RS51129B - Kompozicije kontrolisanog otpuštanja za inteferon na osnovu pegt/pbt blokirajućim kopolimerima - Google Patents

Abstract

Postupak za dobijanje mikročestica koje sadrže jednu ili više aktivnih jedinjenja odabrani iz grupe interferona i jedan ili više biorazgradivih blokirajućih kopolimera sastavljeni od poli(etilen glikol) tereftalata (PEGT) i poli(butilen tereftalata) (PBT), obuhvata sledeće korake:(a) dobijanje emulzije koja sadrži(aa) vodenu unutrašnju fazu koja sadrži jednu ili više aktivnih jedinjenja, i(ab) organsku spoljašnju fazu koja sadrži jedan ili više biorazgradivih blokirajućih kopolimera i bar jedan organski rastvarao;(b) očvršćavanja jednog ili više biorazgradivih blokirajućih kopolimera unutar mikročestica uklanjanjem bar frakcije organskog rastvarača iz emulzije dobijene u koraku (a);(c) skupljanje i sušenje mikročestica dobijene u koraku (b) pri čemu je korak (b) izvođen emulgovanjem emulzije dobijene u koraku (a) u koherentnoj vodenoj fazi kako bi se dobila v/u/v dvostruka emulzija, u kojoj koherentna vodena faza sadrži osmotski agens, gde je osmolalit koherentne vodene faze veći nego u vodenoj unutrašnjoj fazi.Prijava sadrži još 4 zavisna patentna zahteva.

Description

Oblast tehnike

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na postupak dobijanja mikročestica koje se mogu koristiti za farmaceutske kompozicije za kontrlolisano otpuštanje aktivnih jedinjenja. Mikročestice su zasnovane na biorazgradivim polimerima i naročito su korisne za kontrolisanu predaju terapeutskih proteina ili peptida.

Stanje tehnike

[0002]Parenteralni dozni oblici sa slabim osobinama otpuštanja leka su razvijeni kako bi odgovorili potrebi poboljšanja terapeutske primene lekovitih supstanci koje se ne primenjuju oralno na osnovu njihovih fizikohemijskih osobina, a koje imaju relativno kratak poluvek zbog toga što moraju često biti ubrizgavane. Česta ubrizgavanja su neprijatna za pacijente, i ako ubrizgavanje treba da se vrši od strane lekara ili medicinske sestre, takođe su prilično skupa. Iskustvo neudobnosti i bola mogu rezultovati kod pacijenta kompikacije i ugroziti uspešnost terapije.

[0003]Broj lekovitih supstanci koje se ne mogu primenjivati pogodnim oralnim putem je trenutno u porastu, uglavnom kao posledica skorašnjih prednosti biotehnološkog istraživanja u oblasti farmacije, koje je dovelo do povećanja broja visoko snažnih peptidnih i proteinskih lekova. Možda sa izuzetkom nekih manjih peptida, međutim, ova jedinjenja su relativno nestabilna u gastrointestinalnom fluidu i, najvažnije, jako velika i ftidrofilna kao molekuli da budu absorbovani kroz crevne mukoze do značajnog mesta. Za neke od ovih supstanci, ubrizgavajuće ili usađene formulacije za kontrolisano otpuštanje se razvijaju u cilju da smanje učestalost doziranja i prema tome smanje neudobnost pacijenta, i postignu visok nivo usklađenosti i terapeutskog uspeha.

[0004]Parenteralno kontrolisano otpuštanje doznih oblika su uglavnom u obliku mikroskopskih, čvrstih pojedinačnih ili više jediničnih implanata (kao što su polimerne šipke i pločice), mikročestičnih suspenzija, i od skoro takođe gelova, uključujući in-situ formirajuće gelove Čvrsti implanti ispunjeni lekom su dostupni kao ne-razgrađujući polimerni, keramički ili metalni uređaji koje je potrebno hirurški ukloniti posle naznačenog preioda dejstva leka, ili kao biorazgradivi polimerni oblici koji ne zahtevaju uklanjanje. Primer ne-razgradivog implanta je Bayer-ov Viadur®, koji otpušta peptidni lek, leuprolid, u periodu od godinu dana Primer biorazgradivog implanta je AstraZeneca-ov Zoladex®, koji predstavlja polimerni štap koji je sposoban da otpušta peptidni lek, goserelin, u periodu od jednog do tri meseca.

[0005]Odmah posle upoznavanja tržišta sa prvim biorazgradivim implantima, mikročestice sa kontrolisanim otpuštanjem su postale dostupne, kao što su Takeda-ove Lupron® Depot formulacije, koje otpuštaju leuprolid u periodu od jednog, tri, i četiri meseca. U cilju da se takve mikročestice ubrizgaju, one moraju biti suspendovane u vodenom nosaču. Iz razloga stabilnosti, međutim, baza mikročestica se ne može uobičajeno skladištiti kao vodena suspenzija, već moraju biti rekonstruisane u vidu suvog praha.

[0006]Razni oblici mikročestica koje su napunjene lekom i postupci njihovog dobijanja su opisani od strane E. Mathiovvitz et a!., Microencapsulation, u: Encvclopedia of Controlled Drug Deliverv (ed. E. Mathiovvitz), Vol. 2, p. 493-546, John Wiley & Sons

(1999).

[0007]Kako bi omogućili ubrizgavanje leka putem sistema prenosa kroz naročito finu iglu kako bi obezbedtli povećanje udobnosti pacijenta, naučnici koji se bave prenosom leka su skoro počeli da razvijaju ubrizgavajuće gelove koji su u mogućnosti da formiraju podkožnu ili intramuskularnu bazu. U jednom od koncepata, dizajnirane su formulacije gela koje poseduju visoko smicanje sa smanjenom viskoznošću i koje su tiksotropne. Primenom poprečne sile na primenu, viskoznost ovih gelova je znatno smanjena, dozvoljavajući ubrizgavanje sa relativno malom iglom, gde se otpornost gela posle primene popravlja. Prema drugom konceptu, formulisane su tečne kompozicije koje, posle primene, formiraju gelove kao odgovor na promene njihove sredine, kao što je pH, temperaturea, jačina jona. Prema trećem pristupu, fromulacije tečnog polimera koje sadrže ne-vodeni rastvarač su ubrizgane. Nakon primene, rastvarač se širi od mesta ubrizgavanja, što dovodi do taloženja polimernih čestica ili do formiranja gela.

[0008]Biorazgradivi ubrizgavajući gelovi su diskutovani u više detalja od strane A. Hatefi et al., Journal of Controlled Release 80 (2002), 9-28.

[0009]VVO 03/041689 otkriva biokompatibilne polimerne smeše koje sadrže hidrofobni polimer i amfipatični polimer i njihovu primenu kao polimerne nosače u kontinuiranim otpuštajućim kompozicijama. Primer pogodnog amfipatičnog polimera je kopolimer polietilen glikola (PEG) i polibutilen tereftalata (PBT). Primer 2 reference ilustruje mikročestice poli (laktid-ko-glikolida) i razne PEG/PBT kopolimere koja su napunjena sa interferon-a

[0010] EP 0 830 859 se odnosi na klase kopolimera polieterestra kao matrica za isporuku leka. Dokument navodi mnoge moguće aktivne sastojke za inkorporaciju u kompoziciju za kontrolisano otpuštanje sa ovim kopolimerima, uključujući interferone.

[0011] Terapeutska korisnost nekoliko polimernih nosača za kontolisano otpuštanje, naročito onih polimera i kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline, je prikazana za nekoliko aktivnih jedinjenja, kao što su leuprolid, goserelin, buserelin, i triptorelin, koji predstavljaju peptide sa veoma velikim terapeutskim indeksom, odn. imaju veoma nisku toksičnost čak i na nivou daleko iznad terapeutski efikasnih koncentracija. Suprotno, manje tolerantna aktivna jedinjenja kao što su eritropoietini i interferoni, čija tačno kontrolisana isporuka je neophodna za postizanje terapeutskih efekata bez nepodnošljivih sporednih efekata, nisu uspešno razvijena kao dozni oblici za kontrolisano otpuštanje. Glavna teškoća je ta da biorazgradivi polimerni nosači koji su korišćeni kod ranije uspešnih proizvoda izgleda da nisu pogodni za obezbeđivanje profila otpuštanja nultog-reda ili blizu nultog-reda. Umesto toga, oni tokom primene proizvode visoko neželjena početna eksplozivna otpuštanja. Dalje, autokatalitička degradacija polimera i kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline može takođe da dovede do doznog efekta odlaganja pri kasnijoj fazi otpuštanja leka. Sa druge strane, drugi novi polimeri o kojima se diskutovalo kao poboljšani nosači za kontrolisano otpuštanje za terapeutska jedinjenja nemaju sigurnosni zapis poli (laktida) i poli (glikolida).

[0012] Prema tome, postoji potreba za polimerni prenosni sistem za koji je dokazana biokompatibilnost, ali koji je takođe sposoban za bolje kontrolisano otpuštanje relativno toksičnih terapeutskih jedinjenja nego što su prethodno korišćeni nosači.

[0013] Stoga predmet pronalaska je da se obezbedi postupak dobijanja kompozicija sa kontrolisanim otpuštanjem koje sadrže jedan ili više polimernih nosača koji imaju odličnu biokompatibilnost i relativno toksično jedinjenje koje se neče davati oralnim putem, kao što je protein.

[0014] Drugi predmet pronalaska jeste da se obezbede mikročestice koje sadrže aktivno jedinjenje koje se otpušta u kontrolisanom odnosu. Ostali predmeti će postati očigledni na osnovu sledećeg opisa i patentnih zahteva.

Kratak opis pronalaska

[0015]Pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja mikročestica za farmaceutsku kompoziciju za kontrolisano otpuštanje interferona. Tačnije, kompozicija koja je obezbeđena pronalaskom sadrži biorazgradivi polimer i aktivno jedinjenje koje je odabrano iz grupe interferona. Biorazgradivi polimer je blokirajući kopolimer koji je sačinjen od poli (etilen glikol)-tereftalatea (PEGT) i poli (butilen tereftalata) (PBT). Poželjno aktivno jedinjenje je interferon odabran iz familije alfa-interferona. Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.

Kratak opis slika

[0017]Slika 1 prikazuje otpuštanje interferona iz kopolimernih mikročestica in vitro i to kod hrčaka.

Slika 2 prikazuje otpuštanje interferona iz kopolimernih mikročestica in vitro i to kod majmuna.

