RS50148B - Upotreba docetaksela za lečenje hepatoćelijskog karcinoma - Google Patents

Abstract

Upotreba kompozicije za proizvodnju leka za lečenje hepatoćelijskog karcinoma, naznačena time, što kompozicija kao aktivni sastojak sadrži docetaksel ili njegov hidrat. Prijava sadrži 3 zavisna patentna zahteva

Description

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na lečenje hepatoćelijskog karcinoma.

Hepatoćelijski karcinom (HCC) je jedan od najrasprostranjenijih kancera u jugoistočnim azijskim i afričkim zemljama. U Tajvanu je hepatoćelijski karcinom vodeći uzrok smrti kod muških bolesnika od raka (kancera). Stepen preživljavanja od hepatoćelijskog karcinoma je vrlo mali. Ovo je uglavnom posledica nedostatka efikasnih lečenja. Zračenje i hemoterapije do sada se nisu pokazali zadovoljavajućim; hirurgija je najefikasnije lečenje (tretman) za hepatoćelijski karcinom. Međutim, hirurgija je odgovarajuća samo za pacijente sa malim tumorima koji se mogu iseći.

? Nedavno su ponovo postali značajni antimitotički lekovi kao što je paklitaksel (paclitaxel). Paklitaksel je originalno izolovan iz kore tise. Antitumorni efekat paklitaksela je poznat od 1971. godine. Paklitaksel inhibira deobu ćelija tumora delovanjem na sistem mikrotubulusa (mikrokanalića). Analizein vitrouz primenu ćelija tumora su otkrile da paklitaksel zaustavlja (sprečava) ćelije uglavnom u fazi G2/M ćelijskog ciklusa (P.B. Schiff i S.B. Horwitz,Proc.

Natl. Acad. Sci. 77(1980) 1561-1565). Nedavna proučavanja su pokazala da je paklitaksel efikasan protiv različitih malignih ćelija tumora kao što su tumor mozga, rak želuca i prostate, rak grudi (dojke), melanom i rak jajnika.

Međutim, paklitaksel nije efikasan protiv hepatoćelijskog karcinoma. UBritish Journal of Cancer78(1) (1998) 34-39 objavljena je faza II kliničke probe na paklitaksel za pacijente sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC). Taj članak zaključuje da paklitaksel nije imao značajan anti-kancerski efekat kod pacijenata sa hepatoćelijskim karcinomom.

Kao što je gore objašnjeno, nađeno je da citotoksični efekat paklitaksela zavisi od ćelijskog ciklusa, pri čemu se zaustavljanje (sprečavanje) ćelijskog ciklusa vrši uglavnom u fazi G2/M. Međutim, sada je nađeno da docetaksel (docetaxel) može postići citotoksičnost u ćelijama hepatoćelijskog karcinoma koja ne zavisi od ćelijskog ciklusa. Ovo ukazuje da se citotoksični efekat docetaksela na ćelije hepatoćelijskog karcinoma postiže različitim mehanizmom od onog kod paklitaksela. Dalje,in vitroaktivnost docetaksela protiv ćelija hepatoćelijskog karcinoma je znatno veća od aktivnosti paklitaksela pri koncentracijama do 1 uM. Za datu visoko citotoksičnu prirodu taksoida, povećana aktivnost pri maloj koncentraciji sugeriše da će docetaksel, za razliku od paklitaksela, imati praktičnu primenu u kliničkom lečenju (tretmanu) hepatoćelijskog karcinoma.

Prema tome, ovaj pronalazak daje primenu docetaksela ili njegovog hidrata u proizvodnji leka za primenu u lečenju hepatoćelijskog karcinoma.

Takođe je dat postupak lečenja (tretmana) pacijenta koji pati (boluje) od hepatoćelijskog karcinoma, koji obuhvata davanje efikasne količine docetaksela ili nekog njegovog hidrata pomenutom pacijentu. Ovaj pronalazak takođe daje postupak za poboljšanje stanja pacijenta koji pati (boluje) od hepatoćelijskog karcinoma, koji obuhvata davanje efikasne količine docetaksela ili nekog njegovog hidrata pomenutom pacijentu.

