RS51273B - Konjugati nosač-hapten za tretman i prevenciju zavisnosti od nikotina - Google Patents

Abstract

Konjugat hapten-nosač sledeće formule:naznačen time, što su m 1 do 2500, n je 0 do 12, y je 1 do 12,X se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S;Y se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S, i-(CH2)n-X-(CH2)y-Y- ostatak je vezan u 3', 4' ili 5' položaju nikotina.Prijava sadrži još 8 nezavisnih i 17 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na tretman i prevenciju zavisnosti od nikotina. Detaljnije, ovaj pronalazak se odnosi na nove konjugate, nosač-hapten koji su u stanju da indukuju stvaranje antitela. Ova antitela su u stanju da se specifično vežu za nikotin. Pored toga, ovaj pronalazak predviđa prevenciju ili tretman zavisnosti od nikotina ordiniranjem konjugata nikotin-nosač u farmaceutski prihvatljivoj formulaciji. Ovaj pronalazak takođe razmatra upotrebu antitela pobuđenih kao odgovor na konjugat nosač-hapten, u prevenciji ili tretmanu zavisnosti od nikotina.

Pušenje cigareta, cigara i lule je rasprostranjen problem u Sjedinjenjim Američkim Državama i širom sveta. Duvan za pušenje ili duvan koji se ne puši su bogati nikotinom, koji je poznata supstanca koja stvara zavisnost. Nikotin je alkaloid koji se dobija iz biljke duvana i odgovoran je za efekte psihoaktivnosti i zavisnosti pušača. Nikotin formiraju dva prstena povezana preko jedne veze: aromatični šestočlani prsten (piridin) i alifatični petočlani prsten (pirolidin). Piroliidin je N-metilovan i vezan preko njegovog ugljenika-2 za ugljenik-3 piridina.

Dakle, ugljenik-2 je hiralan, tako da postoji virtuelna slobodna rotacija oko jednogube veze koja povezuje dva prstena. Utvrđeno je da je S apsolutna konfiguracija ugljenika-2. Dakle, prirodna konfiguracija nikotina je (S)-(-)-nikotin.

Upotreba nikotina je raširena zbog lake pristupačnosti cigareta, cigara, lula i duvana koji se ne puši. Prema podacima U.S.Department of Health and Human Services, pušenje cigareta je vodeći uzrok smrti koja se može sprečiti u Sjedinjenim Državama. Videti takođe McGinnis et al.J. Am. Med. Assoc,1993, 270. 2207-2211. Takođe je ustanovljeno da sekundarno izlaganje dimu uzrokuje ozbiljne štetne efekte na zdravlje, što uključuje i pogoršanje asme.

Mada je priroda zavisnosti od nikotina dobro poznata, pušenje cigareta je rasprostranjeno. Maksimalni sadržaji nkotina u krvi su oko 25-50 ng/mL, a postižu se 10-15 min nakon pušenja cigarete. Kod humanih bića , pušenje jedne cigarete dovodi do koncentracija nikotina u arterijama koje su 10-struko veće od koncentracija nikotina u venama, zato što se nikotin brzo oslobađa iz pluća ka srcu (videti, Henningsfeld,Drug Alcohol Depend.1993, 33, 23-29). Ovo vodi brzom oslobađanju arterijskih koncentracija nikotina u mozak. Kada prođe barijeru krv-mozak, podaci ukazuju da se vezuje za holinergijske receptore koji se normalno aktiviraju neurotransmiterom acetilholinom, koji je angažovan u disanju, održavanju srčanog ritma, memorije, budnosti i kretanja mišića. Kada se nikotin veže za ove receptore, on može da utiče na normalne funkcije mozga, tako što startuje oslobađanje drugih neurctransmitera, kao što je dopamin. Dopamin je pronađen u delovima mozga koji su povezani sa emocijama, motivacijom i osećanjem zadovoljstva. Oslobađanje neurotransmitera, naročito dopamina, je to koje je odgovorno za zavisnost korisnika duvana prema nikotinu, ili drugim načinima unošenja nikotina.

Zahvaljujući značajnim štetnim efektima pušenja na zdravlje, pušači često pokušavaju da ostave pušenje. Međutim, zavisnička priroda nikotina i pristupačnost cigareta pomažu nastavku zavisnoti od nikotina i visokom procentu neuspeha kod onih koji pokušavaju da ostave pušenje. Simptomi odvikavanja su neprijatni, a prestaju pušenjem.

Postoji mnogo terapija za zavisnost od nikotina, ali su većinom neefikasne. Dve najpopularnije terapije su nikotinski flasteri za kožu i žvakaća guma sa dodatkom nikotina. Ove terapije, koje se nazivaju "terapijama sa zamenom nikotina" (NRT), zamenjuju količinu nikotina koju je pušač ranije primao kroz pušenje i deluju na odvikavanje korisnika od nikotina. Međutim, kod ove vrste terapije opaženi su neki nedostaci. Naročito je penetracija nikotina u krvotok niska, pa je stoga želja za pušenjem povećana. Sa upotrebom nikotinske žvakaće gume povezani su problemi nadražaja usta, bol u vilici, mučnina. Sa upotrebom nikotinskih flastera za kožu povezani su nadražaj kože, poremećaj sna i nervoza.

Prema tome, neophodna je alternativna metodologija tretiranja zavisnosti od nikotina. U literaturi ova potreba je naznačena i postoji nekoliko pokušaja da se obezbedi metodologija za lečenje zavisnosti od nikotina. Jedan od postupaka uključuje ordiniranje antitela koja su nastala, kao odgovor na nikotin. Međutim, supstance niske molarne mase, koje se nazivaju hapteni, poznato je da nisu u stanju da startuju imuni odgovor u životinjama domaćinima:* Nikotin nije izuzetak, i kao mali molekul on nije antigen ili imunogen. Da bi se izazvao odgovor antitela na hapten, tipično je da se on kovalentno veže za protein-nosač, a ovaj kompleks izaziva stvaranje antitela koja prepoznaju hapten. ;Na primer, kotinin 4'-karboksilna kiselina, kada se kovalentno veže za ključno-prisajedinjeni hemocijanin (KLH), koristi se za generisanje antitela za nikotinski metabolit kotinin. Ova antitela se koriste za određivanja prisustva kotinina u fiziološkim fluidima. Videti Bjerke et al.J. lmmunol. Methods1987, 9fc, 239*246.

Druga nikotinska antitela su dobili Castro et al.( Eur. J. Biochem.1980, 104, 331-340). Castro et al. su dobili nikotin haptene, konjugovane na albumin iz goveđeg seruma (BSA), sa proteinom-nosačem koji je konjugovan preko linkera u 6-položaju nikotina. Castro et al. su dobili i dodatne konjugate BSA koji se injektuju sisarima radi povećanja sadržaja antitela. U jednoj drugoj publikaciji, uBiochem. Biophys. Res. Commun.1975, 67, 583-589, Castro et al. opisuju dva nikotin-albuminska konjugata: N-sukcinil-6-amino-(±)-nikotin-BSA i 6-(c-aminokapramido)-(±)-nikotin-BSA. U ovoj publikaciji iz 1975, Castro et al. su takođe koristili antitela za konjugate nikotinskog nosača, 6-(a-aminokapramido)-(±)-nikotin-BSA, za određivanje sadržaja nikotina u krvi i urinu, videtiRes. Commun. Chem., Path., Pharm.1986, 51, 393.404.

Swain et al. (WO 98/14216) opisuju konjugate nikotinskog nosača, gde je hapten konjugovan u 1, 2, 4, 5, 6 ili 1" položaju nikotina. Hieda et al. su pokazali da životinje koje su imunizovane sa 6-(karboksimetilureido)-(±)-nikotinom, koji je bio vezan za ključno-prisajedinjeni hemocijanin, stvaraju antitela specifična za nikotin,J. Pharm. Exper. Thera.1997, 283, 1076-1081. Langone et al. su dobili derivate haptena, 0-sukcinil-3'-hidroksimetii-nikotin, videtiBiochemistry VI,5025-5030, i koristili su antitela za ovaj konjugat hapten-nosač u testovima radio-imuniteta. VidetiMethods in Enzymology1982, 84, 628-635. Konjugat koji je dobio Langone je osetljiv na hidrolizu.

Pored toga, Abad et al., uAnal. Chem.1993, 65, 3227-3231, opisuju konjugovanje 3'-(hidroksimetil)nikotin hemisukcinata sa albuminom iz goveđeg seruma za proizvodnju antitela nikotina u cilju omogućavanja merenja sadržaja nikotina u kondenzatu dima cigareta u testu ELISA.

Prema tome, iz prethodnog stanja tehnike ne sledi stabilan konjugat nikotinskog nosača, u kome je očuvana hiralna struktura nikotin-hapten i koji se vezuje za hapten-nosač na način kojim je očuvana priroda nikotinskog epitopa. Pored toga, stanje tehnike ne daje ili ne predlaže metode prevencije ili tretiranja zavisnosti od nikotina upotrebom ovakvih konjugata. Seeman, uHeterocycles1984, 22, 165-193, opisuje rezultate izučavanja konformacione analize i hemijske reaktivnosti nikotina.

Kao odgovor na zahteve za efikasnijom metodologijom tretiranja zavisnosti od nikotina, jedan od aspekata ovog pronalaska je davanje novih konjugata nikotinskog nosača, koji su stabilni, sadrže nikotin u njegovoj prirodnoj (S)-(-)-formaciji i koriste vezu nikotin-nosač u kojoj je očuvana priroda nikotinskog epitopa i relativna orijentacija dva prstena u molekulu nikotina. Smatra se da su oba prstena nikotina i njihova relativna orijentacija bitne za prepoznavanje od strane nikotinskog antitela u rastvoru. Ovi konjugati su u stanju da stimulišu stvaranje antitela koja su u stanju da se specifično vežu za nikotin. Koristeći konjugate iz ovog pronalaska, ovi pronalazači su kod sisara povisili sadržaje nikotina u serumu, a snizili sadržaje nikotina u mozgu. Pored toga, koristeći konjugate iz ovog pronalaska, ovi pronalazači su takođe sprečili promene u krvnom pritisku i lokomotome efekte indukovane nikotinom.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje zavisnosti od nikotina ordiniranjem konjugata iz ovog pronalaska pacijentu koji je zavisan od nikotina, čime se generišu anti-nikotinska antitela u tom pacijentu. Dakle, kada pacijent puši (ili koristi duvan za žvakanje), nikotin iz ovih proizvoda će biti vezan za anti-nikotinska antitela u krvi, sprečavajući da nikotin pređe barijeru krv-mozak, čime se eliminišu promene u herniji mozga indukovane nikotinom, koje su izvor zavisnosti od nikotina. U tom pogledu, značajno je da konjugat nosač-nikotin izaziva stvaranje antitela koja prepoznaju molekul prirodnog nikotina. Kao što je gore opisano, novi konjugati nosač-nikotin iz ovog pronalaska, zadržavaju hiralnost i epitop nikotina koji se nalazi u prirodi.

Pronalazači ne nameravaju da se vežu za neku posebnu teoriju kako nikotinski konjugati i antitela nastala ko odgovor na te konjugate, inhibiraju efekte nikotina koji uzimaju životinje. Pored sprečavanja da nikotin prođe kroz barijeru krv-mozak, antitela mogu takođe da sprečavaju vezivanje nikotina za druge receptore u perifernom nervnom sistemu, jednostavno sternom blokadom.

Ovi aspekti se mogu postići dobijanjem konjugata nosač-hapten formule (I):

gde su

m 1 do 2500,

n je Odo 12,

y je 1 do 12,

X se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S;

Y se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S, i

-(CH2)n-X-(CH2)y-Y- ostatak je vezan u 3', 4' ili 5' položaju.

U poželjnoj realizaciji konjugata nosač-hapten, m je 11 do 17, n je 1, y je 2, X je NH-CO, Y je CO-NH, nosač-protein je egzoprotein A, a -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-ostatak je vezan u 3' položaju. U sledećoj poželjnoj realizaciji konjugata nosač-hapten, mje11do17, njel, yje2, X je NH-CO, Y je CO-NH, nosač-protein je egzoprotein A, a -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- ostatak je vezan u 4' položaju. U sledećoj poželjnoj realizaciji konjugata nosač-hapten, m je 11 do 17, nje 1, yje 2, Xje NH-CO, Y je CO-NH, a nosač-protein je egzoprotein A, i -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-ostatak je vezan u položaju 5'. U drugoj poželjnoj realizaciji m se bira iz grupe koju čine 1 do 20 i 1 do 200.

Gornji aspekti se mogu takođe postići dobijanjem konjugata nosač-hapten formule (III):

gde su

n je Odo 12, j je 1 do 1000, k je 1 do 20, i E je matrica koja sadrži aminokiselinu. U poželjnoj realizaciji ova matrica je poli-L-glutaminska kiselina.

Ovi aspekti se mogu postići takođe i dobijanjem antitela koje se stvara kao odgovor na konjugat nosač-hapten Formule (I). U sledećoj realizaciji, antitelo je funkcionalni fragment. U poželjnoj realizaciji antitelo je monoklonalno antitelo. U sledećoj realizaciji ovog pronalaska antitelo je poliklonalno.

Ovi aspekti se mogu postići takođe dobijanjem antitela koje se stvara kao odgovor na konjugat nosač-hapten Formule (III). U sledećoj realizaciji, antitelo je funkcionalni fragment. U poželjnoj realizaciji antitelo je monoklonalno antitelo. U sledećoj realizaciji ovog pronalaska antitelo je poliklonalno.

Ovi aspekti se mogu postići davanjem postupka za tretiranje ili prevenciju zavisnosti od nikotina kod pacijenta kome je takav tretman neophodan, koji se sastoji u ordiniranju terapeutski efikasne količine konjugata nosač-hapten Formule (I) ili (III). Alternativno, ovi aspekti se mogu postići davanjem postupka za tretiranje ii prevenciju zavisnosti od nikotina kod pacijenta kome je takav tretman neophodan, koji se sastoji u ordiniranju terapeutski efikasne količine antitela koje nastaje kao odgovor na konjugate nosač-hapten Formule (I) ili (III). Pored toga, ovi aspekti se mogu postići davanjem preparata vakcije koja sadrži konjugat nosač-hapten Formule (I) ili (III). Pored toga, vakcina može još da sadrži i dodatno terapeutsko jedinjenje za tretiranje zavisnosti od nikotina.

Ovi aspekti se mogu takođe postići davanjem procesa za proizvodnju antitela, koji se sastoji u imunizaciji sisara-domaćina sa konjugatdm nosač-hapten Formule (I) ili (III). U poželjnoj realizaciji antitelo koje se proizvodi je monoklonalno antitelo. U drugim realizacijama antitelo je poliklonalno.

Mogu se postići i dodatni aspekti, davanjem kompleta za određivanje prisustva nikotina u uzorku, koji sadrži antitelo nastalo kao odgovor na konjugat nosač-hapten Formule (I) ili (III).

Ovi aspekti i drugi koji su očigledni onima koji su verzirani u stanje tehnike, postižu se ovim pronalaskom koji je opisan niže u detaljnom opisu i u priključenim zahtevima.

Slika 1 je grafikon koji pokazuje efekat aktivne imunizacije sa konjugatom vakcine 3'AMNic-Suc-rEPA na sadržaje nikotina u krvnom serumu pacova, koji slede nakon jedne injekcije nikotina. Pokazani su sadržaji nikotina u serumu 3 i 10 min posle injekcije nikotina.

Slika 2 pokazuje efekat pasivne imunizacije sa antitelima protiv 3'AMNic-Suc-rEPA na sadržaje nikotina u krvi i mozgu pacova. Pacovi su tretirani sa 12,5, 25 i 50 mg antitela.

Slika 3 pokazuje efekte pasivne imunizacije sa antitelima protiv 3'AMNic-Suc-rEPA na sadržaje nikotina u krvnom serumu i mozgu, kod pacova. Sadržaji nikotina su mereni 30 min i 1 dan posle ordiniranja antitela i 3 min pre injekcije nikotina.

Slika 4 pokazuje efakat pasivne imunizacije, sa antitelima protiv 3'AMNic-Suc-rEPA, na sadržaje nikotina u krvnom serumu, kod pacova koji primali više doza nikotina.

Slika 5 pokazuje efakat pasivne imunizacije, sa antitelima protiv 3'AMNic-Suc-rEPA, na sadržaje nikotina u mozgu, kod pacova koji primali više doza nikotina.

Slika 6 pokazuje efakat pasivne imunizacije, sa antitelima protiv 3'AMNic-Suc-rEPA, na lokomotome efekte izazvane nikotinom, kod pacova.

Slika 7 pokazuje efakat pasivne imunizacije, sa antitelima protiv 3'AMNic-Suc-rEPA, na povišenje sistolnog krvnog pritiska izazvano nikotinom. Slika pokazuje da povećanje sadržaja antitela povećava efikasnost antitela u snižavanju povećanja nikotina u krvnom pritisku.

Ovaj pronalazak daje nikotinski konjugat nosač-hapten za tretiranje zavisnosti od nikotina. Nikotinski konjugat nosač-hapten ima formulu (I):

gde su

m 1 do 2500,

n je Odo 12,

<y>je 1 do 12,

X se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S;

Y se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S;

nosač-protein je bilo koji podesni imunogeni protein ili polipeptid." Poželjno je da nosač-protein sadrži epitom T-ćelije, i

-(CH2)n-X-(CH2)yY- ostatak je vezan u 3', 4' Ni 5' položaju molekula nikotina.

U formuli (I) n je poželjno 1 do 200. U sledećoj poželjnoj realizaciji m je 1 do 20. U naročito poželjnoj realizaciji, m je 11 do 17. U sledećoj poželjnoj realizaciji X se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH i CO-NH-NH-CO.

Ukoliko je m veće od jedan, ostatak u zagradi je m puta vezan za različita mesta vezivanja u nosaču-proteinu. Na primer, ako je m=2, tada će formula (I) biti:

Pošto antitela ne mogu da nastanu kao odgovor na sam nikotin, ovi pronalazači su razvili nikotinski hapten koji je derivatizovan u 3', 4' i 5' položaju nikotina. Ovaj ostatak se vezuje za nosač-proteina dajući konjugat nosač-hapten koji će stvarati antitela protiv nikotinskog ostatka, kada se isti injektira u odgovarajućeg sisara-domaćina. U tom pogledu, da bi farmaceutski preparat, koji sadrži konjugat nosač-hapten izazvao stvaranje antitela, kada se ordinira sisaru, nosač-protein mora biti imunogen. Poželjno je da sadrži epitop T-ćelije. Dakle, kada se nosač-protein konjuguje sa nikotinskim haptenom i nakon toga ordinira sisaru, sisar stvara ili "daje" antitela, kao odgovor na nikotinski hapten.

U ovom pronalasku koristi se naziv "hapten" koji se odnosi na organsko jedinjenje niske molarne mase koje nije u stanju da izaziva imuno-odgovor samo po sebi, ali će izazvati imuno-odgovor kada se veže za molekul-nosač. U poželjnoj realizaciji hapten se vezuje sa nosač preko linkera. Hapten iz ovog pronalaska je derivat nikotina. Ovaj nikotinski hapten sadrži reaktivnu funkcionalnu grupu za koju se nosač vezuje direktno ili preko linkera, ili preko matrice, ili preko linkera i matrice. Poželjno je da se nikotinski hapten vezuje na nosač-protein preko amidne ili disulfidne veze. Amidna i disulfidna veza imaju poželjno svojstvo stabilnosti. Zato što se konjugati hapten-nosač iz ovog pronalaska koriste kao vakcine, važno je da su konjugati stabilni, zbog produženog vremena skladištenja vakcine.

U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, nikotinski hapten predstavlja formula (II):

gde su

n je Odo 12,

Z je NH2, COOH, CHO ili SH, i

-(CH2)n-Zje vezano u 3', 4' ili 5' položaju.

Ostatak Z je u stanju da se veže za nosač direktno ili preko linkera. Konjugat nosač-hapten će izazvati stvaranje antitela, nakon njegovog unošenja u telo pacijenta ili životinje.

U naročito poželjnoj realizaciji nikotinski hapten je sledeće formule (3'-aminometilnikotin):

1 Direktni konju<g>ati

Da bi se napravio "direktni konjugat" veže se jedan nikotinski hapten direktno za nosač, sa ili bez linkera. Na primer, po jedan nikotinski hapten se može vezati sa svaku slobodnu amino grupu na nosaču. Opisane su opšte metode direktnog konjugovanja haptena na nosač-proteine, korišćenjem homo-bifunkcionalnih ili hetero-bifunkcionalnih linkera za umrežavanje, na primer u G.T.Hermanson uBioconjugate Techniques,Academic Press (1996), i u Dick and Beurret,Conjugate Vaccines,Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal (1989), Vol. 10, 48-114. Direktnim konju govanjem, koristeći bifunkcionalne linkere za umrežavanje, molski odnos haptena prema proteinu je ograničen brojem funkcionalnih grupa na proteinu, koje su na raspolaganju za specifičnu konjugovanu herniju. Na primer, sa nosač-proteinom, koji ima n lizinskih ostataka, biće teorijski n+1 primarnih amina (uključujući terminalnu amino grupu) slobodnih za reakciju sa karboksilnom grupom linkera. Dakle, korišćenjem ove direktne procedure konjugovanja proizvod je ograničen na posedovanje n+1 stvorene amido veze, tj. na maksimalno vezanih n+1 haptena.

Verzirana osoba podrazumeva da će zavisno od koncentracije reaktanata koji se koriste za konjugovanje nikotinskog haptena sa nosačem-proteina i od prirode nosača-proteina, varirati odnos haptena prema nosaču. Takođe, u okviru istog dobijanja konjugata nikotin-nosač, postojaće varijacije u odnosu hapten-nosač za svaki pojedini konjugat. Međutim, ovi pronalazači su odredili da kada se 3'-aminometil-sukcinil-nikotin konjuguje na ovaj protein, u opsegu između 11-17 nikotinskih haptena se vezuje za nosač egzoprotein A, u jednom dobijanju konjugata. Ovaj opseg je eksperimentalno određen korišćenjem hromatografije sa filtriranjem gasa i merenjem porasta UV absorbancije na 260 nm. Na neke nosače veže se 17 nikotina, zato što se nikotinski hapten može vezati na ne-aminske ostatke nosača. Primeri ne-aminskih ostataka za koje se hapten može vezati su, - ali nisu njima ograničeni, -SH i -OH ostaci. Međutim, dešavanje ovih sporednih reakcija je retko.

2. Matrični konju<g>ati

Da bi se izbegla ograničenja u pogledu broja haptena koji se mogu vezati za nosač korišćenjem direktnog konjugovanja, može se koristiti "matrica" aminokiseline. Naziv "matrica" označava aminokiselinu, peptid, dipeptid ili polipeptid, uključujući oligomeme i polimeme polipeptide. Matrica takođe može biti linearni ili račvast polipeptid. Primeri aminokiselina koje se mogu koristiti za formiranje matrice su, ali se njima ne ograničavaju, asparaginska kiselina, lizin, cistein i L-glutaminska kiselina. Ovakvi matrični materijali se mogu formulisati u polimere, kao što je L-poliglutamisnka kiselina. Kada se koristi aminokiselina kao što je cistein, tiolska grupa je zaštićena, jer se tako dozvoljava haptenu da se veže za karboksilnu grupu aminokiseline. Onome ko je verziran u stanje tehnike dobro su poznate vrste zaštitnih grupa i načini vezivanja zaštitinih grupa za funkcionalnosti aminokiselina. Za diskusiju, videti Green,Protective Groups in Organic Chemistry,John Wiley & Sons, New York, 1991.

Podesna matrica ima odgovarajuću funkcionalnu grupu i nosi dva ili više haptena. Prema tome, u sledećoj poželjnoj realizaciji ovog pronalaska konjuguje se matrica supstituisana nikotinom na nosač-protein da bi se povećao molski odnos haten:nosač u konjugatu hapten-nosač. Matrica ima dvostruku ulogu, prvo kao nosač velikog broja haptena, i drugo, kao linker za umrežavanje. Matrica supstituisana nikotinom konjugovana na nosač-protein, predstavljena je formulom (III):

gde su: n je 0 do 12, j je 1 do 1000, k je 1 do 20, E je matrica koja sadrži aminokiselinu, za koju se može vezati hapten, i nosač-protein je bilo koji podesan protein ili polipeptid koji sadrži epitop T-ćelije. Matrica koja sadrži amino kiselinu E, može biti jedna aminokiselina, peptid, dipeptid, ili polipeptid, uključujući oligomeme kao i polimerne polipeptide. Matrica sadrži jednu ili više aminokiselina koje obuhvataju, ali nisu njima ograničene, asparaginsku kiselinu, lizin, cistein i poli-L-glutaminsku kiselinu. U poželjnoj realizaciji j je 1 do 200, a u drugim poželjnim realizacijama j je 1 do 4.

Konjugati matrica-nosač su u stanju da formiraju multimeme "rešetke". Takvu jednu rešetku predstavlja slika u nastavku. Naziv "rešetka" se koristi da označi kovalentno vezan kompleks koji se sastoji od više matrica, haptena, linkera i nosač-proteina, koji su svi zajedno kovalentno povezani. Zato što matrica supstituisana nikotinom sadrži više nikotinskih ostataka slobodnih za konjugovanje sa nosačem, može se formirati rešetka koja se sastoji od više nosača i više matrica supstituisanih nikotinom. Pojednostavljena predstava dela takve rešetke je prikazana kao što sledi:

Osoba verzirana u stanje tehnike podrazumeva da rešetka u skladu sa ovim pronalaskom sadrži konjugat hapten-nosač Formule (III).

Ovaj metod konjugovanja koji koristi matricu daje fleksibilnost i kontrolu molskih odnosa hapten:protein, bez obzira na broj funkcionalnih grupa na proteinu koje su slobodne za konjugovanje. Ovo je naročito korisno kada se koristi specifični nosač-protein i kada treba da se dobije optimalan odnos, kako bi se postigla viša antigeničnost konjugata. lako nije neophodna upotreba linkera kada se koristi matrica, linker se može koristiti. Da bi se upotrebio linker u ovoj realizaciji, matrica supstituisana nikotinom reaguje sa jedinjenjem koje je aktivni linker. Na primer, ADH, adipinska kiselina hidrazid, se može upotrebiti kao linker sa matričnim konjugatima.

Nosač- proteini

Kada se dobije nikotinski hapten, on se zatim konjuguje na nosač-protein koji će koristiti za nastajanje antitela prema konjugatu nikotinskog nosača. Nosač-protein u ovom pronalasku konjugata nikotinskog nosača predstavljen je u formulama (I) i (III) kao

i obuhvata bilo koji antigeni protein ili polipeptid. Poželjno je da nosač-protein sadrži epitop T-ćelije. Takođe, ovim pronalaskom su pod "nosač-protein" obuhvaćeni MAP-ovi ili multi-antigenski peptidi, koji su račvasti peptidi. Upotrebom MAP gustina i valentnost haptena se dovodi do maksimuma, zahvaljujući višestruko račvastim ostacima aminokiselina. Primer aminokiseline koja se može koristiti za formiranje MAP, ali nije njime ograničen, je lizin.

Nosač protein iz ovog pronalaska sadrži molekul koji ima najmanje jedan epitop T-ćelije, koji je u stanju da stimuliše T-ćelije osobe, koje zatim indukuju

B ćelije dOa proizvode antitela protiv celog molekula konjugata hapten-nosač. Naziv "epitop" se koristi u opisu ovog pronalaska da označi bilo koju determinantu na antigenu koja je odgovorna za specifičnost njene interakcije sa molekulom antitela. Epitopske determinante se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupadja molekula, kao što su aminokiseline ili šećerna strana lanaca, i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i karakteristike specifičnog naboja. Smatra se, da bi imao antigena svojstva, protein ili polipeptid mora biti u stanju da stimuliše T-ćelije. Međutim, moguće je da nosač-protein kome nedostaje epitop T-ćelije, takođe može da bude antigeničan.

Izborom nosača-proteina za koje se zna da izazivaju jak antigeni odgovor, može se tretirati raznolika populacija pacijenata sa pronađenim konjugatima hapten-nosač. Nosač-protein mora biti dovoljno stran da bi izazvao imuni odgovor na vakcinu. Tipično, poželjno je da se kao nosač-protein koristi veliki molekul, koji je u stanju da pruži antigeničnost kovalentno vezanom haptenu. Naročito poželjan nosač-protein je onaj koji je sam po sebi antigeničan. Dakle, veoma je poželjan nosač-protein koji ima visok stepen antigeničnosti i u stanju je da stvaranje antitela prema haptenu dovede do maksimuma.

Obično se u razvoju vakcina konjugata, prilikom eksperimentisanja na životinjama, kao nosači koriste i albumin iz goveđeg seruma (BSA) i ključno-prisajedinjeni hemocijanin (KLH). Međutim, ovi proteini ne moraju biti pogodni za humanu upotrebu. Proteini koji su korišćeni za dobijanje terapeutskih vakcina konjugata su, mada nisu njima ograničeni, brojni toksini patogenih bakterija i njihovi toksoidi. Primeri su toksini difterije i tetanusa i odgovarajući njihovi medicinski prihvatljivi toksoidi. Drugi kandidati su antigeni proteini slični bakterijskim toksinima, koji su poželjni kao materijali za unakrsno reagovanje (CRM).

Prilikom dobijanja farmaceutskih preparata nikotinskih konjugata, kao nosač-protein može se koristiti egzoprotein A iz rekombinantnePseudomonas aeruginosa(rEPA), zato što su njegova struktura i biološke aktivnosti dobro karakterisani. Pored toga, ovaj rekombinantni protein je uspešno i sigurno korišćen na humanim bićima u vakcinama konjugata kapsulamog polisaharidaStaphylococcus aureus,u National Institute of Health i od strane ovih autora. Fattom et al.,Infect. lmmun.1993, 61, 1023-1032. Ovaj protein je identifikovan kao podesan nosač-protein, zato što mu je svojstvena enzimatska aktivnost prirodnog egzotoksina, eliminisana izbacivanjem aminokiseline u položaju 553. Posledica toga je da rEPA ima isti imunološki profil kao i prirodni egzotoksin A (ETA), ali ne poseduje hepatotoksična svojstva prirodnog ETA. U ovoj prijavi naziv "egzoprotein A" odnosi se na modifikovani, ne-hepatotoksični ETA. Na primer, takav egzoprotein A ima izbačenu aminokiselinu u položaju 553.

Konjugovanje haptena na nosač- protein

Postoji veliki broj funkcionalnih grupa koje se mogu koristiti da bi se olakšalo vezivanje ili konjugovanje na nosač malih molekula, kao što je hapten. To su funkcionalni ostaci karboksilnih kiselina, anhidrida, mešovitih anhidrida, aciihalida, acilazida, alkilhalida, N-maleimida, irainoestara, izocijanata, amina, tiola, izotiocijanata i drugih, što je poznato verziranoj osobi u stanje tehnike. Ovi ostaci su u stanju da formiraju kovalentnu vezu sa reaktivnom grupom molekula proteina. Zavisno od funkcionalnog ostatka koji se koristi, reaktivna grupa može biti amino grupa lizinskog ostatka, ili tiolska grupa na nosaču-proteinu ili modifikovanom molekulu nosača-proteina, koji kada reaguje, vodi stvaranju amidne, aminske, tioetarske, amidinureine ili tioureine veze. Onaj ko je verziran u stanje tehnike podrazumeva da se mogu koristiti i druge podesne aktivne grupe i tehnike konjugovanja. Videti na primer, VVong,Chemistry of Protein Conjugation and Cross- Linking,CRC Press, Inc. (1991). Videti takođe Hermanson,Bioconjugate Technigues,Academic Press, (1996) i Dick i Beurret, uConjugate Vaccines,Contribu.Microbiol.lmmunol., Karger, Basal (1989), Vol. 10, 48-114.

Za konjugovanje haptena na nosač-proteine poželjniji su linearni ostaci linkera, u odnosu na ciklične ili račvaste linkere. Poželjan linker je sukcinil ostatak. Međutim, linker može biti ciklične strukture, a isto tako i linearan ostatak. Drugi primer linkera je ADH.