Detaljan opis pronalaska

[0018]U otkrivenom postupku koji vodi predmetni pronalazak, pronađeno je da mnogi polimeri koji su predloženi kao agensi za kontrolisano otpuštanje aktivnih jedinjenja, kao što su polimeri mlečne i/ili glikolne kiseline ili, nisu posebno pogodni za prenos relativno toksičnih aktivnih jedinjenja kao što su interferoni. Naročito, postupak otpuštanja izgleda da je slabo kontrolisan, pogotovo kada su polimeri formirani u vidu mikročestica ili gelova. Na primer, izgleda da je teško izbeći takozvano eksplozivno otpuštanje, odn. brzo otpuštanje značajne frakcije objedinjenog jedinjenja odmah posle primene, kada se koristi uobičajeni polimerni nosači. U zavisnosti od terapeutskog indeksa aktivnog jedinjenja, takvo eksplozivno otpuštanje može izazvati skoro toksični efekat kod pacijenata.

[0019]U suprotnom, iznenađujuće je pronađeno da su blokirajući kopolimeri PEGT i PBT sposobni sjedinjavanju i otpuštanju interferona (gore navedena jedinjenja) na mnogo bolji kontrolisani način, sa malim ili značajnim odsustvom eksplozivnog efekta, kao što će dalje biti diskutovano u ovom opisu.

[0020]Stoga, otkrivena je famaceutska kopozicija za kontrolisano otpuštanje koja sadrži biorazgradivi polimer i aktivno jedinjenje odabrano iz grupe interferona, gde biorazgradivi polimer je blokirajući kopolimer konstruisan od poli (etilen glikol)-tereftalata (PEGT) i poli (butilen tereftalata) (PBT).

[0021] Pronađeno je pronalaskom da blokirajući polimeri koji su opisani gore mogu formirati iznenađujući pogodni matriks za inkorporaciju interferona za primenu kontrolisanog otpuštanja. Naročito, mogu spajati velike količine interferona bez gubitka bioaktivnosti.

[0022] Drugi razlog zašto su specifični kopolimeri posebno pogodni je taj što su u mogućnosti da kontrolišu otpuštanje inkorporiranih interferona tokom šireg opsega profila otpuštanja koji se može smatrati poželjnim, u zavisnosti od tačne terapeutske primene. Polimerni nosač može biti razvijen u razne dozne oblike, kao što su mikročestice, filmovi, gelovi, i čvrsti implanti, i mogu uključivati opseg molekulske težine i stepen hidrofilnosti koji može - zajedno sa geometrijom doznog oblika ili njegove jedinice - postići razna trajanja otpuštanja interferona, i razne tipove profila otpuštanja.

[0023] Farmaceutska kompozicija je definisana kao kompozicija koja se uobičajeno koristi za terapeutske ili diagnostičke namene, ili za zdravlje ili prevenciju obolenja. Dok su mnoge farmaceutske kompozicije konstruisane tako da odmah otpuštaju spojena aktivna jedinjenja, postoje takođe i kompozicije koje poseduju karakteristike kontrolisanog otpuštanja u cilju da se obezbedi produženo trajanje efikasnosti. Nekoliko pojmova je korišćeno kako bi se opisali razni tipovi karakteristika kontrolisanog otpuštanja. Kao što je ovde korišćeno, kontrolisano otpuštanje se odnosi na bilo koje modifikovano otpuštanje aktivnog jedinjenja kao što je odloženo otpuštanje, produženo otpuštanje, konstantno ili nulti-redosled otpuštanja, prošireno otpuštanje, sudržano otpuštanje, lagano otpuštanje, bifazno otpuštanje itd.

[0024] Kompozicija sadrži biorazgradiv polimer. Prema IUPAC terminologiji, polimer je definisan kao supstanca koja je sastavljena od makromolekula. Suprotno, makromolekul je molekul visoke relativne molekulske mase, strukture koja u osnovi obuhvata višestruko ponavljanje broja ustanovljenih jedinica. Uobičajenim jezikom, međutim, razlika između polimera i makromolekula koji ih sadrže nije uvek napravljena. Ovo je takođe tačno i za predmetni opis, koji se može pripisati dalje polimeru koji bi trebao - striktno govoreći - biti pripojen makromolekulima.

[0025]Biorazgradivost se može definisati kao sposobnost supstance da bude hemijski razgradiva pri fiziološkim uslovima, u fiziološkoj okolini, putem enzimske aktivnosti. U kontekstu pronalaska, poželjno je da je biorazgradivi polimer razgradiv u fiziološkoj okolini - kao što su fiziološki fluidi na telesnoj temperaturi - čak i u odsustvu enzima u cilju da značajna razgradivost se dešava u okviru sata, dana, nedelja, meseci, ili godina. Degradacija može obuhvatati razne hemijske mehanizme uključujući hidrolizu ili oksidaciju. Radi izbegavanja nesporazuma, biorazgradivost ne znači da se biorazgradivi polimer mora razgraditi u respektivnim monomernim jedinicama. Dovoljno je da proces razgradnje vodi do rastvorljivih vrsta molekula koja se mogu eliminisati iz organizma postupcima kao što je renalno ili jetreno izlučivanje. U predmetnom pronalasku, polimer tipično služi kao nosač za aktivno jedinjenje i kao agens za kontrolisano otpuštanje.

[0026]Dalje, biorazgradivi polimer je odabran iz grupe blokirajućih kopolimera sastavljeni od poli (etilen glikol) tereftalata (PEGT) i poli (butilen tereftalata) (PBT). Kopolimer je definisan kao polimer dobijen iz više od jedne vrste monomera. U blokirajućem kopolimeru (ili blokirajućen polimeru), sastavni deo makromolekula ima granične blokere koji su sastavno različiti, odn. granične blokere koji sadrže sastavne jedinice izvedene iz različitih vrsta monomera ali sa različitom kompozicijom ili sekvencom distribucije sastavnih jedinica. Blok se može definisati kao deo makromolekula koji sadrži veći broj sastavnih jedinica koje imaju bar jedno svojstvo koja nije prisutno u graničnim delovima.

[0027]Broj blokirajućih kopolimera koji sadrže PEGT i PBT je opisan u stanju tehnike, na primer od strane J. M. Bezemer et al. (J. Control Release 1999, 62 (3), 393-405; J. Biomed. Mater. Res. 2000, 52 (1), 8-17; J. Control Release 2000, 66 (2-3), 307-320; J. Control Release 2000, 67 (2-3), 249-260; J. Control Release 2000, 67 (2-3), 233-248; J. Control Release 2000, 64 (1-3), 179-192), R. Dijkhuizen-Radersma et al.

(Biomaterials 2002, 23 (24), 4719-4729; J. Biomed. Mater. Res. 2004, 71A (1), 118; Biomaterials 2002, 23 (6), 1527-1536; Pharm. Res. 2004, 21 (3), 484-491; Int. J. Pharm, 2002, 248 (1-2), 229-237; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2002, 54 (1), 89-93), i J. Sohier et al. (J. Control Release 2003, 87 (1-3), 57-68; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003, 55 (2), 221-228), i u WO 93/21858, EP 0 830 859 A2, i EP 1 090 928 A1.

[0028]Ovi kopolimeri se mogu shvatiti kao da su sastavljeni od ponavljajućih blokirajućih hidrofilnih poli (etil glikola) (PEG) i hidrofobnog poli (butilen tereftalata)

(PBT). Ovi poli (etar estri) su uobičajeno dobijeni polikondenzacijom PEG, butandiola i

dimetil terftalata. Alternativno, mogu se shvatiti kao da su sastavljeni od ponavljajućih blokirajućih poli (etilen glikol) tereftalata (PEGT) i PBT. Ovi kopolimeri uobičajeno imaju osobine termoplasitčnih elastomera. U vodenoj sredini, formiraju hidrogelove ili hidrogel polimerne mreže, u kojima lanac polimera nije hemijski već fizički vezan. Veruje se da je vezivanje proizvedeno udruživanjem "čvrstih" PBT segmenata u kristalne domene, gde amorfna regija obuhvata "meke" PEG segmente a neki PBT su odgovorni za efekat bubrenja u vodi. Suprotno hemijskom vezivanju, ovo fizičko vezivanje je suprotno na povišenim temperaturama ili u odgovarajućim rastvaračima.

[0029]Prema pronalasku, aktivno jedinjenje je odabrano iz grupe interferona. Interferoni predstavljaju familiju priprodnih proteina koji su izvedeni iz ljudskih ćelija i uključeni u razne funkcionalnosti imunog sistema, kao što je borba protiv virusne infekcije. Nekoliko interferona je razvijeno u farmaceutskim proizvodima i danas su dostupni kao proizvodi generičnog inženjeringa za primenu u lečenju leukemije, hepatitisa, multiple skleroze, i nekih drugih obolenja.

[0030]U poređenju sa nekoliko drugih aktivnih peptida i proteina koja su uspešno razvijena u formulacijama za kontrolisano otpuštanje, interferoni imaju relativno mali terapeutski indeks. Drugim recima, pokazuju znatan toksični nivo iznad terapeutske efikasne koncentracije. Stoga, njihov tačni prenos je neophodan za postizanje terapeutskih efekata bez nepodnošljivih sporednih efekata.

[0031]Jedna od glavnih klasa interferona je ona koju čine alfa-interferoni (IFN-alfa ili IFN-alpha). Alfa-interferoni sadrže nekoliko urođenih i modifikovanih proteina sa sličnim molekulskim težinama i funkcionalnostima (vidi D. J. A. Crommelin et al., Pharmaceutical Biotechnologv, Harvvood Academic Publishers (1997), 219-222). Leukociti čine glavno poreklo ovih proteina kod ljudi. Bar 23 različita urođena podtipa i nekoliko modifikovanih verzija IFN-alfa su poznati, od kojih su neka dostupna u farmaceutskim proizvodima. Na primer, smeša nekoliko urođenih IFN-alfa podtipova izvedenih iz udruženih inficiranih ljudskih leukocita su komercijalno dostupna. Trenutno najvažniji članovi IFN-alfa grupe su rekombinovane verijante IFN-alfa-2a i IFN-alfa-2b. Druga rekombinovana IFN-alfa grupa koja je korišćena u lečenju je IFN-alfacon-1.