Docetaksel je poznato jedinjenje. On ima formulu

Postupci za dobivanje docetaksela su opisani u EP-A-253738 i EP-A-336841.

Docetaksel se može upotrebiti, na primer, u anhidrovanom obliku ili kao neki hidrat. Kao što se ovde upotrebljavaju, reference koje se odnose na docetaksel takođe uključuju i reference na njegove hidrate.

Hidrati docetaksela mogu se dobiti rastvaranjem anhidrovanog docetaksela u organskom rastvaraču kao što je aceton, etanol, acetonitril ili N,N-dimetilformamid, i prekristalisanjem hidrata docetaksela dodavanjem tako dobivenog rastvora u vodu. Hidrat docetaksela je tipično dihidrat, trihidrat ili tetrahidrat. Posebno rečeno, nađeno je da je trihidrat osobito stabilan i otuda je docetaksel-trihidrat naročito pogodan. Docetaksel-trihidrat se može dobiti (spraviti) pomoću postupaka datih u EP-A-770070.

Docetaksel-trihidrat je neočekivano aktivan protiv hepatoćelijskih karcinoma. Posebno rečeno, on se može koristiti u lečenju ćelijskih karcinoma jetre, fibrolamelarnih varijanti i mešovitih hepatoćelijskih holanangio-karcinoma.

U ovom pronalasku, docetaksel se može davati bilo kojim uobičajenim putem (načinom) koji je poznat za davanje docetaksela. Tako, na primer, on se može davati parenteralno. Tipično, on se daje intravenozno, pogodno intravenoznom infuzijom.

U ovom pronalasku, docetaksel se tipično formuliše za davanje kao farmaceutski prihvatljiva smeša koja sadrži docetaksel i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Pogodni nosači i razblaživači uključuju netoksične rastvarače i medijume za suspendovanje, na primer, sterilne vodene medijume. Pogodno smeše uzimaju oblik vodenih rastvora ili suspenzija, na primer, rastvora pogodnih za injekciju ili infuziju, koji mogu sadržati sredstva za emulgovanje, bojenje, prezervative (sredstva za čuvanje) ili stabilizatore.

Farmaceutske smeše koje su pogodne za parenteralno davanje uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore ili suspenzije. Pogodni sterilni nevodeni rastvori i suspenzije uključuju rastvore i suspenzije u prirodnim biljnim uljima kao što su maslinovo ulje, sezamovo ulje ili tečni petrolej ili u organskim estrima koji se mogu ubrizgavati injekcijom kao što je etiloleat. Pogodni sterilni vodeni rastvori uključuju rastvore docetaksela u vodi. Tipično se pH sterilnih vodenih rastvora pogodnih za parenteralno davanje odgovarajuće podešava. Dalje, takvi sterilni vodeni rastvori su generalno načinjeni izotoničnim, na primer, sa dovoljnom količinom natrijum-hlorida ili glukoze. Naročito je pogodno da rastvori pogodni za davanje infuzijom imaju vrednost pH sličnu pH krvi i da su načinjeni izotoničnim.

Sterilizacija se može vršiti zagrevanjem ili pomoću drugih načina koji ne utiču štetno na ovu smešu.

Farmaceutske smeše koje sadrže docetaksel koje su pogodne za primenu u ovom pronalasku dalje mogu sadržati površinski-aktivnu materiju. Pogodne površinski-aktivne materije su polisorbati, estri polioksietilenglikola i estri-etri polietilenglikola i ricinusovih ulja. Primeri pogodnih površinski-aktivnih materija i farmaceutskih smeša koje sadrže površinski-aktivne materije se mogu naći u AU-A-666859.

Docetaksel se takođe može formulisati za primenu u ovom pronalasku kao liofilizovana smeša. Takve liofilizovane smeše imaju dobru fizičku i hemijsku stabilnost i otuda se mogu skladištiti u dužim periodima vremena. Liofilizovane smeše koje sadrže docetaksel mogu se dobiti liofilizacijom vodenog rastvora docetaksela pomoću standardnih tehnika. One dalje mogu sadržati sredstva za punjenje (punioce) kao što je laktoza. One takođe mogu sadržati sredstva za podešavanje toničnosti kao što su šećeri i polimeri. Primeri pogodnih sredstava za podešavanje toničnosti uključuju glukozu, dekstrozu i manitol i polimere, na primer, polivinilpirolidon.

