RO116205B1

RO116205B1 - Procedeu de obţinere a unui produs activ, de uz uman, pentru reglarea florei intestinale

Info

Publication number: RO116205B1
Application number: RO96-01321A
Authority: RO
Inventors: Tudora Caraiani; Maria Pamfil; Doina Dobrovolschi; Sanda Stan
Original assignee: Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutică - I.C.C.F. Bucureşti R.A.
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2000-11-30

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unui produs activ, de uz uman, pentru reglarea florei intestinale, prin biosinteză, cu ajutorul microorganismului Bacillus subtilis, care cuprinde fazele de: obţinere a inoculului prin cultivarea tulpinii ICCF-77A, pe un mediu conţinând extract de porumb şi săruri minerale, la 30...32°C, timp de 18...20 h, bioproces propriu-zis prin dezvoltarea vegetativă pe un mediu identic şi în aceleaşi condiţii, cu sporulare maximă în proporţie de peste 90% a populaţiei bacteriene, între 22...26 h, decantare şi centrifugare la 3000 rpm, timp de 20...30 min, sub răcire, uscarea biomasei sporulate prin liofilizare, obţinându-se o pulbere cu 1,7 . 10...2 . 10spori/gram, proteină brută cu 8...15% substanţă uscată şi aminoacizi liberi: acid aspartic, valină, leucină, acid gluconic, alfa-alanină şi metale grele 0,001%.

Description

RO 116205 B

Invenția de față se referă la un procedeu de obținere a unui produs de uz uman, pentru reglarea florei intestinale.

Microorganismul Bacillus subtilis este utilizat în terapeutică pentru reglarea florei intestinale, datorită capacității sale de a sporula și de a elibera, în momentul germinării, enzime, în cantitate destul de mare. Ingerat sub formă sporulată, Bacillus subtilis traversează stomacul și duodenul fără să fie alterat de HCI gastric, de pepsine și de enzimele pancreatice. Germinarea este maximă la nivelul regiunii ileocecale și continuă în lungul colonului.

In timpul parcurgerii acestui traseu, Bacillus subtilis își exercită proprietățile specifice influențând în mod pozitiv microflora intestinală.

Sporii de Bacillus subtilis, în timpul germinării, eliberează două tipuri de enzime: enzime paradigestive și enzime bacteriolitice.

Enzimele paradigestive, sintetizate de Bacillus subtilisîn timpul germinării, ajută la descompunerea glucidelor, lipidelor și protidelor din organism.

Enzimele bacteriolitice lizează direct microorganismele patogene [Ex: Proteus, Staphylococi patogeni etc.) prin delipidarea peretelui extern.

Echipamentul enzimatic foarte polimorf explică eficacitatea microorganismului în reglarea tulburărilor intestinale și al meteorismului intestinal, simptomele cele mai frecvente ale diareeelor fermentative.

Pe plan mondial se cunosc procedee de obținere a unor produse active în reglarea florei intestinale, utilizând tulpina Bacillus IP 5832. Aceste produse prezintă dezavantajul că tulpina Bacillus IP 5832 este sensibilă la agenți chimioterapici, ca cei din clasa chinolonelor (acid nalidixic, norfloxacină) și unele antibiotice ca, de exemplu, din clasa tetraciclinelor-doxiciclina.

Procedeul de obținere a unui produs activ de uz uman, pentru reglarea florei intestinale prin biosinteză cu ajutorul microorganismului Bacillus subtilis, conform invenției, constă în aceea că cuprinde fazele de: obținere a inoculului prin cultivarea tulpinii Bacillus subtilis ICCF-77A pe un mediu conținând extract de porumb și săruri minerale, la 3O...32°C, timp de 18...20 h, bioproces propriu-zis prin dezvoltarea vegetativă pe un mediu identic și în aceleași condiții, cu sporulare maximă în proporție de peste 90% a populației bacteriene între 22...26 h, decantare și centrifugare la 3000 rpm, timp de 20...30 min, sub răcire uscarea biomasei sporulate prin liofilizare, obținându-se o pulbere cu 1,7x1O^1o...2.1O¹² spori/gram, proteină brută cu 8...15% substanță uscată și aminoacizi liberi: acid aspartic, valină, leucină, acid gluconic, a-alanină și metale grele sub 0,001%.

Procedeul de realizare a produsului activ, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:

- sporii de Bacillus subtilis ICCF-77A realizează o germinare maximă (peste 99%) într-un interval de timp mai scurt cu 3 h comparativ cu produsele cunoscute;

- rezistență crescută la agenți chimioterapici (ca, de exemplu: acid nalidixic, norfloxacină);

- lărgirea gamei de rezistență la tetracicline (doxiciclină).

