu

[0061]U kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom spadaju one koje uključuju unakrsno udvojene kristale mikrobiološke lipaze, mikrobiološku proteazu i mikrobiološku amilazu, u odnosu od približno 1.0:1.0:0.15 USP jedinica aktivnog enzima kako se traži u patentnom zahtevu 1, zajedno sa jednim ili više ekscipijenata. Najpoželjnije, kompozicija uključuje kristaleBurkholderia cepaciaunakrsno udvojene sa BS-3 sredstvom za unakrsno udvajanje, kristaleAspergillus melleusproteaze i amorfnuAspergillus oryzaeamilazu; u odnosu od približno 1.0:1.0:0.15 USP jedinica aktivnosti enzima.

[0062]Unakrsnim udvajanjem lipaza komponente kompozicije iz ovog pronalaska obezbeđuje se dodatna stabilnost pri ekstremnim pH i zaštita od proteoliza, pri čemu proteaza i amilaza komponente zadržavaju maksimum solubilnosti za efikasno rastvaranje. Još preciznije, kristalizacija i unakrsno udvajanje lipaza komponente pomaže da se obezbedi kompozcija sa pojačanom enzimskom aktivnošću pri nižim dozama. Kristalni oblik proteaze takođe pomaže da se obezbedi povećana stabilnost, čistoća i potencija enzima.

[0063]I, nezavisno od svog oblika, jedna ili obe, proteaza i amilaza mogu da se unakrsno udvoje.

[0064]Kompozicije iz ovog pronalaska nesumljivo vode ka usklađenom povećanju koeficijenta apsorpcije masti i koeficijenta apsorpcije azota kod pacijenata kod kojih se primenjuje. Pored toga, kompozicije iz ovog pronalaska uključuju takav nivo amilaze koji obezbeđuje povećano varenje škroba i apsorpciju ugljenih hidrata kod tih pacijenata. Ovim pronalaskom je otkriveno da se ovakav efekat na varenje škroba i apsorpciju ugljenih hidrata može postići upotrebom manjih količina amilaze u odnosu na lipazu i proteazu nego u pankreatičnim suplementima svinje. Ovo otkriće je suprotno verovanju u tehnici da amilaza nije neophodna za tretman pankreatične insuficijencije, posebno kod pacijenata sa cističnom fibrozom.

[0065]Ekscipijenti pogodni u kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom služe kao punioci ili kombinacija punilaca, kao što su oni koji se koriste u farmaceutskim kompozicijama. U preferiranom otelotvorenju ovog pronalaska, ekscipijent uključuje mikrokristalnu celulozu, maltrin, krospovidon, koloidni silicijum dioksid, magnezijum stearat i talk. U narednu preferiranu grupu ekscipijenata spadaju pojedinačno ili smeše: saharoze, trehaloze, laktoze, sorbitola, laktitola, manitola, inozitola, soli natrijuma i kalijuma, kao što su acetatna, fosfatne, citratne i boratna so, glicin, arginin, polietilen oksid, polivinil alkohol, polietilen glikol, heksilen glikol, metoksi polietilen glikol, želatin, hidroksipropil-P-ciklodekstrin, polilizin i poliarginin.

[0066]Drugi preferirani ekscipijenti mogu da budu bilo koji ili smeše: ili a) amino kiseline, kao što su glicin, arginin, aspartanska kiselina, glutaminska kiselina, lizin, asparagin, glutamin, prolin; 2) ugljeni hidrati, na primer, monosaharidi kao što su glukoza, fruktoza, galaktoza, manoza, arabinoza, ksiloza, riboza; 3) disaharidi, kao što su laktoza, trehaloza, maltoza, saharoza; 4) polisaharidi, kao što su maltodekstrini, dekstrani, škrob, glikogen; 5) alditoli, kao što su manitol, ksilitol, laktitol, sorbitol; 6) glukuronska kiselina, galakturonska kiselina; 7) ciklodekstrini, kao što su metil ciklodekstrin, hidroksipropil-P-ciklodekstrin i slično; 8) neorganske molekule, kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid, magnezijum hlorid, fosfati natrijuma i kalijuma, borna kiselina, amonijum karbonat i amonijum fosfat; 9) organske molekule kao što su acetati, citrat, askorbat, laktat; 10) sredstva za emulgovanje ili solubilizaciju/stabilizaciju kao što su akacija, dietanolamin, glicerol monostearat, lecitin, monoetanolamin, oleinska kiselina, oleil alkohol, poloksamer, polisorbati, natrijum lauril sulfat, stearinska kiselina, sorbitan monolaurat, sorbitan monostearat i drugi derivati sorbitana, polioksil derivati, vosak, polioksietilen derivati, derivati sorbitana; ili) reagensi za povećanje viskoziteta kao što su agar, arginatna kiselina i njene soli, guar guma, pektin, polivinil alkohol, polietilen oksid, celuloza i njeni derivati, propilen karbonat, polietilen glikol, heksilen glikol, tiloksapol. Takođe mogu da se koriste soli ovih jedinjenja.

[0067] Dodatni primeri ekscipijenata su opisani u priručniku Pharmaceutical Excipients, koji su zajednički objavili American Pharmaceutical Association i Pharmaceutical Societv of Great Britain. U odnosu na kompozicije, u skladu sa ovim pronalaskom, ekscipijenti su neaktivni sastojci a lipaza, proteaza i amilaza su aktivni sastojci. Odnos aktivnih i neaktivnih sastojaka u kompozicijama iz ovog pronalaska na osnovu m/m može da bude između približno 1:9 do približno 9:1, preferirano između približno 1:6 do približno 6:1.

[0068] U alternativnom otelotvorenju ovog pronalaska, bilo koja od lipaza, proteaza ili amilaza komponenti može da bude prisutna u kompoziciji povezana sa polimernim nosačem. Ovim se obezbeđuje kiselo-rezistentno kontrolisano oslobađanje kompozicije, što dozvoljava oslobađanje enzima u efektivnim količinama i manjim dozama u crevo, to jest, distalni deo creva nakon oralnog uzimanja.

[0069] U korisne polimerne nosače spadaju, na primer, polimeri koji se koriste za enkapsulaciju kristala proteina za oslobađanje proteina, uključujući kontrolisano otpuštanje biološkim oslobađanjem. Ovakvi polimeri uključuju biokompatibilne i biodegradibilne polimere ili njihove smeše. Preferirano, polimerni nosač je biodegradibilini polimer. Brzina rastvaranja i prema tome, oslobađanje enzima se određuje posebnom tehnikom enkapsulacije, kompozicijom polimera, unakrsnim udvajanjem polimera, gustinom polimera, stabilnošću polimera, geometrijom kristala enzima i stepenom, ukoliko postoji, unakrsnog udvajanja enzima. U skladu sa jednim otelotvorenjem, komozicije iz ovog pronalaska su enkapsulirane unutar matriksa polimernog nosača, čime se obezbeđuje dalja zaštita za lipazu, proteazu i amilazu komponente od nepovoljne sredine gastrointestinalnog trakta.

Načini doziranja kompozicije, oblici, režimi i postupci za tretman

[0070]U skladu sa preferiranim otelotvorenjem, komopozicije iz ovog pronalaska su korisne za lečenje pankreatične insuficijencije kod bilo kog subjekta, uključujući i one koji boluju od cistične fibroze. U skladu sa alternativnim otelotvorenjem, kompozicije iz ovog pronalaska su korisne u postupcima za lečenje malapsorpcije kod subjekta. Naredna otelotvorenja iz ovog pronalaska uključuju upotrebu kompozicija iz ovog pronalaska za povećanje koeficijenta apsorpcije masti ili za povećanje koeficijenta apsorpcije azota kod subjekta. Naredno otelotvorenje ovog pronalaska obuhvata upotrebu ovih kompozicija za povećanje i koeficijenta apsorpcije masti i koeficijenta apsorpcije azota kod subjeketa, opciono za istu količinu. U narednom otelotvorenju, kompozicije iz ovog pronalaska su korisne za povećanje apsorpcije ugljenih hidrata kod subjekta.

[0071]Upotreba kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom uključuje primenu na subjektu terapeutski efektivne količine takve kompozicije. Bilo koja od kompozicija iz ovog pronalaska može da se koristi za lečenje bilo kog subjekta koji boluje od pankreatične insuficijencije, uključujući pacijente sa cističnom fibrozom. Slično tome, bilo koja od ovih kompozicija može da se koristi za lečenje bilo kog pacijenta sa cističnom fibrozom.