Liofilizovana smeša se može ponovo rastvoriti u momentu primene u bilo kojem kompatibilnom i farmaceutski prihvatljivom medijumu koji se može ubrizgvati injekcijom. Ovaj liofilizat se pogodno može uzeti sa dva puta destilovanom vodom čija je čistoća pogodna za davanje injekcija, u zapremini ekvivalentnoj početnoj zapremini rastvora koji treba liofilizovati.

Farmaceutska smeša koja sadrži docetaksel i koja je pogodna za primenu u ovom pronalasku tipično sadrži najmanje 0,01 težinskih % terapeutski aktivnog proizvoda. Uopšte, neka farmaceutska smeša sadrži od 0,01 do 1000 mg, pogodno od 0,1 do 500 mg terapeutski aktivnog proizvoda.

Prvenstveno rastvor pogodan za intravenoznu injekciju sadrži od 38 do 42, pogodnije oko 40 mg/ml aktivnog proizvoda. Tipično su takvi rastvori dati u ampulama koje sadrže 20 mg ili 80 mg aktivnog proizvoda.

Prvenstveno rastvor pogodan za infuziju sadrži od 0,1 do 11, pogodnije od 0,1 do 10, još pogodnije od 0,3 do 0,9 mg/ml aktivnog proizvoda.

Terapeutski tretman sa docetakselom prema ovom pronalasku može se vršiti konkurentno sa drugim terapeutskim tretmanima uključujući tretman sa drugim antineoplastičnim (antineoplastnim) lekovima, monoklonalnim antitelima, imunoterapijom ili radioterapijom ili modifikatorima biološkog odgovora. Pogodni modifikatori biološkog odgovora uključuju limfokine i citokine kao Sto su interleukini, interferoni (a, P ili 8) i TNF. Drugi hemoterapeutski agensi koji su prikladni u lečenju poremećaja prouzrokovanih abnormalnom proliferacijom ćelije uključuju sredstva za alkilovanje, na primer, azotne senfove (muštarde) kao što su mehloretamin, ciklofosfamid, melfalan i hlorambucil, alkil-sulfonate kao što je busulfan, notrozouree kao što su karmustin, lomustin, semustin i streptozokin, triazine kao što je dakarbazin, antimetabolite kao što su analozi folne kiseline, na primer, metotreksat, analoge pirimidina kao što su fluoruracil i citarabin, analoge purina kao što su merkaptopurin i tiogvanin, prirodne proizvode, na primer, vinka alkaloide kao što su vinblastin, vinkristin i vindesin, epidofilotoksine kao što su etopozid i tenipozid, antibiotike kao što su daktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, bleomicin, plikamicin i mitomicin, enzime kao što je L-asparaginaza, različite agense kao što su koordinacioni kompleksi platine, na primer, cisplatina, supstituisane uree kao što je hidroksiurea, derivate metilhidrazina kao što je prokarbazin, adrenokortikalne supresante (suzbijače) kao što su mitotan i aminoglutetimid, hormone i antagoniste kao što su adrenokortikosteroidi kao što je prednizon, progestine kao što su hidroksiprogesteron-kaproat, metoksi-progesteron-acetat i megestrol-acetat, estrogene kao što su dietilstilboestrol i etinilestradiol, antiestrogene kao što je tamoksifen i androgene kao što su testosteron-propionat i fluoksimesteron.

Pogodan je konkurentni tretman sa ciklofosfamidom, 5-fluoruracilom, etopozidom, vinorelbinom ili metotreksatom jer se može postići sinergizam između ovih jedinjenja i docetaksela. Dalje, 2-metoksiestradiol je aktivan protiv hepatoćelijskih karcinoma i nađeno je da se dobro podnosi posle jednomesečnog dnevnog tretmana u miševima (Klauber etal., Cancer Research57 (1997) 81-86). Otuda je takođe pogodan konkurentni tretman (lečenje) sa 2-metoksi-estradiolom, naročito kada se zahteva hronično lečenje.

U ovom pronalasku docetaksel se daje pri dozi koja dozvoljava tretman (lečenje) hepatoćelijskog karcinoma. Doziranje varira prema načinu (putu) davanja i fizičkim karakteristikama pacijenta. Pogodna doziranja uključuju doziranja koja su terapijski efikasna za lečenje poremećaja prouzrokovanih abnormalnom proliferacijom ćelija. Docetaksel se može davati toliko često koliko je potrebno da se postigne željeni terapeutski efekat.

Tipična doza docetaksela za lečenje čoveka je od 50 do 150, pogodno 60 do 100, još pogodnije oko 100 mg docetaksela/m<2>površine kože pacijenta. Kada se docetaksel daje infuzijom, tipična brzina infuzije je od 1 do 200, pogodno oko 100 mg/m<2>docetaksela na sat.

Kad je to potrebno gornja doza se može ponoviti. Tipično se ponavlja dnevno ili nedeljno. Pogodno se ponavlja svake 3 nedelje. Na primer, docetaksel se može davati pri dozi od oko 100 mg/m<2>kao intravenozna infuzija u toku 1 sat svake tri nedelje.

Sledeći primer ilustruje ovaj pronalazak.

Primar

Materijali i postupci (metode)

Ukoliko nije drugačije ukazano, ovde korišćeni postupci (metode) su standardne biohemijske tehnike. Svi upotrebijeni ćelijski nizovi su komercijalno raspoloživi.

Kultura ćelija

Detaljno dati donji eksperimenti obuhvataju ćelijske nizove humanog hepatoma Hep 3B (ATCC oznaka HB 8064), Hep G2 (ATCC oznaka HB 8065) i HA22T/VGH i ćelijski niz mišjeg hepatoma Hepa 1-6. Ove ćelije su gajene u DMEM (GIBCO, BRL) koji sadrži 10% seruma telećeg fetusa (Hvclone), 0,01 mg/ml gentamicina i 0,1 mM neesencijalne aminokiseline. Ćelije su rasle (razvijane) u inkubatoru sa C02pri 37°C sa 5% C02i 95% filtriranog vazduha.

Lečenje ( tretman) lekom

U donjim detaljnim eksperimentima, gore date ćelije hepatoma su tretirane različitim koncentracijama paklitaksela (0,001-10 uM) i docetaksela (0,001-10 uM) u toku 24 sata i 72 sati. Radi dobivanja skladišnih rastvora paklitaksel je rastvoren u dimetilsulfoksidu (DMSO) a docetaksel je rastvoren u etanolu. Finalna koncentracija prenosnika je bila manja od 0,1%.

Proučavanje sposobnosti ćelija za opstanak ( život) : probe

MTT

Ćelije su gajene u klasteru (grupi) sa 96 udubljenja za gajenje ćelija (COSTAR) pri gustini od 4 x IO<4>ćelija/ml. Posle tretiranja lekom u toku 24 sata ili 72 sata, medijum je uklonjen i zamenjen istom zapreminom (100 ul) svežeg medijuma koji sadrži MTT (0,456 mg/ml; 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-dif enil-tetrazoli jum-bromid)

i smeša je inkubirana 1,5 sat pri 37°C. Svež medijum je zatim uklonjen i potom je dodato 100 ul DMSO. Sposobnost ćelija za opstanak (život) je određena kolorimetrijskim poređenjem uz primenu čitanja vrednosti OD (optičke gustine) iz čitača sa mikropločom (SPECTRA MAX 250) pri talasnoj dužini apsorpcije od 570 nm.

Dobiveni rezultati su prikazani na Slici 1, u kojoj ispunjeni krugovi predstavljaju vrednosti (podatke) nakon tretiranja u toku 24 sata a otvoreni krugovi predstavljaju vrednosti (podatke) koje su dobivene nakon tretiranja u toku 72 sata. Dobivene vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± standardnu grešku u odnosu na srednju vrednost koja je dobivena iz dvostrukih uzoraka iz tri nezavisna eksperimenta.

