RS54074B1 - Metode i kompozicije koje sadrže supramolekulske konstrukte - Google Patents

Abstract

Konformaciono senzibilno antitelo koje se može dobiti antigenim konstruktom koji sadrži antigeni peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu p amiloida izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, ili njegov fragment, pri čemu je antigeni peptid ili njegov aktivni fragment modifikovan tako da ima kovalentno vezani polietilen glikol, po jedan na svakom kraju, i rekonstituisan je u lipozomu, koje antitelo ima specifičnost vezivanja za antigeni peptid i(a) ispoljava konformacionu senzibilnost i afinitet za antigen, koji je povećan u poređenju sa antitelom pobuđenim sa palmitoilovanim antigenim peptidom; i(b) indukuje tranziciju amiloidnog peptida iz β-ploče u α-zavojnicu.Prijava sadrži još 11 patentnih zahteva.

Description

Opis pronalaska

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na konformaciono senzibilna antitela i metode za njihovo dobijanje.

[0002]Imuni sistem je kompleksni sistem reakcija tela koji obuhvata mnoge različite vrste ćelija koje imaju različite aktivnosti. Aktivacija jednog dela imunog sistema obično izaziva mnoštvo reakcija zbog neželjene aktivacije drugih srodnih delova sistema. Trenutno ne postoje zadovoljavajuće metode ili kompozicije za stvaranje specifične željene reakcije ciljanjem na specifične komponente imunog sistema.

[0003]Imuni sistem je kompleksan interaktivni telesni sistem koji obuhvata mnoštvo različitih komponenti, uključujući ćelije, i ćelijske faktore, koji sadejstvuju sa stimulansima i unutar tela, i izvan tela. Pored svog direktnog dejstva, na reakcije imunog sistema takođe utiču i drugi telesni sistemi uključujući nervni, respiratorni, cirkulatorni, i digestivni sistem.

[0004]Jedan od bolje poznatih aspekata imunog sistema je njegova sposobnost da reaguje na strane antigene prezentovane invazivnim organizmima ćelijskim promenama unutar tela ili usled vakcinacije. Neke od prvih vrsta ćelija koje reaguju na takvu aktivaciju imunog sistema su fagociti i ćelije prirodne ubice. Između ostalog, fagociti obuhvataju druge ćelije, monocite, makrofage, i polimorfonuklearne neutrofile. Ove ćelije se generalno vezuju za strani antigen, internalizuju ga i često ga uništavaju. One takođe proizvode rastvorljive molekule koji posreduju u drugim imunim reakcijama, kao što su zapaljenske reakcije. Ćelije prirodne ubice mogu prepoznati i uništiti izvesne virusom inficirane embrionske i tumorske ćelije. Drugi faktori imune reakcije obuhvataju komplementarne kaskade, koje mogu da reaguju nezavisno na strane antigene ili mogu da deluju usklađeno sa ćelijama ili antitelima.

[0005]Generalno se smatra da reakcija antigena obuhvata i humoralne reakcije, i celularne reakcije. Humoralne imune reakcije su posredovane necelularnim faktorima koji oslobađaju ćelije i koji mogu ili ne moraju da se nađu slobodni u plazmi ili intracelularnim fluidima. Najvažnija komponenta humoralne reakcije imunog sistema je posredovana antitelima koja proizvode B limfociti. Ćelijski posredovane imune reakcije nastaju usled interakcija ćelija, uključujući ćelije koje prezentuju antigen i B limfocite (B ćelije) i T limfocite (T ćelije).

[0006]Jedan od najprimenjivanijih aspekata svojstava imune reakcije je proizvodnja monoklonskih antitela. Pojava tehnologije monoklonskih antitela (Mab) sredinom 1970-tih je obezbedila vredno novo terapeutsko i dijagnostičko sredstvo. Po prvi put su istraživači i klinički lekari imali pristup neograničenim količinama istih antitela sposobnih da se vezuju za unapred određeno antigeno mesto i koja imaju različite imunološke efektorske funkcije. Trenutno su tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela dobro poznate u odgovarajućoj oblasti. Međutim, i dalje postoji kontinualna potreba za specijalizovanim antitelima U suštini, ono što je poželjno je sposobnost da se stvaraju prilagođena antitela. Ova potreba je posebno velika u oblasti borbe protiv infektivnih bolesti, čiji patogeni imaju stečenu rezistenciju na najčešće primenjivane antibiotike. Pored toga, postoji potreba za antibioticima usmerenim na patološke uslove nastale iz drugačijih razloga nego što je infektivni agens.

[0007]Alchajmerova bolest (AD) je neurološki poremećaj za koji se primarno smatra da je uzrokovan obrazovanjem amiloidnih plakova izazvanih abnormalnim deponovanjem proteina u mozgu. Naučni dokazi pokazuju da AD nastaje usled povećanja proizvodnje ili akumulacije beta-amiloidnog proteina u plakovima, što dovodi do smrti nervnih ćelija. Gubitak nervnih ćelija u strateškim oblastima mozga, dalje izaziva redukciju neurotransmitera i oštećenje memorije Proteini koji su u suštini odgovorni za obrazovanje plaka obuhvataju amiloidni prekursorski protein (APP) i dva presenilina (presenilin I i presenilin II). Degradacija APPs verovatno povećava njihovu sklonost da se nagomilavaju u plakove. Zato postoji potreba za specifičnim antitelima koja mogu da ciljaju i spreče obrazovanje amiloidnih plakova.

[0008]U US 2003/108551 A1 (Nicolau et al, 2003) su opisana antitela, koja se stvaraju protiv tetrapalmitoil-terakislizin-A(31-16. Za jedno od tih antitela, R7CN, je pokazano u primerima da sprečava nagomilavanje vlakana obrazovanih od Af31-42

[0009]Simptomi AD se manifestuju polako, a prvi simptom može biti samo blaga zaboravnost. U ovom stadijumu, pojedinci mogu zaboravljati skorašnje događaje, aktivnosti, imena bliskih ljudi ili stvari i ne mogu biti u stanju da rešavaju jednostavne matematičke probleme. Kako bolest napreduje, simptomi se lakše uočavaju i postaju dovoljno ozbiljni da dovode do toga da ljudi sa AD ili njihovi članovi porodice zatraže medicinsku pomoć. Simptomi AD u srednjem stadijumu obuhvataju zaboravljanje jednostavnih zadataka, kao što je održavanje higijene, a razvijaju se i problemi sa govorom, razumevanjem, čitanjem ili pisanjem. AD pacijenti u kasnom stadijumu mogu postati anksiozni ili agresivni, mogu odlutati od kuće i apsolutno im je potrebna totalna nega

[0010]Trenutno je jedini definitivni način da se dijagnostikuje AD identifikacija plakova i spletova u moždanom tkivu na autopsiji posle smrti pojedinca. Zbog toga dok je osoba još uvek živa, lekari dijagnozu AD mogu da učine samo "mogućom" ili "verovatnom". Koristeći aktuelne metode, lekari mogu tačno dijagnostikovati AD u do 90 procenata slučajeva korišćenjem nekoliko sredstava za dijagnostikovanje "verovatne" AD. Lekari postavljaju pitanja o opštem zdravstvenom stanju osobe, prethodnim medicinskim problemima, i istoriji bilo kakvih teškoća koje osoba ima pri izvođenju svakodnevnih aktivnosti. Bihevioralni testovi memorije, rešavanja problema, pažnje, brojanja i jezika daju informacije o kognitivnoj degeneraciji, a medicinski testovi kao što su testovi krvi, urina, ili spinalnog fluida, i snimci mozga na skeneru mogu obezbediti neke dodatne informacije.

[0011]Kontrola AD se sastoji u lečenju baziranom na medikamentima i lečenju koje nije bazirano na medikamentima Lečenje koje je usmereno na pramenu aktuelnog toka bolesti (usporavanje ili preokretanje progresije) do sada su bili u velikoj meri neuspešni Za lekove koji ponovo uspostavljaju deficit (defekt), ili loše funkcionisanje hemijskih mesendžera nervnih ćelija (neurotransmitera), kao što su inhibitori holinesteraze (engl. cholinesterase inhibitors, skr. ChEIs) se pokazalo da poboljšavaju simptome. Takođe su na raspolaganju lekovi koji su usmereni na psihijatrijske manifestacije AD.

[0012]Inhibitori holinesteraze, kao što su takrin i rivastigmin, su trenutno jedina klasa agenasa koji su odobreni od strane FDA za lečenje AD. Ovi agensi su lekovi koji ponovo uspostavljaju, odnosno smanjuju defekt, ili loše funkcionisanje hemijske neurotransmisije u mozgu. ChEIs sprečavaju enzimsku degradaciju neurotransmitera, čime se povećava količina hemijskih mesendžera koji su na raspolaganju za prenos nervnih signala u mozgu.

[0013]Kod nekih ljudi sa ranim i srednjim stadijumima bolesti, lekovi takrin (COGNEX<®>, Moriš Pleins, NJ), donepezil (ARICEPT<®>, Tokio, JP), rivastigmin (EXELON<®>, Ist Hanover, NJ), ili galantamin (REMINYL<®>, Nju Brunsvik, NJ) mogu pomoći u sprečavanju pogoršanja nekih simptoma tokom ograničenog vremenskog perioda. Sledeći lek, memantin (NAMENDA<®>, Njujork, NY), je odobren za lečenje umerene do ozbiljne AD. Takođe neki lekovi pomažu u kontroli simptoma ponašanja AD kao što su nesanica, razdražljivost, lutanje, anksioznost i depresija. Lečenje ovih simptoma često čini pacijente komfornijim i olakšava negu licima koja se brinu o njima. Na nesreću, uprkos značajnim prednostima u lečenju koja ispoljava ova klasa agenasa, a koje pokazuju da je ova klasa agenasa konzistentno bolja od placeba, bolest nastavlja da napreduje uprkos lečenju, a prosečni efekat na mentalno funkcionisanje je samo umeren. ChEIs takođe imaju neželjena dejstva koja obuhvataju gastrointestinalnu disfunkciju, toksičnost za jetru i gubitak težine.

[0014]Postoji nada da će prednosti u razumevanju abnormalnosti mozga koje se pojavljuju kod AD obezbediti okvir za nove ciljeve lečenja koji su fokusirani na pramenu toka i razvoja bolesti. Trenutno se ispituju mnoga jedinjenja, uključujući antiinflamatorne agense. Takođe su u toku klinička ispitivanja u kojima se primenjuju specifični inhibitori ciklooksigenaze (COX-2), kao što su rofekoksib i celekoksib.

[0015]Sledeći faktor koji treba razmotriti pri razvoju novih lekova je lakoća upotrebe za ciljne pacijente. Davanje lekova oralnim putem - konkretno tableta, kapsula i mekih gelova - obuhvata 70% svih potrošenih dozimih oblika, zbog podesnosti za pacijente. Oni koji razvijaju lekove se slažu da pacijenti daju prednost oralnoj primeni radije nego da budu izloženi injekcijama ili drugim, invazivnijim oblicima administracije lekova. Takođe su poželjne formulacije koje rezultuju sa malim intervalima doziranja (tj. jednom dnevno ili sa odloženim oslobađanjem). Lakoća administracije antibiotika u oralnim dozirnim oblicima rezultuje povećanim pridržavanjem propisanog od strane pacijenata tokom lečenja.

[0016]Ono što je potrebno su efektivne metode i kompozicije za generisanje visoko specifičnih i visoko efektivnih antitela. Takva antitela bi prvenstveno trebala da prepoznaju specifične epitope na različitim antigenima, kao što su amiloidni protein, prionski protei n ili P170 glikoprotein.

[0017]Zbog toga su ono što je neophodno efektivne kompozicije i metode usmerene na komplikacije povezane sa neurološkom bolesti koja je povezana sa formiranjem amiloidnog plaka, kao što je Alchajmerova bolest. Ono što je posebno potrebno su specijalizovana antitela koja mogu da deluju protiv fizioloških manifestacija bolesti, kao što je formiranje plakova povezano sa agregacijom vlakana amiloidnog peptida u njegovu konformaciju beta ploče.

[0018]Predmetni pronalazak obuhvata nove metode za pobuđivanje visoko specifičnih i visoko efektivnih antitela. Za razliku od aktuelno raspoloživih proizvoda, predmetnim pronalaskom su realizovane jedinstvene metode koje rezultuju antitelima koja imaju sposobnost da prepoznaju specifične epitope niza antigena.