[0072]Upotreba kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata primenu na subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije iz ovog pronalaska, pri čemu ta terapeutski efektivna količina povećava koeficijenat apsorpcije masti kod tog subjekta za količinu između približno 30% i približno 35% u odnosu na početnu vrednost, kada je početna vrednost koeficijenta apsorpcije masti kod tog subjekta manja od ili jednaka sa 40%>. Preferirano, povećanje koeficijenta apsorpcije masti kod takvog subjekta je približno 30%> u odnosu na početnu vrednost. U alternativnom otelotvorenju, upotreba uključuje primenu na subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije iz ovog pronalaska, pri čemu ta terapeutski efektivna količina povećava koeficijent apsorpcije masti kod tog subjekta za količinu između približno 10% i približno 25% u odnosu na početnu vrednost, kada je početna vrednost koeficijenta apsorpcije masti kod tog subjekta veća od 40% ali manja od 85%. Preferirano, povećanje koeficijenta apsorpcije masti kod takvog subjekta je približno 15%> u odnosu na početnu vrednost.

[0073]Pored toga, upotreba kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom uključuje one kompozicije koje obuhvataju primenu na subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije iz ovog pronalaska, pri čemu ta terapeutski efektivna količina povećava koeficijent apsorpcije azota kod subjekta za približno 30% i približno 35% u odnosu na početnu vrednost, kada je početna vrednost koeficijenta apsorpcije azota kod tog subjekta manja od ili jednaka sa 40%. Preferirano, povećanje koeficijent apsorpcije azota kod takvog subjekta je približno 30% iznad početne vrednosti. U alternativnom otelotvorenju upotreba uključuje primenu na subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije iz ovog pronalaska, pri čemu ta terapeutski efektivna količina povećava koeficijent apsorpcije azota kod tog subjekta za između 10%> i približno 25% iznad početne vrednosti, kada je početna vrednost koeficijenta apsorpcije azota kod tog subjekta veća od 40% ali manja od 85%. Preferirano, povećanje koeficijenta apsorpcije azota kod tog subjekta je približno 15% veće od početne vrednosti.

[0074]U narednom otelotvorenju, upotreba kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom uključuje primenu na subjektu terapeutski efektivne količne kompozicije iz ovog pronalaska, pri čemu ta terapeutski efektivna količina povećava apsorpciju ugljenih hidrata kod tog subjekta za stepen koji je veći od ili jednak sa približno 30% iznad početne vrednosti. U narednom otelotvorenju, ovakve upotrebe uključuju one kod kojih je terapeutski efektivna količina kompozicije iz ovog pronalaska ona koja povećava apsorpciju ugljenih hidrata kod tog subjekta do stepena koji je veći od ili jednak sa približno 20%> iznad početne vrednosti. Kako je ovde mereno, povećanje apsorpcije ugljenih hidrata za 10% omogućava još 90 kalorija dnevno. Nakon 365 dana, ukupno 32.850 dodatnih kalorija godišnje se apsorbuje. Pošto je potrebno približno 3.500 kalorija za povećanje težine od jedne funte, za nešto više od 9 funti godišnje.

[0075]Kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se formulišu za bilo koji uobičajeni način oslobađanja, uključujući primenu preko gornjeg gastrointestinalnog trakta, na primer, usta (na primer u obliku kapsula, tableta, suspenzija ili sa hranom) ili preko stomaka, ili gornjeg intestinuma (na primer, kanilom ili infuzijom), oralnim putem. Preferirano, kompozicije su formulisane za oralno oslobađanje. U skladu sa tim, kompozicija može da bude u bilo kom doznom obliku, uključujući one u čvrstom, tečnom obliku, suspenzije ili disperzije kao što su, na primer, kapsule, tablete, kaplete, sahete ili dražeje. Za novorođenčad i decu, ili za bilo koju odraslu osobu koja ne može da uzme tablete ili kapsule, kompozicije se primenjuju kao tečnosti, suspenzije ili sahete ili mogu da se primene sa drugom kompatibilnom hranom ili produktima.

[0076]U jednom otelotvorenju ovog pronalaska, kompozicije u skladu sa ovim pronalakom se primenjuju na subjektu u vreme obroka ili užine, u jednoj ili više kapsula, suspenzija ili saheta. Preferirano, kompozicije iz ovog pronalaska se primenjuju na subjektu u jednoj do dve kapsule, suspenzije ili sahete po obroku ili užini. Kompozicije mogu da se primene nakon uzete polovine obroka ili užine. Terapeutski efektivna količina kompozicije za lečenje pankreatične insuficijencije u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata lipazu, proteazu i amilazu u odnosu od približno 1:1:0.15 USP jedinica aktivnosti enzima i po dozi uključuje: vrednost aktivne lipaze od između približno 5,000 USP jedinica i približno 100,000 USP jedinica; vrednost aktivne proteaze od između približno 5,000 USP jedinica i približno 100,000 USP jedinica; i vrednost aktivne amilaze od između približno 750 USP jedinica i približno 15,000 USP jedinica. Još poželjnije, ovakve kompozicije uključuju lipazu, proteazu i amilazu u odnosu od približno 1:1:0.15 USP jedinica aktivnog enzima i, po dozi, uključuju vrednost aktivne lipaze od između približno 25,000 USP jedinica i približno 100,000 USP jedinica; vrednost aktivne proteaze od između približno 25,000 USP jedinica i približno 100,000 USP jedinica; i vrednost aktivne amilaze od između približno 3,750 USP jedinica i približno 15,000 USP jedinica. Najpoželjnije, ovakve kompozicije uključuju lipazu, proteazu i amilazu u odnosu od približno 1:1:0.15 USP jedinica aktivnog enzima i, po dozi, uključuju vrednost aktivne lipaze od približno 25,000 USP jedinica; vrednost aktivne proteaze od približno 25,000 USP jedinica; i vrednost aktivne amilaze od približno 3,750 USP jedinica.

[0077]Za decu, kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom uključuju lipazu, proteazu i amilazu u odnosu od 1:1:0.15 USP jedinica aktivnog enzima i, po dozi, uključuju: vrednost aktivne lipaze od između približno 12,500 USP jedinica i približno 25,000 USP jedinica; vrednost aktivne proteaze između približno 12,500 USP jedinica i približno 25,000 USP jedinica; i vrednost aktivne amilaze od između približno 1,875 USP jedinica i približno 3,750 USP jedinica. Za novorođenčad, ovakve kompozicije uključuju lipazu, proteazu i amilazu u odnosu od približno 1:1:0.15 USP jedinica aktivnog enzima i, po dozi uključuju: vrednost aktivne lipaze od između približno 500 USP jedinica i približno 1,000 USP jedinica; vrednost aktivne proteaze od između približno 500 USP jedinica i približno 1,000 USP jedinica; i vrednost aktivne amilaze od između približno 75 USP jedinica i približno 150 USP jedinica. Za sve ovde diskutovane brojeve i opsege jedinica aktivnog enzima, jedna jedinica lipaze, proteaze ili amilaze se definiše u skladu sa prethodno datom ispitivanju za određeni enzim. Prethodno opisane količine su, tim redom, takođe terapeutski efektivne količine za lečenje malapsorpcije ili maldigestije kod odraslih, dece ili novorođenčadi, ili za povećanje bilo kog koeficijenta apsorpcije masti, koeficijenta apsorpcije azota, apsorpcije ugljenih hidrata ili varenja škroba kod odraslih, dece ili novorođenčadi.

[0078]Najefikasniji način primene i dozni režim kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom će da zavisi od traženog efekta, prethodne terapije, ukoliko je bilo, zdravstvenog stanja subjekta ili statusa samog stanja, odgovora na terapiju i procene ordinirajućeg lekara.

[0079]Nakon poboljšanja stanja kod subjekta, ukoliko je potrebno, može da se primeni režim održavanja. Nakon toga, doza ili učestalost primene ili oba, mogu da se redukuju u funkciji simptoma do nivoa na kome se poboljšano stanje održava. Međutim, kod subjekata može da bude potreban periodičan tretman za duže vreme na osnovu bilo kog ponovljenog stanja ili njegovih simptoma.

[0080]Kako bi se ovaj pronalazak bolje razumeo, dati su naredni primeri. Ovi primeri su dati samo kao ilustracija i ne predstavljaju ograničenje okvira pronalaska na bilo koji način.

PRIMERI

[0081]Naredni primeri se odnose na kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom kao i na kliničke studije kojima se procenjuje njihova bezbednost i efikasnost za tretman pankreatčine insuficijencije. Ove studije uključuju Fazu 1 i Fazu 2 kliničkih ispitivanja kod pacijenata sa cističnom fibrozom a koji pate od pankreatične insuficijencije.