Conform invenției, se obține, prin biosinteză, un produs de uz uman, util și activ în normalizarea florei intestinale acidofile și anaerobe, și a microflorei neutrofile.

Se dă, în continuare, un exemplu de realizare a invenției.

Claims

RO 116205 B

Se prepară un mediu de inocul compus din următoarele ingrediente: extract de porumb 1 g (50% s.u.]; sulfat de amoniu 0,1 g; clorură de calciu sicc 0,01 g; sulfat de mangan 0,001 g; sulfat de magneziu 0,05 g și apă de robinet ad. 100 ml, pH 6,5.,,6,7 corectat cu sol. NaOH 40%.

Sterilizarea mediului de inocul se face la 120°C timp de 30 min. 50

Mediul de inocul sterilizat se însămânțează cu 1% v/v suspensie obținută din

5 ml apă distilată sterilă, în care se reia cultura vegetativă de Bacillus subtilis ICCF77A dintr-un tub de cultură de întreținere.

Dezvoltarea mediului de inoculînsămânțat are loc la 30...32°Ctimp de 18...20 h. 55

In final, inoculul dezvoltat se prezintă ca un lichid cenușiu, cu miros caracteristic, nespumogen, cu inel slab de peliculă sporulată pe pereții flaconului. Microscopic, inoculul se prezintă ca o cultură pură conținând forme vegetative și un număr mic de spori eliberați. In general, acești spori au tendința de aglomerare în grămezi mari, refrigerente. ⁶⁰

Cu acest inocul se însămânțează în raport de 0,5...1,0% v/v mediul de bioproces format din: extract de porumb 3,0 g(50% s.u.]; sulfat de amoniu 0,1 g; clorură de calciu sicc 0,01 g; sulfat de mangan 0,001 g; sulfat de magneziu 0,05 g; apă de robinet ad. 100 ml; pH 6,5...6,7. Sterilizare 30 min la 125°C.

Bioprocesul decurge într-un reactor prevăzut cu agitator tip turbină, cu 65 barbotor de aer, la următorii parametri: temperatura 32...33°C, aer 1 1/1 mediu/min, presiune 0,5 atm.

Pe parcursul bioprocesului se urmărește: evoluția pH-ului; concentrația biomasei bacteriene; consumul de oxigen dizolvat; gradul de sporulare și puritatea culturii. După un interval de 22...26 h, mediul de fermentație prezintă următoarele 70 caracteristici; pH 8,2...8,5: spori peste 90% și rare forme vegetative. Numărul sporilor este de aproximativ 1. 1O¹⁰ ufc/ml.

Mediul de fermentație rezultat se prelucrează prin decantare, centrifugare la 3000 rpm, timp de 20...30 min și uscare prin liofilizare.

Produsul final liofilizat se prezintă sub formă de pulbere de culoare alb-gri 75 deschis, nehigroscopică, cu gust și miros caracteristic. Produsul conține o concentrație de 1,7. 10¹⁰...2.10¹⁰ spori/g proteină brută 8...15% la s.u., aminoacizi liberi: acid aspartic, valină, leucină, acid gluconic, α-alanină și metale grele sub 0,001%, limită admisă pentru medicamente de uz uman.

Revendicare

Procedeu de obținere a unui produs activ de uz uman, pentru reglarea florei intestinale prin biosinteză cu ajutorul microorganismului Bacillus subtilis, caracterizat prin aceea că, cuprinde fazele de: obținere a inoculului prin cultivarea tulpinii ICCF- 85 77A pe un mediu conținând extract de porumb și săruri minerale, la 3O...32°C, timp de 18...20 h, bioproces propriu-zis prin dezvoltarea vegetativă pe un mediu identic și în aceleași condiții, cu sporulare maximă în proporție de peste 90% a populației

RO 116205 B bacteriene între 22 și 26 h, decantare și centrifugare la 3000 rpm, timp de 20...30 90 min, sub răcire, uscarea biomasei sporulate prin liofilizate, obținându-se o pulbere cu

1,7x1O^1o...2. 10¹² spori/gram, proteină brută cu 8...15% substanță uscată și aminoacizi liberi: acid aspartic, valină, leucină, acid gluconic, α-alanină și metale grele 0,001%.

Președintele comisiei de examinare: chim. Hăulică Mariela

Examinator: biochim. Crețu Adina

Editare și tehnoredactare computerizată - OSIM

Tipărit la: Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci