PT99778B - Processo para preparacao de uma transferrina humana pasteurizada e isenta de ferro - Google Patents

Description

Descrição

A presente invenção refere-se a um processo para preparação de uma transferrina humana pasteurizada e isenta de ferro, e sua utilização.

A transferrina é a proteína transporte do ferro no plasma sanguíneo dos mamíferos, incluindo o ser humano.

GSP

A transferrina humana é utilizada sobretudo como factor de crescimento rias culturas celulares, p.e. para multiplicação de células de mamíferos em engenharia genética, e como meio terapêutico nos casos raros de atransferrinemia.

Para a preparação de transferrina humana a partir do soro ou do plasma foram descritos uma série de processos que se servem dos mais diversos principios de fraccionamento e que são realizáveis à escala industrial, p.e. através de precipitações progressivas com o auxílio de misturas de etanol e água a frio, sendo a transferrina obtida sob forma cristalina, através com etanol na presença de iões de cálcio e zinco, bem como através de adsorção de impurezas sobre carboximetil-celulose e DEAE-celulose, sendo obtida uma transferrina saturada de ferro, pasteurizado e utilizável em terapêutica, através de precipitação fraccionada com sais com o auxílio de sulfato de amónia, bem como da adsorção de impurezas sobre hidróxido de alumínio em meio aquoso, com o auxílio de processo combinado de rivanol e álcool, sendo isolada uma transferrina humana com um grau de pureza de pelo menos 85% que pode ser posteriormente cristalizada sem problemas numa forma pura e com bom rendimento, bem como através de uma combinação de passos de precipitação com rivanol e sulfato de amónia bem como adsorção de impurezas sobre hidróxido de alumínio.

Para além destes processos de purificação adequados para o isolamento industrial de transferrina humana, foram descritos na literatura uma série de outros processos adequados para a preparação de pequenas quantidades de transferrina para fins de investigação científica.

Apesar de a transferrina humana, tal como actualmente todas as preparações de plasma, ser preparada exclusivamente a partir de plasma HBsAg-negativo e anti-HIV-negativo, e de acordo com os seus processos de preparação e após longos anos de aplicação clínica pode ser agrupada dentro do grupo das preparações de baixo risco no que se refere à transmissão de doenças virais, não é possível excluir um risco residual de contaminação virai. Assim, pareceu desejável combinar com a já existente eliminação dos virus no processo de preparação, um passo adicional efi- 2 cas na inactivação dos virus, por forma a atingir o mais elevado grau de segurança actualmente possível.

SSo conhecidos essencialmente três processos para a esterilização de proteínas plasmaticas; o tratamento a quente em estado líquido ou seco; o tratamento combinado com β-propiloactona e a radiação com luz UV e o tratamento com éter ou n-trifoutil-fosfato em combinação com detergentes.

A transferrina saturada com ferro pode ser pasteurizada em solução durante 10 horas a 60°C, enquanto que a apotransferrina é desnaturada nestas condições.

Todos estes processos tem relativamente à·; fabricação de uma preparaçãode trans ferrina isenta de ferro a desvantagem de o ferro adicionado ou naturalmente ligado â transferrina ter de ser separado após a esterilização num passo adicional com o auxílio de um agente complexante (em geral EDTA).

Objectivo da presente invenção é a apresentação de um processo que possibilite a separação e complexação do ferroligado â transferrina e simultaneamente a estabilização da apotransferrina formada durante o processo de aquecimento de 10 horas a 60°C.

Era conhecido a utilização de agentes complexantes como estabilizadores na pasteurização de inactivador 01, õ^-enantripsina ou de determinados factores de coagulação, mas de forma alguma era previsível que na presença de tais compostos fosse também mantida a actividaSe biológica da apotransferrina durante a esterilização.

Objecto da presente invenção é um processo para a pasteurização de transferrina humana, caracterizado por se pasteurizar uma solução de transferrina huma3 na gue contém um agente complexante.

Para tal, pode juntar-se a uma solução obtida pelos processos conhecidos, previamente purificados e contando 10-100 g, de preferência 40-60 g, de transferrina por.d, uma quantidade de um agente complexante, de preferência um citrato solúvel ou um seu sal do ácido etilenodiamino· -tetracético (CDTA), de modo a obter uma concentração de pelo menos 0,4 mol/1, de preferência 1,2 M de citrato de sódio ou 0,5 M de EDTA, acertar-se o pH a 7-8 de preferência com ácido cítrico, e aquecer a mistura durante 10 horas a 60°C.

Enquanto que nestas condições a apotrans^J ferrina formada é protegida antes da inactivação térmica, os virus modelo adicionados experimentalmente são com este processo inactivados logo ao fim de pouco tempo de incubação.

Para o demonstrar, juntaram-se a amostras de transferrina humana (5% em 1, 2 M de citrato, pH 7,5) HSV-1, polio-virus tipo 1 ou virus da varíola na proporção de 10 íl. Estas amostras foram aquecidas a 60°C em banho-maria com termostato, durante períodos de tempo até 10 horas.

As amostras foram retiradas passados 30 minutos, 1, 2, 4, 6, e 10 horas, e tituladas de imediato quanto ao seu teor em virus. A titulação dos virus H_erpes simplex e do virus da variola foi detectado sobre células reais, e a do poliovirus foi efectuado sobre células reais, e a do poliovirus sobre células HEP-2, respectivamente com oito culturas paralelas para cada diluição virai. Se numa tal titulação (limite inferior de detecção 1,5 log ID^/ml) não fosse detectado qualquer virus infeccioso, era testado em amostra dupla um volume correspondente a 1 ml da amostra original em frascos de ensaio individuais. No caso de se manterem negativos todas as culturas de ensaio, era indicado um título virai de < 20 ID₅₀/ml. Os cálculos dos titulos foram efectuados segundo Reed e Muench.