[0019] Predmetni pronalazak zadovoljava dugo postojeću potrebu za generisanjem antitela koja specifično prepoznaju epitope, kao što su oni od amiloidnog proteina.

[0020]Predmetni pronalazak sadrži jedinstvenu prezentaciju antigena koja rezultuje povećanim izlaganjem i konačno antitelima sa višim stepenom konformacione senzibilnosti. U jednom primeru izvođenja pronalazak obuhvata raspolaganje aminokiselinskom sekvencom p amiloida ili njegovog aktivnog fragmenta, izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, EQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, ili njegovog aktivnog fragmenta, peptidne sekvence, kovalentno vezane za pegilovanu aminokiselinu (kao što je pegilovani lizin)- po jedne na svakom kraju.

[0021]Shodno tome, cilj predmetnog pronalaska je da se realizuju metode za pobuđivanje specifičnih i efektivnih antitela.

[0022]Sledeći cilj predmetnog pronalaska je da se realizuju metode i antitela za lečenje i prevenciju pojave ili širenja bolesti.

[0023]Dalje, ovde su opisane metode i kompozicije za prevenciju, lečenje ili smanjenje bolesti pobuđivanjem aktivne celulame i humoralne reakcije kod domaćina.

[0024]Još jedan naredni cilj predmetnog pronalaska je da se realizuju metode i antitela za smanjenje i prevenciju pojave neuroloških poremećaja

[0025]Posebno je predmetnim pronalaskom realizovano konformaciono senzibilno antitelo koje se može dobiti antigenim konstruktom koji sadrži antigeni peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu (3 amiloida izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, ili njegov aktivni fragment, pri čemu je antigeni peptid ili njegov aktivni fragment modifikovan tako da ima kovalentno vezani polietilen glikol, po jedan na svakom kraju, i rekonstituisan je u lipozomu, koje antitelo ima specifičnost vezivanja za antigeni peptid i (a) ispoljava konformacionu senzibilnost i afinitet za antigen, koji je povećan u poređenju sa antitelom pobuđenim sa palmitoilovanim antigenim peptidom, i

(b) indukuje tranziciju amiloidnog peptida iz p-ploče u a-zavojnicu.

[0026]U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo prema pronalasku je lgG1 izotip.

[0027]U sledećem primeru izvođenja, pomenuto antitelo prema pronalasku posle inkubacije sa amiloidnim vlaknima dovodi do vlakana sa veličinom < 800 nm kod 40-60% od svih prisutnih vlakana.

[0028]U jednom drugom primeru izvođenja, pomenuto antitelo se vezuje za rastvorljive Ap^ooligomere.

[0029]U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku je pobuđeno sa antigenim konstruktom koji sadrži antigeni peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 koja je modifikovana tako da sadrži po jedan lizin kovalentno vezan na svakom kraju amiloidne sekvence FRHDSGY i polietilen glikol (PEG) kovalentno vezan za lizin najednom kraju i dioleil-fosfatidil holin etanolamin na drugom kraju PEG molekula, koje antitelo

(a) efikasno rastvara Ap>:_ A0\ Ap,.«vlakna;i

(b) štiti in vitro PC12 ćelije protiv apoptoze i metaboličke inhibicije indukovane sa APi.40i Apv42vlaknima

[0030]Ovo antitelo, posle administracije životinjskom ili humanom pacijentu dovodi do značajnih nivoa vraćanja memorije i pobuđivanja radoznalosti bez izazivanja krvarenja u mozgu kod imunizovanog životinjskog ili humanog pacijenta.

[0031]U izvesnim primerima izvođenja, antitelo prema bilo kom od prethodnih primera izvođenja je poliklonsko antitelo ili monoklonsko antitelo

[0032]U izvesnim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na primenu epitopa izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, i SEQ ID NO: 4, ili njegovog aktivnog fragmenta, ugrađenog u antigeni konstrukt koji sadrži antigeni peptid ili njegov aktivni fragment modifikovan tako da ima kovalentno vezan po jedan polietilen glikol na svakom kraju, i rekonstituisan u lipozomu radi generisanja antitela prema bilo kom od prethodnih primera izvođenja

[0033]Antitelo prema pronalasku koje je opisano u bilo kom od prethodnih primera izvođenja se može primeniti za pasivnu imunizaciju pojedinaca protiv neuroloških bolesti i poremećaja, pri čemu je pomenuta bolest ili poremećaj naročito Alchajmerova bolest.

[0034]Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za dobijanje konformaciono senzibilnog antitela za pasivnu imunizaciju pojedinaca protiv neuroloških bolesti i poremećaja, a naročito Alchajmerove bolesti, koji postupak sadrži rekonstituisanje antigenog konstrukta u lipozomima, pri čemu antigeni konstrukt sadrži peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu (3 amiloida ili njegov aktivni fragment, izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, ili njegov aktivni fragment, pri čemu je antigeni peptid ili njegov aktivni fragment modifikovan tako da ima po jedan polietilen glikol kovalentno vezan na svakom kraju, i pobuđuje antitelo koje je usmereno protiv antigenog konstrukta.

[0035]Ovde su takođe opisane metode i kompozicije za smanjenje i sprečavanje pojave hiperproliferativnih poremećaja.

[0036]Ovde su takođe opisane metode i kompozicije za terapeutsku imunološku intervenciju kod neuroloških poremećaja.

[0037]Dalje, ovde su opisane metode i kompozicije za vakcinaciju čoveka ili životinje protiv izabranih infektivnih organizama.

[0038]Dalje, ovde su opisane metode i kompozicije za pasivnu imunizaciju čoveka ili životinje protiv izabranih infektivnih organizama.

[0039]Dalje, ovde su opisane kompozicije supramolekulskih konstrukata koje su antigene i pobuđuju imunu reakciju protiv patološke manifestacije kod ljudi ili životinja.

[0040]Dalje, ovde su opisane kompozicije supramolekulskih konstrukata koje su antigene i pobuđuju imunu reakciju protiv patološke manifestacije kod ljudi ili životinja, pri čemu takva patološka manifestacija obuhvata abnormalnosti kao što su amiloidni plakovi.

[0041]Dalje, ovde su opisane kompozicije supramolekulskih konstrukata koje su antigene i pobuđuju imunu reakciju protiv infektivnih organizama kod ljudi ili životinja.

[0042]Dalje, ovde su opisane kompozicije vakcina koje sadrže supramolekulske antigene konstrukte koji su neimunogeni kod čoveka ili životinje koji treba da budu imunizovani sa kompozicijom; i nosače, pri čemu je antigeni peptid jedinstveno prisutan na površini nosača, tako da su rezultujuća antitela visoko specifična i imaju veći stepen konformacione senzibilnosti kada se daju čoveku ili životinji.

[0043]Dalje, ovde su opisane metode i kompozicije koje sadrže modifikovane antigene grupe radi povećanja reakcije pojedinca na bolesti i poremećaje.

[0044]Dalje, ovde su opisane kompozicije vakcina koje sadrže supramolekulske antigene konstrukte, pri čemu su peptidi modifikovani tako da pojačaju antigeni efekat

[0045]Dalje, ovde su opisane kompozicije vakcina koje sadrže supramolekulske antigene konstrukte, koji sadrže peptide modifikovane tako da pojačaju antigeni efekat, pri čemu su takvi peptidi modifikovani pegilacijom (primenom polietilen glikola ili modifikovanog polietilen glikola), ili su modifikovani drugim metodama kao što je poli-aminokiselinama (npr. poli-glicin, polihistidin), poli-saharidima (npr. poligalakturonska kiselina, polimlečna kiselina, poliglikolid, hitin, hitosan), sintetičkim polimerima (poliamidi, poliuretani, poliesteri) ili ko-polimerima (poli(metakrilna kiselina) i N-(2-hidroksi) propil metakrilamid) i sličnim.

[0046]Dalje, ovde su opisane imunogene kompozicije, pri čemu nosač za antigeni peptid sadrži modifikovane lipozome,

[0047]Dalje, ovde su opisane imunogene kompozicije, pri čemu nosač za antigeni peptid sadrži koloidni metal.

[0048]Dalje, ovde su opisane imunogene kompozicije, pri čemu nosač za antigeni peptid sadrži vezikulu dobijenu od bakulovirusa.

[0049]Dalje, ovde su opisane imunogene kompozicije u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansima za stimulisanje imune reakcije.

[0050]Dalje, ovde su opisane imunogene kompozicije koje se mogu davati intramuskularno, intravenski, transdermalno, oralno, ili subkutano.

[0051]Ovi i drugi ciljevi, karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska će postati jasni posle pregleda sledećeg detaljnog opisa jednog otkrivenog primera izvođenja i priloženih patentnih zahteva.

Fig. 1 prikazuje šematski prikaz hemijski modifikovanog 6-amiloidnog antigena.

Fig. 2 prikazuje reprezentativni šematski prikaz lipozoma rekonstituisanog sa hemijski modifikovanim amiloidnim antigenom.

Fig. 3 prikazuje šematski prikaz višestrukog P170 antigena.

Fig. 4 prikazuje sintetičke peptide, homologe sa različitim segmentima PrP°upotrebljenim za ispitivanje njihovog uticaja na vijabilnost primarnih pacovskih hipokampusnih neurona. Fig. 5 prikazuje šematski peptide dobijene od A(3 sekvenci 4-11 (SEQ ID NO: 2), 1-16 (SEQ ID NO: 5), 22-35 (SEQ ID NO: 3) i 29-40 (SEQ ID NO: 4). Fig. 6 prikazuje šematski prikaz opštih sintetičkih pristupa antigenima dobijenim od peptidnih sekvenci sa ili bez internih His ili Lys ostataka. Fig. 7 prikazuje rezultate ELISE izvedene sa 1:5000 razređenim serumima C57BL/6 miševa imunizovanih sa pegilovanim amiloidom/ lipozomima/ lipidom A. PEG-Ap^sl- -crno), PEG-AB1.16 + ALUM (- -sivo), PEG-Ap4.n(-sivo). Srednje vrednosti od 10 miševa po antigenu: srednje vrednosti od 2 miša su prikazane za A3m6 +ALUM. Kao kontrola su prikazane srednje vrednosti od 12 palmitoilovanim APm6(- - svetio sivo) injektiranih životinja (objavljeno 2002). Fig. 8 prikazuje rezultate testova evaluacije rastvorljivosti AP,.42 vlakana sa serumima C57BL/6 miševa imunizovanih sa PEG-ApVn. Intenzitet tioflavinske emisije fluorescencije je u korelaciji sa količinom fibrilarnog amiloida prisutnog u rastvoru. Obrazovanje APi.42 vlakana tokom 7 dana na 37°C u PBS, pH = 7,1. Serumi su bili dodati na dan 7, pa su inkubirani 24h. Polja 1-9 predstavljaju eksperimente rastvorljivosti izvedene sa serumima vakcinisanih životinja. Prikazane su srednje vrednosti od 4 uzorka + SD. Fig. 9 prikazuje rezultate testa rastvorljivosti Ap,.42 vlakna sa supernatantima od hibridoma klonova od palm.— C57BL/6 miševa imunizovanih sa ApM5. Obrazovanje Ap^j vlakana tokom 7 dana na 37°C u PBS, pH = 7,1. Supernatanti su bili inkubirani 24 h sfr medijum = medijum bez FCS. Hibridoma klonovi su gajeni u medijumu bez seruma 1 dan. Prikazana su 4 uzorka + SD. Fig. 10 prikazuje spektar 13C-13C korelacije amiloidnih vlakana napravljenih od amiloidnog p-peptida obeleženog na 10Tyr i 12Val. Fig. 11 prikazuje projekciju 13C-13C spektra korelacija AP-peptidnih vlakana (A) i posle inkubacije sa antitelom tokom 12 dana (B). Fig. 12 prikazuje podatke od NMR spektara za ocenjivanje efekta monoklonskih antitela na amiloidna beta vlakna. Fig. 13 prikazuje dijagram koji pokazuje uporedne podatke za pegilovane i palmitoilovane antigene. Fig. 14 prikazuje dijagram koji pokazuje uporedne podatke za pegilovani beta amiloid (1-16, 4-11, 22-35, 1-15) i palmitoilovani beta amiloid (1-16).

[0052]Predmetni pronalazak se može lakše razumeti sa pozivom na sledeći detaljni opis specifičnih primera izvođenja koji su ovde uključeni.

[0053]Ovde izveštavamo o metodu za pobuđivanje visokih imunih reakcija, velike specifičnosti, koje daju konformaciono senzibilna antitela. Ova antitela prepoznaju specifične epitope na mnoštvu antigena uključujući, ali bez ograničavanja na amiloidni protein, prionski protein, P170glikoprotein. Preciznije, mi ovde izveštavamo o konceptu modifikovanja peptida, kao što su amiloidni peptidi, da bi se pobudila poboljšana imunogena reakcija. U izvesnim slučajevima, peptidi se modifikuju pegilacijom.

[0054]Izrazi "polipeptid", "peptid", i "protein", kada se ovde upotrebljavaju, se koriste jedan umesto drugoga i definisani su tako da označe biomolekul koji se sastoji od dve ili više aminokiselina vezanih peptidnom vezom.

[0055]Izraz "peptidi" se odnosi na lance aminokiselina (obično L-aminokiselina) čiji alfa ugljenici su vezani peptidnim vezama formiranim reakcijom kondenzacije između karboksilne grupe alfa ugljenika

jedne aminokiseline i amino grupe alfa ugljenika druge amino kiseline. Krajnja aminokiselina najednom kraju lanca (tj. amino kraj) ima slobodnu amino grupu, dok krajnja aminokiselina na drugom kraju lanca (tj. karboksilni kraj) ima slobodnu karboksilnu grupu. Kao takav, izraz "amino kraj" (skraćeno N-kraj) se odnosi na slobodnu alfa-amino grupu na aminokiselini na amino kraju peptida, ili na alfa-amino grupu (imino grupu kada učestvuje u peptidnoj vezi) aminokiseline na bilo kojoj drugoj lokaciji u okviru peptida. Isto tako, izraz "karboksilni kraj" (skraćeno C-kraj) se odnosi na slobodnu karboksilnu grupu na aminokiselini na karboksilnom kraju peptida, ili na karboksilnu grupu aminokiseline na bilo kojoj drugoj lokaciji u okviru peptida.

[0056]Obično su aminokiseline koje sačinjavaju peptid numerisane po redu polazeći od amino kraja i rastući u smeru prema karboksilnom kraju peptida. Na taj način, kada je navedeno da jedna aminokiselina "sledi" drugu, onda se ta aminokiselina nalazi bliže karboksilnom kraju peptida od prethodne aminokiseline.

[0057]Kada se ovde upotrebljava izraz "ostatak", onda se on odnosi na aminokiselinu koja je ugrađena u peptid amidnom vezom. Kao takva, aminokiselina može biti aminokiselina koja se pojavljuje u prirodi ili, ukoliko nije drugačije ograničeno, može obuhvatati poznate analoge prirodnih aminokiselina koji funkcionišu na sličan način kao aminokiseline koje se pojavljuju u prirodi (tj. aminokiselinski mimetici). Pored toga, mimetici amidne veze obuhvataju modifikacije peptidnog skeleta koje su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0058]Izraz "sastoji se u suštini od" se ovde upotrebljava da bi se isključio bilo koji od elemenata koji bi u suštini izmenili bitna svojstva peptida na koje se taj izraz odnosi. Na taj način, opis peptida "koji se u suštini sastoji od ..." isključuje bilo kakve aminokiselinske supstitucije, adicije, ili delecije koje bi bitno izmenile biološku aktivnost tog peptida

[0059]Pored toga, stručnjak iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da su, kao što je gore navedeno, pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije koje menjaju, dodaju ili brišu pojedinačnu aminokiselinu ili mali procenat aminokiseline (obično manjr od 5%, još tipičnije manje od 1 %) u kodiranoj sekvenci konzervativno modifikovane varijacije, gde izmene rezultuju supstitucijom aminokiseline sa hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativnih supstitucija, koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline, su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti. Svaka od sledećih šest grupa sadrži aminokiseline koje su konzervativne supstitucije jedna za drugu: 1) Alanin (A), Serin (S), Treonin (T); 2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q);

4) Arginin (R), Lizin (K),

5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); i

6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W).

[0060]Fraze "izolovan" ili "biološki čist" se odnose na materijal koji je u suštini ili bitno oslobođen od komponenata koje ga normalno prate kada se nalazi u svom prirodnom stanju Shodno tome, ovde opisani peptidi ne sadrže materijale koji su normalno povezani sa njihovim in situ okruženjem. Izolovani, imunogeni peptidi koji su ovde opisani su obično najmanje oko 80% čisti, a obično su najmanje oko 90%, i prvenstveno najmanje oko 95% mereno intenzitetom trake na srebrom obojenom gelu.

[0061]Čistoća ili homogenost proteina može biti indikovana različitim metodama koje su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti, kao što su elektroforeza proteinskog uzorka na poliakrilamidnom gelu, praćena vizuelizacijom posle bojenja. Za izvesne svrhe potrebna je visoka rezolucija i HPLC ili se za prečišćavanje upotrebljavaju slična sredstva.

[0062]Kada imunogeni peptidi imaju relativelno malu dužinu (tj. manju od oko 50 aminokiselina), onda se oni često sintetizuju korišćenjem standardnih tehnika hemijske sinteze peptida.

[0063]Sinteza na čvrstoj fazi u kojoj se sekvenca sa C-terminalnom aminokiselinom vezuje za nerastvorljivi nosač, što je praćeno sekvencijalnom adicijom preostalih aminokiselina u sekvenci, je poželjan metod za hemijsku sintezu ovde opisanih imunogenih peptida. Tehnike za sintezu na čvrstoj fazi su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0064]Alternativno tome, ovde opisani imunogeni peptidi se sintetizuju korišćenjem metodologije rekombinantnih nukleinskih kiselina. Generalno, ovo obuhvata stvaranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid, stavljanje nukleinske kiseline u ekspresionu kasetu pod kontrolu posebnog promotera, izražavanje peptida u domaćinu, izolovanje izraženog peptida ili polipeptida i, ako je potrebno, renaturaciju peptida. U literaturi se nalaze tehnike koje su dovoljne za usmeravanje stručnjaka iz odgovarajuće oblasti kroz takve procedure

[0065]Kada su jednom izraženi, onda se rekombinantni peptidi mogu prečistiti prema standardnim procedurama, uključujući taloženje sa amonijum sulfatom, afinitetne kolone, kolonsku hromatografiju, gel elektroforezu i slično. U suštini su poželjne čiste kompozicije od oko 50 do 95% homogenosti, dok su 80 do 95% ili veća homogenost najpoželjnije za njihovu primenu kao terapeutskih agenasa

[0066]Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da posle hemijske sinteze, biološke ekspresije ili prečišćavanja, imunogeni peptidi mogu posedovati konformaciju koja je u suštini drugačija od prirodnih konformacija konstituentnih peptida. U ovom slučaju, često je neophodno da se antiproliferativni peptid denaturiše i redukuje i da se onda izazove da se peptid ponovo savije u poželjnu konformaciju. Metode za redukciju i denaturaciju proteina i indukovanje ponovnog savijanja su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0067]Antigenost prečišćenog proteina može biti potvrđena, na pnmer, demonstriranjem reakcije sa imunim serumom, ili antiserumima stvorenim protiv samog proteina

[0068]Kada se ovde upotrebljavaju izrazi "jedan", "jedna" i "taj", onda oni treba da definišu "jedan ili više" i obuhvataju množinu, osim ako to iz konteksta nije podesno.

[0069]Kada se ovde upotrebljavaju izrazi "detektovanje" ili "detektovan", onda oni znače korišćenje poznatih tehnika za detekciju bioloških molekula kao što su imunohemijske ili histološke metode i odnose se na kvalitativno ili kvantitativno određivanje prisustva ili koncentracije biomolekula koji se ispituje.

[0070]"Izolovan" predstavlja biološki molekul koji je oslobođen, odnosno ne sadrži bar neke od komponenata sa kojima se prirodno pojavljuje.

[0071]Kada se ovde upotrebljavaju izrazi "antitelo" ili "antitela", onda oni obuhvataju monoklonska antitela, poliklonalna, himerična, jednolančana, bispecifična, simijanizovana, i humanizovana antitela, kao i Fab fragmente, uključujući proizvode biblioteke za ekspresiju Fab imunoglobulina

[0072]Izraz "antigen" se odnosi na entitet ili njegov fragment koji može indukovati imunu reakciju kod sisara. Taj izraz obuhvata imunogene i regione koji su odgovorni za antigenost ili antigene determinante.

[0073]Kada se ovde upotrebljava, onda izraz "rastvorljiv" znači delimično ili kompletno rastvoren u vodenom rastvoru

[0074]Takođe kada se ovde upotrebljava izraz "imunogeni", onda se on odnosi na supstance koje pobuđuju ili pojačavaju proizvodnju antitela, T-ćelija i drugih reaktivnih imunih ćelija usmerenih protiv imunogenog agensa i doprinose imunoj reakciji kod ljudi ili životinja.

[0075]Imuna reakcija se dešava onda kada pojedinac proizvede dovoljno antitela, T-ćelija i drugih reaktivnih imunih ćelija protiv date imunogene kompozicije da bi se usmeno ili ublažio poremećaj koji treba da se leči.

[0076]Kada se ovde upotrebljava izraz "nosač", onda on označava strukturu u koju može biti ugrađen ili sa kojom može biti povezan antigeni peptid ili supramolekulski konstrukt, čime se prezentuju ili izlažu antigeni peptidi ili deo peptida imunom sistemu čoveka ili životinje Izraz "nosač" dalje sadrži metode primene, pri čemu kompozicije supramolekulskih antigenih konstrukata koje sadrže antigeni peptid mogu biti transportovane na željena mesta pomoću mehanizama za primenu. Jedan primer takvog sistema za primenu koristi koloidne metale, kao što je koloidno zlato

[0077]Pored toga, izraz "nosač" dalje sadrži mehanizme za primenu koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti uključujući, ali bez ograničavanja na hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata (engl. Kevhole limpet hemocvanin, skr. KLH), goveđi serumski albumin (BSA) i druge adjuvanse. Takođe se podrazumeva da, kao što je ovde opisano, kompozicije supramolekulskih antigenih konstrukata dalje mogu sadržati adjuvanse, konzervanse. razređivače, emulgatore, stabilizatore i druge komponente koje su poznate i koriste se u vakcinama iz stanja tehnike. Bilo koji sistem adjuvanasa koji je poznat iz odgovarajuće oblasti se može primeniti u kompoziciji. Takvi adjuvansi obuhvataju, ali nisu ograničeni na Frojndov nekompletni adjuvans, Frojndov kompletni adjuvans, polidispergovani ft-(1,4) vezani acetilovani manan ("Acemannan"), TITERMAX<®>(polioksietilen-polioksiproplenske kopolimerne adjuvanse firme CytRx Corporation), modifikovane lipidne adjuvanse firme Chiron Corporation, adjuvanse na bazi saponinskih derivata firme Cambridge Biotech, umrtvljeneBordetella pertussis,lipopolisaharid (LPS) od gram-negativnih bakterija, velike polimeme anjone kao što je dekstran sulfat, i neorganske gelove kao što su stipsa, aluminijum hidroksid, ili alumijunum fosfat.

[0078]Noseći proteini koji se mogu upotrebiti u kompozicijama supramolekulskih antigenih konstrukata koje su ovde opisane obuhvataju, ali nisu ograničene na protein koji vezuje maltozu (engl. maltose binding protein, skr. "MBP"), goveđi serumski albumin "BSA"; hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata "KLH"; ovalbumin; flagelin; tiroglobulin; serumski albumin bilo koje vrste; gama globulin bilo koje vrste; singene ćelije; singene ćelije koje nose la antigene; i polimere D- i/ili L- aminokiselina.

[0079]Dalje, izraz "efektivna količina" se odnosi na količinu antigene/imunogene kompozicije, koja kada se daje čoveku ili životinji, pobuđuje imunu reakciju. Efektivnu količinu može lako odrediti stručnjak iz odgovarajuće oblasti prateći rutinske procedure

[0080]Na primer, kompozicije supramolekulskih antigenih konstrukata se mogu davati parenteralno ili oralno u opsegu od približno 1,0 ug do 10,0 mg po pacijentu, mada ovaj opseg ne treba da bude ograničavajući. Aktuelna količina kompozicije koja je potrebna za pobuđivanje imune reakcije će varirati za svakog pojedinog pacijenta u zavisnosti od imunogenosti kompozicije koja se daje i od imune reakcije pojedinca. Shodno tome, specifična količina koja se daje pojedincu će biti određena rutinskim eksperimentisanjem i na bazi obuke i iskustva stručnjaka iz odgovarajuće oblasti.

[0081]Ovde opisane kompozicije se upotrebljavaju za proizvodnju antitela usmerenih protiv antigenih peptida. Rezultujuća antitela se daju pojedincima radi njihove pasivne imunizacije protiv niza bolesti ili poremećaja, uključujući, ali bez ograničavanja na Alchajmerovu bolest, multi medikamentozno rezistentni kancer ili prionsku bolest.

[0082]Ovde opisane imunogene kompozicije mogu sadržati lipozome napravljene rekonstituisanjem lipozoma u prisustvu prečišćenih ili delimično prečišćenih ili modifikovanih antigenih peptida. Pored toga, u iipozomima mogu biti rekonstituisani fragmenti peptida. Dalje, ovde su opisani fragmenti antigenog peptida modifikovani tako da se poveća njihova antigenost. Na primer, antigeni radikali i adjuvansi mogu biti vezani ili pomešani sa peptidom. Primeri antigenih radikala i adjuvanasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na lipofilne muramilne dipeptidne derivate, nejonske blok polimere, aluminijum hidroksidni ili aluminijum fosfatni adjuvans, i njihove smeše

[0083]Antigeni peptidi se modifikuju sa hidrofobnim radikalima, kao što je palmitinska kiselina, što olakšava inserciju u hidrofobni lipidni dvosloj nosača. Hidrofobni radikali mogu biti masne kiseline, trigliceridi i fosfolipidi, pri čemu ugljenični skelet masne kiseline ima najmanje 10 atoma ugljenika. Najpoželjniji su lipofilni radikali koji imaju masne kiseline sa ugljeničnim skeletom od najmanje približno 14 atoma ugljenika i do približno 24 atoma ugljenika. Najpoželjniji hidrofobni radikali imaju ugljenični skelet od najmanje 14 atoma ugljenika. Primeri hidrofobnih radikala obuhvataju, ali nisu ograničeni na palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, oleinsku kiselinu, linoleinsku kiselinu, i linolensku kiselinu. Najpoželjniji hidrofobni radikal je palmitinska kiselina.

[0084]Kompozicije supramolekulskih antigenih konstrukata se administriraju čoveku ili životinji da bi se indukovao imunitet na antigeni agens, kao što je infektivni organizam. Imunizovani čovek ili životinja razvija cirkulišuća antitela protiv infektivnog organizma, čime se smanjuje ili inaktivira njegova sposobnost da stimuliše bolest.

[0085]Kompozicije supramolekulskih antigenih konstrukata se takođe upotrebljavaju za dobijanje panela monoklonskih ili poliklonskih antitela specifičnih za različite poremećaje, uključujući, na primer, Alchajmerovu bolest. Antitela se pripremaju metodama koje su dobro poznate onima koji su prosečni stručnjaci iz odgovarajuće oblasti.

[0086]Kompozicije se daju čoveku ili životinji bilo kojim odgovarajućim sredstvom, a prvenstveno injekcijom. Na primer, modifikovani antigeni peptid rekonstituisan u lipozomima se daje subkutanom injekcijom. Bilo da su interno proizvedena ili pribavljena iz spoljašnjih izvora, cirkulišuća antitela se vezuju za antigen i redukuju ili inaktiviraju njegovu sposobnost da stimuliše bolest.

[0087]Lipozomi koji se mogu upotrebiti u ovde opisanim kompozicijama obuhvataju one koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. Može se upotrebiti bilo koji od standardnih lipida koji su korisni za pravljenje lipozoma. Za pravljenje takvih kompozicija se mogu upotrebiti standardni dvoslojni i višeslojni lipozomi. Mada se može primeniti bilo koji metod za pravljenje lipozoma koji je poznat stručnjaku iz odgovarajuće oblasti, najpoželjniji lipozomi se prave po metodu autora Alving et al., Infect. Immun. 60:2438-2444, 1992. Lipozom može opciono sadržati adjuvans. Poželjni adjuvans je detoksifikovani lipid A, kao što je monofosforil ili difosforil lipid A.

[0088]Kada su lipozomi vezikule, onda antigeni peptid generalno ima hidrofobni rep koji se umeće u membranu lipozoma pri njegovom formiranju. Pored toga, antigeni peptidi se mogu modifikovati tako da sadrže hidrofobni rep, da bi se mogli umetnuti u lipozom. Na primer, antigeni peptid na površini prethodno formiranih lipozoma može biti izložen hemijskom vezivanju ili elektroinserciji.

[0089]Ovde realizovana antitela su monoklonska ili poliklonska antitela koja imaju specifičnost vezivanja za infektivne organizme ili antigene peptide reprezentativne za različite poremećaje, kao što su Alchajmerova bolest, multi medikamentozno rezistentni kancer i prionske bolesti.

[0090]Monoklonsko antitelo se priprema imunizacijom životinje, kao što je miš ili zec, sa ovde opisanim kompozicijama supramolekulskih antigenih konstrukata. Ćelije slezine su uzete od imunizovanih životinja, a hibridomi su generisani fuzionisanjem senzibilizovanih ćelija slezine sa mijeloma ćelijskom linijom, kao što su misije SP2/0 mijeloma ćelije (ATCC, Manassas, VA). Da bi se fuzionisale ćelije su bile indukovane dodavanjem polietilen glikola. Hibridomi su hemijski selektovani zasejavanjem ćelija u medijumu za selekciju koji je sadržao hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT).

[0091]Hibridomi su posle toga ispitani u pogledu sposobnosti proizvodnje monoklonskih antitela protiv specifičnih bolesti ili poremećaja. Hibridomi koji proizvode antitela od interesa su klonirani, ekspandovani i zamrznuti za buduću proizvodnju. Poželjni hibridom proizvodi monoklonsko antitelo koje ima IgG izotip, a još poželjnije lgG1 izotip.

[0092]Poliklonsko antitelo se priprema imunizovanjem životinja, kao što su miševi ili zečevi sa gore opisanim kompozicijama supramolekulskih antigenih konstrukata. Posle toga od životinja su uzeti krvni serumi, pa su antitela u serumima ispitana u pogledu reaktivnosti protiv ciljnih agenasa.

[0093]Bilo monoklonsko antitelo ili poliklonsko antitelo ili oba mogu biti direktno obeleženi sa detektabilnim markerom za identifikaciju ciljnog agensa u biološkom uzorku kao što je dole opisano. Markeri za primenu u imunotestovima su generalno poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i obuhvataju enzime, radioizotope, i fluorescentne, luminescentne i hromogene supstance, koje obuhvataju obojene čestice, kao što su koloidne zlatne i lateks perle. Antitela takođe mogu biti vezana za čvrstu fazu da bi se olakšalo razdvajanje kompleksa antitelo-antigen od neizreagovalih komponenata u imunotestu. Primeri supstanci za čvrste faze obuhvataju, ali nisu ograničeni na mikrotitarske ploče, test epruvete, magnetne, plastične ili staklene perle ili ploče. Metode za kuplovanje antitela za čvrste faze su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0094]Alternativno tome, antitelo može biti indirektno obeleženo reakcijom sa obeleženim supstancama koje imaju afinitet za imunoglobulin, kao što su protein A ili G ili druga antitela. Antitelo može biti konjugovano sa drugom supstancom i detektovano sa obeleženom trećom supstancom koja ima afinitet za drugu supstancu konjugovanu sa antitelom Na primer, antitelo može biti konjugovano sa biotinom, pa konjugat antitelo-biotin može biti detektovan korišćenjem obeleženog avidina ili streptavidina. Slično tome, antitelo može biti konjugovano sa haptenom, pa konjugat antitelo-hapten može biti detektovan korišćenjem obeleženog anti-haptenskog antitela. Ove i druge metode obeležavanja antitela i testiranja konjugata su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0095]Antitelo može biti obeleženo indirektno na osnovu reaktivnosti sa drugim antitelom koje je obeleženo sa detektabilnim markerom. Drugo antitelo je prvenstveno ono koje se vezuje za antitela životinje od koje je dobijeno monoklonsko antitelo. Drugim rečima, ako je monoklonsko antitelo mišije antitelo, onda je obeleženo drugo antitelo anti-mišije antitelo. Za monoklonsko antitelo koje je upotrebljeno u testu koji je dole opisan, ovaj marker je prvenstveno perla obložena antitelom, a naročito magnetna perla. Za poliklonsko antitelo koje je upotrebljeno u ovde opisanom imunotestu, marker je prvenstveno detektabilni molekul, kao što je radioaktivna, fluorescentna ili elektrohemiluminescentna supstanca.

Formulacije

[0096]Prirodni ili sintetički protein, peptid, ili fragment proteina, koji sadrži sve ili aktivni deo imunogenog proteina ili peptida mogu se pripremiti u fiziološki prihvatljivu formulaciju, kao što je u farmaceutski prihvatljivom nosaču, korišćenjem poznatih tehnika. Na primer, protein, peptid ili fragment proteina se sjedinjuje sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom da bi se formirala terapeutska kompozicija.

[0097]Alternativno tome, gen za protein, peptid, ili fragment proteina, koji sadrži ceo ili aktivni deo imunogenog peptida, se mogu davati u vektoru za kontinualnu administraciju korišćenjem tehnika genske terapije. Vektor se može davati u nosaču koji ima specifičnost za ciljno mesto, kao što je tumor.

[0098]Kompozicije se mogu primenjivati u čvrstom, tečnom ili obliku aerosola. Primeri čvrstih kompozicija obuhvataju pilule, kremove i implantabilne dozirne jedinice. Pilule se mogu primenjivati oralno. Terapeutski kremovi se mogu primenjivati topički. Implantabilne dozirne jedinice se mogu primenjivati lokalno, na primer, na mestu tumora, ili se mogu implantirati radi sistemskog oslobađanja terapeutske kompozicije, na primer, subkutano. Primeri tečnih kompozicija obuhvataju formulacije prilagođene za injektiranje intramuskularno, subkutano, intravenski, intra-arterijski, kao i formulacije za topičku i intraokularnu administraciju. Primeri aerosolnih formulacija obuhvataju formulacije za inhalatore za administraciju u pluća.

[0099]Kompozicije se mogu administrirati standardnim načinima primene. Generalno, kompozicija se može primenjivati topičkim, oralnim, rektalnim, nazalnim ili parenteralnim (na primer, intravenskim, subkutanim, ili intramuskularnim) putem. Pored toga, kompozicija se može inkorporirati u matrice za odloženo oslobađanje, kao što su biodegradabilni polimeri, i to polimeri koji se implantiraju u blizini mesta gde je poželjno davanje, na primer, na mestu tumora. Metod obuhvata administraciju pojedinačne doze, administraciju ponovljenih doza u unapred određenim vremenskim intervalima, i administraciju odloženu za unapred određeni period vremena

[0100]Kada se ovde upotrebljava, matrica za odloženo oslobađanje je matrica napravljena od materijala, a obično polimera koji su degradabilni enzimskom ili kiselom/baznom hidrolizom ili rastvaranjem. Kada se jednom umetne u telo, onda na matricu deluju enzimi ili telesni fluidi Poželjno je da se matrica za odloženo oslobađanje izabere između biokompatibilnih materijala, kao što su lipozomi, polilaktid (polimlečna kiselina), poliglikolid (polimer glikolne kiseline), polilaktid ko-glikolid (kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline), polianhidridi, poli(orto)estri, polipeptidi, hijaluronska kiselina, kolagen, hondroitin sulfat, karboksilne kiseline, masne kiseline, fosfolipidi, polisaharidi, nukleinske kiseline, poliaminokiseline, aminokiseline kao što su fenilalanin, tirozin, izoleucin, polinukleotidi, polivinil propilen, polivinilpirolidon i silikon. Poželjna biodegradabilna matrica je matrica jednog od polilaktida, poliglikolida, ili polilaktida ko-glikolida (ko-polimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline).

[0101]Doziranje kompozicije će zavisiti od stanja koje se tretira, a naročito upotrebljene kompozicije i drugih kliničkih faktora, kao što su težina i stanje pacijenta i način primene.

[0102]Kompozicija se može primenjivati u kombinacii sa drugim kompozicijama i procedurama za lečenje bolesti. Na primer, neželjena proliferacija ćelija se može obično lečiti hirurški, zračenjem ili hemoterapijom u kombinaciji sa administracijom kompozicije, a dodatne doze kompozicije se mogu sledstveno primeniti na pacijentu da bi se stabilizovao i inhibirao rast bilo koje rezidualne nepoželjne ćelijske proliferacije.

Supramolekulski antigeni konstrukti

[0103]Supramolekulski antigeni konstrukti koji su ovde opisani generalno sadrže peptide modifikovane da pojačaju antigeni efekat, pri čemu su takvi peptidi modifikovani pegilacijom (korišćenjem polietilen glikola ili modifikovanog polietilen glikola), ili su modifikovani nekom drugom metodom, kao što je sa palmitinskom kiselinom, poli-aminokiselinama (npr. poli-glicin, poli-histidin), polisaharidima (npr. poligalakturonska kiselina, polimlečna kiselina, poliglikolid, hitin, hitosan), sintetičkim polimerima (poliamidi, poliuretani, poliesteri) ili ko-polimerima (npr. poli(metakrilna kiselina) i N-(2-hidroksi) propil metakrilamid) i sličnim.

[0104]Ovde opisani supramolekulski antigeni konstrukti mogu sadržati peptidnu sekvencu, kovalentno vezanu za pegilovani lizin- po jedan na svakom kraju. Dužina PEG (polietilenglikolskog) lanca može varirati od 8 do 150000. Slobodni PEG kraj je kovalentno vezan za molekul fosfatidiletanolamina (pri čemu masna kiselina može biti: miristinska, palmitinska, stearinska, oleinska itd. ili njihova kombinacija). Ova supramolekulska struktura može biti rekonstituisana u lipozome koji se sastoje od fosfolipida i holesterola (fosfatidiletanol amin, fosfatidil glicerol, holesterol u različitim molskim odnosima. Mogu se primeniti i drugi fosfolipidi. Lipid A se upotrebljava u koncentraciji od približno 40 mg/pmol fosfolipida

[0105]U izvesnim slučajevima, supramolekulski antigeni konstrukti sadrže peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu beta-amiloida. Peptidi mogu takođe sadržati ili odgovarati ćelom amiloidnom beta peptidu i njegovim aktivnim fragmentima. Pored toga, peptidi koji se mogu koristiti za predmetni pronalazak dalje obuhvataju AB4.n(SEQ ID NO: 2), A622.35(SEQ ID NO: 3), i Ap29.40 (SEQ ID NO: 4) i Ap1.16(SEQ ID NO: 5); i njihove aktivne fragmente

[0106]Pored toga, ovde je opisan supramolekulski 1 antigeni konstrukt koji sadrži peptidne sekvence koje sadrže ekstracelularne petlje 1, 4 i 6 od P170 glikoproteina. Supramolekulski 1 antigeni konstrukt može sadržati peptidne sekvence koje sadrže aminokiselinske sekvence 109-129 prionskog proteina.

[0107]Predmetni pronalazak dalje sadrži monoklonska antitela koja su pobuđena protiv supramolekulske strukture rekonstituisane u lipozomu, pri čemu, na primer, peptidna sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu amiloidnog proteina. Pored toga, ovde su opisana monoklonska antitela koja su pobuđena protiv supramolekulskih struktura, pri čemu je peptidna sekvenca jedna/ili nekoliko aminokiselinskih sekvenci iz P- glikoproteinskih (Pi70) ekstracelularnih petlji.

[0108]Takođe su u predmetni pronalazak uključena monoklonska antitela koja su pobuđena protiv supramolekulske strukture, pri čemu peptidne sekvence sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu između proteina od interesa. Preciznije, na primer, pronalazak obuhvata monoklonska antitela koja su pobuđena protiv supramolekulske strukture rekonstituisane u lipozomu, pri čemu je peptidna sekvenca aminokiselinska sekvenca koja je izabrana između beta amiloidnog proteina (4 -10, ili 1 - 8, ili 8 - 16, itd.), koja ne indukuje cerebralno krvarenje kod transgenskih miševa za humanu Alchajmerovu bolest. Pronalazak dalje sadrži monoklonska antitela senzibilna na konformacione karakteristike antigenih peptida. Specifični protokoli za dobijanje antitela prema predmetnom pronalasku i specifične informacije koje se odnose na karakterizaciju takvih antitela su date u Primerima u nastavku.

Amiloid

[0109]Bilo je sintetizovano 7 aminokiselinskih sekvenci: FRHDSGY (SEQ ID NO:1) B-amiloida. Po jedan lizin je bio kovalentno vezan za svaki kraj sekvence (1). Lizini, pre vezivanja za gore navedenu sekvencu su reagovali sa lancem polietilenglikola (PEG, n = 8-2000). Polietilenglikolski lanci vezani za lizin na jednom kraju su kovalentno vezani za molekul dioleil-fosfatidilholin etanolamina (ili bilo koje masne kiseline - fosfatidilholina) kao što je opisano (2)

[0110]Onda je hemijski modifikovani antigen rekonstituisan u lipozomima koji se sastoje od fosfolipida i hoiesterola (3). Primeri podesnih lipozoma obuhvataju, ali nisu ograničeni na DOPG, DOPEA, Chol.

(lipid A je bio u koncentraciji od 40 mg/mmol fosfolipida.) Reprezentativni šematski prikaz lipozoma rekonstituisanog sa hemijski modifikovanim amiloidom-antigenom je prikazan na Fig. 2.

[0111]Ovde opisani supramolekulski antigeni konstrukti imaju velike prednosti u odnosu na palmitoilovane antigene, rekonstituisane u lipozomima. Primarno, dugi PEG lanci (n - 8 - 5000) znatno pojačavaju izlaganje i dostupnost peptidne sekvence. Prezentacija antigena je poboljšana, a senzibilnost konformacije pobuđenih antitela je povećana. Sledeća prednost je ta što se mogu upotrebiti peptidne sekvence u različitim konformacijama. Povećano rastojanje između sekvence i površine lipozoma obezbeđuje da površina ne sadejstvuje sa sekvencom, čime bi eventualno uticala na njegovu konformaciju. Takođe, antigenost konstrukta postaje znatno veća nego kod palmitoilovanih sekvenci rekonstituisanih u lipozomima. Visoki titri antitela, sa sadržajem između 1:5000 i 1:10000, su dobijeni kod miševa, u okviru nekoliko nedelja. Pored toga, afinitet antitela za antigen je znatno povećan. U slučaju amiloidne sekvence FRHDSGY (SEQ ID NO:1), antitela pobuđena sa ip ili iv injekcijom konstrukta su efikasno rastvaralaAp,.^iA^. A2vlakna,štitećiin vitroPC12 ćelije protiv apoptoze i metaboličke inhibicije (MTT redukcija) indukovane Ap,_42 i Ap,.40 vlaknima.

[0112]U jednom ovde opisanom slučaju se upotrebljava FRHDSGY (SEQ ID NO: 1) sekvenca amiloidnog proteina, međutim, ona može biti zamenjena bilo kojom drugom amiloidnom proteinskom sekvencom. Monoklonska antitela dobijena od miševa imunizovanih sa opisanim konstruktom, pored gore navedenihin vitrosvojstava za poliklonska antitela, ispoljavaju biološku aktivnost kod APP[V717I] FVB transgenskih miševa za humanu Alchajmerovu bolest Uočeni su značajni nivoi restauracije memorije i pobuđivanja radoznalosti kod ovih miševa. mAb ne indukuje krvarenje u mozgu kod imunizovanih, transgenskih miševa.

[0113]Mada ne želimo da se vezujemo za sledeću teoriju, baziranu nain vitrostudijama interakcije antiamiloida mAb (protiv 1-16 sekvence, generisane ovde opisanim metodama) uglavnom za rastvaranje vlakana i CD spektre, izgleda da se antitela vezuju prvenstveno za p-amiloid u njegovoj konformaciji a-zavojnice. Ovo bi objasnilo efekat rastvaranja amiloidnog vlakna u termodinamičkom smislu. Pošto vezivanjem prvenstveno za a-zavojnicu antitelo izvodi amiloid u obliku a-zavojnice iz ravnoteže:

time se povećavaju količine p-amiloida u konformaciji p-ploče koje se podvrgavaju konformacionoj tranziciji iz rastvorljivog oblika a-zavojnice sa ciljem da se ponovo uspostavi ravnoteža. Izvršena stehiometrijska zapažanja podržavaju ideju da mAbs utiču direktno na ravnotežu konformacija.

[0114]Kao što je elaborirao Selkoe (2002), Alchajmerova bolest izgleda kao sinaptički defekt. U ranijim stadijumima bolesti gubitak memorije može poticati od takvog otkaza. Smatra se da rastvorljivi oligomeri Ap,.40mogu, na primer, da blokiraju sinapse. Monoklonska antitela, generisana ovde opisanim metodama, vezuju se za rastvorljive oligomere Ap,.40. Merenja provodnosti sinapsi u prisustvu i odsustvu antitela omogućavaju određivanje dejstva antitela na sinapse, u prisustvu rastvorljivih oligomera.

[0115]Pronalazači predmetnog pronalaska su proverili aktivnost više dobijenih mAbs sa epitopima kao štosu Ap4..n(SEQ ID NO: 2), Ap22.35 (SEQ ID NO: 3), i A(329.40 (SEQ ID NO: 4) ugrađenim u supramolekulski konstrukt (vidi Fig. 5). Sekvenca 4-11 je bila određena da bude epitop za mAb pobuđena sa palmitoilovanim Ap 1-16 antigenom (SEQ ID NO: 5).

[0116]Prema ovde opisanim metodama, novi i jedinstveno modifikovani peptidni antigeni su bili upotrebljeni u cilju da se pobude mAbs:

Ostatak 22-35: EDVGSNK GAIIGLM (SEQ ID NO:3)

[0117]Za spojeve između ekstracelularnih i transmembranskih (TM) domena utvrđeno je da ih ciljaju inhibitorna antitela (kao što su Herceptin-Trastuzumab anti-HER2/neu antitela), a kod višestruko premošćavajućih TM proteina da obrazuju džepove koje ciljaju inhibitori male molekulske težine (Dragic et al., 2000). Mada ne želimo da se vezujemo za sledeću teoriju, verovatno je da je ova sekvenca krucijalna za kapacitet oligomerizacije Ap,-42i Ap^o, pošto ona predstavlja prelaz između polarnih i hidrofobnih regiona (pri čemu se izraz "ekstracelularna sekvenca" upotrebljava za označavanje ekstracelularnih sekvenci u AP, 42 amiloidogenoj sekvenci). Sekvenca sadrži prva dva GXXXGXXXG motiva Ap142 i Ap,.40 sekvenci. GXXXG su ključni induceri za oligomerizaciju hidrofobnih sekvenci (Russ i Engelmann, 2000). Interesantno je da je predviđeno da je GXXXG motiv ekstracelularan, dok je za sledeća dva predviđeno da se nalaze u membrani. Mada ne želimo da budemo vezani za sledeću teoriju, može se po analogiji pretpostaviti daje oligomerizacija AB peptida specifično aktivirana sa GXXXG motivima. Ostaci 29-40: GAIIGLMVGGVV (SEQ ID N0.4)

[0118]Hidrofobna sekvenca od AP,.42 i AB,.^sadrži motiv GXXXGXXXGG, za koji je utvrđeno da indukuje jaku oligomerizaciju hidrofobnih sekvenci (Eilers et al., 2002; Leeds et al., 2001; Lemmon et al., 1994; Russ i Engelmann, 1999; Russ i Engelmann, 2000; Smith i Bormann, 1995). Ovaj motiv se smatra primarnom metom za terapeutske pristupe; pošto on igra veliku ulogu u patogenim procesima koji dovode do formiranja, oligomerizacije i akumulacije AB1.42i ApY40U intaktnoj sekvenci od APP, verovatno je da ovaj motiv pokriva nizvodnu sekvencu koja treba da se razvije y-sekretazom u procesu, kao što je pokazano za SREBP odvajanje (Ye et al., 2000). Ovu sekvencu nije niko identifikovao kao važnu za amiloidnu oligomerizaciju. Kao što je ovde navedeno, supramolekulski modifikovani (prvenstveno pegilovani) antigeni koji su ovde opisani imaju visoku antigenost, a antitela koja su pobuđena njima imaju više afinitete. Pored Ap,.^, supramolekulski konstrukti takođe obuhvataju peptide koje predstavljaju Ap4.„ (SEQ ID NO: 2), Ap22.35 (SEQ ID NO 3), Ap29.40 (SEQ ID NO: 4) za primenu u vakcinama.