Proi?a isključenja sa propidijum- jodidom ( PI)

Ćelije su razvijane na balonima od 5 cm<2>(CORNING) i tretirane sa paklitakselom i docetakselom kao što je gore dato. Zatim je dodat propidijum-jodid (10 ug/ml) i izvršena je inkubacija u toku 15 minuta na 37°C. Zatim je pre žetve (sakupljanja) prionulih (adherovanih) ćelija sakupljen medijum. Suspendovane i priključene ćelije su sakupljene i ponovo suspendovane sa 500 ul PĐS za dole datu analizu protočnom citometrijom. Signali otpadaka su uklonjeni pomoću FSC-SSC upravljanja impulsima.

Određivanje sadržaja DNK pomoću protočnecitometrijske

analize

Pufer za liziranje (0,5% Triton X-100, 0,2 ug/ml Na2EDTA.2H20 i 1 % goveđi serum albumin u PBS) je dodat u u granule (pelete) ćelija koje su zatim držane na ledu u toku 15 minuta. U ovu smešu je zatim dodat 100%-ni metanol koji je prethodno ohlađen na -20°C. Smeša je potom centrifugirana pri 300 x g u toku 5 minuta. Gornji bistri sloj tečnosti (iznad taloga) je uklonjen i ćelijska granula (pelet) je ispirana sa PBS. Isprana granula (pelet) je obojena rastvorom za bojenje DNK (50 ug/ml propidijum-jodida i 5 kjedinica/ml RNaze A) u toku 30 minuta pri 4°C u mraku. Sadržaj DNK svake ćelije je izmeren uz primenu protočnog citometra Becton DickinsonFACS Caliburkao što je dole dato.

Protočna citometrija

Ćelije (10.000) su analizirane na protočnom citometru model Becton DickinsonFACSCaJiburuz primenu lasera sa argonskim jonom (15 m Watt) sa upadnim (incidentnim) mlazom (snopom) na 488-nm. Za PI probu isključenja crvena fluorescencija je sakupljena kroz filter na 585 nm i signali otpadaka ćelija su uklonjeni pomoću FSC-SSC upravljanja impulsima. Dobiveni podaci su sakupljeni i analizirani uz primenu softvera FACS/CELLQuest na računaru Power Macintosh 7600/120. Apoptotične ćelije i ćelije pri specifičnim fazama ciklusa su određene pomoću softvera ModFit LT.

Dobiveni rezultati protočne citometrije su prikazani naTabelama 1 i 2 i na Slici 2. Tabela 1 daje brojne vrednosti za propustijivost ćelijske membrane kod ćelija hepatoma, nakon tretmana (lečenja) sa paklitakselom i docetakselom. Tabela 2 daje u detaljima procenat apoptotičnih (sub-GO/Gl) ćelija koji je nađen posle tretmana (lečenja) sa paklitakselom i docetakselom. Slika 2 prikazuje analizu histograma DNK koja u detaljima daje efekat paklitaksela i docetaksela na napredovanje ćelijskog ciklusa.

Brojne vrednosti su%apoptotičnih ćelija ( sub- GO/ Gl) kao

što je određeno protočnom citometrijom.

Analiza pomoću DNK fragmentacione elektroforeze

Utvrđivanje (procenjivanje) pomoću DNK fragmentacije je bilo prema postupku Herrmann-a et al.,Nucleic Acids Res.22(1994) 5506-5507.