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Resultados: (Todos os títulos expressos sob a forma de log 10 ID^/ml).

HSV-1: Titulo virai na mistura de virus e transferrina antes da inactivação 6,4. Nenhum virus infeccioso detectável a partir de 1 hora de período de inactivação.

Poli°virus: Título virai na mistura de virus e transferrina 5,7.

Nenhum virus infeccioso detectável a partir de 30 minutos de período de inactivação.

Virus da varíola: Título virai na mistura de virus e transferrina 6,5. Nenhum virus infeccioso detectável a partir de 2 horas de período de inactivação.

Os reduzidos períodos de inactivação que foram suficientes para a total inactivação dos três modelos virais revelam que através da pasteurização da transferrina é possível uma inactivação muito eficaz de virus não capsulados# capsulados e de estrutura complexa. 0 HSV-1 pode ser considerado como um modelo para o grande grupo de virus envolvidos por uma cápsula rica em lipídeos, e dentro deste grupo pela sua estabilidade relativamente elevada. Em todos os casos até agora estudados, os retrovírus, tal como os virus HIV, são mais rapidamente inactivados do que o HSV. 0 polio-virus e o virus da varíola representam o grupo dos virus não capsulados, cuja estabilidade ao calor substancialmente elevada é conhecida. Também estes dois virus modelo são inactivados surpreendentemente depressa, apesar da sua elevada estabilidade. Assim, a pasteurização da transferrina representa um método muito eficaz para a inactivação de virus capsulados e não capsulados de diversos tipos.

O aquecimento na presença de um agente complexante provoca em simultâneo a complexação do ferro naturalmente contido na transferrina, que pode depois ser removido durante a posterior purificação, p.e. através de ultrafiltração.

Revelou-se vantajosa a introdução da pa teurização no processo de preparação, antes do último passo de purificação. Nesta fase do tratamento, a transferrina possui já um grau de pureza suficientemente elevado, a este método de trabalho tem a vantagem de permitir mais facilmente separar os resíduos de impurezas proteicas desnaturadas na maior parte dos casos durante o processo de aquecimento, através da posterior adsorção p.e. sobre hidroxiâo de alumínio. As pequenns quantidades de transferrina agregada são igualmente eliminadas através da adsorção.

Em combinação com os processos de purificação conhecidos para a transferrina, pode obter-se a partir da fracção IV de Cohn e de acordo com o processo descrito, uma transferrina humana pasteurizada, isenta de ferro, com um grau de pureza imuno-químico de pelo menos 98%. A solução obtida da transferrina pasteurizada, isento de ferro, pode ser purificada e concentrada, filtrada para esterilizar a liofilizar pelos processoso conhecidos. A percentagem de agregados (dímeros) situa-se com aprox,

2-5% dentro dos valores de um produto liofilizado não pasteurizado.

A capacidade de ligação do ferro de transferrina pasteurizado é totalmente mantida. A transferrina isenta de ferro e saturada com ferro cristalizam após o processo de pasteurização com etanol ou polietileno-glicol, com a mesma facilidade e nas mesmas formas cristali nas que a transferrina não pasteurizada. Para além disso, t t

são totalmente mantidas as propriedades da transferrina pasteurizada para actuar como factor de crescimento em culturas celulares.

Exemplo lí

Dissolver 1000 g de matérias seca de uma transferrina em bruto previamente purificada através de um dos processos conhecidos, com um grau de pureza imunológica de aprox. 90% e um teor de ferro de 550 ug/j. de proteina, em água destilada e juntar uma quantidade de citrato trissódico até se obterem 20 1 de uma solução proteica a 5 g% com 1,2 M de citrato trissódico. Acertar o pH da solução a 7,5 com ácido cítrico ÍM.

A solução de transferrina em bruto é aquecida em banho-maria a 60°G, ewmantida a 60°G durante 10 horas, agitando sempre. Depois de arrefecer a temperatura ambiente filtra-se para eliminar a ligeira turvação formada durante o processo de aquecimento.

Remover da solução proteica o citrato de sódio e e ferro a ele ligado, através de ultrafiltração (limite de exclusão da membrana = 10 KD) com água destilada, o teor de ferro da solução de transferrina é então inferior a 20 ug/g de proteína.

A subsequente alta purificação da transferrina isenta de ferro faz-se com o auxílio de métodos conhecidos, como a adsorção de impurezas residuais sobre hidróxido de alumínio ou a cromatografia sobre resinas de permuta iónica.

Exemplo 2:

P_rocede-se como no exemplo 1, mas em lugar do citrato trissódico utiliza-se sal dissódico do ácido etilenodinitrilo-tetracético, numa concentração de O,5 M.

pH da solução é acertado a pH 7,5 com solução de hidróxido de sódio IN. 0 posterior tratamentoq feito como descrito no exemplo 1.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ P_rocesso para preparação de transferrina humana, caracterizado por se pasteurizar uma solução de transferrina humana contendo um agente complexante.

   - 2S Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar como agente complexante um citrato solúvel ou um sal do ácido etilenodiamino-tetracético (CDTA).

   _3ã_

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente complexante ser separado com o ferro gue se encontra ligado à transferrina.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 13 de Dezembro de 1990, sob o na. P4O39-721.1.