[0119]Metodologije za mono-pegilaciju peptida na N-a-poziciji su poznate i široko se primenjuju. Mesno specifična mono-pegilacija na internim, N- ili C- terminalnim aminokiselinskim ostacima peptida srednje veličine je takođe bila opisana bilo posle pristupa sa čvrstom fazom ili sa graftovanjem peptida. Međutim, pokazalo se da su sintetički pristupi sa čvrstom fazom za di-pegilovane peptide ozbiljno sprečeni sterinskim blokiranjem i posle početka ovog projekta nije bilo izveštaja o efikasnim sintetičkim metodologijama za takva jedinjenja. Dalje, peptidi koji su mesno specifično derivatizovani na N- i C-krajevima i sa PEG, i sa lipidnim radikalom nisu bili prethodno opisani. Ovde aktuelni pronalazači opisuju novu metodologiju za sintezu takvih Ap peptidnih konjugata.

[0120]Pri dolasku do predmetnog pronalaska bilo je pokušano nekoliko pristupa, od kojih je većina bila neuspešna. Na primer, inicijalni pristup sintezi, koji je fokusiran na graftovanje konjugata lipid-PEG na smoli je sadržao distalne amino grupe, do peptida sa zaštićenim bočnim lancem (Ap4.n, ^16. 22.35 i 29-4o) koji su sadržali terminalne ostatke glutaminske kiseline. Nisu uočeni proizvodi kuplovanja pod širokim spektrom reakcionih uslova. Kao što je opisano u Primeru 2 i prikazano na Fig. 5, supramolekulski konstrukti koji su ovde opisani su bili generalno sintetizovani korišćenjem zaštite bočnih lanaca aminokiselina sa Fmoc/tBu.

[0121]Ovaj novi pristup sintezi N- i C-terminalnih lipid-PEG fi-amiloidnih antigena korišćenjem zaštićenih peptida se može primeniti na široki spektar peptidnih sekvenci uključujući, na primer, protein multi medikamentozne rezistencije P-glikoprotein.

[0122]Sa ciljem da se oceni efikasnost ovde opisanih antigenih peptida, bili su izvedeni eksperimenti da bi se uporedila imunogenost pegilovanih i palmitoilovanih antigena uz korišćenje ELISE i testova disagregacije (vidi Primer 2, i Fig. 7). Podaci iz ELISE pokazuju da je lipozomski PEG-AP,.1Sbio znatno imunogeniji od palmitoilovanog ApM6. Dodatni ALUM nije pojačao imunogenost PEG-Ap,.^ kod miševa. Reakcija antitela indukovana sa PEG-Ap4.n je bila sporija u poređenju sa PEG-Ap116.

[0123]Zbog toga u suštini predmetni pronalazak obezbeđuje nova monoklonska antitela protiv supramolekulskih antigena izloženih različitim amiloidnim sekvencama. Naročito su razvijeni originalni sintetički procesi sa ciljem da se dva polietilen glikolna (n=70) lanca kovalentno vežu za izabrane amiloidne sekvence Na slobodnom kraju PEG lanca je bio kovalentno vezan fosfatidil etanol amin. Mada ne želimo da budemo vezani za sledeću teoriju, veruje se da je njegova funkcija da veže pegilovanu amiloidnu sekvencu u dvosloju lipozoma Ovde je pokazano da pegilacija povećava imunogenost antigena u poređenju sa palmitoilacijom Studije afiniteta, određivanje epitopa, indukcija konformacione tranzicije sa ovim monoklonskim antitelima su bili nedavno izvedeni u našoj laboratoriji Jedinstvena metodologija modifikacije koja je ovde opisana se može primeniti na mnoštvo peptida i može u načelu biti upotrebljena u terapeutskim formulacijama i vakcinama za bolesti i poremećaje uključujući, ali bez ograničavanja na Alchajmerovu bolest, kancer, i infektivne bolesti

[0124]Kao što je ovde opisano, supramolekulski antigeni konstrukti sadrže peptide koji su modifikovani da bi pojačali antigeni efekat, pri čemu su takvi peptidi modifikovani pegilacijom (korišćenjem polietilen glikola ili modifikovanog polietilen glikola), ili su modifikovani nekom drugom metodom, kao što je sa palmitinskom kiselinom, poli-aminokiselinama (npr. poli-glicin, poli-histidin) poli-saharidima (npr. poligalakturonska kiselina, polimlečna kiselina, poliglikolid, hitin, hitosan), sintetičkim polimerima (poliamidi, poliuretani, poliesteri) ili ko-polimerima (poli(metakrilna kiselina) i N-(2-hidroksi) propil metakrilamid) i sličnim. Za terapeutsku intervenciju kod neuroloških poremećaja, kao što je Alchajmerova bolest, supramolekulski antigeni konstrukti sadrže modifikaciju amiloidnih beta peptida.

Multi medikamentozna rezistencija 1 ( MDR 1) u ćelijama kancera

[0125]Multi medikamentozna rezistencija 1 u ćelijama kancera je izazvana prekomernom ekspresijom P-glikoproteina (P170), membranske pumpe koja izbacuje veliko mnoštvo nesrodnih hemoterapeutskih agenasa iz ćelija kancera.

[0126]Imunizacija sa palmitoilovanim ekstracelularnim sekvencama P170, rekonstituisanim u lipozomima, dovodi do ponovnog uspostavljanja senzibilnog fenotipain vitrou MDR1 L12io mišijim ćelijama leukemije (3). Drugi rezultati su dobijemin vivo(Madoulet, Tosi, Nicolau et al., 2002 - nepublikovani rezultati) koji ukazuju na 70% povećanje poluživota preživljavanja kod imunizovanih miševa, inokulisanih sa MDR ćelijama kancera, podvrgnutim hemoterapiji.

[0127]Ovde je demonstrirano daje antigen koji se sastoji od P-|70 ekstracelularnih sekvenci 1,4 i 6 konstruisan, u skladu sa metodom koji je ovde opisan, daleko efikasniji u pobuđivanju antitela koja u velikoj meri menjaju MDR fenotip u senzibilni fenotipin vitroiin vivo.

[0128]U skladu sa metodama koje su ovde opisane bili su sintetizovani peptidi koji odgovaraju P170ekstracelularnim petljama 1, 4 i 6, a zatim su vezani za pegilovane lizine -1 na svakom kraju - koji su dalje kovalentno vezani za jedan molekul dioleil fosfatiletanolamina na svakom kraju. Može se upotrebiti bilo koja masna kiselina, miristinska, palmitinska, stearinska ili polinezasićena masna kiselina

[0129]Ova 3 konstrukta su bila rekonstituisana u lipozomima koji se sastoje od PC-PEA-PG-holesterola (ili bilo koje druge kombinacije fosfolipida i holesterola). Lipid A je dodat u koncentraciji od 40 ug/umol fosfolipida. Odnos peptid: fosfolipid je bio 1 : 200 (mogu se koristiti i drugi odnosi).

[0130]Dužina lanaca polietilenglikola varira: što je duža peptidna sekvenca, to treba da bude veći broj PEG molekula u lancu. Za 3 upotrebljene sekvence, dužina PEG lanca varira od 10 do 5000. Mogu se upotrebiti i druge dužine lanaca. Fig. 3 je reprezentativni šematski prikaz višestrukog P170antigena.

[0131]IP inokulacija ovog antigena, praćena sa tri pojačanja u intervalima od 2 nedelje pobuđuje visoke titre anti P170antitela (1:5000-1:10000) koji mogu da blokiraju aktivnost pumpanja P170,in vitroiin vivo.

Prionske bolesti

[0132]Prioni izazivaju neurodegenerativne bolesti kao što su grebež kod ovaca, goveđa spongiformna encefalopatija kod stoke i Krojcfeld - Jakobova- bolest kod ljudi Jedina poznata komponenta čestice je izoforma proteina grebeža, PrP<Sc>. Mada se prioni umnožavaju, ne postoji dokaz da oni sadrže nukleinsku kiselinu. PrP<Sc>je dobijen od neinfektivnog ćelijskog proteina PrP<c>posttranslacionim procesom tokom koga se PrP<c>podvrgava značajnoj promeni konformacije

[0133]Protein grebeža, PrP<Sc>ima kritičnu ulogu u degeneraciji neurona i tokom razvoja bolest prolazi kroz tri stadijuma kao što sledi: (normalna ćelijska izoforma proteina) PrP<c->infektivni oblik (izoforma proteina grebeža) PrP<Sc>protein PrP27-30 Takva kaskada događaja se dešava tokom razvoja Krojcfeld - Jakobove bolesti (CJD), Kuru, Gerstman - Štrausler-Šajnkerovog sindroma (GSS), fatalne familijarne nesanice kod ljudi, grebeža kod ovaca i koza, encefalopatije kod lasica i goveđe spongiformne encefalopatije kod stoke.

[0134]Ćelijski netoksični protein (PrP<c>je sijaloglikoprotein od MW 33-35 K koji se predominantno izražava u neuronima. Kod gore navedenih bolesti, PrP<c>se pretvara u izmenjeni oblik (PrP<Sc>), koji se razlikuje od svog normalnog homologa po svojoj relativnoj otpornosti na razlaganje proteazom. PrP<Sc>se akumulira u centralnom nervnom sistemu obolelih životinja i pojedinaca, a njegovo jezgro otporno na proteazu se nakuplja ekstracelularno. Molekulska osnova patogeneze nije poznata.

[0135]Veoma interesantna zapažanja su načinjena što se tiče neurotoksičnosti fragmenta proteina, koja može imati uticaja na razumevanje mehanizma degeneracije ćelija koja se pojavljuje kod odgovarajućih encefalopatija.

[0136]Na osnovu ovog zapažanja, da je beta-amiloidni fragment odgovoran za ekstracelularno deponovanje amiloidnih vlakana i plakova kod Alchajmerove bolesti neurotoksičan, postavljena je hipoteza da bi neuronska smrt kod srodnih encefalopatija mogla biti uzrokovana toksičnim efektima abnormalne ekstracelularne akumulacije PrPSc i/ili proizvodima njene degradacije.

[0137]Sintetički peptidi, homologi sa različitim segmentima PrPc su bili upotrebljeni za ispitivanje njihovog uticaja na vijabilnost primarnih pacovskih hipokampusnih neurona (Fig. 4)

[0138]Ovde je bilo je pokazano da se neuronska smrt dešava zbog hroničnog izlaganja primarnih pacovskih hipokampusnih kultura mikromolskim koncentracijama peptida koji odgovara ostacima 106-126 aminokiselinske sekvence dobijene od humane PrP<c>kDNK, na način zavisan od koncentracije (Primer 1).

[0139]Kao što je detaljno opisano u Primeru 1, bilo je pokazano da se neuronska smrt indukovana sa PrP 106-126 dogodila usled apoptoze na način zavisan od doze. Kod finalnih stadijuma subakutnih encefalopatija, kao što je grebež, PrP<Sc>dostiže u ćelom mozgu koncentracije od 10 do 20 puta veće od PrP<c>, što upadljivo nalikuje podacima navedenim u Tabeli 1 za 2 koncentracije PrP106-126.

[0140]Proces programirane ćelijske smrti indukovane sa PrP106-126 je povezan, između ostalog, sa indukcijom „testosterone - repressed prostate message - 2" gena (TRPM-2). Nije poznato da li je apoptoza aktiviranain vivokod srodnih encefalopatija, ali je ekspresija TRPM-2 iRNK izražena 10-struko više kod grebežom inficiranih hrčaka.

[0141]Na osnovu ovih podataka sledi da je neurotoksični mehanizam verovatno odgovoran za gubitak nervnih ćelija kod odgovarajućih encefalopatija i da bi takođe mogao biti relevantan kod Alchajmerove bolesti.

[0142]Mogući mehanizam ove neurotoksičnosti je bio ispitivan u modelu sistema koji je usmeren na detektovanje i analizu formiranja jonskih kanala posle interakcije peptida ili proteina sa lipidnim dvoslojevima.