[0032]Osnovna funkcija ovih interferona jeste da nadograde imuni sistem, kao što je stimulacija imunologičnih ćelija koje su sposobne da prepoznaju i direktno ili indirektno unište ćelije raka ili virusa. Između terapeutskih indikacija za alfa-interferone su (hronični) hepatitis B, (hronični) hepatitis C, leukemija ćelije dlake, (hronična) mielogenouzna leukemija, multipla mieloma, folikularna limfoma, karcinoidni tumor, maligni metanom, genitalne bradavice, karcinom bešike, cervikalni karcinom, karcinom renalne ćelije, laringeal papilomatozis, mikozis fungeoidez, kondiloma akuminata, SARS, i (AIDS-povezan) Kaposi sarkom. Ustvari, trenutno je nejpoželjnije prema pronalasku da je aktivno jedinjenje odabrano iz grupe alfa-interferona.

[0033]Urođeni članovi alfa-interferona imaju molekulsku masu između 19-26 kDa i sastoje se od proteina sa dužinom od 156-166 i 172 amino kiseline. Svi IFN-alfa podtipovi poseduju uobičajene očuvane sekvencione regije između amino kiselinskih pozicija 115-151 dok su krajevi amino-terminala varijabilni. Mnogi IFNalfa podtipovi se razlikuju u njihovoj sekvenci na samo jednoj ili dve pozicije. Prirodne varijante koje nastaju takođe uključuju proteine skraćene sa 10 amino kiselina na karboksi-terminal kraju.

[0034]Još jedna glavna klasa interferona je ona koju čine beta-interferoni (IFN-beta), trenutno najvažniji predstavnici u lečenju su IFN-beta la i lFNbeta-1b. Ovi interferoni su korišćeni npr. u upravljanju izvesnih formi multiplaskleroze, prvenstveno replasing fori multipla skleroze, kako bi usporili akumulaciju fizičke neosposobljenosti i smanjili učestalost kliničke eksacerbacije. Pacijenti sa multipla sklerozom kod kojih je efikasnot demonstrirana uključuju pacijente koji su iskusili kliničku epizodu i imaju MRI osobine u skladu sa multiplasklerozom,

[0035]Još jedna terapeutski korišćena klasa interferona je ona koju čine gama interferoni (IFN-gama). Ovi interferoni imaju antivirusne, antiproliferativne i imunomodularne aktivnosti. Jedan član gama-interferona, IFN-gama-1b, je trenutno označen za upravljanje raznih infekcija koje su udružene sa hroničnim granulomatoznim obolenjima.

[0036]Skoro, nekoliko dodatnih klasa interferona je otkriveno i opisano, uključujući IFN-epsilon, IFN-kapa i IFN-lambda (vidi P. Kontsek et al., Acta Virol. 2003; 47(4):201-15).

[0037]Naročito, kompozicija gde je interferon odabran iz grupe alfa-interferona, prvenstveno iz grupe koja se sastoji od IFN-alfa, IFN-alfa-2a, IFN-alfa-2b, IFN-alfacon-1, pegilovane IFN-alfa-2a, pegilovane IFN-alfa-2b, skraćene IFN-alfa-2a, skraćene IFN-alfa-2b, fuzije proteina IFN-alfa i albumina i njihovih finkcionalnih derivata daje veoma dobre osobine U ovom slučaju, alfa-interferon može takođe predstavljati smešu raznih alfa-interferon varijanti, kao što je smeša urođenih alfa-interferona koju je teško ili nepotrebno odvojiti i prečistiti. Interferon se može ekstrakovati iz živih organizama ili izolovanih ćelija ili ćelijskih kultura. Ćelije i/ili organizmi iz kojih je interferon dobijen se mogu modifikovati, kao što je infekcijom, u cilju da se proizvede željeni interferon.

[0038] Kompozicija gde interferon predstavlja rekombinovani interferon proizveden iz genetički inženjerskih ćelija ili organizama, u kojima su ćelije ili organizmi prvenstveno odabrani iz sisara, insekata, bakterija, kvasaca, gljivica i viših biljnih ćelija ili organizama, daje naročito dobre osobine.

[0039] Jedan od naročito pogodnih interferona za izvođenje pronalaska je skraćena verzija IFN-alfa-2b ili, opciono, smeša više od jedne skraćene verzije IFN-alfa-2b. Na primer, molekuli koji sadrže IFN-alfa-2b sekvence amino kiselina u kojima bar 5 do 10 N-krajnjih amino kiselina je uklonjeno se mogu dobiti trenutno dostupnim postupcima genetičkog inžinjeringa. U daljem rešenju, poželjne su varijante IFN-alfa-2b koje su skraćene sa 7 ili 8 N-krajnjih amino kiselina.

[0040] Poželjno je da predmetno otkrivena kopozicija poseduje otpuštanje aktivnog jedinjenja u periodu od bar 7 dana. Prvenstveno, interferon je otpušten u periodu od bar 10 dana, ili bar 14 dana. U daljem rešenju, otpuštanje se odvija u periodu od 3 nedelje, 4 nedelje, 6 nedelja, i 2 meseca. Trenutno mnogo poželjnije je otpuštanje u periodu od 10 dana do 1 meseca. Koju klasu polimera bi trebalo odabrati i koje dalje precizne osobine su poželjne za postizanje takvog otpuštajućeg trajanja zavisi bar delimično od odabranog oblika dizajna i opisana je u više detalja dole.

[0041] Takođe je otkrivena i farmaceutska kompozicija za kontrolisano otpuštanje koja sadrži biorazgradivi polimer i jednu ili više aktivnih jedinjenja odabranih iz grupe interferona, u kojoj je bar 80 mas.% aktivnog jedinjenja, na osnovu ukupne težine aktivnog jedinjenja, otpušteno u monomerni, ne-agregatni oblik. Prema ovom rešenju, biorazgradivi polimer je blokirajući kopolimer kao što je ovde definisano, konstruisan iz poli (etilen glikol) tereftalata (PEGT) i poli (butilen tereftalata) (PBT). Pronalaskom je pronađeno da blokirajući polimeri koji su ovde opisani mogu formirati iznenađujuće pogodan matriks za uključivanje interferona za primenu kontrolisanog otpuštanja. Naročito, mogu uključivati velike količine interferona bez gubitka bioaktivnosti, i izgleda da čuvaju monomerno, ne-agregaciono stanje uključenih interferona. Ovo je iznenađujuće pošto se za interferone zna da su osetljivi na razne polimere i uslove postupka, a naročito naklonjene agregaciji koja je često povezana sa deaktivaciom. Suprotno, primenom blokirajućih polimera koji su ovde naznačeni kao nosači za interferone, moguće je postići da većina uključenih interferona je otpuštena u monomernom obliku.

[0042]Prvenstveno, polimema klasa i uslovi postupka bi trebali da budu odabrani tako da osiguraju da bar oko 80 % uključenog aktivnog sastojka, odn. interferon, je otpušten u monomernom, ne-agregatnom obliku. Čak, bar oko 90 % interferona je otpušteno kao monomeri, ili prema daljim rešenjima, bar oko 95 %, 97%, i 98%. Ovi procenti su po težini, zasnovani na ukupnoj težini uključenog aktivnog sastojka.

[0043]Dalje poželjni oblici kompozicija su opisani dole.

[0044]Jedinična dozna kompozicija, koja čini količinu kompozicije koja se primenjuje na vreme, prvenstveno obuhvata količinu aktivnog jedinjenja koja je ekvivalentna 1 milionu internacionalnih jedinica (MIU) odgovarajućeg interferona. Tačna količina koja je uključena zavisi, naravno, od profila otpuštanja kompozicije i od dnevne ili nedeljne doze koji određeni pacijent treba da primi.

[0045]U jednom od rešenja, kompozicija je prilagođena da otpušta bar oko 5 MIU interferona tokom 14 dana, odn. tokom prvih 14 dana posle primene. U drugom rešenju, obuhvata dozu od oko 10 do oko 150 MIU, čija doza se otpušta tokom perioda od oko 10 dana do oko 1 meseca, naročito tokom perioda od oko 14 dana. Takođe poželjna je kompozicija koja sadrži i otpušta, tokom istog vremenskog perioda, dozu od oko 20 do oko 100 MIU. Takve kompozicije su naročito poželjne ako je aktivni sastojak alfa-interferon, kao stoje IFN-alfa-2b ili njegov derivat.

[0046]Izračunato za prosečan dan u periodu otpuštanja interferona posle primene, kompozicija je poželjno prilagođena da otpušta količinu od oko 0.5 do 20 MIU određenog interferona, ili od oko 1 do 10 MIU. U zavisnosti od oblika otpuštajućeg profila, moguće je da je količina aktivnog sastojka koja se otpušta u okviru prvog dana posle primene veča od 10 ili 20 MIU, ali prosečno dnevno otpuštanje može još uvek biti u poželjnom opsegu.

[0047]Trenutno otkrivena kompozicija može biti oblikovana, formulisana i prerađena tako da bude pogodna za razne terapeutske primene i načine primene, kao što je topična, oralna, rektalna, vaginalna, ili oftalmična primena; prvenstveno, međutim, je prilagođena za parenteralnu primenu. Kao što je ovde korišćeno, parenteralna primena uključuje bilo koji invanzivni način primene, kao što je subdermalno, intradermalno, subkutaneozno, intramuskularno, lokoregionalno, intratumoralno, intraperitonealno, interstinalno, intralesiono, sa nekim manjim prednostima u kontekstu ovog pronalaska takođe intravenozno, intraarterijalno itd. Najpoželjniji načini primene kompozicije su subkutaneozno i intramuskularno ubrizgavanje ili implantacija.

[0048]Pogodna za parenteralnu primenu prvenstveno znači da je kompozicija prvenstveno sterilna i usaglašena sa potrebama trenutne farmakopeje u pogledu na sadržaj endotoksina, osmolalita, itd. Ekscipijenti su prvenstveno odabrani da budu sigurno podnošljivi za parenteralnu primenu. U daljem aspektu, kompozicija je formulisana tako da bude relativno izotonična (ili izoomotična), kao što je u opsegu od oko 150 do 500 mOsmol/kg, a prvenstveno u opsegu od oko 250 do 400 mOsmol/kg. Dalje, pH bi trebala da bude približno u fiziološkom opsegu u cilju da se izbegne bol i lokalna nepodnošljivost nakon ubrizgavanja. Prvenstveno, pH kompozicije je u opsegu od oko 4 do 8.5, a pogotovo u opsegu od oko 5.0 do 7.5.

[0049]Kompozicija je oblikovana i formulisana tako da obuhvata mikročestice koje zauzvrat sadrže biorazgradivi blokirajući kopolimer i aktivno jedinjenje, ili bar značajnu frakciju aktivnog jedinjenja koja je prisutna u kompoziciji. U tom slučaju, dozni oblik kompozicije koja se primenjuje je tipično ubrizgavajuća suspenzija koja sadrži mikročestični tečni koherentni nosač.

[0050]U kontekstu pronalaska, mikročestice treba razumeti kao čvrste ili polu čvrste čestice koje imaju prečnik u opsegu od oko 0.1 do oko 500 Pm, bez obzira na njihov oblik ili unutrašnju strukturu. Na primer, mikročestice takođe predstavljaju mikrosfere i mikrokapsule. U još poželjnijem rešenju, mikročestice imaju prečnik od oko 1 do oko 300 Pm. Osim toga, pronađeno je da su željene otpištajuće osobine najbolje postignute za interferone koje su umetnute u mikročestice na osnovu PEGT/PBT blokirajućih kopolimera koje imaju prosečni prečnik od 25 do oko 200 Pm, kao što je izmereno sa foton koleracijskim spektroskopom. Odabirući takvu veličinu čestice takođe će osigurati da je suspenzija ovih mikročestica dobro ubrizgana i da se može lako i konvencionalno primenjivati putem intramuskularnog ili subkutaneoznog ubrizgavanja.

[0051]U okviru ovog opsega veličine, prečnik se dalje može optimizovati za tačan proizvod primene ili prilagoditi određene interferone. Na primer, u slučaju - opcionog skraćivanja - trenutno je najbolje da se odaberu interferon-alfa-2a i interferon-alfa-2b sa prosečnim prečnikom mikročestice od oko 30 do oko 175 Pm. U daljem poželjnom rešenju, prosečni prečnik je u opsegu od oko 50 do oko 150 Pm.

[0052]Prvenstveno, mikročestice treba da imaju relativno nisku poroznost. Naročito, je pronađeno da željeni otpuštajući profil za primenu kontrolisanog otpuštanja alfainterferona se može najbolje postići kada je prisustvo velikih pora opsežno izbegnuto. U ovom kontekstu, velike pore se mogu definisati kao pore koje imaju prečnik od oko 5 Pm ili više. Prema tome, u jednom od poželjnih rešenja većina mikročestica je značajno slobodna od pora koje imaju prečnik od oko 5 Pm ili više. U drugom rešenju, većina mikročestica je značajno slobodna od pora koje imaju prečnik od oko 2 Pm ili više

[0053]Opciono, mikročestice mogu biti obložene sa slojem polimera koji ne sadrži lek. Takvo rešenje može biti kroisno za sprečavanje početnog eksplozivnog otpuštanja ikorporiranog aktivnog jedinjenja, ili čak postići predodređeno zaostalo vreme dok ne počne otpuštanje, ako se tako želi.

[0054]Mikročestice su zasnovane na blokirajućem kopolimeru PEGT i PBT, koji se koristi kao nosač i agens za kontrolisano otpuštanje. Pronađeno je, međutim, da svi kopolimeri PEGT i PBT nisu isto korisni za pravljenje mikročestica za kontrolisano otpuštanje svih interferona. Dalje, naznačeno vreme otpuštanja ili trajanje efekta je značajno za selekciju blokirajućeg kopolimera. U slučaju alfa-interferona, pronađeno je da bi kopolimeri trebali da sadrže od oko 50 do ok 95 mas.% PEGT, i prema tome od oko 5 do oko 50 mas.% PBT. U drugom rešenju, kopolimeri sadrže od oko 70 do oko 95 mas.% PEGT. Prema prinosu daljeg poželjnog rešenja, kopolimer sadrži od oko 70 do oko 85 mas.% PEGT.

[0055]Dalja naznaka hemijske kompozicije kopolimera koja predstavlja veoma značajan parameta je molekulska težina PEG segmenata PEGT komponente. Pronađeno je da su alfa-interferoni veoma lako inkorporirani u kopolimer mikročestica čiji profil otpuštanja može biti podešen unutar korisnog opsega kada je prosečna molekulska težina PEG od oko 600 do oko 3,000. Čak naročito poželjno, prosečna molekulska težina PEG je od oko 1,000 do oko 2,000.

[0056]Odabir prosečne molekulske težine PEG može takođe uzeti i prosečnu veličinu čestice u razmatranje. Ako je, na primer, odabrana relativno mala veličina čestice, npr. iz razloga prerade, kao što je 100 Pm, ili čak ispod 75 Pm, prvenstveno se odabire blokirajući polimer sa relativno niskim stepenom hidrofilnosti, odn. koji ima relativno nisku prosečnu molekulsku težinu PEG, kao što je oko 1,500 ili manje, ili oko 1,000 ili manje, naročito ako je poželjno da period otpuštanja iznosi dve nedelje ili više. Alternativno, ili dodatno, niži stepen hidrofilnosti može se takođe postići odabirom relativno niskog sadržaja PEGT segmenta, kao što je ne više od 75 mas.%.

[0057] Suprotno, možda postoji razlog da se odabere relativno velika prosečna veličina čestica, kao što je iznad 100 Pm, npr. zasnovano na razmatranju postupka ili da se postigne željeno in vivo ponašanje. U tom slučaju, trenutno je poželjno da se odabere prosečna molekulska težina PEG od oko 1,000 do oko 3,000, ili bar oko 1,500, i/ili relativno visok sadržaj PEGT, kao što je bar oko 75 mas.%.

[0058] Dalje, može biti korisno da se kombinuju dve ili više različitih PEGT/PBT blokirajućih kopolimera za dobijanje mikročestica koje imaju optimalnu karakteristiku otpuštanja. Dva ili više blokirajućih kopolimera mogu se razlikovati, na primer, u njihovom relativnom PEGT sadržaju, ili se mogu razlikovati u prosečnoj molekulskoj težini PEG, ili se mogu razlikovati na osnovu oba parametra. Na primer, korisne polimerne mešavine za pravljenje mikročestica sa alfa-interferonima kao aktivnim agensima mogu sadržati dva polimera koja imaju sadržaj PEGT oko 80 mas.% ali sa prosečnom molekulskom težinom PEG od oko 1,000 i oko 2,000. Druga korisna mešavina sadrži dva polimera koji imaju sadržaj PEGT oko 80 mas.% i prosečnu molekulsku težinu PEG od oko 1,000 i oko 1,500. Dva ili više različitih polimera mogu se mešati u raznim odnosima kao što su 50 : 50, 75 : 35, or 75 : 25.

[0059] Pronađeno je da trenutno otkrivene kompozicije su pogodne za inkorporiranje alfa-interferona i postizanje vremena otpuštanja od oko 1 do oko 8 nedelja. Na primer, odabiranjem odgovarajućeg blokirajućeg kopolimera, otpuštajući profil može biti podešen tako da obezbedi efekat leka tokom perioda od oko 10 dana ili 2 nedelje do oko 4 nedelje, što je trenutno najpoželjnije vreme otpuštanja. Vreme otpuštanja, ili vreme trajanja otpuštanja, treba shvatiti kao vreme za koje se bar oko 80 mas.%, a naročito oko 90 ili 95 mas.% inkorporiranog aktivnog jedinjenja otpušta. Otpuštajući profil ne pokazuje nikakve istaknute eksplozivne efekte, odn. početno otpuštanje (unutar 4 sata) nije veće od oko 10 % inkorporirane doze, a naročito nije veće od oko 7 % inkorporirane doze.

[0060] Primenom blokirajućih kopolimera kao što je ovde opisano, moguće je napraviti inkorporisanu terapeutski efikasnu količinu interferona. Na primer, pronađeno je da polimeri odabrani prema poželjnom rešenju mogu inorporirati alfa-interferon pri sadržaju od oko 0.1 do oko 20 mas.% u odnosu na ukupnu težinu mikročestice. Naročito, sadržaj interferona u mikročestici je od oko 0.2 do oko 10 mas.%, ili od 0.5 do oko 5 mas.%. Unutar tog opsega, interferon je kompatibilan sa polimernim matriksom, sa malom tendenciom ili sa nedostatkom tedencije za agregaciju. U isto vreme, koncentracija aktivne supstance je dovoljno visoka da dozvoli za uobičajenu primenu relativno malu zapreminu suspenzije mikročestica koja se namerava ubrizgati.

[0061]Tipično, doza alfa-interferona po ubrizgavanju će biti u opsegu od oko 3 do 2,400 milliona internacionalnih jedinica (MIU), u zavisnosti od faktora kao što je stanje pacijenta, tipa i težine obolenja, i naročito od trajanja otpuštanja iz mikorčesice. Ukoliko su mikročestice oblikovane tako da otpuštaju interferon u perodu od oko 2 ili 4 nedelje, doza će normalno biti u opsegu od oko 10 do oko 150 MIU. Ustvari, u jednom od željenih rešenja, kompozicija pronalska sadrži interferon- alfa-2a, interferon-alfa-2b, ili njihov fragmen, na jačini od oko 10 do oko 150 MIU po zapremini koja se ubrizgava. Prema daljim pogodnostima, kompozicija ima jačinu u opsegu od oko 20 do oko 100 MIU po ubrizgavanju.

[0062]Radi pacijentovog komfora, zapremina injekcije nebi trebala da bude velika, ne više od 3 mL u pogledu poželjnog načina primene, koja predstavlja intramuskularno ili sunkutenozno ubrizgavanje. U slučaju subkutanozne primene, poželjnije je da zapremina injekcije nije veća od oko 2 mL. Sa druge strane, veoma je teško da se tačno dozira visoko koncentrovano ubrizgavanje u veoma malim zapreminama, zbog čega je poželjno da zapremina po ubrizgavanju bude bar oko 0.1 mL, a naročito bar oko 0.3 mL. Trenutno najpoželjniji opseg je od oko 0.5 do oko 2 mL.

[0063]Ipak intramuskularno ili subkutanozno ubrizgavanje mikročestičnih kompozicija predstavlja poželjniji način primene, međutim može biti moguće i korisno u slučaju nekih pacijenata ili obolenja da se kompozicija primenjuje na neki drugi način. Ovi načini naročito predstavljaju parenteralnu primenu, ali takođe mogu biti pulmonarni, nazalni, ili mukotalni - kao što je pod jezik ili na obraz -, ili neki drugi način. Između korisnih parenteralnih načina pored intramuskularnog i subkutanoznog ubruzgavanja naročito je korisno intratumoralno, intralezionalno, lokoregionalno, arterijalno, interstijalno, i intraperitonealno ubrizgavanje.

[0064]Mikročestice i njihove suspenzije za ubrizgavanje su prilagođene za parenteralnu primenu, koja označavaju da su formulisani i obrađeni tako da ispunjavaju potrebe parenteralnih doznih oblika. Takve potrebe su, na primer, prikazane u većini farmakopeja. Prema jednom aspektu, kompozicija, ili njegova predsmeša ili njegova oprema pomoću koje se kopozicija primenjuje, mora biti sterila. Prema drugom aspektu, ekscipijenti moraju biti odabrani tako da budu sigurni i podnošljivi za parenteralnu primenu. Prema daljem aspektu, kompozicije su formulisane tako da budu relativno izotonične (ili izoosmotične), kao što je u opsegu od oko 150 do 500 mOsmol/ kg, a prvenstveno u opsegu od oko 250 do 400 mOsmol/kg. Dalje, pH bi trebala da bude približno u fiziološkom opsegu u cilju da se izbegne bol i lokalna nepodnošljivost nakon ubrizgavanja. Prvenstveno, pH kompozicije je u opsegu od oko 4 do 8.5, a pogotovo u opsegu od 5.0 do 7.5.

[0065] Mikročestice se uobičajeno izvode ubrizgavanjem tako što se suspenduju u odgovarajući, fiziološki tečni nosač koji je poželjno zasnovan na vodi, čak kroz druge biokompatibilne rastvarače kao što su etanol, glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, ili druge organske rastvarače koji mogu biti prisutni. U naročito poželjnom rešenju, tečni konstituent tečnog nosača je vodeni i značajno slobodan organski rastvarač. Sa druge strane, inkorporacija drugih farmaceutskih ekscipijenata može biti korisna ili potrebna za optimizaciju osobina formulacije, kao što je tolerantnost, karakteristike u pogledu otpuštanja leka, i stabilnost. Ovo može biti istinito za obe, mikročestice kao same i tečni nosač. Bilo koja faza može sadržati jedan ili više aditiva koji su fiziološki podnošljivi.

[0066] Tipično, mikročestice su resuspendovane u tečnom nosaču kako bi obrazovale suspenziju sa čvrstim sadržajem čestice od približno 1 do 20 mas.%, a naročito od oko 3 do 10 mas.%. Veličina čestice i viskoznost tečnog nosača su poželjno odabrane kako bi se dozvolilo ubrizgavanje sa relativno finom iglom, kao što je sa 20 do 22 G iglom. U drugom poželjnom rešenju, veličina čestice i viskoznost tečnog nosača su prilagođeni da omoguće subkutaneoznuo ili intramuskularno ubrizgavanje primenom 23 do 25 G igle.

[0067] Opciono, mikročestice su oblikovane za rekonstituciju primenom sterilnog rastvora natrijum hlorida za ubrizgavanje.

[0068] Može biti korisno da se stabiliše interferon sa stabilnim ekscipijentom ili kombinacijom ekscipijenata, kao što je jedna ili više soli, šećeri, šećerni alkoholi, amino kiseline, peptidi, proteini, polimeri, površinski aktivne supstance, krioprotektanti, agensi za osmozu, puferne soli, kiseline ili baze. Neki od ovih ekscipijenata mogu takođe biti korisne za druge farmaceutske razloge, kao što je poboljšanje tolerantnosti mikročestica ili njihove suspenzije. Kako bi se prilagodile osobine polimernog nosača ili poboljšala njegova stabilnost, može biti korisno da se dalje inkorporišu jedna ili više plastikanata, agensi za formiranje pora, agensi za modifikovano otpuštanje, ili antioksidansi.

[0069] Kako bi se izbegla aglomeracija mikročestica kada se suspeduju u vodenom nosaču, vodeni nosač može takođe da sadrži jedan ili više fiziološki prihvatljivih površinski aktivnih supstanci. Ustvari, u zavisnosti od aktuelne prezentacije doznog oblika, potrebni ekscipijent kao što je površinski aktivna supstanca može biti inkorporisan ili u vodeni nosač ili u suvu kompoziciju koja sadrži mikročestice. Odabirom odgovarajuće površinski aktivne supstance može takođe da pomogne da se osigura da su mikročestice brzo i lako rekostituisane, kao što je ne više od 3 minute, ili prvenstveno u preiodu od 60 sekundi, a pogotovo ne više od oko 30 sekundi. Primeri potencijalnih korisnih površinski aktivnih supstanci uključuju poloksamere, fosfolipide, i vitamin ETPGS.

[0070] Dalje je otkrivena farmaceutksa oprema koja sadrži mikročestice koje su ovde opisane. U ovom kontekstu, farmaceutska oprema se može definisati kao set od bar dve kompozicije koje se kombinuju i koriste za tačnu terapeutsku, prevencionu, ili diagnostičnu svrhu. U predmetnom slučaju, oprema sadrži prvu i drugu zatvorenu pregradu koja može biti član istog ili dva različita primarna paketa. Prva pregrada sadrži kompoziciju zahteva 1 u značajnom suvom obliku, gde druga pregrada sadrži vodeni tečni nosač za rekonstituisanje ove osušene kompozicije u ubrizgavajuću mikročestičnu suspenziju. Opciono, oprema sadrži dva ili više seta prve i druge pregrade.

[0071] Tipično, značajno osušena kompozicija u prvoj pregradi sadrži slične pojedinačne doze koje se ubrizgavaju, i takođe uobičajeno druga pregrada će sadržati zapreminu tečnog nosača koja je potrebna za rekonstituciju sadržaja prve pregrade. Trenutno manje poželjne su pregrade koje sadrže više od jedne doze koja se ubrizgava u isto vreme. Prema tome poželjno je da je sadržaj interferona u prvoj pregradi od oko 10 do oko 150 MIU, a da je zapremina vodenog tečnog nosača u drugoj pregradi koja se može ukloniti sa iglom od oko 0.3 mL do oko 3 mL, a naročito od oko 0.5 do oko 2 mL.

[0072]Oprema dalje obezbeđuje sekundarno pakovanje koje je pogodno za prilagođavanje seta ili setova prve i druge pregrade.

[0073] Prva i druga pregrada mogu predstavljati različite komore pojedinačnog uređaja ili pojedinačnog primarnog pakovanja. Na primer, mogu postojati dve komore šprica sa dualnom komorom Prednost prepunjenih špriceva sa dualnom komorom je da je priprema i primena sigurna i pogodna i što ne zahteva rukovanje nekoliko posuda pod aseptičnim uslovima. Jedno od mana takvog šprica je to što je njihovo obezbeđivanje dosta skupo, ne može uvek omogućiti kompletnu i pouzdanu rekonstituciju.

[0074] Alternativno, dve pregrade seta mogu biti članovi dve različite primarne posude ili pakovanja Na primer, prva pregrada koja sadrži značajno suvu mikročestičnu kompoziciju može biti obezbeđena u obliku zatvorene boce ili posudice od pogodnog stakla ili plastike, a vodeni tečni nosač može biti obezbeđen u bocama, posudicama, ili ampulama. U daljem rešenju, prva pregrada je komora šprica a druga pregrada je obezbeđena u boci, posudici, ili ampuli

[0075] Opciono, jedna od posuda je konstruisana kao ketridž za auto-ubrizgavajući uređaj. Nakon kombinovanja suve kompozicije i vodenog tečnog nosača, tečna suspenzija koja je spremna za primenu je čuvana u ketridžu i može se ubaciti u auto-ubrizgavač.

[0076] Ponovo, treba da se naglasi da li značajno suva kompozicija u prvoj pregradi ili vodeni tečni nosač, ili oba, mogu obuhvatati jedan ili više drugih ekscipijenata, kao što su fileri, fazni agensi, površinski aktivne supstance, konzervansi, kiseline, baze, soli, šećeri, šećerni alkoholi, amino kiseline, stabilizatori, antioksidansi, polimeri, puferi, polioli, proteini kao što su humani serum albumin, i plastifikatori.

[0077] Suva kompozicija koja sadrži mikročestice i vodeni tečni nosač su prilagođeni da proizvode rekonstituisanu suspenziju koja je pogodna za ubrizgavanje, odn. koja je sterilna, relativno izotonična i izoosmotična, i značajno slobodna od sastojaka koja su toksična kada se primenjuju parenteralno. Viskoznos bi trebala da je niska dovoljno da dozvoli ubrizgavanje sa iglon kalibracije 17 ili više, a naročito sa iglom kalibracije 20 ili više, ili čak sa iglom kalibracije 22. Kao što je ovde korišćeno, sposobnost da se primeni se odnosi na reološke osobine koje dozvoljavaju ubrizgavanje sa određenim tipom igle bez primene sile za ubrizgavanje više od oko 25 N. Pogotovo, reološke osobine su usvojene, a veličina igle odabrana, tako da se omogući ubrizgavanje sa snagom ne većom od oko 20 N, a naročito sa snagom ubrizgavanja ne većom od 15 N, tako da dozvoli primenu koja se takođe izvodi od strane lekara, medicinske sestre, ili pacijenta koji nisu naročito snažni. Naravno, drugi uslov za takvu veličinu igle je da je prečnik mikročestica dovoljno mali, i da se mikročestice ne slepljuju posle rekonstitucije. Kao što je navedeno gore, težina prosečnog prečnika većine mikročestica nebi trebala da bude veća od oko 200 Pm, a prvenstveno da bude u opsegu od oko 30 do oko 175 Pm.

[0078]Prema pronalasku, mikročestice su proizvedene na osnovu osnovnog postupka emulzije koji obuhvata korak (a) pripremu emulzije koja sadrži vodenu unutrašnju fazu koja sadrži aktivni sastojak, i organsku spoljašnju fazu koja sadrži biorazgradivi polimer i bar jedan organski rastvarač; (b) očvršćavanja biorazgradivog polimera u mikročesticama uklanjanjem bar frakcije organskog rastvarača iz emulzije koja je pripremljena u koraku (a), i (c) sakupljanje i sušenje mikročestica koje su formirane korakom (b). Osnovni postupak konstruisanja je opisan npr. od strane JM. Bezemer et al. u J. Control Release 2000, 67 (2-3), 233-248 i 249-260, i J. Control Release 2000, 66 (2-3), 307-320.

[0079]Uopšteno govoreći, mikročestice su formirane iz organskog polimernog rastvora koji je dispergovan kao kapi u vodenoj ili hidrofilnoj fazi. U cilju da očvrsnu u čestice, organski rastvarač mora biti bar delimično uklonjen iz disperzne faze. Ovo se može postići korakom ekstrakcije rastvarača ili uparavanjem rastvarača, ili njihovom kombinacijom. Ekstrakcija rastvarača znači da je kontinualna vodena faza modifikovana do takve granice da je sposobna da rastvori ili ekstraktuje značajan deo organskog rastvarača disperzne faze. Na primer, ako organski rastvarač ima neku umerenu mešljivost sa vodom, razblaživanje ili povećanje zapremine vodene faze može već uticati značajno na ekstrakciju organske faze. Alternativno, kompozicija spoijašnje faze može se modifikovati dodavanjem jednog ili više organskih rastvarača koja su mešljiva sa vodom, ali koja mogu delovati kao korastvarači tako da rastvore i ekstrakuju organski rastvarač disperzne faze. Na primer, kao korastvarači se mogu koristiti etanol, metanol, aceton, izopropil alkohol.

[0080]Uparavanje rastvarača, sa druge strane, ne zahteva dodavanje bilo kojih komponenti kako bi direktno uticali na kompoziciju i osobine organske faze, ali čini primenu tipičnog ali mnogo većeg pritiska uparavanja organskog rastvarača disprezne faze u poređenju sa vodenom fazom: primenom vakuuma i/ili toplote, organski rastvarač može se upariti. Nakon dostizanja izvesne koncentracije polimera u organskoj fazi, formiraju se polimerni očvrščivaći i mikročestice. Veoma je važno da se naglasi da bilo koje uparavanje rastvarača željene disperzne faze će uobičajeno obuhvatati takođe i prisustvo mehanizna ekstrakcije rastvarača.

[0081]U cilju da se inkorporiraju hidrofilna aktivna jedinjenja u mikročestice, nebi bilo pogodno da se organska faza direktno puni sa aktivnim sastojkom. Prvo, to može da dovede do slabe efikasnosti inkorporacije pošto će se hidrofilna jedinjenja podeliti u vodenoj fazi kada se formira emulzija. Drugo, mnoga značajna jedinjenja, pogotovo peptidi i proteini kao što su interferoni koja je potrebno inkorporirati prema predmetnom pronalasku, su veoma osetljiva na organske rastvarače i mogu postati neaktivni. Stoga prema predmetnom pronalasku, interferon je inkorporisan u obliku vodenog rastvora koji je emulgovan u organskom rastvaraču blokirajućeg kopolimera kako bi se obrazovala emulzija "voda u ulju", koja je značajno emulgovana u drugoj vodenoj fazi kako bi se formirala dvostruka emulzija "voda-u-ulju-u-vodi" (v/u/v). Kada se izvodi ekstrakcija rastvarača ili uparavanje rastvarača kao što je ovde opisano, unutrašnja vodena faza koja sadrži interferon postaje enkapsulirana u polimernim mikročesticama.

[0082]Jedan od trenutno poželjnih organskih rastvarača da rastvori blokirajući kopolimer i da obezbedi organsku fazu u/v-emulzije ili v/u/v-emulzije je dihlorometan. Polimerni sadržaj organske faze može veoma da zavisi od specifične kompozicije polimera i organskog rastvarača koji se trenutno koriste, i može se kretati od oko 1 do oko 300 mg/mL. Prvenstveno, sadržaj polimera bi trebao da bude u opsegu od oko 50 do oko 250 mg/mL, ili čak od oko 100 do oko 150 mg/mL u slučaju da se dihlorometan koristi kao rastvarač.

[0083]Aktivni sastojak, odn. interferon, je inkorporisan u obliku vodenog rastvora koji je emulgovan u organskom polimernom rastvoru. Vodeni rastvor interferona se može stabilisati primenom ekscipijenata, kao što su kiseline, baze, ili puferne soli kako bi se postigla i održala pH vrednost, ili sa agensima osmoze kao što je jedna ili više soli, šećeri, šećerni alkoholi, amino kiseline itd. Neki od ovih ekscipijenata takođe mogu da budu značajniji za efekat stabilnosti nego što su za osmolizu. Međutim, pronađeno je da interferon, a naročito alfa-interferoni, se može lako inkorporisati primenom tehnike v/u/v-dvostruke emulzije primenom jednostavnog vodenog rastvora interferona kao najunutrašnjija emulziona faza koja ne sadrži druge ekscipijente.

[0084]Sadržaj interferona u unutrašnjoj vodenoj fazi će očigledno uticati na sadržaj interferona u mikročesticama, i stoga može biti odabran prema željenim osobinama mirkočestice. U slučaju alfa-interferona, na primer, sadržaj se može kretati od oko 1 do oko 100 mg/mL, a prvenstveno od oko 10 do oko 50 mg/mL.

[0085] Zapreminski odnos unutrašnje vodene faze prema organskoj fazi će takođe imati uticaj na sadržaj aktivnog sastojka mikročestica. Dalje, može uticati na druge značajne osobine čestica kao što je njihova poroznost i otpuštajući profil. Prema tome, odnos treba pažljivo podesiti na željene karakteristike proizvoda u svakom pojedinačnom slučaju Ukoliko su osobine unutrašnje vodene i organske faze odabrane prema pogodnostima koje su ovde opisane, zapreminski odnos od oko 1 : 3 do oko 1 : 15 (unutrašnja vodena faza : organska faza) je pronađen korisnim. Prema jednom od poželjnih rešenja, zapreminski odnos je odabran od oko 1 : 5 do oko 1 .10.

[0086] Kako bi se stabilizovala dvostruka emulzijav/u/v,bilo bi korisno da se inkorporira jedan ili više stabilajzera koji imaju osobine površinski aktivne supstance u spoljašnju vodenu fazu. Korisni stabilajzeri mogu biti mali amfilitički molekuli kao što su jonske ili nejonske površinski aktivne supstance ili deterdženti, ili površinski aktivni polimeri. Na primer, pronađeno je da je polivinil alkohol korisni aditiv koji je sposoban da stabilizuje emulziju bez da ima neke dodatne štetne efekte na postupak dobijanja ili na finalni proizvod. Korisni polivinil alkoholi mogu imati bilo koju prosečnu molekulsku težinu koja se kreće od oko 10,000 do oko 1 milion, i imati stepen hidrolize od oko 80 do oko 99 %, a prvenstveno od oko 85 do oko 90 %. Alternativno, se mogu koristiti polivinil piroiidon ili površinski aktivni polisaharidi. Sadržaj stabilajzera u spoljašnjoj fazi zavisi od njegove hemijske prirode, kao i od prirode i relativne zapremine dispergovane organske faze. U slučaju polivinil alkohola, na primer, može se kretati od oko 0.1 do oko 10 mas.%, a prvenstveno od oko 0.5 do oko 5 mas.%. U slučaju pirolidona, korisni opseg je od oko 1 do oko 30 mas.%, a prvenstveno od oko 5 do oko 25 mas.%.

[0087] Spoljašnja vodena faza takođe može da sadrži druge ekscipijente, kao što su puferni agensi, agensi za osmozu, ili korastvarači. Prema pronalasku, spoljašnja vodena faza obuhvata osmotski agens. Korastvarač kao što je etanol ili metanol može se koristiti za prilagođavanje hidrofilnosti vodene faze i da poboljša bilo koju ekstrakciju rastvarača postupka dobijanja. Osmotski agensi mogu, na primer, da budu odabrani iz grupe koju čine soli, šećeri, šećerni alkoholi, oligosaharidi, glikoli, drugi alkoholi, i amino kiseline. U jednom od rešenja, kao osmozni agens je korišćen natrijum hlorid. Treba naglasiti takođe da bilo koji puferni sistem u spoljašnjoj fazi će izazvati osmotski pritisak.

[0088] Prema pronalasku, osmolalit spoljašnje faze ima vrednost koja je veća nego, od one u unutrašnjoj vodenoj fazi dvostruke emulzije. Na ovaj način, osmotski izvedena difuzija vode iz spoljašnje vodene faze u unutrašnju vodenu fazu može biti obilato izbegnuta. Pronađeno je da takav difuzioni postupak može povećati poroznost mikročestice koja je formirana ekstrakcijom rastvarača i/ili uparavanjem rastvarača u naknadnom koraku. Prvenstveno, osmolalit spoljašnje vodene faze je podešen da značajno prevazilazi da najunutrašnjija vodena faza, kao što je inkorporiranje natrijum hlorida na nivou od oko 3 do 6 mas.%.

[0089] Realtivna zapremina spoljašnje faze mora biti odabrana tako da je iznad minimalne zapremine koja je potrebna za inkorporaciju dve spoljašnje faze, i prema tome zavisi takođe od prirode i kompozicije svih faza, naročito organske faze i spoljašnje vodene faze. Iznad minimalne zapremine, stvarna zapremina vodene spoljašnje faze je bitna uglavnom u pogledu značajnog postupka ekstrakcije rastvarača i/ili uparavanja rastvarača. Uglavnom, zapremina spoljašnje vodene faze je veća nego od v/u-emulzije u koju se inkorporira. Na primer, može biti dva puta veća nego zapremina v/u-emulzije. Prvenstveno, je oko 5 do 40 ili 50 puta veća.

[0090] Dobijanje unutrašnje v/u-emulzije se može vršiti uobičajenom opremom visokog smicanja, kao što je rotor-stator uređaj velike brzine, npr. Ultra-Turrax tip, ako je aktivni sastojak relativno stabilan da deli snagu. Kako bi se emulgovala takva emulzija u vodenoj fazi koja sadrži površinski aktivno jedinjenje, nije potrebno da se primenjuje visoko smicanje ili agitacija: može biti dovoljna uobičajena oprema za mešanje. Dobijanje v/u- i v/u/v emulzije se prvenstveno izvodi na sobnoj temperature, ili na temparaturama koje su ispod sobne temperature, kao što je oko 0 °C i oko 25 °C, a pri normalnom pritisku. Očigledno, postupak emulgovanja koji je korišćen sa uticajem rezultujućeg prosečnog prečnika i distribucije disperzne faze, i veličina distribucije mikročestica. Drugi faktori koji utiču na ove parameter su kompozicije odgovarajućih faza, naročito prirode organkog rastvarača i tipa i sadržaja površinski aktivnog stabilajzera u spoljašnjoj fazi.

[0091] Solidifikacija polimera koji je rastvoren u organskoj fazi kako bi se formirale mikročestice može biti izazvana uparavanje rastvarača kao primarni mehanizam. Ovo se može ostvariti povećanjem temperature v/u/v-dvostruke emulzije uz mešanje, i/ili primenom vakuuma.

[0092] Pogotovo, međutim, formiranje mikročestice je izazvano korakom koji uključuje ekstrakciju rastvarača. Kako bi se to uradilo, spoljašnja faza v/u/v-dvostruke emulzije je razblažena sa dodatnim vodenim rastvorom koji može, opciono, biti sličan ili čak identičan po svojoj kompoziciji spoljašne vodene faze. Ukoliko je sadržaj stabilajzera spoljašnje vodene emulzione faze dovoljno visok, vodeni rastvor koji je dodat za izazivanje postupka ekstrakcije rastvarača neće morati da sadrži bilo koji drugi stabilajzer. Sa druge strane, preporučljivo je da vodeni rastvor koji je dodat sadrži osmotski aktivni sastojak, kao što su jedna ili više soli, šećeri, šećerni alkoholi, oligosaharidi, glikoli, drugi alkoholi, i amino kiseline, u cilju da se održi bilo koji osmotski gradijent između unutrašnjih i spoljašnjih faza dvostruke emulzije, i da se izbegne difuzija vode u unutrašnju fazu. Opciono, vodeni rastvor koji se dodaje može takođe da sadrži korastvarač kao što je methanol ili etanol, ili puferni agens.

[0093] Zapremina vodenog rastvora koji je dodat dvostrukoj emulziji je tipična bar kao velika nego ona od emulzije pre sprovođenja koraka ekstrakcije rastvarača. Prvenstveno, zapremina je od oko 1 do 5 puta nego dvostruke emulzije. Može biti pogodno da se rastvor doda polako uz konstantno mešanje kako bi se izbegla lokalna inhomogenacija unutar posude. Opciono, temperature se može povećavati i/ili primenjivati vakuum kako bi se uklonio ekstrakovani organski rastvarač. Posle dodavanja vodenog rastvora, mešanje se može nastaviti još neko vreme kako bi se dozvolila mnogo opsežnija ekstrakcija rastvarača iz organske faze, i možda takođe omogućila difuzija vode iz unutrašnje vodene faze emulzije u spoljašnju fazu.

[0094] Kada su mikročestice solidifikovane, mogu se skupljati, kao što je centrifugiranjem, filtracijom, ili sijanjem. Ponovljeno centrifugiranje, filtracija, ili sejanje posle resuspendovanja mikročestica u nekom svežem vodenom rastvoru kao što je pufer bi trebalo da se izvodi tako da ukloni značajne sve preostale organske rastvarače i sva rastvorna jedinjenja čije prisustvo u mikročesticama nije poželjno. Opciono, mikročestice mogu biti zamaskirane kako bi se odvojile željene veličine čestica frakcije.

[0095] Posle ispiranja, mikročestice se mogu osušiti za spremanje. Poželjna metoda sušenja je sušenje zamrzavanjem. Na primer, mikročestice se mogu zamrznuti u tečnom azotu a potom sušiti pod vakuumom kako bi se sublimirao ostatak vode. Uobičajeno, postupak sušenja obuhvata prvo fazu sušenja koja se izvodi na temperature ispod 0 °C koja je potom praćena drugom fazom sušenja na temperaturi okoline ili višoj temperaturi.

[0096]Osušene mikročestice se mogu mešati sa drugim opcionim ekscipijentima kao što je opisano gore kako bi se postigla kompozicija pronalaska. Na primer, prahasta smeša koja sadrži mikročestice i jedan ili više čvrstih ekscipijenata odabrani iz grupe koja se sastoji od površinski aktivnih supstanci, resuspendovanih agenasa, osmotskih genas, i pufernih agenasa može predstavljati kompoziciju prema zahtevu 1. Prvenstveno, mikročestice i ekscipijenti su obezbeđeni u sterilnom obliku, a mešanje se izvodi aseptično. Takva prahasta smeša može se aseptički puniti u bočice ili posudice. Kao što je navedeno gore, bočice ili posudice se mogu kombinovati sa vodenim tečnim nosačem za rekonstituisanje praha sa farmaceutskim opremama.

[0097] Kompozicije blokirajućeg kopolimera mogu biti odabrane kao što je opisano gore u kontekstu mikročestica. Tip ekscipijenta koji se naročito može koristiti u implantima je plastifikator, koji može smanjiti opseg topljenja ili tačku prenosa stakla sa polimera na temperature koja nema negativni uticaj na stabilnost inkorporisanog interferona. Potencijalno korisni plastifikatori obuhvataju glicerol, propilen glikol, i polietilen glikol.

[0098] Farmaceutska primena lekovitog proizvoda za rukovanje obolenja i stanja koje se može lečiti, ili čiji progress se može sprečiti ili umanjiti, sa primenom interferona, a pogotovo primenom alfa-interferona. Primeri ovih obolenja i stanja obuhvataju akutni i hronični hepatitis B, akutni i hronični hepatitis C, leukemiju ćelije dlake, akutnu i hroničnu mielogenouznu-leukaemiju, multiple mielom, folikular limfomu, karcinoidni tumor, maligni melanom, kondiloma acuminata, SARS, i Kaposi sarkoma, kao što je Kaposi sarkoma povezana sa AIDS-om.

[0099] Trenutno otkrivena kompozicija obezbeđuje prednost u odnosu na uobičajene formulacije interferona za ubrizgavanje tako da učestalost ubrizgavanja može da se znatno smanji u pogledu njegove karakteristike kontrolisanog otpuštanja, kao što je jedno ubrizgavanje svake 2 ili 4 nedelje umesto nekoliko ubrizgavanja po nedelji. Kao posledica, komfor pacijenta i usklađivanje su povećani, a troškovi koji su vezani za često ubrizgavanje su znatno smanjeni. U pogledu na druge sisteme kontrolisanog otpuštanja polimera za ubrizgavanje ili implantaciju, predmetni pronalazak obezbeđuje odličnu kompatibilnost sa inteferonima, poboljšanu kontrolu otpuštanja bez efekta eksplozije, dozno odlaganje, ili autokatalitičku polimernu degradaciju i eroziju. Dalje, predmetni sistemi dostave su fiziološki dobro podnošljivi, bez izazivanja bilo kog značajnog sporednog efekta koji je povezan za nosač.

[0100]Bez želje da se vežu za određenu teoriju, ponašanje koje se odnosi na dobro otpuštanje trenutno dostavnog sistema izgleda da je povezan za činjenicu da je aktivno jedinjenje otpušteno uglavnom kroz difuziju, a ne kroz eroziju kao u slučaju mnogih do sada poznatih poli (mlečnnog)-osnovnog i/ili (glikolidnog)- sistema dostave. Primenom amfilitičnih blokirajućih kopolimera, nema autokatalitične polimerne degradacije koja je obuhvaćena u postupak otpuštanja. Suprotno poznatim sistemima dostave, blokirajući kopolimeri ne proizvode kiselinsku mikro okolinu koja je neprijatna za osetljiva biološka jedinjenja. Sa druge strane, hidrofilni blokirajući kopolimeri verovatno obezbeđuju hidrofilnu mikro okolinu koja poboljšava in situ stabilnost svakog osetljivog biloškog jedinjenja. Naročito, izgleda da su interferoni - pogotovo interferoni iz alfa familije - stabilni u ne-agregatnom stanju u mikro okolini koja je obezbeđena od strane amfifilnih blokirajućih kopolimera u sistemu nosača koji čini pronalazak.

[0101]Takođe se veruje da relativno niska poroznost mikročestica koje su formirane iz blokirajućih kopolimera je jedan od uzroka niskog efekta eksplozije koja je posmatrana u trenutno otkrivenoj kompoziciji.

[0102]Dalja rešenja, prijave i prednosti pronalska će postati očigledne na osnovu sledećih primera.

Primer T. Pobijanje v/ u/ v dvostruke emulzije koja sadrži interferon- alfa- 2b

[0103]Ne-glikozilovani, rekombinovani interferon-alfa-2b (IFN-a-2b), protein sastavljen od 165 amino kiselina, koji ima molekulsku težinu približno 19,000 Da i izoelektričnu tačku od oko 6.0, je dobijen u vidu vodenog rastvora sa koncentracijom proteina približno 10 mg/mL. Blokirajući kopolimer od 80 mas.% PEGT i 20 mas.% PBT sa PEG segmentima koji imaju prosečnu molekulsku masu od 1,500 je dobijen iz IsoTis, Bilthoven, Holandija. Pripremljen je rastvor od 1 g polimera u 7 mL dihlorometana. Kako bi se dobila v/u-emulzija, 1 mL IFN-alfa-2b rastvora je dodat polimernom rastvoru uz mešanje, praćen ultra turaksnom homogenizacijom na 19,000 rpm približno 30 sekundi.

[0104]Dve različite v/u/v-dvostruke emulzijesu dobijene sipanjem dve v/u-emulzije - dobijene kao što je ovde opisano- odvojene u 50 mL (a) vodenog PBS pufera koji sadrži 4 % PVA (w/v) (MW približno 130,000, stepen hidrolize približno 87 %), ili (b) vodenog rastvora natrijum hlorida (5 % w/v) koji takođe sadrži 4 % PVA (w/v) uz mešanje na 700 rpm.

Primer 2: Pobijanje mikročestica ekstrakcijom rastvarača i uparavanjem

[0105]Dvostruke emulzije dobijene prema Primeru 1 su dalje obrađivane kako bi se dobile mikročestice. Svakoj od dve dvostruke emulzije, polako je dodato uz konstantno mešanje na 700 rpm 100 mL vodenog PBS pufera. Podati rastvor PBS vodi do širenja vodene faze dvostrukih emulzija. Potom, mešanje je nastavljeno približno još 1 sat kako bi se ekstrakovao veći deo dihlorometana u spoljašnju vodenu fazu, i kako bi se očvrsnuo polimer u organskoj fazi. Potom, očvrsnute mikročestice su centrifugirane na 2,500 rpm i na sobnoj temperaturi. Supernatant je odbačen, a granula je resuspendovana u svežem PBS puferu kako bi se ponovo centrifugirale. Postupak je ponavljan tri puta. Konačno, mikročestice su zamrznute u tečnom azotu i zamrznuto osešene približno tokom 12-24 hours. Efikasnost enkapsulacije je određena tako da bude oko 85 % za mikročestice iz v/u/v dvostruke emulzije čija spoljašnja faza sadrži 5 % natrijum hlorida, i približno 25 % za drugu smešu. Mikročestice su ispitane elektronskim mikroskopom (SEM) i pronađeno je da su približno sferične i predominantne pri veličini od oko 50 do oko 120 Pm.