Ukratko, HEP G2 ćelije (2 x 10<7>) su tretirane 72 sata paklitakselom i docetakselom kao što je gore dato i potom centrifugirane. Tako dobivene ćelijske granule (peleti)

su ponovo suspendovane sa NP-40 puferom za liziranje (1% NP-40 u 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5). Posle liziranja ćelija u toku nekoliko sekundi, gornji bistri slojevi rastvora (iznad taloga) su sakupljeni (5 minuta pri 1.600 x g). Ekstrakcija je ponovljena sa istim puferom za liziranje. Dodati su SDS (finalne koncentracije 1%) i RNaza (finalne koncentracije 2,5 ug/ml) u gornje (bistre) slojeve tečnosti (iznad taloga) i ovi su inkubirani u toku 2 sata pri 56°C čemu je sledilo varenje

(digestija) sa proteinazom K (2,5 ug/ul) u toku 2 sata pri 37°C. Zatim su smeše dodate u 10 M rastvor amonijum-acetata pre taloženja sa 100%-nim etanolom u toku 30 minuta pri -20°C. DNK je sakupljena centrifugiranjem (10 minuta pri 12.000 x g) čemu je sledila elektroforeza na 1,5%-nom agaroznom gelu.

Dobiveni rezultati su prikazani na SI. 3. Na SI. 3, M je parni marker sa osnovom 100. Red 1 pokazuje medijumsku kontrolnu probu. Redovi 2 i 3 pokazuju srednju vrednost grupa tretiranih paklitakselom (0,1 i 1 uM) . Redovi 4 i 5 pokazuju srednju vrednost grupa tretiranih docetakselom (0,1 i 1 uM).

Rezultati

Proučavanja sposobnosti ćelija za opstanak ( život)

Slika 1 pokazuje zavisnost efekta paklitaksela i docetaksela na sposobnost ćelija za opstanak (život) u ćelijskim nizovima hepatoma (Hep G2, Hep 3B, HA22T/VGH i Hepa 1-6) od doze. Kao što se vidi iz Slike 1, docetaksel je postigao smanjenu sposobnost ćelija za opstanak (život) pri 0,01 i 0,1 uM u skoro svakom slučaju.

Kod ćelija Hep G2, sposobnost ćelija za opstanak (život) je pokazala trend smanjivanja posle tretmana paklitakselom ili docetakselom. Sposobnost za opstanak (život) ćelija Hep G2 je bila 61,81% odnosno 39,45% u odnosu na kontrolnu probu za grupe tretirane paklitakselom (10 uM) pri 24 odnosno 72 sata. Za ćelije Hep G2 tretirane docetakselom, maksimalno smanjenje sposobnosti ćelija za opstanak (život) je primećeno pri 1 uM docetaksela. Nije pronađeno dalje smanjenje sposobnosti ćelija za opstanak (život) pri dozi od 10 uM docetaksela. Sposobnost ćelija za opstanak (život) tretiranih sa 1 uM docetaksela u toku 24 odnosno 72 sata je bila 65,03% odnosno 48,99%.

Kod ćelija Hep 3B, značajno je da je primećeno znatno smanjenje sposobnosti ćelija za opstanak (život)

(37,06%) posle tretmana u toku 72 sata sa 0,01 uM docetaksela.

Kod ćelija Hepa 1-6 tretiranih docetakselom, maksimalna citotoksičnost (65,34% odnosno 30,71%) je nađena u grupama tretiranim sa 1 uM docetaksela pri 24 odnosno 72 sata.

Proba isključenja sa propidijum- jodidom ( PI)

Tabela 1 pokazuje da je propustljivost membrana ćelija Hep G2 i Hep 3B nakon tretmana sa paklitakselom i docetakselom zavisila od doze i vremena.

■ Za ćelije HA22T/VGH je primećeno manje povećanje

propustijivosti membrana posle tretmana sa paklitakselom (0,01-1 uM) u toku 72 sata u poređenju sa povećanjem kod grupa tretiranih sa docetakselom. Značajno je primetiti da je samo 55,44% ćelija imalo nedirnute (čitave) membrane posle tretmana sa 0,01 uM docetaksela u toku 72 sati, dok je, posle iste doze paklitaksela, nedirnute (čitave) membrane imalo 92,58% tretiranih ćelija.

Analiza ćelijskog ciklusa

Slika 2 pokazuje da su ćelije Hep G2 tretirane sa 1 uM paklitaksela u toku 24 sata rezultovale u očiglednom zaustavljanju (sprečavanju) faze G2/M. Slični histogrami DNK su primećeni posle 72 sata izlaganja (eksponiranja).