[0143]Niski pH, koji podstiče formiranje kanala pomoću PrP106-126, takođe pretvara ovaj peptid iz konformacije alfa-zavojnice u (3-ploču. Dok mapiranje peptida PrPSc Edmanovim sekvenciranjem i masenom spektrometrijom nije otkrilo razlike između njegove aminokiselinske sekvence i one koja je predviđena na osnovu sekvence PrP°gena; a nisu pronađene ni hemijske modifikacije tamo gde se moglo očekivati da se PrP<Sc>razlikuje od PrP<p>; međutim, infracrvena spektroskopija sa Furijeovim transformacijama i cirkularna dihromna spektroskopija su otkrile značajne konformacione razlike između Pr<psc>i<p>r<ppc>

[0144]PrP<c>je u suštini a-zavojnica sa malo ili nimalo p -ploča, dok PrP<Sr>'ima visoki sadržaj p-ploča i manje a-zavojničke strukture.

[0145]Sekvenca KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG (PrPI06-126) (SEQ ID NO: 6) nije samo veoma hidrofobna, već se pri malom pH pretvara u konformaciju p-ploče. Pored toga, ona može pretvoriti druge peptide u rastvoru u konformaciju p-ploče

[0146]Na osnovu ovih zapažanja i ovde razvijenih tehnika, bila je razvijena "vakcina" protiv bolesti pobuđivanjem jake humoralne i celularne imune reakcije kod miševa protiv neurotoksičnog PrP106-126, a onda su imunizovani miševi inficirani sa ekstraktima mozgova miševa obolelih od grebeža.

[0147]Kao u prethodnim primerima, pegilovani lizini su bili kovalentno vezani za svaki kraj PrP106-126 sekvence. Dužina PEG lanca je bila 12 - 4000. Svaki PEG lanac je bio kuplovan za po jedan molekul fosfatidil etanol amina, pa su rekonstituisani u PG-PEA-chol lipozomima-lipidu A.

[0148]Kada su ubrizgani miševima, ovi supramolekulski antigeni konstrukti su pobudili jaku humoralnu imunu reakciju, dajući antitela sa visokim afinitetom za PrP106-126 sekvencu, i posedujući efekte rastvaranja u njima.

PRIMER 1

[0149]Kao što je detaljnije opisano u Primeru 1, pokazano je da se neuronska smrt dešava usled hroničnog izlaganja primarnih pacovskih hipokampusnih kultura mikromolskim koncentracijama peptida koji odgovara ostacima 106-126 aminokiselinske sekvence dobijene od humane PrP<c>kDNK, na način zavisan od koncentracije. Podaci su prikazani u Tabeli 1

[0150]Podaci su srednje vrednosti ± s e. od 6-10 određivanja i normalizovani su prema toksičnom efektu PrP106-126 (označava 100% reakciju).

[0151]Pokazano je da se neuronska smrt indukovana sa PrP 106-126 dešava zbog apoptoze na način zavisan od doze. U krajnjim stadijumima subakutnih encefalopatija, kao što je grebež, PrPScu ćelom mozgu dostiže koncentracije od 10 do 20 puta više nego PrP<c>, što upadljivo nalikuje podacima navedenim u Tabeli 1 za 2 koncentracije PrP 106-126

[0152]Proces programirane ćelijske smrti koji je indukovan sa PrP106-126 je povezan, između ostalog, sa indukcijom „testosterone - repressed prostate message - 2" gena (TRPM-2) Nije poznato da li je apoptoza aktiviranain vivokod srodnih encefalopatija, ali ekspresija TRPM-2 iRNK je 10-struko povećana kod hrčaka inficiranih grebežom.

PRIMER 2

Metode za dobijanje supramolekulskih antigenih konstrukata

[0153]Ovde opisani supramolekulski konstrukti su bili jedinstveno sintetizovani korišćenjem standardnih zaštita bočnih lanaca aminokiselina sa Fmoc/tBu. Peptidi koji su modifikovani sa PEG-lipidnim radikalom i na C-, i na N-kraju nisu bili prethodno uočeni. Pegilacija peptida obično rezultuje smešama regioizomera. Pronalazači su ovde demonstrirali podesan metod za mesno specifično vezivanje PEG-lipidnog konjugata i na C- i na N- kraju Ap korišćenjem delimično zaštićenih peptida.

[0154]Kod onih peptidnih sekvenci koje sadrže interne Lys ili His ostatke (4-11, 1-16, 22-35), na svaki kraj je bio dodat ortogonalno zaštićeni Lys(ivDde). Da bi se olakšala sinteza, na C-kraj je bio dodat dodatni Gly. Fmoc grupa je bila odstranjena sa 20 % piperidina u DMF i N-acetilovana korišćenjem acetat anhidrida. Selektivno odvajanje ivDde grupa je izvršeno sa 3 % hidrazin hidratom u DMF tokom jednog sata. 2-hlorotritil smola je bila podesnija u odnosu na šire korišćenu Wang smolu, pošto se ona pokazala kao daleko otpornija na hidrazinolizu. Dalje, 2-hlorotritil smola je ekstremno senzibilna na kiselinu i shodno tome, za razliku od VVang smole, omogućava izolovanje zaštićenih peptida Zaista, bilo je neophodno da se reakcija kuplovanja izvede u fazi rastvora, pošto kuplovanje peptida vezanog za smolu sa pre-aktiviranim pegilovanim lipidnim reagensom DSPE-PEG-SPA nije dovelo do pojave proizvoda kuplovanja. Shodno tome, selektivnim odvajanjem od smole pod blagim uslovima (sirćetna kiselina / trifluoroetanol / dihlorometan, 1:1:8, 1 h, rt) su dobijeni interno zaštićeni peptidi (Fig. 5).

[0155]Kuplovanja u fazi rastvora su uspešno izvršena sa peptidima dobijenim od sekvenci Ap4-n(SEQ ID NO: 2), Ap1.16(SEQ ID NO: 5), Ap22.35 (SEQ ID NO: 3), do DSPE-PEG-SPA u DMSO i višku baze (Fig. 6). Reakcije su onda prekinute dodavanjem viška etanolamina tokom 2 h, pa je zatim rastvor liofilizovan. Prečišćavanjem sa HPLC (semi-preparativna reverzno-fazna C4kolona) je dobijena 50-70 % čistoća N- i C- terminalno PEG-lipidnih konjugata, čiji identiteti su bili potvrđeni sa MALDI (masenom spektrometrijom sa matricom potpomognutom laserskom desorpcijom). Svaka sekvenca je pokazala značajnu varijaciju u lakoći reakcije kuplovanja, pa su uslovi bili podešeni u skladu sa time (temperatura, broj molskih ekvivalenata DSPE-PEG-SPA, vreme). Prečišćavanje sa HPLC se pokazalo odličnim za izdvajanje viška DSPE-PEG-SPA iz željenog proizvoda, međutim, pošto prethodno navedeni nije pokazao afinitet za kolonu, razdvajanje mono-PEG-lipidnih (i N- i C- terminalnih) peptidnih proizvoda od željenog proizvoda se pokazalo teškim. Pokušaji da se ovi proizvodi izdvoje korišćenjem ekskluzione hromatografije su se takođe pokazali neuspešnim, pretpostavlja se zbog njihovih relativno velikih polidisperzitivnosti. Ipak aktuelni pronalazači su koristili katjonsko-izmenjivačku hromatografiju za izdvajanje mono- i di- kuplovanih proizvoda pre finalnih deprotekcija bočnog lanca. Posle deprotekcija bočnog lanca peptida i izdvajanja viška neizreagovalog DSPE-PEG-SPA omogućeno je izolovanje željenih konjugata sa mnogo većom čistoćom.

PRIMER 3

Poređenje imunogenosti PEGilovanih i palmitoilovanih antigena, ELISA i testovi disagregacije

[0156]Lipozomski antigeni su bili pripremljeni kao što je gore opisano Sekvence PEG-AB^e, -Ap4.-i, - AB22-35SUbile rekonstituisane u konstruktu koji se sastojao od lipozoma napravljenih od dimiristoil fosfatidil holina (DMPC), dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPEA), dimiristoil fosfatidil glicerola (DMPG) 1 holesterola (0,9: 0,1: 0,1: 0,7 molski odnosi) koji su sadržali monofosforil lipid A (40mg/mM fosfolipida)

ELISA

[0157]Antigeni i palmitoilovani APm6su bili upotrebljeni za imunizaciju C57BL/6 miševa u intervalima od 2 nedelje. Sa svakim antigenom je bilo imunizovano po 10-12 životinja. Serumi su bili uzeti 5 dana posle pojačanja, a ELISE su bile izvedene sa nekoliko razređenja seruma. Komparativni rezultati koji pokazuju imunogenost različitih antigena su prikazani na Fig. 7.

[0158]Podaci iz ELISE pokazuju daje lipozomski PEG-Ap,.16 znatno imunogeniji od palmitoilovanog ABi_16. Dodatni ALUM nije pojačao imunogenost PEG-Ap,16kod miševa. Reakcija antitela indukovana sa PEG-Ap4.11je bila sporija u poređenju sa PEG-Ap,.^.

Testovi disagregacije

[0159]Devet seruma (1:100 razređenje) od lipozomski-PEG-Ap4 n imunizovanih životinja je bilo upotrebljeno u testu gde su prethodno formirana Ap,_42 vlakna bila inkubirana sa antiserumima. Test je bio izveden kao što je opisano (Nicolau et al., 2002).

[0160]Za vreme inkubacije od 24 h (Fig. 8) sa različitim serumima je bilo uočeno rastvaranje Api.42vlakana. Neki od seruma su rastvorili vlakna do 75% (serumi od miševa 5 i 6). Ćelije slezina ovih miševa su bile upotrebljene za proizvodnju monoklonskih antitela

PRIMER 4

Tesf rastvaranja

[0161]Od dve životinje imunizovane palmitoilovanim Ap^s/lipozomima/ lipidom A je bilo dobijeno 25 supernatanata iz nedavno generisanih hibridoma klonova za koje se pokazalo da su specifični za ApV42 specifična antitela. Oni su bili testirani u testu rastvaranja u skladu sa metodama i protokolima opisanim u PNAS 2002, 99, 2332-2337. Rezultati su prikazani na Fig 9

[0162]Utvrđeno je da su supernatanti od 5 hibridoma klonova mogli da rastvore 6-amiloidna vlaknain vitrodo 75%. Dva najbolja klona 15 i 27 su bila izabrana za prečišćavanje monoklonskih antitela. Oni su bili upotrebljeni za dalje ispitivanje kao pozitivna kontrolna mAbsin vivo.

PRIMER 5

Ispitivanje prelaza izp-ploče ua- zavojnicu A^-,. 42 peptida NMR spektroskopijom u čvrstom stanju

[0163]Da bi se izbegao gubitak aminokiseline obeležene sa 13C, sinteza ApY42sa Fmoc peptidnom sintezom je bila verifikovana testirajućom sintezom bez obeleženih aminokiselina. Identitet dobijenog Ap,.42 peptida je mogao biti verifikovan sa MALDI masenom spektroskopijom, a procedura prečišćavanja korišćenjem HPLC sa reverzno faznom kolonom i mogao je biti uspostavljen gradijent<4>acetonitril voda puferovan amonijakom.

[0164]Uspešno uspostavljanje protokola za sintezu i prečišćavanje amiloidnog p-peptida je bilo praćeno sintezom obeleženog peptida koji je sadržao sa 13C obeleženi valin na poziciji 12 (<12>val) i sa 13C obeleženi tirozin na poziciji 10(10tyr)-

[0165]Obeleženi APi.42je bio upotrebljen za generisanje vlakana inkubacijom rastvora peptida u PBS puferu tokom jedne nedelje na 37°C.<13>C NMR spektri liofilizovanih vlakana potvrđuju strukturu p-ploča i u skladu su sa objavljenim rezultatima. Inkubacija vlakana sa ApM6 specifičnim antitelom tokom 2 dana nije pokazala značajnu promenu 13C spektra. Prve procene NMR merenja ukazuju na pramenu sekundarne strukture (Fig. 10).

PRIMER 6

Antitela pobuđena sa supramolekulskim antigenim konstruktima

[0166]Dobijanje mAbs :Lipozomski antigeni su bili pripremljeni kao što je opisano (Nicolau et al., 2002, PNAS, 99, 2332-37). Sekvence PEG-ASms, -APi_i6, Ap4.n -Ap22 35 i AP29-40SU bile rekonstituisane u konstrukt koji se sastojao od lipozoma napravljenih od dimiristoil fosfatidil holina (DMPC), dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPEA), dimiristoil fosfatidil glicerola (DMPG) i holesterola (0,9: 0,1: 0,1: 0,7 molski odnosi) koji su sadržali monofosforil lipid A (40mg/mM fosfolipida). Ovi antigeni i palmitoilovani APi_16su bili upotrebljeni za imunizaciju C57BL/6 miševa tokom 2-nedeljnih intervala. Sa svakim antigenom je bilo imunizovano po 10-12 životinja. Posle 3 do 6 pojačanja, za fuziju su bili izabrani miševi sa terapeutskim titrima (kada je 1:5.000 razređenje seruma bilo pozitivno u ELISI). Bila je izvedena fuzija mišijih B limfocita iz slezine sa mijeloma ćelijskom linijom SP2-0. Hibridoma klonovi koji proizvode IgG su bili izabrani i testirani u pogledu njihovog specifičnog vezivanja za Ap,.42peptide sa ELISOM

[0167]Karakterizacija mAb:Testovi disagregacije, NMR-studije, QELS- i SPR- merenja su bili primenjeni za karakterizaciju mAbs. mAbs su izazvala disagregaciju prethodno formiranih amiloidnih vlakana do 80% (Tabela 1). Bio je uočen prelaz iz p-ploče u a-zavojnicu amiloida koji je bio indukovan antitelima (Fig. 11, 12). Merenja kvazi elastičnim rasejavanjem svetlosti (engl. Ouasi Elastic Light Scattering, skr. QELS) su pokazala da je inkubacija amiloidnih vlakana sa monoklonskim antitelima rezultovala vlaknima sa veličinom < 800 nm, (40 - 60% od svih prisutnih vlakana), dok je sam amiloid dao samo veoma velike agregate (> 4um).

NMR studije:U cilju da se oceni efekat mAb na vlakna rastvor Ap-vlakana je bio inkubiran sa antitelom tokom 12 dana. Merenja sa difuzijom izazvanom spinom protona (engl. Proton Driven Spin Diffusion, skr. PDSD) su bila izvedena da bi se izmerio 2D,<3>C-<13>C spektar korelacije Fig. 11-13 prikazuje NMR podatke i analizu: NMR.<13>C-<13>C spektar korelacije amiloidnih B-peptidnih vlakana pre i posle inkubacije sa EN4H7, ET-1H6 ili AN9C-E4 tokom 12 dana (A, B). Kolona (D) i red (C) su ekstrahovani iz spektra korelacije. Spektar (- antitela) pokazuje spektar čistih vlakana, dok (+ antitela) pokazuje spektar u prisustvu mAb.

[0168] 13Cspektri liofilizovanih vlakana omogućavaju određivanje rezonanci. Vrednosti hemijskog pomaka za CaiCpod Val12 i Tyr10 potvrđuju strukturu B-ploča čistih vlakana. (Fig. 11). Pomaci rezonanci za Ca i Cpjezgra<12>Val jasno pokazuju prelaz iz B-ploče u a-zavojnicu. Pomak rezonance za Cai CpOd Tyr 10 sa druge strane ne ukazuje jasno na prelaz sekundarne strukture. Ponašanje za Tyr10 rezonancu može biti objašnjeno modelom gde je Tyr10 na kontaktnoj površini između sekcije B-ploče i sekcije petlje AB-peptida u amiloidnim vlaknima.

[0169]U drugom eksperimentu sa 13C-obogaćena vlakna su bila inkubirana sa EN4H7 i ET1H6 antitelima (vidi Tabelu 1) tokom 12 dana. Inkubirana vlakna pokazuju pomake rezonanci Cpjezgra od<12>Val sa 32ppm na 28ppm, što ukazuje na prelaz iz B-ploče u a-zavojnicu za značajnu frakciju peptida (Fig. 12 i 13) za oba antitela. Rezonance CaiCpza 10Tyr postaju šire u prisustvu antitela. Ovo ukazuje na prelaz u prilično nestrukturisanu konfirmaciju položaja 10Tyr.

PRIMER 7

Poređenje imunogenosti PEGilovanih i palmitoilovanih antigena testiranih u ELISI

[0170]Podaci iz ELISE su pokazali da je PEG-AP^b imunogeniji od palmitoilovanog Ap,.^ (Fig. 14). Dodatni ALUM nije pojačao imunogenost PEG-APl^ kod miševa. Sa izuzetkom reakcije antitela indukovane sa PEG-Ap4.n, koja je bila sporija u poređenju sa PEG-APi_15, generalno izgleda da su pegilovani peptidi imunogeniji od palmitoilovanih peptida (Fig. 14).

PRIMER 8

Bihevioralni testovi za ocenjivanje efikasnosti antitela

[0171]Da bi se ocenila efikasnost antitela pobuđenih ovde opisanim metodama, odnosno pobuđenih primenom supramolekulskih antigenih konstrukata koji sadrže modifikovane amiloidne peptide (kao što su pegilovani amiloidni peptidi), miševi će biti tretirani, a zatim evaluirani korišćenjem dole navedenih bihevioralnih testova.

Morisov vodeni lavirint

[0172]Bazen (beli, kružni sud, prečnika od 1 m) sadrži vodu temperature 20°C sa titanijum-dioksidom kao bezmirisnim, netoksičnim aditivom za skrivanje platforme za bekstvo (1 cm ispod nivoa vode). Plivanje svakog miša je snimljeno kamerom i analizirano (Ethovision, Noldus information Technologv, VVageningen, Holandija). Pre treninga, svaki mišje bio stavljen na gornju stranu platforme 15 sekundi. Za testove mesne navigacije, miševi su bili trenirani da lociraju skrivenu platformu u pet blokova od tri pokušaja tokom tri uzastopna dana. Svaki pokušaj se sastojao od testa prinudnog plivanja od maksimalno 120 sekundi, što je bilo praćeno sa 60 sekundi odmaranja. Mereno je vreme koje je svakom mišu bilo potrebno da locira platformu. Pet uzastopnih pokušaja je rezultovalo krivom učenja.

[0173]24 sata posle poslednjeg treninga, svaka životinja je imala probni pokušaj sa uklanjanjem platforme. Miševima je dozvoljeno da traže tokom 60 sekundi i mereno je vreme pretraživanja kvadranta i prelaska preko pozicije originalne platforme.

[0174]Miševi koji su odbili da plivaju i da traže platformu, već su umesto toga čekali da ih eksperimentator uzme iz bazena, takozvani "plutajući" su bili isključeni iz analize.

Otvoreno polje

[0175]Za test je upotrebljena kutija od pleksiglasa sa otvorenim poljem (52 x 52 x 40 cm) sa crnim vertikalnim zidovima i delimično prozirnim podom, slabo osvetljenim lampom postavljenom ispod kutije. Različite oblasti su dodeljene kompjuterizovanim sistemom (Ethovision, Noldus information Technologv, VVageningen, Holandija): uglovi (9x9 cm), četiri strane kutije (9 cm od zida) i centar otvorenog polja kutije (43 x 43 cm). Svaki miš je sniman kamerom i analizirana je njegova aktivnost (Ethovision) merenjem dužine (cm) puta, brzine (cm/sec) miša, trajanja/vremena (sec) provedenog u centru u poređenju sa granicom (uglovi + strane) i učestalosti (N) prelaska iz jedne oblasti u drugu. Svaki mišje bio stavljen u sredinu kutije i dozvoljeno mu je da istražuje kutiju tokom deset minuta Između testova je kutija sa otvorenim poljem bila očišćena i osušena pre uvođenja novog miša.

Test prepoznavanja novog objekta

[0176]Miševi su tokom jednog sata navikavani na kutiju sa otvorenim poljem od pleksiglasa (52 x 52 x 40 cm) sa crnim vertikalnim zidovima i poluprozirnim podom, slabo osvetljenim lampom postavljenom ispod kutije. Sledećeg dana životinje su bile stavljene u istu kutiju i podvrgnute su 10-to minutnom testu akvizicije. Tokom ovog testa miševi su stavljani pojedinačno u otvoreno polje u prisustvu objekta A (plava lopta ili crvena kocka, slične veličine ± 4 cm), i beležena je učestanost istraživanja objekta A (kada je njuška životinje usmerena prema objektu na rastojanju < 1 cm i kada su miševi aktivno njuškali u smeru objekta) (Freq AA). Tokom 10-to minutnog pokušaja zadržavanja (drugi pokušaj) koji je izveden 3 sata kasnije, novi objekat (objekat B, crvena kocka ili plava lopta) je stavljen zajedno sa poznatim objektom (objekat A) u otvoreno polje. Zabeležena je učestanost kojom je životinja ispitivala dva objekta (FreqAiFreqB).

[0177]Indeks prepoznavanja (engl. recognition index, skr. Rl), koji je definisan kao odnos učestalosti kojom je ispitivan novi objekat u odnosu na učestanost kojom su ispitivana oba objekta [FreqB/ (FreqA+ FreqB) x 100], je korišćen za merenje neprostorne memorije. Za merenje radoznalosti je upotrebljena učestanost objekta A koja je ispitivana tokom testa akvizicije.

Claims (12)

1. Konformaciono senzibilno antitelo koje se može dobiti antigenim konstruktom koji sadrži antigeni peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu B amiloida izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, ili njegov fragment, pri čemu je antigeni peptid ili njegov aktivni fragment modifikovan tako da ima kovalentno vezani polietilen glikol, po jedan na svakom kraju, i rekonstituisan je u lipozomu, koje antitelo ima specifičnost vezivanja za antigeni peptid i (a) ispoljava konformacionu senzibilnost i afinitet za antigen, koji je povećan u poređenju sa antitelom pobuđenim sa palmitoilovanim antigenim peptidom; i (b) indukuje tranziciju amiloidnog peptida iz B-ploče u a-zavojnicu

2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu pomenuto antitelo je lgG1 izotip.

3. Antitelo prema zahtevu 1, koje posle inkubacije sa amiloidnim vlaknima dovodi do vlakana sa veličinom < 800 nm kod 40-60% od svih prisutnih vlakana.

4. Antitelo prema zahtevu 1 koje je pobuđeno sa antigenim konstruktom koji sadrži antigeni peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 koja je modifikovana tako da sadrži po jedan lizin kovalentno vezan na svakom kraju amiloidne sekvence FRHDSGY i polietilen glikol (PEG) kovalentno vezan za lizin na jednom kraju i dioleil-fosfatidil holin etanolamin na drugom kraju PEG molekula, koje antitelo (a) efikasno rastvara ABi-40i AB-,.42 vlakna; i (b) štiti in vitro PC12 ćelije protiv apoptoze i metaboličke inhibicije indukovane sa Ap1_40 i A8i-42 vlaknima.

5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu pomenuto antitelo je poliklonsko antitelo ili monoklonsko antitelo.

6. Antitelo prema zahtevu 4, koje posle administracije životinjskom ili humanom pacijentu dovodi do značajnih nivoa vraćanja memorije i pobuđivanja radoznalosti bez izazivanja krvarenja u mozgu imunizovanog životinjskog ili humanog pacijenta

7. Antitelo prema zahtevu 1, koje se vezuje za rastvorljive Ap,.40oligomere

8. Primena epitopa izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, i SEQ ID NO: 4, ili njegovog aktivnog fragmenta, ugrađenog u antigeni konstrukt koji sadrži antigeni peptid ili njegov aktivni fragment modifikovan tako da ima kovalentno vezan po jedan polietilen glikol na svakom kraju, i rekonstituisan u lipozomu radi generisanja antitela prema bilo kom od zahteva 1-7

9. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-7 za pasivnu imunizaciju pojedinaca protiv neuroloških bolesti i poremećaja.

10.Antitelo prema zahtevu 9, pri čemu je pomenuta bolest ili poremećaj Alchajmerova bolest.

11.Postupak za dobijanje konformaciono senzibilnog antitela za pasivnu imunizaciju pojedinaca protiv neuroloških bolesti i poremećaja, koji postupak sadrži rekonstituisanje antigenog konstrukta u lipozomima, pri čemu antigeni konstrukt sadrži peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu (3 amiloida ili njegov aktivni fragment, izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, ili njegov aktivni fragment, pri čemu je antigeni peptid ili njegov aktivni fragment modifikovan tako da ima po jedan polietilen glikol kovalentno vezan na svakom kraju, i pobuđuje antitelo koje je usmereno protiv antigenog konstrukta.

12.Postupak prema zahtevu 11, pri čemu je neurološka bolest Alchajmerova bolest.