[0082]U Fazi 2 studije je ispitivana efikasnost kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom merenjem promena u: koeficijentu apsorpcije masti ("CFA"), koeficijentu apsorpcije azota ("CNA"), apsorpciji oralno uzeti ugljenih hidrata, težini stolice po danu, broju stolica po danu i kvalitetu života, u pogledu gastrointestinalih simptoma, mereno Cvstic Fibrosis Questionnaire ("CFQ"). U studiji se takođe ispituje doza ovih kompozicija koja obezbeđuje najveći stepen klinički smislenog poboljšanja koeficijeta apsorpcije masti u odnosu na početnu vrednost (nedostatak enzima) kod subjekta koji se tretira.

[0083]Kako je pokazano u Fazi 2 studije, kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom obezbeđuju statistički značajan porast u prošeku CFA i u CNA u odnosu na početne vrednosti za period tretmana kod subjekata sa cističnom fibrozom sa pankreatičnom insuficijencijom. Nađeno je da su kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom efikasne pri minimalnoj dozi od 25,000 USP jedinica lipaze, 25,000 USP jedinica proteaze i 3,750 USP jedinica amilaze po kapsuli ("srednja doza" ili "Arm 2" studije); dovodeći do značajnog (> 10 %) povećanja i CFA i CNA kod većine subjekata. CFA i CNA takođe rastu kada doza za tretman sadrži lipazu, proteazu i amilazu u odnosu od 100,000:100,000:15,000 USP jedinica aktivnog enzima po kapsuli ("veća doza" ili "Arm 3" studije). Međutim, ne postoji statistička razlika između režima srednje doze i veće doze u odnosu ili na CFA ili na CNA. Kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom i koje su korišćene u Fazi 2 studije takođe obuhvataju one koje se primenjuju u dozi od 5,000 USP jedinica lipaze, 5,000 USP jedinica proteaze i 750 USP jedinica amilaze po kapsuli ("niska doza" ili "Arm 1" studije).

[0084]Kao prednost, čak i nakon kontrole početnih vrednosti CFA i CNA i pola tretiranih subjekata, ovaj efekat kompozicija u skladu sa pronalaskom na CFA i CNA ostaje statistički značajan (p=0.0003 i <0.0001, tim redom), za grupe tretirane sa srednjom i većom dozom. Kada se i CFA i CNA ispituju kao odvojeni kvartili (Slike 1 i 2) najveće promene su uočene kod onih subjekata čije su početne vrednosti <40% a proporcionalno manje promene kod subjekata sa početnom vrednošću CFA i CNA > 40%. Kada je u pitanju CFA, prosečno povećanje u grupi od osam subjekata sa početnom vrednošću CFA < 40% tretiranoj srednjom dozom je bilo 35.3%. Prosečno povećanje u grupi od 12 subjekata sa početnom vrednošću CFA < 40% tretiranoj većom dozom je bilo 30.4%. Ukupno povećanje CFA kod 20 subjekata sa početnom vrednošću CFA < 40%, za obe grupe, tretirane srednjom i većom dozom, je bilo 32.3%.

[0085]Kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom takođe obezbeđuju značajan efekat lečenja mereno u smislu promene broja i težine stolica po danu kod lečenih subjekata. Subjekti koji su dobijali veće doze ispoljavaju značajno smanjenje u broju stolica u odnosu na početni broj u toku perioda tretamana, dok je smanjenje težina stolice statistički značajno za obe grupe, tretirane srednjom dozom i većom dozom. U suštini, postoji veoma značajna inverzna korelacija (R = - 0.7283; p < 0.0001) između promene u apsorpciji masti i promene u težini stolice. U tom smislu, veća doza (Arm 3) studije se značajno ne razlikuje od srednje doze (Arm 2).

[0086]Kod svih subjekata u studiji, mada nije bilo ukupnih statistički značajnih promena zabeleženih u Starch Challenge testu na izostavljanje enzima, efekat nađen kod subjekata tretiranih većom dozom i kod promene maksimuma glukoze i oblasti ispod krive ("AUC") ima trend (p < 0.057) koji ukazuje na aktivnost amilaze. Pored toga, ad-hok analiza koja koristi Fischer-ov ekzaktni test pokazuje da više subjekata u grupi sa srednjom dozom i u grupi sa većom dozom ima > 10% povećanje u promeni maksumuma glukoze nakon Starch Challenge testa nego grupa tretirana sa manjom dozom, na osnovu poređenja perioda tretmana bez enzima i sa enzimom (p = 0.0138). Ovi rezultati pokazuju da funkcije amilaze kao važne komponente kompozicije iz ovog pronalaska, dovode do poboljšanja varenja škroba i apsorpcije ugljenih hidrata.

[0087]Kod subjekata tretiranih sa kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom koji su dobro podnosili sve vrednosti doze u Fazi 2 studije, nisu zabeležena ozbiljna neželjena dejstva. Ni jedan subjekat nije umro u toku ove studije.

Primer 1 - Izrada kompozicija za studiju

[0088] Kompozicije koje se koriste u ovde diskutovanim studijama Faza 1 i Faza 2 uključuju lipazu, proteazu i amilazu, od kojih je svaka proizvedena odvojeno, pod kontrolisanim uslovima, iz različitih mikrobioloških sojeva pre izolovanja, prečišćavanja i sušenja. Proizvodnja se sprovodi tako da obezbedi kompozicije koje će da budu stabilne i da održe potentnu aktivnost enzima unutar tankog creva.

[0089] Lipaza: postupci za produkciju i prečišćavanje lipaze iz bakterija su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Na primer, lipaza komponenta kompozicija se produkuje fermentacijom iz bakterijeBurkholderia cepacia(ranije poznata kaoPseudomonas cepacia).Fermentacija se izvodi u fermentoru kapaciteta 25.000 litara. Soj je nabavljen od banke matičnih ćelija koje su zamrznute liofilizacijom, uzgajane pod nagibom, prenete u osam litara kulture za zasejavanje, a nakon toga fermentovane u fermentoru za zasejavanje kapaciteta 2.500 litara i konačno dobijene u fermentoru kapaciteta 25.000 litara. Nakon fermentacije, organizmi sposobni za život se ubijaju tretmanom toplotom i uklanjaju centrifugiranjem. Proteini se koncentruju evaporacijom, nakon toga precipitiraju etanolom i isperu sa etnolom u korpici centrifuge.

[0090] Dodatno prečišćavanje lipaze se vrši precipitacijom sa amonijum sulfatom, adsoprcijom i eluacijom sa DEAE celulozom, a nakon toga prečišćavanjem koncentracijom i desalinizacijom ultrafiltracijom. Dobijeni materijal se dalje prečisti tretmanom sa acetonom i CM-celulozom, a nakon toga se doda glicin kao sredstvo za stabilizaciju. Dobijeni materijal se filtrira membranskom filtracijom a nakon toga liofilizira. Zatim se materijal proseje i ispituje na specifičnu aktivnost, čistoću i odsustvo patogena.

[0091] Prečišćena lipaza se dalje podvrgne procesu dijafiltracije kako bi se uklonio glicin stabilizator. Nakon toga se precipitira i kristališe u 25% t-butanolu, a nakon toga se unakrsno udvoji sa BS<3>u opsegu koncentracija koje su prethodno opisane, preferirano tako daje finalna koncentracija sredstva za unakrsno udvajanje u kristalima unakrsno udvojene lipaze u rasponu između približno 2.0 mM i približno 5.0 mM. Kristali unakrsno udvojene lipaze se isperu sa pet zapremina 15% etanolnog pufera a nakon toga se dodtno isperu sa pet zapremina 15% etanolnog pufera (sa 1.5mM kalcijum acetata, pH 5.0), kako bi se smanjile količine i rezidualnog sredstva za udvajanje i t-butanola. Dobijeni materijal se liofilizira i upakuje za transport u HDPE bočicama sa lepljivom trakom, pakuju u jednu PE vreću sa silika gel desikantom. Svaka serija se posebno ispituje na mikrobiološku kontaminaciju saBurkholderia cepacia,pored drugih mikroba, i rezultat treba da bude negativan naBurkholderia cepaciai patogene pre puštanja za kliničku upotrebu.

[0092] Proteaza: postupci za dobijanje i prečišćavanje proteaze su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Na primer, proteaza se dobij a čvrstom fermentacijomAspergillus melleus.Zasejana kultura se prenese u rastvor, a nakon toga prenese na pšenične mekinje. Kada je zasad obložen sterilnim mekinjama, čvrsti delovi se stave na tacne za fermentaciju u sobama za fermentaciju. Nakon završene fermentacije, enzim se ekstrahuje iz čvrste biomase perfusijom vode kroz velike tankove za ekstrakciju.