Dakle, konjugati nikotinski hapten-nosač iz ovog pronalaska se dobijaju reagovanjem jednog ili više haptena sa nosač-proteinom, dajući konjugat hapten-nosač koji je u stanju da stimuliše T-ćelije i vodi proliferaciji T-ćelija i oslobađanju medijatora koji aktiviraju specifične B-ćelije i stimulišu proizvodnju antitela, kao odgovor na antigeni konjugat hapten-nosač. Neka antitela nastala kao odgovor na konjugat hapten-nosač su specifična na haptenski deo konjugata hapten-nosač. Ovaj pronalazak razmatra upotrebu različitih podesnih kombinacija haptena sa nosač-proteinima za upotrebu u tretmanu zavisnosti od nikotina.

Monoklonalna i poliklonalna antitela

U stanju tehnike dobro su poznate tehnike dobijanja monoklonalnih antitela. Monoklonalna antitela se mogu dobiti ubrizgavanjem miševima preparata koji sadrže konjugat nikotinski hapten-nosač, i naknadnim proveravanjem prisustva stvaranja antitela uzimanjem uzorka seruma, vađenjem slezine da se dobiju B-limfociti, spajanjem B-limfocita sa ćelijama mijeloma da bi se dobili hibn'domi, kloniranje hibridoma, selekcija pozitivnih klona koji stvaraju antitela konjugata hapten-nosač, kultivisanje klona koji proizvode antitela i izolovanje antitela iz kulture hibridoma.

Monoklonalna antitela se mogu izolovati i prečistiti iz kultura hibridoma nizom dobro razrađenih tehnika. Te tehnike izolovanja su afinitetna hromatografija sa Protein-A Sefarozom, hromatografija sa izdvajanjem po velični, i jonoizmenjivačka hromatografija. Videti na primer, Coligan, na stranama 2.7.1-2.7.12 i strane 2.9.1-2.9.3. Videti takođe, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" uMethods in Molecular Biology,Vol. 10, strane 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

U stanju tehnike dobro su poznate tehnike dobijanja poliklonalnih antitela. Poliklonalna antitela se dobijaju u skladu sa standardnim tehnikama poznatim u stanju tehnike. Da bi se dobilo poliklonalno antitelo, životinja se ubrizgava sa antigenim matrijalom, pa se sakupi serum bogat antitelima, koji sadrži smešu antitela, koja su usmerena protiv brojnih epitopa ubrizganog antigena. Podesni sisari-domaćini za proizvodnju antitela su, ali nisu njima ograničeni, humana bića, pacovi, miševi, zečevi i koze.

U skladu sa ovim pronalaskom, mogu se takođe koristiti i funkcionalni fragmenti antitela. Ovi fragmenti se dobijaju postupcima koji obuhvataju digestiju sa enzimima, kao što je pepsin ili papain i/ili raskidanje disulfidnih veza hemijskom redukcijom. Alternativno, fragmenti antitela obuhvaćeni ovim pronalaskom mogu se sintetizovati upotrebom automatizovane sinteze peptida, kao što su oni koje komercijalno nude Apllied Biosvnthesis, Multiple Peptide Svstems i drugi, ili se mogu proizvesti ručno, korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike. Videti Gevsen at al.J. Immunol. Methods1978, 102, 259. Direktno ordređivanje sekvencije aminokiselina u različitim regionima u dugim i kratkim lancima monoklonalnih antitela, u skladu sa ovim pronalaskom, može se obaviti konvencionalnim tehnikama.

Fragment u skladu sa ovim pronalaskom može biti Fv fragment. Fv fragment antitela se dobija iz varijabilnog regiona dugog lanca (Vh) antitela i varijabilnog regiona kratkog lanca antitela (VI). Proteolitsko odvajanje antitela može dati dvostruki lanac Fv fragmenata u kome Vh i VI regioni ostaju ne-kovalentno povezani, a zadržavaju kapacitet vezivanja antigena. Fv fragmenti takođe su molekuli antitela rekombinantnog jedinstvenog lanca, u kome su varijabilni regioni dugog i kratkog lanca povezani peptidnim linkerom. Videti Skerra et al.Science,1988, 249, 1038-41. Fragmenti antetela u skladu sa ovim pronalaskom su takođe Fab, Fab', F(ab')2, kojima nedostaje Fc fragment iz nedirnutog antitela.. •

Terapeutski postupci

Zahvaljujući tome što nikotin pokazuje mnogo njegovih značajnih efekata tek kada pređe barijeru krv-mozak, ovaj pronalazak obuhvata terapeutske postupke koji sprečavaju da nikotin prođe kroz barijeru krv-mozak. Detaljnije, ordiniranje pacijentu konjugata nikotinski hapten-nosač generiše antitela protiv nikotina u krvotoku pacijenta. Alternativno, mogu se pacijentu ordinirati anti-nikotinska antitela generisana u podesnom sisaru-domaćinu, izvan tela pacijenta koji treba da se tretira. Ukoliko pacijent puši, nikotin u njegovoj krvi će se vezati za cirkulatorna anti-nikotinska antitela, koja sprečavaju da nikotin stigne do mozga. Stoga, antitela će sprečiti fiziološke i psihološke efekte nikotina koji potiču iz mozga. Zato što pušač oseća umanjenje ili prestanak tih efekata, on/ona gubi želju za pušenjem. Isti terapeutski efekti se očekuju kod korisnika duvana koji se ne puši, nakon što se imunizuju sa konjugatom nikotinski hapten-nosač iz ovog pronalaska. Pored toga, konjugati i antitela iz ovog pronalaska mogu da ispolje njihove efekte utičući na svojstvo nikotina da stimuliše periferni nervni sistem.

Kao što je gore razmotreno, novi konjugati nikotin-nosač iz ovog pronalska održavaju prirodnu hiralnost i strukturu molekula nikotina, a posebno nikotinskog ostatka ovih konjugata koji ima (S)-(-)-konfiguraciju. Prema tome, antitela koja su nastala kao odgovor na takve konjugate su specifična na prirodni oblik nikotina i biće najefiksnija u specifičnom vezivanju nikotina koji se udiše prilikom pušenja ili absorbuje iz duvana koji se ne puši, i inhibiraće efekte ovako unetog nikotina. Pored toga, pronađeni konjugati su hemijski stabilni, a stabilnost je kritična prilikom proizvodnje vakcine koja treba da ima dug vek skladištenja.

Ovi preparati vakcine se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjima ili drugim terapijama koje su korisne u tretmanu zavisnosti. To je ordiniranje jedinjenja koja su, ali nisu njima ograničena, lekovi protiv depresije, kao što je Zyban i Prozac. 1. Ordiniranje konjugata nikotinski hapten- nosač

Konjugati ovog pronalaska su podesni za tretiranje i prevenciju zavisnosti od nikotina. Za tretiranje zavisnosti od nikotina, ordinira se pacijentu koji pati od zavisnosti od nikotina konjugat nikotin-nosač iz ovog pronalaska. Kod prevencije zavisnosti od nikotina, pacijenti koji su rizični u pogledu stvaranja zavisnosti od nikotina, kao što su tinejdžeri, tretiraju se sa konjugatom u skladu sa ovim pronalaskom. Direktno ordiniranje ovog konjugata pacijentu naziva se "aktivna imunizacija".

Preparat vakcine iz ovog pronalska sadrži najmanje jedan konjugat nikotinski hapten-nosač u količini koja je dovoljna da kod njega izazove imuni odgovor. Konjugat nikotinski hapten-nosač je u stanju da zadrži koncentracijuin vivokoja je dovoljna da bude aktivan i prilikom naknadnog uzimanja nikotina.

Početna vakcinacija sa konjugatom nikotinski hapten-nosač iz ovog pronalska stvara visoke titre antitela koja su specifična na nikotin. Terapeutski efikasnu količinu konjugata, koja se ordinira pacijentu kome je neophodan tretman protiv zavisnosti od nikotina, lako određuje verzirana osoba u stanju tehnike. Podesne doze se kreću od 1 -1000 ug/doza. Obično je pacijentu potrebno od jedne do nekoliko nedelja da generiše antitela protiv stranog antigena. Stvaranje antitela u krvi pacijenta se može pratiti korišćenjem tehnika koje su dobro poznate verziranoj osobi u stanju tehnike, kao što su ELISA, radioimunološki test i metode VVestem blotting. Terapeutska efikasnost se takođe može pratiti testiranjem raznih fizičkih efekata nikotina, kao što je krvni pritisak.

Kao što je detalnije opisano u nastavku, pronađeni konjugati nikotinski hapten-nosač mogu se pripremiti tako da daju preperat koji se jednostavno ordinira pacijentu. Poželjni načini ordiniranja su, ali nisu njima ograničeni, intranazalni, intratrahealni, oralni, dermalni, transmukozalne potkožne injekcije i intravenozne injekcije. Verzirana osoba zna da inicijalnu injekciju može da sledi nekoliko naknadnih ordiniranja jedne ili više pojačanih doza konjugata. Ovakva pojačana doza povećava proizvodnju antitela protiv konjugata nikotinski hapten-nosač iz ovog pronalaska.

Preparati vakcine iz ovog pronalska mogu da sadrže najmanje jedan adjuvant. Adjuvant koji se koristi u ovom pronalasku se bira tako da se ne inhibira efekat nosača-proteina. Adjuvanti koji se koriste u ovom pronalasku su oni koji su fiziološki prihvatljivi humanim bićima, a to su, bez ograničavanja na iste, stipsa, QS-21, saponin i MPLA (monofosforillipid A).

Preparati vakcije iz ovog pronalaska mogu opciono da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih dodataka. Dodaci koji su korisni u ovom pronalsku su sterilna voda, slani rastvori soli, natrijum-fosfat, natrijum-hlorid, alkohol, gumiarabika, biljna ulja, benzilakoholi, polietilenglikol, želatin, manitol, ugljenihidrati, magnezijum-stearat, viskozni parafin, estri masnih kiselina, hidroksimetil celuloza i puferi. Naravno, u ovom pronalasku su korisni i drugi dodaci koji su poznati verziranim osobama u stanje tehnike.

Konjugati hapten-nosač iz ovog pronalaska, da bi se ordinirali pacijentu kome je potreban tretman protiv zavisnosti od nikotina, ugrađeni su u farmaceutski preparat. Kada se preparat koji sadrži konjugat hapten-nosač koristi za injekcije, poželjno je da se konjugat hapten-nosač solubilizuje u vodenom slanom rastvoru, na farmaceutski prihvatljivom pH. Međutim, moguća je upotreba i injektibilne suspenzije konjugata hapten-nosač. Pored uobičajenih, farmaceutski prihvatljivih dodataka, preparat može opciono da sadrži i komponente koje obezbeđuju čistoću, pojačavaju bioupotrebljivost i/ili povećavaju penetraciju.

Pored toga, preparat vakcine može opciono da sadrži najmanje jedan pomoćni agens, kao što su medijum za dispergovanje, prevlake, mikrosfere, lipozomi, mikrokapsule, lipidi, surfaktanti, lubrikanti, prezervativi i stabilizatori. Naravno, u ovom pronalasku od koristi mogu biti bilo koji pomoćni agensi, koji su poznati verziranim osobama u stanje tehnike. Takođe, ovde su korisni svi agensi koji vode sinergiji sa efektom preparata ove vakcine.

Farmaceutski preparat iz ovog pronalaska je sterilan i dovoljno stabilan da podnese skladištenje, disribuciju i upotrebu. Pored toga, ovaj preparat sadrži i druge komponente, kako bi se preparat zaštitio od zaraze od ili rasta mikroorganizama. Poželjno je da se ovaj preparat proizvodi u obliku liofilnog praha koji se rekonstituiše sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, neposredno pred ordiniranje. Postupci dobijanja sterilnih injektibilnih rastvora su dobro poznati u stanju tehnike, a to su, bez ograničavanja na iste, sušenje u vakuumu, sušenje smrzavanjem i obrtno sušenje. Ove tehnike daju prah aktivnog sastojka zajedno sa drugim dodacima ubačenim prethodno u smešu. 2. Ordiniranje antitela nastalih kao odgovor na koniuaat nikotin- nosač Pasivna imunizacija se sastoji u ordiniranju ili izlaganju poliklonalnom antitelu ili monoklonalnom antitelu, koje je nastalo kao odgovor na konjugat nikotinski hapten-nosač iz ovog pronalaska. Takva antitela se mogu generisati u životinjama ili humanim bićima. Antitela nastala ko odgovor na nikotinski konjugat iz ovog pronalaska se mogu ordinirati da bi se sprečila zavisnost od nikotina. Na primer, takva antitela se mogu ordinirati ljudima za koje se smatra da su rizični u pogledu stvaranja zavisnosti od nikotina, kao što su tinejdžeri. Antitela su takođe podesna za tretiranje pacijenta zavisnog od nikotina. Kao što je gore razmatrano, ova antitela će vezati nikotin u krvi i sprečiti nikotin da pređe barijeru krv-mozak. Antitela nastala ordiniranjem pronađenog konjugata hapten-nosač imaju opseg molarne mase od oko 150 kDa do oko 1000 kDa.

Terapeutski efikasnu količinu terapeutskog antitela iz ovog pronalaska, koja se ordinira pacijentu kome je potreban tretman protiv zavisnosti od nikotina, jednostavno određuje verzirana osoba u stanje tehnike. Podesni opsezi doze su 1-1000 ug/doza.

Terapeutski preparat iz ovog pronalaska sadrži antitelo koje je proizvedeno kroz odgovor na konjugat nikotin-nosač iz ovog pronalaska. Ti preparati iz ovog pronalaska mogu opciono da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih dodataka. Dodaci koji su korisni u ovom pronalasku su sterilna voda, slani rastvori soli, natrijum-fosfat, natrijum-hlorid, alkohol, gumiarabika, biljna ulja, benzilakoholi, polietilenglikol, želatin, manitol, ugljenihidrati, magnezijum-stearat, viskozni parafin, estri masnih kiselina, hidroksimetil celuloza i puferi. Naravno, u ovom pronalasku su korisni i drugi dodaci koji su poznati verziranim osobama u stanje tehnike.

Antitela iz ovog pronalaska, da bi se ordinirala pacijentu kome je potreban tretman protiv zavisnosti od nikotina, su ugrađena u farmaceutski preparat. Kada se preparat koji sadrži antitelo, treba da koristi za injekcije, poželjno je da ima antitelo u vodenom, slanom arstvoru, pri farmaceutski prihvatljivom pH. Međutim, moguće je koristiti i injektibilnu suspenziju antitela. Pored uobičajenih, farmaceutski prihvatljivih dodataka, preparat može da sadrži opciono i komponente koje osiguravaju čistoću, podižu bioupotrebljivost i/ili povećavaju penetraciju.

Farmaceutski preparat koji sadrži antitelo iz ovog pronalaska je sterilan i dovoljno stabilan da izdrži skladištenje, distribuciju i upotrebu. Pored toga, ovaj preparat može da sadrži dodatne komponente da bi se preparat zaštitio od zaraze od ili rasta mikroorganizama. Postupci dobijanja sterilnih injektibilnih rastvora su dobro poznati u stanju tehnike, a to su, bez ograničavanja na iste, sušenje u vakuumu, sušenje smrzavanjem i obrtno sušenje. Ove tehnike daju prah aktivnog sastojka zajedno sa drugim dodacima ubačenim prethodno u smešu.

Kompleti koji sadrže antitela iz ovog pronalaska

Antitela iz ovog pronalaska su korisna takođe za dobijanje kompleta koji se može koristiti za detekciju i kvantitativno vrednovanje sadržaja nikotina u uzorku. Komplet u skladu sa ovim pronalaskom sadrži specifično nikotinsko antitelo u skladu sa ovim pronalaskom, u podesnom kontejneru. Za radioimonološki test, komplet može takođe da sadrži radioaktivno obeleženi nikotin. Nikotin u uzorku se detektuje vezivanjem nikotina za antitelo i zatim konkurencijom obeleženog nikotina iz ovog antitela sa uzorkom koji se testira. Komplet ELISA takože sadrži antitelo u skladu sa ovim pronalaskom. ELISA može da sadrži i inhibitor vezivanja antitela za poznatu količinu nikotina, u poređenju sa inhibicijom u uzorku u kome je sadržan nikotin. Ovo omogućava određivanje nepoznatog sadržaja nikotina u uzorku, poređenjem uzorka sa standardnom krovom inhibicije poznatih koncentracija nikotina. U drugom tipu ELISA, uzorak u kome se nalazi nikotin inkubira se na mikrotitarskoj ploči, obloženoj supstancom koja će vezivati nikotin. Dodaju se antitela iz ovog pronalaska, pa se na ploču dodaju enzimski vezana anti-antitelna antitela. Dodatak substrata kvantitativno određuje količinu nikotina vezanog na ploči.

Primeri koji slede daju se samo za dodatno ilustrovanje dobijanja i upotrebe ovog pronalaska. Obim ovog pronalaska se ne ograničava primerima koji slede.

Primer 1.

Sinteza i derivatizaciia nikotinskog haptena ( supstituisanog u 3' položaju)

Polazni materijal za sintezu haptena je f/ans-4'-karboksi-(-)-kotinin, koji se dobija iz komercijalnih izvora. Proceduru modifikacije su opisali Cushman i Catagnoli.Jr.,J. Org. Chem.1972, 37(8), 1268-1271, koja daje alkohol,trans-3'-hidroksimetil-(-)-nikotin, posle metil esterifikacije kiseline, posle koje sledi redukcija estra. Ovaj alkohol se zatim sulfonizuje, a sulfonatna grupa se izmesti sa azido grupom, koja se konačno redukuje u amin.

Uzme se 4 g f/ans-4'-karboksi-(-)-kotinina i rastvori u 50 mL 1M rastvora sumporne kiseline u suvom metanolu, pa se preko noći mesa na sobnoj temperaturi. Nastala suspenzija se filtrira kroz filter papir VVhatman No. 1, pa se lagano doda u 100 mL zasićenog rastvora natrijum-bikarbonata. Ovaj estar se ekstrahuje dihlorometanom, dajući posle isparavanja rastvarača 4,2 g ružičastog ulja.

Rastvor 3,9 g ovog estra u suvom tetrahidrofuranu (100 mL) se u kapima dodaje u suspenziju 4 ekvivalenta litijum-amonijumhidrida u suvom tetrahidrofuranu (70 mL), pod suvim argonom. Ova suspenzija se 2 h meša na sobnoj temperaturi. Razori se višak hidrida pažljivim i kontrolisanim dodavanjem vode, uz hlađenje u kupatilu sa ledom. Nastali beli talog se odvoji filtriranjem, a filtrat osuši iznad natrijum-sulfata i koncentriše pod sniženim pritiskom, dajući 2,7 g alkohola u obliku žutog ulja.

Ovaj alkohol (1,9 g) se rastvori u 20 mL dihlorometana. Zatim se redom ovom rastvoru dodaju trietilamin (0,75 mL) i p-toluensurfonilhlorid (1 g). Oranž rastvor se 24 h meša na sobnoj temperaturi. Istaloženi trietilamin hidrohlorid se odvoji filtriranjem kroz sloj Celite-a, a filtrat se koncentriše pod sniženim pritiskom, dajući mrko ulje. Sulfonat se prečisti hromatografijom na koloni sa silikagelom, i eluira sa 5% metanolom u dihlorometanu, dajući 2,1 g žutog ulja.

Ovaj sulfonat (1,8 g) se tretira upotrebom natrijum-azida (0,8 g) u 50 mL dimetilformamida, tokom 1 h, na 80°C. Posle isparavanja dimetilformamida pod visokim vakuumom, ostatak se rastvori u dihlorometanu, opere vodom i zasićenim rastvorom soli i osuši iznad natrijum-sulfata. Posle isparavanja rastvarača, dobije se azid kao mrko ulje (1,1 g)..

Dodavanjem ovog azida u suvom tetrahidrofuranu (20 mL) u suspenziju litijum-amonijumhidrida u suvom tetrahidrofuranu (50 mL), lako se dobija željeni amin, što se prati hromatografijom u tankom sloju. Protonska i ugljenična magnetna nuklearna rezonanca prečišćenog amina odgovaraju očekivanoj strukturi.

Primer 2

Sinteza derivatizovanoa nikotinskog haptena ( supstituisanog u 4' položaju)

Uvođenje funkcionalizovanog ogranka u 4' položaju nikotina se može postići enolatnim alkilovanjem kotinina, nakon čega sledi redukcija alkilovanog proizvoda. Mogu se koristiti razna sredstva za alkilovanje, kao što je odgovarajuće zaštićeni 3-bromo-propilamin. Na primer, mogu se koristiti 3-bromo-N-karbobenziloksi-propilamin ili N-(3-bromopropil)-ftalamid. Zaštitna grupa amina treba da se ukloni posle alkilovanja i redukcije, pre konjugovanja na nosač-protein. Enolatno alkilovanje cikličnih laktama (koji sadrže pirolidinski prsten) dobro je dokumentovano u literaturi (videti za opšti pregled G.Helmchen et al. "Stereoselective Svntheses", uHouben- Weyl- Methods of Organic Chemistry.1995, Vol. E21a, 762-881, Thieme, Stuttgart, Nemačka, i A.J.Mevers et al.J. Am. Chem. Soc.1997, 119, 4564-4566 za sterna razmatranja ove reakcije). Postoje takođe neki primeri enolatnog alkilovanja samog kotinina (N.H.Lin et al.J. Med. Chem.1994, 37, 3542-3553). Interesantno dobijanje 4'-acetil-nikotina, kao 1:1 smeše dva epimera, postiže se korišćenjem tandemskog katjonskog aza-Cope premeštanja u Mannich-evoj reakciji ciklizacije, koja polazi od ketona (ili aldehida) i 2-alkoksi-3-alkenamina (L.E.Overman, 1983J. Am. Chem. Soc.105. 6622-6629). Ova reakcija se može produžiti da se dobije 4'-aldehido-nikotin, koji je podesan za konjugovanje.