Primer 3: Otpuštanje interferon- alfa- 2b iz mikročestica in vitro

[0106]Za testiranje njihovog ponašanja pri otpuštanju, približno 15 mg svake smeše mikročestica koje su dobijene prema Primeru 2 je izmereno u 1.5 mL balonu u tri primerka. Svakom balonu je dodato 1 mL PBS pufera. Baloni su čuvani u vodenom kupatilu na 37 °C. Za vreme uzorkovanja, mikročestice su centrifugirane na 1,000 rpm 2 minute na sobnoj temperaturi. Uzorci od 700 Pl su povučeni i zamenjeni sa svežim PBS puferom. Količina IFN-alfa-2b u svakom uzorku je određena primenom ukupne analize proteina sa Micro bihinhoničnom kiselinom.

[0107]Pronađeno je da obe smeše jasno pokazuju karakteristike zadržanog otpištanja. Dobijena smeša iz v/u/v dvostruke emulzije čija spoljašnja faza sadrži 5 % natrijum hlorida pokazuje početni efekat eksplozije koji je manji od oko 10 %, dok druga smeša ima efekat eksplozije od oko 20 %. Obe smeše otpuštaju 50 % njihovog sadržaja interferona u periodu od oko 3-4 dana, i 75 % u periodu od oko 7-8 dana. Posle 14 dana, otpušteno je približno 85-90 % inkorporirane doze.

Primer 4: Pobijanje kompozicije koja sadrži mikročestice koje su inkorporirane u

skraćeni lFN- alpha- 2b

[0108]Mikročestica koja sadrži kompoziciju je dobijena kao što sledi, primenom aseptičnih uslova. Količina od 6 g sterilnog blokirajućeg kopolimera 77 mas.% PEGT i 23 mas.% PBT sa PEG segmentima koji imaju prosečnu molekulsku masu od 1,500 je izmerena i rastvorena u 54 g sterilnog dihlorometana. Rastvor organskog polimera je kombinovan sa 5.5 mL sterilnog rastvora koji sadrži smešu od INF-alfa-2b skraćenog N-kraja koji ima, u prošeku, dužinu od oko 158 ostataka amino kiseline, specifične aktivnosti od oko 0.25 do 0.35 MIU po Pg, i koncentracije interferona od oko 10 mg/mL. Za dobijanje homogene voda-u-ulju emulzije korišćen je ultraturaks uređaj.

[0109]Potom, emulzija je kombinovana uz mešanje sa 445 g sterilnog vodenog rastvora polivinil alkohola (4 % w/v) koji takođe sadrži natrijum hlorid (5 % w/v). Prema tome, dobijena je v/u/v dvostruka emulzija gde je rastvor polivinil alkohola formirao spoljašnju vodenu fazu.

[0110]U sledećem koraki, mikročestice su formirane i očvrsnute uklanjanjem rastvarača iz organske faze, što je postignuto kombinacijom ekstrakcije rastvarača i uparavanjem rastvarača. Neka ekstrakcija rastvarača je izvedena dodavanjem sterilnog PBS pufera kontinualnoj fazi dvostruke emulzije, a druga porcija dihlorometana je uaprena uduvavanjem sterilnog azota pri protoku od oko 5-10 L/min preko površine dvostruke faze oko 24 sata.

[0111]Mikročestice su prikupljene i isprane sa sterilnim rastvorom manitola (26.7 g/L) i resuspendovane u odgovarajućoj zapremini rastvora manitola kako bi se podesila osmoliznost do fiziološke podnošljive vrednosti i omogućila adekvatno formiranje pogače tokom liofilizacije. Alikvoti suspenzije su punjeni u sterilne staklene posude i osušene smrzavanjem, pri čemu se dobijaju liofilizati. Posude su zatvorene sa plastičnim stoperima i aluminijumskim poklopcima.

[0112]Analitičkim testiranjem prikazano je da prosečni prečnik mikročestica je oko 83 Pm, a iz sadržaja interferona je zaključeno da efikasnost enkapsulacije je veća od oko 90 %. Ostatak dihlorometana je suspendovan ispod 600 ppm. Elektronska mikrografija mikročestice otkriva malu poroznost; pogotovo, većina čestica koje imaju prečnik veći od 2-5 pm nema poroznost.

Primer 5: In vivo testiranje mikročestica koje sadrže skraćen lFN- alfa- 2b

[0113]Mikročestica koja sadrži kompozicije koje su dobijene na analogan način kao u primeru 4 je testirana na njeno in vivo ponašanje kod hrčaka i majmuna. Čvrste lipofilne kompozicije su suspendovane u sterilnom vodenom rastvoru natrijum karboksimetil celuloze (0.1 % w/v), opciono je dodat manito kako bi se podesila osmoliza tečne faze. Količine vodenog rastvora su izračunate, na osnovu sadržaja aktivnog sastojka i doze koja se treba primeniti, kako bi se dobila zapremina ubrizgavanja od 0.5 do 1.0 mL po pojedinačnoj primeni. Svaki od deset hrčaka je primilo dozu od 0.99 mg/kg aktivnog jedinjenja primenjenoj sa s.c. ubrizgavanjem svakih 7 dana, a druga grupa od deset hrčaka je primilo 3.46 mg/kg svakih 7 dana. Uzorci seruma su dobijeni iz životinja u odabranim intervalima, koji su potom čuvani u zamrznutom stanju a kasnije analizirani na njihov sadržaj interferona. Sve životinje su izgleda dobro podnele lečenje.

[0114]Na osnovu profila seruma, izračunati su profili otpuštanja aktivnog jedinjenja in vivo. U odvojenom eksperimentu, profili otpuštanja in vitro su određeni kao što je opisano u Primeru 3. Poređenjem profila otpuštanja in vivo i in vitro prikazano je da postoji dobra koleracija između odgovarajućih profila, oba u obliku i u trajanu otpuštanja, i izgleda da ponašanje pri in vitro otpuštanju je odličan pokazatelj in vivo karakteristike kompozicija. Nije zapažen značajan efekat eksplozije in vivo ili in vitro.

[0115]Slika 1 pokazuje kalkulisane prosečne in vivo profile otpuštanja grupe hrčaka sa manjom dozom, grupa sa večom dozom, određeni in vitro profil otpuštanja, normalizovan na 100 % ukupnog otpuštanja.

[0116]U drugoj seriji eksperimenta, uzorci iste kompozicije su primenjivani subkutaneozno na mužjake i ženke majmuna. Doza aktivnog sastojka je 180 Pg po životinji, i ista rekostituisana tečnost je korišćena za disperziju kompozicije zapremine od 0.5 do 1.0 ml po injekciji. Polazeći od vremena ubrizgavanja, uzorci seruma su dobijeni pri odabranim vremenskim intervalima tokom period od 14 dana. Ponovo, koncentracije seruma su korišćene kako bi se izračunao in vivo otpuštajući profil, koji je potom poređen sa in vitro otpuštajućim profilom određen iz uzorka smeše kompozicije prema postupku opisanom u Primeru 3.

[0117]U rezultatu, korelacija između respektivnog profila otpuštanja je bila izuzetna. Obe kompozicije in vitro i in vivo izgleda da otpuštaju svoj sadržaj interferona odmereno tokom perioda od 14 dana, bez nekog značajnog eksplozivnog otpuštanja.

[0118] Slika 2 prikazuje izračunati prosečni in vivo otpuštajući profil i respektivno in vitro otpuštajući profil, normalizovan na 100 % ukupnog otpuštanja.

Primer 6: Čistoća otpuštenog interferona

[0119] Uzorci otpuštenog interferona dobijenog iz in vitro otpuštanja testiran kao što je opisano u Primerima 4 i 5 su analizirani hromatografijom sa visoko izvedenom veličinom isključivanja kako bi se odredila frakcija interferona koji je otpušten u monomernom obliku. Iznenađujuće, je pronađeno da je manje od 1 % otpuštenog aktivnog jedinjenja u obliku dimera ili velikih agregata, čak su uz to i alfa-interferoni poznati aglomerati. Prema tome, mikročestična kompozicija je izgleda doprinela značajnoj stabilizaciji interferona.

Claims (5)

1. Postupak za dobijanje mikročestica koje sadrže jednu ili više aktivnih jedinjenja odabrani iz grupe interferona i jedan ili više biorazgradivih blokirajućih kopolimera sastavljeni od poli(etilen glikol) tereftalata (PEGT) i poli(butilen tereftalata) (PBT), obuhvata sledeće korake: (a) dobijanje emulzije koja sadrži (aa) vodenu unutrašnju fazu koja sadrži jednu ili više aktivnih jedinjenja, i (ab) organsku spoljašnju fazu koja sadrži jedan ili više biorazgradivih blokirajućih kopolimera i bar jedan organski rastvarač; (b) očvršćavanja jednog ili više biorazgradivih blokirajućih kopolimera unutar mikročestica uklanjanjem bar frakcije organskog rastvarača iz emulzije dobijene u koraku (a); (c) skupljanje i sušenje mikročestica dobijene u koraku (b) pri čemu je korak (b) izvođen emulgovanjem emulzije dobijene u koraku (a) u koherentnoj vodenoj fazi kako bi se dobila v/u/v dvostruka emulzija, u kojoj koherentna vodena faza sadrži osmotski agens, gde je osmolalit koherentne vodene faze veći nego u vodenoj unutrašnjoj fazi.

2. Postupak prema zahtevu 1, gde osmotski agens predstavlja so.

3. Postupak prema zahtevu 2, gde so je natrijum hlorid.

4. Postupak prema zahtevu 3, gde je natrijum hlorid prisutan u količini od oko 3 do oko 6 mas.%.

5. Postupak prema jednom od prethodnih zahtev, gde je interferon odabran iz grupe alfa-interferona.