[0093] Ekstrakt koji sadrži proteazu se nakon toga propusti kroz čestice drvenog uglja i filtrira kako bi se uklonile suspendovane čestice. Rastvor se nakon toga koncentruje i drugi put tretira sa drvenim ugljeni. Proteaza se precipitira sa etanolom i nakon toga suši pod vakuumom zbog finalnog prečišćavanja.

[0094] Proteaza se rastvori i nakon toga propusti kroz smolu jonskih izmenjivača. Nakon toga se materijal filtrira pre prenošenja u tankove za kristalizaciju, gde se kristališe uz višestruko dodvanje etanola. Kada je kristalizacija završena, kristali se obnavljaju u korpici centrifuge i isperu sa dodatnom količinom etanola. Kristali se pokupe iz korpice centrifuge i suše pod vazdušnim pritiskom a nakon toga pod vakuumom. Kada je sušenje završeno, prašak se prenese u kontejnere za serije zbog konačnog prosejavanja i pakovanja.

[0095] Amilaza: postupci za izradu i prečišćavanje amilaze su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Na primer, amilaza se izrađuje čvrstom fermentcijomAspergillus oryzae.Kultura za zasejavanje se doda u rastvor, a nakon toga prenese na pšenične mekinje. Kada je zasad obložen sterilnim mekinjama, čvrsti delovi se stave na tacne za fermentaciju. Nakon završene fermentacije, enzim se ekstrahuje iz čvrste biomase perfusijom vode kroz tankove za ekstrakciju. Filtrirani ekstrakt se nakon toga koncentruje i dijafiltrira. Nakon dijafiltracije se sprovodi tretman toplotom i podešavanje pH, a nakon toga se vrši dodatna dijafiltracija i koncentracija. Nakon toga se u materijal doda riblji želatin kao stabilizator a zatim se vrši sušenje raspršivanjem i dobija se do 30% ukupne težine produkta. Kada je osušen, materijal se proseje, izmeša sa dekstrinom i pakuje. Dekstrin se koristi kao stabilizator za dugotrajno čuvanje i može da predstavlja do 30% ukupne težine finalnog produkta. U dobijenim aktivnim farmaceutskim sastojcima protein ima čistoću veću od 90% potvrđenu sa SEC HPLC uz detekciju na 280 nm. U ovih 90% se ne broji prisustvo želatina ili dekstrina kao ekscipijenata; niti ekscipijent ima značajnu apsorpciju na 280 nm. Nakon što su prečišćene i izrađene, lipaza, proteaza i amilaza se zajedno formulišu u obliku kapsula. Još preciznije, osušeni enzimi se u suvom obliku izmešaju (sa ekscipijentima) i pune u želatinske kapsule. Kompozicije su označene kao TheraCLEC™.

Primer 2 - Faza 2 studije

Doze za tretman

[0096] Kompozicije korišćene u Fazi 2 studije uključuju aktivne sastojke unakrsno udvojenih kristala lipazeBurkholderia cepacia,kristale proteazeAspergillus melleusi rastvori) ivuamilazu Aspergillusorvzae; i sledeće neaktivne sastojke: mikrokristalnu celulozu, maltrin, krospovidon, koloidni silicijum dioksid, magnezijum stearat i talk. Takođe sadrže lipazu, proteazu i amilazu u odnosu 1:1:0.15 USP jedinica aktivnosti enzima.

[0097] Kompozicije se isporučuju u obliku kapsula u dve različite jačine. Formulacija veće jačine, označena kao "TCT20", se puni u bele neprovidne čvrste želatinske kapsule veličine 2 sa jačinom od 20,000 USP jedinica lipaze, 20,000 USP jedinica proteaza i 3,000 USP jedinica amilaze. Formulacija manje jačine, ozanačena kao "TCT5", se puni u bele neprovidne čvrste želatinske kapsule veličine 5, sa jačinom od 5,000 USP jedinica lipaze, 5,000 jedinica proteaza i 750 USP jedinica amilaze. Odnos aktivnih i neaktivnih sastojaka na bazi m/m je 3:4 za TCT20 i 2:5 za TCT5.

[0098] Placebo kapsule veličine 2 i veličine 5 se koriste u Fazi 2 studije kao šlepa proba TheraCLEC doze. Placebo kapsule sadrže iste neaktivne sastojke kao TheraCLEC™ kapsule i imaju isti izgled kao TheraCLEC™ kapsule, tako da vrsta kapsule (aktivne u odnosu na placebo) nije prepoznatljiva. Daje se isti broj i tip TheraCLEC™ kapsula i placebo kapsula kako bi isti broj randomiziranih subjekata dobio aktivne sastojke ili šlepu probu.

[0099] U toku Faze 2 studije, približno na polovini svakog obroka ili užine u toku 28 dana perioda tretmana, subjekti uzimaju ukupno šest kapsula koje su kombinacija TheraCLEC™ i placebo kapsula, jedna je kapsula veličina 5 a 5 su kapsule veličine 2, kako je niže opisano:

Izbor i raspored doza

[0100]Najveća utvrđena doza od 100.000 USP jedinica lipaze/obrok u Fazi 2 studije je ekvivalentna sa 1.250 lipaza USP jedinica po kg za subjekta težine 80 kg i 2.500 USP jedinica lipaze po kg za subjekta sa 40 kg.

Drugi parametri u Fazi 2 studije

[0101] Faza 2 studija je randomizirano ispitivanje, sa dvostrukom kontrolom i paralelnim opsegom doza. Studija je obuhvatila ukupno 129 muškaraca i žena iz približno 26 gradova Sjedinjenih Država sa tri vrednosti doze TheraCLEC™ (približno 42 subjekata po grupi). Studija je razdvojena u četiri posebna perioda praćenja i procene: skrining, početak, tretman i kontrola.

Populacija Faze 2 studije

[0102]Kompozicije izrađene kako je prethodno opisano su testirane u tri grupe populacije. Modifikovana populacija predviđena za lečenje ("mITT") obuhvata sve prihvatljive subjekte koji su prošli početni period (bez enzima) merenja, primili najmanje jednu randomiziranu dozu, koji su u periodu tretmana ispitivani na sigurnost i koji su imali marker-do-marker sakupljenu stolicu. Testirane su druge populacije subjekata i rezultati su konzistentni sa rezultatima mITT populacije.

Skrining period ( Dan SI - početna vrednost)

[0103]Prvog dana upoznavanja (Dan SI), subjekti se intervjuišu da se utvrdi njihova pogodnost za učešće u studiji. Subjekti se takođe podvrgavaju potpunoj fizičkoj proveri.

[0104]Od subjekata se traži da u toku perioda studije uzimaju hranu sa visokim sadržajem

masti. Subjektima je dozvoljeno da uzimaju lekove potrebne za tretman i održavanje njihove postojeće cistične fibroze i pratećih bolesti. Subjekti nisu dobijali produkte za suplementaciju enzima ili dodatke hrani koji mogu da deluju kao suplementi enzima u toku perioda početnog boravka u bolnici (Dani BI do B3) i tretmana (Dani T1-T28) studije.

[0105]Subjekti su po randomiziranu principu dobijali od jedne do tri slepe probe doze TheraCLEC™.

Pripremni period u bolnici ( Dani B1- B3)

[0106]U toku 10-14 dana perioda posmatranja, od randomiziranih subjekata je traženo da dođu u bolnicu pre prvog dnevnog obroka (doručak), bez unosa hrane. Pripremni period počinje sa prvim obrokom (doručak) na Dan BI. Pre doručka, izmeri se telesna težina. Nakon toga, subjekat počinje sa periodom od 72-sata kontrolisane ishrane bez suplementacije pankreatičnih enzima. Marker stolice (500 mg FD&C Dye Blue #2) se uzme na početku prvog obroka na Dan BI. Uzimanje masti i proteina se beleži na osnovu stvarnog utroška. Sakupljanje stolice za ispitivanje fekalnih masti i azota počinje nakon što prođe prvi marker (stolica koja sadrži prvi marker se odbaci) a završava se kada se drugi marker prvi put uoči u stolici (uzima se stolica koja sadrži drugi marker).

[0107]Svakog dana u toku pripremnog perioda, subjekti se ispituju na neželjene pojave i prateće medikacije, vitalni znaci se beleže a vrši se skraćeni fizički pregled.

Period lečenja ( Dani T1- T28)

[0108]Prva doza leka koji se ispituje se obezbedi za svaki subjekt na dan jedan perioda lečenja (TI) približno na polovini prvog obroka a nakon završenih pre-doznih procedura i Starch Challenge testa na Dan TI (ručak). Subjekti se nakon toga posmatraju najmanje 30 minuta nakon primene prve doze. Ukoliko se lek dobro podnosi subjekti nakon toga uzimaju istu dozu leka koji se ispituje na približno polovini svakog od 3 obroka i 2 užine na dan TI do 28 perioda lečenja. U ovoj studiji, sredina obroka se definiše kao vreme u kome je subjekt konzumirao približno jednu polovinu obroka ili užine.