Kao što je pokazano na Tabeli 2, nađene su apoptotične ćelije (sub-GO/Gl) posle tretmana sa 0,001 uM, 0,01 uM, 0,1 uM i 1 uM docetaksela u toku 24 sata sa apoptotičnim prinosima od 31,02%, 45,24%, 38,77% odnosno 28,33%. Posle 72 sata tretiranja docetakselom (0,001-1 uM), apoptotični procenti su bili 21,92%, 42,45%, 42,44% odnosno 56,66%.

Kod ćelija Hep 3B, tretman sa 0,1 uM ili 1 uM paklitaksela u toku 24 sata rezultovao je u zaustavljanju (sprečavanju) faze G2/M a inkubacija sa 0,1 uM ili 1 uM paklitaksela u toku 72 sata rezultovala je u povećanim procentima sub-GO/Gl do 38,37% odnosno 47,01%. Nasuprot tome, ćelije Hep 3B, tretirane sa 0,01 uM, 0,1 uM i 1 uM docetaksela u toku 24 sata ili 72 sata povećale su do visokih koncentracija populacija sub-GO/Gl od 59,14%, 58,69% i 65,74% pri 24 sata i 64,12%, 81,66% i 79,33% pri 72 sata.

Kod ćelija HA22T/VGH, povećavajuće koncentracije paklitaksela (0,001 uM do 1 uM) bile su u međusobnom odnosu sa povišenim procentom ćelija G2/M pri 24 sata. Nije primećena značajna populacija sub-GO/Gl u grupama koje su tretirane sa 0,1 uM ili 1 uM paklitaksela pri 72 sata. Nasuprot tome, značajno je da su ćelije HA22T/VGH koje su tretirane sa 0,01 uM docetaksela pri 24 sata imale veći procenat (41,75%) sub-GO/Gl nego grupe tretirane sa 0,1 uM (18,61%) ili 1 uM (22,94%) docetaksela. Kada su ćelije tretirane u toku 72 sata, nađeni su značajni procenti sub G0/G1 populacije u ćelijama HA22T/VGH tretiranim sa 0,01 uM (56,64%), 0,1 uM(58,61%) i 1 uM (60,98%) docetaksela.

Za ćelije Hepa 1-6, tretman paklitakselom (0,01, 0,1 ili 1 uM) u toku 24 sata rezultovao je u povećanom formiranju populacija sub-GO/Gl (24,02%, 55,64% odnosno 64,38%) i primećeno je zaustavljanje (sprečavanje) faze G2/M u grupama tretiranim sa 0,1 uM i 1 uM paklitaksela. Kada su ćelije Hepa 1-6 tretirane sa 0,1 uM i 1 uM paklitaksela u toku 72 sata, većina ćelija je bila mrtva i nije bilo očiglednog profila ćelijskog ciklusa. Tretman ćelija Hepa 1-6 docetakselom (0,01 uM, 0,1 uM i 1 uM) rezultovao je u formiranju ćelija sub-GO/Gl (52,81%, 50,76% i 53,8 % pri 24 sata odnosno 31,25%, 53,95% i 62,49% pri 72 sata).

Analiza fragmentacijom DNK

Slika 3 pokazuje da je tretman pomoću paklitaksela (0,1 i 1 uM) i docetaksela (0,1 i 1 uM) indukovao fragmentaciju DNK u ćelijama Hep G2.

Claims (4)

1. Upotreba kompozicije za proizvodnju leka za lečenje hepatoćelijskog karcinoma, naznačena time što kompozicija kao aktivni sastojak sadrži docetaksel ili njegov hidrat.

2. Upotreba kompozicije prema zahtevu 1, naznačena time što je hidrat trihidrat.

3. Upotreba kompozicije prema zahtevu 1 ili 2, za proizvodnju leka za lečenje hepatoćelijskog karcinoma, naznačena time što je lek namenjen za parenteralno davanje.

4. Upotreba kompozicije prema zahtevu 3, naznačena time što je lek pogodan za davanje infuzijom i sadrži od 0.1 do 11 mg/ml aktivnog jedinjenja.