Suspenduje se 3-bromo-propilamin hidrobromid (4,2 g) u 50 mL dihlorometana, pa se dodaje trietilamin (oko 7 mL) sve dok rastvor ne postane bistar. Ovaj rastvor se ohladi na 0°C, pa se u kapima dodaje benzilhloroformijat (2,5 mL). Reakcija se ostavi da se 16 h odigrava, uz mešanje, na sobnoj temperaturi, (staložene soli se odvoje filtriranjem, a bistar organski sloj se opere hladnom vodom, hladnom 1M HCI i hladnom vodom, osuši na natrijum-sulfatu i ispari pod sniženim pritiskom, do žutog ulja (2,93 g sirovog materijala).

Kotinin (62 mg) i 3-bromo-N-karbobenziloksipropilamin (100 mg) se odvojeno ko-isparavaju sa suvim toluenom. Kotinin se rastvori u 5 mL sveže destilovanog, bezvodnog tetrahidrofurana, pa se doda 60 pL N,N,N',N'-tetrametilendiamina (TMEDA), a rastvor ohladi na -78°C, potapanjem u kupatilo etanol-suvi led. Rastvor kotinina se u kapima dodaje rastvoru litijum-diizopropilamida (LDA, 200 uL 2M rastvor u heptan-tetrahidrofuranu) u tetrahidrofuranu, koji je prethodno ohlađen na -78°C. Oranž smeša se 15 min meša na -78°C, a zatim se osatvi da se zagreje do temperature ledenog kupatila (2° do 6°C). Reakcija se ponovo ohladi na -78°C, pa se tokom 15 min u kapima dodaje 3-bromo-N-karbobenzoksi-propilamin, rastvoren u bezvodnom tetrahidrofuranu. Reakciona smeša se ostavi da se zagreje do -10°C, pa zatim tretira sa metanolom. Proizvod ove reakcije se prečisti hromatografijom na koloni sa silikagelom. Redukcija amida ovog kotininskog derivata se obavlja sa boranom, nakon čega sledi cezijum-fluorid u vrućem etanolu. Konačni amin se dobija posle uklanjanja karbobenziloksi grupe, pod kiselim uslovima.

Primer 3

Sinteza derivatizovanog nikotinskog haptena ( supstitisanog u položaju 5')

Uvođenje funkcionalizovanog ogranka u položaju 5' nikotina može se postići reagovanjem odgovarajuće zaštićenog alkil-litijum jedinjenja sa kotininom, nakon čega sledi redukcija sa natrijum-cijanoborohidridom, po procedurama koje su slične onima koje su opisali Shibagaki et al.Heterocycles1986, 24, 423-428, i N.H.Lin et al. (1994) videti gore.. ,

Primer 4.

Konjugovanje derivatizovanog nikotinskog haptena sa nosač- proteinom

Rekombinantni egzoprotein A (rEPA) se vezuje za derivatizovani nikotinski hapten preko grane ćilibame kiseline. Sukciniluje se ćilibamom kiselinom 15 lizina iz rEPA. Zatim, u tipičnoj reakciji konjugovanja dobije se 5 do 10 mg/mL rastvora sukcinilovanog rekombinantnog egzoproteina A (Suc-rEPA) u 0,05 M puferu 2-(N-morfolino)etansulfonske kiseline (MES), koji sadrži 0,15 M NaCI, na pH 6,0. Jednaka masa haptena, 3'-aminometil-(-)-nikotina (3'AMNIc) se rastvori u minimalnoj zapremini destilovane vode, pa se doda rastvoru proteina. Pre dodavanja, podesi se pH haptenskog rastvora na 6,0 sa 0,1 M HCI. Konačno, jednaka masa 1-etil-3-(3-dietilamino)propil karbodiimid hidrohlorida (EDC) se doda u smešu hapten-protein, pa se ostavi da reaguje 30 min na sobnoj temperaturi, uz mešanje. Ovako dobijen nikotinski konjugat se prečisti na koloni sa Sephadex G.25 i eluira slanim fosfatnim puferom (PBS), od pH 7,4. Regenerisani konjugat se kreće u opsegu od 80 do 90%.

Primer 5

Konju<g>ovanje matrice zasićene nikotinom

Ovaj primer opisuje sintezu konjugata hapten-nosač, koji se sastoji od 3'-aminometil-(-)-nikotina kao derivatizovanog haptena, rekombinantnog egzoproteina A (rEPA) kao nosač-proteina, adipinska kiselina hidrazida (ADH) kao linkera i poli-L-glutaminske kiseline kao "matrice" ili polimernog nosača, za haptene.

U ovom primeru se koristi poli-L-glutaminska kiselina, koja ima prosečnu molamu masu 39900, polidisperznost 1,15 i stepen polimerizacije 264. Količine haptena i polimera koje treba da reaguju, izračunaju se tako da je ciljani stepen supstituicije oko 80%. To znači, kada se dostigne stepen supstitucije 80%, konjugovano je oko 208 haptenskih jedinica, od ukupnih 264 jedinice u prosečnom molekulu polimera glutaminske kiseline.

Ova poli-L-glutaminska kiselina zasićena nikotinom ima sledeću formulu:

Kao što je pokazano na ovoj slici, polimer poliglutamisnke kiseline sadrži oko 52 glutaminska ostatka. Ovaj broj će varirati zavisno od šarže i izvora poliaminokiselinskih ostataka koji se biraju za matricu. Takođe, slika pokazuje 4 nikotinska haptena u svakoj ponovljenoj jedinici. Ovaj broj će varirati zavisno od odnosa upotrebljenih reaktanata, kada se konjuguju matrica i nikotinski hapten.

Nakon konjugacije sa derivatizovanim nikotinom, neizreagovale karboksilne grupe (oko 20%) se zatim derivatizuju sa ADH. Kada se matrica konjuguje sa nosačem, kao što je opisano u Primeru 6, molski odnos nikotinom zasićene matrice prema proteinu je 1:1. Dakle, posle završetka reakcije konjugacije u ovom konjugatu teorijski molski odnos nikotinskog haptena prema proteinu iznosi 200:1.

Stvarni odnos supstitucije nikotina na poliglutaminskoj kiselini se određuje koristeći analizu proizvoda sa NMR. Intenzitet pika a-vodonika glutaminske kiseline, u odnosu na četiri vodonika piridinskog prstena nikotina, daje proporciju ugrađenog nikotina. Procenjeni prosečni odnos je 143:1 (nikotin: nosač-protein).

Primer 6

Pobijanje vakcine nikotinskog koniuoata korišćenjem matrice zasićene

nikotinom

A. zasićavanie matrice nikotinskim haptenom

Rastvori se 10 mg soli poli-L-glutaminske kiseline (Sigma, katal. broj P-4761) u 2 mL 0,05 M pufera 2-(N-morfolino)etansulfonske kiseline (MES) koji sadrži 0,15 M NaCI pri pH 6,0. Rastvori se 10 mg 3'-aminometil-(-)-nikotina u minimalnoj zapremini destilovane vode, pa se podesi pH ovog rastvora na 6,0 sa 0,1 M HCI. Rastvor nikotinskog haptena se uz mešanje dodaje u kapima u rastvor polipeptida, pa se posle toga podesi pH na 6,0. Zatim se u tri porcije, tokom 20 min, dodaje 20mg čvrstog 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (EDC) u smešu hapten-polipeptid. Reakcija se ostavi da teče 1 h na sobnoj temperaturi. Proizvod reakcije (matrica supstituisana nikotinom) se dijalizuje sa tri izmene vode, pa se liofilizuje. Dobije se 12 mg poliglutaminske kiseline supstituisane nikotinom, u obliku belog paperjastog materijala.

B. Vezivanje linkera za matricu supstituisanu nikotinom

Rastvori se 10 mg poliglutaminske kiseline supstituisane nikotinom u 2 mL MES pufera od pH 6,0. U ovaj rastvor sledi dodavanje, uz-mešanje, 8 mg dihidrazida adipinske kiseline (ADH) i zatim 10 mg EDC. Reakcija se ostavi 1 h na sobnoj temperaturi, da se odigra. Dobijeni rastvor se konačno dijalizuje uz tri promene pufera MES od pH 6,0.

C. Koniugaciia sa nosač- proteinom

Rastvori se 10 mg rekombinantnog egzoproteina A (rEPA) u 2 mL 0,05 M pufera MES, pH od 5,6, koji sadrži 0,5 M NaCI. Procenjena zapremina rastvora poliglutaminske kiseline supstituisane nikotinom sa vezanim ADH, koja sadrži 7,5 mg ovog derivatizovanog materijala, doda se u rastvor proteina. Ovoj smeši dodaje se tokom 20 min, u tri porcije, čvrst EDC, uz mešanje na sobnoj temperaturi. Reakcija se ostavi peko noći na sobnoj temperaturi, da se odigra. Nastali konjugat se konačno prečisti na koloni sa Sephadex-om G-25, uz eluiranje sa slanim puferom (PBS), od pH 7,4. Ovako se dobije prečišćeni preparat konjugata, pri čemu ovaj konjugat sadrži samo (S)-(-) oblik nikotina.

Primer 7

Karakterizacija konjugata nikotinskog nosača iz Primera 4

Prečišćena vakcina konjugata iz Primera 4 je analizirana posebnom hromatografijom na koloni sa Superose 12 i eluirana sa PBS od pH 7,4. Molski odnos haptena prema proteinu od 11 do 17 je izračunavan određivanjem porasta UV absorpcije na 260 nm nakon ugradnje nikotina, u odnosu na a<p>sorpciju na 280 nm. Ovaj opseg je određen izračunavanjem odnosa hapten-(protein-nosač) za šest posebno dobijenih partija konjugata hapten-nosač (1. partija 17,2; 2.partija; 16,2; 3. partija 13,2; 4.partija12,0; 5. partija 11,0; 6. partija: 17,2). Sledeća analiza za određivanje ovog odnosa koristi masenu spektrometriju MALDI-TOF, koja je dala suštinski iste brojeve koji su dobijeni iz razlike UV absorbancija. Koncentracija proteina u vakcini konjugata je određena korišćenjem BCA testa. Obavljeno je izučavanje stabilnosti konjugata nikotin-nosač iz Primera 4. Ovo izučavanje je koristilo vakcinu pakovanu u staklene fiole od 1 mL, sa koncentracijom 0,5 mg/mL, a stabilnost vakcine u fiolama je testirana na tri temperature: -70°C, 2° do 8°C i na sobnoj temperaturi.

Primer 8

Stabilnost koniuaata nikotinsko<g>nosača iz Primera 4 ,

Procedura konjugovanja, zasnovana na stvaranju amidnih veza između hapten-linker-nosača, a ne drugih veza, pokazala se korisnom, što je opaženo preko stabilnosti konjugata tokom šest meseci na -70°C, 2° do 8°C i čak i na sobnoj temperaturi. Ovo izučavanje stabilnosti, praćenje i testiranje vakcine konjugata je korstilo sledeće kriterijume: 1) vizuelno opažanje, traženjem bilo kakvih nastalih čestica (zamućenje, taloženje); 2) provera bilo koje značajne promene pH; 3) profil hromatografije sa isključivanjem po veličini, u kombinaciji sa UV absorpcijom na 260 i 280 nm, da bi se odredilo da li se promenio odnos ugrađenog nikotina; 4) hromatografija sa reversnom fazom, da se proveri degradacija nosač proteina; 5) SDS PAGE sa bojenjem srebra, da se proveri da li je došlo do proteolitičkog cepanja konjugovanog proteina.

Procedura konjugovanja, zasnovana na stvaranju amidne veze između haptena i linkera, a isto tako između linkera i nosača, pokazala se korisnom pri proveravanju stabilnosti konjugata, tokom šest meseci na -70°C i između 2° i 8°C.

Primer 9

Autoimunooeni podaci konjugovanog nosača iz Primera 4 i 6

Dve vakcine konjugata nikotinski hapten-nosač su korišćene za imunizaciju miševa, pacova i zečeva.

A_ Poliklonalna antitela. testovi na životinjama

Životinje se imunizuju korišćenjem standardnog protokola. Kod miševa, ordiniraju se tri potkožne injekcije vakcine, u razmaku od dve nedelje, sa testovima krvi obavljenim jednu nedelju nakon prve i druge injekcije i iskrvarenjem prve nedelje posle treće injekcije, Uzorci seruma su vrednovani pomoću ELISA testa, koji je opisan u Primeru 10. Test ELISA je koristio 3' AMNic-pGlu vezan za mikrotitarske ploče.

Pacovi su imunizovani vakcinom tri puta, intraperitonealno. Injekcije su davane sa razmakomod dve nedelje, sa testovima krvi obavljenim jednu nedelju nakon prve i druge injekcije. Pacovi su iskrvareni jednu nedelju posle treće injekcije. Korišćen je Freund-ov kompletni adjuvant u prvoj injekciji, a Freund-ov nekompletni adjuvant kod narednih injekcija. Uzorci seruma su vrednovani pomoću ELISA testa.

Zečevi su imunizovani tri puta, sa razmakom od tri nedelje, sa vakcinom od 100 ug . Prva injekcija je sadržala Freund-ov adjuvant, a naredne injekcije su sadržale Freund-ov nekompletni adjuvant. Zečevi su testirani jednu nedelju posle druge i treće injekcije, kako bi se obezbedili adekvatni titri za proizvodnju iz krvi. Ukoliko se dostigne adekvatni titar, mereno sa ELISA, zečevi su zatim stavljani na nedeljnu šemu proizvodnje krvi (20 do 40 mL seruma po zecu). Titri anitetla su praćeni tokom ovog vremena, a životinjama su davane pojačane doze, ukoliko je bilo neophodno da se obnove sadržaji antitela.

Rezultati ovih izučavanja antigeničnosti su pokazani u Tabelama 1-5. Tabele 1 i 2 pokazuju rezultate izučavanja antigeničnosti kod miševa. U Tabeli 1 korišćen je konjugat 3'-aminometil-(-)-nikotin-sukcinil-rEPA (Primer 4). U Tabeli 2 korišćen je konjugat 3-aminometil-(-)-nikotin-poliglutaminska kiselina-ADH-rEPA (Primer 6). Ove Tabele pokazuju generisanje visokih titara antitla koja specifično vezuju nikotin. Dalje, ovi konjugati su pokazali svojstvo sa indukuju pojačani odgovor.

Tabele 3 i 4 pokazuju rezultate izučavanja antigeničnosti kod pacova. U Tabeli 3 korišćen je konjugat 3'-aminometil-(-)-nikotin-sukcinil-rEPA (Primer 4). U Tabeli 4 je korišćen je konjugat 3-aminometiI-(-)-nikotin-poliglutaminska kiselina-ADH-rEPA (Primer 6).

Ove Tabele pokazuju generisanje visokih titara antitela koja se specifično vežu za nikotin. Pored toga, ovi konjugati su pokazali svojstvo pojačanog odgovora.

Tabela 5 pokazuje rezultate izučavanja antigeničnosti kod zečeva. Koristeći bilo 3'-aminometil-sukcinil-rEPA (Primer 4) ili 3-aminometil-poliglutaminska kiselina-ADH-rEPA (primer 6), generisani su visoki titri antitela protiv ova dva konjugata. Ovi titri su ostali povišeni duže od 6 meseci.

Primer 10.

Test ELISA i specifičnost antitela

Sam molekul nikotina nije podesan za oblaganje ELISA ploča i treba da se veže za veći molekul, koji ima bolja adhezivna svojstva. U tu svrhu se obično koriste poli-L-lizin ili poli-L-glutaminska kiselina. Za oblaganje ELISA ploča koriste se derivatizovani nikotinski hapten 3'-aminometil-(-)-nikotin (3'AMNic), koji se konjuguje sa poli-L-glutaminskom kiselinom, i konjugat 3'-aminometil-(-)-nikotin-poli-L-glutaminska kiselina (3'AMNic-pGlu).

Antitela koja se generišu protiv vakcine 3'AMNic vrednuju se korišćenjem 3'AMNic-pGlu ELISA, kao što sledi: Mikrotitarske ploče Dvnatech Immulon 4 (Chantilly, VA) oblože se sa 10 ng/mL 3'AMNic-pGlu u 0,1 M bikarbonatnom puferu, pH 9,6 zapremine 100 pL/bazenčić, pa se ostave da se inkubiraju preko noći (ON), na sobnoj temperaturi (RT). Ploče se zatim aspiriraju i blokiraju 1 h na RT sa 1% BSA u PBS. Uzorci i referentni serum se razblaže u PBB (1% BSA, 0,3% BRU u PBS, pH 7,2) do razblaženja koje daje optičku gustinu (OD) od približno 2,0 na 450 nm. Ove ploče se pet puta operu (9% NaCI, 0,1% BRU), pa se napune razblaženim uzorcima i referentnim serumom. Referentni uzorak i uzorci se 2-struko razblaže u pločama do konačne zapremine od 100 pL/bazenčić, pa se ploče 1 h inkubiraju na 37° C. Ploče se zatim ponovo operu i pune sa 100 pL/bazenčić sa anti-specijom konjugovane peroksidaze IgG, specifično Fc (Jackson, West Grove, PA), razblaže u PBB i inkubiraju 1 h na 37°C. Ploče se operu i inkubiraju 10 min na RT sa 100 pL/bazenčić 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), substratom (KPL, Gaithersburg, MD) razblaženim 1:1 sa H2O2(kome je dodat TMB reagens komplet). Ova reakcija se zaustavlja dodatkom 100 pL/bazenčić 1M fosforne kiseline, pa se čita na 450 nm, pomoću MR4000, microtiter plate reader (Dvnatech). Uzorci se kvantitativno odrede relativno prema referentnom uzorku, koristeći analizu paralelne linije. Referentnom uzorku se pripiše brojčana vrednost (U/mL) koja odgovara razblaženju koje daje OD od približno 2,0 na 450 nm.

Specifičnosti antitela se vrednuju korišćenjem inhibicionog testa ELISA. Svaka anti[3'AMNic-Suc-rEPA] grudvica se razblaži do dvostruke koncentracije od one koja bi dala optičku gustinu od oko 2,0 na 450 nm. Korišćenjem 3'AMNic-pGlu ELISA opisanog gore, razblaženi antiserum koji treba da se testira, absorbuje se u odnosu 1:1 (VA/) sa rastućom zapreminom test-antigena (inhibitor), tokom 3 h na 37°C, pa se taj absorvani uzorak testira u ELISA, koristeći neabsorbovani serum kao referencu. Procenat absorpcije u odnosu na neabsorbovani uzorak odredi se za svaki uzorak.

Specifičnost seruma pacova koji sadrži antitela nastala kao odgovor na 3'AMNic-Suc-rEPA, izračunava se koristeći inhibicioni test ELISA sa nikotintartaratom kao inhibitorom. Vrednost IC50za ovo antitelo je 3,5-10"<6>M. Specifičnost seruma zečeva koji sadrži antitela nastala kao odgovor na 3'AMNic-Suc-rEPA, izračunava se koristeći inhibicioni test ELISA sa nikotintartaratom kao inhibitorom. IC50za ovo antitelo je 2,3-10"<5>M.

Primer 11

Afinitet antitela i kapacitet vezivanja ?

Kapacitet vezivanja antitela se meri korišćenjem ravnotežne dijalize, tokom 4 h na 37°C, uz upotrebu 0,7 mL plazme, Teflonske semi-mikro ćelije, membrane Spectrapor 2 koja odseca molame mase od 12 do 14 kDa i Sorenson-ovog pufera (0,13 fosfat, pH 7,4). Videti Pentel et al.J. Pharmacol. Exp. Ther.1987, 246. 1061-1066. Odredi se pH plazme na kraju svakog eksperimenta ravnotežne dijalize, a uzorci se koriste samo ukoliko je konačno pH između 7,30 i 7,45.

Afinitet antitela prema nikotinu se izračunava korišćenjem radioimuno testa, videti Mueller,Meth. Enzymol.1983, 92, 589.601. Određena molama masa IgG je bila 150 kDa.

Konstante vezivanja i afiniteti se dobijaju iz radioimunotesta kao što sledi. Za anti-[3'AMNic-Suc-rEPA] serum pacova, IC50(molama) je 1.36-10"<7>. K (molami-1) je 2,57-10<7.>Koncentracija mesta za vezivanje je 2,62-10'<6>mesta za vezivanje/L, a koncentracija IgG specifičnih na nikotin je 0,2 mg/mL.

Primer 12.

Vrednovanje rasoodele nikotina u plazmi i mozgu, na modelu životinja

Ovde pronađena vakcina je vrednovana na različitim modelima životinja. Korišćeni su modeli pacova da bi se odredio efekat aktivne ili pasivne imunizacije na raspodelu nikotina u plazmi i mozgu. Jedna studija je ispitivala efekte pasivne imunizacije na prigušivanje lokomotomih efekata nikotina, kao dejstva nikotina na centralni nervni sistem (CNS). Drugi eksperiment je vrednovao efekte pasivne imunizacije na efekte nikotina na kardiovaskularni sistem: povišenje sistolnog krvnog pritiska.