[0109]Na Dan T29, subjekti prestaju sa uzimanjem leka koji se ispituje. U toku Dana T29/ET boravka u bolnici, vrši se kompletno fizičko ispitivanje. Subjekti se takođe ispituju na neželjena dejstva.

Period kontrole ( Dan F7 ± 2)

[0110]U toku perioda kontrole, subjekti se zadržavaju na hrani sa visokim sadržajem masti i uobičajenom režimu enzima kako je njihov lekar prepisao. Završetak perioda kontrole u toku boravka u bolnici (Dan F7 ± 2) se planira tako da dođe 7 ± 2 dana nakon završetka boravka u bolnici zbog perioda lečenja (Dan T29). Pri ovom boravku, subjekti se podvrgavaju skraćenom fizičkom ispitivanju i procenjuju na neželjena dejstva i istovremene medikacije.

Analiza stolice na mast i azot

[0111]Stolica za test elastaze fekalnih mrlja se uzima u toku perioda posmatranja za procenu pogodnosti za studiju. U toku studije, svakom subjektu je u različito vreme ispitivana stolica na prisustvo prikrivene krvi i ćelija belih krvnih zrnaca.

[0112]U toku pripremnog perioda boravka u bolnici i perioda lečenja u bolnici, indikator marker (500 mg FD & C Blue #2) je dat na početku prvog obroka kontrolisane ishrane (doručak), koji sadrži približno 100 g masti i minimum približno 2 g proteina po kilogramu telesne težine po danu. Stvarno unošenje masti i proteina se beleži na osnovu količine unete hrane.

[0113]Nakon 72 sata na kontrolisanoj ishrani, drugi plavi marker indikator se našte da subjektima sa test obrokom za Start Challenged test. Uzimanje stolice za ispitivanje fekalne masti i azota počinje nakon prolaska prvog plavog markera a završava se kada prođe drugi plavi marker. Sakupljena stolica se meri na težinu stolice i ispituje na sadržaj masti i azota. Seligson, D (ed), Standard Methods of Clinical Chemistrv, Volume II, Fatty Acids in Stool, 1985, Academic Press, pp 34-39; Veldee MS, Nutritional Assessment, Therapv, and Monitoring in Burtis CA, Ashwood ER (eds). Tietz Textbook of Clinical Chemistrv, 3rd Ed., 1999, W.B. Sanders Co, pp 1385-86.

[0114]Koeficijent apsorpcije masti (% CFA) se pojedinačno izračunava na licu mesta pomoću dve vrednosti:

(1) Utrošena mast u g/24 sata koju daje glavni dijetetičar istraživanja, i

(2) izlučena mast u g/24 sata koju daje Mayo Clinical Laboratory Services.

[0115]CFA se izračunava na sledeći način:

( prosečni grami utrošene masti/ 24 sata - prosečni grami izlučene masti/ 24 sata x 100)

prosečni grami utrošene masti/24 sata

[0116]Koeficijent apsorpcije azota (% CNA) se izračunava koristeći dve vrednosti:

(1) utrošak u g/24 sata koji daje glavni dijetetičar istraživanja, i

(2) izlučeni azot u g/24 sata kako je dobijeno od Mayo Clinical Laboratory Services.

[0117]CNA se izračunava na sledeći način:

( prosečni grami utrošenog azota/ 24 sata - prosečni grami izlučenog azota/ 24 sata)

prosečni grami utrošenog azota/24 sata x 100

Procena efikasnosti - koeficijent apsorpcije masti

[0118]Koeficijent apsorpcije masti u pripremnom periodu, u toku tretmana i promene od pripremnog perioda do tretmana je sumiran za tretiranu grupu. Objavljeni koeficijent apsorpcije masti je prošek izračunavanja dva nezavisna CFA koristeći dva rezultata fekalne masti iz jedne dobijene stolice. Razlika između tri tretirane grupe u prosečnom keoficijentu apsorpcije masti u toku perioda tretmana je analizirana koristeći analizu odstupanja u jednom pravcu. Kako bi se ispitala tri moguća uporedna para uz kontrolu za ukupno 5% tip 1 nivoa greške, korišćen je Tukey-jev studentizovan test raspona. U zavisne varijabile su uključena merenja dobij ena u toku tretmana.

[0119]Takođe je sprovedena analiza linearne regresije kojom se istovremeno ispituju efekti tretirane grupe i srednje početne vrednosti CFA. Zavisne varijabile ponovo uključuju merenja u periodu tretmana. Dodatni faktori koji su testirani u modelu uključuju sledeća osnovna merenja: godine starosti, pol, rasu i BMI. Za ove dodatne faktore, koriste se ,,step-down" procesi kako bi se iz modela eliminisali faktori koji nisu od značaja (p > 0.10). Takođe se sprovodi upoređivanje po parovima koristeći Tukey-jev studentizovan test raspona u ovim analizama linearne regresije.

[0120] Koeficijent apsorpcije masti (CFA) za pripremni period, u toku tretmana i promene od pripremnog perioda do tretmana za mITT populaciju je sumiran u niže datoj Tabeli 3 po tretiranoj grupi. Kod sve tri tretirane populacije, postoji značajno povećanje u prosečnom CFA od pripremnog perioda do perioda tretmana. U toku tretmana, CFA je značajno veći i kod tretirane grupe 2 (srednja doza) i tretirane grupe 3 (veća doza) nego u tretiranoj grupi 1 (manja doza). Pored toga, tretirane grupe 2 i 3 ispoljavaju veće prosečno povećanje u CFA od perioda bez enzima do enzima nego tretirana grupa 1. Mada tretirana grupa 3 pokazuje konzistentnu numeričku prednost u odnosu na tretiranu grupu 2, ova razlika nije statistički značajna. [01211Ukoliko se početna vrednost CFA podeli na petine od 0-100%, jasno je da sve tretirane grupe imaju mnogo veće povećanje u odnosu na početnu vrednost od 0-40% CFA nego ukoliko je početna vrednost CFA iznad 40% (videti Sliku 1). Osim toga, što je niža početna vrednost CFA veći je odgovor na tretman.

Procena efikasnosti - koeficijent apsorpcije azota

[0122] Koeficijenti apsorpcije azota (CNA) u pripremnom periodu (BI do B3) i u toku tretmana za mITT populaciju su sumirani u niže datoj Tabeli 4, po tretiranim grupama. Objavljeni koeficijent apsorpcije azota je srednja vrednost izračunavanja dva nezavisna CNA koristeći dva rezultata fekalnog azota iz jedne uzete stolice. Razlika srednjeg CNA između tri tretirane grupe se analizira na isti način kao i srednjeg CFA.

[0123] Slično sa merenjima CFA, za sve tri tretirane populacije, postoji značajno povećanje u srednjim vrednostima CNA od početka do perioda tretmana. U sve tri tretirane populacije, CNA u toku tretiranja je znatno veći i u tretiranoj grupi 2 i u tretiranoj grupi 3 nego u tretirnoj grupi 1. Pored toga, tretirane grupe 2 i 3 ispoljavaju veće prosečno povećanje u CNA od perioda bez enzima do enzima nego tretirana grupa 1. Mada tretirana grupa 3 pokazuje konzistentnu numeričku prednost u odnosu na tretiranu grupu 2, ova razlika nije statistički značajna.

[0124]Ukoliko se osnovni CNA podeli na petine od 0-100%, iz Slike 2 je jasno da sve tretirane grupe imaju veće povećanje u odnosu na početnu vrednost ukoliko je početna vrednost CNA 40% ili manje ukoliko je CNA iznad 40%. Tretirane grupe 2 i 3 se i dalje pojavljuju kao efikasnije nego tretirana grupa 1. Osim toga, što je niža početna vrednost CNA, veći je odgovor na tretman.

Poboljšanja CFA i CNA i korelacija između njih

[0125]Studija pokazuje značajan porast u srednjim vrednostima CFA i u CNA u odnosu na početne vrednosti u periodu tretmana u grupama tretiranih sa srednjom i većom dozom između sve tri tretirane populacije. Osim toga, tretirana grupa 3 (grupa tretirana većom dozom) ispoljava najveće prosečno povećanje u CFA i CNA u toku ovog vremenskog perioda, mada razlika između srednje i visoke doze nije statistički značajna. Čak i nakon početnih vrednosti CFA i CNA i pola, efekat tretmana na CFA i CNA ostaje statistički značajan (p=0.0003 i <0.0001, tim redom).

[0126]Korelacija između porasta CFA i CNA je takođe statistički značajna. Slike 3 i 4 ilustruju korelaciju između CFA i CNA kod mITT pacijenata tretiranih sa kompozicijama svih doza u skladu sa ovim pronalaskom, na nivou početnih vrednosti i na nivou tretmana, tim redom. Slika 5 ilustruje razliku u korelaciji između CFA i CNA na nivoima tretmana i početnih vrednosti kod tih pacijenata.

Procena efikasnosti - analiza promene od početne vrednosti - uzorkovanje stolice

[01271Prosečne promene u broju stolica i težini stolice od početnog perioda do perioda tretmana u odnosu na vrednost na završetaku relevantnog perioda tretmana su date odvojeno za svaku tretiranu grupu u studiji u Tabeli 5 i Tabeli 6,tim redom.

[0128]U sve tri tretirane grupe, pojavljuje se smanjenje u broju stolica od početnog perioda do perioda tretmana (p=0.0968, p=0.0975 i p=0.1807, tim redom). Posebno, tretirana grupa 3 ispoljava najveće prosečno smanjenje (-.2.6 u mITT) u broju stolica od početne vrednosti do tretmana (p=0.0003). Međutim, poređenje u promeni u broju stolica između grupa ne pokazuje statistički značajnu razliku između tretiranih grupa.

[0129] Takođe je značajno smanjena težina stolica od početnih vrednosti do perioda tretmana u grupama tretiranih srednjom i većom dozom od sve tri tretirane populacije (p=0.0001). Mada tretirana grupa 3, od sve tri populacije, pokazuje najveće prosečno smanjenje u težini stolice od početne vrednosti do perioda tretmana (p<0.0001), poređenje po parovima koristeći Tukey-jev studentizovan test raspona ne pokazuje statistički značajne razlike između grupa tretiranih srednjom i većom dozom.

Procena efikasnosti - varenje škroba i apsorpcija ugljenih hidrata mereno odgovorom

nivoa glukoze u krvi

[0130] U toku Starch Challenge testa, subjektima koji u toku noći nisu unosili hranu najmanje 8 sati je davan standardni test obrok koji sadrži 100 grama hleba od belog brašna (50 g ugljenih hidrata) u toku pripremnog perioda u bolnici i perioda tretmana u bolnici. Subjekti se odmore 30 minuta pre početka Starch Challenge testa a aktivnosti su ograničene u toku procene. Vrednosti glukoze u krvi se mere pomoću glukometra (Accucheck, Bayer). Merenje se vrši neposredno pre test obroka. TheraCLEC se primenjuju približno na polovini uzimanja hleba. Serijska merenja glukometrom se vrše u periodu od 4 sata. Izračunate vrednosti uključuju promenu maksimuma glukoze od nivoa gladi i promenu maksimuma glukoze sa i bez enzima (T17 - TI). Subjekti sa dijabetes melitusom nisu podvrgnuti Starch Challenge testu ukoliko je izmerena našte glukoza manja od 75 mg/dL.

[0131] Odgovor glukoze u krvi se meri preko sledećih promenljivih u mITT populaciji: Promena glukoze od vremena 0: promena glukoze u svakoj tački vremena od vremena 0. Odgovor maksimuma glukoza: vrednost maksimuma glukoze nakon vremena 0. Promena maksimuma u odgovoru glukoze: definiše se kao odgovor maksimuma minus vrednost glukoze u vremenu 0. Vreme za pik odgovora glukoze ( Tmax): definše se kao sati promene od vremena 0 do maksimuma glukoze.

[0132] Opisni statistički podaci su dati za svaku od ovih promenljivih za tretirane grupe kako sledi: 1. Bez TheraCLEC™

2. Sa TheraCLEC

3. Sa TheraCLEC™ minus bez TheraCLEC™ 4. Odnos (R) sa TheraCLEC™ : bez TheraCLEC™

[0133]Ovi opisni statistički podaci su prezentovani i za sve subjekte i samo za subjekte bez dijabetesa. Smatra se da cistična fibroza kod pacijenta povezana sa dijabetesom ukoliko ima ili medicinsku istoriju dijabetesa, ukoliko je na insulinu ili oralnoj medikaciji dijabetesa ili ukoliko ima vrednost glukoze našte > 126 mg/dL ili vrednost postprandijalne glukoze > 200 mg/dL.

[0134]U Tabeli 7, 25 subjekata sa cističnom fibrozom povezanom sa dijabetes melitusom su odstranjeni iz analize da se smanji promenljivost i za visoku početnu vrednost glukoze kao i za smanjenje glukoze nakon Starch Challenge testa što je rezultat jutarnje injekcije insulina. Čini se da TCT5 ima značajno manji (p = 0.0053) broj subjekata sa povećanjem maksimuma glukoze sa i bez enzima > 10 mg/dL nego TCT25. Pored toga, rezultati u Tabeli 7 ukazuju da je prosečna vrednost amilaze u Tretiranoj grupi 2 po efikasnosti jednaka kao najveća doza u Tretiranoj grupi 3.

[0135]Sve ukupno, ova studija je pokazala da se kod subjekata tretiranih sa kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom postiže povećanje u varenju škroba i apsorpciji ugljenih hidrata mereno odgovorom glukoze u krvi, pri čemu je kod subjekata u grupi tretiranoj većom dozom potrebno kraće vreme da se to postigne.

Primer 3 - Faza 1 studije

[0136]Pre Faze 2 studije, kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom su takođe ispitivane na svoju sigurnost i preliminarnu efikasnost u probi Faze 1 kod pacijenata sa cističnom fibrozom koji pate od pankreatične insuficijencije.

[0137]Izvedena je otvoreno obeležena studija sa velikim opsegom doza da se odredi akutna sigurnost, tolerancija i klinička aktivnost TheraCLEC™ kod 23 pacijenta sa cističnom fibrozom praćenom pankreatičnom insuficijencijom. Pacijenti su uzimali ili 100, 500, 1,000, 2,500 ili 5,000 jedinica lipaze/kg/obrok TCT u toku tri dana. Praćeni su klinički i laboratorijski parametri sigurnosti i neželjena dejstva.

[0138]Nisu se javili slučajevi ozbiljnog neželjenog dejstva ili slučajeva smrti u Fazi 1 studije. Najčešća neželjena dejstva su bila blage, mada su bile česte gastrointestinalne smetnje. TheraCLEC™ povećava koeficijent apsorpcije masti i koeficijent apsorpcije azota u svim grupama izuzev one koja je dobijala 100 lipaze /kg/obrok. Kod svih ostalih subjekata, na drugim nivoima doziranja, prosečno povećanje CFA = 20.6 ± 23.5, prosečno povećanje CNA = 19.7 ± 12.2% i prosečno smanjenje težine stolice = 425 ± 422 grama.

[0139]TheraCLEC™ je pokazala da se dobro podnosi u ovoj studiji kratkotrajnog izlaganja dozama do 5,000 lipaze/kg/obrok. Rezultati preliminarne efikasnosti pokazuju uspešan efekat na apsorpciju masti i azota. Kao prednost, ovi efekti su viđeni sa dozom od 500 lipaze/kg/obrok i čini se da neće biti potrebe za povećanjem doze izvan tog nivoa da bi se postigli ovi rezultati. Ovi rezultati podržavaju obimniju randomiziranu Fazu 2 ispitivanja.

1. Oblik Faze 1 studije

[0140]Sprovedena je otvorena, multicentralna, više-dozna studija, sa primarnim ciljem da se odredi akutna sigurnost i tolerabilnost pet različitih vrednosti doze TheraCLEC™, kod subjekata sa cističnom fibrozom i pankreatičnom insuficijencijom. Drugi ciljevi su bili da se odredi efekat TheraCLEC™ na apsorpciju oralno uzetih masti i azota, na gastrointestinalne simptome i na broj i težinu stolica. TheraCLEC™ ima fiksne odnose lipaze, amilaze i proteaze. Kohorti doziranja su određeni na osnovu doze lipaze po kg po obroku, kako je opisano u Tabel 8.

[0141]Obezbeđene su kapsule sa sledećim enzimima u fiksnim odnosima: lipaza 20.000 USP jedinica + proteaza 20,000 USP jedinica + amilaza 3,000 USP jedinica po kapsuli).

[0142]Za studiju su uzeti subjekti sa cističnom fibrozom praćenih u jednom od jedanaest akreditovanih centara CF fondacije. Svi pojedinci su potpisali pristupni obrazac odobren od lokalnog institucijonalnog tela a u slučaju pedijatrijskih pacijenata, takođe je dat pristanak. Uvršteni su subjekti koji su bili >13 do <45 godina starosti, koji su imali dijagnostikovanu cističnu fibrozu na osnovu standardnih kriterijuma [BJ. Rosenstein i saradnici, "The Diagnosis of Cvstic Fibrosis: A Consensus Statement", J. Pediatr., 132, pp. 589-595 (1998)], koji su imali pankreatičnu insuficijenciju na osnovu fekalne elastaze <100 mg/gm mereno posmatranjem izvan bolnice koristeći ScheBo monoklonalni ELISA test (BioTech USA) i koji su imali koeficijent apsorpcije masti <80% mereno skriningom u bolnici, imali zapreminu forsiranog izdisaja u jednoj sekundi (FEVi) >30% od predviđene, imali indeks telesne mase > 10 procenata i koji su bili klinički stabilni bez evidencije akutne infekcije gornjeg i donjeg respiratornog trakta. Isključeni su subjekti u trudnoći ili koji doje, koji su imali epizodu sindroma distalne intestinalne opstrukcije koji je zahtevao intervenciju u hitnoj službi ili bolnici u toku prethodnih šest meseci, koji su uzimli lekove koji utiču na pH želuca (na primer, antagoniste histamin-2 receptora, inhibitore protonske pumpe ili antacide) u toku prethodne nedelje a koji ne mogu da prekinu sa ovim lečenjem u toku studije, koji su imali istoriju fibrozne kolonopatije, alergijske bronhopulmonarne aspergiloze ili oboljenje jetre definisano sledećim kriterijumima: dvostruko povećanu alanin aminotransferazu (AST), aspartat aminotransferazu (ALT) ili alkalnu fosfatazu; istoriju visceralnog krvavljenja; konstatovanu cirozu ili značajno oboljenje jetre prilikom biopsije jetre; transplantiranu jetru; subjekti koji su koristeli ursodeoksiholnu kiselinu u toku prethodne godine. Pacijenti koji nisu mogli da prekinu hranjenje preko enteralne kanile u toku bolničkog dela studijskog protokola, oni koji su znali da su hipersenzitivni na dodatke hrani ili oni koji su učestvovali u bilo kojoj drugoj istraživačkoj studiji leka, bioloških proizvoda ili uređaja koji još uvek nisu odobreni prethodnog meseca, su takođe isključeni.

[0143]Ukoliko ispune kriterijum prilikom početnog skrininga, primaju se u centar za kliničko ispitivanje. Prekida se terapija subjekata sa prepisanim enzimom, oralno se daje marker indikator boje (FD & C Blue #2 500 mg) i subjekat se podvrgne specijalnom načinu ishrane koji se sastoji od 100 grama masti i minimum 2 grama proteina po kilogramu telesne težine podeljeno u tri obroka i dve užine. Tačan unos masti i proteina se beleži na osnovu količine unete hrane. Nakon 72 sata na posebnom režimu ishrane, taj način ishrane se prekida i daje se drugi indikator marker. Tada pacijenti nastavljaju svoju normalnu enzimsku terapiju. Uzimanje stolice za ispitivanje fekalne masti i azota počinje nakon prve stolice u kojoj je uočen plavi marker i završava se nakon prolaska drugog markera uz računanje i te stolice. Izračuna se CFA i ukoliko je <80%, subjekat je prihvatljiv za fazu tretmana studije.

[0144]Subjekti se ponovo upućuju u centar za klinička ispitivanja i prekida se rutinska dopuna pankreatičnih enzima. Ponovo se daje obojeni marker i sprovodi specijalni način ishrane i subjekti uzimaju lekove koji se ispituju sa svakim od tri obroka i dve užine u toku naredna 72 sata, sa dozama po kohortu, kako je prethodno opisano. Subjektima se daje uputstvo da ispitivane lekove uzimaju pre svakog obroka. Nakon 72 sata, specijalna ishrana se prekida i daje se drugi marker indikator. Nakon toga, pacijenti nastavljaju sa svojom normalnom enzimskom terapijom. Procedura za sakupljanje stolice je ista kako je prethodno opisano. Pacijenti se telefonski prate tri dana od izlaska iz centra za klinička ispitivanja a kontrolna poseta se sprovodi tri do sedam dana nakon otpuštanja.

[0145]Praćenje sigurnosti obuhvata incidencu neželjenih dejstava, što se određuje otvorenim ispitivanjem učesnika u studiji u toku vanbolničkih poseta i boravka u bolnici i u toku redovnih telefonskih poziva, frekvencije nenormalnih laboratorijskih testova uključujući uobičajene hematološke faktore, herniju seruma i profile koagulacije, kontrolu urina, urinarno izlučivanje mokraćne kiseline i krvavih stolica i ispitivanja belih krvnih zrnaca. Takođe se prati frekvencija gastrointestinalnih simptoma mereno Gl-specifično modifikovanim cistično fibroznim upitnikom (CFQ) [A. Quittner i saradnici, "CFQ Cvstic Fibrosis Questionnaire, a Health Related Quality of Life Measure", English Version 1.0. (2000)].

[0146]CF Foundation's Therapeutics Development Network Data Safety i Monitoring Board (DSMB) su obezbedili nadzor ovog ispitivanja. DSMB prati rezultate sigurnosti kohorta sa povećanim dozama kroz celo ispitivanje a formalna procena sigurnosti je zahtevana pre nego što su subjekti uključeni u kohorte sa 5.000 jedinica lipaze/kg/obrok, jer to prevazilazi trenutno preporučene doze. DSMB je takođe imao mogućnost da zaustavi ispitivanje u bilo kom trenutku zbog brige za bezbednost subjekta.

2. Kompozicija Faze 1

[0147]Tri enzimatične komponente TheraCLEC™, lipaza, proteaza i amilaza se proizvode nezavisno jedna od druge. Lipaza se dobija fermentacijom iz bakterijeBurkholderia cepacia(prethodno poznata kaoPseudomonas cepacia),a nakon toga se procesuira do kristalnog oblika lipaze koji se zatim unakrsno udvoji, stvarajući oblik enzima stabilan na kiselinu i proteaze, bez enteričnog oblaganja (važi isto kao i za TheraCLEC™-lipazu). Svaka serija se posebno uzgaja iz mikrobiološke kontaminacije saBurkholderia cepaciai mora da bude negativna zaBurkholderia cepaciapri izdvajanju serije za kliničku upotrebu. Proteaza komponenta se izdvaja izAspergillus melleus;amilaza komponenta se izdvaja fermentacijom izAspergillus oryzae.Isto tako, ovi produkti se podvrgavaju višestrukim fazama prečišćavanja nakon čega se uzgajaju na čistoj buđi i kvascu.

[0148]Komponente uključuju tri enzima. TheraCLEC™ se formuliše kao kapsula koja sadrži prašak. Prekliničke studije efikasnosti pokazuju da su lipaza i proteaza efikasne u dozi od

>500 jedinica lipaze/kg/obrok i >1000 jedinica proteaze/kg/obrok u modelu pankreatične insuficijencije psa.In vitroanalize amilaze izdvojene iz Aspergillusa u TheraCLEC™ se izvode koristeći metodologiju (koja je ekvivalentna sa USP metodologijom korišćenom za testiranje lekova) USP i FCC (Food Chemical Codex). Gljivična amilaza ima različit pH profil od amilaze dobijene od svinja. Gljivična amilaza je dvadeset puta aktivnija pri pH 4.8 neto amilaza iz svinja. Prema tome, za TheraC-LEC™ je nađeno daje doza amilaze dvadeset puta manja u odnosu na lipazu u standardnoj kapsuli pankrelipaze.

3. Analiza rezultata u Fazi 1 studije

[0149]Koeficijent apsorpcije masti se izračunava na sledeći način:

( gramiunetemasti - grami izlučene masti)x100

grami unetemasti

[0150]Ista jednačina koja koristi broj grama azota se koristi za izračunavanje koeficijenta apsorpcije azota (CNA).

[0151]Cilj je bio da se sumiraju demografske i prognostičke karakteristike, uključujući godine starosti, pol, rasu, genotip, funkciju pluća i elastazu fekalnih mrlja sa dozirajućim kohortom i ukupno. Veličina uzorka za ovu studiju Faze 1 je procenjena da bude 20 subjekata, 4 subjekta po kohortu doziranja. Studija nije predviđena za formalno statističko testiranje. Cilj je bio da se grupišu nezeželjena dejstva po standardnom sistemu klasifikacije. Učestalost nenormalnih laboratorijskih vrednosti je podeljena po periodu studije, vremenu dešavanja i doze kohorta.

4. Rezultati Faze 1 studije

[0152]Dvadeset i tri subjekta (14 M) su raspoređeni uli centara za cističnu fibrozu. Prosečna starost subjekata je bila 23.5 ± 7.8 (SD)(opseg = 15.2-44.5 godina) (Tabela 9). Po jedan dodatni subjekt je uključen u kohorte 1, 3 i 5 kao rezultat istovremenog uzimanja subjekata u nekoliko centara.