Da bi se vrednovala ova imunoterapija, razvijen je model na životinji tako da simulira brzu absorpciju nikotina iz dve cigarete kod humanih bića. Ovaj model na životinji je opisao HiedaJ. Pharmacol. Exp. Ther.1997, 283(3), 1076-1081. U ovom modelu, pacovima se ordinira 0,03 mg/kg nikotina i.v. infuzijom, tokom 10 s, simulirajući brzu absorpciju nikotina iz pluća ljudi koji puše. Uzorci krvi za merenja nikotina u plazmi su uzeti 3 i 10 min posle injekcije nikotina. Kada je trebalo odrediti koncentarcije nikotina u mozgu, životinje su žrtvovane 3 min posle injekcije nikotina i njihov mozak je brzo izvađen. Vrednovana je vakcina iz Primera 4 na pacovima, da bi se odredio njen efekat na raspodelu nikotina u plazmi i mozgu.

A. aktivna imunizaciia

Pacovi su imunizirani sa nikotinskom vakcinom kroz tri i.p. injekcije od ukupno 25 pg po injekciji vakcine (3'AMNic-Suc-rEPA), u razmaku od dve nedelje. Ove životinje su imale povišene sadržaje nikotina u plazmi 3 i 10 min posle infuzije 0,03 mg/kg nikotina, tokom 10 s, u poređenju sa sadržajima kod neimunizovanih kontrolnih uzoraka. Videti sliku 1. Dakle, aktivna imunizacija je efikasna u povećanju vezivanja nikotina u plazmi. Poznato je da i najskromnija redukcija nikotina koji stiže u mozak može dramatično da izmeni efekte ponašanja usled nikotina.

B. Pasivna imunizaciia

Kod pasivne imunizacije, bilo je moguće određivanje odgovora na efekat doze imunog IgG na porast nikotina u plazmi i smanjenje sadržaja nikotina u mozgu. Pacovima su ordinirane različite količine anti-(3'AMNic-Suc-rEPA) IgG (12,5 do 50 mg) po injekciji. Kao što pokazuje slika 2, postoji jasan efekat doza-odgovor, sa povećanjem doze IgG rastu sadržaji serumskog nikotina, a opadaju sadržaji nikotina u mozgu.

Slika 3 pokazuje da su anti-nikotinska antitela (anti-3'AMNic-Suc-rEPA) prisutna i aktivna u serumu pacova 30 min i 1 dan posle ordiniranja antitela (50 mg, ukupno po injekciji). Slika 3 pokazuje da su, posle uzimanja nikotina (0,03 mg/kg infuzijom za 10 s), ova antitela bila efikasna u smanjenju koncentracija nikotina u mozgu i povećanju sadržaja nikotina u plazmi, i 30 min i 1 dan posle ordiniranja antitela.

Sledeća demonstracija efikasnosti pasivne imunizacije sa nikotinskom vakcinom iz ovog pronalaska je njeno svojstvo da se suprotstavi uzastopnim infuzijama nikotina. U odvojenim eksperimentima pasivne imunizacije kod pacova, višestruke doze nikotina nisu smanjile antitela prisutna ili značajno snizila njihov kapacitet da se vežu za sveže injektirani nikotin. Na slici 4, infuzijom je dato 50 mg anti[3'AMNic-Suc-rEPA) u vremenu 0, pa 24 h kasnije, je dato pet nikotinskih injekcija, 0,03 mg/kg nikotina je dato infuzijom tokom 10 s, a iz desne jugulame vene na svakih 20 min, tokom 80 min. Ukupno je dato pet injekcija nikotina. Peta injekcija nikotina je sadržala<3>H-nikotin. Sakupljeni su ukupna krv i mozak 1 min posle pete injekcije. Rezultati su pokazani niže, a grafički predstavljeni na slikama 4 i 5.

Ovi rezulati pokazuju da su čak i posle 5 doze nikotina antitela efikasna za povećanje sadržaja nikotina u serumu i smanjenje sadržaja nikotina u mozgu. Rezultati sa<3>H-nikotinom pokazuju da su antitela efikasna protiv nikotina injektovanog sa petom dozom.

Primer 13

Vrednovanje lokomotomih efekata nikotina

Ovaj eksperiment je smišljen da se odredi da li pasivna imunizacija može da spreči neposredno dejstvo nikotina posredovano CNS. U ovom eksperimentu korišćen je model pacova, koji je razvio Dr. David Malin, a opisan je u Malin et al. "Nicotine-specific IgG reduced distribution to brain and attenuates its behavioral and cardiovascular effect in rats", koji je prezentiran na Fifth Annual Meeting of the Society for Research on Nicotine and Tobacco, San Diego, CA, 5-7. marta 1999. Da bi se uspostavila osnovna linija za poređenje, meren je efekat potkožne injekcije 0,8 mg/kg nikotintartarata na nivo lokomotome aktivnosti pacova. Doza od 0,8 mg/kg nikotintartarata je najveća doza koja se može koristii bez indukovanja lokomotomih abnormalnosti.

Postoji porast nivoa aktivnosti posle injekcije nikotina kod pacova koji prethodno nisu tretirani sa anti-(3'AMNic-Suc-rEPA) i kod pacova koji se prethodno tretirani sa 50 mg normalnog zečjeg seruma IgG. Videti Sliku 6A, desni stub, i sliku 6B, levi stub. Ovaj efekat se suzbija prethodnim tretmanom životinja sa 50 mg anti-(3'AMNic-Suc-rEPA)-imunog IgG (Slika 6B, desni stub). Ovo pokazuje da anti-nikotinski antiserum eliminišein vivostimulatome efekte nikotina.

Primer 14

Vrednovanje dejstva nikotina na sistolni krvni pritisak

U ovom eksperimentu, meren je sledeći indikator efekta nikotina na ponašanje: pramena sistolnog krvnog pritiska. Pacovi su tretirani potkožnom injekcijom sa 0,1 mg/kg nikotintartarata. Kontrolni pacovi su pokazivali porast sistolnog krvnog pritiska od 56,8±4,3 mbar (ili 42,6±3,2 mm Hg), kada su tretirani nikotinom. Kada su pacovi prethodno tretirani sa anti-nikotinskim antiserumom IgG, izlaganje nikotinu je bilo manje efikasno. Kada su ordinirane povećane količine antiseruma, ovaj je smanjio svojstvo nikotina da podiže krvni pritisak. Kao što pokazuje slika 7, postoji negativan linearni trend krvnog pritiska u zavisnoti od doze IgG.

Claims (26)

1. Konjugat hapten-nosač sledeće formule: naznačen time, što su m 1 do 2500, n je Odo 12, <y>je 1 do 12, X se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S; Y se bira iz grupe koju čine NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO i S-S, i -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- ostatak je vezan u 3', 4' ili 5' položaju nikotina.

2. Konjugat prema Zahtevu 1, naznačen time, što je m 11 do 17, n je 1, y je 2, X je NH-CO, Y je CO-NH, i -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- je vezan u 3' položaju nikotina.

3. Konjugat prema Zahtevu 1, naznačen time, što je m 11 do 17, n je 1, y je 2, X je NH-CO, Y je CO-NH, i -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- je vezan u 4' položaju nikotina.

4. Konjugat prema Zahtevu 1, naznačen time, što je m 11 do 17, n je 1, z je 2, X je NH-CO, Y je CO-NH, i -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- je vezan u 5' položaju nikotina.

5. Konjugat prema bilo kome od Zahteva 1 do 4, naznačen time, što se m bira iz grupe koju čine 1 do 20 i 1 do 200.

6. Konjugat prema bilo kome od Zahteva 1 do 5, naznačen time, što je nosač-protein egzoprotein A.

7. Konjugat hapten-nosač sledeće formule: naznačen time, što je n 0 do 12, j je 1 do 1000, k je 1 do 20, i E je matrica koja sadrži aminokiselinu.

8. Konjugat prema Zahtevu 7, naznačen time, što je matrica poli-L-glutaminska kiselina.

9. Konjugat hapten-nosač prema bilo kome od Zahteva 1 do 8, naznačen time, što se pomenuti konjugat pravi korišćenjemtrans- 4'-karboksi-(-)-kotinina, kao polaznog materijala.

10. Antitelo, naznačeno time, što se stvara kao odgovor na konjugat hapten-nosač prema bilo kome od Zahteva 1 do 9.

11. Antitelo prema Zahtevu 10, naznačeno time, što je monoklonalno.

12. Antitelo prema Zahtevu 10, naznačeno time, što je poliklonalno.

13. Funkcionalni fragment, naznačen time, što je od antitela prema Zahtevu 10.

14. Komplet za određivanje prisustva nikotina u uzorku, naznačen time, što sadrži antitelo ili njegov funkcionalni fragment, prema bilo kome od Zahteva 10 do 13.

15. Postupak dobijanja antitela, naznačen time, što se sastoji od imunizacije sisara domaćina sa konjugatom hapten-nosača prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9.

16. Postupak prema patentnom zahtevu 15, naznačen time, što je antitelo monoklonalno.

17. Postupak prema patentnom zahtevu 15, naznačen time, što je antitelo poliklonalno.

18. Vakcina, naznačen time, što sadrži bar jedan konjugat hapten-nosača prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 9.

19. Vakcina prema zahtevu 18, naznačena time, što sadrži bar jedan adjuvant.

20. Vakcina prema zahtevu 19, naznačena time, što sadrži bar jedan ekscipijent.

21. Vakcina prema zahtevu 20, naznačena time, što sadrži bar jedno pomoćno sredstvo.

22. Konjugat hapten-nosač prema bilo kom od Zahteva 1 do 9 ili antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kom patentnom zahtevu od 10 do 13 za primenu kao lek.

23. Konjugat hapten-nosač prema bilo kome od Zahteva 1 do 9, ili antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kome od Zahteva 10 do 13 za primenu kao lek prema Zahtevu 22 za prevenciju ili lečenje zavisnosti od nikotina.

24. Konjugat hapten-nosač prema bilo kome od Zahteva 1 do 9, za primenu kao lek prema Zahtevima 22 i 23, gde taj lek dalje sadrži još i jedinjenje koje je korisno u lečenju zavisnosti od nikotina.

25. Upotreba konjugata hapten-nosač prema bilo kome od Zahteva 1 do 9, ili antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema bilo kome od Zahteva 10 do 13 za dobijanje leka za lečenje ili prevenciju zavisnosti od nikotina.

26. Upotreba konjugata hapten-nosač prema bilo kome od Zahteva 1 do 9 za dobijanje leka prema Zahtevu 25, pri čemu taj lek sadrži još i jedinjenje koje je korisno u lečenju zavisnosti od nikotina.