5. Sigurnost

[0153]TheraCLEC™ se dobro podnosi pri svim vrednostima doze. Nisu dokumentovana ozbiljna neželjena dejstva ili smrt i ni jedan pacijent nije odustao u toku studije. U periodu pre tretmana bez terapije enzimom, najčešće pogođeni sistem u organizmu je bio gastrointestinalni, pri čemu je 14 subjekata prijavilo ukupno 23 neželjena dejstva pre tretmana. Najčešća neželjena dejstva gastrointestinalnog trakta u periodu pre tretmana su bila neprijatnost u abdomenu (4 subjekta su prijavila 5 slučajeva), bol u gornjem abdomenu (4 subjekta su prijavila 4 slučaja) i nadimanje (4 subjekta su prijavila 4 slučaja). Drugi najčešće pogođeni sistem organizma je respiratorni sistem, gde je 5 subjekata prijavilo 8 neželjenih dejstava u periodu pre tretmana. Najčešće neželjeno dejstvo respiratornog sistema u periodu pre tretmana je bio kašalj (4 subjekta su prijavila 4 slučaja).

[0154]Neočekivana neželjena dejstva u periodu tretmana su započinjala nakon dana 2 i javila su se kod 18 (78.3%) od 23 subjekta. Nije bilo statistički značajnih razlika između kohorta u incidenci neočekivanih neželjenih dejstava u periodu tretmana (p = 0.6196). Bilo je 11 (47.8%) subjekata sa navedenim neželjenim dejstvima (definisana kao dejstva koje je istraživač podelio kao moguća ili verovatno povezana sa ispitivanim lekom).

[0155]Kod šest subjekata je registrovano povećanje alanin aminotransferaze (ALT) i/ili aspartat aminotransferaze (AST) u toku studije. Kod četiri subjekta je registrovan porast nivoa enzima koji je započeo nakon tretmana sa ispitivanim lekom. Jedan subjekt (kohort 1) je imao visoku ALT vrednost po završetku studije a jedan subjekt (konort 5) je imao povećanu AST pri naknadnoj kontroli, u poseti nakon završene studije.

6. Efikasnost

[0156]Kako je sumirano u Tabeli 10 i na Slikama 6 i 7, preliminarni rezultati kliničke aktivnosti u kohortima 1 do 4 pokazuju da tretman sa TheraCLEC™ povećava CFA i CNA kada se uporedi sa periodom bez suplementacije svih pankreatičnih enzima. Za sve subjekte u kohortima 1-4, prosečno povećanje CFA je bilo 20.6 ± 23.5% a prosečno CNA povećanje 19.7 ± 12. 2%. Težina stolice je takođe smanjena nakon tretmana sa TheraCLEC™ za ove kohorte sa prosečnim smanjenjem od 425 ± 422 grama. CFA i CNA su minimalno povećani iznad vrednosti rezultata bez enzima pri najnižem nivou doze TheraCLEC™ (Kohort 5:100 USP jedinica lipaze/kg/obrok, 100 USP jedinica proteaze/kg/obrok i 15 USP jedinica amilaze/kg/obrok).

Rezultati Faze 1 studije

[0157] Proizilazi daje TheraCLEC™ siguran i da se dobro podnosi u toku trodnevne studije. Ne postoji veza između doze i neočekivnih neželjenih dejstava u toku tretmana. Gastrointestinalne smetnje su bile česte u toku ove studije, bilo da su subjekti bili na uobičajenoj nezi, bez enzima, ili sa TheraCLEC™, mada je do njih dolazilo nešto rede u toku perioda izvan bolnice kada su subjekti bili na uobičajenom režimu. U toku intrabolničkog dela studije, subjekti su ispitani o GI smetnjama na regularnoj osnovi a studija je bila otvorena, što je dovelo do predubeđenja. Povećanje enzima jetre i prisustvo ćelija i crvenih i belih krvnih zrnaca u stolici nisu bili mnogo češći kada su subjekti bili pod terapijom sa TheraCLEC™ nego kada su bili bez enzima ili na uobičajenom tretmanu.

[0158] Poboljšana je apsorpcija masti i azota uz TheraCLEC™ u poređenju sa početnom vrednošću, što pokazuje efikasnost lipaza i proteaza komponenti TheraCLEC™. Proizilazi da nije bilo krive doza-odgovor pri dozama iznad 500 jedinica lipaze/kg/obrok. Mada je postojao trend ka smanjenju težine fekalija sa povećanjem doza, opseg je veliki. Proizilazi da su vrednosti za CFA u ovoj studiji niže nego vrednosti u objavljenoj literaturi. U moguća objašnjenja spadaju izbor predubeđenja, ishrana, kompletan zbir i tajming enzima.

[0159]Svi subjekti u ovoj studiji su imali tešku pankreatičnu insuficijenciju, kako je određeno pregledom fekalne elastaze i potvrđene nedostatkom CFA enzima. Druge studije su uključile pacijente sa pankreatičnom suficijencijom, koji su pomerili prosečne CFA na više [R.C. Stern i saradnici, "A Comparison of the Efficacv and Tolerance of Pancrelipaza and Placebo in the Tretman of Steatorrhea in Cvstic Fibrosis Patients with Clinical Exocrine Pancreatic Insufficiencv", Am J. Gasteroenterol., pp. 1932-1938 (2000); M.P Francisco i saradnici, "Ranitidine and Omeprazole as Adjuvant Therapv to Pancrealipaza to Improve Fat Absorption in Patients with Cvstic Fibrosis", J. Pediatr. Gastrenterol. Nutr., 35, pp. 79-83

(2002)].

[0160]U ovoj studiji, subjekti su uzimali najmanje 100 grama masti po danu. U literaturi su objavljene CFA vrednosti dobijene na osnovu uobičajene ishrane pacijenata zasnovanoj na smanjenom uzimanju masti, čak i brojni ambulantni pacijenti su uzimali manje od 100 grama masti po danu [P. Durie i saradnici, "Uses and Abuses of Enzvme Therapv in Cvstic Fibrosis", J. Royal Soc. Med., 91, suppl. 34, pp. 2-3 (1998); D.A. Kawchak i saradnici, "Longitudinal, Prospective Analysis of Dietary Intake in Children with Cystic Fibrosis", J. Pediatr., 129, pp. 119-129 (1996)]. Manji unos masti može lakše da se podnese rezidualnom, kompenzatornom lingvalnom lipazom što se vidi kod pacijenata sa cističnom fibrozom [B. Fredrikzon i saradnici, "Lingual Lipase: an Important Lipase in the Digestion of Dietary Lipids in Cystic Fibrosis?", Pediatr. Res., 14, pp. 1387-1390 (1980)].

[0161]Plava boja za hranu je korišćena za obeležavanje sakupljene stolice. Kao anegdota, sestre u centru za klinička istraživanja su izvestile da markeri boje karmin crvene ili boje uglja mogu da budu teške za identifikaciju u stolici. FD&C Blue # 2 u dozi od 500 mg oralno je lako vidljiva kada prođe u stolicu i jasno određuje početak i završetak sakupljanja stolice. Skraćeno uzimanje stolice će da dovede do manje masti u ukupnoj sakupljenoj stolici, što dovodi do lažno visokog CFA. Možda su prethodne studije imale lažno visoke CFA zbog teškoća u identifikaciji početka i završetka sakupljanja. Kako je uzimanje stolice neprijatno, kod ljudi postoji tendencija da završe sa uzimanjem što je moguće pre.

Claims (8)

1. Kompozicija koja uključuje lipazu, proteazu i amilazu, naznačena time što je odnos lipaze, proteaze i amilaze u navedenoj kompoziciji prilbižno 1:1:0.15 USP jedinica, pri čemu je lipaza unakrsno udvojena kristalisanaBurkholderia cepacialipaza, proteaza je kristalisanaAspergillus melleusproteaza a amilaza je amorfnaAspergillus oryzaeamilaza.

2. Kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što su kristali lipaze unakrsno udvojeni sa multifunkcionalnim sredstvom za unakrsno udvajanje.

3. Kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačena time što je multifunkcionalno sredstvo za unakrsno udvajanje bins(sulfosukcinimidil)suberat.

4. Kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što dalje uključuje farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

5. Kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je kompozicija oralni dozni oblik izabran iz grupe koja sadrži tablete, kapsule, žitke mase, sahete, suspenzije i dražeje.

6. Kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što je za upotrebu u lečenju malapsorpcije kod sisara.

7. Kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što je za upotrebu u lečenju pankreatične insuficijencije kod sisara.

8. Kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili 7, naznačena time što sisar boluje od cistične fibroze.